CN109943593B

CN109943593B - Mir3061基因Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型构建方法与应用

Info

Publication number: CN109943593B
Application number: CN201910240768.9A
Authority: CN
Inventors: 刘特; 郑锦; 陈川; 郁志华; 林佳佳
Original assignee: SHANGHAI GERIATRIC INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE
Current assignee: SHANGHAI GERIATRIC INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2039-03-28
Also published as: CN109943593A

Abstract

本发明公开了Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法与应用。所述构建的小鼠基因为Rosa26^LSL/+，本发明首次提供的构建方法，未见任何国内外文献报道。为POF发病机制的研究和药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。本发明还提供了所述小鼠模型在筛选制备检测/治疗生殖发育疾病药物，以及检测/治疗卵巢颗粒细胞的老化和凋亡疾病药物中的应用。本发明方法构建的小鼠模型为生殖发育遗传学和制备检测/治疗卵巢疾病药物以及相关药物筛选提供有效的实验动物模型，有很好的实用价值，并有良好的医学临床应用前景和较大的社会效益。

Description

Mir3061基因Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及利用CRISPR/Cas9技术，获得可进行条件性过表达Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型构建方法与应用。

背景技术

卵巢早衰(POF)是导致女性不孕的主要原因之一，其很大程度上与卵巢颗粒细胞的老化和凋亡直接导致各级卵泡质量下降有关。由于目前缺乏靶向卵巢颗粒细胞转基因小鼠模型，严重制约了POF的机制研究和有效药物的研发。本发明通过RNA-seq高通量测序发现miR-3061在POF小鼠卵巢颗粒细胞内显著降低表达。体外实验也证实，过表达miR-3061会显著促进原代小鼠卵巢颗粒细胞的老化和凋亡。CRISPR/Cas9技术：一种基因编辑技术，通过对靶向基因进行特定DNA修饰，以获取相应的结果的技术。Mir3061基因：microRNA3061基因，microRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与生物体转录后基因表达调控。Rosa26：基因Gt(ROSA)26Sor的缩写为Rosa26。本发明进一步研究发现miR-3061与卵巢颗粒细胞存在关联，利用CRISPR/Cas9技术构建Rosa26定点miR-3061基因Cre-loxP条件性敲入小鼠模型，成功构建C57BL/6J-Gt(ROSA)26Sor^em(EF1a ^{-Mir3061)1Smoc}小鼠，对研究卵巢早衰提供了实验动物模型，从而进一步用于筛选制备检测/治疗卵巢疾病药物有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计利用CRISPR/Cas9技术构建Rosa26定点miR-3061基因Cre-loxP条件性敲入小鼠模型及其应用。为POF发病机制的研究和药物设计及药效评价提供有效的实验动物数据。本发明方法所述构建得到的模型的小鼠基因为Rosa26^LSL/+，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了利用CRISPR/Cas9技术构建Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，该方法包括如下步骤：

A、确定小鼠5号和3号染色体上的Rosa26基因所在位点为site1如SEQ ID NO：1所示，序列表2，

设计gRNA1的设计识别位点如SEQ ID NO：2所示，序列表3；

B、构建表达gRNA1的表达载体；

C、将步骤B得到的表达gRNA1表达载体，以及含Cas9基因的表达载体共转染C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；经长片段PCR鉴定，共获得正确同源重组的F0代小鼠；

D、F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠。进一步地，利用CRISPR/Cas9技术构建Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，步骤C中PCR鉴定的检测引物序列为，序列表4：

P1:atggcgtgttttggttggcgtaag(SEQ ID NO：3)

P2:tttttgggggtgatggtggtc(SEQ ID NO：4)。

步骤C中PCR鉴定的检测引物序列为，P1为序列表4，P2为序列表5。

更具体的构建方法，包括下列步骤：

(1)通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)，该载体包含3.3kb 5’同源臂、(倒置polyA-EGFP、loxp-loxp2272-EF1a-promoter-loxp-loxp2272)、Mir3061-polyA、3.3kb 3’同源臂；

(2)将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；经长片段PCR鉴定，共获得3只正确同源重组的F0代小鼠；

(3)F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得5只阳性F1代小鼠。

本发明方法中，Mir3061基因Rosa26位点条件性过表达杂合子小鼠无明显异常。倒置的loxp-loxp2272-EF1a-promoter-loxp-loxp2272表达框的存在阻止了下游目的基因Mir3061的转录。

目的基因Mir3061的表达部位及效率，取决于Cre表达的组织类型和效率。Mir3061基因Rosa26位点条件性过表达小鼠与Cre小鼠交配后，在其后代双阳性小鼠中，Cre表达的组织和细胞类型，倒置的loxp-loxp2272-EF1a-promoter-loxp-loxp2272表达框将被转正，目的基因Mir3061在EF1a启动子的驱动下，实现高表达。

过表达目的基因名称(MGI号)：Mir3061(4834233)

目的基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary？db＝core；g＝ENSMUSG00000092870；r＝11:52126746-52126836；t＝ENSMUST00000175129

插入位点基因名称(Ensembl)：Gt(ROSA)26Sor(ENSMUSG00000086429)，简称：Rosa26

插入位点目的基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary？db＝core；g＝ENSMUSG00000086429；r＝6:113067428-113077333

插入位点染色体位置(Ensembl)：Chromosome 6:113,076,031

本发明通过上述构建方法获得的小鼠基因型为Rosa26^LSL/+。

本发明首次提供了Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型及其构建方法，未见任何国内外文献报道。本发明方法构建的小鼠模型为生殖发育遗传学和筛选制备检测/治疗卵巢疾病药物以及相关药物筛选提供有效的实验动物模型，具有良好的医学临床应用前景，在制备检测/治疗卵巢疾病药物中有很大的应用价值，有较大的社会效益。

附图说明

图1：体外转录Cas9、gRNA电泳结果(实施例1，以下同)

1:Mir3061guide RNA1；M：DL2000maker(Takara)

a:pXT7-Cas9质粒；b:线性化pXT7-Cas9质粒；

c:Cas9 mRNA；d:1kb DNA maker(Thermo)

图2：打靶载体质粒图谱

图3：打靶载体酶切鉴定电泳图

1:B公路酶切鉴定结果，理论条带大小为2.6kb、5.5kb、8.0kb；

M：1kb DNA ladder。

图4：同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定电泳图6、11、14为阳性F0小鼠，wt为野生型对照；M为1kb DNA marker,marker左侧为5’同源臂鉴定结果，marker右侧为3’同源臂鉴定结果。

图5：F1代小鼠5’同源臂和3’同源臂PCR鉴定电泳图

F1代小鼠5’同源臂(Marker左侧)和3’同源臂(Marker右侧)PCR鉴定电泳图

(数字：F1代小鼠编号；wt：野生型对照；M：1kb DNA ladder)

图6：F1代小鼠5’同源臂PCR鉴定测序比对结果

1#测序反应比对结果

图7：2#测序反应比对结果：

图8：3#测序反应比对结果

图9：4#测序反应比对结果

图10通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)，该载体包含3.3kb 5’同源臂、(倒置polyA-EGFP、loxp-loxp2272-EF1a-promoter-loxp-loxp2272)、Mir3061-polyA、3.3kb 3’同源臂(实施例2)

具体实施方式

实施例1

本发明利用CRISPR/Cas9技术，获得可进行条件性过表达Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法。

(一)实验动物

5周龄健康的C57BL/6型小鼠(体重在18±2g)，雌雄各100只，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，经隔离饲养一周后即可达到实验要求的6周龄；6～8周龄健康的ICR小鼠60只，雌雄各半，体重在24±2g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，小鼠均在SPF级环境下喂养，严格按照动物饲养环境管理规定，保证每天温度在22℃，湿度40％～60％，动物房内光照时间和黑暗时间各半，动物实验所有相关操作处理严格遵循实验动物相关管理条例。

(二)实验试剂

Cas9Nuclease(NEB美国)；Premix TaqTM PCR酶(TAKARA日本)；DNA纯化回收试剂盒(天津TIANGEN中国)；注射用Cas9 mRNA(北京百奥生物中国)；短链RNA纯化试剂盒(Invitrogen美国)；孕马血清(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)(宁波第二激素厂中国)；KSOM培养液(Millipore美国)；透明质酸酶、M2、KSOM培养基(Sigma美国)；小鼠基因组DNA提取试剂盒(成都嘉诚中国)；水合氯醛(浙江嘉之源中国)。

构建方法包括下列步骤：

(1)敲入位点上下游序列信息

Cas9和gRNA体外转录结果(见表1)

(表1)

gRNA	序列(5’-3’)
		gRNA1	GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG

体外转录Cas9、gRNA电泳结果(见图1)

图1：体外转录Cas9、gRNA电泳结果。

(2)同源重组质粒构建同源重组质粒图谱(见图2)

图2：打靶载体质粒图谱

表2：各元件名称详解

同源重组质粒酶切鉴定(见图3)

图3：打靶载体酶切鉴定电泳图。

1:B公路酶切鉴定结果，理论条带大小为2.6kb、5.5kb、8.0kb；

M：1kb DNA ladder。

(3)F0代小鼠基因型鉴定

经受精卵显微注射，本发明共获得44只F0代小鼠。通过长片段PCR的方式，对F0代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，该项目共获得4只正确同源重组的阳性F0代小鼠。

同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案：

5’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.7kb片段，阴性基因组应扩增出7.0kb片段；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出4.6kb片段，阴性基因组无产物。

同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定结果

双臂同源重组阳性的F0代小鼠为6、11、14号，长片段PCR鉴定电泳结果如图4所示：

图4：同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定电泳图。

6、11、14为阳性F0小鼠，wt为野生型对照；M为1kb DNA marker,marker左侧为5’同源臂鉴定结果，marker右侧为3’同源臂鉴定结果。

同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定方法

表3引物信息：

引物	序列5'-->3'	引物类型
			I	atggcgtgttttggttggcgtaag	Forward
II	tttttgggggtgatggtggtc	Reverse

反应体系：

*PrimeStar GXL(TaKaRa，Code No：R050A)

反应条件：

(4)同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定方法

表4引物信息：

引物	序列5'-->3'	引物类型
			III	TTGCTGCTTCAATGATGAGTGT	Forward
IV	tctggtgtgggtgatgggatga	Reverse

反应体系：

*PrimeStar GXL(TaKaRa，Code No：R050A)

反应条件：

F1代小鼠获得及基因型鉴定

F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代小鼠。经PCR鉴定及测序确认，共获得阳性F1代小鼠5只，号码为：10、15、16、18、19号。F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定

PCR鉴定策略及方法同4.3F0代小鼠鉴定部分，F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定电泳结果如图6所示。PCR鉴定阳性小鼠为：10、15、16、18、19号；经测序确认均为阳性。(见图5)

图5：F1代小鼠5’同源臂(Marker左侧)和3’同源臂(Marker右侧)PCR鉴定电泳图。

(数字：F1代小鼠编号；wt：野生型对照；M：1kb DNA ladder)

F1代小鼠PCR鉴定测序比对结果

F1代阳性小鼠PCR鉴定产物测序，共进行了4个测序反应。测序反应对应的区域，如图7所示。其中，5’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：1、2；3’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：3、4。

以10号阳性小鼠为例

F1代小鼠5’同源臂PCR鉴定测序比对结果

1#测序反应比对结果：图6

Sbjct为目的序列R26-e(EF1a-Mir3061)Recombinated Genomic DNA sequence)，

Query为测序结果。

2#测序反应比对结果：图7

Sbjct为目的序列R26-e(EF1a-Mir3061)Recombinated Genomic DNA sequence)，

Query为测序结果。

F1代小鼠3’同源臂PCR鉴定测序比对结果

3#测序反应比对结果：图8

Sbjct为目的序列R26-e(EF1a-Mir3061)Recombinated Genomic DNA sequence)，

Query为测序结果。

4#测序反应比对结果：图9

Sbjct为目的序列R26-e(EF1a-Mir3061)Recombinated Genomic DNA sequence)，

Query为测序结果。

F1代阳性小鼠编号和基本信息

F1代阳性小鼠编号和基本信息见表5。

表0：F1代阳性小鼠基本信息

(5)PCR鉴定

表6

PCR鉴定结果发现杂合子小鼠呈现阳性表现。

本发明通过上述构建方法获得的小鼠基因型为Rosa26^LSL/+。

实施例2

一、实验动物

二、实验试剂

Cas9 Nuclease(NEB美国)；Premix TaqTM PCR酶(TAKARA日本)；DNA纯化回收试剂盒(天津TIANGEN中国)；注射用Cas9 mRNA(北京百奥生物中国)；短链RNA纯化试剂盒(Invitrogen美国)；孕马血清(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)(宁波第二激素厂中国)；KSOM培养液(Millipore美国)；透明质酸酶、M2、KSOM培养基(Sigma美国)；小鼠基因组DNA提取试剂盒(成都嘉诚中国)；水合氯醛(浙江嘉之源中国)。

三、实验方法

1、Cas9 mRNA、gRNA和donor vector制备

通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)，该载体包含3.3kb 5’同源臂、(倒置polyA-EGFP、loxp-loxp2272-EF1a-promoter-loxp-loxp2272)、Mir3061-polyA、

3.3kb 3’同源臂；如图10所示。

2、C57BL/6供体雌鼠受精卵准备

(1)于下午17：00～18:30之间给供体雌鼠腹腔注射PMSG 5IU。

(2)48小时后，给每只雌鼠腹腔注射hCG(10IU/mL)0.5mL,将注射后的雌鼠与雄鼠进行合笼，次日上午10:00挑栓。

(3)脱颈处死供体见栓雌鼠，取其输卵管，放入提前备好的M2培养液滴的培养皿中。

(4)体视显微镜下用注射器针头撕破壶腹部，收集释放出来的受精卵-卵丘细胞复合体。

(5)将收集到的细胞用口吸管转移至透明质酸酶液滴中，37℃消化3～5min后，放入平衡好的KSOM液滴中，37℃温箱孵育，过夜培养，保证温箱内为5％的CO2环境。

3、显微注射Cas9 mRNA、gRNA、donor vector混合物

将合成后纯化的gRNA、Cas9 mRNA、donor vector稀释后等量混合，吸取少量RNA混合物加入注射针头中，将针头装入显微注射臂上，取过夜培养的受精卵细胞在M2培养基中洗三次后置于显微注射平台上进行显微注射。将注射成功的受精卵细胞，放入新的KSOM培养液中培养0.5h。

4、胚胎移植

(1)取6周龄的发情ICR雌鼠，与结扎的雄鼠合笼，次日受精卵细胞显微注射之后挑栓，于下午进行胚胎移植。

(2)装好移卵管，取出温箱中注射后的胚胎，在M2培养液中洗三遍后待用，吸入一定量M2培养基，吸入空气，再吸入要回植的胚胎，再吸入一段空气后，吸入M2培养基，避免虹吸作用，控制移卵管的液体流出。

(3)挑选见栓的ICR小鼠，称重后按每千克体重5mg剂量进行腹腔给药麻醉。

(4)待母鼠失去知觉后，将其侧卧保定，背腹部除毛，酒精消毒后置于纸巾上。体式显微镜下在小鼠最后一根肋骨下皮肤切开一个1cm左右的小创口。

(5)根据小鼠的解剖生理位置找到卵巢和输卵管部位，剪开腹壁，用弹性脂肪镊夹持脂肪组织，在体视显微镜下找到输卵管壶腹部。

(6)用注射器针头轻轻刺破输卵管壶腹部，将移卵管尖端刺入壶腹部，将胚胎吹入输卵管壶腹部，移植后将组织回填，缝合伤口，同样的操作移植对侧输卵管壶腹部。

(7)将母鼠放置到保温台上待其自然苏醒后，放回鼠笼并记录日期、移卵数等信息。待其生产后鉴定。

5、F0代阳性鼠的基因型鉴定

(1)ICR受体雌鼠胚胎回植后将其单独饲养，水料充足妊娠三周后，观察产仔情况并做好记录工作。

(2)产仔后，在每只小鼠尾部剪取0.5～1cm组织,加入400μL的BufferTL1溶液。

(3)再向混合液中加入40μL的蛋白消化酶Protease Plus，65℃水浴半小时以上，注意每隔5分钟混匀一次。

(4)消化至管内只剩毛发、骨骼后，加入400μL Buffer TL2溶液，待管内出现分层现象，颠倒混匀。

(5)水浴锅调至65℃，水浴10min，13400×g离心8min。

(6)吸取上清至离心柱，13400×g离心2min后弃液，尽量避免将下层沉淀吸入离心柱中。再加入500μL Buffer PW,13400×g离心1min后弃液。

(7)用700μL Buffer WB洗一次离心柱，13400×g离心1min后弃液。

(8)用700μL Buffer WB再洗一遍。13400×g空离1min。

(9)丢弃下层收集管换成新的1.5mL EP管，用100μL Buffer EB，13400×g离心1min洗脱收集DNA。

(10)将回收液重新加入硅胶膜上,13400×g离心1min再次洗脱。

(11)用酶标仪检测提取的基因组DNA浓度和OD260/280值。

(12)以提取的小鼠组织DNA为模板，进行PCR扩增并送测序。

6、获取F1代小鼠

选取F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配得到F1代小鼠。F1代小鼠基因鉴定方法与F0代小鼠相同。

四、实验结果

1获得的小鼠情况

F0代小鼠获得44只，其中3只阳性结果，F1代小鼠获得阳性结果5只。

2基因敲入鼠的基因型鉴定结果

双臂同源重组阳性的F0代小鼠为6、11、14号，长片段PCR鉴定电泳结果同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定电泳。

6、11、14为阳性F0小鼠，wt为野生型对照；

M为1kb DNA marker,marker左侧为5’同源臂鉴定结果，marker右侧为3’同源臂鉴定结果。

F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定电泳结果PCR鉴定阳性小鼠为：10、15、16、18、19号；经测序确认均为阳性。

F1代小鼠5’同源臂(Marker左侧)和3’同源臂(Marker右侧)PCR鉴定电泳(数字：F1代小鼠编号；wt：野生型对照；M：1kb DNA ladder)

序列表

<110> 上海市中医老年医学研究所

<120> Mir3061基因Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型构建方法及其应用

<130> /

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5651

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

gccagcgggg gcggcgagga ggcgctccca ggttccggcc ctcccctcgg ccccgcgccg 60

cagagtctgg ccgcgcgccc ctgcgcaacg tggcaggaag cgcgcgctgg gggcggggac 120

gggcagtagg gctgagcggc tgcggggcgg gtgcaagcac gtttccgact tgagttgcct 180

caagaggggc gtgctgagcc agacctccat cgcgcactcc ggggagtgga gggaaggagc 240

gagggctcag ttgggctgtt ttggaggcag gaagcacttg ctctcccaaa gtcgctctga 300

gttgttatca gtaagggagc tgcagtggag taggcgggga gaaggccgca cccttctccg 360

gaggggggag gggagtgttg caataccttt ctgggagttc tctgctgcct cctggcttct 420

gaggaccgcc ctgggcctgg gagaatccct tccccctctt ccctcgtgat ctgcaactcc 480

agtctttcta gaagatgggc gggagtcttc tgggcaggct taaaggctaa cctggtgtgt 540

gggcgttgtc ctgcagggga attgaacagg tgtaaaattg gagggacaag acttcccaca 600

gattttcggt tttgtcggga agttttttaa taggggcaaa taaggaaaat gggaggatag 660

gtagtcatct ggggttttat gcagcaaaac tacaggttat tattgcttgt gatccgcctc 720

ggagtatttt ccatcgaggt agattaaaga catgctcacc cgagttttat actctcctgc 780

ttgagatcct tactacagta tgaaattaca gtgtcgcgag ttagactatg taagcagaat 840

tttaatcatt tttaaagagc ccagtacttc atatccattt ctcccgctcc ttctgcagcc 900

ttatcaaaag gtattttaga acactcattt tagccccatt ttcatttatt atactggctt 960

atccaacccc tagacagagc attggcattt tccctttcct gatcttagaa gtctgatgac 1020

tcatgaaacc agacagatta gttacataca ccacaaatcg aggctgtagc tggggcctca 1080

acactgcagt tcttttataa ctccttagta cactttttgt tgatcctttg ccttgatcct 1140

taattttcag tgtctatcac ctctcccgtc aggtggtgtt ccacatttgg gcctattctc 1200

agtccaggga gttttacaac aatagatgta ttgagaatcc aacctaaagc ttaactttcc 1260

actcccatga atgcctctct cctttttctc catttataaa ctgagctatt aaccattaat 1320

ggtttccagg tggatgtctc ctcccccaat attacctgat gtatcttaca tattgccagg 1380

ctgatatttt aagacattaa aaggtatatt tcattattga gccacatggt attgattact 1440

gcttactaaa attttgtcat tgtacacatc tgtaaaaggt ggttcctttt ggaatgcaaa 1500

gttcaggtgt ttgttgtctt tcctgaccta aggtcttgtg agcttgtatt ttttctattt 1560

aagcagtgct ttctcttgga ctggcttgac tcatggcatt ctacacgtta ttgctggtct 1620

aaatgtgatt ttgccaagct tcttcaggac ctataatttt gcttgacttg tagccaaaca 1680

caagtaaaat gattaagcaa caaatgtatt tgtgaagctt ggtttttagg ttgttgtgtt 1740

gtgtgtgctt gtgctctata ataatactat ccaggggctg gagaggtggc tcggagttca 1800

agagcacaga ctgctcttcc agaagtcctg agttcaattc ccagcaacca catggtggct 1860

cacaaccatc tgtaatggga tctgatgccc tcttctggtg tgtctgaaga ccacaagtgt 1920

attcacatta aataaataaa tcctccttct tcttcttttt ttttttttta aagagaatac 1980

tgtctccagt agaatttact gaagtaatga aatactttgt gtttgttcca atatggtagc 2040

caataatcaa attactcttt aagcactgga aatgttacca aggaactaat ttttatttga 2100

agtgtaactg tggacagagg agccataact gcagacttgt gggatacaga agaccaatgc 2160

agactttaat gtcttttctc ttacactaag caataaagaa ataaaaattg aacttctagt 2220

atcctatttg tttaaactgc tagctttact taacttttgt gcttcatcta tacaaagctg 2280

aaagctaagt ctgcagccat tactaaacat gaaagcaagt aatgataatt ttggatttca 2340

aaaatgtagg gccagagttt agccagccag tggtggtgct tgcctttatg cctttaatcc 2400

cagcactctg gaggcagaga caggcagatc tctgagtttg agcccagcct ggtctacaca 2460

tcaagttcta tctaggatag ccaggaatac acacagaaac cctgttgggg aggggggctc 2520

tgagatttca taaaattata attgaagcat tccctaatga gccactatgg atgtggctaa 2580

atccgtctac ctttctgatg agatttgggt attatttttt ctgtctctgc tgttggttgg 2640

gtcttttgac actgtgggct ttctttaaag cctccttcct gccatgtggt ctcttgtttg 2700

ctactaactt cccatggctt aaatggcatg gctttttgcc ttctaagggc agctgctgag 2760

atttgcagcc tgatttccag ggtggggttg ggaaatcttt caaacactaa aattgtcctt 2820

taattttttt tttaaaaaat gggttatata ataaacctca taaaatagtt atgaggagtg 2880

aggtggacta atattaaatg agtccctccc ctataaaaga gctattaagg ctttttgtct 2940

tatacttaac ttttttttta aatgtggtat ctttagaacc aagggtctta gagttttagt 3000

atacagaaac tgttgcatcg cttaatcaga ttttctagtt tcaaatccag agaatccaaa 3060

ttcttcacag ccaaagtcaa attaagaatt tctgactttt aatgttaatt tgcttactgt 3120

gaatataaaa atgatagctt ttcctgaggc agggtctcac tatgtatctc tgcctgatct 3180

gcaacaagat atgtagacta aagttctgcc tgcttttgtc tcctgaatac taaggttaaa 3240

atgtagtaat acttttggaa cttgcaggtc agattctttt ataggggaca cactaaggga 3300

gaccaccatc acccccaaaa aataacttcg tataaagtat cctatacgaa gttatataac 3360

ttcgtatagg atactttata cgaagttatg cttgggtgat agttggtaaa atgtgtttca 3420

agtgatgaaa acttgaatta ttatcaccgc aacctacttt ttaaaaaaaa aagccaggcc 3480

tgttagagca tgcttaaggg atccctagga cttgctgagc acacaagagt agttacttgg 3540

caggctcctg gtgagagcat atttcaaaaa acaaggcaga caaccaagaa actacagtta 3600

aggttacctg tctttaaacc atctgcatat acacagggat attaaaatat tccaaataat 3660

atttcattca agttttcccc catcaaattg ggacatggat ttctccggtg aataggcaga 3720

gttggaaact aaacaaatgt tggttttgtg atttgtgaaa ttgttttcaa gtgatagtta 3780

aagcccatga gatacagaac aaagctgcta tttcgaggtc tcttggttta tactcagaag 3840

cacttctttg ggtttccctg cactatcctg atcatgtgct aggcctacct taggctgatt 3900

gttgttcaaa taaacttaag tttcctgtca ggtgatgtca tatgatttca tatatcaagg 3960

caaaacatgt tatatatgtt aaacatttgt acttaatgtg aaagttaggt ctttgtgggt 4020

ttgattttta attttcaaaa cctgagctaa ataagtcatt tttacatgtc ttacatttgg 4080

tggaattgta taattgtggt ttgcaggcaa gactctctga cctagtaacc ctacctatag 4140

agcactttgc tgggtcacaa gtctaggagt caagcatttc accttgaagt tgagacgttt 4200

tgttagtgta tactagttta tatgttggag gacatgttta tccagaagat attcaggact 4260

atttttgact gggctaagga attgattctg attagcactg ttagtgagca ttgagtggcc 4320

tttaggcttg aattggagtc acttgtatat ctcaaataat gctggccttt tttaaaaagc 4380

ccttgttctt tatcaccctg ttttctacat aatttttgtt caaagaaata cttgtttgga 4440

tctccttttg acaacaatag catgttttca agccatattt tttttccttt tttttttttt 4500

ttttggtttt tcgagacagg gtttctctgt atagccctgg ctgtcctgga actcactttg 4560

tagaccaggc tggcctcgaa ctcagaaatc cgcctgcctc tgcctcctga gtgccgggat 4620

taaaggcgtg caccaccacg cctggctaag ttggatattt tgttatataa ctataaccaa 4680

tactaactcc actgggtgga tttttaattc agtcagtagt cttaagtggt ctttattggc 4740

ccttcattaa aatctactgt tcactctaac agaggctgtt ggtactagtg gcacttaagc 4800

aacttcctac ggatatacta gcagattaag ggtcagggat agaaactagt ctagcgtttt 4860

gtatacctac cagctttata ctaccttgtt ctgatagaaa tatttcagga catctagagt 4920

gtactataag gttgatggta agcttataag gaacttgaaa gtggagtaac tactccattt 4980

ctctgagggg agaattaaaa tttttgacca agtgttgttg agccactgag aatggtctca 5040

gaacataact tcttaaggaa ccttcccaga ttgccctcaa cactgcacca catttggtcc 5100

tgcttgaaca ttgccatggc tcttaaagtc ttaattaaga atattaattg tgtaattatt 5160

gtttttcctc ctttagctgt ggaatgactt tttaatctat tggtttgtct agaacagtta 5220

tgttgccatt tgccctaatg gtgaaagaaa aagtggggag tgccttggca ctgttcattt 5280

gtggtgtgaa ccaaagaggg gggcatgcac ttacacttca aacatccttt tgaaagactg 5340

acaagtttgg gtcttcacag ttggaattgg gcatcccttt tgtcagggag ggagggaggg 5400

agggaggctg gcttgttatg ctgacaagtg tgattaaatt caaactttga ggtaagttgg 5460

aggaacttgt acattgttag gagtgtgaca atttggactc ttaatgattt ggtcatacaa 5520

aatgaaccta gaccaacttc tggaagatgt atataataac tccatgttac attgatttca 5580

cctgactaat acttatccct tatcaattaa atacagaaga tgccagccat ctgggccttt 5640

taacccagaa a 5651

<210> 2

<211> 344

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

actgtgaata taaaaatgat agcttttcct gaggcagggt ctcactatgt atctctgcct 60

gatctgcaac aagatatgta gactaaagtt ctgcctgctt ttgtctcctg aatactaagg 120

ttaaaatgta gtaatacttt tggaacttgc aggtcagatt cttttatagg ggacacacta 180

agggagcttg ggtgatagtt ggtaaaatgt gtttcaagtg atgaaaactt gaattattat 240

caccgcaacc tactttttaa aaaaaaaagc caggcctgtt agagcatgct taagggatcc 300

ctaggacttg ctgagcacac aagagtagtt acttggcagg ctcc 344

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 3

ggggacacac taagggagct tgg 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 4

atggcgtgtt ttggttggcg taag 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 5

tttttggggg tgatggtggt c 21

Claims

1.Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法为：利用CRISPR/Cas9技术构建Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型；该方法包括以下步骤：

A、确定小鼠5号和3号染色体上的Rosa26基因所在位点为site1如SEQ ID NO：2所示；

设计gRNA1的设计识别位点如SEQ ID NO：3所示；

B、构建表达gRNA1的表达载体；

C、将步骤B得到的表达gRNA1表达载体，以及含Cas9基因的表达载体共转染C57BL/6J小鼠的受精卵中，经长片段PCR鉴定，获得F0代小鼠；

D、F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠。

2.根据权利要求1所述Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤C中PCR鉴定的检测引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1所述Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法构建得到的小鼠模型在筛选制备检测或治疗生殖发育疾病药物中的应用。

4.根据权利要求1所述Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法构建得到的小鼠模型在筛选制备检测或治疗卵巢疾病药物中的应用。