CN115998690B

CN115998690B - 包含免疫球蛋白g降解酶的冻干制剂及其制备工艺

Info

Publication number: CN115998690B
Application number: CN202211404514.4A
Authority: CN
Inventors: 王双; 胡倩; 刘亚辉; 高飞; 赵小平; 刘宾
Original assignee: Shanghai Tianze Yuntai Biomedical Co ltd; Shanghai Taichang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Tianze Yuntai Biomedical Co ltd; Shanghai Taichang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-10
Filing date: 2022-11-10
Publication date: 2024-07-26
Anticipated expiration: 2042-11-10
Also published as: CN115998690A

Abstract

本发明提供一种免疫球蛋白G降解酶(IdeS)的冻干制剂。本发明还提供用于制备所述冻干制剂的液体药物组合物和冻干方法，以及通过复配所述冻干制剂获得的复配制剂。

Description

包含免疫球蛋白G降解酶的冻干制剂及其制备工艺

技术领域

本发明提供一种免疫球蛋白G降解酶IdeS的冻干制剂。具体而言，所述冻干制剂可以复配为用于胃肠外施用的复配制剂，如复配注射剂。本发明还涉及用于制备所述冻干制剂的液体组合物和冻干方法。

背景技术

酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶(Immunoglobulin G-degrading enzyme ofStreptococcus pyogenes，IdeS)是一种典型的半胱氨酸水解酶。IdeS最初从血清型为M1的A组链球菌菌株中被分离得到。IdeS具有极高的底物特异性，仅识别IgG铰链区的特定位点(CH1结构域和CH2结构域之间)进行切割，以产生F(ab’)₂和Fc片段。IdeS能够切割多种动物来源的IgG，其底物特异性、切割位点的专一性使其在抗体药物或Fc融合蛋白药物的结构解析中得到广泛应用。

近年来，IdeS的酶切特性也得到了开发和利用。例如，基于IdeS能够切割免疫球蛋白的能力，将IdeS作为一种免疫抑制剂应用于人类免疫疾病及器官移植等领域。另一方面，IdeS作为一种蛋白类制剂/药物，需要能够稳定保存的配方组成和剂型，具有延长货架期，保证经过一定保存时间后仍然具有理想的纯度与活性。稳定的制剂也便于运输和贮存。

目前未见报道关于IdeS蛋白酶制剂的研究。开发IdeS蛋白酶制剂的挑战在于，作为一种半胱氨酸蛋白酶，IdeS蛋白酶的活性中心为游离半胱氨酸，因而可以预见其蛋白稳定性较差，容易形成二聚体或高聚体。

蛋白类药物的制剂形式多为注射液或冻干粉剂。无法冻干的蛋白采用液体注射剂剂型，通常需要超低温冻存(一般小于-60℃)，但超低温冻存的保存和运输成本较高。因此，如何稳定IdeS蛋白酶的构象、保证酶活性、避免产生二聚体或高聚体、延长常温或低温下的保存时间，成为制备稳定IdeS制剂过程中的挑战。

发明内容

发明人对IdeS酶的配方组成及剂型(保存体系)进行了系统研究，确定了一种能够稳定保存的IdeS酶制剂的配方组成，其适合于制备为冻干制剂并稳定保持，并且在复配之后具有理想的活性，由此完成了本发明。

因此，第一方面，本发明提供一种液体药物组合物，其包含：

(a)免疫球蛋白G降解酶(IdeS)；

(b)冻干保护剂；

(c)表面活性剂；

(d)金属螯合剂；和

(e)缓冲剂。

优选地，所述液体药物组合物的pH为7.2～7.5。

在第一方面的优选实施方案中，所述液体药物组合物包含：

(a)8～12mg/ml的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)；

(b)0.1mg/ml～0.5mg/ml的聚山梨酯80；

(c)1.5mmol/L～3mmol/L乙二胺四乙酸二钠；

(d)3％的甘露醇和3％的蔗糖；和

(e)磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲剂；并且

所述液体药物组合物的pH为7.2～7.5。

所述液体药物组合物特别适合用于制备IdeS酶的冻干制剂。

第二方面，本发明提供一种IdeS酶的冻干制剂的制备方法，包括对第一方面的液体药物组合物按照如下条件进行冻干：

(1)在5℃至-50℃进行2至10小时的预冻；

(2)在-20℃至-30℃进行4至25小时的一次升华；

(3)在-5℃至35℃进行4至18小时的二次升华。

在第二方面的一个具体实施方案中，所述冻干如下进行：

(1)预冻阶段，依次设置

设定温度：5℃，设定时间5min，保持时间30min；

设定温度：-45℃，设定时间50min，保持时间120min；

设定温度：-10℃，设定时间30min，保持时间120min；

设定温度：-45℃，设定时间30min，保持时间120min；

(2)一次升华阶段，依次设置

设定温度：-30℃，设定时间180min，保持时间900min，真空度：0.2mbar；

设定温度：-20℃，设定时间60min，保持时间300min，真空度：0.2mbar；

(3)二次升华阶段，依次设置

设定温度：-5℃，设定时间60min，保持时间120min，真空度：0.2mbar；

设定温度：15℃，设定时间60min，保持时间120min，真空度：0.2mbar；

设定温度：30℃，设定时间30min，保持时间120min，真空度：0.1mbar；

设定温度：35℃，设定时间60min，保持时间300min，真空度：0.1mbar；

设定温度：35℃，设定时间30min，保持时间120min，真空度：0.0mbar。

第三方面，本发明提供一种IdeS酶的冻干制剂，其在单一容器中包含：

(a)免疫球蛋白G降解酶(IdeS)；

(b)冻干保护剂；

(c)表面活性剂；

(d)金属螯合剂；和

(e)缓冲剂。

优选地，所述冻干制剂通过第二方面的方法获得。

第四方面，本发明提供一种IdeS酶的复配制剂，其在单一容器中包含：

(a)免疫球蛋白G降解酶(IdeS)；

(b)冻干保护剂；

(c)表面活性剂；

(d)金属螯合剂；

(e)缓冲剂和

(f)至少1ml的无菌水。

第五方面，本发明提供第一方面的液体药物组合物用于制备冻干制剂的方法。

本发明至少具有如下优势：

本发明首次对IdeS的配方及剂型进行了探索，确定了IdeS的稳定冻干制剂的配方，及冻干工艺。

在所述冻干制剂中，IdeS能够长期稳定储存并保持较高的酶活性。所述冻干工艺提供的IdeS冻干产品外观合格，水分<2％，有利于长期保存，为IdeS作为一种生物药品的工业化生产及商业化应用奠定了基础。

附图说明

图1显示了本发明的IdeS酶液体组合物(原液)在反复冻融后的稳定性考察结果。XH1:1次冻融循环后；XH3:3次冻融循环后；XH5:5次冻融循环后。

图2显示了使用不同缓冲体系的IdeS液体组合物(原液)在30℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第14天、第21天)。

图3显示了使用不同浓度的聚山梨酯80的IdeS液体组合物在30℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第14天、第21天)。

图4显示了使用不同浓度的乙二胺四乙酸二钠盐的IdeS液体组合物在在30℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第14天、第21天)。

图5显示了使用不同冻干保护剂的IdeS液体组合物在30℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第14天、第21天)。

图6显示了不同pH的IdeS液体组合物在30℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第14天、第21天)。

图7显示了不同主药浓度的IdeS液体组合物在30℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第14天、第21天)。

图8显示了使用不同缓冲体系的IdeS冻干制剂在37℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第5天、第10天)。

图9显示了使用不同浓度的聚山梨酯80的IdeS冻干制剂在37℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第5天、第10天)。

图10显示了使用不同浓度的乙二胺四乙酸二钠盐的IdeS冻干制剂在37℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第5天、第10天)。

图11显示了使用不同冻干保护剂的IdeS冻干制剂在37℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第5天、第10天)。

图12显示了不同pH的IdeS冻干制剂在37℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第5天、第10天)。

图13显示了不同主药浓度的IdeS冻干制剂在37℃的纯度和酶活性的稳定性(第0天、第5天、第10天)。

发明详述

定义

在本文中，术语“制剂”、“组合物”、“药物制剂”和“药物组合物”可互换使用。

本发明的制剂可以为液体制剂或固体制剂。为液体制剂时，蛋白存在于诸如注射用水(WFI)等介质中。为固体制剂时，可通过混合固体成分或蒸发溶剂介质制备，在本发明中固体制剂可以为冻干制剂。

术语“液体药物组合物”在本文中通常指进行冻干之前的组合物，除非另行说明。冻干之前的液体组合物已经包含冻干制剂中所含有的全部成分。

术语“冻干”是指通过冷冻升华去除水的处理方法。

术语“冻干制剂”指液体组合物通过冻干后获得的制剂。

术语“复配制剂”指通过向冻干制剂添加溶剂后获得的制剂。

术语“赋形剂”和“辅料”可互换使用，在药品中不具药理作用的成分，可用于提供所需的黏稠度、改善稳定性和/或调整组合物的渗透压。本发明的赋形剂的实例为缓冲剂、蛋白质稳定剂、聚合物、增溶剂、冻干保护剂、填充剂/稀释剂或其混合物。

制剂的“稳定性”在本发明的上下文中可以指制剂中酶活性在经过处理(如冻融、冻干)之后相较于未经处理之前的酶活性和纯度不会表现出明显的变化，或表现出尽量小的变化；也可以指酶活性和纯度在经历一段时间之后相较于新制备时的酶活性不会表现出明显的变化，或表现出尽量小的变化。

术语“稳定期”是指制剂和制剂中的活性成分保持其所有特性(例如同一性、强度、质量、纯度和活性)的时间段。

IdeS

作为本发明的冻干制剂中的有效成分，酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶(Immunoglobulin G-degrading enzyme of S.pyogenes，IdeS)是一种典型的半胱氨酸水解酶。在本发明的实施方案中，例如，所述IdeS是一种重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示。所述重组IdeS具有接近35kDa的分子量。

用于本发明的IdeS可以通过本领域的常规方法获得，例如通过重组表达产生。

对于本发明用于制备冻干制剂的液体药物组合物而言，可以以约8mg/ml至约12mg/ml，甚至更高的浓度包含IdeS。发明人惊讶地发现相对于包含低浓度(如8mg/ml)的IdeS的液体组合物制备的冻干制剂而言，高浓度(如10mg/ml)的IdeS的液体组合物制备的冻干制剂在长时间维持活性和纯度方面表现更好。因此，在优选的实施方案中，本发明中用于冻干的液体药物组合物包含8mg/ml以上的IdeS，优选10mg/ml的IdeS。

对于本发明的冻干制剂而言，可以在单一容器如2ml西林瓶中包含约8mg至24mg的IdeS，优选约10mg至20mg，更优选10mg至15mg。

缓冲剂和pH值

任选地，本发明的液体药物组合物的pH范围在5～8之间，更优选地，pH在6.5～7.8之间。

可采用缓冲剂来维持理想的pH值。例如，所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl或磷酸盐，含量在10-100mmol/L之间，更优选地，在15-50mmol/L之间。

在本发明的优选实施方案中，磷酸盐缓冲剂由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成。在具体的实施方案中，调整所述磷酸盐缓冲剂中盐的比例使液体药物组合物的pH在7.2至7.5之间。例如，所述液体药物组合物中的磷酸二氢钠以4.0-14.0mmol/L的浓度存在，和/或磷酸氢二钠以11.0-36.0mmol/L的浓度存在。

对于本发明的冻干制剂而言，可以在单一容器如2ml西林瓶中包含约0.5-2.0mg，优选0.77-1.54mg的一水磷酸二氢钠；和/或1.5-5.0mg，优选2.04-4.08mg的无水磷酸氢二钠。

冻干保护剂

在优选的实施方案中，本发明的用于制备冻干制剂的液体药物组合物和制得的冻干制剂还包含冻干保护剂。

优先地，采用糖类作为冻干保护剂。在一个实施方案中，所述糖类为选自：蔗糖、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、甘油、乳糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、棉子糖、麦芽糖、葡聚糖、肌醇中的一种或多种，优选选自蔗糖、葡萄糖、甘露醇、海藻糖。

在一个实施方案中，本发明的液体药物组合物和冻干制剂中包含两种或更多种糖类作为冻干保护剂。

例如，在本发明的液体药物组合物中，作为冻干保护剂的糖类可以以约2～12％，更优选5～10％，更优选约6～8％的量添加。在没有特殊说明的情况下，在本文中涉及冻干保护剂例如糖类的百分比含量数值均为重量/体积百分比(w/v％)。

优选地，使用蔗糖或甘露醇或两者的组合作为冻干保护剂。例如，在本发明的液体药物组合物中，蔗糖可以以2～12％，更优选5～10％，更优选约6～8％的量添加。例如，甘露醇可以以2～12％，更优选5～10％，更优选约6～8％的量添加。

发明人发现当使用特定量的蔗糖和甘露醇的组合作为冻干保护剂时，其他条件可以适当灵活地变化，仍然能够保证获得的冻干制剂具有较为优秀的稳定性。在一个更优选的实施方案中，所述液体药物组合物和冻干制剂中作为冻干保护剂的糖类为蔗糖和甘露醇。优选地，所述蔗糖和甘露醇按重量计以大约1:2至2:1的比例存在，更优选以大约1:1的比例存在。在更优选的实施方案中，所述液体药物组合物中包含蔗糖和甘露醇的组合作为冻干保护剂，其中所述蔗糖的量为2～6％，优选3～5％，更优选3％，并且所述甘露醇的量为2～6％，优选3～5％，更优选3％。在一个具体的实施方案中，所述冻干保护剂是约3％的蔗糖和约3％的甘露醇。

对应地，对于本发明的冻干制剂而言，可以在单一容器中包含20-200mg，优选30-160mg的蔗糖，和/或20-200mg，优选30-160mg的甘露醇。在优选的实施方案中，同时使用蔗糖和甘露醇作为冻干保护剂。例如，可以在单一容器如2ml西林瓶中包含约30-60mg的蔗糖和30-60mg的甘露醇。

表面活性剂

在优选的实施方案中，本发明的用于制备冻干制剂的液体药物组合物和制得的冻干制剂还包含表面活性剂。表面活性剂在制备冻干制剂的过程中可以发挥助溶的作用。

在一个具体的实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80。对于本发明用于制备冻干制剂的液体药物组合物而言，聚山梨酯80可以以约0.01～1mg/ml，更优选0.1～0.5mg/ml的量添加。

对于本发明的冻干制剂而言，可以在单一容器如2ml西林瓶中包含约0.01-2mg，优选0.1-1mg的聚山梨酯80。

金属螯合剂

在优选的实施方案中，本发明的用于制备冻干制剂的液体药物组合物和制得的冻干制剂还包含金属螯合剂。

在一个具体的实施方案中，所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠(依地酸二钠)。对于本发明用于制备冻干制剂的液体药物组合物而言，乙二胺四乙酸二钠可以以约1-5mmol/L，更优选1.5-3.0mmol/L的量添加。

对于本发明的冻干制剂而言，可以在单一容器如2ml西林瓶中包含约0.37-3.73mg的乙二胺四乙酸二钠，如0.56-2.24mg的乙二胺四乙酸二钠。

水

本发明的用于制备冻干制剂的液体药物组合物包含水作为溶剂。优选地，所述水为注射用水。

对于冻干制剂而言，则应将水含量控制在相对较低的范围内。例如，按照冻干制剂的总重量计，本发明的冻干制剂含有小于5％的水，优选小于3％，更优选小于2％，还更优选小于1.5％。

在复配所述冻干制剂时，可以使用水作为复配溶剂。优选地，使用无菌注射用水将本发明的冻干制剂复配为复配制剂。本发明的复配制剂在单一容器中包含至少1ml的水，例如至少1.2ml、至少1.5ml、至少2ml或更多。

液体药物组合物

本发明提供的用于进行冻干的液体药物组合物是保证获得稳定的IdeS冻干制剂的关键。

在一个具体的实施方案中，所述液体药物组合物具有如下组成和特征，其中溶剂为注射用水：

冻干制剂的制备

用于制备本发明的冻干产品的冻干方法可包括以下步骤：

(1)提供包含IdeS的液体药物组合物，

(2)按照如下步骤对步骤(1)中的液体药物组合物进行冻干，从而获得冻干制剂，

(2-1)在5℃至-50℃进行2至10小时的预冻；

(2-2)在-20℃至-30℃进行4至25小时的一次升华；

(2-3)在-5℃至35℃进行4至18小时的二次升华。

在优选的实施方案中，在升华过程中，将真空度保持在0.2mbar以下。

发明人针对本发明的IdeS配方进一步优化了冻干的具体条件。在一个具体的实施方案中，所述冻干步骤如下进行：

(2-1)预冻阶段，依次设置

设定温度：5℃，设定时间5min，保持时间30min；

设定温度：-45℃，设定时间50min，保持时间120min；

设定温度：-10℃，设定时间30min，保持时间120min；

设定温度：-45℃，设定时间30min，保持时间120min；

(2-2)一次升华阶段，依次设置

(2-3)二次升华阶段，依次设置

容器

适合于容纳本发明的冻干制剂的容器优选为玻璃容器。所述容器的具体实例包括但不限于西林瓶、玻璃药瓶、安瓿瓶。在一个具体实施方案中，使用西林瓶，例如2ml规格的西林瓶。

在优选的实施方案中，将本发明的冻干制剂以单位剂量置于单一容器中。所述单位剂量可以是包含指定量的IdeS的剂量。本领域技术人员能够根据冻干前的液体药物组合物中IdeS的浓度、期望的IdeS单次用量、复配后的期望浓度等条件来确定适合的容器容积。

本发明至少包括以下各项实施方案：

1.一种液体药物组合物，其包含以下组分或由以下组分组成：

(a)免疫球蛋白G降解酶(IdeS)；

(b)冻干保护剂；

(c)表面活性剂；

(d)金属螯合剂；和

(e)缓冲剂。

2.实施方案1中所述的液体药物组合物，其用于制备冻干制剂。

3.实施方案1或2中所述的液体药物组合物，其中所述IdeS的氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示。

4.实施方案1-3中任一项所述的液体药物组合物，其中IdeS的含量为8-15mg/ml。

5.实施方案4中所述的液体药物组合物，其中IdeS的含量为10-15mg/ml。

6.实施方案1-5中任一项所述的液体药物组合物，其中所述冻干保护剂为糖类。

7.实施方案6中所述的液体药物组合物，其中所述糖类的浓度为3-12％。

8.实施方案1-7中任一项所述的液体药物组合物，其中所述冻干保护剂为蔗糖和/或甘露醇。

9.实施方案8所述的液体药物组合物，其中蔗糖的浓度为2-10％，优选3-8％。

10.实施方案8或9所述的液体药物组合物，其中甘露醇的浓度为2-10％，优选3-8％。

11.实施方案8-10中任一项所述的液体药物组合物，所述冻干保护剂为重量比为1:1的蔗糖和甘露醇。

12.实施方案8-11中任一项所述的液体药物组合物，所述冻干保护剂为3％的蔗糖和3％的甘露醇。

13.实施方案1-12中任一项所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂选自下组中的一种或多种：聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、山梨醇酐单月桂酸酯、山梨醇酐单硬脂酸酯、山梨醇酐三硬脂酸酯。

14.实施方案1-13中任一项所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨酯80。

15.实施方案13或14中所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂的量为0.1-0.5mg/ml。

16.实施方案1-15中任一项所述的液体药物组合物，其中金属螯合剂为选自下组中的一种或多种：乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸钠盐、乙二胺四乙酸钙。

17.实施方案16中所述的液体药物组合物，所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠。

18.实施方案1-17中任一项所述的液体药物组合物，其中所述金属螯合剂的量为1-5mmol/L，优选1.5-3.0mmol/L。

19.实施方案1-18中任一项所述的液体药物组合物，其中所述缓冲剂选自下组：三羟甲基胺基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、MOPS缓冲剂、HEPES缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂。

20.实施方案1-19中任一项所述的液体药物组合物，其pH为7.0-7.5，优选约pH7.2。

21.实施方案1-20中任一项所述的液体药物组合物，其中所述缓冲剂是磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲剂。

22.实施方案21所述的液体药物组合物，其中所述磷酸二氢钠以4.0-14.0mmol/L的浓度存在，和/或所述磷酸氢二钠以11.0-36.0mmol/L的浓度存在。

23.实施方案1-22中任一项所述的液体药物组合物，其中所述IdeS不含纯化标签。

24.实施方案1-23中任一项所述的液体药物组合物，其不包含动物源性辅料。

25.实施方案1-24中所述的液体药物组合物，其不包含BSA、HSA或FBS。

26.一种冻干制剂，其包含在单一容器中，并且包含以下组分或由以下组分组成：

(a)免疫球蛋白G降解酶(IdeS)；

(b)冻干保护剂；

(c)表面活性剂；

(d)金属螯合剂；和

(e)缓冲剂。

27.实施方案26所述的冻干制剂，其中所述IdeS的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

28.实施方案26或27中所述的冻干制剂，其中IdeS的含量为8mg至24mg。

29.实施方案26-28中任一项所述的冻干制剂，其中所述冻干保护剂为糖类。

30.实施方案29中所述的冻干制剂，其中所述冻干保护剂为蔗糖和/或甘露醇。

31.实施方案30所述的冻干制剂，其中所述冻干保护剂为重量比为1:1的蔗糖和甘露醇。

32.实施方案26-31中任一项所述的冻干制剂，所述冻干保护剂为30-60mg的蔗糖和30-60mg的甘露醇。

33.实施方案26-32中任一项所述的冻干制剂，其中所述表面活性剂选自下组中的一种或多种：聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、山梨醇酐单月桂酸酯、山梨醇酐单硬脂酸酯、山梨醇酐三硬脂酸酯。

34.实施方案26-33中任一项所述的冻干制剂，其中所述表面活性剂为聚山梨酯80。

35.实施方案26-34中任一项所述的冻干制剂，其中所述表面活性剂的量为0.1-1mg。

36.实施方案26-35中任一项所述的冻干制剂，其中金属螯合剂为选自下组中的一种或多种：乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸钠盐、乙二胺四乙酸钙。

37.实施方案36中所述的冻干制剂，所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠。

38.实施方案26-37中任一项所述的冻干制剂，其中所述金属螯合剂的量为0.37-3.73mg，优选0.56-2.24mg。

39.实施方案26-38中任一项所述的冻干制剂，其中所述缓冲剂选自下组：三羟甲基胺基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、MOPS缓冲剂、HEPES缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂。

40.实施方案39中所述的冻干制剂，所述缓冲剂由一水磷酸二氢钠和无水磷酸氢二钠组成。

41.实施方案26-40中任一项所述的冻干制剂，其中所述一水磷酸二氢钠的量为0.77-1.54mg，无水磷酸氢二钠的量为2.04-4.08mg。

42.实施方案26-39中任一项所述的冻干制剂，其中所述IdeS不含纯化标签。

43.实施方案26-40中任一项所述的冻干制剂，其不包含动物源性辅料。

44.实施方案26-41中所述的冻干制剂，其不包含BSA、HSA或FBS。

45.实施方案26-42中所述的冻干制剂，所述单一容器为西林瓶，例如2ml西林瓶。

46.实施方案26-43中所述的冻干制剂，其通过冻干实施方案1-23中任一项的液体药物组合物获得。

47.一种制备免疫球蛋白G降解酶的冻干制剂的方法，包括将实施方案1-26中任一项的液体药物组合物按照如下条件进行冻干：

(1)在5℃至-50℃进行2至10小时的预冻；

(2)在-20℃至-30℃进行4至25小时的一次升华；和

(3)在-5℃至35℃进行4至18小时的二次升华。

48.实施方案45中所述的方法，所述冻干如下进行：

(1)预冻阶段，依次设置

设定温度：5℃，设定时间5min，保持时间30min；

设定温度：-45℃，设定时间50min，保持时间120min；

设定温度：-10℃，设定时间30min，保持时间120min；

设定温度：-45℃，设定时间30min，保持时间120min；

(2)一次升华阶段，依次设置

(3)二次升华阶段，依次设置

49.实施方案44或45中所述的方法，其中在冻干之前，将所述液体药物组合物1.2ml/瓶灌装入2ml西林瓶中。

50.通过实施方案44-46中任一项所述的方法获得的免疫球蛋白G降解酶的冻干制剂。

51.实施方案1-25中任一项所述的液体药物组合物用于制备冻干制剂的用途。

52.一种复配制剂，其通过复配实施方案26-46和50任一项的冻干制剂获得。

53.实施方案52所述的复配制剂，其中所述复配通过向所述冻干制剂添加至少1ml注射用水获得。

具体实施方案

下面结合本发明实施例对本发明的技术方案进行具体的描述，本领域技术人员应该知道，这些实施例仅用于说明，并不意在以任何方式对具体的实施方案进行限制。

实施例1.IdeS蛋白酶的不同制剂配方的稳定性测定

本实施例测定了不同制剂配方的稳定性。

1.1材料和配方

下表中显示了各个试剂的来源。

本实施例中对以下参数的组合进行了筛选：

(1)活性成分浓度：8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml；

(2)缓冲体系：PB缓冲液20mmol/L(pH7.2)、PB缓冲液20mmol/L(pH7.5)、Tris-HCl20mmol/L(pH7.2)、Tris-HCl 20mmol/L(pH7.5)；

(3)螯合剂：EDTA-2Na 1.5mmol/L、EDTA-2Na 3mmol/L

(4)表面活性剂：0.1mg/ml聚山梨酯80、0.3mg/ml聚山梨酯80、0.5mg/ml聚山梨酯80；

(5)冻干保护剂：8％甘露醇、6％甘露醇、3％甘露醇+3％蔗糖

具体而言，按照下表1所示的配方配制了30种不同的IdeS蛋白酶处方样品F01～F30。

表1.IdeS蛋白酶制剂配方

按表1的配方，将除IdeS酶之外的其他成分和无菌水混合在一起形成溶液，然后通过缓冲液置换将IdeS酶置换至所述溶液中，并用所述溶液稀释至相应3种活性成分浓度，分装到2ml西林瓶中。具体地，每种样品以0.5ml/瓶的体积分装3瓶，用于检测液体状态在30℃的稳定性；1.2ml/瓶的体积分装4瓶，用于冻干并检测冻干制剂在37℃的稳定性；并以0.3ml/管分装至冻存管中，分装3管，用于测试液体状态的冻融稳定性。

冻干

将4瓶1.2ml/瓶分装的样品进行冻干，将使用的冻干曲线列于表2。

表2冻干曲线

1.2检测方法和结果

对表1制备的样品按照1.1中所述的体积和容器进行分装后，以表3所示的条件进行了多项检测。

表3.IdeS蛋白酶制剂配方筛选稳定性试验

冻融操作

样品体积(0.3ml)在<-60℃冻结，冻结16h以上，然后室温融化2h以上为一个冻融循环，3支样品每支冻融1次、3次、5次送检。

1.2.1液体样品冻融循环

考察了液体样品F1-F26在经历1个、3个、5个冻融循环之后的稳定性，将结果进行归一化处理，示于图1。XH后的数字表示冻融循环次数。

如图1所示，结果显示，本发明生产的原液蛋白样品经过5轮冻融循环，纯度及活性未见明显变化。在1～5轮考察范围内，蛋白冻融性质稳定。

1.2.2液体样品在30℃的稳定性

对液体样品F1-F28在30℃的酶活性和纯度的稳定性进行了考察，寻找最优配方，将结果进行归一化处理，示于图2-图7。具体的说明如下。

缓冲体系的筛选

F01～F09、F19～F21、F25、F27组为磷酸盐缓冲体系；F10～F18、F22～F24、F26、F28组为Tris-盐酸缓冲体系。

F01与F10、F02与F11之间的其他处理条件相同，仅缓冲体系不同，以此类推。

采用磷酸盐缓冲体系与Tris-盐酸缓冲体系下制备的原液，在30℃条件下进行了稳定性考察，将结果示于图2。

结果如图2所示，F01与F10、F02与F11之间等两两比较显示，在纯度(通过SDS-PAGE测定)上，磷酸盐缓冲体系均分别优于Tris-盐酸缓冲体系，但在酶活性上无明显差异。因此，从纯度方面考虑，优选磷酸盐缓冲体系。

聚山梨酯80浓度的筛选

F01～F03、F10～F12为0.1mg/ml聚山梨酯80组；F04～F06、F13～F15为0.3mg/ml聚山梨酯80组；F07～F09、F16～F18为0.5mg/ml聚山梨酯80组。

F01～F09、F19～F21、F25组为磷酸盐缓冲体系，F10～F18、F22～F24、F26组为Tris-盐酸缓冲体系。

F01、F04、F07三组之间，F10、F13、F16三组之间的其他处理条件相同，仅聚山梨酯80浓度不同，以此类推。

采用磷酸盐缓冲体系与Tris-盐酸缓冲体系下添加不同浓度的聚山梨酯80制备的原液，在30℃条件下进行了稳定性考察。

结果如图3所示，仅聚山梨酯80浓度不同的相邻三组之间比较，在纯度与酶活性上均无明显差异。提示关于目的蛋白在液体状态下的稳定性，0.1mg/ml～0.5mg/ml的聚山梨酯80均可使用。

乙二胺四乙酸二钠浓度的筛选

F04、F25、F13、F26分别为磷酸盐体系配合1.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、磷酸盐体系配合3mmol/L乙二胺四乙酸二钠、Tris-盐酸体系配合1.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、Tris-盐酸体系3mmol/L配合乙二胺四乙酸二钠组。

采用磷酸盐缓冲体系与Tris-盐酸缓冲体系下添加不同浓度的乙二胺四乙酸二钠制备的原液，在30℃条件下进行了稳定性考察，结果如图4所示。

如图4所示，结果显示：在Tris-盐酸缓冲体系中，纯度与酶活性上，乙二胺四乙酸二钠1.5mmol/L～3mmol/L之间无明显差异。

在磷酸盐缓冲体系中，在纯度方面，乙二胺四乙酸二钠不同浓度无明显差异；在活性方面，1.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠组优于3mmol/L乙二胺四乙酸二钠组。

冻干保护剂筛选

F01～F03组的其他处理条件相同，冻干保护剂在F01为8％甘露醇，F02为6％甘露醇，F03为3％甘露醇+3％蔗糖；F04～F06，F07～F09，F19～F21组以此类推。

采用磷酸盐缓冲体系配合不同冻干保护剂制备的原液，在30℃条件下进行稳定性考察。

如图5所示，纯度上各组间纯度差异不大；在酶活性上，F01～F03和F19～F21组别中，酶活性表现出明显差异，具体而言，3％甘露醇+3％蔗糖组＞8％甘露醇组＞6％甘露醇组。

pH的筛选

F04～F06为磷酸盐缓冲体系pH7.2、F13～F15为Tris-盐酸缓冲体系pH7.2分组；F19～F21为磷酸盐缓冲体系pH7.5、F22～F24为Tris-盐酸缓冲体系pH7.5分组。

F04与F19，F05与F20之间的其他处理条件相同，仅pH不同，以此类推。

采用磷酸盐与Tris-盐酸缓冲下不同pH体系制备的原液，在30℃条件下进行稳定性考察。

如图6所示，将仅不同pH的组两两比较，在纯度(SDS-PAGE)上无明显差异；在酶活性上，以F05对比F20，以F15对比F24组时，显示pH7.2组的酶活性明显高于pH7.5组。提示pH7.2在液体样品状态下对维持酶活性更有利。

主药浓度的筛选

F04、F27分别为磷酸盐体系配合10mg/ml、12mg/ml主药浓度；F13、F28分别为Tris-盐酸体系配合10mg/ml、12mg/ml主药浓度。

采用磷酸盐缓冲体系与Tris-盐酸缓冲体系下不同主药浓度制备的原液，在30℃条件下进行稳定性考察。

如图7所示，在纯度与酶活性上，磷酸盐体系和Tris-盐酸缓冲体系中主药浓度10mg/ml～12mg/ml无明显差异。

1.2.3冻干样品的37℃稳定性

使用不同配方配制了样品，并制备了冻干样品，对冻干样品的37℃纯度与酶活性的稳定性进行了考察，寻找最优配方，将结果进行归一化处理。

缓冲体系的筛选

F01与F10之间，F02与F11之间的其他处理条件相同，仅缓冲体系不同，以此类推。

采用磷酸盐缓冲体系与Tris-盐酸缓冲体系下制备了制剂，进行37℃的稳定性考察。

结果如图8所示，F01与F10之间等两两比较显示，在纯度(SDS-PAGE)和酶活性(如无特殊说明，指纯度和酶活性的稳定性，下同)上，磷酸盐缓冲体系组均优于Tris-盐酸缓冲体系，在酶活性上尤为突出。因此，从纯度和酶活性上，优选磷酸盐缓冲体系。

聚山梨酯80浓度的筛选

F01～F09组为磷酸盐缓冲体系，F10～F18组为Tris-盐酸缓冲体系。

F01、F04、F07组之间，F10、F13、F16组之间其他处理条件相同，仅聚山梨酯80浓度不同，以此类推。

采用磷酸盐缓冲体系与Tris-盐酸缓冲体系下添加不同浓度的聚山梨酯80制备的制剂，在37℃条件下进行稳定性考察。

结果如图9所示，每相邻三组之间比较，在纯度上无明显差异，在酶活性上，F02、F05、F08组及F12、F15、F18组中0.1mg/ml聚山梨酯80的活性优于其他浓度组。提示对冻干样品的稳定性而言，0.1mg/ml聚山梨酯80优于0.3mg/ml和0.5mg/ml。

乙二胺四乙酸二钠浓度的筛选

F04、F25为1.5mmol/L、3mmol/L乙二胺四乙酸二钠组；F13、F26为1.5mmol/L、3mmol/L乙二胺四乙酸二钠组。

F04、F25为磷酸盐缓冲体系，F13、F26为Tris-盐酸缓冲体系。

采用磷酸盐缓冲体系与Tris-盐酸缓冲体系下添加不同浓度的乙二胺四乙酸二钠制备的制剂，在37℃条件下进行稳定性考察。

结果如图10所示，在活性的长期维持上，1.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠组优于3mmol/L乙二胺四乙酸二钠组；磷酸盐缓冲体系与Tris-盐酸缓冲体系之间纯度无明显差异。

冻干保护剂筛选

F01～F03组之间的其他处理条件相同，仅冻干保护剂不同，F01为8％甘露醇，F02为6％甘露醇，F03为3％甘露醇+3％蔗糖；F04～F06，F07～F09，F19～F21组，以此类推。

采用磷酸盐缓冲体系配合不同冻干保护剂制备的制剂，在37℃条件下进行稳定性考察。

结果如图11所示，无论是纯度还是酶活性，3％甘露醇+3％蔗糖组都优于8％甘露醇组和6％甘露醇组。

pH的筛选

F04～F06、F13～F15为pH7.2分组，F19～F21、F22～F24为pH7.5分组。

F04～F06、F19～F21为磷酸盐缓冲体系，F13～F15、F22～F24为Tris-盐酸缓冲体系。

F04与F19之间、F05与F20之间的其他处理条件相同，仅缓冲体系pH不同，以此类推。

采用磷酸盐或Tris-盐酸缓冲下不同pH体系制备的制剂，在37℃条件下进行稳定性考察。

结果如图12所示，将仅不同pH的组两两比较，对于磷酸盐缓冲体系，在pH7.2和pH7.5组别间纯度和酶活性差异不明显，pH7.2组略优于pH7.5。而对于Tris-盐酸缓冲体系，在纯度和酶活性上，pH7.2组均明显优于pH7.5组。提示pH7.2在冻干样品下对维持纯度和酶活性更有利。

主药浓度的筛选

F04、F29分别为磷酸盐体系10mg/ml主药浓度、8mg/ml主药浓度；F13、F30分别为Tris-盐酸体系10mg/ml主药浓度、8mg/ml主药浓度。

采用磷酸盐缓冲体系与Tris-盐酸缓冲体系下不同主药浓度制备的制剂，在37℃条件下进行稳定性考察。

结果如图13所示，对于磷酸盐体系，F04与F29相比，酶活性差异不大，但在纯度上，F04组对纯度的维持优于F29组；对于Tris-盐酸缓冲体系，在纯度与酶活性上，10mg/ml主药浓度组明显优于8mg/ml主药浓度组。

小结

综上所述，F03、F06、F09为优选的配方，更优选F03。关于各组分而言：磷酸盐缓冲体系要优于Tris体系。不同浓度聚山梨酯80含量的考察对蛋白稳定性只存在微小的影响，优选0.1mg/ml含量。加入3％甘露醇和3％蔗糖作为冻干保护剂对蛋白活性及纯度的保护作用优于单独加入8％甘露醇及6％甘露醇组。1.5mmol/L EDTA*2Na对蛋白活性的维持效果优于3mmol/L。pH7.2对维持纯度和酶活性优于pH7.5。

在液体状态下，高主药浓度(12mg/ml)在长时间稳定性考察中能够维持活性和纯度的稳定，提示原液能够做到高浓度，至少能够达到12mg/ml。

在冻干剂型中，低主药浓度(8mg/ml)在长时间稳定性考察中，活性和纯度均较难维持，提示作为IdeS酶较适合的制剂灌装浓度，优选为10mg/ml。

实施例2.冻干工艺的优化

使用在稳定性实验中表现较优的配方(表1中所示的F03配方)，以1.1ml灌装入2ml西林瓶，用于筛选不同冻干工艺条件，具体处方信息见表4。将具体的条件组合和考察结果、水分含量示于表5。

表4.制剂处方信息表

表5.冻干曲线优化设计及结果汇总

测试了采用筛选的冻干工艺制备的冻干制剂的水分含量，并观察其外观，结果见表5。

从表5结果可知，通过工艺优化，采用考察6的条件，能够获得冻干外观合格，不发生塌陷，无粉末飞出，水分含量低至1.1％的冻干制剂成品，获得能够稳定储存的制剂。

序列信息

IdeS蛋白酶的氨基酸序列，SEQ ID NO:1

MDSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN。

Claims

1.一种用于制备冻干制剂的液体药物组合物，其包含以下组分或由以下组分组成：

(a)8-12mg/ml的免疫球蛋白G降解酶，所述免疫球蛋白G降解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；

(b)冻干保护剂，所述冻干保护剂为3％的蔗糖和3％的甘露醇；

(c)表面活性剂，所述表面活性剂为0.1-0.5mg/ml的聚山梨酯80；

(d)金属螯合剂，所述金属螯合剂为1.5-3.0mmol/L的乙二胺四乙酸二钠；和

(e)缓冲剂，所述缓冲剂为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲剂，并且

所述液体药物组合物的pH为7.2-7.5。

2.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其包含：

10mg/ml的所述免疫球蛋白G降解酶；

3％的蔗糖和3％的甘露醇；

0.1-0.5mg/ml的聚山梨酯80；

1.5-3.0mmol/L的乙二胺四乙酸二钠；

4.0-14.0mmol/L的磷酸二氢钠；和/或

11.0-36.0mmol/L的磷酸氢二钠。

3.一种冻干制剂，其包含在单一容器中，并且包含以下组分：

(a)8mg至24mg的免疫球蛋白G降解酶，所述免疫球蛋白G降解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；

(b)冻干保护剂，所述冻干保护剂为30-160mg的蔗糖和30-160mg的甘露醇；

(c)表面活性剂，所述表面活性剂为0.1-1mg的聚山梨酯80；

(d)金属螯合剂，所述金属螯合剂为0.56-2.24mg的乙二胺四乙酸二钠；和

(e)缓冲剂，所述缓冲剂为0.77-1.54mg的一水磷酸二氢钠和2.04-4.08mg的无水磷酸氢二钠。

4.一种冻干制剂，其通过冻干根据权利要求1或2所述的液体药物组合物获得。

5.一种制备免疫球蛋白G降解酶的冻干制剂的方法，包括将根据权利要求1或2所述的液体药物组合物按照如下条件进行冻干：

(1)在5℃至-50℃进行2至10小时的预冻；

(2)在-20℃至-30℃进行4至25小时的一次升华；和

(3)在-5℃至35℃进行4至18小时的二次升华。

6.通过根据权利要求5所述的方法获得的免疫球蛋白G降解酶的冻干制剂。

7.一种复配制剂，其通过复配根据权利要求3、4和6中任一项所述的冻干制剂获得。