TWI343923B - Recombinant antibodies and fragments which recognize n glycolil gm3 ganglioside and its use in diagnosis and treatment of tumors - Google Patents
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Description
1343923 Ο) 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於免疫學之領域以及尤其是使用遺傳工程 學技術得到免疫性較小的免疫球蛋白用以治療癌症。本發 明特別是相關於編撰源自辨識內含N-羧乙醯GM3神經節 苷脂以及無神經節苷脂抗原（例如無N-羧乙醯或N·乙醯基 、以及無硫酸鹽醣之脂類）之單株抗體或片段的肽序列。 【先前技術】 神經節苷脂是含有唾液酸之鞘糖脂，以及存在於脊椎 動物細胞膜（Stults CL M et. al，Methods Enzymology 179 :16*7-2 I4，1 98 9)。據文獻報導，某些此類分子爲腫瘤相 關的抗原或腫瘤標識（Hakamori SH : Curr Opin Immuno] 3 :646- 6 5 3, 1 99 1)，且已有文獻描述使用抗神經節苷脂抗 體診斷及治療癌症。（Hougton AN et. al，NAS’USA 82 : 1 242 - 1 24 6，1 9 8 5; Zhang S et a 1. Int J Cancer 73 : 42-49, 1 99 7).哺乳動物的細胞中最常見的唾液酸是 N-乙醯基 (NAc)以及 N-羧乙醯（NGc) (Cor field AP et. al: Cel I Biol Monogr 10: 5-50, ]982)。一般而言NGc並未表現於人類 以及雞的正常組織，但確廣汎的分佈於其它脊椎動物 (Leeden R W et. a 1, Biological Role of Sialic
Acid.Rosemberg A and Shengtrund CL (Eds).Plenum Press, New York, 1-48. 1976. Kawai T et. al, Cancer Research 51 :]242-] 24 6, 2 00])。然而有文獻報告顯示，抗-NGc抗體 -5- (2) (2)1343923 可辨識某些人類腫瘤以及腫瘤的細胞株（Higashi H et. al, Jpn J. Cancer Res.79 : 9 5 2-95 6, 1 98 8, Fukui Y et. a 1,
Biochem Biophys Res Commun 160 : 1 1 4 9 -1 1 5 4, 1989)。 在人類乳癌中已發現GM3 (NGc)神經節苷脂之含量增加 (Marquina G et. al, Cancer Research 56 ： 5165-5171, ]9 96)，因此使用此分子作爲癌症治療之目標頗具吸引力 〇 申請之專利EP 0972 782 A1，描述以融合瘤（依據布達 佩斯條約寄存，寄存號碼E C A C C 9 8 1 0 1 9 0 1 )製作之鼠科動 物單株抗體。此單株抗體是IgG 1同功型以及係使用 NGcGM3神經節苷脂疏水性共軛結合的低密度脂蛋白 (VLDL)以及在Freund佐劑存在下免疫接種Balb/c小鼠加 以產生，該抗體可優先的結合至人類乳房以及黑素瘤腫瘤 中表現的抗原 NGcGM3神經節苷脂。_(Carr A et. a】， H ybridoma 19 : 3 : 24卜247，2000).此抗體對帶有該序列 性質之細胞顯示強烈的細胞水解活性，因此可作爲治療的 工具。 此外目前已知腫瘤誘發的新血管形成是控制腫瘤生長 的一個重要參數。因此目前硏究朝向探索相關於抑制抗原 性加工的新穎治療武器。實驗證據指出1 4F7抗體對此加 工具有相關之效應。該證據來自基質凝膠分析 (Angiogenesis. Vol. 4, Pags.H3-121; 2001; Anti-Cancer Res.Vol.]8, Pags.7 8 3 - 790，】99 8 )。基質凝膠是基底膜蛋白 質以及圍繞內皮細胞之細胞外基質混合物。於新血管形成 -6- (3) (3)1343923 過程中’發展新血管須要生理上重要的內皮細胞與基質間 之相互作用。同樣地，該凝膠成份（例如海帶氨酸）是血管 形成過程中重要的指標。 此模型亦已用於硏究相關腫瘤誘發的血管生成作用的 機制’用以評估能調控與腫瘤直接相關進而影響其生長以 及轉移之藥物。使用非人類單株抗體，例如鼠科動物 1 4 F7 ’在治療人類尤其是在重複治療的療程上有某些缺點 。例如鼠科動物單株抗體在血液中半衰期很短。此外彼喪 失重要的免疫的性質，例如用於人類時會喪失效應子功能 〇 更重要的是，鼠科動物單株抗體含有相當重要的胺基 酸序列，注射入人類後具有免疫性。許多的硏究顯示投用 外來的抗體之後，病人之免疫反應可強烈的以及實質上去 除起始治療抗體之治療效果。此外，即使投用鼠科動物單 株抗體治療病人之後，再投用不相關的鼠科動物抗體作後 續的治療，可能會不起作用以及甚至會因誘發習知的 HAMA 反應而引起危險（Khazae]is M.B., et. al，.丨 ourna] of Immunotherapy 1 5:42* 52, 1 994) 〇
Maieo et_ a丨（美國專利第US 5 712 120號）描述一種 降低鼠科動物抗體免疫性的步驟。修飾抗體之方法描述於 Mateo et.al (Mateo C et. al, Hybridoma 19:6:463-471. 2 0 00)，其係保留原本的抗體對抗原之辨識以及結合容量 ，降低免疫性，以增加抗體的治療用途。由此步驟得到一 個，相較於嵌合抗體，具體少數量之突變，顯示降低免疫 (4) (4)1343923 性之經修飾抗體。 從上述方法得到之治療抗體版本，係以簡單經濟的方 法得到免疫性較小，適於人類使用的治療抗體。 據知抗體片段可用於疾病之免疫診斷。其中Ira Pastan (歐洲專利第EP 0796334 AI號）描述使用抗體變異 區構築可專一性的辨識路易士 Y抗原相關的醣類之F v型 單鏈片段。以該片段爲基礎，本作者發展出一種偵測帶有 該抗原的細胞之方法，亦提供此類片段對帶有抗原之細胞 具有抑制效應之證據。 由於此抗原對各種疾病具有免疫療之潛力，因此在實 用及理論的觀點上，1 4 F 7單株抗體結合部位之知識曰益 重要。S 〇 u r i a u , C e t. a 1 i η E X p e r t Ο p i η · Biol. Ther. 1, 8 4 5 - 8 5 5，2 00】以及 Chester，K. A·，et. al in Dis. Markers. ]6，53-62, 2000’顯示使用scFv型抗體片段，利用其藥 理性質的優點（例如可較佳的穿透腫瘤組織）可產生良好的 治療結果。 經由構築抗體片段微基因庫，將融合瘤曝露於絲狀噬 菌體，可選擇能專一性辨識基因庫抗原之分子。本發明的 目標是快速地得到具體原本抗體的辨識能力且分子較小以 及可經細菌寄主製作之抗體片段。經習見的選殖技藝，分 離以及操作融合瘤之變異區基因（Roovers, R. C. et. al， Br. J. Cancer. 78: 1407-1416,】99 8)，可得到在細菌中無 功能或不可能製作之抗體片段多重變異體。 絲狀噬菌體之抗體片段技藝提供獨一無二的機會接近 -8- (5) (5)1343923 抗體之結合位點，以及修飾改進抗體親和性（ChameS，Ρ· et. al, J. Immunol. 161，5 4 2 1 -5 429, 1998, Lamminmaki, U et. a), J. Mol. Biol. 2 91, 5 89 -602, 1 999, P a r h a m i - S e r e n et. al, J. Immunol. Methods. 259，43-53, 2002)或調控抗體 專一性（Iba, Y. et. al, Prot. Engn·，Η, 361-370,1998, Miyazaki, C. et. al, Prot. Engn.】2, 407-415， 】 999, Darveau, R. P. et. a], J. Clin. Immunoassay. 1 5, 2 5 -29, 1992) 〇 於絲狀噬菌體中表現抗體片段可進行鏈之交換 (Lantto, J. et. a 1, Methods Mol. Biol. 1 7 8, 3 03 -3 1 6, 2002) ，組合不同之VL與原本的抗體VH或反之亦然，因此可 硏究各鏈在抗原辨識中伴演之功能以及對抗體親和力之影 響（Kabat，E. A.，Wu，T. 丁·，J. Immunoi. ]47, 1709-1719, 1991, Barbas III, C . F ., Lerner, R. A . M e t h od s : A companion to Methods in Enzymology 2，1 19-124,1991) ° 鏈之交換可改變結合部位之性質以及亦可合倂不同種之免 疫球蛋白序列以選擇專一性辨識之變異體（Klimka，A. et. a], Br. J. Cancer. 83, 2 52-260, 2 000. Steinberger, P. e t. al, J. Bio). Chem. 275,36073-36078, 2000, Rader, C. et. al, Proc. Nat]. Acad. Sci. USA. 9 5,89 1 0-8 9 1 5, 1 998,
Beiboer: S. W. H et. al. J. Mol. Biol. 2 96,83 3 - 849, 2000) 【發明內容】 -9- (6) (6)1343923 本發明是源自鼠科動物1 4F7單株抗體經修飾之抗體 ’該抗體具有與原本抗原相同之確認親和性以及投用至病 患後具體較小之免疫性。本發明另一發現是得到源自該抗 體之片段，其係包含不同於原本的輕鏈變異區但仍保持其 專一性、親和性、辨識之性質，以及爲可經細菌宿主表現 的可溶解分子並呈現在絲狀噬菌體之表面。源自】4 F7抗 體之片段可作爲治療的武器。此外，於Μ 1 3絲狀噬菌體 之表面表現I4F7抗體scFv型片段可操作結合部位，以及 得到具有治療功能的較高親和性變異體。 本發明目標之一是鑑定14F7抗體中保持其專一性、 親和性及辨識性質之局部序列片段。 經修飾之抗體以及得到之專一性辨識腫瘤細胞表現之 NGcGM3抗原的片段可用於診斷或治療該腫瘤以及具有免 疫性較原本鼠科動物抗體小的優點。 本發明之目標是使用包含經修飾之14F7抗體或其Fv 單鏈片段之新治療的組成成分，其中該抗體或片段可結合 放射性同位素，以定位或治療表現抗原之腫瘤。 本發明之目標亦是使用包含經修飾之I 4 F 7抗體或其 片段結合放射性同位素之藥學組成物，放射免疫診斷或放 射免疫治療表現NGcGM3神經節苷脂之腫瘤。 發明之詳細描述 本發明描述融合瘤（編號ECACC 9 8 1 0 1 9 0 1 )製作之嵌 合抗體，其係源自鼠科動物14F7單株抗體，其特徵在於 -10- (7) (7)1343923 具有下列重及輕鏈過變區域（CD RS)之序列： 重鏈
S Y WIH
YIDPATAYTESNQKFKD ESPRLRRGI YY YAMD Y 輕鏈
RASQSISNNLH YASQSIS QQSNR WPLT 較佳之該嵌合抗體，其特徵在於具有下列重及 架區（FRs)之序列： 重鏈
QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFT
WLKQRPDQGLEWIG
KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR
WGQGTTVTVSS 輕鏈
FRI : DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSC WYQQRTHESPRLLIK -11 - (8) (8)1343923
G1PSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFC
FGAGTKLELKRA 此外該嵌合抗體之特徵在於內含人類重鏈IgG丨恒定 區以及人類輕鏈C k恒定區。 較佳的實例中’本發明爲融合瘤（編號ECACC 98】0】90】）製作之經修飾抗體，其係源自鼠科動物的]4F7 單株抗體’其特徵在於重及輕鏈支架區域因含有任何下列 之突變： 重鏈：
位置 5 : Q替代成V 位置 9 : N替代成A 位置]】：L替代成V 位置 12 : A替代成V 位置 1 8 : Μ替代成V 位置 1 9 : Κ替代成R 位置20: μ替代成V 位置 3 S : κ替代成R 位置 40: R替代成a 位置 42: D替代成G 位置 4 8 : I替代成V 輕鏈：
位置 3 9 : R替代成K -12- (9) 1343923
位置 4 Ο : T替代成P 位置 4 1 : Η替代成G 位置 42 : E替代成Q 位置 5 8 : I替代成V 較佳者該經修飾之抗體其內含人類遷 以及人類輕鏈Ck恒定區。本發明另一 ！{ 抗體之 Fv單鏈型片段，其係包含得 ECACC 98101901)之重鏈變異區序列，而 辨識專一性。 較佳者，該Fv片段包含源自非免疫 鏈變異區，與融合瘤製作之輕鏈變異區不 宿主生產，爲絲狀噬菌體或可溶解的分子 本發明亦相關於表現嵌合的以及人類 株以及產生源自】4F7片段之細菌菌落》 此外本發明係關於治療及/或定位與 以及黑素瘤腫瘤，其腫瘤移轉以及復發之 內含一種本發明之重組單株抗體或其片段 劑。該ί几體或片段可結合放射性同位素戶 療惡性腫瘤β 最後’本發明係關於使用描述的重組 成物’用於治療及/或定位與鑑定惡性腫瘤 本發明之執行方法以及其用途將詳細: :鏈I g G】恒定區 寺色是源自14F7 自融合瘤（編號 且保留]4 F 7之 的小鼠或人類輕 同，彼可經細菌 呈現之抗體片段 化的抗體之細胞 鑑定惡性的乳房 藥學組成物，其 以及適當的賦形 弓於定位及/或治 抗體製造藥學組 〇 苗述於下： -13- (10) (10)1343923 ]· 合成ADNc及以PCR放大14F7鼠科動物抗體變異區 以G Μ 3 (N e u G c)神經節苷脂疏水性的共軛結合低密度 脂蛋白以及在Freund佐劑存在下免疫Balb/c小鼠，得到 鼠科動物 14F7 抗體（EP 09 72782 Al, Carr A et. al， Hybridoma ] 9 : 3 ·· 2 4 1 - 2 4 7，2 0 0 0 )。自 l〇6 個產生確認 N G c G Μ 3神經節苷脂的1 4 F 7單株抗體（鼠科動物i g G ! Mab)之融合瘤細胞中，使用TRIZ0L萃取方法依據製造者 之說明得到 RNA (GIBCO BRL, NY)。 使用試劑組套：Access RT-PCR (Pr〇mega，USA)依據 製造者之建議’合成互補DNA (DNAc)以及放大VH以及 VL變異區。簡言之，以5微克之RNA在25微微莫耳與 RNA聚腺苷酸尾部雜交之dT寡核苷酸或各變異區·· VH 以及VL終端對應的寡核苷酸存在下進行反應。在6〇ι下 反應]〇分鐘以及之後加入內含〇·2毫莫耳濃度之各去氧 核酸（dNTPs)、1毫莫耳濃度MgS〇4、5單位之aMv_反轉 錄酶以及5單位之DNA聚合酶，反應緩衝液混合物總體 積爲50微升。樣品在48t下反應45分鐘，在“艺下反 應2分鐘’之後進行4〇週期之pcR:溫度94t(3〇秒）、 6〇°C (】分鐘）、68°C (2分鐘），以及最終在68t下反應7 分鐘。 2·構築嵌合基因以及將放大的DNAc定序。將pcR之 以及VK產物水解，以限制酶Ec〇RV_ Nhe】水解， -14 - (11) (11)1343923 以 EcoRV-Sa丨I水解 νκ，以及分別地選殖入表現載體 (Coloma MJ et. a 1, J Immunol Methods 1 52:8 9- 1 04, 1 992) 。VH區域係選殖入PAH4604載體，其係包括人類IgGI 恒定區以及抗L·組織胺醇之選擇標記基因。VK區域係選 殖入載體PAG4622，其係帶有抗麥考酚酸基因以及人類κ 區域的恒定區。產生的基因構築體分別稱爲]4F7VH-ΡΑΗ4604 以及 14F7VK-PAG4622。 此二構築體係使用序列反應劑組套 Τ7 DNA聚合酶 (Amershan-Pharmacia)，依據製造者描述的步驟流程，經 二去氧核酸方法定序（Sanger F et. al，PN AS USA 74:5463-54 70, 1 979)- .3 . 表現嵌合抗體。 以Pvul酵素線性化的1 0微克之14F7VH-PAH4604以 及】〇微克之14F7VK-PAG4622電穿透NSO細胞。以乙醇 沈澱DNA，混合以及溶於50微升之PBS (磷酸緩衝鹽水） 。將大約〗〇7細胞生長至半滿並離心收集。隨後將細胞共 同與DNA再懸浮於0.5毫升PBS之電穿孔盤。冰浴1〇分 鐘之後，對細胞施周2 00 V以及96 0 F之脈衝，以及置於 冰浴中1 〇分鐘。將細胞培養於96孔平板，含經修飾之 Dulbecco (DMEM-F12)選擇細胞培養液、10%胎牛血淸 (FCS)以及]0毫莫耳濃度之L-組織胺醇。於加入選擇培 養液】〇天之後可看見轉染菌落。 以酵素聯結免疫抗體檢測法測定菌落上淸液中產生之 -15- (12) 1343923
嵌合型免疫球蛋白。在4°C下’將聚苯乙烯板（HUh binding, Costar)塗覆山羊抗人類IgG抗血淸之100毫莫耳 濃度碳酸鹽-重碳酸鹽緩衝液（PH 9.8)過夜。然後用PBS-Tween (磷酸鹽緩衝鹽水，0.5% Twee η- 20’ pH 7.5)淸洗平 板，以及加入PBS-Tween-FCS稀釋之培養上淸液樣品’ 以及在37°C下反應一小時。平板再次用PBS-Tween淸洗 以及在37 °C下與共軛結合過氧化酶的山羊抗人類κ鏈抗 血淸（J a c k s ο η )反應一小時。之後平板用相同方式淸洗以及 與含有受質：〇-分尼林（fe nil en)二胺之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩 衝溶液（pH 4.2)反應。15分鐘之後在492毫微米下測量吸 光。 以競爭酵素聯結免疫抗體檢測法，使用NG.CGM3以 及NacGM3神經節苷脂証實嵌合抗體辨識抗原之容量。簡 言之，將聚苯乙烯平板（Polysorp, Nunc)塗覆上50微升內 含4微克/毫升之NGcGM3或NAcGM3的甲醇溶液，及在 3 7 °C下反應一小時。然後平板在3 7 °C下用2 0 0微升之】％ 牛血淸白蛋白（BSA)Tris·HCl緩衝溶液（pH7.8-8.0)阻塞一 小時。P B S淸洗3次之後，加入稀釋於T r i s - H CI - B S A之 ]%樣品’濃度範圍介於2微克/毫升至0.0 ]微克/毫升之 間，在37°C、生物素化之鼠科動物】4F7抗體I毫克/毫 升存在下反應2小時。之後平板用PBS淸洗以及用抗生 蛋白鏈菌素-過氧化酶結合物（.丨a c k s ο η )，在3 7 °C下反應1 小時。於4 9 2毫微米下測量吸光率。 -16- (13) (13)1343923
4. 以人源化之T抗原決定部位構築人類化的Ab ] 4F7hT ο 預測Τ抗原決定部位。 以 AMPHI Program (Margalit H et. al, J Immunol 1 3 8 :2 2 1 3 - 2 2 2 9，1 9 8 7)分析1 4 F 7可變結構區的序列，辨別 具有相關於T細胞免疫性之兩性螺旋構造的7或Π個氨 基酸之片段。此類演算法可預測鼠科動物1 4F7單株抗體 之重鏈以及輕鏈變異區中與Τ抗原決定部位呈現相關的片 段。 - 分析人類免疫球蛋白之同源性。 比較14F7可變結構區的胺基酸序列與人類免疫球蛋 白變異區序列，以確認與分析之鼠科動物分子具有最高同 源性之人類免疫球蛋白。可使用網際網路提供的 SWISSPROT 資料庫，經由 BLAST 程式（Altschul S F et. al，Nucleic Acids Res 25:3389-3402,】997)進行分析。 - 分析免疫性之降低。 本方法之精華是破壞或人源化可能的T抗原決定部位 以降低免疫性，在FR上作最小量之突變，特別地是在具 有兩性分子的螺旋構造之片段上去除與抗原辨識三維結構 有關聯的的位置。 依據此方法比較鼠科動物與最高同源性之人類免疫球 蛋白變異區VH以及VL序列，以及確認FR區域之內兩 -17 - (14) (14)1343923 性分子的區域中鼠科動物以及人類序列間不同之殘基 (Kabat E, Sequences o f proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health, 1 99 1 )。在人類序列相同位置之”鼠科動物"殘基將是進行 突變之對象。 存在於FR位置經典構造之殘基、存在於Vernier區 域或參與 VH-VL相之相互作用區域則不可突變，因爲會 影響抗體可變結構區之三維結構，因而影響抗原結合。變 異區分子模式化可得到影響上述三級結構之取代更多的信 息。 由於分析突變元件，例如兩性分子的螺旋中存在之脯 胺酸殘基或事實上不出現在大多數同源的人類序列相同位 置之某些鼠科動物殘基但在其它人類免疫球蛋白上常見之 殘基，可能取得含有最大突變之版本，即將不同於人類序 列之所有鼠科動物殘基突變’亦可得到不同突變組合之其 它版本。 在鼠科動物MF7序列上進行確認之後，可能的τ抗 原決定部位以及經確認之不同於人類之此類片段殘基，可 用習見的定向誘變技藝進行取代。 - 於N SO細胞中選殖以及表現人類化的】4F7hT抗體 —旦以上述方法得到對應至1 4 F 7 h T抗體V Η以及V L 區域之基因構築體’分別地將其選殖入與上述嵌合抗體同 樣地表現載體’可得到下列之基因構築體：】4 f 7 h Τ V Κ_ -18- (15) (15)1343923 PAG4622以及14F7hTVH-PAH4604。在與轉染嵌合抗體之 相同條件下將此類基因轉染進入N S 0細胞。以酵素聯結 免疫抗體檢測法偵測菌落產生之人源化抗體。 以競爭酵素聯結免疫抗體檢測法，使用NGcGM3以 及NacGM3神經節苷脂証實人源化抗體專一性辨識抗原之 容量。此步驟與描述於嵌合抗體之步驟相同。 從！#7融合瘤中以絲狀噬菌體構築抗體片段基因庫。 從〗4F7融合瘤細胞中分離傳訊RNA，合成互補DNA 以及分別使用與大範圍鼠科動物變異區雜合之兩組寡核苷 酸，放大對應的重及輕鏈變異區序列。純化各放大的重鏈 變異區’以適當的酵素水解以及聯結至事先用相同酵素水 解之噬菌粒p H G - 1 m載體（於絲狀噬菌體之表面呈現單鏈 抗體）。純化結合反應產物以及由電穿孔法引入大腸桿菌 TG 1株系。轉形的細菌由有限之重鏈變異區半基因庫構成 (均源自MF7融合瘤）。純化對應至半基因庫的〇ΝΑ以及 分別地聯結至（之前純化以及以適當的酵素水解的）輕鏈變 異區。最後將基因的構築體用電穿孔法引入細菌之TG1 菌株’ 一致化不同型態之非依存的基因庫。有限的微基因 庫之一亦是構築自〗4F7融合瘤細胞之輕鏈變異區。得自 融合瘤重鏈變異區之鏈交換基因庫亦可合倂各種得自鼠科 動物以及人類淋巴細胞的輕鏈變異區。 分離以及鑑定對抗N-羧乙醯GM3之產生抗體片段的菌落 -19- (16) (16)1343923 從基因庫中隨機挑選菌落，使用輔助噬菌體Ml 3 KO 7 產生噬菌體》直接的用固相免疫酵素測驗，分析帶有抗體 片段之噬菌體對Ν-羧乙醯GM3之辨識。定位產生功能片 段的菌落。從各基因庫轉形細菌的混合物中，取得帶有抗 體片段之噬菌體，以及探索基因庫之多樣性。將得到噬菌 體混合物與結合至固忘表面之抗原N-glicolil GM3接觸， 帶有結合容量抗體片段之噬菌體會保持在固態表面以及其 餘的會經洗滌消除。結合的噬菌體經變化pH値加以溶析 以及放大，取得新噬菌體混合物，其可作爲重新選擇抗原 之起始材料。各種選擇週期之後，分析菌落喔菌體呈現之 抗體片段的辨識能力。因此確認稀釋於起始基因庫中額外 的產生功能片段的菌落。 鑑定菌落產生的抗體片段，包括以酵素聯結免疫抗 檢測法分析彼對一組相關的神經節苷脂之專—彳生，& % & 組織化學硏究腫瘤辨識性，評估呈現於噬菌體# &胃# g 產生可溶解功能的容量以及將其變異區完全的。 【實施方式】 實施例： 下列實施例中所有使用之限制酶或修飾作用_ f式齊U & 及材料（除非另行說明）係購自商品來源。 實施例]。得到]4F7嵌合型單株抗體。 -20- (17) (17)1343923 合成DNAc以及以Vent聚合酵素使用具有限制位點 Eco RV-Nhe I(VH)以及 Eco RV-Sa] I(VK)之專一性寡核苷 酸經P C R放大鼠科動物變異區V Η以及V K。轉換寡核苷 酸表列如下： VH : 寡核苷酸1(雜交於信號肽）： 5' ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg ate ttl etc ttc ctg 3, 寡核苷酸2 (雜交於JH]): 5' ggg getage tga gga gac ggt gac cgt ggt 3, VK : 寡核苷酸〗（雜交於信號肽）： 5, ggg gatatc cacc atg gt(at) t(tc)c (ta)ca cct cag (at)t(ac) ett gga ett 3' 寡核苷酸2 (雜交於VLJ5): 5' age gtegae lia cgt ttc age tec age ttg gtc cc 3' 將PCR之 VH以及VK產物用限制酶Eco RV-Nhe 1(VH)，以及Eco RV-Sal I(VK)水解，以及分別選殖入表 現載體PAH4 6 04以及PAG4 62 2 (分別爲VH以及VK)。此 類載體（來自 Sherie Morrison (UCLA, California, USA))可 在哺乳動物的細胞中表現免疫球蛋白。載體P A Η 4 6 0 4具 -21 - (18) (18)Ϊ343923 人類I g G 1恒定區以及p a g 4 6 2 2、人類κ區域的恒定區 (Coloma J et. a 1, J Immunol Methods 152:89-104, 1992)。 —旦】4F7之VH以及VK區域已選殖入前述的載體後可 形成構築體 14F7VH-PAH4604 以及 14F7VK-PAG4622。 以—脫氧核酸方法（Sanger F et at, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS USA 1979;74:5463-5470)使用 T7 DNA 聚合酶定序組套 (Amershan-Pharmacia) ’依據描述於製造者的步驟流程定 序十二個不同的菌落。依據 Kabat分類（Kabat E, Sequences of proteins of inmunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health，1991)，VH 以及 VK 序列分別與ΠΒ以及V亞類高度相關（圖1 a以及B)。 以Pvul酵素線性化的1〇微克之14F7VH-PAH4604以 及10微克之14F7VK-PAG4622電穿透NSO細胞。用乙醇 沈澱DNA，混合以及溶於50微升之PBS。離心收集生長 到半滿之大約1 〇7細胞以及於電穿孔盤中與DN A共同再 懸浮於0.5毫升PBS。冰浴1 0分鐘之後，對細胞施用200 V以及960 F之脈衝，以及置於冰浴中I 〇分鐘。將細胞 培養於96孔平板，含經修飾之Dulbecco (DMEM-F12)選 擇細胞培養液、]〇%胎牛血淸（FCS)以及】0毫莫耳濃度之 L·組織胺醇。加入選擇培養液1 0天之後可看見轉染菌落 。以酵素聯結免疫抗體檢測法，從菌落上淸液中測定嵌合 型免疫球蛋白之產生。在4°C下，將聚苯乙烯板（High binding，Costar)塗覆山羊抗人類IgG抗血淸（Sigma)之〗00 -22- (19) (19)1343923 毫莫耳濃度碳酸鹽-重碳酸鹽緩衝液（pH 9.8)過夜。然後用 PBS-Tween (磷酸鹽緩衝鹽水，〇·5% Tween-20，pH 7.5)淸 洗平板’以及加入PBS-Tween-FCS稀釋之培養上淸液樣 品以及在37°C下反應一小時。平板再次用 PBS-Tween淸 洗以及在37°C下與共軛結合過氧化酶的山羊抗人類κ鏈 抗血淸（Jackson)反應一小時。之後平板用相同方式淸洗以 及與含有受質：〇-分尼林（fenilen)二胺之檸檬酸鹽-磷酸鹽 緩衝溶液（pH 4 · 2 )反應。1 5分鐘之後在4 92毫微米下測量 吸光。 實施例2。14F7Q抗體對抗NGcGM3以及NACGM3抗體之 反應性。 以競爭酵素聯結免疫抗體檢測法測定】4 F 7嵌合抗體 (Ab)之反應性。圖2顯示相較於鼠科動物14F7，嵌合型 I4F7辨識塗覆 GM3 N-羧乙醯化神經節苷脂聚酯平板 (Pol ysorp，Nunc)之專一性。經鼠科動物生物素化之 ]4 F 7 A b偵測顯示，此二A b有相似的5 0 %抑制辨識抗原 之濃度。當平板塗敷GM3之N-乙醯化變異體時，觀察到 此二抗體均無免疫反應性。使用鼠科動物C5 Mab作爲控 制組不相關的A b。 實施例3。得到不同版本之人源化抗體。 以1 4F7 VH以及VK序列比對人類序列資料庫得到 MF7抗體VH以及VK區域最同源的人類序列（圖]A以及 -23- (20) (20)1343923 B)。此外測定兩性分子的區域或可能的T抗原決定部位之 序列。人源化Τ抗原決定部位之後，測定須要突變轉換算 成人類序列之鼠科動物v Η以及V Κ序列。以下爲進行之 最大可能突變。 當 VH 區域於位置 5、9、1]' ]2、18' 19、20、38、 40、42以及48引入突變，氨基酸Q、Ν' L、A、Μ' Κ、 M、K、R、D 以及 I 分別被 V、A'V'V、V、R、V'R 、A、G以及 V取代。以重疊P C R產物進行此類突變 (Kamman M et. a I, Nucleic Acids Research 17:5404-5410, 19 89) ’第一 PCR使用寡核苷酸1以及2，以及3以及4 ，以及結果與僅使用寡核苷酸2以及4之另一 PCR重復 。使用之寡核苷酸序列展示於下： 重鏈突變5, 9，1 1以及I 2之寡核苷酸： 寡核昔酸 1 : 5' gtc cag ctt gtg cag tct ggg get gaa gtg gta aaa cct ggg 3’ 寡核苷酸 2 : 5’ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3' 寡核苷酸3 : 5* ccc agg ttt tac cac ttc age ccc aga ctg cac aag ctg gac 3' 寡核音酸 4 : 5’ ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg ate ttt etc ttc ctg 3’ ~旦定序以及確認之前的突變’ DNA之位置】8、] 9 以及20引入的突變，將氨基酸s Μ、Κ、Μ分別地取代成 V、R、V。 以下展示描述該突變之寡核苷酸】以及2、3以及4 。如前述進行PCR產物之重疊。突變重鏈1 8、] 9以及20 -24- (21) (21)Ϊ343923 之寡核苷酸： 寡核苷酸1 : 5' ggg gcc tea gtg agg gtg tee tgc agg 3' 寡核苷酸 2 : 5’ ggg getage tga gga gac ggt gac cgt ggt 3' 寡核昔酸 3 : 5' cct gca gga cac cct cac tga ggc ccc 3' 寡核苷酸 4 : 5’ ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg ate ttt etc ttc ctg 3' 同樣地一旦定序以及確認之前的突變，dna之位置 38、40以及42引入突變R、A、G，分別地取代氨基酸K 、R、D。 以下展示描述該突變之寡核苷酸1及2、以及3及4 。如前述進行PCR產物之重疊。突變重鏈38、40以及42 之寡核苷酸： 寡核音酸 1 : 5' cac tgg tta aga cag gca cct ggc cag ggt ctg 3' 寡核苷酸 2 : 5’ ggg getage tga gga gac ggt gac cgt ggt 3’ 寡核苷酸 3 : 5’ cag acc ctg gcc agg tgc ctg tet taa cca gtg 3’ 寡核音酸 4 : 5’ ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg ate ttt etc ttc ctg 3’ 最後證實先前重要的突變之後，DNA位置48引入突 變將氨基酸I取代成V。 以下展示用於該突變之寡核苷酸1及2、以及3及4 。如前述進行PCR產物之重疊。 里鍵48突變之寡核苷酸： 寡核音酸 1 : 5’ ctg gaa tgg gu gga tac att 3' -25- (22) (22)1343923 寡核甘酸 2 : 5’ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3， 寡核苷酸3 : 5' aat gta tcc aac cca ttc cag 3' 寡核苷酸 4 : 5’ ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg ate ttt etc ttc ctg 3’ 定序證實所有此類突變。得到之基因構築體稱爲 I4F7hTVH。 當VHMF7以及最相似的人類重鏈之間有不同氨基酸 時’不進行此類取代，因爲此類取代包含Vernier區或抗 原辨識重要位置之氨基酸。進行輕鏈位置39、40、41、 4 2以及5 8之突變，分別將R、T ' Η、E、I取代成K、P 、G ' Q，以及V。和重鏈的方法相同引入突變。以下描述 使用之寡核苷酸序列。 突變輕鏈39、40'41、以及42之寡核苷酸： 寡核苷酸 1 : 5' tat caa caa aaa cca ggt cag tet cca agg 3' 寡核若酸 2 : 5’ age gtegae tta cgt ttc age tec age ttg gtc cc 3’ 寡核昔酸 3 -· 5’ cct tgg aga ctg acc tgg ttt ttg ttg ata 3’ 寡核苷酸 4 : 5’ ggg gatatc cacc alg gt(at)t(tc)c(ta)ca cct cag(at)t(ac)ctt gga ett 3’ 證實先前重要的突變之後，DN A位置5 8引入突變將 氨基酸I取代成V。以下展示用於該突變之寡核苷酸1及 2、以及3及4。如前述進行PCR產物之重疊。 輕鏈5 8突變之寡核苷酸： 寡核Η酸 1 : 5· att ic.t ggg gtc. ccc tee agg 3· -26- (23) (23)1343923 寡核苷酸2 ·· 5' age gtegae tta cgt ttc age tee age ttg gtc cc 3' 寡核苷酸 3 : 5' cct gga ggg gac ccc aga aat 3* 寡核苷酸 4 : 5· ggg gatatc cacc atg gt(at)t(tc)c(ta)ca cct cag(at)t(ac) ett gga ett 3’ 進行突變之後證實序列。 得到之基因構築體稱爲]4F7hTVK。 將VK以及VH人類化的區域選殖入載體PA G4 622以 及 PAH4604，分別形成構築體 14F7hTVH-PAH46(M以及 14F7hTVK-PAG4622 »NSO細胞各電穿透入10微克Pvu I 水解線性化之人類化的變異區載體 14F7hTVH-PAH4 604 以及]4F7hTVK-PAG4 622。進行電穿孔方法以及偵測到表 現與嵌合抗體相同的14F7hT人源化抗體之菌落。 實施例 4 : ] 4 F 7 A b在活體內血管生成作用模型中減少腫 瘤生長之效應。 使用黑素瘤B16腫瘤細胞株混合基質凝膠作爲血管生 成作用感應器之活體內血管生成作用模型 在C5 7/BL6雄鼠中腹線皮下植入含基質凝膠之腫瘤 株（B ] 6)，測量誘導腫瘤的血管生成作用。將黑素瘤B ] 6 細胞混合0.5毫升基質凝膠以及64單位/毫升之肝素，單 獨（對照組）或結合其它抗體，爲皮下注射投用至動物腹部 的區域。動物防疫注射十五天之後，犧牲以及從真皮以及 表皮殘餘物萃取凝膠珠以及用肉眼檢查腫瘤。圖3顯示用 ]4 F 7處理的小鼠腫瘤塊激烈的下降。 爲了分辨新血管’蘇木紫/伊紅染色之凝膠以抗 -27- (24) (24)1343923 PECAM Mab (內皮的標記）免疫染色進行組織病理的分析 。圖4A以及B，相較於未處理動物的腫瘤切片，觀察到 ]4F7處理的動物其組織切片之血管數目減少。 實施例 5 :於絲狀噬菌體從1 4F7融合瘤構築抗體片段基 因庫。 以 TriPure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim, Germany)從5.0 x 106 14F7融合瘤分離細胞傳訊RN以及 用 Pro-STAR First Strand RT-PCR 反應組套（Stratagene, US A)合成互補DNA。使用聚合酶連鎖反應以26個週期放 大源自融合瘤之重鏈及輕鏈變異區，其條件爲：5 0秒， 94° C、1分鐘，55° C、】分鐘，72e C。使用所有可能的 退化的寡核苷酸組合（與各種小鼠變異區設計雜交），其係 展示於下表： 用以放大VH及VL之寡核苷酸。寡核苷酸序列退化 的位置以括弧表示。限制位點之序列以劃底線表示。 5' VH ApaLl 5’..· ttc tat tct c a c a gt g c a c a g (gc)ag gt(gt) c a g ct(gt) ac(ag) c a g tc(at) g g a 3’ 5'... Ttc tat tct c a c a gt g c a c a g gc(ag) gt(ct) ca(ag) ctg cag cag ct(ct) ggg gc 3' 5'.. ttc tat t c t c a c a g t g c a cag ga(ag) gtg a a g ct(gt) (gc)t(gc) gag tct gg(ag) gga 3'
3' VH Sfi I -28- i (25) (25)1343923 5'... ga a c c a g t act c c a g a c ctg agg ggc cgc aga gac agt gac cag agt ccc 3 ' 5'... ga a c c agt act c c a ggc ctg agg ggc cga gga gac ggt gac tga ggt tcc 3' 5·... ga acc agt act cca gqc ctg aqg qgc cga gga gac (gt)gt ga(gc) (ca) gt gga (gc)cc...3,
5' VL Sal I 5'...g t a etc cap teg a c g a c a ttg tg(ca) tg(at) t( a c)c agt etc
«> I
C . . . J 5'…g t a etc c a q teg a c g a t a tec aga tga c(a c)c a(ga) a ct(ac) c .. . 3’ 5’... gt a etc c a g t c q ac(cg) a a a ttg t (t g) c tea ccc agt etc 勹 1
C . . . J
3' VL Not I 5'... aag ga a a a a aq c qqc cqc ttt (tc)a(tg) (tc)tc cag ett ggt... 3’ 5 '... a a g gaa aa a a q c qgc cqc ttt (tg)a(tg) etc c a a ett gt(gt)... 3' 純化放大的重鏈變異區以及依序地以限制酶S fil以 及A p a LI水解。純化水解產物以及聯結p h a g 〇 m i d i u m載體 pHG-lm 之 DNA(Heber Biotec S.A., Cuba)(圖 5)。產生的 基因構築體以電穿孔法轉形入TG ]大腸桿菌菌株。轉形 的細菌與源自1 4 F 7融合瘤一致的重鏈變異區半基因庫含 -29- (26) (26)1343923 有2‘3 x ]0個成員。純化半基因庫之質體dna以及依序 地以Notl以及Sail酵素水解。此DN A分別與相同酵素 預先水解之輕鏈變異區聯結。此類新基因的構築體轉形的 T G 1菌株得到四個獨立的基因庫。其中一個有限的多樣性 微基因庫，內含1 _6 X 1〇6個源自14F7融合瘤重鏈及輕鏈 可變區域。倂入各種小鼠（κ同功型）以及人類（κ以及λ同 功型）$坐鏈變異區得到之其他三個鏈交換基因庫，分別有 l.Ox ΙΟ7' 1·4χ 106、以及 ι·2χ 1〇6 個成員。 實施例6 :分離對抗Ν -羧乙醯G Μ 3之產生抗體片段的 菌落。 從各基因庫隨機挑選92個菌落於微平板孔洞中依據 之前描述之方法產生攜帶抗體片段之噬菌體（Marks，J. D. et. al，J· Mol· Biol· 222,581-597. 1991)。以酵素聯結免疫 抗體檢測法於塗覆1微克/微升N-羧乙醯GM3以及N-乙 醯基GM3之聚氯乙烯板中評估專—性（Costar，USA)。以 共軛結合過氧化酶之抗-M13單株抗體（Amersham, Sweden)偵測結合的噬菌體。除了鑑定隨機挑選的個別菌 落之外’從各基因庫之噬菌體混合物進行選擇具有結合至 N -羧乙醯GM3容量的噬菌體。其係使用輔助的噬菌體 Μ ] 3 K07製作噬菌體，以聚乙二醇依據步驟沉澱純化以及 與結合Ν-翔乙醢GM3之塑膠表面（Inmuno tubes, Nunc, D e n m a r k )接觸。廣泛地淸洗該管以及在三乙胺1 〇 〇毫莫耳 /升存在下溶析噬菌體。中和溶析物以及用以感染T G ]大 -30- (27) (27)1343923 腸# ®品系。產生攜帶抗體噬菌體感染的細菌以及再一次 作爲起始材料進行純化，以相同的條件選擇。四次選擇週 期之後’各基因庫隨機產生92個感染噬菌體的菌落以及 以隨機自基因庫挑選菌落相似的形示進行辨識N_羧乙醯 GM3之評估。 從三鏈交換基因庫中發現各種頻率的菌落，由產生菌 落之基因庫直接分析菌落，分離攜帶辨識羧乙醯GM3 抗體片段之噬菌體。源自14F7融合瘤變異區形成之微基 因庫未發現正性株系。選擇週期之後，從鏈交換基因庫分 離額外的菌落以及未發現原本序列的微基因庫。下表顯示 產生抗體片段辨識N·羧乙醯GM3之菌落量以及代表各基 因庫分析之菌落總數的頻率。只有一個產生噬菌體之株系 可與N-乙醯基GM3交互反應。 1 ~~— --1 基因庫 陽性菌落頻率 (直接篩選） 陽性菌落頻率 (四次選擇週期） 小型基因庫融合瘤MF7 0/92 0/92 交換輕κ鼠科動物鏈 3 1/92 (33.70%) * 52/92 (56.52%) 交換輕κ人類鏈 2/92 (2.17%) 8/92 (1 7.39%) 交換輕λ人類鏈 4/92 (4.35%) 1 2/92 (1 3.04%) 與N·乙醯基 GM3交互反應之一個株系 實施例7。鑑定源自】4 F 7，辨識N -羧乙醯G Μ 3之抗體片 段。 -31 - (28) (28)1343923 以自動測序儀 ALF Express II (Pharmacia, Sweden)使 用與鄰接編碼插入的抗體片段序列5’以及3_端之pHG-lm 載體區域雜交之寡核苷酸完全地定序II個抗體片段之變 異區。証實所有相當於1 4 F 7之重鏈變異區序列’改變僅 呈現於構架1以及構架4區域，假設是由使用退化的寡核 苷酸之PCR產生。三CDR之重調序列並無變異。相反的 ，Π個菌落之輕鏈變異區序列均不同於14F7以及可分成 5個不同序列，兩個源自鼠科動物以及一個源自人類（ic同 功型）以及其它的是源自人類之λ同功型。選擇各株系之 —個序列進行鑑定。 下表顯示選擇的菌落輕鏈變異區間與原本起源以及同 功型特性之差異，以及依據Kabat分類之亞類。
VL起源 同功型 VL 14F7相似性 亞類 A c Μ 1 4 F 7 鼠科動物 K V S c F v 2 A m 鼠科動物 K 5 9.4 6 % III S c F v 3 F m 鼠科動物 K 5 9.81% —~----一 V ScFv 7Bhk 人類 K 6 0.7 4 % --- I ScFv 7AhI 人類 λ 3 5.4 5% -— I ScFv 8Bh) 人類 λ 3 7.04 % III 沿著所有序列包括三個補體決定區域之菌落輕鏈變肆 區與原本】4F7抗體間之差異，展示於下（圖6)。 -32- (29) 1343923
Fr1
14F7 Mab D L V L T
2Am scFv . I . M F 3Fm scFv . I Q M . 7Bhk scFv . I Q M . 7Ahl scFv Q S V V . 8BhlscFv S S E L . CDR1
R A S Q S ....S V S S .
TGTSSDV G
Q G D S L
s PA T L S V T .. s A . s T • s s - . A s T .s s . A s P .s A G G D V A
I S N N L H S Y S Y M .
...Y . N ..S F . N
GY. Η V S
R . Y Y A S PGDSVSFSC L . Q R A T I .. L . . R . T I .. V . . R . T I T . ..Q . L T I .. L . Q T . R I T . K . V Y Y L : . M R K K K K p · V : s p T A A E Q G K K H G D G G T p p p p R K K K H Q · · ·. Q :: 2 Y . Frw :: -33 - (30)1343923 K P G Q A t V v γ CDR2
C/J · · · * * I E H Q p p s L L L R R Q N R N K N s : :N A V * V K Y · · A D G G s G .s , G ·s , F . R . s A p . 3 丨 V V V V FrG : .
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MT T A V D G A A A A A FA— · E E C3 · > · · · E..... T E Q p A A E :QQQ V. L L L A A F N s G G 丨 H s s s T s N T T T T L 依據描述於使用塗覆除了 N-羧乙醯GM3以及N·乙醯 基GM3以外的一組相關的神經節苷脂，包括各種不同的 N -乙醒化物神經節苷脂以及—個N _羧乙醯化之神經節苷 脂的酵素聯結免疫抗體檢測法証實結合之專一性。圖7顯 示5個其特徵在於辨識不同抗原之抗體片段的菌落。僅偵 測到結合至目標抗原N -羧乙醯g Μ 3。 在]微莫耳/升IP TG存在下誘發菌落產生可溶解的抗 18 #段（噬菌體外）°收集上淸液以及依據建立之步驟得到 -34 - (31) (31)1343923 外周質分層（<^1^3以，1^‘11.8;〇1.(：116111.2 74，]8218-1 823 0，1 99 9)。以酵素聯結免疫抗體檢測法，於塗覆相似 於描述之但經下列修飾作用之抗原的平板，偵測外周質分 層培養懸浮液中N-羧乙醯GM3之辨識活性。使用]〇微 克/毫升1E10單株抗體（直接的對抗融合基因構築的抗體 片段與c_myc肽以及抗小鼠免疫球蛋白結合物（sigma, USA)偵測結合的抗體片段。從外周質分層以單一的金屬 性離子親和層析法，使用基質 H1S-S elect HC Nickel Affinity Gel (Sigma, USA)依據製造者之說明，純化抗體 片段。圖8顯示酵素聯結免疫抗體檢測法測定之純化的可 溶解片段的活性。 【圖式簡單說明】 圖1 :顯示14F7 Mab變異區VH(a)以及VK(b)，以及 最具代表性之同源人類序列之氨基酸序列。CDR被畫上 底線以及雨性區域以及可能的T抗原決定部位被畫上陰影 。亦展示人源化變異區突變產生的序列。 圖2 :競爭酵素聯結免疫抗體檢測法測量]4 F 7 Q抗體 之辨識。X軸：表示抗體之濃度》 Y軸：4 92毫微米測量之吸光率》 使用C 5單株抗體作負控制組。 :】4F7單株抗體對鼠科動物腫瘤（黑素瘤b ] 6腫 -35- (32) (32)1343923 瘤細胞株）生長之效應。 圖4 : A)免疫組織化學硏究，1 4F7單株抗體對血管形 成的效應。箭頭指出免疫染色的血管。B )】4 F 7單株抗體 誘發血管生成作用之抑制。 圖5 : pHG- 1載體圖。 圖6: 14F7單株抗體VL區域以及選擇的Fv單鏈片 段之蛋白質序列。點指出與]4F7 VL序列之同源性。 圖7 :攜帶抗體片段噬菌體之辨識專一性。觀察到喔 菌體曝露的片段抑制]4F7 Ab結合至神經節苷脂。平板係 塗覆N-羧乙醯 GM3 ’噬菌體係與病毒的顆粒反應以及 ]4F7之各種濃度。 圖8。經可溶解的純化片段辨識N -羧乙醯G Μ 3。 -36- 1343923 序列表. 序列表 <!】0>免疫分子中心 免疫分子中心 <12〇>辨識N-羧乙醯GM3神經節苷脂之重組抗體和片段、及其於診斷以及治療腫瘤上之用途 <130> QJ 92/2003 <]40> CU 92/2003 <141> 2003-04-23 <160> 58 <170> Patentln 版本 3.2 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213>家鼠 <220> <221>結構區 <222> (1)..(5) <400> 1
Ser Tyr Trp lie His 1 5 <210〉 2 <213> 17 <2!2> PRT <213〉家鼠 <221>結構區 <222> (1)..(17) <400> 2
Tyr He Asp Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Glu Ser Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Asp <2】0> 3 <2]]> 16 <212> PRT <2]3>家鼠 <221>結構區 <222> (1)..(36) <400> 3
Glu Ser Pro Aig Leu Arg Arg Gly lie Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 T鼠 4ns fe> Λ > Q ] z 3 22'2 2 < < < < 1343923 序列表.txt <220> <221>結構區 <222> (])..(]】） <400> 4 Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn Asn Leu His 】 5 10 T鼠 57即家 > > > I 3 <21<21<21<21 <220> <221>結構區 <222> (1)..(7) <400> 5 Tyr Ala Ser Gin Ser lie Ser <210〉 6 <211> 9 <232> PRT <213>家鼠 <220〉 <221>結構區 <222> (1)..(9) <400> 6 GJn Gin Ser Asn Arg Trp Pro Leu Thr 7STSS 0>1>2>3> <21<21<21<21 <220> <221>結構區 <222> (1)..(30) <400> 7 Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Asn Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 15 10 ]5
Scr Met Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Scr Phe Thr 20 25 30 <210> 8 <211> 14 <2]2> PR丁 <213>家鼠 <220〉 <22】> 結構區 <222> (1)..(14) <400> 8 Trp Leu Lys Gin Arg Pro Asp G]n Gly Leu Glu Tip lie Gly 1343923 丁鼠 932砰家 ^ > > > 0 12 3 2 22121 序列表.txt <220> <221>結構區 <222> (1)..(32) <400> 9
Lys Ala lie Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Phe Met Tyr 1 5 10 15
Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213>家鼠 <220> <22]>結構區 <222> (1)..(1]) <400> 10
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213>家鼠 <220> <22】 > 結構區 <222> (1)..(23) <400> 11
Asp Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Va3 Thr Pro Gly ] 5 10 15
Asp Ser Val Ser Phe Ser Cys 20 <2io> n <2)}> 15 <212> PRT <2】3>家鼠 <220> <22]>結構區 <222> (1)..(35) <400〉 12
Trp Tyr G]n Gin Arg Thr His Glu Ser Pro Arg Leu Leu ]]e Lys 15 10 15 3- 1343923 序列表.ut <210> 13 <211> 32 <212> PRT <2]3>家鼠 <220> <221>結描區 <222> (1)..(32) <400> 13
Gly He Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Ser lie lie Ser Val G)u Thi Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys 20 ' 25 30
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala ] 5 <210> 15 <231> 43 <212> DNA <213> 家m <220> <221> prim轉錄產物 <222> (1)--(43) <400> 15 ggggatatcc accatggaaa ggcactgggt ctttctcttc ctg 43 <2】0> 14 <211> 12 <212> PRT <213> 家鼠 <220> <221> 結構區 <222〉 (1)..(12) <400> 14 <2)0> 16 <211> 30 <212> DNA <213>家鼠 <220> <221> 轉錄產物 <222〉 （1)..(30) <400> 16 30 ggggcia£ci gaggagaegg tgaccgtg£t <210> 17 <213> 4S <212> DNA <213>家鼠 <220〉 <221> prim轉錄產物 <222> (3)..(48) -4- <220> 481343923 序列表*txt <22丨> prim_轉錄產物 <222> (1)..(43) <400> 17ggggatatcc accatggtat ttcctacacc tcagattacc ttggactt <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213〉家鼠 <220〉 <22i> prim_轉錄產物 <222> (1)..(35) <400> 18agcgtcgact tacgtttcag ciccagcitg gtccc 35 <210> 19 <21]> 42 <212> DNA <213>家鼠 <220> <221〉prirrL轉錄產物 <222> (1)..(42) <400> 19gtccagcttg tgcagtctgg ggctgaagtg gtaaaacctg gg 42 <2]〇> 20 <211> 30 <232> DNA <2]3>家鼠 <220> <22]> prim_轉錄產物 <222〉 （1)..(30) <400> 20ggggctagct gaggagacgg tgaccgtggt 30 <2)0> 2i <211> 42 <212> DNA <213> 家鼠 <220> <221> prim_轉錄產物 <222> (】）..(42) <4〇〇> 21
cccaggtttt accacttcag ccccagactg cacaagctgg 2C 42 <210> 22 <2Π> 43 <232> DNA <213> 家鼠 <220> <221> 口1^10_轉錄產物 <222> ⑴"(43) <400> 22 ggggatatcc accatggaaa ggcactggat cmc\cttc ctg 43 1343923 序列表.txt <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213>家鼠 <220> <22]> prim轉錄產物 <222> (1)..(27) <400> 23 ggggcctcag tgagggtgtc ctgcagg 21 <210> 24 <2】1> 30 <212> DNA <213>家鼠 30
<220〉 <221> prim_轉錄產物 <222> (1)..(30) <400> 24 ggggcugct gaggagacgg tgaccgtggt <210> 25 <211> 27 <2]2> DNA <213>家鼠 <220> <22]> prim_轉録產物 <222> (1)..(27) <m> 25 cctgcaggac accctcactg aggcccc ΊΊ <210> 26 <211> 43 <212> DMA <2I3> 家鼠 <220> <221> prim_轉錄產物 <222> (1)..(43) <4〇〇> 26
ggggataicc accatggaaa ggcactggat cittctcttc ctg 43 <210> 27 <211> 33 <212> 舰 <213>家鼠 <220> <221> prim_轉錄產物 <222> (]). .(33) <400> 27 cactggtt2a gacaggcacc tggccagggt ctg 33
<210> 28 <2]]> 30 <212> DNA -6- 301343923 <213>家鼠 序列表 <220> <22】> prim_轉錄產物 <222> (1)..(30) <400> 28 ggggctagct gaggagacgg tgaccgtggt <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213>家鼠 <220> <221> prim_$錄產物 <222> (1)..(33) <400> 29 cagaccctgg ccaggtgcct gtcitaacca gtg 33 <2]0> 30 <211> 43 <232> DNA <2I3>家鼠 <220> <221> prinL轉錄產物 <222> (1)..(43) <400> 30 Egggatatcc accatggaaa ggcactggat ctttctcttc ctg 43 <2]0> 3】 <211> 21 <2]2> DNA <2!3>家鼠 <220> <221> prim_轉錄產物 <222〉 （1)..(2]) <400> 31 ciggaatggg ttggatacat t 21 <210〉 32 <231> 30 <212> DNA <2]3>家鼠 <220〉 <22〗> prim_轉錄產物 <222> (1)..(30) <400> 32 ggggctagct gaggagacgg tgaccgtggt <210> 33 <2]]> 21 <2〕2> _ <2]3>家鼠 <220> <22]> prim_轉錄產物 -7- 30 211343923 序列表，txl <400> 33 aatgtatcca acccattcca g A鼠 3443DN家 <210> <211〉 <212> <213> <220> <221> prim_轉錄產物 <222> (1)..(43) <4〇〇> 34 ggggatatcc accat£gaaa <210> 35 <211> 30 <2]2> DNA <213> 家鼠 <220> <221> prim_轉錄產物 <222> (1)..(30) <400> 35 tatcaacaaa aaccaggtca <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> <220> <22)> prinL轉錄產物 <222> (1)..(35) <400> 36 agcgtcgact tacgtttcag <230> 37 <211> 30 <212> DNA <213> 家鼠 <220> <221> ?了爪_轉錄產物 <222> (1)..(30) <400> 37 ccttggagac tgacctggti <210> 38 <2]]> 48 <212> Wk <213> 家鼠 <220> <221> ]prim_轉錄產物 <222> (1)..(48) <400> 38 43 30 35 30 ggggat2tcc accatggtat itcctacacc icaganacc ttggactt 48 1343923 序列表.txt A鼠 39218家 > > > > 012 3 2 ζΝ 2 2<ν < < <220> <221> prim_轉錄產物 <222> (1)..(21) <400> 39 atttctgggg tcccctccag g 21 <210> 40 <211> 35 <212> DNA <213>家鼠 <220> <221> prim_轉錄產物 <222> (1)..(35) <400> 40 agcgtcgact tacgtitcag ctccagcttg gtccc 35 <210〉 41 <211> 21 <212> DNA <213>家鼠 <220> <221> prii轉錄產物 <222> (3)..(21) <4〇〇> 41 cctggagggg accccagaaa t 21 <210> 42 <211> 48 <212> DNA <213>家鼠 <220> <221> prinu轉録產物 <222> (1)..(48) <400> 42 ggggatatcc accatgfitat ttcctacacc tcagattacc ttggactt 48 A鼠 4350^家 J>> Λ > ο 1 z 3 <220> <22〗> prim_轉錄產物 <222> (1)..(50) <400> 43 ttctattcic acagtgcaca ggcaggtgic agctgtacag cagtcatgga 50 <210> 44 <2Π> 51 <212> DNA <2]3>家鼠 9- 511343923 序列表.txt <220> <22〗> prinu轉錄產物 <222> (1)..(51) <400> 44 ttctatictc acagtgcaca ggcaggtctc aagctgcagc agctctgggg c <210> 45 <211> 53 <212> DNA <213> 家鼠 <220> <221> prim_轉錄產物 <222> (1)..(53) <400> 45 ttctatictc acagtgcaca <210> 46 <211> 50 <212> DNA <213> 家鼠 <220> <22 )> prim轉錄產物 <222> (1)..(50) <400> 46 53 gaaccagtac tccaggcctg aggggccgca gagacagtga ccagagtccc 50 A鼠4750^家 ^ > > > Q 1 2 3 <220> <221> prim_轉錄產物 <222> (1)..(50) <400> 47 gaaccagtac tccaggcctg aggggccgag gagacggtga ctgaggttcc 50 <210> 48 <211> 54 <212> DNA <213> 家鼠 <220> <22]> prim_轉錄產物 <222> (1)..(54) <400> 48 gaaccagtac tccaggccig aggggccg*ag gagacgtgtg agccagtgga gccc 54 49401^^ 鼠 <2]〇> <211> <2]2> <213> <220> <22丨> prim_轉錄產物 <222> ())..(40) -10 - 1343923 序列表.ut <400〉 49 gtactccagt cgacgacatt <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> 家鼠 <220> <221> prim轉錄產物 <222> (】）..（40) <400> 50 gtactccagt cgacgatatc <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> 家鼠 <220> <221> prim_轉錄產物 <m> (1)..(39) <400> 5] £tactccagt cgaccgaaat <230> 52 <211> 39 <212> DNA <213> 家鼠 <220> <22 j> prim_轉録產物. <222> (1)..(39) «00> 52 a2£gaaaaaa gcggccgct t <2]〇> 53 <211> 39 <212> <213> 家鼠 <220> <221> ?4〇1_轉錄產物 <222> (1)..(39) <400> 53 aaggaaaaaa gcggccgctt <210> 54 <211> 111 <212> PR 丁 <213> 家鼠 <220> <221> 結構區 <222> (3)..(131) <AQQ> 54 Etgcatgatt accagtctcc cagatgacac cagaactacc tgttgctcac ccagtctcc ncaigicic cagcttggi uga；gcicc aacugtgi 40 40 39 39 39
Asp lie Val Met Phe Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Q\y 】 5 10 15 -11 - 1343923 序列表-txt
Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Tip Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Lys Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His 65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Arg 85 90 95
Asp Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 310 <210> 55 <211> 107 <212> PRT <2】3>家鼠 <220> <22】> 結構區 <222〉 （1)..(107) <400> 55
Asp Jle Gin Met Thr Gin Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly ] 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn 丁rp Tyr G]n Gin Lys Pro Asp Gly Thr Va】Lys Leu Leu lie 35 40 45
Va] Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr ]!e Ser Asn Leu Glu Gin 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Glv Asn Thr Leu Pro Pro 85 90 ' 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 56 <211> 107 <212> PK 丁 <213〉家鼠 <220〉 <22]>結構區 <222> (1)..()07) -12- 1343923 序列表.txt <400> 56
Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 35
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Phe 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Tyr Thr Thr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 57 <211> 111 <212> PRT <2]3>家鼠 <220> <22】> 結構區 <222> (1)..(131) <400> 57
Gin .Ser Val Val Thr Gin Pro Pro Ser Thr Ala Ser Gly Gly Pro Gly 15 10 15
Gin Ser Leu Thr lie Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly 20 25 30
Tyr Asn His Val Ser Trp Tyr Gin Gin His Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45
Leu Met lie Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro His Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly 65 70 75 80
Leu Gin Ala Glu Asp Glu Ala Va] Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr A]a Gly 85 90 95
Ser Asn Asn Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Va] Thr Val Leu 300 105 ]10 <2]〇> 58 <211> 109 <212> PRT <2】3>家鼠 -13- <220>1343923 序列表.U1 結構區 <222> (3)..(109) <400> 58
Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Thr Val Ser Val Ala Leu Gly 】 5 10 15
Gin Thr Val Arg lie Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr 20 25 30
Ala Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro G]y Gin Ala Pro Va] Leu Val lie 35 40 45
Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Thr Gly Ala Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr lyi Cvs Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn 85 ' 90 95
His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 -14 -
Claims (1)
1343923
充‘
L 拾、申請專利範圍 附件3:: :第093 1 1 1 267號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 民國99年10月19曰修正 1·—種由寄存編號ECACC 98 1 0 1 90 1之融合瘤產製 的鼠科動物14F7單株抗體所衍生之重組抗體，其特徵爲 重鏈和輕鏈之高度變異區（CDR)序列和構架區（FR)序列係 如下所示： 重鏈 CDR1 ： SYWIH CDR2: YIDPATAYTESNQKFKD CDR3 ： ESPRLRRGIYYYAMDY FR1 ： QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFT FR2： WLKQRPDQGLEWIG FR3 ： KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR FR4： WGQGTTVTVSS 輕鏈 CDR1 : RASQSISNNLH CDR2 : YASQSIS CDR3 ： QQSNRWPLT FR1 ： DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSC FR2 : WYQQRTHESPRLLIK FR3 ： GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFC 1343923 • FR4 : FGAGTKLELKRA -且其中該重鏈和輕鏈之該等Fr包含任.一下述之突變： 重鏈 位置5 : Q由V替代 位置9 : N由A替代 位置1 1 : L由V替代 位置12 : A由V替代 位置1 8 : Μ由V替代 位置1 9 : Κ由r替代 位置2 0 : Μ由V替代 位置38: Κ由R替代 位置40: R由λ替代 位置42: D由G替代 位置4 8 : I由ν替代 輕鏈 f位置3 9 : R由κ替代 位置40: τ由p替代 位置4 1 : η由G替代 位置42: Ε由Q替代 位置5 8 : I由ν替代。 2· ~種由寄存編號ECACC 98 1 01 90 1之融合瘤產製 的鼠科動物14F7單株抗體所衍生之單鏈Fv片段’其特徵 爲重鏈和輕鏈之C D R序列和F R序列係如下所不： 重鏈 m -2- 1343923 CDRl ： SY WIH CDR2： YIDPATAYTESNQKFKD CDR3 ： ESPRLRRGIY YYAMDY FRl ： QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFT FR2 ： WLKQRPDQGLEWIG FR3 ： KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR FR4： WGQGTTVTVSS 輕鏈 CDRl ： RASQSISNNLH CDR2 ： YASQSIS CDR3 ： QQSNRWPLT FRl : DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSC FR2 ： WYQQRTHESPRLLIK FR3 ： GIPSRFSGSGSGTDFTLSIIS VETEDFGM YFC FR4 ： FGAGTKLELKRA 且其中該重鏈和輕鏈之該等FR包含任一下述之突變： 重鏈 位置5 : Q由V替代 位置9 : N由A替代 位置1 1 : L由V替代 位置1 2 : A由V替代 位置1 8 : Μ由V替代 位置1 9 : Κ由R替代 位置20: Μ由V替代 1343923 位置3 8 : K由R替代 位置40: R由A替代 位置42 : D由G替代 位置4 8 : I由V替代 輕鏈
位置3 9 : R由K替代 位置40 : T由P替代 位置41 : Η由G替代 位置42 : Ε由Q替代 位置5 8 : I由V替代。 3. —種由寄存編號 ECACC 98 1 0 1 90 1之融合瘤產製 的鼠科動物1 4F7單株抗體所衍生之單鏈Fv片段，其中該 抗體含有如申請專利範圍第2項所述之重鏈變異區序列且 輕鏈變異區序列係如下所示： Fr 1 ^ DI VMFQSPASLAVSLGQRATI SC CDR 1 RASQSVSSSSYSYMH Fr 2 WYQQKPGQPPKLLI K CDR 2 Y A S N L E S Fr 3 GVPARFSGSGS GTDFTLNI HPVEEEDAATYYC [SI -4- 1343923 CDR 3 QHSRDVPLTF Fr 4 G A G T K L E I 4·—種由寄存編號ECACC 98 1 0 1 90 1之融合瘤產製 的鼠科動物1 4 F 7單株抗體所衍生之單鏈F v片段，其中該 抗體含有如申請專利範圍第2項所述之重鏈變異區序列且 輕鏈變異區序列係如下所示： Fr 1 DI QMTQTPSSLSASLGDRVTI SC CDR 1 RASQDI SNYLN Fr 2 WYQQKPDGTVKLLI V CDR 2 Y T S R L H S Fr 3 GVPSRFSGSGSGTDYSLTI SNLEQEDIATYFC CDR 3 QQGNTLPPTF Fr 4 GAGTKLELKc 5.—種由寄存編號ECACC 9 8 1 0 1 90 1之融合瘤產製 的鼠科動物1 4 F 7單株抗體所衍生之單鏈F v片段，其中該 -5- 1343923 抗體含有如申請專利範圍第2項所述之重鏈變異區序列且 -人輕鏈變異區序列係如下所示： Fr 1 DI QMTQTPSSLSASVGDRVTI TC CDR 1 RASQSI SSFLN Fr 2 WY QQKPGKAPKLLI Y CDR 2 A A S N L Q S Fr 3 GVPSRFSGRGSGTDFTLTI SSLQPEDFAAYYC CDR 3 QQGYTTPLTF Fr 4 GQGTKLELK〇 6. —種由寄存編號ECACC 98 1 0 1 90 1之融合瘤產製 的鼠科動物14F7單株抗體所衍生之單鏈Fv片段，其中該 抗體含有如申請專利範圍第2項所述之重鏈變異區序列且 人輕鏈變異區序列係如下所示： Fr 1 QSVVTQPPSASGGPGQSLTI SC CDR 1 [ TGTS S DVGGYNHVS -6- 1343923 Fr 2 WYQQHPGKAPKLMI Y CDR 2 D V S K R P S Fr 3 GVPHRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEAVYYC CDR 3 SSYAGSNNLVF Fr 4 GGGTKVTVL 0 7. —種由寄存編號ECACC 98 1 0 1 90 1之融合瘤產製 的鼠科動物1 4F7單株抗體所衍生之單鏈Fv片段，其中該 抗體含有如申請專利範圍第2項所述之重鏈變異區序列且 人輕鏈變異區序列係如下所示： Fr 1 SSELTQDPAVSVALGQTVRI TC CDR 1 QGDSLRSYYAS Fr 2 WYQQKPGQAPVLVI Y CDR 2 G K N N R P S Fr 3 G I PDRFSGSSSGNTASLTI TGAQAEDEADYYC 1343923 CDR 3 NS RDS S GNHVVF Fr 4 GGGTKLTVLe 8. 一種細胞株，其表現如申請專利範圍第1項之重 組抗體。
9. 一種細胞株，其表現如申請專利範圍第2至7項 中任一項之單鏈Fv片段。 10. 如申請專利範圍第1項之重組抗體，其係用於辨 識N-羧乙醯GM3神經節苷脂。 11. 如申請專利範圍第2至7項中任一項之單鏈Fv 片段，其係用於辨識N-羧乙醯GM3神經節苷脂。
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