KR102391259B1 - 포유류 세포 배양물을 회수하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포유류 세포를 배양하고 재조합 단백질을 수확하기 위한 방법 및 재료를 제공한다.

Description

포유류 세포 배양물을 회수하는 방법 {METHODS FOR HARVESTING MAMMALIAN CELL CULTURES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2014년 6월 4일에 출원된 미국 가출원 제62/007,588호(이의 전체내용은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)의 이익을 주장한다.
기술분야
본 발명은 포유류 세포를 배양하고, 재조합 단백질을 회수하기 위한 방법 및 재료를 제공한다.
치료학적 재조합 단백질의 더 높은 품질의 바람이 점점 더 성장하면서, 공정 최적화, 특히 세포 생존능력 및 단백질 회수에 긍정적인 영향을 미치는 제조 세포 배양을 성장시키고 공급하고 유지시키기 위한 방법 및 전략에 더 많은 노력이 있다. 재조합 단백질의 제조를 위한 제조 공정의 개발은 많은 변수가 균형을 이루어야 하는 복잡한 노력이다. 이것은 세포 배양 공정의 모든 요소가 제조의 후기 단계, 특히 수확 및 하류 공정처리에 많은 영향을 미칠 수 있는 상류 공정에 대해 특히 사실이다.
통상적인 세포 배양은 성장기(growth phase), 즉 세포 밀도가 증가하는 지수 성장의 기간을 겪는다. 성장기에 지수 세포 성장이 느려지고 단백질 생성이 증가하기 시작할 때인 전이기(transition phase)가 후행한다. 이것은 세포 밀도가 통상적으로 변동이 없고 생성물 역가가 증가하는 생성기(production phase)인 정상 단계의 시작을 마크한다. 세포 배양이 일련의 수일 동안 유지된 후 전체 배양이 한번에 수확되는 회분식 수확 시스템에서, 세포 배양이 통상적으로 이의 가장 큰 생산량에 도달할 때 대부분의 생성물은 수확 전에 마지막 수일에 생성될 수 있다. 이것이 단일의 높은 역가 수확을 발생시킬 수 있으면서, 이것은 다음 실행을 개시시키는 비생산적 턴어라운드 시간 및 다시 한번 피크 생성을 달성하는 지체 시간을 훼손시킨다. 생성물 함유 투과액이 생성기를 통해 연속 기준으로 세포 배양으로부터 수집되는 연속식 수확 시스템에서, 수확 및 정제 단계 동안 다뤄지는 폐기물 세포 배양 유체의 더 높은 용적 및 더 낮은 생성물 역가의 훼손시에만, 세포 배양 기간이 연장된다.
세포 배양 및 수확 공정 개발은 궁극적으로 공정 최적화, 거래 변수, 예컨대 생성물 역가에 대한 공정처리 속도 및 생성물 품질의 훈련이다. 도전과제는 예를 들어 세포 생존능력의 유지, 작업 가능한 생성물 역가의 달성 및 상류 공정으로부터의 생산량과 수확 및 하류 공정이 취급될 수 있는 생산량의 균형을 포함한다.
대규모 세포 배양 공정의 비용, 및 생물학적 생성물의 더 많은 분량 및 이에 대한 더 낮은 비용에 대한 바람의 증가를 고려하면 재조합 단백질 제조 및 회수의 더욱 증가의 개선을 제공하는 새로운 공정 방법은 가치가 있다. 더 많은 생성물 회수를 발생시켜, 단백질 치료제의 제조와 연관된 비용을 감소시킬 수 있는 세포 배양 공정의 개선이 필요하다. 본 발명은 단백질 회수를 증가시키면서 세포 배양 기간을 연장하기 위한 이러한 방법 및 재료를 제공하면서 이 수요를 충족한다.
본 발명은 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의해 생물반응기를 접종함으로써 세포 배양을 확립하는 단계, 새로운 세포 배양 배지를 생물반응기로 관류시킴으로써 세포 배양을 유지시키고, 세포 배양물을 필터를 통해 통과시키고, 투과액을 수집하는 단계(여기서, 수확 투과액(harvest permeate)이 미리 결정된 시간 동안 수집되는, 제1의 미리 결정된 매개변수에 도달할 때까지, 무효 투과액(null permeate)이 초기에 수집됨), 이후 제2의 미리 결정된 매개변수에 도달할 때까지 무효 투과액을 교대하여 수집한 후, 수확 투과액을 미리 결정된 시간 동안 수집하는 단계(여기서, 무효 투과액 및 수확 투과액의 교대 수집은 세포 배양이 종료할 때까지 계속됨)를 포함하는 연장된 정기적 수확을 위한 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 미리 결정된 매개변수는 시간, 생존가능한 세포 밀도, 충전된 세포 용적 또는 역가로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 제1의 미리 결정된 매개변수는 세포 배양의 확립 이후 적어도 12시간 내지 25일이다. 일 실시형태에서, 제1의 미리 결정된 매개변수는 세포 배양의 확립 이후 적어도 24시간 내지 72시간이다. 일 실시형태에서, 제1의 미리 결정된 매개변수는 세포 배양의 확립 이후 적어도 4일이다. 일 실시형태에서, 제1의 미리 결정된 매개변수는 세포 배양의 확립 이후 적어도 5일 이상이다. 일 실시형태에서, 제1의 미리 결정된 매개변수는 세포 배양의 확립 이후 적어도 25일이다. 일 실시형태에서, 제1의 미리 결정된 매개변수는 세포 배양의 확립 이후 적어도 5일 내지 25일이다. 일 실시형태에서, 제1의 미리 결정된 매개변수는 세포 배양의 확립 이후 적어도 10일 내지 12일이다.
일 실시형태에서, 제2의 미리 결정된 매개변수는 수확 투과액의 수집 이후 적어도 12시간 내지 72시간이다. 일 실시형태에서, 제2의 미리 결정된 매개변수는 수확 투과액의 수집 이후 적어도 24시간 내지 72시간이다. 일 실시형태에서, 제2의 미리 결정된 매개변수는 수확 투과액의 수집 이후 적어도 24시간 내지 48시간이다.
일 실시형태에서, 미리 결정된 시간은 적어도 12시간 내지 72시간이다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 시간은 적어도 24시간 내지 72시간이다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 시간은 적어도 24시간 내지 48시간이다.
일 실시형태에서, 무효 투과액은 적어도 24시간 내지 25일 동안 초기에 수집되고, 이때 수확 투과액은 12시간 내지 72시간 동안 수집된 후, 대안적으로 무효 투과액은 적어도 24시간 내지 25일 동안 수집되고, 이후 수확 투과액은 12시간 내지 72시간 동안 수집된다.
일 실시형태에서, 무효 투과액이 수집될 때, 필터는 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 중공 섬유 필터이다. 관련 실시형태에서, 분자량 컷오프는 300kDa 이하이다. 관련 실시형태에서, 중공 섬유 필터는 울트라필터이다.
일 실시형태에서, 수확 투과액이 수집될 때, 필터는 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 중공 섬유 필터이다. 관련 실시형태에서, 분자량 컷오프는 적어도 500kDa이다. 관련 실시형태에서, 중공 섬유 필터는 마이크로필터이다.
일 실시형태에서, 필터는 단일 유닛 필터 시스템이다. 관련 실시형태에서, 단일 유닛 필터 시스템은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분 및 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분을 포함한다. 관련 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분의 분자량 컷오프는 300kDa 이하이다. 관련 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분의 분자량 컷오프는 적어도 500kDa이다. 관련 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 울트라필터이고, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 마이크로필터이다. 관련 실시형태에서, 단일 유닛 필터 시스템은 하우징 내에 함유된다. 관련 실시형태에서, 단일 유닛 필터 시스템은 중공 섬유 필터 성분의 적어도 2개 사이에 스페이서(spacer)를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 무효 투과액이 수집될 때, 이것은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분으로부터 배출된다.
일 실시형태에서, 수확 투과액이 수집될 때, 이것은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분으로부터 배출된다.
일 실시형태에서, 투과액이 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터인 필터로부터 수집될 때, 새로운 세포 배양 배지는 적어도 5g/ℓ의 비이온성 블록 공중합체를 달성하도록 제제화되거나 보충된다. 관련 실시형태에서, 비이온성 블록 공중합체는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체이다. 관련 실시형태에서, 비이온성 블록 공중합체는 폴록사머(poloxamer) 188이다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 세포 배양 공정 동안 샘플을 수취하는 단계, 재조합 단백질의 특징 및/또는 세포 배양 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하도록 샘플을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 관련 실시형태에서, 샘플은 공정 분석 기법을 이용하여 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링된다.
일 실시형태에서, 관류는 연속식 관류이다. 일 실시형태에서, 관류의 속도는 일정하다. 일 실시형태에서, 관류는 매일 1.0 이하의 작업 용적의 속도로 수행된다. 일 실시형태에서, 관류는 연동 펌프(peristaltic pump), 이중 격막 펌프, 저전단 펌프 또는 교대 접선 유동에 의해 달성된다. 관련 실시형태에서, 관류는 교대 접선 유동에 의해 달성된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 세포가 a) 제1의 시간 기간 동안 제1 온도에서 및 b) 제2의 시간 기간 동안 제2 온도에서 배양되는 온도 이동으로 세포 배양을 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 관련 실시형태에서, 성장기와 생성기 사이에 전이에서 온도 이동이 발생한다. 관련 실시형태에서, 생성기 동안 온도 이동이 발생한다. 관련 실시형태에서, 온도 이동은 미리 결정된 매개변수에 반응한다. 관련 실시형태에서, 온도 이동은 미리 결정된 매개변수에 반응하고, 미리 결정된 매개변수의 달성은 커패시턴스 기반 바이오매스 프로브를 사용하여 결정된다.
일 실시형태에서, 세포 배양은 적어도 0.1x106개의 생존가능한 세포/㎖에 의해 생물반응기를 접종함으로써 확립된다. 관련 실시형태에서, 교대 접선 유동 여과를 사용하여 관류 공정에 의해 접종원을 성장시켰다.
일 실시형태에서, 생물반응기에 진입하기 전에, 세포 배양 배지를 나노여과, 고온 단시간(high temperature short time; HTST), 또는 여과와 조합된 UV를 사용하여 처리한다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 제조 생물반응기이다. 관련 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 500ℓ의 용량을 가진다. 관련 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 500ℓ 내지 2000ℓ의 용량을 가진다. 관련 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 1000ℓ 내지 2000ℓ의 용량을 가진다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 혈청 비함유 세포 배양 배지이다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 혈청 비함유 화학적 한정 세포 배양 배지이다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 관류 세포 배양 배지이다.
일 실시형태에서, 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포이다. 일 실시형태에서, 재조합 단백질은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 융합 단백질 또는 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 응집, 침전, 원심분리, 심층 여과(depth filtration), 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 수산화인회석 크로마토그래피 중 하나 이상에 의해 수확 투과액으로부터 정제된다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 정제 공정 동안 샘플을 수취하는 단계, 재조합 단백질의 특징 및 정제 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하기 위해 샘플을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 약제학적으로 허용되는 제제로 제제화된다. 일 실시형태에서, 상기 방법에 의해 제조된 재조합 단백질이 제공된다.
본 발명은 또한 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의해 생물반응기를 접종함으로써 세포 배양을 확립하는 단계, 적어도 5g/ℓ의 비이온성 블록 공중합체의 농도를 달성하도록 제제화되거나 보충된 새로운 세포 배양 배지에 의해 세포 배양을 관류시킴으로써 세포 배양을 유지시키고, 세포 배양을 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 중공 섬유 필터를 통해 통과시키고, 재조합 단백질을 함유하는 투과액을 수집하는 단계를 포함하는 재조합 단백질을 수확하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 분자량 컷오프는 적어도 500kDa이다. 일 실시형태에서, 중공 섬유 필터는 마이크로필터이다.
본 발명은 또한 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의해 생물반응기를 접종함으로써 세포 배양을 확립하는 단계, 적어도 1g/ℓ의 비이온성 블록 공중합체의 농도를 달성하도록 제제화되거나 보충된 새로운 세포 배양 배지에 의해 세포 배양을 관류시킴으로써 세포 배양을 유지시키고, 세포 배양을 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 중공 섬유 필터를 통해 통과시키고, 투과액을 수집하는 단계; 미리 결정된 매개변수에 도달하면, 적어도 5g/ℓ의 비이온성 블록 공중합체의 농도를 달성하도록 제제화되거나 보충된 새로운 세포 배양 배지에 의해 세포 배양을 관류시키고, 세포 배양을 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 중공 섬유 필터를 통해 통과시키고, 재조합 단백질을 함유하는 투과액을 수집하는 단계를 포함하는 재조합 단백질을 수확하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터의 분자량 컷오프는 300kDa 이하이다. 일 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터는 울트라필터이다.
일 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 중공 섬유 필터의 분자량 컷오프는 적어도 500kDa이다. 일 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 중공 섬유 필터는 마이크로필터이다.
일 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터 및 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터는 단일 유닛 필터 시스템의 성분이다.
일 실시형태에서, 비이온성 블록 공중합체는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체이다. 일 실시형태에서, 비이온성 블록 공중합체는 폴록사머 188이다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 세포 배양 공정 동안 샘플을 수취하는 단계, 재조합 단백질의 특징 및/또는 세포 배양 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하도록 샘플을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 샘플은 공정 분석 기법을 이용하여 정량적으로 및/또는 정성적으로 모티터링된다.
일 실시형태에서, 관류는 연속식 관류이다. 일 실시형태에서, 관류의 속도는 일정하다. 일 실시형태에서, 관류는 매일 1.0 이하의 작업 용적의 속도로 수행된다. 일 실시형태에서, 관류는 연동 펌프, 이중 격막 펌프, 저전단 펌프 또는 교대 접선 유동에 의해 달성된다. 일 실시형태에서, 관류는 교대 접선 유동에 의해 달성된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 세포가 a) 제1의 시간 기간 동안 제1 온도에서 및 b) 제2의 시간 기간 동안 제2 온도에서 배양되는 온도 이동으로 세포 배양을 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 관련 실시형태에서, 성장기와 생성기 사이에 전이에서 온도 이동이 발생한다. 관련 실시형태에서, 생성기 동안 온도 이동이 발생한다. 관련 실시형태에서, 온도 이동은 미리 결정된 매개변수에 반응한다. 관련 실시형태에서, 온도 이동은 미리 결정된 매개변수에 반응하고, 미리 결정된 매개변수의 도달은 커패시턴스 기반 바이오매스 프로브를 사용하여 결정된다.
일 실시형태에서, 세포 배양은 적어도 0.1x106개의 생존가능한 세포/㎖에 의해 생물반응기를 접종함으로써 확립된다. 일 실시형태에서, 교대 접선 유동 여과를 사용하여 관류 공정에 의해 접종원을 성장시켰다.
일 실시형태에서, 생물반응기에 진입하기 전에, 세포 배양 배지를 나노여과, 고온 단시간(HTST), 또는 여과와 조합된 UV를 사용하여 처리한다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 제조 생물반응기이다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 500ℓ의 용량을 가진다. 관련 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 500ℓ 내지 2000ℓ의 용량을 가진다. 관련 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 1000ℓ 내지 2000ℓ의 용량을 가진다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 혈청 비함유 세포 배양 배지이다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 혈청 비함유 화학적 한정 세포 배양 배지이다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 관류 세포 배양 배지이다.
일 실시형태에서, 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 융합 단백질 또는 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 응집, 침전, 원심분리, 심층 여과, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 수산화인회석 크로마토그래피 중 하나 이상에 의해 수확 투과액으로부터 정제된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 정제 공정 동안 샘플을 수취하는 단계, 재조합 단백질의 특징 및 제조 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하기 위해 샘플을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 약제학적으로 허용되는 제제로 제제화된다.
일 실시형태에서, 상기 방법에 의해 제조된 재조합 단백질이 제공된다.
본 발명은 또한 상이한 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)의 2개 이상의 중공 섬유 필터 성분을 포함하는 단일 유닛 필터 시스템을 제공하고, 중공 섬유 필터 성분은 무균 흐름 경로가 개별 중공 섬유 사이에 유지되도록 직렬로 서로에 고정되고, 투과액이 각각의 개별적인 중공 섬유 필터 성분으로부터 독립적으로 제거될 수 있도록 상이한 기공 크기 또는 분자량 컷오프의 중공 섬유 필터 성분이 투과액이 인출되는 이의 중공 쉘 면과 관련하여 서로로부터 격리된다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지고, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터인 기공 크기 필터를 가진다. 관련 실시형태에서, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 300kDa 이하의 분자량 컷오프를 가지고, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 적어도 500kDa의 분자량 컷오프를 가진다. 관련 실시형태에서, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 울트라필터이고, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 마이크로필터이다. 관련 실시형태에서, 단일 유닛 필터 시스템은 하우징 내에 함유된다. 일 실시형태에서, 단일 필터 유닛는 중공 섬유 필터 성분의 적어도 2개 사이의 스페이서를 추가로 포함한다.
상기 방법은 또한 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의해 생물반응기를 접종함으로써 세포 배양을 확립하는 단계, 새로운 세포 배양 배지를 생물반응기로 관류시킴으로써 세포 배양을 유지시키고, 세포 배양을 단일 유닛 필터 시스템을 통해 통과시키고, 투과액을 수집하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 방법을 제공하고, 여기서 단일 유닛 필터 시스템은 생물반응기에 부착되고, 세포 배양은 단일 펌핑 시스템에 의해 생물반응기로부터 단일 유닛 필터 시스템으로 배출되고, 세포 배양은 단일 유닛 필터 시스템의 중공 섬유의 루멘 면을 통해 생물반응기로 다시 통과하고, 투과액은 중공 섬유 필터 성분의 하나 이상으로부터 인출된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 세포 배양 공정 동안 샘플을 수취하는 단계, 재조합 단백질의 특징 및/또는 세포 배양 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하도록 샘플을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 관련 공정에서, 샘플은 공정 분석 기법에 의해 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링된다.
일 실시형태에서, 관류는 연속식 관류이다. 일 실시형태에서, 관류의 속도는 일정하다. 일 실시형태에서, 관류는 매일 1.0 이하의 작업 용적의 속도로 수행된다.
일 실시형태에서, 관류는 연동 펌프, 이중 격막 펌프, 저전단 펌프 또는 교대 접선 유동에 의해 달성된다. 일 실시형태에서, 관류는 교대 접선 유동에 의해 달성된다.
일 실시형태에서, 투과액이 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터 성분으로부터 수집될 때, 새로운 세포 배양 배지는 5g/ℓ의 비이온성 블록 공중합체를 달성하도록 제제화되거나 보충된다. 관련 실시형태에서, 비이온성 블록 공중합체는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체이다. 관련 실시형태에서, 비이온성 블록 공중합체는 폴록사머 188이다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 세포가 a) 제1의 시간 기간 동안 제1 온도에서 및 b) 제2의 시간 기간 동안 제2 온도에서 배양되는 온도 이동으로 세포 배양을 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 성장기와 생성기 사이에 전이에서 온도 이동이 발생한다. 관련 실시형태에서, 생성기 동안 온도 이동이 발생한다. 관련 실시형태에서, 온도 이동은 미리 결정된 매개변수에 반응하고, 미리 결정된 매개변수의 도달은 커패시턴스 기반 바이오매스 프로브를 사용하여 결정된다.
일 실시형태에서, 세포 배양은 적어도 0.1x106개의 생존가능한 세포/㎖에 의해 생물반응기를 접종함으로써 확립된다. 관련 실시형태에서, 교대 접선 유동 여과를 사용하여 관류 공정에 의해 접종원을 성장시켰다.
일 실시형태에서, 생물반응기에 진입하기 전에, 세포 배양 배지를 나노여과, 고온 단시간(HTST), 또는 여과와 조합된 UV를 사용하여 처리한다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 제조 생물반응기이다. 관련 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 500ℓ의 용량을 가진다. 관련 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 500ℓ 내지 2000ℓ의 용량을 가진다. 관련 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 1000ℓ 내지 2000ℓ의 용량을 가진다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 혈청 비함유 세포 배양 배지이다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 혈청 비함유 화학적 한정 세포 배양 배지이다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 관류 세포 배양 배지이다.
일 실시형태에서, 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 융합 단백질 또는 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 응집, 침전, 원심분리, 심층 여과, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 수산화인회석 크로마토그래피 중 하나 이상에 의해 수확 투과액으로부터 정제된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 정제 공정 동안 샘플을 수취하는 단계, 재조합 단백질의 특징 및 정제 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하기 위해 샘플을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 약제학적으로 허용되는 제제로 제제화된다. 일 실시형태에서, 상기 방법에 의해 제조된 재조합 단백질이 제공된다.
도 1: 세포 배양 유체가 단일 개구를 통해 들어가고 나오는 단일 개구를 가지는 단일 유닛 필터 시스템의 도식. 필터는 임의의 배향일 수 있고, 마이크로필터 중공 섬유, 이어서 울트라필터 중공 섬유가 도시되어 있다.
도 2: 한외여과 공정[n=4(채워진 원)]과 비교하여 연장된 수확 공정[n=2(비어 있는 사각형)]으로부터의 역가.
도 3: 한외여과 공정[n=4(채워진 원)]과 비교하여 연장된 수확 공정[n=2(비어 있는 사각형)]으로부터의 생존가능한 세포 밀도.
도 4: 한외여과 공정[n=4(채워진 원)]과 비교하여 연장된 수확 공정[n=2(비어 있는 사각형)]으로부터의 생존능력(%).
도 5: 750kDa 필터(비어 있는 원)가 장착된 반응기 및 30kDa 필터(채워진 원)가 장착된 반응기로부터의 생존능력(%). 생존능력(%)은 750kDa 필터가 장착된 반응기에서 6일에 80%로 감소하였다. 30kDa 필터가 구비된 반응기에서의 생존능력(%)은 14일 동안 80% 초과에서 유지되었다.
도 6: 30kDa 또는 750kDa 중공 섬유 필터 유닛을 가지는 반응기의 상청액(채워진 원) 및 투과액(비어 있는 사각형)에서 측정된 루트롤(Lutrol)(등록상표) F68 농도. 30kDa 상청액은 9-13일에 걸쳐 루트롤(등록상표) F68의 축적을 보여준다.
도 7a: 세포 밀도 비율을 제공하는, 1g/ℓ와 비교하여 각각의 루트롤(등록상표) F68 농도(2g/ℓ-5g/ℓ)에서의 세포주 A 및 B에 대한 정규화된 생존가능한 세포 밀도. 1g/ℓ의 것과 비교하여 모든 계대배양에서의 데이터 사이의 스튜던트 t-시험을 사용하여 비교하였다. 통계 유의성: * < 0.0001; ** < 0.001; *** < 0.01; **** < 0.05.
도 7b: 1g/ℓ와 비교하여 각각의 루트롤(등록상표) F68 농도(2g/ℓ -5g/ℓ)에서의 세포주 A 및 B에 대한 생존능력(%). 1g/ℓ의 것과 비교하여 모든 계대배양에서의 데이터 사이의 스튜던트 t-시험을 사용하여 비교하였다. 통계 유의성: * < 0.0001; ** < 0.001; *** < 0.01; **** < 0.05.
도 7c: 1g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68에서의 세포 직경과 비교하여 각각의 루트롤(등록상표) F68 농도에서의 세포주 A 및 B에 대한 세포 직경. 1g/ℓ의 것과 비교하여 모든 계대배양에서의 데이터 사이의 스튜던트 t-시험을 사용하여 비교하였다. 통계 유의성: * < 0.0001; ** < 0.001; *** < 0.01; **** < 0.05.
도 8: 1g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68(비어 있는 사각형) 및 5g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68(채워진 원)에서의 세포주 A 및 B에 대한 세포 생존능력(%). 생존능력은 루트롤(등록상표) F68의 농도가 5g/ℓ로 증가할 때 30일 초과 동안 90% 초과에서 유지되었다.
도 9: 1g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68(채워진 사각형) 또는 5g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68(비어 있는 원)을 함유하는 관류 배지를 가지는 750kDa ATF 필터를 가지는 2ℓ 반응기에서 성장한 세포의 생존능력에 대한 플루로닉(pluronic) 농도의 효과.
도 10: 750kDa ATF 필터를 가지는 2ℓ 반응기에서 1g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68에서 성장한 세포의 생존능력의 회수에 대한 루트롤(등록상표) F68(5g/ℓ 이하)의 농도의 증가의 효과. 배지 A: 채워진 원. 배지 B: 비어 있는 원. 화살표는 루트롤(등록상표) F68 농도가 증가할 때를 나타낸다.
도 11: 포도당 및 만노스의 GCMS 정량화. (A) 헥소스의 GC 분리를 위한 TIC 및 (B) 12C-헥소스 및 13C-내부 표준 헥소스 둘 다를 함유하는 헥소스 피크에서 발견된 통상적인 질량 스펙트럼 단편화 패턴. (C) 포도당 및 만노스 정량화를 위한 검정 직선성.
도 12: IgG의 고 만노스 글리코실화에 대한 만노스의 효과. (A) 증가하는 양의 만노스에 의해 배양된 CHO 세포; (B) 증가하는 양의 만노스에 의해 그리고 상이한 농도의 포도당에서 배양된 CHO 세포. 고 만노스 글리코실화의 직선 증가는 포도당 농도와 독립적이다.
도 13: PAC 피드백 루프의 도식. 미리 한정된 생성물 품질 속성을 전달하기 위해 필요한 PAC 공정의 주요 요소는 QTPP, 자동화 샘플링 및 속성 특정 분석법을 포함하는 PAT 시스템, 공정을 변형하기 위한 제어 모델 및 속성 수준을 조정하기 위해 공지된 제어 레버를 가지는 공정이다.
도 14: 최소 자승 회귀를 통한 모델 매개변수를 계산하기 위해 단일 반응기 실행을 이용하였다. 기호는 최소 자승 회귀를 통한 모델 매개변수를 발견하기 위해 사용된 측정이다. 파선은 생성된 모델 결과이다. 점선은 MPC에 사용된 성장 매개변수를 사용한 모델 피트이다. 도면 A 및 B에서의 적색 실선은 이 훈련 데이터를 생성하기 위해 사용된 만노스 공급물을 보여준다. A) 고 만노스(%), B) 반응기 만노스 농도, C) 세포 밀도(임의로 등급 매겨진 계산된 용적), D) 생성물 농도.
도 15: 모델 예측 제어를 통한 고 만노스(%)의 조절의 입증. 모든 도면에서, 기호는 측정된 값이지만, 오직 비어 있는 기호는 모델 예측 제어를 위해 사용되었다. 점선은 취해진 측정 및 제어 작용을 고려한 모델 결과이다. 도면 A 및 B에서의 적색 실선은 MPC에 의해 결정된 만노스 공급물을 보여준다. A) 고 만노스(%), B) 반응기 만노스 농도, C) 임의로 등급 매겨진 계산된 용적(SCV)으로서의 세포 밀도, D) 생성물 농도.
도 16: PAC 및 비-PAC 데이터의 비교. 고 만노스(%) 데이터를 HILIC 검정을 통해 얻었다.
본 발명은 높은 역가 투과액을 획득하면서 이의 피크 생성에서 연속식 세포 배양을 유지하는 것의 이점을 제공하는 연장된 정기적 수확 방법을 제공한다. 본 발명은 재조합 단백질 생성물을 발현하는 포유류 세포에 의해 생물반응기를 접종함으로써 세포 배양을 확립하는 단계, 새로운 세포 배양 배지를 생물반응기로 관류시킴으로써 세포 배양을 유지시키고, 세포 배양물을 필터를 통해 통과시키고, 투과액을 수집하는 단계(여기서, 수확 투과액이 미리 결정된 시간 동안 수집되는, 제1의 미리 결정된 매개변수에 도달할 때까지, 무효 투과액이 초기에 수집됨), 이후 제2의 미리 결정된 매개변수에 도달할 때까지 무효 투과액을 교대하여 수집한 후, 수확 투과액을 미리 결정된 시간 동안 수집하는 단계(여기서, 무효 투과액 및 수확 투과액의 교대 수집은 세포 배양이 종료할 때까지 계속됨)를 포함하는 연장된 정기적 수확을 위한 방법을 제공한다.
미리 결정된 매개변수는 세포 배양의 몇몇 원하는 특징, 속성 또는 성능 마일스톤; 예컨대, 생존가능한 세포 밀도, 충전된 세포 용적 또는 역가 또는 시점을 달성함으로써 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 매개변수는 생존가능한 세포 밀도가 1x106개 이상의 생존가능한 세포/㎖일 때 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 매개변수는 생존가능한 세포 밀도가 적어도 20x106개의 생존가능한 세포/㎖ 내지 30x106개의 생존가능한 세포/㎖일 때 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 매개변수는 충전된 세포 용적이 35% 이하일 때 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 매개변수는 충전된 세포 용적이 30% 이하일 때 도달할 수 있다.
미리 결정된 매개변수는 시점에 기초할 수 있다. 시점은 촉발 사건 또는 행동 이후 시간, 일, 주 또는 개월 단위로 측정될 수 있다. 촉발 사건 또는 행동은 배양 시 시간 또는 일, 생존가능한 세포 밀도의 도달, 충전된 세포 용적, 역가, 생물반응기의 접종 또는 수확 투과액의 수집과 같은 사건 이후 시간 또는 일일 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 매개변수는 촉발 사건 또는 행동 이후 12시간 내지 25일 내 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 매개변수는 촉발 사건 또는 행동 이후 24시간 내지 72시간 내 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 매개변수는 촉발 사건 또는 행동의 4일 내 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 매개변수는 촉발 사건 또는 행동 이후 5일 이상에 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 매개변수는 촉발 사건 또는 행동 이후 적어도 25일에 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1의 미리 결정된 매개변수는 생물반응기의 접종 이후 5일 내지 25일 내 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1의 미리 결정된 매개변수는 생물반응기의 접종 이후 10일 내지 12일 내 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 제2의 미리 결정된 매개변수는 수확 투과액의 수집 이후 12시간 내지 72시간 내 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 제2의 미리 결정된 매개변수는 수확 투과액의 수집 이후 24시간 내지 72시간 내 도달할 수 있다. 일 실시형태에서, 제2의 미리 결정된 매개변수는 수확 투과액의 수집 이후 24시간 내지 48시간 내 도달할 수 있다.
미리 결정된 매개변수에 도달하면, 미리 결정된 시간 동안 수확 투과액을 수집할 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 시간은 적어도 12시간 내지 72시간이다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 시간은 24시간 내지 72시간이다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 시간은 24시간 내지 48시간이다.
일 실시형태에서, 필터는 단일 유닛 필터 시스템이다. 관련 실시형태에서, 단일 유닛 필터 시스템은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가지는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분 및 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분의 분자량 컷오프는 300kDa 이하이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분의 분자량 컷오프는 적어도 500kDa이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 울트라필터이고, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 마이크로필터이다. 또 다른 실시형태에서, 단일 유닛 필터 시스템은 하우징 내에 함유된다. 또 다른 실시형태에서, 단일 유닛 필터 시스템은 중공 섬유 필터 성분의 적어도 2개 사이의 스페이서를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 무효 투과액이 단일 유닛 필터 시스템을 사용하여 수집될 때, 이것은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분으로부터 배출된다. 일 실시형태에서, 수확 투과액이 단일 유닛 필터 시스템을 사용하여 수집될 때, 이것은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 적어도 하나의 중공 섬유 필터로부터 배출된다. 일 실시형태에서, 투과액은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터인 필터로부터 수집되고, 새로운 세포 배양 배지는 적어도 5g/ℓ의 비이온성 블록 공중합체를 달성하도록 제제화되거나 보충된다. 관련 실시형태에서, 비이온성 블록 공중합체는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체이다. 또 다른 관련 실시형태에서, 비이온성 블록 공중합체는 폴록사머 188이다.
본 발명은 또한 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의해 생물반응기를 접종함으로써 세포 배양을 확립하는 단계, 적어도 5g/ℓ의 비이온성 블록 공중합체의 농도를 달성하도록 제제화되거나 보충된 새로운 세포 배양 배지에 의해 세포 배양을 관류시킴으로써 세포 배양을 유지시키고, 세포 배양을 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터를 통해 통과시키고, 재조합 단백질을 함유하는 투과액을 수집하는 단계를 포함하는 재조합 단백질을 수확하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 분자량 컷오프는 적어도 500kDa이다. 일 실시형태에서, 중공 섬유 필터는 마이크로필터이다.
본 발명은 또한 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의해 생물반응기를 접종함으로써 세포 배양을 확립하는 단계, 적어도 1g/ℓ의 비이온성 블록 공중합체의 농도를 달성하도록 제제화되거나 보충된 새로운 세포 배양 배지에 의해 세포 배양을 관류시킴으로써 세포 배양을 유지시키고, 세포 배양을 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터를 통해 통과시키고, 투과액을 수집하는 단계; 미리 결정된 매개변수에 도달하면, 적어도 5g/ℓ의 비이온성 블록 공중합체의 농도를 달성하도록 제제화되거나 보충된 새로운 세포 배양 배지에 의해 세포 배양을 관류시키고, 세포 배양을 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터를 통해 통과시키고, 재조합 단백질을 함유하는 투과액을 수집하는 단계를 포함하는 재조합 단백질을 수확하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터의 분자량 컷오프는 300kDa 이하이다. 관련 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터는 울트라필터이다. 일 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터의 분자량 컷오프는 적어도 500kDa이다. 관련 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터는 마이크로필터이다. 일 실시형태에서, 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터 및 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터는 단일 유닛 필터 시스템의 성분이다. 관련 실시형태에서, 비이온성 블록 공중합체는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체이다. 또 다른 관련 실시형태에서, 비이온성 블록 공중합체는 폴록사머 188이다.
본 발명은 또한 상이한 기공 크기 또는 분자량 컷오프의 2개 이상의 중공 섬유 필터 성분을 포함하는 단일 유닛 필터 시스템을 제공하고, 중공 섬유 필터 성분은 무균 흐름 경로가 개별 중공 섬유 사이에 유지되도록 직렬로 서로에 고정되고, 투과액이 각각의 개별적인 중공 섬유 필터 성분으로부터 독립적으로 제거될 수 있도록 상이한 기공 크기 또는 분자량 컷오프의 중공 섬유 필터 성분이 투과액이 인출되는 이의 중공 쉘 면과 관련하여 서로로부터 격리된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지고, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 생물반응기에서 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터인 기공 크기 필터를 가진다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 300kDa 이하의 분자량 컷오프를 가지고, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 적어도 500kDa의 분자량 컷오프를 가진다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 울트라필터이고, 적어도 하나의 중공 섬유 필터 성분은 마이크로필터이다. 일 실시형태에서, 단일 유닛 필터 시스템은 하우징 내에 함유된다. 일 실시형태에서, 단일 유닛 필터 시스템은 중공 섬유 필터 성분의 적어도 2개 사이의 스페이서를 추가로 포함한다.
관련 실시형태에서, 본 발명은 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포에 의해 생물반응기를 접종함으로써 세포 배양을 확립하는 것을 포함하는 재조합 단백질을 발현시키는 단계, 새로운 세포 배양 배지를 생물반응기로 관류시킴으로써 세포 배양을 유지시키고, 세포 배양을 단일 유닛 필터 시스템을 통해 통과시키고, 투과액을 수집하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 배양하고/하거나 수확하는 방법을 제공하고, 여기서 단일 유닛 필터 시스템은 생물반응기에 부착되고, 세포 배양은 단일 펌핑 시스템에 의해 생물반응기로부터 단일 유닛 필터 시스템으로 배출되고, 세포 배양은 단일 유닛 필터 시스템의 중공 섬유의 루멘 면을 통해 생물반응기로 다시 통과하고, 투과액은 중공 섬유 필터 성분의 하나 이상으로부터 인출된다.
관련 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포 배양 공정 동안 샘플을 수취하는 단계, 재조합 단백질의 특징 및/또는 세포 배양 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하도록 샘플을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 관련 실시형태에서, 샘플은 공정 분석 기법을 이용하여 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링된다.
본 발명의 방법의 관련 실시형태에서, 관류는 연속식 관류이다. 일 실시형태에서, 관류의 속도는 일정하다. 일 실시형태에서, 관류는 매일 1.0 이하의 작업 용적의 속도로 수행된다. 일 실시형태에서, 관류는 연동 펌프, 이중 격막 펌프, 저전단 펌프 또는 교대 접선 유동에 의해 달성된다. 일 실시형태에서, 관류는 교대 접선 유동에 의해 달성된다.
관련 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포가 a) 제1의 시간 기간 동안 제1 온도에서 및 b) 제2의 시간 기간 동안 제2 온도에서 배양되는 온도 이동으로 세포 배양을 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 성장기와 생성기 사이에 전이에서 온도 이동이 발생한다. 일 실시형태에서, 생성기 동안 온도 이동이 발생한다. 일 실시형태에서, 온도 이동은 미리 결정된 매개변수에 반응하고, 미리 결정된 매개변수의 도달은 커패시턴스 기반 바이오매스 프로브를 사용하여 결정된다. 일 실시형태에서, 온도 이동은 미리 결정된 매개변수에 반응하고, 미리 결정된 매개변수의 도달은 커패시턴스 기반 바이오매스 프로브를 사용하여 결정된다.
본 발명의 방법의 관련 실시형태에서, 세포 배양은 적어도 0.1x106개의 생존가능한 세포/㎖에 의해 생물반응기를 접종함으로써 확립된다. 일 실시형태에서, 교대 접선 유동 여과를 사용하여 관류 공정에 의해 접종원을 성장시켰다. 일 실시형태에서, 생물반응기에 진입하기 전에, 세포 배양 배지를 나노여과, 고온 단시간(HTST), 또는 여과와 조합된 UV를 사용하여 처리한다.
본 발명의 방법의 관련 실시형태에서, 생물반응기는 제조 생물반응기이다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 500ℓ의 용량을 가진다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 500ℓ 내지 2000ℓ의 용량을 가진다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 1000ℓ 내지 2000ℓ의 용량을 가진다.
본 발명의 방법의 관련 실시형태에서, 세포 배양 배지는 혈청 비함유 화학적 한정 세포 배양 배지이다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 관류 세포 배양 배지이다. 일 실시형태에서, 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일 실시형태에서, 재조합 단백질은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 융합 단백질 또는 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 관련 실시형태에서, 재조합 단백질은 응집, 침전, 원심분리, 심층 여과, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 수산화인회석 크로마토그래피 중 하나 이상에 의해 수확 투과액으로부터 정제된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 정제 공정 동안 샘플을 수취하는 단계, 재조합 단백질의 특징 및 정제 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하도록 샘플을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 샘플은 공정 분석 기법을 이용하여 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링된다. 일 실시형태에서, 재조합 단백질은 약제학적으로 허용되는 제제로 제제화된다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법에 의해 제조된 재조합 단백질을 제공한다.
세포 배양
"세포 배양" 또는 "배양"이란 다세포 유기체 또는 조직 밖의 세포의 성장 및 증식을 의미한다. 포유류 세포에 대한 적합한 배양 조건은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992)]을 참조한다. 포유류 세포는 현탁액 중에 또는 고체 기질에 부착된 채 배양될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "세포 배양 배지"(또한 "배양 배지", "세포 배양 배지", "조직 배양 배지"라 칭함)는 세포, 예를 들어 동물 또는 포유류 세포를 성장시키기 위해 사용되고, 일반적으로 하기로부터 적어도 하나 이상의 성분을 제공하는, 임의의 영양소 용액을 의미한다: 에너지원(보통 탄수화물, 예컨대 포도당의 형태); 모든 필수 아미노산 중 하나 이상, 및 일반적으로 20개의 기본 아미노산과 시스테인; 낮은 농도에서 통상적으로 필요한 비타민 및/또는 다른 유기 화합물; 지질 또는 유리 지방산; 및 마이크로몰 범위의 매우 낮은 농도에서 통상적으로 필요한 미량 원소, 예를 들어 무기 화합물 또는 천연 발생 요소.
영양소 용액은 배양하고자 하는 세포의 요건 및/또는 원하는 세포 배양 매개변수에 따라 세포의 성장을 최적화하기 위한 추가적인 성분, 예컨대 호르몬 및 다른 성장 인자, 예컨대 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 혈청 등; 염, 예컨대 칼슘, 마그네슘 및 인산염, 및 완충제, 예를 들어 HEPES; 뉴클레오사이드 및 염기, 예컨대 아데노신, 타이미딘, 하이폭산틴; 및 단백질 및 조직 가수분해물, 예컨대 가수분해된 식물 또는 동물 단백질(동물 부산물, 정제된 젤라틴 또는 식물 재료로부터 얻어질 수 있는 펩톤 또는 펩톤 혼합물); 항생제, 예컨대 겐타마이신; 폴리아민, 예컨대 푸트레신, 스퍼미딘 및 스퍼민(WIPO 공보 제WO 2008/154014호 참조) 및 피류베이트(미국 제8053238호 참조), 항아폽토시스 화합물, 예를 들어 MDL 28170, 사이퍼메트린, 사이클로스포린 A, BBMP, 봉크레킨산(Bongkrekic acid), S-15176 다이퓨마레이트, 사이클릭 피피트린-a, 피피트린 뮤, BI-6C9, NSCI, NS3694 또는 네크로스타틴-1(WIPO 공보 제WO 2014/022102호 참조)이 임의로 보충될 수 있다.
비이온성 계면활성제는 또한 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 비이온성 계면활성제의 예는 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 글리코실 및 비이온성 블록 공중합체 계면활성제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리(프로필렌 옥사이드)의 공중합체(EO-PO 블록 공중합체), 폴리(비닐피롤리돈), 알킬 폴리글루코사이드(예컨대, 수크로스 모노스테아레이트, 라우릴 다이글루코사이드, 또는 소르비탄 모노라우레이트, 옥틸 글루코사이드 및 데실 말토사이드), 지방 알콜(세틸 알콜 또는 올렐릴 알콜), 또는 코카마이드(코카마이드 MEA, 코카마이드 DEA 및 코카마이드 TEA)가 또한 포함된다.
또한 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체라 칭하는 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드에 기초한 블록 공중합체가 또한 포함된다. 이 분자는 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2개의 친수성 사슬에 의해 플랭킹된 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중앙 소수성 사슬을 가지는 비이온성 삼중블록 공중합체이다. 70개의 폴리옥시프로필렌 단위 및 폴리옥시에틸렌 사슬의 각각의 30개의 단위를 가지는 것이 특히 관심 있다. 바람직한 실시형태에서, 블록 공중합체는 다양한 상표명, 예컨대 플루로닉(등록상표) F68, 콜리포르(Kolliphor)(등록상표) P-188, 루트롤(등록상표) F68 및 루트롤(등록상표) 188 하에 판매되는 폴록사머 188(평균 분자량이 8.4kd인 CAS 90003-11-6호, 바스프 케미컬(BASF Chemical)(뉴저지주 워싱턴))이다.
이 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체는 반응기에서 스파징(sparging) 및 폼(foam)으로 인해 버블 유도 사멸로부터 세포를 보호하기 위해 사용된다. 본 명세서에 기재된 바대로, 세포 배양 배지에서 통상적으로 사용되는 폴록사머 188의 수준(1g/ℓ)은, 세포 배양이 정밀여과에 노출될 때, 교대 접선 유동(alternating tangential flow; ATF) 관류 시스템 내에 높은 전단력으로부터 세포를 보호하기에 충분하지 않을 수 있다. 본 명세서에 기재된 바대로, 더 높은 농도, 예컨대 5g/ℓ에서 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체, 예컨대 폴록사머 188을 첨가하는 것은, ATF 관류 조건 하에 더 긴 배양 기간을 허용하게 하는, 세포 생존능력에 대한 긍정적인 영향을 가졌다.
세포 배양 배지는 임의의 세포 배양 공정, 예컨대 세포의 회분식, 연장된 회분식, 유가식 및/또는 관류 또는 연속식 배양(이들로 제한되지는 않음)에서 통상적으로 사용되고/되거나 이것과 사용되도록 공지된 것을 포함한다.
"기본"(또는 회분식) 세포 배양 배지 또는 공급 배지는 세포 배양을 개시하도록 통상적으로 사용되고 세포 배양을 지지하기에 충분히 완벽한 세포 배양 배지를 의미한다.
"성장" 세포 배양 배지 또는 공급 배지는 지수 성장의 기간, "성장기" 동안 세포 배양에서 통상적으로 사용되고, 이 단계 동안 세포 배양을 지지하기에 충분히 완벽한 세포 배양 배지를 의미한다. 성장 세포 배양 배지는 숙주 세포주로 혼입된 선택 가능한 마커에 내성 또는 생존을 부여하는 선택 물질을 또한 함유할 수 있다. 이러한 선택 물질은 게네티신(G4118), 네오마이신, 하이그로마이신 B, 퓨로이신, 제오신, 메티오닌 설폭시민, 메토트렉세이트, 글루타민 비함유 세포 배양 배지, 글라이신, 하이폭산틴 및 타이미딘, 또는 타이미딘 단독이 부족한 세포 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"제조" 세포 배양 배지 또는 공급 배지는 지수 성장이 종료할 때 전이 동안 및 단백질 생성이 넘어갈 때 후속하는 전이기 및/또는 생성기 동안 세포 배양에서 통상적으로 사용되는 세포 배양 배지를 의미한다. 이러한 세포 배양 배지는 이 단계 동안 원하는 세포 밀도, 생존능력 및/또는 생성물 역가를 유지시키기에 충분히 완벽하다.
"관류" 세포 배양 배지 또는 공급 배지는 관류 또는 연속식 배양 방법에 의해 유지되는 세포 배양에 통상적으로 사용되고, 이 공정 동안 세포 배양을 지지하기에 충분히 완벽한 세포 배양 배지를 의미한다. 관류 세포 배양 배지 제제는 소비된 배지를 제거하기 위해 사용된 방법을 수용하기 위해 기본 세포 배양 배지 제제보다 더 농후하거나 더 농축될 수 있다. 관류 세포 배양 배지는 성장기 및 생성기 둘 다 동안 사용될 수 있다.
세포 배양 배지 성분은 분말 배지 제제로 완전히 분쇄되거나; 필요한 바대로 세포 배양 배지에 첨가된 액체 보충제에 의해 부분적으로 분쇄되거나; 세포 배양에 완전한 액체 형태로 첨가될 수 있다.
세포 배양은 세포 배양의 생성기의 과정 동안 소모된 성분, 예컨대 영양소 및 아미노산을 함유하는 농축된 공급 배지가 보충될 수 있다. 농축된 세포 배양 배지는 세포 배양을 유지시키기에 필요한 영양소 중 일부 또는 전부를 함유할 수 있고; 특히, 농축된 배지는 세포 배양의 생성기의 과정 동안 소모되는 것으로 확인되거나 공지된 영양소를 함유할 수 있다. 농축된 배지는 거의 임의의 세포 배양 배지 제제에 기초할 수 있다. 농축된 공급 배지는 이의 일반 양의 예를 들어 약 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100x, 200X, 400X, 600X, 800X, 또는 심지어 약 1000X에서 세포 배양 배지의 성분 중 일부 또는 전부를 함유할 수 있다.
세포 배양은 또한 제제화하기 어려울 수 있거나 세포 배양에서 쉽게 고갈되는 특정한 영양소의 독립적인 농축된 공급물이 보충될 수 있다. 이러한 영양소는 아미노산, 예컨대 타이로신, 시스테인 및/또는 시스틴(예를 들어, WIPO 공보 제2012/145682호 참조)일 수 있다. 일 실시형태에서, 타이로신의 농축된 용액은 타이로신을 함유하는 세포 배양 배지에서 성장한 세포 배양에 독립적으로 공급되어서, 세포 배양 중의 타이로신의 농도는 8 mM을 초과하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 타이로신 및 시스틴의 농축된 용액은 타이로신, 시스틴 또는 시스테인이 부족한 세포 배양 배지 중에 성장한 세포 배양으로 독립적으로 공급된다. 독립적인 공급은 생성기의 시작 전에 또는 시작 시 시작할 수 있다. 독립적인 공급은 농축된 공급 배지와 동일하거나 상이한 일자에 세포 배양 배지로 유가식에 의해 달성될 수 있다. 독립적인 공급은 관류된 배지와 동일하거나 상이한 일자에 또한 관류될 수 있다. 이러한 독립적인 공급은 1일 이상 후에 세포 배양 배지에 첨가될 수 있고, 세포 배양 배지 중의 타이로신, 시스테인 및 시스틴 고갈이 회피되는 한, 생성기의 과정 동안 반복하여 또한 첨가될 수 있다.
포유류 세포 배양에 대한 연속식 공급에 피드백 제어를 사용하지 않는 것(WIPO 공보 제WO 2013/040444호 참조)과 같은 방법이 사용될 수 있다.
세포 배양 배지는, 소정의 실시형태에서, 혈청을 포함하지 않고/않거나, 동물 기원의 생성물 또는 성분을 포함하지 않는다. 세포 배양 배지는, 소정의 실시형태에서, 모든 화학 성분이 공지된 경우 화학적으로 한정된다.
동물 또는 포유류 세포는 배양되는 특정한 세포에 적합한 배지 중에 배양되고, 부당한 실험 없이 당해 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상업적으로 구입 가능한 배지는 사용될 수 있고, 이스코브(Iscove) 변형 둘베코(Dulbecco) 배지, RPMI 1640, 최소 필수 배지-알파(MEM-알파), 이글(Eagle) 배지의 둘베코 변형(DMEM), DME/F12, 알파 MEM, 기준 배지 이글과 이글 BSS, DMEM 고포도당(글루타민 함유), DMEM 고포도당(글루타민 비함유), DMEM 저포도당(글루타민 비함유), DMEM:F12 1:1(글루타민 함유), GMEM(글라스그로우(Glasgow) MEM), GMEM(글루타민 함유), 그레이스(Grace) 완전 곤충 배지, 그레이스 곤충 배지(FBS 비함유), 햄(Ham) F-10(글루타민 함유), 햄 F-12(글루타민 함유), IMDM(HEPES 및 글루타민 함유), IMDM(HEPES 함유 및 글루타민 비함유), IP41 곤충 배지, 15(레이보비츠(Leibovitz))(2X)(글루타민 또는 페놀 레드 비함유), 15(레이보비츠)(글루타민 비함유), 맥코이(McCoy) 5A 변형 배지, 배지 199, MEM 이글(글루타민 또는 페놀 레드(2X) 비함유), MEM 이글-이글 BSS(글루타민 함유), MEM 이글-이글 BSS(글루타민 비함유), MEM 이글-행크스(Hanks) BSS(글루타민 비함유), NCTC-109(글루타민 함유), 리히터(Richter) CM 배지(글루타민 함유), RPMI 1640(HEPES, 글루타민 및/또는 페닐실린-스트렙토마이신 함유), RPMI 1640(글루타민 함유), RPMI 1640(글루타민 비함유), 슈나이더(Schneider) 곤충 배지 또는 특정한 세포 유형에 제제화되는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 다른 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이전의 예시적인 배지에 필요하거나 원하는 바대로, 및 당해 분야의 당업자에 의해 공지되고 일상 기술을 이용하여 실행되는 바대로, 적절한 농도 또는 양으로 임의의 성분을 포함하는 보충 성분 또는 구성성분이 첨가될 수 있다.
배지 처리
세포 배양 배지는 생물반응기 및/또는 세포 배양에 대한 첨가 이전에 배지를 살균하거나 소독하기 위한 방법 또는 장치를 사용하여 처리될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 고온 단시간(HTST)을 이용하여 처리된다(예를 들어, 미국 제7,420,183호 참조). 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 여과와 조합된 UV를 이용하여 처리된다(예를 들어, WIPO 공보 제WO 2008/157247호; 제WO 2012/115874호; 제WO 2013/063298호 및 제WO 2013/138159호 참조). 또 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는 나노여과로 처리된다(예를 들어, 문헌[Liu et al., (2000) Biotechnol. Prog. 16:425-434] 참조). 또 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는 용매, 세제, 소랄렌 또는 베타-프로피오락톤과 같은 바이러스를 불활화하는 화학물질에 의해 처리된다.
세포
본 발명에서 사용된 세포주(또한 "세포" 또는 "숙주 세포"라 칭함)는 상업적 또는 과학적 관심의 폴리펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된다. 세포주는 비제한 시간 동안 배양에 유지될 수 있는 1차 배양으로부터 생긴 계통으로부터 통상적으로 유래한다. 세포는 예를 들어 형질전환, 형질감염, 감염 또는 주사를 통해 도입된, 발현 벡터(작제물), 예컨대 배양 공정에서 발현 및 제조를 위해 단백질을 코딩하는, 코딩 서열 또는 이의 일부를 보유하는, 플라스미드 등을 함유할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 구성요소를 함유한다. 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되고 이에 의해 실행된 방법은 제조된 단백질 및 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 및 적절한 전사 및 번역 제어 구성요소를 함유하는 발현 벡터를 작제하도록 사용될 수 있다. 이 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기법은 문헌[J. Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th edition Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. 또는 임의의 이전 개정판; F. M. Ausubel et al., 2013, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 또는 임의의 이전 개정판; Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990](이들 모두 임의의 목적을 위해 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다.
동물 세포, 포유류 세포, 배양된 세포, 동물 또는 포유류 숙주 세포, 숙주 세포, 재조합 세포, 재조합 숙주 세포 등은 본 발명의 공정에 따라 배양될 수 있는 세포에 대한 모든 용어이다. 이러한 세포는 통상적으로 포유류로부터 얻어지고 유래한 세포주이고, 적절한 영양소 및/또는 다른 인자를 함유하는 배지, 예컨대 본 명세서에 기재된 것 내에 단층 배양 또는 현탁 배양 중에 배치될 때 성장하고 생존할 수 있다. 단백질을 발현하고 분비할 수 있거나, 많은 분량의 특정한 단백질, 더 특히 관심 있는 당단백질을 발현하고 배양 배지로 분비시키도록 분자로 조작될 수 있는, 세포가 통상적으로 선택된다. 숙주 세포에 의해 제조된 단백질이 숙주 세포에 내인성 또는 상동성일 수 있는 것으로 이해될 것이다. 대안적으로, 단백질은 숙주 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포에 의해 제조되고 분비된 인간 단백질에 비상동성, 즉 외래이다. 추가적으로, 포유류 단백질, 즉 포유류 유기체로부터 원래 얻어지거나 유도된 것이 본 발명 방법에 의해 획득되고, 세포에 의해 배양 배지로 분비될 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 배양된 세포는 진핵생물 세포, 예컨대 식물 및/또는 동물 세포이다. 세포는 포유류 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 양서류 세포 또는 조류 세포일 수 있다. 배양에서의 성장에 적합한 매우 다양한 포유류 세포주는 미국 배양 수집 협회(American Type Culture Collection)(버지니아주 매너서스) 및 다른 기탁기관, 및 상업 판매처로부터 구입 가능하다. 본 발명의 공정에서 사용될 수 있는 세포는 MK2.7 세포, PER-C6 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 예컨대 CHO-K1(ATCC CCL-61), DG44(Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909; 및 WO 01/92337 A2), 디히드로엽산 환원효소 음성 CHO 세포(CHO/-DHFR, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), 및 dp12.CHO 세포(미국 특허 제5,721,121호); 원숭이 신장 세포(CV1, ATCC CCL-70); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포(COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); HEK 293 세포, 및 Sp2/0 세포, 5L8 하이브리도마 세포, 다우디(Daudi) 세포, EL4 세포, 헬라(HeLa) 세포, HL-60 세포, K562 세포, 주르카트(Jurkat) 세포, THP-1 세포, Sp2/0 세포, 1차 상피 세포(예를 들어, 각질세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포) 및 확립된 세포주 및 이들의 균주(예를 들어, 인간 배아 신장 세포(예를 들어, 현탁 배양 중의 성장에 서브클로닝된 293 세포, 또는 293 세포, Graham et al., 1977, J. Gen . Virol ., 36:59); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL-10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL-2); 개과 신장 세포(MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL-75); 인간 간세포종 세포(HEP-G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포(Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68); MCR 5 세포; FS4 세포; PER-C6 망막 세포, MDBK(NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, BeWo 세포, 창(Chang) 세포, 디트로이트(Detroit) 562 세포, 헬라 229 세포, 헬라 S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS 180 세포, LS 174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론(Clone) M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK1 세포, PK(15) 세포, GH1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 및 TH-I, B1 세포, 또는 이들의 유도체), 심장, 간, 신장, 대장, 소장, 식도, 위, 신경 조직(뇌, 척수), 폐, 혈관 조직(동맥, 정맥, 모세혈관), 림프성 조직(림프샘, 인두편도, 편도, 골수 및 혈액), 비장(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 조직 또는 장기로부터의 섬유아세포 세포, 및 섬유아세포 및 섬유아세포양 세포주(예를 들어, TRG-2 세포, IMR-33 세포, 돈(Don) 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, 뎀프시(Dempsey) 세포, 디트로이트 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl1 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDM1C3 세포, KLN205 세포, 맥코이 세포, 마우스 L(Mouse L) 세포, 균주(Strain) 2071(마우스 L) 세포, L-M 균주(마우스 L) 세포, L-MTK(마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, 스위스/3T3 세포, 인도 문탁 세포(Indian muntac cell), SIRC 세포, CII 세포, 및 얀센(Jensen) 세포, 또는 이들의 유도체) 또는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 다른 세포 유형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
세포는 단백질, 예를 들어 항체의 부착성, 단층 및/또는 현탁 배양, 형질감염 및 발현에 적합할 수 있다. 세포는 예를 들어 회분식, 유가식 및 관류 또는 연속식 배양 방법에 의해 사용될 수 있다.
세포 배양의 유형
이해의 목적을 위해, 그러나 제한 없이, 숙련자는 단백질 제조를 위한 세포 배양 및 배양 실행이 회분식 배양, 유가식 배양, 관류 배양, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 것을 이해할 것이다. 회분식 배양에서, 세포는 초기에 배지 중에 배양되고, 이 배지는 제거되거나 대체되거나 보충되지 않고, 즉 세포는 배양 실행 동안에 또는 이의 종료 전에 새로운 배지가 "공급"되지 않는다. 전체 세포 배양은 배양 실행의 종료 시에 수확된다.
유가식 배양의 경우, 배양 실행 시간은 실행 동안 새로운 배지에 의해 주기적으로 또는 연속식으로 배양 배지를 보충함으로써 증가하고, 즉 세포는 배양 실행 동안 새로운 배지("공급된 배지")가 "공급"된다. 유가식 배양은 상기 기재된 바대로 다양한 공급 섭생 및 시간, 예를 들어 매일, 격일, 2일마다 등, 1일 1회 초과, 또는 1일 1회 미만, 및 기타를 포함할 수 있다. 추가로, 유가식 배양은 공급 배지에 의해 연속식으로 공급될 수 있다. 이후, 원하는 생성물은 배양 실행 종료 시에 수확된다.
때때로 연속식 배양으로 공지된 관류 배양은 세포 배양이 새로운 배지("관류 배지")의 첨가를 수용하고 소비된 배지가 생물반응기로부터 제거되는 것이다. 관류는 연속식, 단계식, 간헐적 또는 임의의 이들의 조합 또는 임의의 이들의 전부일 수 있다. 관류 속도는 매일 1 미만의 작업 용적 내지 많은 작업 용적일 수 있다. 용어 "관류 유속"은, 소정의 시간에 작업 용적의 약간의 일부 또는 다수의 작업 용적으로 통상적으로 표현되는, 생물반응기로부터 통과한(첨가된 및 제거된) 배지의 양이다. "작업 용적"은 세포 배양에 사용된 생물반응기 용적의 양을 의미한다. 일 실시형태에서, 관류 유속은 매일 1 이하의 작업 용적이다. 관류 공급 배지는 관류 속도를 최소화하기 위해 관류 영양소 농도를 최대화하도록 제제화될 수 있다.
바람직하게는, 세포는 배양에 보유되고, 제거된 소비된 배지는 실질적으로 세포를 포함하지 않거나 세포 배양보다 상당히 더 적은 세포를 가진다. 세포 배양에 의해 발현된 재조합 단백질은 사용된 보유 시스템에 따라 보유되거나 세포 배양으로부터 제거될 수 있다. 때때로, 숙주 세포 및 발현된 재조합 단백질이 생물반응기에서 보유물에 잔류하고, 투과액이 실질적으로 포함되지 않거나 상당히 덜 있는 것("무효 투과액")이 바람직하다. 다른 때에, 세포를 보유하지만, 발현된 단백질이 투과액("수확 투과액")으로 통과하게 허용하는 것이 바람직할 수 있다.
관류는 원심분리, 침강 또는 여과를 포함하는 다수의 수단에 의해 달성될 수 있고, 예를 들어, 문헌[Voisard et al., (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751-65]을 참조한다. 일 실시형태에서, 여과 방법이 사용된다. 필터는 막 필터, 세라믹 필터 및 금속 필터를 포함하고, 나권형 또는 관형을 포함하는 임의의 형상 또는 시트의 형태일 수 있다. 하나 이상의 필터는 함께 또는 독립적으로, 직렬로 또는 병렬로 생물반응기에 유체 연통으로 연결될 수 있다.
중공 섬유 필터는 세포 및/또는 재조합 단백질 생성물 보유를 위해 포유류 세포 관류 배양에 사용된다. 세포 배양 배지, 세포(전체 및 용해), 가용성의 발현된 재조합 단백질, 숙주 세포 단백질, 폐기 생성물 등을 포함하는 세포 배양물이 필터로 도입될 때, 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)에 따라, 중공 섬유 재료는 루멘 면(내부)에서 소정의 세포 배양 성분을 보유하고, 소정의 성분이 중공 섬유 재료의 기공 크기 또는 분자량 컷오프에 기초하여 필터(투과액)를 통해 통과하게 허용할 수 있다. 보유된 재료(보유물)는 생물반응기로 반송된다. 새로운 관류 세포 배양 배지는 생물반응기에 첨가되고, 투과액은 원하는 또는 일정한 생물반응기 용적을 유지시키기 위해 미리 결정된 간격으로 또는 연속식으로 필터로부터 인출된다. 투과액을 버리고, 보유 탱크, 백 또는 토트에서 저장하거나, 또 다른 유닛 조작, 예컨대 여과, 원심분리 및/또는 다른 하류 정제 방법 등으로 직접적으로 옮길 수 있다. 정밀여과를 위한 중공 섬유는 통상적으로 0.1㎛ 내지 5-10㎛의 범위의 기공 크기 또는 500kDa 이상의 분자량 컷오프를 가지고, 단백질이 통과하여 투과액이 되게 사용될 수 있다. 한외여과 중공 섬유는 통상적으로 0.01㎛ 내지 0.1㎛의 기공 크기 범위 또는 300kDa 이하의 분자량 컷오프를 가지고, 원하는 단백질이 보유물에 보유되고 이것이 생물반응기로 다시 반송되도록 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어 수확을 위해 재조합 단백질 생성물을 농축하기 위해 사용될 수 있다. Xampler UFP-750-E-4MA, Xampler UFP-30-E-4MA(지이 헬스케어(GE Healthcare)(펜실베니아주 피츠버그)) 및 Midikros TC 모듈 T02-E030-10, T02-050-10, T02-E750-05, T02-M10U-06(Spectrum Laboratories, Inc(캘리포니아주 도밍게즈))과 같은 이러한 필터가 상업적으로 구입 가능하다.
본 발명은, 무효 투과액이 수집될 때, 필터가 재조합 단백질 생성물이 투과액으로 통과하게 허용하지 않고 대신에 생물반응기에서 이것을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터라는 것을 제공한다. 본 발명은 또한, 수확 투과액이 수집될 때, 필터가 중공 섬유를 통해 통과하게 허용하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터라는 것을 제공한다.
세포 배양은 중공 섬유의 루멘 면을 통해 세포 배양을 통과시키는 펌핑 시스템에 의해 생물반응기로부터 필터로 배출된다. 세포 펌핑 시스템의 예는 연동 펌프, 이중 격막 펌프, 저전단 펌프(Levitronix(등록상표) 펌프(스위스 취리히)) 및 교대 접선 유동 시스템(ATF(상표명), Refine Technology(뉴저지주 핀 브룩), 예를 들어 미국 제6,544,424호 참조; Furey (2002) Gen. Eng. News. 22 (7), 62-63)을 포함한다. 투과액은 연동 펌프를 사용하여 필터로부터 배출될 수 있다.
단일 유닛 필터 시스템
본 발명은, 단일 세포 펌핑 장치에 의해 조작될 수 있는, 임의로 하우징 내에 함유된, 단일 유닛 필터 시스템에서 직렬로 조합된 상이한 기공 크기 또는 분자량 컷오프의 2개 이상의 중공 섬유 필터 성분을 포함하는 단일 유닛 필터 시스템을 제공한다. 이것은 1개의 필터 시스템을 통한 생성물 보유 모드(무효 투과액 제거) 또는 생성물 수집 모드(수확 투과액 제거)에서의 수집을 허용한다(도 1). 단일 유닛 필터 시스템은 수확 사이클 동안 세포 배양으로부터 숙주 세포 단백질 및 다른 폐기물을 제거하는 이점을 제공하여서, 세포 배양의 기간을 연장한다. 단일 유닛 필터 시스템은 더 높은 수확 효율을 위해 잠재적으로 필터 파울링을 덜 가진다. 단일 유닛 필터 시스템은 하류 정제 칼럼의 더 쉽고 효과적인 로딩을 위한 다수의, 더 적은 뱃취에서 투과액을 제공할 수 있다. 단일 유닛 필터 시스템은 연속식 제조 공정의 일부로서 사용될 수 있다.
단일 유닛 필터 시스템의 구성은 직렬로 구성된 상이한 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 2개 이상의 중공 섬유 필터 성분을 포함하여서, 모든 필터는 서로 유체 연통하고 단일 펌핑 장치에 의해 조작될 수 있다. 이러한 중공 섬유 필터 성분은 예를 들어 지이 헬스케어 및 스펙트럼 래버러토리즈, 인코포레이션(Spectrum Laboratories, Inc.)으로부터 상업적으로 구입 가능하다. 세포 배양이 모든 필터를 통해 흐르면서, 투과액은 일시에 하나 이상의 필터로부터 선택적으로 제거될 수 있다. 투과액(무효 또는 수확)은 이의 기공 크기 또는 분자량 컷오프에 기초하여 적절한 중공 섬유 성분으로부터 투과액을 인출함으로써 제거된다. 무효 투과액 및 수확 투과액은 개별 연동 펌프의 사용에 의해 분리하여 그리고 독립적으로 제거된다. 투과액 수집의 시기 및 비율은 이의 별개의 연동 펌프를 통해 제어될 수 있다.
개별 중공 섬유 필터 성분은 분야에 적합한 임의의 구성으로 정렬될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포 배양물의 재조합 단백질 생성물이 세포 배양 생물반응기에서 보유물에서 보유되게 하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 중공 섬유 필터 성분(들)은 생물반응기로부터의 세포 배양 흐름을 수용하는 첫번째이도록 배치된다.
단일 유닛 필터 시스템의 구성은 수확 투과액 및 무효 투과액이 분리된 방식으로 그리고 상대 용적측정 비율 및 제거의 시기가 원하는 바대로 제어될 수 있는 방식으로 생물반응기로부터 제거되게 한다. 투과액은 관류 속도와 동일한 속도에서 단일 유닛 필터 시스템으로부터 수집된다.
상업적으로 구입 가능한 중공 섬유 필터 성분을 사용하는 것 이외에, 포팅 구역(potting zone)에 의해 서로로부터 단리된 단일 필터 내에 2개의 별개의 구역을 가지는 중공 섬유 재료가 구성될 수 있다. 또한, 상이한 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 별개의 중공 섬유는 2개의 투과액 측면을 격리시키도록 중간 포팅 구역에서 커넥터 구역(connector zone)에 의해 연결될 수 있다. 중공 섬유의 길이에 걸친, 각각의 기공 크기 도메인은 다른 기공 크기 쉘 측면 도메인으로부터 격리된 상응하는 쉘 면을 가져서, 투과액은 다른 것과 독립적인 각각의 기공 크기 쉘 측면 도메인으로부터 인출될 수 있다.
필터는 중공 섬유 필터 성분 사이의 유체 연통을 허용하는 임의의 방법에 의해 서로에 고정될 수 있다. 필터 성분은 함께 접착되거나 용접될 수 있다. 필터는 필터 유닛를 함께 고정하고 필터 사이의 유체 연통을 허용하는 클램프, 예컨대 트라이 클레임(tri claim), 또는 다른 기계적 장치에 의해 함께 연결될 수 있다. 필터 하우징은 직접적으로 또는 트레딩된 커플러를 통해 필터 유닛을 연결하도록 사용되는 내부 및 외부 트레딩된 구역이 제공될 수 있다. 필터는 임의의 유형의 잠금 메커니즘에 또한 연결될 수 있다.
종단간 직접적으로 2개의 필터를 배치하는 것은 세포 흐름을 방해하고 전단으로 인한 세포 손상을 야기하는 중공 섬유 사이의 약간의 정렬불량 또는 밀착 연접을 생성할 수 있다. 그 결과, 필터의 정렬로 인해 생존능력이 하락할 수 있다. 인접한 필터 유닛 사이의 약간의 거리를 제공하여, 세포의 흐름이 하나의 필터의 루멘 사이에 다음의 중공 섬유의 루멘으로 더 쉽게 이동하게 허용하는, 스페이서 또는 커플러는 필터 유닛 사이에 사용될 수 있다. 스페이서는 개별 필터 유닛을 서로 분리하여, 투과액이 인출되는 각각의 중공 쉘 면의 격리를 또한 유지시키면서 개별 중공 섬유 사이의 무균 흐름 경로를 허용하다.
이러한 스페이서는 필터 사이에 튼튼한 무균 연결을 만들고 필터 사이에 유체 연통을 허용하는 임의의 재료로부터 제조될 수 있다. 이러한 스페이서는 필터에 자가 실링할 수 있다. 스페이서는 연결되는 필터에 접착되거나 용접될 수 있다. 스페이서는 스페이서를 필터에 고정하는 기계적 장치, 예컨대 클램프에 의해 필터에 고정될 수 있다. 스페이서는 직접적으로 또는 트레딩된 커플러를 통해 스페이서를 필터에 고정하도록 사용되는 내부 또는 외부 트레딩된 구역이 제공될 수 있다. 스페이서는 임의의 유형의 잠금 메커니즘에 의해 또한 연결될 수 있다.
단일 유닛 필터 시스템은 특히 2개 이상의 필터가 직렬로 구성될 때 사용의 편의를 위해 외부 하우징에 의해 임의로 둘러싸일 수 있다. 외부 하우징은 필터 유닛 내의 재료에 무균 장벽을 유지시키는 플라스틱 또는 다른 적합한 재료로 제조될 수 있다. 하우징은 상업적으로 구입 가능한 중공 섬유 필터에 일치하도록 만들어진 2차 인클로져(enclosure)일 수 있거나, 하우징은 연결된 중공 섬유 필터를 위한 1차 하우징으로서 제조될 수 있다. 하우징은 공급물 및 보유물의 도입 및 수집을 허용하기에 충분한 개구, 및 상이한 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 각각의 중공 섬유 필터에 대한 적어도 하나의 투과액 포트를 가져야 한다.
단일 유닛 필터 시스템은 상기 기재된 바대로 세포 배양을 일정한 유속에서 중공 섬유의 루멘 면을 통해 통과시키는 단일 세포 펌핑 시스템과 연결되어 사용될 수 있다.
세포 배양 공정
세포 배양은 동물 또는 포유류 세포 배양에 대해 종래에 사용된 배양 용기 및/또는 배양 기구를 사용하여 재조합 단백질의 소규모 내지 대규모 제조를 수용하는 조건 하에 수행될 수 있다. 더 큰 규모의 배양을 위해, 설비, 예컨대 롤러 병 시스템, 충전 층 유형 배양 장치, 발효기 유형 탱크 생물반응기, 공기 리프트 유형 생물반응기, 유동 층 생물반응기, 부동 세포 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 교반 탱크 생물반응기, 다단 생물반응기, 원심분리 생물반응기 또는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 다른 적합한 장치를 사용할 수 있다. 단일 사용 바이오프로세싱 설비, 예컨대 단일 사용 생물반응기를 또한 사용할 수 있다. 마이크로캐리어가 생물반응기 시스템과 또한 사용될 수 있다. 시스템은 회분식, 유가식 또는 관류/연속식 방식으로 조작될 수 있다. 또한, 배양 용기는 필터, 중력, 원심분리 힘 등을 사용하는 추가적인 장치, 예컨대 세포 분리기가 장착될 수 있다.
세포 배양의 "성장기"의 정의는 세포가 일반적으로 신속히 분열하는 지수 세포 성장의 기간(즉, 로그기)을 의미한다. 세포는 약 1일, 또는 약 2일, 또는 약 3일, 또는 약 4일, 또는 4일 초과의 기간 동안 성장기에서 유지된다. 세포가 성장기에서 유지되는 시간의 기간은 예를 들어 세포 유형, 세포의 성장의 속도 및/또는 배양 조건에 따라 달라질 것이다.
"전이기"의 정의는 성장기와 생성기 사이의 기간을 의미한다. 일반적으로, 전이기는 성장기로부터 생성기로의 이동을 지지하기 위해 배양 조건이 조절될 수 있는 시간이다. 온도, 삼투압농도, 비타민, 아미노산, 당, 암모늄, 락트산, 및 염의 농도 등 중 하나 이상(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다양한 세포 배양 매개변수가 이동을 조절하기 위해 모니터링되거나 조작될 수 있다.
"생성기"의 정의는 세포 성장이 정체유지되는 시간의 기간을 의미한다. 대수 세포 성장은 통상적으로 이 단계 전에 또는 동안에 감소하고, 단백질 제조가 넘겨진다. 유가식 및 관류 세포 배양 공정은 이 단계 동안 세포 배양 배지를 보충하거나 새로운 배지를 제공하여, 원하는 세포 밀도, 생존능력 및/또는 재조합 단백질 생성물 역가를 달성하고/하거나 유지시킨다. 생성기는 대규모로 수행될 수 있다. 대규모 세포 배양은 적어도 약 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10,000, 15,000, 20,000리터 이상의 용적에서 유지될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 생성기는 500ℓ, 1000ℓ 및/또는 2000ℓ 생물반응기에서 수행된다.
재조합 단백질의 제조는 다수의 단계에서 수행될 수 있다. 다수의 단계 공정에서, 세포는 2개 이상의 명확한 단계에서 배양된다. 통상적으로 세포는 세포 증식 및 생존능력을 최대화하는 환경 조건 하에 하나 이상의 성장기에서 처음에 배양되고, 이후 단백질 제조를 최대화하는 환경 조건 하에 생성기로 전이한다. 포유류 세포에 의한 재조합 단백질의 제조를 위한 상업용 공정에서, 최종 제조 배양에 선행하는 상이한 배양 용기에서 발생하는 다수의, 예를 들어 적어도 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 성장기(N-x 내지 N-1)가 보통 존재한다. 성장기 및 생성기는 하나 이상의 전이기에 선행하거나 이와 분리될 수 있다. 생성기는 대규모로 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 세포 배양의 생성기를 연장시키도록 사용될 수 있다.
재조합 단백질의 상업용 제제를 제조할 때, 최종 제조 배양에 선행하는 세포 배양은 통상적으로 시드 트레인 및 접종 트레인인 2개의 공정을 통과한다. 시드 트레인 단계(N-X)는 세포가 수가 빨리 증식하는 소규모로 발생한다. 접종 트레인 단계(N-1)에서, 세포는 제조 생물반응기를 위한 접종원을 생성하도록 추가로 증식된다. 시드 및 N-1 트레인은 임의의 배양 방법, 통상적으로 회분식 세포 배양에 의해 제조될 수 있다. 15x106개 초과의 세포/㎖의 N-1 세포 밀도는 제조 생물반응기를 시딩하는 데 통상적이다. 더 높은 N-1 세포 밀도 및/또는 세포 배양 배지의 조정은 제조 생물반응기에서 원하는 세포 밀도에 도달하는 데 필요한 시간을 감소시키거나 심지어 제거할 수 있다. 일 실시형태에서, 더 높은 N-1 세포 밀도는 교대 접선 유동 여과를 사용하여 관류 배양을 통해 달성된다. 교대 접선 유동 여과를 사용하여 관류 공정에 의해 성장한 N-1 세포 배양은 임의의 원하는 밀도에서 세포를 제공할 수 있고, 높은 세포 밀도, 예컨대 90x106개 초과의 세포/㎖ 이상의 밀도가 쉽게 달성될 수 있다. N-1 세포 배양은 단일 볼루스 접종 배양을 생성하기 위해 사용될 수 있거나, 다수의 제조 생물반응기를 접종하기 위해 유지되는 롤링 시드 스톡 배양으로서 사용될 수 있다. 접종 밀도는 생성된 재조합 단백질의 수준에 긍정적인 영향을 가질 수 있다. 재조합 단백질 생성물 수준은 접종 밀도의 증가에 따라 증가하는 경향이 있다. 역가의 개선은 더 높은 접종 밀도에 의존할 뿐만 아니라, 제조에 놓인 세포의 대사 및 세포 주기 상태에 의해 영향을 받을 것이다. N-1 공정 동안, 세포 배양은 제조 생물반응기로 접종 전에 생성기에 진입하게 허용될 수 있다. 이러한 접종은 제조 생물반응기에서 제조가 즉시 시작하게 허용한다.
용어 "세포 밀도"는 배양 배지의 소정의 용적에서 세포의 수를 의미한다. "생존가능한 세포 밀도"는, 표준 생존능력 검정(예컨대, 트립판 블루 염료 배제 방법)에 의해 결정된 바대로, 소정의 용적의 배양 배지에서 살아 있는 세포의 수를 의미한다. 또한 "충전된 세포 용적(%)"(%PCV)이라 칭하는 용어 "충전된 세포 용적"(PCV)은 백분율로 표현된 세포 배양의 전체 용적에 대한 세포가 점유하는 용적의 비율이다(문헌[Stettler, et al., (2006) Biotechnol Bioeng. Dec 20:95(6):1228-33] 참조). 충전된 세포 용적은 세포 밀도 및 세포 직경의 함수이고; 충전된 세포 용적의 증가는 세포 밀도 또는 세포 직경 또는 둘 다의 증가로부터 생길 수 있다. 충전된 세포 용적은 세포 배양 중의 고체 함량의 측정치이다. 숙주 세포가 크기가 변하고 세포 배양이 또한 죽은 세포 및 죽고 있는 세포 및 다른 세포 부스러기를 함유하므로, 충전된 세포 용적은 세포 배양 내의 고체 함량을 더 높은 정확도로 기술할 수 있다. 예를 들어, 50x106개의 세포/㎖의 세포 밀도를 가지는 2000ℓ 배양은 세포의 크기에 따라 매우 상이한 충전된 세포 용적을 가질 것이다. 또한, 일부 세포는 예컨대 성장 정지 상태에 있을 때 크기가 증가할 것이고, 그래서 성장-정지 전 및 성장-정지 후 충전된 세포 용적은 세포 크기 증가의 결과로서 바이오매스의 증가로 인해 상이할 것이다. 생성기 동안 더 낮은 충전된 세포 용적은 더 높은 세포 밀도 관류 배양을 방해할 수 있는 용존 산소 살포 문제를 완화하는 것을 돕는다. 더 낮은 충전된 세포 용적은 또한 더 적은 배지 용적을 허용하고, 이것은 더 적은 배지 저장 용기의 사용을 허용하고, 더 느린 유속과 조합될 수 있다. 더 낮은 충전된 세포 용적은 또한 더 높은 세포 바이오매스 배양과 비교하여 수확 및 하류 공정처리에 영향을 덜 가진다. 이들 모두 재조합 단백질 치료제의 제조와 관련한 비용을 감소시킨다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 생성기 동안 충전된 세포 용적이 35% 이하인 것을 추가로 포함한다. 관련 실시형태에서, 충전된 세포 용적은 30% 이하이다.
일 실시형태에서, 35% 이하의 충전된 세포 용적에서의 포유류 세포 배양의 생존가능한 세포 밀도는 10x106개의 생존가능한 세포/㎖ 내지 80x106개의 생존가능한 세포/㎖이다. 관련 실시형태에서, 포유류 세포 배양의 생존가능한 세포 밀도는 20x106개의 생존가능한 세포/㎖ 내지 30x106개의 생존가능한 세포/㎖이다.
세포 배양 조건
본 발명의 방법에 적합한 세포 배양 조건은, pH, 용존 산소(O2), 및 이산화탄소(CO2), 교반 및 습도, 및 온도에 주의하면서, 세포의 회분식, 유가식, 또는 관류(연속식) 배양 또는 이들 방법의 임의의 조합에 통상적으로 사용되거나 공지된 것이다. 재조합 단백질 제조 동안, 세포가 원하는 시간 동안 또는 원하는 밀도로 성장하고, 이후 세포가 세포 밀도의 증가에 대해 재조합 단백질을 생성하도록 에너지 및 기질을 사용하는 성장 제한된 또는 정지된, 높은 생산성 상태로 세포의 생리학적 상태가 전환된, 제어 시스템을 가지는 것이 바람직하다. 생물학적 치료제의 상업용 규모의 세포 배양 및 제조를 위해, 생성기 동안 세포 성장을 제한하거나 정지시키는 능력 및 성장 제한된 또는 정지된 상태에서 세포를 유지시킬 수 있는 능력이 매우 바람직하다. 이러한 방법은 단독으로 또는 조합으로 예를 들어 온도 이동, 단백질 제조의 화학 유도물질의 사용, 영양소 제한 또는 기아 및 세포 주기 저해제를 포함한다.
성장을 제한하거나 정지시키기 위한 이러한 메커니즘은 세포 배양 동안 온도를 이동시키는 것이다. 예를 들어, 성장기는 더 고온에서 발생할 수 있어서, 더 낮은 온도로의 이동은 생성기를 개시시키고/시키거나 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 성장기는 약 35℃ 내지 약 38℃에서 설정된 제1 온도에서 발생할 수 있고, 생성기는 약 29℃ 내지 약 37℃, 임의로 약 30℃ 내지 약 36℃ 또는 약 30℃ 내지 약 34℃에서 설정된 제2 온도에서 발생할 수 있다.
온도 설정의 전환은 수동으로 수행될 수 있거나, 생물반응기 제어 시스템을 사용함으로써 자동으로 수행될 수 있다. 온도 설정은 미리 결정된 시간에서 또는 하나 이상의 세포 배양 매개변수, 예컨대 하나 이상의 배지 성분의 세포 밀도, 역가, 또는 농도에 반응하여 전환될 수 있다. 이러한 방법은 원하는 세포 밀도가 도달할 때 온도 설정 변화를 촉발하는 생물반응기 제어 시스템으로 통합된 온라인 바이오매스 모니터링 도구를 이용한다. 예를 들어, 커패시턴스 기반 바이오매스 프로브는 온라인 세포 밀도 예측에 사용될 수 있고, 온라인 측정으로부터의 데이터는 생물반응기 온도의 이동을 촉발하도록 사용될 수 있다. 이러한 커패시턴스 기반 프로브는 포게일(Fogale) 커패시턴스 센서(DN12-200)(Nimes(프랑스))를 포함한다.
또한, 단백질 제조의 화학 유도물질, 예컨대 카페인, 뷰티레이트, 및/또는 헥사메틸렌 비스아세트아마이드(HMBA)는 온도 이동과 동시에, 이것 전에 또는 후에 첨가될 수 있다. 유도물질이 온도 이동 후에 첨가되면, 이것은 온도 이동 후 1시간 내지 5일에, 임의로 온도 이동 후 1일 내지 2일에 첨가될 수 있다. 세포가 원하는 단백질(들)을 생성하면서 세포 배양은 수일 또는 심지어 주 동안 유지될 수 있다.
원하는 생리학적 효과에서 세포를 유지시키기 위한 또 다른 방법은 저 L-아스파라긴 조건 및/또는 아스파라긴 기아에 대한 세포 배양의 노출로 세포 성장-정지를 유도하는 것이다(예를 들어, WIPO 공보 제WO 2013/006479호 참조). 세포 성장-정지는 세포 배양 중의 제한 농도의 L-아스파라긴 및 낮은 농도의 L-아스파라긴의 유지를 함유하는 배양 배지를 통해 달성되거나 유지될 수 있다. 5mM 이하에서 L-아스파라긴의 농도를 유지시키는 것은 성장-정지 상태에서 세포를 유도하고 유지시키기 위해 사용될 수 있고 이로써 생산성이 증가한다.
세포 주기 저해제, 세포 주기 진행을 조절하는 것으로 공지되거나 의심되는 화합물 및 이와 관련된 전사, DNA 복구, 분화, 노회 및 아폽토시스의 연관 공정은 세포 성장-정지를 유도하는 것에 또한 유용하다. 주기 기계와 상호작용하는 세포 주기 저해제, 예컨대 사이클린 의존성 키나제(CDK)는 다른 경로, 예컨대 AKT, mTOR, 및 세포 주기에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 미치는 다른 경로로부터 단백질과 상호작용하는 이 분자와 같이 유용하다.
수확 및 정제
발현된 재조합 단백질은 회수되고/되거나 수집될 수 있는 배양 배지로 분비될 수 있다. 이후, 재조합 단백질은 수확, 정제, 내독소 및/또는 바이러스 불활화/여과, 적합한 약제학적 제제로의 한외여과/정용여과 및/또는 저장을 포함하는 하나 이상의 공정처리 단계에서 처리될 수 있다.
발현된 재조합 단백질은 수확 투과액에서 포획될 수 있다. 단백질은 당해 분야에 공지되고/되거나 상업적 판매처로부터 구입 가능한 공정 및 상업적으로 구입 가능한 생성물을 사용하여 수확 투과액으로부터 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있다. 이러한 방법은 다른 이용 가능한 방법 중에서 응집; 원심분리; 침전; 여과 방법, 예컨대 심층 여과; 크로마토그래피 방법, 예컨대 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 수산화인회석 크로마토그래피를 포함한다.
이후, 정제된 단백질은 "제제화"될 수 있고, 완충제 교환, 살균, 벌크 포장 및/또는 최종 사용자에 대해 포장을 의미한다. 약제학적 조성물을 위한 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA]에 기재된 것을 포함한다.
공정 분석 기법
공정 분석 기술 및 방법은 재조합 단백질의 특징 및 제조 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하기 위해 세포 배양 및 정제 공정 동안 수취된 샘플을 모니터링하고 평가하기 위해 이용 가능하다. 이 실시간 또는 인라인 정보는 적절히 결정하고 필요한 바대로 공정을 변형시키기 위해 생성물 및 제조 매개변수, 예컨대 역가, 세포 밀도; 생성물 품질 속성, 예컨대 번역 후 변형; 생성물 또는 공정 실행력, 예컨대 불순물 등을 모니터링하고/하거나 제어하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 생성물 품질 속성, 예컨대 글라이칸 종의 분포, 산화 수준 또는 탈아미드화는 모니터링되고/되거나 제어될 수 있다.
상류 세포 배양 공정 또는 하류 정제 공정의 각각의 단계는 특정한 생성물 품질 속성(PQA)의 양에 대한 정보를 제공하고 설정된 표적 및 범위에 의해 이 PQA를 제어하기 위해 모니터링될 수 있다.
샘플은 간헐적으로, 원하는 빈도로 또는 연속식으로 수취될 수 있다. 샘플은 실시간으로 또는 거의 실시간으로 분석되거나 차후 분석을 위해 저장될 수 있다. 이 정보는 상류 및 하류 공정 동안 변화를 만들도록 사용될 수 있다.
생성물 품질 속성의 검출은 질량 분광광도법, 액체 크로마토그래피와 함께 UV 및/또는 질량 분광광도법 검출 및 모세혈관 전기영동 등을 사용하여 수행될 수 있다.
이 공정은 특정한 생성물 품질 속성의 수준에 의해 결정된 바와 같은 수동 또는 자동화 공정 조정, 예컨대 공급물, 온도, 공정 기간에 의한 연속식 모니터링에 적응 가능하다.
번역 후 변형, 예컨대 아미노산 공정처리 및 글리코실화의 존재를 검출하는 온전한 질량 분석은 크기-배제 모드로 조작되고 ESI-MS와 커플링된 폴리하이드록시에틸 아스파르트아마이드 칼럼을 사용하여 이루어질 수 있다(Brady et al., (2008) J Am Soc Mass Spectro, 19: 502-509).
실시간 모니터링은 레이저 광 산란 검출기를 사용하여 각각의 분획에 대한 정규화 LS/UV 비율 및 UV 흡광도의 모니터링에 의해 이온 교환 크로마토그래피로부터 용출되고, 미국 특허 공보 제US 2013-0303732호 참조한다.
다중 속성 방법은 다양한 데이터베이스 및 조사 플랫폼, 예컨대 Sequest(The Scripps Research Institute(캘리포니아주 라 졸라)), X!Tandem(The Global Proteome Machine Organization) 또는 Mascot(Matrix Science(매사추세츠주 보스턴))을 사용하여 탠덤 MS 데이터를 조사하고 규명하기 위해 단일 액체-크로마토그래피/질량 분광광도법(LC/MS)을 사용한다. 샘플은 높은 pH에서 변성될 수 있거나, 낮은 pH에서 이황화 아이소폼을 유지시키고 숙신이미드 변이체를 보호할 수 있다. 이후, 샘플을 환원시키고 알킬화한 후 트립신에 의해 분해한다. 이후, 샘플을 MS(예컨대, Q Exactive(상표명) Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Thermo Fischer Scientific(매사추세츠주 월섬))에 주입하고, 분석은 Pinpoint 소프트웨어(Thermo Fischer Scientific)를 사용하여 수행한다. 확인되고 정량화되고 모니터링될 수 있는 속성은 이성질체화, 탈아미노화, 다이설파이드 환원, 숙주 세포 단백질 오염, 돌연변이, 오편입, 하이드록시라이신, 티오에터, 비글리코실화 중쇄, C 말단 아미노화, 잔류 단백질 A를 포함하고, 글라이칸을 규명하고, 분자 동일성을 제공한다. 모니터링되는 각각의 속성에 대한 질량 정확성은 예상된 질량의 5ppm 미만에서 설정될 수 있다. 펩타이드/속성의 확인은 MS2 단편화 및 직각 특징규명 방법(예를 들어, 글리코실화에 대한 HILIC-MS)에 의해 확인된다. 실험 동위원소 분포는 이론적 동위원소 분포와 비교하여 0.95보다 우수한 도트 생성물 점수를 가져야 한다. 보유 시간 윈도우는 각각의 속성에 대해 설정되고, 각각의 속성에 대한 모든 검출 가능한 변화 상태는 정량화에 고려된다. 속성의 변화를 검출하는 기준이 정의된다. 예를 들어, 탈아미노화는 탈아미노화 값(탈아미노화 펩타이드와 비변형 모 펩타이드의 합으로 나눈 탈아미노화 펩타이드에 100을 곱함)을 결정함으로써 모니터링될 수 있다. 글리코실화는 각각의 특정한 글라이칸을 모든 검출 가능한 글라이칸의 합과 비교함으로써 모니터링될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 공정 분석 기술은 "생성물 속성 제어"(PAC)를 또한 포함할 수 있다. PAC는 다수의 PAT 요소를 하나 이상의 CQA의 실시간 피드백 제어를 채택하는 바이오공정의 모델과 조합한다. 이 새로운 PAC 공정은 생물의약품의 QbD 제조의 실행의 예이다. PAC 공정은 CQA에 영향을 미칠 수 있는 제어 레버의 사용에 의지한다. 제어 레버는 QTPP에 기재된 바대로 원하는 표적에서 CQA를 유지시키는 제어 루프에 기초한 모델로 통합된다. 구체적으로, 제어 레버는 수학적으로 모델링될 수 있는 방식으로 CQA에 영향을 주는 공정 매개변수의 조정이다. 예를 들어, 저해제 또는 활성자의 수준은 생성물의 글리코실화 프로필을 조절하기 위해 글리코실화 효소 활성을 조절하도록 동적으로 조정될 수 있되, 단 이의 영향은 수학적으로 모델링될 수 있다. 마찬가지로, 온도 또는 pH는 실행 동안 조정될 수 있되, 단 CQA에 대한 이의 영향은 또한 신뢰성 있게 모델링될 수 있다.
단백질
본 명세서에 사용된 바대로 "펩타이드," "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 전체에서 상호 교환되어 사용되고, 펩타이드 결합에 의해 서로에 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 또한 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화를 포함하는 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
단백질은 단백질 기반 약물을 포함하는 과학적 또는 상업적 관심일 수 있다. 단백질은 무엇보다도 항체, 융합 단백질 및 사이토카인을 포함한다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 세포 배양 방법을 사용하여 원핵생물 및 진핵생물 세포주에 의해 제조될 수 있고, "재조합 펩타이드", "재조합 폴리펩타이드", "재조합 단백질", "재조합 단백질 생성물" 및 "생성물"이라 칭해질 수 있다. 발현된 단백질(들)은 세포내 제조되거나, 이것이 회수되고/되거나 수집될 수 있는 배양 배지로 분비될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 유리하게 제조될 수 있는 포유류 단백질의 비제한적인 예는 하기 단백질 중 하나의 전부 또는 일부와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산을 포함하는 단백질을 포함한다: 종양 괴사 인자(TNF), flt3 리간드(WO 제94/28391호), 에리쓰로포에이틴, 트롬보포에이틴, 칼시토닌, IL-2, 안지오포이에틴-2(Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55-60), NF-카파 B의 수용체 활성자에 대한 리간드(RANKL, WO 제01/36637호), 종양 괴사 인자(TNF) 관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL, WO 제97/01633호), 흉선 기질 유래 림포포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF, 호주 제588819호), 비만 세포 성장 인자, 줄기 세포 성장 인자(미국 특허 제6,204,363호), 상피 성장 인자, 각질세포 성장 인자, 대핵세포 성장 및 발달 인자, RANTES, 인간 피브리노겐 유사 2 단백질(FGL2; NCBI 수탁 번호 NM_00682;
Figure 112017000612001-pct00001
and Pytela (1995), Gene 160:257-62) 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린 유사 성장 인자, 부갑상선 호르몬, α-인터페론, γ-인터페론, 및 칸센서스 인터페론을 포함하는 인터페론(미국 특허 제4,695,623호 및 제4,897471호), 신경 성장 인자, 뇌 유래 신경영양 인자, 시탭토태그민 유사 단백질(SLP 1-5), 뉴로트로핀-3, 글루카곤, 인터류킨, 콜로니 자극 인자, 림포톡신-β, 백혈병 저해 인자 및 온코스타틴-M. 본 발명 방법에 따라 제조될 수 있는 단백질의 설명은 예를 들어 문헌[Human Cytokines : Handbook for Basic and Clinical Research, Volumes 1-3 (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors : A Practical Approach (McKay and Brown, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1998) 모든 개정판; 및 The Cytokine Handbook, Vols. 1 and 2 (Thompson and Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003)]에서 발견될 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 방법은 임의의 상기 언급된 단백질에 대한 수용체의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질, 이러한 수용체 또는 임의의 상기 언급된 단백질에 대한 길항제, 및/또는 이러한 수용체 또는 길항제에 실질적으로 유사한 단백질을 제조하는 데 유용할 것이다. 이 수용체 및 길항제는 종양 괴사 인자 수용체의 형태 둘 다(TNFR, p55 및 p75라 칭해짐, 미국 제5,395,760호 및 미국 제5,610,279호), 인터류킨-1(IL-1) 수용체(I형 및 II형; EP 제0460846호, 미국 제4,968,607호 및 미국 제5,767,064호), IL-1 수용체 길항제(미국 제6,337,072호), IL-1 길항제 또는 저해제(미국 특허 제5,981,713호, 제6,096,728호 및 제5,075,222호) IL-2 수용체, IL-4 수용체(EP 제0 367 566호 및 미국 제5,856,296호), IL-15 수용체, IL-17 수용체, IL-18 수용체, Fc 수용체, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 수용체, 과립구 콜로니 자극 인자 수용체, 온코스타틴-M 및 백혈병 저해 인자에 대한 수용체, NF-카파 B의 수용체 활성자(RANK, WO 제01/36637호 및 미국 제6,271,349호), 오스테오프로테게린(미국 제6,015,938), TRAIL에 대한 수용체(TRAIL 수용체 1, 2, 3 및 4 포함), 및 사멸 도메인을 포함하는 수용체, 예컨대 Fas 또는 아폽토시스 유도 수용체(AIR)를 포함한다.
본 발명을 사용하여 제조될 수 있는 다른 단백질은 분화 항원의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질(CD 단백질이라 칭함) 또는 이들의 리간드 또는 이들 중 어느 하나와 실질적으로 유사한 단백질을 포함한다. 이러한 항원은 문헌[Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japan, 1996)]에 개시되어 있다. 유사한 CD 단백질은 후속 워크샵에 개시되어 있다. 이러한 항원의 예는 CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, 및 이에 대한 리간드(CD27 리간드, CD30 리간드 등)를 포함한다. CD 항원 중 몇몇은 41BB 및 OX40을 또한 포함하는 TNF 수용체 패밀리의 구성원이다. 리간드는, 41BB 리간드 및 OX40 리간드처럼, 대개 TNF 패밀리의 구성원이다.
효소로 활성인 단백질 또는 이들의 리간드는 본 발명을 사용하여 또한 제조될 수 있다. 예는 하기 단백질 중 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질, 또는 이들의 리간드 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 단백질: 디스인터그린 및 금속단백분해효소 도메인 패밀리 구성원, 예컨대 TNF-알파 전환 효소, 다양한 키나제, 글루코세레브로시다제, 슈퍼옥사이드 디스무타제, 조직 플라스미노겐 활성자, VIII 인자, IX 인자, 아포지단백 E, 아포지단백 A-I, 글로빈, IL-2 길항제, 알파-1 안티트립신, 임의의 상기 언급된 효소를 위한 리간드, 및 수많은 다른 효소 및 이들의 리간드를 포함한다.
용어 "항체"는, 인간, 인간화, 키메라, 이중특이적, 단일특이적, 다중클론, 및 올리고머 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 달리 기재되지 않은 한, 특이적 결합에 대해 온전한 항체와 경쟁하는, 임의의 아이소타입 또는 하위종류의 글리코실화 및 비글리코실화 면역글로불린 둘 다 또는 이의 항원 결합 구역에 대한 언급을 포함한다. 항원 결합 단편 또는 구역을 가지는 단백질, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 다이아바디, Fd, dAb, 맥시바디, 단쇄 항체 분자, 상보성 결정 구역(CDR) 단편, 표적 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는, scFv, 다이아바디, 트라이바디, 테트라바디 및 폴리펩타이드가 또한 포함된다. 용어 "항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나 발현되거나 생성되거나 단리된 것, 예컨대 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
항체의 예는 상기 언급된 단백질 및/또는 하기 항원(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 단백질 또는 단백질의 조합을 인식하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-13 수용체, IL-18 수용체 하위단위, FGL2, PDGF-β 및 이의 유사체(미국 특허 제5,272,064호 및 제5,149,792호 참조), VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, EGF 수용체(미국 제6,235,883호 참조) VEGF 수용체, 간세포 성장 인자, 오스테오프로테게린 리간드, 인터페론 감마, B 림프구 자극자(BlyS, 또한 BAFF, THANK, TALL-1 및 zTNF4로 공지됨; 문헌[Do and Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25] 참조), C5 보체, IgE, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원, LCG(폐암과 연관되어 발현되는 유전자 생성물임), HER-2, HER-3, 종양 연관 당단백질 TAG-72, SK-1 항원, 대장암 및/또는 췌장암을 가지는 환자의 혈청에서 수치가 증가하여 존재하는 종양 연관 에피토프, 유방, 대장, 편평 세포, 전립선, 췌장, 폐, 및/또는 신장 암 세포 및/또는 흑색종, 신경교종, 또는 신경아세포종 세포에서 발현된 암 연관 에피토프 또는 단백질, 종양의 괴사 코어, 인터그린 알파 4 베타 7, 인터그린 VLA-4, B2 인터그린, TRAIL 수용체 1, 2, 3, 및 4, RANK, RANK 리간드, TNF-α, 부착 분자 VAP-1, 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 세포내 부착 분자-3(ICAM-3), 류코인터그린 부착, 혈소판 당단백질 gp IIb/IIIa, 심장 미오신 중쇄, 부갑상선 호르몬, rNAPc2(VIIa 인자-조직 인자의 저해제임), MHC I, 암태아 항원(carcinoembryonic antigen; CEA), 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein; AFP), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor; TNF), CTLA-4(세포독성 T 림프구 연관 항원임), Fc-γ-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, 스클러로스틴, L-셀렉틴, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV), 스트렙토코커스 뮤탄스, 및 스타필리코커스 아우레우스. 본 발명의 방법을 사용하여 제조될 수 있는 공지된 항체의 특정한 예는 아달리무맙, 베바시주맙, 인플릭시맙, 아브식시맙, 알렘투주맙, 바피네우주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 브리아키누맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 코나투무맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 겜투주맙 오조가미신, 골리무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 라베투주맙, 마파투무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 니모투주맙, 아파투무맙, 오말리주맙, 오레고보맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨투모맙, 페르투주맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 레벨리주맙, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙, 베돌리조맙, 잘루투무맙 및 자놀리무맙을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명은 예를 들어 임의의 상기 언급된 단백질을 포함하는 재조합 융합 단백질을 제조하기 위해 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 단백질 중 하나와 다합체 도메인, 예컨대 류신 지퍼, 감긴 코일, 면역글로불린의 Fc 부분, 또는 실질적으로 유사한 단백질을 포함하는 재조합 융합 단백질은 본 발명의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[WO94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83;
Figure 112017000612001-pct00002
et al.(1999), Structure 7:255-64]을 참조한다. 이러한 재조합 융합 단백질 중에서 수용체의 일부가 항체의 Fc 부분에 융합된 단백질, 예컨대 에타네르셉트(p75 TNFR:Fc) 및 벨라타셉트(CTLA4:Fc)가 구체적으로 포함된다. 키메라 단백질 및 폴리펩타이드, 및 임의의 상기 언급된 단백질 및 폴리펩타이드의 단편 또는 부분, 또는 돌연변이체, 변이체 또는 유사체는 본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있는 적합한 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 중에 또한 포함된다.
본원에서 사용된 전문용어가 당해 분야 내에 표준이지만, 소정의 용어의 정의가 청구항의 의미에 명확성 및 한정을 보장하도록 본 명세서에 제공된다. 단위, 첨자 및 기호는 이의 SI 승인 형태로 표시될 수 있다. 본 명세서에 언급된 숫자 범위는 범위를 한정하는 숫자를 포함하고, 한정된 범위 내의 각각의 정수를 포함하고 지지한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 기법은, 달리 표시되지 않은 한, 당해 분야에 널리 공지되고, 본 명세서에 걸쳐 인용되고 기재된 다양한 일반적이고 더 구체적인 참조문헌으로 기재된 바대로, 종래의 방법에 따라 일반적으로 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al . Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012); Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1995), 및 Greenfield, Antibodies : A Laboratory Manual 2nd ed,, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2013)], 또는 임의의 이전 개정판을 참조한다. 특허, 특허 출원, 기사, 책 및 논문(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 본원에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 참조문헌으로 본 명세서에 명확히 포함된다. 본 발명의 실시형태에서 기재된 것은 본 발명의 다른 실시형태와 조합될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 개별 양태의 단일 예시로서 의도된 본 명세서에 기재된 특정한 실시형태에 의해 범위가 제한되지 않아야 하고, 기능적으로 동등한 방법 및 성분은 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본 명세서에 표시되거나 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명 및 수반 도면으로부터 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 해당하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1
연장된 세포 배양 공정
이 실험은 한외여과 배양 공정(UF)과 비교하여 연장된 수확(X-PH)을 가지는 세포 배양 공정을 기재한다. 연장된 공정을 위해, 관심 있는 재조합 단백질이 투과액에서 수행되고 생성물 수확물로서 수집되게 하는, 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 마이크로필터에 연결된 세포 배양 생물반응기에서, 세포 배양의 재조합 단백질 생성물이 보유물에 보유되게 하는, 기공 크기 또는 MWCO를 가지는 울트라필터를 포함하는 단일 필터 유닛 시스템을 사용함으로써 관류를 수행하였다. 미리 결정된 매개변수에 도달할 때까지, 이 경우에 배양에서, 미리 결정된 시간 동안 마이크로필터 성분으로부터 투과액 또는 수확 투과액을 함유하는 재조합 단백질을 배출함으로써 관류가 수행될 때에, 울트라필터 성분으로부터 재조합 단백질 비함유 투과액, 또는 무효 투과액을 배출함으로써 관류를 수행하였다. 미리 결정된 시간이 지나간 후, 공정을 반복하였다. 배양이 종료할 때까지, 단백질 생성물의 이 보유 및 수확의 사이클을 반복하였다.
한외여과 배양 공정의 경우, 재조합 단백질 생성물이 세포 배양 생물반응기에서 보유물에 보유되고 재조합 단백질 비함유 투과액이 수집되게 하는, 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 가지는 울트라필터를 사용하여 관류 시스템에서 세포를 배양하였다. 배양이 종료할 때까지, 보유된 재조합 단백질 생성물을 생물반응기로부터의 수확물로서 회수하였다.
연장된 수확 배양 공정(X- PH )
0일에, 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포를 1500㎖의 혈청 비함유 화학적 한정된 회분 배지의 작업 용적에서 1x106개의 생존가능한 세포/㎖에 의해 2개의 2ℓ 생물반응기(Applikon(캘리포니아주 포스터 시티))로 접종하였다. 배양을 36℃에서, DO를 48.0㎜Hg에서, 교반을 350rpm에서 유지시켰다.
세포 배양을 회분식 모드로 개시하고, 30㎝의 750kDa 중공 섬유 필터(Xampler UFP-750-E-4MA, 지이 헬스케어)와 직렬로 연결된 30㎝의 30kDa 중공 섬유 필터(Xampler UFP-30-E-4MA, 지이 헬스케어(펜실베니아주 피츠버그))를 사용하여 ATF-2(상표명) 교대 접선 유동 여과 시스템(Refine Technologies(뉴저지주 하노버))을 사용하여 2일에 관류를 시작하였다. 위생 클램프를 사용하여 대략 1인치 길이의 위생 연결기 스풀 조각(sanitary connector spool piece)과 필터를 연결하였다. 배지는 1.5g/ℓ의 플루로닉(콜리포르 P188 SAFC Biosciences(미주리주 세인트 루이스))을 함유하는 혈청 비함유 화학적 한정된 관류 배지이었다.
관류 속도는 세포 배양 실행에 걸쳐 매일 0.5 내지 1.0 생물반응기 작업 용적으로 점진적으로 증가하고, 필터 유닛을 통해 균일하였다. 관류 속도와 동일한 속도로 독립적인 관류 펌프를 통해 무효 투과액 및 수확 투과액을 수집하였다. 매일의 샘플을 생물반응기로부터 수취하여 배양을 평가하였다. 생존가능한 세포 밀도(VCD) 및 생존능력을 Vi-Cell(Beckman Coulter(캘리포니아주 브레아))를 사용하여 결정하였다. HPLC 분석에 의해 역가를 측정하였다.
글라이칸 분석을 위해, 단백질 함유 샘플을 수집하고 단백질 A에 의해 정제하였다. 정제된 샘플을 PNGase-F에 의해 처리하고 37℃에서 2시간 동안 항온처리하여 N 연결 글라이칸을 방출시켰다. 효소로 방출된 글라이칸을 80℃에서 75분 동안 2-아미노벤조산(2-AA)에 의해 표지하였다. 이후, 과량의 2-AA 라벨을 글리코클린 S 카트리지에 의해 제거하였다. 샘플을 밤새 증발시키고, 생성된 건조 펠렛을 후속 HILIC(친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 분석을 위해 물에 의해 재구성하였다. 글라이칸을 주입하고, 높은 유기 조건에서 칼럼에 결합하고, 증가 구배의 수성 폼산암모늄 완충제에 의해 용리시켰다. 형광 검출을 이용하여 글라이칸 용리를 모니터링하고, 주 및 부 글라이칸 종의 상대 백분율을 계산하였다.
11일 전에, 연동 펌프(Watson Marlow 120U/DV Falmouth(영국 콘월))를 사용하여 750kDa 울트라필터로부터 투과액을 배출시킴으로써 무효 투과액 또는 생성물 비함유 투과액을 연속식으로 수집하고 버렸다. 필터 크기 때문에, 세포 배양의 단백질 생성물은 세포 배양 생물반응기에서 보유물에 보유되었다.
수확 투과액 또는 생성물 함유 투과액을 표 1에 제공된 스케줄에 따라 세포 배양 실행 동안 5회의 별개의 미리 결정된 시간에 수집하였다. 연동 펌프(Watson Marlow 120U/DV Falmouth(영국 콘월))를 사용하여 30kDa 마이크로필터로부터 투과액을 배출시킴으로써 수확 투과액을 수집하였다. 세포 배양의 단백질 생성물은 투과액에 보유되고, 수확 투과액의 일부로서 수집되었다. 상기 기재된 바대로 역가 및 생성물 품질에 대해 수확 투과액을 평가하였다. 수확 투과액을 투과액 백(RCBB-300, RIM Bio Inc.(워싱턴주 시애틀))에서 저장하였다.
Figure 112017000612001-pct00003
각각의 수확 투과액의 수집의 완료 직후, 무효 투과액을 750kDa 울트라필터로부터 연속식으로 다시 수집하고 버렸다. 24일에 수확 투과액의 수집 이후 배양을 종결하였다.
울트라필터 배양 공정( UF )
0일에, 상기한 바와 같은 동일한 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포를 1500㎖의 혈청 비함유 한정된 회분 배지의 작업 용적에서 1x106개의 생존가능한 세포/㎖에 의해 4개의 2ℓ 생물반응기(Applikon(캘리포니아주 포스터 시티))로 접종하였다. 배양물을 36℃에서, DO를 48.0㎜Hg에서, 교반을 350rpm에서 유지시켰다.
세포 배양을 회분식 모드로 개시하고, 60kDa 중공 섬유 필터(Xampler UFP-30-E-4MA, 지이 헬스케어(펜실베니아주 피츠버그))가 장착된 ATF-2(상표명) 교대 접선 유동 여과 시스템(Refine Technologies(뉴저지주 하노버))을 사용하여 2일에 관류를 시작하였다. 배지는 1g/ℓ의 플루로닉(콜리포르 P 188 SAFC Biosciences(미주리주 세인트 루이스))을 함유하는 혈청 비함유 한정된 관류 배지이었다.
관류 속도는 세포 배양 실행에 걸쳐 매일 0.5 내지 1.0의 작업 용적으로 점진적으로 증가하였다. 샘플을 매일 수취하여 배양을 평가하였다. 생존가능한 세포 밀도(VCD) 및 생존능력을 Vi-Cell(Beckman Coulter(캘리포니아주 브레아))를 사용하여 결정하였다. HPLC 분석에 의해 역가를 측정하였다.
투과액을 관류 속도와 동일한 속도에서 수집하였다. 필터 크기 때문에, 세포 배양의 단백질 생성물은 배양이 15일에 결정될 때 수확까지 세포 배양 생물반응기에서 보유물에 보유되었다.
X-PH 공정으로부터의 역가 프로필은 11일까지 UF 배양 공정으로부터의 역가와 일치하였다(도 2). 제1의 750kDa 수확 사이클이 X-PH 공정으로 도입될 때 역가 프로필은 분리된다. 생존가능한 세포 밀도(도 3) 및 생존능력(%)(도 4)에서 유사한 관련성이 관찰되었다.
51일 생물반응기 제조 기간을 이용하여, 실행 사이의 제조 생물반응기의 배정된 3일 턴어라운드로 X-PH 공정과 UF 공정의 비교가 허용된다. 이 기준으로, 2회의 24일 X-PH 공정 실행 및 3회의 UF 공정 실행은 필적하는 51일 기간에서 수행될 것이다.
X-PH 공정은 51일 제조 기간에 걸쳐 UF 공정과 비교하여 98% 초과의 회수된 생성물을 제공할 것이다(표 2). 이것은 주로 26%의 통합 생존가능한 세포 밀도(IVCD)의 증가 및 46%의 특정 생산성의 증가를 포함한다. X-PH 공정은 UF 공정의 3회의 실행에 비해 2개의 실행에서 27% 초과의 배지를 이용할 것이지만, 이것은 UF 공정과 비교하여 X-PH 공정에 의해 제조된 생성물의 1그램당 배지 요건(배지 비용)의 약 36% 감소로 전환된다.
Figure 112017000612001-pct00004
X-PH 공정 생성물 품질을 HILIC 글라이칸 맵핑에 의해 평가하고, 15일 UF 공정을 사용하여 생성된 표준품과 비교하였다(표 3). X-PH 공정 글라이칸 맵 속성은 UF 공정을 사용한 표준과 일치한다.
Figure 112017000612001-pct00005
실시예 2
이 실험은 관류 배양 시스템에서 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체, 루트롤(등록상표) F68의 낮은 농도 및 높은 농도의 영향, 및 30kDa 대 750kDa 필터의 영향을 비교한다.
0일에, 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포주를 1g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68(BASF(뉴저지주 마운트 올리브))을 함유하는 1500㎖의 혈청 비함유 화학적 한정된 관류 배지의 작업 용적에서 2x106 생존가능한 세포/㎖에 의해 4개의 2ℓ 생물반응기(Applikon Biotechnology(캘리포니아주 포스터 시티))로 접종하였다. 배양을 36℃에서, 용존 산소 농도를 48%, pH 6.9에서, 교반을 350rpm에서 유지시켰다.
세포 배양 실행을 회분식 모드로 개시하고; 세포 밀도가 4-5x106개의 세포/㎖에 도달할 때 2일에 관류를 시작하였다. 관류를 ATF-2(상표명) 교대 접선 유동 관류 및 여과 시스템(Refine Technologies(뉴저지주 하노버))을 사용하여 달성하였다. 세포 배양은 외부 수직으로 배향된 필터의 루멘 면을 통해 연속식으로 순환되어, 상부 말단에서 진입하였다. 투과액을 연동 펌프를 통해 연속식으로 배출하였다. 2개의 반응기는 30kDa 중공 섬유 필터(Xampler UFP-30-E-4MA, 지이 헬스케어(펜실베니아주 피츠버그))가 장착되었다. 2개의 반응기는 750kDa 중공 섬유 필터(Xampler UFP-750-E-4MA, 지이 헬스케어(펜실베니아주 피츠버그))가 장착되었다.
관류 속도는 세포 배양 실행에 걸쳐 0.5 내지 3㎖/분으로 점진적으로 증가하였다. 투과액 샘플을 관류 속도와 동일한 속도에서 수집하였다. 생물반응기 및 투과액 라인으로부터 샘플을 매일 1회 수취하였다. 세포 밀도, 생존능력 및 세포 직경을 인산염 완충 식염수에 의한 희석 후 CEDEX(Roche(뉴저지주 뉴틀리))에 의해 측정하여, 107개 미만의 세포/㎖의 세포 밀도를 얻었다. pH 및 CO2의 분압(pCO2) 및 O2의 분압(pO2)을 혈액 가스 분석기를 사용하여 측정하고; 포도당, 락테이트, 글루타민, 암모니아의 농도 및 K+ 및 Na+의 이온 농도를 NovaFLEX 기계(Nova Biomedical(매사추세츠주 월섬))에 의해 유지시켰다.
750kDa 필터가 장착된 반응기에서, 세포 생존능력은 6일에 80%로 감소하였다. 생존능력이 14일 동안 80% 초과로 유지되는 30kDa 필터가 장착된 반응기에서 감소가 뚜렷하지 않았다(도 5).
30kDa 중공 섬유 필터가 장착된 반응기의 상청액에서 7g/ℓ 이하의 루트롤(등록상표) F68의 축적이 관찰되었다. 이 조건 하에, 루트롤(등록상표) F68은 투과액 샘플에서 검출 가능한 수준보다 낮았다. 750kDa 필터가 장착된 반응기에서, 생물반응기 상청액 및 투과액에서의 루트롤(등록상표) F68의 수준은 비교적 일정하게 머물고, 1-1.5g/ℓ의 범위의 관류 배지 중의 수준과 유사하여, 축적이 없다는 것을 제시한다(도 6). 루트롤(등록상표) F68의 평균 몰 질량은 8,400Da이고, 이론적으로 30kDa 필터를 통해 흘러야 한다. 루트롤(등록상표) F68 미쉘의 형성은 1g/ℓ보다 훨씬 낮은 농도(제조사에 따라 20-25℃에서 0.04mM)에서 발생할 수 있다. 루트롤(등록상표) F68의 농도가 필터 및 반응기 내의 미쉘의 형성으로 인해 증대될 것이다.
루트롤 (등록상표) F68 독성 연구
세포에 대한 높은 루트롤(등록상표) F68 농도의 독성의 효과를 시험하기 위해, 상이한 단일클론 항체를 발현하는 2개의 CHO 세포주(세포주 A 및 세포주 B)는 1, 2, 3, 4 또는 5g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68을 함유하는 세포 배양 배지를 가지는 250㎖ 진탕 플라스크에서 8x105개의 세포/㎖의 초기 시딩 밀도로 10회 계대배양으로(3일/계대배양에서) 넘겨졌다.
3일 후 세포 밀도의 전체 증가가 관찰되었다(3.4-6.5x106개의 세포/㎖). 생존가능한 세포 밀도는 상이한 루트롤(등록상표) F68 농도 사이에 비교가 가능하게 하는 1g/ℓ 조건으로 정규화되었다.
3, 4 또는 5g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68을 함유하는 배지 중에 성장한 세포는 계대배양에 걸쳐 지속적으로 더 높았고, 여기서 세포 밀도의 10% 증가가 1g/ℓ 조건과 비교하여 측정되었다(p<0.01)(도 7a). 생존능력은 더 높은 루트롤(등록상표) F68 배양에 또한 더 높았다(평균 > 95%)(도 7b). 세포 직경은 1g/ℓ 조건(15.42μM)과 비교하여 모든 조건에서 약간 증가한 것으로 또한 발견되었다(p<0.05)(도 7c). 더 높은 루트롤(등록상표) F68 조건에서의 생존가능한 세포 밀도, 생존능력(%) 및 직경의 변경은 연속식 계대배양에 걸친 특징의 변화로 인한 것이었다.
세포에 대한 높은 루트롤(등록상표) F68 농도의 독성의 효과가 단일클론 항체를 발현하는 2개의 CHO 세포주를 사용하여 2ℓ 유가식 배양에서 또한 수행되었다. 역시, 생존가능한 세포 밀도, 생존능력, 세포 직경 또는 역가에 대한 높은 루트롤(등록상표) F68의 영향이 없었다(도 8).
5g/ ℓ의 루트롤 (등록상표) F68에 의한 ATF 관류 배양의 보충
1g/ℓ 및 5g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68을 비교하는 실험을 수행하였다. 0일에, 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포주를 1500㎖의 작업 용적에서 2x106개의 생존가능한 세포/㎖에 의해 6개의 2ℓ 생물반응기(Applikon Biotechnology(캘리포니아주 포스터 시티))로 접종하였다. 2개의 반응기는 1g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68을 함유하는 혈청 비함유 한정된 관류 배지를 수취하고, 2개의 반응기는 5g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68을 함유하는 혈청 비함유 한정된 관류 배지를 수취하였다. 배양을 36℃에서, 용존 산소 농도를 48%, pH 6.9에서, 교반을 350rpm에서 유지시켰다.
세포 배양 실행을 회분식 모드로 개시하고; 2일에 관류를 시작하였다. 관류를 750kDa 중공 섬유 필터(Xampler UFP-750-E-4MA, 지이 헬스케어(펜실베니아주 피츠버그))가 장착된 ATF-2(상표명) 교대 접선 유동 여과 시스템(Refine Technologies(뉴저지주 하노버))을 사용하여 달성하였다. 관류 속도는 3의 작업 용적/일이었다.
이후, 샘플을 생물반응기 및 투과액 라인으로부터 매일 1회 수취하고, 상기 기재된 바대로 시험하였다.
5g/ℓ로의 루트롤(등록상표) F68 농도의 증가는 14일 동안 95% 초과 및 25일까지 동안 90% 초과의 생존능력을 연장시켰다(도 9).
고 루트롤 (등록상표) F68을 가지는 저 루트롤 (등록상표) F68 농도 배양의 회수
0일에, 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포주를 1500㎖의 작업 용적에서 2x106개의 세포/㎖에 의해 4개의 2ℓ 제조 생물반응기(Applikon Biotechnology(캘리포니아주 포스터 시티))로 접종하였다. 세포 배양 실행을 회분식 모드로 개시하고; 2일에 관류를 시작하였다. 관류를 750kDa 중공 섬유 필터(Xampler UFP-750-E-4MA, 지이 헬스케어(펜실베니아주 피츠버그))가 장착된 ATF-2(상표명) 교대 접선 유동 여과 시스템(Refine Technologies(뉴저지주 하노버))을 사용하여 달성하였다. 반응기를 2개의 2개의 그룹으로 나누고, 각각의 그룹은 상이한 관류 세포 배양 배지 제제(배지 A 및 배지 B)를 수용하였다. 배지 제제 둘 다는 1g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68을 함유하였다. 배양을 36℃에서, 용존 산소 농도를 48%, pH 6.9에서, 교반을 350rpm에서 유지시켰다. 배양을 세포 생존능력(%)이 80%로 하강할 때까지 이 조건 하에 유지시켰다. 이때, 그룹 둘 다에 대한 배지를 (전체 5g/ℓ에 대해) 추가적인 4g/ℓ의 루트롤(등록상표) F68에 의해 보충하였다. 배양을 30일까지 이 고 플루로닉 조건 하에 유지시켰다. 더 높은 농도의 루트롤(등록상표) F68의 첨가에 의한 세포 생존능력의 회수가 도 10에 도시되어 있다. 보충 후, 생존능력(%)은 15% 이하로 증가하였다. 감소하는 세포 생존능력을 가지는 배양 중의 더 높은 농도의 플루로닉의 보호 효과가 세포 배양 배지 제제와 무관하게 명확하다.
실시예 3
이 실험은 미리 결정된 품질 표적 생성물 프로필(QTPP)을 전달하기 위해 PAC 공정으로의 설계 (QbD) 요소에 의한 다중 품질의 성공적인 파일러 스케일 적용을 입증한다. 이 실험에서 제어된 CQA는 단일클론 항체의 Fc-도메인에서 고 만노스 N-연결 글리코실화("고 만노스")이었다.
생성물에서의 높은 만노스의 수준을 세포-배양 배지에 대한 만노스(제어 레버)의 첨가 또는 제거에 의해 조절하였다. 그러나, 대사물질 전구체, 대사 저해제, 소분자, 효소 보조인자 및 유도성 프로모터를 또한 사용할 수 있었다. 최근의 연구는 상이한 당이 항체 생성물에서 높은 만노스의 수준에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 만노스의 공급은 배양 생산성에 영향을 미치지 않으면서 높은 만노스의 수준을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 경험 연구를 통해, IgG 높은 만노스 수준에 대한 세포 배양 배지에서의 만노스 농도의 영향의 이해가 개발되었고, 세포 배양 공정에 대한 관계가 연구되었다. 모델 예측 제어(MPC)의 원칙에 기초한 PAC 알고리즘을 개발하도록 파일럿 스케일에서 훈련 제조 실행 및 소규모 연구로부터 얻은 지식을 통합하였다. MPC는 미래의 행적을 예측하기 위해 공정의 수학적 모델이 사용되는 제어 체계이다. 통상적인 CHO 생물반응기 공정의 일시적 성질, 다중 CQA와 이의 제어 레버 사이의 상호작용의 가능성 및 복잡한 분석과 연관된 지연은 모두 MPC에 대한 강한 동기를 제공한다. MPC에 사용된 모델에 정보를 주기 위해 적절한 때에 데이터를 제공하기 위해 표준 생물반응기 모니터링과 조합된 거의 실시간 질량 분광광도법 분석법을 포함하는 PAT 기술이 사용된다. 표적 범위 내에 고 만노스 CQA를 유지시키기 위해 생물반응기에 첨가되는 만노스의 양을 결정하는 MPC 시스템으로 다수의 검정으로부터의 데이터를 통합하였다.
포도당 대 만노스의 세포 배양 플레이트 검정 비율:
세포주는 단일클론 항체를 발현하는 재조합 CHO 세포주이었다. 딥-웰 플레이트에서 2㎖의 작업 용적에서 12g/ℓ의 포도당을 함유하는 화학적 한정된 (CD) 배지 중에 세포를 7.5e5개의 세포/㎖로 시딩하였다. 220rpm(50㎜의 오비탈 직경)에서 36.0℃ 및 5% CO2에서 오비탈 진탕기 내에서 세포를 항온처리하였다. 3-4일에, 포도당 농도를 폴리켐 포도당 시약 플레이트 검정(Polychem Glucose Reagent Plate Assay)(MedTest DX(미시건주 캔톤))을 통해 측정하고, 배양을 원심분리하여 새로운 CD 배지에 의해 소비된 배지의 26%를 대체하였다. 유사하게, 5일에, 소비된 배지의 100%를 포도당을 함유하지 않는 새로운 CD 배지에 의해 대체하였다. 전체 헥소스 농도를 후속하여 농축 헥소스 스톡 용액으로부터의 첨가에 의해 포도당 대 만노스의 상이한 비율을 사용하여 10g/ℓ로 조정하였다. 세포를 24시간 동안 성장하게 허용하였다. 상청액을 제거하고, IgG를 정제하고, 고 만노스(%)를 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 검정에 의해 측정하였다.
GC-MS 헥소스 검정
포도당 및 만노스 농도를 GC-MS에 의해 세포 배양 배지에서 정량화하였다. 1㎖의 세포 배양의 샘플을 펠렛 세포로 원심분리하고, 상청액을 여과시켰다(0.2μM). 여과된 상청액을 DI 물로 10 중 1로 희석하고, 10㎕의 이 희석액을 1.5㎕의 원심분리 관에 첨가하였다. 10mM D-[UL-13C6]만노스 99.9%(Omicron Biochemicals) 및 10mM D-[U-13C6]포도당 99.9%(Cambridge Isotope Labs)을 함유하는 헥소스 내부 표준 용액의 5㎕의 분취량을 첨가하였다. 샘플을 30분 동안 건조시켰다(SpeedVac). 30분 동안 40℃에서 항온처리된 1% 트라이메틸클로로실란(TMCS)과 함께 20㎕의 무수 피리딘 및 30㎕의 N-메틸-N-(트라이메틸실릴)트라이플루오로아세트아마이드(MSTFA)의 첨가에 의해 헥소스를 유도체화하였다. 유도체화 직후, 애질런트(Agilent) GC 6890N MSD 5973 시스템에서 샘플을 분석하였다. 1㎕의 샘플을 50 중 1 분할로 애질런트 DB-35 GC 칼럼(30m x 0.32㎜ x 0.25㎛)에서 주입하였다. 헬륨을 1㎖/분의 일정한 흐름에서 유지시켰다. 오븐 온도를 2분 동안 190℃에서 유지시키고, 4℃/분의 속도로 202℃로 상승시켰다.
온도를 60℃/분의 속도로 280℃로 추가로 상승시켰다. 전체 실행 시간은 6.3분이었다. 각각의 헥소스는 2개의 피크를 제공하여서, 열린 및 닫힌 이성질체 형태 둘 다를 나타낸다. 만노스는 2.7분 및 3.34분에 용리하고; 포도당은 3.5분 및 4.18분에 용리하였다(도 11a). 3.34분 피크 면적은 만노스 정량화에 사용되고, 4.18분 피크 면적은 포도당 정량화에 사용되었다. 특징적인 TMS 탄수화물 단편 m/z = 20416 및 12C 당의 m/z = 204 피크 면적이 13C 당의 m/z = 206 피크 면적과 비교되는 표준 동위원소 희석을 이용하여 헥소스를 정량화하였다(도 11b).
IdeS(FabRICATOR(등록상표))은 MS - PAT 검정의 단백질분해를 제한한다
여과된 세포-배양 배지 샘플을 추가의 정제 없이 분석하였다. 30분 동안 37℃에서 IdeS 효소(fabRICATOR, Genovis(스웨덴 룬드))의 60단위에 의해 대략 60㎍의 각각의 샘플을 분해하였다. 이후, 분해된 샘플을 10분 동안 55℃에서 50mM 다이티오트레이톨(DTT)에 의해 4M 구아니딘 염산염 중에 환원시켰다. 이후, 분해되고 환원된 샘플을 RP-HPLC/MS에 의해 분석하였다.
애질런트 MST 비행 시간(TOF) 질량 분광기(캘리포니아주 산타 클라라)에 커플링된 워터스 애쿼티 울트라-퍼포먼스(Waters Acquity Ultra-Performance) 액체 크로마토그래피(UPLC)(매사추세츠주 밀포드)를 사용하여 RP-HPLC/MS 분석을 수행하였다. 제조된 샘플을 80℃에서 유지된 역상 워터스 BEH 페닐 칼럼(1.7㎛, 2.1x150㎜; 매사추세츠주 밀포드)에서 분리하였다. 220㎚에서 UV 및 TOF-MS에 의해 피크를 모니터링하였다. 피크의 전체 이온 전류(TIC), 이어서 애질런트 MassHunter 소프트웨어를 사용한 디콘볼루션 및 정량화로부터 질량 데이터를 추출하였다.
친수성 상호작용 크로마토그래피( HILIC ) 글라이칸 맵 검정
100㎍의 정제된 항체를 PNGase F(New England Biolabs)에 의해 분해한 후, 0.04M 나트륨 사이아노보로하이드라이드와 함께 12㎎/㎖의 2-아미노벤조산(2AA)을 함유하는 50㎕의 형광 표지 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 75분 동안 80℃에서 항온처리하였다. 표지된 글라이칸을 형광 검출기(매사추세츠주 밀포드)가 장착된 애쿼티 UPLC에 의해 분석하였다. 대략 3㎕의 표지된 글라이칸을 애쿼티 UPLC BEH 글라이칸 칼럼(186004741호, 매사추세츠주 밀포드), 이어서 360㎚에서의 방출 및 425㎚에서의 검출을 이용한 형광 검출기에 주입하였다. MS/MS 기법에 의해 2AA 표지된 글라이칸 종을 확인하였다.
모델 매개변수를 일치시키기 위한 데이터의 생성, 및 고 만노스(%)의 제어에 대한 MPC의 후속하는 입증을 생물반응기에서 수행하였다. 25%의 스톡 용액을 사용하여 1g/ℓ의 배양 농도로 배양의 첫 날짜에 만노스(Sigma, M6020)를 첨가하였다. 관류를 배양 2일에 개시하였다. 관류 배지를 매일 0.5 내지 1.0의 생물반응기 용적의 증가하는 용적에서 전달하였다. 델타 브이(Delta V) 자동화(Emerson)를 사용하여 생물반응기를 제어하였다. 역가, 헥소스 및 생성물 글라이칸 측정을 위해 MAST SP200 오토샘플 밸브(Bend Research)를 사용하여 생물반응기 샘플링을 4시간마다 수행하였다. 자동화 샘플 수집 후, 샘플을 수동으로 원심분리하고 0.2㎛ 여과하여 세포 및 부스러기를 제거하였다. 성장, 생존능력, 삼투압농도 및 락테이트의 측정을 위한 매일의 샘플을 수동으로 또는 MAST SP200을 사용하여 수집하였다. 생존가능한 세포 밀도(VCD) 및 배양 생존능력(%)을 노바(Nova) CDV(Nova Biomedical)를 사용하여 측정하였다. 락테이트 농도를 노바 바이오프로필 베이직 분석기(Nova Bioprofile Basic analyzer)(Nova Biomedical)를 사용하여 결정하였다.
모델 예측 제어
모델 예측 제어(MPC)를 위한 그리고 모델 매개변수를 일치시키기 위한 프로그래밍을 MATLAB(버전 R2014a, Mathworks)에서 수행하고, 코드는 보충 자료에서 이용 가능하다. 단일 훈련 반응기 실행으로부터의 데이터로의 모델 방정식의 최소 자승 회귀에 의해 모델 매개변수를 결정하였다. (MPC를 통한) 만노스 공급에 의한 고 만노스의 제어를 위해, 매일의 속도 변화를 하기 단계를 통해 계산하였다:
1. 현재의 모델 오프셋의 계산. (이용 가능한 경우) 매일의 측정된 값과 조합된 반응기 조작 이력을 모델 미분 방정식의 수치 해법을 생성하기 위해 입력으로서 사용하였다. 모델과 가장 최근의 측정 사이의 차이를 이후 계산할 수 있었다. 미래의 오프셋의 예측치로서 이 차이를 이용하였다.
Hk - 시점 k에서의 모델 값 = f(tk)
H'k = 시점 k에서의 측정된 값
Hk +1 = 시점 k+1에서의 조정된 예측된 값 = F(tk +1) + (Hk -H'k)
2. MPC를 통한 최적 미래의 속도의 결정. 제어가 개시되면 표준 MPC 기록 수평 방법 17을 매일 이용하였다. 모델에 의해 예측된 생성물 품질 프로필과 표적 설정 사이의 제곱 오차의 합을 최소화함으써 5개의 속도 변화의 최적 세트를 결정하였다. 5개의 속도 변화를 계산하였지만, 오직 처음의 것을 사용하였다. 다음의 속도 변화가 실행으로 인한 시간까지, 새로운 데이터가 이용 가능하고, 이것은 이후 미래의 속도의 최적 세트를 재계산하기 위해 사용되었다.
목적 함수(이 경우에 분자에서의 원하는 높은 만노스 수준과 지배 미분 방정식의 적분을 통해 발견된 것 사이의 차이의 제곱의 합임)의 최소화에서 이것을 독립 변수로 처리함으로써 만노스 공급 속도가 발견되었다. 상기 방정식은 충분히 잘 거동하여서, MATLAB 문제풀이에 의해 얻어진 해법은 항체에서 ±1% 고 만노스 종으로 제어하기에 충분하다. 고 만노스를 제어하기 위한 방법은 반응기에 대한 만노스의 첨가가 항체에 대한 고 만노스(%)를 증가시킨다는 점에서 일방적이다. 고 만노스 제조(%)의 감소는 (만노스 공급 속도를 감소시킨 후 관류를 통한 희석에 의해) 만노스 농도를 감소시킴으로써 달성된다.
GC-MS 헥소스 정량화
만노스의 실시간 정량화는 MPC에 필요한 입력이었다. 세포 배양 배지에서 헥소스(만노스 및 포도당)를 구별하기 위해 GCMS를 사용하였다. 상기 기재된 바대로 동위원소 희석에 의해 헥소스를 정량화하였다. 도 11a는 통상적인 실행 동안 세포 배양 배지로부터 만노스의 GC에 의한 기준치 분리를 보여준다. 도 11b는 헥소스 단편화 패턴(만노스와 포도당 사이에 동일)을 보여주고, 여기서 m/z 204 피크는 13C 표지된 내부 표준품으로부터 m/z 206 피크를 사용하여 정량화되었다. 포도당 및 만노스 둘 다에 대한 검출 한계는 0.02g/ℓ이고, 직선성이 6g/ℓ 이하의 헥소스의 정량화에 입증되었다(도 11c).
포도당 대 만노스의 세포 배양 플레이트 검정 비율
세포를 일정한 10g/ℓ의 전체 헥소스에 의해 그러나 만노스의 증가하는 농도에 의해 배양하여, 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8 및 0:10의 포도당:만노스 비율을 제공하였다. 세포를 상이한 헥소스 비율에 의해 24시간 동안 배양하였다. 상청액을 제거하고, IgG를 정제하고, 고 만노스(%)를 HILIC 검정에 의해 측정하였다. 도 12a는 세포 배양 배지 중의 만노스의 농도와 전체 높은 만노스 수준 사이의 선형 관계식을 입증하고, 여기서 고 만노스는 포도당만을 함유하는 배지 중의 10%에서 가장 낮고, 만노스만을 함유하는 배지 중의 37%에서 가장 높았다.
고 만노스의 증가가 만노스 당 농도의 증가 또는 포도당 당 농도의 감소로 인한 것인지를 확립하기 위해, 세포를 5일을 제외하고 제1 플레이트 실험에서처럼 배양하였고, 여기서 배지를 1, 3, 5, 7 또는 10g/ℓ의 만노스를 함유하는 새로운 배지에 대해 교환하였다. 5개의 상이한 농도의 포도당(1, 3, 5, 7 또는 9g/ℓ)을 각각의 만노스 함유 배양에 첨가하였다. 2g/ℓ의 최저량(1g/ℓ의 포도당 및 1g/ℓ의 만노스; 도 12b) 및 19g/ℓ의 최고량(9g/ℓ의 포도당 및 10g/ℓ의 만노스; 도 12b)의 전체 헥소스에 의해 전체 25개의 상이한 배양에 대해 이를 만들었다. 세포를 24시간 동안 성장하게 허용하였다. 이후, 상청액을 제거하고, IgG를 정제하고, 고 만노스(%)를 HILIC 검정에 의해 측정하였다. 도 12b는 고 만노스의 선형 증가가 포도당 농도와 독립적이고, 배지에서 오직 만노스 농도에 따라 달라진다는 것을 나타낸다. 이 관계식은 MPC 제어 루프를 개발하기 위해 사용되었다.
제어 루프 개발: 모델 예측 제어
제어 루프 개발을 위해, 생물반응기를 MAST SP200 자동화 샘플링 장치 및 만노스 용액 공급 펌프, 또한 일상적인 생물반응기 제어 및 오프라인 분석에 연결하였다(도 13). 만노스 공급물을 사용한 고 만노스의 일방 제어를 위해 MPC 피드백 루프를 개발하기 위해 훈련 데이터를 생성하도록 15일 관류 생물반응기 실행을 수행하였다. 고 만노스(%)(도 14a), 반응기에서의 만노스 농도(도 14b), 세포 성장(도 14c) 및 역가 축적(도 14d)에 대한 데이터는 9 내지 11일 동안 수집되지 않은 글라이칸 데이터를 제외하고, 4시간의 시간 간격에서 수집되었다. MPC 모델은, 오차로 인해 유사한 실행으로부터 계산된 성장 매개변수를 제외하고, 이 데이터로부터 개발되었다. 성장 매개변수의 세트 둘 다를 사용한 모델 예측은 도 14에 도시되어 있고, 실제로 동일하다.
제어 루프 개발: 모델 방정식
세포수, 생성물, 만노스 농도 및 고 만노스 종의 변화율을 기술하기 위해 통상의 미분 방정식을 구축하였다.
Figure 112017000612001-pct00006
식 중, N은 세포 밀도이고, μ는 최대 성장률이고, Nm은 최대 세포 밀도이다. 세포 밀도는 세포/용적 또는 세포 용적/용적일 수 있다. 이 작업에서, 계산된 및 임의의 규모조정된 용적은 세포 계수치로부터 계산되고, 직경은 노바 CDV에서 측정되었다. 역가의 경우, 특정 생산성은 일정한 것으로 추정되고, 생성물의 다양한 보유(사용된 관류 필터에 따라 달라짐)가 하기에 대해 확인된다:
Figure 112017000612001-pct00007
생성물 농도는 P이고, qp는 특정 생산성이다. S는 관류 필터를 통과한 생성물의 분획인 체질 계수이고, D는 반응기 용적/일 단위의 관류 속도이다. 만노스의 변화 속도는 하기이다:
Figure 112017000612001-pct00008
반응기에서의 만노스 농도는 M이고, Mf는 관류 배지에서의 만노스의 유효 농도이고, qM은 특정한 만노스 소비 속도이다. 만노스 소비 속도는 미하엘리스-멘톤(Michaelis-Menton) 동역학을 따르는 것으로 추정된다:
Figure 112017000612001-pct00009
최대 반응 속도는 VM이고, KM은 미하엘리스-멘톤 상수이다. 세포 배양 플레이트로부터의 데이터는 고 만노스 종의 상대 제조 속도가 만노스 농도에 비례한다는 것을 제안한다(도 12b):
Figure 112017000612001-pct00010
식 중, H는 고 만노스 종의 농도이고, FH는 고 만노스 비례 인자이다. 이전의 데이터(비도시)의 조사는 FH가 세포 밀도에 따라 변해서 FH에 대해 하기 순수한 경험식이 사용된다는 것을 제안한다:
Figure 112017000612001-pct00011
K1 및 K2는 경험 상수이다. 마지막으로, 고 만노스의 변화 속도는 연쇄 법칙을 통해 발견된다:
Figure 112017000612001-pct00012
도 14에 도시된 훈련 데이터의 최소 자승 회귀를 통해 모든 모델 매개변수를 결정하였다. 매개변수는 도 14c에 도시된 세포 성장 프로필을 작도함으로써 발견되었다. qp에 대한 값은 도 14d에 도시된 역가 곡선을 작도함으로써 발견되었다. 12일 후의 역가의 감소는 한외여과 막(S인 체질 계수에 대해, 0임)으로부터 정밀여과 막(0.76 내지 0.78의 범위의 체질 계수를 제공)으로의 이동으로 인한 것이다. 남은 매개변수는 이 방정식을 도 14a 및 도 14b에서의 데이터에 동시에 작도함으로써 발견되었다.
모델에서 사용된 매개변수 값 및 이의 95% 신뢰 한계가 표 4에 기재되어 있다. 모델 매개변수 및 신뢰 한계의 숫자 값은 훈련 데이터로부터 얻어지고 MPC에 사용되었다. 훈련 데이터에 대한 생성된 모델 피트의 그래프가 도 14(파선 A-D)에 도시되어 있지만, MPC에 사용된 성장 매개변수와의 일치는 점선이다. KM인 만노스 미하엘리스 멘톤 상수에 대한 매개변수 일치가 사용된 농도보다 훨씬 더 크고, 그래서 만노스 소비 동역학은 효과적으로 1 차수이다. 훈련 데이터 및 후속하는 MPC의 입증은 고 만노스에 대한 제어 레버로서 제공되는 만노스 농도의 예외로 동일한 조건 하에 수행되었다.
Figure 112017000612001-pct00013
높은 만노스 수준을 제어하기 위한 MPC의 입증
매개변수 값의 편차에 후속하여, 높은 만노스 수준(%)을 항체 A에 대해 6%±1%로 활발히 제어하기 위해 생물반응기 실행에서 피드백 루프를 사용하였다. 관류 및 만노스 공급을 제조 배양의 2일에 개시하였다. 초기 만노스 공급을 이의 농도를 반응기에서 거의 일정하게 유지시키는 속도로 설정하였다. 이 초기 만노스 공급 속도는 공정에 의해 이전의 경험에 기초하여 예측되고, 제어 루프의 일부가 아니었다. 제어 루프를 제조의 5일에 시작하였다. 샘플을 매일 수취하고 분석하여 MPC 모델로의 입력을 결정하였다. 반응기 샘플과 속도 변화 사이의 지체는 평균 8.5시간으로 5시간 내지 14시간의 범위였다. 모든 필요한 데이터가 이용 가능하면, 이것을 MATLAB 모델로 수동으로 입력하여 다음의 만노스 공급 속도를 결정하였다. 고 만노스(%)의 생성된 궤적, 다른 모델링된 분량 및 공급 농도에 기초한 생성된 MPC(공급 속도로부터 계산됨)는 도 15에 도시되어 있다. 제어가 개시되면, 측정된 및 모델링된 고 만노스(%)는 신속히 증가하였고, 6% 표적의 1% 내에 유지되었다(도 15a). 측정된 및 모델링된 만노스 농도 프로필은 만노스 공급에 반응하여 예상된 바대로 상승하고 하강하였다(도 15b). 세포 성장은 6일 및 12일에 꽤 상당한 편차의 예외로 추정된 로지스틱 곡선을 주로 따랐다(도 15c). 측정된 역가는 모델과 일치하였지만, 배양의 마지막 수 일에서의 불연속은 이 모델이 예상 단백질 제조 하에 있다는 것을 입증한다(도 15d). 측정을 일치시키기 위한 MPC 모델 상태의 조정은 관찰된 편차에도 불구하고 고 만노스의 우수한 제어를 허용하였다. 도 16에서, PAC 공정과 이력 파일럿 플랜트 실행 사이의 비교가 도시되어 있다. PAC 공정과 설계 및 성능이 유사한 종래의 공정을 사용하여 그러나 활성 제어 루프 없이 이력 실행을 수행하였다. 대신에, 종래의 공정은, 처분을 위해 품질 제어를 통과하는 것이 필요한, 원하는 생성물을 전달하기 위해 매 뱃취에 대해 오차 한계 내에 실행하기 위한, 정적 공정 매개변수에 의존한다. PAC 공정에 의해, PQ는 거의 실시간 측정되고, 제조 실행 동안 활발한 제어로 인해, 처분 전에 후속 분석 규명을 필요로 하지 않을 것이다.

Claims (31)

  1. 연장된 정기적 수확을 위한 방법이며,
    생물반응기에 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포를 접종함으로써 세포 배양을 확립하는 단계,
    상기 생물반응기에 새로운 세포 배양 배지를 관류시킴으로써 세포 배양을 유지시키고, 세포 배양물을 필터를 통해 통과시키고, 투과액을 수집하는 단계이며,
    여기서 무효 투과액(null permeate)은 상기 생물반응기 내 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 갖는 중공 섬유 필터를 이용하여 수집되고, 여기서 상기 무효 투과액이 수집될 때, 숙주 세포 및 발현된 재조합 단백질은 생물반응기에서 보유물에 잔류하고, 투과액은 숙주 세포 및 발현된 재조합 단백질을 포함하지 않거나 덜 가지고 있고,
    여기서 수확 투과액(harvest permeate)은 상기 생물반응기 내 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 갖는 중공 섬유 필터를 이용하여 수집되고, 여기서 상기 수확 투과액이 수집될 때, 숙주 세포는 생물반응기에 보유되고, 발현된 재조합 단백질은 투과액으로 통과하고,
    여기서 상기 수확 투과액이 미리 결정된 시간 동안 수집되는 시기인 제1의 미리 결정된 매개변수에 도달할 때까지, 상기 무효 투과액을 초기에 수집하는 단계이며, 상기 수확 투과액은 재조합 단백질을 포함하고,
    이후, 제2의 미리 결정된 매개변수에 도달할 때까지 무효 투과액을 교대로 수집한 후, 수확 투과액을 미리 결정된 시간 동안 수집하는 단계이며,
    여기서 무효 투과액 및 수확 투과액의 교대 수집을 상기 세포 배양 종료시까지 계속하는 단계
    를 포함하는, 연장된 정기적 수확을 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미리 결정된 매개변수가 시간, 생존가능한 세포 밀도, 충전된 세포 용적 또는 역가로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1의 미리 결정된 매개변수가 상기 세포 배양의 확립 이후 적어도 12시간 내지 25일인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2의 미리 결정된 매개변수가 상기 수확 투과액의 수집 이후 적어도 12시간 내지 72시간인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미리 결정된 시간이 적어도 12시간 내지 72시간인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생물반응기 내 재조합 단백질을 보유하는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 갖는 중공 섬유 필터가 울트라필터인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 울트라필터의 분자량 컷오프가 300kDa 이하인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 울트라필터의 분자량 컷오프가 30kDa인 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 울트라필터의 기공 크기가 0.01㎛ 내지 0.1㎛인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 생물반응기 내 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 갖는 중공 섬유 필터가 마이크로필터인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 마이크로필터의 분자량 컷오프가 적어도 500kDa인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 마이크로필터의 분자량 컷오프가 750kDa인 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 마이크로필터의 기공 크기가 0.1㎛ 내지 10㎛인 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 필터가 단일 유닛 필터 시스템인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 투과액이 상기 생물반응기 내 재조합 단백질을 보유하지 않는 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 갖는 중공 섬유 필터인 필터로부터 수집될 때의 상기 새로운 세포 배양 배지가, 적어도 5g/ℓ의 비이온성 블록 공중합체가 달성되도록 제제화되거나 보충되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양 공정 동안 샘플을 수취하는 단계,
    상기 샘플을 평가하여 상기 재조합 단백질의 특징 및/또는 상기 세포 배양 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 관류가 연속식 관류인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 관류가 1일 당 1.0 이하의 작업 용적의 속도로 수행되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 관류가 연동 펌프(peristaltic pump), 이중 격막 펌프, 저전단 펌프 또는 교대 접선 유동에 의해 달성되는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양물을, 세포가 a) 제1의 시간 기간 동안 제1 온도에서 및 b) 제2의 시간 기간 동안 제2 온도에서 배양되는 온도 이동에 적용하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 온도 이동이 미리 결정된 매개변수에 반응하고, 상기 미리 결정된 매개변수의 달성이 커패시턴스(capacitance) 기반 바이오매스 프로브를 사용하여 결정되는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양이 상기 생물반응기에 적어도 0.1x106개의 생존가능한 세포/㎖를 접종함으로써 확립되는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 포유류 세포가 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 융합 단백질 또는 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 응집, 침전, 원심분리, 심층 여과(depth filtration), 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 수산화인회석 크로마토그래피 중 하나 이상에 의해 상기 수확 투과액으로부터 정제되는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 정제 공정 동안 샘플을 수취하는 단계,
    상기 샘플을 평가하여 상기 재조합 단백질의 특징 및 상기 정제 공정을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 샘플이 공정 분석 기법을 이용하여 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링되는 것인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 약제학적으로 허용되는 제제로 제제화되는 것인 방법.
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