JP2024516178A - 免疫グロブリン切断酵素 - Google Patents

Abstract

本発明は、免疫グロブリン、特にヒトＩｇＧに対してプロテアーゼ活性を示す新規なポリペプチド、ならびにインビボ、インビトロおよびエキソビボでのその使用に関する。上記ポリペプチドの使用は、ＩｇＧの分析および抗体フラグメントの生成のための方法、ならびにＩｇＧによって媒介される疾患および状態の防止または処置のための方法を含む。本発明者らは、新規なポリペプチドを同定、精製および特徴付けした。上記ポリペプチドは、多数の齧歯類における試験の一部として単離された、以前は未知であった連鎖球菌種において同定された。

Description

発明の分野
本発明は、免疫グロブリン、特にヒトＩｇＧに対してプロテアーゼ活性を示す新規なポリペプチド、ならびにインビボおよびエキソビボでのその使用に関する。上記ポリペプチドの使用は、ＩｇＧの分析および抗体フラグメントの生成のための方法、ならびにＩｇＧによって媒介される疾患および状態の防止または処置のための方法を含む。

発明の背景
ＩｄｅＳ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリンＧ分解酵素（イムリフィダーゼ（ｉｍｌｉｆｉｄａｓｅ）としても公知）は、ヒトの病原体であるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓによって生成される細胞外システインプロテアーゼである。ＩｄｅＳは、非常に高い程度の基質特異性を有し、その唯一の同定された基質は、ＩｇＧである。ＩｄｅＳは、ヒトＩｇＧの全てのサブクラスの重鎖の下側のヒンジ領域において１つのタンパク質分解性切断を触媒する。ＩｄｅＳはまた、種々の動物においてＩｇＧのいくつかのサブクラスの重鎖の同等の切断を触媒する。ＩｄｅＳは、２段階機序を介して、ＩｇＧをＦｃおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントへと効率的に切断する。第１の段階では、ＩｇＧの１個の（第１の）重鎖が、１個の非共有結合的に結合したＦｃ領域を有する１個の切断されたＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）分子を生成するために切断される。上記ｓｃＩｇＧ分子は、実際は、元のＩｇＧ分子の残っている（第２の）重鎖を保持する中間生成物である。上記機序の第２の段階では、この第２の重鎖は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントおよびホモダイマーのFcフラグメントを放出するためにＩｄｅＳによって切断される。これらは、生理学的条件下で概して観察される生成物である。ホモダイマーのＦｃは、その構成要素のモノマーへと解離し得る。還元条件下では、上記Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、２つのＦａｂフラグメントへと解離し得る。ＩｄｅＳのＩｇＧ切断能力は、エキソビボで、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｃフラグメントを生成するための方法において有用性を有することが示されており、例えば、ＩｇＧの分析およびＦ（ａｂ’）_２フラグメントのインビトロでの生成のために使用され得る。例えば、ＷＯ２００３０５１９１４およびＷＯ２００９０３３６７０を参照のこと。ＩｄｅＳおよびＩｄｅＳの改変によって発生したＩｇＧ切断タンパク質はまた、治療剤としてインビボでの有用性を有することが示されている。例えば、ＷＯ２００６１３１３４７、ＷＯ２０１３１１０９４６、ＷＯ２０１６０１２２８５、ＷＯ２０１６１２８５５８、およびＷＯ２０１６１２８５５９を参照のこと。このようなタンパク質は、この文脈において有用である。なぜならそれらは、疾患を媒介するかまたは別の点で望ましくないＩｇＧ分子のインビボでの切断の能力があるからである。ＩｇＧの除去は有益であり得る。なぜならＩｇＧは、多くの自己免疫状態の病理および移植した器官の急性拒絶に寄与し、抗薬物応答にも寄与し得るからである。所定の治療剤に対して特異的な抗体は、その有効性を低減させ得る。これは、抗体ベースの治療薬、遺伝子治療ベクター、および例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用する養子細胞移入（ＡＣＴ）免疫療法を含む細胞治療の場合に特に該当する。言い換えると、ＩｄｅＳおよびＩｄｅＳの改変によって発生したＩｇＧ切断タンパク質は、ＩｇＧによって全体的にまたは部分的に媒介される任意の疾患または状態のための治療として使用され得、その状態は、抗薬物応答を含み得る。

しかし、ＩｄｅＳは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの病原性因子であり、これは、扁桃炎および連鎖球菌性咽頭炎のような一般的な感染症の原因である。よって、大部分のヒト被験体は、この文脈においてＩｄｅＳに遭遇したことがあり、血流中に抗ＩｄｅＳ抗体を有する可能性が高く、このことは、治療剤としてのその有用性を低減する可能性がある。

ＩｄｅＺは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｓｐ． ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ（ウマにおいて優勢に見出される細菌）によって生成されるＩｇＧシステインプロテアーゼである。ＩｄｅＺは、ＩｄｅＳとおよそ６６％の同一性を有する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｓｐ． ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓは、ヒトの病原体ではないことから、ＩｄｅＺは、ＩｄｅＳベースの治療の選択肢であると考えられた。なぜならヒトは、ＩｄｅＺに対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）がほとんどまたは全くない可能性があるからである。しかし、ＩｄｅＺは、特にＩｇＧ２を切断する場合に、ＩｄｅＳのものよりかなり低いが、ヒトＩｇＧに対してあるレベルのＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する。

上記で概説した免疫グロブリン切断酵素の多数の適用を考慮すると、免疫グロブリン、特にヒトＩｇＧを切断する能力があるさらなる薬剤が明らかに必要である。

国際出願第２００３／０５１９１４号 国際出願第２００９／０３３６７０号 国際出願第２００６／１３１３４７号 国際出願第２０１３／１１０９４６号 国際出願第２０１６／０１２２８５号 国際出願第２０１６／１２８５５８号 国際出願第２０１６／１２８５５９号

発明の要旨
本発明者らは、新規なポリペプチドを同定、精製および特徴付けした。上記ポリペプチドは、多数の齧歯類における試験の一部として単離された、以前は未知であった連鎖球菌種において同定された。単離された１つの特定の種、仮称Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｋｒoeｓｕｓを配列決定したところ、いくつかのグリコシダーゼおよびプロテアーゼを発現することが見出された。驚くべきことに、ポリペプチドは、口腔内連鎖球菌において同定された。ＩｇＧプロテアーゼは、今日まで、口腔内連鎖球菌のいずれにおいても見出されてこなかった。

およそ５６．４ｋＤａの、５５７アミノ酸からなるポリペプチドを同定した。これを、ＩｄｅＳＯＲＫと本明細書で言及する。全長配列は、配列番号１に示される。ＩｄｅＳＯＲＫの配列は、他の公知のＩｇＧシステインプロテアーゼのものとはかなり異なり、ＩｄｅＳＯＲＫは、系統分析においてＩｄｅＳおよびＩｄｅＺとは別個にクラスター化される。さらに、全長配列は、発現するのが比較的困難である。しかし、本発明者らは、全長配列のＮ末端フラグメントが、免疫グロブリン切断活性を保存しつつ、有意に増強された発現を有することを見出した。例えば、配列番号２の配列は、配列番号１のＮ末端に由来する３１２アミノ酸からなる。より良好な発現および精製のために操作（Ｎ末端メチオニンおよびＣ末端タンパク質精製タグであるＨｉｓ６の付加）された配列番号２の配列のあるバージョンからなるポリペプチドは、本明細書でＩｄｅＳＯＲＫ２．０（またはＸｏｒｋ）といわれ、その配列は、配列番号３に示される。

ＩｄｅＳＯＲＫ２．０は、ヒト血清の存在下で免疫グロブリン切断活性を有する。さらに、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０に対する既存の免疫がほとんどない。従って、非常に有利なことに、本発明は、ＩｄｅＳ／ＩｄｅＺに対する既存の免疫に起因して処置から現在排除されている患者の処置を可能にする。

本明細書において：
免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、必要に応じて操作されたポリペプチドであって、ここで上記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１の配列のＮ末端フラグメントであるアミノ酸配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列、
を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドが提供され、
必要に応じて上記ポリペプチドは、Ｎ末端においてさらなるメチオニン、および／またはＣ末端においてタンパク質精製もしくは他のタグであって、上記タグは、リンカーによってＣ末端に結合され得るタグ、を含むように操作される。

上記ポリペプチドは、代表的には、有効量の保存剤を含む組成物において提供され得る。上記ポリペプチドは、固定化され得る。

本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドまたは発現ベクターがまた、提供される。

本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン、代表的にはＩｇＧを切断するための種々の方法において有用である。従って、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物を、例えば、ＩｇＧが存在するサンプルまたは被験体に投与する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。ＩｇＧと、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物とを接触させる工程を包含する方法がまた、提供される。上記方法は、免疫グロブリンを切断する方法であってもよく、必要に応じて、上記切断生成物の検出または分析をさらに含んでいてもよい。上記方法は、疾患を処置する方法であって、上記方法は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物を被験体に投与する工程を包含する方法であり得る。

図１：ＩｄｅＳｏｒｋの発現および精製。全長タンパク質（１．０）を、約７０ｋＤａタンパク質として発現するが、発現は不十分である。Ｃ末端を短縮したＩｄｅＳｏｒｋ（２．０）は、約３６ｋＤａタンパク質として発現する。いくつかの物質は、指定の生成プロトコールを使用して不溶性（ペレット）であるが、大部分は、可溶化され得（上清）、高純度および高収量になるようにアフィニティー精製され得る。 図２．一般的なプロテアーゼ活性（ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）。一般的なプロテアーゼ活性を、基質としてカゼインを使用して、ＥｎｚＣＨＥＣＫプロテアーゼアッセイで測定した。陽性コントロールＦａｂＵＬＯＵＳは、高いシグナルを与える一般的なプロテアーゼ（ＳｐｅＢ）であるが、陰性コントロールＦａｂＲＩＣＡＴＯＲは、ＩｇＧ特異的プロテアーゼ（ＩｄｅＳ）であり、従って、ほとんどシグナルを与えない。ＩｄｅＳｏｒｋ ２．０は、アッセイにおいていかなる測定可能なシグナルをも与えず、より特異的な酵素を示す。 図３．ＩｄｅＳｏｒｋ２．０の特異性。ＩｄｅＳｏｒｋ２．０を、種々の抗体と混合し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分析の前に、３７℃において一晩インキュベートした。その酵素自体は、矢印で注意される。全てのヒトＩｇＧ、またはＩｇＧに基づく融合タンパク質は、ＩｄｅＳｏｒｋ２．０によって加水分解された一方で、マウスに由来するＩｇＧ２ａのみが、加水分解できた。マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ｂおよびヒトＩｇＡは、ＩｄｅＳｏｒｋ２．０によって影響を及ぼされなかった。 同上。 図４．ＩｄｅＳｏｒｋ２．０のプロテアーゼインヒビター感受性。ＩｄｅＳｏｒｋ２．０は、アプロチニン、ＥＤＴＡ、およびペプスタチン以外は、大部分のプロテアーゼインヒビターによって阻害される。ベスタチンはまた、その酵素に対して部分的にのみ阻害性である。 図５．ＩｄｅＳｏｒｋ２．０は、ＩｄｅＳと同一の部位においてＩｇＧのヒンジを加水分解する。市販のおよび市販されていない生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）を、ＩｄｅＳｏｒｋ２．０で加水分解し、加水分解生成物を、ＬＣ－ＭＳを使用して分析した。全ての場合において、加水分解は、ＩｄｅＳが認識するものと同じ部位に相当するヒンジ領域中の単一の部位においてのみ観察された。 図６．ＩｄｅＳｏｒｋ２．０は、２工程機序においてＩｇＧに作用する。ＩｄｅＳｏｒｋ２．０が、ＩｇＧの両方の重鎖を同時に加水分解しているのか、またはそれらに対して個々に作用しているのかを調査するために、本発明者らは、トラスツズマブをＩｄｅＳｏｒｋ２．０とともにインキュベートし（１：２０）、０～６０分間インキュベートし、その後、非還元的ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。大部分のＩｇＧは、最初の数分以内に加水分解され、１本の鎖および２本の鎖が加水分解される。これは、２工程反応であることを示す。 図７．ＩｄｅＳｏｒｋ２．０至適条件。ＩｄｅＳｏｒｋ２．０の至適緩衝液組成を、ｐＨ、ＮａＣｌおよび温度の影響を測定するＢｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ実験デザインを使用して決定した。出力は、ＩｇＧの加水分解パーセンテージとして測定した。 同上。 同上。 図８．ＩｄｅＳｏｒｋ２．０酵素：基質比。反応速度に関する酵素および基質濃度の影響を、Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ実験環境を使用して調査し、反応速度に関する時間の影響もまた分析した。出力を、ＩｇＧの加水分解パーセンテージ（左上の図）、および単位酵素あたりの加水分解されたＩｇＧの量（他の全ての図）として測定した。 同上。 同上。 図９．経時的なＩｄｅＳｏｒｋ２．０酵素：基質活性。酵素：基質比の改変の影響を確認するために、一定量の酵素（１μｇ）に対する種々の量の基質（５～４０μｇ）での実験を、経時的に行った（３０分、６０分、および１２０分）。ほぼ全てのＩｇＧは、全ての条件で３０分以内に加水分解される。 図１０．ＩｄｅＳｏｒｋ２．０は、ＩｄｅＳおよびＩｄｅＺと比較して、類似の活性を有する。ＩｄｅＳｏｒｋ２．０がＩｄｅＳおよびＩｄｅＺと類似の方法でＩｇＧを加水分解しているか否かを調べるために、それらを全て、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２に対してインキュベートし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。切断パターンは同一であるように見え、ＩｄｅＳｏｒｋ２．０およびＩｄｅＳとも、ＩｇＧ２に対してより低い活性を有する。 図１１．ＩｄｅＳｏｒｋ２．０の特異性。ＩｄｅＳｏｒｋ２．０を、種々の抗体と混合し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析する前に、３７℃で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳＯＲＫ２．０は、ヒツジ、ブタ、イヌ、またはラットＩｇＧに対して目に見える効果を有しなかったが、ウマおよびモルモットＩｇＧに対して活性を示した。 図１２．ハタネズミから単離された連鎖球菌株におけるＩｇＧプロテアーゼ活性の同定。（Ａ）野生のハタネズミから単離した８種のβ溶血性細菌を、陽性コントロールとしてＳ．ｏｒａｌｉｓを使用して、１６Ｓ遺伝子増幅に供した。（Ｂ）配列を、既知の１６Ｓ配列を有するデータベースに対して問い合わせたところ、主に口腔内連鎖球菌およびブドウ球菌との類似性を明らかに示した。（Ｃ）ＩｇＧプロテアーゼ活性を調査するために、２％ マウス血清を補充したＣ培地中で増殖させたいくつかの株の上清を、ウェスタンブロットに供した。株β１３およびβ２００３のみが、マウスＩｇＧに対して測定可能な活性を示し、完全に配列決定された。（Ｄ）全ゲノム配列相同性は、新たに単離された株と口腔内連鎖球菌との間の進化的関係性を明らかに示す。ＩｇＧプロテアーゼは、今日まで、口腔内連鎖球菌または類縁菌のうちのいずれにおいても見出されておらず、ＩｄｅＳＯＲＫの遺伝子は、配列決定された株のうちの１つにおいてのみ同定された。 同上。 図１３．（Ａ）ＩｇＧプロテアーゼＩｄｅＳＯＲＫ１．０、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０、ＩｄｅＳおよびＩｄｅＺのＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント。（Ｂ）短縮化したＣ末端を有するＩｄｅＳｏｒｋ２．０を合成し、発現させ、収量および活性に関して試験した。「０」は、最終的なＩｄｅＳＯＲＫ２．０構築物を表し、＋／－は、Ｃ末端においてどの程度多くのアミノ酸が除去されたか、またはその生成物に付加されたかを記載する。 同上。 図１４．ＩｇＧヒドロラーゼ相同性。（Ａ）３種のＩｇＧ特異的ヒドロラーゼ、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、およびＩｄｅＳＯＲＫ２．０（Ｘｏｒｋ）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。（Ｂ）他の公知のＩｇＧプロテアーゼに対するＸｏｒｋの相同性を、系統樹を通じて評価した。（Ｃ）他の公知のＩｇＧプロテアーゼに対するＸｏｒｋの類似性および同一性のパーセンテージ。（Ｄ）Ｘｏｒｋ 対 ＩｄｅＳの配列アラインメントおよび（Ｅ）Ｘｏｒｋ 対 ＩｄｅＺの配列アラインメント。 同上。 図１５．ヒト血清中でのＩｇＧヒドロラーゼの活性。血清（１００％）にＩｇＧヒドロラーゼを添加し、非還元的ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して活性を経時的に分析した。 図１６．ＩｇＧに対する酵素活性。ヒトＩｇＧサブクラス、改変されたＩｇＧ、ＩｇＧ１－Ｆｃ－部分との融合タンパク質、および異なる種に由来するＩｇＧに対するＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、およびＸｏｒｋの活性を、活性でない（－）、低活性（＋）、良好な活性（＋＋）、および大きな活性（＋＋＋）として報告する。図３に関連。 図１７．変性ＩｇＧを、ＩｇＧヒドロラーゼとともにインキュベートして、それらの機能を発揮するために酵素に対する基質の保存された３Ｄ構造の必要性を調査した。 図１８．ＩＶＩＧにおける抗ＩｇＧヒドロラーゼ抗体の蔓延。（Ａ）ＥＬＩＳＡアッセイおよび（Ｂ）ウェスタンブロットアッセイの両方に関して、異なる濃度のＩｇＧヒドロラーゼを、プレート／膜に結合させ、ＩＶＩＧ（５μｇ／ｍＬ）に曝した。二次抗体である融合されたＨＲＰ－タグを有し、シグナル増幅を可能にするヤギ抗ＩｇＧを添加した。

配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｋｒoeｓｕｓａと称される連鎖球菌種から単離されたポリペプチドの全長アミノ酸配列である。上記ポリペプチドは、５５７アミノ酸の長さであり、免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有する。それは、本明細書でＩｄｅＳＯＲＫといわれ得る。

配列番号２は、免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号１の２４５アミノ酸のＣ末端は、この配列から欠失され、従って、これは、ＩｄｅＳＯＲＫのＮ末端の３１２アミノ酸からなる。この配列は、免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するＩｄｅＳＯＲＫのＮ末端フラグメントとして記載され得る。

配列番号３は、免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。この配列は、さらなるＮ末端メチオニンおよびＣ末端タンパク質精製タグ－Ｈｉｓ_６を含むように操作された、配列番号２の配列からなる。その得られた３１９アミノ酸のポリペプチドは、本明細書でＩｄｅＳＯＲＫ２．０といわれ得る。

配列番号４～１１は、種々のヒトおよびマウスＩｇＧサブクラスのヒンジ／ＣＨ２領域の配列である。

配列番号１２は、ＩｄｅＳの全長アミノ酸配列であり、これは、ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１０９２２１６０．１として公に利用可能である。この配列は、Ｎ末端メチオニン、続いて、２８アミノ酸の分泌シグナル配列を含む。

配列番号１３は、成熟ＩｄｅＳタンパク質である。そのＮ末端メチオニンおよびシグナル配列（Ｎ末端において合計２９アミノ酸）は、この配列を形成するために配列番号１２から除去される。この配列はまた、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＦ１３９４９．１として公に利用可能である。実施例の中で使用される場合、ＩｄｅＳは、代表的には、さらなるＮ末端メチオニンおよびＣ末端タンパク質精製タグ（例えば、ポリヒスチジン）を含むように操作されたこの配列を含む。好ましいタグは、Ｈｉｓ_６である。

配列番号１４は、ＩｄｅＺの全長アミノ酸配列であり、これは、ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１４６２２７８０．１として公に利用可能である。この配列は、Ｎ末端メチオニン、続いて、３３アミノ酸の分泌シグナル配列を含む。

配列番号１５は、成熟ＩｄｅＺタンパク質である。そのＮ末端メチオニンおよびシグナル配列（Ｎ末端において合計３４アミノ酸）は、この配列を形成するために配列番号１４から除去され得る。実施例の中で使用される場合、ＩｄｅＺは、代表的には、さらなるＮ末端メチオニンおよびＣ末端タンパク質精製タグ（例えば、ポリヒスチジン）を含むように操作されたこの配列を含む。好ましいタグは、Ｈｉｓ_６である。

配列番号１６は、Ｎ末端ヒスチジンおよびＣ末端Ｈｉｓ_６とともに発現するように操作された配列番号１のポリペプチドをコードする例示的なヌクレオチド配列である。

配列番号１７は、Ｎ末端ヒスチジンおよびＣ末端Ｈｉｓ_６とともに発現するように操作された配列番号２のポリペプチドをコードする例示的なヌクレオチド配列である。配列番号１７は、配列番号３をコードする。

配列番号１８は、配列番号１６の配列を含む例示的な発現ベクター配列である。

配列番号１９は、配列番号１７の配列を含む例示的な発現ベクター配列である。

発明の詳細な説明
本開示の生成物および方法の種々の適用が当該分野での具体的なニーズに合わせられ得ることは、理解されるべきである。本明細書で使用される用語法が、本発明の特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、限定であることが意図されないことはまた、理解されるべきである。本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前出であろうと後出であろうと、それらの全体において本明細書に参考として援用される。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ（1つの、ある）」、「ａｎ（1つの、ある）」、および「ｔｈｅ（この、その、上記）」は、文脈が別段明らかに規定しなければ、複数形への言及を含む。従って、例えば、「ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（１つのポリペプチド）」への言及は、「ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ（複数のポリペプチド）」を含むなど。

免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチド
免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの機能的特徴
この節は、免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの機能的特徴を示し、直後の節において概説される構造的特徴に加えて適用され得る。

本発明は、免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。すなわち、上記ポリペプチドは、免疫グロブリン分子を切断し得る。上記免疫グロブリン分子は、代表的には、ＩｇＧ分子であり、好ましくは、上記ポリペプチドは、他のクラスの免疫グロブリンを切断せず、上記ポリペプチドは、表１に示されるとおりの配列番号４～８のうちのいずれか１つのヒンジ／ＣＨ２配列を含む任意の免疫グロブリン分子を切断し得る。

上記ポリペプチドは、好ましくは、表１中のこれらの配列の各々に関して示されるとおりの太字／下線を付した残基の間を切断する。上記切断部位は、代わりに、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによればヒトＩｇＧの位置２４９と２５０（ＥＵ番号付けシステムによれば位置２３６と２３７）との間であるとして記載され得る。

上記ポリペプチドは、好ましくは、全てのヒトＩｇＧサブクラス、（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）を切断し、他のヒト免疫グロブリンクラスを切断しない。上記ポリペプチドは、他のヒトＩｇＧサブクラスと比較して、ヒトＩｇＧ２に対して低い活性を示し得る。上記ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ２よりヒトＩｇＧ１に対してより大きな活性を示し得る。上記ポリペプチドは、非ヒトＩｇＧ分子（マウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３を含む）に対して活性を示し得る。上記ポリペプチドは、モルモットまたはウマに由来するＩｇＧに対して活性を示し得る。

上記ポリペプチドは、２段階機序を介して、ＩｇＧをＦｃおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントへと効率的に切断し得る。第１の段階では、ＩｇＧの１個の（第１の）重鎖が、１個の非共有結合的に結合したＦｃ鎖を有する１個の切断されたＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）分子を生成するために切断される。上記ｓｃＩｇＧ分子は、実際は、元のＩｇＧ分子の残っている（第２の）重鎖を保持する中間生成物である。本発明のポリペプチドおよび１個の切断されたＩｇＧ分子の複合体がまた、本明細書で提供される。この文脈において、上記ポリペプチドによって切断されたＩｇＧは、好ましくは、組換えモノクローナル抗体である。従って、本発明のポリペプチドおよび単一の切断された組換えモノクローナルＩｇＧ分子の複合体が，提供される。本発明のポリペプチドによって切断され得る例示的な抗体は、以下の「使用方法」の節において列挙される。本発明のポリペプチドおよびこれらの抗体のうちのいずれかの１個の切断されたバージョンの複合体が、提供される。

上記機序の第２の段階では、上記元のＩｇＧ分子の残りの（第２の）重鎖は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントおよびホモダイマーのFcフラグメントを放出するために上記ポリペプチドによって迅速に切断される。これらは、生理学的条件下で概して観察される生成物である。ホモダイマーのＦｃは、その構成要素のモノマーへと解離し得る。還元条件下では、上記Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、２つのＦａｂフラグメントへと解離し得る。

免疫グロブリンプロテアーゼ活性は、任意の適切な方法によって（例えば、ポリペプチドを、ＩｇＧを含むサンプルとともにインキュベートし、ＩｇＧ切断生成物の存在を決定することによって）評価され得る。免疫グロブリンプロテアーゼ活性を評価するためのアッセイはまた、上記活性の有効性を定量するために、すなわち、ポリペプチドの効力を評価するために使用され得る。有効性は、インヒビターの存在下または非存在下で評価され得る。しかし、本明細書での有効性は、代表的には、別段述べられなければ、このようなインヒビターの非存在下で評価される場合の有効性を意味する。活性を決定するおよび／または上記活性の効力を定量するために適したアッセイは、当該分野で周知であり、適切なアッセイが使用され得る。適切なアッセイとしては、ＥＬＩＳＡベースのアッセイが挙げられる。このようなアッセイでは、アッセイプレートのウェルは、代表的には、抗体標的（例えば、ウシ血清アルブミン）（ＢＳＡ））でコーティングされる。次いで、試験されるべき上記ポリペプチドのサンプルは、上記ウェルに添加され、続いて、標的特異的抗体のサンプル、すなわち、この例ではＢＳＡに特異的な抗体が添加される。上記ポリペプチドおよび抗体は、ＩｇＧプロテアーゼ活性に適した条件下で相互作用させられる。適切な間隔の後で、上記アッセイプレートを洗浄し、上記標的特異的抗体に特異的に結合する検出抗体を、上記標的特異的抗体に結合するために適した条件下で添加する。上記検出抗体は、各ウェル中の標的に結合した任意の無傷の標的特異的抗体に結合する。洗浄後、ウェル中に存在する検出抗体の量は、そのウェルに結合した標的特異的抗体の量に比例する。上記検出抗体は、標識または別のレポーターシステム（例えば、酵素）に直接的または間接的に結合体化され得、その結果、各ウェル中に残っている検出抗体の量が決定され得る。ウェル中にあった試験されたポリペプチドの効力が高いほど、残る無傷の標的特異的抗体は少なく、従って、検出抗体も少ない。一実施形態において、所定のアッセイプレート上の少なくとも１個のウェルは、試験されるべきポリペプチドの代わりに、成熟ＩｄｅＳおよび／または成熟ＩｄｅＺおよび／またはＩｄｅＳＯＲＫ２．０を含む。その結果、その試験されたポリペプチドの効力は、成熟ＩｄｅＳおよび／または成熟ＩｄｅＺおよび／またはＩｄｅＳＯＲＫ２．０の効力と直接的に比較され得る。

他のアッセイは、試験されたポリペプチドによるＩｇＧの切断から生じるＩｇＧのフラグメントを直接的に可視化および／または定量することによって、試験されたポリペプチドの効力を決定し得る。このようなアッセイは、代表的には、ＩｇＧのサンプルを、試験ポリペプチド（またはコントロールとしての成熟ＩｄｅＳおよび／または成熟ＩｄｅＺおよび／またはＩｄｅＳＯＲＫ２．０）とともに、滴定系列において種々の濃度でインキュベートする。次いで、各濃度でのインキュベーションから得られる生成物は、ゲル電気泳動を使用して、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離される。次いで、完全ＩｇＧおよびＩｇＧの切断から生じるフラグメントは、サイズによって同定され得、適切な色素での染色の強度によって定量され得る。切断フラグメントの量が多いほど、所定の濃度での試験されたポリペプチドの効力は大きい。アッセイのこのタイプはまた、ＩｇＧ分子の第１のまたは第２の重鎖を切断することにおいてより有効である試験ポリペプチドの同定を可能にし得る。なぜなら各切断事象から生じる種々のフラグメントの量がまた、決定され得るからである。本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ分子の第２の鎖より第１の鎖を切断することにおいてより有効であり得る。

本発明のポリペプチドは、一実施形態において、好ましくは、少なくともＩｄｅＳＯＲＫ２．０と同程度に有効にヒトＩｇＧ１を切断する。

免疫グロブリンプロテアーゼ活性および有効性を評価するために適した方法はまた、実施例の中で記載される。

免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの構造的特徴
この節は、免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの構造的特徴を示す。これは、直前の節に概説される機能的特徴に加えて適用され得る。特に、構造的特徴は、免疫グロブリンプロテアーゼ活性の機能に加えて適用され得る。

上記ポリペプチドは、代表的には、長くても６００アミノ酸の長さである。上記ポリペプチドは、配列番号１の５５７アミノ酸を含み得、さらに、合計の長さが６００アミノ酸までで１個またはこれより多くのさらなるアミノ酸を含むように操作され得る。ここで上記さらなるアミノ酸は、代表的には、生成、単離または精製を補助することになる。上記ポリペプチドは、従って、配列番号１の配列を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。

上記ポリペプチドは、５６０アミノ酸、５００アミノ酸、４００アミノ酸、または３５０アミノ酸の最大長を有し得る。

上記ポリペプチドは、好ましくは、これが免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有する限りにおいて、配列番号１の任意のＮ末端フラグメントを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。上記ポリペプチドは、配列番号１のＮ末端から最初の１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３０１個、３０２個、３０３個、３０４個、３０５個、３０６個、３０７個、３０８個、３０９個、３１０個、３１１個、３１２個、３１３個、３１４個、３１５個、３１６個、３１７個、３１８個、３１９個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４２０個、４３０個、４４０個、４５０個、４６０個、４７０個、４８０個、４９０個または５００個連続したアミノ酸を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得るが、ただし上記ポリペプチドは、免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有する。上記Ｎ末端フラグメントは、好ましくは、少なくとも、配列番号１のＮ末端から最初の２５０個連続したアミノ酸、必要に応じて、配列番号１のＮ末端から最初の３２０個までの連続したアミノ酸を含む。配列番号１の例示的なＮ末端フラグメントは、配列番号２として提供される。それは、配列番号１のＮ末端から最初の３１２個連続したアミノ酸を含む。

配列番号１の任意のＮ末端フラグメントは、１個またはこれより多くのさらなるアミノ酸を含むように操作され得、ここで上記さらなるアミノ酸は、代表的には、生成、単離または精製を補助することになる。配列番号２の操作されたバージョンは、配列番号３として提供される。上記Ｎ末端フラグメントの免疫グロブリンプロテアーゼ活性は、好ましくは、同じアッセイにおいて測定される場合、配列番号３からなるポリペプチドのヒトＩｇＧに対する活性の少なくとも５０％であり、より好ましくは、配列番号３からなるポリペプチドの活性に匹敵するかまたはより優れている。

あるいは、本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または上記で定義されるように免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有する配列番号１の任意の他のＮ末端フラグメントのアミノ酸配列の改変体を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。上記改変体ポリペプチドの免疫グロブリンプロテアーゼ活性は、好ましくは、同じアッセイにおいて測定される場合、配列番号３からなるポリペプチドのヒトＩｇＧに対する活性の少なくとも５０％であり、より好ましくは、配列番号３からなるポリペプチドの活性と匹敵するかまたはより優れている。

上記改変体は、配列番号１、配列番号２、または配列番号１のＮ末端フラグメントのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であり得る。上記改変体配列は、配列番号１、配列番号２、または配列番号１のＮ末端フラグメントの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％ 同一であり得る。同一性レベルは、好ましくは、少なくとも８５％であるか、またはこれより高い。配列番号１、配列番号２、または配列番号１のＮ末端フラグメントの配列に対する同一性は、配列番号１、配列番号２、または配列番号１のＮ末端フラグメントに示される配列のうちの少なくとも１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３０１個、３０２個、３０３個、３０４個、３０５個、３０６個、３０７個、３０８個、３０９個、３１０個、３１１個、３１２個、３１３個、３１４個、３１５個、３１６個、３１７個、３１８個、３１９個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個またはこれより多くの連続したアミノ酸の領域にわたって測定され得る。より好ましくは、同一性は、配列番号１、配列番号２、または配列番号１のＮ末端フラグメントの全長にわたって測定される。配列番号１、配列番号２、または配列番号１のＮ末端フラグメントとの同一性は、上記改変体の長さに渡って測定され得るが、ただし、上記改変体は、参照配列より５０アミノ酸以下だけ長いまたは短い長さであり、好ましくは、参照配列とおよそ（または正確に）同じ長さのものである。配列番号２は、最も好ましい参照配列である。改変体の同一性は、最も好ましくは、配列番号２の全長にわたって測定される。

アミノ酸同一性は、任意の適切なアルゴリズムを使用して計算され得る。例えば、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ． （１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０－３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ， Ｆら（１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０に記載されるように、同一性を計算するかまたは配列を並べる（例えば、等価な配列または相当する配列を（代表的には、それらのデフォルト設定で）同定する）ために使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列における短いワード長Ｗが、データベース配列における同じ長さのワードと整列させた場合に、ある正の値の閾値スコアＴと適合するかまたは満たすかのいずれかであることを同定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を先ず同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値といわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， 前出）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見出すために、検索を開始するためのシードとして作用する。そのワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大され得る限り遠くまで、各配列に沿って両方向に伸ばされる。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減る；１もしくはこれより多くの負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアがゼロまたはそれ未満になる；あるいはいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーター Ｗ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ） １１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５－１０９１９を参照のこと）アラインメント（Ｂ） ５０、期待（Ｅ） １０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う；例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３－５７８７を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の適合が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、第１の配列と第２の配列との比較における最小和確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合に、一方の配列は、もう一方の配列に類似であると考えられる。あるいは、ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅは、同一性を計算するために使用され得る（例えば、そのデフォルト設定で使用され得る）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ３８７－３９５）。

本発明のポリペプチドの配列は、配列番号１、配列番号２、または上記で定義されるとおりの免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有する、配列番号１の任意の他のＮ末端フラグメントのアミノ酸配列の改変体を含み得る。ここで改変（例えば、アミノ酸付加、欠失または置換）は、配列番号１、配列番号２、または配列番号１の他のＮ末端フラグメントの配列に対して行われ得る。

別段同定されなければ、上記改変は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化学的構造、類似の化学的特性または類似の側鎖容積の他のアミノ酸で置き換える。導入される上記アミノ酸は、それらが置き換わるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有し得る。あるいは、上記保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入し得る。保存的アミノ酸変化は、当該分野で周知であり、以下の表Ａ１において定義されるとおりの２０の主要アミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これは、表Ａ２中のアミノ酸側鎖に関するヒドロパシースケールを参照することによって決定され得る。本発明のポリペプチドの配列は、配列番号１のアミノ酸配列の改変体を含み得、ここでは１０個、２０個、３０個、４０個、５０個または６０個までの保存的置換が行われる。

適切な改変は、出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸を、匹敵する特性を有するが、天然の真核生物タンパク質において出現する２０個のL立体配置のアミノ酸のうちの１つではないアミノ酸で置き換え得る。例えば、少なくとも１個のL立体配置のアミノ酸は、直接的に相当する非L立体配置のアミノ酸（例えば、Ｄ立体配置のアミノ酸）で、または他の点では上記で定義されるとおりの保存的置換である非L立体配置のアミノ酸で置き換えられ得る。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、上記のとおりのアミノ酸配列の改変体を含み得る。しかし、ある特定の残基は、好ましくは、上記改変体配列内で保持される。例えば、配列番号２のＮ末端から出発する位置を番号付けすると、位置６６にあるＬｙｓは、オキシアニオンホールを作り出すために重要であると予測され、位置７６にあるＣｙｓおよび位置２２６にあるＨｉｓは、活性部位を構成すると推測され、位置２４８および２５０にあるＡｓｐアミノ酸は、活性部位の適切な配向および加水分解を促進する静電的環境を作り出すために重要であると予測される。これらの位置に相当する位置におけるアミノ酸は荷電されていないことが好ましい（特に、Ｃｙｓ－７６およびＨｉｓ－２２６）。

本発明の任意のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、もしくは上記で定義されるとおりの免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有する配列番号１の任意の他のＮ末端フラグメント、またはこれらの配列のうちのいずれか１つの任意の改変体を含み、これらは、必要に応じて、Ｎ末端においてさらなるメチオニンおよび／またはＣ末端においてタンパク質精製もしくは他のタグを含むように操作され得る。上記タグは、配列番号１のＩｄｅＳＯＲＫタンパク質の連続したドメインとして、連鎖球菌では天然に発現されない配列である。好ましいタンパク質精製タグは、ヒスチジンタグである。ヒスチジンタグは、好ましくは、６個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、リンカーによってＣ末端に連結され得、リンカーは、代表的には、アミノ酸（例えば、３～５アミノ酸）の短い配列である。上記リンカーは、代表的には、グリシンおよびセリン残基から主になり、好ましくは、配列ＧＳＧを含み得る。例えば、ＧＳＧおよびＧＳＧＬＥは、適切なリンカーである。配列番号３は、操作された配列の例である。

従って、まとめると、
ポリペプチド、必要に応じて、免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、ここで上記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１の配列のＮ末端フラグメントであるアミノ酸配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列、
を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、
必要に応じてここで上記ポリペプチドは、Ｎ末端においてさらなるメチオニンおよび／またはＣ末端においてタンパク質精製もしくは他のタグを含むように操作され、上記タグは、Ｃ末端にリンカーによって連結され得る、ポリペプチドが提供される。

配列番号１、２および３は、本発明の例示的なポリペプチドの配列である。上記ポリペプチドは、配列番号１、２または３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。本発明の例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号１６～１９を含む。

一般的なポリペプチド構造
「ポリペプチド」とは、その最も広い意味において、２またはこれより多くのサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、または他のペプチド摸倣物の化合物をいうために、本明細書で使用される。用語「ポリペプチド」は，従って、短いペプチド配列、ならびにより長いポリペプチドおよびタンパク質をも含む。用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、交換可能に使用され得る。用語「アミノ酸」とは、天然のおよび／または非天然のもしくは合成のアミノ酸（ＤまたはＬ両方の光学異性体を含む）、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド摸倣物のいずれかに言及し得る。

ポリペプチドは、組換え法または合成法を含む適切な方法によって、生成され得る。例えば、上記ポリペプチドは、当該分野で公知の標準的な技術を使用して（例えば、Ｆｍｏｃ固相化学、Ｂｏｃ固相化学または液相ペプチド合成によって）直接合成され得る。あるいは、ポリペプチドは、細胞、代表的には細菌細胞を、上記ポリペプチドをコードする核酸分子またはベクターで形質転換することによって生成され得る。細菌宿主細胞における発現によるポリペプチドの生成は、以下で記載され、実施例の中で例示される。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子およびベクターを提供する。本発明はまた、このような核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。本明細書で開示されるポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチド分子は、配列番号１６および１７として提供される。これらの配列の各々は、５’末端ではＮ末端メチオニンのコドン（ＡＴＧ）、および３’末端では終止コドン（ＴＡＡ）の前にタンパク質精製タグ、この場合には、６×Ｈｉｓタグのコドン（これは、必要に応じて排除され得る）を含み得る。さらなるメチオニンおよびタグの必要に応じた包含は、本文書の他の箇所でより詳細に考察される。配列番号１８および１９は、それぞれ、配列番号１６および１７を含む発現ベクター配列である。

用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書で交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれらのアナログのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態に言及する。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードし、単離されたまたは実質的に単離された形態において提供され得る。実質的に単離されるとは、任意の周囲の媒体からの上記ポリペプチドの実質的な、しかし完全ではない単離が存在し得ることを意味する。上記ポリヌクレオチドは、キャリアまたは希釈剤と混合され得、これは、それらの意図された使用に干渉せず、実質的に単離されたとなおも見做される。選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、例えば、発現ベクターにおいて、適切な調節配列の制御下に配置される場合に、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドへと翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端にある開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端にある翻訳終止コドンによって決定される。本発明の目的のために、このような核酸配列としては、ウイルス、原核生物もしくは真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルスもしくは原核生物のＤＮＡもしくはＲＮＡからのゲノム配列、およびさらには合成のＤＮＡ配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列に対して３’側に位置し得る。

ポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ － ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）における例によって記載されるように、当該分野で周知の方法に従って合成され得る。本発明の核酸分子は、挿入された配列に作動可能に連結され、よって、本発明のポリペプチドの発現をインビボで（例えば、原核生物または真核生物の発現系において）可能にする、制御配列を含む発現カセットの形態において提供され得る。これらの発現カセットは、次に、代表的には、ベクター（例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター）内で提供される。このような発現カセットは、宿主被験体に直接投与され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが、宿主被験体に投与され得る。好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを使用して、調製および／または投与される。適切なベクターは、十分な量の遺伝情報を運び、本発明のポリペプチドの発現を可能にする任意のベクターであり得る。

本発明は、従って、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。このような発現ベクターは、分子生物学の分野において慣用的に構築され、例えば、プラスミドＤＮＡ、ならびに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレメント（例えば、本発明のペプチドの発現を可能にするために、必要であり得、正しい配向において配置されるポリアデニル化シグナルのような）の使用を含み得る。他の適切なベクターは、当業者に明らかである。この点においてさらなる例示によって、本発明者らは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに言及する。

本発明はまた、本発明のポリペプチドを発現するために改変された細胞を含む。このような細胞は、代表的には、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物細胞を含む。このような細胞は、本発明のポリペプチドを生成するために慣用的な方法を使用して培養され得る。

ポリペプチドは、生成、単離または精製を補助するために操作または改変され得る。例えば、本発明のポリペプチドが細菌宿主細胞において組換え発現によって生成される場合、上記ポリペプチドの配列は、発現を改善するために、Ｎ末端においてさらなるメチオニン（Ｍ）残基を含み得る。別の例としては、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端におけるタンパク質精製タグの付加によって操作または改変され得る。上記タンパク質精製タグは、好ましくは、連鎖球菌では天然に発現されない部分である。上記タンパク質精製タグは、好ましくは、連鎖球菌において発現される場合に、野生型ポリペプチド鎖に存在しない部分である。タンパク質精製タグは、分離手段に直接的にかつ特異的に結合する能力があるリガンドであり得る。あるいは、上記タンパク質精製タグは、結合対の一方のメンバーである場合があり、上記分離手段は、上記結合対の他方のメンバーを含む試薬を含む。任意の適切な結合対が使用され得る。

上記ポリペプチドが、結合対の一方のメンバーの付加によって操作または改変される場合、上記ポリペプチドは、好ましくは、ヒスチジンでタグ付けまたはビオチンでタグ付けされる。代表的には、ヒスチジンタグまたはビオチンタグのアミノ酸コード配列は、遺伝子レベルで含まれ、上記ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換え発現される。上記ヒスチジンタグまたはビオチンタグは、代表的には、上記ポリペプチドのいずれかの末端、好ましくはＣ末端に存在する。それは、上記ポリペプチドに直接結合されてもよいし、任意の適切なリンカー配列（例えば、３個、４個もしくは５個のグリシン残基、またはグリシンおよびセリン残基の混合物）によって間接的に結合されてもよい。上記ヒスチジンタグは、代表的には、6個のヒスチジン残基からなるが、それは、これより長くてもよく、代表的には、７個、８個、９個、１０個または２０個のアミノ酸までまたはより短く、例えば、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸であり得る。

タンパク質精製に有用な代替のタグとしては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ユビキチン（Ｕｂ）、低分子ユビキチン様修飾因子（ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）、溶解度エンハンサーペプチド配列（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ－ｅｎｈａｎｃｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＳＥＴ）、およびＮ－利用物質（Ｎ－ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）（ＮｕｓＡ）が挙げられる。適切なタグはまた、特にＣｏｓｔａらの表１に開示されるタグの各々を含め、Ｃｏｓｔａら； Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１４； ５： ６３（参考として援用される）の中で考察される。

ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、安定性を増大させるために、少なくとも１個の天然に存在しないアミノ酸を含むように改変または操作され得る。上記ポリペプチドが合成的手段によって生成される場合、このようなアミノ酸は、生成中に導入され得る。上記ポリペプチドはまた、合成または組換え生成のいずれかの後に改変され得る。ポリペプチドはまた、Ｄ－アミノ酸を使用して生成され得る。この様な場合に、アミノ酸は、ＣからＮの配向にある逆向きの配列の中に連結される。これは、このようなポリペプチドの生成に関して当該分野で従来どおりである。本発明の好ましいポリペプチドは、少なくとも１個のこのような非天然のもしくは合成アミノ酸、または少なくとも１個の非L立体配置のアミノ酸を含むように操作され得る。

多くの側鎖改変が、当該分野で公知であり、上記ポリペプチドが、本明細書で特定され得るように、任意のさらなる必要とされる活性または特徴を保持することを条件として、上記ポリペプチドの側鎖に対して行われ得る。ポリペプチドが化学的に改変され得る、例えば、翻訳後修飾され得ることはまた、理解される。例えば、それらは、グリコシル化されても、リン酸化されてもよいし、改変されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。上記ポリペプチドは、ＰＥＧ化されてもよい。

ポリペプチドは、実質的に単離または精製された形態において、すなわち、上記ポリペプチドが発現された細胞の細胞抽出物中に存在する他の構成要素の大部分から単離されて提供され得る。上記ポリペプチドは、キャリアまたは希釈剤（以下で考察されるとおり）と混合され得、これは、それらの意図された使用に干渉せず、実質的に単離されたとなおも見做される。それはまた、実質的に精製された形態において存在し得る。この場合、それは、一般に、調製物中に上記タンパク質の少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％または９９％を含む。ポリペプチドがさらなる活性な構成要素（例えば、別のポリペプチド）との組成物中で提供される場合、各上記ポリペプチドは、各々のその意図された目的に適切な比において混合する前に、高い均質性レベルまで個々に精製される。例えば、２つのポリペプチドは、１：１比において組み合わせる前に、少なくとも９０％の均一性まで各々精製され得る。本発明のポリペプチドとの混合物中に含まれ得る例示的なポリペプチドとしては、以下のうちの１またはこれより多くのものが挙げられ得る： エキソグリコシダーゼ；エンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、ＥｎｄｏＥ（ＷＯ２０１３／０３７８２４に開示されるとおりのエンドグリコシダーゼ活性を有する任意のポリペプチドを含む））；プロテアーゼ（好ましくは、本発明のポリペプチドに対して異なる特異性を有する免疫グロブリンプロテアーゼ、例えば、ＷＯ２０１７／１３４２７４に開示されるとおりのプロテアーゼ－例えば、その文書の配列番号３またはその文書の中で開示されるとおりのその改変体を含むポリペプチド）；またはアミダーゼ（例えば、ＰｎｇａｓｅＦ）。

ポリペプチドは、使用前に水性溶液中での再構成に適した凍結乾燥形態において提供され得る。凍結乾燥された組成物は、上記ポリペプチドのより長期間の貯蔵を可能にする改善された安定性を有する。ポリペプチドは、代表的には、フリーズドライの前に、実質的に精製される。上記ポリペプチドを適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ）、または別のＴｒｉｓ緩衝液）中でフリーズドライする工程を包含する凍結乾燥形態でポリペプチドを調製する方法は、本明細書で提供される。凍結乾燥形態において得られるポリペプチドがまた、提供される。ポリペプチドの溶液を調製する方法であって、凍結乾燥形態において上記ポリペプチドを提供する工程、および適切なキャリアまたは希釈剤（例えば、水）で再構成する工程を包含する方法がまた、提供される。

ポリペプチドは、例えば、Ｄａｔｔａ Ｓら， Ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ３ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ３（１）：１－９ （２０１３）において記載されるように、当該分野で公知の方法を使用して固定化され得る。例えば、上記ポリペプチドは、吸着、共有結合、アフィニティー固定化または捕捉によって固定化され得る。支持体として使用され得る物質としては、例えば、天然の支持体、例えば、アガロース、セファロース、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ペクチン、セファロース、無機物質（例えば、セラミック、シリカ、ガラス、活性炭または木炭）、または合成ポリマー、例えば、ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）、またはラテックスが挙げられるが、これらに限定されない。これらのうちのいずれも、樹脂として、または任意の他の適切な形式において提供され得る。上記ポリペプチドは、磁性ビーズ上で固定化され得る。

ポリペプチドを含む組成物および製剤
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の１またはこれより多くのポリペプチドおよび少なくとも１種の賦形剤、好ましくは保存剤または安定化剤、ならびに必要に応じて１またはこれより多くのさらなるキャリア、希釈剤またはビヒクルも含む組成物を提供する。賦形剤の例示的なクラスおよび個々の例は、以下の表に含まれる。

代表的には、最終組成物は、無菌であり、発熱物質を含まない。

特定の実施形態において、本発明の賦形剤は全て、好ましくは、組成物の他の成分と適合性でありかつその組成物が投与される被験体に有害でないという意味において薬学的に受容可能である。この場合、上記組成物は、薬学的組成物といわれ得る。

適切な組成物の製剤化は、標準的な薬学的製剤化化学および方法論を使用して行われ得、それらは全て、当業者に容易に利用可能である。例えば、上記薬剤は、保存剤、および１またはこれより多くのキャリア、賦形剤またはビヒクルと合わされ得る。補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質、還元剤など）は、上記賦形剤またはビヒクルの中に存在し得る。適切な還元剤としては、システイン、チオグリセロール、チオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｕｃｉｎ）、グルタチオンなどが挙げられる。賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般に、上記組成物を受容する個体において免疫応答を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る薬学的作用物質である。薬学的に受容可能な賦形剤としては、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、チオグリセロールおよびエタノールのような液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩はまた、その中に含められ得る（例えば、塩化物塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような無機酸塩；および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）。薬学的に受容可能な賦形剤、ビヒクルおよび補助物質の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ． １９９１）において入手可能である。

このような組成物は、ボーラス投与または連続投与に適した形態において、調製、パッケージングまたは販売され得る。注射用組成物は、単位投与形態において（例えば、アンプル、または保存剤を含む複数用量容器において）調製、パッケージングまたは販売され得る。組成物としては、懸濁物、液剤、油性または水性ビヒクル中のエマルジョン、パスタ剤および移植用持続放出または生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定されない。このような組成物は、１またはこれより多くのさらなる成分（懸濁化剤、安定化剤、または分散剤が挙げられるが、これらに限定されない）をさらに含み得る。非経口投与のための組成物の１つの実施形態において、活性成分は、再構成した組成物の非経口投与の前に適切なビヒクル（例えば、無菌の発熱物質非含有の水）での再構成のために、乾燥（例えば、散剤または粒剤に関して）形態で提供される。上記組成物は、無菌の注射用の水性または油性懸濁物または液剤の形態において調製、パッケージングまたは販売され得る。上記懸濁物または液剤は、公知の技術に従って製剤化され得、上記活性成分に加えて、本明細書で記載される分散剤、湿潤剤、または懸濁化剤のようなさらなる成分を含み得る。このような無菌の注射用製剤は、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒（例えば、水または１，３－ブタンジオールのような）を使用して調製され得る。他の受容可能な希釈剤および溶媒としては、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液、および不揮発性油（例えば、合成モノグリセリドまたはジグリセリド）が挙げられるが、これらに限定されない。

有用な他の非経口投与可能な組成物としては、微結晶性形態において、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマーシステムの構成要素として、上記活性成分を含むものが挙げられる。持続放出または移植のための組成物は、薬学的に受容可能なポリマー物質または疎水性物質（例えば、エマルジョン、イオン交換樹脂、やや溶けにくいポリマー、またはやや溶けにくい塩）を含み得る。上記組成物は、任意の適切な経路（例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨内または他の適切な投与経路が挙げられる）による投与に適切であり得る。好ましい組成物は、静脈内注入による投与に適している。

ポリペプチドの使用方法
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび／または組成物は、種々の方法において有用である。従って、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび／または組成物を、例えば、サンプルまたは被験体に投与する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。ＩｇＧと、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物とを接触させる工程を包含する方法がまた、提供される。上記方法は、免疫グロブリンを切断する方法であり得、必要に応じて、その切断生成物の検出または分析をさらに含み得る。上記方法は、疾患を処置する方法であって、上記方法は、本発明のポリペプチドを被験体に投与する工程を包含する方法であり得る。

例えば、本発明のポリペプチドは、生物工学に有用なツールを提供し得る。上記ポリペプチドは、ＩｇＧのエキソビボでの切断のための方法において使用され得る。上記ＩｇＧは、ヒト、マウス、ウマまたはモルモットのＩｇＧであり得る。上記ＩｇＧは、これらの種のうちのいずれかに由来する組換えモノクローナル抗体であり得る。上記ポリペプチドは、ＩｇＧを含むサンプルに投与され得、免疫グロブリンプロテアーゼ活性が生じることを可能にする条件下でインキュベートされ得る。

適切な条件としては、代表的には混合しながら、例えば、転倒混和（ｅｎｄ－ｏｖｅｒ－ｅｎｄ ｍｉｘｉｎｇ）しながら、少なくとも２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分または１２０分、３時間、５時間、１０時間、または一晩にわたるインキュベーションを含む。好ましいインキュベーション時間は、およそ３０分またはおよそ１時間である。

インキュベーションは、好ましくは、室温で、より好ましくは、およそ２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃または４５℃で、最も好ましくは、およそ３７℃で起こる。

上記の方法は、任意の適切なｐＨ下で行われ得る。適切なｐＨ値としては、例えば、およそｐＨ６．５～およそｐＨ８．５、好ましくはおよそｐＨ７．０～およそｐＨ８．５、最も好ましくはおよそｐＨ７．５が挙げられる。

上記方法は、任意の適切な緩衝液（例えば、トリス緩衝化食塩水（ＴＢＳ）またはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ））中で行われ得る。好ましくは、塩、補因子または還元剤に関する要件はないが、２００ｍＭまでの塩（例えば、ＮａＣｌ）の存在は、好ましくは、本発明のポリペプチドによって許容される。

本発明のポリペプチド 対 サンプルのタンパク質含有量の適切な比は、１：１、２：１、４：１、６：１、１０：１、１５：１、２０：１、１：２、１：４、または１：６、１：１０、１：１５、１：２０、１：４０、１：１００、１： ２００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：１５００、１：２０００、または１：２５００（ｗｔ：ｗｔ）までであり得る。好ましい比は、１：２０～１：４０（ｗｔ：ｗｔ）の間である。

特異的切断は、検証され得、その切断生成物は、任意の適切な方法（例えば、この文書中の、実施例中を含む他の箇所に、またはＷＯ２００３０５１９１４およびＷＯ２００９０３３６７０に記載されるもの）を使用して単離され得る。上記方法は、特に、ＦｃおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントを精製するために使用され得る。次いで、Ｆａｂフラグメントは、本発明のポリペプチドでのＩｇＧの切断から生じるＦ（ａｂ’）_２フラグメントに対して還元工程を（例えば、２－メルカプトエタノールアミンまたはシステアミン中で）行うことによって生成され得る。

上記方法はまた、サンプル中のＩｇＧを検出もしくは分析する、またはサンプルからＩｇＧを除去するために使用され得る。サンプル中でＩｇＧの検出するための方法は、代表的には、上記ポリペプチドを上記サンプルとともに、結合および切断を可能にする条件下でインキュベートする工程を包含する。ＩｇＧの存在を、特異的ＩｇＧ切断生成物（これは、その後、分析され得る）の検出によって検証され得る。

上記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび／または組成物はまた、治療または予防において使用され得る。治療適用では、ポリペプチドまたは組成物は、障害または状態を既に被っている被験体に、上記状態またはその症状の１もしくはこれより多くのものを治癒、緩和または部分的に停止するために十分な量において投与される。このような治療的処置は、疾患症状の重篤度の減少、または無症状期間の頻度もしくは継続期間の増大を生じ得る。これを達成するために適した量は、「治療上有効な量」として定義される。予防適用では、ポリペプチドまたは組成物は、障害もしくは状態の症状を未だ示していない被験体に、症状の発生を防止もしくは遅らせるために十分な量で投与される。このような量は、「予防上有効な量」として定義される。上記被験体は、任意の適切な手段によって、上記疾患または状態を発生させるリスクがあるとして同定されている場合もある。従って、本発明はまた、ヒトまたは動物の身体の処置における使用のための本発明のポリペプチドを提供する。被験体において疾患または状態の防止または処置の方法であって、上記方法は、本発明のポリペプチドを、予防上または治療上有効な量において上記被験体に投与する工程を包含する方法がまた、本明細書で提供される。上記ポリペプチドは、好ましくは、静脈内注入によって投与されるが、任意の適切な経路（例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨内または他の適切な投与経路が挙げられる）によって投与され得る。投与される上記ポリペプチドの量は、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、０．１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、０．１５ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、０．２ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、０．２ｍｇ／ｋｇ ＢＷまたは０．２５ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、最大で約０．５ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、最大で約１．０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、１．５ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、２．０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、または２．５ｍｇ／ｋｇ ＢＷまでであり得る。上記下限のうちのいずれかは、用量範囲を提供するために上限のうちのいずれかと組み合わされ得る。上記量は、好ましくは、０．２～１．２ｍｇ／ｋｇ ＢＷの間である。

本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ抗体（これは、この文脈では、病原性ＩｇＧ抗体として記載され得る）によって媒介される疾患または状態の処置または防止のための方法において特に有用であり得る。よって、本発明は、疾患または状態、特に、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患または状態の処置または防止における使用のための本発明のポリペプチドを提供する。本発明はまた、疾患または状態、特に、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患または状態を処置または防止する方法であって、本発明のポリペプチドを個体に投与する工程を包含する方法を提供する。上記方法は、上記ポリペプチドの反復投与を包含し得る。本発明はまた、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患または状態、特に、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患または状態を処置または防止するための医薬の製造における使用のための本発明のポリペプチドを提供する。

多くの自己免疫疾患は、全体的にまたは部分的に、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される。従って、病原性抗体は、代表的には、全体的にまたは部分的に、ＩｇＧ抗体によって媒介される自己免疫疾患または他の状態において標的化される抗原に対して特異的であり得る。抗体およびその関連する抗原によって媒介される例示的な疾患および状態は、ＷＯ ２０１６／１２８５５９の表Ｄの中で詳細に列挙される。本発明のポリペプチドは、これらの疾患または状態のうちのいずれかを処置するための方法において使用され得る。

病原性抗体は、被験体によって受容される組織または器官移植片を認識し得る。従って、上記ポリペプチドによって処置または防止される上記疾患は、抗体媒介性移植片拒絶であり得る。上記病原性抗体は、上記被験体に投与される別の治療剤（例えば、抗体、遺伝子治療（例えば、ウイルスまたは他のベクター）、酵素、増殖因子もしくは凝固因子のような欠損性内因性因子の補充、または細胞治療）を認識し得る。従って、上記ポリペプチドによって処置または防止される上記疾患または状態は、上記治療剤の、上記被験体への有効性または利益を低減する、上記被験体の任意の抗体応答であり得る。

本発明のポリペプチドは、被験体において疾患または状態を処置または防止するために特に有用であり得る。ここで上記被験体は、他のＩｇＧプロテアーゼに対して既存の免疫を含む。例えば、上記被験体は、以前のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染または以前のＩｇＧプロテアーゼでの処置に起因して、ＩｄｅＳまたはＩｄｅＺに対する抗体を含み得る。

本発明の方法は、既知の抗体を含むサンプルの切断を含み得る。上記抗体は、好ましくは、組換えモノクローナル抗体である。上記抗体は、以下であり得る： アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アクトクスマブ（Ａｃｔｏｘｕｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフェリモマブ（Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）、アフツズマブ（Ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アラシズマブペゴル（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アリロクマブ（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、アルツモマブペンテタート（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、アマツキシマブ（Ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）、アナツモマブマフェナトックス（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アンルキンズマブ（Ａｎｒｕｋｉｎｚｕｍａｂ）、アポリズマブ（Ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アチヌマブ（Ａｔｉｎｕｍａｂ）、アトリズマブ（Ａｔｌｉｚｕｍａｂ）（＝トシリズマブ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、バピヌズマブ（Ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ（Ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（Ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、ビマグルマブ（Ｂｉｍａｇｒｕｍａｂ）、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブロソズマブ（Ｂｌｏｓｏｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カンツズマブメルタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、カンツズマブラブタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、カプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）、カプロマブペンデチド（Ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、カルルマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）、カツマクソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、ＣＣ４９、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトックス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、クレノリキシマブ（Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、クリバツズマブテトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、クレネズマブ（Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、デムシズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ドルリモマブアリトクス（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（Ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、デュシギツマブ（Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ） エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エンリモマブペゴル（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、エノキズマブ（Ｅｎｏｋｉｚｕｍａｂ）、エノチクマブ（Ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エピツモマブシツキセタン（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、エルリズマブ（Ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、エクスビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ） ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ（Ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フォントリズマブ（Ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、フォラルマブ（Ｆｏｒａｌｕｍａｂ）、フォラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）、フルラヌマブ（Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ）、フツキシマブ（Ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ），ガニツマブ（Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ゲボキズマブ（Ｇｅｖｏｋｉｚｕｍａｂ）、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、ＧＳ６６２４、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、イブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インクラクマブ（Ｉｎｃｌａｃｕｍａｂ）、インダツキシマブラブタンシン（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、イノツズマブオゾガマイシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ケリキシマブ（Ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、ランパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レキサツムマブ（Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブメルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ（Ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マブリリムマブ（Ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、モタビズマブ（Ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）、モキセツモマブパスドトクス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、ムロモナブ－ＣＤ３（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ－ＣＤ３）、ナコロマブタフェナトックス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナミルマブ（Ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナプツモマブエスタフェナトックス（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ネバクマブ（Ｎｅｂａｃｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ノフェツモマブメルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、
オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オズリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブモナトックス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、オルチクマブ（Ｏｒｔｉｃｕｍａｂ）、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、オキセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）、オザネズマブ（Ｏｚａｎｅｚｕｍａｂ）、オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、パギバキシマブ（Ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パルサツズマブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ（Ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ペキセリズマブ（Ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）、ピディリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ピナツズマブベドチン（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プラクルマブ（Ｐｌａｃｕｌｕｍａｂ）、ポラツズマブベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ポネズマブ（Ｐｏｎｅｚｕｍａｂ）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリトキサキシマブ（Ｐｒｉｔｏｘａｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＰＲＯ １４０、キリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ラキシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、レガビルマブ（Ｒｅｇａｖｉｒｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ロレヅマブ（Ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）、ロモソズマブ（Ｒｏｍｏｓｏｚｕｍａｂ）、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、サツモマブペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、セトキサキシマブ（Ｓｅｔｏｘａｘｉｍａｂ）、セビルマブ（Ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ（Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スタムルマブ（Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、スビズマブ（Ｓｕｖｉｚｕｍａｂ）、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、タカツズマブテトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タドシズマブ（Ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タリズマブ（Ｔａｌｉｚｕｍａｂ）、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）、タプリツモマブパプトクス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）、テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、テリモマブアリトクス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テネリキシマブ（Ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、ＴＧＮ１４１２、ティシリムマブ（Ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（＝トレメリムマブ）、ティルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ティガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）（＝アトリズマブ）、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ（Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ） ツコツズマブセルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツビルマブ（Ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ウルトキサズマブ（Ｕｒｔｏｘａｚｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、バテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ） ベセンクマブ（Ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）、ビシリズマブ（Ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）、ボロシキシマブ（Ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ボルセツズマブマホドチン（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、ザツキシマブ（Ｚａｔｕｘｉｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）またはゾリモマブアリトックス（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）。

本発明のポリペプチドは、治療用抗体または治療剤（例えば、その効果がＦｃレセプター結合を通じて媒介される）の被験体に対する利益を改善するための方法において有用であり得る。例えば、本発明のポリペプチドは、急速に、一時的におよび安全に、被験体において全てまたは実質的に全ての内因性ＩｇＧによるＦｃレセプター結合を排除する。従って、投与される、例えば、その後投与される治療用抗体（または治療剤、例えば、Ｆｃレセプターに結合するもの）は、増強された有効性を有する。なぜならそれは、Ｆｃレセプターの結合に関して、内因性ＩｇＧと競合する必要がないからである。

以下の実施例は、本発明を例証する。

実施例１
別段示されなければ、使用される方法は、標準的な生化学および分子生物学技術である。適切な方法論の教科書の例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．が挙げられる。

新たなプロテアーゼの分析
試験を多くの異なる齧歯類（例えば、モグラおよびハタネズミ）を捕まえた際に行い、その連鎖球菌種を単離し、部分的に特徴づけた。これらの単離物のうちの１つ、仮称Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｋｒoeｓｕｓを配列決定したところ、いくつかのグリコシダーゼおよびプロテアーゼを有することが見出された。１つの遺伝子は特に、ＩｄｅＳと低い程度の相同性を有した。この遺伝子を、本明細書でＩｄｅＳＯＲＫといわれ、以下で特徴づける。

野生ハタネズミに由来する細菌の最初の同定
より大きな生態学的プロジェクトの一部として、スウェーデン南部の野生ハタネズミ（Ｍｉｃｒｏｔｕｓ ａｒｖａｌｉｓ）から咽頭スワブを採取し、再び放した。そのスワブを、４％ ウマ血液寒天プレート上で培養し、連続的に再度画線し、純粋な単離物を得た。コロニーの色および形態および溶血（α、βまたはγ）パターンを記録した。合計で５７個の異なる単離物を分離したところ、そのうち、８個の明らかにβ溶血性のものをさらなる分析のために選択した。

単離物の系統分析
１６Ｓ ＤＮＡ配列決定
１６Ｓ遺伝子に関する１５４１塩基対のＰＣＲ生成物を、全８株（およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓの公知のコントロール株）から生成した（図１２Ａ）。生成物を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを使用して完全に配列決定し、公知の１６Ｓ配列でデータベースに対して問い合わせた（図１２Ｂ）。

代謝特徴付け
全ての単離物を、連鎖球菌を使用する代謝試験およびブドウ球菌試験に供した。結果は確定的ではなく、全ての株が公知の種とは代謝的に別個のものであることを示した（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの陽性コントロールを正しく同定した）。

マウスＩｇＧに対する活性試験
全ての単離物を、マウスＩｇＧに対するタンパク質分解活性に関してスクリーニングした。β１３およびβ２００３は、ＩｇＧに対して弱い活性を示したので、さらなる分析のために選択した（図１２Ｃ）。

β１３およびβ２００３の全ゲノム配列決定
β１３およびβ２００３のゲノムＤＮＡを、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（ＯＮＴ）およびＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングの組み合わせを使用して決定した。ＯＮＴロングリードのｄｅ ｎｏｖｏアセンブリを、アセンブラーＣａｎｕを使用して行った。これの結果として、両方のゲノムを、１つのドラフトゲノムコンティグへとアセンブルできた。β２００３はまた、２つの染色体外プラスミドを含んだ。Ｎａｎｏｐｌｉｓｈを使用して補正を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａリードを上記ドラフトコンティグ上へとマッピングした。遺伝子註釈を、ＲＡＳＴを使用して作成した。２つのおよそ２．４６Ｍｂゲノムの全ゲノム系統樹から、両方の株は、同じ新種の別個の単離物である可能性が非常に高いことが確認された（図１２Ｄ）。その註釈を付けたゲノムを詳細に分析する場合、推定ＩｇＧエンドペプチダーゼをコードする遺伝子は、β１３において見出されたが、β２００３においては見出されなかった。

結論
いくつかの新たな連鎖球菌およびブドウ球菌種が、野生ハタネズミの咽頭において同定できた。そのβ溶血性のものであるβ１３およびβ２００３は、極めて驚くべきことに、通常はα溶血性である口腔内連鎖球菌に類縁であった。ＩｇＧプロテアーゼは、今日まで、口腔内連鎖球菌または類縁菌のうちのいずれにおいても見出されていないので、これらの株におけるＩｇＧプロテアーゼＸｏｒｋの発見は、極めて予測外であった。

生成および精製
配列番号１（ＩｄｅＳＯＲＫ）の全長タンパク質は、発現が一貫して不十分であり、低純度であった（図１）。しかし、配列番号１の約２０ｋＤａの長さのＣ末端ドメインを欠き、Ｎ末端ＭおよびＣ末端Ｈｉｓタグで操作された短縮されたバージョン（ＩｄｅＳＯＲＫ２．０； 配列番号３）は、十分に作用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ＳＴＡＲ細胞において、高純度およびいくぶん高発現で可溶性タンパク質として発現され得る。その発現および精製は、標準的なプロトコールに従い、３７℃で細胞を培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧを使用して誘導し、５時間の誘導後に細胞を採取する。超音波処理後に物質を精製（ＧｒａｖｉＴＲＡＰ）する場合、本発明者らはしばしば、およそ５ｍｇ／ｇの収量を得る。誘導中にその温度を３０℃へと変えると、生成が有意に改善され得、約９ｍｇ／ｇに達する（データは示さず）。上記構築物のさらなる短縮化は、非常に低い収量および低活性を生じる一方で、Ｃ末端への（ＩｄｅＳＯＲＫ ２．０に対する）付加は、より受容されるが、部分的に収量および活性に影響を及ぼす（図１３Ｂ）。

活性
特異性
ＩｄｅＳ（－コントロール）とは異なり、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０は、全ての試験したヒトＩｇＧおよびＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を加水分解する（図３および図１６）一方で、カゼイン／ゼラチンに対する一般的なプロテアーゼ活性の徴候を示さない（図２）。ＩｄｅＳＯＲＫ２．０は、ＩｇＡに対して活性ではなく、それは、活性を規定する一般的な免疫グロブリン構造ではなく、むしろさらに高い特異性であることを示す（図３）。上記酵素は、ＩｄｅＳと同様に、ＩｇＧ２よりＩｇＧ１に対してわずかに優先性があり、モノクローナルＩｇＧ４をも加水分解し得る。マウスＩｇＧに関しては、上記プロテアーゼは、ｍＩｇＧ２ａに対して活性であるが、ｍＩｇＧ１にもｍＩｇＧ２ｂにも活性でない。ヒト抗体のヒンジ領域の変更（例えば、ＬＡＬＡ－配列）は、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０の活性に影響を及ぼさなかった。ポリクローナルＩｇＧ（例えば、ＩＶＩＧ）とのインキュベーションは、ほぼ完全な加水分解を生じた。これは、上記酵素が特定のモノクローナル抗体に限定されるのではなく、全てのヒトＩｇＧを加水分解し得ることを示す。より多くの動物ＩｇＧ（ブタ、ウマ、イヌ、ラット、モルモット、ヒツジ、ウシ）に対するさらなる試験は、ウマおよびモルモットのＩｇＧにしか活性を示さなかった（図１１）。ＩｄｅＳＯＲＫ２．０は、変性および還元ＩｇＧに対しては活性でない（図１７）。

プロテアーゼインヒビター感受性
ＩｄｅＳは、システインプロテアーゼとして特徴づけられ、よって、Ｅ６４以外の大部分のプロテアーゼインヒビターによって影響を及ぼされない。ここで同定した新たなプロテアーゼの酵素機序は、十分に特徴づけられていないが、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０は、 公知のセリンおよびシステインプロテアーゼインヒビターを含む多くのプロテアーゼインヒビターに関して非常に感受性である（図４）。しかし、上記酵素は、カチオンには依存せず、ＥＤＴＡの存在によって影響を及ぼされない（図４）。

加水分解の部位
いくつかの基質（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、融合タンパク質、ＬＡＬＡ変異ＩｇＧ）を、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０による加水分解に供し、加水分解の部位をＬＣ－ＭＳを通じて同定した。図５に示されるように、わずか１個の加水分解部位が検出された。この部位は、全ての配列において同一であり、ヒトＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２領域に相当する（上記表１および以下の表も参照のこと）。これは、ＩｄｅＳによって認識されるものと同じ部位である。加水分解の部位は、エタネルセプト、トラスツズマブ、セツキシマブ、および２つの市販されていないモノクローナル抗体に関して確認された。

作用機序
ＩｄｅＳは、抗体の一方の鎖を先ず加水分解し、その加水分解の際に、第２の鎖に対して低い親和性を有することが公知である。よって、多くの抗体は、反応の開始時に部分的にしか加水分解され得ない。ＩｄｅＳＯＲＫ２．０はまた、１つの鎖の切断を有するフラグメントを生成するが、これらのうちの大部分は、迅速に完全な切断へとプロセシングされる（図６）。上記第２の鎖に対する親和性は決定されていないが、活性は一度に１本の鎖を媒介することは明らかである。

至適条件
ＩｄｅＳＯＲＫ２．０の至適条件を、Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ実験デザインを使用して評価して、多数の要因およびそれらの相互依存性を評価した。本発明者らは、上記プロテアーゼに関してｐＨ、ＮａＣｌおよび温度の重要性をアッセイした。その結果を図７にまとめる。ＩｄｅＳＯＲＫ２．０は、ｐＨ７．０～８．５において非常に活性であり、顕著な活性の低下なしに２００ｍＭまでのＮａＣｌに耐える。その活性は、室温と比較して、３７℃でインキュベートされる場合に改善される。酵素反応は、基質濃度によって主に駆動される（高濃度が反応に都合が良い）が、酵素濃度は二次的である。このことはまた、低パーセンテージのＩｇＧが長期間のインキュベーションの後ですら容易に加水分解されていないことから理解され得る（図９）。まとめると： 至適ｐＨ（範囲）： ７．５（６．５～８．５； ＞９０％ 活性）、至適ＮａＣｌ（範囲）： ０ｍＭ（０～２００ｍＭ； ＞９０％ 活性）、補因子または還元剤に関する要件はなく、ＩｇＧに対して高い特異性。

時間－用量アッセイ
基質および酵素濃度の影響、および反応が完了する（＞９５％ 加水分解）ために必要とされる時間を調査するために、新たなＢｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎアッセイをデザインした（図８）。データは、類似の結果とともに、旧来のアッセイによって裏付けられた（図９）。ＩｄｅＳＯＲＫ２．０は、その物質の大部分を極めて迅速に加水分解するが、他の免疫グロブリンプロテアーゼと同様に、無傷のＩｇＧの最後のパーセンテージの加水分解を終えるにはより長い時間を必要とする。１：４０の比で、ＩｇＧの＞９５％が３０～６０分間で加水分解される。

他のＩｇＧプロテアーゼとの比較
ＩｄｅＳＯＲＫ２．０の活性をさらに調べるために、その活性を、ＩｄｅＳおよびＩｄｅＺと、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の両方に対して比較した。全ての酵素は、表面上は、同一な様式において、しかしわずかに異なる効率で抗体を加水分解することができた（図１０）。

他のＩｇＧプロテアーゼとの配列比較
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを、ＩｄｅＳＯＲＫ、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０、ＩｄｅＳおよびＩｄｅＺの配列に関して行った（図１３Ａ）。ＩｄｅＳに長さは匹敵するが、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０は、整列させた配列においてＩｄｅＳとおよそ２５％の同一性、４２％の類似性を有するに過ぎず、これは、ＩｄｅＳとＩｄｅＺとの間の類似性より顕著に低い。ＩｄｅＳおよびＩｄｅＺは、互いと６２％の同一性、７４％の類似性を有し、系統樹では一緒にクラスター化される（図１４Ｂ）。ＩｄｅＳＯＲＫおよびその短縮化した形態ＩｄｅＳＯＲＫ２．０はともに、互いと関連するが、ＩｄｅＳおよびＩｄｅＺに対しては遠縁である。図１４は、他の公知のＩｇＧヒドロラーゼに対するＩｄｅＳＯＲＫ２．０（Ｘｏｒｋ）のパーセンテージ類似性および同一性、ならびにＸｏｒｋ 対 ＩｄｅＳおよびＩｄｅＺのアミノ酸配列アラインメントを示す。

ヒト血清におけるＩｇＧヒドロラーゼの活性
ＩｄｅＳおよびＩｄｅＺと同様に、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０は、ヒト血清の存在下で免疫グロブリン切断活性を明らかに示した（図１５）。これは、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０が、臨床環境において適用を有することを明らかに示す。

ＩＶＩＧにおける抗ＩｇＧヒドロラーゼ抗体の蔓延
ヒト集団における抗ＩｇＧヒドロラーゼ抗体の蔓延を、ＥＬＩＳＡによって評価し、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺおよびＩｄｅＳＯＲＫ２．０に結合するＩＶＩＧのウェスタンブロット分析を評価した（図１８ＡおよびＢ）。ＩｄｅＳに対する抗体は優勢であった。ＩｄｅＺに結合する抗体は有意に少なく、ＩｄｅＳＯＲＫ２．０に関してはさらにより少なかった。ＩｄｅｓＳＯＲＫ２．０は、ＩＶＩＧとの反応性がほとんどないことが明らかに示され、これは、抗ＩｄｅｓＳＯＲＫ２．０抗体がヒトにおいて一般的でないことを示す。

材料および方法
組換えタンパク質の発現および精製
ベクター（２０ｎｇ）を、製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３ ＳＴＡＲ細胞に形質転換した。ベクター配列を、ＩｄｅＳＯＲＫ１．０に関しては配列番号１８およびＩｄｅＳＯＲＫ２．０に関しては配列番号１９として提供する。使用したベクターは、ｐｅｔ２１ａ＋であった。１００μｇ／ｍＬ アンピシリンを補充したＬＢ中、３７℃、２００ｒｐｍで増殖させた細菌の一晩の培養物を使用して、新鮮なＬＢ（１００μｇ／ｍＬ アンピシリンを補充）に１：４０の比で接種する。ＯＤ６００が約０．６～０．８に達するまでインキュベーションを継続し、その際に、温度を３０℃へと低下させ、タンパク質発現を、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって誘導する。発現は、細胞が収集されるまで５時間継続し、－２０℃でさらに処理するまで貯蔵する。

凍結した細胞を融解し、超音波処理を介する溶解の前に、結合緩衝液（５ｍＬ／ｇ 細胞； ２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）中に再懸濁した。不溶性の細胞デブリを遠心分離（１１０００ｇ、２０分、４℃）によって除去し、溶解物を、予備平衡化したＨｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐを使用して精製し、ＰＤ１０カラムでＴＢＳへと緩衝液交換した。全ての材料を、生成物の純度および質の決定のために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＮａｎｏｄｒｏｐで分析した。

ＬＣ－ＭＳを使用する特異性決定
サブユニットフラグメントを変性させ、還元し、続いて、逆相ＬＣ－ＭＳ分析に供した。分離を、ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ（４５０Å、２．７μｍ ２．１×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ（移動相として水中０．１％ ギ酸および９５％アセトニトリル中０．１％ ギ酸）を使用して達成し、Ｂｒｕｋｅｒ Ｉｍｐａｃｔ ＩＩ ＱＴＯＦ質量分析計に連結したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０／１２９０ ＵＨＰＬＣシステムで実行した。その得られたデータを、デコンボリューションのためのＭａｘＥｎｔアルゴリズムおよびモノアイソトピック分子量の決定のためのＳＮＡＰアルゴリズムを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｍｐａｓｓ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアで評価した。

一般的なプロテアーゼ活性決定
一般的なプロテアーゼ活性を、ＥｎｚＣｈｅｋ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙキットを使用して、製造業者の説明書に従って決定した。陽性コントロールとして一般的なプロテアーゼＦａｂＵＬＯＵＳ（ＳｐｅＢ、５μｇ）を、陰性コントロールとしてＩｇＧ特異的プロテアーゼＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（ＩｄｅＳ、１０μｇ）を使用した。ＩｄｅＳＯＲＫ２．０を、１０μｇの合計量まで添加した。

プロテアーゼインヒビターアッセイ
ＩｇＧ１（トラスツズマブ）を、プロテアーゼインヒビターのセット（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに予めインキュベートし、その後、ＩｄｅＳｏｒｋ２．０（配列番号３のもの）を添加し（１：５）、その混合物を、３７℃で一晩インキュベートさせ、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。

免疫グロブリン特異性
種々の抗体および抗体ベースの治療薬を、Ｘｏｒｋ、ＩｄｅＳ、またはＩｄｅＺとともに（１：４０比）、１時間、３７℃においてＰＢＳ中、基質濃度を２～５ｍｇ／ｍＬの範囲にしてインキュベートし、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。動態試験のために、２～２００μＭ ＩＶＩＧの基質レベルを、３７℃で１０分間の間に使用し、その後、ＵＨＰＬＣシステムで分析した。

尿素変性させ、還元したＩｇＧを、ＩｇＧ特異的酵素とともに、Ｅ：Ｓ比 １：１０でインキュベート（５時間、３７℃でインキュベートする）し、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。

血清活性アッセイに関しては、Ｅ：Ｓ比 １：４０（血清中１０ｍｇ／ｍＬ ＩｇＧと想定）を使用し、０～４時間、３７℃でインキュベートし、その後、非還元的ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。全ての酵素は、Ｇｅｎｏｖｉｓ ＡＢによって供給された。

活性アッセイ
酵素がその活性を発揮するために必要とされる至適条件をよりよく理解するために、Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎデザインを、実験のために使用した。ＮａＣｌの添加（０～４００ｍＭ）、ｐＨ（５．５～８．５）、［酵素］、［基質］、時間、および温度が、調査したパラメーターであった。別段注記されなければ、全ての実験を、ＴＢＳ中、酵素：基質比 １：２０、１時間、３７℃で行った。

ＥＬＩＳＡ
タンパク質（ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、Ｘｏｒｋ； ０．５～２μｇ／ｍＬ）を、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３ ｐＨ ９．６中で熱変成させた（７０℃、１０分）。酵素を、９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ， ＮＵＮＣ）に三連で添加し、４℃で一晩インキュベートした。上記ウェルを、ＴＢＳＴスキムミルク（５％）中、室温で２時間ブロックし、洗浄し、ＴＢＳＴスキムミルク中で希釈した一次抗体（ＩＶＩＧ； ０．００５ｍｇ／ｍＬ）を添加した（１時間、３７℃）。そのプレートを洗浄し、その後、二次抗体（抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ， １：３０００）を添加し、１時間、３７℃でインキュベーションを継続した。上記ウェルを洗浄し、その後、１００μｌのＴＭＢ単独溶液を添加した。そのプレートを室温においてプレートリーダーの中で、４５分間連続して読み取りながらインキュベートし、６５０ｎｍの吸光度を測定した。

ウェスタンブロット
ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺおよびＸｏｒｋ（０．１～２．５μｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、膜に転写した。４℃において一晩ＴＢＳＴスキムミルク（５％）でブロックしたあと、一次抗体（ＩＶＩＧ、５μｇ／ｍＬ）を添加し、２時間、室温でインキュベートした。その膜を洗浄し、二次抗体（抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ、１：１０００）を添加した。その膜を徹底的に洗浄し、その後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｐｌｕｓ化学発光基質を添加した。シグナルをＣｈｅｍｉＤｏｃで測定した。

本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン、代表的にはＩｇＧを切断するための種々の方法において有用である。従って、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物を、例えば、ＩｇＧが存在するサンプルまたは被験体に投与する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。ＩｇＧと、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物とを接触させる工程を包含する方法がまた、提供される。上記方法は、免疫グロブリンを切断する方法であってもよく、必要に応じて、上記切断生成物の検出または分析をさらに含んでいてもよい。上記方法は、疾患を処置する方法であって、上記方法は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物を被験体に投与する工程を包含する方法であり得る。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、必要に応じて操作されたポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１の配列のＮ末端フラグメントであるアミノ酸配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列、
を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド。
（項目２）
Ｎ末端においてさらなるメチオニン、および／またはＣ末端においてタンパク質精製もしくは他のタグを含むように操作され、前記タグは、リンカーによって前記Ｃ末端に結合され得る、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
配列番号３のアミノ酸を含むまたはそれからなる、項目１または２に記載のポリペプチド。
（項目４）
配列番号４～８のいずれか１つに示されるとおりのＣＨ２／ヒンジ配列を含む任意の免疫グロブリン分子に対してプロテアーゼ活性を有し、ここで前記ポリペプチドは、前記ＣＨ２／ヒンジ配列を、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従ってヒトＩｇＧの位置２４９および２５０（ＥＵ番号付けシステムに従って位置２３６および２３７）に相当する位置の間で切断する、前述の項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目５）
ＩｇＧに対してプロテアーゼ活性を有し、前記ＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、マウスＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ３、またはモルモットもしくはウマに由来するＩｇＧであり得る、前述の項目のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目６）
前述の項目のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
（項目７）
項目６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞は、好ましくは細菌細胞であり、好ましくは連鎖球菌種の細胞でなく、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉの細胞である、宿主細胞。
（項目８）
前記ポリペプチドは、溶液中に、凍結乾燥されて、または固定化されて、必要に応じて、有効量の少なくとも１種の賦形剤とともに提供され、前記賦形剤は、好ましくは保存剤である、項目１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目９）
項目１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドを、少なくとも１種の賦形剤とともに含む組成物であって、前記賦形剤は、好ましくは保存剤であり；必要に応じてここで前記組成物は、薬学的に受容可能である、組成物。
（項目１０）
項目１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドを、ＩｇＧが存在するサンプルまたは被験体に投与する工程を包含する方法。
（項目１１）
項目１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドを、ＩｇＧが存在するサンプルに投与する工程を包含する、インビトロでの方法。
（項目１２）
前記方法は、サンプル中のＩｇＧのエキソビボでの切断のためであり、前記方法は、前記ポリペプチドを前記サンプルに投与する工程、およびＩｇＧプロテアーゼ活性に適した条件下でインキュベートする工程を包含する、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１３）
前記方法は、得られた切断生成物の分離、検出または分析をさらに含む、および／または前記方法は、ＦｃおよびＦａｂフラグメントを生成する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
項目６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを、ＩｇＧが存在するサンプルまたは被験体に投与する工程を包含する方法。
（項目１５）
項目９に記載の組成物を、ＩｇＧが存在するサンプルまたは被験体に投与する工程を包含する方法。
（項目１６）
前記方法は、被験体における疾患または状態の防止または処置のためのものであり、前記方法は、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、または組成物を、予防上または治療上有効な量において前記被験体に投与する工程を包含する、項目１０、１４または１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
前記疾患または状態は、全体的にまたは部分的に、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患または状態である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記疾患または状態は、（ｉ）全体的にまたは部分的に、ＩｇＧ抗体によって媒介される自己免疫疾患； （ｉｉ）前記被験体によって受容される器官または組織移植片のＩｇＧ媒介性拒絶； あるいは（ｉｉｉ）前記被験体に投与される治療剤に対するＩｇＧ媒介性抗薬物応答である、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１９）
被験体における疾患または状態の処置または防止における使用のための、項目１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター、あるいは項目９に記載の組成物。
（項目２０）
被験体における疾患または状態の処置または防止のための医薬の調製における項目１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター、あるいは項目９に記載の組成物の使用。
（項目２１）
前記疾患または状態は、全体的にまたは部分的に、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患または状態である、項目１９に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物、あるいは項目２０に記載の使用。
（項目２２）
前記疾患または状態は、（ｉ）全体的にまたは部分的に、ＩｇＧ抗体によって媒介される自己免疫疾患； （ｉｉ）前記被験体によって受容される器官または組織移植片のＩｇＧ媒介性拒絶； あるいは（ｉｉｉ）前記被験体に投与される治療剤に対するＩｇＧ媒介性抗薬物応答である、項目１９に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物、あるいは項目２０に記載の使用。
（項目２３）
被験体に対する、治療剤、例えば治療用抗体の利益を改善するための方法であって、前記方法は、項目１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター、あるいは項目９に記載の組成物を投与する工程を包含し、前記方法は、ｉ）前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、または組成物を、予防上または治療上有効な量において前記被験体に投与する工程、およびｉｉ）治療剤、例えば、治療用抗体を、前記被験体に投与する工程、例えば、引き続いて投与する工程を包含する、方法。

Claims (23)

1. 免疫グロブリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、必要に応じて操作されたポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドは、
   （ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列；
   （ｃ）配列番号１の配列のＮ末端フラグメントであるアミノ酸配列；
   （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列、
   を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド。
2. Ｎ末端においてさらなるメチオニン、および／またはＣ末端においてタンパク質精製もしくは他のタグを含むように操作され、前記タグは、リンカーによって前記Ｃ末端に結合され得る、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 配列番号３のアミノ酸を含むまたはそれからなる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 配列番号４～８のいずれか１つに示されるとおりのＣＨ２／ヒンジ配列を含む任意の免疫グロブリン分子に対してプロテアーゼ活性を有し、ここで前記ポリペプチドは、前記ＣＨ２／ヒンジ配列を、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従ってヒトＩｇＧの位置２４９および２５０（ＥＵ番号付けシステムに従って位置２３６および２３７）に相当する位置の間で切断する、前述の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
5. ＩｇＧに対してプロテアーゼ活性を有し、前記ＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、マウスＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ３、またはモルモットもしくはウマに由来するＩｇＧであり得る、前述の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
6. 前述の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
7. 請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞は、好ましくは細菌細胞であり、好ましくは連鎖球菌種の細胞でなく、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉの細胞である、宿主細胞。
8. 前記ポリペプチドは、溶液中に、凍結乾燥されて、または固定化されて、必要に応じて、有効量の少なくとも１種の賦形剤とともに提供され、前記賦形剤は、好ましくは保存剤である、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
9. 請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドを、少なくとも１種の賦形剤とともに含む組成物であって、前記賦形剤は、好ましくは保存剤であり；必要に応じてここで前記組成物は、薬学的に受容可能である、組成物。
10. 請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドを、ＩｇＧが存在するサンプルまたは被験体に投与する工程を包含する方法。
11. 請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドを、ＩｇＧが存在するサンプルに投与する工程を包含する、インビトロでの方法。
12. 前記方法は、サンプル中のＩｇＧのエキソビボでの切断のためであり、前記方法は、前記ポリペプチドを前記サンプルに投与する工程、およびＩｇＧプロテアーゼ活性に適した条件下でインキュベートする工程を包含する、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 前記方法は、得られた切断生成物の分離、検出または分析をさらに含む、および／または前記方法は、ＦｃおよびＦａｂフラグメントを生成する、請求項１２に記載の方法。
14. 請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを、ＩｇＧが存在するサンプルまたは被験体に投与する工程を包含する方法。
15. 請求項９に記載の組成物を、ＩｇＧが存在するサンプルまたは被験体に投与する工程を包含する方法。
16. 前記方法は、被験体における疾患または状態の防止または処置のためのものであり、前記方法は、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、または組成物を、予防上または治療上有効な量において前記被験体に投与する工程を包含する、請求項１０、１４または１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記疾患または状態は、全体的にまたは部分的に、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患または状態である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記疾患または状態は、（ｉ）全体的にまたは部分的に、ＩｇＧ抗体によって媒介される自己免疫疾患； （ｉｉ）前記被験体によって受容される器官または組織移植片のＩｇＧ媒介性拒絶； あるいは（ｉｉｉ）前記被験体に投与される治療剤に対するＩｇＧ媒介性抗薬物応答である、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 被験体における疾患または状態の処置または防止における使用のための、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター、あるいは請求項９に記載の組成物。
20. 被験体における疾患または状態の処置または防止のための医薬の調製における請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター、あるいは請求項９に記載の組成物の使用。
21. 前記疾患または状態は、全体的にまたは部分的に、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患または状態である、請求項１９に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物、あるいは請求項２０に記載の使用。
22. 前記疾患または状態は、（ｉ）全体的にまたは部分的に、ＩｇＧ抗体によって媒介される自己免疫疾患； （ｉｉ）前記被験体によって受容される器官または組織移植片のＩｇＧ媒介性拒絶； あるいは（ｉｉｉ）前記被験体に投与される治療剤に対するＩｇＧ媒介性抗薬物応答である、請求項１９に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組成物、あるいは請求項２０に記載の使用。
23. 被験体に対する、治療剤、例えば治療用抗体の利益を改善するための方法であって、前記方法は、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクター、あるいは請求項９に記載の組成物を投与する工程を包含し、前記方法は、ｉ）前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、または組成物を、予防上または治療上有効な量において前記被験体に投与する工程、およびｉｉ）治療剤、例えば、治療用抗体を、前記被験体に投与する工程、例えば、引き続いて投与する工程を包含する、方法。

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