JP4434882B2

JP4434882B2 - レーザ走査型蛍光観察装置

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Description

この発明は、レーザ走査型蛍光観察装置に関するものである。

試料に励起光を照射して、試料から発生する蛍光を観察する蛍光観察装置においては、蛍光を励起光から分離して検出する必要がある。従来、蛍光を励起光から分離する方法としては、ダイクロイックミラーを用いる方法が一般的である。しかしながら、試料に入射させる励起光の波長と、それによって発生する蛍光の波長とが近接しているため、蛍光を励起光から効率よく分離するダイクロイックミラーの設計は困難な場合が多い。

このような不都合を回避するために、従来、プリズム等の分光装置を用いて励起光から蛍光を分離することが考えられている（例えば、特許文献１〜３参照。）
特許文献１は、ダイクロイックミラーを不要とする共焦点蛍光顕微鏡装置を開示している。この共焦点蛍光顕微鏡装置は、光源から発せられた光を複数の縞状の光束に変換する絞りと、プリズムと、プリズムによって分光された各縞状の光束の一部を選択的に反射するミラーとを備え、試料から戻る蛍光を該ミラーに設けられたスリットに通過させることで励起光から分離して光検出器に検出させるようになっている。

また、特許文献２は、プリズムと絞りを有するミラーとにより光束中の少なくとも２つのスペクトル範囲の光を選択的に検出する装置を開示している。特許文献３は、プリズムと３角形のミラーとにより、共焦点走査型顕微鏡のビーム路において光束中の少なくとも１つのスペクトル領域を選択的に検出する装置を開示している。
米国特許第５７５１４１７号明細書特表平９−５０２２６９号公報特開２００１−２７２２７５号公報

しかしながら、特許文献１の共焦点蛍光顕微鏡は、ダイクロイックミラーを用いることなく励起光から蛍光を分離することができるものの、複数の励起光を同時に照射して、発生する複数の蛍光を観察することはできないという不都合がある。すなわち、ミラーを光軸に交差する方向に移動させることで、ミラーによって反射し励起光の波長およびスリットを通過させる蛍光の波長を変化させることはできるが、複数波長の励起光を同時に照射し、複数波長の蛍光を同時に検出することは困難である。

また、特許文献２および３の装置によれば、複数波長の光を選択的に検出することができるが、間隔をあけて配置される複数の絞りや複数の３角形ミラーを用意する必要があり、構造が複雑になるとともに装置が大型化する不都合がある。さらに、このように複数の絞りや３角形ミラーを用意する場合には、これらの絞りや３角形ミラーをそれぞれ調節する必要があり、精度よく検出することが困難であるという問題がある。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料から発生する蛍光を効率よく検出することを可能とするとともに、複数波長の励起光を同時に照射して、複数波長の蛍光を同時に検出することを可能とするレーザ走査型蛍光観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、複数波長のレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられたレーザ光を波長ごとに分光する分光装置と、該分光装置により分光されたレーザ光を集光させる集光レンズと、該集光レンズの焦点位置近傍に、前記分光装置による分光方向に間隔をあけて配置され、異なる波長のレーザ光をそれぞれ反射する複数の反射部と、該反射部に隣接配置された透過部とを一体的に備える波長選択反射装置と、該波長選択反射装置により反射されたレーザ光を重ね合わせる回折格子と、該回折格子により重ね合わせられたレーザ光を２次元的に走査させる走査部と、該走査部により走査されたレーザ光を試料に集光させる対物光学系と、試料において発せられ、前記対物光学系、前記走査部および回折格子を介して戻り、前記波長選択反射装置の透過部を透過させられた蛍光を検出する光検出器とを備え、前記波長選択反射装置の反射部の分光方向に沿う幅寸法が透過部よりも細く形成されているレーザ走査型蛍光観察装置を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光が分光装置により波長ごとに分光され集光レンズによって焦点位置に集光される。レーザ光は狭い波長帯域を有するので、分光されたレーザ光は、狭い幅の筋状の光束となって波長選択反射装置に入射させられる。波長選択反射装置は、集光レンズの焦点位置近傍に配置された反射部を備えているので、集光された筋状のレーザ光は反射部によって容易に反射される。反射されたレーザ光は回折格子により重ね合わせられて走査部により２次元的に走査され、対物光学系を介して試料に照射される。

レーザ光が照射された試料内においては蛍光物質が励起されることにより蛍光が発せられる。発せられた蛍光は、対物光学系、走査部および回折格子を介して同一光路を戻る。蛍光はレーザ光とは異なる波長を有しているので、回折格子において若干異なる方向に偏向されて、波長選択反射装置に入射される。波長選択反射装置の反射部は透過部よりも細く形成されているので、入射された蛍光は、容易に透過部を透過して光検出器により効率的に検出されることになる。

また、反射部は、それぞれ異なる波長のレーザ光を反射するように、分光装置による分光方向に間隔をあけて配置されているので、複数の波長のレーザ光を試料に対して同時に照射することができる。そして、試料から戻る蛍光は、反射部から若干ずれた位置において波長選択反射装置に入射されるので、全てのレーザ光に対して発生された蛍光が透過部を容易に透過させられて光検出器により効率的に検出されることになる。

上記発明においては、前記波長選択反射装置が、透明基板に筋状の反射膜をコーティングしてなることが好ましい。透明基板上に反射膜をコーティングすることで、反射膜を細い筋状に形成しかつ精度よく配置することができる。レーザ光が反射膜からなる反射部によって反射され、蛍光が反射膜間に配される透明基板を通過させられることになる。反射膜の反射率を高めるよりも透明基板の透過率を容易に高めることができるので、光強度の少ない蛍光を損失なく光検出器によって検出させることができる。

上記発明においては、前記波長選択反射装置が、異なる位置に反射部が設けられた、複数の領域を備えるとともに、該領域を切替可能に支持する切替手段を備えることとしてもよい。
切替手段の作動によって領域を切り替えることにより、レーザ光源から発せられた複数のレーザ光の内の１以上のレーザ光を選択的に反射して試料に入射させることができる。

また、上記発明においては、前記分光装置が、音響光学素子からなることとしてもよい。
音響光学素子によれば、入力する周波数を変更するだけで、出射されるレーザ光の角度を容易に変化させることができるので、出射されたレーザ光が反射部に正確に一致するように微調整することが可能となる。

上記発明においては、前記波長選択反射装置における分光可能な波長帯域に対応する幅寸法Ｈ１と、反射部の幅寸法Ｈ２との寸法比が、以下の条件式（１）を満足することが好ましい。
１００：２５＜Ｈ１：Ｈ２＜４００：１・・・（１）

また、本発明は、複数波長のレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられたレーザ光を波長ごとに分光する分光装置と、該分光装置により分光されたレーザ光を集光させる集光レンズと、該集光レンズの焦点位置近傍に、前記分光装置による分光方向に間隔をあけて配置され、異なる波長のレーザ光をそれぞれ第１の方向に反射する複数の第１の反射部と、該第１の反射部に隣接配置され入射された光を第２の方向に反射する第２の反射部とを備えるミラー装置と、該ミラー装置の第１の反射部により第１の方向に反射されたレーザ光を重ね合わせる回折格子と、該回折格子により重ね合わせられたレーザ光を２次元的に走査させる走査部と、該走査部により走査されたレーザ光を試料に集光させる対物光学系と、試料において発せられ、前記対物光学系、前記走査部および回折格子を介して戻り、前記ミラー装置の第２の反射部において反射された蛍光を検出する光検出器とを備え、前記ミラー装置の第１の反射部の分光方向に沿う幅寸法が第２の反射部よりも細く形成されているレーザ走査型蛍光観察装置を提供する。

この発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光がミラー装置に入射されると、各波長に対応する位置に配置されている第１の反射部により回折格子、走査部および対物光学系を介して試料に照射される。また、試料から発せられた蛍光は、対物光学系、走査部および回折格子を介して戻るが、レーザ光とは波長が異なるために、レーザ光が入射された方向とは異なる方向に反射する。したがって、蛍光は第１の反射部に入射されることなく、それに隣接する第２の反射部に入射させられ、第２の反射部による反射方向に配置されている光検出器によって検出されることになる。この場合において、ミラー装置の第１のミラーは第２のミラーよりも細く形成されているので、ミラー装置に入射された蛍光は、容易に第２のミラーにより反射されて光検出器により効率的に検出されることになる。したがって、複数波長のレーザ光を試料に対して同時に照射し、各レーザ光により励起されて試料から発せられる蛍光を検出することができる。

上記発明においては、前記ミラー装置が、複数の可動ミラーを備え、第１の反射部および第２の反射部の位置を変更可能に構成されていることとしてもよい。
例えば、複数の可動式の微小ミラーを配列してなるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）のように、第１の反射部および第２の反射部により構成されるパターンを任意に切り替えることで、試料に対して照射するレーザ光の波長を任意に選択することができる。

本発明によれば、複数のレーザ光を発生するレーザ光源を使用することにより、分光装置により分光されたレーザ光を細い筋状に形成することができるので、蛍光の透過可能な透過部の面積を大きく確保して、試料から発生する蛍光を効率よく検出することができる。また、試料に対して複数波長のレーザ光を同時に照射して、発生した蛍光を広い透過部によって光検出部に漏れなく透過させることができ、効率よく検出することができるという効果を奏する。

以下、本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置について、図１〜図３を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置１は、図１に示されるように、複数波長のレーザ光を出射するレーザコンバイナ（レーザ光源）２と、該レーザコンバイナ２からのレーザ光を導く第１の光ファイバ３と、該第１の光ファイバ３の端面から発せられたレーザ光を平行光に変換する第１のコリメートレンズ４と、複数波長のレーザ光を含む光束を分光して、波長ごとに異なる方向に出射する音響光学素子（分光装置）５と、該音響光学素子５から発せられた複数のレーザ光を分光方向に沿って異なる集光位置に集光する第１の集光レンズ６と、第１の集光レンズ６の焦点位置近傍に配置された波長選択反射板７と、該波長選択反射板７において反射されたレーザ光を集光して平行光にする第２のコリメートレンズ８と、前記波長選択反射板７を挟んで第２のコリメートレンズ８に対向する位置に配置された第３のコリメートレンズ９と、該第３のコリメートレンズ９から出射された平行光を集光するレンズアレイ１０と、該レンズアレイ１０を構成する各レンズ１１の焦点位置に分光方向に並んで配置された複数の光検出器１２と、第２のコリメートレンズ９から出射されたレーザ光を合波する回折格子１３と、回折格子１３により重ね合わせられたレーザ光を集光する第２の集光レンズ１４と、該第２の集光レンズ１４の焦点位置近傍に端面１５ａが配置された第２の光ファイバ１５と、該第２の光ファイバ１５の他端に接続された測定ヘッド１６とを備えている。

レーザコンバイナ２は、複数のレーザ発振器（図示略）からの波長の異なる複数のレーザ光を合波して出力するようになっている。レーザ発振器は、例えば、４００ｎｍ、４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、６３３ｎｍ、８００ｎｍの波長のレーザ光をそれぞれ発振するようになっている。

音響光学素子５は、所定の周波数を入力されることにより、波長に応じて異なる一定の方向にレーザ光を出射するようになっている。したがって、波長の異なる複数のレーザ光は、音響光学素子５において分光され、予め定められた方向に出射されるようになっている。また、音響光学素子５は、入力周波数を微調整することができるようになっており、入力周波数を微調整することで、各レーザ光の出射方向を微調整することができるようになっている。

前記波長選択反射板７は、図２および図３に示されるように、長方形状の透明基板１７の一表面に長辺方向に延びる直線の筋状の反射膜１８をコーティングすることにより構成されている。反射膜１８の位置には、図３に示されるように、レーザ光が反射される反射部７ａが構成され、反射膜１８のない位置には、入射された光がほぼ１００％透過できる透過部７ｂが構成されている。

波長選択反射板７は、長辺方向に沿って並ぶ５つの領域Ａ１〜Ａ５に分けられている。第１の領域Ａ１には４００ｎｍのレーザ光が集光される位置のみに反射膜１８が配置され、第２の領域Ａ２には４８８ｎｍのレーザ光が集光される位置のみに反射膜１８が配置され、第３の領域Ａ３には５４３ｎｍのレーザ光が集光される位置のみに反射膜１８が配置されている。また、第４の領域Ａ４には、４００ｎｍ、４８８ｎｍ、５４３ｎｍのレーザ光がそれぞれ集光される位置に反射膜１８が配置されている。また第５の領域Ａ５には、４００ｎｍ、４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、６３３ｎｍ、８００ｎｍのレーザ光がそれぞれ集光される位置に反射膜１８が配置されている。

反射部７ａと透過部７ｂの幅寸法は、光の波長の幅に比例する。
本実施形態においては、両端に配される反射部７ａの間において４００〜８００ｎｍの波長帯域の光を分光できるようになっているので、両端の反射部７ａ間の幅寸法Ｈ１を４００とした場合、各反射部７ａの幅寸法Ｈ２は、理想的なレーザ光の場合には１でよい。この場合、例えば、領域Ａ５において、４００ｎｍの光の反射部７ａと、４８８ｎｍの光の反射部７ａとの間に配される透過部７ｂの幅寸法は８７、４８８ｎｍと５４３ｎｍの反射部７ａ間の透過部７ｂの幅寸法は５４、５４３ｎｍと６３３ｎｍの反射部７ａ間の透過部７ｂの幅寸法は８９、６３３ｎｍと８００ｎｍの反射部７ａ間の透過部７ｂの幅寸法は１６６となる。

上記の場合に、分光可能な波長帯域４００〜８００ｎｍに対応する幅寸法Ｈ１に対する反射部７ａの幅寸法Ｈ２の比は４００：１である。レーザ光源として半導体レーザを用いる場合には、温度変化等による波長のばらつき等が生ずるので、分光可能な波長帯域に対応する幅寸法Ｈ１と反射部７ａの幅寸法Ｈ２との比を４００：５程度にすることが望ましい。さらに、組立調整上、作業を簡単にしたい場合には、寸法比Ｈ１：Ｈ２を４００：２５程度にすることが好ましい。

また、分光可能な光の波長帯域を小さくすれば装置をコンパクトにできる。その場合には、例えば、分光可能な波長帯域を５００〜６００ｎｍのように１００ｎｍ程度にしてもよく、このとき、寸法比Ｈ１：Ｈ２は１００：２５となる。
したがって、以下の条件式（１）を満たすことが好ましい。
１００：２５＜Ｈ１：Ｈ２＜４００：１・・・（１）

波長選択反射板７は、リニアガイド１９によって長辺方向に移動可能なスライダ２０に固定されている。スライダ２０は図示しないモータおよびボールネジ等の直動機構によって波長選択反射板７の長辺方向の位置を変化させることができるようになっている。これにより、波長選択反射板７の５つの領域Ａ１〜Ａ５の内のいずれか１つの領域にレーザ光および蛍光が入射されるように切替可能に構成されている。

これにより、光路上に配置された領域Ａ１〜Ａ５に配置された反射膜１８に対応する波長のレーザ光Ｌ１は、図３に示されるように、ちょうど反射膜１８の位置に入射されて反射され、鎖線で示されるように、その波長に対応する反射膜１８が存在しない場合には、レーザ光Ｌ２は、透過部７ｂを透過して捨てられるようになっている。

光検出器１２は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）である。
前記回折格子１３は、第２のコリメートレンズ８から出射された１つのレーザ光を反射し、または、異なる波長の複数のレーザ光を合波して反射する一方、試料Ａから戻る１または複数の波長の蛍光Ｆを分光して第２のコリメートレンズ８に入射させるようになっている。

第２の光ファイバ１５は、シングルモードファイバであり、その端面１５ｂが、後述する測定ヘッド１６の先端に配置された対物レンズ２１の焦点位置と共役な位置関係になっている。
測定ヘッド１６は、試料Ａに対向する先端に対物レンズ２１を固定した筐体２２内に、第２の光ファイバ１５により伝播されてきた光を平行光に変換する第４のコリメートレンズ２３と、第４のコリメートレンズ２３から発せられた平行光を２次元的に走査する走査部２４と、該走査部２４により走査されたレーザ光を集光して中間像を形成する瞳投影レンズ２５と、中間像を形成したレーザ光を集光して対物レンズ２１に入射させる結像レンズ２６とを備えている。
走査部２４は、例えば、相互に直交する軸線回りに揺動可能に支持された２枚のガルバノミラーからなるいわゆる近接ガルバノミラーにより構成されている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置１によって、例えば、４００ｎｍの波長を有するレーザ光のみに対する蛍光観察を行う場合には、リニアガイド１９を作動させてスライダ２０を移動させることにより、領域Ａ１が光路上に配置されるように設定しておく。そして、レーザコンバイナ２からレーザ光を出射する。このとき全てのレーザ発振器をＯＮにして全ての波長を含むレーザ光Ｌ１，Ｌ２を出射することにしてもよく、また、対応する４００ｎｍの波長を有するレーザ光Ｌ１を出射するレーザ発振器のみをＯＮにしておくことにしてもよい。

全てのレーザ発振器をＯＮにして、全ての波長を含むレーザ光Ｌ１，Ｌ２を出射させると、レーザ光Ｌ１，ｌ２は第１のコリメートレンズ４によって平行光にされた後に音響光学素子５に入射される。音響光学素子５においては、レーザ光Ｌ１，Ｌ２は波長ごとに分光され、それぞれ単一波長を有する筋状の光束となって、波長ごとに定まる異なる方向に向かって出射される。そして、出射された各レーザ光Ｌ１，Ｌ２は、第１の集光レンズ６によって集光され、その焦点位置近傍に配置されている波長選択反射板７に入射される。

波長選択反射板７は、領域Ａ１が光路中に配置されているので、波長４００ｎｍのレーザ光の集光位置に対応する位置のみに反射膜１８が配置される。したがって、波長４００ｎｍのレーザ光Ｌ１のみが反射部７ａにより反射され、他の波長のレーザ光Ｌ２は透過部７ｂを透過して捨てられる。または、他の波長のレーザ発振器をＯＦＦにしておけば、レーザ光Ｌ１のみが反射部７ａにより反射される。

波長選択反射板７により反射された波長４００ｎｍのレーザ光Ｌ１は、第２のコリメートレンズ８によって平行光にされた後に、回折格子１３において反射される。ここで、第２のコリメートレンズ８を通過してきたレーザ光Ｌ１は波長４００ｎｍのレーザ光Ｌ１のみであるため、回折格子１３では、所定の偏向角度で第２の集光レンズ１４に向けて反射されるのみとなる。

第２の集光レンズ１４により集光されたレーザ光Ｌ１は、その焦点位置に配置されている第２の光ファイバ１５の端面１５ａに入射され、第２の光ファイバ１５内を伝播されて測定ヘッド１６に伝達される。
第２の光ファイバ１５を介して伝播されてきたレーザ光は、第４のコリメートレンズ２３により平行光に変換され、走査部２４により２次元的に走査され、瞳投影レンズ２５、結像レンズ２６および対物レンズ２１を介して試料Ａに照射される。そして、試料Ａにおいて波長４００ｎｍのレーザ光により励起されて発生した蛍光Ｆは、対物レンズ２１、結像レンズ２６、瞳投影レンズ２５、走査部２４および第４のコリメートレンズ２３を介して第２の光ファイバ１５の端面１５ｂに集光される。

第２の光ファイバ１５の端面１５ｂは、対物レンズ２１の焦点位置と共役な位置関係に配置されているので、共焦点ピンホールとして機能し、対物レンズ２１の焦点位置近傍から戻る光のみが第２の光ファイバ１５内に入射される。これにより、光検出器１２により検出される蛍光Ｆは、対物レンズ２１の焦点位置近傍からの蛍光Ｆのみとなり、試料Ａの所定の深さ位置に配される対物レンズ２１の焦点位置に２次元的に広がる試料Ａの蛍光画像を取得することが可能となる。

第２の光ファイバ１５内を伝播して戻る蛍光Ｆは、第２の集光レンズ１４によって平行光にされた後、回折格子１３において反射されることにより分光され、波長ごとに定められた方向に向けて出射される。波長ごとに分光された蛍光Ｆは第２のコリメートレンズ８を通過させられることで集光されて波長選択反射板７に入射される。これらの蛍光Ｆは入射されたレーザ光Ｌ１、この例の場合には、波長４００ｎｍのレーザ光Ｌ１に近接するが異なる波長を有しているので、波長選択反射板７のレーザ光Ｌ１とは異なる位置に入射させられる。

測定ヘッド１６から戻る戻り光の中に、波長４００ｎｍのレーザ光Ｌ１が含まれている場合には、該レーザ光Ｌ１は同一の光路を戻ることによって、回折格子１３によりもと来た方向に反射される。したがって、レーザ光Ｌ１は、波長選択反射板７の反射膜１８に一致する位置に入射されることにより波長選択反射板７を透過することなく反射される。一方、戻り光の中の蛍光Ｆは、波長４００ｎｍとは異なる波長を有しているために、波長選択反射板７の反射膜１８とは異なる位置に入射される。反射膜１８からなる反射部７ａに隣接する領域には反射膜１８よりも十分に広い透過部７ｂが設けられ、透過部７ｂは反射防止処理等を施されてほぼ１００％が透過させられるようになっているので、波長選択反射板７に入射した蛍光Ｆはそのほぼ全てが透過部７ｂを透過させられて第３のコリメートレンズ９により平行光にされた後に、レンズアレイ１０によって、それぞれの波長ごとに用意されている光検出器１２に入射されることになる。

また、波長４８８ｎｍまたは５４３ｎｍのレーザ光Ｌ１を試料Ａに照射して蛍光観察を行う場合、波長４００ｎｍ，４８８ｎｍ，５４３ｎｍの３つの異なる波長のレーザ光Ｌ１を試料Ａに同時に照射する場合、および、波長４００ｎｍ，４８８ｎｍ，５４３ｎｍ，６３３ｎｍ，８００ｎｍの５つの異なる波長のレーザ光Ｌ１を試料Ａに同時に照射して蛍光観察を行う場合には、それぞれ、リニアガイド１９を作動させてスライダ２０を波長選択反射板７の長辺方向に移動させることにより、波長選択反射板７の領域Ａ２〜Ａ５のいずれかが光路上に配置されるように設定する。
これにより、領域Ａ２〜Ａ５に入射されたレーザ光Ｌ１，Ｌ２は、その波長に対応する位置に反射膜１８が存在するレーザ光Ｌ１のみが、反射膜１８によって反射されて試料Ａに照射され、試料Ａから戻る蛍光Ｆが、波長選択反射板７の透過部７ｂを透過して対応する光検出器１２により検出されることになる。

このように、本実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置１によれば、レーザコンバイナ２を採用することによって、個々のレーザ発振器において発振されるレーザ光Ｌ１，Ｌ２の波長帯域を狭い波長帯域に限定することができる。したがって、音響光学素子５による分光後のレーザ光Ｌ１，Ｌ２を細長い筋状に形成することができ、筋状の反射膜１８によってそれぞれの波長のレーザ光Ｌ１を反射することができる。その一方で、反射膜１８に隣接する広い範囲の透過部７ｂによってレーザ光Ｌ１の波長に隣接する波長帯域の蛍光Ｆを漏れなく効率的に透過させて光検出器１２により回収することができる。

その結果、ダイクロイックミラーを使用することなく蛍光Ｆをレーザ光Ｌ１から分離することができる。また、ストークスシフトが小さく、ダイクロイックミラーによっては分離が困難な場合においても、蛍光Ｆとレーザ光Ｌ１とをより確実に分離することができる。

本実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置１においては、第２の光ファイバ１５に測定ヘッド１６を接続することにより、第２の光ファイバ１５を湾曲させて測定ヘッド１６を自由な姿勢に配置することができる。したがって、試料Ａに対して種々の方向から対物レンズ２１を近接させる用途や、実験小動物等の試料Ａを生きたままの状態で観察する際に、試料Ａに対物レンズ２１を装着したままの状態で試料Ａの活動を許容する用途等に適している。

なお、これに代えて、図４に示されるように、第２の光ファイバ１５をなくして対物レンズ２１を固定式にした構造のレーザ走査型蛍光観察装置１′を採用してもよい。この場合、第２の光ファイバ１５に代えて、第２の集光レンズ１４の焦点位置近傍に配置されるコンフォーカル絞り２７を配することが好ましい。このようにすることで、第２の光ファイバ１５の端面１５ｂが果たしていたコンフォーカル絞りの機能を直接置き換えて、同様の作用効果を達成することができる。

また、上記実施形態においては、レーザコンバイナ２から発せられた複数波長のレーザ光Ｌ１，Ｌ２を含む光束を、各波長のレーザ光Ｌ１，Ｌ２ごとに分光する分光装置として、音響光学素子５を採用した場合について説明したが、これに代えて、図５および図６に示されるように、複数のダイクロイックミラー２８，２９およびミラー３０，３１を組み合わせた分光装置３２を採用することにしてもよい。この場合に、各ダイクロイックミラー２９の角度を微調整することにより、各波長のレーザ光Ｌ１，Ｌ２の第１の集光レンズ６による集光位置を分光方向に微調整することができる。図５は図１と同様の第２の光ファイバ１５を用いた例、図６は図４と同様の第２の光ファイバ１５を有しない例をそれぞれ示している。

また、分光装置としては音響光学素子５や上記ダイクロイックミラー２８，２９等を組み合わせたものに限定されるものではなく、例えば、プリズムのような他の任意の分光装置を採用することができる。

次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置４０について、図７〜図９を参照して説明する。
なお、本実施形態の説明においては、上述した第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置１，１′と構成を共通とする箇所に同一の符号を付して説明を簡略化することにする。

本実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置４０は、図７に示されるように、第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置１において使用していた波長選択反射板７に代えて、複数の微小ミラーを備えるミラーアレイ４１を採用してもよい。

ミラーアレイ４１は、図８に示されるように、第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置１における波長選択反射板７の反射部７ａと同様の位置に、直線的な筋状に配置され、第１の反射角度に固定された第１のミラー４１ａと、透過部７ｂと同様の位置に配置され、第２の反射角度に固定された第２のミラー４１ｂとを備えている。また、第１の実施形態の波長選択反射板７の長辺方向に沿って配列された複数の領域（Ａ１〜Ａ５）と同様の領域Ａ１〜Ａ５（図示略）を備え、各領域内において、これらミラー４１ａ，４１ｂは、領域全体に伸びている。

第１のミラー４１ａは、各波長のレーザ光Ｌ１の第１の集光レンズ６による集光位置に配置され、レーザ光源２から送られてきたレーザ光Ｌ１を第２のコリメートレンズ８に向けて反射するように第１の反射角度が設定されている。また、第２のミラー４１ｂは、第２のコリメートレンズ８から戻る蛍光Ｆが入射される位置に配置され、蛍光Ｆを第１の集光レンズ６とは異なる方向に配置されている光検出器１２に向けて反射するように第２の反射角度が設定されている。

第２のミラー４１ｂは、第１のミラー４１ａと同等の幅寸法を有しているが、２つの第１のミラー４１ａの間に複数本の第２のミラー４１ｂを配置することにより、第１のミラー４１ａの分光方向に沿う幅寸法を、第２のミラー４１ｂの幅寸法と比較して十分に小さく設定している。第１のミラー４１ａは、その位置に集光された、ごく限られた波長帯域を有するレーザ光Ｌ１を反射することができれば足り、その波長のレーザ光Ｌ１を照射された試料Ａから発せられたレーザ光Ｌ１の波長に隣接する比較的広い波長帯域の蛍光Ｆを広い第２のミラー４１ｂに入射させる必要があるからである。
また、試料Ａに照射するレーザ光Ｌ１の波長を変更する場合には、リニアガイド１９を作動させて、ミラーアレイ４１をその長辺方向に沿って移動させ、光路中に配置される領域Ａ１〜Ａ５を変更することができる。

このように、本実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置４０によっても、ダイクロイックミラーを使用することなく、蛍光Ｆをレーザ光Ｌ１から分離し、効率的に検出することができるという点で、第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置１とほぼ同等の作用効果を奏する。

なお、上記実施形態においては、異なる反射角度に固定された第１のミラー４１ａと第２のミラー４１ｂとを有するミラーアレイ４１を採用し、試料Ａに照射するレーザ光Ｌ１を変更するときにはリニアガイド１９によってミラーアレイ４１を長辺方向に移動させる方式を採用したが、これに代えて、図９（ａ）に示されるように、ミラーアレイ４１′として、複数の可動式の微小ミラー４２を配列してなるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）のような走査ミラー素子を採用することにしてもよい。

この場合に、試料Ａに照射するレーザ光Ｌ１の波長に応じて、第１の実施形態に係る波長選択反射板７の反射部７ａおよび透過部７ｂと同様のパターンとなるように第１の反射部４２ａと、第２の反射部４２を構成し、これらの反射部４２ａ，４２ｂの反射角度を異ならせるとともに、必要に応じて反射部７ａ、透過部７ｂのパターンを変更することにより、複数波長のレーザ光Ｌ１を試料Ａに同時に照射して、試料Ａから発生する複数波長の蛍光Ｆを光検出器１２により効率的に検出することができる。
なお、図１０に示されるように、第２の光ファイバ１５を有しない構造を採用してもよい。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置を示す模式図である。図１のレーザ走査型蛍光観察装置の波長選択反射板を示す正面図である。図２の波長選択反射板におけるレーザ光の反射および蛍光の透過の様子を示す模式図である。図１の変形例に係るレーザ走査型蛍光観察装置を示す模式図である。図１の他の変形例に係るレーザ走査型蛍光観察装置を示す模式図である。図１の他の変形例に係るレーザ走査型蛍光観察装置を示す模式図である。本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型蛍光観察装置を示す模式図である。図７のレーザ走査型蛍光観察装置のミラーアレイにおけるレーザ光および蛍光の反射の様子を示す模式図である。図９のミラーアレイの変形例を示す模式図である。図７のレーザ走査型蛍光観察装置の変形例を示す模式図である。

符号の説明

Ａ試料
Ａ１〜Ａ５領域
１，１′，４０，４０′ レーザ走査型蛍光観察装置
２レーザコンバイナ（レーザ光源）
５音響光学素子（分光装置）
６第１の集光レンズ（集光レンズ）
７波長選択反射板（波長選択反射装置）
７ａ反射部
７ｂ透過部
１２光検出器
１３回折格子
１７透明基板
１８反射膜
１９リニアガイド（切替手段）
２０スライダ（切替手段）
２１対物レンズ（対物光学系）
２４走査部
３２分光装置
４１，４１′ ミラーアレイ（ミラー装置）
４１ａ第１の反射部
４１ｂ第２の反射部
４２可動ミラー

Claims

複数波長のレーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源から発せられたレーザ光を波長ごとに分光する分光装置と、
該分光装置により分光されたレーザ光を集光させる集光レンズと、
該集光レンズの焦点位置近傍に、前記分光装置による分光方向に所定の間隔をあけて配置され、異なる波長のレーザ光をそれぞれ反射する複数の反射部と、該反射部に隣接配置された透過部とを一体的に備える波長選択反射装置と、
該波長選択反射装置により反射されたレーザ光を重ね合わせる回折格子と、
該回折格子により重ね合わせられたレーザ光を２次元的に走査させる走査部と、
該走査部により走査されたレーザ光を試料に集光させる対物光学系と、
試料において発せられ、前記対物光学系、前記走査部および回折格子を介して戻り、前記波長選択反射装置の透過部を透過させられた蛍光を検出する光検出器とを備え、
前記波長選択反射装置の各反射部の分光方向に沿う幅寸法が透過部よりも細く形成されているレーザ走査型蛍光観察装置。
前記波長選択反射装置が、透明基板に筋状の反射膜をコーティングしてなる請求項１に記載のレーザ走査型蛍光観察装置。
前記波長選択反射装置が、異なる位置に反射部が設けられた、複数の領域を備えるとともに、該領域を切替可能に支持する切替手段を備える請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型蛍光観察装置。
前記分光装置が、音響光学素子からなる請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光観察装置。
前記波長選択反射装置における分光可能な波長帯域に対応する幅寸法Ｈ１と、反射部の幅寸法Ｈ２との寸法比が、以下の条件式（１）を満足する請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光観察装置。
１００：２５＜Ｈ１：Ｈ２＜４００：１・・・（１）
複数波長のレーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源から発せられたレーザ光を波長ごとに分光する分光装置と、
該分光装置により分光されたレーザ光を集光させる集光レンズと、
該集光レンズの焦点位置近傍に、前記分光装置による分光方向に間隔をあけて配置され、異なる波長のレーザ光をそれぞれ第１の方向に反射する複数の第１の反射部と、該反射部に隣接配置され、入射された光を第２の方向に反射する第２の反射部とを備えるミラー装置と、
該ミラー装置の第１の反射部により第１の方向に反射されたレーザ光を重ね合わせる回折格子と、
該回折格子により重ね合わせられたレーザ光を２次元的に走査させる走査部と、
該走査部により走査されたレーザ光を試料に集光させる対物光学系と、
試料において発せられ、前記対物光学系、前記走査部および回折格子を介して戻り、前記ミラー装置の第２の反射部において反射された蛍光を検出する光検出器とを備え、
前記ミラー装置の第１の反射部の分光方向に沿う幅寸法が第２の反射部よりも細く形成されているレーザ走査型蛍光観察装置。
前記ミラー装置が、複数の可動ミラーを備え、第１の反射部および第２の反射部の位置を変更可能に構成されている請求項６に記載のレーザ走査型蛍光観察装置。