CN110055285A - 与恶性胸腔积液相关的靶点myo9b及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与恶性胸腔积液相关的靶点MYO9B及其应用。本发明还公开了如下1)‑5)中任一种应用：1)抑制MYO9B蛋白活性的物质在制备治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用；2)抑制MYO9B蛋白活性的物质在制备降低或减少恶性胸腔积液患者胸腔积液量的产品中的应用；3)抑制或沉默MYO9B基因表达的物质在制备治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用；4)抑制或沉默MYO9B基因表达的物质在制备降低或减少恶性胸腔积液患者胸腔积液量的产品中的应用；5)MYO9B蛋白及其相关信号通路作为靶点在开发或设计治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用。

Description

与恶性胸腔积液相关的靶点MYO9B及其应用
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及与恶性胸腔积液相关的靶点MYO9B及其应用。
背景技术
肿瘤细胞向胸膜侵犯能够导致恶性胸腔积液(Malignant Pleural Effusion，MPE)。在我国，肺癌发病率位居所有癌症的首位，且死亡率最高，而肺癌伴有MPE患者的中位生存期较无MPE患者明显缩短，生活质量更差。因此，探讨MPE的发病机制，较早发现并诊断MPE，给予相应防治措施，对于提高患者的生活质量意义重大，然而有关MPE的发病机制目前还不是十分清楚。肿瘤与宿主之间的相互作用是MPE形成的关键，胸膜处的肿瘤是MPE形成的驱动力，且宿主的多种免疫细胞在MPE的发生发展过程中起重要作用。
MYO9B是一种多结构域、单头马达信号分子，在免疫系统中多种组织如淋巴结、胸腺、脾脏以及多种免疫细胞如树突状细胞、巨噬细胞和CD4+ T细胞中大量表达。2010年，Hanley等采用cre-loxP系统对小鼠胚胎干细胞MYO9B基因进行编辑，获得MYO9B基因敲除小鼠。虽然Cre/loxP系统在理论上已十分成熟但在实际应用中仍存在不足和限制：(1)利用Cre/loxP技术进行基因的条件性敲除首先要构建打靶载体，扩增长度约为4-5kb的同源臂，同时还需要BAC克隆和基因重组技术。将loxP片段靶向导入细胞基因组，这一步发生同源重组的概率极低，并且需要通过长片段PCR和Northern杂交等复杂的筛选工作，才能鉴定靶向成功的细胞。因此，该步骤需要大量的时间和精力，是利用Cre/loxP系统进行基因条件性敲除的限速步骤。(2)Cre酶作为一种外源性重组酶在哺乳动物中表达后具有一定的潜在毒性，会引起细胞增殖异常、DNA错配和染色体缺失等问题。(3)Cre/loxP系统切割效率在70％左右，目的器官或组织中仍有少量敲除基因未被敲除，这些未敲除的目的基因会在特定器官或组织内微量表达。
发明内容
本发明的第一个目的是提供如下1)-5)中任一种应用：
1)抑制MYO9B蛋白活性的物质在制备治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用；
2)抑制MYO9B蛋白活性的物质在制备降低或减少恶性胸腔积液患者胸腔积液量的产品中的应用；
3)抑制或沉默MYO9B基因表达的物质在制备治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用；
4)抑制或沉默MYO9B基因表达的物质在制备降低或减少恶性胸腔积液患者胸腔积液量的产品中的应用；
5)MYO9B蛋白及其相关信号通路作为靶点在开发或设计治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用。
上述应用中，所述抑制MYO9B蛋白活性的物质可为抑制MYO9B蛋白合成或促进MYO9B蛋白降解或抑制MYO9B蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物；
所述抑制或沉默MYO9B基因表达的物质可为干扰MYO9B基因表达的物质或敲除MYO9B基因的物质或突变MYO9B基因的物质。
进一步的，所述敲除MYO9B基因的物质可为CRISPR/Cas9系统。
更进一步的，所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1识别的靶序列为序列表中的序列1所示的DNA分子；
所述sgRNA2识别的靶序列为序列表中的序列2所示的DNA分子。
在本发明的具体实施例中，所述sgRNA1为序列表中序列3所示的RNA分子；
所述sgRNA2为序列表中序列4所示的RNA分子。
本发明的另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品的活性成分为上述抑制MYO9B蛋白活性的物质或抑制或沉默MYO9B基因表达的物质；
所述产品的功能为治疗或辅助治疗恶性胸腔积液或降低或减少恶性胸腔积液患者胸腔积液量。
本发明还有一个目的是提供一种转基因小鼠的制备方法。
本发明提供的转基因小鼠的制备方法包括如下步骤：基于CRISPR/Cas9系统对小鼠基因组中的MYO9B基因进行编辑，进而使所述小鼠基因组中的MYO9B基因功能丧失，即得到所述转基因小鼠。
上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1识别的靶序列为序列表中的序列1所示的DNA分子；
所述sgRNA2识别的靶序列为序列表中的序列2所示的DNA分子；
进一步的，所述sgRNA1为序列表中序列3所示的RNA分子；
所述sgRNA2为序列表中序列4所示的RNA分子。
上述方法包括使用所述sgRNA1、所述sgRNA2和Cas9 mRNA的步骤；
进一步的，所述sgRNA1、所述sgRNA2和所述Cas9 mRNA的质量比为(1-2):(1-2):2；
更进一步的，所述sgRNA1、所述sgRNA2和所述Cas9 mRNA的质量比为1:1:2。
在本发明的具体实施例中，所述方法包括如下步骤：
(1)将含有所述sgRNA1、所述sgRNA2和Cas9 mRNA的电转液电转至小鼠受精卵中，得到电转后的受精卵；
(2)培养所述电转后的受精卵，并挑选发育到2细胞期的胚胎植入代孕小鼠中，发育完成后，得到F0代小鼠；
(3)从所述F0代小鼠中鉴定得到MYO9B基因突变的F0代小鼠(杂合)；
(4)将所述F0代小鼠(杂合)与野生型小鼠(C57BL/6J小鼠)杂交，得到F1代小鼠(杂合)；
(5)将所述F1代小鼠(杂合)中的雌性和雄性杂交，得到F2代小鼠(纯合)；
(6)将所述F2代小鼠(纯合)连续杂交繁殖到F4代，得到F4代小鼠(纯合)。
和野生型C57BL/6J小鼠相比，本发明获得的F4代小鼠(纯合)两条同源染色体上的MYO9B基因的第17697-17712位所示的大小为16bp的DNA片段和第17866-17872所示的大小为7bp的DNA片段均发生了缺失。
本发明还有一个目的是提供制备上述转基因小鼠的产品。
本发明提供的制备上述转基因小鼠的产品包括上述sgRNA1、上述sgRNA2和Cas9mRNA。
如下M1)或M2)或M3)所述的应用也属于本发明的保护范围：
M1)上述方法制备得到的转基因小鼠在作为用于研究恶性胸腔积液发生发展机制和/或预后的小鼠模型中的应用；
M2)上述方法制备得到的转基因小鼠或上述产品在制备用于研究恶性胸腔积液发生发展机制和/或预后的小鼠模型中的应用；
M3)上述方法制备得到的转基因小鼠或上述产品在制备和/或筛选治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的药物中的应用。
本发明首次采用CRISPR/Cas9系统对小鼠基因组中的MYO9B基因进行编辑，得到MYO9B基因敲除小鼠，并进一步对MYO9B功能进行了研究。恶性胸腔积液模型实验结果表明：MYO9B基因参与恶性胸腔积液的免疫反应，和野生型小鼠相比，MYO9B基因敲除后的恶性胸腔积液小鼠的胸腔积液量明显减少。
附图说明
图1为01#小鼠突变情况。01#小鼠为含突变杂合子，突变为：-16-7(缺失16bp+缺失7bp)。
图2为02#小鼠突变情况。02#小鼠为含突变杂合子，突变为：-16-1(缺失16bp+缺失1bp)。
图3为MYO9B基因敲除小鼠与野生型小鼠的胸腔积液量比较。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的Opti-MEM的产品名称为GibcoTM Opti-MEMTM，是Thermo的产品。
下述实施例中的Cas9 mRNA的产品名称为GeneArtTMCRISPR Nuclease mRNA，是Invitrogen产品，批号为00556295。
下述实施例中的C57BL/6J小鼠和CD-1小鼠均是北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。
实施例1、MYO9B基因编辑小鼠模型的构建方法
一、sgRNA和Cas9 mRNA准备
1、靶点序列的设计
根据MYO9B基因序列(MYO9B基因的mRNA序列的Genbank号为NM_001142322.1，如序列表中序列5所示。其中，序列5第171-6557位所示的DNA序列为编码小鼠MYO9B蛋白的CDS序列)，设计的靶点序列如下：
1#：TGGCTCGAAGCACTACGTGC(序列1)；
2#：AGGCTGGCAGCTCGGGCCGT(序列2)。
2、sgRNA的制备
(1)以eSpCas9(1.1)质粒(addgene)为模板，采用invitro-sgMyo9b-1#.S和hU6.R引物进行PCR扩增，得到PCR产物，即为体外转录模板1；
以eSpCas9(1.1)质粒(addgene)为模板，采用invitro-sgMyo9b-2#.S和hU6.R引物进行PCR扩增，得到PCR产物，即为体外转录模板2。
引物序列如下：
invitro-sgMyo9b-1#.S：TAATACGACTCACTATAGGGTGGCTCGAAGCACTACGTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAG；
invitro-sgMyo9b-2#.S：TAATACGACTCACTATAGGGAGGCTGGCAGCTCGGGCCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAG；
hU6.R：AAAAGCACCGACTCGGTGCC。
(2)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，然后琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，再分别以回收的体外转录模板1和体外转录模板2为模板，利用T7体外转录试剂盒(购自Ambion公司，货号为AM1334)进行体外转录，分别得到sgRNA1和sgRNA2。
sgRNA1序列如下：UGGCUCGAAGCACUACGUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(序列3)
sgRNA2序列如下：AGGCUGGCAGCUCGGGCCGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(序列4)。
(3)转录产物经琼脂糖凝胶电泳，然后RNA纯化试剂盒回收，再用DEPC水溶解，得到sgRNA1溶液和sgRNA2溶液，最后-80℃保存备用。
3、电转混合液的制备
将Opti-MEM、sgRNA1溶液、sgRNA2溶液和Cas9 mRNA溶液混匀，得到电转混合液(总体积50μL)，sgRNA1、sgRNA2和Cas9 mRNA在电转混合液中的终浓度分别为200ng/μL、200ng/μL和400ng/μL。
二、超排卵
8周龄雄性C57BL/6J小鼠1只，8周龄雌性C57BL/6J小鼠3只。雌鼠于第一天14：00腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG(5U/只)，第三天14：00腹腔注射人绒毛膜促性腺激素hCG(5U/只)，然后立即将3只雌鼠与1只雄鼠合笼，第四天8：00-9：00检查雌鼠阴道栓，选取检查到阴栓的雌鼠。
三、受精卵收集及培养
安乐死上述步骤二中检查到阴栓的雌鼠，无菌采集其输卵管，放入一个35mm皮氏培养皿(用M2培养液和透明质酸酶溶液制作的液滴培养基，37℃预温)中，在体视显微镜下将输卵管壶腹部用镊子撕破，将卵丘细胞包围的合子团释放出来，移入透明质酸酶液滴中放置几分钟，收集受精卵，转移到M2液滴培养基中，挑选形态正常的受精卵，在37℃、5％CO2条件下培养备用。
四、电转及输卵管内胚胎移植
取45μL上述步骤一中制备的电转混合液加到CUY505P5电极杯中，再加入挑选出的受精卵，测量电阻，使其为0.48-0.52kΩ，电转，具体参数如下：Poring Pulse：225V，Length1ms，interval 50ms，No.4，D.Rate 10％，Polarity+；Transfer Pulse：20V，Length 50ms，interval 50ms，No.5，D.Rate 10％，Polarity+/-。电转后的受精卵转到KSOM培养基中，在37℃、5％CO2条件下过夜培养，挑选发育到2细胞期的胚胎植入代孕小鼠。
胚胎移植的具体步骤如下：假孕0.5d(当天早晨检查到阴栓)的CD-1雌性小鼠，麻醉后于背部做约1cm切口，暴露卵巢和输卵管，体视显微镜下，将显微注射后培养到2细胞期的胚胎植入输卵管壶腹部，将卵巢和输卵管放回腹腔后缝合，左右两侧输卵管均移植，每只小鼠植入20个2细胞期胚胎。
五、品系建立
1、阳性F0代小鼠的鉴定
1)移植后约20天CD-1小鼠产仔，得到F0代小鼠。F0代小鼠出生后，在3-4周龄时剪尾，并将获得的组织用于基因组DNA的提取，同时以野生型C57BL/6J小鼠作为对照。
2)以提取的基因组DNA为模板，采用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物，并对PCR产物进行测序。引物序列如下：
My09b.dec.S：TCTGGTATGAACTGCCTTG；
My09b.dec.A：TAGTAGCCATCCTCCTGAG。
测序结果表明：和野生型C57BL/6J小鼠相比，阳性F0代小鼠01#两条同源染色体中的一条同源染色体上的MYO9B基因的第17697-17712位(对应mRNA序列的189-204位)所示的大小为16bp的DNA片段和第17866-17872位(对应mRNA序列的358-364位)所示的大小为7bp的DNA片段发生了缺失，另一条染色体没有发生突变(图1)。
和野生型C57BL/6J小鼠相比，阳性F0代小鼠02#两条同源染色体中的一条同源染色体上的MYO9B基因的第17695-17710位(对应mRNA序列的187-202位)所示的大小为16bp的DNA片段和第17868位(对应mRNA序列的360位)所示的碱基G发生了缺失，另一条染色体没有发生突变(图2)。
2、品系的建立
取阳性F0代小鼠01#建系。具体步骤如下：将阳性F0代小鼠01#与野生型C57BL/6J小鼠杂交获得F1代小鼠，3-4周龄时，剪尾基因型鉴定筛选与阳性F0代小鼠01#基因型一致的小鼠，得到F1代杂合小鼠01#；F1代杂合小鼠01#之间进行杂交获得F2代小鼠，3-4周龄时，剪尾基因型鉴定筛选出F2代纯合小鼠01#，F2代纯合小鼠01#的雌性和雄性即可作为种鼠交配，连续杂交繁殖到F4代，得到F4代纯合小鼠01#并对其进行基因型鉴定。基因型鉴定引物My09b.dec.S和My09b.dec.A。
和野生型C57BL/6J小鼠相比，F4代纯合小鼠01#两条同源染色体上的MYO9B基因的第17697-17712位所示的大小为16bp的DNA片段和第17866-17872所示的大小为7bp的DNA片段均发生了缺失。
六、MYO9B基因敲除小鼠的功能验证
对野生型C57BL/6J小鼠及MYO9B基因敲除小鼠(F4代纯合小鼠01#)进行恶性胸腔积液模型实验。
1、恶性胸腔积液小鼠模型的构建
基于野生型C57BL/6J小鼠和MYO9B基因敲除小鼠(F4代纯合小鼠01#)按照文献“Stathopoulos GT et al.,J Natl Cancer Inst,2008；Stathopoulos GT et al.,Am JRespir Crit Care Med,2010；Wu XZ et al.,Am J Respir Cell Mol Biol,2017”中的方法构建恶性胸腔积液小鼠模型，分别得到野生型MPE小鼠模型和MYO9B基因敲除MPE小鼠模型。具体步骤如下：当小鼠进入深麻状态后，用灭菌胶布固定小鼠四肢，使其处于仰卧位，剪去小鼠右前侧胸壁的毛发，然后依次用碘伏和75％的酒精对小鼠右前侧胸壁的皮肤进行消毒。在小鼠剑突右上45°约1cm处将皮肤剪开一处约5mm长的小口，然后钝性逐层分离皮下筋膜和肌肉直至暴露肋骨。向小鼠胸膜腔内接种肿瘤细胞：在直视下用100μl量程的微量注射器抽取50μl小鼠Lewis肺癌细胞悬液(1.5*105/只，PBS缓冲液)，并通过肋间隙向小鼠胸膜腔内注入肿瘤细胞悬液。用尼龙线依次缝合肌肉层和表皮层，然后用75％的酒精消毒伤口。最后等待小鼠苏醒，并放回笼中。
2、恶性胸腔积液小鼠模型的胸腔积液量测定
小鼠模型建立14天后，麻醉并处死小鼠，用胶带将小鼠固定于仰卧位，再用75％酒精消毒胸腹部，在腹中线做一“T”型切口，翻开肝脏可见胸膜腔，内有血性胸腔积液(图3)。采用1mL量程的注射器，最小分度值0.01mL。手持注射器，针头穿刺隔膜，小心吸取胸腔积液，排空注射器内气泡，按注射器所示读数，记录胸腔积液体积。
结果如图3所示。结果显示：野生型MPE小鼠模型(n＝10)的胸腔积液量为0.61±0.01mL(mean±SEM)，MYO9B基因敲除MPE小鼠模型(n＝10)的胸腔积液量为0.26±0.05mL(mean±SEM)。与野生型MPE小鼠相比，MYO9B基因敲除MPE小鼠模型的胸腔积液量明显较少，差异具有统计学意义(P<0.0001)。说明MYO9B基因缺失可以显著降低恶性胸腔积液小鼠的胸腔积液量。
序列表
<110>首都医科大学附属北京朝阳医院
<120>与恶性胸腔积液相关的靶点MYO9B及其应用
<160>5
<170>PatentIn version 3.5
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<212>DNA
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caagcgatgt catccaggat gtggtggcca gcctacacct ggatggctcg aagcactacg 360
tgctggtgga ggtgaaggag tcaggcgggg aggagtgggt gttggatgcc agcgactcac 420
ctgtacaccg agtgctactg tggcctcggc gagctcagga cgagcaccct caggaggatg 480
gctactactt cttgctgcag gaacgcaatg ctgatggcag tattcagtac ctgcccatac 540
agctgctggc tcagcctaca gctgcatgtc gcctggtaga gcgagggctg ttgccgaggc 600
ctcaagcaga ctttgatgac ctgtgcaacc tgccagagct gactgaagcc aacctgctgc 660
agaacctgaa gctgcgcttc atgcagcaaa agatctacac atacgcgggc agcatcctgg 720
tggccatcaa cccctttaag ttcctgccca tttacaaccc caagtatgtg aagatgtatg 780
agaaccaaca gctgggcaaa ctggagccac atgtgttcgc tctggccgat gtagcctact 840
acgccatgct gcgcaagcac gtgaaccagt gtatcgtcat ctctggtgag agtggctctg 900
gcaagacaca gagcaccaac ttcctcatcc actgcctcac agcgctcagc cagaagggct 960
atgccagtgg cgtcgaaagg accatcctgg gagcagggcc tgtgctggag gcttttggga 1020
atgccaagac agcccacaac aacaactcca gccgcttcgg gaagttcatc caagtcaact 1080
acctagaaaa tggcattgtg aggggagctg ttgtggaaaa ataccttctt gaaaagtctc 1140
gcctggtttc ccaggagaag gatgagcgga actaccatgt gttttattat ctgctgctgg 1200
gtgtcagtga ggaggagcgc ctggaatttc agctgaagca gcctcaagac tatttctacc 1260
tcaaccagca taacttgaat attgaagatg gagaagacct caaacatgac tttgaaaggc 1320
ttcagcaggc catggagatg gtgggcttcc tgcctgccac caagaagcag atcttctctg 1380
tcctctcagc catcctgtac cttggcaatg tcacctacaa gaagagagcc acaggccgag 1440
atgaaggcct ggaggtcggt cctccagagg tgttggacac cctctcccag ctcttaaagg 1500
taaagcggga gaccctggtg gaggtcttaa ccaagagaaa aacagttaca gtcaatgaca 1560
aactcatcct gccttacagc ctcagtgagg ccataactgc acgagactcc atggccaagt 1620
ccctatacag tgccctattt gactggattg tgctaaggat caaccacgcc ctcctcaaca 1680
agaaggacat ggaagaggct gtttcctgct tgtccattgg cgtcctggac atctttggat 1740
ttgaggactt cgaaaggaat agctttgagc agttttgcat caactatgcc aatgagcagt 1800
tgcagtacta cttcacccag cacatcttca agctggagca ggaggagtac cagggtgagg 1860
gcatctcgtg gcacaacatt gactacaccg acaacgtggg ctgtatccac ctcatcagca 1920
agaagcccac tggcctcttc tacctgctgg acgaggagag caacttccca catgccacaa 1980
gccacacttt gctggccaag ttcaagcagc agcatgagga caataagtac ttcctgggca 2040
caccagtcct ggagcccgcc ttcatcatcc agcacttcgc gggcagagtg aaataccaga 2100
tcaaggactt ccgggagaag aacatggact acatgcggcc tgacatcgtg gcactgctaa 2160
ggggcagtga cagctcctat gtgcgccagc tcattggcat ggacccggta gctgtgttcc 2220
gctgggctgt actacgagca gccatcaggg ccatggctgt gctgcgggag gctgggcgcc 2280
tgcgtgcaga gagagcggag aaggcagcag gtataagtag ccctgccact cgaagtcaca 2340
tggaagagct accaagagga gccagtaccc cttcagaaaa actgtaccgc gatttgcata 2400
accaaatcat caagagcctc aaaggactgc catggcaggg cgaggacccg aggaggcttc 2460
tccagtccct cagtctgttc cagaagcccc gcacctcctt cctgaagagt aaaggtatca 2520
aacaaaagca gatcattccc aagaacctgc tggactcgaa gtccctgagg ctcatcatca 2580
gcatgacact gcatgaccga actaccaagt cactgctgca cctgcacaaa aagaagaagc 2640
cacctagcat cagtgcacag ttccagacat ctcttaacaa gctgttggag gcactgggca 2700
aggccgagcc cttcttcatc cgctgcatcc gctccaatgc cgagaagaag gaactttgct 2760
ttgatgatga actggtgctg cagcaactgc gctacacagg catgctagag actgtgcgca 2820
tccgacgctc tggctacagc gccaagtaca ccttccagga cttcacggag cagttccagg 2880
tgttgctgcc caaggatgtc cagccctgta gggaggccat tgctgccctg ctggagaagc 2940
tgcaggtgga caggcagaac taccagattg gaaagacgaa ggtcttcctg aaggagacag 3000
agcgtcagac cctgcaggag aagctgcatg gtgaggtcct gcgtagaatc ctgcagctgc 3060
agagttggtt ccgtatggtg ctggaacgca agcactttgt acagatgaag catgctgcct 3120
tgaccatcca ggcctgctgg cggtcttacc gtgtgcgccg tgcactggaa aggacgcagg 3180
cagctgtgta cctgcaggct gcctggaggg gctacctgca gagacaggcc taccaccacc 3240
agaggcatag catcatccgc ctgcagagcc tctgccgtgg ccacctgcag cgcaggagct 3300
tcagccagat ggtgtcagag aagcagaagg cagagcaagc cagggaggca gcaggaggaa 3360
agctgtcaga gggtgagcct ggccccgtgg ccgctgggga gcagctatct gagcaccctg 3420
tggaagaccc tgagagcctg ggtgtggagg ctgaaacctg gatgaacaag tccccagacg 3480
gcatgtcacc taagaaggag acacccagcc cagagatgga gaccgcagcc caaaagacag 3540
tgccagctga aagtcatgag aaagtctcca gtagccgaga gaagcgagag tcacggcggc 3600
aacgagggtt ggagcatgtt gaacgacaga ataaacacat ccaatcctgc agggaggaga 3660
gcagcaccca ccgagaacct tccagaaggg caagcctgga aataggggaa agcttccctg 3720
agggcacaaa gggacccaga gaagatggac ttgaggcatg gactgagacc acagccccct 3780
ctagttcaaa gcaggcacag gttgtgggag acccacctgg gagtcccagt cccgtgcaga 3840
ggcccaccac cctggcccta gacagtaggg ttagcccaat gctccccagc agctccctgg 3900
aggttagccc agtgctcccc agcagctccc tggaatcccc caaagataag gacaaggatg 3960
agagcagcac caaggctcag gacaagcccg agagtcccag tggctccacc cagatccaac 4020
gataccaaca cccagacaca gagcggctgg ccactgctgt agagatatgg cgaggcaaga 4080
agcttgccag tgccgtgctg agccaatccc tggacctgag tgagaagcac cgggctacag 4140
gggcagccct gactcccaca gaggagaggc gcatctcttt ctccaccagt gacgtctcca 4200
agctgtcccc agtcaaggta cagacttcag ctgaaatcga tggggacttt agcagcaaga 4260
agccatccat ccataagaag aagtcaggag atccatccgc tggtcctgat gcaggcctgt 4320
ctccaggctc ccagggtgac tctaaatctg catttaagcg gctcttcctg cacaaagcca 4380
aggataagaa gcccagcctg gagggtgtag aggagacaga gagcaatgga gggcaggctg 4440
cacaggagac cccggccagg aagactctag acgtaccttc tagccagcag caccgccata 4500
ccacaggtga gaagccccta aaagggaaga agaaccgaaa tcgcaaagtt ggccagatca 4560
cagtgtccga gaagtggcga gagtcagtgt tccgtaagat cactaatgcc aatgagctca 4620
agtttctgga cgagttcctg ctcaacaagg tgaatgacct tcgctcacag aagacaccca 4680
tcgaaagctt gttcattgag gccactgagc gcttcaggag caacatcaag accatgtatt 4740
cggtgcctaa tgggaagatc catgtaggct acaaggacct gatggagaac taccagatcg 4800
ttgtcagtaa cctggctgcc gagcgtgggg agaaggacac caatctggtc ctcaatgtct 4860
tccagtcact gctggatgag ttcacccgca gctacaacaa gactgacttt gagcgggcca 4920
agcagagcaa agcccagaag aagaagcgga agcaggagcg tgctgtccag gaacacaatg 4980
gacatgtgtt tgccagctac caggtgaaca ttccacagtc atgtgagcag tgtctgtcct 5040
acatctggct catggacaag gctctactgt gcagtgtgtg caagatgacc tgccacaaga 5100
aatgcgtgca caagattcag agctattgct cctacactgg aaggaggaag agtgagctgg 5160
gtgccgaacc aggccacttc ggtgtgtgtg tagacagcct gaccagtgac aaggcctccg 5220
tgcccattgt gctggagaag cttctggaac acgtagagat gcatggcctg tacactgagg 5280
gcctttaccg caagtcagga gctgccaacc ggacacggga attacgccag gcactgcaga 5340
cagaccctgc tgcagttaag ctggaagact tccctatcca cgctatcacc ggggtcctga 5400
agcaatggct tcgtgagctg cctgagccac tcatgacttt tgcccagtat ggagatttcc 5460
tcagggctgt tgagcttcca gagaagcagg agcagctgtc tgccatctat gcagtcctgg 5520
accacctgcc agaagccaac cacacctccc tggagcgact catcttccac cttgtcaaag 5580
tggccctgct tgaagatgtg aaccgcatgt ctccgggagc tctagctatc atctttgcac 5640
cctgcctgct tcgctgccct gacaactccg accccctgac cagcatgaag gatgtactga 5700
agatcaccac gtgtgtggag atgctcatca aagaacagat gaggaagtac aagatgaaga 5760
tggaggaaat caaccacctg gaggctgctg agagcattgc attccgcagg ctctccctgt 5820
tgaggcagaa tgctccgtgg cctctcaaac tggggttttc atcaccctat gagggggtcc 5880
ggatcaaaag ccccaggacc ccagtggtcc aagacctgga gctgggggct ctccccgagg 5940
aggctgcagg tggcgacgag gaccgagaaa aggagattct catggagagg atccagtcca 6000
tcaaggaaga gaaggaggac atcacatatc gactgccgga gctggaccca cggggttctg 6060
atgaggagaa ccttgactca gagacatcgg ccagcactga gagcctgctg gaggagaggg 6120
gcgtgcgggg ggccgtggaa gggccccccg cacctgctct cccctgcccc atttcgccca 6180
ccctgagtcc cctccccgag gccgccgccc ctccacgagg aaggccgaca tccttcgtca 6240
cggtcagagt gaagacacct cggaggaccc ccatcatgcc catggccaat atcaagctcc 6300
ctccgggcct gcccttgcac ctgacaagct gggcacctgc tctccaggag gctgttgttc 6360
cagtgaagcg ccgagagcca cctgcccgca gacaggacca ggtacattcc gtatacatcg 6420
cccctggggc tgacctgcca tcacagagta cactgatagc cctggaccat gataccatac 6480
ttcctgggac caagcgcagg tattcggacc cccctaccta ctgcctgccc cccagctccg 6540
gccaggccaa tggctgagga ccatgactgg cagtctgcat ctcctaacat ccccgaactg 6600
gcatcccagc tgtggagctg gccttcactt tctgagaagg atctagaatg aaaagctccc 6660
aaagggatgc agtggccagc tctgtgtgtt gtggagactg ggagctgctg gccaggagcc 6720
atcagagccc caacctgcac agcagtggct cctttgtcct ttcagtaact gtttctcttt 6780
ttgtggttta cataactttt aagttcataa cagccttaat ggaggaccaa acttttgtat 6840
ttgtatgtct gaacttttat attaactctg cacccttgta acctggacat gggcagggca 6900
agcctgcaaa gtggacatgt gggctacaga tgactgctgc actcactgca tagtggtaga 6960
gagtgaactc acaggacgtc tgtccatctt gaatgcctcc cagcagtagt catctgccca 7020
gagaaccttc cagagattgc tggagctttc cacagctgaa ggcaggacag gagtgggaag 7080
tccctgagtg ccagggaagc ctgaatgtag cttacagctc tgcccactgt gcctgtgaaa 7140
tgcacggagc cagggacttg gaacctttag gaacaatcag tgcatccggt gacagcctgg 7200
gttctttaga ggctggctct cttctcaggc tctacccagt cctggagaca aggaagcccc 7260
acaggaggtg tgaaataaaa gtacttgaga agggtt 7296

Claims (10)

1.如下1)-5)中任一种应用：
1)抑制MYO9B蛋白活性的物质在制备治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用；
2)抑制MYO9B蛋白活性的物质在制备降低或减少恶性胸腔积液患者胸腔积液量的产品中的应用；
3)抑制或沉默MYO9B基因表达的物质在制备治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用；
4)抑制或沉默MYO9B基因表达的物质在制备降低或减少恶性胸腔积液患者胸腔积液量的产品中的应用；
5)MYO9B蛋白及其相关信号通路作为靶点在开发或设计治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制MYO9B蛋白活性的物质为抑制MYO9B蛋白合成或促进MYO9B蛋白降解或抑制MYO9B蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物；
或，所述抑制或沉默MYO9B基因表达的物质为干扰MYO9B基因表达的物质或敲除MYO9B基因的物质或突变MYO9B基因的物质。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述敲除MYO9B基因的物质为CRISPR/Cas9系统；
或，所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；
或，所述sgRNA1识别的靶序列为序列表中的序列1所示的DNA分子；
或，所述sgRNA2识别的靶序列为序列表中的序列2所示的DNA分子。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述sgRNA1为序列表中序列3所示的RNA分子；
或，所述sgRNA2为序列表中序列4所示的RNA分子。
5.一种产品，其活性成分为权利要求1-4中任一所述的抑制MYO9B蛋白活性的物质或抑制或沉默MYO9B基因表达的物质；
所述产品的功能为治疗或辅助治疗恶性胸腔积液或降低或减少恶性胸腔积液患者胸腔积液量。
6.一种转基因小鼠的制备方法，包括如下步骤：基于CRISPR/Cas9系统对小鼠基因组中的MYO9B基因进行编辑，进而使所述小鼠基因组中的MYO9B基因功能丧失，即得到所述转基因小鼠。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNA1和sgRNA2；
或，所述sgRNA1识别的靶序列为序列表中的序列1所示的DNA分子；
或，所述sgRNA2识别的靶序列为序列表中的序列2所示的DNA分子；
或，所述sgRNA1为序列表中序列3所示的RNA分子；
或，所述sgRNA2为序列表中序列4所示的RNA分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括使用所述sgRNA1、所述sgRNA2和Cas9 mRNA的步骤；
或，所述sgRNA1、所述sgRNA2和所述Cas9 mRNA的质量比为(1-2):(1-2):2；
或，所述sgRNA1、所述sgRNA2和所述Cas9 mRNA的质量比为1:1:2。
9.制备权利要求6-8中任一所述的转基因小鼠的产品，其包括权利要求6-8中任一所述的sgRNA1、sgRNA2和Cas9 mRNA。
10.如下M1)或M2)或M3)所述的应用：
M1)权利要求6-8任一所述的方法制备得到的转基因小鼠在作为用于研究恶性胸腔积液发生发展机制和/或预后的小鼠模型中的应用；
M2)权利要求6-8任一所述的方法制备得到的转基因小鼠或权利要求9所述的产品在制备用于研究恶性胸腔积液发生发展机制和/或预后的小鼠模型中的应用；
M3)权利要求6-8任一所述的方法制备得到的转基因小鼠或权利要求9所述的产品在制备和/或筛选治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的药物中的应用。
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