CN109071668B - 抗n-乙酰基葡萄糖胺和n-乙酰基-半乳糖胺的抗体 - Google Patents

抗n-乙酰基葡萄糖胺和n-乙酰基-半乳糖胺的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明提供了特异性结合含有N‑乙酰基葡萄糖胺和/或N‑乙酰基‑半乳糖胺的表位的抗体和嵌合抗原受体(CARs)，例如由癌细胞或炎症细胞表达的表位。同时还提供了包含这些抗体和/或嵌合抗原受体的组合物，以及与之相关的多核苷酸、载体、宿主细胞、方法和试剂盒。进一步提供了用于治疗或抑制个体癌症的方法和试剂盒，其通过对个体给药特异性结合含有N‑乙酰基葡萄糖胺或N‑乙酰基‑半乳糖胺的表位的抗体，或包含特异性结合含有N‑乙酰基葡萄糖胺或N‑乙酰基‑半乳糖胺的表位的嵌合抗原受体的T细胞，也可选择性地与另一种抗癌药物的联合用药。

Description

抗N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年2月19日提交的国际专利申请PCT/CN2016/074146作为基础的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及特异性结合N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的抗体及其相关的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞、制备方法、使用方法和试剂盒。
背景技术
基于多方面的原因，癌症是现代医学中最具挑战性的疾病之一。由于癌症是由自身细胞的异常行为引起的，所以很难区分患者体内的癌细胞与正常细胞。通常人体自身的免疫系统难以识别和清除癌细胞。此外，“癌症”是指个体疾病的群集，也就是不同的癌症类型和亚型。许多不同的细胞类型可以通过不同的机制产生癌变，从而导致可能出现的癌症细胞类型极大的表型多样性。这种多样性对于癌症治疗来说是一个巨大的难题，因为不同类型的癌细胞可能有不同的诊断识别特性，或者可能具有不同的治疗弱点或抗性特性。这一难题使得我们很难找到单一治疗策略或药剂来诊断、治疗和/或预防多种类型的癌症。尽管肿瘤学在过去十年中取得了巨大的进步，但仍有必要鉴定新的癌细胞特异性生物标记物，尤其是表征多种癌症类型而非正常组织的生物标记物。
细胞表面分子对癌细胞非常重要。这些分子与细胞间的相互作用密切相关，这对于许多癌细胞的行为，包括细胞侵袭、转移、逃避免疫系统以及对治疗药物的响应都是非常重要的。众所周知，癌细胞表达不同于正常细胞的许多细胞表面蛋白。然而，许多细胞表面蛋白通过添加糖类(如N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺)进行修饰，这一过程称为蛋白质糖基化。特定的细胞表面蛋白是如何通过添加糖类修饰的，哪些糖类分子可以在哪些细胞表面蛋白被发现，以及在不同类型或阶段的癌变中糖基化的模式是如何变化的，这些问题都是刚刚开始探索(参见Moremen,K.W.,et al.(2012)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.13(7):448-62)。这种糖基化的多样性增加了利用表面生物标志物识别癌细胞的复杂性。
因此，仍然需要新的用于癌症的诊断、治疗和预防的生物标志物和治疗药物，特别是靶向癌症特异性糖基化模式的生物标志物和试剂。特别是，仍然需要改进特异性结合一种或多种糖类(例如N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺)的诊断和/或治疗制剂，它们特别是对癌症、炎症和/或自身免疫性疾病的治疗可能是有用的。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公开文件以及UniProtKB/Swiss-Prot登录号通过引用整体并入本文，如同具体和单独指明每个单独的参考文献通过引用并入。
发明内容
为了满足对诊断、治疗和预防多种类型癌症的新的生物标志物和治疗制剂的需求，本发明公开了特异性结合N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体(例如表达于癌细胞或炎症细胞)，以及其相关的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞、生产方法和试剂盒。还进一步公开了通过给药特异性结合在癌细胞的细胞表面表达的N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的抗体以治疗或预防个体癌症的方法，以及使用特异性结合N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的抗体诊断癌症的方法。这些组合物和方法在一定程度上是基于如下预料不到的发现，即与正常人体组织相比，代表多种不同类型癌症的人癌细胞表达更高水平的N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺。此外，本发明公开了如下预料不到的结果，即特异性结合肿瘤细胞表面表达的N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的抗体对于降低不同类型癌细胞的生长速率(在体外和体内两种情况下)具有强有力的效果。此外，本发明描述了如下预料不到的发现，即能特异性结合N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的抗体可以用来有效的预防和治疗胃肠疾病，如病毒感染、炎症性肠病、痔疮、类风湿性关节炎。
一方面，本发明提供了特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体。本发明还提供了包含这些抗体的组合物，以及相关的多核苷酸、载体、宿主细胞和用于生产的方法。进一步提供了通过给药特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体用于治疗或预防个体癌症的方法和试剂盒，所述抗体可选择性地与其他抗癌剂联合用药。还提供了通过给药特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体用于治疗或预防个体胃肠道疾病的方法和试剂盒。还提供了用于检测个体中癌细胞存在的方法和试剂盒，即从个体获得生物样本，并将该生物样本与特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体接触，并检测结合到生物样本的抗体量，其中抗体结合表明个体中存在癌细胞。
在某些方面，本发明提供了分离的特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的单克隆抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如FTSX1LX2S(SEQ ID NO:25)所示的HVR-L2序列、如SEQ IDNO:9所示的HVR-L3序列，其中X1是T或S，X2是Q或E。在某些实施方式中，所述HVR-L2序列包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链。在某些实施方式中，HVR-L2包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，所述抗体包括具有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链。在某些实施方式中，抗体进一步包含重链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ IDNO:2所示的HVR-H2序列以及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列。在某些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链。在某些实施方式中，抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包括来自如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包括来自如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包括来自如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包括来自如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包括来自如SEQ IDNO:10所示氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包括来自如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包括来自如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包括来自如SEQ IDNO:19所示氨基酸序列的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包括来自如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包括来自如SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和/或包含如SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的轻链可变区。在可以与上述任何一种实施方式结合的某些实施方式中，抗体是抗体片段。在某些实施方式中，抗体是Fab片段、scFv、微抗体、双价抗体、scFv多聚体或双特异性抗体片段。在某些实施方式中，抗体是人源化抗体。在某些实施方式中，抗体是人源抗体。在某些实施方式中，抗体是嵌合抗体。在某些实施方式中，抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位。在可以与上述任何一种实施方式结合的某些实施方式中，表位由癌细胞或者炎症细胞表达，该表位表达于癌细胞的细胞表面。在某些实施方式中，表位由癌细胞表达。在可以与上述任何一种实施方式结合的某些实施方式中，癌细胞选自：胰腺腺癌细胞、结肠腺癌细胞、直肠腺癌细胞、食管腺癌细胞、白血病细胞、腺样癌细胞、纤维肉瘤细胞、十二指肠腺癌细胞、胶质瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、卵巢癌细胞和宫颈腺癌细胞。在某些实施方式中，胰腺腺癌细胞是胰腺导管腺癌细胞。在某些实施方式中，抗体结合至表位抑制癌细胞的生长。在某些实施方式中，肺癌细胞是小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌细胞或者肺腺癌细胞。在某些实施方式中，炎症细胞是结肠炎、炎症性肠病或胃肠炎的肠道炎症细胞，并且表位表达于这些炎症细胞的细胞表面。在某些实施方式中，炎症细胞是类风湿性关节炎的炎症细胞，并且表位表达于这些炎症细胞的细胞表面。在某些实施方式中，类风湿性关节炎由胶原蛋白诱发。
在其他方面，本发明提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码以上任一实施方式中抗体的核酸序列。本发明还提供了包含编码上述任一实施方式中抗体的核酸序列的载体。本发明还进一步提供了分离的宿主细胞，该宿主细胞包括含有编码上述任一实施方式中抗体的核酸序列的分离的多核苷酸或含有编码上述任一实施方式中抗体的核酸序列的载体。本发明还进一步提供了分离的宿主细胞，该宿主细胞包括含有编码上述任一实施方式中抗体的核酸序列的分离的多核苷酸或含有编码上述任一实施方式中抗体的核酸序列的载体。本发明还提供了制备抗体的方法，该方法包括培养能够产生上述任一实施方式抗体的上述任一实施方式中的宿主细胞，并且从细胞培养物中回收所述抗体。本发明更进一步提供了通过上述任一实施方式中生产抗体的方法所生产的抗体。本发明还提供了包含上述任一实施方式中抗体和药学上可接受的载体的组合物。
另一方面，本发明提供了用于治疗或预防个体癌症的方法，包括对个体给药有效量的含有上述任一实施方式中抗体的组合物。本发明还提供了用于治疗或预防个体癌症的方法，包括对个体给药一定量的含有上述任一实施方式中的抗体以及一定量的其他抗癌药物，以使抗体与抗癌药物联合为个体提供有效的癌症治疗或预防。在一些实施方式中，个体患有或已被诊断出患有癌症。在某些实施方式中，癌症选自：胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、白血病、腺癌、纤维肉瘤、十二指肠腺癌、脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌。在某些实施方式中，个体是人。在某些实施方式中，个体是非人动物。在某些实施方式中，抗癌药物是化疗药。
在其他方面，本发明提供了用于检测个体中癌细胞的方法，包括将上述任一实施方式中的抗体与来源于个体的生物样本接触，并检测抗体与生物样本的结合，其中抗体与生物样本的结合可以指示个体中存在癌细胞。在某些实施方式中，该方法还包含比较被检测样本的抗体结合量与对照样本的抗体结合量。在可以与上述任何一种实施方式结合的某些实施方式中，检测抗体结合到生物样本的方法选自由下述各项组成的组：ELISA法、流式细胞术、免疫组织化学法、免疫荧光法、血循环肿瘤细胞检测和免疫胶体金法。在可以与上述任何一种实施方式结合的某些实施方式中，生物样本选自：全血、血清、尿、粪便、乳汁、精液、唾液、胸液、腹腔液、脑脊液、痰以及其他体液或分泌物。在某些实施方式中，个体是人。在某些实施方式中，个体是非人动物。在可以与上述任何一种实施方式结合的某些实施方式中，其中癌细胞选：胰腺癌细胞、白血病细胞、腺癌细胞、纤维肉瘤细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌或结直肠癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、子宫内膜癌细胞、宫颈癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞和淋巴瘤细胞。
另一方面，本发明提供了用于治疗或预防个体的胃肠道疾病的方法，包括对个体给药有效量的上述任一实施方式中的抗体。在一些实施方式中，个体患有或被诊断为本发明提及的胃肠道疾病。在某些实施方式中，个体患有炎症性肠病。在某些实施方式中，个体患有克罗恩病。在某些实施方式中，个体患有溃疡性结肠炎。在某些实施方式中，个体患有急性感染性胃肠炎。在某些实施方式中，个体患有痔疮。在某些实施方式中，个体患有病毒感染引起的胃肠疾病。在某些实施方式中，病毒感染是轮状病毒感染或猪流行性腹泻病毒感染。在可以与上述任何一种实施方式结合的某些实施方式中，个体是人。在可以与上述任何一种实施方式结合的某些实施方式中，个体是非人动物。在可以与上述任何一种实施方式结合的某些实施方式中，抗体通过静脉给药、肌内给药、皮下给药、局部给药、口服、经皮给药、腹膜内给药、眼眶内给药、植入、吸入、鞘内给药、脑室内给药或鼻内给药。
在其他方面，本发明公开了用于治疗或预防个体的类风湿性关节炎的方法，包括对个体给药有效量的特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体。在一些实施方式中，个体患有或被诊断为类风湿性关节炎。在一些实施方式中，表位由炎症细胞表达。在一些实施方式中，抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位。在一些实施方式中，抗体是抗体片段。在某些实施方式中，抗体是Fab片段、scFv、微抗体、双价抗体、scFv多聚体或双特异性抗体片段。在某些实施方式中，抗体是人源化抗体。在某些实施方式中，抗体是人源抗体。在某些实施方式中，抗体是嵌合抗体。在某些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQID NO:10所示氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包括选自SEQ ID NO:12、13、14、19和23组成的组中氨基酸序列的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的HVR-L1序列、如SEQ IDNO:6所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包括如SEQ IDNO:21所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:22所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:18所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO:20所示氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:7所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链和含有如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:8所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链和含有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链。在可以与上述任一实施方式结合的某些实施方式中，个体是人。在可以与上述任一实施方式结合的某些实施方式中，个体是非人动物。在可以与上述任一实施方式结合的某些实施方式中，抗体的给药方式为：静脉给药、肌内给药、皮下给药、局部给药、口服、经皮给药、腹膜内给药、眼眶内给药、植入、吸入、鞘内给药、脑室内给药或鼻内给药。
另一方面，本发明公开了包括具有上述任一实施方式中的抗体的药物组合物的试剂盒。在某些方面，该试剂盒还包括用于对个体给药有效量的药物组合物以治疗或预防癌症的说明书。在某些实施方式中，个体患有或被诊断为癌症。在某些方面，该试剂盒还包括用于对个体给药有效量的药物组合物以治疗或预防胃肠疾病的说明书。在一些实施方式中，个体患有或被诊断为胃肠道疾病。在某些方面，该试剂盒还包括用于对个体给药有效量的药物组合物以治疗或预防自身免疫病的说明书。在某些方面，该试剂盒还包括用于检测个体中癌细胞存在的说明书。在一些方面，该试剂盒还包括检测从患有癌症个体获得的生物样本中的N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺水平的说明书。
在其他方面，本发明公开了一种试剂盒，其中包括含有特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的药物组合物，其中表位表达于炎症细胞；以及对个体给药有效量的组合物用于治疗或预防类风湿性关节炎的说明书。在一些实施方式中，个体患有或被诊断为类风湿性关节炎。在一些实施方式中，抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位。在一些实施方式中，抗体是抗体片段。在一些实施方式中，抗体是Fab片段、scFv、微抗体、双价抗体s、cFv多聚体或双特异性抗体片段。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，抗体是人源抗体。在一些实施方式中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括来自如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包括来自由SEQ ID NOs:12、13、14、19和23组成的组中氨基酸序列的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:6所示的HVR-L2序列及如SEQID NO:9所示的HVR-L3序列。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:21所示的HVR-L1序列、如SEQ IDNO:22所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包括如SEQ IDNO:4所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:18所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:7所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO:16所示氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:8所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链。在可以与上述任一实施方式结合的某些实施方式中，个体是人。在可以与上述任一实施方式结合的某些实施方式中，个体是非人动物。在可以与上述任一实施方式结合的某些实施方式中，抗体的给药方式为：静脉给药、肌内给药、皮下给药、局部给药、口服、经皮给药、腹膜内给药、眼眶内给药、植入、吸入、鞘内给药、脑室内给药或鼻内给药。
另一方面，本发明公开了一种包含抗体片段的嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:7所示的HVR-L2序列和如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列和如SEQ IDNO:3所示的HVR-H3序列。在其他方面，本发明公开了一种包含抗体片段的嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括如SEQID NO:5所示的HVR-L1、序列如SEQ ID NO:8所示的HVR-L2序列和如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列和如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列。在其他方面，本发明公开了特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括(a)如SEQ ID NO:4所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:6所示的HVR-L2序列、如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列；(b)如SEQ IDNO:21所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:22所示的HVR-L2序列、如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列；(c)如SEQ ID NO:4所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:18所示的HVR-L2序列、如SEQID NO:9所示的HVR-L3序列；(d)如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:7所示的HVR-L2序列、如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3；或者(e)如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:8所示的HVR-L2序列、如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3，所述重链可变区包括如SEQID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列和如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列。在其他方面，本发明公开了特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如FTSX1LX2S(SEQ ID NO:25)所示的HVR-L2序列、如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列，其中X1是T或S，X2是Q或E，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列以及如SEQ IDNO:3所示的HVR-H3序列。在一些实施方式中，HVR-L2序列包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括具有如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，HVR-L2包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:12、13、19或23所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区。在上述任一实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区与具有如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区与具有如SEQID NO:10或SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的轻链可变区与具有如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区与具有如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区与具有如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方式中，轻链可变区和重链可变区是人源化的或人源的。在一些实施方式中，CAR包括人CD3ζ胞内结构域序列。在一些实施方式中，CAR还包括人CD28胞内结构域序列。在一些实施方式中，CAR从N-末端到C-末端包括重链可变区、连接子、轻链可变区、CD8铰链区、人CD28胞内结构域和人CD3ζ胞内结构域。在一些实施方式中，CAR包括如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，CAR特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位。在一些实施方式中，表位表达于癌细胞表面。在一些实施方式中，其中癌细胞选自由下述各项组成的组：胰腺腺癌细胞、结肠腺癌细胞、直肠腺癌细胞、食管腺癌细胞、白血病细胞、腺样癌细胞、纤维肉瘤细胞、十二指肠腺癌细胞、胶质瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、卵巢癌细胞和宫颈腺癌细胞。在一些实施方式中，胰腺腺癌细胞是胰腺导管腺癌细胞。在一些实施方式中，CAR表达在T细胞表面，且CAR与表达在癌细胞表面的表位结合，进而引导T细胞杀伤癌细胞。
在其他方面，本发明公开了分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码上述任一实施方式中嵌合抗原受体的核酸序列。在另一方面，本发明公开了包含编码上述任一实施方式中嵌合抗原受体的核酸序列的载体。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在一些实施方式中，载体是慢病毒载体。在其他方面，本发明公开了包含上述任一实施方式中的多核苷酸或者上述任一实施方式中的载体的分离的T细胞。在另一方面，本发明公开了包含上述任一实施方式中的CAR的分离的T细胞，且CAR表达在T细胞的细胞表面。在一些实施方式中，T细胞是人T细胞。
另一方面，本发明公开了用于治疗或预防个体的癌症的方法，包括对个体给药有效量的含有上述任一实施方式中的含有T细胞的组合物。在一些实施方式中，癌症选自由下述各项组成的组：胰腺癌、结直肠癌、食管癌、白血病、腺癌、纤维肉瘤、十二指肠腺癌、脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌。在一些实施方式中，癌症选自由下述各项组成的组：胰腺癌、结直肠癌、肺癌和脑癌。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，该方法还包括对个体给药一定量的其他抗癌药物，即T细胞和抗癌药物联合用药为个体提供癌症的有效治疗或预防。在一些实施方式中，抗癌药物是化疗药。
需要理解的是，本发明所描述的各种实施方式的一个、一些或者全部属性可以组合成本发明的其他实施方式。本发明的这些或其他方面对本领域技术人员是显而易见的。下面详细及进一步的描述了本发明的这些和其他实施方式。
附图说明
图1A与1B显示人源化抗体VK3和VK4体外结合N-乙酰基葡萄糖胺(NAcGlu；图1A)和N-乙酰基-半乳糖胺(NAcGal；图1B)。
图2显示通过使用N-乙酰基葡萄糖胺(NAcGlu)或N-乙酰基-半乳糖胺(NAcGal)预处理后，抑制了抗体VK3(“K3”)和VK4(“K4”)与N-乙酰基葡萄糖胺(10μg)的结合，未经过预处理的组(单独抗体)作为对照。
图3显示了人源化抗体K3(VK3)和K4(VK4)对由三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠IBD模型的肠形态的作用效果，该效果通过在第7天进行大体(病理)评分判断。治疗组包括：G1：未治疗(n＝5)；G2：200μg阿达木单抗/只动物，腹膜内注射(IP)(n＝5)；G3：5μg VK3/只动物，腹膜内注射(IP)(n＝5)；以及G4：5μg VK4/只动物，腹膜内注射(IP)(n＝5)；*表示t检验中的p<0.05(在治疗组G3与未治疗对照组G1之间进行比较)。
图4展示了由TNBS诱导的IBD模型在第7天所拍摄的大体影像图。在IBD造模后48小时进行抗体的给药治疗。如上所述，治疗组如图3所示。
图5A和图5B显示了人源化抗体VK2和VK3在大鼠胶原诱导性关节炎模型中对爪子肿胀体积(图5A)和总体重(图5B)的作用效果，生理盐水治疗组作为对照。治疗组包括：G1：未治疗(n＝5)；G2：抗体VK2(“K2”)每隔一天250μg/kg，静脉注射(n＝5)；G3：抗体VK3(“K3”)每隔一天250μg/kg，静脉注射(n＝5)；
图6A和图6B展示了大鼠胶原诱导性关节炎模型在给药后第5天(即给予2剂量后；图6A)或给药后第28天(即给予14剂量后；图6B)的大体影像图。治疗组分组情况如上述图5A和图5B。
图7A和图7B显示了不同浓度抗体VK3(图7A；“K3”)和VK4(图7B；“K4”)对胰腺癌模型PDX-P3的细胞生长抑制的百分比。
图8A-8C显示了抗体VK4(“K4”)对PDX-P3胰腺癌模型的肿瘤体积(图8A)、抑瘤率(TGI；图8B)和肿瘤大小(图像；图8C)的作用效果，另一抗体组(7C)或未治疗组作为对照。
图9显示了不同浓度抗体VK3(“K3”)对直肠癌模型PDX-P3的细胞生长抑制的百分比。
图10A和图10B显示了抗体VK3(“K3”)或VK4(“K4”)对PDX-P3直肠癌模型的肿瘤体积(图10A)和抑瘤率(TGI；图10B)的作用效果，未治疗组作为对照。
图11表明与阴性对照(磷酸盐缓冲液，PBS)相比，抗体VK3(“K3”)和VK4(“K4”)对多种人类肿瘤细胞系抑制作用的反应性。被测细胞系包括：NCI-H446(小细胞肺癌)、H1299(非小细胞肺癌)、ECAP-1090(食管腺癌)；Jurkat(急性T细胞白血病)、ACC-2(腺样囊性癌细胞)、HT1080(纤维肉瘤)、HUTU80(十二指肠腺癌)、MCF-7(乳腺癌)和Hela(宫颈癌)。
图12A显示了用于制备生成CAR-T细胞的慢病毒嵌合抗原受体(CAR)载体的载体图谱。图12B显示了如图12A所示的慢病毒载体经过EcoRⅠ-BamHⅠ酶切之后预期的DNA条带。
图13-16表明CAR-T细胞介导的对肿瘤细胞系的细胞杀伤活性。图像描述了靶细胞与预定E/T比的裂解率。显示的是针对A549肺腺癌细胞系(图13)、BxPc-3胰腺腺癌细胞系(图14)、HCT116结直肠癌细胞系(图15)和U87胶质母细胞瘤细胞系(图16)的CAR-T介导的杀伤活性结果。
具体实施方式
本发明重点公开了可以特异性结合N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的新型抗体。本发明公开了多种此类抗体，用于在多种体内模型中治疗炎症、癌症和/或自身免疫病的一个或多个症状。特别是，这些抗体与现有抗体相比，具有更好的疗效，例如缓解炎症性肠病(IBD)模型中的炎症和溃疡，减轻胶原诱导性关节炎模型中的炎症，以及抑制胰腺癌或直肠癌模型中的肿瘤生长。此外，证明了这些抗体与一系列不同肿瘤类型的人类肿瘤细胞系结合。也发现在人T细胞表达的嵌合抗原受体的情况下，结合N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的抗体的可变域介导对广泛的肿瘤细胞系的杀伤。
Ⅰ.常规技术
本发明描述或引用的技术能够被本领域技术人员很好的理解并通过常规方法使用，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.,(2003))；Harlow和Lane,eds.(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1987))；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Monoclonal Antibodies:APractical Approach(P.Shepherd和C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；以及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita et al.,eds.,J.B.Lippincott Company,1993)所描述的广泛使用的方法。
Ⅱ.定义
在详细描述本发明前，需要理解的是，本发明不限定于特定的组分或生物系统，其当然是可以改变的。还需要理解的是，本发明使用的术语只是为了描述具体的实施方式，并不是为了限制。
在本发明说明书中以及权利要求中，单数形式的“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”除非另有明确规定，包括复数对象。因此，例如对“分子”的引用可选的包含两个或更多这样的分子的组合，诸如此类。
本发明中所使用的“约”这个词是指本领域技术人员所熟知的相应值的通常误差范围。本发明中“约”值或参数引用包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方式。
需要理解的是，本发明的各个方面和实施方式包括“包含方面和实施方式”、“由方面和实施方式组成”和“主要由方面和实施方式组成”。
术语“炎症”指的是身体组织对有害刺激(如病原体、受损细胞或刺激物)而产生的复杂生物反应。急性炎症的典型症状包括但不限于疼痛、发热、发红、肿胀和功能丧失。炎症是一种普遍的反应，因此被认为是一种先天免疫机制。炎症可以被分为慢性和急性。急性炎症反应是指机体对有害刺激的最初反应，它是由血液中的血浆和白细胞(特别是粒细胞)从血液中加速迁移到受伤组织而实现的。一系列生化反应使得炎症反应扩散和成熟，涉及局部血管系统、免疫系统和受损组织内的各种细胞。长期的炎症，即为慢性炎症，它会导致炎症部位的细胞类型发生渐进式转变，其特征是炎症过程中组织的同时破坏和愈合。
术语“炎症细胞”指的是通常存在于血液中并通过外渗进入发炎组织以帮助炎症反应的白细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞)。一些作为吞噬细胞，摄入细菌、病毒和细胞碎片。其他的则释放酶颗粒，破坏致病的入侵者。白细胞同时也会释放炎症介质，从而形成和维持炎症反应。一般来说，急性炎症反应由粒细胞介导，而慢性炎症反应由单个核细胞介导，例如单核细胞和淋巴细胞。在一些实施方式中，炎症细胞可以包括淋巴细胞，如T或B细胞。
术语“炎症性肠病(IBD)”是指全部或部分消化道慢性炎症的病理状态。IBD主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。两者通常都有严重的腹泻、疼痛、疲劳和体重减轻的症状。溃疡性结肠炎是一种可以引起大肠(结肠)和直肠长期炎症和疮(溃疡)的IBD。克罗恩病是一种引起消化道炎症的IBD。克罗恩病中，炎症通常会扩散深入到受影响的组织中。炎症可能涉及消化道的不同区域，如大肠、小肠或者两者。胶原性结肠炎和淋巴细胞性结肠炎也被认为是炎症性结肠炎，但通常与典型的炎症性肠病所区分。
术语“癌症”和“癌症细胞”是指或描述动物的一种生理状态，其特征是不受限制的细胞增殖。癌症的实例包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、肝细胞癌、脑癌(包括恶性少突胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤或胶质瘤)、胃肠癌(包括但不限于食管癌、胃部癌症、肠癌、结肠癌和结直肠癌)、肾透明细胞癌、皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、喉癌、霍奇金淋巴瘤、甲状腺髓样癌、胰腺癌、腺癌、纤维肉瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌，尿道癌、乳腺癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、白血病、十二指肠癌(如腺癌)，以及相关的转移瘤。在一些实施方式中，癌症类型选自：脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌。在一些实施方式中，癌细胞选自：胶质瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和宫颈癌细胞。在一些实施方式中，癌症类型选自：胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、白血病、腺癌、纤维肉瘤、十二指肠腺癌、脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌。
本发明中术语“免疫球蛋白”(Ig)和“抗体”可以互换使用。在本发明中术语“抗体”以最广泛的含义使用，具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、以及抗体片段(如Fab片段、scFv、微抗体、双价抗体、scFv多聚体或双特异性抗体片段)，只要它们表现出所需的生物活性。
在本发明中，术语“特异性结合”和“对……特异性”指的是可测量的和可重复的相互作用，例如抗体与靶标之间的结合，在包括生物分子在内的各种各样分子存在的情况下，决定了靶标的存在。例如，特异性结合到靶标(可以是一个表位)的抗体是这个抗体结合到这一靶标相比于结合到其他靶标具有更强的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间。在一些实施方式中，与靶标特异性结合的抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM。在另一些实施方式中，特异性结合可以包括但不需要排他性的结合。
抗体的“可变区”或“可变域”指的是抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变域可以分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体中最多变的部分(相对于同一类的其他抗体)，并且包括抗原结合位点。
术语“可变的”指的是可变域中的某些片段在抗体之间的序列中广泛不同。V域介导与抗原的结合并且定义特定抗体针对其特定抗原的特异性。然而，可变性并不是均匀分布在可变域的整个跨度中。相反，它集中在轻链和重链可变域中都存在的称为“高变区(HVR)”的三个片段中(每个抗体或其抗原结合片段共有6个HVR)。在本发明中，“高变区(HVR)”含有赋予抗体特异性抗原结合的高度可变序列。可变域中更高度保守的部分称为框架区(FR)。每条链上的HVR都通过框架区紧密靠近在一起，并与其它链的HVR一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应子功能，例如参与抗体在抗体依赖的细胞毒性的功能。
在本发明中，使用并包含了大量的HVR描述。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性，并且是最被广泛使用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的折中方案，并被OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR基于对现有复杂晶体结构的分析。每个这些HVR的残基示例如下。
Figure BDA0001746817940000201
Figure BDA0001746817940000211
HVR可以包含如下的“扩展的HVR”：VL上的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)和VH上的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的，根据上文的Kabat等对可变域残基进行编号。
本发明中使用的术语“单克隆抗体”指的是从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即除了可能存在少量的自然发生的突变和/或翻译后修饰(如异构化、酰胺化)，组成该抗体群体的每个抗体都是相同的。单克隆抗体是高度特异的，针对单一的抗原位点。与通常包括针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体都针对的是单一的抗原决定簇。
修饰词“单克隆”表明抗体的性质是从基本上同质的抗体群体中获得的，不应解释为需要任何特定的方法来产生抗体。例如，本发明所使用的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，包括杂交瘤法(如Kohler and Milstein.,Nature,256:495-97(1975))；重组DNA法(参见美国专利4,816,567号)；噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，Nature，352:624-628(1991))；以及在动物中产生人源或人样抗体(human or human-likeantibody)技术，所述人源或人样抗体具有编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部(参见Jakobovits et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994))。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选为完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；微抗体；双价抗体；scFv；scFv多聚体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段构成的双特异性或多特异性抗体。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是由VH和VL抗体域连接组成一个多肽链的抗体片段。优选的，scFv多肽在VH和VL域之间还包括一个多肽接头，使scFv能够形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,vol.113，Rosenburg和Moore等，Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双价抗体”指的是通过在VH和VL域之间的短接头(大约5-10个残基)构成的scFv片段所形成的小的抗体片段，以实现链内而非链间的V域的配对，从而产生双价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双价抗体更详细的描述参见例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90:6444-48(1993)。
本发明中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及这种抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性，所述抗体重链和/或轻链的一部分与来源于特定的物种或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一种物种或属于另一抗体类或亚类的抗体相应序列相同或同源(美国专利4,816,567号；Morrison et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA，81:6851-55(1984))。
非人源抗体(如鼠源)的“人源化”形式包含来源于非人源免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施方式中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)的HVR残基被具有所需的特异性、亲和力和/或功能的非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的HVR残基所取代。详情参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)。
“人源抗体”是一种具有与人体产生和/或使用本发明公开的任意制备人源抗体技术所制成的抗体相一致的氨基酸序列的抗体。人源抗体可以使用本领域已知的各种技术进行制备，例如Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)所描述的方法。
“分离的”抗体是从其制备环境的组分(如天然或重组地)识别、分离和/或回收的抗体。优选地，分离的多肽不含通常会干扰抗体使用的无污染成分，例如酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。
在本发明中，术语“治疗”指的是旨在改变临床病理过程中被治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预。治疗的预期效果包括降低疾病进展速度，改善或减轻病情，以及缓解或改善预后。例如，如果一个或多个与癌症相关的症状得到缓解或消除，就成功地“治疗”了该个体。
在本发明中，术语“预防”包括为个体疾病的发生或复发提供预防措施。个体可能易患某种类型的癌症，易受某种类型的癌症影响，或有罹患某种癌症的风险，但尚未被诊断出患有该疾病。
“有效量”指的是在必需的剂量和时间段内有效达到预期治疗或预防效果的最少量。有效量可以通过一次或多次给药提供。
“治疗有效量”指的是至少实现特定疾病(如癌症)的可测量的改善所需的最小浓度。本发明中的治疗有效量可能因患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及单克隆抗体在个体中产生预期效果的能力等因素而异。治疗有效量也是任何单克隆抗体治疗有益效果超出毒性或有害效果的剂量。“预防有效量”在必要的剂量和时间内有效达到预期预防效果的量。由于预防剂量被用于疾病早期阶段之前或疾病的早期阶段，通常但不一定，预防有效量可能低于治疗有效量。
在本发明中，与另一种化合物或组合物“联合”给药包括同时给药和/或在不同时间给药。联合给药还包括作为联合制剂给药或单独组合物给药，包括以不同的给药频率或间隔给药，使用相同的给药途径或不同的给药途径。
用于治疗或预防目的的“个体”是指被归类为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农场动物以及动物园动物、运动或宠物动物，如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，个体是非人动物。
在本发明中所使用的“载体”包括以所采用的剂量和浓度暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、辅料或稳定剂。通常，生理上可接受的载体是含水的pH缓冲溶液。生理上可接受的载体实例包括磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸等缓冲液；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸；碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；和/或非离子表面活性剂如吐温TM、聚乙二醇(PEG)、PLURONICSTM。
“药学上可接受的”缓冲液和盐包括上文中所提到的酸和碱的加成盐衍生而来的酸和碱。特定的缓冲液和/或盐包括组氨酸、琥珀酸盐和乙酸盐。
在本发明中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、被修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或合成反应聚合产生聚合物的任何底物。
编码本发明中抗体的“分离的”核苷酸是从至少一种污染的核酸分子中被识别与分离的核酸分子，这种核酸分子通常与产生的环境相关联。编码本发明多肽和抗体的分离的核酸分子是以其在自然界中被发现的形式或环境外的形式存在。优选的，分离的核酸与生产环境相关的所有成分不相关联。
本发明中所使用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另外的核酸的核酸分子。载体的类型包括质粒(即可以连接另外的DNA片段的环状双链DNA)和病毒载体。一些载体能够在它们被导入的宿主细胞中进行自我复制(例如，具有细菌复制起始位点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他的载体可以被整合到宿主细胞的基因组中，并与宿主基因一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这种载体被称为“重组表达载体”，或者简称为“表达载体”。在本发明中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
Ⅲ.糖类
本发明某些方面涉及含糖类的表位。在本发明中，“糖类”可指单糖、寡糖或多糖。单糖包括但不限于果糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、半乳糖、乳糖、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基葡萄糖胺和唾液酸。寡糖是包含通过组分糖的糖苷键连接多种糖单体的糖类聚合物。
糖蛋白或蛋白糖是指与糖类连接的蛋白质，通常含有例如单糖与蛋白质中相容的氨基酸侧链或与脂质部分的O-或N-糖苷键。在本发明中，术语“聚糖”和“糖基部分”可以互换使用来指糖本身或作为糖蛋白的糖类成分的糖。本领域所熟知的两种糖基化：与天冬酰胺侧链的酰胺氮N-连接的糖基化以及与丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基氧O-连接的糖基化。其它糖类，包括但不限于O-GlcNAc、GAG链、糖胺和糖鞘脂。O-和N-连接糖在真核生物中很常见，在原核生物钟虽然不常见，但也有发现。
本发明的一些方面涉及N-乙酰基-半乳糖胺和N-乙酰基葡萄糖胺。N-乙酰基葡萄糖胺可以指含有N-连接有葡萄糖胺部分的任何氨基糖化合物。正如本说明书所述，N-乙酰基葡萄糖胺可以糖类实体本身，或者作为较大的多糖的组成部分的单糖。如本说明书所述，N-乙酰基葡萄糖胺可以指糖类实体本身，或是作为糖蛋白的聚糖组分或蛋白质被一个或多个N-乙酰基葡萄糖胺组分糖基化的糖类(例如，含有N-乙酰基葡萄糖胺的单糖或多糖)。
N-乙酰基-半乳糖胺可以指包含与乙酸部分N-连接的葡糖胺的任何化合物。N-乙酰基-半乳糖胺可以指包含N-连接有半乳糖胺部分的任何氨基糖化合物。如本说明书所述，N-乙酰基-半乳糖胺可以指单糖本身，或者作为较大的多糖的组成部分的单糖。N-乙酰基-半乳糖胺可以指糖类实体本身，或是作为糖蛋白的聚糖组分或蛋白质被一个或多个N-乙酰基-半乳糖胺组分糖基化的糖类(例如，含有N-乙酰基-半乳糖胺的单糖或多糖)。
虽然已知许多蛋白质是糖基化的，但糖蛋白通常存在于细胞的外表面(即胞外)或被分泌。因此，糖蛋白对于外部制剂(例如给药至患者的外源性化合物)是非常容易接近的。例如，能够特异性识别某些糖蛋白(例如抗体或凝集素)的组分能够在完整生物体中结合到在其细胞表面上表达这些糖蛋白的细胞。能够特异性识别某些糖蛋白的组分也能够结合分泌的糖类或糖蛋白，例如可以在某些组织样本中(包括但不限于血液或血清)发现游离的糖类或糖蛋白。
凝集素在本领域中已知是能够高度特异性识别同源糖部分的糖结合蛋白。这些高度特异性结合相互作用可以用于例如，检测组织中特定的糖类(如，检测通过特定糖部分糖基化修饰的细胞表面蛋白)。凝集素可以包括如动物凝集素、植物凝集素和病原体凝集素。在哺乳动物中，已知凝集素在免疫系统中起到重要作用，例如，识别仅在病原体中发现的碳水化合物，或者在宿主细胞中难见到的碳水化合物。
本发明的一些方面使用植物凝集素来检测特定糖类部分的存在或表达。例如，植物凝集素包括但不限于对果糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺和N-乙酰基葡萄糖胺特异的凝集素。
Ⅳ.抗体
表位结合
本发明公开了某些方面涉及特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体。如上所述，这样的抗体将显示可测量的和可再现的相互作用，例如与含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位结合。例如，特异性结合表位的抗体是一种结合到该表位相比于结合到其他靶标具有更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间。含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的实例包括含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺聚糖的糖蛋白，例如但不限于表达在癌细胞表面的带有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺部分的细胞表面糖蛋白。
特异性结合可以包括但不不需要是独占性结合。当抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位时，也发现它们与不含这些部分的其它表位结合，例如具有比含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位较低的结合亲和力。
在一些实施方式中，抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位。例如，抗体可以特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位。在一些实施方式中，抗体可以特异性结合到同时含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位。
在一些实施方式中，抗体与在癌细胞表面表达的含有N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位结合能够抑制癌细胞的生长。正如本说明书所述，抑制细胞的生长可以指抑制其增殖速率。不希望受理论束缚，通过与细胞表面结合，抗体可以通过多种机制抑制细胞的生长。例如，与细胞表面结合的抗体可能对细胞有毒性，或者以其他方式导致细胞死亡，例如但不限于凋亡或坏死。与细胞表面结合的抗体可以减缓或停止细胞的增殖。与细胞表面的细胞表面糖蛋白结合的抗体可以抑制或增强糖蛋白的功能，例如细胞信号转导功能，并且在此过程中抗体结合可以抑制细胞的生长。与细胞表面结合的抗体可以与外源配体竞争，该外源配体，例如生长因子，通过与细胞表面结合从而加速细胞的生长。这种竞争可能是间接的，也就是说，抗体不需要与外源配体竞争结合相同糖蛋白的表位。与细胞表面结合的抗体也可以招募免疫系统的一个或多个组分，如自然杀伤细胞或NK细胞，进而可以抑制抗体结合细胞的生长。不同抗体通过结合细胞表面的表位来抑制细胞生长的机制可以因为细胞背景或特异性抗体或表位而有所不同。
抗体特征
本发明描述和表征了特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的特定抗体。在一些实施方式中，抗体是1C5C9，如PCT/CN2015/087717所述。在一些实施方式中，抗体是1C5C9抗体的人源化形式，如PCT/CN2015/087717所述。例如，在一些实施方式中，抗体来源于人源化的亲本1C5C9抗体。在一些实施方式中，人源化的亲本1C5C9抗体包含重链可变区，所述重链可变区包括如YTFPDYNIH(SEQ ID NO:1)所示的HVR-H1序列、如CIYPYNGNTA(SEQ ID NO:2)所示的HVR-H2序列以及如SDLYYFGSRGFD(SEQ ID NO:3)所示的HVR-H3序列。在一些实施方式中，人源化的亲本1C5C9抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包括如RASQDISTYLN(SEQ ID NO:4)所示的HVR-L1序列、如FTSRLHS(SEQ ID NO:6)所示的HVR-L2序列以及如QQGNTLPW(SEQ ID NO:9)所示的HVR-L3序列。在一些实施方式中，人源化的亲本1C5C9抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包括如下氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO:10)，所述轻链可变区包括如下氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方式中，人源化的亲本1C5C9抗体包括具有以下氨基酸序列的重链：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)；和/或具有以下氨基酸序列的轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:15)。
在一些实施方式中，抗体是1C5C9抗体的人源化形式。在一些实施方式中，所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如FTSX1LX2S(SEQ ID NO:25)所示的HVR-L2序列以及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列，其中X1是T或S，X2是Q或E。
在一些实施方式中，抗体是人源化的1C5-VK1。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包括如YTFPDYNIH(SEQ ID NO:1)所示的HVR-H1序列、如CIYPYNGNTA(SEQ ID NO:2)所示的HVR-H2序列以及如SDLYYFGSRGFD(SEQ ID NO:3)所示的HVR-H3序列。在一些实施方式中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包括如QASQDISTYLN(SEQ ID NO:21)所示的HVR-L1、如FTSNLET(SEQ ID NO:22)所示的HVR-L2序列以及如QQGNTLPW(SEQ ID NO:9)所示的HVR-L3序列。
在一些实施方式中，抗体包括具有如下氨基酸序列的重链可变区：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO:10)，和/或具有如下氨基酸序列的轻链可变区：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:23)。
在一些实施方式中，抗体包括具有如下氨基酸序列的重链：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)，和/或含有如下氨基酸序列的轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:24)。
在一些实施方式中，抗体是人源化的1C5-VK2。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包括如YTFPDYNIH(SEQ ID NO:1)所示的HVR-H1序列、如CIYPYNGNTA(SEQ ID NO:2)所示的HVR-H2序列以及如SDLYYFGSRGFD(SEQ ID NO:3)所示的HVR-H3序列。在一些实施方式中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包括如RASQDISTYLN(SEQ ID NO:4)所示的HVR-L1序列、如FTSSLQS(SEQ ID NO:18)所示的HVR-L2序列以及如QQGNTLPW(SEQ ID NO:9)所示的HVR-L3序列。
在一些实施方式中，抗体包括具有如下氨基酸序列的重链可变区：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO:10)，和/或具有如下氨基酸序列的轻链可变区：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:19)。
在一些实施方式中，抗体包括具有如下氨基酸序列的重链：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)，和/或具有如下氨基酸序列的轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:20)。
在一些实施方式中，抗体是人源化的1C5-VK3。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包括如YTFPDYNIH(SEQ ID NO:1)所示的HVR-H1序列、如CIYPYNGNTA(SEQ ID NO:2)所示的HVR-H2序列以及如SDLYYFGSRGFD(SEQ ID NO:3)所示的HVR-H3序列。在一些实施方式中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包括如RASQDISTYLA(SEQ ID NO:5)所示的HVR-L1序列、如FTSTLQS(SEQ ID NO:7)所示的HVR-L2序列以及如QQGNTLPW(SEQ ID NO:9)所示的HVR-L3序列。
在一些实施方式中，抗体包括具有如下氨基酸序列的重链可变区：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO:10)，和/或具有如下氨基酸序列的轻链可变区：
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在一些实施方式中，抗体包括具有如下氨基酸序列的重链：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)；和/或含有如下氨基酸序列的轻链：
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在一些实施方式中，抗体是人源化的1C5-VK4。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包括如YTFPDYNIH(SEQ ID NO:1)所示的HVR-H1序列、如CIYPYNGNTA(SEQ ID NO:2)所示的HVR-H2序列以及如SDLYYFGSRGFD(SEQ ID NO:3)所示的HVR-H3序列。在一些实施方式中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包括如RASQDISTYLA(SEQ ID NO:5)所示的HVR-L1序列、如FTSSLES(SEQ ID NO:8)所示的HVR-L2序列以及如QQGNTLPW(SEQ ID NO:9)所示的HVR-L3序列。
在一些实施方式中，抗体包括具有如下氨基酸序列的重链可变区：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO:10)，和/或具有如下氨基酸序列的轻链可变区：
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYFTSSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:14)。
在一些实施方式中，抗体包括具有如下氨基酸序列的重链：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)；和/或具有如下氨基酸序列的轻链：
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYFTSSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:17)。
在一些实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:10的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:12的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:10的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:13的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:10的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:14的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:10的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:19的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:10的三个HVR，所述轻链可变区包含来自EQ IDNO:23的三个HVR。在一些实施方式中，抗体包括具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包括具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区。
用于本发明的抗体可以包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和F(ab’)2)、嵌合抗体、双特异性抗体、多价抗体、异源缀合抗体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体和包含所需特异性(如针对含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位)的抗原识别位点的免疫球蛋白的任何其他修饰结构，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体以及共价修饰的抗体。抗体可以是小鼠、大鼠、人或其他任何来源(包括嵌合或人源化抗体)。
在一些实施方式中，特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体是单克隆抗体。例如，单克隆抗体可以通过由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤技术获得，或者通过DNA重组技术(美国专利4,816,567号)制备。
测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对抗原(例如含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位)的单克隆抗体的产生。优选的，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀法或体外结合测定，如放射免疫分析法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。
单克隆抗体也可以通过如上所述的重组DNA法制备。编码单克隆抗体的DNA很容易通过常规方法分离和测序，置于表达载体中，并转染宿主细胞，如大肠杆菌细胞或CHO细胞中，以产生重组单克隆抗体。
在一些实施方式中，特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体是人源化抗体。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，所述人免疫球蛋白中来自受体的互补决定区(CDR)残基被具有所需的特异性、亲和性和功能的来自非人物种(供体抗体，如小鼠、大鼠或兔子)的CDR残基所取代。详情参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)and Presta,Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
非人源抗体的人源化方法是本领域熟知的。一般而言，人源化抗体含有一个或多个非人源来源的氨基酸残基。人源化可以基本上遵循Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)的方法；或者通过用非人CDR序列取代人源抗体的相应序列。为了确保人源化抗体对抗原保持高度的亲和力，可以通过利用亲本和人源化序列的三维模型，分析对亲本序列和各种概念性人源化产品的过程来制备人源化抗体。免疫球蛋白的三维模型是通常可用的，并且是本领域技术人员所熟知的。通常，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原的结合。
在一些实施方式中，特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体是人源抗体。本领域已知的用于制备人源抗体的方法包括但不限于噬菌体展示技术和使用响应抗原产生人源抗体的转基因动物。
在一些实施方式中，特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体是嵌合抗体。嵌合抗体可以指来自于一个物种的互补决定区(CDR)或可变区的残基与来自于另一物种的恒定区相对应的序列连接的抗体。制备嵌合抗体的方法在本领域是已知的(参见如美国专利4,816,567号)。
在一些实施方式中，特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体是抗体片段。在一些实施方式中，特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体是Fab片段、scFv、微抗体、双价抗体、scFv多聚体或双特性抗体片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌中表达并被分泌，从而可以直接产生大量的这些片段，或者从噬菌体文库中分离出来。这些线性抗体可以是单特异性或双特异性的。
在一些实施方式中，特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体是双特异性抗体。双特异性抗体(BsAbs)是具有至少两个不同结合表位(包括在相同或不同蛋白上的表位)的特异性抗体。制备双特异性抗体的方法在本领域是已知的。全长双特异性抗体的常规生产基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中这两条链具有不同的特异性。
在一些实施方式中，特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体是多价抗体。多价抗体可以指具有超过2个抗原结合位点的抗体。在一些实施方式中，特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体是异源缀合抗体。异源缀合抗体是指通过连接具有不同特异性的两种抗体所产生的抗体，例如通过共价键连接。
通过不同的方法，将具有所期望的结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。将编码免疫球蛋白重链融合体和必要时的免疫球蛋白轻链的DNA插入分离的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。
在一些实施方式中，含有特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的组合物可包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，所述载体、赋形剂或稳定剂以用作药物组合物一部分的剂量和浓度对暴露于其中的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体实例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸等；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子如钠；和/或非离子表面活性剂如吐温TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
多核苷酸、编码抗体的载体以及宿主细胞
本发明的某些方面涉及特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的生产。特别地，某些方面涉及包含编码特异性结合有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的核酸序列的分离的多核苷酸。如上所述，多核苷酸可以指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物。这些多核苷酸可以在宿主细胞内或通过体外转录产生。编码抗体的多核苷酸可以指在产生抗体的细胞(如B细胞或杂交瘤细胞)中鉴定出的携带编码抗体序列的多核苷酸，或含有与它们的天然序列相区别的同义突变的多核苷酸，由于遗传密码固有的简并性，它们编码相似的蛋白质。多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法进行分离，包括PCR，随后基于PCR反应进行沉淀纯化，或通过含有PCR产物的琼脂糖凝胶进行切胶回收，或通过纯化含有来自宿主细胞的多核苷酸的载体(例如大肠杆菌质粒的提取)。
本发明的某些方面涉及含有编码特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的核酸序列的载体。为了重组生产抗体或其片段，将编码所需抗体或抗体片段的核酸分离，并插入到可复制的载体中，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码多克隆或单克隆抗体的DNA很容易分离(如，使用与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，并使用常规方法进行测序。许多克隆和/或表达载体都是市售的。
载体通常包含但不限于以下的一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、包含多个限制性核酸内切酶的识别序列的多克隆位点、增强子元件、启动子和转录终止序列。表达载体和克隆载体都含有能够使载体在一种或多种选定的宿主细胞中进行复制的核酸序列。这种序列对于多种细菌、酵母和病毒是公知的。表达和克隆载体还可以包含选择基因，即所谓的可选择标记，其表达能够赋予对抗生素或其它毒素的抗性，补充营养缺陷，或提供无法从复合培养基中获得的关键营养物质。
表达和克隆载体通常包含启动子，所述启动子被宿主所识别并与编码抗体(例如特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体)或其片段的核酸可操作地连接。适合于原核生物宿主使用的启动子包括phoA启动子、内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸启动子系统和混合启动子如tac启动子，尽管其他已知的细菌启动子也是适合的。在细菌系统中使用的启动子也包括与编码抗体和抗体片段的DNA可操作地连接的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno，S.D.)序列。真核生物已知的启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解激酶的酵母启动子和从病毒基因组中获得的哺乳动物启动子，所述病毒如多瘤病毒、巨细胞病毒且最优选猿猴病毒40(Simian Virus40，SV40)。各种异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子，同样也是已知的。真核宿主细胞中使用的表达载体还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。
本发明的某些方面涉及含有载体的分离的宿主细胞，所述载体含有编码特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的核酸序列。适合克隆或表达载体上编码抗体(例如特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体)或其片段的DNA的宿主细胞，如本发明中描述的原核生物如革兰氏阴性或革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科如大肠杆菌。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是合适的克隆或表达宿主，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。关于使用酵母和丝状真菌来生产治疗性蛋白的综述参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。适合表达糖基化抗体或抗体片段的宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物的实例包括植物和昆虫细胞，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster，果蝇)或家蚕(Bomhyx mori，蛾)细胞。应用哺乳动物宿主细胞系的实例有：SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(用于在悬浮培养基中生长的293或293细胞亚克隆，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub etal.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；和人肝癌细胞系(Hep G2)。关于特定的哺乳动物宿主细胞系适用于抗体生产的综述参见Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.255-268。这些例子仅是说明性的而非限制性的。
抗体生产及纯化
本发明的某些方面涉及通过培养含有编码抗体核酸序列的载体的宿主细胞，并从细胞培养物中回收抗体来生产抗体的方法。用上述的表达载体或克隆载体转染宿主细胞以用于抗体或抗体片段的生产，并在改良为适合于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规培养基中进行培养。
用于产生本发明所述的抗体(例如特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体)或抗体片段的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基，例如Ham’s F10(Sigma)、最低必须培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco改良型Eagle’s培养基(DMEM，Sigma)都适用于培养宿主细胞。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、核苷酸、抗生素、微量元素和葡萄糖或等效的能量源。还包括本领域技术人员所熟知的合适浓度的任何其他的必需的补充剂。培养条件，如温度、pH等，可沿用先前用于选择宿主细胞的表达的条件，对本领域技术人员来说是公知的。
当使用重组技术时，抗体(例如特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体)或抗体片段可以在细胞内、周质空间中产生，或者直接分泌到培养基中。从这样的细胞中制备抗体可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析例如使用附着在基质上(如琼脂糖)的蛋白A或蛋白G的方法进行纯化。
一般而言，本领域已建立了制备用于研究、测试和临床应用的纯化抗体的各种方法，与上述方法相一致和/或本领域技术人员制备感兴趣的特定抗体认为是合适的。
Ⅴ.癌症
本发明公开的某些方面涉及通过对个体给药有效量的含有特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的组合物来治疗或预防个体癌症的方法，其中表位由癌细胞表达。在一些实施方式中，表位在癌细胞的细胞表面表达。在一些实施方式中，抗体与癌细胞表面的表位结合可以抑制癌细胞的生长。
某些糖蛋白，特别是N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺，已被发现在许多类型的人癌细胞表面上高度表达，而在正常的人细胞表面上很少或没有表达(参见PCT/CN2015/087717)。因此，这些糖部分可以作为癌症的生物标记物，也可以用于优先将治疗剂(例如抗体)靶向到癌细胞。有利的是，特异于N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的抗体可以结合到细胞表面，并且能够抑制表达这些糖部分的癌细胞的生长。
本发明描述的是特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的新的抗体。如下文所述，这些抗体在不同肿瘤异种移植瘤模型中可以有效抑制不同类型的癌细胞的生长。肿瘤异种移植瘤模型是本领域已知的用于检测和预测人类肿瘤药物反应的有力工具(参见Richmond,A.and Su,Y.(2008)Dis.Model Mech.1(2-3):78-82)。这些抗体对多种不同的人肿瘤细胞系也发挥作用。此外，这些抗体在多种炎症模型中，例如IBD和关节炎，被发现优于现有抗体。
本发明所述的结果说明了特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体对多种形式的人类癌症是广泛有效的。在一些实施方式中，被抗体抑制生长的癌细胞选自：胰腺腺癌细胞、结肠腺癌细胞、直肠腺癌细胞、食管腺癌细胞、白血病细胞、腺样癌细胞、纤维肉瘤细胞、十二指肠腺癌细胞、胶质瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、卵巢癌细胞、宫颈腺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌或胃部癌症细胞、食管癌细胞和纤维肉瘤细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是胰腺腺癌细胞。胰腺腺癌细胞可指源自胰腺的任何腺癌细胞，包括原发性肿瘤或已经转移到其他部位的胰腺腺癌细胞。在一些实施方式中，胰腺腺癌细胞是胰腺导管腺癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是结肠或直肠腺癌细胞。结肠或直肠腺癌细胞可指源自结肠或直肠的任何腺癌细胞，包括原发性肿瘤或已经转移到其他部位的腺癌细胞。在一些实施方式中，腺癌细胞是中度分化的结肠腺癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是胶质瘤或胶质母细胞瘤细胞。胶质瘤细胞可指来源于神经胶质细胞(例如大脑或脊柱的胶质细胞)的任何恶性细胞，包括原发性肿瘤或已经转移到其他部位的胶质瘤细胞。胶质瘤细胞可指胶质瘤细胞的均质群体，或者是由不同类型神经胶质细胞产生的混合细胞群。在一些实施方式中，胶质瘤细胞可指少突胶质瘤细胞、脑干胶质瘤细胞、室管膜瘤细胞或视神经胶质瘤细胞。胶质瘤可包括Ⅲ级星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和少突星形细胞瘤。胶质母细胞瘤是指起源于星形胶质细胞(通常用于表征Ⅳ级神经胶质瘤或星形细胞瘤)的恶性细胞，例如脑星形胶质细胞，包括原发性肿瘤或转移到其他部位的胶质母细胞瘤细胞。胶质母细胞瘤细胞可包括原发性或新发性肿瘤和继发性肿瘤，并可包括其他细胞类型和血管。
在一些实施方式中，癌细胞是肝癌细胞。肝癌细胞可指来源于肝脏的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移至其他部位的肝癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是肺癌细胞。肺癌细胞可指来源于肺的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已经转移到其他部位的肺癌细胞。在一些实施方式中，肺癌细胞可以是非小细胞肺癌细胞。在一些实施方式中，肺癌细胞可以是肺腺癌细胞。在一些实施方式中，肺癌细胞可以是肺鳞状细胞癌。在一些实施方式中，肺癌细胞可以是小细胞肺癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是乳腺癌细胞。乳腺癌细胞可指来源于乳腺的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已经转移至其他部位的乳腺癌细胞。在一些实施方式中，乳腺癌细胞可以是导管原位癌细胞。在一些实施方式中，乳腺癌细胞可以是浸润性导管癌细胞。在一些实施方式中，乳腺癌细胞可以是浸润性小叶癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是卵巢癌细胞。卵巢癌细胞可指来源于卵巢的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已经转移至其他部位的卵巢癌细胞。在一些实施方式中，卵巢癌细胞可以是表面上皮间质瘤细胞。在一些实施方式中，卵巢癌细胞可以是性索间质瘤细胞。在一些实施方式中，卵巢癌细胞可以是生殖细胞肿瘤细胞。卵巢癌细胞可以指卵巢癌细胞的均质群体，或者是由不同类型的卵巢癌组成的混合细胞群。
在一些实施方式中，癌细胞是宫颈腺癌细胞。宫颈腺癌细胞可指来源于宫颈的任何腺癌细胞，包括原发性肿瘤或已经转移至其他部位的宫颈腺癌细胞。在一些实施方式中，宫颈腺癌细胞是腺鳞癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是结肠癌细胞。结肠癌细胞可指来源于结肠或直肠的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已经转移到其他部位的结肠癌细胞。在一些实施方式中，结肠癌细胞是腺癌细胞。在一些实施方式中，结肠癌细胞是腺鳞癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是胃癌或胃部癌症细胞。胃癌或胃部癌症细胞可指来源于胃部的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已经转移到其他部位的胃癌细胞。在一些实施方式中，胃癌或胃部癌症细胞是腺癌细胞。在一些实施方式中，胃癌或胃部癌症细胞是弥漫型腺癌(粘液、胶质、革囊、皮革样胃)细胞。在一些实施方式中，胃癌或胃部癌症细胞是淋巴瘤细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是食管癌细胞。食管癌细胞可指来源于食管的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已经转移到其他部位的食管癌细胞。在一些实施方式中，食管癌细胞是腺癌细胞。在一些实施方式中，食管癌细胞是鳞状癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是纤维肉瘤细胞。纤维肉瘤细胞可指来源于纤维结缔组织的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已经转移到其他部位的食管癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是白血病细胞。白血病细胞可指通常来源于骨髓的任何恶性白细胞，包括慢性、急性、淋巴细胞和髓性白血病细胞。例如，在一些实施方式中，白血病细胞是急性T细胞白血病细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是腺癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移到其他部位的食管癌细胞。在一些实施方式中，腺癌细胞是腺样囊性癌细胞。
Ⅵ.胃肠道疾病和类风湿性关节炎
本发明公开的某些方面涉及通过对个体给药有效量的含有特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的组合物来治疗或预防胃肠道疾病的方法，其中表位是由炎症细胞表达的。在一些实施方式中，个体患有或被诊断为本发明公开的胃肠道疾病。
在一些实施方式中，表位在炎症细胞的细胞表面表达。在一些实施方式中，炎症细胞是结肠炎、炎症性肠病或肠胃炎的肠道炎症细胞，并且表位在炎症细胞的细胞表面表达。如本发明所述，特异性识别含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体可结合结肠炎症部位(例如以结肠炎症为特征的疾病(如结肠炎、IBD或胃肠炎)中所见的炎症部位)的炎症细胞(如，白细胞，例如中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞)。
本发明公开的其他方面涉及通过对个体给药有效量的含有特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的组合物来治疗或预防类风湿性关节炎的方法。在一些实施方式中，个体患有或被诊断为类风湿性关节炎。在一些实施方式中，表位由炎症细胞表达。本发明的结果表明，抗N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的抗体(如抗体1C5C9，或其变体例如VK1、VK2、VK3和/或VK4)可以有效治疗类风湿性关节炎的一个或多个症状。在一些实施方式中，炎症细胞是T细胞或B细胞。
在一些实施方式中，炎症细胞是类风湿性关节炎的炎症细胞。如本发明所述，特异性识别含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体可用于治疗或预防类风湿性关节炎的一个或多个症状。例如，这些抗体已经证明在胶原诱导的关节炎模型中是有效的，该模型在本领域中被公认为是类风湿性关节炎的一种常见的自身免疫模型(参见Brand,D.D.等，(2007)Nat.Protoc.2:1269-1275)。
Ⅶ.治疗方法
癌症
本发明公开的某些方面涉及通过对个体给药有效量的含有特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的组合物来治疗或预防个体癌症的方法。本文描述的令人惊讶的发现是，抗体特异性结合在细胞表面或癌细胞表达的含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体，可用于抑制多种癌细胞的生长。在一些实施方式中，抗体与癌细胞表面上表达的表位结合抑制癌细胞的生长。
在一些实施方式中，癌症可包括胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、白血病、腺癌、纤维肉瘤、十二指肠腺癌、脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌、食管癌和纤维肉瘤。在一些实施方式中，个体患有或被诊断为本发明所描述的癌症。由于本发明公开表明了许多类型的癌症组织高水平表达N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺，因此本文所述的方法在治疗多种癌症方面可能具有广泛有效性。在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是指原发性肿瘤，例如代表性原发性肿瘤胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、白血病、腺癌、纤维肉瘤、十二直肠腺癌、脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌、食管癌或纤维肉瘤。在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是指原发的胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、白血病、腺癌、纤维肉瘤、十二指肠腺癌、脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌、食管癌或纤维肉瘤的转移癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是脑癌。脑癌可指起源于脑部的任何癌症，包括但不限于由上述细胞引发的癌症。脑癌的实例包括但不限于神经胶质瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤和垂体腺瘤。脑癌也可指起源于中枢神经系统例如脊柱的癌症。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是肝癌。肝癌可指起源于肝脏的任何癌症，包括但不限于由上述细胞引发的癌症。肝癌的实例包括但不限于肝癌、胆管癌和肝母细胞瘤。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是肺癌。肺癌可指起源于肺的任何癌症，包括但不限于由上述细胞引发的癌症。肺癌的实例包括但不限于非小细胞肺癌，包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌，以及小细胞肺癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是乳腺癌。乳腺癌可指起源于乳腺的任何癌症，包括但不限于由上述细胞引发的癌症。乳腺癌的实例包括但不限于原位导管癌、浸润性导管癌、三阴性乳腺癌(例如由孕激素、雌激素和HER2/neu受体阴性的细胞构成的癌症)和炎症性乳腺癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是卵巢癌。卵巢癌可指起源于卵巢的任何癌症，包括但不限于由上述细胞引发的癌症。卵巢癌的实例包括但不限于表面上皮间质肿瘤(包括子宫内膜样肿瘤、粘液性囊腺癌和浆液性肿瘤)、生殖细胞肿瘤、性索间质肿瘤和混合型卵巢肿瘤。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是宫颈癌。宫颈癌可指起源于宫颈的任何癌症，包括但不限于由上述细胞引发的癌症。宫颈癌的实例包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、腺鳞状癌、神经内分泌肿瘤、绒毛腺型腺癌和玻璃状细胞癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是结肠癌。结肠癌可指起源于结或直肠的任何癌症，包括但不限于由上述细胞引发的癌症。结肠癌的实例包括但不限于腺癌和腺鳞癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是胃癌或胃部癌症。胃癌或胃部癌症可指起源于胃的任何癌症，包括但不限于有上述细胞引发的癌症。胃癌或胃部癌症的实例包括但不限于腺癌、弥漫型腺癌(粘液、胶质、革囊、皮革样胃)和淋巴瘤。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是食管癌。食管癌可指起源于食管的任何癌症，包括但不限于由上述细胞引发的癌症。食管癌的实例包括但不限于腺癌和鳞状癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是纤维肉瘤。纤维肉瘤可指起源于纤维结缔组织的任何癌症，包括但不限于由上述细胞引发的癌症。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是胰腺癌。胰腺癌可指起源于胰腺的任何癌症，包括但不限于由上述细胞，例如胰腺导管癌细胞引发的癌症。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是白血病。白血病可指以恶性白细胞为特征的任何癌症，包括但不限于上述细胞，如急性T细胞白血病细胞引发的癌症。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是腺癌。腺癌可指起源于上皮中腺体结构的任何癌症，包括但不限于由上述细胞，例如腺样囊性癌细胞或十二指肠腺癌细胞引发的癌症。
给药与联合治疗
本领域已知的任何方法都可用于给药有效量的组合物，所述组合物包含特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体，如静脉内给药，推注或在一段时间内连续灌注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜腔内、鞘内、口服、局部或吸入方式。在一些实施方式中，抗体通过口服给药。在一些实施方式中，该组合物包含特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体和另外的蛋白质，例如不特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体。含有特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的组合物的有效量可以通过本领域已知的任何方法来确定，并且取决于上述个体的多种特征。
本发明公开的某些方面涉及通过对个体给药有效量的含有特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的组合物和一定量的另外的抗癌药物来治疗或预防个体癌症的方法，抗体与抗癌药物的联合用药为个体提供癌症的有效治疗或预防。本领域已知的任何合适的抗癌药物都可以与本发明所述的抗体联合使用。抗癌药物可以包括抗体(包括抗体-药物缀合物)、小分子、免疫治疗剂、分化诱导剂、靶向治疗剂和激素。
在某些实施方式中，抗癌药物是化疗药。许多类型的化疗药是本领域所熟知的。化疗药的实例可以包括但不限于抗代谢产物类(如5-氟尿嘧啶或卡培他滨)、蒽环类药物、抗肿瘤抗生素(如放线菌素D、丝裂霉素C或博来霉素)、有丝分裂抑制剂(如紫杉烷类，例如
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或埃博霉素类)、皮质类固醇、拓扑异构酶抑制剂(如依托泊苷)、烷化剂和铂类药物(如顺铂、奥沙利铂或卡铂)。这些药物是作为本领域技术人员提供的实例，并不是为了限制化疗药的选择。
胃肠道疾病与类风性关节炎
本发明公开的某些方面涉及通过对个体给药有效量的含有特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的组合物来治疗或预防胃肠道疾病的方法。本发明公开了如下令人吃惊的发现，特异性结合在炎症细胞的细胞表面上表达的含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体可用于治疗或预防各种胃肠道疾病，包括自身性免疫疾病和传染性疾病。
如本发明所述，本发明公开的方法对个体中广泛的胃肠道疾病或自身免疫性疾病有效。在一些实施方式中，个体患有炎症性肠病。本发明中的炎症性肠病可以是急性的也可以是慢性的。如本领域所熟知的，许多胃肠道疾病如炎症性肠病可能在组织中出现症状，包括但不限于小肠和大肠、口腔、胃、食管和肛门。在一些实施方式中，炎症性肠病可包括结肠炎(如转移性、淋巴细胞性、胶原性或不确定性结肠炎)或贝切特病(Behcet's disease)。
在一些实施方式中，个体患有克罗恩病。在一些实施方式中，个体患有溃疡性结肠炎。在一些实施方式中，个体患有急性感染性肠胃炎。在一些实施方式中，个体患有痔疮。在一些实施方式中，个体患有类风湿性关节炎。
在一些实施方式中，个体患有由病毒感染引起的胃肠道疾病。已知会引起胃肠道疾病的病毒可包括但不限于轮状病毒、诺如病毒、腺病毒和星状病毒。在一些实施方式中，病毒感染是轮状病毒感染。
在一些实施方式中，患有胃肠道或自身免疫性疾病的个体是人。在一些实施方式中，患有胃肠道或自身免疫性疾病的个体是非人动物。
本领域已知许多适合给药用于治疗或预防胃肠道或自身免疫性疾病的组合物的方法。在一些实施方式中，本发明公开的抗体可以通过静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内给药。
嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗
本发明进一步举例说明(参见下述的实施例5)本发明中任意抗体在CAR中的应用，例如用于CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法是本领域已知的一种治疗方法，该方法利用抗体的抗原结合区域(例如scFv的单链可变片段)融合到T细胞信号分子的跨膜和胞内信号结构域。这些CAR-T细胞通常根据他们来源的抗体的特异性识别抗原(例如未加工的抗原)，从而重定向T细胞以达到治疗目的，例如靶向带有特定抗原的肿瘤细胞，或将Treg细胞重定向，以阻断炎症性疾病。更详细的描述参见Dai,H.et al.(2016)J.Natl.Cancer Inst.108(7):djv439。
免疫疗法是一种利用病人免疫系统的力量来对抗疾病的疗法。免疫疗法的其中一种方法是操纵病人自身的免疫细胞识别并攻击肿瘤。尽管这种被称为过继细胞转移(ACT)的方法迄今为止仅限于小规模的临床试验，但使用这些工程免疫细胞的疗法在晚期癌症患者中产生了一些显著的反应。
ACT的构建模块是T细胞，这是一种从患者自身血液中收集的一种免疫细胞。收集后，T细胞经过基因改造，在其表面产生特殊的受体，称为嵌合抗原受体(CAR)。CAR是允许T细胞识别肿瘤细胞上的特异性蛋白质(抗原)的蛋白质。这些经过工程化改造的CAR-T细胞随后在实验室中进行增殖，直到其数量达到数十亿。然后将扩增的CAR-T细胞群体注入患者体内。在注入后，T细胞在患者体内繁殖，并在其工程受体的指引下识别并杀死表面具有抗原的癌细胞。
N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺或带有明显的N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺部分的糖缀合物可以是肿瘤细胞上的港湾抗原(harbor antigen)，并且识别本发明和在先专利公开的抗原的抗体可以是肿瘤抗原受体。因此本发明的一个方面是使用基因工程将编码抗体K3、K4和识别N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺或带有明显的N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺部分的糖缀合物的抗体(例如带有抗原结合片段的抗体片段或这样抗体的重链和/或轻链可变域)的基因导入来自患者的T细胞，从而在T细胞上产生CAR。这些经过工程化改造的CAR-T细胞可用于治疗癌症和自身免疫性疾病，如本发明所述的IBD和类风湿性关节炎。
在一些实施方式中，CAR包括含有轻链可变区和/或重链可变区的抗体片段，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:7所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列。在一些实施方式中，CAR包括含有轻链可变区和/或重链可变区的抗体片段，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1序列、如SEQ ID NO:8所示的HVR-L2序列及如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列。
本发明的某些方面涉及嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，CAR特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的HVR-L1、如FTSX1LX2S(SEQ ID NO:25)所示的HVR-L2序列、如SEQ ID NO:9所示的HVR-L3序列，其中X1是T或S，X2是Q或E，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的HVR-H1序列、如SEQ ID NO:2所示的HVR-H2序列及如SEQ ID NO:3所示的HVR-H3序列。在一些实施方式中，HVR-L2序列包含如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，CAR特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位。
在一些实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方式中，CAR包括具有如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方式中，轻链可变区和/或重链可变区是人源化的或人源的。
如本领域所熟知的，CAR通常包括一个或多个增强T细胞受体信号传导的多肽结构域，如CD3ζ和/或CD28胞内结构域(参见Maher,J.et al.(2002)Nat.Biotechnol.20:70-75and Savoldo,B.et al.(2011)J.Clin.Invest.121:1822-1826)。在一些实施方式中，CAR包括人源CD3ζ(也称为CD247)胞内结构域序列。在一些实施方式中，人源CD3ζ是指由人CD247基因编码的多肽，如NCBI RefSeq Gene ID No.919和/或UniProt AccessionNo.P20963。在一些实施方式中，CAR还包括人源CD28胞内结构域序列。在一些实施方式中，人源CD28是指由人CD28基因编码的多肽，如NCBI RefSeq Gene ID No.940和/或UniProtAccession No.P10747。
在一些实施方式中，CAR从N-末端到C-末端包括重链可变区、连接子、轻链可变区、CD8铰链区、人CD28胞内结构域和人CD3ζ胞内结构域。例如在一些实施方式中，CAR包括如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
如本发明所示，本发明公开的CAR由T细胞表达(如在细胞表面)时，能够诱导肿瘤细胞杀伤。例如，CAR能够结合在癌细胞(如本发明公开的癌细胞)的细胞表面上表达的表位(如包含N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位)。在一些实施方式中，CAR与癌细胞的细胞表面上表达的表位结合导致T细胞杀死癌细胞。
本发明进一步提供分离的多核苷酸，其包含编码本发明的CAR的核酸序列。还提供了包含编码本发明的CAR的核酸序列的载体。在一些实施方式中，载体是病毒载体。各种类型的病毒载体在本领域是已知的，包括但不限于慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)载体。还进一步提供了分离的T细胞(例如人T细胞)，其包含编码本发明的CAR的核酸序列和/或表达本发明公开的CAR，如在其细胞表面。
本发明公开的CAR(以及与之相关的分离的核苷酸、载体和分离的T细胞)可以在本发明中公开的治疗方法中使用，例如本发明所述的治疗或预防癌症的方法。因此本发明提供了治疗和预防个体的癌症的方法，包括对个体给药有效量的包含本发明的T细胞的组合物，例如表达本发明CAR的T细胞。在一些实施方式中，癌症是本发明所述的癌症之一，包括但不限于从以下各项组成的组中选择的癌症：胰腺癌、结直肠癌、食管癌、白血病、腺癌、纤维肉瘤、十二指肠腺癌、脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌、结直肠癌、肺癌或脑癌，包括本发明所述的亚型。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，这些方法还包括给药另外的抗癌药物，例如参见本发明所述的联合疗法。在一些实施方式中，T细胞和抗癌药物的联合使用能够为个体提供有效的治疗和预防癌症的效果。在一些实施方式中，抗癌药物是化疗药物。
Ⅷ.检测方法
本发明公开的某些方面涉及用于检测个体中癌细胞存在与否的方法：通过从个体中获得生物样本，将生物样本与特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体结合，并检测与生物样本结合的抗体的量，其中抗体结合指示个体中癌细胞的存在。有利地，本发明描述了特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体如何可以用于检测个体中癌症的存在，这是由于癌症存在与血清样本中N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺升高水平之间的相关性。这些方法可用于检测多种类型的癌症，包括但不限于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌或结直肠癌、食管癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、甲状腺癌、脑癌和淋巴瘤。
抗体与含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位之间的特异性结合可以通过本领域任何已知的方法检测。用于检测抗体与表位之间结合的方法是本领域熟知的，可包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、免疫组化法(IHC)、免疫荧光测定、流式细胞术、CTC(血循环肿瘤细胞)测定和免疫胶体金测定。这些示例性检测方法对于本领域技术人员是公知的；对于更详细的描述，请参见Harlow and Lane,eds.(1988)Antibodies,A LaboratoryManual。ELISA的例子可包括直接法、间接法、竞争法和夹心法ELISA。可以使用任何表面，包括但不限于板(如96孔板)或柱子。
在一些实施方式中，将上述检测结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体量与使用对照样本检测到的抗体的结合量进行比较。相对于对照样本抗体的结合量，与生物样本结合的抗体量的增加可指示个体中癌细胞的存在。对照样本的处理方法与上述被测试个体的生物样本处理方法一致。对照样本的实例可包括来自未患癌症个体，或具有已知量的N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的样本。作为非限制性的例子，可以使用本发明所述的方法检测来自于受试个体的血清样本与健康(即未患癌症)个体的血清样本进行比较。在这种情况下，与健康个体或具有已知量的N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的血清相比，受试个体的血清中抗体结合的增加可指示受试个体中存在癌细胞。
任何体液或切片都可以作为本发明的生物样本。生物样本的实例包括但不限于血液、血清、尿液、粪便、乳汁、精液、唾液、胸液、腹腔液、脑脊液、痰液和任何其他体液或分泌物。
如本发明所述，可以使用本发明所描述的方法在个体中检测许多类型的癌细胞。可以在个体中检测到的癌细胞的实例包括但不限于肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌或结直肠癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、子宫内膜癌细胞、宫颈癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞和淋巴瘤细胞。
此外，糖类相关的生物标志物本身可用于检测患有癌症或其他疾病的患者的自身抗体。这些自身抗体可以与糖类结合，所述糖类在癌症或其它病变组织或细胞上或其中差异性表达或者被释放到血液、尿液、粪便、乳汁、精液、唾液和体液或分泌物中。体液或分泌物包括但不限于胸液、腹腔液、脑脊液、痰液和脏器涂片。在一些实施方式中，糖类相关的生物标记物包括但不限于N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺或岩藻糖、或带有明显的N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺或岩藻糖的糖缀合物。
Ⅸ.试剂盒
本发明的某些方面涉及包含药物组合物的试剂盒，所述药物组合物含有特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体。在一些实施方式中，该试剂盒还包括用于对个体给药有效量的药物组合物以治疗或预防癌症的说明书。这些说明书可指通常包含在药品商业包装中的说明书，这些说明书包含关于药品商业包装中通常包含的指示性信息，这些信息包含关于适应症、用法、用量、给药、禁忌症、与包装产品组合使用的其他药物和/或关于使用这些药物的注意事项等信息。
适用于本发明试剂盒的容器包括如瓶、小瓶(如双腔瓶)、注射器(如单室或双室注射器)和试管。该制品可进一步包括标签或包装插页，其位于容器上或与容器相关联，可指示制剂的重配方法和/或使用方法。标签或包装插页可进一步表明该制剂是用于或意图用于口服或其他给药方式来治疗或预防个体的癌症。该制品可进一步包括从商业、治疗和用户角度所需要的其他材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装说明书。
在一些实施方式中，包含特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的药物组合物的试剂盒还包含用于检测个体中是否存在癌细胞的说明书。这些说明书可以指通常包含在ELISA检测试剂盒、免疫组化(IHC)检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒、流式细胞术检测试剂盒、CTC(血循环肿瘤细胞)检测试剂盒和免疫胶体金检测试剂盒的商业包装中的说明书。本发明的试剂盒还包含用于检测个体中癌细胞存在的任何其他试剂，例如96孔微孔板、非特异性蛋白质如牛血清白蛋白、与本发明公开的抗体结合而不影响其余抗原结合的第二抗体以及用于检测的试剂，如荧光或化学发光标记物或产生可检测信号的酶和底物(如辣根过氧化物酶和TMB)。
本发明的某些方面涉及包含含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的药物组合物的试剂盒和用于使用所述药物组合物检测患有癌症或炎症个体中自身抗体存在的说明书或其他试剂。这些说明书可以指通常包含在ELISA检测试剂盒、免疫组化(IHC)检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒、流式细胞术检测试剂盒、CTC(血循环肿瘤细胞)检测试剂盒和免疫胶体金检测试剂盒的商业包装中的说明书。本发明的试剂盒还包含用于检测个体中癌细胞存在的任何其他试剂，例如96孔微孔板、非特异性蛋白质如牛血清白蛋白、与本发明公开的抗体结合而不影响其余抗原结合的第二抗体以及用于检测的试剂，如荧光或化学发光标记物或产生可检测信号的酶和底物(如辣根过氧化物酶和TMB)。
本说明书被认为足以使本领域技术人员实施本发明。除了上述描述外，通过前述说明，本发明的各种修改对本领域技术人员是显而易见的，并落入所附权利要求的保护范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利文件和专利申请文件通过引用以其整体并入本文。
实施例
参考下面的实施例更加全面的理解本发明。然而它们不应解释为限制本发明的范围。应该理解的是，本发明所描述的实施例和实施方式仅用于说明性目的，因此本领域技术人员被建议根据其进行各种修改或改变，并且这些修改或改变包括在本申请的精神和范围内以及随附的权利要求书范围内。
实施例1：人源化抗体与N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的结合
由癌细胞而不是正常的人细胞优先表达的生物标志物的识别可允许设计新的检测和治疗方法以辅助癌症的诊断、治疗和/或预防。为了满足这一需求，此处描述了结合N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体。
首先已证明了Mab-1C5C9在抑制癌细胞生长、检测循环癌细胞和治疗IBD方面是有效的(参见PCT/CN2015/087717)。随即对Mab-1C5C9进行人源化。对具有共同重链可变区(VH)和不同轻链可变区(VK)的人源化1C5C9的变体(1C5-VK1和1C5-VK2)进行了表征。如PCT/CN2015/087717中所描述的，对人源化1C5C9抗体在不同IBD体内动物模型中的功效、结合和毒性进行了检测。
此处提供了人源化1C5C9的新变体，1C5-VK3(“VK3”)和1C5-VK4(“VK4”)。对这些抗体在如下实施例中的不同IBD、关节炎和癌症的体内动物模型中的结合和功效进行了检测。
材料和方法
结合活性的表征
100μL的浓度为1μg/mL的N-乙酰基葡萄糖胺(NAcGlu或NAG)和N-乙酰基-半乳糖胺(NAcGal)分别在96孔板中孵育过夜，然后洗涤并封闭。检测人源化抗体克隆1C5-VK3(K3)和1C5-VK4(K4)。
将检测抗体加入板后，洗涤板，并使用HRP标记的抗人IgG作为第二试剂检测结合。通过标准显色分析检测HRP，通过OD450nm分析结合。在另一检测中，各个抗体在加入用NAcGlu孵育的板之前，与20μL各1μg/mL的NAcGlu和NAcGal先预混15min。其余检测如上所述。
小鼠IBD模型
通过肛门注射0.15mL的120mg/ml溶于50％乙醇中的三硝基苯磺酸(TNBS；Sigma-Aldrich)，在6-8周龄、体重为17-19g的BALB/c雌性小鼠中诱导急性结肠炎。将小鼠分为以下5个治疗组：
G1：未治疗(n＝5)；
G2：每只动物用200μg抗体阿达木单抗(Humira)(Vetter Pharma-FertigungGmbH&Co.KG)进行治疗，腹膜内注射(IP)(n＝5)；
G3：每只动物用5μg抗体K3进行治疗，腹膜内注射(IP)(n＝5)；
G4：每只动物用5μg抗体K4进行治疗，腹膜内注射(IP)(n＝5)。
G2-G4小鼠的治疗在用TNBS诱导IBD 48h后每天给药一次，共4天。
每天记录各组IBD模型小鼠的体重及临床体征。经TNBS诱导IBD模型48h后处死对照组(G1)的2只小鼠，收集全结肠组织。最后一次给药一天(24h)后，所有动物结束实验(整个过程的第7天)。根据下面表1所示的关键点，收集全结肠组织进行大体病理学(结肠重量、溃疡)和组织学评价(结肠组织切片的标准HE染色)，得到代表性图。用标准组织学方法评估结肠组织病理学，如图4所示。
表1.结肠组织大体评价的评分表
Figure BDA0001746817940000571
胶原诱导性关节炎(CIA)模型
约8周龄的Lewis大鼠用牛Ⅱ型胶原作为免疫原，每周免疫1次，持续3周。将具有显著炎症性肿胀关节的大鼠随机分为3组：
第1组(G1)：对照，未治疗，n＝5；
第2组(G2)：用250μg/kg抗体1C5-VK2(“K2”)隔日治疗一次，经静脉注射，n＝5；
第3组(G3)：用250μg/只抗体K3隔日治疗一次，经静脉注射，n＝5。
每周测量两次爪子体积与体重，每周拍摄一次代表性图像。最后一次给药的一天(24h)后，所有动物结束实验(给药后28天)。收集踝关节和膝关节组织进行组织学评价，包括关节骨液、软骨和骨骼的状态，收集胸腺和脾脏，称重并计算脏器系数。采集血液并分离血清。
胰腺癌的患者源性异种移植瘤(PDX)模型
采用胰腺癌的患者源性异种移植瘤(PDX)小鼠模型评价抗体-K4的抗肿瘤功效。用Nu/Nu小鼠(6周龄)和来自未经治疗的47岁原发性低分化胰腺导管腺癌的女性患者的人肿瘤组织，构建PDX模型。
体外试验
进行CellTiter-Glo(CTG)发光细胞活力测定。简单地说，K3和K4与来自上述胰腺癌模型的PDX-P3肿瘤组织的肿瘤细胞共培养6天，然后加入CTG试剂，并根据制造商的说明书读取荧光信号(Promega,Madison,USA)。单独使用肿瘤细胞作为对照。通过比较对照组与各试验组，计算细胞生长抑制率。
体内试验
将PDX-P2胰腺组织接种于6周龄的Nu/Nu小鼠16天。将肿瘤体积约为200mm3的小鼠随机分为三组：第1组(G1)：对照，未治疗；第2组(G2)：用50μg/只抗体K4隔日治疗一次；第3组(G3)：用100μg/只小鼠抗体隔日治疗一次。每周测量两次肿瘤大小(体积)和小鼠体重。在给药后第37天收集肿瘤并进行测量。TGI的计算公式为
TGI％＝[1–(Ti–T0)/(Vi–V0)]x 100
其中T代表试验组的肿瘤大小；V代表对照组的肿瘤大小；0表示在给药前的肿瘤大小；“i”代表时间点。
结直肠癌患者源性异种移植瘤(PDX)模型
体外试验
K3与来自67岁男性中分化型结肠腺癌的PDX-P3直肠肿瘤组织的肿瘤细胞共培养6天。然后加入CTG试剂，并根据制造商的说明书读取荧光信号。单独使用肿瘤细胞作为对照。通过比较对照组与各试验组，计算细胞生长抑制率。
体内试验
用NCG小鼠(6周龄)和未经治疗的47岁男性原发性低分化直肠腺癌患者的人肿瘤组织，构建小鼠直肠癌PDX模型。将PDX-P2直肠组织接种于6周龄的NCG小鼠22天。将肿瘤体积约80-100mm3的小鼠随机分为三组：第1组(G1)：对照，未治疗；第2组(G2)：用50μg/只抗体K3隔日治疗一次；第3组(G3)：用50μg/只抗体K4隔日治疗一次。每周测量两次肿瘤大小(体积)和小鼠体重。在给药后第17天收集肿瘤并进行测量。TGI的计算公式如上所述。
抗体与肿瘤细胞的体外结合
用ELISA法检测单克隆抗体与人肿瘤细胞的结合。简单来讲，将培养有人类肿瘤细胞的96孔组织培养板孵育至约90％汇合。然后除去培养基，加入100μL无血清新鲜培养基，弃去培养基，在4℃下不盖盖保存平板直至平板干燥。将平板密封，直到在结合试验中使用。
在ELISA试验中，将100μL/孔的抗体K3和K4加入到上述包被有人肿瘤细胞的96孔板上，一式两孔，室温下孵育1小时。洗涤后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG作为第二试剂，用TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)过氧化物酶EIA底物试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)检测HRP标记抗体。通过ELISA读板机读取板的OD450。磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为阴性对照。
结果
图1A和1B表明这两种抗体与NAcGlu(图1A)和NAcGal(图1B)呈剂量依赖性结合。图2表明K3和K4的结合通过NAcGlu)和NAcGal预处理而被抑制。这些结果表明K3和K4特异性地识别N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺。两种人源化抗体K3和K4进一步描述如下文所述。
实施例2：检测N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的人源化抗体在小鼠IBD和大鼠CIA模型中的作用
使用小鼠和大鼠IBD模型研究疾病的发病机制和验证治疗靶标。如上所述在小鼠中诱导急性结肠炎，并对给药人源化的K3和K4对体重、临床症状如腹泻和结肠状况的影响进行测试，并与阿达木单抗的效果进行比较。根据上述表1所提供的关键点，通过对结肠状况的大体评价来测定抗体治疗的效果。如图4所示，治疗组G1-G4中小鼠的结肠被评估为存在结肠炎。
图3显示，与未经处理的对照组相比，K3(G3)的治疗结果的分值显著下降，表明抗体K3治疗显著缓解了溃疡和炎症。值得注意的是，阿达木单抗(G2)的治疗并没有显著缓解溃疡和炎症。
图4显示了从这些结肠样本中采集的代表性总图。对照组的所有未治疗的小鼠(G1)都显示出溃疡、炎症和组织坏死的结肠炎。G2组中，1例(#1)显示无溃疡和炎症的肠壁增厚，4例(#2、3、4和5)表现为具有溃疡或炎症或两者均有的结肠炎。G3组中，2例(#1和2)显示为轻度炎症而无明显溃疡的肠壁增厚，3例(#3、4和5)显示为无溃疡和炎症。G4组中，3例(#1、2、4和5)显示为无溃疡和轻度炎症的肠壁增厚。
这些结果说明K3治疗可以显著缓解溃疡和炎症。虽然K4治疗表现出改善，但大体评估分数没有统计学显著性。结果还表明K3和K4均表现出比阿达木单抗更好的疗效。
使用小鼠和大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)模型研究类风湿关节炎的发病机制和验证治疗靶标。CIA的主要病理特征包括多形核和单核细胞浸润的增生性滑膜炎、关节翳形成、软骨退化、骨侵蚀和纤维化。这种疾病的发展伴随着针对II型胶原蛋白的强烈的T细胞和B细胞炎症反应。疾病活动度通过测量随着时间推移受影响的关节的炎症肿胀(爪体积或厚度)来确定。
使用了如上所述的大鼠CIA模型。如图5A、5B和图6B所示，与对照组相比，抗体VK3治疗显著降低了大鼠踝关节和膝关节的炎症严重程度。VK3也比抗体VK2更能减少炎症。
代表性的总图如图6A和6B所示。图6A显示在给药后第5天(2次给药后)的代表性总图。所有大鼠踝关节和膝盖均肿胀、发红和发热。所有的大鼠都拖着腿走路。图6B显示在给药后第28天(14次给药后)的代表性总图。
这些结果证明了K3和K4在炎症性疾病的IBD和关节炎模型中的功效。
实施例3：检测N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的人源化抗体在PDX癌症模型中的作用
如上所述，使用胰腺癌PDX模型检测K3和K4。体外试验的结果如下所述。如图7A和7B所示，不同浓度下的抗体K3(图7A)和K4(图7B)均能够抑制PDX-P3胰腺癌细胞的细胞生长。抗体K3和K4(浓度为20μg/ml)分别抑制胰腺癌细胞的生长51.7％和71.8％。
体内试验结果如下所示。如图8A-8C所示，抗体K4在试验结束时抑制肿瘤生长约62％。K4对肿瘤生长的功效在分析随时间肿瘤的体积(图8A)、TGI(图8B)和肿瘤的大体评估(图8C)中得到证实。
如上文所述，接下来使用结直肠癌PDX模型检测K3和K4。体外试验的结果如下所述。如图9所示，抗体K3(浓度为10μg/ml)抑制直肠肿瘤细胞的生长49.6％。
体内试验结果如下所示。如图10A和10B所示，抗体K3和K4在试验结束时分别抑制肿瘤生长约23％和63％。这些结果使用多种肿瘤模型，证明了K3和K4在体外和体内抑制肿瘤生长的功效。
实施例4：N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的人源化抗体对肿瘤细胞系的体外结合
用上述ELISA法表征人源化单克隆抗体K3和K4与人肿瘤细胞的结合。检测了抗体K3和K4对多种人肿瘤细胞系的反应活性，包括NCI-H426(小细胞肺癌)、H1299(非小细胞肺癌)、ECAP-1090(食管腺癌)、Jurkat(急性T细胞白血病)、ACC-2(腺样囊性癌细胞)、HT1080(纤维肉瘤)、HUTU80(十二指肠腺癌)、MCF-7(乳腺癌)和HeLa(宫颈癌)。
如图11所示，人源化单克隆抗体K3和K4均能结合人肿瘤细胞。不希望被理论束缚，这些结果可能表明图11中列出的肿瘤抗原包括N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺、或包括带有明显的N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺部分的糖缀合物。这些结果表明，K3和K4能够结合广泛的人类肿瘤细胞类型。
实施例5：带有嵌合抗原受体的T细胞的肿瘤细胞杀伤
对上述抗体K4的重链和轻链可变区进行重组以用于嵌合抗原受体(CAR)，以测试具有这种特异性的CAR-T细胞是否能够影响T细胞介导的癌细胞杀伤，例如表达N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的肿瘤细胞系。
慢病毒载体的构建与产生
带有基于抗体K4的VH(SEQ ID NO：33)和VL(SEQ ID NO：26)结构域的全长CAR被合成并亚克隆到Lenti-Puro载体上。该结构具有如下结构域结构(从N-末端到C-末端)：信号序列-VH结构域-连接子-VL结构域-CD8铰链区-CD28胞内结构域-CD3ζ胞内结构域，并且在EF-1α启动子的调控下(图12A)。特别地，除了CD3ζ胞内结构域外，CD28信号胞内结构域的结合也被证明可以重定向和放大CAR-T细胞反应(参见Maher,J.et al.(2002)Nat.Biotechnol.20:70-75)。插入通过Sanger测序证实。用Qiagen plasmid maxi prepkit试剂盒制备重组的Lenti-CD274-CAR-puro。CAR的全部氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
为了产生慢病毒，每个15cm培养皿接种约5×106细胞，并加入25mL含10％FBS的DMEM培养基。细胞在37℃，5％CO2培养箱培养过夜。接下来，PEI储存液(PosiSalk，货号23966-2)与慢病毒包装系统(Lenti-CAR,Lenti-Mix)被加热至室温。经过上下吹吸充分混匀后，在6孔板中的一个孔中加入2mL的PBS、10μg Lenti-CAR和11μg Lenti-Mix质粒。然后加入26μL 100μM的PEI并立即混合。将该板在室温下孵育10分钟。
将PEI/DNA复合物加入15cm培养皿中，轻轻摇动。将培养皿在培养箱中培养6-8小时，更换培养基。培养皿连续培养48小时。48小时后，收集上清液，并用0.45μm膜过滤。将滤液在50000×g、4℃离心2小时，再将沉淀重悬于1mL的PBS中。分装病毒储存液并存储在-80℃。
为了滴定慢病毒，从液氮中复苏HT1080细胞并传代，直至达到指数生长期。在24孔板中每个孔接种50000个细胞，并补加500μL培养基。细胞在37℃、5％CO2培养箱培养过夜。
在每个孔中一起加入10-2、10-1、1或10μL的慢病毒以及终浓度为6μg/ml聚凝胺，在37℃，5％CO2培养箱中孵育96小时。
用PBS洗涤细胞，用基因组DNA纯化试剂盒(Lifetech，货号K0512)提取基因组DNA。NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)用于测定DNA浓度。
PCR检测
为了检测成功转导，如表2所示进行PCR反应。引物在下面的表3中列出。WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)和ALB(白蛋白)代表慢病毒质粒中用于病毒滴定的已知的序列；参见Barczak,W.et al.(2015)Mol.Biotechnol.57:195-200。
表2.PCR反应混合液
试剂 体积(20μL)
2×PCR混合液 10
探针混合液(WPRE探针、ALB探针) 0.4
引物混合液(WPRE F&R、ALB F&R) 0.4
PCR级水 4.2
表3.用于诊断PCR的引物
Figure BDA0001746817940000632
准备一个新的96孔板，每孔加入5μL基因组DNA样品或标准样品，同时加入15μLPCR反应混合液。平板用封板膜密封，离心1分钟。PCR反应热循环如表4所示。
表4.PCR热循环
Figure BDA0001746817940000631
CAR-T细胞的构建
为了分离CAR-T细胞，将LymphoprepTM密度梯度培养基(STEMCELL Technologies)通过翻转离心管混匀，在生物安全柜中向50ml离心管中加入15ml的LymphoprepTM。外周血样本用1倍体积的PBS稀释。将稀释的血液样品缓慢加入LymphoprepTM上方，然后在室温下，800×g离心30min。
离心后，从顶部黄色血清和无色LymphoprepTM试剂之间的界面收集PBMC，并用PBS洗涤一次。用PBS调整细胞密度为1×106cell/mL。在细胞悬浮液中加入磁性免疫磁珠(Magnetic Dynabeads)，磁珠与细胞比率为3:1，室温下孵育30分钟。用磁体分离CD3+T细胞，并用PBS清洗细胞一次。
细胞/免疫磁珠用含有300U/ml IL-2、5ng/mL IL-15和10ng/mL IL-7的X-vivo15培养基重新悬浮。细胞连续培养48h。
慢病毒转导原代T细胞
用完全培养基调整细胞密度为1×106cell/mL。慢病毒量的计算如下：病毒体积(ml)＝(MOI*细胞数)/病毒滴度。
将慢病毒和6μg/mL聚凝胺加入培养板中，800×g离心1小时。离心后，将细胞在37℃5％CO2培养箱中培养24小时，传代至使用。
CAR-T细胞对靶细胞的裂解
靶细胞从液氮中复苏并在检测前常规传代两次。将细胞密度调整至5×105细胞/mL，接种100μL/孔于96孔板中。平板放置在5％CO2 37℃培养箱培养过夜。
用无血清RPMI1640培养基重悬CAR-T细胞，并按所示的E/T比加入到96孔板中。将板放回培养箱中培养6小时。
培养后，将裂解缓冲液加入到“最大裂解”对照孔中，1200×g离心5min。将50μL上清液转移到一个新的96孔板中，并加入LDH底物。将板孵育15分钟，用微孔板读板机读取OD490nm值。剩余上清液等分用于ELISA检测，以确定细胞因子的分泌。
裂解率计算如下：
Figure BDA0001746817940000651
结果
重组慢病毒载体用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，并用琼脂糖凝胶电泳显示预期片段(图12B)。重组载体被进一步测序以验证正确的构造。这些结果表明，图12A中所示的载体被成功地制备。
为了证明用这种慢病毒载体转导的CAR-T细胞能够有效的杀伤靶细胞，将A549肺腺癌细胞用作靶细胞，将CAR-T细胞用作细胞裂解试验中的效应细胞。两种细胞共培养8小时后，收集细胞上清以确定LDH的量，指示细胞杀伤。如图13所示，即使在E/T比低至0.5∶1时，CAR-T细胞也能够有效地清除靶细胞。这些结果表明，K4抗体的可变域，如前面的实施例所示，与N-乙酰基葡萄糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺(或带有明显的N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺部分的糖缀合物)结合，在将嵌合抗原受体转导到原代人T细胞中的情况下，能够有效杀伤靶肿瘤细胞。
为了证明CAR-T细胞策略能够杀伤一系列肿瘤细胞，在对胰腺(BxPc-3)、结直肠(HCT116)和胶质母细胞瘤(U87)肿瘤细胞系的杀伤试验中测试了CAR-T细胞。首先，在细胞裂解试验中将BxPc-3胰腺癌细胞作为靶细胞，将CAR-T细胞作为效应细胞。两种细胞共培养8小时后，收集细胞上清以确定指示细胞杀伤的LDH的量。如图14所示，即使在E/T比低至0.5∶1时，CAR-T细胞也能够有效地清除BxPc-3细胞。
接下来，在细胞裂解试验中将HCT116结直肠癌细胞作为靶细胞，将CAR-T细胞作为效应细胞。两种细胞共培养8小时后，收集细胞上清以确定指示细胞杀伤的LDH的量。如图15所示，即使在E/T比低至0.5∶1时，CAR-T细胞也能够有效地清除HCT116细胞。
然后，在细胞裂解试验中将U87胶质母细胞瘤细胞作为靶细胞，将CAR-T细胞作为效应细胞。两种细胞共培养8小时后，收集细胞上清以确定指示细胞杀伤的LDH的量。如图16所示，即使在E/T比低至0.5∶1时，CAR-T细胞也能够有效地清除U87细胞。
综上所述，这些结果表明，带有K4抗体特异性CAR的人T细胞能够有效地杀伤肺、胰腺、结直肠和脑癌细胞系的细胞，证明通过该CAR-T细胞途径介导的肿瘤细胞杀伤具有广泛的适用性。
序列
除非另有说明，所有多肽序列均以N-末端至C-末端的方式示出。除非另有说明，所有核酸序列均以5’至3’的方式示出。
人源化亲本1C5C9和1C5C9-VK1/VK2/VK3/VK4HVR-H1:
YTFPDYNIH(SEQ ID NO:1)
人源化亲本1C5C9和1C5C9-VK1/VK2/VK3/VK4HVR-H2:
CIYPYNGNTA(SEQ ID NO:2)
人源化亲本1C5C9和1C5C9-VK1/VK2/VK3/VK4HVR-H3:
SDLYYFGSRGFD(SEQ ID NO:3)
人源化亲本1C5C9/1C5C9-VK2HVR-L1:
RASQDISTYLN(SEQ ID NO:4)
人源化1C5C9-VK3/VK4HVR-L1:
RASQDISTYLA(SEQ ID NO:5)
人源化亲本1C5C9HVR-L2:
FTSRLHS(SEQ ID NO:6)
人源化1C5C9-VK3HVR-L2:
FTSTLQS(SEQ ID NO:7)
人源化1C5C9-VK4HVR-L2:
FTSSLES(SEQ ID NO:8)
人源化亲本1C5C9和1C5C9-VK1/VK2/VK3/VK4HVR-L3:
QQGNTLPW(SEQ ID NO:9)
人源化亲本和1C5C9-VK1/VK2/VK3/VK4重链可变区:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO:10)
人源化亲本和1C5C9-VK1/VK2/VK3/VK4重链:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)
人源化亲本1C5C9轻链可变区:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:12)
人源化1C5C9-VK3轻链可变区:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYFTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:13)
人源化1C5C9-VK4轻链可变区:
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYFTSSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:14)
人源化亲本1C5C9轻链:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:15)
人源化1C5C9-VK3轻链:
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人源化1C5C9-VK4轻链:
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYFTSSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:17)
人源化1C5C9-VK2HVR-L2:
FTSSLQS(SEQ ID NO:18)
人源化1C5-VK2轻链可变区:
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人源化1C5-VK2轻链:
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人源化1C5C9-VK1HVR-L1:
QASQDISTYLN(SEQ ID NO:21)
人源化1C5C9-VK1HVR-L2:
FTSNLET(SEQ ID NO:22)
人源化1C5-VK1轻链可变区:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:23)
人源化1C5-VK1轻链:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:24)
共有区人源化1C5C9-VK3/-VK4HVR-L2:
FTSX1LX2S(SEQ ID NO:25)
用于CAR的VK4轻链可变区
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYFTSSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFI(SEQ ID NO:26)
WPRE正向引物
GGCACTGACAATTCCGTGGT(SEQ ID NO:27)
WPRE反向引物
AGGGACGTAGCAGAAGGACG(SEQ ID NO:28)
WPRE探针
ACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGC(SEQ ID NO:29)
ALB正向引物
GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT(SEQ ID NO:30)
ALB反向引物
ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC(SEQ ID NO:31)
ALB探针
CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC(SEQ ID NO:32)
用于CAR的VK4重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSG(SEQ ID NO:33)
CAR氨基酸序列
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYFTSSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFITTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:34)
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州惠瑞生物医药有限公司
<120> 抗N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的抗体
<130> P50158WHR-43874
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<170> PatentIn version 3.3
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Humanized parental 1C5C9and 1C5C9-VK1/VK2/VK3/VK4HVR-H2
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<213> Artificial Sequence
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<223> Humanized parental 1C5C9and 1C5C9-VK1/VK2/VK3/VK4HVR-H3
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<213> Artificial Sequence
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Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr Leu Ala
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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Phe Thr Ser Ser Leu Glu Ser
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<213> Artificial Sequence
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Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized parental and 1C5C9-VK1/VK2/VK3/VK4 Heavy ChainVariable
Region
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Cys Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Leu Tyr Tyr Phe Gly Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized parental and 1C5C9-VK1/VK2/VK3/VK4Heavy Chain
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Cys Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Leu Tyr Tyr Phe Gly Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly Lys
450
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> Artificial Sequence
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Humanized parental1C5C9 Light Chain
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<213> Artificial Sequence
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Phe Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> Artificial Sequence
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<223> Humanized 1C5C9-VK4 Light Chain
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Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Phe Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 1C5-VK2 Light Chain Variable Region
<400> 19
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 1C5-VK2 Light Chain
<400> 20
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
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<213> Artificial Sequence
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Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr Leu Asn
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 22
Phe Thr Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 1C5-VK1 Light Chain Variable Region
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 1C5-VK1 Light Chain
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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195 200 205
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210
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Consensus humanized 1C5C9-VK3/-VK4 HVR-L2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa is Q or E
<400> 25
Phe Thr Ser Xaa Leu Xaa Ser
1 5
<210> 26
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VK4 light chain variable region used for CAR
<400> 26
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile
115
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WPRE forward primer
<400> 27
ggcactgaca attccgtggt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WPRE reverse primer
<400> 28
agggacgtag cagaaggacg 20
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WPRE probe
<400> 29
acgtcctttc catggctgct cgc 23
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALB forward primer
<400> 30
gctgtcatct cttgtgggct gt 22
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALB reverse primer
<400> 31
actcatggga gctgctggtt c 21
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALB probe
<400> 32
cctgtcatgc ccacacaaat ctctcc 26
<210> 33
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VK4 heavy chain variable region used for CAR
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Cys Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Leu Tyr Tyr Phe Gly Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120
<210> 34
<211> 501
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR amino acid sequence
<400> 34
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Pro Asp Tyr Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Cys Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser
85 90 95
Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Leu Tyr Tyr Phe Gly Ser Arg
115 120 125
Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
145 150 155 160
Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
165 170 175
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr Leu
180 185 190
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Phe Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
225 230 235 240
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
245 250 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
260 265 270
Ser Val Phe Ile Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
290 295 300
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
305 310 315 320
Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
325 330 335
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
340 345 350
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
355 360 365
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
370 375 380
Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
385 390 395 400
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
405 410 415
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
420 425 430
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
435 440 445
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
450 455 460
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
465 470 475 480
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
485 490 495
Ala Leu Pro Pro Arg
500

Claims (70)

1.一种分离的单克隆抗体，该单克隆抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位，其中，抗体包含：如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区；以及如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的重链可变区。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，抗体包含：具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中，抗体包含：具有如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的轻链。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中，抗体包含：具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的抗体，其中，抗体是Fab片段、scFv、微抗体、双价抗体、scFv多聚体或双特异性抗体片段。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的抗体，其中，抗体是人源化抗体。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的抗体，其中，抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位。
8.根据权利要求1-4中任意一项所述的抗体，其中，表位由癌细胞或炎症细胞表达。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中，表位表达在癌细胞的细胞表面。
10.根据权利要求8所述的抗体，其中，表位在癌细胞内表达。
11.根据权利要求9或10所述的抗体，其中，癌细胞选自由下述各项组成的组：胰腺腺癌细胞、结肠腺癌细胞、直肠腺癌细胞、食管腺癌细胞、白血病细胞、腺样癌细胞、纤维肉瘤细胞、十二指肠腺癌细胞、胶质瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、卵巢癌细胞和宫颈腺癌细胞。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中，胰腺腺癌细胞是胰腺导管腺癌细胞。
13.根据权利要求9-10中任意一项所述的抗体，其中，抗体与表位的结合能够抑制癌细胞的生长。
14.根据权利要求8所述的抗体，其中，炎症细胞是结肠炎、炎症性肠病或胃肠炎的肠道炎症细胞，并且表位表达于所述炎症细胞的细胞表面。
15.根据权利要求8所述的抗体，其中，炎症细胞是类风湿性关节炎的炎症细胞，并且表位表达于该炎症细胞的细胞表面。
16.根据权利要求15所述的抗体，其中，类风湿性关节炎由胶原蛋白诱发。
17.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码权利要求1-16中任意一项所述的抗体的核酸序列。
18.一种载体，该载体包含编码权利要求1-16中任意一项所述的抗体的核酸序列。
19.一种分离的宿主细胞，该宿主细胞包含权利要求17所述的多核苷酸或者权利要求18所述的载体。
20.一种制备抗体的方法，该方法包括培养权利要求19所述的能够产生由核酸编码的抗体的宿主细胞，并且从细胞培养物中回收所述抗体。
21.根据权利要求20所述的方法制备的抗体。
22.一种组合物，该组合物包含权利要求1-12和21中任意一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
23.权利要求1-16中任意一项所述的抗体和权利要求22所述的组合物在制备用于治疗或预防个体的癌症的药物中的应用。
24.根据权利要求23所述的应用，其中，癌症选自由下述各项组成的组：胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、白血病、腺癌、纤维肉瘤、十二指肠腺癌、脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌。
25.根据权利要求23或24所述的应用，其中，个体是人。
26.根据权利要求23或24所述的应用，其中，个体是非人动物。
27.权利要求1-16中任意一项所述的抗体在制备用于治疗或预防个体的胃肠道疾病的药物中的应用；其中，个体患有炎症性肠病或患有急性感染性胃肠炎。
28.根据权利要求27所述的应用，其中，个体患有克罗恩病；或个体患有溃疡性结肠炎。
29.根据权利要求27所述的应用，其中，个体是人。
30.根据权利要求27所述的应用，其中，个体是非人动物。
31.一种抗体在制备治疗或预防个体的类风湿性关节炎的药物中的应用，所述抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列所示，所述轻链可变区如SEQ ID NO: 13或14的氨基酸序列所示。
32.根据权利要求31所述的应用，其中，抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位。
33.根据权利要求31或32所述的应用，其中，
抗体是Fab片段、scFv、微抗体、双价抗体、scFv多聚体或双特异性抗体片段。
34.根据权利要求31或32所述的应用，其中，抗体是人源化抗体。
35.根据权利要求31或32所述的应用，其中，抗体是人源抗体。
36.根据权利要求31或32所述的应用，其中，
抗体包含：如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的轻链可变区。
37.根据权利要求36所述的应用，其中，抗体包含：如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链和如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链。
38.根据权利要求31或32所述的应用，其中
抗体包含：如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区构成。
39.根据权利要求38所述的应用，其中，抗体包含：如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链和如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的轻链。
40.根据权利要求31所述的应用，其中，个体是人。
41.根据权利要求31所述的应用，其中，个体是非人动物。
42.根据权利要求23或27或31中任意一项所述的应用，其中，抗体的给药方式为：静脉给药、肌内给药、皮下给药、局部给药、口服、经皮给药、腹膜内给药、眼眶内给药、植入、吸入、鞘内给药、脑室内给药或鼻内给药。
43.一种试剂盒，该试剂盒包括：含有权利要求1-16和21中任意一项所述的抗体的药物组合物。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，该试剂盒还包括用于对个体给药有效量的药物组合物以治疗或预防癌症的说明书。
45.根据权利要求43所述的试剂盒，该试剂盒还包括用于对个体给药有效量的药物组合物以治疗或预防胃肠疾病的说明书。
46.一种试剂盒，该试剂盒包括：
(a)含有抗体的组合物，所述抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位，其中，表位由炎症细胞表达；以及
(b)对个体给药有效量的组合物以治疗或预防类风湿性关节炎的说明书；
所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的轻链可变区，或包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的轻链可变区。
47.根据权利要求46所述的试剂盒，其中，抗体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位。
48.根据权利要求46或47所述的试剂盒，其中，
抗体是Fab片段、scFv、微抗体、双价抗体、scFv多聚体或双特异性抗体片段。
49.根据权利要求46或47所述的试剂盒，其中，抗体是人源化抗体。
50.根据权利要求46或47所述的试剂盒，其中，抗体是人源抗体。
51.根据权利要求46所述的试剂盒，其中，抗体包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链和如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链。
52.根据权利要求46所述的试剂盒，其中，抗体包含：如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链和如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的轻链。
53.一种特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的嵌合抗原受体，其中，该嵌合抗原受体包含轻链可变区和重链可变区，
其中，嵌合抗原受体包含： SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的轻链可变区，以及
其中，嵌合抗原受体包含： SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的重链可变区。
54.根据权利要求53所述的嵌合抗原受体，其中，轻链可变区和重链可变区是人源化的或人源的。
55.根据权利要求53所述的嵌合抗原受体，其中，嵌合抗原受体包括人CD3ζ胞内结构域序列。
56.根据权利要求53所述的嵌合抗原受体，其中，嵌合抗原受体包括人CD28胞内结构域序列。
57.根据权利要求53所述的嵌合抗原受体，其中，嵌合抗原受体从N-末端到C-末端包括：重链可变区、连接子、轻链可变区、CD8铰链区、人CD28胞内结构域和人CD3ζ胞内结构域。
58.根据权利要求53所述的嵌合抗原受体，其中，嵌合抗原受体包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
59.根据权利要求53所述的嵌合抗原受体，其中，嵌合抗原受体特异性结合含有N-乙酰基葡萄糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位。
60.根据权利要求53所述的嵌合抗原受体，其中，表位表达于癌细胞的细胞表面。
61.根据权利要求60所述的嵌合抗原受体，其中，癌细胞选自由下述各项组成的组：胰腺腺癌细胞、结肠腺癌细胞、直肠腺癌细胞、食管腺癌细胞、白血病细胞、腺样癌细胞、纤维肉瘤细胞、十二指肠腺癌细胞、胶质瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、卵巢癌细胞和宫颈腺癌细胞。
62.根据权利要求61所述的嵌合抗原受体，其中，胰腺腺癌细胞是胰腺导管腺癌细胞。
63.根据权利要求60-62所述的嵌合抗原受体，其中，嵌合抗原受体表达在T细胞的细胞表面，且嵌合抗原受体与表达在癌细胞的细胞表面的表位结合，进而引导T细胞杀灭癌细胞。
64.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码权利要求53-63中任意一项所述的嵌合抗原受体的核酸序列。
65.一种载体，该载体包含编码权利要求53-63中任意一项所述的嵌合抗原受体的核酸序列。
66.根据权利要求65所述的载体，其中，载体是病毒载体。
67.根据权利要求65所述的载体，其中，载体是慢病毒载体。
68.一种分离的T细胞，该分离的T细胞包含根据权利要求64所述的多核苷酸或者权利要求65-67中任意一项所述的载体。
69.一种分离的T细胞，该分离的T细胞包含根据权利要求53-63中任意一项所述的嵌合抗原受体，其中，嵌合抗原受体表达在T细胞的细胞表面。
70.根据权利要求68或69所述的分离的T细胞，其中，T细胞是人T细胞。
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