EA008353B1

EA008353B1 - Рекомбинантные антитела и фрагменты, узнающие n-гликолил gm3 ганглиозид и их применение в диагностике и лечении злокачественных опухолей

Info

Publication number: EA008353B1
Application number: EA200501653A
Authority: EA
Inventors: Лоудес Татьяна Роке Наварро; Кристина Мария Матео Де Акоста Дель Рио; Мабель Родригес Гонсалес; Гертрудис РОХАС ДОРАНТЕС; Арьель Талавера Перес; Эрнесто Морено Фриас
Original assignee: Сентро Де Инмунология Молекулар
Priority date: 2003-04-23
Filing date: 2004-04-22
Publication date: 2007-04-27
Also published as: AU2004232391A1; TNSN05274A1; CL2004000843A1; JP2006524194A; RS51853B; HUE025266T2; ZA200509457B; EP1623997A1; ES2535813T3; CA2523449A1; RS20110319A3; GEP20084476B; CR8105A; AR044076A1; KR20060006937A; LT5353B; PE20050422A1; LV13427B; CU23403A1; AU2004232391B2

Abstract

Настоящее изобретение преимущественно относится к моноклональным антителам, распознающим антигены, содержащие ганглиозид N-гликолил GM3, не распознающим другие ганглиозиды N-гликолил или N-ацетил класса или сульфатированные гликолипиды. Более конкретно, настоящее изобретение относится к пептидным последовательностям, кодирующим рекомбинантное моноклональное антитело, полученное из антитела 14F7, которое распознает ганглиозид N-гликолил GM3, или к фрагментам, полученным из него, и к фармацевтическим композициям, содержащим указанное рекомбинантное антитело или его фрагменты, и к их применению в диагностике или лечении рака молочной железы и меланомы

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области иммунологии, и в частности к получению менее иммуногенных иммуноглобулинов, с применением технологий генной инженерии, которые могут использоваться при лечении рака. Конкретно, настоящее изобретение относится к пептидным последовательностям, кодирующим моноклональные антитела или их фрагменты, которые распознают антигены, содержащие Ν-гликолилганглиозид ОМ3 ганглиозид, не распознают другие связанные ганглиозиды, такие как Ν-гликолил или Ν-ацетил, и сульфатированные гликолипиды.

Уровень техники

Ганглиозиды представляют собой гликосфинголипиды, содержащие сиаловую кислоту. Они представлены в плазматических мембранах позвоночных (8ш11к С.Ь.М. с1 а1., Ме1Иобк Επζνιηοίοβν 179:167214, 1989). В литературе были описаны некоторые из этих молекул как ассоциированные с опухолями антигены или маркеры опухолей (Накатой 8.Н.: Сшт. Ορίη. 1ттипо1. 3:646-653, 1991), также было описано применение антител против ганглиозидов в диагностике и лечении рака (Ноид1оп Α.Ν. е1 а1., ΝΆ8 И8Л 82:1242-1246, 1985; 2Иапд 8. е1 а1., Ιηΐ. 1. Сапсег 73:42-49, 1997). Чаще всего в клетках млекопитающих сиаловые кислоты представлены Ν-ацетилом (ΝΑ^ и Ν-гликолилом (ИОс) (СогПе1б А.Р. е1 а1., Се11. Βίο1. Моподг. 10:5-50, 1982). Обычно ΝΟ не экспрессируются в нормальных тканях человека и кур, но широко распространены у других позвоночных (Ьеебеп Ρ.\ν. е1 а1., Вю1одюа1 Во1е о£ 81аИс Лс1б. ВокетЬегд Л. апб 8йепд1гипб С.Ь. (Ебк). Р1епит Ргекк, Νο\ν Уотк, 1-48, 1976, Ка^а1 Т. е1 а1., Сапсег ВекеагсИ 51:12421246, 2001). Однако в литературе было показано, что антитела против ΝΟ распознают некоторые злокачественные опухоли человека и клеточные линии опухолей (ШдакЫ Н. е1 а1., 1рп 1. Сапсег Век. 79:952956, 1988, Еикш Υ. е1 а1., ВюсИет. ВюрИук. Век. Соттип. 160:1149-1154, 1989). При раке молочной железы человека было обнаружено повышение уровня ОМ3 (ΝΟ^ ганглиозидов (Магсцнпа О. е1 а1., Сапсег ВекеагсИ 56:5165-5171, 1996), что делает эту молекулу очень эффективной в качестве мишени при лечении рака.

В патенте данной области ЕР 0972782 А1 описано мышиное моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой, и гибридома депонирована в соответствии с Будапештским соглашением под инвентарным номером ЕСАСС 98101901. Это моноклональное антитело относится к изотипу 1дО1 и образуется при иммунизации мышей Ва1Ь/с ганглиозидом N^с^М3, гидрофобно-коньюгированным с липопротеинами низкой плотности (УЙОИ) и в присутствии адъюванта Фрейнда, указанное антитело преимущественно направлено против ганглиозида ХОсСМ.! и распознает антигены, экспрессированные опухолевыми клетками молочной железы и клетками меланомы человека (Сагг Л. е1 а1., НуЬпбота 19:3:241-247, 2000). Это антитело обладает сильной цитолитической активностью в отношении клеток, несущих указанную последовательность, свойство, которое могло бы сделать его терапевтическим инструментом.

Кроме того, известно, что неоваскуляризация, индуцированная опухолями, составляет один из главных параметров в контроле опухолевого роста. Поэтому исследования направлены на поиск новых терапевтических средств, имеющих отношение к ингибированию антигенного процесса. Существуют экспериментальные доказательства эффекта антител 14Е7 на этот процесс. Указанные доказательства были обнаружены в исследованиях матриксного геля (Лпдюдепек1к. Уо1. 4, Радк. 113-121, 2001; ЛпИСапсег Век. Уо1. 18, Радк. 783-790, 1988). Матриксный гель представляет собой смесь белков базальной мембраны и экстрацеллюлярного матрикса, который окружает эндотелиальные клетки. Его значимость в процессе неоваскуляризации заключается в физиологической необходимости взаимодействия эндотелия с матриксом при развитии новых кровеносных сосудов. Также полагают, что важными маркерами этого процесса являются такие компоненты этого геля, как ламинин.

Эту модель также применяли при изучении механизмов, связанных с индуцированным опухолями ангиогенезом, что позволяет оценить фармацевтические возможности модулирования событий, непосредственно связанных с опухолью, таким образом, влияя на ее рост и метастазирование.

Применение нечеловеческих моноклональных антител, таких как мышиные 14Е7, имеет ряд недостатков при лечении человека, особенно при повторных схемах лечения. Например, мышиные моноклональные антитела обладают относительно коротким временем полужизни антитела в кровотоке. Кроме того, при применении у человека они теряют важные иммунологические свойства, такие как эффекторные функции.

И, еще более важно, мышиные моноклональные антитела содержат значительное количество аминокислотных последовательностей, являющихся иммуногенными при введении человеку. Многочисленные исследования показали, что после введения чужеродного антитела вызванный иммунный ответ у пациента может быть значительно сильнее и, по существу, элиминирует терапевтический эффект антитела после первоначального введения. Кроме того, даже после лечения пациента мышиными моноклональными антителами последующее лечение неродственными мышиными антителами могло бы быть неэффективным или даже опасным вследствие возникновения перекрестной реакции, известной как ответ НАМА (КИи-иаей. М.В., е1 а1., 1оитпа1 о£ 1ттипо1Иетару 15:42-52, 1994).

Ма1ео е1 а1. (патент США № И8 5712120) описали способ снижения иммуногенности мышиных антител. Антитело, модифицированное способом, описанным Ма1ео е1 а1. (Ма1ео С. е1 а1., НуЬпбота 19:6:463-471, 2000), сохраняет способность исходного антитела распознавать и связываться с антигеном

- 1 008353 и является менее иммуногенным, что повышает его терапевтическую применимость. Данная процедура является процедурой, в которой, посредством небольшого ряда мутаций, получают модифицированные антитела со сниженной иммуногенностью по сравнению с химерными антителами.

На основании указанного выше можно предположить необходимость получения вариантов терапевтических антител, которые являются менее иммуногенными, получают простым экономным путем и являются адекватными для получения терапевтических препаратов для применения у человека.

Также известно, что применение фрагментов антител также может быть очень эффективным при иммунодиагностике заболеваний. 1га Рак!ап и другие (заявка на езропейский патент ЕР 07 96334 А1) описывают конструкцию одноцепочечных фрагментов типа Εν с применением вариабельных областей антител, которые специфически распознают углевод, связанный с антигеном Υ Льюиса. На основании указанных фрагментов авторы разработали способ обнаружения клеток, несущих указанный антиген, а также привели доказательства ингибирующего эффекта, который эти фрагменты оказывают на клетки, несущие антиген.

Данные об участке связывания моноклонального антитела 14Ε7 позволили сформировать интересную практическую и теоретическую точку зрения о возможности применения этого антигена в иммунотерапии различных заболеваний. 8оштаи, С. е! а1. в Ехрег! Θρίη. ΒίοΙ. Тйег. 1, 845-855, 2001 и Сйек!ет, К. А., е! а1. в Όίκ. Магкегк. 16, 53-62, 2000, показали, что применение фрагментов антител типа ксР'т может иметь широкое терапевтическое применение, учитывая преимущества таких их фармакологических свойств, например более эффективное проникновение в опухолевую ткань. Конструирование мини-библиотек фрагментов антител из гибридом, экспонированных на нитевидных фагах, позволяет провести селекцию в пределах данного спектра молекул, способных к специфическому распознаванию антигена. Целью является быстрое получение фрагментов антител, сочетающих в себе возможность распознавать исходное антитело с меньшим молекулярным размером и способностью к продукции бактериальным хозяином. Эта методика позволяет исключить множество вариантов фрагментов антител, получаемых при выделении или манипуляции с генами вариабельных областей гибридомы посредством обычных технологий клонирования, которые не являются функциональными или которые не могут быть получены из бактерий (Воо^'е^ К..С. е! а1., Вг. I. Сапсег. 78, 1407-1416, 1998).

С помощью технологии представления фрагмента антитела в нитевидных фагах можно получить уникальную возможность доступа к участку связывания антитела, а также возможность внесения модификаций в антитело с целью повышения его аффинности (Сйатек, Р. е! а1., 1. 1шшипо1. 161, 5421-5429, 1998, Ьаттштак1, и. е! а1., I. Мо1. Βίο1. 291, 589-602, 1999, Рагйаш1-8егеп е! а1., I. 1шшипо1. МеШобк 259, 43-53, 2002) или модулирования его специфичности (1Ьа, Υ. е! а1., Рго!. Епдп., 11, 361-370, 1998, М|уахакт С. е! а1., Рго!. Епдп. 12, 407-415, 1999, □аггеаи, К..Р. е! а1., I. С1ш. 1ттипоаккау 15, 25-29, 1992).

Благодаря экспрессии фрагментов антител в нитевидных фагах можно осуществить обмен цепями (Ьапйо, 1. е! а1., МеФобк Мо1. Вю1. 178, 303-316, 2002), которые представляют собой сочетание различных УЪ и УН исходного антитела, или, наоборот, что, таким образом, позволяет изучать роль каждой цепи в распознавании антигена и ее влияния на аффинность антитела (КаЬа!, Е.А., Аи, Т.Т., 1. 1ттипо1. 147, 1709-1719, 1991, ВагЬак III, С.Е., Ьетет, К..А. Ме!1обк: А сотрапюп !о Ме!1обк ш Епхуто1оду 2, 119124, 1991). Обмен цепей позволяет модифицировать свойства участка связывания, а также сочетать последовательности иммуноглобулинов разных видов и отбирать те варианты, которые сохраняют специфичность распознавания (КИтка, А. е! а1., Вг. I. Сапсег. 83, 252-260, 2000, 8!ешЬегдег, Р. е! а1., I. Вю1. С1ет. 275, 36073-36078, 2000, Набег, С. е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А 95, 8910-8915, 1998, ВеФоег, 8.А.Н. е! а1., I. Мо1. Вю1. 296,833-849, 2000).

Настоящее изобретение относится к модифицированному антителу, полученному из мышиного моноклонального антитела 14Ε7, распознающего исходный антиген с такой же аффинностью и которое обладает меньшей иммуногенностью при введении пациентам. Еще одним открытием настоящего изобретения явилось получение фрагментов, полученных из указанного антитела, которые содержат вариабельные области легких цепей, отличающиеся от исходной, но сохраняющие ее свойства специфичности, аффинности и распознавания, и которые могут быть экспрессированы бактериальным хозяином в виде растворимых молекул, а также быть представлены на поверхности нитевидных фагов. Фрагменты, полученные из антитела 14Ε7, могут использоваться в качестве терапевтических средств. Кроме того, экспрессия фрагментов антитела 14Ε7 типа ксР\^г на поверхности нитевидного фага М13 позволяет совершать манипуляции с участком связывания и получать варианты с более высокой аффинностью в терапевтических целях.

Одной из целей настоящего изобретения является характеристика фрагментов антител, только частично сохраняющих последовательность 14Ε7, но сохраняющих его специфичность, аффинность и распознающие свойства.

Полученное модифицированное антитело и фрагменты специфически распознают опухолевые клетки, которые экспрессируют антиген ЫОсОМ3, что, таким образом, делает возможным их применение для диагностики и терапии указанных опухолей, и они обладают преимуществом меньшей иммуногенности по сравнению с мышиными антителами, из которого они были получены.

Объектами настоящего изобретения являются новые терапевтические композиции, содержащие мо

- 2 008353 дифицированные антитела 14Ε7 или одноцепочечные фрагменты Εν, где указанные антитела или фрагменты могут быть связаны с радиоактивным изотопом, который может использоваться для определения локализации или лечения опухолей, экспрессирующих антиген.

Также объектом настоящего изобретения является способ радиоиммунодиагностики или радиоиммунотерапии опухолей, экспрессирующих ганглиозид ЫСеСМЗ, с применением фармацевтических композиций, содержащих модифицированные антитела 14Ε7 или их фрагменты, связанные с радиоактивным изотопом.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении описано химерное антитело, полученное из мышиного моноклонального антитела 14Ε7, продуцируемого гибридомой с инвентарным номером ЕСАСС 98101901, характеризующееся следующими последовательностями гипервариабельных областей (ΟΌΚ) тяжелой и легкой цепей:

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ

С1Ж1: δΥ\ΙΗ

С1Ж2: ΥΙΌΡΑΤΑΥΤΕ8Ν0ΚΕΚΌ

ΟΌΚ3: ΕδΡΚΕΚΚΟΓΥΥΥΑΜΌΥ

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ

СОР1: ΚΑδΟδΙδΝΝΕΗ

СОР2: ΥΑδΟδΙδ

ΟΌΚ3: Ε)Ε)δ\Κ\\'ΡΡΤ

Предпочтительно указанное химерное антитело характеризуется следующими последовательностями каркасных областей (ΕΚ) тяжелой и легкой цепей:

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ

ΕΚ1: ΟνΟΕΟΟδΟΝΕΕΑΚΡΟΑδΜΚΜδΟΚΑδΟΥδΕΤ

ΕΚ2: \\'1.К('ЖР1МХ.,1.Е\\'1С1

ΕΚ3 : ΚΑΙΕΤΑΌΚδδΝΤΑΕΜΥΕΝδΕΤδΕΌδΑνΥΥΟΑΚ

ΕΚ4: \606ΤΤνΤν§8

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ

ΕΚ1: ΌΕνΕΤΟδΡΑΤΕδνΤΡΟΌδνδΕδΟ

ΕΚ2: ΑΥΟΟΡΤΗΕδΡΡΡΡΙΚ

ΕΚ3: ΟΙΡδΚΕδΟδΟδΟΤΌΕΤΕδΙΙδνΕΤΕΌΕΟΜΥΕΟ

ΕΚ4: Ε6Α6ΤΚΕΕΕΚΚΑ

Кроме того, химерное антитело характеризуется содержанием константной области тяжелой цепи ЦС1 человека и константной области легкой цепи Ск человека.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модифицированному антителу, полученному из мышиного моноклонального антитела 14Ε7, продуцируемого гибридомой с инвентарным номером ЕСАСС 98101901, характеризующегося тем, что каркасные области тяжелой и легкой цепей содержат любую из следующих мутаций:

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ:

Позиция 5 О для ν

Позиция 9 Ν для А

Позиция 11 Ь для ν

Позиция 12 А для ν

Позиция 18 М для ν

Позиция 19 Κ для Κ

Позиция 20 М для ν

Позиция 38 Κ для Κ

Позиция 40 Κ для А

Позиция 42 Ό для С

Позиция 48 Ι для ν

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ:

Позиция 39 Κ для Κ

Позиция 40 Т для Р

Позиция 41 Н для С

Позиция 42 Е для О

Позиция 58 Ι для ν

Предпочтительно указанное модифицированное антитело характеризуется содержанием константной области тяжелой цепи ЦС1 человека и константной области легкой цепи Ск человека.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к одноцепочечным фрагментам Εν типа, полученным из антитела 14Ε7, содержащего последовательность вариабельной области тяжелой цепи, полученной из гибридомы (инвентарный номер ЕСАСС 98101901), и сохраняющим специфичность распознавания 14Ε7.

Предпочтительно указанные фрагменты Εν содержат вариабельные области легких цепей, получен

- 3 008353 ные от неиммунизированных мышей или человека, отличающиеся от вариабельной области легкой цепи, продуцируемой указанной выше гибридомой, что делает возможным ее продукцию бактериальным хозяином в виде фрагментов антитела, представленных на нитевидных фагах, или растворимых молекул.

Настоящее изобретение также относится к клеточным линиям, которые экспрессируют химерные и гуманизированные антитела, и бактериальным клонам, которые продуцируют фрагменты, полученные из 14Е7.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения и/или определения локализации и идентификации злокачественных опухолей молочной железы и меланом, их метастазов и рецидивов, характеризуемых содержанием одного из рекомбинантных моноклональных антител по настоящему изобретению или их фрагментов, а также наполнителя, подходящего для их применения. Указанное антитело или фрагмент могут быть связаны с радиоактивным изотопом, который может использоваться для обнаружения локализации и/или терапии злокачественных опухолей.

Наконец, настоящее изобретение относится к применению описанных рекомбинантных антител для получения фармацевтической композиции, которая может использоваться для лечения и/или определения локализации и идентификации злокачественных опухолей.

Подробное описание того, как выполнять и применять настоящее изобретение, приводится ниже.

1. Синтез ΆΌΝο и амплификация посредством ПЦР (полимеразной цепной реакции) вариабельных областей мышиного антитела 14Е7.

Мышиное антитело 14Р7 получали иммунизацией мышей Ва1Ь/с ганглиозидом СМ3 (№иСс), гидрофобно конъюгированным с липопротеинами низкой плотности и в присутствии адъюванта Фрейнда (ЕР 0972782 А1, Сагг А. е! а1., НуЬпбота 19:3:241-247, 2000). РНК получали из 10⁶ клеток гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело 14Е7 (мышиный 1дС1 МаЬ), распознающее ганглиозид NСсСМ3, применяя способ экстракции с тризолом (С1ВСО ВКЕ, ΝΥ) в соответствии с инструкциями производителя.

Синтез комплементарной ДНК (кДНК) и амплификацию вариабельных областей УН и УЪ осуществляли, с применением набора реагентов: Ассезз КТ-РСК. (Рготеда, И8А) в соответствии с рекомендациями производителя. В кратком изложении: реакцию проводили с 5 мкг РНК в присутствии 25 пМ олигонуклеотида бТ, предназначенного для связывания с поли-А хвостом РНК и олигонуклеотидов, соответствующих концам каждой вариабельной области: УН и УЬ. Инкубировали 10 мин при 60°С, после чего добавляли смесь, содержащую 0,2 мМ каждого дезоксирибонуклеотида (6ΝΤΡ), 1 мМ Мд8О₄, 5 μ АМУ-обратной транскриптазы, 5 μ ДНК-полимеразы в реакционном буфере до общего объема 50 мкл. Образцы инкубировали в течение 45 мин при 48°С, 2 мин при 94°С, затем проводили 40 циклов ПЦР при температурах 94°С (30 с), 60°С (1 мин), 68°С (2 мин), а конечную инкубацию в течение 7 мин при 68°С.

2. Конструирование химерных генов и определение последовательности нуклеотидов амплифицированной кДНК.

Продукты ПЦР УН и УК обрабатывали рестрикционными ферментами Есо ΚΎ-ΝΙκ I для УН и Есо КУ-8а1 I для УК и клонировали в соответствующие экспрессирующие векторы (Со1ота М.1. е! а1., 1. 1ттипо1. Ме1йобз 152:89-104, 1992). Область УН клонировали в вектор РАН4 604, содержащий константную область 1дС1 человека, а в качестве селективного маркера ген устойчивости к Ь-гистидинолу. Область УК клонировали в вектор РАС4622, несущий ген устойчивости к микофенольной кислоте и константную область человеческой каппа. Полученные генетические конструкции обозначили 14Е7УНРАН4604 и 14Е7УК-РАС4622, соответственно.

Обе конструкции секвенировали способом с применением дидезоксинуклеотидов (8апдет Е. е! а1., ΡNА8 И8А 74:5463-5470, 1979), применяя коммерческий набор реагентов для определения последовательности с ДНК-полимеразой Т7 (Атетзйап-Рйатташа) в соответствии с протоколом, описанным производителем.

3. Экспрессия химерного антитела.

Клетки N80 подвергали электропорации 10 мкг 14Е7УН-РАН4604, а 10 мкг 14Е7УК-РАС4622 преобразовывали в линейную форму ферментом Руи1. ДНК выделяли с применением этанола, перемешивали и растворяли в 50 мкл РВ8 (раствор фосфатно-солевого буфера). Приблизительно 10⁷ клеток растили до неполной конфлюэнтности и собирали центрифугированием. Затем клетки ресуспендировали в 0,5 мл РВ8 вместе с ДНК в кювете для электропорации. Клетки выдерживали 10 мин на льду, затем подвергали импульсу 200 В и 960 Ф, после чего помещали в лед на 10 мин. Клетки культивировали в 96-луночном планшете в модифицированной Дульбекко селективной культуральной среде (ЭМЕМ-Е12) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ЕС8) и 10 мМ Ь-гистидинола. Трансфицированные клоны становились видимыми через 10 суток после добавления селективной среды. Продукцию химерного иммуноглобулина определяли способом ЕЬ18А в супернатантах клонов. Для этого полистироловые планшеты (Н1дй Ьшбшд, Соз1ат) покрывали сывороточным козьим 1дС против иммуноглобулинов человека в 100 мМ карбонатно-бикарбонатного буфера, рН 9,8 в течение ночи при 4°С. Затем планшеты отмывали в РВ8-Т\тееп (раствор фосфатно-солевого буфера, 0,5% Ттееп-20, рН 7,5) и добавляли и инкубировали в течение часа при 37°С образцы супернатантов культур, разведенные РВ8-Тетееп-ЕС8. Планшеты снова

- 4 008353 отмывали в РВ8-Т\тссп. после чего инкубировали с сывороткой, содержащей козью цепь каппа против иммуноглобулинов человека. конъюгированной с пероксидазой Цаскюп). в течение часа при 37°С. После этого планшеты отмывали в тех же условиях и инкубировали с раствором цитратно-фосфатного буфера. рН 4.2. содержащего субстрат о-фенилендиамин. Спустя 15 мин измеряли поглощение при 492 нм. Способность химерного антитела распознавать антиген проверяли посредством конкурентного ЕЫ8А. применяя ганглиозиды ЫСсСМЗ и ЫасСМЗ. В кратком изложении: полистироловые планшеты (Ро1укогр. Ыипс) покрывали 50 мкл раствора с 4 мкг/мл ЫСсСМЗ или ЫЛсСМЗ в метаноле и инкубировали в течение часа при 37°С. Затем планшеты блокировали 200 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (В8А) в буфере Тг1к-НС1. рН 7.8-8.0 в течение часа при 37°С. После трех отмывок в РВ8 в присутствии 1 мг/мл биотинилированного мышиного антитела 14Е7 на 2 ч при 37°С добавляли разведенные в 1% ТпкНС1-В8А образцы в диапазоне концентраций 2-0.01 мкг/мл. Затем планшеты отмывали в РВ8. и реакция развивалась в присутствии конъюгата стрептавидин-пероксидаза (1асккоп) при 37°С в течение 1 ч. Поглощение измеряли при 492 нм.

4. Конструирование гуманизированного антитела 14Е711Т посредством гуманизирования Т-эпитопов. Прогнозирование Т-эпитопов.

Последовательности вариабельных доменов 14Е7 анализировали при помощи программного обеспечения АМРН1 Ргодгат (Магда1й Н. е1 а1.. 1. 1ттипо1. 138: 2213-2229. 1987). которое позволяет идентифицировать сегменты из 7-11 аминокислот с амфипатической спиральной структурой. связанные с иммуногенностью Т-клеток. В данном случае такие алгоритмы предсказывают фрагменты. связанные с представлением Т-эпитопов в вариабельных областях тяжелых и легких цепей мышиного моноклонального антитела 14Е7.

Анализ гомологии с иммуноглобулинами человека.

Аминокислотные последовательности вариабельных доменов 14Е7 сравнивали с последовательностями вариабельных областей описанных иммуноглобулинов человека для того. чтобы определить человеческий иммуноглобулин. обладающий наибольшей гомологией с анализируемой мышиной молекулой. Для этого можно применять базу данных 8^188РВОТ. доступную в 1п1етпе1 посредством программного обеспечения ВЬА8Т (А11ксйи1 8.Е. е1 а1.. №.1с1ею Лабк Век. 25:3389-3402. 1997).

Анализ для снижения иммуногенности.

Сущность способа состоит в достижении снижения иммуногенности посредством разрушения или гуманизирования возможных Т-эпитопов с минимальным количеством мутаций в ЕВ. в особенности в тех сегментах. которые содержат амфипатические спиральные структуры. за исключением положений. вовлеченных в трехмерную структуру распознающей антиген области. По данному способу последовательности вариабельных областей УН и УЪ мышиного иммуноглобулина сравнивают с последовательностями вариабельных областей УН и УЪ человеческого иммуноглобулина с наибольшей гомологией. а различающиеся между мышиной и человеческой последовательностями остатки идентифицируют только в амфипатических областях в пределах областей ЕВ (КаЬа1 Е.. Зесщепсек о£ рго1ешк о£ 1ттипо1од1са1 ш1егек1. ΡίΠΙι Ебйюп. №Шопа1 1пк1йи1е о£ НеаИй. 1991). Такие мышиные остатки являются остатками. восприимчивыми к замене теми остатками. которые находятся в том же положении человеческой последовательности.

Остатки. присутствующие в положениях ЕВ. соответствующих канонической структуре. т.е. остатки. присутствующие в зоне Вернера или участвующие во взаимодействиях на поверхности раздела УНУЪ. нельзя подвергать мутациям. так как это может воздействовать на трехмерную структуру вариабельного домена антитела и. таким образом. воздействовать на связывание с антигеном. Дополнительную информацию о действии замен. основанных на третичной структуре. можно получить посредством молекулярного моделирования вариабельных областей.

Так как при анализе элементов мутаций. таких как присутствие пролиновых остатков в амфипатической спирали или тот факт. что определенный мышиный остаток не обнаруживается в том же положении в большинстве гомологичных человеческих последовательностей. но часто встречается в других человеческих иммуноглобулинах. можно рассматривать. что возможно получить вариант. содержащий максимальное количество мутаций. то есть такой. где все мышиные остатки. отличающиеся от человеческой последовательности. являются мутированными. но другие варианты можно получить с другими сочетаниями мутаций.

После определения в мышиной последовательности 14Е7 возможных Т-эпитопов. и установив в пределах этих сегментов остатки. отличающиеся от человеческих. конструировали замены посредством стандартных способов направленного мутагенеза.

Клонирование и экспрессия гуманизированного 14Е711Т антитела в клетках N80.

После получения описанным ранее способом генетических конструкций. соответствующие областям УН и УЪ антитела 14Е7ЙТ. клонировали в соответствующие экспрессирующие векторы так же. как описано выше в случае химерной конструкции антитела. с получением следующих генетических конструкций: 14Е7ЙТУК-РАО4622 и 14Е7ЙТУН-РАН4604. Трансфекцию этих генов в клетки N80 проводили в тех же условиях. которые описаны для химерного антитела. Клоны. продуцирующие гуманизированное антитело. также определяли посредством ЕЬ18А.

- 5 008353

Способность специфического распознавания антигена гуманизированным антителом подтверждали посредством конкурентного ЕЫ8А, применяя ганглиозиды ЫСеСМЗ и ЫЛеСМЗ. Процедура идентична процедуре для химерного антитела.

5. Конструкция библиотек фрагментов антител из гибридомы 14Е7 на нитевидных фагах.

Информационную РНК выделяли из клеток гибридомы 14Е7, синтезировали комплементарную ДНК, а соответствующие вариабельным областям тяжелых и легких цепей последовательности амплифицировали отдельно, применяя два набора олигонуклеотидов, предназначенных для гибридизации с широким диапазоном мышиных вариабельных областей. Вариабельные области каждой амплифицированной тяжелой цепи очищали, обрабатывали соответствующими ферментами и связывали с фагмидным вектором рНС-1ш (сделан для представления одноцепочечных антител на поверхности нитевидных фагов), расщепленным ранее тем же ферментом. Продукты реакции связывания очищали и посредством электропорации вводили в бактериальный штамм Е. со11 ТС1. Трансформированные бактерии составляют неполную библиотеку вариабельных областей тяжелой цепи с ограниченным разнообразием (все из них получены из гибридомы 14Е7). ДНК, соответствующую этой неполной библиотеке, очищали и по отдельности связывали с коллекциями вариабельных областей легкой цепи (очищенными ранее и обработанными соответствующими ферментами). Наконец, эти генетические конструкции вводили посредством электропорации в бактериальный штамм ТС1 для согласования различные типов независимых библиотек. Одна из них представляет собой мини-библиотеку с ограниченным разнообразием, сконструированную из вариабельной области легкой цепи, также полученной из клеток гибридомы 14Е7. Также получали библиотеки замены цепей, в которых вариабельные области тяжелых цепей из гибридомы сочетали с разными коллекциями вариабельных областей легких цепей, полученными из мышиных и человеческих лимфоцитов.

6. Выделение и характеристика клонов, продуцирующих фрагменты антител против Ν-гликолил СМ3.

Колонии из каждой библиотеки брали случайным образом для получения из них фагов с применением вспомогательного фага М13 К07. Распознавание Ν-гликолил СМ3 фагами, несущими фрагменты антител, сразу анализировали посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Таким образом, определяли продуцирующие функциональные фрагменты клоны. Несущие фрагменты антител фаги выделяли из общей смеси трансформированных бактерий, формирующих каждую библиотеку, чтобы получить препарат с высоким содержанием функциональных фрагментов антител, и исследовали разнообразие библиотек. Полученную фаговую смесь приводили в контакт с антигеном Ν-гликолил СМ3, связанным с твердой поверхностью фаги, несущие фрагменты антител со связывающей способностью, удерживались, а остаток удаляли истощающими отмывками. Связанные фаги элюировали посредством изменения рН, размножали с получением новой фаговой смеси, которая служила исходным материалом для нового цикла отбора на антигене. После различных циклов селекции анализировали распознавание фрагментов антител, представленных на поверхности фагов из колоний. Таким образом, идентифицировали дополнительные клоны, продуцирующие функциональные фрагменты, растворенные в исходной библиотеке.

Характеристика фрагментов антител, продуцируемых клонами, включала в себя анализ специфичности посредством ЕЬ1§Л против панели связанных ганглиозидов, изучение распознавания опухолей посредством иммуногистохимии, оценку их способности вырабатываться в виде растворимых функциональных фрагментов антител, вне контекста их представления в фагах, и полного секвенирования их вариабельных областей.

Примеры

В следующих ниже примерах, если не указано иначе, все применяемые ферменты рестрикции или модификации, а также реагенты и материалы получали из коммерческого источника.

Пример 1. Получение химерного моноклонального антитела 14Е7.

Синтез ДНК и амплификацию посредством ПЦР мышиных вариабельных областей УН и УК проводили с применением фермента полимеразы Усп1. применяя специфические олигонуклеотиды с областями рестрикции Есо ВУ-ΝΙιο I для УН и Есо КУ-8а1 I для УК. Переключающие олигонуклеотиды являлись следующими.

Для УН:

Олигонуклеотид 1 (гибрид в сигнальном пептиде): 5' ддд да1а1с сасс а1д даа адд сас 1дд а1с й1 с1с Ис с1д 3' Олигонуклеотид 2 (гибрид в Ш1): 5' ддд дс4адс 1да дда дас дд4 дас сд1 дд 3'

Для УК:

Олигонуклеотид 1 (гибрид в сигнальном пептиде):

5' ддд да1а1с сасс а1д д4(а4) 1(1с)с (1а)са сс1 сад (а()1(ас) сП дда сй 3'

Олигонуклеотид 2 (гибрид в УЫ5):

5' адс дсдас йа сд1 йс адс 1сс адс йд д1с сс 3'

Продукты ПЦР УН и УК расщепляли ферментами рестрикции Есо РУ-Шс I для УН и Есо КУ-8а1 I для УК и клонировали их в соответствующие экспрессирующие векторы, РАН4604 и РАС4622, для УН и УК, соответственно. Данные векторы применяют для экспрессии иммуноглобулинов в клетках млекопитающих, и они подарены 811спс МопЦоп (иСЬА, Са1йотша, И8А). Вектор РАН4604 содержит констант

- 6 008353 ную область человеческого 1дО1, а РЛС4622 - константную область человеческой каппа (Со1ота 1. с( а1., I. 1ттипо1. Мебюбз 152:89-104, 1992). После того, как области УН и УК 14Р7 клонировали в предшествующие векторы, формируют конструкции 14Р7УН-РЛН4604 и 14Р7УК-РЛС4622.

Двенадцать независимых клонов секвенировали посредством дидезоксинуклеотидного способа (8апдег Р. е( а1., ΌΝΆ зесщепсшд \νί(1ι сйашЧеттшайпд 1пЫЬйот8. ΡΝΆ8 И8Л 1979;74:5463-5470), с применением коммерческого набора для секвенирования с ДНК-полимеразой Т7 (Атегзйат-Рйаттааа) в соответствии с протоколом, описанным производителем. Последовательности УН и УК обладают высоким родство с подгруппами ΙΙΒ и У, соответственно (фиг. 1А и В), в соответствии с классификацией КаЬа( (КаЬа( Е., 8ес.|иепсе5 оГ рго(еш8 оГ 1птипо1од1са1 1п1егек1. ΡίΓιΙι Еббюп, №1бопа1 1п8(йи(е оГ НеаКй, 1991).

Проводили электропорацию клеток N80 с 10 мкг 14Р7УН-РАН4604 и 10 мкг 14Р7УК-РАО4622, преобразованными в линейную форму ферментом Руи1. ДНК выделяли с применением этанола, перемешивали и растворяли в 50 мкл РВ8 (раствор фосфатно-солевого буфера). Приблизительно 10⁷ клеток растили до неполной конфлюэнции и собирали посредством центрифугирования. Затем клетки ресуспендировали в 0,5 мл РВ8 вместе с ДНК в кювете для электропорации. Клетки выдерживали 10 мин на льду, затем подвергали импульсу 200 В и 960 Ф, после чего помещали в лед на 10 мин. Клетки культивировали в 96-луночном планшете в модифицированной Дульбекко селективной культуральной среде (ΌΜΕΜР12) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (РС8) и 10 мМ Ь-гистидинола. Трансфицированные клоны становились видимыми через 10 суток после добавления селективной среды. Продукцию химерного иммуноглобулина определяли посредством способа ЕЫ8А из супернатанта клонов. Для этого полистироловые планшеты (Нф11 Ьшбшд, Соз(аг) покрывали сывороточным козьим 1дО против иммуноглобулинов человека в 100 мМ карбонатно-бикарбонатного буфера, рН 9,8 в течение ночи при 4°С. Затем планшеты отмывали в РВ8-Т\\ееп (раствор фосфатно-солевого буфера, 0,5% Т\тееп-20. рН 7,5), добавляли и инкубировали в течение часа при 37°С культуру супернатантов образцов, растворенных в РВ8-ТетеепРС8. Планшеты снова отмывали в РВ8-Тетееп, после чего инкубировали с сывороткой, содержащей козью цепь каппа против иммуноглобулинов человека, конъюгированной с пероксидазой (Заскзоп), в течение часа при 37°С. Далее планшеты отмывали в тех же условиях и инкубировали с раствором цитратно-фосфатного буфера, рН 4,2, содержащего субстрат о-фенилендиамин. Через 15 мин измеряли поглощение при 492 нм.

Пример 2. Реактивность антитела 14Р7О против антител N6с6Μ3 и NАс6Μ3.

Реактивность химерного антитела 14Р7 (АЬ) определяли посредством конкурентного ЕЬ18А. На фиг. 2 показана специфичность химерного 14Р7 по сравнению с мышиным 14Р7 в распознавании полистироловых планшетов (Ро1узогр, №пс), покрытых ОМ3 Ν-гликолилированным ганглиозидом. Оба антитела показали сходную концентрацию 50%-ного ингибирования распознавания антигена биотинилированным мышиным АЬ 14Р7. При покрытии планшетов Ν-ацетилированным вариантом ОМ3 или антителами иммунореактивность не отмечали. Мышиное С5 МаЬ применяли в качестве несоответствующего АЬ.

Пример 3. Получение различных вариантов гуманизированного антитела.

Последовательности УН и УК сравнивали с базой данных человеческих последовательностей с получением наиболее гомологичной антителу 14Р7 человеческой последовательности для областей УН и УК (фиг. 1А и В). Дополнительно в обеих последовательностях определяли амфипатические области или потенциальные Т-эпитопы. Далее мутации, необходимые для преобразования мышиных последовательностей УН и УК в человеческие последовательности, определяли указанным ниже способом гуманизирования Т-эпитопов. Ниже авторы приводят максимальное количество возможных мутаций, которые можно проводить.

В случае области УН мутации вводили в положения 5, 9, 11, 12, 18, 19, 20, 38, 40, 42 и 48, где аминокислоты О, Ν, Ь, А, М, К, М, К, В, Ό и I заменяли на У, А, У, У, У, В, У, В, А, О и У, соответственно. Эти мутации проводили перекрыванием продуктов ПЦР (Каттап М. е( а1., №1с1ею Ас1бз Везеагсй 17:5404-5410, 1989), с применением олигонуклеотидов 1 и 2, и 3 и 4, в первом ПЦР, а результаты перекрывали в другой ПЦР, с применением только олигонуклеотидов 2 и 4. Последовательности применяемых олигонуклеотидов показаны ниже.

Олигонуклеотиды для мутаций 5, 9, 11 и 12 тяжелой цепи:

Олигонуклеотид 1: 5' д(с сад ей д(д сад (с( ддд дс( даа д(д д(а ааа сс( ддд 3' Олигонуклеотид 2: 5' ддд дс(адс (да дда дас дд( дас сд( дд( 3'

Олигонуклеотид 3: 5' ссс адд ((( (ас сас ((с адс ссс ада с(д сас аад с(д дас 3' Олигонуклеотид 4: 5' ддд да(а(с сасс а(д даа адд сас (дд а(с ((( с(с ((с с(д 3'

После секвенирования и проверки предшествующих мутаций в положениях 18, 19 и 20 вносили мутации в содержащую их ДНК, где аминокислоты М, К, М заменяли на У, В, У, соответственно.

Ниже показаны олигонуклеотиды 1 и 2 и 3 и 4, описанные для указанных мутаций. Перекрывание продуктов ПЦР проводили, как описано выше.

Олигонуклеотиды для мутаций 18, 19 и 20 тяжелой цепи:

Олигонуклеотид 1: 5' ддд дсс (са д(д адд д(д (сс (дс адд 3' Олигонуклеотид 2: 5' ддд дс(адс (да дда дас дд( дас сд( дд( 3' Олигонуклеотид 3: 5' сс( дса дда сас сс( сас (да ддс ссс 3' Олигонуклеотид 4: 5' ддд да(а(с сасс а(д даа адд сас (дд а(с ((( с(с ((с с(д 3'

- 7 008353

Подобным образом после секвенирования и проверки предшествующих мутаций в положениях 38, 40 и 42 вводили мутации К, А, С в содержащую их ДНК, заменяя аминокислоты К, К, Ό. соответственно.

Ниже представлены олигонуклеотиды 1 и 2 и 3 и 4, описанные для этих мутаций. Перекрывание продуктов ПЦР выполняли, как описано выше.

Олигонуклеотиды для мутаций 38, 40 и 42 тяжелой цепи:

Олигонуклеотид 1: 5' сас !дд йа ада сад дса сс! ддс сад дд! с!д 3'

Олигонуклеотид 2: 5‘ ддд дс!адс !да дда дас дд! дас сд( дд! 3’

Олигонуклеотид 3: 5’ сад асе с!д дсс адд !дс с!д !с! !аа сса д!д 3'

Олигонуклеотид 4: 5' ддд да!а!с сасс а!д даа адд сас (дд а!с !й с!с йс с!д 3'

Наконец, после проверки посредством сиквенса предшествующих мутаций вводили мутацию в положении 48 в содержащую ее ДНК, замещая аминокислоту I на V. Ниже указаны олигонуклеотиды 1 и 2 и 3 и 4, применяемые для этой мутации. Перекрывание продуктов ПЦР проводили, как описано выше.

Олигонуклеотиды для мутации 48 тяжелой цепи:

Олигонуклеотид 1: 5' с!д даа !дд дй дда 1:ас ай 3’

Олигонуклеотид 2: 5' ддд дс!адс !да дда дас дд! дас сд! дд! 3'

Олигонуклеотид 3: 5' аа! д!а !сс аас сса йс сад 3*

Олигонуклеотид 4: 5' ддд да!а!с сасс а!д даа адд сас !дд а!с Ш с!с йс с!д 3'

Все эти мутации проверяли посредством определения последовательности. Полученную генетическую конструкцию обозначили 14Е711ТУН.

В случае тяжелой цепи между УН 14Р7 и большинством сходных человеческих УН существуют различные замены аминокислот, которые не проводили, так как эти замены включали в себя аминокислоты из зоны Вернера или ключевые положения в распознавании антигена.

Для легкой цепи проводили мутации в положениях 39, 40, 41, 42 и 58, заменяя В, Т, Η, Е, I на К, Р, С, ζ). и V, соответственно. Мутации вводили тем же путем, что в тяжелой цепи. Ниже представлены последовательности применяемых олигонуклеотидов.

Олигонуклеотиды для мутаций 39, 40, 41, 42 легкой цепи:

Олигонуклеотид 1: 5’ !а! саа саа ааа сса дд! сад !с! сса адд 3'

Олигонуклеотид 2: 5’ аде д!сдас йа сд! йс аде !сс аде йд д!с сс 3’

Олигонуклеотид 3: 5' сс! !дд ада с(д асе !дд !й йд йд а!а 3'

Олигонуклеотид 4: 5’ ддд да!а!с сасс а!д д!(а!) !(!с)с (!а)са сс! сад (а!)!(ас) ей дда ей 3’

После подтверждения посредством сиквенса предшествующих мутаций вводили мутацию в положении 58 в содержащую ее ДНК, заменяя аминокислоту I на V. Ниже указаны олигонуклеотиды 1 и 2 и 3 и 4, применяемые для этой мутации. Перекрывание продуктов ПЦР проводили, как описано выше.

Олигонуклеотид для мутации 58 легкой цепи:

Олигонуклеотид 1: 5’ ай !с! ддд д!с ссс !сс адд 3'

Олигонуклеотид 2: 5’ аде д!сдас йа од! йс аде !сс аде йд д!с сс 3'

Олигонуклеотид 3: 5’ сс! дда ддд дас ссс ада аа! 3’

Олигонуклеотид 4: 5' ддд да!а!с сасс а!д д!(а!) Щс)с (!а)са сс! сад (а!)!(ас) ей дда ей 3'

После проведения мутации ее проверяли посредством определения последовательности.

Полученную генетическую конструкцию обозначили 14Е711ТУК.

Гуманизированные области УК и УН клонировали в векторы РА64622 и РАН4604 с формированием конструкций 14Е711ТУН-РАН4604 и 14Е711ТУК-РАС4622. соответственно.

Проводили электропорацию клеток N80 в присутствии 10 мкг каждого вектора, несущего гуманизированные вариабельные области, 14Е7ЙТУН-РАН4604 и 14Е711ТУК-РАС4622. ранее преобразованные в линейную форму посредством обработки Руи1. Процесс электропорации и детекция клонов, экспрессирующих гуманизированное антитело Ι4Ε711Τ. являлись идентичными процессу электропорации и детекции клонов, описанному для химерного антитела.

Пример 4. Эффект АЬ 14Е7 на снижение опухолевого роста в модели ангиогенеза ίη νίνο.

В качестве модели ангиогенеза ίη νίνο применяли меланомную опухолевую клеточную линию В16, смешанную с матриксным гелем в качестве индуктора ангиогенеза.

Индукцию процессов опухолевого ангиогенеза измеряли с применением подкожной имплантации опухолевой линии (В 16) матриксного геля в срединную брюшную линию самцов мышей С57/ВЬ6. Для этого меланомные клетки В16 смешивали только с 0,5 мл матриксного геля и 64 Ед/мл гепарина в контрольной группе или в сочетании с другими антителами для введения посредством подкожной инъекции в брюшную область животных. Через 15 суток после введения животных умерщвляли, и гранулы геля экстрагировали вместе с остатками дермы и эпидермиса, и макроскопически оценивали размер опухоли. На фиг. 3 показано, насколько радикально уменьшался размер опухолевой массы опухолей мышей, обработанных 14Е7.

-8008353

Для выявления новых сосудов проводили гистопатологический анализ, для чего гели окрашивали гематоксилин/эозином и проводили иммунное окрашивание в присутствии МаЬ РЕСАМ (эндотелиальный маркер). Фиг. 4А и В в срезах ткани животных, обработанных 14Е7, по сравнению с опухолевыми срезами необработанных животных наблюдали уменьшение количества кровеносных сосудов.

Пример 5. Создание библиотек фрагментов антител из гибридомы 14Е7 на нитевидных фагах.

Матричную РНК выделяли с применением ТпРиге ΙδοΙηΙίοη Кеа§еи! (Вое1ши§ег Маппйепи, Сепиапу) из 5,0х10⁶ гибридомных клеток 14Е7, а комплементарную ДНК синтезировали при помощи коммерческого набора Ρτο-δΤΑΚ. Είτδΐ δΐηηά ВТ-РСР геа§еи! кй (8!га!а§еие, и8А). Вариабельные области тяжелой и легкой цепей получали из гибридомы, амплифицировали в 26 циклах посредством полимеразной цепной реакции при следующих условиях: 50 с при 94°С, 1 мин при 55°С, 1 мин при 12°С. Для этого применяли все возможные комбинации вырожденных олигонуклеотидов набора (предназначены для гибридизации с широким спектром мышиных вариабельных областей), указанные в приведенной ниже таблице.

Олигонуклеотиды, применяемые для амплификации УН и УЪ.

Вырожденные положения указаны в скобках в последовательности олигонуклеотидов. Последовательности рестрикционных областей подчеркнуты.

5’ УН Ара К

5’... йс !а! !с! сас асй аса сад (дс)ад д!(д!) сад с!(д!) ас(ад) сад !с(а!) дда 3’

5'... йс !а( !с! сас аа! аса сад дс(ад) д!(с!) са(ад) с!д сад сад с!(с!) ддд дс 3’

5'... йс !а!!с! сас аа! аса сад да(ад) д!д аад с!(д!) (дс)!(дс) дад 1с1 дд(ад) дда 3'

3' УН 8ίϊ I

5’... да асе ад! ай сса аас йа ада аас сас ада дас ад! дас сад ад! ссс 3'

5’... да асе ад! ай сса аас йа ааа аас саа дда дас дд! дас !да дд! !сс 3’

5’... да асе ад! ас! сса дас йа ааа аде саа дда дас (д!)д! да(дс) (са) д! дда (дс)сс...З’

5’ У|. 3а1 ί

5'...д!а йс сад !сд аса аса йд !д(са) !д(а!) !(ас)с ад! йс с... 3' б’... д!а йс сад !сд асд а!а !сс ада !да с(ас)с а(да)а й(ас) с... 3’

5’... д!а йс сад !сд ас(сд) ааа йд !(!д)с !са ссс ад! йс с... 3’

3' Νο! I

5'...аад даа ааа аде ддс сдс й! (!с)а(!д) (!с)!с сад ей дд!... 3’

5’...аад даа ааа адеддс сдсй!(!д)а(!д) йс саа ей д!(д!)... 3’

Вариабельные области амплифицированных тяжелых цепей очищали и последовательно обрабатывали рестрикционными ферментами δίϊΐ и АраЫ. Продукты расщепления очищали и связывали с ДНК фагмидного вектора рНС-1ш (НеЬег Βίοίεο δ.А., СиЬа) (фиг. 5). Полученными в результате генетическими конструкциями посредством электропорации трансформировали бактерии штамма Е. сой ТСЛ. Группа трансформированных бактерий соответствовала неполной библиотеке вариабельных областей тяжелых цепей, полученной из гибридомы 14Е7 со средним размером 2,Зх10⁴ представителей. Плазмидную ДНК неполной библиотеки очищали и последовательно обрабатывали ферментами ΝοίΙ и 8а11. ДНК по отдельности связывали с четырьмя коллекциями вариабельных областей легкой цепи, расщепленных ранее теми же ферментами. Бактерии штамма ТСЛ трансформировали в присутствии этих новых генетических конструкций и получили четыре независимых библиотеки. Одной из них была мини-библиотека с ограниченным разнообразием содержащихся вариабельных областей обеих тяжелой и легкой цепей, полученных из гибридомы 14Е7 с размером 1,6х10⁶ представителей. Тремя другими являлись библиотеки с заменой цепей, содержащие разные коллекции вариабельных областей легких цепей, полученных ранее от мышей (изотип каппа) и людей (изотипы каппа и лямбда), и их размер составлял Ι,ΟχΙΟ⁷, 1,4х10⁶ и 1,2х10⁶ представителей, соответственно.

Пример 6. Выделение клонов, продуцирующих фрагменты антител против Ν-гликолил СМ3.

В лунках планшета для микротитрования в соответствии с описанным ранее способом (Маткк, Ю. е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. 222,581-597. 1991) получали фаги, несущие фрагменты антител из 92 случайно взятых клонов из каждой библиотеки. Их специфичность оценивали при помощи ЕЫ8А в поливинилхлоридных планшетах (Со§!ат, и8А), покрытых Ν-гликолил СМ3 и Ν-ацетил СМ3 в концентрации 1 мкг/мл. Связанные фаги определяли при помощи моноклональных антител против М13, конъюгированных с пероксидазой (Ашегейаш, 8\\сс1сп). Кроме характеристики отдельных случайно выбранных клонов проводили отбор фагов со способностью к связыванию Ν-гликолил СМ3 из смеси фагов при помощи группы бактерий, которые соответствовали каждой полученной библиотеке. Для этого получали фаги с применением вспомогательного фага М13 К07, их очищали посредством преципитации полиэтиленгликолем в соответствии с указанным выше способом и приводили в контакт с Ν-гликолил СМ3, связанным с поверхностью пластика (1шпипо 1иЬс5. Νιιηο. Оешиатк). Пробирки интенсивно отмывали и фаги элюировали в

-9008353 присутствии 100 мМ/л триэтиламина. Элютат нейтрализовали и применяли для инфицирования бактерий штамма Е. сой ТС1. Из группы инфицированных бактерий получали фаги, несущие антитело, и снова очищали, что применяли в качестве исходного материала для нового цикла селекции, в условиях, идентичных описанным. После четырех циклов селекции 92 колонии бактерий инфицировали фагами из каждой случайно взятой библиотеки и проводили распознавание Ν-гликолил СМ3 в условиях, сходных описанным, для определения клонов, случайно взятых из библиотек. После прямого анализа клонов библиотек продуцирующие клоны выделяли из несущих фрагменты антител, распознающих Ν-гликолил СМ3, фагов, которые с переменной частотой находили в трех библиотеках с заменой цепей. Положительных клонов в минибиблиотеке, сформированной только посредством вариабельных областей, полученных из гибридомы 14Е7, не обнаружили. После циклов селекции из библиотек с заменой цепей выделили дополнительные клоны, а в минибиблиотеке исходных последовательностей не нашли ни одного. В приведенной ниже таблице указаны количество продуцирующих фрагменты антител клонов, распознающих Ν-гликолил СМ3, и частота, представляющая собой общее количество клонов, проанализированных в каждой библиотеке. Только один клон продуцировал фаги, проявляющие перекрестную реактивность с Ν-ацетил СМ3,

Библиотека	Частота положительных клонов (прямой скрининг)	Частота положительных клонов (четыре цикла селекции)
Гибридома 14Е7 из минибиблиотеки	0/92	0/92
Замена мышиных легких цепей каппа	31/92 (33,70%)*	52/92 (56,52%)
Замена человеческих легких цепей каппа	2/92 (2,17%)	8/92 (17,39%)
Замена человеческих легких цепей лямбда	4/92 (4,35%)	12/92 (13,04%)

* Один клон с перекрестной реактивностью с Ν-ацетил СМ3.

Пример 7. Характеристика полученных из 14Е7 фрагментов антител, распознающих Ν-гликолил СМ3. Вариабельные области 11 фрагментов антител полностью секвенировали на автоматическом секвенаторе АЬЕ Ехргекк II (Р11аппас1а, 8\\сс1сп). применяя олигонуклеотиды, гибридизующиеся с областью вектора рНС-1ш, фланкированного концевыми 5'- и 3'-последовательностями, кодирующими фрагменты представляющего интерес антитела. Подтвердили, что последовательность вариабельной области всех тяжелых цепей соответствует вариабельной области тяжелой цепи, опубликованной для 14Е7, изменения представлены только в каркасных областях 1 и 4, вероятно, внесенные посредством применения вырожденных олигонуклеотидов при ПЦР. Перестановка последовательностей, включающих в себя три СОЯ, не имела вариаций. Наоборот, все последовательности вариабельных областей легких цепей 11 клонов отличались от вариабельных областей легких цепей 14Е7 и были разбиты на 5 групп различающихся последовательностей, две мышиного происхождения, и одна человеческого происхождения (изотип каппа), и две другие человеческого происхождения, но изотипа лямбда. Один клон, представляющий собой каждую группу последовательностей, брали для последующей характеристики.

В указанной ниже таблице приведены различия между вариабельными областями легких цепей отобранных клонов по отношению к их исходной идентичности, их происхождению и изотипу и классификация на подгруппы в соответствии с классификацией КаЬа1.

	Происхождение УЬ	Изотип	Идентичность с У_ь 14Е7	Подгруппа
АсМ 14Г7	Мышиная	каппа	-	V
ЗсГу 2Аш	Мышиная	каппа	59,46%	III
ЗсГч ЗЕт	Мышиная	каппа	59,81%	V
ЗсГд 7ВНк	Человеческая	каппа	60,74%	I
ΞσΕν 7АН1	Человеческая	лямбда	35,45%	I
ЗсЕу 8ВЬ1	Человеческая	лямбда	37,04%	III

Различия между вариабельными областями легких цепей клонов и вариабельными областями легких цепей, исходно описанными для антитела 14Е7, локализованы на всей последовательности, содержащей три определяющие комплементарность области, указанные ниже (фиг. 6).

-10008353

ЕП

14Г7 МаЬ

РАТ1.$УТРСО8У8Г8С

2АтвсРу . I Μ Е

ЗРт зсЕу , I О М ,

7ВНк5θΡν . I О М .

. . . 8. А. 8 1. О К А Т I.

Т. 8 8, . А 5 ί . . Р . Т I.

Т. 58. . А 8 V . . К . Т IТ

7АЫ зсЕ* а 5 V V .

ЗВЫвсРу 5 5 Е I .

V. . А I . ОТ. К I Т

С ЦК 1

Я А 8 а 8 I 8 NN IН . . . . 8 V 8 8 , 8Υ8ΥΝΙ.

.... О . . . Υ .N

.... . . . 8 Р .N

Т В Т 8 8 О V 6 6 Υ . Η V8 а с о з ь в . γ γ а з

Рг 2

« γ о а к	т	н	Е	3
. . . . к	Р	6	О	Р
. . . . к	Р	ϋ	в	т
. . . . к	Р	6	к	А
. . . . и	Р	с	к	А
. . . . к	Р	6	а	А

Р В ί ί Iк . к . . ..

V К . . .V . К . . .Υ , К . Μ .Υ . V . V .Υ

СОК 2

Υ А 3 О 3 I 3 . . . Ν ί Е .

. Т . К ί н . А . . Ν ί о . ϋν. КНР. е К N N й Р .

РгЗ

С! РЗКРЗСЗСЗбТОРТЬ . V . А . ............

. V.........	. . . Υ	3 .
. V ... .	. . к . .
. V .	н . .	. . . к .	. N	т	А	3 .
	ϋ . .	. . . 3 .	. N	т	А	5 .

3 1 1	А	V	Е	7 Е ϋ Р	6	Μ Υ	Р с
N	. Н	Р			Е . . А	А	7 .	Υ .
7	. 8	N	Ь		а . . ι	А	7 .
7	. 8	8	ί	О	Р . . .	А	А .	Υ .
7	V 8	6	ί	О	А . . Е	А	V .	Υ .
7	. 7	6	А	а	А . . Е	А	О .	Υ .

сокз

О О 5 N К щр ί Т Р . И . Н О V ,...

. . 6 . Т ί .Р . .

. . 6 Υ т т ....

8 Υ А 6 5 N N . V.

Ν8Κ0883ΝΗνν.

Гг4

С А 6 Т К ί Е I К

.......I .

-О.......

. С . . . V Т V ί . С. . . .ТУЬ

-11 008353

Специфичность связывания подтверждали посредством ЕБ18А в соответствии с описанным способом с применением в качестве покрывающего слоя в дополнение к Ν-гликолил СМ3 и Ν-ацетил СМ3 панели связанных ганглиозидов, включающую в себя различные Ν-ацетилированные ганглиозиды и один Ν-гликолилированный ганглиозид. На фиг. 7 показано распознавание различных антигенов 5 клонами, продуцирующими охарактеризованные фрагменты антитела. Обнаружили связывание только с антигеном-мишенью Ν-гликолил СМ3.

Продукцию клонами растворимых фрагментов антител (вне контекста фагов) индуцировали в присутствии изопропил-тиогалактопиранозида в концентрации 1 мМ/л. Собирали супернатант и получали периплазматические фракции в соответствии с установленными процедурами (бе Наатб, Η. 1. ΒίοΙ. СЕет. 274, 18218-18230, 1999). Распознающую активность Ν-гликолил СМ3 определяли в супернатантах культур и в периплазматических фракциях при помощи ЕБ18А на планшетах, покрытых вышеупомянутым антигеном, сходным с описанным антигеном, но с последующей модификацией. Фрагменты связывающих антител определяли с применением моноклонального антитела 1Е10 (направленное против пептида с-тус, слитого с фрагментами антител в генетическую конструкцию) в концентрации 10 мкг/мл и конъюгата иммуноглобулинов против мышиных иммуноглобулинов (81§та, И8А). Фрагменты антител из периплазматических фракций очищали с применением одной аффинной хроматографии с ионами металлов, применяя в качестве матрикса Н18-8е1ес1 НС №ске1 АГПпЦу Се1 (8щта. И8А) в соответствии с инструкциями производителя. На фиг. 8 показана активность очищенных растворимых фрагментов, определенная посредством ЕЫ8А.

Краткое описание фигур

Фиг. 1: показана аминокислотная последовательность вариабельных областей УН (а) и УК (Ь) МаЬ 14Е7 и соответствующая человеческая последовательность с наибольшей степенью гомологии. СЭК. подчеркнуты, а амфипатические области и потенциальные Т-эпитопы затенены. Также приведена полученная в результате гуманизирования последовательность вариабельных областей с произведенными мутациями.

Фиг. 2: распознавание антитела 14Е7С мерили посредством конкурентного ЕБ18А. Ось X: отображены концентрации антител. Ось Υ: поглощение, измеренное при 492 нм. В качестве отрицательного контроля применяли моноклональное антитело ютС5.

Фиг. 3: эффект моноклонального антитела 14Е7 на рост мышиных опухолей (меланомная опухолевая клеточная линия В16).

Фиг. 4: А) иммуногистохимическое исследование эффекта моноклонального антитела 14Е7 на формирование кровеносных сосудов, стрелки указывают сосуды с иммунным окрашиванием; В) ингибирование ангиогенеза, индуцированное моноклональным антителом 14Е7.

Фиг. 5: диаграмма вектора рНС-1т.

Фиг. 6: белковая последовательность областей УБ моноклонального антитела 14Е7 и отобранные одноцепочечные фрагменты Εν. Точки указывают гомологию с последовательностью УБ 14Е7.

Фиг. 7: специфичность распознавания фагами, несущими фрагменты антител. Наблюдали ингибирование связывания АЬ 14Ε7 с ганглиозидом экспонированными на фагах фрагментами. Планшеты покрывали Ν-гликолил СМ3, фаги инкубировали с вирусными частицами и различными концентрациями 14Ε7.

Фиг. 8: распознавание Ν-гликолил СМ3 очищенными растворимыми фрагментами.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Рекомбинантное антитело, полученное из мышиного моноклонального антитела 14Ε7, продуцируемое гибридомой с инвентарным номером ЕСАСС 98101901, характеризуемое последовательностями гипервариабельных областей (СИК) тяжелой и легкой цепей, приведенных ниже.

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ

СБК1: 8ΥΑΙ1Ι

СБК2: 441)РАТА4’ТЕ8\ОКЕК1)

СБК3: Е8Р1Я.1ШСПЛАА\ПП·

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ

СБК1: КА8Р818ЫМБН

СИЯ2: ΥА8^8I8

СБК3: ОО8ХКАТБГ
2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является химерным вариантом антитела 14Ε7, содержащим СИЯ и каркасные области (ЕК) тяжелой и легкой цепей указанного антитела 14Ε7, константную область тяжелой цепи человеческого 1дС1, константную область Ск человеческой легкой цепи с указанными ниже последовательностями каркасных областей (ЕК) тяжелой и легкой цепей:

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ

ЕЯ1: ^У^^^^8СNЕ^АКΡСА8МКМ8СЯА8СΥ8ΕΤ

ЕЯ2: \\БК('ЖР1)ОСРЕ\\'1С

ЕЯ3 : КАI^ΤА^Я88NΤАΕМΥ^N8^Τ8Е^8АУΥΥСАЯ

- 12 008353

ΕΚ4: \\'(.ιΟ(.ιΤΤ\Ί'νδδ

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ

ΕΚ1: ΌΕνυΓΟδΡΑΤΕδνΤΡΟΌδνδΕδΟ

ΕΚ2: \\ΎΕ)Ε)ΚΤ1 ΙΕδΡΙΚ.ΡΙΚ

ΕΚ3: ΟΙΡδΚΕδΟδΟδΟΤΌΕΤΕδΙΙδνΕΤΕΌΕΟΜΥΕΟ

ΕΚ4: ΕΟΑΟΤΚΕΕΕΚΚΑ
3. Антитело по пп.1 и 2, отличающееся тем, что является гуманизированным вариантом моноклонального антитела 14Ε7, содержащим точечные мутации в каркасных областях (ΕΚ) тяжелой и легкой цепей для снижения иммуногенности.
4. Антитело по п.3, отличающееся тем, что является гуманизированным вариантом моноклонального антитела 14Ε7, каркасные области тяжелых и легких цепей которого содержат любые из указанных ниже мутаций:

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ:

Позиция 5 О вместо ν

Позиция 9 Ν вместо А

Позиция 11

Позиция 12

Б вместо ν А вместо ν

Позиция 18

М вместо ν

Позиция 19

Κ вместо Κ

Позиция 20

Позиция 40

Позиция 42

М вместо ν Κ вместо А Ό вместо С

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ:

Позиция 39

Позиция 40

Позиция 41

Κ вместо Κ Т вместо Р

Н вместо С

Позиция 42 Е вместо О
5. Одноцепочечный фрагмент Εν, полученный из мышиного моноклонального антитела 14Ε7, продуцируемого гибридомой с инвентарным номером ЕСАСС 98101901, отличающийся тем, что содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 14Ε7 и вариабельную область легкой цепи мышиного антитела.
6. Одноцепочечный фрагмент Εν по п.5, отличающийся тем, что вариабельная область легкой цепи представляет собой само антитело 14Ε7.
7. Одноцепочечный фрагмент Εν по п.6, отличающийся тем, что последовательности гипервариабельных областей (ΟΌΚ) тяжелой и легкой цепей представляют собой последовательности, указанные ниже:

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ

0ΌΚ1: δΥ\\'Ι1Ι

0ΌΚ2: ΥΙΌΡΑΤΑΥΤΕδΝΟΚΕΚΌ

ΟΌΚ3: ΕδΡΡΡΡΡΕΙΥΥΥΛΜΟΥ

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ

ΟΌΚ1: ΚΑδΟδΙδΝΝΕΗ

ΟΌΚ2: ΥΑδΟδΙδ

ΟΌΚ3: Ε)Ε)δ\Κ\\'ΡΡΤ
8. Одноцепочечный фрагмент Εν по п.7, отличающийся тем, что содержит гипервариабельные области (ΟΌΚ) и каркасные области (ΕΚ) тяжелой и легкой цепей указанного антитела 14Ε7, последовательности каркасных областей (ΕΚ) тяжелой и легкой цепей которого представляют собой указанное ни же:

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ

ΕΚ1: ^V^^^^δСNΕ^ΑΚΡСΑδΜΚΜδСΚΑδСΥδΕΤ

ΕΚ2: \\ΕΚΕ)ΡΡΙΜΧ.,ΡΕ\\'Ι(.ι

ΕΚ3 : ΚΑΙΕΤΑΌΚδδΝΤΑΡΜΥΕΝδΕΤδΕΌδΑνΥΥΟΑΚ

ΕΚ4: VС^СΤΤVΤVδδ

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ

ΕΚ1: Ι)ΡΥΡΤΕ)δΡΑ'Π ,δνΤΡΕιΟδνδΡδΕ

ΕΚ2: \\ΎΕ)Ε)ΚΤ1 ΙΕδΡΙΚ.ΡΙΚ

ΕΚ3: СIΡδΚΕδСδСδСΤ^ΕΤ^δIIδVΕΤΕ^ΕСΜΥΕС

ΕΚ4: ΡΕιΑΕιΤΚΡΕΡΚΚΛ
9. Одноцепочечный фрагмент Εν по п.8, который содержит точечные мутации каркасных областей (ΕΚ) тяжелой и легкой цепей для снижения иммуногенности.
10. Одноцепочечный фрагмент Εν по п.9, каркасные области тяжелой и легкой цепей которого содержат любые из указанных ниже мутаций:

- 13 008353

ζ) вместо V Ν вместо А Ь вместо V А вместо К М вместо V К вместо К М вместо V К вместо А Ό вместо С

К вместо К Т вместо Р

Н вместо С

Е вместо ζ)

ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ:

Позиция 5

Позиция 9

Позиция 11

Позиция 12

Позиция 18

Позиция 19

Позиция 20

Позиция 40

Позиция 42

ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ:

Позиция 39

Позиция 40

Позиция 41

Позиция 42
11. Одно цепочечный фрагмент Εν по и. 5, полученный из мышиного моноклонального антитела 14Е7, продуцируемого гибридомой с инвентарным номером ЕСАСС 98101901, отличающийся тем, что содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела 14Е7 и вариабельную область легкой цепи, последовательность которых представляют собой указанное ниже: РН

О 1 V м Р О 5 Р А 3 ί А V 3 ί 6 о к А Т I 5 с СОН1 К А 5 о 8 V 3 5 δ 3 Υ 3 Υ м н Рг2 νν Υ О о К р е О Р Р к Ь Ц I к СОЙ 2 УАЗ N ί Е 5 РгЗ 6 V Р А Я Г 5 6 5 6 3 О т О Р т ί N I К Р V ΕΕΕϋΑΑΤΥΥΟ

сокз

ΟΗδκονΡίΤΡ

Рг4

6 А О Т К Ц Е I К
12. Одно цепочечный фрагмент Εν по и. 5, полученный из мышиного моноклонального антитела 14Е7, продуцируемого гибридомой с инвентарным номером ЕСАСС 98101901, отличающийся тем, что содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 14Е7 и вариабельную область легкой цепи, последовательности которых представляют собой указанное ниже:

-14008353

Рг1 ϋ I ΰΜΤαΤΡ3515Α512ϋΚνΤΙ 3 С сок1

К А 5 О β I 8 Ν Υ ί N

Яг 2 «γοακροοτνκίίΐ ν

СОК 2

Υ Τ 8 Й ί Η 8

РгЗ βνΡ8ΚΡ3Ο3Ο5ΟΤ0Υ3ίΤΙ 8 Ν Ь Ε О Ε О I А Τ Υ Ρ С

СОКЗ

ОйбМТЬРРТР

Рг4

6Α6ΤΚΙ.ΕΙ.Κ
13. Одноцепочечный фрагмент Ρν, полученный из мышиного моноклонального антитела 14Р7, продуцируемого гибридомой с инвентарным номером ЕСАСС 98101901, отличающийся тем, что содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 14Р7 и вариабельную область легкой цепи антитела человека.
14. Одноцепочечный фрагмент Ρν по и. 13, отличающийся тем, что содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 14Р7 и вариабельную область легкой цепи, последовательность которого представляет собой указанное ниже:

РП

О I ΟΜΤαΤΡ58Ι.5Α5ν(50ΚνΤΙ ТС

С ОРМ й А 5 а 5 I 5 8 Р ί N

Яг 2 νγγαακροκΑρκίίΐ γ

СОК 2

А А 8 Ν ί О 8

РгЗ <3νΡ8ΚΡ3£ΪΚβ5ΘΤΟΡΤΙ.ΤΙ881.αΡΕΟΡΑΑΥΥΟ

СОЯЗ

ОСбУТТРЬТР

Рг4 οαοτκίΕίκ
15. Одноцепочечный фрагмент Ρν по и. 13, отличающийся тем, что содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 14Р7 и вариабельную область легкой цепи, последовательность которого представляет собой указанное ниже:

-15 008353

РН

а 5 ν V т а Р Р 8 А 8 О О Р 6 О 5 ί Т 1 8 С СОЯ 1 тот 5 5 о V 6 6 Υ N н V 5 Рг2 ΪΥΥ О О Н Р о К А Р К ί м 1 Υ СОЯ 2 ϋ V 8 К Я Р 3 РгЗ О V Р Н Я Р 8 6 8 К 8 6 N т А 8 1 Т V 8 о ίΟΑΕΟΕΑνΥΥΟ СОЯЗ 5 5 Υ А О 8 N N ί V Р

Рг4 οοοτκντνί
16. Одноцепочечный фрагмент Εν по п. 13, отличающийся тем, что содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 14Е7 и вариабельную область легкой цепи, последовательность которого представляет собой указанное ниже:

Рг1

8 3 Е ь т О О Р А V 8 V Α ί 6 а т V Я 1 т с С ОЯ1 ООО 8 ί. Я 8 Υ Υ А 8 Рг2 νν γ а О к Р О 0 А Р V Ь V 1 Υ СОЯ 2 С К N N я Р 8 РгЗ О I Р О я Р 5 6 8 5 8 6 N т А 8 Ь т 1 Т 6 ΑΟΑΕΟΕΑΟΥΥΟ СОЯЗ N 8 Я О 8 8 в N Н V V Р

Рг4 е е е т к ί т ν ь
17. Клеточная линия, отличающаяся тем, что экспрессирует рекомбинантное антитело по любому из пп.1-4.
18. Клеточная линия, отличающаяся тем, что экспрессирует одноцепочечный фрагмент Εν по любому из пп.5-16.
19. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолей, отличающаяся тем, что содержит рекомбинантное антитело по любому из пп.1-4.
20. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолей, отличающаяся тем, что содержит одноцепочечный фрагмент Εν по любому из пп.5-16 и соответствующий наполнитель.
21. Применение фармацевтической композиции по и. 19 для лечения злокачественных опухолей мо

-16008353 лочной железы, и меланом, и их метастазов и рецидивов.
22. Применение фармацевтической композиции по и.20 для лечения злокачественных опухолей молочной железы, и меланом, и их метастазов и рецидивов.
23. Реагент для определения локализации и идентификации ίη νίνο злокачественных опухолей, отличающийся тем, что содержит рекомбинантное антитело по любому из пи. 1-4 и соответствующий маркер.
24. Реагент по и. 23, отличающийся тем, что может использоваться для определения локализации и идентификации ίη νίνο злокачественных опухолей молочной железы, и меланом, и их метастазов и рецидивов.
25. Реагент для определения локализации и идентификации ίη νίνο злокачественных опухолей, отличающийся тем, что содержит одноцепочечный фрагмент Εν по любому из пи.5-16 и соответствующий маркер.
26. Реагент по и.25, отличающийся тем, что может использоваться для определения локализации и идентификации ίη νίνο злокачественных опухолей молочной железы, и меланом, и их метастазов и рецидивов.

А)

10 УН 14 £7 ОУОЦ№ 5Μ&ΙΑΙ УН человека . Т. . V. . .А.УК УН 1417НТ ....0.. А.УУ

УйУ. .К... .Τ.ΪΡ5Υ., .ТЙ.А.СН....V.И.N.N566.ЛУАРА.

УАУ.................А.А.6.....V................

70 90 90 100 НО

УН 1417 КРКА1ЕТАРК85ЯТАЕМУЬЛ5ЕТ5ЕР£АУУУСААВ5Р—АЕАА61УУЗДаЦрУИЙЙЯ!^ШУ85

УН человека ОСЙУТМ.В.А.Г5. .У.Р.Й..Й.Р. . . .Р.. . КЗР. ΡΚ5ΡΥΥΝΕΡ.5 .ТЕ. V. ........ .

УН 14Е7НТ ................................................................

В)

УК 14£7 УК человека

УК 14£7ЬТ

10 20 30 4050 □ЬУЕТ05РАТЕ5УТР6Р5У5^^^^ЙШЙИУ00^Ш^ .ΙΟΜ.Ζ..55..А5У.ВК.Т1Т. . ..ΖΤ..3Υ.В..ΖΖΚΡ6ΚΑ.В...ΥΑ..ВЬИ..V ......................................АТНЕV

70 80 90100

УК 14 £7 ЙМИМРРТЕ8115УЕТЕРЕ6МУЕСОО8ЛКИРЕТР6А6ТКЕЕЕКАА

УК человека .....В..ЕТ.5.ΕΖΡΖΒ.АТ.У.ΖΖ.Υ.8,Т...2..й.ΖΙ...

УК 14£7кТ .............................................

с О

0 2,5 5 7,5

-•—мышиное СМЗ(МеиОс)-1417

-·— химерное С М3( Меи Со )-1417 мышиное бМЗ(1Чеибс)-10гС5 —о— мышиное СМЗ-14Г7 —о— химерное СМ3-1417 —л— мышиное СМЗ-(ОгС5

С(тАЬ) мкг/мл

Фиг. 2

- 17008353

Контроль МАЬ14Е7

В)

Кровеносные 12 сосуды

10 ‘

Θ 6 4 2 о -*

Контроль ^МАЬΉΕ7

Фиг. 4

- 18008353

СОНТ

14Р7Май 2Ат зсру ЗРт есРу 7ВЫ( есру 7АЫ 5сРу βΒ Ы есру

О Ь V ί Т О 5 I . I . Μ ΐ . . . . ι о м . . т . . ι о м . . т . О 8 V V , . Р . 8 5 Е ί . . О .

А Т к 5 4 Т Р<

. 8 . А . 8 ί.

8 8. . А 5 ί.

5 8. . А 8 V.

3 А . О 6 . .

V . . А I.

О 8 V 8 Р 5С

О К А Т I ..

. й . Т I ..

. « . Т I т.

β , ί Т I ,.

ОТ. К I т .

ВАЗа

....8483

5 I 8 Ν Ν ίН . 8 У 8 Υ М.

О . . . Ϋ .N . . . $ Г .N с α γ . н νз

18. Υ Υ А 3

1г2 СОВг ГгЗ

VI Υ 0 0 я . . К т Р н с Е 0 5 Р Р Я 1 Ь 1 К . . . К Υ А 8 0 N 8 ί 1 3 Е . 6 1 Р 5 Я Р . V . А . . 8 6 3 В 8 6 Т 0 Р . К Р 0 О т V К . . . V т Я Ь н , . V ... . Υ . К Р с К А К . . . Υ А N ί а . .V ... . . . Я . н Р 6 К А К . м . Υ □ 4 К Я Р . . V . н . . К . . N т А . К Р <3 0 А 4,4. Υ 6 К N N Р Р . . . 0 . . 3 . . N т А

сояз

1г 3 (г4

Т 1 8 1 1 А V Е Т Е 0 Р 6 Μ Υ Р С а 0 3 N я и Р ί Т Р 6 А О Т К ί Е ί К н Р Е . . А А т . Υ . В Я ϋ V 1 3 . Т . 3 N ί а . . ι А т . 6 т ί Р . . т . 3 8 ί а Р . . . А А . Υ . 6 Ϋ т т . а . . . . 8 . Т V 5 6 ί а А . . Е А V . Υ . 3 8 Υ А 6 3 N N V . .6...4 Т V ί 8 . Т . т 6 А 0 А . . Е А 0 . Υ . N 8 я ϋ 3 3 6 N Н V V . . 6 . . . . т V ь

Фиг. 6

ΒΝ- ацетил 6М1 □ Ν- гликолил СМ2 □Ν- ацетил СМ2 И-ацетил 601а □ Н-ацетил 601Ь (ЗН* ацетил 603 Ν ацетил 6Т1Ь Н ГЛИКОЗИЛ СМ3 □Ν. ацетил ΟΝΒ

Клон

Фиг. 7 !-♦—2Агт> I !-»-7АЫ —ЗРт

-ЧК— 7ВЬк ¹

Фиг. 8

- 19008353

Перечень последовательностей <110> СЕЫТНО ОЕ ίΝΜϋΝ0!_03!Α ΜΟΙΕΟυίΑΗ

ΟΕΝΤΚΟ ϋΕ ΙΝΜϋΝΟί-ΟΘΙΑ МОБЕСиЬАР <120> Рекомбинантные антитела и фрагменты, распознающие N-гл и коп и л ганглиозид ОМЗ и их применение в диагностике и лечении злокачественных опухолей, <130> Си 92/2003 <140> си 92/2003 <141> 2003-04-23 <160> 58 <170> Ра1еп11п νβΓδίοη 3.2 <210> 1 <211> 5 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221 > ДОМЕН <222> (1)..(5) <400> 1 бег Туг Тгр Не Ηί3

1 5 <210> 2 <211> 17 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)..(17) <400> 2

Туг Не Азр Рго А!а ТНг А!а Туг ТЬг С1и 5ег Азп С1п Ьуз РЬе Ьуз 1 5 10 15

Азр <210> 3 <211> 16 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)..(16)

-20008353 <400> 3

ΘΙυ Зег Рго Агд Ьеи Агд Агд С1у Не Туг Туг Туг А!а Ме1 Азр Туг 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221 > ДОМЕН <222> (1)..(11) <400> 4

Агд А!а Зег ΘΙη Зег Не Зег Азп Азп Ьеи Ηίβ 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> белок <213> домовая мышь <220* <221 > ДОМЕН <222* (1)..(7) <400> 5

Туг А1а Зег ΘΙη Зег Не Зег

1 5 <210> 6 <211> 9 <212> белок <213* домовая мышь <220>

<221 > ДОМЕН <222* (1)..(9) <400> 6

ΘΙη ΘΙη Зег Азп Агд Тгр Рго 1еи ТИг

1 5 <210> 7 <211> 30 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221 > ДОМЕН <222> (1)..(30)

-21 008353 <400> 7

С1п 7а!0!п 1_еи βΐη Θίη Зег С1у Азп О1и (.ей А!а Буз Рго 31у А!а

1 5 10 15 *

Зег Ме! |_уз Ме! Зег Суз Агд А1а Зег О!у Туг Зег РЬе ТЬг

20 25 30 <210> 8 <211* 14 <212> белок <213> домовая мышь <22О>

<221 > ДОМЕН <222> (1)..(14) <400> 8

Тгр 1еи !_уз ΘΙη Агд Рго Азр ΘΙπ С1у ίβυ С1и Тгр Не О1у 1 5 10 <210> 9 <211> 32 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)..(32) <400> 9

Ьуз А!а Не Ьеи ТЬг А!а Азр Агд Зег Зег Азп ТЬг А!а РЬе Ме! Туг 1 5 10 15

Ьеи Азп Зег (.ей ТЬг Зег ΘΙυ Азр Зег А!а \/а1 Туг Туг Суз А1а Агд 20 25 30 <210> 10 <211> 11 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221 > ДОМЕН <222> (1)..(11) <400> 10

Тгр С(у С1п 31у ТЫ ТЫ Уа! ТЬг Уа! Зег Зег

1 5 10 <210> 11

-22008353 <211> 23 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)..(23) <400> 11

Азр Ьеи \/а1 Ьеи ТЬг ΘΙη Зег Рго А!а ТИг Ьеи Зег \/а1 ТЬг Рго С1у 15 10 15

Азр Зег Уа! Зег РЬе Зег Суз <210> 12 <211> 15 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)..(15) <400> 12

Тгр Туг ΘΙη ΘΙπ Агд ТЬг Н1з С1и Зег Рго Агд Ьеи Ьеи Не Ьуз

15 10 15 <210> 13 <211> 32 <212> белок <213> домовая мышь <220* <221> ДОМЕН <222> (1)..(32) <400> 13

С51у Не Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег <3!у Зег С1у ТНг Азр РЬе ТЬг 15 10 15

Ьеи Зег Не Не Зег Уа1 ΘΙυ ΤΙίγ ΟΙυ Азр РЬе <3<у Ме1 Туг РЬе Суз 20 25 30 <210* 14 <211> 12 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)..(12)

-23 008353 <400> 14

РЬе О!у А1а О!у ТЬг Ьуз Ьеи б!и Ьеи Ьуз Агд А!а 1 5 10 <210=- 15 <211> 43 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(43) <400> 15 дддда!а!сс асса1ддааа ддсайдда! сШс(сйс с(д <210> 16 <211> 30 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(30) <400> 16 ддддсйдй даддадасдд (аассд!дд( <210=- 17 <211=- 48 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(48) <220>

<221=- первичный транскриггт <222> (1)..(43) <400> 17 дддда»а(сс асса(дд(а( Йсс1асасс (садайасс йддасй <210=- 18 <211> 35 <212> ДНК <213=- домовая мышь <220* <221> первичный транскрипт <222> (1)..(35) <400> 18

-24008353 адсдйдас! !асдй1сад йссадсйд д(ссс <210? 19 <211? 42 <212> ДНК <213? домовая мышь <22О>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(42) <400? 19 д!ссадсйд 1дсад1с1дд ддс(даад1д д!аааасс!д дд <210? 20 <211? 30 <212> ДНК <213? домовая мышь <220>

<221 > первичный транскрипт <222> (1)..(30) <400> 20 ддддс1адс1 даддадасдд (дассд!дд( <210> 21 <211> 42 <212> ДНК <213> домовая мышь <220?

<221 > первичный транскрипт <222> (1)..(42) <400? 21 сссаддйй ассасйсад ссссадас!д сасаадс1дд ас <210> 22 <211> 43 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221 > первичный транскрипт <222> (1)..(43) <400> 22 ддддаЗДсс асса(ддааа ддсас!дда( сШсТсйс с£д <210> 23 <211> 27 <212> ДНК <213? домовая мышь

-25 008353 <220 <221> первичный транскрипт <222> (1)..(27) <400 23 ддддсйсад (даддд(д!с йдсадд <210> 24 <211> 30 <212> ДНК <213> домовая мышь <22О>

<221 > первичный транскрипт <222> (1)..(30) <400> 24 ддддс’адс( даддадасдд 1дассдгдд1 <210> 25 <211> 27 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221? первичный транскрипт <222> (1)..(27) <400> 25 сйдсаддас ассс1сас1д аддсссс <210 26 <211> 43 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221* первичный транскрипт <222> (1)..(43) <400 26 ддддакз1сс асса1ддааа ддсас!дда1 сЖс1сНс С1д <210> 27 <211> 33 <212> ДНК <213=· домовая мышь <220>

<221 > первичный транскрипт <222> (1)..(33) <400* 27

-26008353 сайддйаа дасаддсасс 1ддссаддд‘ с(д <210> 28 <211> 30 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(30) <400> 28 ддддс1адс1 даддадасдд 1дассд1дд1 <210> 29 <211> 33 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(33) <400 29 садассс1дд ссадд1дсс1 дЮйаасса д1д <210> 30 <211> 43 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(43) <400> 30 дддда1а1сс асса1ддааа ддсас1дда‘ ййс1сйс с1д <210> 31 <211> 21 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(21) <400> 31

Йддаа(ддд Йдда1аса11 <210> 32 <2130 <212> ДНК <213> домовая мышь

-27008353 <220>

<221 > первичный транскрипт <222* (1)..(30) <400> 32 ддддсйдс1 даддадасдд 1дассдГдд1 <210> 33 <211> 21 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(21) <400> 33 аа1д(а(сса асссаНсса д <210> 34 <211> 43 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(43) <400> 34 дддда1а1сс асса^ддааа ддсас1дда( сШс‘сйс с1д <210> 35 <211> 30 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(30) <400> 35

1а1саасааа аассадд(са дЮссаадд <210> 36 <211> 35 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(35) <400> 36 адсд1сдас( 1асдйсад с1ссадсйд д1ссс

-28008353 <210> 37 <211> 30 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(30) <400> 37 ссйддадас (дассйддй Шдйда{а <210> 38 <211> 48 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> 1 первичный транскрипт <222> ¢1)..(48) <400> 38 ддддаййсс асса1дд1а1 Псс1асасс (садайасс «ддасй <210> 39 <211> 21 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(21) <400> 39 ай1с1дддд 1сссс(ссад д <210> 40 <211> 35 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(35) <400> 40 адсд1сдас( 1асд1йсад с1ссадсйд д1ссс <210> 41 <211> 21 <212> ДНК <213> домовая мышь

-29008353 <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)-.(21) <400* 41 сс1ддадддд ассссадааа I <210* 42 <211> 48 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(48) <400> 42 ддддаЗДсс асса1дд(а1 Ксс1асасс ‘садабасс йддасй <210> 43 <211> 50 <212> ДНК <213> домовая мышь <22С>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(50) <400> 43 йс1айс!с асад'дсаса ддсадд!д{с адс1д1асад сад1са‘дда <210> 44 <211> 51 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1).-(51) <400> 44 йс!айс(с асад(дсаса ддсаад*с1с аадс^дсадс адс1с1дддд с <210> 45 <211> 53 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(53) <400> 45 йсйййс асад^дсаса ддаадд’даа дс(д1дс!дс дадМддад дда

-30008353 <210> 46 <211> 50 <212* ДНК <213> домовая мышь <220* <221> первичный транскрипт <222* {1)..(50) <400> 46 даассад1ас 1ссаддсс1д аддддссдса дадасад!да ссададЩсс <210> 47 <211> 50 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(50) <400> 47 даассад|ас (ссаддсс{д аддддссдад дадасдд(да с1даддПсс <210> 48 <211> 54 <212> ДНК <213=- домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(54) <400> 48 даассад(ас (ссаддсс(д аддддссдад дадасд1д!д адссад!дда дссс <210> 49 <211> 40 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(40) <400> 49 д‘ас!ссад{ сдасдасай д!дса1дай ассад(с1сс <210> 50 <211> 40 <212> ДНК <213> домовая мышь <220=· <221> первичный транскрипт

-31 008353 <222> (1)..(40) <400> 50 д!ас‘ссад{ сдасда!а!с сада(дасас садаас1асс <21 О> 51 <211> 39 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221> первичный транскрипт <222> (1)..(39) <400> 51 д!ас1ссад( сдассдаааг (дйдШсас ссад1с1сс <210> 52 <211> 39 <212> ДНК <213> домовая мышь <220>

<221 > первичный транскрипт <222> (1)..(39) <400> 52 ааддаааааа дсддссдсй йса1д(с!с садсйдд!

<210> 53 <211> 39 <212> ДНК <213> домовая мышь <220* <221> первичный транскрипт <222> (1)..(39) <400> 53 ааддаааааа дсддссдсй Йда1дс1сс аасйд(д1 <210> 54 <211> 111 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221* ДОМЕН <222> (1)..(111) <400> 54

Азр 1!е Уа1 Ме! РЬе ΘΙη Зег Рго А1а Зег Ьеи А1а Уа! Зег Ьеи О1у 15 10 15

-32008353

ΘΙη Агд А1а ТЬг Не Зег Суз Агд А!а Зег ΘΙη Зег \/а1 Зег Зег Зег 20 2530

Зег Туг Зег Туг Ме1 Нгз Тгр Туг ΘΙπ <31п Буз Рго С1у ΘΙη Рго Рго 35 4045

Буз Ьеи Беи Не Буз Туг А1а Зег Азп Беи ΘΙυ Зег С1у Уа1 Рго А1а 50 5560

Агд РЬе Зег О1у Зег О1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Беи Азп Не ΗΪ3

65 70 7580

Рго Х/а! 61и 61и С1и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз ΘΙη Н1з Зег Агд

85 9095

Азр Уа! Рго Беи ТЬг РЬе С1у А1а С1у ТЬг Буз Беи С1и Не Буз

100 105110 <210> 55 <211> 107 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)..(107) <400> 55

Азр Не ΘΙη Ме! ТЬг ΘΙη ТЬг Рго Зег Зег Беи Зег А1а Зег Беи С!у

15 1015

Азр Агд Уа! ТЬг Не Зег Суз Агд А1а Зег ΘΙη Азр Не Зег Азп Туг

20 2530

Беи Азп Тгр Туг ΘΙη ΘΙη Буз Рго Азр О1у ТЬг Х/а1 Буз Беи Беи Не 35 4045

7а! Туг ТЬг Зег Агд Беи Ηίβ Зег С!у Уа! Рго Зег Агд РЬе Зег О!у 50 5560

Зег О!у Зег О1у ТЬг Азр Туг Зег Беи ТЬг Не Зег Азп Беи Θΐυ ΘΙη

65 70 7580

С!и Аер Не А!а ТЬг Туг РЬе Суз ΘΙη ΘΙη С!у Азп ТЬг Беи Рго Рго

Э5 9095

ТЬг РЬе О1у А!а О1у ТНг Буз Беи О1и Беи Буз

100105

-33 008353 <210> 56 <211> 107 <212> белок <213> домовая мышь <220 <221 > ДОМЕН <222> (1)-.(107) <400> 56

Азр Не Θίη Ме1 ТЬг ΘΙη ТЬг Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа! 0!у 15 1015

Авр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг С,ув Агд А1а Зег ΘΙη Зег Не Зег Зег РЬе 20 2530

Ьеи Азп Тгр Туг ΘΙη С!п Ьуз Рго 01у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 4045

Туг А1а А!а Зег Азп Ьеи ΘΙη Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 6!у 50 5560

Агд С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи О1п Рго 65 70 7580

С1и Азр РЬе А1а А!а Туг Туг Суз С1п ΘΙη С1у Туг ТЬг ТЬг Рго Ьеи

85 9095

ТЬг РЬе С!у ΘΙη С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Ьеи Ьуз 100105 <210> 57 <211> 111 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221 > ДОМЕН <222> (1)..(111) <400 57

ΘΙη Зег Уа! Уа! ТЬг ΘΙη Рго Рго Зег ТЬг А!а Зег С1у <3!у Рго О!у 15 1015

ΘΙη Зег Ьеи ТЬг Не Зег Суз ТЬг С!у ТЬг Зег Зег Азр Х/а! С1у С!у 20 2530

Туг Азп Ηίδ Уа! Зег Тгр Туг ΘΙη ΘΙη Ηίδ Рго С1у Ьуз А!а Рго Ьуз 35 4045

-34008353

Ьеи Ме( Не Туг Азр Уа1 5ег Ьуз Агд Рго Зег С1у Уа1 Рго Ηίβ Агд 50 5560

РЬе Зег С1у Зег Ьуз Зег С1у Азп ТЬг А!а Зег Ьеи ТЬг УаI Зег С1у 65 70 7580

Ьеи ΘΙη А1а С1и Азр б!и А1а У а! Туг Туг Суз Зег Зег Туг А1а О1у 85 9095

Зег Азп Азп Ьеи Уа1 РЬе О1у 61у О1у ТЬг Ьуз Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи 100 105110 <210> 58 <211> 109 <212> белок <213> домовая мышь <220>

<221> ДОМЕН <222> (1)..(109) <400> 58

Зег Зег С1и Ьеи ТЬг ΘΙπ Азр Рго А!а ТЬг Уа1 ЗегУа! А1а Ьеи С1у 15 1015

ΘΙπ ТЬг Уа) Агд Не ТЬг Суз ΘΙη О!у Азр Зег Ьеи Агд Зег Туг Туг 20 2530

А!а Зег Тгр Туг С!п ΘΙπ Ьуз Рго О1у ΘΙπ А!а Рго Уа! Ьеи Уа1 Не 35 4045

Туг С!у Ьуз Азп Азп Агд Рго Зег Θ 1у Не Рго Азр Агд РЬе Зег С1у 50 5560

Зег Зег Зег С1у Азп ТЬг А1а Зег Ьеи ТЬг Не ТЬг <3!у А!а ΘΙη А!а 65 70 7580

С1и Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз Азл Зег Агд Азр Зег Зег С1у Азл

85 9095

ΗΪ8 Уа1 Уа! РЬе Θίγ ΘΙγ С1у ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи