JP7097404B2 - 哺乳類細胞培養物を回収するための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2014年6月4日に出願された米国仮出願第62/007,588号の利益を主張する。
「細胞培養」または「培養」は、多細胞生物または組織外での細胞の増殖及び繁殖を意味する。哺乳類細胞に好適な培養条件は、当該分野において既知である。例えば、Animal cell culture:A Practical Approach,D.Rickwood編、Oxford University Press,New York(1992)を参照されたい。哺乳類細胞は、懸濁液中で培養されてよいかまたは固体基質に付着される間に培養されてよい。
細胞培養培地は、バイオリアクター及び/または細胞培養物への添加の前に培地を滅菌するまたは消毒するための方法またはデバイスを使用して処理することができる。一実施形態では、細胞培養培地は、高温短時間法(HTST)を使用して処理される(例えば、米国特許第7,420,183号を参照されたい)一実施形態では、細胞培養培地は、ろ過と組み合わせたUVを使用して処理される(例えば、WIPO公開WO2008/157247;WO2012/115874;WO2013/063298及びWO2013/138159を参照されたい)。別の実施形態では、細胞培養培地は、ナノろ過に供される(例えば、Liuら、(2000)Biotechnol.Prog.16:425-434を参照されたい)。別の実施形態では、細胞培養培地は、溶媒、洗剤、ソラレンまたはベータ-プロピオラクトンなどのウイルスを不活性化する化学物質で処理される。
本発明において使用される細胞系(「細胞」または「宿主細胞」とも呼ばれる)は、商業的または科学的対象となるポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている。細胞系は、典型的には、無期限にわたって培養物内に維持されることができる初代培養物から生じる細胞系譜に由来する。細胞は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、または注入を介して導入された発現ベクター(構築物)、例えば、プラスミド等を含有することができ、これらは、培養プロセスにおいて発現及び産生するためのタンパク質をコードするコード配列またはその一部を抱える。そのような発現ベクターは、挿入されるコード配列の転写及び翻訳に必須のエレメントを含有する。当業者に周知でありかつ実践されている方法を使用して、産生されるタンパク質及びポリペプチドをコードする配列、ならびに適切な転写及び翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。そのような技術は、これらの全てが任意の目的のために本明細書に組み込まれる、J.Sambrookら、2012,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第4版、Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.または前版のいずれか;F.M.Ausubelら、2013,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y,または前版のいずれか;Kaufman,R.J.,Large Scale Mammalian Cell Culture 1990に記載されている。
理解の目的のために、しかし限定するものではなく、タンパク質産生のための細胞培養及び培養実行は、バッチ培養、流加培養、灌流培養またはそれらの組み合わせを含むことができることが当業者により理解されるだろう。バッチ培養では、細胞は、最初に培地内で培養され、この培地は除去、置換または補充されない、すなわち、細胞は、培養実行の間または終了の前に新鮮な培地を「供給」されない。細胞培養物全体が、培養実行の終了時に回収される。
本発明は、単一ユニットフィルタシステムであって、任意選択で筐体内に含有された単一ユニットフィルタシステム内で一連に組み合わされた異なる孔径または分子量カットオフの2つ以上の中空糸フィルタ構成要素を含み、単一の細胞ポンプデバイスによって操作することができる、前記単一ユニットフィルタシステムを提供する。これにより、1つのフィルタシステム(図1)を介して(ヌル透過物を除去する)生成物保持様式または(回収透過物を除去する)生成物収集様式で収集することが可能になる。単一ユニットフィルタシステムは、回収サイクル中に宿主細胞タンパク質及び他の廃棄物を細胞培養物から除去して、細胞培養の期間を延長する利点を提供する。単一ユニットフィルタシステムは、潜在的に、より高い回収効率に対してフィルタの汚染可能性はより少ない。単一ユニットフィルタシステムは、下流の精製カラムのより容易な及び効率的なローディングのための複数のより小さなバッチにおいて透過物を提供することができる。単一ユニットフィルタシステムは、連続製造プロセスの一部として使用してよい。
う
細胞培養は、動物または哺乳類細胞培養に従来採用されている培養容器及び/または培養装置を使用して組換えタンパク質の小規模産生から大規模産生に適応する条件下で行うことができる。大規模で培養するために、ローラーボトルシステム、充填層型培養デバイス、発酵型槽バイオリアクター、エアリフト型バイオリアクター、流動床バイオリアクター、固定化菌体バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、撹拌槽バイオリアクター、多段バイオリアクター、遠心分離バイオリアクターまたは当業者に既知の任意の他の好適なデバイスなどの機器を使用することができる。単回使用バイオリアクターなどの単回使用バイオ処理機器も使用してよい。マイクロキャリアもバイオリアクターシステムと使用してよい。このシステムは、バッチ、流加または灌流/連続様式で操作することができる。加えて、培養容器は、フィルタ、重力、遠心力等を使用する細胞分離器などの追加の装置を備えていてよい。
本発明の方法に好適な細胞培養条件は、細胞のバッチ、流加、もしくは灌流(連続)培養に関して典型的に採用される及び知られているものまたはこれらの方法の任意の組み合わせであり、pH、溶存酸素(O2)、及び二酸化炭素(CO2)、撹拌及び湿度、ならびに温度に注意を払う。組換えタンパク質産生の間、細胞が所望の時間にわたってまたは所望の密度まで増殖し、その後細胞の生理学的状態が、増殖が制限または停止した、細胞がエネルギー及び基質を使用して細胞密度を増加させるために組換えタンパク質を産生する高生産特性態に切り替えられる、制御されたシステムを有することが望ましい。商業的規模の細胞培養及び生物学的治療薬の製造については、産生期中に細胞増殖を制限するまたは停止し、細胞を増殖制限または停止状態に維持することができる能力が非常に望ましい。そのような方法には、例えば、温度変化、タンパク質産生の化学誘導物質、栄養制限または飢餓及び細胞周期阻害剤、の単独または併用のいずれかでの使用が含まれる。
発現した組換えタンパク質は、そこからそれらを回復及び/または収集することができる培養培地中に分泌されてよい。次いで、組換えタンパク質は、好適な医薬製剤及び/または保管へと、回収、精製、エンドトキシン及び/またはウイルス不活性化/ろ過、限外ろ過/ダイアフィルトレーションを含む1つまたは複数の処理ステップに供されてよい。
プロセス分析技術及び方法は、組換えタンパク質及び産生プロセスの特徴を定量的に及び/または定性的にモニターするために細胞培養及び精製プロセス中に採取された試料をモニターする及び評価するために利用可能である。このリアルタイムまたはインライン情報を使用して、力価、細胞密度;翻訳後修飾などの生成物品質特性;不純物などの生成物またはプロセス変動性などの生成物及び産生パラメータをモニター及び/または制御してタイムリーな決断及び修正プロセスを必要に応じて行うことができる。例えば、グリカン種の分布、酸化レベルまたは脱アミド化などの生成物品質特性をモニター及び/または制御することができる。
本明細書で用いるとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書を通して互換可能に使用され、ペプチド結合によって相互に結合される2つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びADPリボース化を含むが、これらに限定されない修飾も含む。
長期周期的な細胞培養プロセス
この実験は、限外ろ過培養プロセス(UF)と比較して長期周期的回収(X-PH)を伴う細胞培養プロセスを説明する。長期周期的プロセスでは、灌流は、対象となる組換えタンパク質が透過物中に運ばれて生成物回収として収集されるように孔径または分子量カットオフを有する精密ろ過膜に接続された、細胞培養物の組換えタンパク質生成物が、細胞培養バイオリアクター内の被保持物中に保持されるように孔径またはMWCOを有する限外ろ過膜を含む単一フィルタユニットシステムを使用して実行された。灌流は、組換えタンパク質不含透過物、またはヌル透過物、を限外ろ過膜構成要素から所定のパラメータに到達するまで取り出すことによって行われ、この場合は、培養において数日間、そのときに、灌流は、精密ろ過膜構成要素から組み換えタンパク質含有透過物、または回収透過物、を所定の時間にわたって取り出すことによって実行された。所定の時間が経過した後、プロセスを反復した。タンパク質生成物を保持する及び回収するというこのサイクルは、培養が終了するまで反復された。
0日目に、組換え抗体を発現するCHO細胞を、2つの2Lバイオリアクター(Applikon、カリフォルニア州、フォスターシティ)内に、1500mlの作業量の無血清既知組成バッチ培地中1×106生存細胞/mLで接種した。培養物を36℃、48.0mmHgのDO、350RPMでの撹拌に維持した。
0日目に、上と同じ組換え抗体を発現するCHO細胞を、4つの2Lバイオリアクター(Applikon、カリフォルニア州、フォスターシティ)内に、1500mlの作業量の無血清既知組成バッチ培地中1×106生存細胞/mLで接種した。培養物を36℃、48.0mmHgのDO、350RPMでの撹拌に維持した。
この実験は、低濃度及び高濃度のポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロック共重合体、Lutrol(登録商標)F68、及び灌流培養システムにおける30kDa対750kDaフィルタの影響を比較する。
細胞に及ぼす高いLutrol(登録商標)F68濃度の毒性の効果について検査するために、異なるモノクローナル抗体を発現する2つのCHO細胞系(細胞系A及び細胞系B)を(3日/継代で)10継代にわたって繰り越し、初期接種密度は、250ml振とうフラスコ中8×105細胞/mlとし、細胞培養培地は、1、2、3、4または5g/LのLutrol(登録商標)F68を含有した。
1g/Lと5g/LのLutrol(登録商標)F68を比較する実験を行った。0日目に、組換え抗体を発現するCHO細胞系を、6つの2Lバイオリアクター(Applikon Biotechnology、カリフォルニア州、フォスターシティ)内に、1500mlの作業量中2×106生存細胞/mLで接種した。2つのリアクターは、1g/LのLutrol(登録商標)F68を含有する無血清既定灌流培地を受け、2つのリアクターは、5g/LのLutrol(登録商標)F68を含有する無血清既定灌流培地を受けた。培養物を36℃、48%の溶存酸素濃度、pH6.9、350RPMでの撹拌で維持した。
0日目に、組換え抗体を発現するCHO細胞系を4つの2L産生バイオリアクター(Applikon Biotechnology、カリフォルニア州、フォスターシティ)内に、1500mlの作業量中2×106細胞/mLで接種した。細胞培養実行を、バッチ様式で開始し;灌流を2日目に開始した。灌流は、750kDa中空糸フィルタ(Xampler UFP-750-E-4MA、GE Healthcare、ペンシルベニア州、ピッツバーグ)を備えたATF-2(商標)交互接線流ろ過システム(Refine Technologies、ニュージャージー州、ハノーバー)を使用して達成した。リアクターを2つの2群に分割し、各群は異なる灌流細胞培養培地製剤(培地A及び培地B)を受けた。両方の培地製剤は、1g/LのLutrol(登録商標)F68を含有した。培養物を36℃、48%の溶存酸素濃度、pH6.9、350RPMでの撹拌で維持した。培養物を、細胞生存率(%)が80%に落ちるまでこれらの条件下で維持した。その時、両群用の培地に、追加の4g/LのLutrol(登録商標)F68を補充した(合計で5g/L)。培養物を、これらの高プルロニック条件下で30日目まで維持した。より高い濃度のLutrol(登録商標)F68の添加による細胞の生存率の回復を図10に示す。補充後、生存率(%)は、最大で15%増加した。細胞生存率の低下を伴う培養物中のより高い濃度のプルロニックの保護効果は、細胞培養培地製剤にかかわらず明らかであった。
この実験は、前もって定義された目標製品品質プロファイル(QTPP)の送達ためのPACプロセスへの複数のクオリティバイデザイン(QbD)要素の試験的な規模適用の成功を実証する。この実験における制御されたCQAは、モノクローナル抗体のFcドメイン上の高マンノースN結合型グリコシル化(「高マンノース」)とした。
細胞系は、モノクローナル抗体を発現する組換えCHO細胞系とした。細胞を、ディープウェルプレートに、2mLの作業量で12g/Lグルコースを含有する既知組成(CD)培地中7.5e5細胞/mLで播種した。細胞を、オービタルシェーカー内、36.0℃及び5%CO2、220rpmでインキュベートした(オービタル直径は50mm)。3~4日目に、グルコース濃度を、Polychemグルコース試薬プレートアッセイ(MedTest DX、ミシガン州、カントン)を介して測定し、培養物を遠心分離して使用済み培地の26%を新鮮なCD培地と置き換えた。同様に、5日目に、使用済み培地の100%を、グルコースを含有しない新鮮なCD培地と置き換えた。総ヘキソース濃度を、その後、濃縮ヘキソース原液からの添加により異なる比率のグルコース対マンノースを使用して10g/Lに調整した。細胞を24時間自然に増殖させた。上清を除去し、IgGを精製し、高マンノース率(%)を親水性相互作用液体クロマトグラフィー(HILIC)アッセイによって測定した。
グルコース及びマンノース濃度は、GC-MSにより細胞培養培地において定量化された。細胞培養物の1mL試料をペレット細胞に遠心分離して、上清をろ過した(0.2μM)。ろ過された上清を10分の1に脱イオン水中に希釈し、10μLのこの希釈液を1.5μLの遠心分離管に加えた。10mM D-[UL-13C6]マンノース99.9%(Omicron Biochemicals)及び10mM D-[U-13C6]グルコース99.9%(Cambridge Isotope Labs)を含有する、5μLの一定分量のヘキソース内部標準溶液を加えた。試料を30分間乾燥させた(SpeedVac)。ヘキソースを、20μL無水ピリジンの添加により誘導体化し、1%トリメチクロロシラン(trimethychlorosilane)(TMCS)を含む30μLのN-メチル-N-(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(MSTFA)を40℃で30分間インキュベートした。誘導体化の直後、試料をAgilent GC 6890N MSD 5973システムにて分析した。1μL試料を、Agilent DB-35GCカラム(30m×0.32mm×0.25um)に1/50分割で注入した。ヘリウムを1mL/分の一定流に保った。オーブン温度を190℃に2分間保ち、202℃まで4℃/分の速度で強めた。
ろ過された細胞培養培地試料を、さらなる精製は行わずに分析した。おおよそ60μgの各試料を60単位のIdeS酵素(fabRICATOR、Genovis、スウェーデン、ルンド)を用いて37℃で30分間消化した。消化された試料を、次いで、4M塩化グアニジニウム中で50mMジチオトレイトール(DTT)を用いて55℃で10分間還元した。次いで、消化された及び還元された試料をRP-HPLC/MSにより分析した。
100μgの精製された抗体を、PNGase F(New England Biolabs)で消化し、その後、0.04Mシアノ水素化ホウ素ナトリウムを伴う12mg/mLの2-アミノ安息香酸(2AA)を含有する50μLの蛍光標識溶液を添加した。この混合物を80℃で75分間インキュベートした。標識されたグリカンを、蛍光検出器(マサチューセッツ州、ミルフォード)を備えたAcquity UPLCによって分析した。おおよそ3μLの標識されたグリカンを、Acquity UPLC BEHグリカンカラム(186004741番、マサチューセッツ州、ミルフォード)に注入し、その後、360nmでの発光及び425nmでの検出を使用して蛍光検出した。2AAで標識したグリカン種は、MS/MS技術により同定した。
モデル予測制御(MPC)及びモデルパラメータを当てはめるためのプログラミングは、MATLAB(バージョンR2014a、Mathworks)においてなされ、コードは補足資料にて入手可能である。モデルパラメータは、単回の訓練リアクター実行からのデータに対するモデル方程式の最小二乗回帰により決定した。(MPCを介する)マンノース供給による高マンノースの制御のために、それぞれの毎日の割合変化を以下のステップを介して算出した:
1.現行モデルオフセットの算出。毎日の測定値(入手可能である場合)と組み合わせたリアクター操作履歴を入力として使用してモデル微分方程式の数値解を生成する。そして、モデルと最も直近の測定との間の差異が算出され得る。この差異は、将来のオフセットの推定として使用された。
Hk-時点kでのモデル値=f(tk)
H’k=時点kでの測定値
Hk+1=時点k+1での調整された予測値=F(tk+1)+(Hk-H’k)
2.MPCを介した最適な将来割合の決定。標準MPC後退ホライズン法17を一度制御が開始されたら各日に使用した。5つの割合変更の最適なセットを、モデルにより予測される生成物品質プロファイルと標的設定点との間の二乗誤差の合計を最小化することによって決定した。5つの割合変更が算出されたが、最初のもののみを使用した。次の割合変更が実施されることになったころには、新しいデータが利用可能であり、これは、次いで将来の割合の最適なセットを再算出するために使用された。
マンノースのリアルタイム定量化は、MPCのために必要な入力であった。GCMSを使用して、細胞培養培地中のヘキソース(マンノース及びグルコース)を区別した。ヘキソースは、上述のように同位体希釈により定量化した。図11(A)は、マンノースのGCによる及び典型的な実行中の細胞培養培地からのベースライン分離を示す。図11(B)は、ヘキソース断片化パターン(マンノース及びグルコース間で同一)を示し、ここでm/z204ピークは、13C標識内部標準からのm/z206ピークを使用して定量化された。グルコース及びマンノースの両方に関する検出限界は、0.02g/Lであり、線形性は最大で6g/Lヘキソースまでの定量化について実証された(図11(C))。
細胞を、一定の10g/L総ヘキソースで、しかし10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8及び0:10のグルコース:マンノース比率へとマンノースの濃度を増加させて培養した。細胞を、異なるヘキソース比率で24時間培養した。上清を除去し、IgGを精製し、高マンノース率(%)をHILICアッセイにより測定した。図12(A)は、細胞培養培地中のマンノースの濃度と総高マンノースレベルとの間で線形関係を実証し、ここで、高マンノースは、グルコースのみを含有する培地中では10%で最小であり、マンノースのみを含有する培地中では37%で最高であった。
制御ループ開発のために、バイオリアクターを、通常のバイオリアクター制御及びオフライン分析に加えて、MAST SP200自動化サンプリング装置及びマンノース溶液供給ポンプに接続した。(図13)。15日間の灌流バイオリアクター実行を行って、マンノース供給を使用する高マンノースの一側制御のためのMPCフィードバックループを開発するための訓練データを生成した。高マンノース率(%)(図14(A))、リアクター内のマンノース濃度(図14(B))、細胞増殖(図14(C))及び力価蓄積(図14(D))についてのデータを、9~11日目の間収集しなかったグリカンデータを除いて、4時間間隔で収集した。MPCモデルは、エラーのために、同様の実行から算出された増殖パラメータを除いて、このデータセットから開発された。増殖パラメータの両方のセットを使用するモデル予測を図14に示し、これはほとんど同一である。
通常の微分方程式を、細胞数、生成物、マンノース濃度、及び高マンノース種の変化の割合を説明するように、構築した。
生成物濃度は、Pであり、qpは、比生産性である。Sは、灌流フィルタを通過する生成物の割合であるふるい係数であり、Dは、リアクター容積/日での灌流速度である。マンノースの変化の割合
パラメータ値の誘導の後、フィードバックループをバイオリアクター実行において使用して、抗体Aについて高マンノースレベル率(%)を6%+/-1%に能動的に制御した。灌流及びマンノース供給を、産生培養の2日目に開始した。初期マンノース供給は、リアクター内のその濃度を大体一定に保つ速度に設定した。この初期マンノース供給は、本プロセスを用いた以前の実験に基づいて推算され、制御ループの一部ではなかった。制御ループは、産生の5日目に開始された。試料を毎日採取し、分析して、MPCモデルへの入力を決定した。リアクター試料及び速度変化間のラグは、5~14時間の範囲であり、平均は8.5時間であった。一度、全ての必要なデータが利用可能になると、それらを、MATLABモデルに手動で入力して、次のマンノース供給速度を算出した。結果得られた高マンノース率(%)、他のモデル化量、及び結果得られたMPCに基づく供給濃度(供給速度から算出)の軌道を図15に示す。一度、制御が開始されたら、測定された及びモデル化された高マンノース率(%)は、急速に増加し、6%標的の1%以内に維持された(図15(A))。測定された及びモデル化されたマンノース濃度プロファイルは、予測通りマンノース供給に応答して増減した(図15(B))。細胞増殖は、6日目及び12日目のかなり著しい偏差を除いて、想定されたロジスティック曲線に大部分が従った(図15(C))。測定された力価は、モデルと適合したが、培養の最後の数日での中断は、モデルがタンパク質産生を推定中であった証拠であった(図15(D))。測定を適合させるためのMPCモデル状態の調整は、観察された偏差にもかかわらず、高マンノースの良好な制御を可能にした。図16では、PACプロセス及び過去の試験的プラント実行間の比較を示す。過去の実行は、能動的な制御ループは伴わないが、PACプロセスに設計及び性能において類似する従来のプロセスを使用して行われた。代わりに、従来のプロセスは、析出のための品質管理を通る必要があるだろう、所望の生成物を送達するために全バッチについて誤差内で実行するための静的なプロセスパラメータに依存する。PACプロセスでは、PQは、準リアルタイムで測定され、産生実行中の能動的制御のために、その後の析出前の分析的特徴づけを必要としないだろう。
Claims (16)
- 組換えタンパク質を回収するための方法であって、
1)組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞をバイオリアクターに播種することによって細胞培養を確立するステップと、
2)1g/Lの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合又は補充された新鮮な細胞培養培地を細胞培養物に灌流し、前記細胞培養物を、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持する孔径又は分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通すことによって、前記細胞培養を維持し、透過物を収集するステップと、
3)所定のパラメータに到達したら、5g/Lの濃度の非イオン性ブロック共重合体を達成するように配合又は補充された新鮮な細胞培養培地を前記細胞培養物に灌流すること、及び前記細胞培養物を、前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径又は分子量カットオフを有する中空糸フィルタに通すステップと、
4)前記組換えタンパク質を含有する透過物を収集するステップと
を含む、方法。 - 前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持する孔径又は分子量カットオフを有する中空糸フィルタ及び前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径又は分子量カットオフを有する前記中空糸フィルタが、単一ユニットフィルタシステムの構成要素である、請求項1に記載の方法。
- 前記非イオン性ブロック共重合体は、前記バイオリアクター内の散布及び泡に起因する気泡により誘発される死から細胞を保護するポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロック共重合体である、請求項1に記載の方法。
- 前記非イオン性ブロック共重合体は、ポロクサマー188である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、アルキルポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレンオキシド)の共重合体、及びポリ(プロピレンオキシド)の共重合体、ポリ(ビニルピロリドン)、アルキルポリグルコシド、脂肪族アルコール、又はコカミドをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 非イオン性ブロック共重合体は、前記バイオリアクター内の散布及び泡に起因する気泡により誘発される死から細胞を保護するポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロック共重合体である、請求項2に記載の方法。
- 前記非イオン性ブロック共重合体は、ポロクサマー188である、請求項2に記載の方法。
- 前記所定のパラメータは、時点に基づく、請求項1に記載の方法。
- 前記所定のパラメータは、細胞培養の確立の少なくも12時間~25日後である、請求項9に記載の方法。
- 維持するステップの間に収集された前記透過物が、前記組換えタンパク質を含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持する孔径又は分子量カットオフを有する中空糸フィルタの分子量カットオフが、300kDa以下である、請求項11に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持する孔径又は分子量カットオフを有する中空糸フィルタが、限外ろ過膜である、請求項11に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径又は分子量カットオフを有する中空糸フィルタの分子量カットオフが、少なくとも500kDaである、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径又は分子量カットオフを有する中空糸フィルタの分子量カットオフが、少なくとも750kDaである、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質を前記バイオリアクター内に保持しない孔径又は分子量カットオフを有する中空糸フィルタが、精密ろ過膜である、請求項14に記載の方法。
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