CN117280026A - 免疫球蛋白切割酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及表现出针对免疫球蛋白(特别是人IgG)的蛋白酶活性的新型多肽及其体内、体外和离体用途。多肽的用途包括用于分析IgG和生成抗体片段的方法，以及用于预防或治疗由IgG介导的疾病和病症的方法。
Description
技术领域
本发明涉及表现出针对免疫球蛋白(特别是人IgG)的蛋白酶活性的新型多肽及其体内和离体用途。多肽的用途包括用于分析IgG和生成抗体片段的方法，以及用于预防或治疗由IgG介导的疾病和病症的方法。
背景技术
IdeS(酿脓链球菌(S.pyogenes)的免疫球蛋白G-降解酶，也称为imlifidase)是由人类病原体酿脓链球菌产生的细胞外半胱氨酸蛋白酶。IdeS具有极其高的底物特异性，其唯一鉴定出的底物是IgG。IdeS催化人IgG所有亚类的重链下部铰链区的单一蛋白水解切割。IdeS还催化各种动物中一些IgG亚类的重链的等效切割。IdeS通过两阶段机制高效地将IgG切割为Fc和F(ab’)2片段。在第一阶段，IgG的一条(第一条)重链被切割以生成具有单个非共价结合Fc链的单切割的IgG(scIgG)分子。scIgG分子实际上是一种中间产物，它保留原始IgG分子的剩余(第二条)重链。在该机制的第二阶段，该第二重链被IdeS切割以释放F(ab’)2片段和同源二聚体Fc片段。这些是通常在生理条件下观测到的产物。同源二聚体Fc可以解离成其组成单体。在还原条件下，F(ab’)2片段可以解离成两个Fab片段。IdeS的IgG切割能力已被证明具有离体效用，例如用于生产Fab、F(ab’)2和Fc片段的方法中，这些片段可用于例如分析IgG和体外生成F(ab’)2片段。参见例如，WO2003051914和WO2009033670。IdeS和由修饰IdeS而开发的IgG切割蛋白也已显示出具有作为治疗剂的体内效用，参见例如WO2006131347、WO2013110946、WO2016012285、WO2016128558和WO2016128559。此类蛋白质在这种情况下是有用的，因为它们能够在体内切割介导疾病或其他不期望的IgG分子。去除IgG可能是有益的，因为IgG会导致许多自身免疫性疾病的病状以及移植器官的急性排斥反应，并且还可能导致抗药物反应。对给定治疗剂具有特异性的抗体可能会降低该治疗剂的功效。对于基于抗体的疗法、基因治疗载体和细胞疗法(包括过继细胞转移(ACT)免疫疗法，例如使用CAR-T细胞)来说尤其如此。换言之，IdeS和由修饰IdeS而开发的IgG切割蛋白可用作完全或部分由IgG介导的任何疾病或病症的疗法，所述病症可以包括抗药物反应。
然而，IdeS是酿脓链球菌的毒力因子，该酿脓链球菌是导致如扁桃体炎和链球菌性咽喉炎的常见感染的原因。因此，大多数人类对象在这种情况下接触过IdeS，并且可能在血液中具有抗IdeS抗体，这可能降低其作为治疗剂的效用。
IdeZ是由马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.Zooepidemicu，一种主要发现于马中的细菌)产生的IgG半胱氨酸蛋白酶。IdeZ与IdeS具有约66％的同一性。由于马链球菌兽疫亚种不是人类病原体，IdeZ被认为是基于IdeS的疗法的替代方案，因为人类可能很少或没有针对IdeZ的抗体(抗药物抗体，ADA)。然而，IdeZ针对人IgG的IgG半胱氨酸蛋白酶活性水平明显低于IdeS，特别是在切割IgG2时。
鉴于上述免疫球蛋白切割酶的多种应用，显然需要能够切割免疫球蛋白、特别是人IgG的其他药剂。
发明内容
本发明人已鉴定、纯化并表征了新的多肽。该多肽是从以前未知的链球菌物种中鉴定出来的，这种以前未知的链球菌物种作为对多种啮齿动物研究的一部分而分离。一种特殊的分离物种(暂定名为Streptococcus)经过测序并发现表达多种糖苷酶和蛋白酶。出乎意料地，从口腔链球菌中鉴定出一种多肽。迄今为止，尚未从任何口腔链球菌中发现IgG蛋白酶。
鉴定出的多肽为约56.4kDa，由557个氨基酸组成，在本文中称为IdeSORK。全长序列如SEQ ID NO:1所示。IdeSORK的序列与其他已知的IgG半胱氨酸蛋白酶的序列有很大不同，并且在系统发育分析中IdeSORK与IdeS和IdeZ分开聚类。此外，全长序列的表达相对困难。然而，发明人发现该全长序列的N端片段具有显著增强的表达，同时保留了免疫球蛋白切割活性。例如，SEQ ID NO:2的序列由SEQ ID NO:1的N端的312个氨基酸组成。由SEQ IDNO:2序列经工程改造以更好表达和纯化的版本(添加N端的甲硫氨酸和C端的蛋白纯化标签-His6)的多肽，在本文中称为IdeSORK2.0(或Xork)，其序列如SEQ ID NO:3所示。
在存在人血清的情况下，IdeSORK2.0具有免疫球蛋白切割活性。此外，针对IdeSORK2.0的预先存在的免疫力极低。因此，非常有利的是，本发明允许对目前因预先存在针对IdeS/IdeZ的免疫力而排除在治疗之外的患者进行治疗。
本文提供的是：
一种多肽，任选为工程改造的多肽，所述多肽具有免疫球蛋白蛋白酶活性，其中所述多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：
(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:1序列的N端片段的氨基酸序列；
(d)与(a)、(b)或(c)中任一项的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列；
任选地，其中所述多肽经工程改造以包含在N端的附加甲硫氨酸和/或在C端的蛋白质纯化标签或其他标签，该标签可以通过接头连接至C端。
该多肽可以以组合物的形式提供，通常该多肽包含有效量的防腐剂。该多肽可以是固定化的。
还提供了多核苷酸或表达载体，其包含编码本发明多肽的核酸序列。
本发明的多肽可用于切割免疫球蛋白(通常是IgG)的多种方法。因此，本文提供了包括将本发明的多肽、多核苷酸、表达载体或组合物施用至例如其中存在IgG的样品或对象中的方法。还提供了包括使IgG与本发明的多肽、多核苷酸、表达载体或组合物接触的方法。该方法可以是切割免疫球蛋白的方法，并且可以任选地还包括对切割产物进行检测或分析。该方法可以是治疗疾病的方法，该方法包括向对象施用本发明的多肽、多核苷酸、表达载体或组合物。
附图说明
图1.IdeSork的表达和纯化。全长蛋白质(1.0)表达为约70kDa的蛋白质，但低表达。C端截短的IdeSork(2.0)表达为约36kDa的蛋白质。使用指定的生产方案，某些物质是不溶的(沉淀物)，但绝大多数物质是可溶解的(上清液)并经亲和纯化至高纯度和产率。
图2.一般蛋白酶活性。使用酪蛋白作为底物，通过EnzCHECK蛋白酶测定法测定一般蛋白酶活性。阳性对照FabULOUS是发出高信号的一般性蛋白酶(SpeB)，而阴性对照FabRICATOR是IgG特异性蛋白酶(IdeS)，因此几乎不发出信号。IdeSork 2.0在测定中没有发出任何可测量的信号，表明它是一种特异性更强的酶。
图3.IdeSork2.0的特异性。IdeSork2.0与不同的抗体混合并在37℃下孵育过夜，然后进行SDS-PAGE分析。用箭头标记酶本身。所有的人IgG或基于IgG的融合蛋白均被IdeSork2.0水解，然而仅来自小鼠的IgG2a可以被水解。小鼠IgG1、小鼠IgG2b和人IgA不受IdeSork2.0影响。
图4.IdeSork2.0的蛋白酶抑制剂敏感性。除了抑肽酶、EDTA和胃酶抑素外，大多数蛋白酶抑制剂均可抑制IdeSork2.0。苯丁抑制素对该酶也只有部分抑制作用。
图5.IdeSork2.0在与IdeS相同的位点处水解IgG的铰链。用IdeSork2.0水解商业化和非商业化生物制剂，并使用LC-MS分析水解产物。在所有情况下，仅在铰链区的单一位点处观测到水解，该位点对应于IdeS识别的相同位点。
图6.IdeSork2.0以两步机制作用于IgG。为了研究IdeSork2.0是同时水解IgG的两条重链还是单独地作用于它们，将曲妥珠单抗与IdeSork2.0(1:20)一起孵育，并孵育0至60分钟，然后进行非还原SDS-PAGE分析。大多数IgG在最初几分钟内被水解，其中一条链和两条链经受水解，表明这是两步反应。
图7.IdeSork2.0最佳条件。使用Box-Behnken实验设计来确定IdeSork2.0的最佳缓冲液组分，测定pH、NaCl和温度的影响。输出结果以IgG的水解百分比来衡量。
图8.IdeSork2.0酶:底物之比。使用Box-Behnken实验设置来研究酶和底物的浓度对反应速度的影响，还分析了时间对反应速度的影响。输出结果以IgG的水解百分比(左上图)以及以每单位酶水解IgG的量(所有其他图)来衡量。
图9.随时间变化的IdeSork2.0酶:底物活性。为了验证改变酶:底物比率的影响，随着时间的推移(30分钟、60分钟和120分钟)，用不同量的底物(5μg至40μg)对固定量的酶(1μg)进行了实验。在所有条件下，几乎所有IgG都会在30分钟内水解。
图10.与IdeS和IdeZ相比，IdeSork2.0具有相似的活性。为了研究IdeSork2.0是否以与IdeS和IdeZ相似的方式来水解IgG，将它们针对IgG1和IgG2进行孵育，并进行SDS-PAGE分析。切割模式看起来相同，其中IdeSork2.0和IdeS针对IgG2的活性更低。
图11.IdeSork2.0的特异性。将IdeSork2.0与不同的抗体混合并且在37℃下孵育过夜，然后进行SDS-PAGE分析。IdeSORK2.0对绵羊、猪、狗或大鼠的IgG没有明显效果，但是表现出针对马IgG和豚鼠IgG的活性。
图12.从田鼠分离的链球菌菌株中IgG蛋白酶活性的鉴定。(A)使用口链球菌作为阳性对照，对从野生田鼠中分离出的8种β-溶血细菌进行16S基因扩增。(B)根据具有已知16S序列的数据库查询这些序列，证明主要与口腔链球菌和葡萄球菌的相似性。(C)为了研究IgG蛋白酶活性，对在补充有2％小鼠血清的C-培养基中生长的几种菌株的上清液进行蛋白质印迹。仅菌株β13和β2003针对小鼠IgG显示出可测量的活性，并且进行了完整测序。(D)全基因组序列同源性证明了新分离的菌株与口腔链球菌之间的进化关系。迄今为止，尚未在任何口腔链球菌或其相近菌株中发现IgG蛋白酶，并且仅在其中一种经测序的菌株中鉴定出IdeSORK基因。
图13.(A)IgG蛋白酶IdeSORK1.0、IdeSORK2.0、IdeS和IdeZ的Clustal W比对。(B)合成具有截短的C端的IdeSork2.0，并且进行表达以及测试了产率和活性。“0”代表最终的IdeSORK2.0构建体，+/-描述了C端有多少个氨基酸已被删除或添加到该产物中。
图14.IgG水解酶同源性。(A)将三种IgG特异性水解酶IdeS、IdeZ和IdeSORK2.0(Xork)在SDS-PAGE上进行分离。(B)通过系统发育树评估Xork与其他已知IgG蛋白酶的同源性。(C)Xork与其他已知IgG蛋白酶的相似性百分比和同一性百分比。(D)Xork与IdeS的序列比对和(E)Xork与IdeZ的序列比对。
图15.人血清中IgG水解酶的活性。在血清(100％)中加入IgG水解酶，并使用非还原SDS-PAGE来分析随时间的活性。
图16.针对IgG的酶活性。将IdeS、IdeZ和Xork针对人IgG亚类、修饰的IgG、与IgG1-Fc部分的融合蛋白和来自不同物种的IgG的活性报告为无活性(-)、低活性(+)、良好活性(++)和高活性(+++)。与图3相关。
图17.将变性的IgG与IgG水解酶一起孵育，以研究底物保守性3D结构对于酶发挥其功能的必要性。
图18.IVIG中抗IgG水解酶抗体的普遍程度。对于(A)ELISA测定和(B)蛋白质印迹测定二者，将不同浓度的IgG水解酶结合到板/膜上，并暴露于IVIG(5μg/mL)。添加具有融合HRP标签的二抗(山羊抗IgG)用于进行信号放大。
序列的简要描述
SEQ ID NO:1是从命名为Streptococcus的链球菌物种中分离的多肽的全长氨基酸序列。该多肽的长度为557个氨基酸，具有免疫球蛋白蛋白酶活性。该序列在本文中可称为IdeSORK。
SEQ ID NO:2是具有免疫球蛋白蛋白酶活性的多肽的氨基酸序列。使SEQ ID NO:1的C端245个氨基酸缺失以形成该序列，因此该序列由IdeSORK的N端312个氨基酸组成。该序列可被描述为具有免疫球蛋白蛋白酶活性的IdeSORK的N端片段。
SEQ ID NO:3是具有免疫球蛋白蛋白酶活性的多肽的氨基酸序列。该序列由SEQID NO:2经工程改造以包含N端附加甲硫氨酸和C端蛋白质纯化标签His6的序列组成。所得的319个氨基酸的多肽在本文中可称为IdeSORK2.0。
SEQ ID NO:4至11是人和小鼠的多种IgG亚类的铰链/CH2区的序列。
SEQ ID NO:12是IdeS的全长氨基酸序列，其以NCBI参考序列号WP_010922160.1公开获得。该序列包含N端甲硫氨酸和随后的28个氨基酸分泌信号序列。
SEQ ID NO:13是成熟的IdeS蛋白。从SEQ ID NO:12去除N端甲硫氨酸和信号序列(在N端的总共29个氨基酸)以形成该序列，其也以Genbank登录号ADF13949.1公开获得。当在实施例中使用时，IdeS通常包含经工程改造以含有N端附加甲硫氨酸和C端蛋白质纯化标签(例如聚组氨酸)的序列。优选的标签是His6。
SEQ ID NO:14是IdeZ的全长氨基酸序列，其以NCBI参考序列号WP_014622780.1公开获得。该序列包含N端甲硫氨酸和随后的33个氨基酸分泌信号序列。
SEQ ID NO:15是成熟的IdeZ蛋白。从SEQ ID NO:14去除N端甲硫氨酸和信号序列(N端的总共34个氨基酸)以形成该序列。当在实施例中使用时，IdeZ通常包含经工程改造以含有附加N端甲硫氨酸和C端蛋白质纯化标签(例如聚组氨酸)的序列。优选的标签是His6。
SEQ ID NO:16是编码SEQ ID NO:1经工程改造用于表达N端组氨酸和C端His6的多肽的示例性核苷酸序列。
SEQ ID NO:17是编码SEQ ID NO:2经工程改造用于表达N端组氨酸和C端His6的多肽的示例性核苷酸序列。SEQ ID NO:17编码SEQ ID NO:3。
SEQ ID NO:18是包含SEQ ID NO:16序列的示例性表达载体序列。
SEQ ID NO:19是包含SEQ ID NO:17序列的示例性表达载体序列。
具体实施方式
应当理解的是，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需要进行调整。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方式的目的，而不是为了限制。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论在上文还是在下文，均通过引用整体并入本文。
如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非内容另有明确规定，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，对“多肽()”的提及包括“多个多肽()”等。
具有免疫球蛋白蛋白酶活性的多肽
具有免疫球蛋白蛋白酶活性的多肽的功能特征
本节阐述了具有免疫球蛋白蛋白酶活性的多肽的功能特征，除了紧接着的下一节中概述的结构特征之外，还可以应用这些功能特征。
本发明提供了具有免疫球蛋白蛋白酶活性的多肽。即，该多肽能够切割免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子通常是IgG分子，并且优选地，该多肽不切割其他类别的免疫球蛋白。该多肽可以切割包含表1所示SEQ ID NO.4至8中任一的铰链/CH2序列的任何免疫球蛋白分子。
表1
该多肽优选地在如表1中每个序列所示的粗体/下划线残基之间切割。将切割位点可替代地描述为位于根据Kabat编号系统的人IgG的第249位和第250位(根据EU编号系统的第236位和第237位)之间。
该多肽优选地切割人IgG的所有亚类(即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，并且不切割人免疫球蛋白的其他类别。相比于人IgG的其他亚类，该多肽可以表现出针对人IgG2的较低活性。该多肽可以表现出针对人IgG1比针对人IgG2更大的活性。该多肽可以表现出针对非人IgG分子(包括小鼠IgG2a和IgG3)的活性。该多肽可以表现出针对来自豚鼠或马的IgG的活性。
该多肽可以通过两阶段机制高效地将IgG切割为Fc和F(ab’)2片段。在第一阶段，IgG的一条(第一)重链被切割以产生具有单个非共价结合Fc链的单切割的IgG(scIgG)分子。scIgG分子实际上是一种中间产物，它保留原始IgG分子的剩余(第二)重链。本文还提供了本发明多肽与单切割的IgG分子的复合物。在这种背景下，被多肽切割的IgG优选是重组单克隆抗体。因此，提供了本发明多肽与单切割的重组单克隆IgG分子的复合物。在下面的“使用方法”部分中列出了被本发明多肽切割的示例性抗体。提供了本发明多肽与任何这些抗体的单切割版本的复合物。
在该机制的第二阶段，原始IgG分子的剩余(第二)重链被多肽快速切割，释放F(ab’)2片段和同源二聚体Fc片段。这些是通常在生理条件下观测到的产物。同源二聚体Fc可以解离成其组成单体。在还原条件下，F(ab’)2片段可以解离成两个Fab片段。
免疫球蛋白蛋白酶活性可以通过任何合适的方法来评估，例如通过将多肽与含有IgG的样品一起孵育并确定IgG切割产物的存在。用于评估免疫球蛋白蛋白酶活性的测定法也可用于量化所述活性的功效，即评估多肽的效力。可以在存在或不存在抑制剂的情况下评估功效。然而，除非另有说明，本文中的功效通常是指在不存在此类抑制剂的情况下评估的功效。确定活性和/或量化所述活性的效力的合适测定法是本领域公知的，并且可以使用任何合适的测定法。合适的测定法包括基于ELISA的测定。在这样的测定中，测定板的孔通常用抗体靶标例如牛血清白蛋白(BSA)包被。然后将待测试的多肽样品添加到孔中，随后添加靶标特异性抗体的样品，在该实例中该抗体是对BSA特异的。允许多肽和抗体在适合IgG蛋白酶活性的条件下相互作用。在合适的时间间隔后，洗涤测定板，并且在适合与靶标特异性抗体结合的条件下添加特异性结合靶标特异性抗体的检测抗体。检测抗体将与每个孔中已与靶标结合的任何完整靶标特异性抗体结合。洗涤后，孔中存在的检测抗体的量与结合到该孔的靶标特异性抗体的量成比例。检测抗体可以直接地或间接地与标记或另一种报告系统(例如酶)缀合，从而可以确定每个孔中剩余的检测抗体的量。孔中测试的多肽的效力越高，保留的完整靶标特异性抗体越少，并且因此存在的检测抗体更少。在一个实施方式中，给定测定板上至少有一个孔包含成熟IdeS和/或成熟IdeZ和/或IdeSORK2.0，而不是待测试的多肽，使得可以将测试多肽的效力直接与成熟IdeS和/或成熟IdeZ和/或IdeSORK2.0的效力进行比较。
其它测定法可以通过直接可视化和/或量化由测试多肽切割IgG产生的IgG片段来确定测试多肽的效力。这种测定法通常将IgG样品与滴定系列中不同浓度的测试多肽(或与作为对照的成熟IdeS和/或成熟IdeZ和/或IdeSORK2.0)一起孵育。然后使用凝胶电泳，例如通过SDS-PAGE，分离在每个浓度下孵育所产生的产物。然后整个IgG和由切割IgG产生的片段可以通过大小进行鉴定并且通过使用合适染料的染色强度进行量化。切割片段的数量越多，在给定浓度下测试多肽的效力就越大。这种类型的测定还能够鉴定在切割IgG分子的第一重链或第二重链方面更有效的测试多肽，因为也可以确定由每个切割事件产生的不同片段的数量。本发明的多肽切割IgG分子的第一条链比切割第二条链可能更有效。
在一个实施方式中，优选地，本发明的多肽切割人IgG1至少与IdeSORK2.0一样有效。
评估免疫球蛋白蛋白酶活性和功效的合适方法还在实施例中进行了描述。
具有免疫球蛋白蛋白酶活性的多肽的结构特征
本节阐述了具有免疫球蛋白蛋白酶活性的多肽的结构特征，除了紧接前一节中概述的功能特征之外，还可以应用这些结构特征。特别地，除了免疫球蛋白蛋白酶活性的功能之外，还可以应用结构特征。
多肽的长度通常不超过600个氨基酸。该多肽可以包含SEQ ID NO:1的557个氨基酸，并且可以额外经工程改造以包含一个或多个另外的氨基酸，总长度达到600个氨基酸，其中所述另外的氨基酸通常有助于生产、分离或纯化。因此，该多肽可以包含SEQ ID NO:1的序列、基本上由SEQ ID NO:1的序列组成或由SEQ ID NO:1的序列组成。
该多肽的最大长度可以为560个、500个、400个或350个氨基酸。
该多肽优选地包含SEQ ID NO:1的任何N端片段、基本上由SEQ ID NO:1的任何N端片段组成或由SEQ ID NO:1的任何N端片段组成，前提是其具有免疫球蛋白蛋白酶活性。该多肽可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1的N端的前150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318 319、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500个连续氨基酸，前提是该多肽具有免疫球蛋白蛋白酶活性。N端片段优选地包含SEQ ID NO:1的N端的至少前250个连续氨基酸，任选地SEQ ID NO:1的N端的至多前320个连续氨基酸。示例性的SEQ ID NO:1的N端片段以SEQ ID NO:2提供。该SEQ ID NO:2包含SEQ ID NO:1的N端的前312个连续氨基酸。
SEQ ID NO:1的任何N端片段可以经工程改造以包含一种或多种另外的氨基酸，其中所述另外的氨基酸通常有助于产生、分离或纯化。SEQ ID NO:2的工程改造版本以SEQ IDNO:3提供。当在相同的测定法中测量时，N端片段的免疫球蛋白蛋白酶活性优选为由SEQ IDNO:3组成的多肽针对人IgG的活性的至少50％，并且更优选地与由SEQ ID NO:3组成的多肽的活性相当或优于该活性。
或者，本发明多肽可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：具有如上定义的免疫球蛋白蛋白酶活性的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的任何其他N端片段的氨基酸序列的变体。当在相同的测定法中测量时，变体多肽的免疫球蛋白蛋白酶活性优选为由SEQ ID NO:3组成的多肽针对人IgG的活性的至少50％，并且更优选与由SEQ ID NO:3组成的多肽的活性相当或优于该活性。
所述变体可以与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的所述N端片段的氨基酸序列至少50％相同。变体序列可以与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的所述N端片段的序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。同一性水平优选为至少85％或更高。可以在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或所述SEQ ID NO:1的N端片段所示序列的至少150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、330、340、350、360、370、380、390、400个或更多个连续氨基酸的区域内测量相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:1的所述N端片段的序列的同一性。更优选地，在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:1的所述N端片段的全长上测量同一性。可以在变体的长度上测量与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:1的所述N端片段的同一性，前提是变体的长度比参考序列更长或更短不超过50个氨基酸，并且优选地具有与参考序列近似(或完全)相同的长度。SEQ ID NO:2是最优选的参考序列。最优选地在SEQ ID NO:2的全长上测量变体的同一性。
氨基酸同一性可以使用任何合适的算法来计算。例如，PILEUP和BLAST算法可用于计算同一性或排列序列(例如识别等效序列或相应序列(通常以它们的默认设置)，例如Altschul SF(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S,F等人(1990)J Mol Biol 215:403-10中所述。执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字段来鉴定高评分序列对(HSP)，这些短字段在与数据库序列中相同长度的字段比对时匹配或满足一些正值的阈值得分T。T被称为邻域字段得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始邻域字段命中充当启动搜索以查找包含它们的HSP的种子。字段命中沿着每条序列双向延长，只要可以增加累积比对得分。在以下情况下，每个方向上的字段命中延长会停止：在累积比对得分从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分达到零或以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序默认使用11的字长(W)，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。
BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计学分析；参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，它提供对两条多核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列相比的最小总和概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，且最优选小于约0.001，则认为该序列与另一序列相似。或者，UWGCG软件包提供BESTFIT程序，其可以用于计算同一性(例如以其默认设置使用)(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research 12，387-395)。
本发明多肽的序列可以包含具有如上定义的免疫球蛋白蛋白酶活性的SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的任何其他N端片段的氨基酸序列的变体，变体中相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的所述其他N端片段的序列进行修饰(例如，氨基酸的添加、缺失或置换)。
除非另有说明，修饰优选地是保守性氨基酸的置换。保守性置换是氨基酸用化学结构相似、化学性质相似或侧链体积相似的其它氨基酸替代。引入的氨基酸可以具有与其所取代的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。或者，保守性置换可以引入另一种芳香族或脂肪族氨基酸来代替先前存在的芳香族或脂肪族氨基酸。保守性氨基酸改变是本领域熟知的，并且可以根据如下表A1中定义的20种主要氨基酸的性质进行选择。当氨基酸具有相似极性时，这可以通过参考表A2中氨基酸侧链的亲水性等级来进行确定。本发明的多肽序列可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的变体，在该变体中进行最多达10、20、30、40、50或60个保守性置换。
表A1-氨基酸的化学性质
| Ala(A) | 脂肪族、疏水性、中性 | Met(M) | 疏水性、中性 |
| Cys(C) | 极性、疏水性、中性 | Asn(N) | 极性、亲水性、中性 |
| Asp(D) | 极性、亲水性、带负电荷 | Pro(P) | 疏水性、中性 |
| Glu(E) | 极性、亲水性、带负电荷 | Gln(Q) | 极性、亲水性、中性 |
| Phe(F) | 芳香族、疏水性、中性 | Arg(R) | 极性、亲水性、带正电荷 |
| Gly(G) | 脂肪族，中性 | Ser(S) | 极性、亲水性、中性 |
| His(H) | 芳香族、极性、亲水性、带正电荷 | Thr(T) | 极性、亲水性、中性 |
| Ile(I) | 脂肪族、疏水性、中性 | Val(V) | 脂肪族、疏水性、中性 |
| Lys(K) | 极性、亲水性、带正电荷 | Trp(W) | 芳香族、疏水性、中性 |
| Leu(L) | 脂肪族、疏水性、中性 | Tyr(Y) | 芳香族、极性、疏水性 |
表A2-亲水性等级
合适的修饰可以用具有相当特征但非天然真核蛋白质中出现的20种L-型氨基酸之一的氨基酸来替代起始序列中的至少一个氨基酸。例如，至少一个L-型氨基酸可以用直接对应的非L-型氨基酸(例如D-型氨基酸)或者用另外如上定义的保守性置换的非L-型氨基酸进行替代。
本发明的多肽的氨基酸序列可以包含如上所述的氨基酸序列的变体。然而，将某些残基优选地保留在所述变体序列内。例如，从SEQ ID NO:2的N端开始对位点进行编号，预期第66位的Lys对于生成氧阴离子穴是重要的，预期第76位的Cys和第226位的His构成活性位点，预期第248位和第250位的Asp氨基酸对于活性位点的正确取向以及生成促进水解的静电环境是重要的。优选地，不改变与这些位点对应的位点处的氨基酸，特别是Cys-76和His-226。
本发明的包含具有如上定义的免疫球蛋白蛋白酶活性的SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:1的任何其他N端片段的任何多肽，或这些序列中任一种的任何变体，可以任选地经工程改造以包含在N端的附加甲硫氨酸和/或在C端的蛋白质纯化标签或其他标签。该标签是在链球菌属细菌中不会作为SEQ ID NO:1的IdeSORK蛋白的连续结构域天然表达的序列。优选的蛋白纯化标签是组氨酸标签。组氨酸标签优选地由六个组氨酸残基组成。组氨酸标签可以通过接头连接到C端，接头通常是短氨基酸序列，例如3至5个氨基酸。接头通常主要由甘氨酸和丝氨酸残基组成，并且可以优选地包含序列GSG。例如，GSG和GSGLE是合适的接头。SEQ ID NO:3是工程改造序列的实例。
因此，概括而言，本文提供的是：
一种多肽，任选为工程改造的多肽，所述多肽具有免疫球蛋白蛋白酶活性，其中所述多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：
(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:1序列的N端片段的氨基酸序列；
(d)与(a)、(b)或(c)中任一项的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列；
任选地，其中所述多肽经工程改造以包含在N端的附加甲硫氨酸和/或在C端的蛋白质纯化标签或其他标签，该标签可以通过接头连接至C端。
SEQ ID NO:1、2和3是本发明示例性多肽的序列。该多肽可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1、2或3中的任一氨基酸序列。本发明的示例性多核苷酸序列包括SEQ ID NO:16至19。
一般多肽特征
“多肽”在本文中以其最广泛的含义使用，是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它肽模拟物的化合物。因此，术语“多肽”包括短肽序列以及更长的多肽和蛋白质。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用。术语“氨基酸”可以是指天然和/或非天然或合成的氨基酸(包括D或L旋光异构体二者)以及氨基酸类似物和肽模拟物。
多肽可以通过合适的方法产生，包括重组或合成方法。例如，可以使用本领域已知的标准技术直接合成多肽，例如Fmoc固相化学、Boc固相化学或通过液相肽合成。或者，可以通过用编码所述多肽的核酸分子或载体转化细胞(通常是细菌细胞)来产生多肽。下面描述了通过在细菌宿主细胞中表达来产生多肽，并在实施例中举例说明。本发明提供了编码本发明的多肽的核酸分子和载体。本发明还提供了包含此类核酸或载体的宿主细胞。编码本文公开的多肽的示例性多核苷酸分子以SEQ ID NO:16和17提供。这些序列中的每一个包括在5'端的N端甲硫氨酸密码子(ATG)，以及在3'端的终止密码子(TAA)之前的蛋白质纯化标签密码子，该蛋白质纯化标签在本文中为6x His标签，其可以任选地将其排除。将在本文件的其他地方更详细地讨论任选包括的另外甲硫氨酸和标签。SEQ ID NO:18和19分别是包含SEQ ID NO:16和17的表达载体序列。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核酸或核糖核酸)或者其类似物的聚合物的形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体()、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸编码本发明的多肽，并且可以以分离的或基本上分离的形式提供。基本上分离的是指可以将多肽从任何周围介质中基本上但不是完全分离。多核苷酸可以与载体()或稀释剂混合，所述载体或稀释剂不会干扰它们的预期用途，并且仍然被认为是基本上分离的。“编码”所选择的多肽的核酸序列是当处于适当的调节序列的控制下时在体内(例如在表达载体中)转录(DNA的情况下)并翻译(mRNA的情况下)为多肽的核酸分子。编码序列的界限由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。为了本发明的目的，这种核酸序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列以及甚至合成的DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3’。
多核苷酸可以依照本领域熟知的方法来合成，如以Sambrook等人(1989，Molecular Cloning-a laboratory manual(分子克隆-实验室手册)；冷泉港实验室出版社)中的实例所描述的。可以以表达盒的形式提供本发明的核酸分子，所述表达盒包括可操作地连接至插入序列的控制序列，由此允许本发明的多肽在体内(例如在原核或真核表达系统中)表达。通常在载体(例如，质粒或重组病毒载体)中提供这些表达盒。这样的表达盒可直接施用于宿主对象。或者，可以将包含本发明的多核苷酸的载体施用于宿主对象。优选地，使用遗传载体来制备和/或施用多核苷酸。适合的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并且允许本发明的多肽的表达的任何载体。
因此，本发明包括包含这种多核苷酸序列的表达载体。这种表达载体在分子生物学领域中常规构建，并且其可以例如包括质粒DNA和可能是必需的并以正确方向放置的适当的起始密码子、启动子、增强子和其他元件(例如诸如多聚腺苷化信号)的使用，以便允许表达本发明的肽。其他合适的载体对本领域的技术人员来说是明显的。作为这方面的进一步实例，参考Sambrook等人。
本发明还包括已经修饰以表达本发明的多肽的细胞。此类细胞通常包括原核细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌。可以使用常规方法培养此类细胞以产生本发明的多肽。
可以对多肽进行工程改造或修饰以辅助生产、分离或纯化。例如，当本发明的多肽通过在细菌宿主细胞中重组表达进行生产时，该多肽的序列可以包含在N端的另外甲硫氨酸(M)残基以改善表达。作为另一个实例，可以通过在N端或C端、优选在C端添加蛋白质纯化标签来对本发明的多肽进行工程改造或修饰。蛋白质纯化标签优选地是在链球菌属细菌中不会天然表达的部分。蛋白质纯化标签优选地是在链球菌属细菌表达的野生型多肽链中不存在的部分。蛋白质纯化标签可以是能够直接且特异性地与分离工具结合的配体。或者，蛋白质纯化标签可以是结合对的一个成员，并且分离工具包含含有结合对的另一个成员的试剂。可以使用任何合适的结合对。
当通过添加结合对的一个成员来工程改造或修饰多肽时，该多肽优选地带有组氨酸标签或生物素标签。通常，在基因水平上包括组氨酸标签或生物素标签的氨基酸编码序列，并且多肽在大肠杆菌中重组表达。组氨酸标签或生物素标签通常存在于多肽的任一末端，优选存在于C端。该标签可以直接连接至多肽或通过任何合适的接头序列(例如，3、4或5个甘氨酸残基，或甘氨酸和丝氨酸残基的混合物)间接连接。组氨酸标签通常由6个组氨酸残基组成，尽管该组氨酸标签可以比6个更长(通常最多至7、8、9、10或20个氨基酸)或者更短(例如5、4、3、2或1个氨基酸)。
可用于蛋白质纯化的替代标签包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还原蛋白(TRX)、泛素(Ub)、小泛素相关修饰剂(SUMO)、溶解度增强肽序列(SET)和氮素利用物质(NusA)。合适的标签还在Costa等人(Front Microbiol.2014；5:63)中讨论，其通过引用并入，特别包括Costa等人在表1中公开的每种标签。
多肽的氨基酸序列可以经修饰或工程改造以包含至少一种非天然存在的氨基酸，例如以增加稳定性。当通过合成方法生产多肽时，可以在生产过程中引入此类氨基酸。多肽还可以在合成或重组生产后进行修饰。还可以使用D-氨基酸来生产多肽。在这种情况下，氨基酸将以C至N方向的相反顺序连接。这是本领域生产此类多肽的常规方法。本发明的优选多肽可经工程改造以包含至少一种此类非天然或合成的氨基酸，或至少一种非L-型氨基酸。
许多侧链修饰是本领域已知的，并且可以对多肽的侧链进行修饰，前提是多肽保留本文指定的任何进一步所需的活性或特征。还应当理解，多肽可以经化学修饰，例如翻译后修饰。例如，多肽可以经糖基化、磷酸化或包含修饰的氨基酸残基。多肽可以是聚乙二醇化的。
多肽可以以基本上分离的或纯化的形式提供。也就是说，与来自表达多肽的细胞的细胞提取物中存在的大多数其他组分分离。多肽可以与载体或稀释剂(如下所述)混合，其不会干扰预期用途并且仍然被认为是基本上分离的。多肽也可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，制剂中通常包含至少90％，例如至少95％、98％或99％的蛋白质。当多肽与另外的活性组分(例如另一种多肽)一起在组合物中提供时，每种所述多肽将单独纯化至高水平的同质性，然后以适当的比例混合以用于每种多肽的预期目的。例如，在以1:1的比率组合之前，可以将两种多肽各自纯化至至少90％同质性。可以包含在与本发明的多肽的混合物中的示例性多肽可以包括以下中的任意一种或多种：外切糖苷酶；内切糖苷酶(例如EndoS、EndoS2、EndoE，包括如WO2013/037824中公开的具有内切糖苷酶活性的任何多肽)；蛋白酶(优选对本发明的多肽具有不同特异性的免疫球蛋白蛋白酶，例如WO2017/134274中公开的蛋白酶——例如如包含该文件的SEQ ID NO:3的多肽或该文件中公开的其变体)；或酰胺酶(例如，PngaseF)。
多肽可以以适合在使用前在水溶液中复溶的冻干形式提供。冻干组合物具有改善的稳定性，使得多肽能够储存更长时间。多肽通常在冷冻干燥之前经充分纯化。本文提供了制备冻干形式的多肽的方法，包括在合适的缓冲液中冷冻干燥所述多肽，所述缓冲液为例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris缓冲盐水(TBS)或另一种Tris缓冲液。还提供了冻干形式的所得多肽。还提供了制备多肽溶液的方法，包括提供冻干形式的多肽并用合适的载体或稀释剂例如水复溶。
多肽可以使用本领域已知的方法来进行固定，例如Datta S等人(Enzymeimmobilization：an overview on techniques and support materials)，3Biotech，3(1)：1-9(2013)所述。例如，可以通过吸附、共价结合、亲和固定或包埋来固定多肽。可用作支持物的材料包括但不限于，例如天然支持物(如琼脂糖、琼脂糖凝胶、胶原蛋白、明胶、纤维素、果胶、琼脂糖凝胶)，无机材料(如陶瓷、二氧化硅、玻璃、活性炭或木炭)，或合成聚合物(例如聚(苯乙烯-二乙烯基苯)或乳胶)。这些中的任一种可以以树脂或以任何其他合适的形式提供。可以将多肽固定在磁珠上。
包含多肽的组合物和制剂
另一方面，本发明提供了包含本发明的多肽的组合物。例如，本发明提供了组合物，该组合物包含一种或多种本发明的多肽和至少一种赋形剂，该赋形剂优选为防腐剂或稳定剂，以及任选的一种或多种另外的载体、稀释剂或溶媒。下表中包括示例性的赋形剂类别和单独的实例。
通常，最终组合物是无菌且无热原的。
在具体的实施方式中，在与组合物的其他成分相容并且对施用组合物的对象无害的意义上，所有的本发明赋形剂优选是药学上可接受的。在这种情况下，该组合物可以被称为药物组合物。
合适组合物的配制可以使用标准的药物制剂化学和方法进行，所有这些对于普通技术人员来说都是易于获得的。例如，可以将该药剂与防腐剂以及一种或多种载体、赋形剂或溶媒组合。辅助性物质(例如，润湿剂或乳化剂)、pH缓冲物质、还原剂等可以存在于赋形剂或溶媒中。合适的还原剂包括半胱氨酸、硫代甘油、硫氧还原蛋白、谷胱甘肽等。赋形剂、溶媒和辅助性物质通常是不会在接受该组合物的个体中诱导免疫反应并且可以施用而没有过度毒性的药学上的药剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，例如聚乙二醇、透明质酸、甘油、硫代甘油和乙醇。其中还可以包含药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。药学上可接受的赋形剂、溶媒和辅助性物质的深入讨论在《雷氏药学大全》(Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.,NJ 1991)中可获得。
此类组合物可以以适合于单次施用()或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射的组合物可以以单位剂型(例如，含防腐剂的安瓿或多剂量容器中)制备、包装或出售。组合物包括但不限于混悬剂、溶液剂、油性或水性溶媒中的乳剂、糊剂和可植入的缓释或可生物降解的制剂。此类组合物还可以包含一种或多种附加成分，包括但不限于助悬剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的组合物的一个实施方式中，活性成分以干燥(例如，粉末或颗粒)形式提供，用合适的溶媒(例如，无菌无热原水)复溶然后经肠胃外施用该复溶的组合物。组合物可以以无菌可注射的水性或油性混悬剂或溶液剂的形式制备、包装或出售。该混悬剂或溶液剂可以根据已知技术进行配制，并且可以包含除活性成分外的附加成分，例如本文所述的分散剂、润湿剂或助悬剂。此类无菌可注射制剂可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如，水或1,3-丁二醇)来制备。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发油(例如合成的甘油单酯或甘油二酯)。
其它可用的肠胃外施用的组合物包括以微晶形式、在脂质体制剂中或作为生物可降解聚合物系统组分的含有活性成分的那些组合物。用于持续释放或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。组合物可以适合于通过任何合适途径施用，包括例如皮内、皮下、经皮、肌内、动脉内、腹膜内、关节内、骨内或其它适当的施用途径。优选的组合物适合于通过静脉内输注进行施用。
多肽的使用方法
本发明的多肽、多核苷酸、表达载体和/或组合物可用于多种方法。因此，本文提供了包括将本发明的多肽、多核苷酸、表达载体和/或组合物施用至例如样品或对象中的方法。还提供了包括使IgG与本发明的多肽、多核苷酸、表达载体或组合物接触的方法。该方法可以是切割免疫球蛋白的方法，并且可以任选地还包括对切割产物进行检测或分析。该方法可以是治疗疾病的方法，该方法包括向对象施用本发明的多肽。
例如，本发明的多肽可以为生物技术提供有用的工具。多肽可用于离体切割IgG的方法中。IgG可以是人、小鼠、马或豚鼠的IgG。IgG可以是源自这些物种中任一种的重组单克隆抗体。可以将多肽施用至含有IgG的样品并且在允许免疫球蛋白蛋白酶活性出现的条件下孵育。
合适的条件包括孵育至少20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟或120分钟、3小时、5小时、10小时或过夜，通常伴随着混合，例如翻滚混合()。优选的孵育时间为约30分钟或约1小时。
孵育优选在室温下进行，更优选在约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃下进行，最优选在约37℃下进行。
上述方法可以在任何合适的pH下进行。合适的pH值包括例如约pH 6.5至约pH8.5，优选为约pH7.0至约pH 8.5，最优选为约pH 7.5。
该方法可以在任何合适的缓冲液中进行，例如Tris缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。优选不需要盐、辅因子或还原剂，尽管本发明的多肽优选地耐受存在高达200mM的盐(例如NaCl)。
本发明的多肽与样品的蛋白质含量的近似比可以为1:1、2:1、4:1、6:1、10:1、15:1、20:1、1:2、1:4或1:6、1:10、1:15、1:20、1:40、1:100、1:200、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:1500、1:2000或最高达1:2500(重量:重量)。优选的比率为1:20至1:40(重量:重量)。
可以验证特异性切割，并且使用任何合适的方法分离切割的产物，例如本文其他地方(包括实施例)或WO2003051914和WO2009033670中描述的那些。该方法尤其可用于生成Fc和F(ab’)2片段。然后可以通过对用本发明的多肽切割IgG而产生的F(ab’)2片段进行还原步骤(例如在2-巯基乙醇胺或半胱胺中进行)来产生Fab片段。
该方法还可用于检测或分析样品中的IgG，或从样品中去除IgG。用于检测样品中IgG的方法通常包括在允许结合和切割的条件下将多肽与样品一起孵育。IgG的存在可以通过检测特定的IgG切割产物来进行验证，随后可以对该特定的IgG切割产物进行分析。
多肽、多核苷酸、表达载体和/或组合物还可用于治疗或预防。在治疗性应用中，将多肽或组合物以足够用于治愈、减轻或部分阻止病症或其一种或多种症状的量施用至已经患有障碍或病症的对象。这种治疗性治疗可以导致疾病症状的严重程度降低，或增加无症状期的频率或持续时间。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效量”。在预防性应用中，将多肽或组合物以足够用于预防或延缓症状发展的量施用于尚未表现出障碍或病症的症状的对象。这样的量被定义为“预防有效量”。对象可能已通过任何合适的方式被确定为处于发展出疾病或病症的风险。因此，本发明还提供了用于在治疗人体或动物体中使用的本发明的多肽。本文还提供了预防或治疗对象中的疾病或病症的方法，该方法包括向对象施用预防或治疗有效量的本发明的多肽。多肽优选地通过静脉内输注进行施用，但是可以通过任何合适的途径施用，包括例如皮内、皮下、经皮、肌内、动脉内、腹膜内、关节内、骨内或其它适当的施用途径。施用的所述多肽的量可以是至少约0.01mg/kg体重，至少约0.05mg/kg体重、0.1mg/kg体重、0.15mg/kg体重、0.2mg/kg体重、0.2mg/kg体重或0.25mg/kg体重，最高达至多约0.5mg/kg体重，至多约1.0mg/kg体重、1.5mg/kg体重、2.0mg/kg体重或2.5mg/kg体重。任何上述下限可以与任何上限组合以提供剂量范围。该量优选地为0.2mg/kg体重至1.2mg/kg体重。
本发明的多肽可特别用于治疗或预防由IgG抗体(在本文中可被描述为致病性IgG抗体)介导的疾病或病症的方法。因此，本发明提供了用于在治疗或预防疾病或病症(特别是由致病性IgG抗体介导的疾病或病症)中使用的本发明的多肽。本发明还提供了治疗或预防疾病或病症(特别是由致病性IgG抗体介导的疾病或病症)的方法，该方法包括向个体施用本发明的多肽。该方法可以包括重复施用所述多肽。本发明还提供了在制备用于治疗或预防由病原性IgG抗体介导的疾病或病症(特别是由病原性IgG抗体介导的疾病或病症)的药物中使用的本发明的多肽。
许多自身免疫性疾病全部或部分由致病性IgG抗体介导。因此，病原性抗体通常可以对靶向自身免疫性疾病或完全或部分由IgG抗体介导的其他病症的抗原具有特异性。由抗体介导的示例性疾病和病症以及相关抗原在WO 2016/128559的表D中详细列出。本发明的多肽可用于治疗这些疾病或病症中任一种的方法中。
致病性抗体可以识别对象所接受的组织或器官移植物。因此，通过多肽治疗或预防的疾病可以是抗体介导的移植排斥反应。病原性抗体可以识别施用至对象的另一种治疗剂，例如抗体、基因疗法(例如，病毒或其他载体)、内源因子(例如，酶、生长因子或凝血因子)缺陷的替代物，或细胞疗法。因此，由多肽治疗或预防的疾病或病症可以是对象的任何抗体反应，该抗体反应降低所述治疗剂对对象的功效或益处。
本发明的多肽可特别用于治疗或预防对象中的疾病或病症，其中该对象包含预先存在的针对其他IgG蛋白酶的免疫力。例如，由于以前的酿脓链球菌感染或之前用IgG蛋白酶治疗，该对象可能包含抗IdeS或IdeZ的抗体。
本发明的方法可以包括对含有已知抗体的样品进行切割。该抗体优选为重组单克隆抗体。该抗体可以是阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿克托舒单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)、培戈-阿拉赛珠单抗(Alacizumab pegol)、ALD518、阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、阿利库单抗(Alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)、阿麦妥单抗(Amatuximab)、马安那莫单抗(Anatumomabmafenatox)、安芦组单抗(Anrukinzumab)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿替奴单抗(Atinumab)、阿特利珠单抗(Atlizumab)(＝托珠单抗(tocilizumab))、阿托木单抗(Atorolimumab)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利木单抗(Belimumab)、贝那利珠单抗(Benralizumab)、柏替木单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、贝洛托舒单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、比玛卢单抗(Bimagrumab)、比伐单抗美登素(Bivatuzumab mertansine)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、布索组单抗(Blosozumab)、本妥昔单抗(Brentuximab vedotin)、布雷奴单抗(Briakinumab)、布罗达单抗(Brodalumab)、卡那奴单抗(Canakinumab)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansine)、雷坎妥珠单抗(Cantuzumab 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merpentan)、奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)、奥卡妥珠单抗(Ocaratuzumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥拉单抗(Olaratumab)、奥洛组单抗(Olokizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、奥那妥组单抗(Onartuzumab)、莫妥组单抗(Oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥替苏单抗(Orticumab)、奥昔组单抗(Otelixizumab)、奥塞芦单抗(Oxelumab)、奥扎奈珠单抗(Ozanezumab)、奥利组单抗(Ozoralizumab)、帕昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、帕巴库单抗(Panobacumab)、帕萨妥珠单抗(Parsatuzumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、帕替组单抗(Pateclizumab)、帕曲妥单抗(Patritumab)、帕尼单抗(Pemtumomab)、培拉凯珠单抗(Perakizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、培克珠单抗(Pexelizumab)、匹地利珠单抗(Pidilizumab)、维汀-匹那妥珠单抗(Pinatuzumab vedotin)、平妥莫单抗(Pintumomab)、普拉鲁单抗(Placulumab)、泊洛妥珠单抗(Polatuzumab 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aritox)、替妥莫单抗(Tenatumomab)、替奈昔单抗(Teneliximab)、替利组单抗(Teplizumab)、替妥木单抗(Teprotumumab)、TGN1412、替西木单抗(Ticilimumab)(＝曲美木单抗(Tremelimumab))、替拉珠单抗(Tildrakizumab)、替加组单抗(Tigatuzumab)、TNX-650、托珠单抗(Tocilizumab)(＝atlizumab)、托利珠单抗(Toralizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲罗芦单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、TRBS07、曲丽珠单抗(Tregalizumab)、替西木单抗(Tremelimumab)、西莫白介素单抗(Tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌妥昔单抗(Ublituximab)、乌瑞芦单抗(Urelumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、乌司奴单抗(Ustekinumab)、伐利昔单抗(Vapaliximab)、伐利组单抗(Vatelizumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥组单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维森库单抗(Vesencumab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、玛汀-沃索妥珠单抗(Vorsetuzumab mafodotin)、伏妥莫单抗(Votumumab)、扎芦木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、扎妥昔单抗(Zatuximab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)或阿佐莫单抗(Zolimomabaritox)。
本发明的多肽可用于改善治疗性抗体或治疗剂对对象的益处的方法，例如该治疗性抗体或治疗剂的作用是通过Fc受体结合介导的。例如，本发明的多肽可以快速、暂时且安全地消除对象中通过所有或基本上所有的内源IgG进行的Fc受体结合。因此，施用的，例如随后施用的治疗性抗体(或治疗剂，例如结合Fc受体的治疗剂)会具有增强的功效，因为该治疗性抗体不需要与内源IgG竞争结合Fc受体。
以下实施例举例说明了本发明。
实施例1
除非另有说明，否则所使用的方法是标准的生物化学和分子生物学技术。合适的方法教科书的实例包括Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)(1989)和Ausubel等人，分子生物学实验室指南(Current Protocolsin Molecular Biology)(1995),John Wiley和Sons,Inc。
新蛋白酶的分析
进行了一项研究，在该研究中捕获了多种不同的啮齿动物(鼹鼠和田鼠)，并且将其链球菌物种分离和部分地进行鉴定。对其中的一种分离株(暂时称为Streptococcus)进行测序，发现其具有几种糖苷酶和蛋白酶。特别是，一个基因与IdeS的同源性很低。该基因在本文中称为IdeSORK，具有如下特征。
野生田鼠中细菌的初步鉴定
作为一项大生态项目的一部分，对瑞典南部的野生田鼠(普通田鼠(Microtusarvalis))进行咽喉拭子采集并再次释放。将拭子在4％马血琼脂平板上培养，并连续重新划线以获得纯分离株。记录菌落的颜色和形态以及溶血(α、β或γ)模式。总共分析了57种不同的分离株，选择了其中的8种明显β溶血性分离株进行进一步分析。
分离株的系统发育分析
16SDNA测序
从所有8种菌株(和已知对照菌株口腔链球菌)产生了16S基因的1541个碱基对PCR产物(图12A)。使用Sanger测序法对产物进行完整测序，并从具有已知16S序列的数据库进行查询(图12B)。
代谢特征
使用链球菌和葡萄球菌试验对所有分离株进行代谢试验。尚无结果，表明所有菌株在代谢上与已知菌种不同(作为阳性对照的酿脓链球菌、口腔链球菌和金黄色葡萄球菌被正确鉴定)。
小鼠IgG的活性试验
筛选了所有分离株针对小鼠IgG的蛋白水解活性。β13和β2003表现出对IgG的弱活性，因此被选择用于进一步分析(图12C)。
β13和β2003的全基因组测序
使用Oxford Nanopore(ONT)和Illumina测序组合对β13和β2003的基因组DNA进行测序。使用组装工具Canu来完成ONT长读段的从头组装。这导致两个基因组可以被组装成一个基因组重叠群草图。β2003还含有两个染色体外质粒。使用Nanoplish进行校正，并将Illumina读段映射到重叠群草图上。使用RAST进行基因注释。两个约2.46Mb基因组的系统发育全基因组证实，这两个菌株很可能是同一新物种的不同分离株(图12D)。当详细分析带注释的基因组时，可以在β13中发现编码推定的IgG内肽酶的基因，但在β2003中却未发现。
结论
能够从野生田鼠的喉咙中鉴定出几种新的链球菌和葡萄球菌物种。出乎意料地，β溶血性菌株β13和β2003与通常为α溶血性的口腔链球菌密切相关。迄今为止，尚未在任何口腔链球菌或其相近菌株中发现IgG蛋白酶，因此在这些菌株中发现IgG蛋白酶Xork是完全意外的。
生产及纯化
SEQ ID NO:1的全长蛋白(IdeSORK)始终低表达且纯度低(图1)。然而，缺少SEQ IDNO:1的约20kDa长的C端结构域且经工程改造为具有N端M和C端His标签的截短版本(IdeSORK2.0；SEQ ID NO:3)表现良好，可以在大肠杆菌BL21(DE3)STAR细胞中作为可溶性蛋白表达，纯度高且表达量相当高。表达和纯化遵循标准方案，在37℃培养细胞，用1mMIPTG诱导，并在诱导5小时后收获细胞。当在超声处理后纯化(Gravitrap)物质时，通常得到约5mg/g的产率。在诱导期间将温度调节至30℃可以显著提高产量，达到约9mg/g(数据未显示)。
构建体的进一步截短导致非常低的产率和低活性，而C端的添加(相对于IdeSORK2.0)更容易被接受，但部分影响产率和活性(图13B)。
活性
特异性
与IdeS(-Ctrl)不同，IdeSORK2.0没有表现出针对酪蛋白/明胶的一般蛋白酶活性的迹象(图2)，同时其水解所有测试的人IgG和IgG Fc融合蛋白(图3和图16)。IdeSORK2.0针对IgA不具有活性，这表明决定活性的不是一般免疫球蛋白结构而是较高的特异性(图3)。与IdeS类似，该酶对IgG1的偏向性略高于IgG2，并且该酶还可以水解单克隆IgG4。对于小鼠IgG，该蛋白酶针对mIgG2a具有活性，但针对mIgG1或mIgG2b没有活性。人抗体铰链区(例如LALA序列)的改变不会影响IdeSORK2.0的活性。与多克隆IgG(例如IVIG)一起孵育导致几乎完全水解，这表明该酶不仅限于特定的单克隆抗体，还可以水解所有人IgG。针对更多种动物IgG(猪、马、狗、大鼠、豚鼠、绵羊、牛)的进一步测试仅仅显示出针对马IgG和豚鼠IgG的活性(图11)。
IdeSORK2.0针对变性和还原的IgG不具有活性(图17)。
蛋白酶抑制剂的敏感性
IdeS被表征为一种半胱氨酸蛋白酶，因此不受E64以外的大多数蛋白酶抑制剂的影响。本文鉴定出的新蛋白酶的酶促机制尚未充分表征，但IdeSORK2.0对许多蛋白酶抑制剂高度敏感，包括已知的丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(图4)。然而，该酶不依赖于阳离子，并且不受EDTA存在的影响(图4)。
水解位点
通过IdeSORK2.0对几种底物(IgG1、IgG2、融合蛋白、LALA突变IgG)进行水解，并通过LC-MS鉴定水解位点。如图5所示，仅检测到单一水解位点，该水解位点在所有序列中都相同，并且对应于人IgG1铰链/CH2区(参见以上表1和下表)。该位点与IdeS识别的位点相同。已经证实了依那西普、曲妥珠单抗、西妥昔单抗以及两种非商业单克隆抗体的水解位点。
作用机制
已知IdeS首先水解抗体的一条链，并且在该链水解后，IdeS对第二条链具有较低的亲和力。因此，许多抗体在反应开始时可能仅受到部分水解。IdeSORK2.0还生成单链切割的片段，但其中很大一部分很快进行加工为完全切割(图6)。尚未确定针对第二条链的亲和力，但是明显的是每次由一条链介导活性。
最佳条件
使用Box-Behnken实验设计来评估IdeSORK2.0的最佳条件，以评估多个因素及其相互依赖性。分析了pH、NaCl和温度对蛋白酶的重要性，结果总结于图7。IdeSORK2.0在pH7.0-8.5时具有高活性，并且耐受最高至200mM的NaCl，而活性没有显著下降。与室温相比，在37℃下孵育时活性提高。酶促反应主要由底物浓度驱动(高浓度对反应有利)，而酶浓度其次。这也可以看作是，即使在长时间孵育后，低百分比IgG也不易于水解(图9)。总结：最适pH(范围)：7.5(6.5-8.5；>90％活性)，最适NaCl(范围)：0mM(0-200mM；>90％活性)，不需要辅因子或还原剂，具有针对IgG的高特异性。
时间-剂量测定
为了研究底物和酶浓度以及完成(>95％水解)反应所需时间的影响，设计了一项新的Box-Behnken测定(图8)。传统测定法支持该数据的，具有相似的结果(图9)。IdeSORK2.0相当快速地水解绝大多数物质，但需要更长的时间才能完成完整IgG的最后百分比的水解，与其他免疫球蛋白蛋白酶类似。1:40的比率可以在30-60分钟内水解>95％的IgG。
与其他IgG蛋白酶的比较
为了进一步研究IdeSORK2.0的活性，将IdeSORK2.0与IdeS和IdeZ针对IgG1和IgG2的活性进行了比较。所有酶能以似乎相同的方式水解抗体，但效率略有不同(图10)。
与其他IgG蛋白酶的序列比较
将IdeSORK、IdeSORK2.0、IdeS和IdeZ的序列进行Clustal W比对(图13A)。尽管IdeSORK2.0的长度与IdeS相当，但是在比对序列中，IdeSORK2.0与IdeS的同一性仅为25％左右，相似性为42％，明显低于IdeS和IdeZ之间的相似性。IdeS和IdeZ彼此之间的同一性为62％，相似性为74％，并在系统发育树中聚类在一起(图14B)。IdeSORK和截短形式IdeSORK2.0彼此相关，但与IdeS和IdeZ关系较远。
图14显示了IdeSORK2.0(Xork)与其他已知IgG水解酶的相似性和同一性百分比，以及Xork与IdeS和IdeZ的氨基酸序列比对。
人血清中IgG水解酶的活性
与IdeS和IdeZ类似，在存在人血清的情况下，IdeSORK2.0表现出免疫球蛋白切割活性(图15)。这表明IdeSORK2.0在临床中具有应用价值。
IVIG中抗IgG水解酶抗体的普遍程度
通过ELISA评估了人群中抗IgG水解酶抗体的普遍程度，并评估了IVIG与IdeS、IdeZ和IdeSORK2.0结合的蛋白质印迹分析(图18A和图18B)。针对IdeS的抗体很普遍。与IdeZ结合的抗体明显更少，与IdeSORK2.0结合的抗体甚至更少。IdesSORK2.0与IVIG的反应性非常低，表明抗IdesSORK2.0抗体在人类中并不常见。
材料与方法
重组蛋白的表达与纯化
根据制造商的说明(Invitrogen)，将载体(20ng)转化至化学感受态大肠杆菌BL21DE3 STAR细胞中。IdeSORK1.0的载体序列以SEQ ID NO:18提供，IdeSORK2.0的载体序列以SEQ ID NO:19提供。使用的载体是pet21a+。将在37℃、200rpm下在补充有100μg/mL氨苄青霉素的LB中过夜生长的细菌培养物以1:40的比率接种到新鲜的LB(补充有100μg/mL氨苄青霉素)中。持续孵育，直至达到约0.6-0.8的OD600，在此时将温度降低至30℃，并通过添加1mM IPTG来诱导蛋白质表达。表达持续5小时直到收集细胞，并将细胞储存在-20℃直至进一步处理。
将冷冻细胞解冻，并重新悬浮于结合缓冲液(5mL/g细胞；20mM磷酸钠pH 7.4，500mM氯化钠，20mM咪唑)中，然后通过超声处理进行裂解。通过离心(11000g，20分钟，4℃)去除不溶性细胞碎片，并使用预平衡的His GraviTrap纯化裂解物，然后在PD10柱上将缓冲液更换为TBS。所有材料均在SDS-PAGE和Nanodrop上进行分析，以确定产品的纯度和质量。
使用LC-MS确定特异性
使亚基片段变性并还原，然后进行反相LC-MS分析。使用BioResolve RP mAb多酚，2.7μm2.1×100mm，Waters(0.1％甲酸的水溶液以及0.1％甲酸的95％乙腈溶液作为流动相)来实现分离，并在与Bruker Impact IIQTOF质谱仪连接的Agilent 1260/1290UHPLC系统上运行。在Bruker Compass数据分析软件中评估获得的数据，其中使用MaxEnt算法进行反卷积，并使用SNAP算法确定单同位素分子量。
一般蛋白酶活性的确定
根据制造商的说明，使用EnzChek蛋白酶测定试剂盒来确定一般蛋白酶活性。使用一般性蛋白酶FabULOUS(SpeB，5μg)作为阳性对照，使用IgG特异性蛋白酶FabRICATOR(IdeS，10μg)作为阴性对照。添加IdeSORK2.0至10μg的总量。
蛋白酶抑制剂的测定
将IgG1(曲妥珠单抗)与一组蛋白酶抑制剂(G-Biosciences)预先孵育，然后添加IdeSork2.0(SEQ ID NO:3)(1:5)，并将混合物在37℃下孵育过夜，随后进行SDS-PAGE分析。
免疫球蛋白的特异性
在进行SDS-PAGE分析之前，将各种抗体和基于抗体的治疗剂与Xork、IdeS或IdeZ以1:40的比率在37℃下于PBS中孵育1小时，底物浓度范围在2mg/mL至5mg/mL之间。对于动力学研究，在UHPLC系统上进行分析之前，在37℃下10分钟内使用2-200μM IVIG的底物水平。
将已经尿素变性并还原的IgG与IgG特异性酶以1:10的E:S比一起孵育，在37℃下孵育5小时，随后进行SDS-PAGE分析。
对于血清活性测定，使用1:40的E:S比(假设血清中含有10mg/mL的IgG)，在37℃下孵育0-4小时，随后进行非还原SDS-PAGE分析。所有酶均由Genovis AB供应。
活性测定
为了更好地了解酶发挥其活性所需的最佳条件，实验采用了Box-Behnken设计。研究参数包括添加NaCl(0-400mM)、pH(5.5-8.5)、[酶]、[底物]、时间和温度。除非另有说明，所有实验以1:20的酶:底物比于37℃下在TBS中进行1小时。
ELISA
将蛋白质(IdeS、IdeZ、Xork；0.5-2μg/mL)在50mM NaHCO3 pH 9.6中加热(70℃，10分钟)使其变性。将酶以一式三份添加到96孔板(Maxisorb，NUNC)中，并在4℃下孵育过夜。将孔在TBST脱脂奶(5％)中室温封闭2小时，洗涤，并添加在TBST脱脂奶中稀释的一抗(IVIG；0.005mg/mL)(1小时，37℃)。清洗板，然后加入二抗(抗人IgG-HRP，1:3000)，在37℃下继续孵育1小时。清洗孔，然后添加100μl的TMB单一溶液。将板在酶标仪中室温孵育，连续读数45分钟，测量650nm处的吸光度。
蛋白质印迹
在SDS-PAGE上分离出IdeS、IdeZ和Xork(0.1-2.5μg)，并将其转移到膜上。在4℃下以TBST脱脂奶(5％)进行过夜封闭后，添加一抗(IVIG，5μg/mL)，并在室温下孵育2小时。清洗膜，添加二抗(抗人IgG-HRP，1:1000)。彻底清洗膜，然后添加SuperSignal West PicoPlus化学发光底物。在ChemiDoc中测量信号。
序列
SEQ ID NO:1(IdeSORK)，从Streptococcus分离的蛋白酶的全长序列。
LSKRKLLKKIEKKDTSSVLTQKKQTKTLWADGVQVDDKDFKPSTENFGTNYLAAEYGIGKGYYDINKKFDGTDDDLCSGVVAANQLHWWLDRNKDYIEKYRQQSKDNGVTIGNTDIFELNKLHDEDQSNFFDFIKKSFGNKFLQPERLLNMYINGYGYLTSQDKAKTSQPSPSKLNFFQKVFKNNLLTDKTPINDIDEFSSQTKNALQNHKVLAVSFASIKNRGLGHVVTVWGADFDENGKVVALYVTDSDDRSKNIGNAKLGMKKLRIEVSAQDSSTIKLTGFEDKNSGGSLRHLYSLSTGEQIWKKYFEETEKERIRLEEEADKAKLEQDRIQKEAEEKLALEKAEKERIRLEEEADKAKLEQDRIQKEAEEKLALEKAEKERIRLEEEADKAKLEQDRIQKEAEEKLALEKAEKERIRLEEEADKAKLEQDRIQKEAEEKLALEKAEKERIRLEEEAAKAKLEQEKQIATAPQPDKKQENTTSEQEKPAPTELPPLVNKADETETPRETAPDQTPSATNTFRKILPKMNAVSQFFSQLMGTIQIVFAFILKIFK
SEQ ID NO:2，具有免疫球蛋白蛋白酶活性的IdeSORK的N端片段。
SKRKLLKKIEKKDTSSVLTQKKQTKTLWADGVQVDDKDFKPSTENFGTNYLAAEYGIGKGYYDINKKFDGTDDDLCSGVVAANQLHWWLDRNKDYIEKYRQQSKDNGVTIGNTDIFELNKLHDEDQSNFFDFIKKSFGNKFLQPERLLNMYINGYGYLTSQDKAKTSQPSPSKLNFFQKVFKNNLLTDKTPINDIDEFSSQTKNALQNHKVLAVSFASIKNRGLGHVVTVWGADFDENGKVVALYVTDSDDRSKNIGNAKLGMKKLRIEVSAQDSSTIKLTGFEDKNSGGSLRHLYSLSTGEQIWKKYFEET
SEQ ID NO:3(IdeSORK2.0)，SEQ ID NO:2经工程改造以包含N端的另外甲硫氨酸和C端的蛋白质纯化标签-His6的蛋白质。
MSKRKLLKKIEKKDTSSVLTQKKQTKTLWADGVQVDDKDFKPSTENFGTNYLAAEYGIGKGYYDINKKFDGTDDDLCSGVVAANQLHWWLDRNKDYIEKYRQQSKDNGVTIGNTDIFELNKLHDEDQSNFFDFIKKSFGNKFLQPERLLNMYINGYGYLTSQDKAKTSQPSPSKLNFFQKVFKNNLLTDKTPINDIDEFSSQTKNALQNHKVLAVSFASIKNRGLGHVVTVWGADFDENGKVVALYVTDSDDRSKNIGNAKLGMKKLRIEVSAQDSSTIKLTGFEDKNSGGSLRHLYSLSTGEQIWKKYFEETHHHHHH
SEQ ID NO:4至10是人和小鼠的多种IgG亚类的铰链/CH2区的序列。
| 亚类 | 铰链/CH2序列 | SEQ ID | 亚类 | 铰链/CH2序列 | SEQ ID |
| 人 | 小鼠 | ||||
| IgG1 | CPPCPAPELLGGPSVF | 4 | IgG1 | PCICTVPEVSSVF | 10 |
| IgG2 | CPPCPAPPVAGPSVF | 5 | IgG2a | CPPCAAPNLLGGPSVF | 8 |
| IgG3 | CPRCPAPELLGGPSVF | 6 | IgG2b | CHKCPAPNLEGGPSVF | 11 |
| IgG4 | AHHAQAPEFLGGPSVF | 7 | IgG3 | GSSCPAGNILGGPSVF | 9 |
SEQ ID NO:12，全长IdeS，还以NCBI参考序列号WP_010922160.1公开。
MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:13，成熟的IdeS，还以Genbank登录号ADF13949.1公开。
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:14，全长IdeZ，还以NCBI参考序列号WP_014622780.1公开。
MKTIAYPNKPHSLSAGLLTAIAIFSLASSNITYADDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:15，成熟的IdeZ。
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:16是编码SEQ ID NO:1经工程改造用于表达N端组氨酸和C端His6的多肽的示例性核苷酸序列。
ATGAGCAAGCGTAAACTGCTGAAGAAAATCGAGAAGAAAGACACCAGCAGCGTGCTGACCCAGAAGAAACAAACCAAGACCCTGTGGGCGGATGGCGTGCAGGTTGACGATAAGGACTTCAAACCGAGCACCGAAAACTTTGGTACCAACTACCTGGCGGCGGAGTATGGTATCGGCAAGGGTTACTACGATATCAACAAGAAGTTCGACGGCACCGACGATGACCTGTGCAGCGGTGTGGTTGCGGCGAACCAGCTGCACTGGTGGCTGGATCGTAACAAGGACTACATTGAAAAATATCGTCAGCAAAGCAAGGATAACGGCGTGACCATCGGTAACACCGACATTTTCGAACTGAACAAACTGCACGATGAGGACCAGAGCAACTTCTTTGATTTCATCAAGAAAAGCTTCGGCAACAAGTTTCTGCAACCGGAGCGTCTGCTGAACATGTACATTAACGGCTACGGTTATCTGACCAGCCAGGATAAGGCGAAAACCAGCCAACCGAGCCCGAGCAAGCTGAACTTCTTTCAGAAGGTTTTCAAAAACAACCTGCTGACCGACAAAACCCCGATCAACGATATTGACGAATTTAGCAGCCAGACCAAGAACGCGCTGCAAAACCACAAAGTGCTGGCGGTTAGCTTCGCGAGCATCAAGAACCGTGGCCTGGGTCACGTGGTTACCGTGTGGGGCGCGGATTTTGACGAGAACGGTAAAGTGGTTGCGCTGTATGTTACCGACAGCGATGACCGTAGCAAGAACATTGGCAACGCGAAACTGGGTATGAAGAAACTGCGTATCGAAGTGAGCGCGCAGGATAGCAGCACCATTAAGCTGACCGGCTTCGAGGACAAAAACAGCGGTGGCAGCCTGCGTCACCTGTACAGCCTGAGCACCGGTGAACAAATCTGGAAGAAGTACTTCGAGGAAACCGAAAAGGAGCGTATTCGTCTGGAGGAAGAGGCGGATAAGGCGAAACTGGAACAGGACCGTATCCAAAAAGAGGCGGAAGAGAAACTGGCGCTGGAAAAGGCGGAAAAAGAGCGTATCCGTCTGGAAGAGGAAGCGGACAAAGCGAAGCTGGAACAAGACCGTATTCAAAAAGAGGCGGAGGAAAAACTGGCGCTGGAGAAAGCGGAGAAGGAACGTATCCGCCTGGAGGAAGAGGCGGACAAAGCGAAACTGGAACAAGATCGCATTCAGAAAGAGGCGGAGGAGAAGCTGGCGCTGGAAAAAGCGGAGAAGGAGCGCATTCGCCTGGAAGAGGAAGCGGATAAAGCGAAGCTGGAACAGGATCGCATCCAGAAAGAGGCGGAAGAGAAGCTGGCGCTGGAGAAGGCGGAGAAGGAGCGTATCCGACTGGAGGAAGAGGCGGCGAAAGCTAAACTGGAACAAGAAAAACAAATTGCGACCGCGCCGCAGCCGGACAAGAAACAAGAAAACACCACCAGCGAACAGGAGAAACCGGCGCCGACCGAGCTGCCGCCGCTGGTTAACAAAGCGGATGAAACCGAGACCCCGCGTGAGACCGCGCCGGACCAAACCCCGAGCGCGACCAACACCTTCCGTAAGATCCTGCCGAAAATGAACGCTGTGAGCCAGTTCTTTAGCCAACTGATGGGTACCATCCAGATTGTTTTCGCGTTTATCCTGAAGATTTTTAAAGGCAGCGGTCATCACCACCACCACCACTAA
SEQ ID NO:17是编码SEQ ID NO:2经工程改造用于表达N端组氨酸和C端His6的多肽的示例性核苷酸序列。SEQ ID NO:17编码SEQ ID NO:3。
ATGAGCAAGCGTAAACTGCTGAAGAAAATCGAGAAGAAAGACACCAGCAGCGTGCTGACCCAGAAGAAACAAACCAAGACCCTGTGGGCGGATGGCGTGCAGGTTGACGATAAGGACTTCAAACCGAGCACCGAAAACTTTGGTACCAACTACCTGGCGGCGGAGTATGGTATCGGCAAGGGTTACTACGATATCAACAAGAAGTTCGACGGCACCGACGATGACCTGTGCAGCGGTGTGGTTGCGGCGAACCAGCTGCACTGGTGGCTGGATCGTAACAAGGACTACATTGAAAAATATCGTCAGCAAAGCAAGGATAACGGCGTGACCATCGGTAACACCGACATTTTCGAACTGAACAAACTGCACGATGAGGACCAGAGCAACTTCTTTGATTTCATCAAGAAAAGCTTCGGCAACAAGTTTCTGCAACCGGAGCGTCTGCTGAACATGTACATTAACGGCTACGGTTATCTGACCAGCCAGGATAAGGCGAAAACCAGCCAACCGAGCCCGAGCAAGCTGAACTTCTTTCAGAAGGTTTTCAAAAACAACCTGCTGACCGACAAAACCCCGATCAACGATATTGACGAATTTAGCAGCCAGACCAAGAACGCGCTGCAAAACCACAAAGTGCTGGCGGTTAGCTTCGCGAGCATCAAGAACCGTGGCCTGGGTCACGTGGTTACCGTGTGGGGCGCGGATTTTGACGAGAACGGTAAAGTGGTTGCGCTGTATGTTACCGACAGCGATGACCGTAGCAAGAACATTGGCAACGCGAAACTGGGTATGAAGAAACTGCGTATCGAAGTGAGCGCGCAGGATAGCAGCACCATTAAGCTGACCGGCTTCGAGGACAAAAACAGCGGTGGCAGCCTGCGTCACCTGTACAGCCTGCATCACCACCACCACCACTAA
SEQ ID NO:18是包含SEQ ID NO:16序列的示例性表达载体序列。载体是pET21a+。基因呈灰色阴影。
SEQ ID NO:19是包含SEQ ID NO:17序列的示例性表达载体序列。载体是pET21a+。基因呈灰色阴影。
Claims (23)
1.一种多肽，任选为工程改造的多肽，所述多肽具有免疫球蛋白蛋白酶活性，其中所述多肽包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：
(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:1序列的N端片段的氨基酸序列；
(d)与(a)、(b)或(c)中任一项的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽经工程改造以包含在N端的附加甲硫氨酸和/或在C端的蛋白质纯化标签或其他标签，所述标签可以通过接头连接至C端。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有针对包含SEQ ID NO:4至8任一所示的CH2/铰链序列的任何免疫球蛋白分子的蛋白酶活性，其中所述多肽在与根据Kabat编号系统的人IgG的第249位和第250位(根据EU编号系统的第236位和第237位)对应的位点之间切割所述CH2/铰链序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有针对IgG的蛋白酶活性，所述IgG可以为人的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，小鼠的IgG2a或IgG3，或者来自豚鼠或马的IgG。
6.一种多核苷酸或表达载体，包含编码前述权利要求中任一项所述的多肽的核酸序列。
7.一种宿主细胞，包含权利要求6所述的多核苷酸或表达载体，所述宿主细胞优选是细菌细胞，优选不是链球菌物种的细胞，并且最优选是大肠杆菌细胞。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述多肽以溶液、冻干或固定化的形式提供，任选地所述多肽与有效量的至少一种赋形剂一起提供，所述赋形剂优选为防腐剂。
9.一种组合物，包含根据权利要求1至5中任一项所述的多肽和至少一种赋形剂，所述赋形剂优选为防腐剂；任选地，其中所述组合物是药学上可接受的。
10.一种方法，包括将权利要求1至5中任一项所述的多肽施用至其中存在IgG的样品或对象中。
11.一种体外方法，包括将根据权利要求1至5中任一项所述的多肽施用至其中存在IgG的样品中。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述方法用于对样品中的IgG进行离体切割，并且所述方法包括将所述多肽施用至所述样品中以及在适合IgG蛋白酶活性的条件下孵育。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法还包括对所得到的切割产物进行分离、检测或分析，和/或其中所述方法生成Fc片段和Fab片段。
14.一种方法，包括将根据权利要求6所述的多核苷酸或表达载体施用至其中存在IgG的样品或对象中。
15.一种方法，包括将根据权利要求9所述的组合物施用至其中存在IgG的样品或对象中。
16.根据权利要求10、14或15任一项所述的方法，其中所述方法用于预防或治疗对象中的疾病或病症，并且所述方法包括向所述对象施用预防或治疗有效量的所述多肽、所述多核苷酸、所述表达载体或所述组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病或病症是全部或部分由致病性IgG抗体介导的疾病或病症。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述疾病或病症是(i)全部或部分由IgG抗体介导的自身免疫性疾病；(ii)IgG介导的对所述对象接受的器官或组织移植物的排斥反应；或(iii)IgG介导的对施用至所述对象的治疗剂的抗药物反应。
19.权利要求1至5中任一项所述的多肽、权利要求6所述的多核苷酸或表达载体、或权利要求9所述的组合物，其用于治疗或预防对象内疾病或病症的用途。
20.权利要求1至5中任一项所述的多肽、权利要求6所述的多核苷酸或表达载体、或权利要求9所述的组合物在制备用于治疗或预防对象内疾病或病症的药物中的用途。
21.根据权利要求19所述用途的多肽、多核苷酸、表达载体或组合物，或根据权利要求20所述的用途，其中所述疾病或病症是全部或部分由致病性IgG抗体介导的疾病或病症。
22.根据权利要求19所述用途的多肽、多核苷酸、表达载体或组合物，或根据权利要求20所述的用途，其中所述疾病或病症是(i)全部或部分由IgG抗体介导的自身免疫性疾病；(ii)IgG介导的对所述对象接受的器官或组织移植物的排斥反应；或(iii)IgG介导的对施用至所述对象的治疗剂的抗药物反应。
23.一种用于改善治疗剂对对象的益处的方法，所述治疗剂例如为治疗性抗体，所述方法包括施用根据权利要求1至5中任一项所述的多肽、根据权利要求6所述的多核苷酸或表达载体、或根据权利要求9所述的组合物，所述方法包括i)向所述对象施用预防或治疗有效量的所述多肽、所述多核苷酸、所述表达载体或所述组合物，以及ii)向所述对象施用(例如，随后施用)治疗剂(例如，治疗性抗体)。
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