KR20220086522A - Taci 단백질의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편을 유효 성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물을 통하여 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

TACI 단백질의 용도 {Use of TACI protein}
본 발명은 TACI 단백질의 용도에 관한 것이다.
우리 몸의 T세포 중에의 한 아형인 조절 T세포 (Treg)는 과다한 염증과 면역반응의 발생을 자연적으로 방지하는 중요한 역할을 하지만, 자가면역질환과 만성염증성질환이 생기면 오히려 조절 T세포의 기능과 숫자가 현저하게 줄어드는 것으로 알려져 왔다. 따라서 면역질환과 염증질환이 있는 환자의 경우, 조절 T세포가 많이 생성되도록 하는 것은 가장 중요하면서 자연적인 치료법이다. 지금까지 조절 T세포 (Treg)에 특이적으로 존재하는 유전자 및 단백질들이 아래와 같이 몇 개 발굴되어 발표되었다. 최근 LRIG1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질은 막관통 단백질로서, 조절 T 세포에 특이적으로 발현하는 것으로 알려졌다(US20200048343A1 참조).
본 연구진은 조절 T 세포에 특이적으로 발현하는 유전자 또는 단백질을 찾기 위하여, 유세포 분석(FACS) 등을 통하여 조절 T 세포에 TACI 단백질이 특이적으로 발현되고, 조절 T 세포의 활성화 및 분화와 연관되어 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하는 것으로, 본 발명의 다른 목적은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 진단할 수 있는 조성물, 키트 또는 상기 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다. 나아가 본 발명의 또 다른 목적은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 치료하기 위한 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하는 것으로 본 발명의 또 다른 목적은 암을 진단할 수 있는 조성물, 키트 또는 상기 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다. 나아가, 본 발명의 또 다른 목적은 암을 치료하기 위한 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에서 상기 “TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질”은 ‘TNFRSF13B(tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B)’로도 알려져 있으며, TNFRSF13B 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 상기 TNFRSF13B는 B 세포의 표면에서 주로 발견되는 TNF 리셉터 슈퍼패밀리의 막 관통 단백질로, 면역계에서 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 TACI는 APRIL, BAFF 및 CAML의 리간드를 인지할 수 있다. 본 발명에서 상기 TACI는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩티드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포 배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩티드(들)로 체내에서 형질주입된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells), PERC.6(인간 망막 세포), 조절 T 세포의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명의 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 포함하는 부위를 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 단백질 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다.
본 발명의 상기 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
본 발명의 상기 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번째 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 Fc 영역은 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
본 발명의 상기 융합 단백질의 단백질은 그 활성이 전체적으로 변화되지 않는 한 공지의 방법에 따라 변형된 Fc 유도체로 제작될 수 있다. 예를 들면, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
본 발명의 상기 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증대된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질 전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인으로 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신으로 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 또는 마우스 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
본 발명의 상기 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명의 상기 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 Fc 영역에서 당을 제거할 수 있는 효소를 이용하여 당을 제거하는 것을 의미하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 예를 들면 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 Fc 영역, 중쇄 불변영역 2(CH2), 중쇄 불변영역 3(CH3), 힌지(hinge), 이의 단편, 또는 이들의 조합(combination), 또는 이들의 조합을 포함하는 하이브리드 Fc(hybrid Fc)일 수 있다.
본 발명의 상기 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역, 중쇄 불변영역 2(CH2) 또는 중쇄 불변영역 3(CH3)을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE 유래의 Fc 영역, 중쇄 불변영역 2(CH2) 또는 중쇄 불변영역 3(CH3)으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명의 상기 "하이브리드 Fc"는 인간 IgG 서브클래스의 조합 또는 인간 IgD 및 IgG의 조합으로부터 유도될 수 있다. 하나의 실시예에서, 상기 하이브리드 Fc는 예를 들어, IgD 힌지 영역 및 CH2 N-말단 영역 + IgG4 CH2 및 CH3 영역을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 한국등록특허 제0897938호에 개시된 하이브리드 Fc 형태를 동일하게 차용하여 사용할 수 있고, 본 명세서에 참조로서 도입된다. 본 발명에서 상기 하이브리드 Fc는 생물학적 활성 분자, 폴리펩타이드 등에 결합하는 경우, 생물학적 활성 분자의 혈청 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 Fc-폴리펩타이드 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드가 발현될 때 폴리펩타이드의 발현 수준을 높이는 효과가 있다.
본 발명의 일 예시로 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래 Fc 영역이거나, 혹은 상기 IgG 또는 IgM 유래 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함할 수 있고, 다른 예시로 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래 Fc 영역이거나, 혹은 상기 IgG 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함할 수 있고, 또 다른 예시로 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유래 Fc 영역이거나, 혹은 상기 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함할 수 있으며, 또 다른 예시로 IgG1 또는 IgG2 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편과 Fc 영역이 링커를 통해 연결되는 경우, 상기 링커는 Fc 단편의 N 말단, C 말단 또는 유리기 (free radical)에 연결될 수 있고, TACI 단백질의 N-말단, C-말단 또는 유리기에 연결될 수 있다. 링커가 펩타이드 링커인 경우, 연결은 임의의 부위에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 상기 링커가 상기 면역글로불린의 Fc 영역의 C 말단 및 상기 TACI 단백질의 N 말단에 연결될 수 있다.
본 발명에서 상기 "링커(linker)"는 융합 단백질 내 TACI 단백질 또는 이의 단편과 면역글로불린 Fc 영역 사이의 간섭 효과를 줄여 타겟 세포에서 상기 TACI 단백질의 목적하는 활성을 높일 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 링커는 목적하는 질환의 조직 또는 세포 내에서 과발현되는 효소에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기와 같이 과발현되는 효소에 의해 절단될 수 있는 경우에는 Fc 영역으로 인하여 폴리펩타이드의 활성이 저하되는 것을 효과적으로 방지할 수 있다.
본 발명의 일 예시로서 상기 링커는 1 내지 100개의 아미노산을 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않으며, 융합 단백질 내 TACI 단백질 또는 이의 단편과 면역글로불린 Fc 영역을 분리시킬 수 있는 어떠한 펩타이드라도 가능하다. 상기 링커를 구성하는 아미노산 서열에는 특별한 제한은 없으나, 글라이신(G) 및 세린(S)을 포함하거나, 이들을 반복적으로 또는 무작위적 패턴으로 포함하는 것이 바람직하다. 그러한 예로서, 상기 링커는 GS로 표시되는 펩타이드 링커; 및 GGG로 표시되는 펩타이드 링커; 중 적어도 하나를 포함할 수 있고, 혹은 (GGGGS)N(N은 1 이상의 정수, 바람직하게는 1 내지 20의 정수임)의 아미노산 서열 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 링커의 일 예시로, 혈액 내에 가장 많이 존재하는 인간 알부민의 282번 내지 314번째 부분에 위치한 33개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커, 보다 바람직하게는 292번 내지 304번째 부분에 위치한 13개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있으며, 이러한 부분은 3차원적인 구조상 대부분 외부에 노출된 부분으로서 체내에서 면역반응을 유도할 가능성이 최소화된 부분이다. 단, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 링커 및 Fc 영역이 별개로 발현된 후에 서로 결합될 때, 링커는 당업계에 알려진 가교제일 수 있다. 상기 가교제는, 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄 (1,1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethane), 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde), 4-아지도살리실릭산 (4-azidosalicylic acid)과 같은 N-하이드로옥시석신이미드 에스테르 (N-hydroxysuccinimide ester), 3,3'-디사이오비스(석신이미딜프로피오네이트) (3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate))와 같은 디석신이미딜에스테르 (disuccinimidyl esters)를 포함하는 이미도에스테르 (imidoesters), 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥테인과 같은 이중 기능적 말레이미드 (bifunctional maleimides)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하여 조절 T 세포의 기능을 유지하거나 억제할 수 있다. 즉, 상기 항체는 조절 T 세포를 억제하여 신호전달을 막을 수 있다. 이는 길항제 (Antagonist)의 기능이 가능하다는 뜻이다. 길항제는 수용체에 특이적으로 결합한 후 기존의 리간드와 수용체의 상호작용을 방해하여 리간드에 의한 세포의 조절 작용을 억제시킬 수 있다. 예를 들어, PD-1, CTLA-4 등을 차단하는 항체들은 모두 길항성 항체들로 면역 체크포인트 단백질들에 의한 종양의 면역 저항을 봉쇄할 수 있다.
또한, 5XFAD AD mouse 모델에서 조절 T 세포의 일시적인 결핍 또는 조절 T 세포의 활성을 억제하는 경우, 인지능력 감소 현상의 역전이 일어난다는 것과 신경성 염증 반응이 완화되는 것을 발견한 연구결과(Baruch K, Rosenzweig N, Kertser A, Deczkowska A, Sharif AM, Spinrad A, Tsitsou-Kampeli A, Sarel A, Cahalon L, Schwartz M. 2015. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3(+) regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nat Commun 6: 7967)에 따르면 본 발명의 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하여 조절 T 세포의 기능을 유지하거나 억제하여 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 상기 항체는 전장 항체 (full-length antibody) 또는 항체의 일부분으로써 TACI 단백질 또는 이의 단편에 결합할 능력을 가지며 본 발명의 결합 분자와 경쟁적으로 TACI 단백질 또는 이의 단편의 항원 결정 부위(Epitope)에 결합하는 항체 단편 모두를 포함한다.
본 발명의 상기 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로블린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항원은 조절 T 세포, 바람직하게는 이펙터 T 세포의 억제능이 활성화된 조절 T 세포의 표면에 존재하는 TACI 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 바람직하게는 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편으로 예를 들면, 세포 외 도메인의 류신 리치 구역(Leucine Rich Region) 또는 면역글로블린 유사 도메인을 특이적으로 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "면역글로불린"은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(Framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(Epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명의 상기 상보성 결정 영역이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명의 상기 "전장 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(Disulfide) 결합으로 연결되어 있으며, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG를 포함한다. 상기 IgG는 그 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명의 상기 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 항원 결합 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역 (CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ⅱ) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (ⅲ) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (ⅶ) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (ⅷ) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) 등을 포함한다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신을 이용하는 경우 Fab 또는 F(ab')2의 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명의 상기 항체는 단일클론항체(monoclonal antibody), 다클론항체(polyclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 유니바디(unibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "단일클론항체"는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 일컫는 말로, 특정 항원 결정기(Epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명의 상기 "키메라 항체"는, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
본 발명의 상기 "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고, 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명의 상기 "결합" 또는 "특이적 결합"은 본원 항체 또는 항체 조성물의 항원에 대한 친화도를 나타내는 것이다. 항원 항체 결합에서 "특이적 결합"은 전형적으로 해리상수(dissociation constant, Kd)가 1×10-5M 미만 또는 1×10-6M 미만 또는 1×10-7M 미만인 경우 비특이적인 배경 결합과 구분될 수 있다. 특이적 결합은 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 ELISA, SPR(Surface plasmon resonance), 면역침전(immunoprecipitation), 공침전(coprecipitation) 등의 방법으로 검출될 수 있으며, 비특이적 결합과 특이적 결합을 구분할 수 있는 적절한 대조군을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 단량체의 항원 결합능의 적어도 일부를 포함하는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체로 존재할 수 있다. 이러한 다량체는 또한 동종다량체, 또는 이종다량체를 포함하는 것이다. 항체 다량체는 다수의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 단량체와 비교하여 항원에 대한 결합능이 우수하다. 항체의 다량체는 또한 다기능성(bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) 항체 제작에도 용이하다.
본 발명에서 상기 "다기능성"이란, 두 가지 이상의 활성 또는 기능 (예를 들면 항원결합능, 효소 활성, 리간드 또는 수용체 결합능)을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 일컫는 것으로, 예를 들면 본 발명의 항체는 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드 예를 들면 루시퍼라제, 아세틸트랜스퍼라제, 갈락토시다제 등과 결합될 수 있다. 다기능성 항체는 또한 다가성(multivalent) 또는 다특이성(bispecific, trispecific, 등) 형태의 항체를 포함한다.
본 발명의 상기 "항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)"란, 항체와 약물의 생물학적 활성을 저하시키지 않으면서 약물과 항체를 화학적으로 연결한 형태를 지칭한다. 본 발명에서 상기 항체-약물 결합체는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단의 아미노산 잔기에 약물이 결합된 형태, 구체적으로는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단, α-아민기에 약물이 결합된 형태를 말한다.
본 발명의 상기 "약물"은 세포에 특정 생물학적 활성을 가지는 임의의 물질을 의미할 수 있으며, 이는 DNA, RNA 또는 펩타이드(Peptide)를 포함하는 개념이다. 상기 약물은 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 형태일 수 있으며, α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 링커가 연결되어 있는 형태 역시 포함한다.
본 발명의 상기 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기의 예로는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있다면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 아민기와 반응하는 종류를 모두 포함한다. 그 예로 아이소티오시아네이트(Isothiocyanate), 아이소시아네이트(Isocyanates), 아실 아자이드(Acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(Sulfonyl chloride), 알데하이드(Aldehyde), 글리옥살(Glyoxal), 에폭사이드(Epoxide), 옥시레인(Oxirane), 칼보네이트(Carbonate), 아릴 할라이드(Aryl halide), 이미도에스터(Imidoester), 카보이미드(Carbodiimide), 안하이드라이드(Anhydride) 및 플루오로페닐 에스터(Fluorophenyl ester) 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 약물은 뇌신경계 질환 또는 암 질환으로, 특히 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암 질환을 치료할 수 있는 약물이라면 그 종류에 관계없이 포함될 수 있다.
본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환 증상을 차단하거나, 질환 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, "치료" 및 "개선"은 본 발명의 약학 조성물을 조사하여 질환 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투여가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명에서 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 TACI 단백질 또는 이의 세포 외 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 바이오마커 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다.
본 발명의 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이다.
본 발명의 상기 TACI 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명의 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명의 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 TACI 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 진단용 키트는 예를 들면, 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 암호화하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TACI 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 "목적하는 개체"란 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 발병 여부가 불확실한 개체로, 질환의 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명의 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포, 바람직하게는 TIL 조절 T 세포 또는 활성화된 조절 T 세포, 보다 바람직하게는 이펙터 T 세포의 억제능이 활성화된 조절 T 세포의 세포 표면에서 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법에서, TACI 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제 등과 관련된 내용은 상기 진단용 조성물에 기재된 바와 중복되어 이하 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 분리된 생물학적 시료는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환이 유발되었거나 유발되지 않은 개체로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 구체적으로는 상기 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포, 바람직하게는 TIL 조절 T 세포 또는 활성화된 조절 T 세포, 보다 바람직하게는 이펙터 T 세포의 억제능이 활성화된 조절 T 세포의 세포 표면에서 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 피검 물질은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.
본 발명에서 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 흑색종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, TACI 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조절 T 세포를 유효 성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체는 C-9 항체(Mouse anti TACI antibody)일 수 있다. 본 발명에서 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포에 존재하는 것일 수 있다.
암 세포는 종양 형성에 대해 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 항원을 발현하는 것으로 널리 사료되고 있다. 추가로, 종양 미세환경은 항-종양 반응을 활성화하기 위해 TLR 시그날 전달을 유발할 수 있는 성분이 풍부하다. 이것은, 질환의 초기 단계에서, 암 세포가 종양을 발병하는 것에 대한 숙주-보호 및 종양-모델링 작용 둘다를 발휘하는 면역계에 의해 인지되고 거부될 기회를 가질 수 있음을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 암 세포는 또한 MHC 분자의 하향 조절 또는 항원 프로세싱 및 제공 기구와 같은, 억제성 사이토킨의 분비를 증가시키고 억제성 분자를 발현하여 암세포에 대한 면역 내성을 유도하는 면역 감시를 회피하기 위한 많은 음성 조절 기작을 갖는다. 따라서, 암 환자는 흔히 불량한 면역력을 갖는 것으로 고려된다. 따라서, 여전히 암 관련 면역 억제의 역전을 위한 제제 또는 치료요법을 개발할 필요가 있다. 한편, 항체 기반 암 치료법은 통상적인 약물에 비해 잠재적으로 특이성이 높고 부작용이 낮다는 특성을 갖는다. 그 이유는 항체에 의한 정상 세포와 신생 세포 간의 정밀한 구별이 가능하다는 것과 이들의 작용 방식이 세포독성 면역 세포의 유입 및 상보적인 활성화와 같은 독성이 덜한 면역학적 항종양 메카니즘에 의존하기 때문이다.
항체 기반 요법을 위한 표적은 정상 세포와 신생 세포를 적절하게 구별 지을 만한 기초가 되는 특정한 성질을 가져야만 한다. 효과적이고도 안전한 항체 요법을 개발하는데 있어서, 종양 세포에만 독점적으로 국한되거나, 정상 조직상에서는 전혀 검출되지 않는 표적이 이상적이리라는 것은 두 말 할 필요도 없다. 다른 측면에서, 고도의 과발현은 치료 창의 기초가 될 수 있고 유전자 증폭의 결과로서 인간 상피성장인자 수용체 타입 2(HER-2)에 의해 예시되는 낮은 부작용은 항체 트라스투주맙(헤르셉틴)의 우수한 표적이다.
종양 치료법에서 이미 승인받았거나 임상 개발 중에 있는 항체들의 다른 표적들은 종양 세포 상의 표적 분자의 수치상의 과발현에 기초하지 않는, 고유한 특성을 갖는다. 프로테오글리칸 MUC-1에 대한 항체의 경우, 표적의 골격 중에 존재하는 펩타이드 반복 에피토프가 종양 세포에서 언더글리코실화되어 그의 정상적인 카운터파트로 변경된다. CD20(리툭시맙), CD52(캄파트-1H) 및 CD22(에프라투주맙)에 대한 항체의 경우, 항체 표적들은 종양 세포과 정상적인 임파구 상에서 필적할만한 발현 수준을 보인다. 이와 관련해서, 표적-음성적인 줄기 세포들이 정상적인 임파구 레파토리를 복구시켜주기 때문에, 항체에 의한 정상 세포의 제거는 관용될 수 있다. 항체 표적의 서로 다른 접근성의 또 다른 예는 암배아성 항원(CEA)와 카보안하이드라제 IX(CA9)이다. 이들 두 가지 항원은 모두 각각 결장과 신장의 정상적인 상피에서 발현된다. 그러나, 방사능 표지된 조영 항체들은 종양 조직과 정상 조직을 잘 구별해 내기 때문에, 세포독성 항체들은 잘 관용된다. 이는 아마도 IgG 항체가 접근하지 못하는 정상적인 상피 조직의 관강 쪽에만 CA9와 CEA의 발현이 국한되기 때문인 것으로 여겨진다. 항원 상피 세포 부착 분자(Ep-CAM) 역시도 이 카테고리에 속한다. 상피 세포에 대한 상동기관 세포 부착 분자로서, 이것은 세포간 공간에 위치한다. 흥미로운 것은, 고친화성 항Ep CAM 항체들은 매우 독성이 높은 반면, 중간 정도의 친화성 항체들은 잘 관용된다는 점이다. 이는, 정상 세포에 대한 Ep-CAM 표적의 접근성뿐만 아니라, 항체 결합의 동력학(kinetics)가 새로운 치료 창을 열어줄 수 있음을 시사하는 것이다. 신생조직과 관련한 질병을 치료하는데 있어서 8 가지 항체가 승인되었지만, 이들 대부분은 임파종과 백혈병에 대한 것이다. 단 3개의 단일클론항체, 즉, 헤르셉틴, 아바스틴 및 에르비툭스만이 암 사망률의 90% 이상을 차지하는 고형암 종류에 듣는다. 실질적으로 잔존하는 의학적 요청, 현저한 임상적 장점이 인정된 mAb가 이미 제공되었고 이들의 상당한 상업적 성공 역시 여러 그룹의 환자들에 대한 항체 기반 요법 개발과 이들의 효능 증강이 잘 균형을 이룬 새로운 혁신적인 접근법을 개발하는 동기를 제공하였다. 업그레이드된 차세대 항체 기반 암 치료법의 출현과 관련하여 마스터하여야 할 과제 중 하나는 유리한 독성/효능 프로파일의 핵심 인자인 적절한 표적 분자를 선택하는 것이다.
고형암의 치료에 이용 가능한 현행 항체들은 정상 조직에 대한 이들의 표적 발현으로 인하여, 항체 분자에 내재된 작용 모드의 축적된 힘을 충분히 발휘하지 못한다. 예를 들어 헤르셉틴의 표적인 Her2/neu는 심장 근육을 비롯한 많은 정상적인 인체 조직에서 발현된다. 그 결과, 헤르셉틴은 면역력이 감소되게 설계되어 최대 유효량으로 투약되지 못하는데, 이는 그렇지 않을 경우, 허용 불능한 독성이 나타나기 때문이다. 이와 같이 "잠재적으로 날카로운 칼날을 무디게 하는 조치"는 헤르셉틴의 치료 효능에 제한을 가한다.
독성과 관련된 정상 조직에서는 발현하지 못하게 하는 것에 더하여, 종양 세포 표면상에서는 강력하고 높은 발현율을 나타내도록 하면서 종양 촉진 기능을 나타내는 것이 이상적인 항체 표적의 바람직한 특징이다.
본 발명의 “전사인자”라고 함은, DNA에 결합하여 mRNA를 전사하도록 조절하는 다수의 단백질들을 말한다. 세포핵 내외에 존재하는 많은 수의 전사인자들은 같은 유전자를 가지고 있는 세포들이라고 하여도 서로 다른 기능을 할 수 있도록 유전자 발현을 조절하는 역할을 한다. 전사인자에 따라 유전자 발현을 촉진하기도, 억제하기도 한다고 알려져 있다.
본 발명의 일 구체예에서, TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편을 유효 성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체는 인간 또는 마우스 유래 항체인 것인, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포에 존재하는 것인, 약학 조성물을 제공하며, 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 약학 조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장에서 선택된 경로를 통해 체내 주입되는, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효 성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체는 인간 또는 마우스 유래 항체인 것인, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포에 존재하는 것인, 약학 조성물을 제공하며, 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 약학 조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장에서 선택된 경로를 통해 체내 주입되는, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암의 진단용 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공하고, 상기 TACI 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 진단용 조성물을 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암의 진단용 키트을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암을 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함하는, 정보 제공 방법을 제공하고, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 측정 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 정보 제공 방법을 제공하며, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의해 수행되는, 정보 제공 방법을 제공하며, 상기 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 감소된 경우, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 분리된 생물학적 시료에서 TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 생물학적 시료에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 피검 물질의 접촉 후 상기 생물학적 시료에서 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편; 또는 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암을 치료하기 위한 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체는 인간 또는 마우스 유래 항체인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포에 존재하는 것인, 약학 조성물을 제공하며, 상기 암은 고형암인, 약학 조성물을 제공하며, 상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암인, 약학 조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장에서 선택된 경로를 통해 체내 주입되는, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체는 인간 또는 마우스 유래 항체인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하며, 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포에 존재하는 것인, 약학 조성물을 제공하며, 상기 암은 고형암인, 약학 조성물을 제공하며, 상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암인, 약학 조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장에서 선택된 경로를 통해 체내 주입되는, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 TACI 단백질 또는 이의 단편은 이펙터 T 세포의 억제능이 활성화된 조절 T 세포에서 특이적으로 발현되며, 이는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암의 진단 또는 치료제의 새로운 타겟으로 사용될 수 있다.
TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편을 이용하여 조절 T 세포 의 분화 과정 중 T 세포의 활성화를 방해해 iTreg 세포의 분화를 저해함으로써 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암의 진단 또는 치료를 할 수 있다.
도 1과 도 2a와 도 2b은 본 발명의 일 실시예에 따른 TACI 단백질이 조절 T세포에서 많이 발현된다는 것을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3b은 본 발명의 일 실시예에 따른 TGF-B의 농도가 늘어남에 따라 TACI의 발현이 늘어난다는 것을 알 수 있으므로 Treg 세포 표면의 TACI 발현은 음성 면역 조절제 TGF-B에 의해 유도된다는 사실을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4b은 본 발명의 일 실시예에 따른 Foxp3의 발현이 높은 쥐의 iTreg Cell에서는 TACI의 발현이 늘어난다는 것을 알 수 있으므로 TACI 발현은 Foxp3 발현과 상관관계가 있다는 사실을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 C-9(인간 기원의 TACI 단백질의 C-말단에서 매핑되는 아미노산 42-293번째의 항원에 대해 생성된 쥐 항-TACI 단일클론 항체, Santa Cruz [Cat No. sc-365253] 참조) 항체가 투여된 경우 CD69 단백질의 발현이 적음을 알 수 있으므로 C-9 항체는 iTreg 분화 과정에서 그 활성을 억제하여 iTreg 세포로의 분화를 억제한다는 사실을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 C-9 항체가 투여된 경우 Treg 세포에서 전사인자의 발현이 적음을 알 수 있으므로 C-9 항체는 iTreg 분화 과정에서 그 활성을 억제하여 iTreg 세포로의 분화를 억제한다는 사실을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 C-9 항체가 투여된 경우 Treg 세포에서 Foxp3 단백질의 발현이 적음을 알 수 있으므로 C-9 항체는 iTreg 분화 과정에서 그 활성을 억제하여 iTreg 세포로의 분화를 억제한다는 사실을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 세포 별 TACI 발현 수준의 확인
[1-1] T 세포 각 서브세트(subset)의 분화 프로토콜
쥐로부터 비장(spleen)을 분리한 뒤 PBS 3ml이 담긴 60Ψ 디쉬(dish)에 넣고 헹군 후 또 다른 60Ψ 디쉬에 PBS 3ml으로 옮겼다. e-튜브(tube) 뚜껑 부분으로 비장을 갈아준 뒤 50 ml 코니컬 튜브(conical tube)로 조직을 제외한 나머지 용액을 옮겨주고, PBS로 e-튜브 뚜껑 부분도 씻어서 넣어주었다. 1500 rpm으로 5분 동안 원심 분리한 뒤 1 ml 정도를 제외한 나머지 PBS를 빨아들이고, RBC 용혈 버퍼를 이용해 펠렛을 풀어주었다(쥐 1마리당 5 ml씩). 새로운 50ml 코니컬 튜브에 세포 여과체(cell strainer) 위로 풀어준 세포들을 걸러준 뒤 PBS로 세척하며 총 50 ml이 되도록 부피를 맞추고 세포 수를 세었다. (쥐 한 마리당 대략 107 ~ 108개의 세포 수가 관찰되었다.) 1500 rpm으로 5분간 원심 분리한 뒤 세포 108개 당 MACS 버퍼 400 ㎕ (~ 30%), CD4+ 칵테일(cocktail) 100 ㎕ (~ 30%)를 넣고 10분간 냉장고에 넣어두었다(1분마다 15초씩 tapping). MACS 버퍼 300 ㎕ (~ 30%), 항-비오틴(Anti-biotin) 200 ㎕ (~ 30%)를 위의 코니컬에 넣고 15분간 냉장고에 넣어두었다(1분마다 15초씩 tapping). MACS 버퍼로 20 ml 맞춘 뒤, 1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다(동시에 LD column MACS 버퍼 3ml로 충진하였다). 1 ml만 남기고 빨아들인 뒤, MACS 버퍼 3 ml로 풀고 LD 컬럼(column) 아래에 종이컵과 얼음 및 50 ml 코니컬을 받친 후 세포 여과체 위로 내렸다(2번 더 반복). MACS 버퍼로 20 ml 맞춘 뒤, 1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 1 ml 남기고 빨아들인 뒤 세포 108개 당 MACS 버퍼 800 ㎕ (~ 30%), 항-CD62L+ 200 ㎕ (~30%)를 넣고 15분간 냉장고에 넣어두었다(1분마다 15초씩 tapping). MACS 버퍼로 20ml 맞춘 뒤, 1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다 (5분쯤 남았을 때 LS 컬럼 MACS 버퍼 3 ml로 충진). 1 ml 남기고 빨아 들인뒤, MACS 버퍼 3ml로 풀고 LS 컬럼 아래에 종이컵을 받친 후 세포 여과체 위로 내렸다(2번 더 반복). LS 컬럼을 15 ml 코니컬 튜브 위에 얹고 MACS 버퍼 3 ml을 넣은 뒤, 실린더를 이용해 LS 컬럼에서 비드가 떨어지도록 밀어주었다. MACS 버퍼로 10ml을 맞춘 뒤, 세포 수를 세었다(쥐 한 마리당 7×106 ~ 8×106개의 세포 수가 관찰되었다). 1500 rpm으로 5분간 원심 분리한 뒤 bruff 배지로 풀어주었다 (100 ㎕ 당 세포 2 × 105개). 96 웰 플레이트에 세포 100 ㎕와, 단백질 20 ㎕ 및 배지(cytokine) 80 ㎕를 순서대로 넣어주고 주위를 둘러싼 모든 웰에 PBS 200 ㎕를 넣어주었다(증발 방지). 4일 경과 후 100마이크로 ELISA용 걷어두고 세포들을 재-자극(re-stimulation)하여 사이토카인을 분비하도록 하였다. 세포 자극 칵테일(Cell stimulation cocktail)(500X)은 총량을 200 ㎕를 기준으로 하여 1/500로 배지에 희석하였고, 100 ㎕를 추가하였다. (-)는 배지에만 하였고, 파이페팅 한번씩 수행하였다. 4시간 경과 후 세포 라운드 웰(cell round well)에 옮겨서 2500 rpm으로 2분간 다운시킨 뒤 PBS로 세척하고 다시 다운시켰다. PBS 50 ㎕에 웰당 CD4-APC 0.2ul를 파이페팅 후 냉장고에서 30분(호일)간 보관한 뒤 PBS 150 ㎕를 넣고 다운시켰다. 1X IC 고정 버퍼 80 ㎕씩 넣고 30분간 냉장고에서 보관하였다. 막 투과 버퍼(Permeabilization buffer) 10X를 1X 120 ㎕에 넣고 바로 원심 분리하였다. 막 투과 용액 50 ㎕ 및 IL17A 0.2ul를 파이페팅 30분하고 21웰에 처리하였다. 막 투과 용액으로 세척 후 다운시킨 뒤, 다시 세척 후 다운시키고 PBS로 풀어 유세포 분석(FACS)을 수행하였다. CD4+ 세포는 CD4 APC (FL-4), Th17 세포는 IL-17A PE(Phycoerythrin) (FL-2), Th2 세포는 IL-4 PE (FL-2), Th1 세포는 IFN-r FITC (FL-1), Treg 세포는 Foxp3 FITC (FL-1)를 사용하였다.
[1-2] 항체 염색(staining) 실험 프로토콜
상기 [1-1]에서 각 분화시킨 세포(200ul)를 피펫팅하여 라운드 웰로 옮겼다. 2500 rpm으로 2분간 원심 분리한 뒤 세포 표면 단백질의 염색을 위해서는, 배지를 제거한 뒤 1 웰 기준 PBS 50 ㎕ 및 항체를 혼합하여 피펫팅하였다. 플레이트를 호일로 싸고 4도씨에서 30분간 배양하였다. 이후 PBS를 각 웰당 150 ㎕씩 더 채워주고 2500 rpm에서 2분간 원심 분리하였다. 세포 내 단백질의 염색을 위해서는 배지를 제거한 뒤 고정/투과 농도 (4x)를 고정/투과 희석액을 이용하여 1x로 희석하고, 1 웰당 80ul씩 풀고 플레이트를 호일로 싸서 4도씨에서 30분간 배양하였다. 이후 10x 투과 버퍼를 DW를 이용하여 1x 투과 버퍼로 희석하고 1 웰당 120 ㎕씩 넣고 2500 rpm으로 2분간 원심 분리하였다. 이후 1 웰당 1x 투과 버퍼 50 ㎕와 항체를 혼합하여 피펫팅하였다. 플레이트를 호일로 싸고 4도씨에서 30분간 배양하였다. 1x 투과 버퍼를 150 ㎕씩 추가로 넣고 2500rpm으로 2분간 원심 분리하였다. PBS 200 ㎕씩 넣고 풀어준 이후 2500 rpm으로 2분간 원심 분리하여 세척하였다. 또, PBS 200 ㎕씩 넣고 풀어준 이후 FACS 분석을 진행하였다.
[1-3] 결과
그 결과, 도 1 내지 도 2에서 보는 바와 같이, Treg 세포에서 특이적으로 TACI 단백질의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2] TGF-B 농도 별 TACI 발현 수준의 확인
[2-1] T 세포 각 서브세트(subset)의 분화 프로토콜
쥐로부터 비장(spleen)을 분리한 뒤 PBS 3ml이 담긴 60Ψ 디쉬(dish)에 넣고 헹군 후 또 다른 60Ψ 디쉬에 PBS 3ml으로 옮겼다. e-튜브(tube) 뚜껑 부분으로 비장을 갈아준 뒤 50 ml 코니컬 튜브(conical tube)로 조직을 제외한 나머지 용액을 옮겨주고, PBS로 e-튜브 뚜껑 부분도 씻어서 넣어주었다. 1500 rpm으로 5분 동안 원심 분리한 뒤 1 ml 정도를 제외한 나머지 PBS를 빨아들이고, RBC 용혈 버퍼를 이용해 펠렛을 풀어주었다(쥐 1마리당 5 ml씩). 새로운 50ml 코니컬 튜브에 세포 여과체(cell strainer) 위로 풀어준 세포들을 걸러준 뒤 PBS로 세척하며 총 50 ml이 되도록 부피를 맞추고 세포 수를 세었다. (쥐 한 마리당 대략 107 ~ 108개의 세포 수가 관찰되었다.) 1500 rpm으로 5분간 원심 분리한 뒤 세포 108개 당 MACS 버퍼 400 ㎕ (~ 30%), CD4+ 칵테일(cocktail) 100 ㎕ (~ 30%)를 넣고 10분간 냉장고에 넣어두었다(1분마다 15초씩 tapping). MACS 버퍼 300 ㎕ (~ 30%), 항-비오틴(Anti-biotin) 200 ㎕ (~ 30%)를 위의 코니컬에 넣고 15분간 냉장고에 넣어두었다(1분마다 15초씩 tapping). MACS 버퍼로 20 ml 맞춘 뒤, 1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다(동시에 LD column MACS 버퍼 3ml로 충진하였다). 1 ml만 남기고 빨아들인 뒤, MACS 버퍼 3 ml로 풀고 LD 컬럼(column) 아래에 종이컵과 얼음 및 50 ml 코니컬을 받친 후 세포 여과체 위로 내렸다(2번 더 반복). MACS 버퍼로 20 ml 맞춘 뒤, 1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 1 ml 남기고 빨아들인 뒤 세포 108개 당 MACS 버퍼 800 ㎕ (~ 30%), 항-CD62L+ 200 ㎕ (~30%)를 넣고 15분간 냉장고에 넣어두었다(1분마다 15초씩 tapping). MACS 버퍼로 20ml 맞춘 뒤, 1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다 (5분쯤 남았을 때 LS 컬럼 MACS 버퍼 3 ml로 충진). 1 ml 남기고 빨아 들인뒤, MACS 버퍼 3ml로 풀고 LS 컬럼 아래에 종이컵을 받친 후 세포 여과체 위로 내렸다(2번 더 반복). LS 컬럼을 15 ml 코니컬 튜브 위에 얹고 MACS 버퍼 3 ml을 넣은 뒤, 실린더를 이용해 LS 컬럼에서 비드가 떨어지도록 밀어주었다. MACS 버퍼로 10ml을 맞춘 뒤, 세포 수를 세었다(쥐 한 마리당 7×106 ~ 8×106개의 세포 수가 관찰되었다). 1500 rpm으로 5분간 원심 분리한 뒤 bruff 배지로 풀어주었다 (100 ㎕ 당 세포 2 × 105개). 96 웰 플레이트에 세포 100 ㎕와, 단백질 20 ㎕ 및 배지(cytokine) 80 ㎕를 순서대로 넣어주고 주위를 둘러싼 모든 웰에 PBS 200 ㎕를 넣어주었다(증발 방지). 4일 경과 후 100마이크로 ELISA용 걷어두고 세포들을 재-자극(re-stimulation)하여 사이토카인을 분비하도록 하였다. 세포 자극 칵테일(Cell stimulation cocktail)(500X)은 총량을 200 ㎕를 기준으로 하여 1/500로 배지에 희석하였고, 100 ㎕를 추가하였다. (-)는 배지에만 하였고, 파이페팅 한번씩 수행하였다. 4시간 경과 후 세포 라운드 웰(cell round well)에 옮겨서 2500 rpm으로 2분간 다운시킨 뒤 PBS로 세척하고 다시 다운시켰다. PBS 50 ㎕에 웰당 CD4-APC 0.2ul를 파이페팅 후 냉장고에서 30분(호일)간 보관한 뒤 PBS 150 ㎕를 넣고 다운시켰다. 1X IC 고정 버퍼 80 ㎕씩 넣고 30분간 냉장고에서 보관하였다. 막 투과 버퍼(Permeabilization buffer) 10X를 1X 120 ㎕에 넣고 바로 원심 분리하였다. 막 투과 용액 50 ㎕ 및 IL17A 0.2ul를 파이페팅 30분하고 21웰에 처리하였다. 막 투과 용액으로 세척 후 다운시킨 뒤, 다시 세척 후 다운시키고 PBS로 풀어 유세포 분석(FACS)을 수행하였다. CD4+ 세포는 CD4 APC (FL-4), Th17 세포는 IL-17A PE(Phycoerythrin) (FL-2), Th2 세포는 IL-4 PE (FL-2), Th1 세포는 IFN-r FITC (FL-1), Treg 세포는 Foxp3 FITC (FL-1)를 사용하였다.
[2-2] 항체 염색(staining) 실험 프로토콜
상기 [2-1]에서 각 분화시킨 세포(200ul)를 피펫팅하여 라운드 웰로 옮겼다. 2500 rpm으로 2분간 원심 분리한 뒤 세포 표면 단백질의 염색을 위해서는, 배지를 제거한 뒤 1 웰 기준 PBS 50 ㎕ 및 항체를 혼합하여 피펫팅하였다. 플레이트를 호일로 싸고 4도씨에서 30분간 배양하였다. 이후 PBS를 각 웰당 150 ㎕씩 더 채워주고 2500 rpm에서 2분간 원심 분리하였다. 세포 내 단백질의 염색을 위해서는 배지를 제거한 뒤 고정/투과 농도 (4x)를 고정/투과 희석액을 이용하여 1x로 희석하고, 1 웰당 80ul씩 풀고 플레이트를 호일로 싸서 4도씨에서 30분간 배양하였다. 이후 10x 투과 버퍼를 DW를 이용하여 1x 투과 버퍼로 희석하고 1 웰당 120 ㎕씩 넣고 2500 rpm으로 2분간 원심 분리하였다. 이후 1 웰당 1x 투과 버퍼 50 ㎕와 항체를 혼합하여 피펫팅하였다. 플레이트를 호일로 싸고 4도씨에서 30분간 배양하였다. 1x 투과 버퍼를 150 ㎕씩 추가로 넣고 2500rpm으로 2분간 원심 분리하였다. PBS 200 ㎕씩 넣고 풀어준 이후 2500 rpm으로 2분간 원심 분리하여 세척하였다. 또, PBS 200 ㎕씩 넣고 풀어준 이후 FACS 분석을 진행하였다.
[2-3] 결과
그 결과, 도 3a 내지 도 3b에서 보는 바와 같이, TGF-B의 농도가 늘어남에 따라 TACI의 발현이 늘어난다는 것을 알 수 있으므로 Treg 세포 표면의 TACI 발현은 음성 면역 조절제 TGF-B에 의해 유도된다는 사실을 확인할 수 있었다.
[실시예 3] Foxp3 발현과 TACI 발현 수준과의 관계 확인
[3-1] iTreg 세포의 분화 프로토콜
여기서, iTreg 세포는 자연적으로 분리한 nTreg 세포와는 달리 하기 조성을 포함하는 배지에서 분화를 인공적으로 유도한 세포를 의미한다. iTreg 세포는 우선, 쥐의 비장으로부터 나이브(naive) T 세포를 분리한 뒤, 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT) 10%를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 영양배지에 하기 표 1의 성분을 각각 더 포함하도록 하여, 37℃ 5% CO2 배양기 내에서 72시간 배양을 통해 iTreg 세포로 분화를 유도하였다.
분화 세포 조성
iTreg IL-2, TGFβ
[3-2] 항체 염색(staining) 실험 프로토콜
상기 [3-1]에서 각 분화시킨 세포(200ul)를 분화한지 1일째 activation marker인 CD69을 염색하여 발현정도 확인하였다. 즉, 상기 [3-1]에서 각 분화시킨 세포(200ul)를 피펫팅하여 라운드 웰로 옮겼다. 2500 rpm으로 2분간 원심 분리한 뒤 세포 표면 단백질의 염색을 위해서는, 배지를 제거한 뒤 1 웰 기준 PBS 50 ㎕ 및 항체를 혼합하여 피펫팅하였다. 플레이트를 호일로 싸고 4도씨에서 30분간 배양하였다. 이후 PBS를 각 웰당 150 ㎕씩 더 채워주고 2500 rpm에서 2분간 원심 분리하였다. 세포 내 단백질의 염색을 위해서는 배지를 제거한 뒤 고정/투과 농도 (4x)를 고정/투과 희석액을 이용하여 1x로 희석하고, 1 웰당 80ul씩 풀고 플레이트를 호일로 싸서 4도씨에서 30분간 배양하였다. 이후 10x 투과 버퍼를 DW를 이용하여 1x 투과 버퍼로 희석하고 1 웰당 120 ㎕씩 넣고 2500 rpm으로 2분간 원심 분리하였다. 이후 1 웰당 1x 투과 버퍼 50 ㎕와 항체를 혼합하여 피펫팅하였다. 플레이트를 호일로 싸고 4도씨에서 30분간 배양하였다. 1x 투과 버퍼를 150 ㎕씩 추가로 넣고 2500rpm으로 2분간 원심 분리하였다. PBS 200 ㎕씩 넣고 풀어준 이후 2500 rpm으로 2분간 원심 분리하여 세척하였다. 또, PBS 200 ㎕씩 넣고 풀어준 이후 FACS 분석을 진행하였다.
[3-3] 결과
그 결과, 도 4a 내지 도 4b에서 보는 바와 같이, Foxp3의 발현이 높은 쥐의 iTreg 세포에서는 TACI의 발현이 늘어난다는 것을 알 수 있으므로 TACI 발현은 Foxp3 발현과 상관관계가 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] C-9 항체가 iTreg 분화과정에서 활성을 억제시키는지 확인
[4-1] iTreg 세포의 분화 프로토콜
여기서, iTreg 세포는 자연적으로 분리한 nTreg 세포와는 달리 하기 조성을 포함하는 배지에서 분화를 인공적으로 유도한 세포를 의미한다. iTreg 세포는 우선, 쥐의 비장으로부터 나이브(naive) T 세포를 분리한 뒤, 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT) 10%를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 영양배지에 하기 표 1의 성분을 각각 더 포함하도록 하여, 37℃ 5% CO2 배양기 내에서 72시간 배양을 통해 iTreg 세포로 분화를 유도하였다.
분화 세포 조성
iTreg IL-2, TGFβ
[4-2] 항체 염색(staining) 실험 프로토콜
상기 [4-1]에서 각 분화시킨 세포(200ul)를 분화한지 1일째 activation marker인 CD69을 염색하여 발현정도 확인하였다. 즉, 상기 [4-1]에서 각 분화시킨 세포(200ul)를 피펫팅하여 라운드 웰로 옮겼다. 2500 rpm으로 2분간 원심 분리한 뒤 세포 표면 단백질의 염색을 위해서는, 배지를 제거한 뒤 1 웰 기준 PBS 50 ㎕ 및 항체를 혼합하여 피펫팅하였다. 플레이트를 호일로 싸고 4도씨에서 30분간 배양하였다. 이후 PBS를 각 웰당 150 ㎕씩 더 채워주고 2500 rpm에서 2분간 원심 분리하였다. 세포 내 단백질의 염색을 위해서는 배지를 제거한 뒤 고정/투과 농도 (4x)를 고정/투과 희석액을 이용하여 1x로 희석하고, 1 웰당 80ul씩 풀고 플레이트를 호일로 싸서 4도씨에서 30분간 배양하였다. 이후 10x 투과 버퍼를 DW를 이용하여 1x 투과 버퍼로 희석하고 1 웰당 120 ㎕씩 넣고 2500 rpm으로 2분간 원심 분리하였다. 이후 1 웰당 1x 투과 버퍼 50 ㎕와 항체를 혼합하여 피펫팅하였다. 플레이트를 호일로 싸고 4도씨에서 30분간 배양하였다. 1x 투과 버퍼를 150 ㎕씩 추가로 넣고 2500rpm으로 2분간 원심 분리하였다. PBS 200 ㎕씩 넣고 풀어준 이후 2500 rpm으로 2분간 원심 분리하여 세척하였다. 또, PBS 200 ㎕씩 넣고 풀어준 이후 FACS 분석을 진행하였다.
[4-3] 결과
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, C-9 (인간 기원의 TACI 단백질의 C-말단에서 매핑되는 아미노산 42-293번째의 항원에 대해 생성된 쥐 항-TACI 단일클론 항체, Santa Cruz [Cat No. sc-365253] 참조) 항체가 투여된 경우 CD69 단백질의 발현이 적음을 알 수 있으므로 C-9 항체는 iTreg 분화 과정에서 그 활성을 억제하여 iTreg 세포로의 분화를 억제한다는 사실을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] C-9 항체가 전사 인자의 발현을 억제하는지 확인
[5-1] CD4 T 세포가 분화되는 과정에서 C-9 처리방법
마우스에서 분리한 CD4+CD62L+Naive CD4 T 세포를 0.2ug의 anti CD3 항체와 1ug 의 C-9 항체가 함께 코팅된 96 웰에 넣은 후, 각 CD4 T cell 서브세트(subset)으로 분화를 하는데 요구되는 사이토카인 혼합물(cytokine mixture)와 0.2ug의 anti CD28 항체를 soluble한 형태로 함께 처리 후 약 3일 동안 분화시켰다. 이후 TH17 세포는 1ng/ml TGF-B과 30ng/ml IL-6을 혼합하였고, Treg 세포는 1ng/ml TGF-B과 20ng/ml IL-2을 혼합하여 실험을 진행하였다.
[5-2] 결과
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, C-9 항체가 투여된 경우 Treg 세포 및 그 기능에 중요한 마커 전사인자인 Foxp3의 발현이 줄어들었음을 알 수 있었다. 반면에, TH17 세포의 마커 전사인자인 RORgt의 발현에는 영향을 주지 않았다. 따라서, C-9 항체는 다른 T 세포 서브세트에는 영향을 주지 않고, 선택적으로 iTreg 분화 과정에서 그 활성을 억제하여 iTreg 세포의 기능을 선택적으로 저해한다는 사실을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] C-9 항체가 Foxp3의 발현을 억제하는지 확인
[6-1] C-9 항체 처리 후 Foxp3의 발현 정도 확인
마우스에서 분리한 CD4+CD62L+Naive CD4 T 세포를 0.2ug의 CD3 항체와 함께 표시된 농도에 따라 C-9 항체 혹은 AL-IgG를 각각 96 웰 플레이트의 웰에 코팅을 시켜준 후, 앞서 [실시예 4]에서 살펴본 Treg 분화 조건에 따라 3일 동안 배양을 진행 한 후 Foxp3 발현 정도를 측정하였다.
[6-2] 결과
그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, C-9 항체가 투여된 경우 Treg 세포에서 Foxp3 단백질의 발현이 적음을 알 수 있으므로 C-9 항체는 iTreg 분화 과정에서 그 활성을 억제하여 iTreg 세포로의 분화를 억제한다는 사실을 역시 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Good T Cells, Inc. <120> Use of TACI protein <130> PDPB204392k01 <150> KR 10-2020-0176159 <151> 2020-12-16 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp 1 5 10 15 Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly Val Ala Met Arg 20 25 30 Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met 35 40 45 Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala 50 55 60 Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp 65 70 75 80 His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His 85 90 95 Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val 100 105 110 Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val Glu Asn 115 120 125 Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg Gly Ser 130 135 140 Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gln Val 145 150 155 160 Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Val Leu Cys 165 170 175 Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro 180 185 190 Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser Pro Ala Lys Ser 195 200 205 Ser Gln Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val Ser Thr Ser Pro 210 215 220 Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro 225 230 235 240 Thr Gln Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr Cys Ala 245 250 255 Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu Gln Pro Cys Pro 260 265 270 His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val Pro Ala Gln Glu 275 280 285 Gly Gly Pro Gly Ala 290 <210> 2 <211> 249 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Met Ala Phe Cys Pro Lys Asp Gln Tyr Trp Asp Ser Ser Arg 1 5 10 15 Lys Ser Cys Val Ser Cys Ala Leu Thr Cys Ser Gln Arg Ser Gln Arg 20 25 30 Thr Cys Thr Asp Phe Cys Lys Phe Ile Asn Cys Arg Lys Glu Gln Gly 35 40 45 Arg Tyr Tyr Asp His Leu Leu Gly Ala Cys Val Ser Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Cys Thr Gln His Pro Gln Gln Cys Ala His Phe Cys Glu Lys Arg Pro 65 70 75 80 Arg Ser Gln Ala Asn Leu Gln Pro Glu Leu Gly Arg Pro Gln Ala Gly 85 90 95 Glu Val Glu Val Arg Ser Asp Asn Ser Gly Arg His Gln Gly Ser Glu 100 105 110 His Gly Pro Gly Leu Arg Leu Ser Ser Asp Gln Leu Thr Leu Tyr Cys 115 120 125 Thr Leu Gly Val Cys Leu Cys Ala Ile Phe Cys Cys Phe Leu Val Ala 130 135 140 Leu Ala Ser Phe Leu Arg Arg Arg Gly Glu Pro Leu Pro Ser Gln Pro 145 150 155 160 Ala Gly Pro Arg Gly Ser Gln Ala Asn Ser Pro His Ala His Arg Pro 165 170 175 Val Thr Glu Ala Cys Asp Glu Val Thr Ala Ser Pro Gln Pro Val Glu 180 185 190 Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Arg Ser Ser Pro Thr Gln Glu Ser 195 200 205 Ala Pro Arg Ser Leu Gly Ile His Gly Phe Ala Gly Thr Ala Ala Pro 210 215 220 Gln Pro Cys Met Arg Ala Thr Val Gly Gly Leu Gly Val Leu Arg Ala 225 230 235 240 Ser Thr Gly Asp Ala Arg Pro Ala Thr 245

Claims (32)

  1. TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편을 유효 성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체는 인간 또는 마우스 유래 항체인 것인, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포에 존재하는 것인, 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 약학조성물은 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장에서 선택된 경로를 통해 체내 주입되는, 약학 조성물.
  6. TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효 성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체는 인간 또는 마우스 유래 항체인 것인, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포에 존재하는 것인, 약학 조성물.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 약학 조성물.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 약학조성물은 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장에서 선택된 경로를 통해 체내 주입되는, 약학 조성물.
  11. TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암의 진단용 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 TACI 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
  14. 제 11 내지 제 13항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암의 진단용 키트.
  15. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함하는, 정보 제공 방법.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 측정 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 정보 제공 방법.
  18. 제 15항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의해 수행되는, 정보 제공 방법.
  19. 제 15항에 있어서,
    상기 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 감소된 경우, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는, 정보 제공 방법.
  20. 분리된 생물학적 시료에서 TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    상기 생물학적 시료에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및
    상기 피검 물질의 접촉 후 상기 생물학적 시료에서 상기 TACI 단백질 또는 이의 단편; 또는 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환 또는 암을 치료하기 위한 약물을 스크리닝하는 방법.
  21. TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체는 인간 또는 마우스 유래 항체인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  23. 제 21항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포에 존재하는 것인, 약학 조성물.
  24. 제 21항에 있어서,
    상기 암은 고형암인, 약학 조성물.
  25. 제 21항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암인, 약학 조성물.
  26. 제 21항에 있어서,
    상기 약학조성물은 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장에서 선택된 경로를 통해 체내 주입되는, 약학 조성물.
  27. TACI(Transmembrane activator and CAML interactor) 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체는 인간 또는 마우스 유래 항체인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  29. 제 27항에 있어서,
    상기 TACI 단백질 또는 이의 단편은 조절 T 세포에 존재하는 것인, 약학 조성물.
  30. 제 27항에 있어서,
    상기 암은 고형암인, 약학 조성물.
  31. 제 27항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암인, 약학 조성물.
  32. 제 27항에 있어서,
    상기 약학조성물은 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장에서 선택된 경로를 통해 체내 주입되는, 약학 조성물.
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