BR112016028285B1

BR112016028285B1 - Método para uma colheita periódica prolongada, sistema de filtro de unidade única e método para cultivo de células que expressam proteína recombinante

Info

Publication number: BR112016028285B1
Application number: BR112016028285-0A
Authority: BR
Inventors: Chetan Goudar; Sean COLE; Nicole Sabo; Henry Lin; Tharmala Tharmalingam; Jonathan LULL
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2023-02-23
Also published as: JP6695814B2; CY1121217T1; ZA201608303B; CA2951046A1; CA2951046C; PT3152317T; JP7097404B2; US20220356502A1; LT3926051T; FI3926051T3; ES2909630T3; AU2020294155B2; JP2020124207A; AU2020294155A1; WO2015188009A1; AU2022224699A1; TR201900776T4; HUE042277T2; DK3926051T3; EP4372078A2

Abstract

MÉTODOS PARA COLHEITA DE CULTURAS DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS. A invenção fornece métodos e materiais para o cultivo de células de mamíferos e colheita de proteína recombinante.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N ° 62/007.588, depositado em 4 de junho de 2014, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção prevê métodos e materiais para o cultivo de células de mamíferos e a colheita de proteínas recombinantes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Visto que a demanda por maiores quantidades de proteínas recombinantes terapêuticas continua a aumentar, muitos esforços estão sendo dedicados à otimização processual, particularmente em métodos e estratégias para o cultivo, alimentação e manutenção da produção de cultivos celulares que tenham impacto positivo sobre a viabilidade celular e a recuperação de proteínas. O desenvolvimento de processos de fabricação para a produção de proteínas recombinantes é uma tarefa complexa, em que muitas variáveis devem ser ponderadas. Isto é particularmente verdadeiro para os processos à montante, em que todos os elementos do processo de cultivo celular podem ter um amplo impacto sobre os estágios posteriores da produção, particularmente os processos de colheita e à jusante.

[004] Um cultivo celular típico é submetido a uma fase de crescimento, um período de crescimento exponencial em que a densidade celular é aumentada. A fase de crescimento é seguida de uma fase de transição em que o crescimento celular exponencial está desacelerando e a produção proteica começa a aumentar. Isso marca o início da fase estacionária, uma fase de produção, em que a densidade celular tipicamente se nivela e produz aumentos de título. Em sistemas de colheita em lotes, em que o cultivo celular é mantido por um determinado número de dias depois da colheita de todo o cultivo de uma só vez, a maioria do produto pode ser produzida nos últimos dias antes da colheita quando o cultivo celular tipicamente alcançou sua maior produção. Embora isso possa resultar em uma colheita única de título elevado, isso se dá às custas de um tempo de resposta improdutivo para iniciar a rodada seguinte e do tempo de latência para obter outra vez o pico de produção. Em sistemas de colheita contínua, em que o produto contendo permeado é coletado do cultivo de célula em uma base continua ao longo da fase de produção, a duração do cultivo de célula é estendida, mas às custas de títulos mais baixos do produto e maiores volumes de fluido de cultivo celular residual a serem tratados durante as fases de colheita e purificação.

[005] O desenvolvimento do cultivo celular e do processo de colheita é, em última análise, um exercício na otimização processual e variáveis de troca, como a velocidade de processamento para o título do produto e qualidade do produto. Os desafios incluem, por exemplo, a manutenção da viabilidade celular, a obtenção de um título de produto viável e o equilíbrio da produção do processo à montante com o que os processos de colheita e à jusante podem processar.

[006] Novos métodos de processo que preveem até mesmo melhorias incrementais na produção de proteínas recombinantes e recuperação são importantes, dada a despesa de processos de cultivo celular e a demanda de crescimento para maiores quantidades e custos mais baixos dos produtos biológicos. Melhorias nos processos de cultivo celular que podem levar a uma maior recuperação do produto, reduzindo os custos associados com a fabricação de terapêuticos proteicos, são necessárias. A invenção satisfaz essas necessidades proporcionando esses métodos e materiais para estender a duração do cultivo celular ao mesmo tempo em que se aumenta a recuperação de proteínas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A invenção proporciona um método para uma colheita periódica estendida que compreende o estabelecimento de um cultivo de células pela inoculação de um biorreator com células de mamíferos que expressam uma proteína recombinante, mantendo o cultivo celular pela perfusão de um meio de cultivo de células novo no biorreator, passando o cultivo celular por um filtro e coletando um permeado, em que um permeado nulo é coletado inicialmente até que se alcance um primeiro parâmetro predeterminado, momento em que o permeado de colheita é coletado por um tempo predeterminado. Isso é seguido de uma colheita alternativa de um permeado nulo até que um segundo parâmetro predeterminado seja obtido, colhendo, então, um permeado de colheita por um tempo predeterminado, em que a coleção alternada do permeado nulo e o permeado da colheita continuam até o término do cultivo celular.

[008] Em uma modalidade, o parâmetro predeterminado é selecionado dentre tempo, densidade de células viáveis, volume de células embaladas ou título.

[009] Em uma modalidade, o primeiro parâmetro predeterminado é a pelo menos 12 horas a 25 dias após o estabelecimento do cultivo de células. Em uma modalidade, o primeiro parâmetro predeterminado é a pelo menos 24 a 72 horas após o estabelecimento do cultivo celular. Em uma modalidade, o primeiro parâmetro predeterminado é a pelo menos 4 dias após o estabelecimento do cultivo celular. Em uma modalidade, o primeiro parâmetro predeterminado é a pelo menos 5 ou mais dias após o estabelecimento do cultivo de células. Em uma modalidade, o primeiro parâmetro predeterminado é a pelo menos 25 dias após o estabelecimento do cultivo de células. Em uma modalidade, o primeiro parâmetro predeterminado é a pelo menos 5 a 25 dias após o estabelecimento do cultivo celular. Em uma modalidade, o primeiro parâmetro predeterminado é a pelo menos 10 a 12 dias após o estabelecimento do cultivo celular.

[0010] Em uma modalidade, o segundo parâmetro predeterminado é de pelo menos 12 a 72 horas após a coleta do permeado da colheita. Em uma modalidade, o segundo parâmetro predeterminado é de pelo menos 24 a 72 horas após a coleta do permeado da colheita. Em uma modalidade, o segundo parâmetro predeterminado é de pelo menos 24 a 48 horas após a coleta do permeado da colheita.

[0011] Em uma modalidade, o tempo predeterminado é a pelo menos 12 a 72 horas. Em uma modalidade, o tempo predeterminado é a pelo menos 24 a 72 horas. Em uma modalidade, o tempo predeterminado é a pelo menos 24 a 48 horas.

[0012] Em uma modalidade, o permeado nulo é coletado inicialmente por menos 24 horas a 25 dias, tempo em que o permeado da colheita é coletado por 12 a 72 horas, seguida de uma coleta alternada de um permeado nulo por pelo menos 24 horas a 25 dias e, em seguida, a coleta de um permeado de colheita por 12 a 72 horas.

[0013] Em uma modalidade, quando o permeado nulo é coletado, o filtro é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou peso molecular de corte (MWCO) que retém a proteína recombinante no biorreator. Em uma modalidade relacionada, o peso molecular de corte é de 300 kDa ou menos. Em uma modalidade relacionada, o filtro de fibra oca é um ultrafiltro.

[0014] Em uma modalidade, quando o permeado de colheita é coletado, o filtro é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou peso molecular de corte (MWCO) que não retém a proteína recombinante no biorreator. Em uma modalidade relacionada, o peso molecular de corte é de pelo menos 500 kDa. Em uma modalidade relacionada, o filtro de fibra oca é um microfiltro.

[0015] Em uma modalidade, o filtro é um sistema de filtro de unidade única. Em uma modalidade relacionada, o controle do sistema de filtro de unidade única compreende pelo menos um filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso de molecular de corte (MWCO) que retém a proteína recombinante no biorreator e pelo menos um componente de filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso de molecular de corte (MWCO) que não retém a proteína recombinante no biorreator. Em uma modalidade relacionada, o peso molecular de corte de pelo menos um componente de filtro de fibra oca que retém a proteína recombinante no biorreator é de 300 kDa ou menos. Em uma modalidade relacionada, o peso molecular de corte de pelo menos um componente de filtro de fibra oca que não retém a proteína recombinante no biorreator é de pelo menos 500 kDa ou menos. Em uma modalidade relacionada, pelo menos um componente de filtro de fibra oca que retém a proteína recombinante no biorreator é um ultrafiltro e pelo menos um componente de filtro de fibra oca que não retém a proteína recombinante no biorreator é um microfiltro. Em uma modalidade relacionada, o sistema de filtro de unidade única está contido em um compartimento. Em uma modalidade relacionada, o sistema de filtro de unidade única compreende ainda um espaçador entre pelo menos dois dos componentes de filtro de fibra oca.

[0016] Em uma modalidade, quando o permeado nulo é coletado, ele é retirado de pelo menos um componente filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou peso molecular de corte (MWCO) que retém a proteína recombinante no biorreator.

[0017] Em uma modalidade, quando o permeado nulo é coletado, o filtro é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou peso molecular de corte (MWCO) que não retém a proteína recombinante no biorreator.

[0018] Em uma modalidade, quando o permeado é coletado de um filtro que é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que não retém a proteína recombinante no biorreator, o meio fresco de cultura de células é formulado com ou complementado para atingir pelo menos 5 g/L de um copolímero em bloco não iônico. Em uma modalidade relacionada, o copolímero em bloco não iônico é um copolímero de bloco de polioxipropileno-polioxietileno. Numa concretização relacionada, o copolímero em bloco não-iónico é poloxâmero 188.

[0019] Em uma modalidade, o método acima que compreende ainda a retirada de amostras durante os processos de cultivo celular, a avaliação das amostrar para monitorar quantitativamente e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e/ou o processo de cultivo celular. Em uma modalidade relacionada, as amostras são monitoradas quantitativamente e/ou qualitativamente utilizando técnicas analíticas processuais.

[0020] Em uma modalidade, a perfusão é uma perfusão contínua. Em uma modalidade, a taxa de perfusão é constante. Em uma modalidade, a perfusão é realizada a uma taxa de menos do que ou igual a 1,0 volume de trabalho por dia. Em uma modalidade, a perfusão é realizada por uma bomba peristáltica, uma bomba de diafragma duplo, uma bomba de baixo cisalhamento ou fluxo tangencial alternado. Em uma modalidade relacionada, a perfusão é obtida por uma alternância de fluxo tangencial.

[0021] Em uma modalidade, o método acima compreende ainda submeter o cultivo celular a uma mudança de temperatura em que as células são cultivadas a) a uma primeira temperatura por um primeiro período de tempo e b) a uma segunda temperatura por um segundo período de tempo. Em uma modalidade relacionada, a mudança de temperatura ocorre na zona de transição entre a fase de crescimento e a fase de produção. Em uma modalidade relacionada, a mudança de temperatura ocorre durante a fase de produção. Em uma modalidade relacionada, a mudança de temperatura é em resposta a um parâmetro predeterminado. Em uma modalidade relacionada, a mudança de temperatura é em resposta a um parâmetro predeterminado, em que atingir um parâmetro predeterminado é determinado usando uma sonda de biomassa baseada na capacitância.

[0022] Em uma modalidade, o cultivo de células é estabelecida pela inoculação do biorreator com pelo menos 0,1 x 106 de células viáveis. Em uma modalidade, o inóculo foi cultivado por meio de um processo de perfusão que utiliza uma filtração de fluxo tangencial alternado.

[0023] Em uma modalidade, antes de ingressar no biorreator, o meio de cultivo celular é tratado utilizando nanofiltração, um tempo curto de temperatura elevada (HTST) ou UV em combinação com filtração.

[0024] Em uma modalidade, o biorreator é um biorreator de produção. Numa concretização relacionada, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 500L. Em uma modalidade relacionada, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 500L a 2000L. Em uma modalidade relacionada, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 1000L a 2000L.

[0025] Em uma modalidade, o meio de cultivo de células é um meio de cultura de células livres de soro. Em uma modalidade, o meio de cultivo de células é um meio de cultura de células definidas como quimicamente livres de soro. Em uma modalidade, o meio de cultivo de células é um meio de cultivo de células de perfusão.

[0026] Em uma modalidade, as células de mamíferos hospedeiras são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Em uma modalidade, a proteína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, uma proteína de fusão recombinante ou uma citocina.

[0027] Em uma modalidade, a proteína recombinante é purificada a partir do permeado da colheita por um ou mais dentre: floculação, precipitação, centrifugação, filtração profunda, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de permuta iônica, cromatografia de permuta aniônica de modo misto, cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia de hidroxiapatite. Em uma modalidade, o método acima compreende ainda a coleta de amostras durante o processo de purificação, avaliar as amostras para monitorar quantitativamente e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e o processo de purificação.

[0028] Em uma modalidade, a proteína recombinante é formulada em uma formulação farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, é fornecida uma proteína recombinante produzida pelo método acima.

[0029] A invenção também fornece um método para colheita de uma proteína recombinante que compreende o estabelecimento de um cultivo de células por inoculação de um biorreator com células de mamíferos que expressam uma proteína recombinante, a manutenção do cultivo de células por perfusão do cultivo celular com meio de cultivo celular novo formulado ou suplementado para se obter uma concentração de pelo menos 5 g/L de um copolímero em bloco não iônico e passar o cultivo de células através de um filtro de fibras ocas com um tamanho de poro ou peso molecular de corte (MWCO) que não retém a proteína recombinante no biorreator e coletar um permeado que contém a proteína recombinante.

[0030] Em uma modalidade relacionada, o peso molecular de corte é de pelo menos 500 kDa. Em uma modalidade, o filtro de fibra oca é um microfiltro.

[0031] A invenção também fornece um método para a colheita de uma proteína recombinante que compreende o estabelecimento de um cultivo celular por inoculação de um biorreator com células de mamíferos que expressam uma proteína recombinante, a manutenção do cultivo de células por perfusão do cultivo celular com meio de cultura celular fresco formulado ou suplementado para alcançar uma concentração de pelo menos 1 g/L de um copolímero em bloco não iônico e passar o cultivo de células através de um filtro de fibras ocas com um tamanho de poro ou um peso molecular de corte (MWCO) que retém a proteína recombinante no biorreator e a coleta de um permeado; uma vez que um parâmetro predeterminado for obtido pela perfusão do cultivo celular com um meio de cultivo celular novo formulado ou suplementado para obter uma concentração de pelo menos 5 g/ L de um copolímero e pela passagem do cultivo celular por um filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte (MWCO) que não retém a proteína recombinante no biorreator e pela coleta de um permeado contendo a proteína recombinante.

[0032] Em uma modalidade, o peso molecular de corte do filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte que retém a proteína recombinante no biorreator é de 300 kDa ou menos. Em uma modalidade, o filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte que retém a proteína recombinante no biorreator é um ultrafiltro.

[0033] Em uma modalidade, o peso molecular de corte do filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte (MWCO) que não retém a proteína recombinante no biorreator é de pelo menos 500 kDa. Em uma modalidade, o filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte (MWCO) que não retém a proteína recombinante no biorreator é um microfiltro.

[0034] Em uma modalidade, o filtro de fibra oca tendo um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que retém a proteína recombinante no biorreator e o filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que não retém a proteína recombinante no biorreator são componentes de um sistema de filtro de unidade única.

[0035] Em uma modalidade, o copolímero em bloco não iônico é um copolímero de bloco de polioxipropileno-polioxietileno. Em uma modalidade, o copolímero em bloco não iônico é poloxâmero 188.

[0036] Em uma modalidade, o método acima compreende ainda a retirada de amostras durante os processos de cultivo de células, avaliação das amostras para monitorar quantitativa e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e/ou processo de cultivo de células. Em uma modalidade, as amostras são monitoradas quantitativamente e/ou qualitativamente utilizando técnicas analíticas processuais.

[0037] Em uma modalidade, a perfusão é uma perfusão contínua. Em uma modalidade, a taxa de perfusão é constante. Em uma modalidade, a perfusão é realizada a uma taxa de menos do que ou igual a 1,0 volume de trabalho por dia. Em uma modalidade, a perfusão é realizada por uma bomba peristáltica, uma bomba de diafragma duplo, uma bomba de baixo cisalhamento ou fluxo tangencial alternado. Em uma modalidade, a perfusão é obtida por uma alternância de fluxo tangencial.

[0038] Em uma modalidade, o método acima compreende ainda submeter o cultivo celular a uma mudança de temperatura em que as células são cultivadas a) a uma primeira temperatura por um primeiro período de tempo e b) a uma segunda temperatura por um segundo período de tempo. Em uma modalidade relacionada, a mudança de temperatura ocorre na zona de transição entre a fase de crescimento e a fase de produção. Em uma modalidade relacionada, a mudança de temperatura ocorre durante a fase de produção. Em uma modalidade relacionada, a mudança de temperatura é em resposta a um parâmetro predeterminado. Em uma modalidade relacionada, a mudança de temperatura é em resposta a um parâmetro predeterminado, em que a obtenção de um parâmetro predeterminado é determinada pelo uso de uma sonda de biomassa baseada na capacitância.

[0039] Em uma modalidade, o cultivo de células é estabelecida pela inoculação do biorreator com pelo menos 0,1 x 106 de células viáveis. Em uma modalidade, o inóculo foi cultivado por meio de um processo de perfusão que utiliza uma filtração de fluxo tangencial alternado.

[0040] Em uma modalidade, antes de ingressar no biorreator, o meio de cultivo celular é tratado utilizando nanofiltração, um tempo curto de temperatura elevada (HTST) ou UV em combinação com filtração.

[0041] Em uma modalidade, o biorreator é um biorreator de produção. Em uma modalidade, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 500L. Em uma modalidade relacionada, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 500L a 2000L. Em uma modalidade relacionada, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 1000L a 2000L.

[0042] Em uma modalidade, o meio de cultivo de células é um meio de cultura de células livres de soro. Em uma modalidade, o meio de cultivo de células é um meio de cultura de células definidas como quimicamente livres de soro. Em uma modalidade, o meio de cultivo de células é um meio de cultivo de células de perfusão.

[0043] Em uma modalidade, as células hospedeiras de mamíferos são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[0044] Em uma modalidade, a proteína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, uma proteína de fusão recombinante ou uma citocina.

[0045] Em uma modalidade, a proteína recombinante é purificada do permeado da colheita por um ou mais dentre floculação, precipitação, centrifugação, filtração de profundidade, cromatografia de afinidade, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca aniônica de modo misto, cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia em hidroxiapatita.

[0046] Em uma modalidade, o método acima compreende ainda a retirada de amostras durante o processo de purificação, a avaliação das amostras para monitorar quantitativa e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e/ou o processo de cultivo de células.

[0047] Em uma modalidade, a proteína recombinante é formulada em uma formulação farmaceuticamente aceitável.

[0048] Em uma modalidade, é fornecida uma proteína recombinante produzida pelo método acima.

[0049] A invenção prevê ainda um sistema de filtro de unidade única que compreende dois ou mais componentes de filtro de fibra oca de diferentes tamanhos de poros ou peso molecular de corte (MWCO), em que os componentes de filtro de fibra oca são presos uns aos outros em série, tal que um caminho de fluxo estéril é mantido entre as fibras ocas individuais e os componentes de filtro de fibra oca de diferentes tamanhos de poros ou níveis de corte de peso molecular são isolados uns dos outros em relação a seus lados de cápsula oca a partir do qual o permeado é retirado, tal que o permeado possa ser removido independentemente de cada componente de filtro de fibra oca respectivo.

[0050] Em uma modalidade, pelo menos um componente de filtro de fibra oca tem um tamanho de poros ou corte de peso molecular que retém a proteína recombinante no biorreator e pelo menos um componente de filtro de fibra oca tem um filtro com um tamanho de poros que é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou corte de peso molecular que não retém a proteína recombinante no biorreator. Em uma modalidade, pelo menos um componente do filtro de fibra oca tem um corte de peso molecular de 300 kDa ou menos e pelo menos um componente de filtro de fibra oca tem um corte de peso molecular de pelo menos 500 kDa. Em uma modalidade, pelo menos um componente de filtro de fibra oca é um ultrafiltro e pelo menos um componente de filtro de fibra oca é um microfiltro. Em uma modalidade, o sistema de filtro de unidade única está contido em um compartimento. Em uma modalidade, o sistema de filtro de unidade única compreende ainda um espaçador entre pelo menos dois dos componentes de filtro de fibra oca.

[0051] O método também fornece um método para o cultivo de células que expressam uma proteína recombinante que compreende o estabelecimento de um cultivo de células por inoculação de um biorreator com células de mamífero que expressam uma proteína recombinante, a manutenção do cultivo de células por perfusão do meio de cultivo celular novo para o interior do biorreator, a passagem do cultivo celular por um sistema de filtro de unidade única e a coleta de um permeado, em que o sistema de filtro de unidade única está ligado ao biorreator e o cultivo de células é removido do biorreator e para o sistema de filtro de unidade única por um sistema de bombeamento único, onde o cultivo de células passa pelo lado do lúmen das fibras ocas do sistema de filtro de unidade única e de volta ao biorreator, e o permeado é removido de um ou mais dos componentes dos filtros de fibra oca.

[0052] Em uma modalidade, o método acima compreende ainda a retirada de amostras durante os processos de cultivo de células, avaliação das amostras para monitorar quantitativa e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e/ou processo de cultivo de células. Em um processo relacionado, as amostras são monitoradas quantitativamente e/ou qualitativamente utilizando técnicas analíticas processuais.

[0053] Em uma modalidade, a perfusão é uma perfusão contínua. Em uma modalidade, a taxa de perfusão é constante. Em uma modalidade, a perfusão é realizada a uma taxa de menos do que ou igual a 1,0 volume de trabalho por dia.

[0054] Em uma modalidade, a perfusão é realizada por uma bomba peristáltica, uma bomba de diafragma duplo, uma bomba de baixo cisalhamento ou fluxo tangencial alternado. Em uma modalidade, a perfusão é obtida por uma alternância de fluxo tangencial.

[0055] Em uma modalidade, quando o permeado é coletado de um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que não retém a proteína recombinante no biorreator, o meio fresco de cultura de células é formulado com ou complementado para atingir pelo menos 5 g/L de um copolímero em bloco não iônico. Em uma modalidade relacionada, o copolímero em bloco não iônico é um copolímero de bloco de polioxipropileno-polioxietileno. Numa concretização relacionada, o copolímero em bloco não-iónico é poloxâmero 188.

[0056] Em uma modalidade, o método acima compreende ainda submeter o cultivo celular a uma mudança de temperatura em que as células são cultivadas a) a uma primeira temperatura por um primeiro período de tempo e b) a uma segunda temperatura por um segundo período de tempo. Em uma modalidade, a mudança de temperatura ocorre na zona de transição entre a fase de crescimento e a fase de produção. Em uma modalidade relacionada, a mudança de temperatura ocorre durante a fase de produção. Em uma modalidade relacionada, a mudança de temperatura é em resposta a um parâmetro predeterminado, em que a obtenção de um parâmetro predeterminado é determinada pelo uso de uma sonda de biomassa baseada na capacitância.

[0057] Em uma modalidade, o cultivo de células é estabelecida pela inoculação do biorreator com pelo menos 0,1 x 106 de células viáveis. Em uma modalidade, o inóculo foi cultivado por meio de um processo de perfusão que utiliza uma filtração de fluxo tangencial alternado.

[0058] Em uma modalidade, antes de ingressar no biorreator, o meio de cultivo celular é tratado utilizando nanofiltração, um tempo curto de temperatura elevada (HTST) ou UV em combinação com filtração.

[0059] Em uma modalidade, o biorreator é um biorreator de produção . Numa concretização relacionada, o bioreactor tem uma capacidade de pelo menos 500L. Em uma modalidade relacionada, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 500L a 2000L. Em uma modalidade relacionada, o biorrator tem uma capacidade de pelo menos 1000L a 2000L.

[0060] Em uma modalidade, o meio de cultivo de células é um meio de cultura de células livres de soro. Em uma modalidade, o meio de cultivo de células é um meio de cultura de células definidas como quimicamente livres de soro. Em uma modalidade, o meio de cultivo de células é um meio de cultivo de células de perfusão.

[0061] Em uma modalidade, as células de mamíferoshospedeiras são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[0062] Em uma modalidade, a proteína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, uma proteína de fusão recombinante ou uma citocina.

[0063] Em uma modalidade, a proteína recombinante é purificada do permeado da colheita por um ou mais dentre floculação, precipitação, centrifugação, filtração de profundidade, cromatografia de afinidade, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca aniônica de modo misto, cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia em hidroxiapatita.

[0064] Em uma modalidade, o método acima compreende ainda a retirada de amostras durante o processo de purificação, a avaliação das amostras para monitorar quantitativa e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e o processo de cultivo de células.

[0065] Em uma modalidade, a proteína recombinante é formulada em uma formulação farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, é fornecida uma proteína recombinante produzida pelo método acima.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0066] Figura 1: diagrama esquemático do sistema de filtro de unidade única, tendo uma única abertura, onde o fluido do cultivo celular entra e sai através de uma única abertura. Os filtros podem estar em qualquer orientação, as fibras ocas de microfiltro seguidas de fibras ocas de ultrafiltro são mostradas.

[0067] Figura 2: Título de um processo de coleta periódica estendida, n=2 (quadrado aberto) em comparação ao processo de ultrafiltração, n=4 (círculo fechado).

[0068] Figura 3: Densidade de células viáveis de colheita periódica estendida, n=2 (quadrado aberto) em comparação ao processo de ultrafiltração, n=4 (círculo fechado).

[0069] Figura 4: Viabilidade percentual de um processo de colheita periódica estendida, n=2 (quadrado aberto) em comparação ao processo de ultrafiltração, n=4 (círculo fechado).

[0070] Figura 5: Viabilidade percentual dos reatores equipados com um filtro de 750 kDa (círculos abertos) e de reatores equipados com filtros de 30 kDa (círculos fechados). A viabilidade percentual reduzida a 80% no dia 6 nos reatores equipados com os filtros de 750 kDa. A viabilidade percentual nos reatores equipados com filtros de 30 kDa foi mantida a > 80% durante 14 dias.

[0071] Figura 6: concentrações de Lutrol® F68 medidas no sobrenadante (círculo fechado) e no permeado (quadrado aberto) de reatores com 30 kDa ou de uma unidade de filtro de fibra oca de 750 kDa. O sobrenadante de 30 kDa mostra uma acumulação de Lutrol® F68 ao longo dos dias 9-13.

[0072] Figure 7A Densidade de células viáveis normalizadas para as linhas celulares A e B em cada concentração de Lutrol® F68 (2g/L -5g/L) em comparação com 1 g/L, proporcionando a razão da densidade celular. As comparações foram feitas usando o teste t de Student entre os dados em todas as passagens em comparação com a de 1 g/L. A significância estatística: * < 0,0001; ** < 0,001; *** < 0,01; **** < 0,05.

[0073] Figura 7B Viabilidade percentual das linhas celulares A e B em cada concentração de Lutrol® F68 (2g/L -5g/L) em comparação à de 1 g/L. As comparações foram feitas com o uso de testes T de Student entre os dados em todas as passagens em comparação à de 1 g/L. Significância estatística: * < 0,0001; ** < 0,001; *** < 0,01; **** < 0,05.

[0074] Figura 7C Diâmetro celular para as linhas celulares A e B em cada concentração de Lutrol® F68 em comparação ao diâmetro celular a 1 g/L de Lutrol® F68. As comparações foram feitas usando o teste t de Student entre os dados em todas as passagens em comparação com a de 1 g/L. A significância estatística: * < 0,0001; ** < 0,001; *** < 0,01; **** < 0,05.

[0075] Figura 8 Viabilidade celular percentual para as linhas celulares A e B a 1 g/L de Lutrol® F68 (quadrados abertos) e 5 g/L de Lutrol® F68 (círculos fechados). A viabilidade foi mantida a> 90% por > 30 dias quando a concentração de Lutrol® F68 foi aumentada para 5 g/L.

[0076] Figura 9 O efeito da concentração plurômica sobre a viabilidade das células cultivadas em reatores de 2L com um filtro de ATF de 750 kDa com meios de perfusão contendo 1 g/L de Lutrol® F68 (quadrado fechado) ou 5 g/L de Lutrol® F68 (círculo aberto).

[0077] Figura 10 O efeito do aumento da concentração de Lutrol® F68 (até 5 g/L) sobre a recuperação da viabilidade de células cultivadas a 1 g/L de Lutrol® F68 em reatores de 2L com um filtro de ATF de 750 kDa. Meios A: círculo fechado. Meios B: círculo aberto. A seta indica quando a concentração de Lutrol® F68 foi aumentada.

[0078] Figura 11: Quantificação de GCMS de glicose e manose. (A) O TIC para a separação de GC de hexoses e (B) o padrão típico de fragmentação do espectro de massa encontrado nos picos de hexose que contenham tanto a hexose de 12C quanto a hexose de padrão interno de 13C. (C) Linearidade de ensaio para a quantificação de glicose e manose.

[0079] Figura 12: O efeito da manose sobre a elevada glicosilação de manose da IgG. (A) células CHO cultivadas com quantidades crescentes de manose; (B) células CHO cultivadas com quantidades crescentes de manose e a diferentes concentrações de glicose. O aumento linear na glicosilação elevada de manose é independente da concentração de glicose.

[0080] Figura 13: Esquema do ciclo de feedback de PAC. Os elementos chave do processo de PAC necessários para apresentar atributos predefinidos de qualidade do produto são o QTPP, um sistema de PAT que inclui a amostragem automatizada e análises específicas de atributos, um modelo de controle para modificar o processo e um processo com alavancas de controle conhecidos por ajustar os níveis dos atributos.

[0081] Figura 14: Uma única execução do reator foi usada para calcular os parâmetros do modelo por meio da regressão por mínimos quadrados. Os símbolos são as medidas usadas para encontrar os parâmetros do modelo através da regressão por mínimos quadrados. As linhas tracejadas são os produtos do modelo resultante. As linhas tracejadas são os ajustes de modelo que utilizam os parâmetros de crescimento que foram usados para a MPC. As linhas vermelhas contínuas nas figuras A e B mostram a administração de manose usada para gerar esses dados de formação. A) % elevado de manose B) Concentração de manose do reator C) densidade celular (volume calculado dimensionado arbitrariamente) D) Concentração do produto

[0082] Figura 15: Demonstração do controle de % elevado de manose através do controle preditivo do modelo. Em todas as figuras, os símbolos são os valores medidos, mas apenas os símbolos abertos foram usados para o Controle Preditivo do Modelo. A linha pontilhada é o produto do modelo fornecido pelas medidas e pela ação de controle tomadas. As linhas vermelhas contínuas nas figuras A e B mostram a administração de manose determinada por MPC. A) % elevado de manose B) Concentração de manose do reator C) densidade celular na forma de volume calculado dimensionado arbitrariamente (SCV) D) Concentração do produto

[0083] Figura 16: Comparação da PAC e dos dados não-PAC. Os dados do % elevado de manose foram obtidos por meio do ensaio de HILIC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0084] A invenção proporciona um método de colheita periódica estendida que oferece a vantagem de se manter um cultivo de células contínuo no seu pico de produção, enquanto que se obtém um permeado de título elevado. A invenção proporciona um método para uma colheita periódica estendida que compreende o estabelecimento de um cultivo de células pela inoculação de um biorreator com células de mamíferos que expressam um produto de proteína recombinante, mantendo o cultivo celular pela perfusão de um meio de cultivo de células novo no biorreator, passando o cultivo celular por um filtro e coletando um permeado, em que um permeado nulo é coletado inicialmente até que se alcance um primeiro parâmetro predeterminado, momento em que o permeado de colheita é coletado por um tempo predeterminado. Isso é seguido de uma coleta alternativa de um permeado nulo até que um segundo parâmetro predeterminado seja obtido, coletando, então, um permeado de colheita por um tempo predeterminado, em que a coleção alternada do permeado nulo e do permeado da colheita continuam até o término do cultivo celular.

[0085] Os parâmetros predeterminados podem ser alcançados através da realização de algum marco de característica, atributo ou desempenho do cultivo celular; como a densidade de células viáveis, o volume de células embaladas ou o título ou ponto de tempo. Em uma modalidade, o parâmetro predeterminado pode ser obtido quando a densidade de células viáveis é superior ou igual a 1 x 106 células viáveis. Em uma modalidade, o parâmetro predeterminado pode ser obtido quando a densidade de células viáveis é de pelo menos 20 x 106 células viáveis/ml a 30 x 106 células viáveis/ml. Em uma modalidade, o parâmetro predeterminado pode ser obtido quando o volume de células embaladas é inferior ou igual a 35%. Em uma modalidade, o parâmetro predeterminado pode ser obtido quando o volume de células embaladas é inferior ou igual a 30%.

[0086] O parâmetro predeterminado pode se basear em um ponto de tempo. O ponto de tempo pode ser medido em horas, dias, semanas ou meses após um evento ou ação de ativação. Um evento ou ação de ativação pode ser horas ou dias em cultivo, horas ou dias depois de um evento, como a obtenção de uma densidade de células viáveis, um volume de células embaladas, título, inoculação do biorreator ou coleta de um permeado de colheita. Em uma modalidade, o parâmetro predeterminado pode ser obtido em 12 horas a 25 dias após o evento ou ação de ativação. Em uma modalidade, o parâmetro predeterminado pode ser obtido em 24 horas a 72 horas após o evento ou ação de ativação. Em uma modalidade, o parâmetro predeterminado pode ser obtido em 4 dias desde o evento ou ação de ativação. Em uma modalidade, o parâmetro predeterminado pode ser obtido 5 dias ou mais depois do evento ou ação de ativação. Em uma modalidade, o parâmetro predeterminado pode ser obtido pelo menos 25 dias depois do evento ou ação de ativação. Em uma modalidade, o primeiro parâmetro predeterminado pode ser obtido em 5 a 25 dias depois da inoculação do biorreator. Em uma modalidade, o primeiro parâmetro predeterminado pode ser obtido em 10 a 12 dias depois da inoculação do biorreator. Em uma modalidade, um segundo parâmetro predeterminado pode ser obtido em 12 a 72 horas após a coleta de um permeado de colheita. Em uma modalidade, um segundo parâmetro predeterminado pode ser obtido em 24 a 72 horas após a coleta de um permeado de colheita. Em uma modalidade, um segundo parâmetro predeterminado pode ser obtido em 24 a 48 horas após a coleta de um permeado de colheita.

[0087] Uma vez que o parâmetro predeterminado for obtido, um permeado de colheita pode ser coletado por um tempo predeterminado. Em uma modalidade, o tempo predeterminado é de pelo menos de 12 a 72 horas. Em uma modalidade, o tempo predeterminado é de 24 a 72 horas. Em uma modalidade, o tempo predeterminado é de 24 a 48 horas.

[0088] Em uma modalidade, o filtro é um sistema de filtro de unidade única. Em uma modalidade relacionada, o sistema de filtro de unidade única compreende pelo menos um filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso de molecular de corte (MWCO) que retém a proteína recombinante no biorreator e pelo menos um componente de filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso de molecular de corte que não retém a proteína recombinante no biorreator. Em outra modalidade, o peso molecular de corte de pelo menos um componente de filtro de fibra oca que retém a proteína recombinante no biorreator é de 300 kDa ou menos. Em outra modalidade, o peso molecular de corte de pelo menos um componente de filtro de fibra oca que não retém a proteína recombinante no biorreator é de pelo menos 500 kDa. Em outra modalidade, pelo menos um componente de filtro de fibra oca que retém a proteína recombinante no biorreator é um ultrafiltro e pelo menos um componente de filtro de fibra oca que não retém a proteína recombinante no biorreator é um microfiltro. Em outra modalidade, o sistema de filtro de unidade única está contido em um compartimento. Em outra modalidade, o sistema de filtro de unidade única compreende ainda um espaçador entre pelo menos dois dos componentes de filtro de fibra oca.

[0089] Em uma modalidade, quando o permeado nulo é coletado utilizando-se um sistema de filtro de unidade única, ele é retirado de pelo menos um componente filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou peso molecular de corte que retém a proteína recombinante no biorreator. Em uma modalidade, quando o permeado de colheita é coletado utilizando- se um sistema de filtro de unidade única, ele é retirado de pelo menos um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou peso molecular de corte que não retém a proteína recombinante no biorreator. Em uma modalidade, o permeado é coletado de um filtro que é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que não retém a proteína recombinante no biorreator, o meio fresco de cultura de células é formulado com ou complementado para atingir pelo menos 5 g/L de um copolímero em bloco não iônico. Em uma modalidade relacionada, o copolímero em bloco não iônico é um copolímero de bloco de polioxipropileno-polioxietileno. Em outra modalidade relacionada, o copolímero em bloco não iónico é poloxâmero 188.

[0090] A invenção também fornece um método para colheita de uma proteína recombinante que compreende o estabelecimento de um cultivo de células por inoculação de um biorreator com células de mamíferos que expressam uma proteína recombinante, a manutenção do cultivo de células por perfusão do cultivo celular com meio de cultivo celular novo formulado ou suplementado para se obter uma concentração de pelo menos 5 g/L de um copolímero em bloco não iônico e passar o cultivo de células através de um filtro de fibras ocas com um tamanho de poro ou peso molecular de corte que não retém a proteína recombinante no biorreator e coletar um permeado que contém a proteína recombinante. Em uma modalidade, o peso molecular de corte é de pelo menos 500 kDa. Em uma modalidade, o filtro de fibra oca é um microfiltro.

[0091] A invenção também fornece um método para a colheita de uma proteína recombinante que compreende o estabelecimento de um cultivo celular por inoculação de um biorreator com células de mamíferos que expressam uma proteína recombinante, a manutenção do cultivo de células por perfusão do cultivo celular com meio de cultura celular fresco formulado ou suplementado para alcançar uma concentração de pelo menos 1 g/L de um copolímero em bloco não iônico e passar o cultivo de células através de um filtro de fibras ocas com um tamanho de poro ou um peso molecular de corte que retém a proteína recombinante no biorreator e a coleta de um permeado; uma vez que um parâmetro predeterminado for obtido pela perfusão do cultivo celular com um meio de cultivo celular novo formulado ou suplementado para obter uma concentração de pelo menos 5 g/ L de um copolímero e pela passagem do cultivo celular por um filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte que não retém a proteína recombinante no biorreator e pela coleta de um permeado contendo a proteína recombinante. Em uma modalidade, o peso molecular de corte do filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte que retém a proteína recombinante no biorreator é de 300 kDa ou menos. Em uma modalidade relacionada, o filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte que retém a proteína recombinante no biorreator é um ultrafiltro. Em uma modalidade, o peso molecular de corte do filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte que não retém a proteína recombinante no biorreator é de pelo menos 500 kDa. Em uma modalidade relacionada, o filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte que não retém a proteína recombinante no biorreator é um microfiltro. Em uma modalidade, o filtro de fibra oca tendo um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que retém a proteína recombinante no biorreator e o filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que não retém a proteína recombinante no biorreator são componentes de um sistema de filtro de unidade única. Em uma modalidade relacionada, o copolímero em bloco não iônico é um copolímero de bloco de polioxipropileno-polioxietileno. Em outra modalidade relacionada, o copolímero em bloco não iónico é poloxâmero 188.

[0092] A invenção também prevê um sistema de filtro de unidade única que compreende dois ou mais componentes de filtro de fibra oca de diferentes tamanhos de poros ou níveis de corte de peso molecular, em que os componentes de filtro de fibra oca são presos uns aos outros em série, tal que um caminho de fluxo estéril é mantido entre as fibras ocas individuais e os componentes de filtro de fibra oca de diferentes tamanhos de poros ou níveis de corte de peso molecular são isolados uns dos outros em relação a seus lados de cápsula oca a partir do qual o permeado é retirado, tal que o permeado possa ser removido independentemente de cada componente de filtro de fibra oca respectivo. Em uma modalidade, pelo menos um componente de filtro de fibra oca tem um tamanho de poros ou corte de peso molecular que retém a proteína recombinante no biorreator e pelo menos um componente de filtro de fibra oca tem um filtro com um tamanho de poros que é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou corte de peso molecular que não retém a proteína recombinante no biorreator. Em uma modalidade, pelo menos um componente do filtro de fibra oca tem um corte de peso molecular de 300 kDa ou menos e pelo menos um componente de filtro de fibra oca tem um corte de peso molecular de pelo menos 500 kDa. Em uma modalidade, pelo menos um componente de filtro de fibra oca é um ultrafiltro e pelo menos um componente de filtro de fibra oca é um microfiltro. Em uma modalidade, o sistema de filtro de unidade única está contido em um compartimento. Em uma modalidade, o sistema de filtro de unidade única compreende ainda um espaçador entre pelo menos dois dos componentes de filtro de fibra oca.

[0093] Em uma modalidade relacionada, a invenção fornece um método para o cultivo de células e/ou colheita de uma proteína recombinante compreendendo a expressão de uma proteína recombinante que compreende o estabelecimento de um cultivo de células por inoculação de um biorreator com células de mamífero que expressam uma proteína recombinante, a manutenção da cultura de células por perfusão do meio de cultivo celular novo para o interior do biorreator, a passagem do cultivo celular por um sistema de filtro de unidade única e a coleta de um permeado, em que o sistema de filtro de unidade única está ligado ao biorreator e o cultivo de células é removido do biorreator e introduzido no sistema de filtro de unidade única por um sistema de bombeamento único, onde o cultivo de células passa pelo lado do lúmen das fibras ocas do sistema de filtro de unidade única e de volta ao biorreator, e o permeado é removido de um ou mais dos componentes dos filtros de fibra oca.

[0094] Em uma modalidade relacionada, os métodos da invenção compreendem ainda a retirada de amostras durante os processos de cultivo de células, avaliação das amostras para monitorar quantitativa e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e/ou processo de cultivo de células. Em uma modalidade relacionada, as amostras são monitoradas quantitativamente e/ou qualitativamente utilizando técnicas analíticas processuais.

[0095] Em uma modalidade relacionada dos métodos da invenção, a perfusão é a perfusão contínua. Em uma modalidade, a taxa de perfusão é constante. Em uma modalidade, a perfusão é realizada a uma taxa de menos do que ou igual a 1,0 volume de trabalho por dia. Em uma modalidade, a perfusão é realizada por uma bomba peristáltica, uma bomba de diafragma duplo, uma bomba de baixo cisalhamento ou fluxo tangencial alternado. Em uma modalidade, a perfusão é obtida por uma alternância de fluxo tangencial.

[0096] Em uma modalidade relacionada, os métodos da invenção compreendem ainda submeter o cultivo celular a uma mudança de temperatura em que as células são cultivadas a) a uma primeira temperatura por um primeiro período de tempo e b) a uma segunda temperatura por um segundo período de tempo. Em uma modalidade, a mudança de temperatura ocorre na zona de transição entre a fase de crescimento e a fase de produção. Em uma modalidade, a mudança de temperatura ocorre durante a fase de produção. Em uma modalidade, a mudança de temperatura é em resposta a um parâmetro predeterminado, em que atingir o parâmetro predeterminado é determinado usando uma sonda de biomassa baseada na capacitância. Em uma modalidade, a mudança de temperatura é em resposta a um parâmetro predeterminado, em que atingir o parâmetro predeterminado é determinado usando uma sonda de biomassa baseada na capacitância.

[0097] Em uma modalidade relacionada dos métodos da invenção, o cultivo de células é estabelecido por inoculação do biorreator com pelo menos 0,1 x 106 de células viáveis/ml. Em uma modalidade, o inóculo foi cultivado por meio de um processo de perfusão que utiliza uma filtração de fluxo tangencial alternado. Em uma modalidade, antes de ingressar no biorreator, o meio de cultivo celular é tratado utilizando nanofiltração, um tempo curto de temperatura elevada (HTST) ou UV em combinação com filtração.

[0098] Em uma modalidade relacionada dos métodos da invenção, o biorreator é um biorreator de produção. Em uma modalidade, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 500L. Em uma modalidade, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 500L a 2000L. Em uma modalidade, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 1000L a 2000L.

[0099] Em uma modalidade relacionada dos métodos da invenção, o meio de cultivo de células é um meio de cultivo de células definido como quimicamente isento de soro. Em uma modalidade, o meio de cultivo de células é um meio de cultivo de células de perfusão. Em uma modalidade, as células de mamíferos são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Em uma modalidade, a proteína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, uma proteína de fusão recombinante ou uma citocina.

[00100] Em uma modalidade relacionada dos métodos da invenção, a proteína recombinante é purificada pelo permeado da colheita por um ou mais dentre floculação, precipitação, centrifugação, filtração de profundidade, cromatografia de afinidade, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca aniônica de modo misto, cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia em hidroxiapatita. Em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem ainda a retirada de amostras durante o processo de purificação, avaliar as amostras para monitorar quantitativamente e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e o processo de purificação. Em uma modalidade, as amostras são monitoradas quantitativamente e/ou qualitativamente utilizando técnicas analíticas processuais. Em uma modalidade, a proteína recombinante é formulada em uma formulação farmaceuticamente aceitável.

[00101] A invenção proporciona também uma proteína recombinante produzida por qualquer método da invenção.

Cultura de Células

[00102] Por "cultura celular" ou "cultura" entende-se o crescimento e a propagação de células de fora de um organismo ou tecido multicelular. As condições de cultura adequadas para células de mamífero são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). As células de mamífero podem ser cultivadas em suspensão ou ligadas a um substrato sólido.

[00103] Tal como aqui utilizados, os termos "meio de cultura de células" (também denominado "meio de cultura", "meios de cultura celular", "meios de cultura de tecidos,") refere-se a qualquer solução de nutrientes utilizada para o cultivo das células, por exemplo, células de animais ou de mamíferos, e que geralmente proporciona pelo menos um ou mais componentes a partir dos seguintes: uma fonte de energia (geralmente sob a forma de um carboidrato tal como glicose); um ou mais de todos os aminoácidos essenciais, e geralmente, os vinte aminoácidos básicos, além de cisteína; vitaminas e/ou outros compostos orgânicos tipicamente necessários em concentrações baixas; lipídios ou ácidos graxos livres; e elementos traço, por exemplo, compostos inorgânicos ou elementos de ocorrência natural que são tipicamente requeridos em concentrações muito baixas, normalmente na gama micromolar.

[00104] A solução de nutrientes pode, opcionalmente, ser suplementada com componentes adicionais para otimizar o crescimento de células, tais como hormônios e outros fatores de crescimento, tais como insulina, transferrina, fator de crescimento epidérmico, soro, e semelhantes; sais, tais como cálcio, magnésio e fosfato, e tampões, por exemplo, HEPES; nucleosídeos e bases, tais como a adenosina, timidina, hipoxantina; e hidrolisados de proteínas e tecidos, tais como proteínas hidrolisadas de plantas ou animais (peptona ou misturas de peptona, que podem ser obtidas a partir de subprodutos animais, gelatina purificada ou material de planta); antibióticos, tais como gentamicina; poliaminas, tais como putrescina, espermidina e espermina (ver Publicação WIPO N ° WO 2008/154014) e piruvato (ver Patente US N ° 8.053.238), compostos anti- apoptóticos, por exemplo, MDL 28170, cipermetrina, ciclosporina A, BBMP, ácido bongkrekico, S-15176 difumerato, pifitrina-a cíclica, pifitrina mu, BI- 6C9, NSCI, NS3694 ou Necrostatin-1 (ver Publicação WIPO N ° WO 2014/022102) de acordo com os requisitos das células a serem cultivadas e/ou os parâmetros de cultura das células desejados.

[00105] Os surfactantes não iônicos podem também ser adicionados ao meio de cultura de células. Exemplos de surfactantes não iônicos incluem, mas não estão limitados a, álcool polivinílico, polietileno glicol, e surfactantes de copolímero de bloco não iônico. Também estão incluídos os alquil poli(óxido de etileno), copolímeros de poli(óxido de etileno) e poli(óxido de propileno) (copolímeros de blocos EO-PO), poli(vinilpirrolidona), alquil poliglicosídeos (tais como monoesterato de sacarose, lauril diglicosídeo ou monolaurato de sorbitano, octilglicosídeo e decil maltosídeo), álcoois graxos (álcool cetílico ou álcool oleílico), ou cocoamidas (cocoamida MEA, cocoamida DEA e cocoamida TEA).

[00106] Também estão incluídos copolímeros em bloco à base de óxido de etileno e óxido de propileno, também mencionados como copolímeros em bloco de polioxipropileno-polioxietileno. Estas moléculas são copolímeros triblocos não iônicos compostos de uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno(poli(óxido de propileno)) flanqueada por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)). De particular interesse são aqueles que têm 70 unidades de polioxipropileno e 30 unidades de cada uma das cadeias de polioxietileno. Em uma modalidade preferencial, o copolímero em bloco é poloxâmero 188 (CAS # 90003-11-6, com um peso molecular médio de 8,4 kd, BASF Chemical, Washington, NJ), que é vendido sob vários nomes de marca tais como Pluronic® F68, Kolliphor® P-188, Lutrol® F68, e Lutrol® 188.

[00107] Estes copolímeros em bloco de polioxipropileno-polioxietileno são utilizados para proteger as células de morte induzida por bolha devido à borbulhamento e espuma no reator. Tal como descrito neste documento, o nível de poloxâmero 188 que é tipicamente utilizado em meio de cultura celular (1 g/L) pode não ser suficiente para proteger as células de elevadas forças de cisalhamento dentro de um sistema de perfusão de fluxo tangencial alternado (ATF) quando as culturas de células são expostas a microfiltração. Tal como aqui descrito, a adição de um copolímero de bloco de polioxipropileno-polioxietileno, tal como poloxâmero 188, em concentrações mais elevadas, tal como 5 g/L, teve um impacto positivo sobre a viabilidade celular, o que permitiu durações mais longas de cultura sob condições de perfusão de ATF.

[00108] O meio de cultura de células inclui os que são tipicamente usados em e/ou são conhecidos para utilização com qualquer processo de cultura celular, tais como, mas não se limitando a, em lote, lote estendido, lote alimentado e/ou cultura em perfusão ou contínua de células.

[00109] Um meio de cultura ou meio de alimentação de células em "base" (ou lotes) refere-se a um meio de cultura de células que é tipicamente usado para iniciar uma cultura de células e é suficientemente completo para sustentar a cultura de células.

[00110] Um meio de cultura ou meio de alimentação de células de "crescimento" refere-se a um meio de cultura que é tipicamente usado em culturas de células durante um período de crescimento exponencial, uma "fase de crescimento", sendo suficientemente completa para sustentar a cultura de células durante esta fase. Um meio de cultura de células de crescimento também pode conter agentes de seleção que conferem resistência ou a sobrevivência de marcadores selecionáveis incorporados na linha celular hospedeira. Tais agentes de seleção incluem, mas não estão limitados a, geneticina (G4118), neomicina, higromicina B, puromicina, zeocina, sulfoximina de metionina, metotrexato, meio de cultura de células sem glutamina, meio de cultura celular sem glicina, hipoxantina e timidina ou timidina sozinha.

[00111] Um meio de cultura ou alimentação de células de "produção" refere-se a um meio de cultura de células que é tipicamente utilizado em culturas de células durante a transição quando o crescimento exponencial está terminando e durante as subsequentes fases de transição e/ou produção quando a produção de proteína é preponderante. Tal meio de cultura celular é suficientemente completo para manter uma densidade, viabilidade de células e/ou titulação de produto durante esta fase.

[00112] Um meio de cultura de células de "perfusão" refere-se a um meio de cultura de células que é tipicamente utilizado em culturas de células que são mantidas métodos de cultura de perfusão ou contínua e são suficientemente completos para sustentar a cultura de células durante este processo. Formulações de meio de cultura celular de perfusão podem ser mais ricas ou mais concentradas do que formulações de meio de cultura celular de base para acomodar o método usado para remover o meio gasto. Um meio de cultura de células de perfusão pode ser utilizado em ambas as fases de crescimento e de produção.

[00113] Os componentes do meio de cultura celular podem ser completamente moídos em um meio de formulação em pó; parcialmente moídos com suplementos líquidos adicionados ao meio de cultura de células, conforme necessário; ou adicionados completamente em uma forma líquida para a cultura de células.

[00114] As culturas de células podem ser suplementadas com componentes contendo meio de alimentação concentrado, tais como nutrientes e aminoácidos, que são consumidos durante o curso da fase de produção da cultura de células. Um meio de cultura celular concentrado pode conter alguns ou todos os nutrientes necessários para a manutenção da cultura de células; em particular, o meio concentrado pode conter nutrientes identificados ou conhecidos para ser consumidos durante o decurso da fase de produção da cultura de células. Um meio concentrado pode basear-se apenas em qualquer formulação dos meios da cultura celular. Um meio de alimentação concentrado pode conter alguns ou todos os componentes do meio de cultura celular em, por exemplo, cerca de 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, ou mesmo cerca de 1000X dos seus valores normais.

[00115] As culturas celulares também podem ser suplementadas com alimentações concentradas independentes de nutrientes específicos que podem ser difíceis de formular e são rapidamente esgotados em culturas de células. Esses nutrientes podem ser aminoácidos tais como tirosina, cisteína e/ou cistina (ver, por exemplo, Publicação WIPO N ° 2012/145682). Em uma modalidade, uma solução concentrada de tirosina é alimentada de forma independente para uma cultura de células cultivada num meio de cultura de células contendo tirosina, de tal modo que a concentração de tirosina na cultura de células não seja superior a 8 mM. Em outra modalidade, uma solução concentrada de tirosina e cistina é alimentada de forma independente para a cultura de células sendo cultivada em um meio de cultura celular a sem tirosina, cistina ou cisteína. As alimentações independentes podem começar antes de ou no início da fase de produção. As alimentações independentes podem ser realizadas por lotes alimentados ao meio de cultura de células no mesmo ou em diferentes dias, conforme o meio de alimentação concentrada. As alimentações independentes também podem ser perfundidas no mesmo ou em diferentes dias, conforme o meio perfundido. Tais alimentações independentes podem ser adicionadas ao meio de cultura de células após um ou mais dias, e também pode ser adicionadas repetidamente durante o curso da fase de produção, contanto que seja evitado o esgotamento de tirosina, cisteína e cistina no meio de cultura de células.

[00116] Os métodos podem ser usados para a alimentação contínua de uma cultura de células de mamífero, tais como aqueles que não empregam controle de retorno (ver Publicação WIPO N ° WO 2013/040444).

[00117] O meio de cultura celular, em certas modalidades, é isento de soro e/ou isento de produtos ou ingredientes de origem animal. O meio de cultura celular, em certas modalidades, é quimicamente definido, em que todos os componentes químicos são conhecidos.

[00118] As células de mamíferos ou animais são cultivadas em um meio adequado para as células específicas a serem cultivadas e que podem ser determinadas pelo versado na técnica sem experimentação indevida. Os meios comercialmente disponíveis que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam ao Meio de Iscove Modificado do Meio de Dulbecco, RPMI 1640, Meio Essencial Mínimo-alfa. (MEM-alfa), Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), DME/F12, alfa-MEM, Meio Basal de Eagle com Earle BSS, glicose alta DMEM, com glutamina, glicose alta DMEM, sem glutamina, DMEM baixa glicose, sem glutamina, DMEM:F12 1:1, com glutamina, GMEM (Glasgow MEM), GMEM com glutamina, meio de inseto completo de Grace, meio de inseto de Grace, sem FBS, F-10 de Ham, com glutamina, F-12 de Ham, com glutamina, IMDM com HEPES e glutamina, IMDM com HEPES e sem glutamina, meio de inseto IP41, 15 (Leibovitz)(2X), sem glutamina ou vermelho de fenol, 15 (Leibovitz), sem meio de glutamina, 5A meio modificado de McCoy, 199, Eagle MEM, sem glutamina ou vermelho de fenol (2X), BSS de MEM Eagle-Earle, com glutamina, BSS de MEM Eagle-Earle, sem glutamina, BSS de MEM EagleHanks, sem glutamina, NCTC-109, com glutamina, meio de Richter CM, com glutamina, RPMI 1640 com HEPES , Glutamina e/ou estreptomicina- penicilina, RPMI 1640, com glutamina, RPMI 1640, sem glutamina, meio de inseto de Schneider ou qualquer outro meio conhecido por um versado na técnica, que são formulados para os tipos de célula específicos. Aos os meios exemplificativos anteriores podem ser adicionados componentes ou ingredientes suplementares, incluindo componentes opcionais, em concentrações ou quantidades apropriadas, conforme necessário ou desejado, e como será conhecido e praticado por aqueles versados na técnica utilizando conhecimentos de rotina.

Tratamentos em Meios

[00119] O meio de cultura celular pode ser tratado usando os métodos ou dispositivos para esterilizar ou desinfetar meios antes da adição ao biorreator e/ou cultura de células. Em uma modalidade, o meio de cultura de células é tratado usando Alta Temperatura e Curto Tempo (HTST) (ver, por exemplo, Patente US N° 7.420.183). Em uma modalidade, o meio de cultura de células é tratado usando UV em combinação com filtração (ver, por exemplo., Publicações WIPO WO 2008/157247; WO 2012/115874; WO 2013/063298 e WO 2013/138159). Em outra modalidade, o meio de cultura de células é submetido a nanofiltração (ver, por exemplo., Liu et al., (2000) Biotechnol. Prog. 16:425-434). Em outra modalidade, o meio de cultura de células é tratado com produtos químicos que inativam vírus, tais como solventes, detergentes, psoraleno ou betapropiolactona. Células

[00120] As linhas das células (também mencionadas como "células hospedeiras") utilizadas na presente invenção são geneticamente modificadas para expressar um polipeptídio de interesse comercial ou científico. Linhas celulares são tipicamente derivadas de uma linhagem proveniente de uma cultura primária que pode ser mantida em cultura durante um tempo ilimitado. As células podem conter introduções, por exemplo, através de transformação, transfecção, infecção, ou de injeção, vetores de expressão (construtos), tais como plasmídeos e semelhantes, que abrigam sequências de codificação, ou partes das mesmas, que codificam as proteínas para a expressão e produção no processo de cultura. Tais vetores de expressão contêm os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência de codificação inseridas. Os métodos que são bem conhecidos e praticados pelos versados na técnica podem ser utilizados para construir vetores de expressão contendo sequências que codificam as proteínas e polipeptídios produzidos, bem como os elementos de controle transcricionais e translacionais adequados. Esses métodos incluem, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Tais técnicas são descritas em J. Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4a edição Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. ou qualquer uma das edições anteriores; F. M. Ausubel et al., 2013, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, ou qualquer uma das edições anteriores; Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, todas as quais são aqui incorporadas para qualquer finalidade.

[00121] As células animais, células de mamífero, células de cultura, células hospedeiras de animais ou mamíferos, células recombinantes, células hospedeiras recombinantes, e semelhantes, são todos termos para as células que podem ser cultivadas de acordo com os processos desta invenção. Tais células são tipicamente linhas celulares obtidas ou derivadas de mamíferos e são capazes de crescer e sobreviver quando colocadas em qualquer cultura em monocamada ou cultura em suspensão em meio contendo nutrientes adequados e/ou outros fatores, tais como aqueles aqui descritos. As células são tipicamente selecionadas que podem expressar e segregar proteínas, ou que podem ser molecularmente manipuladas para expressar e segregar grandes quantidades de uma proteína específica, mais particularmente, uma glicoproteína de interesse, em meio de cultura. Deve entender-se que a proteína produzida por uma célula hospedeira pode ser endógena ou homóloga para a célula hospedeira. Alternativamente, a proteína é heteróloga, isto é, estranha para a célula hospedeira, por exemplo, uma proteína humana produzida e secretada por uma célula hospedeira de ovário de hamster chinês (CHO). Além disso, as proteínas de mamífero, isto é, aquelas originalmente obtidas ou derivadas de um organismo de mamífero, são obtidas através dos métodos da presente invenção e podem ser secretadas pelas células para o meio de cultura.

[00122] As composições da presente invenção podem ser usadas para a cultura de uma variedade de células. Em uma modalidade, as células cultivadas são células eucarióticas, tais como células de plantas e/ou animais. As células podem ser células de mamíferos, células de peixes, células de insetos, células de anfíbios ou de células de aves. Uma ampla variedade de linhas de células de mamífero adequadas para crescimento em cultura estão disponíveis pela American Type Culture Collection (Manassas, Va.) e outros depósitos, bem como vendedores comerciais. Célula que pode ser utilizada nos processos da invenção inclui, mas não estão limitadas a, células MK2.7, células PER-C6, células de ovário de hamster chinês (CHO), tais como CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909; e WO 01/92337 A2), células CHO negativas de diidrofolato redutase (CHO/-DHFR, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), e dp12.células CHO (Pat. US 5.721.121); células de rim de macaco (CV1, ATCC CCL-70); células de rim de macaco CV1 transformadas por SV40 (COS, células COS-7, ATCC CRL-1651); células HEK 293 e células Sp2/0, células de hibridoma 5L8, células Daudi, células EL4, células HeLa, células HL-60, células K562, células de Jurkat, células THP-1, células Sp2/0, células epiteliais primárias (por exemplo, queratinócitos, células epiteliais cervicais, células epiteliais dos brônquios, células epiteliais da traqueia, células epiteliais renais e células epiteliais da retina) e linhas de células estabelecidas e as suas estirpes (por exemplo, células de rim embrionário humano (por exemplo, células 293 ou células 293 clonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); células de rim de hamster recém-nascido (BHK, ATCC CCL-10); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL-2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL-34); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL- 75); células de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL-51); células de fígado de camundongo búfalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células TRI (Mather, 1982, Anais NY Acad. Sci., 383:44-68); células MCR 5; células FS4; células da retina PER-C6, células MDBK (NBL-1), células 911 , células CRFK, células MDCK, células BeWo, células Chang, células de Detroit 562, células HeLa 229, células HeLa S3, células Hep-2, células KB, células 180 LS, células de 174T LS, células NCI-H-548, células RPMI 2650, células SW-13, células T24, WI-28 VA13, células 2RA, células de WISH, células BS-C-l,2 células de LLC-MK2, células do Clone M-3, células 1-10, Células de RAG TCMK-1, células Y-1, células de LLC-PK1 , células PK(15), células GH1, células GH3, células L2, células LLC-RC 256, células de MH1C1 , células XC, células MDOK, células VSW e TH-I, células B1 ou seus derivados), células de fibroblastos de qualquer tecido ou órgão (incluindo mas não limitado ao coração, fígado, rim, cólon, intestino, esôfago, estômago, tecido neural (cérebro, medula espinhal), pulmão, tecido vascular (artéria, veia, capilar), tecido linfoide (gânglios da linfa, adenoide, amígdala, medula óssea e sangue), baço e fibroblastos e linhas de células tipo fibroblastos (por exemplo, células TRG-2, células IMR-33, células Don, células GHK-21, células Citrulinemia, células Dempsey, células Detroit 551, células de Detroit 510, células Detroit 525, células Detroit 529, células Detroit 532, células Detroit 539, células de Detroit 548, células Detroit 573, células HEL 299, células IMR-90, células MRC-5, células WI-38, células WI-26, células MiCl1 , células CV-1, células COS-1, células COS-3, células COS-7, células de rim de macaco verde africano (VERO-76 , ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); células DBS-FrhL-2, células BALB/3T3, células F9, células SV-T2, células M-MSV-BALB/3T3, células BALB-K, células BLO-11, células NOR-10, células C3H/IOTI/2 , células HSDM1C3, células KLN205, células de McCoy, células L Mouse, células de estirpe 2071 (Camundongo L), células de tensão (Camundongo L) L-M, células L-MTK (Camundongo L), células clones NCTC 2472 e 2555, SCC-PSA1, células suíças/3T3, células de muntjac da Índia, células SIRC, as células CII e células de Jensen ou seus derivados) ou qualquer outro tipo de célula conhecida a um versado na técnica.

[00123] As células podem ser adequadas para cultura, transfecção e expressão aderente, em monocamada e/ou em suspensão de proteínas, por exemplo, anticorpos. As células podem ser utilizadas, por exemplo, com lote, lote de alimentação e perfusão ou métodos de cultura contínua.

Tipos de Culturas de Células

[00124] Para os fins de compreensão, mas sem limitação, será apreciado por aqueles versados na técnica que as culturas de células e execuções de cultura para produção de proteínas podem incluir cultura em lote, cultura de fermentação semi-descontínua, cultura de perfusão, ou combinações dos mesmos. Na cultura em lote, as células são inicialmente cultivadas em meio e este meio não é removido, substituído ou suplementado, isto é, as células não são "alimentadas" com meio fresco, durante ou antes do final da execução de cultura. Toda a cultura de célula é colhida no final da execução da cultura.

[00125] Para as culturas de fermentação semi-descontínua , o tempo de execução de cultura é aumentado completando o meio de cultura periodicamente ou continuamente com meio fresco durante a execução, ou seja, as células são "alimentadas" com novo meio ("meio alimentado") durante o período de cultura. Culturas de fermentação semi-descontínua podem incluir os vários regimes de alimentação e tempos como descrito acima, por exemplo, diariamente, em dias alternados, de dois em dois dias, etc., mais do que uma vez por dia, ou menos do que uma vez por dia, e assim por diante. Além disso, as culturas de fermentação semi-descontínua podem ser alimentadas continuamente com meio de alimentação. O produto desejado é então recolhido no final da execução de cultura.

[00126] A cultura de perfusão, por vezes conhecida como cultura contínua, é uma em que a cultura celular recebe a adição de meio fresco ( "meio de perfusão") e o meio gasto é retirado do biorreator. A perfusão pode ser contínua, em passo a passo, intermitente ou uma combinação de qualquer um ou todos de qualquer um destes. As taxas de perfusão podem ser menores que um volume de trabalho até muitos volumes de trabalho por dia. O termo "taxa de fluxo de perfusão" é a quantidade de material que é passada através de (adicionada e removida) um biorreator, normalmente expressa como uma parte de ou um múltiplo do volume de trabalho, em um determinado momento. "Volume de trabalho" refere-se à quantidade de volume de biorreator utilizada para cultura de células. Em uma modalidade a taxa de fluxo de perfusão é um volume de trabalho ou menos por dia. O meio de alimentação de perfusão pode ser formulado para maximizar a concentração de nutrientes de perfusão para minimizar a taxa de perfusão.

[00127] De preferência, as células são mantidas em cultura e o meio gasto que é removido é substancialmente livre de células ou as células tem um número significativamente menor do que a cultura. As proteínas recombinantes expressas pela cultura de células podem ser mantidas ou removidas a partir da cultura celular, dependendo do sistema de retenção usado. Às vezes, é preferível que as células do hospedeiro e as proteínas recombinantes expressas permaneçam no produto retido no biorreator e para que o permeado seja substancialmente isento de ou tenha significativamente menos do ("permeado nulo"). Outras vezes, pode ser preferível manter as células, mas permitir que as proteínas expressas passem para o permeado ("permeado de colheita").

[00128] A perfusão pode ser realizada por uma série de meios, incluindo centrifugação, decantação, ou filtração, ver, por exemplo, vide Voisard et al., (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751-65. Em uma modalidade, é utilizado um método de filtração. Os filtros incluem filtros de membrana, filtros cerâmicos e os filtros de metal e podem estar em qualquer forma, incluindo enrolados em espiral ou tubulares, ou sob a forma de uma lâmina. Um ou mais filtros podem ser ligados a, em comunicação de fluido com, um biorreator em conjunto ou independentemente, em série ou em paralelo.

[00129] Os filtros de fibras ocas são usados em cultura de perfusão de células de mamíferos para a célula e/ou retenção do produto de proteína recombinante. Quando a cultura de células, incluindo meios de cultura celular, as células (no todo e lisadas), as proteínas recombinantes expressas solúveis, proteínas da célula hospedeira, produtos de resíduos e similares, são introduzidos no filtro, dependendo do tamanho de poro ou corte de peso molecular (MWCO) o material de fibra oca pode reter certos componentes de cultura de células do lado do lúmen (interior) e permitir que certos componentes passem através do filtro (permeado) com base no tamanho dos poros ou corte de peso molecular do material de fibra oca. O material que é retido (retentado) é devolvido ao biorreator. O meio fresco de cultura de células de perfusão é adicionado ao biorreator e o permeado é retirado do filtro em intervalos predeterminados ou continuamente para manter um volume desejado ou constante do biorreator. O permeado pode ser descartado, armazenado em tanques de retenção, bolsas ou sacolas ou transferido diretamente para uma outra operação unitária, tal como filtração, centrifugação e/ou outros métodos de purificação a jusante ou semelhantes. As fibras ocas para microfiltração têm tipicamente um tamanho de poro que varia de 0,1 μm a 5-10 μm ou um peso molecular de corte de 500 kDa ou mais e podem ser usadas para permitir que a proteína passe através do permeado. As fibras ocas de ultrafiltração têm tipicamente uma gama de tamanho de poro de 0,01 um a 0,1 um, ou um peso molecular de corte de 300 kDa ou menos, e podem ser usadas para reter a proteína desejada no retentado e devolvê-la para o biorreator. Isto pode ser utilizado, por exemplo, para concentrar o produto de proteína recombinante para a colheita. Estes filtros estão disponíveis comercialmente, como Xampler UFP-750-E-4MA, Xampler UFP-30-E-4MA, (GE Healthcare, Pittsburg, PA) e Midikros TC Modules T02-E030-10, T02-050-10, T02-E750- 05, T02-M10U-06 (Spectrum Laboratories, Inc, Dominguez, CA).

[00130] A invenção proporciona que, quando o permeado é recolhido, o filtro é um filtro de fibra oca que possui um tamanho de poros ou corte de peso molecular que não permite que o produto de proteína recombinante passe para o permeado e, em vez disso, retém no biorreator. A invenção também prevê que, quando o permeado de colheita é recolhido, o filtro é um filtro de fibra oca que possui um tamanho de poros ou corte de peso molecular que permite que a proteína recombinante passe através da fibra oca.

[00131] A cultura de células é arrastada para fora do biorreator e para dentro do filtro por um sistema de bombeamento, que passa a cultura de células através do lado do lúmen das fibras ocas. Exemplos de sistemas de bombeamento de células incluem bombas peristálticas, bombas de diafragma duplo, bombas de baixo cisalhamento (bombas Levitronix®, Zurich, Switzerland) e sistemas de fluxo tangencial alternado (ATFTM, Refine Technology, Pine Brook, NJ, Vide, por exemplo. Patente US N° 6.544.424; Furey (2002) Gen. Eng. News. 22 (7), 62-63.). O permeado pode ser desenhado a partir dos filtros por utilização de bombas peristálticas. Sistema de filtro Unidade Individual

[00132] A invenção proporciona um sistema de filtro de unidade individual que compreende dois ou mais componentes de filtro de fibra oca de diferentes tamanhos de poros ou cortes de peso molecular combinados em série de um sistema de filtro de unidade individual, opcionalmente contido dentro de um compartimento que pode ser operado por um único dispositivo de bombeamento de células . Isto permite o recolhimento em um modo de retenção do produto (remoção de permeado nulo) ou um modo de recolhimento de produto (remoção de permeado de colheita) através de um sistema de filtro (Figura 1). O sistema de filtro de unidade individual oferece as vantagens de remoção de proteínas da célula hospedeira e outros resíduos a partir da cultura de células durante os ciclos de colheita, prolongando a duração da cultura celular. O sistema de filtro de unidade individual tem potencialmente menos incrustação para uma maior eficiência de colheita. O sistema de filtro de unidade individual pode fornecer permeado em vários lotes menores para o carregamento mais fácil e eficiente de colunas de purificação a jusante. O sistema de filtro de unidade individual pode ser usado como parte de um processo de fabricação contínua.

[00133] A configuração do sistema de filtro de unidade individual inclui dois ou mais componentes de filtro de fibra oca com diferentes tamanhos de poros ou cortes de peso molecular, configurados em série, de tal modo que todos os filtros estão em comunicação fluida um com o outro e o biorreator pode ser operado pelo dispositivo de bombeamento individual. Tais componentes de filtro de fibra oca encontram-se comercialmente disponíveis a partir de GE Healthcare and Spectrum Laboratories, Inc., por exemplo. Embora a cultura de células flui através de todos os filtros, o permeado pode ser removido seletivamente a partir de um ou mais filtros de cada vez. O permeado (nulo ou colheita) é removido pela retirada do permeado a partir do componente de fibra oca adequado com base no seu tamanho de poro ou corte de peso molecular. O permeado nulo e permeado de colheita são removidos separadamente e de forma independente pelo uso de bombas peristálticas individuais. A temporização e razão de recolha de permeado podem ser controladas através de suas bombas peristálticas separadas.

[00134] Os componentes individuais de filtro de fibra oca podem ser alinhados em qualquer configuração que é adequada para a aplicação. Em uma modalidade, o(s) componente(s) de filtro de fibra oca possui um tamanho de poro ou corte de peso molecular de modo que o produto de proteína recombinante da cultura de células é retido no retentado no biorreator cultura de células que é colocado de tal modo que ele é o primeiro a receber a fluxo de cultura de células do biorreator.

[00135] A configuração do sistema de filtro de unidade individual permite que o permeado da colheita e permeado nulo sejam removidos do biorreator de forma segregada e de uma maneira tal que a razão volumétrica relativa e tempo de remoção podem ser controlados como desejado. O permeado é recolhido a partir do sistema de filtragem de unidade individual na mesma taxa conforme a taxa de perfusão.

[00136] Além da utilização de componentes de filtro de fibra oca disponíveis comercialmente disponíveis, o material de fibra oca pode ser construído tendo duas zonas separadas dentro de um único filtro que estão isoladas uma da outra com uma zona de envasamento. Além disso, as fibras ocas separadas tendo diferentes tamanhos de poro ou cortes de peso molecular podem estar unidas por uma zona de ligação em uma área de envasamento de meio para isolar os dois lados de permeado. Cada domínio de tamanho de poro, ao longo do comprimento da fibra oca, teria os lados de cobertura correspondentes isolados a partir dos outros domínios lado da cobertura de tamanho de poro para que permeado possa ser retirado de cada domínio de lado da cobertura de tamanho de poro independente dos outros.

[00137] Os filtros podem ser presos uns aos outros por qualquer método que permita a comunicação de fluido entre os componentes de filtro de fibra oca. Os componentes de filtro podem ser colados ou soldados em conjunto. Os filtros podem ser unidos por um grampo, tal como uma união TC, ou outro dispositivo mecânico que prenda as unidades de filtro em conjunto e permita a comunicação de fluido entre os filtros. O compartimento do filtro pode ser proporcionado com regiões internas e externas roscadas para ser utilizada para unir as unidades de filtro, diretamente ou através de um acoplador roscado. Os filtros também podem ser ligados por qualquer tipo de mecanismo de bloqueamento.

[00138] O posicionamento de dois filtros diretamente em cada extremidade pode criar uma junção apertada ou um ligeiro desalinhamento entre as fibras ocas que poderia impedir o fluxo de células e causar danos celulares devido ao cisalhamento. Em resultado, pode haver uma queda na viabilidade, devido ao alinhamento dos filtros. Um espaçador ou acoplador que fornece uma certa distância entre as unidades de filtro adjacentes permitindo o fluxo das células para a transição mais fácil entre o lúmen de um filtro para dentro do lúmen do próximo filtro de fibra oca pode ser usado entre as unidades de filtro. O espaçador separa as unidades de filtro individuais umas das outras, permitindo um percurso de fluxo estéril entre as fibras ocas individuais ao mesmo tempo mantendo o isolamento dos respectivos lados da cobertura oca a partir da qual o permeado é retirado.

[00139] Tais espaçadores podem ser feitos de qualquer material que possa estabelecer uma ligação segura e estéril entre os filtros e que permita a comunicação de fluido entre os filtros. Tais espaçadores podem ser de autovedação para os filtros. Os espaçadores podem ser colados ou soldados aos filtros que serão unidos. O espaçador pode ser preso aos filtros por um dispositivo mecânico que prende o espaçador nos filtros, tal como um grampo. O espaçador pode ser fornecido com as regiões internas ou externas roscadas para ser utilizado para fixar o espaçador nos filtros diretamente ou através de um acoplador roscado. O espaçador pode também ser ligado por qualquer tipo de mecanismo de bloqueamento.

[00140] O sistema de filtro de unidade individual pode opcionalmente ser fechado por um invólucro exterior, para facilidade de utilização, especialmente quando mais de dois filtros estão configurados em série. O invólucro exterior pode ser feito de plástico ou outro material adequado que irá manter uma barreira estéril para o material no interior da unidade de filtro. O invólucro pode ser um invólucro secundário feito para se encaixar sobre filtros de fibra oca disponíveis comercialmente ou o compartimento pode ser fabricado como o compartimento principal para os filtros de fibras ocas ligados. O invólucro deve ter aberturas suficientes para permitir a introdução e recolhimento de alimentação e retentado, bem como pelo menos uma porta de permeado para cada filtro de fibra oca que possui um tamanho de poro ou corte de peso molecular diferente.

[00141] O sistema de filtro de unidade individual pode ser usado em conjunto com um sistema de bombeamento de células individual que passa a cultura de células através do lado do lúmen das fibras ocas, em uma vazão constante, conforme descrito acima. Processos de Cultura Celular

[00142] A cultura celular pode ser realizada sob condições de produção que acomodem produção desde pequena até larga escala de proteínas recombinantes utilizando recipientes de cultura e/ou dispositivos de cultura que são convencionalmente utilizados para cultura de células de animal ou de mamífero. Para a cultura em maior escala, equipamentos, tais como os sistemas rotativos de cultura em frascos, dispositivos de cultura de tipo leito recheado, biorreatores tipo tanque fermentador, biorreatores tipo air lift, biorreatores de leito fluidificado, biorreatores de células imobilizadas, biorreatores de fibras ocas, biorreatores de tanque agitado, biorreatores de vários estágios, biorreatores centrífugos ou qualquer outro dispositivo adequado conhecido por um versado na técnica que possa ser utilizado. Equipamento de bioprocessamento de uso único, como biorreatores de uso único, também podem ser usados. Os microtransportadores também podem ser utilizados com sistemas de biorreator. Os sistemas podem ser operados em um modo de lote, fermentação semi-contínua ou perfusão/contínua. Além disso, os recipientes de cultura podem ser equipados com aparelhos adicionais, tais como separadores de células usando filtros, gravidade, força centrífuga, e semelhantes.

[00143] O termo "fase de crescimento" de uma cultura celular refere- se ao período de crescimento celular exponencial (isto é, a fase log), onde as células geralmente se dividem rapidamente. As células são mantidas na fase de crescimento durante um período de cerca de um dia, ou cerca de dois dias, ou cerca de três dias, ou cerca de quatro dias, ou mais do que quatro dias. A duração de tempo durante o qual as células são mantidas em fase de crescimento vai variar com base no tipo de células, a taxa de crescimento das células e/ou as condições de cultura, por exemplo.

[00144] O termo "fase de transição" refere-se a um período de tempo entre a fase de crescimento e a fase de produção. Geralmente, a fase de transição é o tempo durante o qual as condições de cultura podem ser controladas para suportar uma mudança de fase de crescimento para a fase de produção. Vários parâmetros de cultura de células podem ser monitorados ou manipulados para controlar o deslocamento, incluindo, mas não se limitando a, um ou mais de, temperatura, pressão osmótica, concentração de vitaminas, aminoácidos, açúcares, amônio, ácido láctico, e sais ou outros semelhantes.

[00145] O termo "fase de produção" refere-se ao período de tempo em que o crescimento celular estagnou. O crescimento celular logarítmico normalmente diminui antes ou durante esta fase e a produção de proteína torna-se preponderante. Processos de cultura de células de perfusão e fermentação semi-contínua suplementam o meio de cultura celular ou fornecem meio fresco durante esta fase para alcançar e/ou manter a densidade celular desejada, a viabilidade e/ou a titulação do produto de proteína recombinante. A fase de produção pode ser conduzida em larga escala. Culturas de células em larga escala podem ser mantidas em um volume de pelo menos cerca de 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10000, 15000, 20000 litros ou mais. Em uma modalidade preferencial, a fase de produção é conduzida em biorreatores de 500L, 1000L e/ou 2000L.

[00146] A produção de proteínas recombinantes pode ser feita em várias fases. Em um processo de fases múltiplas, as células são cultivadas em duas ou mais fases distintas. Geralmente, as células são cultivadas em primeiro lugar em uma ou mais fases de crescimento, sob condições ambientais que maximizam a proliferação e viabilidade celular, em seguida, transferidas para uma fase de produção, em condições ambientais que maximizem a produção de proteína. Em um processo comercial para a produção de proteínas recombinantes por células de mamíferos, há normalmente várias, por exemplo, pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais fases de crescimento que ocorrem em diferentes recipientes de cultura (N-x para N-1) que precedem uma cultura de produção final. As fases de crescimento e de produção podem ser precedidas por, ou separadas por, uma ou mais fases de transição. A fase de produção pode ser conduzida em larga escala. O método de acordo com a presente invenção pode ser usado para prolongar a fase de produção de uma cultura de células.

[00147] Ao se preparar para a produção comercial de uma proteína recombinante, as culturas celulares que antecedem uma cultura de produção final tipicamente passam por dois processos, um cultivo celular e um cultivo de inóculo. A fase de cultivo celular (NX) ocorre em pequena escala, onde as células são expandidas rapidamente em número. Na fase de cultivo de inóculo (N-1), as células são ainda mais expandido para gerar o inóculo para o biorreator de produção. Cultivos celulares e de N-1 podem ser produzidos por qualquer método de cultura, tipicamente culturas de células em lotes. Densidades de células N-1 de > 15 x 106 células/mL são típicas para semear biorreatores de produção. As maiores densidades celulares de N-1 e/ou ajuste de meio de cultura celular podem diminuir ou mesmo eliminar o tempo necessário para atingir uma densidade de células desejada no biorreator de produção. Em uma modalidade, densidades celulares mais elevadas de N-1 são alcançadas por meio de cultura de perfusão utilizando filtração de fluxo tangencial alternada. Uma cultura de células de N-1 cultivadas por meio de um processo de perfusão utilizando filtração de fluxo tangencial alternada pode fornecer células em qualquer densidade desejada, tais como densidade de >90 x 106 células/ml ou mais, pode ser facilmente obtida. A cultura de células de N-1 pode ser utilizada para gerar um único bolus de cultura de inoculação ou pode ser utilizada como uma cultura de estoque de semente de rolamento que é mantida para inocular biorreatores múltiplos de produção. A densidade de inoculação pode ter um impacto positivo sobre o nível de proteína recombinante produzida. Níveis do produto de proteína recombinante tendem a aumentar com o aumento da densidade de inoculação. A melhoria em título está ligada não só a uma maior densidade de inoculação, mas é suscetível de ser influenciada pelo estado metabólico e do ciclo celular das células que são postas em produção. Durante o processo de N-1, a cultura de células pode entrar numa fase de produção antes da inoculação para o biorreator de produção. Tal inoculação permite que a produção de comece imediatamente no biorreator de produção.

[00148] O termo "densidade celular" refere-se ao número de células num dado volume de meio de cultura. "Densidade de células viáveis" refere-se ao número de células vivas em um dado volume de meio de cultura, tal como determinado por ensaios de viabilidade padrão (como método de exclusão de corante azul tripano). O termo "hematócrito" (PCV), também mencionado como "percentagem de hematócrito" (% PCV), é a razão entre o volume ocupado pelas células e o volume total de cultura de células expresso como uma percentagem (vide Stettler, et al., (2006) Biotechnol Bioeng. Dez 20:95(6):1228-33). Hematócrito é uma função da densidade celular e o diâmetro da célula; aumentos do hematócrito podem surgir a partir de aumentos tanto na densidade celular ou diâmetro das células, ou ambos. Hematócrito é uma medida do conteúdo de sólidos na cultura de células. Uma vez que variam em tamanho e culturas de células também contêm células mortas e morrendo e outros restos celulares, o hematócrito é uma forma mais precisa para descrever o grau de precisão do conteúdo sólido dentro de uma cultura de células. Por exemplo, uma cultura de 2000L que tem uma densidade de células de 50 x 106 células/ml teria hematócritos vastamente diferentes, dependendo do tamanho das células. Além disso, algumas células aumentarão de tamanho, tal como quando em um estado de pausa de crescimento, de modo que o hematócrito antes de pausa no crescimento e após pausa no crescimento provavelmente será diferente, devido ao aumento da biomassa, como resultado do aumento de tamanho da célula. O hematócrito inferior durante a fase de produção ajuda a mitigar os problemas de aspersão de oxigênio dissolvido que podem dificultar culturas de perfusão de densidade celular mais elevada. O hematócrito menor também permite um volume de meio menor que permite a utilização de recipientes de armazenamento de meio menores e pode ser combinado com vazões mais lentas. Hematócritos menores também tem menos impacto na coleta e processamento a jusante, em comparação a culturas de biomassa celular mais elevadas. Tudo o que reduz os custos associados à fabricação das proteínas terapêuticas recombinantes.

[00149] Em uma modalidade, o método compreende que o hematócrito durante uma fase de produção, é inferior ou igual a 35%. Numa modalidade relacionada, o volume de células compactado é menor do que ou igual a 30%.

[00150] Numa modalidade, a densidade de células viáveis da cultura de células de mamífero com um hematócrito inferior ou igual a 35% é 10 x 106 células viáveis/ml a 80 x 106 células viáveis/ml. Numa modalidade relacionada, a densidade de células viáveis da cultura de células de mamífero é 20x106 células viáveis/ml a 30x106 células viáveis/ml. Controles de cultura de células

[00151] Condições de cultura de células adequadas para os métodos da presente invenção são aquelas que são normalmente utilizadas e conhecidas por lote, fed batch (semi-descontínuo) ou perfusão (contínua) de cultura de células ou qualquer combinação destes métodos, com especial atenção ao pH, o oxigênio dissolvido (O2), e dióxido de carbono (CO2), agitação e umidade e temperatura. Durante a produção de proteína recombinante, é desejável ter um sistema controlado onde as células são crescidas por um período desejado ou até uma densidade desejada e, em seguida, o estado fisiológico das células é mudado para um estado de crescimento limitado ou pausado com alta produtividade, onde as células utilizam energia e substratos para produzir a proteína recombinante visando aumentar a densidade celular. Para a cultura de células em larga escala comercial e a preparação de agentes terapêuticos biológicos, a capacidade de limitar ou parar o crescimento celular e ser capaz de manter as células num estado de crescimento limitado ou parado durante a fase de produção é muito desejável. Tais métodos incluem, por exemplo, mudanças de temperatura, utilização de indutores químicos de produção de proteína, inibidores de limitação de nutrientes ou de fome e do ciclo celular, quer isoladamente ou em combinação.

[00152] Uma vez que tal mecanismo para limitar ou parar o crescimento é de mudar a temperatura durante a cultura de células. Por exemplo, uma fase de crescimento pode ocorrer a uma temperatura mais elevada, a mudança para uma temperatura mais baixa pode iniciar e/ou manter uma fase de produção. Por exemplo, uma fase de crescimento pode ocorrer em um ponto fixo de primeira temperatura de cerca de 35 °C a cerca de 38 °C, e uma fase de produção pode ocorrer num segundo ponto de ajuste de temperatura de cerca de 29 °C a cerca de 37 °C, opcionalmente desde cerca de 30°C a cerca de 36 °C ou entre cerca de 30 °C a cerca de 34 °C.

[00153] Mudar o ponto de ajuste da temperatura pode ser feito manualmente ou pode ser feito automaticamente por meio da utilização de sistemas de controle de biorreator. O ponto de ajuste da temperatura pode ser ligado a um tempo predeterminado ou em resposta a um ou mais parâmetros de cultura de células, tais como a densidade celular, título, ou concentração de um ou mais componentes do meio. Um tal método utiliza uma ferramenta de monitorização on-line de biomassa integrada no sistema de controle de biorreator para provocar uma mudança de ponto de ajuste da temperatura, quando uma densidade celular desejada é atingida. Por exemplo, uma sonda de biomassa baseada em capacitância pode ser utilizada para estimar a densidade celular em linha e os dados a partir de medições em linha podem ser utilizados para induzir uma mudança na temperatura do biorreator. Tais sondas baseadas em capacitância incluem sensor de capacitância Fogale (DN12-200) (Nimes, França).

[00154] Além disso, indutores químicos de produção de proteína, tais como a cafeína, butirato, e/ou hexametileno bisacetamida (HMBA), podem ser adicionados ao mesmo tempo que, antes, ou após uma mudança de temperatura. Se os indutores forem adicionados após uma mudança de temperatura, os mesmos poderão ser adicionados a partir de uma hora até cinco dias depois da mudança de temperatura, opcionalmente, de um a dois dias após a mudança de temperatura. As culturas de células podem ser mantidas por vários dias ou mesmo semanas, enquanto que as células produzem a(s) proteína(s) desejada(s).

[00155] Outro método para manter as células em um estado fisiológico desejado é o de induzir parada de crescimento de células por exposição da cultura de células a condições de baixa L-asparagina e/ou inanição asparagina (ver, por exemplo, Publicação WIPO N ° WO 2013/006479). Parada de crescimento celular pode ser obtida e mantida através de um meio de cultura que contém uma concentração limitante de L-asparagina e manutenção de uma baixa concentração de L-asparagina na cultura de células. Manter a concentração de L-asparagina em 5 mM ou menos pode ser utilizado para induzir e manter as células em um estado de parada de crescimento em que a produtividade aumenta.

[00156] Inibidores do ciclo celular, composto conhecido ou suspeito de regular a progressão do ciclo celular e os processos associados de transcrição, reparação de DNA, diferenciação, senescência e apoptose relacionados com isto também são úteis para induzir a parada de crescimento de células. Inibidores do ciclo celular que interagem com a maquinaria do ciclo, tais como quinases dependentes de ciclina (CDKs), são úteis como também são aquelas moléculas que interagem com as proteínas a partir de outras vias, tais como AKT, mTOR, e outras vias que afetam, direta ou indiretamente, o ciclo de célula. Colheita e Purificação

[00157] As proteínas recombinantes expressas podem ser secretadas no meio de cultura a partir da qual elas podem ser recuperadas e/ou coletadas. As proteínas recombinantes podem então ser submetidas a uma ou mais etapas de processamento, incluindo a colheita, a purificação, a endotoxina e/ou inativação/filtração, ultrafiltração/diafiltração viral numa formulação farmacêutica adequada e/ou de armazenamento

[00158] As proteínas recombinantes expressas podem ser capturadas no permeado de colheita. As proteínas podem ser purificadas, ou parcialmente purificadas, a partir de permeados de colheita utilizando processos e produtos comercialmente disponíveis conhecidos na técnica e/ou disponíveis a partir de vendedores comerciais. Tais métodos incluem floculação; centrifugação; precipitação; métodos de filtração, tais como filtração em profundidade; incluindo métodos de cromatografia, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de permuta iônica, cromatografia de permuta aniônica modo misto, cromatografia de interação hidrófoba e cromatografia de hidroxiapatite, entre outros métodos disponíveis.

[00159] As proteínas purificadas podem então ser "formuladas", significando trocadas, esterilizadas, embaladas a granel e/ou embaladas em tampão para o usuário final. As formulações adequadas para as composições farmacêuticas incluem aquelas descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Técnicas Analíticas de Processos

[00160] Tecnologias e métodos analíticos de processo, estão disponíveis para monitorizar e avaliar as amostras tomadas durante os processos de cultura de células e de purificação para monitorizar quantitativamente e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e o processo de produção. Esta informação em tempo real ou em linha pode ser utilizada para monitorizar e/ou controlar a produção de produtos e de parâmetros, tais como o título, a densidade celular; atributos de qualidade do produto, tais como modificações pós-tradução; variabilidade de produto ou processo, tais como impurezas e semelhantes, para tomar decisões oportunas e modificar processos conforme necessário. Por exemplo, os atributos de qualidade do produto, tais como a distribuição de espécies glicano, os níveis de oxidação ou desaminação podem ser monitorizados e/ou controlados.

[00161] Cada etapa de um processo de cultura de célula a montante ou a jusante de um processo de purificação pode ser monitorizado para fornecer informações sobre a quantidade de um atributo de qualidade particular do produto (PQA) e para controlar esta PQA com um alvo e gama programados.

[00162] As amostras podem ser tomadas de forma intermitente, a frequências desejadas, ou de forma contínua. As amostras podem ser analisadas em tempo real ou quase em tempo real ou armazenadas para posterior análise. Esta informação pode ser utilizada para fazer alterações durante processos a montante e a jusante.

[00163] Detecção de atributo de qualidade do produto pode ser realizada utilizando espectrometria de massa, cromatografia líquida com UV e/ou detecção por espectrometria de massa e eletroforese capilar e semelhantes.

[00164] Estes processos são adaptáveis a monitorização contínua com ajustes manuais ou automatizados de processo, tais como alimentos, temperatura, duração do processo conforme determinado pelo nível de um atributo de qualidade do produto especificado.

[00165] Análise de massa intacta para detectar a presença de modificações pós-translacionais, tais como processamento de aminoácidos e de glicosilação pode ser feita utilizando uma coluna de polihidroxietil aspartamida operada em modo de exclusão de tamanho e acoplado com ESI-MS (Brady et al., (2008) J. Am Soc Mass Spectro, 19: 502-509).

[00166] Monitorização em tempo real a partir de eluato de cromatografia de permuta iônica por monitorização de uma razão normalizada LS/UV para cada fração utilizando detector de espalhamento de luz laser e uma absorvância no UV, ver US Publicação de Patente N ° US 2013-0303732.

[00167] Método de multi atributo faz utilização cromatografia líquida/espectrometria de massa únicos (LC/MS) para procurar e caracterizar dados de MS em tandem utilizando várias plataformas de banco de dados e de busca como Sequest (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA), X!Tandem (The Global Proteome Machine Organization) ou MascotMatrix Science, Boston, MA). As amostras podem ser desnaturadas a pH elevado ou para manter e proteger isoformas dissulfureto variantes de succinimida, a pH baixo. A amostra é, em seguida, reduzida e alquilada seguida por digestão com tripsina. A amostra é depois injetada num MS (tal como um Espectômetro de Massa Q Exactive™ Quadrupolo-Orbitrap Híbrido, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) e a análise é realizada através do software de localização (Thermo Fisher Scientific). Atributos que podem ser identificados, quantificados e monitorados incluem isomerização, desaminação, redução de dissulfeto, a contaminação de proteínas da célula hospedeira, mutações, incorporação em frente a uma lesão, hidroxilisina, tioéter, cadeias pesadas não-glicolisadas, amidação C-terminal, a proteína residual A, caracterizar glicanos e fornecer identidade de molécula. A precisão de massa para cada atributo monitorizado pode ser fixada em menos de 5 ppm da massa prevista. Identificação do peptídeo/atributo é confirmada por fragmentação MS2 e os métodos de caracterização ortogonais (HILIC-MS para glicosilação, por exemplo). A distribuição isotópica experimental deve ter uma pontuação escalar de produto melhor do que 0,95 quando comparada com a distribuição teórica isotópica. Uma janela de tempo de retenção é definida para cada atributo e todos os estados de carga detectáveis para cada atributo são considerados para efeitos de quantificação. Um critério é definido que irá detectar alterações no atributo. Por exemplo, a desaminação pode ser monitorizada por determinação de um valor de desaminação (peptídeo desaminado dividido pela soma do peptídeo desaminado e o peptídeo de origem não modificado multiplicado por 100. A glicosilação pode ser monitorizada por comparação de cada glicano específico para a soma de todos os glicanos detectáveis.

[00168] Em algumas modalidades processar tecnologias de análise pode também incluir o "controle de atributo de produto" (PAC). PAC combina vários elementos PAT com um modelo de bioprocessos para decretar controle de feedback em tempo real de um ou mais CQAs. Este novo processo de PAC é um exemplo de aplicação da produção de produtos biofarmacêuticos QbD. O processo de PAC baseia-se na utilização de uma alavanca de comando que pode ter impacto no CQA. A alavanca de comando é incorporada num circuito de controle baseado em modelo para manter a CQA no alvo desejado, tal como especificado na QTPP. Especificamente, uma alavanca de controle é um ajuste a um parâmetro de processo que impacta a CQA de uma forma que pode ser modelada matematicamente. Por exemplo, os níveis de um inibidor ou ativador podem ser ajustados de forma dinâmica para regular uma atividade da enzima de glicosilação para regular o perfil de glicosilação de um produto, desde que o seu impacto podem ser modelados matematicamente. Da mesma forma a temperatura ou pH pode ser modificada durante uma execução desde que o seu impacto sobre CQAs também possa ser modelado de forma confiável. Proteínas

[00169] Tal como aqui utilizado "peptídeo","polipeptídeo" e "proteína" são utilizados alternadamente e referem-se a uma molécula compreendendo dois ou mais resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas. Peptídeos, polipeptídeos e proteínas também são inclusive de modificações incluindo, mas não se limitando a glicosilação, ligação de lipídios, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.

[00170] As proteínas podem ser de interesse científico ou comercial, incluindo drogas à base de proteínas. As proteínas incluem, entre outras coisas, anticorpos, proteínas de fusão e citocinas. Peptídeos, polipeptídeos e proteínas podem ser produzidas através de linhas celulares procariotas e eucariotas utilizando métodos de cultura de células e pode ser referido como "peptídeo recombinante", "polipeptídeo recombinante", "proteína recombinante", "produto de proteína recombinante" e "produto". A proteína (s) expressa pode ser produzida intracelularmente ou segregada no meio de cultura a partir do qual podem ser recuperadas e/ou recolhidas.

[00171] Exemplos não limitativos de proteínas de mamíferos que podem ser vantajosamente produzidos pelos métodos desta invenção incluem proteínas compreendendo sequências de aminoácidos idênticas ou substancialmente semelhantes a totalidade ou parte de uma das seguintes proteínas: fator de necrose tumoral (TNF), ligando flt3 (WO 94/28391), eritropoietina, trombopoeitina, calcitonina, IL-2, angiopoietina-2 (Maisonpierre et al. (1997), Ciência 277 (5322): 55-60), ligando para receptor ativador de NF-kapa B (RANKL, WO 01/36637), fator de necrose tumoral (TNF) relacionados a ligando indutor de apoptose (TRAIL, WO 97/01633), linfopoietina derivada de estroma do timo, fator de estimulação de colônias de granulócitos, fator de estimulação de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF, Patente Australiana N ° 588819), fator de crescimento de mastócitos, fator de crescimento celular estaminal (Patente US N ° 6.204.363), fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de queratinócitos, fator de crescimento e desenvolvimento de megacariota, RANTES, proteína humana semelhante a fibrinogênio 2 (FGL2; NCBI N ° de identificação NM_00682; Rüegg e Pytela (1995), Gene 160: 257-62) hormônio de crescimento, insulina, insulinotropina, fatores de crescimento semelhantes a insulina, hormônio paratiroide, incluindo os interferons a-interferons, Y-interferon, e interferons de consenso (Patentes US Nos 4.695.623 e 4.897.471), fator de crescimento do nervo. , fator neurotrófico derivado do cérebro, proteínas semelhantes a sinaptotagmina (SLP 1-5), neurotrofina-3, glucagon, interleucinas, fatores estimuladores de colônias, linfotoxina-p, fator inibidor de leucemia, e oncostatina-M. As descrições de proteínas que podem ser produzidas de acordo com os métodos da invenção podem ser encontrados em, por exemplo, Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, Volumes 1-3 (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay and Brown, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1998) all editions; and The Cytokine Handbook^_Vols. 1 e 2 (Thompson e Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003).

[00172] Além disso, os métodos da invenção seriam úteis para a produção de proteínas compreendendo a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de um receptor para qualquer uma das proteínas acima mencionadas, um antagonista para um receptor deste tipo, ou qualquer uma das proteínas acima mencionadas, e/ou proteínas substancialmente semelhantes a estes receptores ou antagonistas. Estes receptores e antagonistas incluem: ambas as formas de receptor do fator de necrose tumoral (TNFR, referido como p55 e p75, Patente US N ° 5.395.760 e Patente US N ° 5.610.279), interleucina-1 (IL-1) receptores (tipos I e II;. A Patente EP N ° 0460846, Patente US N ° 4.968.607, e na Patente US N ° 5.767.064,), IL-1 antagonistas do receptor (Patente US N ° 6.337.072), antagonistas de IL-1 ou inibidores (Patentes US Nos 5.981.713, 6.096.728, e 5.075.222) 2 IL-receptores, receptores IL-4 (Patente EP N ° 0 367 566 e na Patente US N ° 5.856.296), receptores de IL-15, receptores de IL-17, IL- 18, receptores de Fc, receptor do fator de estimulação de colônias de granulócitos-macrófagos, fator de estimulação de receptor de colônias de granulócitos, receptores para oncostatina-M e fator inibidor de leucemia, ativador de receptor de NF-kapa B (RANK, WO 01/36637 e Patente US N ° 6.271.349), osteoprotegerina (Patente US N ° 6.015.938), receptores para TRAIL (incluindo receptores de TRAIL 1, 2, 3 e 4) e os receptores que compreendem os domínios de eliminação, como receptor de Fas ou Receptor Indutor de Apoptose (AIR).

[00173] Outras proteínas que podem ser produzidas utilizando a presente invenção incluem proteínas que compreendem toda ou parte das sequências de aminoácidos de antígenos de diferenciação (referidas como proteínas CD) ou seus ligantes ou proteínas substancialmente semelhantes a qualquer uma dessas. Tais antígenos são descritos em Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japan, 1996). As proteínas CD semelhantes são divulgadas nos seminários subsequentes. Exemplos de tais antígenos incluem CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 e ligantes dos mesmos (ligante de CD27, ligante de CD30, etc.). Vários dos antígenos CD são membros da família do receptor do TNF, que também inclui 41BB e OX40. Os ligantes são frequentemente membros da família do TNF, como são o ligante 41BB e o ligante OX40.

[00174] As proteínas enzimaticamente ativas ou seus ligantes também podem ser produzidos utilizando a presente invenção. Os exemplos incluem proteínas que compreendem toda ou parte de uma das seguintes proteínas ou seus ligantes ou uma proteína substancialmente semelhante a uma dessas: membros da família do domínio da desintegrina e metaloproteinase incluindo Enzima Conversora TNF-alfa, várias quinases, glucocerebrosidase, superóxido dismutase, ativador de plasminogênio tecidual, Fator VIII, Fator IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, um antagonista de IL-2, alfa-1 antitripsina, ligantes para qualquer uma das enzimas mencionadas acima e numerosas outras enzimas e seus ligantes.

[00175] O termo "anticorpo" inclui a referência a ambas as imunoglobulinas glicosiladas e não glicosiladas de qualquer isotipo ou subclasse ou a uma região de ligação de antígeno destas que compete com o anticorpo intacto pela ligação específica, a menos que especificado o contrário, incluindo humano, humanizado, quimérico, multi-específico, monoclonal, policlonal e oligômeros ou seus fragmentos de ligação de antígeno. Também estão incluídas as proteínas tendo um fragmento ou região de ligação de antígeno, como o Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, diacorpos, Fd, dAb, maxicorpos, moléculas de anticorpo de cadeia única, fragmentos da região determinante de complementaridade (CDR), scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir uma ligação de antígeno específica a um polipeptídeo alvo. O termo "anticorpo" é inclusivo de, mas não está limitado a, aqueles que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo.

[00176] Exemplos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, aqueles que reconhecem qualquer um ou uma combinação de proteínas, incluindo, mas não limitado a, as proteínas acima mencionadas e/ou os seguintes antígenos: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL- 3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, IL-18 subunidades do receptor, FGL2, PDGF-β e seus análogos (ver Patentes US Nos. 5.272.064 e 5.149.792), VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, receptor de EGF (ver Patente US N ° 6.235.883) receptor VEGF, fator de crescimento de hepatócitos, ligando osteoprotegerina, interferon gama, estimulador de linfócitos B (BlyS, também conhecido como BAFF, THANK, TALL-1, e zTNF4; ver Do e Chen- Kiang (2002), Cytokine Growth Factor de Rev. 13 (1): 19-25), complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno do tumor de MUC1, antígeno PEM, LCG (que é um produto do gene que é expresso em associação com câncer do pulmão), HER-2, HER-3 , uma glicoproteína de TAG-72, o antígeno SK-1, epítopos associados a tumores que estão presentes em níveis elevados nos soros de pacientes com cólon e/ou do câncer do pâncreas, epítopos ou proteínas associadas a câncer expressos em células da mama, cólon, escamosas, da próstata, pancreáticas, do pulmão, e/ou células de câncer e/ou melanoma do rim, glioma, neuroblastoma, ou núcleo necrótico de um tumor, integrina alfa 4 beta 7, a integrina VLA-4, integrinas B2, receptores de TRAIL 1, 2, 3 e 4, RANK, ligando RANK, TNF-α, a molécula de adesão VAP-1, molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), molécula de adesão intercelular-3 (ICAM-3), leucointegrina adesina, a glicoproteína de plaqueta GP IIb/IIIa, miosina cardíaca de cadeia pesada, hormônio paratiroide, rNAPc2 (que é um inibidor do fator de fator VIIa do tecido), MHC I, antígeno carcinoembrionário (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), fator de necrose tumoral (TNF), CTLA-4 (que é um antígeno associado a linfócitos T citotóxicos),-1 FC-Y receptor, HLA-DR 10 beta, o antígeno HLA- DR, esclerostina, L-selectina, vírus sincicial respiratório, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), Streptococcus mutans, e Staphlycoccus aureus. Exemplos específicos de anticorpos conhecidos que podem ser produzidos utilizando os métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a adalimumabe, bevacizumabe, infliximabe, abciximabe, alemtuzumabe, bapineuzumabe, basiliximabe, belimumabe, briakinumabe, canakinumabe, certolizumabe pegol, cetuximabe, conatumumabe, denosumabe, eculizumabe, gemtuzumabe ozogamicina, golimumabe, ibritumomabe tiuxetano, labetuzumabe, mapatumumabe, matuzumabe, mepolizumabe, motavizumabe, muromonabe-CD3, natalizumabe, nimotuzumabe, ofatumumabe, omalizumabe, oregovomabe, palivizumabe, panitumumabe, pemtumomabe, pertuzumabe, ranibizumabe, rituximabe, rovelizumabe, tocilizumabe, tositumomabe, trastuzumabe, ustekinumabe, vedolizomabe, zalutumumabe e zanolimumabe.

[00177] A invenção também pode ser utilizada para produzir proteínas recombinantes de fusão que compreendem, por exemplo, qualquer das proteínas acima mencionadas. Por exemplo, proteínas de fusão recombinantes que compreendem uma das proteínas acima mencionadas, além de um domínio de multimerização, tais como um zíper de leucina, uma espiral enrolada, uma porção de Fc de uma imunoglobulina, ou uma proteína substancialmente semelhante, podem ser produzidos utilizando os métodos da invenção. Ver, por exemplo WO94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hâkansson et al.(1999), Structure 7:255-64. Especificamente incluídas entre tais proteínas de fusão recombinantes são proteínas em que uma porção de um receptor está fundida a uma porção Fc de um anticorpo como etanercepte (um p75 TNFR:Fc) e belatacepte (CTLA4:Fc). As proteínas quiméricas e polipeptídeos, bem como fragmentos ou porções, ou mutantes, variantes ou análogos de qualquer uma das proteínas e polipeptídeos acima mencionados também estão incluídos entre as proteínas adequadas, polipeptídeos e peptídeos que podem ser produzidos pelos métodos da presente invenção.

[00178] Embora a terminologia utilizada neste pedido seja padrão na técnica, as definições de certos termos são aqui fornecidas para assegurar a clareza e definição do significado das reivindicações. Unidades, prefixos e símbolos podem ser denotados em sua forma aceita de SI. Intervalos numéricos recitados aqui são inclusivos dos números que definem o alcance e incluem e suportam cada número inteiro dentro do intervalo definido. Os métodos e técnicas descritos aqui são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e, tal como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo, a menos que indicado de outra forma. Ver, por exemplo., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1995), and Greenfield, Antibodies: A Laboratory Manual 2nd ed,, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2013), ou qualquer edições anteriores. Todos os documentos, ou porções de documentos, citados neste pedido, incluindo, mas não limitado a, patentes, pedidos de patente, artigos, livros e tratados, são expressamente incorporados por referência. O que é descrito numa modalidade da invenção pode ser combinado com outras modalidades da invenção.

[00179] A presente invenção não deve ser limitada pelas modalidades específicas descritas aqui, que se destinam como simples ilustrações dos aspectos individuais da invenção, e componentes e métodos funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. De fato, as várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas aqui serão aparentes para àquelas pessoas versadas na técnica a partir da descrição antecedente e desenhos que acompanham. Tais modificações são destinadas a estar dentro do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS Exemplo 1 Processo de Cultura Celular Periódico Extendido

[00180] Este experimento descreve um processo de cultura de células com a colheita periódica estendida (X-PH) em comparação com um processo de cultura ultrafiltração (UF). Para o processo periódico estendido, a perfusão foi realizada utilizando um único sistema de unidade de filtro compreendendo um ultrafiltro com um tamanho de poro ou MWCO de tal modo que o produto de proteína recombinante da cultura de células foi retido no retentado no biorreator de cultura celular ligado a um micro-filtro possuindo um tamanho de poro ou corte de peso molecular tal que a proteína recombinante de interesse foi realizada no permeado e recolhido como produto de colheita. A perfusão foi realizada pelo desenho de um permeado recombinante isento de proteína, ou permeado nulo, a partir do componente do ultrafiltro, até um parâmetro pré-determinado ser alcançado, neste caso os dias em cultura, altura em que a perfusão foi realizada extraindo uma proteína recombinante contendo permeado, ou a colheita de permeado, a partir do componente de microfiltro, durante um tempo predeterminado. Depois do tempo pré-determinado ter decorrido, o processo foi repetido. Este ciclo de retenção e a colheita do produto de proteína foi repetido até que a cultura foi terminada.

[00181] Para o processo de cultura de ultrafiltração, as células foram cultivadas num sistema de perfusão utilizando um ultrafiltro com um tamanho de poro ou corte de peso molecular tal que o produto da proteína recombinante foi retido no retentado no biorreator de cultura de células e um permeado isento de proteína recombinante foi colhido. O produto de proteína recombinante retido foi recuperado como uma colheita do biorreator, quando a cultura foi terminada. Processo de Colheita de Cultura Periódica Extendida (X-PH)

[00182] No dia 0, as células CHO que expressam um anticorpo recombinante foram inoculadas em dois biorreatores de 2 L (Applikon, Foster City, CA) em 1 x 106 células viáveis/mL num volume de trabalho de 1500 ml de um meio de lote-quimicamente definido isento de soro. As culturas foram mantidas a 36 °C, fazemos em 48,0 mmHg, agitação a 350 RPM.

[00183] As culturas de células foram iniciadas no modo de lote, a perfusão foi iniciada no dia 2 utilizando uma ATF-2TM alternando sistema de filtração de fluxo tangencial (Refine Technologies, Hanover, NJ), utilizando um filtro de 30 centímetros de 30 kDa de fibra oca (Xampler UFP-30-E-4 mA, GE Healthcare, Pittsburg, PA), ligado em série com um filtro de 30 centímetros de 750 kDa de fibra oca (Xampler UFP-750-E-4 mA, GE Healthcare). Os filtros foram unidos com uma longa peça de ligação de carretel sanitário de aproximadamente 1 polegada utilizando braçadeiras sanitárias. O meio foi um meio de perfusão quimicamente definido isento de soro, contendo 1,5 g/L plurônico (Kolliphor P188 SAFC Biosciences, ST. Louis, MO).

[00184] A taxa de perfusão foi aumentada gradualmente de de volume de trabalho de biorreator de 0,5 a 1,0/ dia através da execução de cultura de células e foi uniforme através da unidade de filtro. Permeados nulos e colheita foram recolhidas, por meio de bombas de perfusão independentes, com a mesma taxa que a taxa de perfusão. Amostras diárias foram tomadas a partir do biorreator para avaliar a cultura. Densidade viável de células (VCD) e viabilidade foram determinadas utilizando Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA). Título foi medido por análise de HPLC.

[00185] Para a análise de glicano, amostras contendo proteína foram recolhidas e purificadas por proteína A. As amostras purificadas foram tratadas com PNGase-F e incubadas a 37 °C durante 2 horas para liberar os glicanos N-ligados. Os glicanos enzimaticamente liberados foram marcados com ácido 2-aminobenzóico (2-AA) a 80 °C durante 75 minutos. Rótulo 2-AA em excesso foi então removido com um cartucho Glycoclean S. As amostras foram evaporadas durante a noite e o sedimento seco resultante foi reconstituído com água para subsequente análise HILIC (cromatografia de interação líquida hidrófila). Os glicanos foram injetados e ligaram à coluna em condições orgânicas elevadas e eluidos com um gradiente crescente de um tampão de formiato de amônio aquoso. A detecção da fluorescência foi utilizada para monitorizar a eluição de glicano e a percentagem relativa das maiores e menores espécies de glicano foi calculada.

[00186] Antes do dia 11, permeado nulo, ou não-produto que contenha permeado, foi continuamente recolhido por desenhar o permeado do ultrafiltro de 750 kDa utilizando uma bomba peristáltica (Watson Marlow 120U/DV Falmouth, Cornualha, Reino Unido) e foi descartado. Devido ao tamanho do filtro, o produto da proteína da cultura de células foi retido no retentado no biorreator de cultura de células.

[00187] Permeado de colheita, ou que contêm o produto permeado, foi recolhido a cinco vezes predeterminadas separadas durante a execução de cultura de células, de acordo com o calendário apresentado na Tabela 1. O permeado de colheita foi recolhido por desenhar o permeado do micro- filtro de 30 kDa utilizando uma bomba peristáltica (Watson Marlow 120U/DV Falmouth, Cornwall, Reino Unido). O produto da proteína da cultura de células foi realizada no permeado e recolhidas como parte do permeado de colheita. O permeado de colheita foi avaliado quanto ao título e qualidade do produto, como descrito acima. O permeado de colheita foi armazenado em sacos de permeado (RCBB-300, a RIM Bio Inc., Seattle, WA). Tabela 1 Programação de recolha de permeado de colheita

[00188] Imediatamente após a conclusão da recolha da cada um dos permeados de colheita, permeado nulo foi de novo continuamente recolhido a partir do filtro de ultrafiltro de 750 kDa e descartado. A cultura foi encerrada após a colheita do permeado de colheita no dia 24.

Processo de Cultura de Ultrafiltro (UF)

[00189] No dia 0, as células CHO que expressam um anticorpo recombinante foram inoculadas em dois biorreatores de 2L (Applikon, Foster City, CA) em 1 x 106 células viáveis/mL num volume de trabalho de 1500 ml de um meio de lote definido isento de soro. As culturas foram mantidas a 36 °C, fazemos em 48,0 mmHg, agitação a 350 RPM.

[00190] As culturas de células foram iniciadas no modo de lote, a perfusão foi iniciada no dia 2 utilizando uma ATF-2TM alternando sistema de filtração de fluxo tangencial (Refine Technologies, Hanover, NJ), equipado de um filtro de fibra oca de 60 kDa (Xampler UFP-30-E-4 mA, GE Healthcare, Pittsburg, PA). O meio foi um meio de perfusão quimicamente definido isento de soro, contendo 1 g/L plurônico (Kolliphor P188 SAFC Biosciences, ST. Louis, MO).

[00191] A taxa de perfusão aumentou gradualmente de 0,5 a 1,0 volume de trabalho/dia durante a execução de cultura de células. As amostras foram retiradas diariamente para avaliar a cultura. Densidade viável de células (VCD) e viabilidade foram determinadas utilizando Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA). Título foi medido por análise de HPLC.

[00192] Permeado foi recolhido na mesma taxa que a taxa de perfusão. Devido ao tamanho do filtro, o produto da proteína da cultura de células foi retido no retentado no biorreator de cultura de células até ser colhido quando a cultura foi terminada no dia 15.

[00193] O perfil dos títulos do processo de X-PH foi consistente com o título a partir do processo de UF cultura até ao dia 11 (Figura 2). Os perfis de titulação separados quando o primeiro ciclo de colheita de 750 kDa, é introduzido no processo de X-PH. Uma correspondência semelhante foi observada na densidade de células viáveis (Figura 3) e % de viabilidade Figura 4).

[00194] Um período de produção de biorreator de 51 dias foi utilizado para permitir a comparação do processo de X-PH para o processo de UF com uma reviravolta atribuída de três dias do biorreator de produção entre as execuções. Com este critério, dois processos X-PH são executados 24 dias e três execuções de processos UF seriam feitos em um período comparável de 51 dias.

[00195] O processo de X-PH forneceria 98% do produto recuperado mais em comparação com o processo de UF ao longo de um período de 51 dias de produção (Tabela 2). Este composto, principalmente, um aumento de 26% na densidade de células viáveis integradas (IVCD) e um aumento de 46% na produtividade específica. O processo de X-PH usaria 27% mais meio, em dois ensaios relativos a três execuções do processo de UF, mas isto traduz-se numa redução de ~36% do requisito médio (custo médio) por grama de produto produzido pelo processo X-PH em comparação com o processo de UF. Tabela 2. Produto recuperado ao longo de um período de fabricação de 51 dias em um biorreator de 2L com 1,5L de volume de trabalho

[00196] A qualidade do produl to do processo X-PH foi avaliada pelo processo de HILIC mapeamento de glicano e comparada com um padrão gerado utilizando o processo de UF 15 dias (Tabela 3). O processo X-PH glicano de mapa de atributos são consistentes com o padrão utilizando o processo UF. Tabela 3. Análise de Glicano HILIC

Exemplo 2

[00197] Esta experiência compara o impacto de concentrações baixas e elevadas e de copolímero em bloco de polioxipropileno- polioxietileno, Lutrol® F68, e filtros 30 kDa vs. 750 kDa em um sistema de cultura de perfusão.

[00198] No dia 0, uma linhagem de células CHO que expressam um anticorpo recombinante foi inoculada em quatro biorreatores de 2L (Applikon Biotechnology, Foster City, CA) a 2x106 células viáveis/mL em um volume de trabalho de 1500 ml de um meio de perfusão quimicamente definido sem soro contendo 1 g/L Lutrol® F68 (BASF, Mt Olive, NJ). As culturas foram mantidas a 36 °C, a concentração de oxigênio dissolvido a 48%, pH 6,9, agitação a 350 RPM.

[00199] As execuções de cultura celular foram iniciadas no modo de lote; perfusão foi iniciada no dia 2, quando as densidades das células atingiu 4-5 x 106 células/ml. A perfusão foi realizada utilizando um ATF-2TM alternando perfusão de fluxo tangencial e sistema de filtração (Refine Technologies, Hanover, NJ). A cultura de células foi continuamente circulada através do lado do lúmen de um filtro externo orientado verticalmente, que entra na extremidade superior. Permeado foi retirado de forma contínua através de uma bomba peristáltica. Dois reatores foram equipados com filtros de fibra oca de 30 kDa (Xampler UFP-30-E-4 mA, GE Healthcare, Pittsburg, PA). Dois reatores foram equipados com filtros de fibra oca de 750 kDa (Xampler UFP-750-E-4 mA, GE Healthcare, Pittsburg, PA)

[00200] A taxa de perfusão aumentou gradualmente de 0,5 a 3 mL/minuto sobre a execução de cultura de células. Amostras de permeado foram recolhidas na mesma razão que a razão de perfusão. As amostras foram colhidas uma vez por dia a partir do biorreator e a linha do permeado. A densidade celular, viabilidade e diâmetro celular foram medidos por CEDEX (Roche, Nutley, NJ), após a diluição com soluto salino tamponado com fosfato para se obter uma densidade celular de <107 células/ml. O pH e a pressão parcial de CO2 (pCO2) e O2 (pO2) foram medidos utilizando um analisador de gases no sangue; concentração de glucose, lactato, glutamina, amônia e concentrações de íons de K+ e Na+ foram mantidas por um instrumento NovaFLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA).

[00201] Em reatores equipados com o filtro de 750 kDa, a viabilidade celular diminui para 80% no Dia 6. A diminuição não foi tão acentuada nos reatores equipados com os filtros de 30 kDa em que a viabilidade foi mantida a mais de 80% durante 14 dias. (Figura 5)

[00202] Acumulação de até 7 g/L de Lutrol® F68 no sobrenadante de reatores equipados com filtro de fibra oca de 30 kDa foi observada. Sob estas condições Lutrol® F68 era inferior aos níveis detectáveis no permeado nos reatores equipados com o filtro de 750 kDa, níveis de Lutrol® F68 no sobrenadante no biorreator e permeado permaneceram relativamente constantes e semelhantes aos níveis no meio de perfusão, que vão 1 a 1,5 g/L, sugerindo que não há acumulação (Figura 6). A massa molar média de Lutrol® F68 é 8.400 Da e, teoricamente, deveria fluir através do filtro de 30 kDa. Formação de micelas de Lutrol® F68 pode ocorrer em concentrações muito menores do que 1 g/L (0,04 mM a 20 a 25°C, de acordo com o fabricante). É provável que a concentração de Lutrol® F68 foi melhorada devido à formação de micelas dentro do reator e o filtro. Os estudos de toxicidade de Lutrol® F68

[00203] Para testar o efeito de toxicidade de alta concentração de Lutrol® F68 em células, duas linhas de células CHO (Linha celular A e Linha celular e B) que expressam anticorpos monoclonais diferentes foram realizados ao longo de 10 passagens (em 3 dias/passagem), a uma densidade de sementeira inicial de 8 x 105 células/ml em frascos de agitação de 250 ml com meio de cultura celular contendo 1, 2, 3, 4 ou 5 g/L de Lutrol® F68.

[00204] Observou-se um aumento global da densidade de células (3,4-6,5 x 106 células/ml) após 3 dias. Densidade de células viáveis foi normalizada para a condição de 1 g/L para permitir a comparação entre as diferentes concentrações de Lutrol® F68.

[00205] O cultivo de células em meios contendo 3, 4 ou 5 g/L de Lutrol® F68 foram consistentemente mais elevados sobre as passagens, em que um aumento de 10% na densidade celular foi medido em comparação com a condição de 1 g/L (p <0,01) (Figura 7A). A viabilidade era também maior para as maiores culturas de Lutrol® F68 (média> 95%) (Figura 7B). Diâmetro celular também foi encontrado como tendo aumentado ligeiramente em todas as condições em comparação com a condição de 1 g/L (15,42 μM) (p <0,05) (Figura 7C). A variação da densidade de células viáveis,% de viabilidade e de diâmetro nas condições de Lutrol® F68 maiores devido à mudança de características sobre a passagem contínua.

[00206] O efeito de toxicidade de alta concentração de Lutrol® F68 em células também foi realizado em uma cultura de fed-batch (semi- descontínuo) de 2L utilizando duas linhas de células CHO que expressam anticorpos monoclonais. Mais uma vez, não houve impacto de alto Lutrol® F68 na densidade de células viáveis, a viabilidade, diâmetro ou título das células (Figura 8). Completando culturas de perfusão ATF com 5 g/L Lutrol® F68

[00207] Uma experiência comparando 1 g/L e 5 g/L Lutrol® F68 foi realizada. No dia 0, uma linha de células CHO que expressa um anticorpo recombinante foi inoculada em seis biorreatores de 2 litros (Applikon Biotechnology, Foster City, CA) a 2 x 106 células viáveis/ml num volume de trabalho de 1500 ml. Dois reatores receberam um meio de perfusão definido isento de soro contendo 1 g/L de Lutrol® F68 e dois reatores receberam um meio de perfusão definido isento de soro contendo 5 g/L de Lutrol® F68. As culturas foram mantidas a 36 °C, a concentração de oxigênio dissolvido a 48%, pH 6,9, agitação a 350 RPM.

[00208] Ensaios de cultura celular foram iniciados no modo de lote; perfusão foi iniciada no dia 2. A perfusão foi realizada utilizando um ATF- 2TM alternando sistema de filtração de fluxo tangencial (Refine Technologies, Hanover, NJ), equipados com filtros de fibra oca de 750 kDa (Xampler UFP-750-E-4 mA, GE Healthcare, Pittsburg, PA). A taxa de perfusão foi de 3 volumes de trabalho/dia.

[00209] As amostras foram colhidas uma vez por dia a partir do biorreator e da linha do permeado e foram testadas como descrito acima.

[00210] O aumento da concentração de Lutrol® F68 para 5g/L resultou em numa viabilidade estendida de >95% por 14 dias e >90% até o dia 25 (Figura 9). Recuperação de culturas com baixa concentração de Lutrol® F68 com alto teor de Lutrol® F68

[00211] No dia 0, uma linhagem de células CHO que expressa um anticorpo recombinante foi inoculada em quatro biorreatores de 2L (Applikon Biotechnology, Foster City, CA) a 2 x 106 células/ml num volume de trabalho de 1500 ml. Ensaios de cultura celular foram iniciados no modo descontínuo; perfusão foi iniciada no dia 2. A perfusão foi realizada utilizando um ATF-2TM alternando sistema de filtração de fluxo tangencial (Refine Technologies, Hanover, NJ), equipados com filtros de fibra oca de 750 kDa (Xampler UFP-750-E-4 mA, GE Healthcare, Pittsburg, PA). Os reatores foram divididos em dois grupos de dois, cada grupo recebendo uma formulação do meio de cultura de células de perfusão diferente (Meio A e Meio B). Ambas as formulações do meio continham 1 g/L de Lutrol® F68. As culturas foram mantidas a 36 °C, a concentração de oxigênio dissolvido a 48%, pH 6,9, agitação a 350 RPM. As culturas foram mantidas sob estas condições até a viabilidade celular por cento cair para 80%. Nesse momento, os meios para ambos os grupos foram complementados com um adicional de 4g/L de Lutrol® F68 (para um total de 5g/L). As culturas foram mantidas sob estas condições de alto teor plurônico até o dia 30. A recuperação da viabilidade celular pela adição de uma concentração mais alta de Lutrol® F68 é mostrada na Figura 10. Após a complementação, a viabilidade percentual aumentou até 15%. O efeito protetor da maior concentração plurônica em uma cultura com viabilidade celular em declínio era evidente independentemente da formulação dos meios de cultura celular.

Exemplo 3

[00212] Este experimento demonstra a aplicação em escala piloto bem sucedida de qualidade múltipla pela designação (QbD) de elementos em um processo PAC para distribuir um perfil de produto alvo de qualidade predefinida (QTPP). O CQA controlado neste experimento era glicosilação N-ligada de alta manose no domínio Fc de um anticorpo monoclonal ("alta manose").

[00213] O nível de alta manose no produto foi controlado pela adição ou remoção da manose (o nível de controle) aos meios de cultura celular. No entanto, precursores de metabólitos, inibidores metabólicos, moléculas pequenas, cofatores enzimáticos e promotores induzíveis também podem ser usados. Estudos recentes mostraram que diferentes açúcares podem impactar o nível de alta manose em um produto de anticorpo. Especificamente, mostrou-se que a introdução de manose aumenta o nível de alta manose sem impactar a produtividade da cultura. Por meio de estudos empíricos, uma compreensão do impacto da concentração de manose nos meios de cultura celular em níveis de alta manose com IgG foi desenvolvida e a relação ao processo de cultura celular foi estudado. O conhecimento obtido a partir de estudos de pequena escala e uma execução de produção de treinamento em escala piloto foi incorporado para desenvolver um algoritmo PAC com base no princípio de Controle de Modelo Preditivo (MPC). MPC é um esquema de controle no qual um modelo matemático do processo é usado para predizer sua trajetória futura. A natureza transitória de um processo de biorreator CHO típico, a probabilidade de interações entre múltiplos CQAs e seus níveis de controle, e os atrasos associados a análises complexas fornecem forte motivação para MPC. Tecnologias PAT, incluindo análises de espectrometria de massa quase em tempo real combinadas com o monitoramento do biorreator padrão foram usadas para fornecer dados em tempo para informar o modelo usado para MPC. Os dados provenientes de múltiplos ensaios foram incorporados no sistema MPC que determinou a quantidade de manose a ser adicionada ao biorreator para manter o CQA de alta manose dentro do intervalo alvo. Razões de ensaio de placa de cultura celular entre glicose e manose:

[00214] A linhagem celular foi uma linhagem de células CHO recombinante que expressam um anticorpo monoclonal. As células foram semeadas em 7,5e5 células/mL em meio quimicamente definido (CD) contendo 12 g/L de glicose em um volume de trabalho de 2 mL em placas de poços profundos. As células foram incubadas em um agitador orbital a 36,0°C e 5% CO2 a 220 rpm (diâmetro orbital de 50 mm). Nos dias 3-4, a concentração de glicose foi medida através de um Ensaio de Placa de Reagente de Glicose Poliquímico (MedTest DX, Canton MI) e as culturas centrifugadas para substituir 26% do meio gasto com meio CD fresco. Do mesmo modo, no dia 5, 100% do meio gasto foi substituído por meio CD fresco que não continha glicose. A concentração total de hexose foi posteriormente ajustada para 10 g/L usando razões diferentes entre glicose e manose pela adição de soluções-mãe concentradas de hexose. As células foram deixadas crescer por 24 horas. Os sobrenadante foram removidos, a IgG foi purificada e o % de alta manose foi medido por um ensaio de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC). Ensaio de hexose GC-MS

[00215] As concentrações de glicose e manose foram quantificadas nos meios de cultura celular por GC-MS. Uma amostra de 1 mL de cultura de células foi centrifugada para peletizar as células e o sobrenadante foi filtrado (0,2 μM). O sobrenadante filtrado foi diluído 1 em 10 em água DI e 10 μL desta diluição foram adicionados a um tubo de centrífuga de 1,5 μL. Uma alíquota de 5 μL de uma solução padrão interna de hexose foi adicionada contendo 10mM de D-[UL-13C6]manose 99,9% (Omicron Biochemicals) e 10mM de D-[U-13C6]glicose 99,9% (Cambridge Isotope Labs). A amostra foi seca (SpeedVac) durante 30 min. Hexoses foram derivadas pela adição de 20 μL de piridina anidra e 30 μL de N-metil-N- (trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA) com 1% de trimeticlorossilano (TMCS) incubado a 40°C por 30 min. Imediatamente após a derivação, as amostras foram analisadas em um sistema Agilent GC 6890N MSD 5973. Uma amostra de 1 μL foi injetada em uma coluna Agilent DB-35 GC (30m x 0,32 mm x 0,25 um) com uma divisão de 1 em 50. Hélio foi mantido a um fluxo constante de 1 mL/min. A temperatura do forno foi mantida a 190°C por 2 min e aumentada até 202°C a uma taxa de 4°C/min.

[00216] A temperatura foi ainda aumentada para 280°C a uma taxa de 60°C/min. O tempo de execução total foi de 6,3 min. Cada hexose gerou dois picos representando as formas isoméricas aberta e fechada. A manose foi eluída em 2,7 min e 3,34 min; a glicose foi eluída em 3,5 min e 4,18 min (Figura 11(A)). A área de pico de 3,34 min foi usada para a quantificação da manose e o pico de 4,18 min para a quantificação de glicose. As hexoses foram quantificadas usando os fragmentos de carboidratos TMS característicos m/z = 20416 e diluição de isótopo padrão onde a área de pico m/z = 204 do açúcar 12C foi comparada à área de pico m/z = 206 do açúcar 13C (Figura 11 (B)).

Ensaio MS-PAT de proteólise limitada IdeS (FabRICATOR®)

[00217] As amostras dos meios de cultura celular filtradas foram analisadas sem purificação adicional. Aproximadamente 60 μg de cada amostra foram digeridos com 60 unidades da enzima IdeS (fabRICATOR, Genovis, Lund, Suécia) a 37°C por 30 minutos. As amostras digeridas foram então reduzida em 4M de cloridrato de guanidina com 50mM de ditiotreitol (DTT) a 55°C por 10 minutos. Em seguida, as amostras digeridas e reduzidas foram analisadas por RP-HPLC/MS.

[00218] A análise de RP-HPLC/MS foi realizada usando cromatografia líquida de ultra eficiência Waters Acquity (UPLC) (Milford, MA) acoplada a um espectrômetro de massa de tempo de vôo (TOF) Agilent MST (Santa Clara, CA). As amostras preparadas foram separadas em uma coluna de fenil Waters BEH de fase reversa (1,7 μm, 2,1 x 150 mm; Milford, MA) mantidas a 80 °C. Os picos foram monitorados por UV a 220 nm e TOF-MS. Os dados de massa foram extraídos da corrente de íons total (TIC) dos picos, seguido pela desconvolução e quantificação usando o software Agilent MassHunter. Ensaio de Mapeamento de Glicano por Cromatografía de Interação Hidrofílica (HILIC)

[00219] 100 μg de anticorpo purificado foram digeridos com PNGase F (New England Biolabs) seguido pela adição de 50 μL de solução de marcação fluorescente contendo 12 mg/mL de ácido 2-aminobenzoico (2AA) com 0,04 M de cianoborohidreto de sódio Esta mistura foi incubada a 80 °C por 75 minutos. Os glicanos marcados foram analisados por Acquity UPLC equipado com um detector fluorescente (Milford, MA). Aproximadamente 3 μL de glicanos marcados foram injetados em uma coluna de glicano Acquity UPLC BEH (# 186004741, Milford, MA) seguido pelo detector de fluorescência usando uma emissão em 360 nm e detecção a 425 nm. As espécies de glicano marcadas com 2AA foram identificadas pela técnica MS/MS.

[00220] A geração de dados para ajustar os parâmetros do modelo e a subsequente demonstração de MPC para o controle do % de alta manose foram realizados em biorreatores. A manose (Sigma, M6020) foi adicionada no primeiro dia de cultura a uma concentração de cultura de 1 g/L usando uma solução-mãe a 25%. A perfusão foi iniciada no dia dois da cultura. Os meios de perfusão foram distribuídos em volumes crescentes de 0,5 a 1,0 volume de biorreator por dia. O biorreator foi controlado usando a automação Delta V (Emerson). A amostragem no biorreator foi realizada a cada quatro horas usando a válvula de autoamostragem MAST SP200 (Bend Research) para medições da titulação, hexose e produto glicano. Após a coleta automatizada das amostras, as amostras foram centrifugadas manualmente e 0,2 um foram filtrados para remover células e debris. As amostras diárias para medições de crescimento, viabilidade, osmolalidade e lactato foram coletadas manualmente ou usando o MAST SP200. A densidade de células viáveis (VCD) e a viabilidade % da cultura foram medidas usando um Nova CDV (Nova Biomedical). As concentrações de lactato foram determinadas usando um analisador Nova Bioprofile Basic (Nova Biomedical). Controle de Modelo Preditivo

[00221] A programação para o Controle de Modelo Preditivo (MPC) e para o ajuste dos parâmetros do modelo foram feitas em MATLAB (versão R2014a, Mathworks) e o código está disponível nos materiais complementares. Os parâmetros do modelo foram determinados pela regressão dos mínimos quadrados das equações modelo para dados de uma única execução de reator de treinamento. Para o controle da alta manose pela introdução de manose (através de MPC), cada alteração de taxa diária foi calculada através das seguintes etapas: 1. Cálculo de equivalência de modelo atual. O histórico operacional do reator combinado com os valores medidos diários (se disponíveis) foram usado como entradas para gerar uma solução numérica das equações diferenciais do modelo. A diferença entre o modelo e a medição mais recente pode estão ser calculada. Esta diferença foi usada como uma estimativa da equivalência futura. Hk - valor do modelo no momento k = f(tk) H’k = valor medido no momento k Hk+1 = valor previsto ajustado no momento k+1=F(tk+1) + (Hk-H’k) 2. Determinação das taxas futuras ideais através de MPC. O método17 de horizonte de regressão de MPC padrão foi usado em cada dia uma vez que o controle foi iniciado. O conjunto ideal de cinco alterações de taxa foi determinado pela minimização da soma do erro quadrático entre o perfil de qualidade do produto previsto pelo modelo e o ponto de ajuste alvo. Embora cinco alterações de taxa tenham sido calculadas, apenas a primeira foi usada. NO momento em que a alteração da taxa seguinte deveria ser implantada, novos dados ficaram disponíveis , que foram então usados para recalcular o conjunto ideal das taxas futuras.

[00222] A taxa de introdução de manose foi obtida tratando-se a mesma como a variável independente na minimização da função objetiva (que, neste caso, é a soma dos quadrados da diferença entre o nível de alta manose desejado na molécula e aquele encontrado através da integração das equações diferenciais dominantes). As equações acima se comportam suficientemente bem de modo que a solução obtida pelos agentes de resolução do MATLAB fosse suficiente para o controle de +/- 1% das espécies de alta manose no anticorpo. O método para controlar a alta manose é unilateral em que a adição de manose no reator aumenta o % de alta manose no anticorpo. A redução do % de produção de alta manose é obtido pela redução da concentração de manose (pela diluição através da perfusão após a diminuição da taxa de introdução da manose).

Quntificação da Hexose por GC-MS

[00223] A quantificação em tempo real da manose era uma entrada necessária para o MPC. GCMS foi usado para distinguir as hexoses (manose e glicose) nos meios de cultura celular. As hexoses foram quantificadas por diluição de isótopo conforme descrito acima. A Figura 11 (A) mostra a separação da base de referência por GC de manose e dos meios de cultura celular durante uma execução típica. A Figura 11 (B) mostra o padrão de fragmentação da hexose (idêntico entre manose e glicose), onde o pico de m/z 204 foi quantificado usando o pico de m/z 206 do padrão interno marcado com 13C. O limite de detecção para a glicose e para a manose foi de 0,02 g/L e a linearidade foi demonstrada para a quantificação até 6 g/L de hexose (Figura 11(C)). Razões de ensaio de placa de cultura celular entre glicose e manose

[00224] As células foram cultivadas com 10 g/L constante de hexose total mas aumentando-se a concentração de manose para gerar as razões de glicose:manose de 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8 e 0:10. As células foram cultivadas durante 24 horas com as diferentes razões de hexose. Os sobrenadantes foram removidos, a IgG foi purificada e o % de alta manose foi medido pelo ensaio de HILIC. A Figura 12 (A) mostra uma relação linear entre a concentração de manose no meio de cultura celular e o nível total de alta manose, onde a alta manose foi a menor em 10% nos meios contendo apenas glicose e a maior em 37% nos meios contendo apenas manose.

[00225] Para estabelecer se o aumento da alta manose foi devido ao aumento da concentração do açúcar manose ou à diminuição da concentração do açúcar glicose, as células foram cultivadas assim como para o primeiro experimento em placas, com a exceção do dia 5, onde os meios foram trocados por meios frescos contendo 1, 3, 5, 7 ou 10 g/L de manose. Cinco concentrações diferentes de glicose (1, 3, 5, 7 ou 9 g/L) foram adicionadas a cada uma das culturas contendo manose. Isto foi feito para um total de 25 culturas diferentes com a menor quantidade de hexose total sendo 2 g/L (1 gm/L de glicose e 1 gm/L de manose; Figura 12(B)) e a maior de 19 g/L (9 gm/L de glicose e 10 gm/L de manose; Figura 12(B)). As células foram deixadas crescer por 24 horas. Os sobrenadantes foram então removidos, a IgG foi purificada e o % de alta manose foi medido pelo ensaio de HILIC. A Figura 12 (B) indica que o aumento linear da alta manose é independente da concentração de glicose e dependente apenas da concentração de manose nos meios. Esta relação foi usada para desenvolver um ciclo de controle de MPC. Desenvolvimento de Ciclo de Controle: Controle de Modelo Preditivo

[00226] Para o desenvolvimento do ciclo de controle, o biorreator foi conectado ao dispositivo de amostragem automatizado MAST SP200 e uma bomba de introdução de solução de manose além dos controles do biorreator de rotina e das análises off-line (Figura 13). Uma execução de biorreator de perfusão de 15 dias foi realizada para gerar dados de treinamento para desenvolver o ciclo de feedback de MPC para o controle unilateral da alta manose usando introduções de manose. Os dados para o % de alta manose (Figura 14(A)), concentração de manose no reator (Figura 14(B)), crescimento de células (Figura 14(C)) e acúmulo dos títulos (Figura 14(D)) foram coletados em intervalos de tempo de 4 horas com a exceção dos dados de glicano que não foram coletados durante os dias 911. O modelo de MPC foi desenvolvido a partir deste conjunto de dados, com exceção dos parâmetros de crescimento que, devido a um erro, foram calculados a partir de uma execução similar. As previsões do modelo usando ambos os conjuntos de parâmetros de crescimento são mostradas na Figura 14 e são praticamente idênticas. Desenvolvimento do Ciclo de Controle: Equações Modelo

[00227] As equações diferenciais ordinárias foram construídas para descrever a taxa de alteração do número de células, produto, concentração de manose, e espécies de alta manose.

[00228] Aqui N é a densidade celular, μ é a taxa de crescimento máximo, e Nm é a densidade celular máxima. A densidade celular pode ser de células/volume ou volume celular/volume. Neste trabalho, um volume calculado e de escala arbitrária foi calculado a partir da contagem de células e do diâmetro medido no Nova CDV. Para titulação, a produtividade específica foi assumida como sendo constante e a retenção variável de produto (que depende do filtro de perfusão usado) é responsável:

[00229] Pela concentração do produto ser P, e qp ser a produtividade específica. S ser o coeficiente de permeabilidade que é a fração do produto que passa através do filtro de perfusão, e D ser a taxa de perfusão em volumes no reator/dia. A taxa de variação de manose

[00230] A concentração de manose no reator é M, Mf é a concentração eficaz de manose no meio de perfusão e qM é a taxa de consumo de manose específico. A taxa de consumo de manose como assumida para seguir a cinética de Michaelis-Menton:

[00231] A taxa de reação máxima é VM e KM é a constante de Michaelis-Menton. Os dados a partir das placas de cultura de células sugeriram que a taxa relativa da produção de espécies de alta manose era proporcional à concentração de manose (Figura 12 (B)):

[00232] Aqui H é a concentração de espécies de alta manose e FH é o fator de proporcionalidade de alta manose. A exame dos dados anteriores (não mostrados) sugeriram que FH variaram com a densidade celular de modo que a seguinte equação puramente empírica foi usada para FH:

[00233] K1 e K2 são constante empíricas. Finalmente, a taxa de alteração de alta manose é obtida através da regra de cadeia:

[00234] Todos os parâmetros do modelo foram determinados através de regressão dos mínimos quadrados dos dados de treinamento mostrados na Figura 14. Os parâmetros foram obtidos pelo ajuste do perfil de crescimento celular mostrado na Figura 14(C). O valor para qp foi obtido pelo ajuste da curva de titulação mostrada na Figura 14(D). O declínio na titulação após do dia 12 é devido à troca de uma membrana de ultrafiltração (para a qual o coeficiente de permeabilidade, S, é zero) para uma membrana de microfiltração (que gerou um coeficiente de permeabilidade no intervalo de 0,76 a 0,78). Os parâmetros restantes foram obtidos pelo ajuste dessas equações aos dados na Figura 14(A) e Figura 14(B) simultaneamente.

[00235] Os valores dos parâmetros usados no modelo e os seus limites de confiança de 95% estão apresentados na Tabela 4. Os valores numéricos dos parâmetros do modelo e limites de confiança foram obtidos a partir dos dados de treinamento e usados para MPC. Os gráficos do ajuste de modelo resultante aos dados de treinamento são mostrados na Figura 14(linhas tracejadas A-D), enquanto os ajustes com os parâmetros de crescimento usados para MPC são as linhas pontilhadas. O ajuste de parâmetro para a constante de Michaelis Menton de manose, KM, é muito maior do que as concentrações usadas de modo que a cinética do consumo de manose era efetivamente de primeira ordem. Os dados de treinamento e a subsequente demonstração de MPC foram realizados sob condições idênticas com a exceção da concentração de manose que servia como o nível de controle para a alta manose. Tabela 4. Os valores numéricos dos parâmetros do modelo e limites de confiança foram obtidos a partir dos dados de treinamento e usados para MPC.

Demonstração de MPC para controle do nível de alta manose

[00236] Posteriormente à derivação dos valores de parâmetros, o ciclo de feedback foi usado em uma execução de biorreator para controlar ativamente o % do nível de alta manose para 6% +/- 1% para o anticorpo A. A perfusão e a introdução de manose foram iniciadas no dia 2 da cultura de produção. A introdução inicial de manose foi definida a uma taxa que manteria sua concentração aproximadamente constante no reator. Esta taxa de introdução inicial de manose foi estimada com base na experiência prévia com o processo e não era parte do ciclo de controle. O ciclo de controle foi iniciado no dia 5 da produção. As amostras foram colhidas diariamente e analisadas para determinar as entradas no modelo de MPC. A defasagem entre a amostra do reator e a alteração da taxa variou entre 5 e 14 horas com uma média de 8,5 horas. Uma vez que todos os dados necessários estavam disponíveis, eles foram inseridos manualmente no modelo MATLAB para calcular a próxima taxa de introdução de manose. A trajetória resultante do % de alta manose, as outras quantidades modeladas, e as concentrações de introdução com base em MPC (calculada a partir das taxas de introdução) são mostradas na Figura 15. Uma vez que o controle foi iniciado, o % de alta manose medido e modelado aumentou rapidamente e foi mantido dentro de 1% dos 6% alvo (Figura 15(A)). Os perfis de concentração de manose medidos e modelados aumentaram e diminuíram conforme o esperado em resposta à introdução de manose (Figura 15(B)). O crescimento celular seguiu em grande medida a curva logística assumida com exceção dos desvios relativamente significativos nos dias 6 e 12 (Figura 15 (C)). A titulação medida correspondia ao modelo embora as descontinuidades nos últimos dias de cultura estivessem evidentes que o modelo estava sob a produção de proteína estimada (Figura 15(D)). O ajuste do estado do modelo MPC para corresponder às medições permitia o bom controle de alta manose apesar dos desvios observados. Na Figura 16, uma comparação entre o processo PAC e as execuções de planta de piloto histórico é mostrada. As execuções históricas foram realizadas usando um processo convencional que é similar no design e no desempenho ao processo PAC, mas sem o ciclo de controle ativo. Em vez disso, o processo convencional é dependente de parâmetros de processo estáticos para executar dentro de uma margem de erro para cada lote para distribuir o produto desejado, que precisará passar pelo controle de qualidade para a deposição. Com o processo PAC, PQ é medido quase em tempo real e, devido ao controle ativo durante a execução de produção, não necessitará de caracterização subsequente antes da deposição.

Claims

1. Método para uma colheita periódica prolongada caracterizado por compreender: estabelecer uma cultura de células por inoculação de um biorreator com células de mamíferos que expressam uma proteína recombinante, manter a cultura de células por perfusão do meio fresco de cultura de células no biorreator, passando a cultura de células através de um filtro e coletando um permeado, em que o permeado nulo é coletado usando um filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte que retém a proteína recombinante no biorreator, em que quando o permeado nulo é coletado, as células hospedeiras e as proteínas recombinantes expressas permanecem no retentado do biorreator, em que o permeado de colheita é coletado usando um filtro de fibra oca com um tamanho de poro ou peso molecular de corte que não retém a proteína recombinante no biorreator, em que quando o permeado de colheita é coletado, as células hospedeiras são retidas no biorreator e as proteínas recombinantes expressas passam para o permeado; em que um permeado nulo é inicialmente coletado até um primeiro parâmetro predeterminado ser atingido, em cujo momento um permeado da colheita é coletado por um tempo predeterminado, o permeado de colheita compreendendo uma proteína recombinante, isto é seguido pela coleta alternada de um permeado nulo até um segundo parâmetro predeterminado ser atingido, coletando, em seguida, um permeado da colheita por um tempo predeterminado, em que a coleta alternada do permeado nulo e do permeado da colheita continua até a cultura de células ser encerrada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o parâmetro predeterminado ser selecionado dentre tempo, densidade de células viáveis, volume ou título de concentrado de células.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o primeiro parâmetro predeterminado ser de pelo menos 12 horas a 25 dias após o estabelecimento da cultura de células.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segundo parâmetro predeterminado ser de pelo menos 12 a 72 horas após a coleta do permeado da colheita.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o tempo predeterminado ser de pelo menos 12 a 72 horas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, quando o permeado nulo é coletado, o filtro é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que retém a proteína recombinante no biorreator.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, quando o permeado da colheita é coletado, o filtro é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que não retém a proteína recombinante no biorreator.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o filtro ser um sistema de filtro de unidade única.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, quando o permeado é coletado de um filtro que é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que não retém a proteína recombinante no biorreator, o meio fresco de cultura de células é formulado com ou complementado para atingir pelo menos 5 g/L de um copolímero em bloco não iônico.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda retirar amostras durante os processos de cultura de células, avaliar as amostras para monitorar quantitativa e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e/ou os processos de cultura de células.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a perfusão ser uma perfusão contínua.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a perfusão ser realizada em uma taxa menor ou igual a 1,0 de volume de trabalho por dia.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a perfusão ser realizada por uma bomba peristáltica, uma bomba de diafragma duplo, uma bomba de baixo cisalhamento ou fluxo tangencial alternado.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda submeter a cultura de células a uma mudança de temperatura, em que as células são cultivadas a) em uma primeira temperatura por um primeiro período de tempo e b) em uma segunda temperatura por um segundo período de tempo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a mudança de temperatura ser em resposta a um parâmetro predeterminado, em que atingir um parâmetro predeterminado é determinado usando uma sonda de biomassa baseada na capacitância.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cultura de células ser estabelecida pela inoculação do biorreator com pelo menos 0,1 x 106 de células viáveis/mL.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as células de mamífero serem células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína recombinante ser selecionada do grupo consistindo em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, uma proteína de fusão recombinante, ou uma citocina.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína recombinante ser purificada do permeado da colheita por um ou mais dentre floculação, precipitação, centrifugação, filtração por profundidade, cromatografia de afinidade, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca aniônica de modo misto, cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia em hidroxiapatita.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender ainda a retirada de amostras durante o processo de purificação, avaliação das amostras para monitorar quantitativa e/ou qualitativamente as características da proteína recombinante e do processo de purificação.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por as amostras serem quantitativa e/ou qualitativamente monitoradas usando técnicas analíticas de processo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a proteína recombinante ser formulada em uma formulação farmaceuticamente aceitável.

23. Sistema de filtro de unidade única caracterizado por compreender dois ou mais componentes de filtro de fibra oca de diferentes tamanhos de poros ou níveis de corte de peso molecular, em que os componentes de filtro de fibra oca são presos uns aos outros em série, tal que um caminho de fluxo estéril é mantido entre as fibras ocas individuais e os componentes de filtro de fibra oca de diferentes tamanhos de poros ou níveis de corte de peso molecular são isolados uns dos outros em relação a seus lados de cápsula oca a partir do qual o permeado é retirado, tal que o permeado possa ser removido independentemente de cada componente de filtro de fibra oca respectivo.

24. Sistema de filtro de unidade única, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por pelo menos um componente de filtro de fibra oca ter um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que retém a proteína recombinante no biorreator e pelo menos um componente de filtro de fibra oca ter um filtro com um tamanho de poros que é um filtro de fibra oca com um tamanho de poros ou nível de corte de peso molecular que não retém a proteína recombinante no biorreator.

25. Sistema de filtro de unidade única, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o sistema de filtro de unidade única estar contido em um compartimento.

26. Sistema de filtro de unidade única, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por compreender ainda um espaçador entre pelo menos dois dos componentes de filtro de fibra oca.

27. Método para cultivo de células que expressam uma proteína recombinante caracterizado por compreender: estabelecer uma cultura de células por inoculação de um biorreator com células de mamíferos que expressam uma proteína recombinante, manter a cultura de células por perfusão do meio fresco de cultura de células no biorreator, passando a cultura de células através de um sistema de filtro de unidade única, conforme definido na reivindicação 26, e coletando um permeado, em que o sistema de filtro de unidade única é fixado ao biorreator e a cultura de células é retirada do biorreator e posta no sistema de filtro de unidade única por um sistema de bombeamento único, em que a cultura de células passa através do lado do lúmen das fibras ocas do sistema de filtro de unidade única e volta para dentro do biorreator e um permeado é retirado de um ou mais dos componentes de filtros de fibra oca.