JP5435955B2 - 安定な酵素製剤及びその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、意図した酵素活性を維持しながら、周囲条件下の貯蔵のために好適な安定した濃縮された酵素組成物に関する。本発明はさらに、濃縮された酵素組成物を含むキット、前記濃縮された酵素組成物から創傷清拭溶液を調製するための方法、及び希釈された創傷清拭溶液を使用する方法に関する。

慢性潰瘍、特に糖尿病性潰瘍を持つ患者は、局所的及び全身的感染に対して高い危険性がある。脚及び足の潰瘍が頻繁に発生している場合には、これらの患者はまた、構造的な足の変形、制限された関節の運動及び切断の危険性もある。感染された潰瘍に対する治療は、血糖コントロール、抗生物質の全身投与及び細部まで行き届いた創部のケア、主に壊死組織のデブリドマンを含む。デブリドマンは典型的には外科的方法によって試みられるが、創傷清拭酵素の使用を含む非外科的方法は、手術に固有の失血や痛みを避けるように工夫されている。さらに、酵素デブリドマンは、傷ついた患者が外科的手法に関連した追加の外傷にさらされることを要求せず、しかも潰瘍と関連した緊急医療状態の即座の速い解決を与える。

創傷清拭酵素はまた、湿疹、乾癬のような深刻な皮膚問題、及びしわ、にきび及び乾燥皮膚のようなあまり深刻でない皮膚状態を治療するために有用である（例えば、米国特許Ｎｏ．４５２４１３６，５４３９９３５，５４４１７４０，５５５４３６６，５８５３７０５、及び６７８０４４４に開示）。かかる酵素を含む商業的製品はまた、入手可能であり、例えばＡｃｃｕｚｙｍｅ（登録商標）（パパイン）及びＧｒａｎｕｌｅｘ（登録商標）（トリプシン）があるが、それらの用途は創傷のデブリドマンに対して限定されている。

米国特許Ｎｏ．４１９７２９１，４２２６８５４，４３０７０８１，４３２９４３０、及び５８３０７３９は、パイナップル植物から誘導された加水分解酵素、及びそれを含む組成物を開示する。米国特許出願Ｎｏ．２００３／００２６７９４は、皮膚の一つ以上の特定の層に影響を及ぼす少なくとも一つの酵素を使用して皮膚状態を治療するための方法を開示する。上述の酵素製剤は、室温での貯蔵のような標準的な貯蔵条件下では限られた保管寿命を持つ。

酵素組成物は、貯蔵時の酵素活性の損失を阻止する成分によって安定化されてもよい。例えば、米国特許Ｎｏ．６６９２７２６は、酵素、塩化セチルピリジニウム、及び組成物に安定性を与える還元剤を含む安定な経口組成物を開示する。典型的には、かかる添加剤は、特定の酵素に対してだけ安定であり、さらに前記酵素の特定の使用に対して安定である。

創傷上に酵素組成物を付与するための方法及び装置は、本願の発明者のものであるＷＯ ０３／０１１３６９，ＵＳ ２００４／０１８６４２１、及びＷＯ ２００５／０７０４８０に教示され、それらの全てはここに完全に述べられているように参照としてそれらの全体をここに組み入れる。これらの出願は、治療溶液、特に活性成分としてプロテアーゼを含む溶液を潰瘍のような創傷の上に連続的に流すための装置を開示する。

さらに、本願の発明者によって、創傷領域を通してかつその上に数時間活性タンパク質分解酵素の流れを付与することが、効果的なデブリドマンを与えることが示された（Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｗｏｕｎｄ １６：２０１−２０５，２００４年６月）。酵素のない緩衝溶液での同様の治療は効果的でないことが見出された。さらに、同様の時間にわたる酵素の静止した（流動しない）組成物での治療は効果が全くない。

効果的な創傷清拭活性を維持しながら、長い保管寿命を有しかつ創傷清拭酵素を含む酵素組成物に対してまだ満たされていない需要がある。かかる組成物は、使用するのが容易であるべきであり、従っていかなる使用者によっても付与されることができ、必ずしも医療従事者によって付与される必要がないことが有利である。

本発明は、タンパク質分解酵素、特にチオールプロテアーゼ、さらに特定するとパパインを含む安定組成物、それを含むキット、及び前記組成物を使用する酵素デブリドマンのための方法を提供する。本発明の組成物は、即座の希釈のために都合が良く、その調製のため及び局所投与のために医療従事者の補助を必要としない。本発明のキットは、簡単な混合工程によって創傷清拭組成物を形成する異なる成分からなる。

本発明は、活性創傷清拭溶液が濃縮パパイン溶液、濃縮緩衝溶液、濃縮チオール化合物、及び好適な希釈溶液を含む濃縮物から即座に調製されることができ、それらの全てが創傷清拭溶液を構成するために混合される前に数ヶ月の貯蔵で維持されるという予期せぬ発見に部分的に基づく。驚くべきことに、長期間の貯蔵後であっても、本発明の組成物に貯蔵される酵素の活性は、希釈で完全に又は少なくともほとんど回復される。さらに、貯蔵から活性形態への回復は、簡単な仕事であり、患者又は必ずしも医療従事者でない他の人によって実施されることができる。予期せぬことに、前記濃縮物は長期間の貯蔵の間、クリアなままであり、粒状物質を含まない。

一つの側面によれば、本発明は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌのチオールプロテアーゼを含むチオールプロテアーゼの非活性安定濃縮物を含み、さらに少なくとも一種の浸透物質を含む組成物であって、前記チオールプロテアーゼが活性化により５０００〜５００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内のタンパク質分解活性を持つ組成物を提供する。ここで、パパイン活性の一つのＵＳＰ単位は、米国薬局方参照ガイドに記載されるようにカゼイン基質溶液から１ｍｇのチロシンの当量を放出する。

一つの実施態様によれば、チオールプロテアーゼは、パパイン、ブロメライン、及びフィシン（これらに限定されない）を含む植物から誘導されたシステインプロテアーゼからなる群から選択される。本実施態様によれば、チオールプロテアーゼはパパインである。

本発明の範囲は、パパインのホモログ、アナログ、変異体、及び誘導体を包含し、これらのホモログ、アナログ、変異体、及び誘導体が本発明の原理に従って長期間、非活性形態で貯蔵された後、タンパク質分解を実施する能力、特に創傷における壊死組織のデブリドマン、又は皮膚の表面に積み上げられた死細胞の除去（化粧ピーリング）を実施する能力を保持しなければならないという条件を持つことを明白に理解されなければならない。

別の実施態様によれば、チオールプロテアーゼの濃度は２５〜４５ｍｇ／ｍｌの範囲内である。

さらに別の実施態様によれば、非活性濃縮物は、粒状物質を全く含まない。

さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種の浸透物質は、塩化ナトリウム、グリセロール、マンニトール、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種の浸透物質は少なくとも１％ｗ／ｖの濃度の塩化ナトリウムである。さらに別の実施態様によれば、創傷清拭組成物は少なくとも３％ｗ／ｖの塩化ナトリウムを含む。別の実施態様によれば、創傷清拭組成物は少なくとも５％ｗ／ｖの塩化ナトリウムを含む。さらに別の実施態様によれば、創傷清拭組成物はグリセロール及び塩化ナトリウムを含み、グリセロールの濃度は最大３０％ｖ／ｖであり、塩化ナトリウムの濃度は最大１８％ｗ／ｖである。さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種の浸透物質は最大２０％ｖ／ｖの濃度のグリセロールである。

さらに別の実施態様によれば、非活性濃縮物は、活性化前の周囲温度での少なくとも一週間、好ましくは少なくとも一ヶ月、より好ましくは少なくとも６ヶ月の貯蔵で安定であり、活性化により前記チオールプロテアーゼは５０００〜５００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内のタンパク質分解活性を持つ。さらに別の実施態様によれば、非活性濃縮物は、４〜１０℃の範囲内の温度での少なくとも一週間、好ましくは少なくとも一ヶ月、より好ましくは少なくとも６ヶ月の貯蔵で安定であり、前記チオールプロテアーゼは活性化により５０００〜５００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内のタンパク質分解活性を持つ。

さらに別の実施態様によれば、組成物はさらに、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−イミノ二酢酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、及びそれらの組み合わせから選択される緩衝液、好ましくは酢酸緩衝液を含む。

さらに別の実施態様によれば、濃縮パパイン溶液のｐＨは３〜６ｐＨ単位の範囲内、好ましくはｐＨ４〜５の範囲内である。

さらに別の実施態様によれば、組成物は等張性である。さらに別の実施態様によれば、組成物は高張性である。

さらに別の実施態様によれば、組成物は乾燥濃縮物である。

さらに別の実施態様によれば、本発明は、少なくとも一種の希釈溶液に希釈された本発明の濃縮物を含む創傷清拭溶液を提供し、少なくとも一種の希釈溶液は少なくとも一種の還元剤、緩衝液、及び少なくとも一種のキレート化剤を含み、前記チオールプロテアーゼは５０００〜５００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内のタンパク質分解活性を持ち、創傷清拭溶液は生理的なｐＨを持つ。

さらに別の実施態様によれば、創傷清拭溶液は少なくとも６時間創傷清拭活性を示す。さらに別の実施態様によれば、創傷清拭溶液は少なくとも１２時間創傷清拭活性を示す。さらに別の実施態様によれば、創傷清拭溶液は、４〜１０℃で少なくとも６時間の貯蔵後、創傷清拭活性を示す。さらに別の実施態様によれば、創傷清拭溶液は、４〜１０℃で少なくとも１２時間の貯蔵後、創傷清拭活性を示す。

さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種の還元剤は、硫化物、シスタミン、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、及び塩酸システインからなる群から選択されるチオール化合物である。好ましい実施態様によれば、チオール化合物は塩酸システインである。

さらに別の実施態様によれば、緩衝液は、トリスヒドロキシメチルアミノエタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、リシン緩衝液、グリシン緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液及びＭＥＳ緩衝液からなる群から選択される。好ましい実施態様によれば、緩衝液はＴｒｉｓ緩衝液である。

さらに別の実施態様によれば、創傷清拭組成物は等張性である。さらに別の実施態様によれば、創傷清拭組成物は高張性である。

さらに別の実施態様によれば、創傷清拭組成物のｐＨは７〜７．６のｐＨ、好ましく７．２〜７．６のｐＨの範囲内である。

さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種のキレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレン−ビス−（オキシエチレンニトロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、及びエチレンジニトリロ四酢酸（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ ＩＩＩ）からなる群から選択される。

別の実施態様によれば、本発明は、創傷清拭組成物を調製するためのキットを提供し、キットは、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌのチオールプロテアーゼを含むチオールプロテアーゼの非活性濃縮物を含み、所望により少なくとも一種の浸透物質を含む第一成分；少なくとも一種の還元剤の濃縮溶液を含む第二成分；及び少なくとも一種の緩衝剤及び少なくとも一種のキレート化剤を含む濃縮緩衝溶液である第三成分を含み、前記第一、第二及び第三成分を少なくとも一種の希釈溶液において混合することによって生理的なｐＨを有する創傷清拭溶液を提供し、前記チオールプロテアーゼは活性化により５０００〜５００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内のタンパク質分解活性を持つ。

一つの実施態様によれば、第一成分中のチオールプロテアーゼの濃度は２５〜４５ｍｇ／ｍｌの範囲内である。

別の実施態様によれば、チオールプロテアーゼは、パパイン、ブロメライン、及びフィシン（これらに限定されない）を含む植物から誘導されたシステインプロテアーゼからなる群から選択される。本実施態様によれば、チオールプロテアーゼはパパインである。

さらに別の実施態様によれば、第一成分はｐＨ３〜６の範囲内のｐＨ、好ましくはｐＨ４〜５の範囲内のｐＨを有する溶液である。別の実施態様によれば、前記第一成分は、酸性ｐＨを維持できる緩衝液を含み、緩衝液は酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましい実施態様によれば、緩衝液は酢酸緩衝液である。

別の実施態様によれば、第一成分は、活性化前、周囲温度での少なくとも一週間、好ましくは少なくとも一ヶ月、より好ましくは少なくとも６ヶ月の貯蔵で安定である。さらに別の実施態様によれば、第一成分は、活性化前、４〜１０℃の範囲内の温度での少なくとも一週間、好ましくは少なくとも一ヶ月、より好ましくは少なくとも６ヶ月の貯蔵で安定である。

さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種の還元剤は、硫化物、シスタミン、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、及び塩酸システインからなる群から選択されるチオール化合物である。好ましい実施態様によれば、チオール化合物は塩酸システインである。さらに別の実施態様によれば、第二成分のｐＨはｐＨ１〜４の範囲内である。別の実施態様によれば、第二成分のｐＨはｐＨ１〜２の範囲内である。

さらに別の実施態様によれば、第三成分は、トリスヒドロキシメチルアミノエタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、リシン緩衝液、グリシン緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、及びＭＥＳ緩衝液からなる群から選択される緩衝剤を含む。好ましい実施態様によれば、第三成分はＴｒｉｓ緩衝液である。特別な実施態様によれば、第一、第二及び第三成分と少なくとも一種の希釈溶液で希釈すると、緩衝剤は生理的ｐＨの範囲内のｐＨを維持する。一つの実施態様によれば、生理的ｐＨはｐＨ７〜７．６、好ましくはｐＨ７．２〜７．６の範囲内である。

さらに別の実施態様によれば、第一、第二及び第三成分と少なくとも一種の希釈溶液で希釈すると、５０００〜５００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内のタンパク質分解活性を有する希釈溶液が得られる。さらに別の実施態様によれば、希釈溶液は等張性である。さらに別の実施態様によれば、希釈溶液は高張性である。

さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種のキレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレン−ビス−（オキシエチレンニトロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、及びエチレンジニトリロ四酢酸（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ ＩＩＩ）からなる群から選択される。

さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種の希釈溶液は、塩水、高浸透性塩水、及び少なくとも一種の浸透物質を含む塩水からなる群から選択される溶液を含む。

さらに別の実施態様によれば、高浸透性塩水は少なくとも１％ｗ／ｖの塩化ナトリウム、好ましくは少なくとも３％ｗ／ｖの塩化ナトリウムを含む。別の実施態様によれば、高浸透性塩水は少なくとも５％ｗ／ｖの塩化ナトリウムを含む。さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種の浸透物質は、塩化ナトリウム、グリセロール、マンニトール、デキストラン、ＰＥＧ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらに別の実施態様によれば、高浸透性塩水はグリセロール及び塩化ナトリウムを含み、グリセロールの濃度は最大３０％ｖ／ｖであり、塩化ナトリウムの濃度は最大１８％ｗ／ｖである。

さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種の浸透物質は最大１０％ｖ／ｖである。さらに別の実施態様によれば、少なくとも一種の浸透物質の含有量は最大２０％ｖ／ｖである。

一つの実施態様によれば、キットの各成分と創傷清拭溶液の容量の間の容量比は少なくとも１：１０である。別の実施態様によれば、前記容量比は少なくとも１：２０である。

代替実施態様によれば、第一成分はさらに、可逆的な方法でパパインの創傷清拭活性を阻害することができる阻害剤を含む。別の代替実施態様によれば、少なくとも一種の阻害剤は、重金属、カルボニル試薬、アルデヒド、二硫化物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

さらに別の実施態様によれば、前記第一、第二及び第三成分の各々は乾燥物、固体又は凍結乾燥物である。

さらに別の実施態様によれば、本発明は、以下のことを含む、創傷清拭溶液を調製するための方法を提供する：
（ａ）本発明のキットを準備する；そして
（ｂ）キットの成分を少なくとも一種の希釈溶液と混合し、それによって生理的ｐＨを有する創傷清拭組成物を得る、但し、前記創傷清拭溶液中の前記チオールプロテアーゼのタンパク質分解活性は５０００〜５００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内である。

さらに別の実施態様によれば、第一、第二及び第三成分は、互いに対していかなる順序でも少なくとも一種の希釈溶液に添加される。

さらに別の実施態様によれば、創傷清拭溶液は少なくとも６時間創傷清拭活性を示す。さらに別の実施態様によれば、創傷清拭溶液は少なくとも１２時間創傷清拭活性を示す。さらに別の実施態様によれば、創傷清拭溶液は、４〜１０℃で少なくとも６時間の貯蔵後、創傷清拭活性を示す。さらに別の実施態様によれば、創傷清拭溶液は、４〜１０℃で少なくとも１２時間の貯蔵後、創傷清拭活性を示す。

さらに別の実施態様によれば、方法は以下のことを含む：
（ｃ）皮膚病変又は損傷した皮膚上に創傷清拭溶液を付与する；そして所望により
（ｄ）前記皮膚病変又は損傷した皮膚を外傷用医薬材料で覆う。

さらに別の実施態様によれば、工程（ｄ）は、前記皮膚病変又は前記損傷した皮膚を通ってそしてそれの上に創傷清拭溶液の流れを運ぶことを含む。別の実施態様によれば、創傷清拭溶液の流れは、少なくとも６時間前記皮膚病変を通ってそしてそれの上に運ばれる。さらに別の実施態様によれば、工程（ａ）〜（ｄ）は、反復して繰り返され、それによって各繰り返しは創傷清拭溶液の新しい部分で実施される。

さらに別の実施態様によれば、方法は工程（ｃ）の前に周囲温度で又は４〜１０℃の範囲内の温度で創傷清拭溶液を貯蔵することを含む。

さらに別の実施態様によれば、創傷清拭溶液を付与することは以下のことを含む：
皮膚病変又は損傷した皮膚の上に創傷清拭溶液の流れを付与し、前記組成物をそこから少なくとも一時間、好ましくは少なくとも６時間排出する。

さらに別の実施態様によれば、流れは、組成物を含む少なくとも一つの貯蔵器と流体連通しているポンプによって誘導される。さらに別の実施態様によれば、流れは、ドリップカウンター（ｄｒｉｐ ｃｏｕｎｔｅｒ）によって誘導される。

さらに別の実施態様によれば、皮膚病変は慢性潰瘍である。さらに別の実施態様によれば、慢性潰瘍は、糖尿病又は創傷領域上の長期の圧力と関連する。

本発明の他の目的、特徴及び利点は以下の記載及び図面から明らかになるだろう。

図面の簡単な記述
図１は、コントロール（未処理：Ｃ）に対する６時間（Ａ）又は１１時間（Ｂ）にわたって実施例１に従って調製されたパパイン溶液の流れで処理されたブタの創傷モデルの組織構造部分を示す。

図２は、６時間（Ａ）又は１１時間（Ｂ）にわたって実施例２に従って調製されたパパイン溶液の流れで処理されたブタの創傷モデルの組織構造部分を示す。

図３は、６時間（Ａ）又は１１時間（Ｂ）にわたって実施例３に従って調製されたパパイン溶液の流れで処理されたブタの創傷モデルの組織構造部分を示す。

図４は、１１時間にわたって実施例５に従って調製されたパパイン溶液の流れで処理されたブタの創傷モデルの組織構造部分を示す。

図５は、壊死創傷デブリドマンの形態及び外観に対する異なる創傷清拭溶液の影響を示す。

図６は、げっ歯類の点滴注入のための注入ポンプシステムを示す。

図７Ａ及び７Ｂは、パパイン溶液の保管寿命を示す。

定義
本明細書で使用される用語「パパイン」は、インビトロ及びインビボで創傷清拭活性を発揮することができる、植物から誘導されたチオールプロテアーゼのパパイン科のいかなる酵素も指す。パパインは、カリーカパパイヤラテックスから誘導されたスルフヒドリルプロテアーゼである。天然の純粋なパパインは、システインの如き穏やかな還元剤によって活性化されるまで、その自由ＳＨ官能基で部分的に反応性である。パパインは、部分的に精製された結晶形態又は粗パパインとして商業的に提供され、後者はパパイン、キモパパイン及びリゾチームを含む混合物である。本発明の原理によれば、用語「パパイン」は、タンパク質１ｍｇあたり１００００〜１０００００ＵＳ単位の範囲内の活性を有するパパインを指し、そこではパパイン活性の一つのＵＳＰ単位は、米国薬局方の参照ガイドに記載されるようにカゼイン基質溶液からの１ｍｇのチロシンの当量を放出するものである。

用語「非活性形態」又は「不活性形態」は、本明細書では、意図された活性、即ち加水分解又はタンパク質分解活性を示さない酵素組成物を記載するために使用される。特に、非活性形態のパパインは、加水分解又はタンパク質分解活性を部分的に示すか又は実質的な加水分解又はタンパク質分解活性を全く示さず、それはその潜在的な加水分解活性を失わずに数ヶ月間貯蔵されることができる。

用語「安定」は、本明細書では、非活性形態の貯蔵後であっても、活性化により所望の酵素活性を保持する非活性酵素組成物を記載するために使用される。安定な非活性酵素組成物の所望の活性は、好ましくは少なくとも一種のチオール化合物と希釈溶液に適切なｐＨを与えることができる少なくとも一種の緩衝液を含む溶液のような好適な溶液での希釈によって、容易に回復される。好ましくは、安定な非活性酵素組成物は粒状物質を含まない。

本明細書で使用される用語「回復（ｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）」は、インビボ及びインビトロでのパパインの全ての周知の酵素活性、特に加水分解活性、即ちタンパク質の構造的分解活性の回復を指す。

用語「高張性（ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ）」及び「高浸透圧性（ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｌａｒ）」は、本明細書では、少なくともわずかに高張性であるオスモル濃度を有する溶液、即ち塩水のような等張性流体より高い浸透圧を有する溶液を記載するために交換可能に使用される。このような溶液は、高浸透圧性塩水、及び、溶液のオスモル濃度を変更できる、特に等張性溶液のオスモル濃度を増大することができる少なくとも一種の浸透物質を含む塩水を含む。

本明細書で使用される用語「周囲温度」は、１０〜３０℃の範囲、好ましくは１０〜２５℃の範囲内の温度を指す。

本明細書で使用される用語「可逆的な方法」は、条件をなくすと阻害効果がなくなるというある条件下で、酵素の活性、特に加水分解酵素の創傷清拭活性を阻害する阻害能力、例えば化学的存在、生物学的存在又は環境的条件（例えばｐＨ）を示す。例えば、ＥＤＴＡのようなキレート化剤による金属結合酵素の活性の阻害は、過剰の金属の添加によって逆転されうる。特に、用語「可逆的な方法」は、酵素に永久の損傷を起こし、それによってフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）のように非可逆的な方法で所望の酵素活性を阻害する阻害能力を除外する。

本明細書で使用される用語「デブリドマン」は、その最も一般的な意味で解釈されなければならず、創傷からの失活組織の除去、又は化粧ピーリングとしても知られる皮膚の表面からの死細胞の除去を指す。

本発明を実施するための好ましい方式
本発明は、タンパク質分解酵素の技術から知られた多くの原理、及び他の治療様式のうち創傷デブリドマンのためのそれの使用を採用するが、本発明は幾つかの重要な領域で既知の技術から変化する。第一に、本発明は、成分、特に酵素成分の潜在的な活性が維持されながら、周囲条件で、創傷清拭組成物としての意図された使用の前に数週間及び数ヶ月維持されることができる貯蔵可能な成分を初めて提供する。第二に、貯蔵可能な成分から創傷清拭組成物を得ることは、好適な溶液における回復（再構成）だけを含む簡単な仕事であり、それは、これらの簡単な工程を行うことができるいかなる人によっても実施されることができ、必ずしも医療従事者によって実施される必要はない。

酵素が貯蔵中にそれらの潜在的な活性を失わないような貯蔵の目的のために酵素調製物を安定化するための多数の方法が公知である。例えば、金属結合酵素に対してＥＤＴＡのような金属キレート化剤のある量の存在下の貯蔵は酵素活性を阻害し、それは、酵素活性のために要求される金属でＥＤＴＡ酵素溶液をインキュベートすることによって回復されることができる。典型的には、過剰濃度のかかる金属／金属イオンが要求される。金属結合酵素は、金属が浸透によって酵素から移行するように金属キレート化剤でのインキュベーションの前又はその代わりに透析を受けてもよい。このような場合において、活性の回復はまた、透析された酵素溶液を酵素活性の回復に必要な金属イオンでインキュベートすることによって達成される。

非活性形態の酵素を貯蔵する他の方法は、多孔質球における酵素固定、及び約５０％のグリセロールを含む緩衝液における貯蔵を含む。上述の方法の各々は、活性が貯蔵後に回復されることができるように酵素の貯蔵のために潜在的に好適であるが、実際には、各個々の酵素は特定の貯蔵条件を要求する。もし貯蔵条件が酵素のため又は酵素によって発揮される酵素活性のために不適切であるなら、それはおそらく不活性なままであろう。従って、本発明は、パパイン、ブロメライン及びフィシンを含む植物から誘導されたシステインプロテアーゼの如き加水分解酵素、特にシステイン（チオール）プロテアーゼのための特別な貯蔵条件を規定することを目的とする。但し、他のタンパク質分解酵素も本発明の原理に従って貯蔵及び回復されることができる限り、おそらく使用されることができる。

本発明のキットは、創傷清拭組成物中への混合のための少なくとも三つの別個の成分を含む：
非活性形態のチオールプロテアーゼを含む酵素組成物を含む第一成分、但し第一成分中のチオールプロテアーゼの濃度は創傷清拭組成物中のチオールプロテアーゼの濃度より少なくとも１０倍高い；
チオールプロテアーゼを活性化することができる少なくとも一種の還元剤を含む第二成分、但し少なくとも一種の還元剤の濃度は創傷清拭組成物中の前記少なくとも一種の還元剤の濃度より少なくとも１０倍高い；
濃縮緩衝溶液を含む第三成分、但しそれは第一及び第二成分及び少なくとも一種の希釈溶液で希釈されると、チオールプロテアーゼ、特にパパインの活性のために好適なｐＨ範囲内のｐＨで生じた創傷清拭組成物のｐＨを維持することができる；
上記において、少なくとも一種の希釈溶液でのキットの三つの成分の混合は、生理的ｐＨを有し、さらに１００００〜１０００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内のタンパク質分解活性を有する創傷清拭組成物を与える。

あるいは、キットは第三成分の代わりに少なくとも一種の希釈溶液を含み、前記少なくとも一種の希釈溶液は少なくとも一種の緩衝剤、少なくとも一種のキレート化剤を含み、前記少なくとも一種の希釈溶液は等張性又は高張性である。

好ましくは、キットの還元剤は、ガラス又は石英からなる容器で、より好ましくは窒素雰囲気下で又は減圧下で貯蔵される。

本発明の原理によれば、本発明のキット内に含まれるチオールプロテアーゼは１ｍｇあたり少なくとも３００００ＵＳＰ単位の活性を有することが好ましい。かかる活性において、濃縮溶液及び最終溶液におけるチオールプロテアーゼの濃度は低下されてもよく、それによってキットの濃縮溶液の容積を低下することができる。

一つの実施態様によれば、キットの各成分と創傷清拭組成物の間の容積比は少なくとも１：１０である。別の実施態様によれば、前記容積比は少なくとも１：２０である。最終溶液は約５００ｍｌであってもよく、従って輸液バッグに維持されてもよい。従って、キットの成分の各々一つの容積は一成分あたり最大５０ｍｌ、好ましくは一成分あたり最大２５ｍｌ、より好ましくは一成分あたり最大１２．５ｍｌである。

キットの成分は、互いに混合されたり少なくとも一種の希釈溶液と混合されて創傷清拭活性を有する酵素組成物を与える前に、室温で又は４〜１０℃の範囲内の温度で数週間及び数ヶ月間貯蔵しても安定である。

本発明のキットの成分は濃縮溶液の形態で維持され貯蔵されることが好ましいが、成分は、所望により減圧下で、乾燥又は固体形態（例えば凍結乾燥）で維持されてもよい。乾燥組成物の回復は特別な穏やかな条件下での溶解を要求する。なぜならば、不適切な溶解、即ち加熱又は激しい攪拌下の溶解は、完全な又は部分的なタンパク質不活性化を生じうるからである。不完全な溶解はさらに、最終的な創傷清拭組成物内の成分の不適切な濃度を生じ、それによって創傷清拭活性の低下又は不足をもたらしうる。

単一容器又は別個の容器にキットの成分の各々一つずつを貯蔵するために適切な貯蔵手段は、各成分の内容物と相互作用せず、しかも貯蔵条件下で安定している不活性材料から作られた容器でありうることができる。従って、キットの各成分を貯蔵するために好適な容器は、袋、瓶、バイアル、大容量非経口、小容量非経口、予め充填された注射器又はカセットを含む。貯蔵条件は滅菌又は無菌条件を含む。即ち、各成分は滅菌又は無菌に維持されることが好ましい。あるいは、各容器の内容物は容易に滅菌化されうる。さらに、好ましい実施態様では、容器が汚染されないことを維持しながら、各容器の内容物を全体的又は部分的に取り出してもよい。

第一成分の高濃縮酵素溶液を数週間及び数ヶ月間不活性で安定に維持するためには、特に貯蔵中の自己消化、沈殿、凝集、及び不可逆的な不活性化を避けるために、本願の発明者は、溶液が酸性ｐＨ、特に３〜６、好ましくは４〜５の範囲のｐＨで維持されるべきであることを見出した。このような条件下では、チオールプロテアーゼの潜在的な活性は維持され、チオールプロテアーゼは沈殿、分解、自己消化又は凝集しない。さらに、キットの第一成分が他の成分及び少なくとも一種の希釈溶液と混合された後、最終的な創傷清拭組成物中に残る酢酸緩衝液は、チオールプロテアーゼの創傷清拭活性と実質的に相互作用しない。チオールプロテアーゼがこのような貯蔵条件下では凝集物及び／又は沈殿物を形成しないことは、第一成分の溶液においてチオールプロテアーゼの濃度が極めて高く、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ以下であるということに照らすと予期されない。

３〜６のｐＨ範囲で緩衝能力を有する緩衝液が好ましい。このような緩衝液は、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

第二成分は、チオール部分を含有する還元物質を含み、そこでは還元物質はチオール−タンパク質を活性化することができる。第二成分内の還元物質の濃度はかなり高く、特に最終的な創傷清拭組成物におけるその濃度より少なくとも１０倍高い。高度に濃縮されているが、還元剤は貯蔵中、沈殿しないし、凝集しないし又はその潜在的な活性を失わない。好適な還元剤は硫化物、システイン及び塩酸システインを含むが、これらに限定されない。

キットは、第三成分が前記第二成分、前記第一成分、及び少なくとも一種の希釈溶液（以下、「キャリア」とも称する）と混合されるとき、緩衝溶液が希釈され、従ってチオールプロテアーゼの創傷清拭活性を可能にし、同時に生理学的な用途、即ち創傷清拭組成物の意図される用途のために好適なｐＨ範囲において創傷清拭組成物を維持できるように、濃縮緩衝溶液を含む第三成分を含む。従って、チオールプロテアーゼ、特にパパインのために最適であるｐＨ範囲は相対的に幅広いが、本発明の創傷清拭組成物は生理学的に許容可能なｐＨ範囲、即ち６．８〜７．７の範囲、好ましくは７〜７．６の範囲にある。第三成分の緩衝液の濃度は高く、特に最終創傷清拭溶液の緩衝液の濃度より少なくとも１０倍高い。

第三成分はさらに、少なくとも一種のキレート化剤を含む。

創傷清拭組成物を形成するために本発明のキットの全ての成分と混合される少なくとも一種の希釈溶液は、キットの成分と混合されるために必要なキャリアの正確な容積を測定することを可能にする測定手段を有する別個の容器で与えられてもよい。あるいは、キャリアは、創傷清拭組成物を形成するために他の成分と混合されることが必要な正確な容積のキットの成分であってもよい。キャリアは、本発明のキットの成分の各々一つずつが容器中に最終的な創傷清拭組成物を形成するために添加される容器に与えられてもよい。容器は、袋、瓶、バイアル、大容量非経口、小容量非経口、予め充填された注射器又はカセットであってもよい。少なくとも一種の希釈溶液に対する各成分の添加の順序は重要でない。好ましくは、少なくとも一種の希釈溶液は、無菌もしくは滅菌であり、又は無菌又は滅菌になる目的のために容易に処理されてもよい。さらに、少なくとも一種の希釈溶液とキットの成分の混合中、混合物は汚染されないように維持されることが好ましい。ある実施態様によれば、混合は典型的には無菌／滅菌条件下で実施される。

キャリアは、高浸透圧性塩水、浸透物質を含む塩水、及び浸透物質を含む高浸透圧性塩水のような高浸透圧性溶液であってもよい。

高オスモル濃度は、細菌の増殖を防止するので、感染の公知の治療手段である。本発明は、このような高浸透圧溶液を使用すると、充血を誘導又は増強することによる潰瘍及び創傷治癒を促進することを初めて見出した。

本発明のキット、組成物及び方法は、創傷、特に潰瘍、好ましくは糖尿病性潰瘍のような慢性潰瘍に対する効果的な治療を与えるために向けられている。米国における約１６００万人の人々は糖尿病を持ち、その約１５％は足及び脚の慢性潰瘍を発現し、それは治癒の遅い開放創である。糖尿病性潰瘍を持つ患者は、局所的及び全身的感染及び切断に対する高い危険がある。大多数の糖尿病性潰瘍は極めて深く、また不適切な血液供給を持つ。

小さい切断又は切屑の痛みは領域中の神経損傷のために感じないかもしれず、その上、劣った循環は治癒時間を遅らせるので、このような潰瘍は診断される前に危険な創傷に発展しうる。床擦れ又は褥瘡性潰瘍としても知られる褥瘡はまた、致命的になりうる深刻な潰瘍に発展しうる。褥瘡の場合には、皮膚及び組織の潰瘍のある領域は、典型的には長期間の皮膚に対する連続した圧力又は他の継続した攻撃の結果として傷つけられ又は破壊される。典型的には、褥瘡は、皮膚及び下にある組織が骨と外部表面（例えばベッド又はいす）の間で圧搾されるときに発現する。褥瘡の最も一般的な場所は、骨ばっている隆起上であり、例えば肘、かかと、腰、尾骨、足首、肩、背中、及び頭のうしろ上である。一般に、褥瘡は、人が自分の体重を移さずに極めて長い間座ったり又は横たわったりする姿勢にあるときに起こる。従って、いす又はベッドに拘束される人は誰もその危険があるが、より一般的には高齢者及び弱者において観察される。例えば脳卒中による自制不可能や知覚の低下はまた、床擦れを発現する可能性を増大する。皮膚に対する一定の圧力は、皮膚及び隣接する組織へ栄養物及び酸素を供給する血管を部分的に又は完全に閉じるように圧搾し、領域への血液供給を低下させる。酸素及び栄養物の不存在又は深刻な減少は、皮膚、潜在的には下にある組織の死をもたらす。治療しないままであると、隣接組織は死に始め、最終的には骨に影響しうる潰瘍を生じうる。皮膚に開創を生じる深刻な潰瘍は、二次感染への移行を与えうる。特に、深刻な場合、褥瘡性潰瘍は死を招きうる。

治療及び投与方式
本発明による壊死組織を創傷清拭するために有用な典型的な投与量は、病変の深刻さに従って決定される。一般に、本明細書において詳述された配合のいずれか一つに従ってチオールプロテアーゼを含む創傷清拭溶液の流れは、少なくとも一時間、病変の上にそして病変を通して運ばれる。病変はデブリドマンの進行を評価するために監視される。短時間の治療の中断は、流れの阻止及び患者の自由な移動を妨げる導管の除去によって実施される。導管が再び取り付けられる閉塞包帯は病変上に残されてもよい。

治療は、本願の発明者のＵＳ ２００４／０１８６４２１又はＷＯ ２００５／０７０４８０に記載されているような装置を使用して適用されてもよい。このような装置は、中に形成された少なくとも一つの開口を有するハウジング、及び皮膚病変の周囲の皮膚に装置を固定するための手段を含み、前記ハウジングは、（ｉ）第一長手方向軸を有し、かつ前記少なくとも一つの開口を通ってその長手方向軸に沿って調整可能であるように構成された少なくとも一つの入口チューブ；及び（ｉｉ）第二長手方向軸を有する少なくとも一つの出口チューブを含む。装置はさらに、創傷清拭溶液を保持するために適応された貯蔵器を含み、貯蔵器は一つ以上の入口と流体連通している。出口は、貯蔵器と治療領域の間の流れを制御するための弁を含んでもよい。好ましくは、出口はさらに、貯蔵器からのハウジングの断絶及び貯蔵器とハウジングの接続を可能にする手段を含み、それによって治療の中断を可能にする。

流れ手段及び創傷清拭組成物からの患者の断絶及びそれらとの患者の接続の容易性は、創傷清拭処理を長期間適用することを可能にする。創傷清拭溶液の流れは少なくとも一時間続き、また個々の条件によって数時間続きうる。

実施例１：安定でクリアな濃縮溶液からの創傷清拭組成物Ｉの調製
下記成分を含有するキットが与えられた：
１．１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３〜４．５）におけるパパイン（３００００ＵＳＰ Ｕ／ｍｇの比活性を持つＭｅｒｃｋ Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７１４９．５０００，４０ｍｇ／ｍｌ）の酵素溶液（２５ｍｌ）。
２．塩酸システイン、２５ｍｌ．０．１Ｍ，ｐＨ１．４。
３．Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ，２Ｍ／０．０４Ｍの２５ｍｌ，ｐＨ７．８５。

全ての溶液は、クリアであり、沈殿物又は凝集物を含まなかった。三つの溶液は、０．９％塩水を含有する５００ｍｌ溶液中へのそれらの添加によって希釈され、７．４±０．２の最終ｐＨ及び０．９％塩水におけるＴｒｉｓ緩衝液０．１Ｍ、システインＨＣｌ ５ｍＭ，ＥＤＴＡ ２ｍＭ，２ｍｇ／ｍｌパパイン及び０．５％グリセロールの最終濃度を有する溶液を与えた。

実施例２：安定でクリアな濃縮溶液からの創傷清拭組成物ＩＩの調製
下記成分を含有するキットが与えられた：
１．１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３〜４．５）におけるパパイン（３００００ＵＳＰ Ｕ／ｍｇの比活性を持つＭｅｒｃｋ Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７１４９．５０００，４０ｍｇ／ｍｌ）の酵素溶液（２５ｍｌ）。
２．塩酸システイン、２５ｍｌ．０．１Ｍ，ｐＨ１．４。
３．Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ，２Ｍ／０．０４Ｍの２５ｍｌ，ｐＨ７．８５。

全ての溶液は、クリアであり、沈殿物又は凝集物を含まなかった。三つの溶液は、５％（ｗ／ｖ）塩水を含有する５００ｍｌ溶液中へのそれらの添加によって希釈され、７．４±０．２の最終ｐＨ及び５％塩水におけるＴｒｉｓ緩衝液０．１Ｍ、システインＨＣｌ ５ｍＭ，ＥＤＴＡ ２ｍＭ，２ｍｇ／ｍｌパパイン及び０．５％グリセロールの最終濃度を有する高浸透圧性溶液を与えた。

実施例３：安定でクリアな濃縮溶液からの創傷清拭組成物ＩＩＩの調製
下記成分を含有するキットが与えられた：
１．１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３〜４．５）におけるパパイン（３００００ＵＳＰ Ｕ／ｍｇの比活性を持つＭｅｒｃｋ Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７１４９．５０００，４０ｍｇ／ｍｌ）の酵素溶液（２５ｍｌ）。
２．塩酸システイン、２５ｍｌ．０．１Ｍ，ｐＨ１．４。
３．Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ，２Ｍ／０．０４Ｍの２５ｍｌ，ｐＨ７．８５。

全ての溶液は、クリアであり、沈殿物又は凝集物を含まなかった。三つの溶液は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する５００ｍｌ溶液中へのそれらの添加によって希釈され、７．４±０．２の最終ｐＨ及び１０．５％グリセロールにおけるＴｒｉｓ緩衝液０．１Ｍ、システインＨＣｌ ５ｍＭ，ＥＤＴＡ ２ｍＭ，２ｍｇ／ｍｌパパインの最終濃度を有する高浸透圧性溶液を与えた。

実施例４：安定でクリアな濃縮溶液からの創傷清拭組成物ＩＶの調製
下記成分を含有するキットが与えられた：
１．１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３〜４．５）におけるパパイン（３００００ＵＳＰ Ｕ／ｍｇの比活性を持つＭｅｒｃｋ Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７１４９．５０００，４０ｍｇ／ｍｌ）の酵素溶液（２５ｍｌ）。
２．塩酸システイン、２５ｍｌ．０．１Ｍ，ｐＨ１．４。
３．Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ，２Ｍ／０．０４Ｍの２５ｍｌ，ｐＨ７．８５。

全ての溶液は、クリアであり、沈殿物又は凝集物を含まなかった。三つの溶液は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール及び０．９％（ｗ／ｖ）塩水を含有する５００ｍｌ溶液中へのそれらの添加によって希釈され、７．４±０．２の最終ｐＨ及び０．９％塩水における１０．５％グリセロールにおけるＴｒｉｓ緩衝液０．１Ｍ、システインＨＣｌ ５ｍＭ，ＥＤＴＡ ２ｍＭ，２ｍｇ／ｍｌパパインの最終濃度を有する高浸透圧性溶液を与えた。

実施例５：安定でクリアな濃縮溶液からの創傷清拭組成物Ｖの調製
下記成分を含有するキットが与えられた：
１．１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３〜４．５）におけるパパイン（３００００ＵＳＰ Ｕ／ｍｇの比活性を持つＭｅｒｃｋ Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７１４９．５０００，４０ｍｇ／ｍｌ）の酵素溶液（２５ｍｌ）。
２．塩酸システイン、２５ｍｌ．０．１Ｍ，ｐＨ１．４。
３．Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ，２Ｍ／０．０４Ｍの２５ｍｌ，ｐＨ７．８５。

全ての溶液は、クリアであり、沈殿物又は凝集物を含まなかった。三つの溶液は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール及び５％（ｗ／ｖ）塩水を含有する５００ｍｌ溶液中へのそれらの添加によって希釈され、７．４±０．２の最終ｐＨ及び５％塩水における１０．５％グリセロールにおけるＴｒｉｓ緩衝液０．１Ｍ、システインＨＣｌ ５ｍＭ，ＥＤＴＡ ２ｍＭ，２ｍｇ／ｍｌパパインの最終濃度を有する高浸透圧性溶液を与えた。

実施例６：ブタの創傷モデルＩの上に創傷清拭溶液を流すことによる創傷デブリドマン
動物調製及び治療プロトコル：
約３０ｋｇの重量の成熟した大きな白い雌ブタを落ち着かせ、ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）２０ｍｇ／ｋｇ体重、キシラジン１０％（２ｍｇ／ｋｇ体重）、及びアトロピン０．０２ｍｇ／ｋｇ体重の筋肉注射で麻酔した。ブタは、純酸素におけるハロタン及びイソフルレン（１．５〜３％）の吸入混合物での全身麻酔下でかつ３０〜５０滴／分の一定速度でのＨａｒｔｍａｎ溶液（乳酸リンゲル液）の静脈内注入によって維持された。

五つの筋肉二重皮弁の創傷が、Ｓｗｉｎｄｌｅ（Ｓｗｉｎｄｌｅ ＭＭ．Ｓｕｒｇｅｒｙ，ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｓｗｉｎｅ．Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，米国，ｐｐ７４−７７，１９９８）に従ってブタの背中の背面上の（筋層内に延びる）９×３ｃｍのサイズの脊椎傍領域上に誘発された。創傷誘発後７日で、全身麻酔下で、創傷は３．５×３．５ｃｍの開口を与えて露出され、装置（Ｄｅｒｍａｓｔｒｅａｍ（登録商標）；ＷＯ ０３／０１１３６９，ＵＳ ２００４／０１８６４２１及びＷＯ ２００５／０７０４８０）は創傷の上に置かれ、皮膚周囲に取り付けられ、それらの入口及び出口部は溶液貯蔵器及び流体収集袋にそれぞれ接続された。

五つの創傷のうち四つを、１ｍｌ／分の流速で６〜１１時間、酵素又は塩水の６〜１１時間の制御された流れに供した。一つの創傷はコントロールとして治療しなかった。

創傷清拭酵素溶液は６００００ＵＳＰ−Ｕ／ｍｌの濃度でパパイン（Ｍｅｒｃｋ Ｃａｔ．Ｎｏ １．０７１４９．５０００，３００００ＵＳＰ Ｕ／ｍｇの比活性を有する）を含有し、実施例１に従って調製された。

６〜１１時間の治療後、流れを止め、ＤｅｒｍａＳｔｒｅａｍ（登録商標）を全ての創傷から除去し、各創傷領域の表面の写真文書化を、高解像度で〜４５°ｗの角度で創傷表面から２０ｃｍの距離でＳ３ Ｐｒｏ ｚｏｏｍ Ｎｉｋｏｎカメラによって実施した。領域は全創傷部位と縁を含んでいた。

ブタは、ペンタル（２００ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ／１．５ｋｇ体重の筋肉注射によって犠牲にされ、全ての創傷から生検材料を摘出した。それは１×４ｃｍサイズの創傷領域の長手方向のサンプリングを含んでいた。生検材料は通常の皮膚の縁並びに下にある傷ついていない筋層を含んでいた。試料は、４％パラホルムアルデヒドで４８時間固定化され、パラフィンに包埋された。通常の縁から創傷限界の縁まで走る一つの無作為の代表的な切片（８μｍ）を各ブロックから収集し、ヘマトキシリンエオシン染色技術で染色した。

ブタの創傷モデル上に６時間〜１１時間、実施例１に従って調製されたパパイン溶液を流す創傷清拭効果は、未処置の創傷に比べて、図１に示された組織切片に与えられる。結果は、６時間の単一処置後に既に有意なデブリドマンが作用したことを明確に示す。

実施例７：ブタの創傷モデルＩＩの上に創傷清拭溶液を流すことによる創傷デブリドマン
実施例２に記載された溶液を流すことを、実施例６に記載された実験構成を使用して６時間〜１１時間、異なるブタの創傷の上に適用し、その結果を表２に与える。結果は、６時間後に既に効果的なデブリドマンを達成し、１１時間以内に実質的な清浄化が充血の特徴のある外観を伴って達成されたことを示す。

実施例８：ブタの創傷モデルＩＩＩの上に本発明に従って調製された溶液を流すことによる創傷デブリドマン
実施例６に記載された実験構成を使用して６時間及び１１時間、実施例３に記載された溶液を流す結果を図３に与える。結果は、６時間後に既に効果的なデブリドマンを達成したことを示す。

実施例９：ブタの創傷モデルＩＶの上に本発明に従って調製された溶液を流すことによる創傷デブリドマン
実施例６に記載された実験構成を使用して１１時間、実施例５に記載された溶液を流す結果を図４に与える。結果は、効果的なデブリドマンを示す。

壊死創傷のデブリドマンの形態及び外観に対する異なる創傷清拭組成物の影響が図５に示される：Ａ−６時間塩水５％におけるパパイン（４０ｍｇ／ｍｌ）（左側−治療前、右側−治療後）；Ｂ−６時間塩水０．９％及びグリセロール１０％におけるパパイン（４０ｍｇ／ｍｌ）；Ｃ−６時間塩水５％及びグリセロール１０％におけるパパイン（４０ｍｇ／ｍｌ）。

実施例１０：安全性試験−急性皮膚刺激
２ｍｇ／ｍｌを含む創傷清拭溶液（以下「Ｅｎｚｙｓｔｒｅａｍ（登録商標）」とも称される）の皮膚刺激性反応の可能性の評価のために急性皮膚刺激研究を、雌のニュージーランド（ＮＺＷ）のウサギ（ｎ＝３），３．０〜３．４ｋｇにおいて行った。

全てのウサギにおいて、ウサギの背中の指定された部位上への試験溶液の適用の４〜２４時間前に、脊柱の両側をしっかりと切り取ることによって毛皮を除去した。各ウサギの背中上に、二つのコントロール部位及び二つの治療部位（各々約２．５×２．５ｃｍ）を調製した。各ウサギ上の二つの治療部位は０．５ｍｌのＥｎｚｙｓｔｒｅａｍ（登録商標）の最終創傷清拭溶液に供され、残りの二つの試験部位は同容量の塩水で治療された。試験溶液はまずガーゼ片に適用され、それは次いで４時間、それぞれの部位に直接適用された。４時間の露出時間の終了後に、ガーゼ片は除去された。

観察及び検査：ウサギをガーゼ片の除去後に７２時間観察した。７２時間を越える長期間の観察が持続性皮膚反応の場合においてなされ、動物は、可逆性が見られるまで又は適用後最大１４日まで毎日一回観察された。紅斑及び浮腫の兆候（皮膚反応の等級に従う）及び適用部位での反応は、治療後の１，４，２４，４８及び７２時間後に評価された。動物が１４日まで監視された場合には、さらなる検査は毎日一回行われた。全身性の副作用の検査は研究期間全体を通して毎日一回実施された。

体重は試験部位への溶液適用前及び研究終了時（長期間の観察の場合には７２時間又は１４日後）に測定された。

データ評価：試験溶液の潜在的な刺激効果の評価は、紅斑及び浮腫に対してはＤｒａｉｚｅ刺激インデックスを使用する一次刺激インデックス（ＰＩＩ）スケールの測定に基づき（Ｄｒａｉｚｅ，ＵＬ．：Ｄｅｒｍａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｉｎ ｆｏｏｄ，ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ．Ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｏｆｆｉｃｉａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｄｒｕｇ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ．１９５９ Ｐａｇｅｓ：４６〜５９）、ＩＳＯ１０９９３−１０で特定されたように「ウサギの刺激反応分類」と比較された。適用部位のＰＩＩは評価された：１時間ですぐに、４時間ガーゼ適用後、及び治療後２４，４８及び７２時間。

結果：全てのウサギにおける全体の皮膚刺激性反応は、ＰＩＩスコア（０〜１．９）に従うと「無視できる」〜「わずかな」反応をもたらし、１．０５（「わずかな」）の平均を有していた。さらに、試験溶液に対する反応の臨床的兆候が全くないことはいずれのウサギにおいても明白であり、しかも全研究期間にわたって体重の異常な変化は全くなかった。

実施例１１：安全性試験−１時間注入中の急性毒物学
安全性評価のために雄のＳｐａｒｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝１２），２７０−２７５ｇにおけるＥｎｚｙＳｔｒｅａｍ（登録商標）の１時間の静脈内注入の急性毒物学研究。

全てのラットは、カテーテル挿入及び注入を介して頸部に対して７０〜８０分間、ハロタンガス麻酔で麻酔された。塩水−ヘパリンを充填されたポリエチレンカテーテルを頸静脈中に挿入した。試験配合物（コントロール−塩水又はＥｎｚｙＳｔｒｅａｍ（登録商標）溶液）の遅い自動注入は一時間にわたって１ｍｇ／ｍｌパパイン溶液の１ｍｌについて実施された。五匹のラットは塩水に供されたが、七匹のラットはＥｎｚｙＳｔｒｅａｍ（登録商標）溶液で治療された。

投与量の論理的根拠：投与される溶液の量は１ｍｌ／動物重量〜２５０ｇであった。投与されるパパイン酵素の濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。これらの量は、臨床試験における一回の流しの間、治療創傷領域によって流された酵素溶液の５０％の潜在的な吸収を示すために動物及び人間の体重並びに血液循環容量に従って計算された。この値は、臨床試験中の静脈性／糖尿病性潰瘍の治療時に実際に吸収される量より１００倍高いと想定されうる。この想定は糖尿病及び静脈潰瘍の劣った血液循環に基づいており、従って身体／血液系への流体の侵入が最小になると想定されうる。

注入後一時間で、カテーテルは引き抜かれ、血管及び皮膚は縫合された。動物は続く１４日間監視され、ペンタル（２００ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ／１．５ｋｇ体重の注入によって犠牲にされた。

生理的かつ生化学的パラメータ：体重（ＢＷ）は静脈注入前及び注入後２４，４８，７２時間、７及び１４日で測定された。

温度及び心電図（ＥＣＧ）は注入前、注入中に１０分ごとに、そして注入後３，２４，４８，７２時間、７及び１４日で測定された。

血液試料は、注入期間前及び注入後３，２４，４８，７２時間、７及び１４日でＣＢＣ、肝臓及び腎臓機能及び電解質のために尾静脈から得られた。

活力、及び食事、飲水、尿及び糞便分泌物の正常な挙動なパターンが毎日監視された。

組織学：１４日後、心臓；肺；腎臓及び副腎；肝臓；食道；気管；甲状腺；膵臓；胸腺；ｘｙｐｈｏｉｄ軟骨；脾臓及び膝関節の主要な器官からの生検材料が全てのラットから除去され、すぐに４％燐酸緩衝されたホルムアルデヒドに４８時間固定され、通常の組織学的手法によって処理され、パラフィンに包埋された。

連続切片は８μｍ厚さで切断された。切片はヘマトキシリン及びエオシンで染色され、毒性効果のための組織学的検査のためにとられた。

結果：静脈内注入の開始前の順応期間中、ラットの全ての監視されるパラメータは正常な生理学的な範囲内であった。体重（ＢＷ）、直腸温、心拍数、肝臓及び腎臓機能のための血液試験並びに血液電解質レベルは、塩水コントロ−ルと実験治療群の間の統計的な差を全く示さず、全て正常なデータ範囲内であった。ＢＷ変化の同様の動的プロファイルは実験及びコントロール群において示された：ＢＷは注入手順後最初の３日間わずかに減少し、４日目で増加しはじめ、最終的に注入前のＢＷデータよりさらに高くなった。

両動物群から１２個の検査内部器官の組織切片において異常は検出されなかった。組織レベルで試験された全ての動物の全ての器官及び組織（塩水治療又はパパイン治療）は病理学的、形態学的変化又は他の副作用なしで正常な組織パターンを示した。

上記の実験条件下で得られた結果は、ラットに一時間注がれたＥｎｚｙｓｔｒｅａｍ（登録商標）創傷清拭溶液に対していかなる毒性の副作用も存在しないことを示す。

実施例１２：安全性試験−６時間注入中の急性毒物学
６時間の長期間の急性静脈内（ｉ．ｖ．）注入を通して実施例１１に記載された同じ用量（１ｍｇ／ｍｌパパイン溶液の１ｍｌ）でＥｎｚｙｓｔｒｅａｍ（登録商標）溶液の静脈内注入の安全性評価を、８匹のＳｐａｒｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（４匹の雄及び４匹の雌）、２７０〜２７５グラム、麻酔された覚醒ラットにおいて行った。

方法：全てのラットはＦｌｕｎｉｘｉｎ Ｍｅｇｌｕｍｉｎの一回の皮下注射で無痛覚にされ、その後実験構成調製のためにケタミン−キシラシンの注射によって麻酔された。ヘパリン化塩水を充填されたポリエチレンチューブを頸静脈中に挿入した。動物が覚醒状態に戻ってから約一時間後、試験配合物（コントロール−塩水又はＥｎｚｙｓｔｒｅａｍ（登録商標））の遅い自動注入の開始は、スイベル２を通して細長い通路３の一端に接続された注入ポンプ１によって実施され、通路３の第二の端はつなぎ縄及び鞍部４を通して動物の皮膚と通じている（図６）。通路３は、ステンレス鋼のばねを含んでもよい。注入の速度は６時間、１ｍｇ／ｍｌパパイン溶液の１ｍｌの２．７７μｌ／ｍｉｎであった。４匹のラットは塩水の注入を受けたが、他のラットはＥｎｚｙｓｔｒｅａｍ（登録商標）溶液を投与された。

６時間の注入後、カニューレを取りはずし、血管及び皮膚を縫合した。動物は、１４日間監視され、ＣＯ_２窒息によって安楽死させた。

生理的かつ生化学的パラメータ：体重は静脈内注入前及び注入後２，４，７及び１４日で測定された。

臨床的兆候は全１４日の観察期間を通して毎日記録された。観察は皮膚、毛皮、目、粘膜、分泌物及び排出物の発生、自律神経活動（例えば、流涙、唾液分泌、立毛、瞳孔の大きさ、及び異常な呼吸パターン）の変化を含んでいた。

活力、及び食事、飲水、尿及び糞便分泌物の正常な挙動なパターンもまた毎日監視された。

ＣＢＣ、肝臓及び腎臓機能、及び電解質に対する血液試料は、注入期間前及び２４時間後にカニューレによって頸静脈から得られた。観察期間の終了時に、犠牲前に、血液試料は後部眼窩内洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）から得られた。

組織学：心臓；肺；腎臓及び副腎；肝臓；食道；気管；甲状腺；膵臓；胸腺；ｘｙｐｈｏｉｄ軟骨；脾臓；膝関節及び脳の主要な器官から生検材料が全てのラットから除去され、すぐに４％ホルムアルデヒド溶液に４８時間保存され、通常の組織学的手法によって処理され、パラフィンに包埋された。連続切片は８μｍ厚さで切断された。切片はヘマトキシリン及びエオシンで染色され、毒性効果のための組織学的検査のためにとられた。

結果：静脈内注入の開始前の順応期間中、ラットの全ての監視されるパラメータは正常な生理学的範囲内であった。

生理的パラメータ：コントロール塩水治療又はＥｎｚｙｓｔｒｅａｍ（登録商標）治療ラットにおいて全研究期間を通して顕著な臨床的兆候はないことは明らかであった。

体重測定は両群において注入後２及び４日でわずかな一時的なＢＷ損失を示したが、注入後７日で両群の全ての動物は体重の増加を示した。

注入前及び注入後２４時間に収集された血液試料中の電解質並びに肝臓及び腎臓機能のような臨床的化学パラメータの検査は、コントロール及びＥｎｚｙｓｔｒｅａｍ（登録商標）治療群の両方において正常範囲内であった。両群から１４日の研究期間の終了時に得られた血液学的及び生化学的パラメータの両方の測定は同様に、全てが正常範囲内であることを示した。

組織学的所見：死体解剖レベルで、両群において肉眼的病理学的所見は全く観察されなかった。組織学的レベルで、全ての動物（塩水治療又はＥｎｚｙｓｔｒｅａｍ（登録商標）治療）の全ての器官及び組織は、いかなる病理学的、形態学的変化も又は他の悪影響もなしで正常の組織学的パターンを示した。

結果：上記の実験条件下の安全性研究で得られた結果は、６時間静脈内に注入されたときにＥｎｚｙｓｔｒｅａｍ（登録商標）創傷清拭溶液に対する毒性の副作用もないことを明らかに示す。

実施例１３：保管寿命
可変量のグリセロール及びＮａＣｌを含有する濃縮されたパパイン溶液の４℃貯蔵時の貯蔵安定性（保管寿命）。

方法：以下のように可変量のグリセロール及びＮａＣｌを含有する三つの濃縮酵素溶液が調製された（４０ｍｇ／ｍｌパパイン３００００ＵＳＰ−Ｕ／ｍｇ各々）：（Ｉ）５％グリセロール＋０％ＮａＣｌ；（ＩＩ）３０％グリセロール＋０％ＮａＣｌ、及び（ＩＩＩ）３０％グリセロール＋１８％ＮａＣｌ。濃縮された酵素溶液は、使用するまでアルミニウム箔で包まれた、しっかりと封止された管に４℃で貯蔵された。

各チェックポイントで試料は、各管から取り出され、新しく調製された緩衝液及びシステイン活性化剤溶液で予め形成された標準ＢＡＰＮＡ基質パパインバイオアッセイに供された。

残留酵素活性は、４１０ｎｍで１０分間、反応の傾きを比較することによって特徴づけられた。

結果：図７Ａ及び７Ｂによって示されるように、３０％グリセロール及び１８％ＮａＣｌを含む酵素組成物は最も高い残留酵素活性を示す。酵素反応の最初の傾きのほとんど、約９０％が４℃での１２ヶ月のインキュベーションを通して安定に維持された。傾き分析（図７Ｂ）は、最初の３ヶ月の間の反応速度の低下が速く、続いて残留活性の安定化を示すが、これは酵素貯蔵安定性研究の十分な証拠となる現象である。

特定の実施態様の前述の記載は、過度の実験なしでかつ一般的な概念から逸脱せずに、現在の知識を適用し、このような特定の実施態様を様々な用途のために容易に変更及び／又は適応することによって、他人がなしうる本発明の一般的な性質を十分に表わしており、それゆえ、このような適応及び変更は、開示された実施態様の意味及び均等の範囲内で理解されるべきであり、そのように意図される。本明細書において使用される語法又は用語は、説明の目的のためであり、限定されるものではないことを理解されるべきである。様々な開示された機能を実施するための手段、材料及び工程は、本発明から逸脱せずに様々な代替的形態をとりうる。

コントロール（未処理：Ｃ）に対する６時間（Ａ）又は１１時間（Ｂ）にわたって実施例１に従って調製されたパパイン溶液の流れで処理されたブタの創傷モデルの組織構造部分を示す。 ６時間（Ａ）又は１１時間（Ｂ）にわたって実施例２に従って調製されたパパイン溶液の流れで処理されたブタの創傷モデルの組織構造部分を示す。 ６時間（Ａ）又は１１時間（Ｂ）にわたって実施例３に従って調製されたパパイン溶液の流れで処理されたブタの創傷モデルの組織構造部分を示す。 １１時間にわたって実施例５に従って調製されたパパイン溶液の流れで処理されたブタの創傷モデルの組織構造部分を示す。 壊死創傷デブリドマンの形態及び外観に対する異なる創傷清拭溶液の影響を示す。 げっ歯類の点滴注入のための注入ポンプシステムを示す。 パパイン溶液の保管寿命を示す。 パパイン溶液の保管寿命を示す。

Claims (32)

1. パパイン、ブロメライン、及びフィシンからなる群から選択されるチオールプロテアーゼの非活性濃縮物を含む組成物であって、前記濃縮物が高張性濃縮物であり、かつ少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの不活性形態の前記チオールプロテアーゼを含み、さらに塩化ナトリウム、グリセロール、マンニトール、デキストラン、ポリエチレングリコール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一種の浸透物質を含み、前記濃縮物が、周囲温度又は４〜１０℃の範囲内の温度で少なくとも一週間、安定であり、前記チオールプロテアーゼが５０００〜５００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内のタンパク質分解活性を持つように希釈によって再活性化され、組成物が組織の創傷清拭に使用するためのものである、組成物。
2. チオールプロテアーゼはパパインである、請求項１に記載の組成物。
3. チオールプロテアーゼの濃度は２５〜４５ｍｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１に記載の組成物。
4. 非活性濃縮物は、粒状物質を全く含まない、請求項１に記載の組成物。
5. 少なくとも一種の浸透物質は少なくとも１％ｗ／ｖの濃度の塩化ナトリウムである、請求項１に記載の組成物。
6. 少なくとも一種の浸透物質は最大２０％ｖ／ｖの濃度のグリセロールである、請求項１に記載の組成物。
7. 少なくとも一種の浸透物質はグリセロール及び塩化ナトリウムを含み、グリセロールの濃度は最大３０％ｖ／ｖであり、塩化ナトリウムの濃度は最大１８％ｗ／ｖである、請求項１に記載の組成物。
8. 非活性濃縮物は、４〜１０℃の範囲内の温度での貯蔵下で安定である、請求項１に記載の組成物。
9. Ｎ−（２−アセトアミド）−２−イミノ二酢酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、及びそれらの組み合わせから選択される緩衝液をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
10. 少なくとも一種の希釈溶液に希釈された、請求項１に記載の組成物を含む創傷清拭溶液であって、前記少なくとも一種の希釈溶液は少なくとも一種の還元剤、緩衝液、及び少なくとも一種のキレート化剤を含み、前記チオールプロテアーゼがパパインであり、創傷清拭溶液中の前記パパインのタンパク質分解活性は５０００〜５００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内であり、創傷清拭溶液は生理的なｐＨを持つ、創傷清拭溶液。
11. 少なくとも一種の還元剤は、硫化物、シスタミン、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、及び塩酸システインからなる群から選択されるチオール化合物である、請求項１０に記載の創傷清拭溶液。
12. 緩衝液は、トリスヒドロキシメチルアミノエタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、リシン緩衝液、グリシン緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、及びＭＥＳ緩衝液からなる群から選択される、請求項１０に記載の創傷清拭溶液。
13. 少なくとも一種のキレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレン−ビス−（オキシエチレンニトロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、及びエチレンジニトリロ四酢酸（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ ＩＩＩ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の創傷清拭溶液。
14. 創傷清拭組成物を調製するためのキットであって、キットは、請求項１に記載の組成物を含む第一成分；少なくとも一種の還元剤の濃縮溶液を含む第二成分；及び少なくとも一種の緩衝剤及び少なくとも一種のキレート化剤を含む濃縮緩衝溶液である第三成分を含み、前記第一、第二及び第三成分を少なくとも一種の希釈溶液において混合することによって生理的なｐＨを有する創傷清拭溶液を提供し、前記チオールプロテアーゼは活性化により５０００〜５００００ＵＳＰ単位／ｍｇの範囲内のタンパク質分解活性を持つ、キット。
15. チオールプロテアーゼはパパインである、請求項１４に記載のキット。
16. 第一成分はｐＨ３〜６の範囲内のｐＨを有する溶液である、請求項１４に記載のキット。
17. 第一成分は、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝液を含む、請求項１４に記載のキット。
18. 第一成分は、周囲温度での少なくとも一週間の貯蔵下で安定である、請求項１４に記載のキット。
19. 第一成分は、４〜１０℃の範囲内の温度での貯蔵下で安定である、請求項１８に記載のキット。
20. 少なくとも一種の還元剤は、硫化物、シスタミン、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、及び塩酸システインからなる群から選択されるチオール化合物である、請求項１４に記載のキット。
21. 第二成分のｐＨはｐＨ１〜４の範囲内である、請求項１４に記載のキット。
22. 第三成分は、トリスヒドロキシメチルアミノエタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、リシン緩衝液、グリシン緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、及びＭＥＳ緩衝液からなる群から選択される緩衝剤を含む、請求項１４に記載のキット。
23. 第一、第二及び第三成分と少なくとも一種の希釈溶液を混合した後、緩衝剤は生理的ｐＨの範囲内のｐＨを維持する、請求項１４に記載のキット。
24. 少なくとも一種の希釈溶液は、塩水、高浸透性塩水、及び少なくとも一種の浸透物質を含む塩水からなる群から選択される溶液を含む、請求項１４に記載のキット。
25. 少なくとも一種の浸透物質は、塩化ナトリウム、グリセロール、マンニトール、デキストラン、ポリエチレングリコール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載のキット。
26. 高浸透性塩水は少なくとも１％ｗ／ｖの塩化ナトリウムを含む、請求項２４に記載のキット。
27. 高浸透性塩水はグリセロール及び塩化ナトリウムを含み、グリセロールの濃度は最大３０％ｖ／ｖであり、塩化ナトリウムの濃度は最大１８％ｗ／ｖである、請求項２４に記載のキット。
28. キットの各成分と創傷清拭溶液の容量の間の容量比は少なくとも１：１０である、請求項１４に記載のキット。
29. 第一成分はさらに、可逆的な方法で前記チオールプロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害することができる阻害剤を含む、請求項１４に記載のキット。
30. 皮膚病変又は損傷した皮膚を創傷清拭するための薬剤の調製における、外傷用医薬材料と任意選択的に組み合わされる、請求項１４に記載のキットの使用。
31. チオールプロテアーゼはパパインである、請求項３０に記載の使用。
32. 皮膚病変は慢性潰瘍である、請求項３０に記載の使用。