CN108025064A - 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体和其用于诊断与治疗癌症的用途 - Google Patents
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体和其用于诊断与治疗癌症的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗GPC3抗体和其应用。本发明研究抗GPC3抗体对肿瘤生长、增殖、迁移的潜在抑制性影响和其诊断性与治疗性目的的应用。
Description
技术领域
本发明涉及用于诊断与治疗癌症的抗体。确切地说，本发明涉及抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3；GPC3)抗体和其在癌症治疗中的用途。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)为一种高度表达于HCC和一些其它人类癌症(包括黑素瘤)中的细胞表面蛋白。GPC3基因编码具有580种氨基酸的70-kDa前体核心蛋白，所述前体核心蛋白可通过弗林蛋白酶(furin)裂解生成40-kDa氨基(N)末端蛋白和30-kDa膜结合羧基(C)末端蛋白，所述蛋白具有两个硫酸乙酰肝素(HS)聚糖链。已在哺乳动物中鉴别出六种磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC1-6)。所有磷脂酰肌醇蛋白聚糖均具有特征性结构。这些共同特征表明磷脂酰肌醇蛋白聚糖可具有相似三维(3D)结构。
还在HCC细胞中发现GPC3与FGF-2之间的相互作用(绿川,Y.(Midorikawa,Y.)等人,(2003).国际癌症杂志(International journal of cancer Journal internationaldu cancer)103,455-465)。曾假设认为缺乏GPI锚定域的突变GPC3可阻断Wnt信号传导并且抑制Wnt依赖性肿瘤的生长。然而，我们无法排除可因其它因子(如通过HS链调节的肝素结合生长因子)的活性所致而抑制HCC生长的可能性。肝细胞癌(HCC)与胆管癌(CCA)为原发性肝癌的两种主要形式。越来越多的证据支持GPC3为针对HCC的新型肿瘤标记。GPC3高度表达于HCC细胞系、HepG2、Hep3B、HT17、HuH6、HuH7和PLC/PRF中(宋,H.H.(Song,H.H.)等人,(2005).生物化学杂志(The Journal of biological chemistry)280,2116-2125)。此外，GPC3高度表达于HCC中(胡,H.C.(Hsu,H.C.),程,W.(Cheng,W.)和赖,P.L.(Lai,P.L.)(1997).癌症研究(Cancer research)57,5179-5184)而并非CCA或正常肝脏组织中。GPC3还以较小程度表达于黑素瘤(中冢,T.(Nakatsura,T.)等人,(2004a).临床癌症研究：美国癌症研究协会官方杂志(Clinical cancer research:an official journal of theAmerican Association for Cancer Research)10,6612-6621)、卵巢透明细胞癌(斯塔德尔曼,S.(Stadlmann,S.),居特(Gueth)等人,(2007).临床癌症研究：国际妇科病理学家协会官方杂志(Clinical cancer research:an official journal of the InternationalSociety of Gynecological Pathologists)26,341-344)、卵黄囊肿瘤(辛格,D.L(Zynger,D.L)等人,(2006).美国外科病理学杂志(The American journal of surgicalpathology)30,1570-1575)、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、威尔姆斯氏肿瘤细胞(Wilms'tumor cell)和其它肿瘤中(鲍胡尔,D.(Baumhoer,D.),托尼罗(Tornillo)等人,(2008).美国临床病理学杂志(American journal of clinical pathology)129,899-906；赛卡利,Z.(Saikali,Z.)和辛奈特,D.(Sinnett,D.)(2000).国际癌症杂志(International journalof cancer Journal international du cancer)89,418-422)。另一方面，GPC3沉默于乳癌、间皮瘤、上皮卵巢癌和肺腺癌中。当使用抗人类GPC3(残基303-464)而产生的兔多克隆抗体时，在大于70％的HCC肿瘤而非正常肝脏组织中发现GPC3蛋白表达(中冢,T.(Nakatsura,T.)等人,(2003).生物化学与生物物理研究通讯(Biochemical andbiophysical research communications)306,16-25)。由于发现GPC3阳性HCC患者的存活率比GPC3阴性HCC患者明显低5年，因此GPC3表达与HCC中的不良预后相关(白川,H.(Shirakawa,H.)等人(2009).癌症科学(Cancer science)100,1403-1407)。由于GPC3显示出在HCC中的高表达，因此其具有作为肿瘤特异性疗法的有前景目标的可能性。此外，因为可在一些患有GPC3阳性癌症的患者的血液中检测到少量GPC3(卡普罗,M.(Capurro,M.)等人,(2003).胃肠病学(Gastroenterology)125,89-97；黑波,Y.(Hippo,Y.)等人,(2004).癌症研究(Cancer research)64,2418-2423)，因此测量血液中的GPC3可作为追踪这些患者的病程的适用性诊断。
鉴于GPC3在HCC、黑素瘤和卵巢透明细胞癌中的高表达，已评估出GPC3作为基于抗体的免疫疗法和基于细胞的免疫疗法的潜在候选物的有效性。在2003年，报告将对抗由17个残基(355-371)组成的GPC3肽的mAb用于研究GPC3与FGF-2的相互作用(绿川,Y.(Midorikawa,Y.)等人,(2003).国际癌症杂志(International journal of cancerJournal international du cancer)103,455-465)。随后，产生对GPC3蛋白的C端的最后70种氨基酸具有特异性的mAb(IgG1，κ)(卡普罗,M.(Capurro,M.)等人,(2003).胃肠病学(Gastroenterology)125,89-97)和两种对GPC3的残基25到358具有特异性的mAb并且将其用于检测HCC患者中的血清GPC3(黑波,Y.(Hippo,Y.),瓦塔纳贝(Watanabe)等人,(2004).癌症研究(Cancer research)64,2418-2423)。尽管实验室均使用具有两个不同端基的mAb，但他们仍在HCC患者中发现相似比例的GPC3阳性血清。此外，山内(Yamauchi)等人使用缺少GPI锚的GPC3蛋白作为免疫原来获得两种分别针对GPC3的N端和C端的mAb。这些mAb用于癌症的免疫组织化学分析(山内,N.(Yamauchi,N.)等人,(2005).现代病理学：美国与加拿大病理学学院官方杂志(Modern pathology:an official journal of the United Statesand Canadian Academy of Pathology,Inc)18,1591-1598)。
近期已描述识别GPC3的残基524到563的第一治疗性mAb(石黑,T.(Ishiguro,T.)等人,(2008).癌症研究(Cancer research)68,9832-9838；中野,K.(Nakano,K.)等人,(2009).生物化学与生物物理研究通讯(Biochemical and biophysical researchcommunications)378,279-284)。命名为GC33的mAb会诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)并且在小鼠中展现对经皮下移植的HepG2和HuH-7异位异种移植物的肿瘤生长抑制。GC33还会降低正位模型中肝内移植有HepG2细胞的小鼠的血液α-胎蛋白水平。人类化GC33(hGC33)与抗HepG2异种移植物的GC33一样有效。(中野,K.(Nakano,K).,石黑(Ishiguro)等人,(2010).抗癌药物(Anti-cancer drugs)21,907-916)。GC33的ADCC抗肿瘤活性主要归因于自然杀手细胞(石黑,T.(Ishiguro,T.),杉本(Sugimoto)等人,(2008).癌症研究(Cancer research)68,9832-9838)。另一方面，高井(Takai)等人已研究出GPC3的膜表达与肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)的募集之间的关系(高井,H.(Takai,H.)等人,(2009a).癌症生物学与疗法(Cancerbiology&therapy)8,2329-2338；高井,H.等人,(2009b).国际肝脏：国际肝脏研究协会官方杂志(Liver international:official journal of the International Associationfor the Study of the Liver)29,1056-1064)。他们在使用GC33的抗GPC3免疫疗法模型中观测到经浸润的TAM的参与，其显示巨噬细胞可通过非ADCC机制(如调节GPC3功能)对GC33的抗肿瘤活性起到重要作用(高井,H等人,(2009c).癌症生物学与疗法(Cancer biology&therapy)8,930-938)。此外，GC33并未直接抑制GPC3阳性肿瘤细胞的增殖。为全面评估GPC3靶向抗体疗法，靶向GPC3的不同功能域(包括HS链)的mAb应具有适用性。所关注的为研究能够通过阻断Wnt和/或其它信号传导路径而直接抑制癌细胞增殖和/或存活率的抗GPC3mAb的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明至少基于以下发现：GPC3蛋白中所存在的功能域或抗原决定基可充当诊断性和/或治疗性应用的潜在目标。因此，本发明的各方面表征抗GPC3抗体并且说明抗GPC3抗体对肿瘤生长、增殖、迁移和其诊断性和治疗性目的的应用的潜在抑制性影响。确切地说，肝细胞癌(HCC)仍为世界范围内的常见恶性癌症。存在鉴别用于研发新颖治疗性方法的新型分子标靶的迫切需要。本发明意外地发现，鉴于GPC3显示出在HCC中的高表达，其为用于肝癌疗法的有前景的候选物。本文中显示，膜结合PGC3分子为免疫疗法的治疗性标靶并且可溶性GPC3可为适用于HCC的血清生物标记。
在一个方面中，本发明提供一种抗GPC3分离抗体和/或其抗原结合部分，其包含以下中的至少一个：重链互补决定区1(H-CDR1)，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:4中的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；重链CDR2(H-CDR2)，其包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:9中的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；和重链CDR3(H-CDR3)，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或与SEQ ID NO:10到SEQ ID NO:14中的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；和以下中的至少一个：轻链CDR1(L-CDR1)，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17或与SEQ ID NO:15到SEQ ID NO:17中的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；轻链CDR2(L-CDR2)，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22或与SEQ ID NO:18到SEQ ID NO:22中的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；和轻链CDR3(L-CDR3)，其包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:23到SEQ ID NO:27中的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；以使得所述分离抗体或其抗原结合部分与GPC3结合。
在一些实施例中，本发明提供包含氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有选自由如SEQ ID NO:28到SEQ ID NO:35中所列的序列组成的群组的序列。
在一些实施例中，本发明提供包含氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有选自由如SEQ ID NO:36到SEQ ID NO:43中所列的序列组成的群组的序列。
在另一方面中，本发明还提供一种与GPC3结合的抗体和/或其片段，其中重链CDR中的至少一个和/或轻链CDR中的至少一个包含至少一个氨基酸修饰。
在一个实施例中，抗体为人类化scFv抗体。在另一实施例中，人类化scFv抗体包含具有如SEQ ID NO:34中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:42中所列的氨基酸序列的轻链(G5S1人类化scFv抗体)。在另一其它实施例中，本发明包含人类化scFv抗体，其包含具有如SEQ ID NO:35中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:43中所列的氨基酸序列的轻链(GES1人类化scFv抗体)。
在另一方面中，本发明提供一种医药组合物，其包含本发明抗GPC3抗体和医药学上可接受的载剂或赋形剂。
在另一方面中，本发明提供一种用于治疗有需要的个体中的癌症的方法，所述方法包含向个体给予有效量的医药学上可接受的包含本发明抗GPC3抗体的组合物。
在另一方面中，本发明提供一种用于诊断癌症的方法，所述方法包含在样本中检测本发明抗体与GPC3蛋白的结合。
在一个实施例中，本发明提供一种用于诊断个体中的肝硬化或肝癌的方法，所述方法包含在生物样本中检测本发明抗体与GPC3的结合，其中所述结合指示个体存在罹患肝硬化和肝癌的可能性。
附图说明
图1显示GPC3_ECD蛋白的分析结果。
图2显示使用ELISA的抗GPC3抗体的结合活性。
图3显示SDS-PAGE上对经纯化的scFv抗体的分析。
图4A到C显示鸡的GPC3基因的所选scFv序列(555S1、S8和GPC3S1、S2、S6、S8)的重链(A)和轻链(B)和本发明的人类化scFv序列(G5S1人类化scFv序列和GES1人类化scFv序列)的重链和轻链。
图5A到D显示四个肝肿瘤细胞系(第1道到第4道)和四个肉瘤样肝肿瘤细胞系(第5道到第8道)的细胞溶解产物的电泳分析。A：还原条件下的市售GPC3胞外域蛋白(第C道)并且上部箭头显示C端片段并且下部箭头显示N端片段；B：两个经抗GPC3聚IgY所鉴别的片段；C：经G5S1scFv所鉴别的片段；D：经GES1scFv所鉴别的片段。
图6显示特异性抗GPC3scFv抗体在ELISA上的结合分析。
图7A和B显示特异性抗GPC3scFv抗体对肝肿瘤细胞的增殖抑制。A：特异性抗GPC3scFv抗体在不同天数时的增殖抑制；并且B：特异性抗GPC3scFv抗体在不同浓度下的增殖抑制。
图8显示使用流式细胞测量术的特异性抗GPC3scFv抗体的结合分析。
图9A和B显示使用免疫荧光染色的特异性抗GPC3scFv抗体的结合分析；Hep 3B细胞(A)和Hep G2细胞(B)。
图10显示使用免疫沉淀分析的特异性抗GPC3scFv抗体的结合分析。
图11显示群落形成分析上的特异性抗GPC3scFv抗体的抑制。
图12A、B和C显示细胞周期分析的结果。当用0.5μM G5S1和GES1scFv抗体处理时，细胞在G1期中停滞(A和B)。在经GES1和G5S1处理的HepG2细胞中，细胞群体在subG1阶段中分别明显增加到28.8％和16.6％，其可由细胞凋亡的诱导引起(C)。
图13显示特异性抗GPC3scFv抗体对细胞迁移的抑制。
图14A和B显示G5S1和GES1对人类Hep3B异种移植模型(A)和小鼠体重(B)的抗肿瘤作用。
图15显示对异种移植小鼠中的肿瘤组织的免疫组织化学分析。
图16A和B显示1mg/Kg和5mg/Kg GES1IgG的肿瘤生长抑制率可分别为32.4％和51.2％，而索拉非尼(sorafenib)仅具有48.8％抑制率(A)。小鼠体重没有明显变化(B)。
图17A到B显示10mg/Kg GES1IgG可明显抑制肿瘤生长(p<0.01)(A)；抗体处理之后，p-AKT和p-Erk的表达水平降低(B、B2-2、B2-3和B2-5)；与通过市售抗体处理的肿瘤组织中的Ki-67蛋白的表达水平相比，通过GES1IgG处理的肿瘤组织中的Ki-67蛋白的表达水平明显降低(C和D)。
具体实施方式
在以下描述中，使用大量术语并且提供以下定义以有助于理解所要求的目标物。在本文中未明确定义的术语会根据其普通并且一般含义加以使用。
定义
除非另外规定，否则一(a/an)意谓“一或多个”。
如本文所用，术语“抗原决定基”是指抗体结合到抗原上的位点。
如本文所用，术语“抗体”是指属于多克隆、单克隆、嵌合和人类化抗体的类别的单链、双链和多链蛋白质和多肽；其还包括这些抗体的合成和基因工程改造变体。“抗体片段”包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段以及对一或多个所需靶抗原决定基具有特异性的抗体的任何部分。
如本文所用，术语“多克隆抗体”是指在一或多个其它不相同抗体中或存在下所产生的抗体。一般来说，多克隆抗体由B-淋巴细胞在数个产生不相同抗体的其它B-淋巴细胞存在下产生。通常，多克隆抗体直接从免疫动物获得。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从大体上均匀抗体的群体而获得的抗体。换句话说，单克隆抗体由均匀抗体组成，所述均匀抗体从单一细胞克隆(例如融合瘤、经针对均匀抗体进行编码的DNA分子转染的真核宿主细胞，或经针对均匀抗体进行编码的DNA分子转染的原核宿主细胞)生长产生。这些抗体针对单一抗原决定基，并且因此具有高度特异性。
如本文所用，“可变域”是指介导抗原结合的域并且界定特定抗体对特定抗原的特异性。抗原结合位点由界定特异性的两个可变域组成：一个位于重链(VH)中并且另一个位于轻链(VL)中。在一些情况下，如在骆驼中所发现的来自重链抗体的单域抗体中，特异性可仅存在于两个域中的单独一个中。天然重链和轻链的可变域包括四个FR，大部分采用β片层配置，由三个高变区连接，形成环。各链中的高变区通过FR极为紧密地结合在一起，并且与其它链的高变区促成抗体的抗原结合位点的形成(参见卡巴特E A(Kabat E A)等人，见上文)。“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或涉及抗原识别。对于所有可变域，编号是根据Kabat(卡巴特E A等人，见上文)。
大量所用CDR定义涵盖在本文中。Kabat定义是基于序列可变性(卡巴特E A等人，见上文)。而Chothia是指结构环的位置(乔西亚C(Chothia C)和莱斯克A M(Lesk A M)(1987)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901-917)。AbM定义由Oxford分子AbM抗体模型化软件使用(马丁A C R(Martin A C R)等人,(1989)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),86:9268-72牛津大学出版社(Oxford University Press),牛津(Oxford),141-172)。最近引入了接触定义(麦卡勒姆R M(MacCallum R M)等人,(1996)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)262:732-745)并且其是基于蛋白质数据库中可获得的可用复杂结构的分析。根据国际免疫遗传学信息系统(the international ImMunoGeneTicsinformation system).RTM(http://www.imgt.org)，CDR的定义是基于所有物种的所有免疫球蛋白和T细胞受体V区的IMGT编号(国际免疫遗传学信息系统；勒弗朗M P(Lefranc M P)等人,(2005)发展和比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)29(3):185-203；凯斯Q(Kaas Q)等人,(2007)功能基因组学和蛋白组学简报(Briefings in FunctionalGenomics&Proteomics),6(4):253-64)。
如本文所用，根据优选定义本发明中所论述的所有互补决定区(CDR)。这些CDR的可变域残基是根据编号(勒弗朗M P.(Lefranc M P.),(1999)免疫学家(TheImmunologist.)7:132-136；勒弗朗M P等人,(2003)发展和比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)27(1):55-77))。
如本文所用，术语“人类化抗体”是指一种重组蛋白，其中来自一个物种的抗体，例如鼠或鸡抗体CDR从来自所述物种的抗体的重和轻可变链转移到人类重和轻可变域(构架区)中。抗体分子的恒定域源自人类抗体的那些恒定域。在某些情况下，人类化抗体的构架区的特定残基，尤其接触或接近CDR序列的那些特定残基可经修饰，例如用来自最初鼠、啮齿动物、类人猴或其它抗体的对应残基替代。人类化抗体可通过多种方法达成，包括(i)在保留或不保留关键构架残基的情况下仅将非人类CDR移植(graft)到人类构架和恒定区上，或(ii)移植(transplant)整个非人类可变域，但用类人部分通过替代表面残基“遮盖”所述整个非人类可变域。适用于实践本发明的此类方法包括潘德兰(Padlan),分子免疫学(Mol.Immunol.),31(3):169-217(1994)中所公开的方法。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指含有重和轻抗体链的可变域的重组蛋白，包括源自一个物种的抗体(优选地啮齿动物抗体或鸡抗体、更优选鼠抗体)的互补决定区(CDR)，同时抗体分子的恒定域源自人类抗体的恒定域。
如本文所用，术语“Fv”为含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv种属由一个重链和一个轻链可变域以紧密、非共价结合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种属中，一个重链和一个轻链可变域可通过可挠性肽接头共价连接，以便轻链和重链可结合于类似于双链Fv种属中的结构的“二聚”结构中。在这一配置中，各可变域的三个HVR相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个HVR将抗原结合特异性赋予给抗体。然而，即使单一可变域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)还具有识别并且结合抗原的能力，但其亲和力低于完整结合位点。
如本文所用，术语“诊断性”或“诊断”意谓鉴别病理性病状的存在或性质。
如本文所用，术语“治疗(treatment/treating)”和其类似术语涵盖对哺乳动物中，尤其人类中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)在可易患但尚未诊断为患有疾病的个体中预防所述疾病产生；(b)抑制疾病，即，遏制其发展；和(c)缓解疾病，即，使得疾病消退。
如本文中可互换地所用，术语“个人”、“个体”、“主体”和“患者”是指哺乳动物，其包括(但不限于)鼠(大鼠、小鼠)、非人类灵长类、人类、犬科动物、猫科动物、有蹄动物(例如马科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、山羊)等。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“灵验量”是指当给予哺乳动物或其它个体用于治疗疾病时，足以实现对所述疾病的所述治疗的本发明抗GPC-3抗体的量。
如本文所用，术语“生物样本”涵盖多种样本类型，其从个人、个体或患者获得并且可用于诊断性或监测分析。所述定义涵盖血液和生物来源的其它液体样本；固体组织样本，如活组织检查样本或组织培养物或源自其的细胞，和其后代。
抗GPC-3抗体
本发明涉及与GPC3结合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)抗体和其片段。如本文所用，术语“与GPC3结合的抗体或其片段(antibody or fragment thereof that binds toGPC3)”包括与GPC3结合的抗体或其片段(antibodies or a fragment thereof thatbinds to GPC3)。抗GPC3抗体可增加HCC对化学治疗剂的易感性(石黑,T等人,(2010).美国癌症研究协会第101次年会会刊(Proceedings of the 101st Annual Meeting of theAACR))组合疗法可在临床上适用作抗肝癌疗法。
在一个方面中，本发明提供一种抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下中的至少一个：重链互补决定区1(H-CDR1)，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:4中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；重链CDR2(H-CDR2)，其包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:9中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；和重链CDR3(H-CDR3)，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或与SEQ ID NO:10到SEQ IDNO:14中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；和以下中的至少一个：轻链CDR1(L-CDR1)，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17或与SEQ IDNO:15到SEQ ID NO:17中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；轻链CDR2(L-CDR2)，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22或与SEQ ID NO:18到SEQ ID NO:22中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；和轻链CDR3(L-CDR3)，其包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:23到SEQ ID NO:27中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；以使得所述分离抗体或其抗原结合部分与GPC3结合。优选地，如上所述的序列一致性为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一个实施例中，本发明提供一种抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基的重链互补决定区1(H-CDR1)、包含SEQ ID NO:5的氨基酸残基的重链CDR2(H-CDR2)和包含SEQ ID NO:10的氨基酸残基的重链CDR3(H-CDR3)；和包含SEQ ID NO:15的氨基酸残基的轻链CDR1(L-CDR1)、包含SEQ ID NO:18的氨基酸残基的轻链CDR2(L-CDR2)和包含SEQ ID NO:23的氨基酸残基的轻链CDR3(L-CDR3)。
在一个实施例中，本发明提供一种抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基的重链互补决定区1(H-CDR1)、包含SEQ ID NO:6的氨基酸残基的重链CDR2(H-CDR2)和包含SEQ ID NO:11的氨基酸残基的重链CDR3(H-CDR3)；和包含SEQ ID NO:15的氨基酸残基的轻链CDR1(L-CDR1)、包含SEQ ID NO:19的氨基酸残基的轻链CDR2(L-CDR2)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸残基的轻链CDR3(L-CDR3)。
在一个实施例中，本发明提供一种抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：包含SEQ ID NO:3的氨基酸残基的重链互补决定区1(H-CDR1)、包含SEQ ID NO:7的氨基酸残基的重链CDR2(H-CDR2)和包含SEQ ID NO:12的氨基酸残基的重链CDR3(H-CDR3)；和包含SEQ ID NO:16的氨基酸残基的轻链CDR1(L-CDR1)、包含SEQ ID NO:20的氨基酸残基的轻链CDR2(L-CDR2)和包含SEQ ID NO:25的氨基酸残基的轻链CDR3(L-CDR3)。
在一个实施例中，本发明提供一种抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：包含SEQ ID NO:4的氨基酸残基的重链互补决定区1(H-CDR1)、包含SEQ ID NO:8的氨基酸残基的重链CDR2(H-CDR2)和包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基的重链CDR3(H-CDR3)；和包含SEQ ID NO:15的氨基酸残基的轻链CDR1(L-CDR1)、包含SEQ ID NO:21的氨基酸残基的轻链CDR2(L-CDR2)和包含SEQ ID NO:26的氨基酸残基的轻链CDR3(L-CDR3)。
在一个实施例中，本发明提供一种抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：包含SEQ ID NO:3的氨基酸残基的重链互补决定区1(H-CDR1)、包含SEQ ID NO:9的氨基酸残基的重链CDR2(H-CDR2)和包含SEQ ID NO:14的氨基酸残基的重链CDR3(H-CDR3)；和包含SEQ ID NO:17的氨基酸残基的轻链CDR1(L-CDR1)、包含SEQ ID NO:22的氨基酸残基的轻链CDR2(L-CDR2)和包含SEQ ID NO:27的氨基酸残基的轻链CDR3(L-CDR3)。
重链和轻链中的互补决定区的氨基酸序列分别列于下文中。
重链的CDR
轻链的CDR
根据本发明，本发明抗体的重链和轻链的氨基酸的实施例列于下文中。
在一些实施例中，本发明提供包含氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有选自由如SEQ ID NO:28到SEQ ID NO:35中所列的序列组成的群组的序列。
在一些实施例中，重链包含具有如SEQ ID NO:28中所列的序列的氨基酸序列，其中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:6到SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:11到SEQ ID NO:14中的任一个替代。
在一些实施例中，重链包含具有如SEQ ID NO:29中所列的序列的氨基酸序列，其中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7到SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12到SEQ ID NO:14中的任一个替代。
在一些实施例中，重链包含具有如SEQ ID NO:30中所列的序列的氨基酸序列，其中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的任一个替代。
在一些实施例中，重链包含具有如SEQ ID NO:31中所列的序列的氨基酸序列，其中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的任一个替代。
在一些实施例中，重链包含具有如SEQ ID NO:32中所列的序列的氨基酸序列，其中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:3中的任一个、SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:10到SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14中的任一个替代。
在一些实施例中，重链包含具有如SEQ ID NO:33中所列的序列的氨基酸序列，其中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:8中的任一个和SEQ ID NO:10到SEQ ID NO:13中的任一个替代。
在一些实施例中，重链包含具有如SEQ ID NO:34中所列的序列的氨基酸序列，其中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:6到SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:11到SEQ ID NO:14中的任一个替代。
在一些实施例中，重链包含具有如SEQ ID NO:35中所列的序列的氨基酸序列，其中H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的任一个替代。
在一些实施例中，本发明提供包含氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有选自由如SEQ ID NO:36到SEQ ID NO:43中所列的序列组成的群组的序列。
在一些实施例中，轻链包含具有如SEQ ID NO:36中所列的序列的氨基酸序列，其中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:19到SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:24到SEQ ID NO:27中的任一个替代。
在一些实施例中，轻链包含具有如SEQ ID NO:37中所列的序列的氨基酸序列，其中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20到SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25到SEQ IDNO:27中的任一个替代。
在一些实施例中，轻链包含具有如SEQ ID NO:38中所列的序列的氨基酸序列，其中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中的任一个替代。
在一些实施例中，轻链包含具有如SEQ ID NO:39中所列的序列的氨基酸序列，其中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中的任一个替代。
在一些实施例中，轻链包含具有如SEQ ID NO:40中所列的序列的氨基酸序列，其中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:23到SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:27中的任一个替代。
在一些实施例中，轻链包含具有如SEQ ID NO:41中所列的序列的氨基酸序列，其中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中的任一个、SEQ ID NO:18到SEQ ID NO:21中的任一个和SEQ ID NO:23到SEQ ID NO:26中的任一个替代。
在一些实施例中，轻链包含具有如SEQ ID NO:42中所列的序列的氨基酸序列，其中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19到SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:24到SEQ ID NO:27中的任一个替代。
在一些实施例中，轻链包含具有如SEQ ID NO:43中所列的序列的氨基酸序列，其中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中的任一个替代。
在其它实施例中，本发明包含一种分离抗体，其包含重链，所述重链具有如选自由以下组成的群组的序列中所列的氨基酸序列：SEQ ID NO:28到SEQ ID NO:35或与SEQ IDNO:28到SEQ ID NO:35中的任一个具有至少80％一致性的变体，和(ii)轻链，所述轻链具有如选自由以下组成的群组的序列中所列的氨基酸序列：SEQ ID NO:36到SEQ ID NO:43或与SEQ ID NO:36到SEQ ID NO:43中的任一个具有至少80％一致性的变体。优选地，如上所述的序列一致性为至少90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在另一实施例中，本发明包含一种分离抗体，其包含具有如SEQ ID NO:28(G5S1(555S1))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:36(G5S1(555S1))中所列的氨基酸序列的轻链。在另一实施例中，本发明包含一种分离抗体，其包含具有如SEQ ID NO:29(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:37(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的轻链。在另一实施例中，本发明包含一种分离抗体，其包含具有如SEQ IDNO:30(GES1(GPC3S1))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:38(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的轻链。在另一实施例中，本发明包含一种分离抗体，其包含具有如SEQ ID NO:31(GES2(GPC3S2))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:39(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的轻链。在另一实施例中，本发明包含一种分离抗体，其包含具有如SEQ ID NO:32(GES6(GPC3S6))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:40(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的轻链。在另一实施例中，本发明包含一种分离抗体，其包含具有如SEQ ID NO:33(GES8(GPC3S8))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO:41(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的轻链。
在另一方面中，本发明提供与GPC3结合的拮抗性抗体的变体或其片段。因此，本发明提供抗体或其片段，其重链和/或轻链可变区序列的非CDR区的氨基酸序列与亲本拮抗性抗体的重链或轻链的重链和/或轻链可变区序列的非CDR区的氨基酸序列至少80％一致(具有至少80％氨基酸序列一致性)。优选地，重链和/或轻链可变区序列的非CDR区域的氨基酸序列一致性为至少85％，更优选为至少90％，并且最优选为至少95％，确切地说为96％，更确切地说为97％，甚至更确切地说为98％，最确切地说为99％，包括例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。关于氨基酸序列的一致性或同源性在本文中定义为在比对序列并且引入空隙(gap)(如果需要)以实现最高百分比序列一致性之后，候选序列中与与GPC3结合的拮抗性抗体或其片段中一致的氨基酸残基的百分比。因此，可通过通常用于比较两个多肽的氨基酸的位置相似性的标准方法来测定序列一致性。使用如BLAST或FASTA的计算机程序，对两个多肽进行比对，以获得其相应氨基酸的最佳匹配(沿一个或两个序列的全长或沿一个或两个序列的预定部分)。所述程序提供默认开口处罚和默认空隙处罚，并且如PAM250的计分矩阵(一种标准计分矩阵；参见迪霍夫M O(Dayhoff M O)等人,(1978)蛋白质序列和结构图册(Atlas of Protein Sequence and Structure),第5卷,增刊3)可与所述计算机程序结合使用。举例来说，百分比一致性可计算为：一致性匹配的总数乘以100，并且随后除以匹配跨度内较长序列的长度与为比对两个序列而引入到较长序列中的空隙数的总和。
在另一方面中，本发明还提供一种与GPC3结合的抗体和/或其片段，其中重链CDR中的至少一个和/或轻链CDR中的至少一个包含至少一个氨基酸修饰。可进行定点突变诱发或PCR介导的突变诱发以引入修饰，并且可在活体外或活体内分析中评估对抗体结合或其它相关功能性特性的影响。优选引入保守性修饰。修饰可为氨基酸取代、添加或缺失，但优选为取代。通常，在CDR区内进行不超过五个、优选不超过四个、更优选不超过三个、甚至更优选不超过两个，最优选不超过一个氨基酸修饰。
在某些实施例中，构架序列可用于工程改造可变区以产生抗体变体。本发明的抗体变体包括其中已对VH和/或VK内的构架残基进行修饰(例如，以改进抗体特性)的抗体。典型地进行此类构架修饰以降低抗体的免疫原性。举例来说，一种方法为将一或多个构架残基“回复突变”成对应鼠序列或将一或多个构架残基“回复突变”成对应生殖系序列。
在一些实施例中，抗GPC3分离抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。本发明还提供一种与GPC3结合的单价抗体或其片段，即由单一抗原结合臂组成的抗体。本发明还提供一种与GPC3结合的抗体的片段，其选自由以下组成的群组：Fab、Fab'、Fab'-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab')2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双功能抗体、三功能抗体和与相同或不同抗体遗传融合的scFv。优选片段为scFv、双特异性单链Fv二聚体和双功能抗体。本发明还提供一种与GPC3结合的全长抗体。
用于制备对抗实际上任何靶抗原的单克隆抗体的技术为所属领域中所熟知。参见，例如，克勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein),自然(Nature)256:495(1975)和科林根(Coligan)等人(编),免疫学实验室指南(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY),第1卷,第2.5.1-2.6.7页(约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)1991)。简单地说，可通过用包含抗原的组合物对小鼠或鸡进行注射，去除脾脏以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞稠合以产生融合瘤，克隆融合瘤，选择产生针对抗原的抗体的阳性克隆，培养所述克隆以产生针对抗原的抗体，并且从融合瘤培养物分离抗体来获得单克隆抗体。
如产生嵌合或人类化抗体的多种技术可涉及抗体克隆和构建的程序。相关抗体的抗原结合可变轻链和可变重链序列可通过多个分子克隆程序，如RT-PCR、5'-RACE和cDNA库筛选获得。来自表达鼠抗体的细胞的抗体的可变重链或轻链序列基因可通过PCR扩增和定序来克隆。为确认其真实性，克隆VL和VH基因可在细胞培养物中作为嵌合抗体表达，如由奥兰迪(Orlandi)等人所述(美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,86:3833(1989))。基于可变重链或轻链基因序列，可随后设计并且构建人类化抗体，如由梁(Leung)等人所述(分子免疫学(Mol.Immunol.),32:1413(1995))。
嵌合抗体为重组蛋白，其中人类抗体的可变区已经由例如小鼠抗体的可变区(包括所述小鼠抗体的互补决定区(CDR))替代。当向个体给予时，嵌合抗体展现降低的免疫原性和增加的稳定性。用于构建嵌合抗体的方法为所属领域中所熟知(例如，梁等人,1994,杂交瘤(Hybridoma)13:469)。
嵌合单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的重和轻可变链的小鼠CDR转移到人类抗体的对应可变域中来加以人类化。嵌合单克隆抗体中小鼠构架区(FR)还用人类FR序列替代。为保存人类化单克隆的稳定性和抗原特异性，一或多个人类FR残基可经小鼠对应物残基置换。人类化单克隆抗体可用于个体的治疗性治疗。用于产生人类化单克隆抗体的技术为所属领域中所熟知。(参见，例如，琼斯(Jones)等人,1986,自然(Nature),321:522；黎曼(Riechmann)等人,自然(Nature),1988,332:323；费尔海恩(Verhoeyen)等人,1988,科学(Science),239:1534；卡特(Carter)等人,1992,美国科学院院报(Proc.Nat'lAcad.Sci.USA),89:4285；桑德胡(Sandhu),生物技术评论(Crit.Rev.Biotech.),1992,12:437；坦皮斯特(Tempest)等人,1991,生物技术(Biotechnology)9:266；辛格(Singer)等人,免疫学杂志(J.Immun.),1993,150:2844)。
在一个实施例中，抗体为人类化scFv抗体。在另一实施例中，人类化scFv抗体包含具有如SEQ ID NO:34中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:42中所列的氨基酸序列的轻链(G5S1人类化scFv抗体)。在另一其它实施例中，本发明包含人类化scFv抗体，其包含具有如SEQ ID NO:35中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:43中所列的氨基酸序列的轻链(GES1人类化scFv抗体)。
可对编码本文所述的多肽的核酸进行修饰而不降低其生物活性。一些修饰可促进克隆、表达或将靶分子并入融合蛋白质中。此类修饰已为所属领域的技术人员所熟知并且包括，例如终止密码子、添加在氨基端处以提供起始位点的甲硫氨酸、位于任一端上以产生经适宜定位的限制位点的其它氨基酸或辅助纯化步骤的其它氨基酸(如聚His)。除了重组方法以外，还可使用所属领域中所熟知的标准肽合成来整体或部分构建本发明的抗体。
作为双链抗体纯化方案的改进，分别溶解并且还原重链区和轻链区，并且随后合并在再折叠溶液中。当这些两种蛋白质以一定摩尔比混合，使得一种蛋白质的摩尔数不超过另一种的5倍时，会获得示范性产量。氧化还原改组完成之后，可将过氧化麸胱甘肽或其它低分子量氧化化合物添加到再折叠溶液中。
除了重组方法以外，还可使用标准肽合成来整体或部分构建本文中所公开的抗体和其变体。多肽的固相合成可通过将序列的C端氨基酸附着到不可溶支撑物，接着连续添加序列中的剩余氨基酸来完成。用于固相合成的技术由以下描述：巴拉尼(Barany)和梅里菲尔德(Merrifield),肽：分析，合成，生物学(The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.)第2卷:特殊肽合成方法(Special Methods in Peptide Synthesis),部分A.第3-284页；梅里菲尔德等人,美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)85:2149-2156,1963，和斯图尔特(Stewart)等人,固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis),第2版,皮尔斯化学公司(Pierce Chem.Co.),伊利诺伊州罗克福德(Rockford,Ill.),1984。具有较大长度的蛋白质可通过缩合较短片段的氨基末端和羧基末端来合成。
抗GPC3抗体组合物和给予方法
某些实施例涉及包含本发明抗GPC3抗体和医药学上可接受的载剂或赋形剂的医药组合物。“医药学上可接受的载剂”意图(但不限于)为对所属领域的技术人员已知的任何类型的无毒性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、囊封材料或调配助剂。稀释剂，如多元醇、聚乙二醇和聚葡萄糖可用于增加结合物的生物半衰期。
本发明的医药组合物可根据常规方法(例如雷明顿药学大全(Remington'sPharmaceutical Science),最新版,美国伊士顿马克出版公司(Mark PublishingCompany,Easton,U.S.A.))调配，并且还可含有医药学上可接受的载剂和添加剂。实例包括(但不限于)表面活性剂、赋形剂、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等张剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂和矫正剂，并且可适当使用其它常用载剂。载剂的特定实例包括轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯缩醛二乙氨基乙酸酯(polyvinylacetaldiethylaminoacetate)、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链三酸甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、蔗糖、羧基甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐和此类物。
某些实施例涉及一种用于治疗个体中的癌症的方法，所述方法包含向个体给予本发明抗GPC3抗体。本发明还提供一种本发明抗GPC3用于制造供用于治疗癌症的药物的用途。本发明方法还包含与其它标准疗法同时或在其之后给予本发明抗GPC3抗体，其中所述标准疗法选自由放射线疗法、手术和化学疗法组成的群组。
在优选实施例中，个体为哺乳动物。示范性哺乳动物包括人类、猪、绵羊、山羊、马、小鼠、狗、猫、母牛等。可用抗GPC3抗体或其医药组合物治疗的疾病包括癌症，如肝癌、皮肤癌、头颈癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、脑癌、胃癌、胰腺癌或淋巴系统癌。优选地，癌症为肝癌，如肝细胞癌(HCC)、肝母细胞瘤和肉瘤样HCC。
可经静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内、膀胱内或瘤内给予抗GPC3抗体或其医药组合物。一般技术人员应了解，可凭经验确定抗GPC3抗体的有效量。应理解，当向人类患者给予时，抗GPC3抗体或组合物的总体每日用量将由主治医师在合理医疗判断的范围内决定。用于任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素：待达成的细胞反应的类型和程度；所用特异性抗GPC3抗体或组合物的活性；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；抗GPC3抗体的给予时间、给予途径和排泄率；治疗的持续时间；与抗GPC3抗体组合或同时使用的药物；和医学技术中所熟知的类似因素。
以上经鉴别的组合物和治疗方法中的每一种可另外包括其它抗肿瘤药物和其它一或多种抗肿瘤药物的给予。适用于与本发明一起使用的抗肿瘤药物包括(但不限于)诱导凋亡的药剂；抑制腺苷脱氨酶功能、抑制嘧啶生物合成、抑制嘌呤环生物合成、抑制核苷酸相互转化、抑制核糖核苷酸还原酶、抑制单磷酸胸苷(TMP)合成、抑制二氢叶酸还原、抑制DNA合成、与DNA形成加合物、破坏DNA、抑制DNA修复、嵌入DNA、脱氨基化天冬酰胺、抑制RNA合成、抑制蛋白质合成或稳定性、抑制微管合成或功能的药剂和其类似药剂。其它抗肿瘤药物的实例包括(但不限于)：1)生物碱，其包括微管抑制剂(例如，长春新碱、长春碱和长春地辛(vindesine)等)、微管稳定剂(例如，太平洋紫杉醇(紫杉醇(TAXOL))和多烯紫杉醇等)和染色质功能抑制剂，包括拓扑异构酶抑制剂，如表鬼臼毒素(例如，依托泊苷(etoposide；VP-16)和替尼泊甙(teniposide；VM-26)等)，和靶向拓扑异构酶I的药剂(例如，喜树碱并且为伊立替康(isirinotecan；CPT-11)等)；2)共价DNA结合剂(烷基化剂)，其包括氮芥类(例如，二氯甲基二乙胺、氯芥苯丁酸、环磷酰胺、异环磷酰胺和白消安(busulfan；MYLERAN)等)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)和司莫司汀(semustine)等)和其它烷基化剂(例如，达喀尔巴嗪(dacarbazine)、羟甲基三聚氰胺、噻替派(thiotepa)和丝裂霉素等)；3)非共价DNA结合剂(抗肿瘤抗生素)，其包括核酸抑制剂(例如，更生霉素(放线菌素D)等)、蒽环霉素(例如，道诺霉素(柔红霉素和盐酸红比霉素)、小红莓(阿德力霉素)和埃达霉素(埃达米星(idamycin))等)、蒽二酮(例如，蒽环霉素类似物，如米托蒽醌等)、博来霉素(BLENOXANE)等和普卡霉素(光神霉素)等；4)抗代谢物，其包括抗叶酸剂(例如，甲氨喋呤(FOLEX和MEXATE)等)、嘌呤抗代谢物(例如，6-巯嘌呤(6-MP，PURINETHOL)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、硫唑嘌呤、阿昔洛韦(acyclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、氯脱氧腺苷、2-氯脱氧腺苷(CdA)和2'-脱氧柯福霉素(喷司他汀(pentostatin)等)、嘧啶拮抗剂(例如，氟嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶(ADRUCIL)、5-氟脱氧尿苷(FdUrd)(氟尿苷))等)和胞嘧啶阿拉伯糖(例如，CYTOSAR(阿糖胞苷)和氟达拉宾(fludarabine)等)；5)酶类，包括L-天冬酰胺酶和羟基尿素等；6)激素，包括糖皮质激素、抗雌激素(例如，他莫昔芬(tamoxifen)等)、非类固醇抗雄激素(例如，氟他胺等)和芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑(瑞宁德(ARIMIDEX))等)；7)铂化合物(例如，顺铂和卡铂等)；8)与抗癌药物、毒素和/或放射性核种结合的单克隆抗体等；9)生物反应修饰药(例如，干扰素(例如，IFN-α等)和介白素(例如，IL-2等)等)；10)授受性免疫疗法；11)造血生长因子；12)诱导肿瘤细胞分化的药剂(例如，全反式视黄酸等)；13)基因疗法技术；14)反向疗法技术；15)肿瘤疫苗；16)针对肿瘤转移的疗法(例如，巴马司他(batimastat)等)；17)血管生成抑制剂；18)蛋白体抑制剂(例如，VELCADE)；19)乙酰化和/或甲基化的抑制剂(例如，HDAC抑制剂)；20)NFκB的调节剂；21)细胞周期调节的抑制剂(例如，CDK抑制剂)；和22)p53蛋白功能的调节剂。
根据GPC3表达的癌症诊断
本发明意外地发现GPC3的高度表达与癌症相关联。因此，本发明提供一种用于诊断个体中的癌症的方法，所述方法包含在生物样本中检测本发明抗体与GPC3的结合，其中所述结合指示个体罹患癌症的可能性。癌症包括(但不限于)卵巢癌、乳癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、混合小细胞/大细胞癌和合并性小细胞癌)、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、胃癌(stomach cancer)、黑素瘤、骨癌、胃癌(gastric cancer)、乳癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、乳头状肾癌、头颈鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其它肿瘤。确切地说，GPC3的高度表达可富集HCC相关基因的mRNA表达并且与肝硬化肝脏中的发育不良阳性相关；因此，GPC3可充当肝硬化和肝癌中的癌变前生物标记。此外，由GPC3所致的增加的HCC相关基因的mRNA表达在肝硬化肝脏中得到显著确认。因此，GPC3适用作用于检测肝硬化或肝癌的特定标记。因此，在另一方面中，本发明提供一种用于诊断个体中的肝硬化或肝癌的方法，所述方法包含在生物样本中检测本发明抗体与GPC3的结合，其中所述结合指示个体处于罹患肝硬化和肝癌的可能性中。
用于本发明的诊断方法中的生物样本不受特定限制，只要其为可含有GPC3蛋白的样本。确切地说，从生物(如哺乳动物)身体收集的样本为优选的。从人类收集的样本为更优选的。测试样本的特定实例包括血液、间质液、血浆、血管外流体、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿液、组织、腹水和腹膜内灌洗液。
用于检测本发明抗GPC3抗体与测试样本中所含有的GPC3蛋白的结合的方法不受特定限制。使用抗GPC3抗体的免疫方法用于检测，如放射免疫分析(RIA)；酶免疫分析(EIA)；荧光免疫分析(FIA)；发光免疫分析(LIA)；免疫沉淀(IP)；浊度免疫分析(TIA)；西方墨点法(WB)；免疫组织化学(IHC)方法；和单向放射免疫扩散法(SRID)。
本发明还提供用于诊断癌症的诊断剂或试剂盒，其包含用于检测测试样本中的GPC3蛋白的诊断剂。在一个实施例中，本发明还提供用于诊断肝硬化或肝癌的诊断剂或试剂盒，其包含用于检测测试样本中的GPC3蛋白的诊断剂。本发明的诊断剂至少包括本发明抗GPC3抗体。
用于诊断癌症的试剂盒可通过使用于诊断肝硬化或肝癌的药剂与另一用于检测GPC3的组件组合而产生。更确切地说，本发明涉及用于诊断肝硬化或肝癌的试剂盒，其包含与GPC3结合的抗GPC3抗体和用于检测抗体与GPC3之间的结合的试剂。此外，描述测量操作的说明书可隶属于本发明的试剂盒。
本发明提出GPC3蛋白中所存在的功能域或抗原决定基可在临床上充当用于诊断性或治疗性应用的潜在目标。因此，本发明提供具有抗肿瘤活性的抗GPC3抗体和其用于诊断性和治疗性目的，包括抑制肿瘤生长、增殖和迁移的应用。
实例
实例1GPC3蛋白表达与纯化和scFv抗体库的构建和生物淘选
通过PCR扩增编码人类GPC3蛋白的基因的各种片段，克隆于pET21a载体中，并且转移到大肠杆菌BL-21(DE3)菌株中以作为His融合GPC3的表达。在37℃下使个别克隆在含有安比西林(ampicillin)(100μg/ml)的5ml LB培养基中生长隔夜。在同一LB培养基中将细菌培养液稀释10倍并且进一步生长直到OD600达到0.6与1.0之间。将异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)添加到最终浓度为0.5mM的培养液中。在蛋白酶抑制剂存在下将细胞团块再悬浮于含有1％Triton x-100的2mL的1×PBS中并且通过音波处理使所述细胞团块裂解。离心之后，根据制造商(美国新泽西州皮斯卡塔韦通用电气公司(General Electronics,Piscataway,NJ,USA))的指示将所得细胞裂解物与载有Ni2+的树脂柱一起培育以纯化GPC3蛋白。图1显示市售的GPC3_胞外域(ECD)和截短型(C185)蛋白的分析结果。
用100μg经纯化的GPC3于等体积的传氏完全佐剂的溶液通过肌肉内注射对雌性白色来亨(Gallus domesticus)鸡(leghorn chicken)进行免疫接种。以7天的时间间隔用不完全佐剂进行三次另外免疫接种。各免疫接种之后，收集蛋黄中的鸡IgY抗体并且通过酶联结免疫吸附剂分析法(ELISA)滴定以测体液抗GPC3抗体免疫反应的存在。根据公开方案将蛋黄与蛋白分离以使用10％硫酸葡聚糖进行IgY纯化(秋田,E.M.(Akita,E.M.)和中井,S.(Nakai,S.)(1993).来自鸡蛋黄免疫球蛋白Y((IgY)的Fab'片段的制造和纯化(Productionand purification of Fab'fragments from chicken egg yolk immunoglobulin Y(IgY).)免疫学方法杂志(J Immunol Methods)162,155-164)。
将基于先前报告(安德里斯-韦德霍夫,J.(Andris-Widhopf,J.)、瑞德,C.(Rader,C.)、斯坦伯格,P.(Steinberger,P.)、富勒,R.(Fuller,R.)和巴巴斯,C.F.(Barbas,C.F.),第3版(2000).通过噬菌体展示产生鸡单克隆抗体片段的方法(Methods for thegeneration of chicken monoclonal antibody fragments by phage display.)免疫学方法杂志(J Immunol Methods)242,159-181.巴巴斯,C.F.三世(Barbas,C.F.,3rd)、康,A.S.(Kang,A.S.)、勒纳,R.A.(Lerner,R.A.)、和班克维克,S.J.(Benkovic,S.J.)(1991).噬菌体表面上组合抗体库的组装：基因III位点(Assembly of combinatorial antibodylibraries on phage surfaces:the gene III site.)美国科学院院报(Proc Natl AcadSci U S A)88,7978-7982)建立抗体库。简单地说，收集鸡脾脏并且即刻放置于Trizol中。将10ug总RNA逆转录成第一链cDNA。在使用鸡特异性引物扩增之后，将对具有短或长接头的重链和轻链可变(VH和VL)区的PCR产物进行第二轮PCR，用SfiI消化并且克隆于pComb3X载体中。通过电致孔将重组DNA转移到大肠杆菌ER2738菌株中。通过添加VCS-M13辅助噬菌体产生重组噬菌体，用4％聚乙二醇8000(polyethylglycol 8000)和3％NaCl(w/v)沉淀，再悬浮于含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。随后，将1011个噬菌斑形成单位(pfu)的重组噬菌体添加到预涂布有GPC3蛋白的孔中(0.5微克/孔)，并且在37℃下培育2小时。用0.1M HCl/甘氨酸(pH 2.2)/0.1％BSA洗脱经结合的噬菌体，用2M Tris碱缓冲液中和并且用于感染ER2738菌株。如上所述回收经扩增的噬菌体以用于下一轮选择。重复淘选程序三次或四次。纯化总DNA并且转移到大肠杆菌菌株TOP 10F'中。随机选择20个克隆并且从最后一次淘选处理生长。使细菌细胞裂解并且针对scFv抗体表达和与GPC3的结合反应性加以分析。如由制造商(英国安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences,UK))所述，使用载有Ni2+的琼脂糖来纯化scFv抗体。图2显示使用ELISA的抗GPC3抗体的结合活性。使用在第4轮生物淘选之后从各ELISA阳性噬菌体库中随机选出的16个克隆的全部细胞裂解物来检查其抗GPC3活性。这些scFv抗体所用的重和轻可变片段的序列分析表明GES2、GES3和GES4克隆适用于使用相同基因(数据未示出)。GPC3S1-S8和5S1-S8的命名分别替代为GES1-S8和G5S1-S8。
实例2通过ELISA的抗GPC3的cscFv的纯化
在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分析scFv抗体表达。发现6个具有特异性抗GPC3scFv的克隆在细胞质中具有令人满意的表达水平。图3显示SDS-PAGE上对经纯化的scFv抗体的分析。对表达于6个克隆，即G5S1、G5S8、GES1、GES2、GES6和GES8(第1道到第6道)中的scFv抗体进行纯化并且通过库马斯蓝染色(Coomassie bluestaining)观测。将与蛇毒蛋白反应的scFv抗体包括为对照组(ctrl)，其显示分子量为25kD。咸信第1道与第2道中分子量大于25kD的另外条带为scFv抗体的聚集形式(四聚体或二聚体)，因为抗his和抗鸡抗体均能够与这些条带反应(未图示)。
实例3抗GPC3 cscFv的序列比对和分析
scFv到鸡-人类嵌合抗体的转化
将通过重组PCR法(鹤目(Tsurushita)等人，2004)将抗GPC3scFv抗体的VL和VH基因转化为外显子。在PCR的第一步骤中，将通过PCR扩增VL(或VH)的信号肽编码区，以所述方式使得含有Kpn I位点的5'端与3'端将附着于抗GPC3scFv VL(或VH)编码区的5'端的同源序列(左侧片段)。将通过PCR扩增scFv抗体的VL(或VH)，以所述方式使得5'端将附着于VL(或VH)的信号肽编码区的3'端的同源序列，而3'端携载剪接供体信号和Nhe I位点(右侧片段)。将抗GPC3scFv VL和VH中的每一个的左侧和右侧片段合并并且通过PCR扩增以形成由Kpn I和Nhe I位点侧接的小外显子。实验验证之后，将所选scFv转化成IgG形式以用于活体内测试。小鼠/鸡scFv的VH和VL基因将移植于人类IgG架构中以产生嵌合IgG构造。IgG表达载体含有针对IgG1免疫球蛋白的重链和轻链经优化的恒定域。
人类化
将在由先前研究(鹤目等人，2004；齐尔伯(Zilber)等人，1990)中所应用的算法所产生的分子模型的辅助下对鸡scFv抗体的可变区进行人类化。简单地说，将基于序列同源性选择用作抗GPC3scFv抗体的CDR的受体的人类V区构架。由三维模型所预测出的对于CDR结构的正确形成至关重要的人类化V区域中的氨基酸残基将经鸡抗GPC3scFv抗体的对应残基取代。将对其它方法加以组合并且用于进一步精确调谐人类化抗GPC3抗体的结构(埃韦特(Ewert)等人，2003；西杜(Sidhu)等人，2004)。
将通过自动序列发生器使用ompseq(5'-AAGACAGCTATCGCGATTGCAGTG-3')和HRML-F(5'-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCC-3')引物对来自所选表达scFv的克隆的重和轻可变区进行核苷酸序列测定。将使用比对程序BLAST和Vector NTI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析结果。图4显示鸡的GPC3基因的所选scFv序列(555S1、S8和GPC3S1、S2、S6、S8)的重链(A)和轻链(B)和本发明的人类化scFv序列(G5S1人类化scFv序列和GES1人类化scFv序列)的重链和轻链。
用5％脱脂牛奶的TBST溶液封闭硝化纤维膜1小时。以1:5000稀释度添加多克隆山羊抗鸡IgY轻链抗体并且再培育数小时。用TBST将膜洗涤3次并且通过以1:3000稀释度添加经辣根过氧化酶(HRP)结合的驴抗山羊Ig抗体来检测结合抗体。三次洗涤之后，用二氨基联苯胺(DAB)受质使膜显影直到达到所需强度。纯化IgY抗体或表达大肠杆菌的scFv抗体并且与固定于硝化纤维膜或ELISA培养盘孔上的纯化GPC3蛋白或GPC3阳性HepG2和Hep3B细胞的细胞裂解物一起培育。随后通过添加山羊抗小鼠IgG或抗鸡IgY轻链，之后添加如上所述的经HRP结合的驴抗山羊Ig抗体来检测其结合。图5显示四个肝肿瘤细胞系(第1道到第4道)和四个肉瘤样肝肿瘤细胞系(第5道到第8道)的细胞溶解产物的电泳分析。图5A显示还原条件下8个细胞裂解物蛋白和市售GPC3胞外域蛋白(第C道)并且上部箭头显示C端片段并且下部箭头显示N端片段。图5B显示由抗GPC3聚IgY鉴别的两个片段。图5C显示由G5S1 scFv鉴别的片段。图5D显示由GES1 scFv鉴别的片段。图5C和D的两个scFv可鉴别GPC3的C端片段和细胞裂解物中的GPC3(参见箭头)。
实例4抗GPC3 scFv抗体在ELISA上的结合分析
在防护玻璃罩上接种HepG2、Hep3B细胞(2×105个细胞/毫升)并且通过用等体积的8％新制冰冷多聚甲醛保温在冰上固定15分钟。固定之后，在70％、95％和99％甲醇的依序处理中使细胞脱水并且用95％和70％甲醇使其复水。随后在室温(RT)下用阻断缓冲液(1％BSA于1×PBS中的溶液)涂覆载玻片1小时。用1×PBS洗涤之后，再在rt下将细胞与特异性单克隆小鼠或scFv抗体一起培育1小时。最后，通过小鼠抗HA抗体，之后通过经FITC结合的山羊抗小鼠抗体来检测其与GPC3蛋白的结合。同时用PI溶液复染细胞核。使用共焦光谱显微镜成像系统(TCS SP5，徕卡(Leica))检查载玻片。图6显示特异性抗GPC3scFv抗体在ELISA上的结合分析的结果。检查图5中所示的部分纯化scFv抗体对培养盘孔上所固定的市售GPC3的结合活性。结果显示，G5S1、GES1、GES2和GES6scFv抗体与GPC3反应显著。将抗蛇毒scFv(NC)和多克隆抗GPC3抗体分别包括为阴性和阳性对照组。
实例5抗GPC scFv抗体的增殖(MTT)分析
含有5×103个HepG2、Hep3B的100μl体积的DMEM培养基，其中将细胞接种于96孔培养盘上。24小时之后，用最终浓度为0.5μM到5μM的含有抗GPC3 scFv抗体的新鲜DMEM替代培养基。将细胞培养6天。其后，添加10μl的3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT；10mg/ml)以测定存活细胞的数目。培育3小时之后去除上清液，并且通过添加100μl酸化2-丙醇/孔(0.04N HCl)使已产生的甲晶体溶解。通过自动微量滴定板读取器测量540nm处的吸亮度。不相关的抗蛇毒抗体(阴性)包括于对照实验中。图7显示特异性抗GPC3scFv抗体对肝肿瘤细胞的增殖抑制。在最终浓度为0.1μM的含有G5S1、GES1、GES6或对照scFv抗体的培养基中培养HepG2细胞1到6天。如上图中所见，数据表明在第6天时0.1μM的G5S1、GES1和GES6对细胞增殖展现出大约60％的遏制率。下图中的数据表明最终浓度为0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM和8μM的G5S1和GES1 scFv抗体以剂量依赖性方式抑制细胞增殖3天。
实例6抗GPC scFv抗体的流式细胞测量术分析
搜集总计2×106个HepG2、Hep3B细胞并且如先前所述(洛伊(Leu)等人，2010)经微小修改用2％多聚甲醛固定。通过添加纯化鸡scFv抗体，之后添加小鼠抗HA(1:200)和经FITC结合的山羊抗小鼠抗体(1:200)来检测表达于这些canceqazer细胞中的GPC3分子。使用FACScan流式细胞仪分析结果，通过省去初级scFv抗体进行阴性对照，而使用市售多克隆抗人类GPC3抗体(1:200)代替自制鸡抗GPC3scFv抗体进行阳性对照。图8显示使用流式细胞测量术的特异性抗GPC3scFv抗体的结合分析。检查部分纯化scFv抗体对GPC3阳性Hep3B、HepG2和HepJ5细胞的结合活性。浓度为100μg/ml的GES1、GES6和G5S1 scFv抗体展现出对全部3种肝肿瘤细胞不同但显著的结合信号(左图和中图)。使用不相关scFv抗体(NC)进行的实验显示极少或没有结合活性。
实例7抗GPC抗体的免疫荧光染色分析
在防护玻璃罩上接种HepG2、Hep3B细胞(2×105个细胞/毫升)并且通过用等体积的8％新制冰冷多聚甲醛保温在冰上固定15分钟。固定之后，在70％、95％和99％甲醇的依序处理中使细胞脱水并且用95％和70％甲醇使其复水。随后在室温(RT)下用阻断缓冲液(1％BSA于1×PBS中的溶液)涂覆载玻片1小时。用1×PBS洗涤之后，再在RT下将细胞与特异性单克隆小鼠或scFv抗体一起培育1小时。最后，通过小鼠抗HA抗体，之后通过经FITC结合的山羊抗小鼠抗体来检测其与GPC3蛋白的结合。同时用PI溶液复染细胞核。使用共焦光谱显微镜成像系统(TCS SP5，徕卡)检查载玻片。图9A和B显示使用免疫荧光染色的特异性抗GPC3scFv抗体的结合分析。检查部分纯化scFv抗体对GPC3阳性HepG2细胞和Hep3B细胞的结合活性。GES1、GES6和G5S1scFv抗体展现出对Hep 3B细胞(图9A)和Hep G2细胞(图9B)的表面的不同但显著的结合信号，其与来自第4只经免疫的鸡的多克隆IgY抗体的结合信号类似。用不相关scFv抗体(图9A中的Sp scFv和图9B中的α-RTS3)或在不添加特异性抗GPC3抗体(仅第二+第三Ab)情况下进行的相似实验未显示结合活性。
实例8抗GPC抗体的免疫沉淀分析
通过使100μl的Ni-NTA琼脂糖(安玛西亚公司)和1mg的抗GPC3 scFv抗体与20mM庚二亚氨酸二甲酯共价键联制备抗体珠粒。随后，使500μl的HepG2和Hep3B细胞裂解物与25μl的抗体珠粒混合并且在4℃下培育2小时。用PBST充分洗涤之后，将使抗体珠粒再悬浮于50μl的SDS-PAGE加样缓冲液(loading buffer)中，煮沸5分钟，并且随后进行西方墨点分析。图10显示使用免疫沉淀分析的市售抗GPC3scFv抗体的结合分析。将Hep3B和HepG2的全部细胞裂解物与his珠粒分别与G5S1、GES1、GES6或70SC对照scFv抗体的混合物一起培育。洗涤之后，对his珠粒复合物进行SDS-PAGE和西方墨点分析。结果显示具有预测GPC3分子量的Hep3B细胞中的蛋白质经GES1沉淀。使用其它2个scFv抗体，G5S1和GES6的结果却并非同样明显。相比的下，HepG2细胞中的蛋白质经GES1、G5S1和GES6 scFv抗体沉淀。然而，数据尚为极其初步的并且需要进一步核对。
实例9抗GPC scFv抗体的软琼脂分析
为测定HepG2、Hep3B细胞的群落生成，在浓度为0.5μM到5μM的含有抗GPC3抗体的2ml DMEM培养基中预培育5×105个细胞48小时。其后，搜集细胞，进行计数并且转移到补充有0.8％ DMEM甲基纤维素和30％ FBS的半固体培养基。最后，将含有5×103个个别类型的细胞的1ml的半固体培养基涂铺到3.5cm培养皿(Petri-dish)上。将在标准条件下培养每一处理方案的三份培养皿5到7天。将通过用结晶紫染色观测群落形成(≥30个细胞的丛集)并且通过倒置显微镜进行计数。图11显示特异性抗GPC3 scFv抗体对群落形成的抑制。探索到GPC3 scFv对HepG2和Hep3B细胞的固着非依赖性生长的影响。用0.5μM的G5S1、GES1或α-RTS6(阴性)scFv抗体处理肝肿瘤细胞1小时并且悬浮于含有0.4％低熔点琼脂糖的培养基中并且以每培养皿1×105个细胞的密度涂铺到经0.9％琼脂糖固化的培养基上。培育4周之后，对群落数目进行计数和记录。G5S1和GES1 scFv抗体均展现出对HepG2细胞的群落形成的明显抑制性作用。其对Hep3B细胞的抑制性作用却并非同样明显。对2个细胞系的不同抑制作用的确切原因当前尚未知晓。
实例10细胞周期分析
用1μM抗GPC3 scFv抗体处理细胞2到5天，收集并且用70％(体积/体积)乙醇固定隔夜。用碘化丙锭染色经固定的细胞并且通过FACS加以分析。FlowJo 9.0版分析不同阶段的细胞周期分布。图12A、B和C显示细胞周期分析的结果。用G5S1、GES1或α-RTS6(阴性)scFv抗体处理48小时之后，分离、洗涤附着HepG2细胞并且在4℃下使其暴露于70％乙醇隔夜。洗涤之后，将细胞与5mg/mL碘化丙锭和50mg/mL RNaseA一起培育。进行FACS并且通过FlowJo软件以统计方式分析数据。当用0.5μM的G5S1和GES1 scFv抗体处理时，细胞在G1阶段中停滞(图12A和B)。此外，在经GES1和G5S1处理的HepG2细胞中，细胞群体在subG1阶段中分别明显增加到28.8％和16.6％，其可由细胞凋亡的诱导引起(图12C)。
实例11迁移分析
针对细胞迁移分析，将1×103个细胞与浓度为1μg/ml到200μg/ml的抗GPC3抗体一起培育48小时，之后转移到transwell迁移系统中。将细胞涂铺到孔径为8μm的聚碳酸酯过滤薄膜(上层)上并且在5％CO2培育箱中在37℃下培育持续不同时间间隔。含有0.5mM EDTA的无血清培养基用于将细胞从薄膜的下部洗掉到下部孔中。以3000g离心5分钟来收集下部孔中的细胞并且直接在显微镜下进行细胞计数。通过聚碳酸酯过滤迁移之后，细胞的平均生长速率(MGR)通过下式测定：MGR＝log2Nt-log2N0/t，其中N0为初始细胞数目，Nt为最终细胞数目并且t为细胞培育时间周期(以天为单位)。图13显示特异性抗GPC3 scFv抗体对细胞迁移的抑制。为探索GPC3蛋白对细胞迁移是否至关重要，培养Hep3B细胞直到汇合。使单层受伤，用含有0.5μM的G5S1或GES1和两个对照物(NC-70sc或NC-spE)scFv抗体的培养基培养，并且在24小时之后进行分析。当使用GES1时观测到对细胞迁移的部分抑制性作用。G5S1scFv的作用极小并且达到在不含任何scFv抗体的培养基中所获得的基础水平。令人感兴趣的是，在含有阴性对照NC-70sc或NC-spE抗体的培养基中发现对细胞迁移的增强作用。这些结果需要进一步加以研究。
实例12肿瘤异种移植模型和对异种移植小鼠中的肿瘤组织的免疫组织化学分析
使用NOD-SCID小鼠。简单地说，用4×106个HepG2和Hep3B癌细胞在单一背部位点处对4周龄雌性裸鼠进行皮下注射。在第14天时，将携带肿瘤的小鼠随机分入实验组(每组5只)并且相应地用抗GPC3抗体和含有索拉非尼的阳性对照物治疗。每3天通过静脉内(i.v.)注射提供400μg或800μg抗体持续3周。每2天用测径规测量肿瘤大小直到处死动物。在处死时，解剖下肿瘤并进行称重。G5S1和GES1对人类Hep3B异种移植模型的抗肿瘤作用和体重变化展示于图14中。
实例12对异种移植小鼠中的肿瘤组织的免疫组织化学分析
将来自小鼠中的异种移植肿瘤组织的组织切片在二甲苯中脱蜡并且分级乙醇再水合。通过在10mM柠檬酸钠(pH 6.0)中加热经再水合的组织20分钟来进行抗原修复。用含有10mM Tris-HCl(pH 7.4)和150mM氯化钠的缓冲液洗涤之后，用3％过氧化氢处理切片5分钟。在室温下施用抗Ki-67抗体(市售多克隆抗体)1小时。依序添加最佳经辣根过氧化酶结合的二级抗体和二氨基联苯胺以检测Ki-67增殖标记在经检查的组织中的表达。用GM苏木精溶液复染载玻片。图15显示对异种移植小鼠中的肿瘤组织的免疫组织化学分析。处死之后，搜集肿瘤样本的一部分并且检查作为评估细胞增殖的常用标记的Ki-67蛋白的表达。结果表明，与来自未经GES1处理的组的肿瘤切片相比，在来自经GES1(800μg/小鼠/每次)处理的小鼠的肿瘤切片中检测到降低水平的Ki-67表达。
实例13异种移植动物模型
人类化GES1 scFv抗体以获得人类化IgG抗体(GES1人类化scFv抗体)并且建立异种移植动物模型。克隆Hep3B肝肿瘤细胞到NOD-SCID小鼠中。肿瘤生成之后，将1mg/Kg和5mg/Kg GES1 IgG静脉内注射到小鼠中一周一次。用200mg/Kg索拉非尼经口给予另一组小鼠。如图16中所示，1mg/Kg和5mg/Kg GES1 IgG的肿瘤生长抑制率可分别为32.4％和51.2％，而索拉非尼仅产生48.8％抑制率。结果显示1mg/Kg GES1 IgG展现出对肿瘤抑制的有利作用，并且5mg/Kg GES1 IgG展现出比绍拉非尼高的肿瘤抑制作用。小鼠体重没有明显变化。
实例14正位动物模型
建立具有PanC1肿瘤细胞的正位动物模型。将PanC1癌细胞接种到裸鼠中。肿瘤生成之后，将10mg/Kg GES1 IgG静脉内注射到两组小鼠中一周一次。如图17A中所示，10mg/KgGES1 IgG可显著抑制肿瘤生长(p<0.01)。分离肿瘤组织蛋白之后，分离蛋白质并且通过西方墨点法纯化。如图17B中所示，抗体处理之后，p-AKT和p-Erk的表达水平降低(B2-2、B2-3和B2-5)。抗体的靶GPC3的表达水平也有所降低。此外，如图17C和D中所示，与通过市售抗Ki-67抗体处理的肿瘤组织中的Ki-67蛋白的表达水平相比，通过GES1IgG处理的肿瘤组织中的Ki-67蛋白的表达水平显著降低。
实例中所述的用于检测Akt、Erk、p-Akt、p-Erk的抗体均购自细胞信号转导公司(Cell Signaling Technology,Inc.)。实例中所述的用于检测GPC3的抗体购自奥维亚生物技术有限公司(Aviva Systems Biology,Corp.)。实例中所述的用于检测Ki-67的抗体购自(丹科(Dako))。
Claims (45)
1.一种抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下中的至少一个：重链互补决定区1H-CDR1，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或与SEQ IDNO:1到SEQ ID NO:4中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；重链CDR2 H-CDR2，其包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9或与SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:9中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；和重链CDR3 H-CDR3，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或与SEQ ID NO:10到SEQ ID NO:14中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；和
以下中的至少一个：轻链CDR1 L-CDR1，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:17或与SEQ ID NO:15到SEQ ID NO:17中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；轻链CDR2 L-CDR2，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22或与SEQ ID NO:18到SEQ ID NO:22中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；和轻链CDR3 L-CDR3，其包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:23到SEQ IDNO:27中的任一个具有至少80％氨基酸序列一致性的变体的氨基酸残基；以使得所述分离抗体或其抗原结合部分与GPC3结合。
2.根据权利要求1所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分，其中所述序列一致性为至少95％。
3.根据权利要求1所述的分离抗体，其为单克隆抗体、嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。
4.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的所述氨基酸残基组成的重链互补决定区1H-CDR1；由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的所述氨基酸残基组成的重链CDR2 H-CDR2；和由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的所述氨基酸残基组成的重链CDR3 H-CDR3；和
由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的所述氨基酸残基组成的轻链CDR1L-CDR1；由SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的所述氨基酸残基组成的轻链CDR2 L-CDR2；和由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的所述氨基酸残基组成的轻链CDR3 L-CDR3。
5.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：包含SEQ IDNO:1的所述氨基酸残基的重链互补决定区1H-CDR1、包含SEQ ID NO:5的所述氨基酸残基的重链CDR2 H-CDR2和包含SEQ ID NO:10的所述氨基酸残基的重链CDR3 H-CDR3；和包含SEQID NO:15的所述氨基酸残基的轻链CDR1 L-CDR1、包含SEQ ID NO:18的所述氨基酸残基的轻链CDR2 L-CDR2和包含SEQ ID NO:23的所述氨基酸残基的轻链CDR3 L-CDR3。
6.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：包含SEQ IDNO:2的所述氨基酸残基的重链互补决定区1H-CDR1、包含SEQ ID NO:6的所述氨基酸残基的重链CDR2 H-CDR2和包含SEQ ID NO:11的所述氨基酸残基的重链CDR3 H-CDR3；和包含SEQID NO:15的所述氨基酸残基的轻链CDR1 L-CDR1、包含SEQ ID NO:19的所述氨基酸残基的轻链CDR2 L-CDR2和包含SEQ ID NO:24的所述氨基酸残基的轻链CDR3 L-CDR3。
7.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：包含SEQ IDNO:3的所述氨基酸残基的重链互补决定区1H-CDR1、包含SEQ ID NO:7的所述氨基酸残基的重链CDR2 H-CDR2和包含SEQ ID NO:12的所述氨基酸残基的重链CDR3 H-CDR3；和包含SEQID NO:16的所述氨基酸残基的轻链CDR1 L-CDR1、包含SEQ ID NO:20的所述氨基酸残基的轻链CDR2 L-CDR2和包含SEQ ID NO:25的所述氨基酸残基的轻链CDR3 L-CDR3。
8.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：包含SEQ IDNO:4的所述氨基酸残基的重链互补决定区1H-CDR1、包含SEQ ID NO:8的所述氨基酸残基的重链CDR2 H-CDR2和包含SEQ ID NO:13的所述氨基酸残基的重链CDR3 H-CDR3；和包含SEQID NO:15的所述氨基酸残基的轻链CDR1 L-CDR1、包含SEQ ID NO:21的所述氨基酸残基的轻链CDR2 L-CDR2和包含SEQ ID NO:26的所述氨基酸残基的轻链CDR3 L-CDR3。
9.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含以下：包含SEQ IDNO:3的所述氨基酸残基的重链互补决定区1H-CDR1、包含SEQ ID NO:9的所述氨基酸残基的重链CDR2 H-CDR2和包含SEQ ID NO:14的所述氨基酸残基的重链CDR3 H-CDR3；和包含SEQID NO:17的所述氨基酸残基的轻链CDR1 L-CDR1、包含SEQ ID NO:22的所述氨基酸残基的轻链CDR2 L-CDR2和包含SEQ ID NO:27的所述氨基酸残基的轻链CDR3 L-CDR3。
10.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其为单克隆抗体、嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。
11.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有选自由如SEQ ID NO:28到SEQ ID NO:35中所列的序列组成的群组的序列。
12.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:28中所列的所述序列，其中所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:6到SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:11到SEQ ID NO:14中的任一个替代。
13.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:29中所列的所述序列，其中所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:5和SEQID NO:7到SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12到SEQ ID NO:14中的任一个替代。
14.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:30中所列的所述序列，其中所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14中的任一个替代。
15.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:31中所列的所述序列，其中所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14中的任一个替代。
16.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:32中所列的所述序列，其中所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:3中的任一个、SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:10到SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14中的任一个替代。
17.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:33中所列的所述序列，其中所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:5到SEQID NO:8中的任一个和SEQ ID NO:10到SEQ ID NO:13中的任一个替代。
18.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:34中所列的所述序列，其中所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:6到SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:11到SEQ ID NO:14中的任一个替代。
19.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的重链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:35中所列的所述序列，其中所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的任一个、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中的任一个和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14中的任一个替代。
20.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有选自由如SEQ ID NO:36到SEQ ID NO:43中所列的序列组成的群组的序列。
21.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:36中所列的所述序列，其中所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:19到SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:24到SEQ ID NO:27中的任一个替代。
22.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:37中所列的所述序列，其中所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20到SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25到SEQ ID NO:27中的任一个替代。
23.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:38中所列的所述序列，其中所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中的任一个替代。
24.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:39中所列的所述序列，其中所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中的任一个替代。
25.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:40中所列的所述序列，其中所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:23到SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27中的任一个替代。
26.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:41中所列的所述序列，其中所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中的任一个、SEQ ID NO:18到SEQ ID NO:21中的任一个和SEQ ID NO:23到SEQ ID NO:26中的任一个替代。
27.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:42中所列的所述序列，其中所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19到SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:24到SEQ ID NO:27中的任一个替代。
28.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含含有氨基酸序列的轻链，所述氨基酸序列具有如SEQ ID NO:43中所列的所述序列，其中所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17中的任一个、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中的任一个和SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中的任一个替代。
29.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含重链，所述重链具有如选自由以下组成的群组的所述序列中所列的氨基酸序列：SEQ ID NO:28到SEQ IDNO:35或与SEQ ID NO:28到SEQ ID NO:35中的任一个具有至少80％一致性的变体，和(ii)轻链，所述轻链具有如选自由以下组成的群组的所述序列中所列的氨基酸序列：SEQ IDNO:36到SEQ ID NO:43或与SEQ ID NO:36到SEQ ID NO:43中的任一个具有至少80％一致性的变体。
30.根据权利要求1所述的抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其中所述序列一致性为至少95％。
31.一种抗GPC3分离抗体或其抗原结合部分，其包含具有如SEQ ID NO:28(G5S1(555S1))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:36(G5S1(555S1))中所列的氨基酸序列的轻链；具有如SEQ ID NO:29(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:37(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的轻链；具有如SEQ ID NO:30(GES1(GPC3S1))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:38(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的轻链；具有如SEQ ID NO:31(GES2(GPC3S2))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:39(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的轻链；具有如SEQ ID NO:32(GES6(GPC3 S6))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:40(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的轻链；或具有如SEQ ID NO:33(GES8(GPC3 S8))中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:41(G5S8(555S8))中所列的氨基酸序列的轻链。
32.根据权利要求1所述的分离抗体，其为人类化scFv抗体。
33.根据权利要求32所述的分离抗体，其中所述人类化scFv抗体包含具有如SEQ IDNO:34中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:42中所列的氨基酸序列的轻链(G5S1人类化scFv抗体)。
34.根据权利要求32所述的分离抗体，其中所述人类化scFv抗体包含具有如SEQ IDNO:35中所列的氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:43中所列的氨基酸序列的轻链(GES1人类化scFv抗体)。
35.一种医药组合物，其包含根据权利要求1到34中任一权利要求所述的抗体和医药学上可接受的载剂。
36.根据权利要求35所述的医药组合物，其包含其它抗肿瘤药物。
37.一种治疗个体中的癌症的方法，所述方法包含向所述个体给予根据权利要求1到34中任一权利要求所述的抗GPC3抗体。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述癌症为肝癌、皮肤癌、头颈癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、脑癌、胃癌、胰腺癌或淋巴系统癌。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述癌症为肝癌，如肝细胞癌HCC、肝母细胞瘤和肉瘤样HCC。
40.根据权利要求37所述的方法，其与放射线疗法、手术和化学疗法组合。
41.一种用于诊断个体中的癌症的方法，所述方法包含在生物样本中检测根据权利要求1到34中任一权利要求所述的抗GPC3抗体与GPC3的结合，其中所述结合指示所述个体罹患癌症的可能性。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌、乳癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、混合小细胞/大细胞癌和合并性小细胞癌)、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、胃癌(stomach cancer)、黑素瘤、骨癌、胃癌(gastric cancer)、乳癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、乳头状肾癌、头颈鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
43.一种用于诊断个体中的肝硬化或肝癌的方法，所述方法包含在生物样本中检测根据权利要求1到34中任一权利要求所述的抗GPC3抗体与GPC3的结合，其中所述结合指示所述个体罹患肝硬化和肝癌的可能性。
44.根据权利要求37、41或43所述的方法，其中所述生物样本为血液、间质液、血浆、血管外流体、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿液、组织、腹水或腹膜内灌洗液。
45.一种诊断剂或试剂盒，其用于诊断如权利要求37、41或43所述的方法中所定义的癌症、肝硬化或肝癌，其包含根据权利要求1到34中任一权利要求所述的抗GPC3抗体。
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