CN105331686B - Myosin9b蛋白特异性抗体的制备及Myosin9b基因家族变化在肿瘤诊断及预后中的应用 - Google Patents
Myosin9b蛋白特异性抗体的制备及Myosin9b基因家族变化在肿瘤诊断及预后中的应用 Download PDFInfo
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- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
本发明公开了Myosin9b蛋白特异性抗体的制备及Myosin9b基因家族变化在肿瘤诊断及预后中的应用。本发明所提供的Myosin9b蛋白特异性抗体的制备及Myosin9b基因家族变化在肿瘤诊断及预后中的应用中,Myo9b的序列如序列表中序列1所示;Myo9b基因的核苷酸序列如序列2所示。实验证明,Myo9b在不同肿瘤组织中高表达,肺癌组织中的Myo9b及Myo9b基因的表达水平明显高于非肿瘤肺组织,并且肺癌患者的肺癌组织中Myo9b基因的RNA表达水平与肺癌的恶性程度正相关。Myo9b的表达水平与肺癌患者的生存时间相关,Myo9b可以作为肺癌患者肿瘤诊断及预后检测标志物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域中Myosin9b蛋白特异性抗体的制备及Myosin9b基因家族变化在肿瘤诊断及预后中的应用。
背景技术
各种肿瘤在全世界各国仍然是首要的疾病致死原因,严重威胁人类健康(Cookeet al.,2014)。世界卫生组织(WHO)公布的数据表明:在世界范围内,现在发病率最高的癌症是肺癌,2012年新增肺癌病例180万,死亡人数159万(Chen et al.,2014)。肺癌的死亡率以每年1~5%的速度逐年增长,而且在发展中国家这一趋势尤为明显。根据美国SEER(Surveillance,Epidemiology and End Results)的资料显示:美国肺癌患者确诊后的5年生存率为12%~15%;欧洲为8~12%;发展中国家为5~12%(Chen et al.,2014)。随着吸烟人数的不断上升和环境的持续恶化,肺癌发病率呈现出逐渐增高的趋势。目前,肺癌已成为我国首位恶性肿瘤死亡原因,占全部恶性肿瘤死亡的22.7%(She et al.,2013)。且发病率和死亡率仍在继续迅速上升。根据卫生部全国肿瘤防治办公室提供的资料显示:目前我国肺癌发病率每年增长26.9%。如不及时采取有效控制措施,预计到2025年我国肺癌患者将达到100万,成为世界第一肺癌大国(She et al.,2013)。肺癌的病因至今尚不完全明确。
肺癌是一种发病率高,致死性强的恶性肿瘤(Nasarre et al.,2010;Spiro andSilvestri,2005)。由于传统的肺癌检测方法特异性和灵敏性有限,因此并没有降低肺癌的病死率。近年来,肿瘤标志物由于其特异性和灵敏度高等特点,对肿瘤的诊断,治疗及预后判断提供了指导意义(Chaffer and Weinberg,2011;Friedl and Alexander,2011;Spiroand Silvestri,2005)。由于肿瘤发生发展过程的复杂性,肿瘤诊断及预后的检测还有待发展和完善。特别是高特异性的肿瘤标志物及其抗体介导的肿瘤诊断急需发展。
Myosin9是非常规肌球蛋白家族(non-conventional myosin family)的一个成员。在无脊椎动物中只含有单个Myosin9基因;而在脊椎动物中Myosin9含有两个剪切体形式:Myosin9a(Myo9a)和Myosin9b(Myo9b)。Myosin9蛋白含有头,颈和尾三部分(附图3中A)。头部是一个单头的motor结构域,含有extension和insertion模序。Motor结构域具有ATP酶活性,与ATP结合后,使ATP转化成ADP,释放能量的同时促使Myosin9沿着F-actin向前运动(Liao et al.,2010;van den Boom et al.,2007)。颈部含有IQ结构域,是Myosin轻链的结合位点,在Myosin9运动中起着杠杆作用。Myosin9尾部有一个脯氨酸富集区,一个锌指模序和一个RhoGAP(GTPase activation domain)结构域(Post et al.,1998)。Myosin9通过RhoGAP区域下调Rho依赖的信号通路。Myo9a主要在脑和睾丸组织中表达,在上皮细胞分化中起重要作用(Heasman and Ridley,2008)。而Myo9b在更广泛的组织中表达。有文献报道,在巨噬细胞中,Myo9b调节巨噬细胞的形态和运动(Hanley et al.,2010;Parsons et al.,2010;Wirth et al.,1996)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何应用申请人新发现的Myo9b基因及其有关技术及产品对与Myo9b基因有变化肿瘤患者进行诊断检测及预后分析,包括如何预测肿瘤患者预后及相应靶向治疗。
为解决上述技术问题,本发明首先提供了检测Myo9b基因是否改变或表达水平是否变化或Myo9b基因表达水平的系统在制备诊断或辅助诊断肿瘤和/或预后或辅助预后产品中的应用;
所述Myo9b的序列如序列表中序列1所示;
所述Myo9b基因的核苷酸序列如序列2所示。
上述应用中,所述检测Myo9b基因是否改变或表达水平是否变化可包括检测外周血,体液,痰液,粪便,尿液或组织分泌物或肿瘤组织中Myo9b基因的是否改变或表达水平是否变化,检测Myo9b基因是否改变或表达水平是否变化可采用以下技术:DNA测序、RNA测序、基因芯片(microarray)分析或PCR-偶联的核酸测序。
上述应用中,所述检测Myo9b表达水平的系统可包括检测Myo9b表达水平的试剂和/或仪器,如通过免疫组织化学染色或酶联免疫反应检测Myo9b表达水平所需的试剂和仪器。具体来说,检测Myo9b表达水平的系统可包括抗Myo9b的抗体和进行免疫组织化学染色所需要的其它试剂和仪器,上述检测Myo9b表达水平的系统可只由所述抗Myo9b的抗体组成,所述抗Myo9b的抗体和进行免疫组织化学染色所需要的其它试剂均可独立包装;检测Myo9b表达水平的系统可包括所述Myo9b、所述抗Myo9b的抗体和进行酶联免疫反应所需要的其它试剂和仪器,上述检测Myo9b表达水平的系统可只由所述Myo9b和所述抗Myo9b的抗体组成,也可只由所述Myo9b组成,也可只由所述抗Myo9b的抗体组成,所述Myo9b、所述抗Myo9b的抗体和进行酶联免疫反应所需要的其它试剂均可独立包装。
上述应用中,所述抗Myo9b的抗体可为Myo9b单克隆抗体和/或Myo9b多克隆抗体。所述抗Myo9b的抗体可识别序列表中SEQ ID No.1的蛋白质。所述抗Myo9b的抗体可为以序列1的第1691-1916位氨基酸所示的蛋白质为抗原得到的抗体。所述抗Myo9b的抗体可利用所述抗原免疫动物得到。所述动物可为兔(如新西兰白兔)或鼠(如大鼠或小鼠),豚鼠或其他大动物如驴,马,猪,羊等。所述抗Myo9b的抗体也可通过人源或人源化抗体表达系统得到。
上述应用中,所述抗Myo9b的抗体可为生物素或其他标记物标记[包括生物影像标记物(可为生物荧光标记物),放射性物质标记,纳米产物标记,生物毒素等(如lymphotoxin等)]的抗Myo9b的抗体。所述Myo9b的抗体也可为没有生物素或其他标记物标记的抗Myo9b的抗体。所述抗Myo9b的抗体可为标记物标记的抗Myo9b的抗体。
上述应用中,所述检测Myo9b表达水平可为检测所述Myo9b绝对表达水平或所述Myo9b相对表达水平;所述Myo9b绝对表达水平为肿瘤组织中所述Myo9b的表达水平;所述Myo9b相对表达水平为所述肿瘤组织中所述Myo9b的绝对表达水平与非肿瘤组织中所述Myo9b的绝对表达水平的比值。
上述应用中,所述检测Myo9b基因表达水平的系统可包括检测Myo9b基因是否改变或表达水平是否变化的试剂和/或仪器,如通过定量PCR检测Myo9b基因表达水平所需的试剂和/或仪器。具体来说,检测Myo9b基因表达水平的系统可包括扩增所述Myo9b基因全长或片段的引物对和定量PCR所需要的其它试剂和仪器,上述检测Myo9b基因表达水平的系统可只由所述引物对组成,所述引物对和进行定量PCR所需要的其它试剂均可独立包装。
所述引物对可为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对。
定量PCR所需要的其它试剂可包括Trizol、DNA酶I、寡聚引物(dT)和/或逆转录酶(M-MLV RT)。所述Trizol具体可为Invitrogen产品,货号为15596018。所述DNA酶I具体可为NEB公司产品,货号为M0303S。所述寡聚引物具体可为Fermentas公司产品,货号为#SO131。所述逆转录酶具体可为Invitrogen产品,货号为RTC28025-D11。定量PCR所需要的仪器可为实时定量PCR仪和/或分光光度计。所述实时定量PCR仪可为ABI公司的StepOne实时定量PCR仪。所述分光光度计具体可为Ultraspec 5300分光光度计(GE公司)。
上述应用中,所述检测Myo9b基因表达水平可为检测肿瘤组织中所述Myo9b基因相对于内参基因的相对表达量或所述肿瘤组织中所述Myo9b基因表达水平与非肿瘤组织中所述Myo9b基因表达水平的比值。
所述内参基因可为不同组织和细胞中的表达相对恒定的基因,如GAPDH基因或actin基因。
为解决上述技术问题,本发明还提供了下述A1)-A3)中任一种制备抗Myo9b的抗体所需的生物材料在制备诊断或辅助诊断肿瘤和/或预后或辅助预后产品中的应用:
A1)用于制备抗Myo9b的单克隆抗体的免疫原;
A2)用于制备抗Myo9b的多克隆抗体的免疫原;
A3)产生所述单克隆抗体的细胞系统和/或细胞外或无细胞(cell-free proteinexpression)表达系统。
上述应用中,所述免疫原可为序列1或序列1的第1691-1916位氨基酸所示的蛋白质。所述免疫原可为在Myo9b蛋白或其任一片段或其修饰物在制备过程中得到的纯化的Myo9b蛋白或其任一片段或其修饰物,或未纯化的包含Myo9b蛋白或其任一片段或其修饰物的混合物;所述免疫原也可为与Myo9b相关的合成多肽或其修饰物在制备过程中得到的纯化的与Myo9b相关的合成多肽或其修饰物,或未纯化的包含与Myo9b相关的合成多肽或其修饰物的混合物。所述免疫原可采用原核表达系统或真核表达系统制备。
上述应用中,所述产生所述单克隆抗体的细胞系统可为原核表达系统或真核表达系统。
上述应用中,所述抗Myo9b的单克隆抗体可为人源化单克隆抗体。
为解决上述技术问题,本发明还提供了下述X1或X2的应用:
X1、与所述抗Myo9b的抗体(包括人源化单克隆抗体)相关的生物材料在制备诊断或辅助诊断肿瘤和/或预后或辅助预后产品中的应用;
与所述抗Myo9b的抗体(包括人源化单克隆抗体)相关的生物材料为下述A1)-A18)中的任一种:
A1)编码所述抗Myo9b的抗体的核酸分子;
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒;
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体;
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体;
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物;
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物;
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物;
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物;
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因动物细胞系;
A10)含有A2)所述表达盒的转基因动物细胞系;
A11)含有A3)所述重组载体的转基因动物细胞系;
A12)含有A4)所述重组载体的转基因动物细胞系;
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系;
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系;
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系;
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系;
A17)含有A3)所述重组载体的无细胞(cell-free)蛋白或多肽表达系统;
A18)含有A4)所述重组载体的无细胞(cell-free)蛋白或多肽表达系统;
X2、与所述免疫原相关的生物材料在制备诊断或辅助诊断肿瘤和/或预后或辅助预后产品中的应用;
所述与所述免疫原相关的生物材料为下述B1)-B16)中的任一种:
B1)编码所述免疫原的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体;
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体;
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物;
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物;
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物;
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系;
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系;
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系;
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系;
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系;
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系;
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系;
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述应用中,所述核酸分子可以是DNA,如cDNAs、基因组DNA或重组DNAs;所述核酸分子也可以是RNAs,如mRNAs或shRNAs或siRNAs等。
上述应用中,A2)所述的含有编码所述抗Myo9b的抗体的核酸分子的表达盒(抗Myo9b的抗体基因表达盒),是指能够在宿主细胞中表达所述抗Myo9b的抗体的DNA,该DNA不但可包括启动所述抗Myo9b的抗体基因转录的启动子,还可包括终止所述抗Myo9b的抗体基因转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括增强子序列。
上述应用中,B2)所述的含有编码所述免疫原的核酸分子的表达盒(所述免疫原基因表达盒),是指能够在宿主细胞中表达所述免疫原的DNA,该DNA不但可包括启动所述免疫原基因转录的启动子,还可包括终止所述免疫原基因转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述免疫原基因表达盒的重组载体;可用现有的表达载体构建含有所述抗Myo9b的抗体基因表达盒的重组载体。
上述应用中,所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述应用中,A5)-A8)与B5)-B8)所述的微生物均可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述应用中,A9)-A12)与B9)-B12)所述的转基因植物细胞系和转基因动物细胞系均不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题,本发明还提供了以所述Myo9b作为标志物的诊断或辅助诊断肿瘤和/或预后或辅助预后的系统在制备诊断或辅助诊断肿瘤和/或预后或辅助预后产品中的应用。
为解决上述技术问题,本发明还提供了下述P1-P4中任一产品:
P1、所述检测Myo9b表达水平或Myo9b基因表达水平的系统。
P2、与所述抗Myo9b的抗体相关的生物材料;
P3、所述免疫原;
P4、与所述免疫原相关的生物材料。
本发明中,所述肿瘤可为肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、头颈部癌、肾癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨髓瘤或肉瘤。
本发明中,所述肿瘤可为世界范围内(如欧洲、亚洲、南美洲、北美洲或大洋洲)的肿瘤。
本发明中,所述肿瘤的预后可为预测所述肿瘤患者的生存质量和/或生存时间。
本发明中,可按照以下方法诊断或辅助诊断肿瘤:检测待测组织和相应的非肿瘤组织中Myo9b的表达水平,所述待测组织中Myo9b的表达水平高于非肿瘤组织中Myo9b的表达水平,所述待测组织为或候选为肿瘤组织;所述待测组织中Myo9b的表达水平低于或等于非肿瘤组织中Myo9b的表达水平,所述待测组织为或候选为非肿瘤组织。
本发明中,可按照以下方法预后或辅助预后:检测待测患者肿瘤组织中Myo9b的表达水平,所述待测患者肿瘤组织中Myo9b的表达水平越低,所述检测待测患者的生存时间越长或候选越长。申请人的实验表明,Myo9b在不同肿瘤组织中高表达,肺癌组织中的Myo9b及Myo9b基因的表达水平明显高于非肿瘤肺组织,在70%的肺癌患者中,Myo9b蛋白的表达增加,并且肺癌患者的肺癌组织中Myo9b基因的RNA表达水平与肺癌的恶性程度正相关。Myo9b的表达水平与肺癌患者的生存时间相关,Myo9b表达越高肺癌患者的生存时间越短,Myo9b高表达的肺癌患者的生存时间高于Myo9b低表达的肺癌患者的生存时间,Myo9b可以作为肺癌患者预后检测标志物。
附图说明
图1为Myo9b在肿瘤组织数据库中的表达水平。具体分析了Myo9b在乳腺癌,肺癌,胃癌,结直肠癌,食管癌和脑肿瘤中的表达水平。
图2为肺癌组织和非肿瘤肺组织中Myo9b蛋白及RNA的表达水平及肺癌患者的预后。其中,A为免疫组化染色方法检测肺癌组织和非肿瘤肺组织样本中Myo9b的蛋白表达水平,其结果显示在70%的肺癌患者中,Myo9b蛋白的表达增高;B为不同Myo9b蛋白表达水平的百分比;C为肺癌组织和非肿瘤肺组织样本中Myo9b的RNA的表达水平;D为不同分期肺癌组织中Myo9b的RNA的表达水平;E为KM-Plotter数据库中肺癌组织不同Myo9b的表达水平肺癌患者的预后。Ctr与对照均表示非肿瘤肺组织,LuCa与肺癌均表示肿瘤肺组织;low表示Myo9b低表达组,high表示Myo9b高表达组。
图3为Myo9b的序列分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的Myo9b抗体为Myo9b多克隆抗体,Myo9b多克隆抗体的制备方法如下:以序列1的第1691-1916位氨基酸所示的蛋白质为抗原免疫新西兰白兔(SinoBiological Inc产品),2-3月后取兔的腹水,进行纯化得到Myo9b多克隆抗体。在裸鼠皮下异植的人肺癌细胞形成的肿瘤中,通过免疫组化实验发现该抗体可以识别内源表达的Myo9b蛋白。当Myo9b抗体与Myo9bGAP蛋白孵育之后,该抗体不能识别Myo9b蛋白。因此,Myo9b多克隆抗体能特异性地识别Myo9b蛋白。同时Western blot证明Myo9b多克隆抗体特异性地识别细胞的Myo9b蛋白。
实施例1、Myo9b在肿瘤组织中高表达
一、Myo9b在多种肿瘤组织中高表达
Myo9b的氨基酸序列如序列表中序列1所示,Myo9b基因的核苷酸序列如序列2所示。对Oncomine数据库中肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、头颈部癌、肾癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨髓瘤和肉瘤Myo9b表达谱的数据集进行分析(http://www.oncomine.org/),结果如图1中A所示,Myo9b在不同肿瘤组织中高表达。以乳腺癌,肺癌,胃癌,结直肠癌,食管癌和脑肿瘤为例,根据数据库具体分析了在肿瘤中与对照组相比较Myo9b的mRNA表达水平,表明Myo9b在乳腺癌,肺癌,胃癌,结直肠癌,食管癌和脑肿瘤中高表达(图1中B)。
二、Myo9b在肺癌组织中高表达并可以用于检测患者的预后
1、实验材料来源及处理
肺癌组织和非肿瘤肺组织来自第四军医大学唐都医院病理室诊断后收集的60例中国人肺癌患者样本,所有样本均获得患者知情同意并遵照相关机构和国家的指导方针。将手术切除的肿瘤组织样本切成两部分,一部分迅速用液氮冻存,用以提取RNA。另一部分经10%中性福尔马林溶液固定过夜,石蜡包埋切片,根据标准方案进行免疫组化分析。
2、肿瘤组织中Myo9b表达水平的检测
2.1蛋白质水平
通过免疫组织化学染色法检测60例肺癌患者的肺癌组织和非肿瘤肺组织样本中Myo9b的蛋白表达水平,实验重复三次。
将经10%福尔马林固定、石蜡包埋并切片得到的4微米厚的肺癌组织和非肿瘤肺组织样本切片进行免疫组织化学染色分析,具体操作步骤如下:脱蜡,再水化,柠檬酸(pH值6.0)微波炉中加热10分钟进行抗原修复。用3%过氧化氢处理10分钟,封闭内源性过氧化物酶活性,接着用山羊血清30分钟阻塞性孵育。将Myo9b抗体稀释后与样本切片在4℃下孵育过夜,洗去Myo9b抗体,将生物素抗体(北京中山金桥生物技术有限公司产品;货号为SP9002)稀释后与样本切片在室温下孵育30分钟。最后,样本切片经3,3-二氨基联苯胺染色观察(图2中A)。
根据样本切片的染色状况判断Myo9b的表达水平,将样本切片按照染色由浅至深划分为以下四个等级:-、+、++和+++,-表示样本中无Myo9b表达,+、++和+++分别表示样本中Myo9b的表达水平由低至高。统计这四个等级的样本各占总样本的百分比(图2中B)。
结果显示,非肺癌组织-、+、++和+++这四个等级的样本占总样本的百分比分别为77%、22%、1%和0%;肿瘤肺组织中-、+、++和+++这四个等级的样本占总样本的百分比分别为7%、22%、53%和18%。在这60例肺癌患者中,肿瘤肺组织中Myo9b水平高表达(+++/++)的患者占71%;肿瘤肺组织中Myo9b水平低表达(+/-)的患者占29%。表明肺癌组织中的Myo9b表达水平明显高于非肿瘤肺组织(p﹤0.001)。。
2.2RNA表达水平
通过定量RT-PCR方法检测25例肺癌患者的肺癌组织和非肿瘤肺组织中Myo9b基因的RNA表达水平,实验重复三次。用Trizol(Invitroge产品,货号为15596018)提取肺组织总RNA,并利用Ultrospec 5300分光光度计(GE公司)对RNA的量和纯度进行测定;用消化DNA酶I(NEB公司产品,货号为M0303S)从肺组织总RNA中除去基因组DNA,以5微克肺组织总RNA为模板用寡聚引物(dT)(Fermentas公司产品,货号为#SO131)和逆转录酶(M-MLV)(Invitrogen;RTC28025-D11)合成cDNA第一链,利用ABI的StepOne实时定量PCR仪进行扩增。检测Myo9b基因的RNA表达水平的引物为5’-CGAGAAGTTCAGGAGCAACA-3’和5’-GACCAGGTTGGTGTCCTTCT-3’,内参为GAPDH,内参的引物为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’和5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。利用ABI的StepOne实时定量PCR仪(ABI公司)检测Myo9b基因的RNA表达水平的扩增条件为:95℃15秒,60℃30秒,72℃30秒,共40个循环。
结果显示,肺癌患者的肺癌组织中Myo9b的RNA表达水平显著高于肺癌患者的非肿瘤肺组织中Myo9b基因的RNA表达水平(图2中C)。对不同分期肺癌患者肺癌组织样本中Myo9b基因的RNA表达水平进行分析(图2中D),恶性程度越高的肺癌患者肺癌组织样本中Myo9b基因的RNA表达水平越高,Ⅲ和Ⅳ期肺癌患者肺癌组织样本中Myo9b基因的RNA表达水平显著高于Ⅰ和Ⅱ期肺癌患者肺癌组织样本中Myo9b基因的RNA表达水平,表明肺癌患者的肺癌组织中Myo9b基因的RNA表达水平与肺癌的恶性程度正相关。
三、Myo9b的表达水平与肺癌患者的预后
为了研究Myo9b的表达水平与临床之间的关系,发明人根据KM-Plotter数据库探索Myo9b表达水平与与患者生存期之间的关系。依据Myo9b基因的表达水平,将KM-Plotter数据库中的肺癌患者分为两组,即Myo9b高表达组和Myo9b低表达组。利用Kaplan-Meier分析Myo9b高表达组和Myo9b低表达组肺癌患者的生存时间差异。结果显示:Myo9b高表达组肺癌患者的生存时间短于Myo9b低表达组肺癌患者的生存时间(图2中E)。
表明,Myo9b的表达水平与肺癌患者的生存时间相关,Myo9b可以作为肺癌患者预后检测标志物。
四、Myo9b蛋白GAP结构域晶体结构分析
Myo9b的空间结构由头部的Motor结构域、颈部的IQ模序和尾部的GAP结构域三个部分组成(图3中A)。发明人对人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus Linnaeus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)和斑马鱼(Barchydanio rerio var.)的Myo9b GAP结构域的序列进行比对,发现Myo9b GAP结构域具有高度保守性(图3中B)。发明人通过纯化Myo9b GAP结构域(序列1的第1691-1916位氨基酸)并进行结构分析,发现Myo9b GAP结构域含有9个alpha螺旋(图3中C和D)。可以以Myo9b GAP结构域为抗原制备抗Myo9b蛋白的单克隆抗体,该抗Myo9b蛋白的单克隆抗体可以用于肿瘤治疗或肿瘤药物的制备。
Claims (8)
1.检测Myo9b表达水平的系统或检测Myo9b基因表达水平的系统在制备预后产品中的应用;所述预后为预测肺癌患者的生存时间;
所述Myo9b的序列如序列表中序列1所示;
所述Myo9b基因的核苷酸序列如序列2所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述检测Myo9b表达水平的系统为通过免疫组织化学染色法或酶联免疫反应检测所述Myo9b表达水平所需的试剂和/或仪器;
所述检测Myo9b基因表达水平的系统为通过定量PCR检测所述Myo9b基因表达水平所需的试剂和/或仪器。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述检测Myo9b表达水平的系统为抗Myo9b的抗体;
所述检测Myo9b基因表达水平的系统为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述抗Myo9b的抗体为以序列1的第1691-1916位氨基酸所示的蛋白质为抗原得到的抗体。
5.A1)-A3)在制备预后产品中的应用,所述预后为预测肺癌患者的生存时间:
A1)用于制备抗Myo9b的单克隆抗体的免疫原;
A2)用于制备抗Myo9b的多克隆抗体的免疫原;
A3)产生所述单克隆抗体的细胞系统和/或细胞外或无细胞表达系统。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述免疫原为序列1所示的蛋白质或序列1所示蛋白质的部分片段。
7.下述X1或X2的应用:
X1、与权利要求3或4中所述抗Myo9b的抗体相关的生物材料在制备预后产品中的应用,所述预后为预测肺癌患者的生存时间;
与权利要求3或4中所述抗Myo9b的抗体相关的生物材料为下述A1)-A18)中的任一种:
A1)编码权利要求3或4所述抗Myo9b的抗体的核酸分子;
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒;
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体;
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体;
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物;
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物;
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物;
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物;
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因动物细胞系;
A10)含有A2)所述表达盒的转基因动物细胞系;
A11)含有A3)所述重组载体的转基因动物细胞系;
A12)含有A4)所述重组载体的转基因动物细胞系;
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系;
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系;
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系;
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系;
A17)含有A3)所述重组载体的无细胞蛋白或多肽表达系统;
A18)含有A4)所述重组载体的无细胞蛋白或多肽表达系统;
X2、与权利要求5或6中所述免疫原相关的生物材料在制备预后产品中的应用,所述预后为预测肺癌患者的生存时间;
所述与权利要求5或6中所述免疫原相关的生物材料为下述B1)-B16)中的任一种:
B1)编码权利要求5或6中所述免疫原的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体;
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体;
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物;
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物;
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物;
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系;
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系;
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系;
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系;
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系;
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系;
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系;
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
8.以权利要求1中所述Myo9b作为标志物在制备预后产品中的应用,所述预后为预测肺癌患者的生存时间。
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