JP6223483B2 - カドヘリン−１１のｅｃ１ドメインを標的とするヒト化抗体ならびに関連組成物および方法 - Google Patents

カドヘリン−１１のｅｃ１ドメインを標的とするヒト化抗体ならびに関連組成物および方法 Download PDF

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Description

本発明は、カドヘリン−１１のＥＣ１ドメインを標的とするヒト化抗体ならびに関連組成物および方法に関する。
関連出願の相互参照
本願は、２０１０年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／３６４，６９８号明細書の利益を主張するものである。上記出願の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
進行した慢性関節炎症を有する患者は、骨および軟骨破壊を含む重度の関節悪化を患い、それは長期間にわたる疼痛、奇形、関節機能の低下、移動性の低下および平均寿命の低下をもたらす。関節炎症は、関節における細胞および炎症性物質の数の増加に関連し、それらは、炎症、軟骨の擦り減りおよび関節表層（ｊｏｉｎｔ ｌｉｎｉｎｇ）の腫脹の原因となる。いくつかの異なる自己免疫疾患は、関節において異常であるかまたは誤って誘導された（ｍｉｓｄｉｒｅｃｔｅｄ）炎症を誘発し、これらの障害を患う個体の関節において慢性炎症をもたらすことが知られている。一般的な炎症性関節障害は、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、ライター症候群および強直性脊椎炎を含む。
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、炎症性関節炎の最も一般的な形態であり、米国の人口の約１％または約２１０万人のアメリカ人に悪影響を及ぼすことが推定されている。ＲＡは、関節の表層または滑膜の炎症によって特徴づけられる慢性疾患であり、長期間にわたる有意な骨および軟骨の障害をもたらしうる。ＲＡは男性より女性において一般的であり、３％に相当する数の女性が一生涯の内にリウマチ様関節炎を発症しうる。現在、ＲＡの原因は知られていない。
ＲＡは、長期間にわたる関節障害をまねき、慢性疼痛、機能の低下および身体障害をもたらしうる。さらに、最近の研究によると、ＲＡを有する人々、特に疾患が十分に制御されていない人々は、心疾患、脳卒中、および線維症、特に肺線維症の発症に対して高いリスクを有しうる。
特発性肺線維症および放射線誘発性線維症を含む肺線維症、ならびに喫煙、化学暴露、強皮症、サルコイドーシス、治療用放射線、ＲＡ、または狼瘡を原因とする線維症に、世界中で５，０００，０００人の患者、米国で５００，０００を上回る人が罹患している。特発性肺線維症の５年死亡率は約８０％であり、米国だけでも毎年４０，０００人の死亡原因となっている。米国または欧州には特発性肺線維症のために承認された治療法は現在ない。
Ｖａｌｅｎｃｉａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（１２）：１６７３−１６７９頁（２００４年）
したがって、ＲＡおよび他の炎症性症状を原因とする線維症および慢性関節炎症は、国際的な健康問題である。これらおよび他の障害の予防および治療のための新しい作用物質を開発する必要性がある。
本発明は、一実施形態では、哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合するヒト化抗体であって、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、および配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体可変重鎖領域を含むヒト化抗体に関する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質をアンタゴナイズする。さらなる実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号６９を含む抗体可変重鎖領域を含む。
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合するヒト化抗体であって、配列番号６９を含む抗体可変重鎖領域および配列番号７１を含む抗体可変軽鎖領域を含むヒト化抗体に関する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質をアンタゴナイズする。
さらなる実施形態では、本発明は、治療を必要とする哺乳動物被験体（例えばヒト）のカドヘリン−１１媒介性障害（例えば炎症性関節障害）を治療する方法を提供する。本方法は、哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合し、哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質をアンタゴナイズする治療有効量のヒト化抗体を被験体に投与し、それによって被験体に所望の治療効果をもたらすステップを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号６９を含む抗体可変重鎖領域を含む。好ましい実施形態では、カドヘリン−１１媒介性障害はリウマチ様関節炎である。
さらに別の実施形態では、本発明は、哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合するヒト化抗体および薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号６９を含む抗体可変重鎖領域を含む。さらなる実施形態では、医薬組成物は、第２の作用物質、例えば疾患改善抗リウマチ薬または抗炎症剤をさらに含む。
本発明は、ヒトにおいて、カドヘリン−１１によって媒介される炎症および他の症状の治療効果を改善する新しい作用物質および治療法を提供する。
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許または公開特許公報のコピーは、要求および必要手数料の支払時に特許局によって提供されることになる。
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合し、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質をアンタゴナイズするヒト化抗体であって、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、および配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体可変重鎖領域を含むヒト化抗体、
〔２〕前記抗体が、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質の１つ以上の他のカドヘリン−１１タンパク質への結合、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質を発現する細胞の凝集、酵素発現の誘導、サイトカイン発現の誘導、成長因子発現の誘導、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質を発現する細胞の遊走、および軟骨の破壊からなる群から選択される、１つ以上のカドヘリン−１１媒介性活性を阻害する、〔１〕に記載のヒト化抗体、
〔３〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６９を含む、〔１〕に記載のヒト化抗体、
〔４〕前記抗体が、配列番号７１、配列番号７３、および配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体可変軽鎖領域を含む、〔１〕に記載のヒト化抗体、
〔５〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６１を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７１を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔６〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６１を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７３を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔７〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６１を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７５を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔８〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６３を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７１を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔９〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６３を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７３を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔１０〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６３を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７５を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔１１〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６５を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７１を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔１２〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６５を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７３を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔１３〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６５を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７５を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔１４〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６７を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７１を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔１５〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６７を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７３を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔１６〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６７を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７５を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔１７〕前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７１を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔１８〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６９を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７３を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔１９〕前記抗体可変重鎖領域が配列番号６９を含み、前記抗体可変軽鎖領域が配列番号７５を含む、〔４〕に記載のヒト化抗体、
〔２０〕前記抗体が、配列番号３に存在するエピトープに結合する、〔１〕に記載のヒト化抗体、
〔２１〕前記抗体が、配列番号１０に存在するエピトープに結合する、〔１〕に記載のヒト化抗体、
〔２２〕前記抗体が、配列番号１１を含むエピトープに結合する、〔１〕に記載のヒト化抗体、
〔２３〕前記抗体が抗体全体である、〔１〕に記載のヒト化抗体、
〔２４〕前記抗体が抗体断片である、〔１〕に記載のヒト化抗体、
〔２５〕前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびｓｃＦｖからなる群から選択される、〔２４〕に記載のヒト化抗体、
〔２６〕哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合し、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質をアンタゴナイズするヒト化抗体であって、配列番号６９を含む抗体可変重鎖領域および配列番号７１を含む抗体可変軽鎖領域を含むヒト化抗体、
〔２７〕前記抗体が、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質の１つ以上の他のカドヘリン−１１タンパク質への結合、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質を発現する細胞の凝集、酵素発現の誘導、サイトカイン発現の誘導、成長因子発現の誘導、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質を発現する細胞の遊走、および軟骨の破壊からなる群から選択される、１つ以上のカドヘリン−１１媒介性活性を阻害する、〔２６〕に記載のヒト化抗体、
〔２８〕前記抗体が抗体全体である、〔２６〕に記載のヒト化抗体、
〔２９〕前記抗体が抗体断片である、〔２６〕に記載のヒト化抗体、
〔３０〕前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびｓｃＦｖからなる群から選択される、〔２９〕に記載のヒト化抗体、
〔３１〕哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合し、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質をアンタゴナイズするヒト化抗体および薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物であって、前記抗体が、配列番号６９を含む抗体可変重鎖領域を含み、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質をアンタゴナイズする医薬組成物、
〔３２〕前記抗体が、配列番号７１を含む抗体可変軽鎖領域を含む、〔３１〕に記載の医薬組成物、
〔３３〕前記抗体が、前記哺乳動物カドヘリン−１１を発現する細胞の凝集を阻害する、〔３１〕に記載の医薬組成物、
〔３４〕前記抗体が抗体全体である、〔３１〕に記載の医薬組成物、
〔３５〕前記抗体が抗体断片である、〔３１〕に記載の医薬組成物、
〔３６〕疾患改善抗リウマチ薬をさらに含む、〔３１〕に記載の医薬組成物、
〔３７〕前記疾患改善抗リウマチ薬がメトトレキサートである、〔３６〕に記載の医薬組成物、
〔３８〕抗炎症剤をさらに含む、〔３１〕に記載の医薬組成物、
〔３９〕前記抗炎症剤がＮＳＡＩＤまたはステロイドである、〔３８〕に記載の医薬組成物、
〔４０〕〔１〕に記載のヒト化抗体をコードする単離核酸、
〔４１〕前記核酸がベクター中に存在する、〔４０〕に記載の単離核酸、
〔４２〕〔１〕に記載のヒト化抗体を発現する単離細胞、
〔４３〕治療を必要とする哺乳動物被験体のカドヘリン−１１媒介性障害を治療する方法であって、前記被験体に、哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合する治療有効量のヒト化抗体を投与するステップを含み、前記抗体が、配列番号６９を含む抗体可変重鎖領域を含み、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質をアンタゴナイズする方法、
〔４４〕前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質を発現する細胞の凝集が、前記被験体の１つ以上の関節において阻害される、〔４３〕に記載の方法、
〔４５〕前記抗体が、配列番号７１を含む抗体可変軽鎖領域を含む、〔４３〕に記載の方法、
〔４６〕前記抗体が抗体全体である、〔４３〕に記載の方法、
〔４７〕前記抗体が抗体断片である、〔４３〕に記載の方法、
〔４８〕前記カドヘリン−１１媒介性障害が、炎症性障害、線維症、および癌からなる群から選択される、〔４３〕に記載の方法、
〔４９〕前記カドヘリン−１１媒介性障害が、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、若年性慢性関節炎、慢性ライム病、および全身性紅斑性狼瘡に関連した関節炎からなる群から選択される炎症性関節障害である、〔４３〕に記載の方法、
〔５０〕前記哺乳動物被験体がヒトである、〔４３〕に記載の方法、
〔５１〕前記抗体が全身投与される、〔４３〕に記載の方法、
〔５２〕前記抗体が静脈内投与される、〔４３〕に記載の方法、
〔５３〕前記抗体が、関節の中への直接注射により投与される、〔４３〕に記載の方法、
〔５４〕前記抗体が、前記被験体の１つ以上の関節において、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質を発現する細胞の遊走、接着、軟骨への浸潤、または細胞間シグナル伝達を阻害する、〔４３〕に記載の方法、
〔５５〕前記抗体が、前記被験体の１つ以上の関節において、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質を発現する細胞内での、コラゲナーゼ、セリンプロテアーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼからなる群から選択される酵素の発現または活性の誘導を阻害する、〔４３〕に記載の方法、
〔５６〕前記抗体が、前記被験体の１つ以上の関節において、前記哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質を発現する細胞内での、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＲＡＮＫＬ、およびＴＲＡＮＣＥからなる群から選択されるサイトカインまたは成長因子の発現または活性の誘導を阻害する、〔４３〕に記載の方法、
〔５７〕前記抗体が、疾患改善抗リウマチ薬および抗炎症剤からなる群から選択される少なくとも１つの作用物質と併用投与される、〔４３〕に記載の方法、
〔５８〕治療を必要とする哺乳動物被験体におけるカドヘリン−１１媒介性障害の治療のためのヒト化抗体の使用であって、前記抗体が哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合し、配列番号６９を含む抗体可変重鎖領域を含む使用、
〔５９〕前記カドヘリン−１１媒介性障害が炎症性障害である、〔５８〕に記載の使用、
〔６０〕前記炎症性障害が炎症性関節障害である、〔５９〕に記載の使用、
〔６１〕前記炎症性関節障害がリウマチ様関節炎である、〔６０〕に記載の使用、
〔６２〕前記カドヘリン−１１媒介性障害が線維症である、〔５８〕に記載の使用、
〔６３〕前記カドヘリン−１１媒介性障害が癌である、〔５８〕に記載の使用
に関する。
本発明により、カドヘリン−１１のＥＣ１ドメインを標的とするヒト化抗体ならびに関連組成物および方法が提供される。
抗Ｃａｄ−１１抗体２３Ｃ６、１３Ｃ２および２７Ｆ３を使用したカドヘリン−１１−ＥＣ１−５−Ｆｃ融合タンパク質の検出を示すウエスタンブロットである（黒矢印を参照）。これらの抗体は、膜上にさらに存在するカドヘリン−１１−ＥＣ１−Ｆｃおよびカドヘリン−１１−ＥＣ１／２−Ｆｃ融合タンパク質を認識しなかった（ブロット上のカドヘリン−１１−ＥＣ１−Ｆｃおよびカドヘリン−１１−ＥＣ１／２−Ｆｃタンパク質の位置に対しては白矢印を参照）。 ＥＬＩＳＡによって測定された、周知のカドヘリン−１１抗体１３Ｃ２、２３Ｃ６および５Ｆ８２と、Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質ではないヒトＣａｄ−１１−ＥＣ１−５−Ｆｃ融合タンパク質との結合を示すグラフである。それに対し、ＥＣ１抗体Ｈ１Ｍ１は、Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＣａｄ−１１−ＥＣ１−５−Ｆｃ融合タンパク質の双方に結合する。 カドヘリン結合に関与するヒトＣａｄ−１１（配列番号３）、ＭＮ−Ｃａｄ（配列番号４）、およびＣａｄ−８（配列番号５）のＥＣ１ドメインの最初の３４個のアミノ酸のアミノ酸配列アラインメントである。カドヘリンカウンター受容体のポケットに延在するドナー配列を有する残基は、配列の左半分の下線によって示され、ポケット配列の残基は、配列番号３における配列の右半分の下線によって示される。 ＥＬＩＳＡによって測定された、カドヘリン−１１結合Ｆａｂが、ヒトＣａｄ−１１ ＥＣ１ドメインペプチドおよびＣａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質と結合するが、Ｃａｄ−８またはＭＮ−Ｃａｄ ＥＣ１ドメインペプチドと結合しないことを示すグラフである。クローン７は、Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメインペプチドおよび融合タンパク質に有意に結合するが、ＭＮ−ＣａｄまたはＣａｄ−８ ＥＣ１ドメインペプチドに結合しないことを示した。 インビトロＣａｄ−１１細胞凝集アッセイからのデータを示すグラフである。培地に添加されるＣａｄ−１１アンタゴニスト、例えば抗Ｃａｄ−１１抗体１３Ｃ２から作製されるＦａｂ、またはカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインの最初の３５個のアミノ酸に特異的な様々な濃度の抗カドヘリン−１１ ＥＣ１ Ｆａｂ（ＥＣ１ Ｆａｂクローン７と称される）は、Ｃａｄ−１１媒介性４３１−Ｄ−１１細胞凝集を遮断する。抗カドヘリン−１１ ＥＣ１ Ｆａｂ（クローン７）は、０．３μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲内の試験されたすべての濃度で、Ａ−４３１−Ｄ−１１類表皮癌細胞の凝集を阻害した。それに対し、１３Ｃ２抗カドヘリン−１１抗体から作製されたＦａｂは、１０μｇ／ｍｌの濃度でのみ細胞凝集を阻害した。 第２のインビトロＣａｄ−１１細胞凝集アッセイからのデータを示すグラフである。４３１−Ｄ−１１細胞のパーセント凝集が、ＳＭＥ培地（対照と称される）、ヒトＩｇＧ２ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合されたＣａｄ−１１のＥＣ１ドメインを含む様々な濃度の融合タンパク質（Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃと称される）、カドヘリン−１１のＥＣ１ドメインの最初の３５個のアミノ酸に特異的な様々な濃度の抗カドヘリン−１１ ＥＣ１ Ｆａｂ（Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ Ｆａｂと称される）または様々な濃度の対照の抗緑色蛍光タンパク質（抗ＧＦＰ）Ｆａｂ（ＧＦＰ ｆＡｂと称される）のいずれかの添加から４０分後に示される。抗カドヘリン−１１ ＥＣ１ Ｆａｂ（クローン７）は、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌの濃度で、Ｃａｄ−１１発現４３１−Ｄ−１１細胞の凝集を阻害した。ＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質は、３μｇ／ｍｌの濃度で４３１−Ｄ−１１細胞の凝集を阻害した。それに対し、抗ＧＦＰ Ｆａｂは、試験濃度のいずれであっても、細胞凝集を有意に阻害できなかった。 インビトロ細胞凝集アッセイの使用による、Ｃａｄ−１１単独（ＥＣ１ ｆＡｂクローン７およびクローン４）、Ｃａｄ−１１およびＣａｄ−８（ＥＣ１ ｆＡｂクローン６）、またはＣａｄ−１１およびＭＮ−Ｃａｄ（ＥＣ１ ｆＡｂクローン５）に対する結合特異性を有する様々な抗カドヘリン−１１ ＥＣ１ ＦａｂによるＣａｄ−１１媒介性細胞凝集の阻害を示すグラフである。試験されたすべてのＦａｂが、対照（Ｄ−１１ ＳＭＥ；左の棒）に対し、４３１−Ｄ−１１細胞凝集を阻害した。 インビトロ細胞凝集アッセイの使用による、Ｃａｄ−１１単独（ＥＣ１ ｆＡｂクローン７）またはＣａｄ−１１およびＭＮ−Ｃａｄ（ＥＣ１ ｆＡｂクローン８）に対する結合特異性を有する抗Ｃａｄ−１１ ＦａｂによるＣａｄ−１１媒介性細胞凝集の阻害を示すグラフである。試験されたＦａｂの特異性は、各Ｆａｂの記号表示の隣の括弧内に示される。両方のカドヘリンに特異的なＦａｂが、ＧＦＰに特異的な対照Ｆａｂ（左の棒）に対し、細胞凝集を阻害した（中央および右の棒）。 ヒトＣａｄ−１１−ＥＣ１−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ１融合タンパク質（Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃ）のヌクレオチド（ＤＮＡ）配列（配列番号６）を示す。ヒトカドヘリン−１１細胞外ドメインの配列はイタリック体で示され、ＢｇｌＩＩ部位には下線が引かれ、またヒトＩｇＧ２−Ｆｃ１領域をコードする配列は太字で示される。 ヒトＣａｄ−１１−ＥＣ１−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ１融合タンパク質（Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃ）のアミノ酸配列（配列番号７）を示す。ヒトカドヘリン−１１細胞外ドメインの配列はイタリック体で示され、ＢｇｌＩＩ部位によってコードされる配列には下線が引かれ、またヒトＩｇＧ２−Ｆｃ１領域の配列は太字で示される。 クマシーブルーで染色されているＳＤＳポリアクリルアミドゲルの画像である。プロテインＡカラムを使用した細胞培地からの精製後における、精製Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ１（中央レーン）およびＣａｄ−１１−ＥＣ１／２−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ１（右レーン）融合タンパク質の単量体形態にそれぞれ対応する主要な強力なバンドを示す。分子量標準は左レーンに示される。 西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に複合された抗ヒトＩｇＧ抗体の使用による、ヒトＣａｄ−１１−ＥＣ１−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ１（中央レーン）およびＣａｄ−１１−ＥＣ１／２−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ１（右レーン）融合タンパク質の検出を示すウエスタンブロットである。各レーン内での主要な観察されたバンドは、融合タンパク質の単量体形態の位置に対応する。融合タンパク質の二量体形態の位置もまた、不十分な還元条件により、視認できる（あまり強力でないより高い分子量バンドを参照）。分子量標準は左レーンに示される。 Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質およびマウス抗Ｃａｄ−１１抗体１３Ｃ２が、Ｃａｄ−１１を発現するヒト線維芽細胞様滑膜細胞の、Ｉｎｖａｓｉｏｎと称される未処置細胞と比較される指定濃度でのマトリゲルプラグへの浸潤を阻害することを示すグラフである。データは、２つの独立実験からプールされる。 ２つのインビトロＣａｄ−１１細胞凝集アッセイからのデータを示すグラフである。Ｃａｄ−１１発現４３１−Ｄ−１１細胞のパーセント凝集が、ＳＭＥ培地（対照と称される）またはＣａｄ−１１融合タンパク質のいずれかの添加の４０分後に示される。ヒトＩｇＧ２ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合されたＣａｄ−１１の５つの細胞外ドメインを含む様々な濃度の融合タンパク質（Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−５−Ｆｃと称される）の存在下での凝集の阻害を示す。２つのインビトロＣａｄ−１１細胞凝集アッセイからのデータを示すグラフである。Ｃａｄ−１１発現４３１−Ｄ−１１細胞のパーセント凝集が、ＳＭＥ培地（対照と称される）またはＣａｄ−１１融合タンパク質のいずれかの添加の４０分後に示される。ヒトＩｇＧ２ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合されたＣａｄ−１１のＮ末端細胞外ドメイン（ＥＣ１ドメイン）を含む様々な濃度の融合タンパク質（Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃと称される）またはＣａｄ−１１−ＥＣ１−５−Ｆｃのいずれかの凝集の阻害を示す。 ヒトカドヘリン−１１ ｃＤＮＡ配列（配列番号１；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００１７９７を参照）を示す。 ヒトカドヘリン−１１ ｃＤＮＡ配列（配列番号１；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００１７９７を参照）を示す。 ヒトカドヘリン−１１ ｃＤＮＡ配列（配列番号１；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００１７９７を参照）を示す。 ヒトカドヘリン−１１タンパク質配列（配列番号２；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７８８を参照）を示す。 ＥＬＩＳＡによって測定された、ペプチド４ハイブリドーマ（ＨＬ）由来の培地または対照ハイブリドーマ培地（Ｍｅｄｉａ）中の抗体と、Ｃａｄ−１１、Ｃａｄ−８またはＭＮ−ＣａｄのＥＣ１−２ドメインを有するタンパク質との結合のレベルを示すグラフである。 Ｈ１４抗体とＣａｄ−１１発現４３１−Ｄ−１１細胞との結合の尺度としての細胞染色の強度（ＭＦＩ；平均蛍光強度）を示す代表的グラフである。Ｈ１４抗体とＣａｄ−１１発現４３１−Ｄ−１１細胞との結合の尺度としての細胞染色の強度（ＭＦＩ；平均蛍光強度）を示す代表的グラフである。Ｈ１４抗体とＣａｄ−１１発現４３１−Ｄ−１１細胞との結合の尺度としての細胞染色の強度（ＭＦＩ；平均蛍光強度）を示す代表的グラフである。 Ｈ１４抗体とＣａｄ−１１陰性細胞との結合の欠如を示す、図１７Ａ〜Ｃに対する４３１−Ｄ細胞染色の不在（ＭＦＩ；平均蛍光強度）を示す代表的グラフである。Ｈ１４抗体とＣａｄ−１１陰性細胞との結合の欠如を示す、図１７Ａ〜Ｃに対する４３１−Ｄ細胞染色の不在（ＭＦＩ；平均蛍光強度）を示す代表的グラフである。Ｈ１４抗体とＣａｄ−１１陰性細胞との結合の欠如を示す、図１７Ａ〜Ｃに対する４３１−Ｄ細胞染色の不在（ＭＦＩ；平均蛍光強度）を示す代表的グラフである。 Ｈ１Ｍ１抗体とＣａｄ−１１発現４３１−Ｄ−１１細胞との結合の尺度としての細胞染色の強度（ＭＦＩ；平均蛍光強度）を示す代表的グラフである。Ｈ１Ｍ１抗体とＣａｄ−１１発現４３１−Ｄ−１１細胞との結合の尺度としての細胞染色の強度（ＭＦＩ；平均蛍光強度）を示す代表的グラフである。Ｈ１Ｍ１抗体とＣａｄ−１１発現４３１−Ｄ−１１細胞との結合の尺度としての細胞染色の強度（ＭＦＩ；平均蛍光強度）を示す代表的グラフである。 細胞染色の強度（ＭＦＩ；平均蛍光強度）によって測定された、様々な濃度の抗体でのＨ１４抗体とＣａｄ−１１発現細胞との結合およびＨ１４とＣａｄ−１１陰性対照細胞との結合の不在を示すグラフである。細胞染色の強度（ＭＦＩ；平均蛍光強度）によって測定された、様々な濃度の抗体でのＨ１Ｍ１抗体とＣａｄ−１１発現細胞との結合およびＨ１Ｍ１とＣａｄ−１１陰性対照細胞との結合の不在を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによって測定された、様々な抗体濃度でのＨ１４抗Ｃａｄ−１１抗体とＣａｄ−１１およびＣａｄ−８ ＥＣ１ドメインペプチドとの結合度を示すグラフである。ＥＬＩＳＡによって測定された、様々な抗体濃度でのＨ１４抗Ｃａｄ−１１抗体とＣａｄ７、ＭＮＣａｄ、Ｃａｄ９、Ｃａｄ１８、Ｃａｄ２０またはＣａｄ２４ ＥＣ１ドメインペプチドとの結合の不在を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによって測定された、様々な抗体濃度でのＨ１Ｍ１抗Ｃａｄ−１１抗体とＣａｄ−１１、Ｃａｄ−８、Ｃａｄ−７、ＭＮ−Ｃａｄ、Ｃａｄ−９、Ｃａｄ−１８、Ｃａｄ−２０、およびＣａｄ−２４ＥＣ１ドメインペプチドとの結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによって測定された、Ｈ１Ｍ１抗Ｃａｄ−１１抗体と、様々なＣａｄ−１１ ＥＣ１ドメインペプチド免疫原（ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３およびＰＥＰ４）、ならびにＣａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン融合タンパク質（ＥＦＬ）およびヒトＩｇＧ対照（Ｆｃブロック）との結合度を示すグラフである。ＥＬＩＳＡによって測定された、Ｈ１４抗Ｃａｄ−１１抗体と、様々なＣａｄ−１１ ＥＣ１ドメインペプチド免疫原（ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３およびＰＥＰ４）、ならびにＣａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン融合タンパク質（ＥＦＬ）およびヒトＩｇＧ対照（Ｆｃブロック）との結合度を示すグラフである。 ペプチド１〜４の各々によって包含される、ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインの最初の３７個のアミノ酸の配列およびこの配列の一部を示す概略図である。ペプチド３の上流にあるペプチド２および４によって共有されるアミノ酸残基はボックス領域内で強調される。Ｃａｄ−１１とＣａｄ−１１の結合に直接関与するアミノ酸には下線が引かれる。 対照アイソタイプ抗体で処置された大きな凝集Ｃａｄ−１１発現細胞塊を示す写真である。図２３Ａ中で認められる、大きな塊を形成するまで至らなかった、小さいＨ１Ｍ１で処置されたＣａｄ−１１発現細胞塊を示す写真である。未処置の親Ｃａｄ−１１陰性細胞が単一または２つの細胞の集団として残存することを示す写真である。 大きい凝集細胞塊を有するＣａｄ−１１発現細胞の培養物を示す写真である。Ｈ１４ Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン抗体での処置後での、図２４Ａ中に示されるものに比べて、細胞塊が小さく低頻度である、主に単一の細胞を伴うＣａｄ−１１発現細胞の培養物を示す写真である。 未処置対照マウスに対する、増加する用量のＨ１Ｍ１抗Ｃａｄ−１１抗体で処置されたマウスにおける関節炎に随伴する関節腫脹の阻害を示すグラフである。 未処置対照マウスに対する、１日おきに０．３ｍｇのＨ１４またはＨ１Ｍ１抗Ｃａｄ−１１抗体のいずれかで処置されたマウスにおける関節炎に随伴する関節腫脹の阻害を示すグラフである。 ０．３ｍｇのＨ１Ｍ１またはＨ１４抗体のいずれかによる処置が、未処置対照に対し、マウスモデルにおける関節炎の発症を遅延させたことを示すグラフである。 Ｃａｄ−１１、Ｃａｄ−８、およびＭＮ−カドヘリンのＥＣ１−２ドメインまたはＣａｄ−１１ ＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質に対する、ペプチド３ハイブリドーマ（ＨＬ）由来の抗体含有培地または対照ハイブリドーマ培地（Ｍｅｄｉａ）の結合度を示すグラフである。 ヒトＣａｄ−１１タンパク質を発現する細胞（矢印を参照）およびＮｅｏを発現した非Ｃａｄ−１１発現対照細胞に対するペプチド３ハイブリドーマ由来の抗Ｃａｄ−１１抗体の結合度を示すグラフである。 培地と共にインキュベートされた線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）を示す写真である。細胞は凝集し、細胞突起を介して結合する細胞が見える。３０μｇ／ｍｌの対照抗体と共にインキュベートされたＦＬＳを示す写真である。細胞は凝集し、細胞突起を介して結合する細胞が見える。３０μｇ／ｍｌのＨ１Ｍ１抗体と共にインキュベートされたＦＬＳを示す写真である。細胞はほとんど凝集せず、細胞突起が見える。 ＥＣ１領域外に結合する他のＣａｄ−１１抗体を含む対照と比較して、Ｈ１Ｍ１抗体との接触後における、マトリゲルでコーティングされた膜の中へのＦＬＳ浸潤の阻害を示すグラフである。 対照と比較して、Ｈ１Ｍ１抗体の投与後における、関節炎のＫＢＮマウスモデルの関節腫脹の阻害を示すグラフである。 Ｈ１Ｍ１可変重鎖ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔによるものである。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は灰色で示される。 Ｈ１Ｍ１可変軽鎖ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔによるものである。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は灰色で示される。 Ｈ１Ｍ１／ＳＹＮ００１２ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体の設計に使用されるＶＨ１鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号６０および６１）を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔによるものである。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は赤で強調表示される。 Ｈ１Ｍ１／ＳＹＮ００１２ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体の設計に使用されるＶＨ２鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号６２および６３）を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔによるものである。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は赤で強調表示される。 Ｈ１Ｍ１／ＳＹＮ００１２ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体の設計に使用されるＶＨ３鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号６４および６５）を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔによるものである。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は赤で強調表示される。 Ｈ１Ｍ１／ＳＹＮ００１２ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体の設計に使用されるＶＨ４鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号６６および６７）を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔによるものである。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は赤で強調表示される。 Ｈ１Ｍ１／ＳＹＮ００１２ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体の設計に使用されるＶＨ５鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号６８および６９）を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔによるものである。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は赤で強調表示される。 Ｈ１Ｍ１／ＳＹＮ００１２ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体の設計に使用されるＶκ１鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号７０および７１）を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔによるものである。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は赤で強調表示される。 Ｈ１Ｍ１／ＳＹＮ００１２ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体の設計に使用されるＶκ２鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号７２および７３）を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔによるものである。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は赤で強調表示される。 Ｈ１Ｍ１／ＳＹＮ００１２ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体の設計に使用されるＶκ３鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号７４および７５）を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔによるものである。ＣＤＲヌクレオチドおよびタンパク質配列は赤で強調表示される。 ｐＡＮＴＶＫおよびｐＡＮＴＶｈＧ４ベクターを図示するベクター図である。ｐＡＮＴＶＫおよびｐＡＮＴＶｈＧ４ベクターは両方とも、イントロンおよびポリＡ配列を組み込んでいるゲノムＤＮＡ断片を含有する。両鎖の発現はＣＭＶプロモーターによりもたらされる。重鎖ベクター上のＤＨＦＲミニ遺伝子は選択のために使用される。 プロテインＡで精製された抗体のクマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。（ａ）キメラ抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ ＩｇＧ４（ＳＹＮ００１４）；（ｂ）ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体（ＳＤＰ０１１〜ＳＤＰ１５１）。サイズマーカーは前染色されたタンパク質標準のＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（カタログ番号ＳＭ１８１１）である。注：ＳＤＰ１１１は泳動されなかった。 抗Ｃａｄ−１１競合ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。ヒト化抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体（ＳＤＰ０１１〜ＳＤＰ０５１）の希釈系列を、組換えヒトＣａｄ−１１融合タンパク質への結合について、一定濃度のビオチン化マウスＳＹＮ００１２抗体に抗して試験した。ビオチン化抗体の結合は、試験および対照抗体の量の増加につれて減少する。 抗Ｃａｄ−１１競合ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。ヒト化抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体（ＳＤＰ０６１〜ＳＤＰ１０１）の希釈系列を、組換えヒトＣａｄ−１１融合タンパク質への結合について、一定濃度のビオチン化マウスＳＹＮ００１２抗体に抗して試験した。ビオチン化抗体の結合は、試験および対照抗体の量の増加につれて減少する。 抗Ｃａｄ−１１競合ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。ヒト化抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体（ＳＤＰ１１１〜ＳＤＰ１５１）の希釈系列を、組換えヒトＣａｄ−１１融合タンパク質への結合について、一定濃度のビオチン化マウスＳＹＮ００１２抗体に抗して試験した。ビオチン化抗体の結合は、試験および対照抗体の量の増加につれて減少する。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ０１１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ０２１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ０３１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ０４１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ０５１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ０６１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ０７１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ０８１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ０９１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ１０１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ１１１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ１２１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ１３１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ１４１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（各曲線中の赤線）およびカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体（ＳＤＰ１５１）の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体ＳＤＰ０３１の軽鎖および重鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列（配列番号７１、６５）を示す。 ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体ＳＤＰ０５１の軽鎖および重鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列（配列番号７１、６９）を示す。 ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体ＳＤＰ０６１の軽鎖および重鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列（配列番号７３、６１）を示す。 ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体ＳＤＰ０７１の軽鎖および重鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列（配列番号７３、６３）を示す。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（赤）またはカドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ＳＤＰ０５１の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５００ｎｇ／ｍｌであった。 カドヘリン交差反応アッセイにおける、Ｃａｄ−１１ペプチド免疫原（赤）またはカドヘリン−８および−１８からの対応する相同配列を包含するペプチドによる、ＳＤＰ０５１の力価測定を示すグラフである。ペプチドコーティング濃度は５０ｎｇ／ｍｌであった。 組換えヒトＣａｄ−１１（ｒｈＣａｄ−１１）に結合するＳＤＰ０５１に対するセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）プロットである。 ＦＡＣＳ（平均蛍光強度（ＭＦＩ））により測定された、Ｃａｄ−１１発現４３１Ｄ−１１細胞へのヒト化抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体ＳＤＰ０５１およびＳＤＰ０７１の抗体濃度依存性結合を示すグラフである。Ｃａｄ−１１を発現していない４３１Ｄ細胞への結合はないことも示されている。 ＦＡＣＳ（平均蛍光強度（ＭＦＩ））測定による、ＳＤＰ０５１抗体のＣａｄ−１１発現細胞への結合能に対する、Ｃａｄ−１１抗原を包含するペプチドの効果を測定するアッセイを使用して、Ｃａｄ−１１に対するＳＤＰ０５１の特異性を示すグラフである。ＳＤＰ０５１のＣａｄ−１１発現細胞への結合能に対する、関連Ｃａｄ−２０またはＣａｄ−２４抗原を包含するペプチドの効果を比較している。 ＦＡＣＳ（平均蛍光強度（ＭＦＩ））測定による、ＳＤＰ０５１抗体のＣａｄ−１１発現細胞への結合能に対する、Ｃａｄ−１１抗原を包含するペプチドの効果を測定するアッセイを使用して、Ｃａｄ−１１に対するＳＤＰ０５１の特異性を示すグラフである。ＳＤＰ０５１のＣａｄ−１１発現細胞への結合能に対する、関連Ｃａｄ−７またはＣａｄ−１８抗原を包含するペプチドの効果を比較している。 ＦＡＣＳ（平均蛍光強度（ＭＦＩ））測定による、ＳＤＰ０５１抗体のＣａｄ−１１発現細胞への結合能に対する、Ｃａｄ−１１抗原を包含するペプチドの効果を測定するアッセイを使用して、Ｃａｄ−１１に対するＳＤＰ０５１の特異性を示すグラフである。ＳＤＰ０５１のＣａｄ−１１発現細胞への結合能に対する、関連Ｃａｄ−８またはＣａｄ−９抗原を包含するペプチドの効果を比較している。 ２５のドナーからのＰＢＭＣを使用する、免疫原性タイムコースＴ細胞アッセイにより測定された、マウス／ヒトのキメラ抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体ＳＹＮ００１４の免疫原性を示すグラフである。各三つ組み試料の結果は、平均化され、刺激指数（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）（ＳＩ）への変換により規準化された。各ドナーについて、各時点でのＳＩが示される。ＳＩ≧２．０の陽性応答を決定するためのカットオフは、赤線によって強調表示されており、有意な応答（スチューデントｔ検定でｐ＜０．０５）は（＊）で示される。 ２５のドナーからのＰＢＭＣを使用する、免疫原性タイムコースＴ細胞アッセイにより測定された、ヒト化抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体ＳＤＰ０５１の免疫原性を示すグラフである。各三つ組み試料の結果は、平均化され、刺激指数（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）（ＳＩ）への変換により規準化された。各ドナーについて、各時点でのＳＩが示される。ＳＩ≧２．０の陽性応答を決定するためのカットオフは、赤線によって強調表示されており、有意な応答（スチューデントｔ検定でｐ＜０．０５）は（＊）で示される。 投与量０．３μｇ／ｍｌのＳＤＰ−０５１が、投与量３μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体（ＡＣ１Ｐ）と比較して、ＦＬＳ浸潤を５０％阻害することを示すグラフである。 投与量０．３μｇ／ｍｌのＳＤＰ−０５１が、投与量３μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体（ＡＣ１Ｐ）と比較して、ＭＭＰ発現を阻害することを示すグラフである。 ＡＣ１Ｐ対照抗体で処置されたマウスと比較して、ＳＤＰ０５１処置マウスにおける関節腫脹が４７％低下したことを示すグラフである。 マウス（ＫＢＮ関節炎モデル）への投与後の、ＳＤＰ０５１抗体の血清レベルを示すグラフである。 ＡＣ３−１Ｐ対照抗体で処置されたマウスと比較した、種々の投与量のＳＤＰ０５１抗体で処置されたマウスの足首の厚さの変化を示すグラフである（マウスＫＢＮ関節炎モデル；ＫＢＮ０２４試験）。
定義
本明細書で使用される用語「カドヘリン−１１」、「Ｃａｄ−１１」および「ＯＢ−カドヘリン」は、天然または内因性カドヘリン−１１（例えば哺乳類、例えばヒト）タンパク質、ならびに天然または内因性カドヘリン−１１タンパク質の場合と同じアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質）を示す。したがって、用語「カドヘリン−１１」、「Ｃａｄ−１１」および「ＯＢ−カドヘリン」は、本明細書中で同義的に使用され、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）において天然に生じる選択的スプライシングまたは他の細胞プロセスによって生成されるカドヘリン−１１タンパク質（例えば、哺乳類、ヒト）の多形性または対立遺伝子変異体および他のアイソフォームを含む。好ましくは、カドヘリン−１１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ００１７８８および図１５を参照）。
本明細書で定義される「カドヘリン−１１アンタゴニスト」は、カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合し、かつ細胞内での１つ以上のカドヘリン−１１媒介性活性を阻害する（例えば、低下させる、阻止する）作用物質（例えば、抗体、融合タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、小分子、核酸）である。カドヘリン−１１媒介性活性は、限定はされないが、カドヘリン−１１タンパク質と１つ以上の他のカドヘリン−１１タンパク質との同型的な結合、カドヘリン−１１を発現する細胞の凝集、酵素（例えば、コラゲナーゼ、セリンプロテアーゼ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３）の発現または活性の誘導、およびサイトカイン（例えば炎症性サイトカイン）または成長因子（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＲＡＮＫＬもしくはＴＲＡＮＣＥ）の誘導、カドヘリン−１１発現細胞の遊走、およびカドヘリン−１１発現細胞による軟骨の破壊を含む。一実施形態では、カドヘリン−１１アンタゴニストは、カドヘリン−１１タンパク質と１つ以上の他のカドヘリン−１１タンパク質との結合を、例えば、Ｃａｄ−１１タンパク質（例えば、細胞の表面上に発現されるＣａｄ−１１タンパク質）のＥＣ１ドメイン内のドナー配列と１つ以上の他のＣａｄ−１１タンパク質（例えば、別の細胞の表面上に発現される１つ以上のＣａｄ−１１タンパク質）のＥＣ１ドメイン内のポケット配列の間での相互作用を遮断することによって阻害しうる。
本明細書で使用される、カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに「特異的に結合する」カドヘリン−１１アンタゴニストは、（例えば生理的条件下で）カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに、カドヘリン−１１アンタゴニストが別のカドヘリンタンパク質（例えば、ＭＮ−カドヘリン、カドヘリン−８）のＥＣ１ドメインに結合する親和性より高い、少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍の親和性（例えば結合親和性）で結合するカドヘリン−１１アンタゴニストを示す。特定の実施形態では、カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合するカドヘリン−１１アンタゴニストは、ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインのＮ末端部分の配列番号３中に存在するエピトープに、カドヘリン−１１アンタゴニストがヒトＭＮ−カドヘリンのＥＣ１ドメインのＮ末端部分の配列番号４中に存在するエピトープに結合する親和性、およびカドヘリン−１１アンタゴニストがヒトカドヘリン−８のＥＣ１ドメインのＮ末端部分の配列番号５中に存在するエピトープに結合する親和性より高い、少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍の親和性で結合する。
本明細書で使用される用語「抗体」は、全抗体および抗体断片（例えば、抗体の抗原結合断片、例えば、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、およびｄＡｂ断片）の双方を包含することが意図される。「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を示し、天然および改変抗体を含む。したがって、用語「抗体」は、例えば、ヒト、キメラ、ヒト化、霊長類化、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）、一本鎖、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）。
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対によって従来の方法で結合される構造の単位を示す。エピトープは、抗体に対する最小結合部位を規定し、故に抗体の特異性の標的を示す。
用語「融合タンパク質」は、２つ以上の異種ポリペプチドの全部または一部を含む、天然、合成、半合成または組換えの単一のタンパク質分子を示す。
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを示し、特定の長さを示さず、それ故、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。
本明細書で使用される用語「ペプチド」は、１つのアミノ酸のアミノ基がペプチド結合によって別のアミノ酸のカルボキシル基に連結される、約２〜約１００個のアミノ酸残基からなる化合物を示す。かかるペプチドは、典型的には約１００アミノ酸残基長未満であり、好ましくは約１０個、約２０個、約３０個、約４０個または約５０個の残基である。
本明細書で使用される用語「ペプチド模倣体」は、ペプチドまたはタンパク質でないが、それらの構造の局面を模倣する分子を示す。ペプチド模倣アンタゴニストは、従来の化学的方法によって調製されうる（例えば、Ｄａｍｅｗｏｏｄ Ｊ．Ｒ．、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｄｅｓｉｇｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ａｉｄ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７年、第９巻、１−８０頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９６年；Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ Ｗ．Ｋ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、１９９９年を参照）。
本明細書で定義される「治療」は、被験体（例えば、哺乳動物、ヒト）への特定の治療剤または予防剤の投与であり、被験体に所望の治療的または予防的利益をもたらす。
本明細書で定義される「処置レジメン」は、１つ以上の治療剤または予防剤が、哺乳動物被験体に特定の用量（例えば、レベル、量（ａｍｏｕｎｔ）、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ））および特定のスケジュールまたは特定の間隔（例えば、分、日、週、月）で投与されるレジメンである。
本明細書で定義される「治療有効量」は、投与の条件下での所望される治療または予防効果を得るのに十分な量、例えば、限定はされないが、関節における炎症（例えば、カドヘリン−１１を発現する細胞、例えば滑膜細胞の凝集を阻害することによって）、または腫瘍の形成、増殖、もしくは転移を阻害する（すなわち、低下させる、阻止する）のに十分な量である。治療の有効性（例えば、関節における炎症の低下および／または関節における炎症の阻止）は、適切な方法（例えば、イメージング法、例えばＭＲＩ、ＮＭＲ、ＣＴ）によって判定されうる。
カドヘリン
カドヘリンは、他のカドヘリンに同型的に結合することによって細胞接着を媒介するＣａ２＋−依存性接着分子の大ファミリーに属する（Ｍ．Ｊ．ＷｈｅｅｌｏｃｋおよびＫ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９：２０７−２３５頁（２００３年））。古典的なカドヘリンは、５つの細胞外カドヘリン（ＥＣ）ドメイン（各々、約１１０アミノ酸長）、膜透過領域および保存された細胞質ドメインを有する１回膜貫通タンパク質である。カドヘリンは、ＥＣドメイン間の相同度に基づき、Ｉ型またはＩＩ型カドヘリンのいずれかに分かれる。ＩＩ型カドヘリンは、ヒトカドヘリン−５、−６、−８、−１１、および−１２、ならびにＭＮ−カドヘリンを含む。細胞間結合の媒介における細胞外ドメインの各々の役割の相対的重要性は不明確である。
滑膜細胞内でのカドヘリン−１１活性
カドヘリン−１１は、関節接合部（ａｒｔｉｃｕｌａｔｅｄ ｊｏｉｎｔｓ）の滑膜表層内での滑膜細胞と滑膜細胞との結合を媒介する（Ｖａｌｅｎｃｉａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（１２）：１６７３−１６７９頁（２００４年）；ＫｉｅｎｅｒおよびＢｒｅｎｎｅｒ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．７（２）：４９−５４頁（２００５年））。ヒトＩｇＧ２のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに融合された、ヒトカドヘリン−１１の全部で５つの細胞外カドヘリンドメインからなる融合タンパク質は、インビトロで滑膜細胞表層の形成を阻害した（Ｋｉｅｎｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６８頁（２００６年））。さらに、マウスＩｇＧ２ａのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに融合された、アンタゴニスト抗カドヘリン−１１抗体およびマウスカドヘリン−１１のＥＣ１−５からなる融合タンパク質は、リウマチ様関節炎のマウスモデルにおける炎症および関節腫脹を阻害した（Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１００６−１０１０頁（２００７年））。
カドヘリン−１１アンタゴニスト
本発明のカドヘリン−１１アンタゴニストは、カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合する任意の作用物質でありえ、細胞内での１つ以上のカドヘリン−１１媒介性活性を阻害する（例えば、低下させる、阻止する）。カドヘリン−１１媒介性活性は、限定はされないが、細胞表面上でのカドヘリン−１１を発現する細胞の凝集、および例えば、コラゲナーゼ、セリンプロテアーゼ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＩＬ−６、ＩＬ−８またはＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥなどの要素の発現または分泌を含む。作用物質は、特に、抗体、融合タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、小分子、または核酸でありうる。
カドヘリン−１１抗体
本明細書中に記載されるように、Ｃａｄ−１１（例えば配列番号３）のドナー配列およびカドヘリン結合ポケットを含む、ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインのＮ末端部分内のエピトープに結合する抗体は、このタンパク質の他の領域内のエピトープに結合する抗体より有効にインビトロでのカドヘリン−１１活性を遮断する（実施例１および２を参照）。
したがって、一実施形態では、本発明は、Ｃａｄ−１１のドナー配列およびカドヘリン結合ポケットを含むカドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインのＮ末端部分内に存在するエピトープに結合する（例えば特異的に結合する）抗体またはその抗原結合断片を提供する。用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体のすべてのタイプ（例えば、ヒト、キメラ、ヒト化、霊長類化、ベニア化、一本鎖、ドメイン抗体（ｄＡｂ））および抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、ｄＡｂ）を包含することが意図される（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照）。特定の実施形態では、Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン−特異抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン−特異抗体はまた、細胞毒性剤に直接的または間接的に連結されうる。
Ｃａｄ−１１タンパク質のＥＣ１ドメインのＮ末端部分に特異的に結合し、かつＣａｄ−１１タンパク質の活性を阻害する他の抗体または抗体断片はまた、従来の方法または他の適切な技術により、産生され、作成され、改変され、および／または単離されうる。例えば、カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに対して特異的な抗体は、適切な免疫原、例えば組換え哺乳動物（例えばヒト）カドヘリン−１１のＥＣ１ドメインペプチド（例えば配列番号３）またはその一部（合成分子、例えば、合成ペプチドを含む）に対して産生されうる。種々の方法についての記載がなされている（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５４９７頁（１９７５年）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９頁（１９７６年）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０−５５２頁（１９７７年）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、米国特許第４，１７２，１２４号明細書；Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ））；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第２巻（付録２７、１９９４年夏）、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ））、第１１章（１９９１年）を参照）。抗体はまた、適切な宿主（例えばマウス）を、カドヘリン−１１のＥＣ１ドメインを発現する細胞（例えば癌細胞／細胞系）またはカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインを発現するように改変された細胞（例えば形質移入細胞）で免疫することによって産生されうる（例えば、Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：１７８３−１７８９頁（１９９４年）；Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉら、米国特許第５，４４０，０２１号明細書を参照）。モノクローナル抗体の産生においては、ハイブリドーマが、適切な不死化細胞系（例えばＳＰ２／０またはＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３などの骨髄腫細胞系）を抗体産生細胞と融合することによって生成されうる。抗体産生細胞は、目的の抗原で免疫されたヒトまたは他の適切な動物の末梢血、または好ましくは脾臓またはリンパ節から得られうる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を用いて単離され、限界希釈によってクローン化されうる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によって選択されうる。
抗体断片は、酵素切断または組換え技術によって産生されうる。例えば、パパインまたはペプシン切断は、それぞれＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２断片を産生しうる。また、必須の基質特異性を有する他のプロテアーゼを使用し、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２断片が産生されうる。抗体はまた、１つ以上の停止コドンが天然停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使用し、種々の切断形態で産生されうる。例えば、Ｆ（ａｂ'）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメインおよび重鎖のヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計されうる。一本鎖抗体、およびヒト、キメラ、ヒト化または霊長類化（ＣＤＲ移植化）、またはベニア化抗体、ならびにキメラ、ＣＤＲ移植化またはベニア化一本鎖抗体（異なる種由来の一部を含む）などもまた、本発明および用語「抗体」によって包含される。これら抗体の様々な部分は、従来の技術によって化学的に共に連結されうるか、または遺伝子工学技術を用いて隣接タンパク質として調製されうる。例えば、キメラまたはヒト化鎖をコードする核酸は、発現により、隣接タンパク質が生成されうる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号明細書；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ Ｍ．Ｓ．ら、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号明細書；Ｑｕｅｅｎら、欧州特許第０４５１２１６Ｂ１号明細書；およびＰａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．ら、欧州特許第０５１９５９６Ａ１号明細書を参照のこと。また、霊長類化抗体に関するＮｅｗｍａｎ Ｒ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１４５５−１４６０頁（１９９２年）、ならびに一本鎖抗体に関するＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号明細書およびＢｉｒｄ Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−４２６頁（１９８８年）を参照のこと。
ヒト化抗体は、標準的方法または他の適切な技術を用いる合成または組換えＤＮＡ技術を用いて産生されうる。また、ヒト化可変領域をコードする核酸（例えばｃＤＮＡ）配列を、ＰＣＲ突然変異誘発法を用いて作成し、ヒトまたはヒト化鎖をコードするＤＮＡ配列、例えば予めヒト化された可変領域由来のＤＮＡ鋳型が改変されうる（例えば、Ｋａｍｍａｎ Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１７：５４０４頁（１９８９年））；Ｓａｔｏ Ｋ．、ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：８５１−８５６頁（１９９３年）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ Ｂ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９（９）：２４７１−２４７６頁（１９９１年）；ならびにＬｅｗｉｓ Ａ．Ｐ．およびＪ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ、Ｇｅｎｅ、１０１：２９７−３０２頁（１９９１年））。変異体はまた、これらまたは他の適切な方法を用いて容易に生成されうる。一実施形態では、クローン化可変領域（例えばｄＡｂ）が突然変異され、所望の特異性を有する変異体をコードする配列が選択されうる（例えば、ファージライブラリから；例えば、Ｋｒｅｂｂｅｒら、米国特許第５，５１４，５４８号明細書；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９３年４月１日に公開された国際公開第９３／０６２１３号パンフレットを参照）。
例えば、ライブラリ（例えばファージディスプレイライブラリ）から組み換え抗体または抗体結合断片（例えばｄＡｂ）を選択するか、あるいはトランスジェニック動物（例えばマウス）の免疫に依存する方法を含む、必須の特異性を有する抗体を産生または単離する他の適切な方法が使用されうる。ヒト抗体のレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物は、当該技術分野で周知であり（例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）））、適切な方法を用いて産生されうる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１−２５５５頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８頁（１９９３年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；Ｓｕｒａｎｉら、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際公開第９７／１３８５２号パンフレットを参照）。
本発明は、一実施形態では、ヒトＣａｄ−１１のＥＣ１ドメイン（配列番号１３）の最初の約３７個のアミノ酸中に存在するエピトープに結合するＣａｄ−１１抗体を包含する。特定の実施形態では、本発明は、配列番号１０内に存在するエピトープに結合するＣａｄ−１１抗体に関する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１１を含むエピトープに結合するＣａｄ−１１抗体に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号１２内に存在するエピトープに結合するＣａｄ−１１抗体に関する。
一実施形態では、本発明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（私書箱１５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１０８，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）で２００９年１月８日に寄託されているハイブリドーマＨ１Ｍ１（ＡＴＣＣ特許寄託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）ＰＴＡ−９６９９）によって産生されるＣａｄ−１１抗体に関する。別の実施形態では、本発明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（私書箱１５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１０８，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）で２００９年１月９日に寄託されているハイブリドーマＨ１４（ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９７０１）によって産生されるＣａｄ−１１抗体を提供する。
本発明はまた、ハイブリドーマＨ１Ｍ１によって産生されるＣａｄ−１１抗体および／またはハイブリドーマＨ１４によって産生されるＣａｄ−１１抗体と、ヒトＣａｄ−１１タンパク質またはＥＣ１−ドメインを有するその一部（例えば配列番号３、１０、１２、１３）に対する結合に対して特異的に競合する抗体を包含する。特定の実施形態では、ハイブリドーマＨ１Ｍ１および／またはハイブリドーマＨ１４によって産生されるＣａｄ−１１抗体と特異的に競合する抗体は、ハイブリドーマＨ１Ｍ１および／またはハイブリドーマＨ１４によって産生されるＣａｄ−１１抗体の、ヒトＣａｄ−１１タンパク質またはＥＣ１−ドメインを有するその一部（例えば、配列番号３、１０、１２、１３）に対する結合を遮断する（例えば、阻害する、低減させる、阻止する）。
さらに、本発明は、ハイブリドーマＨ１Ｍ１によって産生されるＣａｄ−１１抗体および／またはハイブリドーマＨ１４によって産生されるＣａｄ−１１抗体の、ヒトＣａｄ−１１タンパク質またはＥＣ１−ドメインを有するその一部に対する結合親和性と少なくとも同程度に大きい、ヒトＣａｄ−１１タンパク質またはＥＣ１−ドメインを有するその一部（例えば、配列番号３、１０、１２、１３）に対する結合親和性を有する抗体を包含する。
カドヘリン−１１融合タンパク質
さらに、ヒトＣａｄ−１１のＥＣ１ドメイン（例えば、ヒトＩｇＧの一部に融合されるヒトＣａｄ−１１のＥＣ１ドメイン）のみを有する免疫グロブリン融合タンパク質は、すべての５ＥＣドメインを有する、Ｃａｄ−１１のＥＣ領域のより大きい部分を含む融合タンパク質より有効にインビトロでのＣａｄ−１１活性を阻害した。
カドヘリン−１１アンタゴニストはまた、異種タンパク質の全部または一部に作動可能に連結されるヒトＣａｄ−１１のＥＣ１ドメイン（配列番号２）の少なくともＮ末端の約３５個のアミノ酸を含むキメラまたは融合タンパク質を包含する。「作動可能に連結される」は、Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメインの一部および異種タンパク質がインフレームで融合されることを示す。異種タンパク質は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合されうる。例えば、融合タンパク質は、タンパク質配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ融合タンパク質でありうる。融合タンパク質の他のタイプは、限定はされないが、酵素融合タンパク質、例えば、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ融合タンパク質、ポリ−Ｈｉｓ融合体、ＦＬＡＧ−タグ化融合タンパク質、ＧＦＰ融合タンパク質、および免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質を含む。かかる融合タンパク質は（例えば組換え融合タンパク質の）精製を促進しうる。特定の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）では、タンパク質の発現および／または分泌が異種シグナル配列に使用によって増強されうる。したがって、別の実施形態では、融合タンパク質は異種シグナル配列をそのＮ末端に有する。
欧州特許出願公開第０４６４５３３Ａ号明細書は、免疫グロブリン定常領域の様々な部分を含む融合タンパク質を開示する。Ｆｃは、治療および診断において有用であり、それ故、例えば改善された薬物動態学的特性をもたらす（例えば、欧州特許出願公開第０２３２２６２Ａ号明細書を参照）。薬剤発見では、例えばヒトタンパク質は、ハイスループットスクリーニングアッセイのためにＦｃ部分と融合され、アンタゴニストが同定されている（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８頁（１９９５年）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０（１６）：９４５９−９４７１頁（１９９５年））。したがって、本発明はまた、本発明のタンパク質Ｃａｄ−１１アンタゴニストおよび免疫グロブリンの様々なサブクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖および／または軽鎖の定常領域の様々な部分を有する可溶性融合タンパク質を包含する。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の利点は、次のもの、すなわち、（１）得られる二量体融合タンパク質の二価性に起因する、多価リガンドにおける結合活性の増大、（２）より長い血清半減期、（３）Ｆｃドメインを介したエフェクター細胞に対する活性化能、（４）精製の容易性（例えばプロテインＡクロマトグラフィーによる）、（５）Ｃａｄ−１１に対する親和性、および（６）Ｃａｄ−１１媒介性活性に対する遮断能のうち１つ以上を含む。
したがって、特定の実施形態では、Ｃａｄ−１１アンタゴニストは、哺乳動物免疫グロブリンタンパク質の全部または一部に作動可能に連結された、ＥＣ１ドメインのＮ末端部分（配列番号２のアミノ酸５４〜９０）を含む、カドヘリン−１１タンパク質の細胞外領域の一部を含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１〜６０９内部に含まれる５つすべてのＥＣドメインを含むカドヘリン−１１の細胞外領域の一部を含まない。特定の実施形態では、ヒトカドヘリン−１１細胞外領域の一部は、例えば、配列番号２のアミノ酸１〜１６０、アミノ酸１〜２５９もしくはアミノ酸１〜２６９を含みうる。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヒトカドヘリン−１１のリーダーおよびプロ領域（配列番号２のアミノ酸１〜５３）が欠如し、異種リーダー配列を使用する。免疫グロブリン部分は、任意の脊椎動物供給源、例えばマウス由来でありうるが、好ましくはヒト免疫グロブリンタンパク質である。一実施形態では、哺乳動物免疫グロブリンタンパク質は、ヒトＩｇＧ２タンパク質またはその一部、例えばヒトＩｇＧ２のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分である。
本発明のキメラまたは融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技術によって生成されうる。例えば、異なるタンパク質配列（例えば、Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメインペプチドおよび哺乳動物免疫グロブリン）をコードするＤＮＡ断片は共に、従来の技術に従い、インフレームでライゲートされる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む従来の技術によって合成されうる。あるいは、核酸断片のＰＣＲ増幅は、２つの保存核酸断片の間で相補的なオーバーハングを生じさせる（それらはその後にアニール、再増幅され、キメラ核酸配列を生成しうる）アンカープライマーを使用して行われうる（Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９２年）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴ部分、Ｆｃ部分）を既にコードする多数の発現ベクターが市販されている。タンパク質Ｃａｄ−１１アンタゴニストをコードする核酸分子は、融合部分（例えば免疫グロブリン）がタンパク質にインフレームで連結された、かかる発現ベクターにクローン化されうる。
本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、単量体、二量体、四量体または他の多量体（例えばポリマー）として提供されうる。例えば、融合タンパク質の免疫グロブリン部分の可変ドメインが共に連結され、例えば、各ＶドメインのＣ末端へのヒンジ領域およびヒンジ領域内のシステイン間でのジスルフィド結合の提供；または重鎖（それぞれドメインのＣ末端にシステインを伴う）の提供（ここでシステインは共にジスルフィド結合される）；またはＶ−ＣＨおよびＶ−ＣＬの生成によるＦａｂ形式の生成；またはペプチドリンカー（例えばＧｌｙ４Ｓｅｒリンカー）の使用による二量体、三量体およびさらなる多量体の生成により、多価リガンドが形成されうる。例えば、かかるリガンドは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一方または双方を含む抗体Ｆｃ領域、および場合によってヒンジ領域に連結されうる。例えば、単一のヌクレオチド配列としてＦｃ領域に連結されたリガンドをコードするベクターを使用し、かかるリガンドが（例えば発現によって）調製されうる。
本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の多量体またはその誘導体（例えばポリメチルエチレングリコール）、放射性核種、細胞毒性剤および細胞毒性薬を含む他の部分に複合され、その後にインビボ治療において使用されうる。放射性核種の例として、特に２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、および９０Ｙが挙げられる。放射性核種は、放射線療法の技術分野で公知のように、細胞を局所的に照射し、様々な細胞内病変をもたらすことにより、その細胞毒性効果を発揮する。融合タンパク質に複合しうる細胞毒性薬は、限定はされないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびマイトマイシンＣを含む。細胞毒性薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質合成を含む重要な細胞プロセスに干渉する。薬剤のこれらクラス（当該技術分野で公知）、およびそれらの作用機序のより完全な提示については、Ｇｏｏｄｍａｎ Ａ．Ｇ．ら、「Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第８版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｌ、１９９０年、Ｋａｔｚｕｎｇ編、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」、第５版、７６８−７６９頁、８０８−８０９頁、８９６頁、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ（Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）を参照のこと。
本明細書で使用される用語「免疫グロブリン融合タンパク質」は、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質の断片を含む。かかる断片は、本発明の範囲内に含まれるように意図される。例えば、一旦分子が単離されると、それらはプロテアーゼで切断され、ヒトＣａｄ−１１のＥＣ１ドメインに結合可能な状態を保持する断片が生成されうる。
ペプチドアンタゴニスト
本発明のカドヘリン−１１アンタゴニストはまた、カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに結合するペプチドでありうる。ペプチドは、任意の適切なＬ−および／またはＤ−アミノ酸、例えば一般的なα−アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリン）、非α−アミノ酸（例えば、β−アラニン、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、サルコシン、スタチン））、および異常アミノ酸（例えば、シトルリン、ホモシトルリン、ホモセリン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン）を含みうる。ペプチド上のアミノ、カルボキシルおよび／または他の官能基は、遊離（例えば未修飾）状態でありうるかまたは適切な保護基で保護されうる。アミノおよびカルボキシル基における適切な保護基、および保護基を付加または除去するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、ＧｒｅｅｎおよびＷｕｔｓ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９１年において開示されている。ペプチドの官能基はまた、当該技術分野で公知の方法を用いて誘導体化（例えばアルキル化）されうる。
ペプチドＣａｄ−１１アンタゴニストは、必要に応じて、１つ以上の修飾（例えば、アミノ酸リンカー、アシル化、アセチル化、アミド化、メチル化、末端修飾因子（例えば循環修飾））を含みうる。ペプチドはまた、化学修飾（例えば、Ｎ−メチル−α−アミノ基置換）を含みうる。さらに、ペプチドアンタゴニストは、公知および／または天然ペプチド類似体、例えば、保存的アミノ酸残基置換を有するペプチド類似体でありうる。これらの修飾は、そのカドヘリン−１１アンタゴニスト活性を含むペプチドの様々な特性（例えば、溶解度、結合性）を改善しうる。
Ｃａｄ−１１アンタゴニストは、線状の分岐または環状でありうるペプチド、例えばいくつかのアミド結合を含むヘテロ原子環構造を有するペプチドである。特定の実施形態では、ペプチドは環状ペプチドである。かかるペプチドは、標準的技術を用い、当業者によって生成されうる。例えば、ペプチドは、酵素的または化学的切断によって天然タンパク質から誘導または除去されうるか、あるいは適切な方法、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド型合成）によって合成されうる（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、第２版、１９７６年を参照）。カドヘリン−１１アンタゴニストであるペプチドもまた、例えば組換えＤＮＡ法または他の適切な方法を用いて生成されうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｗ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））、２００１年を参照）。
ペプチドは、数種から多種の別々の分子種を含むライブラリに合成され、構築されうる。かかるライブラリは、コンビナトリアル化学の方法を用いて調製され、任意の適切な方法を用いてスクリーニングされ、ライブラリが所望の生物学的活性を有するペプチドを含むか否かが判定されうる。次いで、かかるペプチドアンタゴニストは適切な方法を用いて単離されうる。
ペプチド模倣アンタゴニスト
カドヘリン−１１アンタゴニストはまた、ペプチド模倣体でありうる。例えば、多糖類はペプチドと同じ官能基を有するように調製されうる。ペプチド模倣体は、例えば、ペプチド剤の三次元構造を、それが結合されるかまたは標的分子に結合することになる環境内で確立することによって設計されうる。ペプチド模倣体は、少なくとも２つの成分、１つ以上の結合部分および骨格または支持構造を含む。
結合部分は、標的分子、例えばＣａｄ−１１のＥＣ１ドメイン内のアミノ酸と（例えば疎水性またはイオン性相互作用を通じて）反応するかまたは複合体を形成することになる化学原子または基である。例えば、ペプチド模倣体中の結合部分は、ペプチドまたはタンパク質アンタゴニスト中のものと同じでありうる。結合部分は、ペプチドアンタゴニスト中の結合部分と同一または類似の方法で受容体と反応する原子または化学基でありうる。例えば、コンピュータ化学を用い、例えばＣａｄ−１１タンパク質のＥＣ１ドメイン内のポケット配列に結合しうる、カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインのドナー配列のペプチド模倣体が設計されうる。ペプチド中の塩基性アミノ酸に対するペプチド模倣体の設計における使用に適した結合部分の例として、アミン、アンモニウム、グアニジンおよびアミドまたはホスホニウムなどの窒素を含有する基が挙げられる。酸性アミノ酸に対するペプチド模倣体の設計における使用に適した結合部分の例として、例えば、カルボキシル、低級アルキルカルボン酸エステル、スルホン酸、低級アルキルスルホン酸エステルまたは亜リン酸またはそのエステルが挙げられる。
支持構造は、１つ以上の結合部分に結合される場合に、ペプチド模倣体の三次元配置を提供する化学的実体である。支持構造は有機または無機でありうる。有機支持構造の例として、有機合成高分子の多糖類、ポリマーまたはオリゴマー（例えば、ポリビニルアルコールまたはポリラクチド）が挙げられる。支持構造がペプチド骨格または支持構造と実質的に同じサイズおよび次元を有することは好ましい。これは、ペプチドおよびペプチド模倣体の原子および結合のサイズを計算または測定することによって決定されうる。一実施形態では、ペプチド結合の窒素が酸素または硫黄と置換され、例えばポリエステル骨格を形成しうる。別の実施形態では、カルボニルがスルホニル基またはスルフィニル基と置換され、それによりポリアミド（例えばポリスルホンアミド）を形成しうる。ペプチドの逆アミドが作製されうる（例えば１つ以上の−ＣＯＮＨ−基を−ＮＨＣＯ−基と置換する）。さらに別の実施形態では、ペプチド骨格はポリシラン骨格と置換されうる。
これらの化合物は、公知の方法によって作製されうる。例えば、ポリエステルペプチド模倣体は、水酸基をアミノ酸上の対応するα−アミノ基と置換し、それにより、ヒドロキシ酸を調製し、ヒドロキシ酸を連続的にエステル化し、場合により塩基性および酸性側鎖を遮断し、副反応を最小化することによって調製されうる。適切な化学合成経路の決定は、一般に化学構造の決定時に容易に同定されうる。
ペプチド模倣体は、合成され、数種から多種の別々の分子種を含むライブラリに構築されうる。かかるライブラリは、コンビナトリアル化学の周知の方法を用いて調製され、スクリーニングされ、ライブラリが所望の活性を有する１つ以上のペプチド模倣体を含むか否かが判定されうる。次いで、かかるペプチド模倣アンタゴニストは適切な方法によって単離されうる。
小分子アンタゴニスト
カドヘリン−１１アンタゴニストはまた、小分子でありうる。小分子の例として、有機化合物、有機金属化合物、無機化合物、および有機、有機金属または無機化合物の塩が挙げられる。小分子中の原子は、典型的には共有および／またはイオン結合を介して共に連結される。小有機分子中の原子の配列は、鎖（例えば、炭素−炭素鎖または炭素−ヘテロ原子鎖）を示しうるか、あるいは炭素原子を有する環、例えばベンゼンまたは多環系、または炭素およびヘテロ原子の組み合わせ、すなわちピリミジンまたはキナゾリンなどのヘテロ環を示しうる。小分子は任意の分子量を有しうるが、一般に約５，０００ダルトン未満の分子を含む。例えば、かかる小分子は、約１０００ダルトン未満でありえ、好ましくは約７５０ダルトン未満であるか、またはより好ましくは約５００ダルトン未満である。小分子および他の非ペプチドカドヘリン−１１アンタゴニストは、天然に見出され（例えば、同定され、単離され、精製され）、および／あるいは（例えば、従来の有機合成、生物媒介性（ｂｉｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）合成、またはそれらの組み合わせによって）合成的に生成されうる。例えば、Ｇａｎｅｓａｎ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、７（１）：４７−５５頁（２００２年１月）；Ｌｏｕ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、６（２４）：１２８８−１２９４頁（２００１年１２月）を参照のこと。天然小分子の例として、限定はされないが、ホルモン、神経伝達物質、ヌクレオチド、アミノ酸、糖類、脂質、およびそれらの誘導体が挙げられる。
本発明に記載の小分子カドヘリン−１１アンタゴニストおよびその生理学的に許容されうる塩は、（例えば、Ｃａｄ−１１タンパク質のＥＣ１ドメイン内のドナー配列と、別のカドヘリン−１１の結合ポケットへの結合に対して直接競合し、Ｃａｄ−１１タンパク質のＥＣ１ドメイン内の結合ポケットと、別のカドヘリン−１１のドナー配列への結合に対して直接競合することにより）カドヘリン−１１タンパク質の同型結合を阻害しうる。
核酸アンタゴニスト
本発明のＣａｄ−１１アンタゴニストはまた、ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインに結合する核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）でありうる。適切な核酸Ｃａｄ−１１アンタゴニストは、特定の目的の分子（例えばヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメイン）に、古典的なワトソン−クリック塩基対合以外の相互作用を通じた高い親和性および特異性で結合可能なアプタマーを含む（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５頁（１９９０年）；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８頁（１９９０年））。
ファージディスプレイまたはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）によって作成されるペプチドのようなアプタマーは、選択される標的に特異的に結合可能であり、結合を通じ、それらの標的が機能する能力を遮断する。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロ選択プロセスによって生成されるアプタマーは、成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、および受容体を含む１００を超えるタンパク質に対して作成されている。典型的なアプタマーは、サイズが１０〜１５ｋＤａ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、その標的にｎＭ以下の親和性で結合し、また密接に関連した標的に対して識別する（例えば典型的には同じ遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質に結合することがない）。一連の構造試験によると、アプタマーが、抗体−抗原複合体における親和性および特異性を駆動する同じタイプの結合相互作用（水素結合、静電的相補性、疎水性接触、立体的排除など）を使用可能であることが示されている。
目的の標的（例えばヒトＣａｄ−１１タンパク質のＥＣ１ドメイン）に結合するアプタマーは、例えば米国特許第５，４７５，０９６号明細書および米国特許第５，２７０，１６３号明細書に記載の「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」（ＳＥＬＥＸ）として公知の標準的プロセスを使用し、作成され、同定されうる。
カドヘリン−１１アンタゴニストの同定
小分子を含む、カドヘリン−１１結合特異性を有する作用物質は、スクリーニング、例えば、化合物および／またはライブラリ（例えば、化学物質、ペプチド、核酸ライブラリ）のハイスループットスクリーニングにおいて同定されうる。
ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインに特異的に結合する抗体は、例えば市販のコンビナトリアル抗体ライブラリ（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＡＧ）のスクリーニングによって同定されうる。適切なコンビナトリアル抗体ライブラリおよびこれらのライブラリをスクリーニングする標準的方法は、Ｈｏｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（３）：３４４−３４８頁（２００５年）およびＲａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（４０）：３８１９４−３８２０５頁（２００３年）（これらの内容は参照により本明細書中に援用される）に記載されている。分子のかかるライブラリまたは集合体はまた、周知の化学的方法を用いて調製されうる。
あるいは、ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインに特異的に結合するマウス抗体は、例えば、マウスを、アジュバントを伴うＥＣ１タンパク質ドメインまたはＥＣ１ペプチドで免疫し、抗原に対する耐性を破壊することによって同定されうる。これらの抗体は、所望の特異性および活性についてスクリーニングされ、次いで公知の技術を用いてヒト化され、ヒト疾患の治療に適した作用物質が作成されうる。
化合物または小分子は、例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＰｕｂＣｈｅｍ）から入手可能な極めて多数の化合物のライブラリ、ならびにＨａｒｖａｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙのライブラリおよび商業的供給源から入手可能な他のライブラリ（例えば、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ、Ｐｅａｋｄａｌｅ、ＣＥＲＥＰ、ＭａｙＢｒｉｄｇｅ、Ｂｉｏｎｅｔ）から同定されうる。分子のかかるライブラリまたは集合体はまた、周知の化学的方法、例えばコンビナトリアル化学の周知の方法を用いて調製されうる。ライブラリはスクリーニングされ、カドヘリン−１１に結合し、それを阻害する化合物が同定されうる。
同定された化合物は、周知の医薬品化学の方法を用い、さらなる多様性におけるリード化合物としての役割を果たしうる。例えば、リードの構造変異体である化合物の集合体は、調製され、カドヘリン−１１結合および／または阻害活性についてスクリーニングされうる。これは、生物学的活性に対する化合物の構造に関連する構造活性相関の開発をもたらしうる。適切な結合および阻害活性を有する化合物が、インビボ使用のためにさらに開発されうる。
カドヘリン−１１に結合する作用物質は、カドヘリン−１１のアンタゴニスト活性についてさらに評価されうる。例えば、カドヘリン−１１タンパク質を含有する組成物をスクリーニングまたは結合アッセイに使用し、カドヘリン−１１タンパク質に結合し、拮抗する作用物質が検出および／または同定されうる。使用に適した組成物として、例えば、カドヘリン−１１タンパク質を天然に発現する細胞（例えば滑膜細胞）、かかる細胞の抽出物、および組換えカドヘリン−１１タンパク質が挙げられる。
カドヘリン−１１タンパク質に結合する作用物質は競合的結合アッセイにおいて同定可能であり、例えばそこでは、カドヘリン−１１の参照作用物質（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｇｅｎｔ）への結合に対する試験作用物質の阻害能が評価される。参照作用物質は、ＥＣ１ドメインを含む完全長Ｃａｄ−１１タンパク質またはその一部でありうる。参照作用物質は、適切な標識（例えば、ラジオアイソトープ、エピトープ標識、親和性標識（例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン）、スピン標識、酵素、蛍光基、化学発光基、染料、金属（例えば、金、銀）、磁気ビーズ）で標識され、アッセイにおいてカドヘリン−１１タンパク質を飽和させるのに必要とされる標識参照作用物質の量が測定されうる。カドヘリン−１１タンパク質と試験作用物質の間での複合体の形成の特異性は、適切な対照（例えば、未標識作用物質、標識単独）を使用して測定されうる。
参照作用物質とカドヘリン−１１タンパク質の間での複合体の形成に対する試験作用物質の阻害能は、標識参照作用物質の特異的結合の５０％阻害（ＩＣ５０値）に必要とされる試験作用物質の濃度として測定されうる。特異的結合は、好ましくは全結合（例えば複合体中の全標識）−非特異的結合として規定される。非特異的結合は、好ましくは過剰な未標識参照作用物質の存在下で形成される複合体中でさらに検出される標識の量として定義される。本方法における使用に適する参照作用物質は、カドヘリン−１１に特異的に結合する分子および化合物、例えばカドヘリン−１１に結合する抗体を含む。
カドヘリン−１１タンパク質に拮抗する作用物質は、カドヘリン−１１の１つ以上の活性、例えば結合活性など（例えば同型Ｃａｄ−１１への結合）に対して拮抗する（低下させる、阻止する、阻害する）能力を有する作用物質のスクリーニングによって同定されうる。かかる活性は、適切なインビトロまたはインビボアッセイを使用して評価されうる。カドヘリン−１１活性に対する典型的なアッセイについては、先行的に記載がなされている（Ｐａｔｅｌ ＳＤら、Ｃｅｌｌ １２４：１２５５−１２６８頁（２００６年）；Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１００６−１０１０頁（２００７年））。
一旦カドヘリン−１１アンタゴニストが同定されると、カドヘリン−１１アンタゴニストが、細胞内でのカドヘリン−１１活性に関連した１つ以上の生物学的機能または特性に対して干渉する（例えば、低下させる、阻害する、阻止する）能力は、例えば、カドヘリン−１１に関連した特定の生物学的機能または特性を測定するように設計された細胞に基づくアッセイを使用し、評価されうる。カドヘリン−１１の発現および／または活性に関連することが公知である生物学的機能および特性は、限定はされないが、細胞接着、細胞遊走、細胞浸潤、細胞分取、細胞凝集、細胞再編成、組織の完全性および構造の維持、細胞増殖の接触阻害、ならびに癌（例えば腫瘍）細胞の悪性形質転換を含む（ＫｉｅｎｅｒおよびＢｒｅｎｎｅｒ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．７（２）：４９−５４頁（２００５年））。さらに、Ｃａｄ−１１アンタゴニストは、本明細書中で、滑膜細胞による活性ＭＭＰの生成を阻害することが示されている。カドヘリンの１つ以上の生物学的機能の評価に適したアッセイは当業者に公知であり（例えば、Ｐａｔｅｌ ＳＤら、Ｃｅｌｌ １２４：１２５５−１２６８頁（２００６年））、例えば本明細書中に記載の細胞凝集アッセイを含む（実施例、材料および方法の項を参照）。
治療の方法
いかなる１つの理論に制約されるものではないが、Ｃａｄ−１１のＥＣ１ドメインの最初の約３５個のアミノ酸（例えば約３３〜約３７個のアミノ酸）が同型カドヘリン結合にとって必要とされ、Ｃａｄ−１１のこの領域に特異的に結合する作用物質がＣａｄ−１１分子間の結合を有効に阻害しうると考えられる。したがって、かかる作用物質は、細胞（例えば滑膜細胞）におけるＣａｄ−１１の発現または活性に関連した障害（例えば、炎症性障害、線維症、癌）の治療および予防において有用である。したがって、本発明の一態様は、哺乳動物被験体におけるカドヘリン−１１媒介性障害を治療するための方法であって、ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインペプチド（配列番号３）に結合する治療有効量のカドヘリン−１１アンタゴニストを被験体に投与するステップを含む方法に関する。
本明細書で使用される「カドヘリン−１１媒介性障害」は、カドヘリン−１１タンパク質を発現する細胞が関与するか、またはそれによって媒介される（例えば、引き起こされる）疾患、障害、または症状を示す。本発明の方法により治療されうるカドヘリン−１１媒介性障害として、限定はされないが、炎症性障害（例えば炎症性関節障害）、線維症障害（例えば、真皮線維症、肺線維症）、および癌が挙げられる。
本発明の方法を用い、哺乳動物（例えばヒト）におけるカドヘリン−１１媒介性障害は、本発明のカドヘリン−１１アンタゴニスト（例えば、抗体、融合タンパク質、小分子、核酸、ペプチド、ペプチド模倣体）を、治療効果を提供するのに十分な量で投与し、例えば、カドヘリン−１１を発現する細胞（例えば、滑膜細胞、線維芽細胞、腫瘍細胞）の凝集を阻害するか、またはその細胞の遊走を阻害するか、またはその細胞による活性プロテアーゼもしくは炎症性分子の発現を阻害することによって治療されうる。
したがって、本発明の一態様は、哺乳動物被験体における炎症性障害を治療するための方法であって、治療有効量の本発明のカドヘリン−１１アンタゴニストを被験体に投与するステップを含む方法に関する。炎症性障害は、一般に、炎症促進性分子（例えば、炎症性サイトカインおよび成長因子）の発現および免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、リンパ球、形質細胞、白血球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞）の活性化を特徴とする。炎症性障害として、例えば、炎症性関節障害、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、乾癬、皮膚炎（例えば湿疹）、アミロイド腎症、糸球体腎炎、血管炎、骨盤内炎症性疾患、慢性前立腺炎、グレーブス眼症が挙げられる。特定の実施形態では、炎症性障害は自己免疫障害である。
特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物被験体における炎症性関節障害を治療するための方法であって、治療有効量の本発明のカドヘリン−１１アンタゴニストを被験体に投与するステップを含む方法に関する。炎症性関節障害は、関節接合部の細胞（例えば滑膜細胞）におけるカドヘリン−１１の発現に関連するかまたはそれによって特徴づけられる任意の疾患でありうる。本発明によって治療されうる炎症性関節障害の例として、限定はされないが、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、若年性慢性関節炎、慢性ライム病、および全身性紅斑性狼瘡に関連した関節炎が挙げられる。特定の実施形態では、炎症性関節障害はリウマチ様関節炎である。
別の態様では、本発明は、哺乳動物被験体における線維症を治療するための方法であって、治療有効量の本発明のカドヘリン−１１アンタゴニストを被験体に投与するステップを含む方法に関する。本明細書で使用される用語「線維症」は、器官または組織における、修復または反応過程としての過剰線維性結合組織の形成または発達を示す。線維症の例として、限定はされないが、血管線維症（例えば、肺高血圧症に関連した血管線維症）、腎線維症、肝線維症（例えば肝硬変）、皮膚／真皮線維症（例えば強皮症）、肺（ｌｕｎｇ）／肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）線維症（例えば特発性肺線維症）、骨髄繊維症、心内膜心筋線維症、関節線維症、中皮線維症、眼線維症、消化管線維症、および間質性線維症が挙げられる。特定の実施形態では、線維症は肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）または肺（ｌｕｎｇ）線維症である。別の実施形態では、線維症は真皮または皮膚線維症である。
いかなる特定の理論にも拘束されたくはないが、特定のタイプの腫瘍細胞は、カドヘリン−１１を発現すると信じられており、カドヘリン−１１は腫瘍転移を促進しうる。したがって、本発明のＣａｄ−１１アンタゴニストは、被験体における腫瘍形成、増殖、および／または転移を阻害するために使用しうる。したがって、別の態様では、本発明は、哺乳動物被験体における癌（例えば、Ｃａｄ−１１を発現する細胞によって特徴づけられる癌）を治療する方法であって、治療有効量の本発明のカドヘリン−１１アンタゴニストを被験体に投与するステップを含む方法に関する。Ｃａｄ−１１タンパク質を発現する細胞を含む癌として、例えば、白血病（例えば、ＡＭＬ、ＣＬＬ、前リンパ性白血病）、肺癌（例えば、小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫）、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、上皮癌、鼻咽腔癌（例えば、口腔または喉頭扁平上皮癌）、リンパ腫（例えば濾胞性リンパ腫）、子宮癌（例えば悪性線維性組織球腫）、肝癌（例えば肝細胞癌）、頭頸部癌（例えば頭頸部扁平上皮癌）、腎癌、雄性胚細胞腫瘍、悪性中皮腫、骨髄異形成症候群、卵巣癌、膵臓または胆汁癌、前立腺癌、甲状腺癌（例えば散発性濾胞甲状腺腫瘍）、および尿路上皮癌が挙げられる。
一態様では、治療有効量のカドヘリン−１１アンタゴニストがそれを必要とする患者に投与される。投与されるべきカドヘリン−１１アンタゴニストの量（例えば治療有効量）は、本明細書中で提供される指針を用いて臨床医によって決定可能であり、当該技術分野で公知の他の方法は、例えば、選択される特定の作用物質、被験体の年齢、感受性、薬剤に対する耐性および全体的な健康状態（ｏｖｅｒａｌｌ ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）を含むいくつかの要素に依存している。例えば、抗体であるＣａｄ−１１アンタゴニストに適した用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重／処置および好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／処置でありうる。小分子Ｃａｄ−１１アンタゴニストに適した用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／処置でありうる。タンパク質またはペプチド（線状、環状、模倣体）であるカドヘリン−１１アンタゴニストに適した用量は、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬのペプチドの血漿濃度をもたらすことになる。特定の作用物質、患者および癌における用量を決定することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。好ましくは、同用量は、有害な副作用（例えば、免疫原性応答、悪心、目まい、胃の不快感、過粘稠度症候群、鬱血性心不全、脳卒中、肺水腫）を引き起こさないか、または最低限のそれらをもたらす。
治療有効量のカドヘリン−１１アンタゴニストは、単独でかまたは１つ以上の他の治療剤（例えば抗炎症剤、化学療法剤）と組み合わせて投与されうる。炎症性関節障害、特にＲＡの治療にとって有用な適切な抗炎症剤は、本発明のＣａｄ−１１アンタゴニストと組み合わせて投与可能であり、限定はされないが、（ｉ）非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ；例えば、デトプロフェン（ｄｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、アスピリン、サリチル酸コリン、サルサラート、ならびにサリチル酸ナトリウムおよびサリチル酸マグネシウム）；（ｉｉ）ステロイド（例えば、コルチソン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン）；（ｉｉｉ）ＤＭＡＲＤ、すなわち、疾患修飾性抗リウマチ薬（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、Ｄ−ペニシラミン、ミノサイクリン、および金）；または（ｉｖ）組換えタンパク質（例えばＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト、可溶性ＴＮＦ受容体）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ、キメラモノクローナル抗ＴＮＦ抗体）、ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標）（アバタセプト、可溶性ＣＴＬＡ４受容体）、ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標）（トシリズマブ、ＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体）、およびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体）を含む。
したがって、カドヘリン−１１アンタゴニストは、併用療法（例えば１つ以上の他の治療剤を伴う）の一部として投与されうる。Ｃａｄ−１１アンタゴニストは、１つ以上の他の治療剤の前、後またはそれと併用的に投与されうる。一部の実施形態では、カドヘリン−１１アンタゴニストおよび他の治療剤は、別々の製剤または関節製剤のいずれかとして同時に（例えば併用的に）同時投与されうる。あるいは、作用物質は、熟練した臨床医が定めた適切な期間内で（例えば治療の薬学的効果の重複（ｏｖｅｒｌａｐ）を可能にするための十分な時間）、別々の組成物として連続的に投与されうる。カドヘリン−１１アンタゴニストおよび１つ以上の他の治療剤は、所望の治療効果（例えば関節炎症の低減および／または阻害）を得るのに適した順序およびスケジュールで、単回用量または複数回用量で投与されうる。投与の適した用量およびレジメンは、臨床医によって決定可能であり、選択される作用物質、薬学的調合物および投与の経路、様々な患者因子ならびに他の検討事項に依存する。
治療の有効性（例えば、関節炎症の低減もしくは除去および／または関節炎症の阻止もしくは阻害）は、任意の適切な方法（例えばイメージング（ＭＲＩ、ＮＭＲ））によって判定されうる。
本発明の方法によると、治療有効量のＣａｄ−１１アンタゴニストが哺乳動物被験体に投与され、炎症性関節障害が治療される。用語「哺乳動物被験体」は、霊長類（例えばヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、または他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、齧歯類およびマウス種などの哺乳動物を含むように本明細書中で定義される。
Ｃａｄ−１１アンタゴニストである作用物質は、種々の経路により、哺乳動物被験体に投与されうる。例えば、作用物質は、例えば、局所（例えば、クリーム、軟膏）、または経鼻（例えば、溶液、懸濁液）を含む、任意の適切な非経口または非経口でない（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路によって投与されうる。非経口投与は、例えば、関節内、筋肉内、静脈内、脳室内、動脈内、髄腔内、皮下、または腹腔内投与を含みうる。作用物質はまた、経口的（例えば、カプセル、懸濁液、錠剤または食事の中に）、経皮的、皮内的、局所的、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、経口吸入または点鼻（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｒｏｐ））により、経粘膜的、または経直腸的に投与されうる。投与は、必要に応じて局所性または全身性でありえ、２つ以上の経路が必要に応じて併用されうる。Ｃａｄ−１１アンタゴニストの局所的投与は、関節内注射によって行われうる（例えば、作用物質の関節への直接注射）。好ましい投与の形式は、選択される特定の作用物質に依存して変化しうる。しかし、全身性静脈内または皮下投与は、一般に抗体にとって好ましい。
送達はまた、患者の脳もしくは体腔への注射または時限放出または持続放出のマトリックス送達システムの使用、またはミセル、ゲルおよびリポソームを使用するオンサイト送達によるものでありうる。噴霧デバイス（Ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ）、粉末吸入器、およびエアロゾル化溶液（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、かかる製剤を気道に投与するのに用いられうる方法を代表する。送達は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボでありうる。
タンパク質（例えば融合タンパク質）である作用物質は、組換えタンパク質のインビボ発現を介して投与されうる。インビボ発現は、適切な方法に従う体細胞発現によってなされうる（例えば米国特許第５，３９９，３４６号明細書を参照）。さらに、タンパク質をコードする核酸はまた、送達のためにレトロウイルス、アデノウイルスまたは他の適切なベクター（好ましくは複製欠損型感染性ベクター）に組み込まれうるか、あるいは送達のため、タンパク質を発現可能な形質移入または形質転換宿主細胞に導入されうる。後者の実施形態では、細胞は、治療有効量のタンパク質を発現するのに有効な量で、移植（単独またはバリアデバイス（ｂａｒｒｉｅｒ ｄｅｖｉｃｅ）で）、注射、または別の方法での導入がなされうる。
核酸に基づくカドヘリン−１１アンタゴニスト（例えばアプタマー）は、いくつかの方法で目的の哺乳動物被験体に導入されうる。例えば、核酸は、宿主細胞内で発現ベクターまたはＰＣＲ産物から内因性に発現されうるか、あるいは合成または改変組成物（例えば、リポソーム、ポリマー、ナノ粒子）に封入され、それは次いで哺乳動物被験体の血流に（例えば、注射、注入により）直接導入されうる。抗カドヘリン−１１核酸または核酸発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純ヘルペスウイルスベクター、改変ベクター、非ウイルス媒介ベクター）はまた、確立された遺伝子治療の方法およびプロトコルを用いて哺乳動物被験体に直接導入されうる（例えば、Ｔｏｃｈｉｌｉｎ Ｖ．Ｐ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ８：３４３−３７５頁、２００６年；「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ」、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓを参照）。
カドヘリン−１１アンタゴニスト（例えば小分子）である作用物質は、薬学的または生理学的組成物の一部として、例えば、カドヘリン−１１アンタゴニストおよび薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物の一部として哺乳動物被験体に投与されうる。カドヘリン−１１アンタゴニストを含む調合物または組成物あるいはカドヘリン−１１アンタゴニストおよび１つ以上の他の治療剤（例えば抗炎症剤）を含む組成物は、選択される投与の経路（例えば、溶液、エマルジョンまたはカプセル）に応じて変化することになる。適切な薬学的担体は、カドヘリン−１１アンタゴニストと相互作用しない不活性成分を含有しうる。例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に記載される標準の薬学的調合技術が用いられうる。非経口投与に適した薬学的担体として、例えば、滅菌水、生理学的食塩水、静菌性生理食塩水（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｓａｌｉｎｅ）（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸塩緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、リンガー乳酸塩などが挙げられる。調合物はまた、活性成分の有効性を高める少量の物質（例えば、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤、浸潤剤）を含みうる。組成物の封入（硬質ゼラチンまたはシクロデキストランのコーティング中など）の方法は、当該技術分野で公知である。吸入においては、作用物質は、投与のため、可溶化され、適切なディスペンサー（例えば、アトマイザーまたはネブライザーまたは加圧エアロゾルディスペンサー）に装填されうる。
薬学的作用物質は、中性化合物または塩もしくはエステルとして投与されうる。薬学的に許容されうる塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸または酒石酸などに由来する遊離アミノ基で形成される塩、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する遊離カルボキシル基で形成される塩を含む。アミンまたは他の塩基性基を有する化合物の塩は、例えば、適切な有機または無機酸、例えば塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などとの反応によって得られうる。第四級アンモニウム基を有する化合物はまた、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、過塩素酸塩などの対アニオンを有する。カルボン酸または他の酸性官能基を有する化合物の塩は、適切な塩基、例えばヒドロキシド塩基との反応によって調製されうる。酸性官能基の塩は、ナトリウムまたはカリウムなどの対カチオンを有する。
本発明は、ここでは次の実施例によって例示されることになり、それらは決して限定するように意図されていない。
実施例１：ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインのＮ末端の３５個のアミノ酸中のエピトープに対する結合特異性を有するＦａｂの同定
材料および方法
ウエスタンブロッティング
タンパク質を、標準的方法を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース（ＮＣ）膜に移した。つまり、ＮＣ膜をトリス緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）（８．８ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．２ｇ／ＬのＫＣｌ、３ｇ／Ｌのトリス塩基、５００ｕｌ／ＬのＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨを７．４）ですすいだ。膜を、ＴＢＳＴ中に溶解した４％ＢＳＡで、２２℃で１時間ブロッキングした。ＮＣ膜をそれぞれＴＢＳＴで５分間にわたって３回すすいだ。マウス抗ヒトＣａｄ−１１抗体をＴＢＳＴ中で０．５μｇ／ｍｌに希釈し、ＮＣを２２℃で１時間インキュベートした。ＮＣ膜をそれぞれＴＢＳＴで５分間にわたって３回すすいだ。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合したヤギ抗マウスＩｇ抗体をＴＢＳＴ中で１μｇ／ｍｌに希釈し、ＮＣ膜を、二次溶液中、２２℃の室温（ＲＴ）で最低時間の１時間インキュベートした。ＮＣ膜をそれぞれＴＢＳＴで５分間にわたって３回すすいだ。シグナルを、標準のＨＲＰ方法を用いて発生させた。
ＥＬＩＳＡ
抗原（５μｇ／ｍｌもしくは５０μｇのＣａｄ−１１−ＥＣ−１−Ｆｃまたは５μｇ／ｍｌのカドヘリンペプチドのいずれか）を緩衝液中で希釈し、使用し、プレートを４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、次いで、ＰＢＳ希釈緩衝液中、１．５％ＢＳＡ、５％低脂肪乳粉末（ＰＢＳ中、１．５％ＢＳＡ、２．５％低脂肪乳粉末、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロッキングした。次いで、プレートを、抗Ｃａｄ−１１ヒトｆＡｂを有する細菌溶解物と共にインキュベートするか、または抗Ｃａｄ−１１ヒトｆＡｂで１時間精製した。洗浄後、二次抗体（Ｃｙ５複合ｈｕ−Ｆａｂ（１／１００に希釈））を２５分間適用した。次いで、プレートを洗浄し、得られた蛍光を読み取った。
結果
先行的に報告されたカドヘリン−１１に特異的な３つの抗体セットを、ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインに対する結合能について試験した。これらの抗体は、カドヘリン−１１ノックアウトまたは欠損マウスにおいてマウスカドヘリン−１１−Ｆｃ融合タンパク質免疫原に対して産生された抗体（Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１００６−１０１０頁（２００７年））、ＣＨＯ細胞内で既に生成されたヒトカドヘリン−１１−Ｆｃ融合タンパク質免疫原に対する、カドヘリン−１１野生型マウスにおいて産生された抗体（Ｖａｌｅｎｃｉａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（１２）：１６７３−１６７９頁（２００４年））、および、ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１−３ドメインを有する細菌によって生成されたタンパク質に対する、カドヘリン−１１野生型マウスにおいて産生された抗体を含んだ。これらの抗体を、ウエスタン分析により、ヒトＣａｄ−１１のＥＣ１ドメインのみ（カドヘリン−１１−ＥＣ１−Ｆｃ）、Ｃａｄ−１１のＥＣ１およびＥＣ２ドメイン（Ｃａｄ１１−ＥＣ１／２−Ｆｃ）またはＣａｄ−１１の全部で５つのＥＣドメイン（カドヘリン−１１−ＥＣ１−５−Ｆｃ）を有する融合タンパク質に対する結合能について試験した。ウエスタンブロットに対し、試験した抗体の中で、ＥＣ１−ＦｃまたはＥＣ１−２−Ｆｃ融合タンパク質を認識するものは全くなかった（図１Ａ）。しかし、３つの試験セットの各々に由来する抗体は、細胞外ドメイン１〜５を含むヒトＣａｄ−１１−Ｆｃ融合タンパク質を認識した（図１Ｂ）。これらの結果は、試験抗体がヒトＣａｄ−１１のＥＣ１またはＥＣ２ドメインに結合しなかったが、このタンパク質の細胞外領域内の他の部分のエピトープを認識したことを示す。
Ｃａｄ−１１発現細胞に結合する入手可能な公表された抗Ｃａｄ−１１抗体１３Ｃ２、２３Ｃ６、５Ｆ８２（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）および２８３４１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ならびにＣａｄ−１１ ＥＣ１結合抗体Ｈ１Ｍ１、および対照抗体ＭＯＰＣを、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＣａｄ−１１のＥＣ１ドメインのみ（カドヘリン−１１−ＥＣ１−Ｆｃ）またはＣａｄ−１１の全部で５つのＥＣドメイン（カドヘリン−１１−ＥＣ１−５−Ｆｃ）を有する融合タンパク質に対する結合能について試験した。入手可能な公表された、試験した抗Ｃａｄ−１１抗体の中で、ＥＣ１−Ｆｃを認識するものは全くなかった（図１Ｂ、白棒）（２８３４１６についてのデータはここでは示されない）。しかし、Ｃａｄ−１１ ＥＣ１結合Ｈ１Ｍ１抗体は、カドヘリン−１１−ＥＣ１−Ｆｃおよびカドヘリン−１１−ＥＣ１−５−Ｆｃの双方に結合した（図１Ｂ、黒棒）。対照ＭＯＰＣ抗体は、いずれの融合タンパク質にも結合しなかった。これらの結果は、入手可能な公表された抗Ｃａｄ−１１抗体はヒトＣａｄ−１１のＥＣ１ドメインに結合しないが、このタンパク質の細胞外領域内の他の部分のエピトープを認識したことを示す。
ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインのＮ末端の３５個のアミノ酸中のエピトープに特異的な抗体を産生するため、ヒトＦａｂをコードするファージディスプレイライブラリ（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＡＧ）をスクリーニングした。候補Ｆａｂを、２つの選択基準−ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインの最初の３５個のアミノ酸を含むペプチドに結合するための陽性選択、および２つの密接に関連し、高度に相同なカドヘリン、カドヘリン−８およびＭＮ−カドヘリンのＥＣ１ドメイン由来の対応するペプチドに結合するための陰性選択を使用して同定した（図２）。ＥＬＩＳＡを使用し、結合を評価した。
２つのスクリーニングを実施した。第１のスクリーニングでは、カドヘリン−１１のＥＣ１ペプチドに結合する９６個のＦａｂクローンをＥＬＩＳＡによって同定した。７つの候補ＦａｂがＣａｄ−１１のＥＣ−１ペプチドに結合したが、これらのうち２つだけがＥＣ−１ペプチドおよびＥＣ１−２−Ｆｃ融合タンパク質の双方に結合した。これら２つのＦａｂの一方はまたＭＮ−Ｃａｄペプチドに結合した。したがって、７つのＦａｂクローンのうち１つだけがＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質に特異的に結合したが、ＭＮ−Ｃａｄおよびカドヘリン−８の双方のＥＣ１ドメインペプチドに結合しなかった。第２のスクリーニングでは、カドヘリン−１１のＥＣ１ペプチドおよびＥＣ１−２−Ｆｃ融合タンパク質に対して特異性を示す、９６Ｆａｂのうち１つだけ（クローンＦ９）が、ＭＮ−Ｃａｄおよびカドヘリン−８のＥＣ１ドメインペプチドに結合できなかったことから、同様の結果が認められた（図３）。試験するＣａｄ−１１のＥＣ１ドメインに結合するＦａｂの大部分が、Ｃａｄ−１１のＥＥＹ ＣＡＲ配列と重なるＥＥＹ ＣＡＲ配列を有するＭＮ−Ｃａｄペプチドとの交差反応を示した。
実施例２：インビトロアッセイにおいてカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインに結合するＦａｂがＣａｄ−１１媒介性細胞凝集を阻害する
材料および方法
インビトロカドヘリン−１１凝集アッセイ
４３１−Ｄ細胞は、懸濁液中で成長し、通常はカドヘリンを全く発現せず、凝集しない。４３１−Ｄ−１１細胞は、遺伝子組み換えにより、Ｃａｄ−１１が発現されている。４３１−Ｄ−１１細胞を４０分間にわたって培地中で単独でインキュベートし、それらが凝集し始める場合、ウェルの底に沈んだ細胞塊および懸濁液中の残りの非凝集細胞が測定され、凝集４３１−Ｄ−１１の百分率が計算されうる。凝集アッセイにおいては、４３１−Ｄ−１１細胞（Ｄ−１１細胞）を、フラスコ内でサブコンフルエンスまで成長させ、次いで０．０５％トリプシン＋０．５３ｍＭ ＥＤＴＡを使用し、フラスコから除去した。約２×１０６個の４３１−Ｄ−１１細胞を、２ｍｌのＳＭＥ培地（ダルベッコ改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）−高グルコース、０．１Ｍヘペス、ｐＨ７．４および５Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅ）に添加し、試験作用物質（例えば、抗体、Ｆａｂ、融合タンパク質）の不在下または存在下のいずれかで、氷上で１５分間プレインキュベートした。試験作用物質とのプレインキュベーション後、細胞を２４ウェルプレート上の丸底ウェルに移し、ロータリーシェーカー上、３０ｒｐｍで回転させながら、３７℃でインキュベートした。細胞は、凝集するにつれて、ウェルの底に沈む。０分後および４０分後、試料の中央から２００μｌをウェルから除去し、２５μｌの８％グルタルアルデヒドと混合し、細胞を固定した。２００μｌの固定した細胞の試料を９．８ｍｌのＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ等張生理食塩溶液に添加し、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒセットを使用し、８μｍ〜２４μｍの閾値でカウントした。３の細胞カウント／試料を記録した。４０分後の細胞の減少または凝集した細胞の（０分時点での百分率に対する）百分率を計算した。
結果
カドヘリン−１１のＥＣ１ドメインのＮ末端の３５個のアミノ酸中のエピトープに対して結合特異性を有する候補Ｆａｂ（クローンＦ９）は、ＭＮ−ＣａｄまたはＣａｄ−８のＥＣ１ドメインに結合しないものであり、インビトロでのカドヘリン−１１細胞凝集アッセイを使用し、Ｃａｄ−１１媒介性細胞凝集に対する阻害能について試験した。候補Ｆａｂは、細胞のカドヘリン−１１媒介性凝集を１μｇ／ｍｌ以下の濃度で有意に阻害した（図４および５）。それに対し、ＥＣ１／２ドメイン外部のＣａｄ−１１の細胞外領域内のエピトープに結合する１３Ｃ２抗体から作製したＦａｂは、１０μｇ／ｍｌの濃度のみでカドヘリン−１１の凝集を阻害し、これは、Ｆ９ ＦａｂがＣａｄ−１１の細胞外ドメインの他の部分に結合する抗体より低い濃度でＣａｄ−１１活性をより効果的に阻害することを示唆する。
Ｃａｄ−１１媒介性細胞凝集はまた、Ｃａｄ−１１単独、Ｃａｄ−１１およびＣａｄ−８、Ｃａｄ−１１およびＭＮ−Ｃａｄ、またはＣａｄ−１１、Ｃａｄ−８およびＭＮ−Ｃａｄのいずれかに対して特異的な様々な抗カドヘリン−１１−ＥＣ１ドメインＦａｂによって阻害された（図６および７）。試験したすべてのカドヘリン−ＥＣ１−ドメインに特異的なＦａｂは、対照試料（例えばＳＭＥ培地（図６）、ＧＦＰに特異的なＦａｂ（図７））に対し、インビトロで細胞凝集を阻害した。
実施例３：ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインを有するカドヘリン−１１／免疫グロブリン融合タンパク質の生成
次のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、標準条件下で実施されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、カドヘリン−１１のＥＣ１領域を、完全長ヒトカドヘリン−１１ ｃＤＮＡをコードするベクターから調製し（ヒトＣａｄ−１１をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＣＥＰ４（登録商標）ベクターのＮｏｔ１およびＫｐｎ−１部位にクローン化し）、ＥｃｏＲ１およびＢｇｌＩＩ部位（それぞれフォワードおよびリバースプライマー内の下線の配列を参照）を増幅産物に導入した。
フォワードプライマー：
Figure 0006223483
リバースプライマー：
Figure 0006223483
増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲ１およびＢｇｌＩＩで消化し、消化産物を、単離し、対応するＥｃｏＲ１およびＢｇｌＩＩ部位を使用したｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ２ｅ１−Ｆｃ１ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）にライゲートした。ＴＯＰ１０コンピテント細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者による説明に従い、ライゲーション産物で形質転換し、カドヘリン−１１−ＥＣ１−Ｆｃプラスミドを伴う細菌をゼオマイシン（ｚｅｏｍｙｃｉｎ）で選択した。カドヘリン−１１−ＥＣ１−Ｆｃプラスミドを単離し、配列決定し、次いで使用し、２９３Ｆ細胞に一時的に形質移入した。条件培地を回収し、カドヘリン−１１−ＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号９）を、タンジェンシャルフローフィルトレーションを使用して精製後、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２の中で平衡化された５０／５０混合のプロテインＡ／プロテインＧカラムで単離した。精製カドヘリン−１１−ＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質を、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３）および１ｍＭ ＣａＣｌ２を使用し、カラムから溶出し、２００μｌの１Ｍトリス（ｐＨ７．４）および１ｍＭ ＣａＣｌ２を有するチューブに入れた。次いで、Ｃａｄ−１１融合タンパク質を有する溶出液を、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２に対して透析した。タンパク質のサイズをＳＤＳ ＰＡＧＥによって確認し（図１０）、ヒトＦｃ領域を認識する抗体を使用するウエスタン分析（図１１）およびＮ末端の配列決定（図示しない）によって同一性を確認した。Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−２−Ｆｃを、上記の場合に類似の技術および条件を用いて生成した。
実施例４：Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃ免疫グロブリン融合タンパク質はインビトロアッセイにおいてＣａｄ−１１媒介性細胞凝集を阻害する
材料および方法
マトリゲルプラグへの細胞浸潤／遊走
線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）遊走活性を、マトリゲル ＥＣＭでコーティングされたトランスウェル内、ＦＬＳ培地（ダルベッコ改良イーグル培地−高グルコース［Ｓｉｇｍａ＃Ｄ７７７７］、１０％ウシ胎仔血清［Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ＃１００−１０６］、１％ペニシリン−ストレプトマイシン［Ｇｉｂｃｏ３１５１４０−１２２］、１％ Ｌ−グルタミン［Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０］、０．５％ゲンタマイシン［Ｇｉｂｃｏ＃１５７１０−０６４］）中で評価した。１×１０４個の細胞を有するＦＬＳ培地中のヒトＦＬＳ細胞懸濁液を、０．７５０ｍＬのＦＬＳ培地を有する２４ウェルプレートのウェル内にセットした対照インサートまたはマトリゲルコーティングされたインサートに添加した。次いで、プレートを、３７℃、５％の大気中ＣＯ２で加湿された組織培養インキュベーター内で２２時間インキュベートした。
遊走した細胞の数を計算するため、非浸潤細胞を、対照インサートの膜の上部表面から綿棒で拭き取ることによって除去した。２回目の拭き取りを、ＦＬＳ培地で湿らせた綿棒を使用して繰り返す。次いで、対照インサートを固定し、分別染色キットを使用して染色した［Ｆｉｓｈｅｒ＃１２２−９１１］。インサートを乾燥状態にしておき、細胞を、１０倍対物レンズでの顕微鏡を使用し、４分割した対照インサート内でカウントする。３つのインサートをカウントし、合計を平均する。
マトリゲルインサートに浸潤した細胞の数を計算するため、非浸潤細胞を、マトリゲルインサートの表面から綿棒で拭き取ることによって慎重に除去した。２回目の拭き取りを、ＦＬＳ培地で湿らせた綿棒を使用して繰り返す。次いで、インサートを固定し、分別染色キットを使用して染色した［Ｆｉｓｈｅｒ＃１２２−９１１］。インサートを乾燥状態にしておき、細胞を、１０倍対物レンズでの顕微鏡を使用し、４分割した対照インサート内でカウントする。３つのインサートをカウントし、合計を平均する。
結果
Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃは、３μｇ／ｍｌの濃度で細胞凝集を有意に阻害した一方、ヒトＣａｄ−１１の全部で５つのＥＣドメインを有する完全長Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−５−Ｆｃタンパク質は、１００μｇ／ｍｌの濃度でＣａｄ−１１媒介性凝集を阻害した（図１３）。これらのデータは、Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃ免疫グロブリン融合タンパク質がインビトロアッセイにおいてＣａｄ−１１媒介性細胞凝集を有効に阻害することを示す。
さらに、Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃ免疫グロブリン融合タンパク質の、ヒト線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）のマトリゲルプラグへの浸潤に対する阻害能をインビトロで試験した。ＦＬＳのマトリゲルへの浸潤は、マトリゲルを分解するための、ＦＬＳによるＭＭＰ１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３、セリンプロテアーゼ、および他のタンパク質の発現、ならびにＦＬＳのマトリゲルへの遊走を伴う複合プロセスである。別々のアッセイにおいて、発明者は、正常な線維インサートを通るＦＬＳの遊走が全く阻害されないことを見出した。これは、ＥＣ−Ｆｃまたは１３Ｃ２ ｍＡｂの影響として、マトリゲル（関節軟骨に対する代理）の分解が阻害されることを示唆している。Ｃａｄ−１１−ＥＣ１−Ｆｃとマウス抗Ｃａｄ−１１ｍＡｂ １３Ｃ２の双方が、２つの独立実験において、ＦＬＳのマトリゲルプラグへの浸潤を阻害した。
実施例５：ヒトカドヘリン−１１のＥＣ１ドメインペプチドに対する抗体の作製
材料および方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＢＳＡに共有結合した、ヒトＣａｄ−１１ ＥＣ１ドメインの最初の３３個のアミノ酸（ＧＷＶＷＮ ＱＦＦＶＩ ＥＥＹＴＧ ＰＤＰＶＬ ＶＧＲＬＨ ＳＤＩＤＳ ＧＤＧ（配列番号１０））に対応する０．０１ｍｇのペプチドで、１か月にわたり週２回、脚パッドに９回免疫した。このペプチドは本明細書中でペプチド４と称される。免疫マウス由来の脾臓を採取し、マウス融合パートナーＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合し、抗体産生ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマを増殖させ、１０、３または０．５細胞／ウェルのいずれかでサブクローン化し、ハイブリドーマ由来の抗Ｃａｄ−１１抗体含有培地を、細菌内で生成されるＣａｄ−１１ ＥＣ１−２ドメインを含むタンパク質に対する特異的結合能について、ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。これらのペプチド４ハイブリドーマ由来の抗Ｃａｄ−１１抗体含有培地を、ヒトＣａｄ−８およびＭＮ−カドヘリンのＥＣ１−２ドメインを含むタンパク質への結合の不在について同時スクリーニングした。９６ウェルＥＩＡプレートを、各ＥＣ１−２ Ｃａｄタンパク質につき０．０５ｍｌの０．０〜０．３ｍｇ／ｍｌで、４℃で一晩コーティングし、次いで生理食塩緩衝液で数回洗浄した。次いで、プレートを０．２５ｍｌのカゼイン−ＰＢＳ緩衝液でブロッキングし、生理食塩緩衝液で数回洗浄した。抗Ｃａｄ−１１抗体を含有するハイブリドーマ培地を、各ウェル内で、２２℃で１時間正確にインキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体の１／１０００希釈物１００μｌを各ウェルに添加し、２２℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回洗浄した。１００μｌ／ウェルの室温ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）試薬を各ウェルに添加し、２２℃で５分間着色させておいた。反応を１００μｌの室温２Ｎ硫酸で停止し、プレートを、Ｗａｌｌａｃ １４２０マイクロプレートリーダー上、４５０ｎｍで読み取った。
Ｈ１Ｍ１およびＨ１４抗Ｃａｄ−１１抗体の特異性を、Ｃａｄ−１１、Ｃａｄ−７、Ｃａｄ−８、Ｃａｄ−２０、Ｃａｄ−２４、Ｃａｄ−９、Ｃａｄ−１８、およびＭＮ−ＣａｄのＥＣ１ドメインの最初の３３個のアミノ酸に対し、ＥＬＩＳＡを使用してさらに試験した。Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメインのＧ１〜Ｇ３３領域と重なるＣａｄ−７、Ｃａｄ−８、Ｃａｄ−２０、Ｃａｄ−２４、Ｃａｄ−９、Ｃａｄ−１８、ＭＮ−Ｃａｄの領域に対応するペプチドを合成し、ビオチンに複合した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中の、これらの各ペプチドにつき３０ｎｇ／ｍｌの溶液１００μｌを、９６ウェルＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎプレートの各ウェル内で、４℃で２〜３時間インキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回洗浄した。様々な濃度の抗Ｃａｄ−１１抗体を、各ウェル内、２２℃で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体の１／１０００希釈物１００μｌを各ウェルに添加し、２２℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回洗浄した。１００μｌ／ウェルの室温ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）試薬を各ウェルに添加し、２２℃で５分間着色させておいた。反応を１００μｌの室温２Ｎ硫酸で停止し、プレートを、Ｗａｌｌａｃ １４２０マイクロプレートリーダー上、４５０ｎｍで読み取った。
陽性抗Ｃａｄ−１１抗体ハイブリドーマを含有するウェル由来の培地を、Ｃａｄ−１１発現細胞に対する結合能について試験した。凍結Ｃａｄ−１１発現４３１Ｄ細胞を解凍し、Ｃａ２＋を含有するハンクス緩衝生理食塩液（ＨＢＳＳ）（０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、０．２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．４４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ ＭｇＳＯ４および４．２ｍＭ ＮａＨＣＯ）で２回洗浄し、次いでＣａ２＋を含有するＨＢＳＳに、１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１０５細胞／ウェルを、５０％または１６％のいずれかの抗Ｃａｄ−１１抗体培地で、氷上で４５分間染色し、Ｃａ２＋を含有するＨＢＳＳで２回洗浄し、１％の濃度でのフィコエリトリンと複合された二次ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ））で、氷上で４５分間染色し、次いでＣａ２＋を含有するＨＢＳＳで２回、再洗浄した。次いで、細胞をＣａ２＋および１％ホルムアルデヒドを含有するＨＢＳＳ４００μｌに再懸濁し、次いでＰＥ陽性細胞について、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））で分析した。
結果
ペプチド４ハイブリドーマ由来の抗Ｃａｄ−１１抗体含有培地は、Ｃａｄ−１１ ＥＣ１−２タンパク質（図１６、ＨＬ対ＣＡＤ−１１）に結合したが、Ｃａｄ−８およびＭＮ−ＣａｄのＥＣ１−２ドメインを含むタンパク質（図１６、それぞれＨＬ対ＣＡＤ−８およびＨＬ対ＭＮＣａｄ）に結合しなかった。対照ハイブリドーマ培地は、試験したカドヘリンタンパク質のいずれにも結合しなかった（図１６、Ｍｅｄｉａ対ＣＡＤ−１１、Ｍｅｄｉａ対Ｃａｄ８、およびＭｅｄｉａ対ＭＮＣａｄ）。これらのデータは、ハイブリドーマにおいてペプチド４に対するＣａｄ−１１特異抗体が存在することを示す。
本明細書中でＨ１Ｍ１およびＨ１４と称される２つのペプチド４ハイブリドーマは、ヒトＣａｄ−１１タンパク質を発現する細胞に結合したが（図１７Ａ〜Ｃおよび１７Ｇ〜Ｉ）、非Ｃａｄ−１１対照４３１−Ｄ細胞に結合しなかった（図１７Ｄ〜１７Ｆ）。Ｈ１Ｍ１と称されるハイブリドーマ細胞系は、２００９年１月８日に寄託されている、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．特許寄託番号ＰＴＡ−９６９９を有する。Ｈ１４と称されるハイブリドーマ細胞系は、２００９年１月９日に寄託されている、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．特許寄託番号ＰＴＡ−９７０１を有する。これらのハイブリドーマは、ペプチド４およびＣａｄ−１１発現細胞の双方をインビトロで認識する抗Ｃａｄ−１１抗体を有する。これら抗体のＣａｄ−１１発現細胞への結合は、Ｈ１Ｍ１（図１８Ａ）およびＨ１４（図１８Ｂ）の力価測定に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）からの細胞染色の強度のプロットで示されるように、使用されるペプチド４抗体の量で力価測定することで示された。
Ｈ１Ｍ１およびＨ１４ペプチド４抗Ｃａｄ−１１抗体は、Ｃａｄ−１１に対し、Ｃａｄ−７、Ｃａｄ−８、Ｃａｄ−２０、Ｃａｄ−２４、Ｃａｄ−９、Ｃａｄ−１８、およびＭＮ−Ｃａｄを含む試験した他のカドヘリンのいずれよりも１００倍を超える結合性を示した。ほとんどの場合、Ｈ１Ｍ１およびＨ１４抗Ｃａｄ−１１抗体の他のカドヘリンに対する結合は全く認められなかった。抗Ｃａｄ−１１抗体Ｈ１４は、Ｃａｄ−１１に対しては強い結合（図１９Ａ）、Ｃａｄ−８に対しては４６８分の１の結合（図１９Ａ）を示し、また、Ｃａｄ−７、ＭＮ−Ｃａｄ、Ｃａｄ−９、Ｃａｄ−１８、Ｃａｄ−２０、またはＣａｄ−２４に対しては事実上全く結合しなかった（図１９Ｂ）。同様に、抗Ｃａｄ−１１抗体Ｈ１Ｍ１は、Ｃａｄ−１１に対しては強い結合（図２０）、Ｃａｄ−８に対しては１５００分の１の結合（図２０）を示し、また、Ｃａｄ−７、ＭＮ−Ｃａｄ、Ｃａｄ−９、Ｃａｄ−１８、Ｃａｄ−２０、またはＣａｄ−２４に対しては実質上結合しなかった（図２０）。
実施例６：抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン抗体Ｈ１Ｍ１およびＨ１４は、アミノ酸配列ＧＰＤＰを含む、Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン内のエピトープに結合する
材料および方法
ペプチド４ Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体Ｈ１Ｍ１およびＨ１４が結合するＣａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン内のエピトープを判定するため、ＥＣ１領域の最初の３７個のアミノ酸を範囲とする４つの異なるペプチド（図２２を参照）をＥＬＩＳＡフォーマットで固定化し、４つのペプチドの各々に対するＨ１Ｍ１およびＨ１４抗体の結合能を測定した。９６ウェルＲｅａｃｔｉｂｉｎｄプレートを、０．３ｎｇ／ウェルのペプチド１（Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメインのアミノ酸Ｇ１〜Ｐ１８）、０．３ｎｇ／ウェルのペプチド２（Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメインのアミノ酸Ｇ１５〜Ｎ３４）、０．３ｎｇ／ウェルのペプチド３（Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメインのアミノ酸Ｖ１９〜Ｙ３７）、０．３ｎｇ／ウェルの免疫原ペプチド４（Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメインのアミノ酸Ｇ１〜Ｇ３３）、全ＥＣ１ドメイン（ＥＦＬ）を含む２０ｎｇの融合タンパク質、または２０ｎｇの対照ヒトＩｇ（Ｆｃ−ブロック）で、４℃で一晩コーティングした。ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回洗浄し、ｄＨ２Ｏ中のカゼインで、２２℃で３時間ブロッキングし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回、再洗浄した。異なるペプチド４ Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン抗体の様々な希釈物を、ペプチド−またはタンパク質−コーティングウェルに移し、２２℃で４５分間インキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ））の１／１０００希釈物１００μｌを各ウェルに添加し、２２℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回洗浄した。１００μｌ／ウェルの室温ＴＭＢ試薬を各ウェルに添加し、２２℃で５分間着色させておいた。反応を１００μｌの室温２Ｎ硫酸で停止し、プレートを、Ｗａｌｌａｃ １４２０マイクロプレートリーダー上、４５０ｎｍの波長で読み取った。
結果
１：１１でのペプチド４抗Ｃａｄ−１１抗体Ｈ１Ｍ１（図２１Ａ）および１：２３でのＨ１４（図２１Ｂ）の双方は、ＥＬＩＳＡにおいてＯＤ４５０プレート読み取り値の対照に対する増加によって示されるように、ペプチド４（ＰＥＰ４）免疫原およびＥＣ１ドメイン融合タンパク質（ＥＦＬ）に結合した。これらの抗体のいずれも、ヒトＩｇＧ対照（Ｆｃブロック）に結合しなかった。さらに、両抗体は、ＥＬＩＳＡにおいて、ペプチド２（ＰＥＰ２）に結合したが、ペプチド１（ＰＥＰ１）またはペプチド３（ＰＥＰ３）に結合しなかった（図２１Ａおよび２１Ｂ）。
これらの結果は、抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン抗体Ｈ１Ｍ１およびＨ１４が、重複するペプチド３中に存在しない、ペプチド２および４中の共通のエピトープに結合することを示唆する。ペプチド３の上流にあるペプチド２および４によって共有されるアミノ酸が、図２２中に示されるボックス領域内で強調される。Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメインのＧ１５から始まるこれら４つのアミノ酸ＧＰＤＰ（配列番号１１）は、Ｈ１Ｍ１およびＨ１４抗体によって認識されるエピトープの一部である可能性が高い。
実施例７：抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン抗体Ｈ１Ｍ１およびＨ１４はインビトロでＣａｄ−１１発現細胞の凝集を阻害する
材料および方法
Ｃａｄ−１１抗体の、Ｃａｄ−１１媒介性細胞凝集に対する阻害能を評価するため、３０μｇ／ｍｌのＨ１Ｍ１ペプチド４抗体を、２４ウェル丸底ポリプロピレンプレート内、０．５ｍｌのＤＭＥＭ−高グルコース、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、１０％ＦＣＳおよび１０Ｕ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ中で、７５，０００個のＣａｄ−１１発現Ａ−４３１−Ｄ類表皮癌細胞と共に培養した。２４ウェルプレートを、約６０ｒｐｍでの回転プラットフォーム上に配置し、５％ＣＯ２と共に３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞凝集を、（Ｈ１Ｍ１実験における）１００倍または（Ｈ１４実験における）４０倍の倍率でプレートを撮影後、評価した。
結果
対照アイソタイプ抗体（３０μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｃａｄ−１１発現細胞は大きな塊を形成した一方（図２３Ａ）、親Ｃａｄ−１１陰性細胞は単一または２つの細胞集団として残存する（図２３Ｃ）。Ｈ１Ｍ１で処置されたＣａｄ−１１細胞は小さな細胞塊として残存し（図２３Ｂ）、それは対照抗体を使用して得られる大きな塊を形成するまで至らなかった。
同じアッセイを使用し、抗Ｃａｄ−１１抗体Ｈ１４はまた、Ｃａｄ−１１媒介性凝集を阻害することが示された。親Ｃａｄ−１１発現細胞が大きい凝集細胞塊を形成した一方（図２４Ａ）、Ｈ１４抗体（図２４Ｂ）は、細胞塊が小さく低頻度であったことから３０μｇ／ｍｌの濃度で凝集を阻害した。これらの結果は、抗Ｃａｄ−１１抗体Ｈ１Ｍ１およびＨ１４がインビトロでＣａｄ−１１媒介性細胞凝集を阻害することを示す。
実施例８：抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン抗体Ｈ１Ｍ１およびＨ１４は、リウマチ様関節炎のマウスモデルにおいて、インビボで関節炎に随伴する関節腫脹を阻害する
材料および方法
試験１−０日目および２日目、６週齢雄Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに１５０μｌのＫＢＮ血清を注射した。ＫＢＮ血清で処置したマウスは、生理食塩水の注射を受けたか（図２５、白三角形）または異なる用量のＨ１Ｍ１抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体で処置された。処置レジメンは、０日目での０．５ｍｇの抗体／マウスと、その後、１日おき（ｑ２ｄ）での０．１ｍｇの抗体／マウス（０．５ｍｇ＋０．１ｍｇ）の投与（図２５、黒三角形）；０日目での０．５ｍｇの抗体／マウス（０．５ｍｇ）の投与（図２５、菱形）；１日おき（ｑ２ｄ）での０．１ｍｇの抗体／マウス（０．１ｍｇ＋０．１ｍｇ）の投与（図２５、四角形）；または１日おき（ｑ２ｄ）での０．３ｍｇの抗体／マウス（０．３ｍｇ＋０．３ｍｇ）の投与（図２５、円形）を含んだ。対照群はマウス５匹からなり、処置群はマウス７匹からなった。関節炎に随伴する関節腫脹を、キャリパー測定値を１日おきにとることによって測定した。
試験２−０日目および２日目、６週齢雄Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに１５０μｌのＫＢＮ血清を注射し、次いでそれらを、１日おき（ｑ２ｄ）に生理食塩水（図２６、三角形）、または、０．３ｍｇ／用量（ｑ２ｄ）で、抗Ｃａｄ−１１抗体Ｈ１Ｍ１（図２６、四角形）もしくはＨ１４（図２６、円形）の一方のいずれかで処置した。対照群はマウス５匹からなり、処置群はマウス７匹からなった。関節炎に随伴する関節腫脹を、キャリパー測定値を１日おきにとることによって測定した。
結果
試験１−Ｈ１Ｍ１抗Ｃａｄ−１１抗体は、対照マウスに対して関節腫脹を阻害した。ＫＢＮで処置されたマウスに０．３ｍｇのＨ１Ｍ１抗体を１日おきに投与することにより、関節炎に随伴する関節腫脹の最大の阻害を認めた（図２５、円形）。
試験２−抗Ｃａｄ−１１抗体の双方が、対照に対し、関節腫脹を阻害した。本試験では、Ｈ１４抗体は、対照動物に対し、関節炎の発症を有意に遅延させた（図２７）。対照群におけるすべてのマウスが３日目までに関節炎を発症する一方、Ｈ１４で処置されたマウスは、すべての動物が関節炎を発症するまで６日を要した。
これら試験は、ヒトＣａｄ−１１のＥＣ１ドメインに対する抗体がインビボで関節炎の発症および重症度を阻害しうることを示す。
実施例９：ヒトカドヘリン−１１の別のＥＣ１ドメインペプチドに対する抗体の作製
材料および方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＢＳＡに共有結合した、ヒトＣａｄ−１１ ＥＣ１ドメインの最初の１９個のアミノ酸に対応する０．０１ｍｇのペプチドＶ１９〜Ｙ３７（ＶＬ ＶＧＲＬＨ ＳＤＩＤＳ ＧＤＧＮＩ ＫＹ（配列番号１２））で、１か月にわたり週２回、脚パッドに９回免疫した。このペプチドは本明細書中でペプチド３と称される。免疫マウス由来の脾臓を採取し、マウス融合パートナーＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合し、抗体産生ハイブリドーマを作製した。これらのハイブリドーマを増殖させ、ハイブリドーマ由来の抗Ｃａｄ−１１抗体含有培地を、細菌内で生成されるＣａｄ−１１のＥＣ１−２ドメインに対応するタンパク質に対する結合能についてスクリーニングした。これらのペプチド３ハイブリドーマ由来の抗Ｃａｄ−１１抗体含有培地を、Ｃａｄ−８およびＭＮ−カドヘリンのＥＣ１−２ドメインを含むタンパク質への結合の不在について同時スクリーニングした。９６ウェルＥＩＡプレートを、ＥＣ１−２ Ｃａｄタンパク質またはＣＨＯ細胞で生成されるＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質の各々の１つにつき０．０５ｍｌの０〜３００ｍｇ／ｍｌで、４℃で一晩コーティングし、次いで生理食塩緩衝液で数回洗浄した。次いで、プレートを０．２５ｍｌのカゼイン−ＰＢＳ緩衝液を使用してブロッキングし、次いで生理食塩緩衝液で数回洗浄した。ペプチド３の抗Ｃａｄ−１１抗体を含有するハイブリドーマ培地を、各ウェル内で、２２℃で１時間そのままでインキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体の１／１０００希釈物１００μｌを各ウェルに添加し、２２℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で２回洗浄した。１００μｌ／ウェルの室温ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）試薬を各ウェルに添加し、２２℃で５分間着色させておいた。反応を１００μｌの室温２Ｎ硫酸で停止し、プレートを、Ｗａｌｌａｃ １４２０マイクロプレートリーダー上、４５０ｎｍで読み取った。
また、ペプチド３ハイブリドーマ由来の培地を、細胞上に発現されるヒトＣａｄ−１１タンパク質に対する結合能について試験した。凍結Ｃａｄ−１１発現４３１Ｄ細胞を解凍し、Ｃａ２＋を有するＨＢＳＳで２回洗浄し、次いでＣａ２＋を含有するＨＢＳＳに１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１０５細胞／ウェルを、５０％または１６％のいずれかの抗Ｃａｄ−１１抗体培地で、氷上で４５分間染色し、Ｃａ２＋を含有するＨＢＳＳで２回洗浄し、次いで１％の濃度でのフィコエリトリンと複合された二次ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で、氷上で４５分間染色し、次いでＣａ２＋を含有するＨＢＳＳで２回、再洗浄した。次いで、細胞をＣａ２＋を含有するＨＢＳＳ４００μｌおよび１％ホルムアルデヒドに再懸濁し、次いでＰＥ陽性細胞について、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで分析した。
結果
ペプチド３ハイブリドーマ由来の抗Ｃａｄ−１１抗体含有培地は、Ｃａｄ−１１ ＥＣ１−２タンパク質およびＥＣ１−Ｆｃ融合タンパク質（図２８、それぞれＨＬ対Ｃａｄ−１１およびＨＬ対Ｃａｄ−１１−ＥＣ１）に結合したが、Ｃａｄ−８およびＭＮ−ＣａｄのＥＣ１−２ドメインを含むタンパク質（図２８、それぞれＨＬ対Ｃａｄ８およびＨＬ対ＭＮＣａｄ）に結合しなかった。対照ハイブリドーマ培地は、カドヘリンタンパク質のいずれにも結合しなかった（図２８、Ｍｅｄｉａ対Ｃａｄ−１１、Ｍｅｄｉａ対Ｃａｄ８、およびＭｅｄｉａ対ＭＮＣａｄ）。
ペプチド３ハイブリドーマ由来の抗Ｃａｄ−１１抗体はまた、ヒトＣａｄ−１１タンパク質を発現する細胞に結合したが（図２９、矢印を参照）、Ｎｅｏを発現する非Ｃａｄ−１１発現対照細胞に結合しなかった。この結果により、インビトロでペプチド３およびＣａｄ−１１発現細胞の双方を認識するハイブリドーマにおける抗Ｃａｄ−１１抗体の存在が確認された。
実施例１０：抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン特異抗体であるＨ１Ｍ１は、滑膜細胞のようなヒト初代線維芽細胞の凝集をインビトロで阻止する。
材料および方法
凝集アッセイ
このアッセイでは、ヒト線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）系を、ＦＬＳ培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン、０．０５％ゲンタマイシン、１％ＨＥＰＥＳ）中で、９０〜１００％コンフルエントになるまで培養した。アッセイの日に、ＦＬＳから培地を除去し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して、フラスコから細胞を取り出し、ＭＭ培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン、０．０５％ゲンタマイシン、１％ＨＥＰＥＳ）で洗浄し、次いで、カルシウム含有ＨＢＳ（０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ、ＫＣｌ ０．２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．４４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ ＭｇＳＯ４、および４．２ｍＭ ＮａＨＣＯ）で２回洗浄した。トリプシン処理されたＦＬＳを、４×１０４細胞／ｍｌでＭＭ培地に再懸濁し、ウェル当たり２×１０４の細胞を、培地のみ、３０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体、または種々の抗Ｃａｄ−１１抗体のいずれかを含有する２４ウェルディッシュに入れた。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間インキュベートし、翌日光学顕微鏡を用いてウェルを観察し撮影した。
ＦＬＳ浸潤アッセイ
種々の細胞外マトリックスタンパク質からなるマトリゲルへのＦＬＳ浸潤を阻害するＨ１Ｍ１抗体の能力を試験するために、マトリゲルスプリットウェルシステム（ｍａｔｒｉｇｅｌ ｓｐｌｉｔ ｗｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ）を用いる浸潤アッセイを使用した。ＦＬＳ生物学のこのインビトロモデルは、関節接合部のヒト軟骨を分解し、その中に穴を開けるＦＬＳの能力を模倣する。このアッセイでは、ヒトＦＬＳ系を、９０〜１００％コンフルエントになるまで、ＦＬＳ ＭＭ培地中で培養する。アッセイ開始の前日に、無血清ＦＬＳ培地中で２４時間、ＦＬＳから血清を枯渇させた。アッセイの日に、血清枯渇ＦＬＳから培地を除去し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して、フラスコから細胞を取り出し、ＭＭ培地で洗浄し、次いでカルシウム含有ＨＢＳで２回洗浄した。トリプシン処理されたＦＬＳを、４×１０５細胞／ｍｌでＭＭ培地に再懸濁した。調製したマトリゲルコーティングインサートを、ＦＬＳに対して有系分裂促進物質として作用するＦＣＳを含むＭＭ培地を含有する２４ウェルプレートに配置した。チャンバーの反対側では、抗体を含有しないかまたは作用濃度の２倍の処理抗体を含有するＭＭ培地５０μｌを各ウェルの中に導入し、それに４×１０５細胞／ｍｌの細胞懸濁液５０μｌを加えた。ＦＬＳおよび抗体を含有するチャンバーを、３７℃インキュベーター中で１８時間インキュベートした。
２４時間後、細胞含有インサートをメタノール中で固定し、マトリゲルコーティングされた膜の外側に固着したＦＬＳを、綿棒を使用して除去し、膜を乾燥した後、暗所にて室温で３０分間ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて染色した。ＰＩ染色剤を除去し、インサートをＤ−グルコース（１ｍｇ／ｍｌ）で洗浄した後、暗所で乾燥した。膜を切除し、螢光顕微鏡を使用してスライド上で画像化し、膜の中に遊走したＦＬＳの数を定量した。
結果
培地または対照抗体のいずれかと共にインキュベートされたＦＬＳは、細胞凝集物、および細胞突起を介して結合する細胞の広範なネットワークを形成した（図３０ＡおよびＢ）。これに対し、抗Ｃａｄ−１１抗体であるＨ１Ｍ１で処置された細胞は、細胞凝集物および結合をほとんど形成しなかった（図３０Ｃ）。
種々の初代ヒトＦＬＳを用いた一連のＦＬＳ浸潤アッセイでは、３０μｇ／ｍｌのＨ１Ｍ１抗体が、膜の中へのＦＬＳの浸潤を一貫して阻害した。具体的には、Ｈ１Ｍ１は３０μｇ／ｍｌの用量で、対照抗体と比較してＦＬＳ浸潤を８０％阻害した。この活性は、１３Ｃ２抗体を含む、ＥＣ１領域外に結合する他のＣａｄ−１１抗体で観察された活性より大きかった（図３１）。
実施例１１：Ｈ１Ｍ１抗体は、ＫＢＮ関節炎マウスモデルにおける関節腫脹を阻害する
材料および方法
抗Ｃａｄ−１１抗体であるＨ１Ｍ１を、関節炎のＫＢＮモデルで試験した。この疾患は、０日目および２日目にＫＢＮ血清７５μｌを２回投与することにより誘導した。７匹の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス群に、０日目に開始して１日おきに１０ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｍ１を腹腔内投与し、マウスの関節腫脹を毎日モニターした。関節腫脹すなわち足首の厚さを、ばね式ダイヤルキャリパー（Ｌｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ）を使用して、足首を完全に屈曲した状態にして踵で測定した。
結果
Ｈ１Ｍ１抗体は、対照群と比較して、関節腫脹を５３％（ｐ＜０．００１）抑制した（図３２）。
実施例１２：Ｈ１Ｍ１可変ドメインおよび相補性決定領域の配列決定
材料および方法
３クローンのＨ１Ｍ１産生ハイブリドーマ細胞（Ｈ１、Ｈ１７、およびＨ２７）からＲＮＡを抽出した。ＩｇＧＶＨ、ＩｇＭＶＨ、ＩｇκＶＬ、およびＩＧλＶＬそれぞれに対する定常領域プライマーに加え、マウスシグナル配列に対する縮重プライマープールを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。重鎖可変（Ｖ）領域ＲＮＡを、６つの縮重プライマープール（ＨＡ〜ＨＦ）１組を使用して増幅し、軽鎖Ｖ領域ｍＲＮＡを、κクラスター（κＡ〜κＧ）に対する７つの縮重プライマープール１組およびλクラスターに対する１つの縮重プライマーを使用して増幅した（表１を参照のこと）。
すべてのＲＮＡ試料について、重鎖からの増幅産物は、重鎖プライマープールＢおよびＥと組み合わせたＩｇＧＶＨ逆転写プライマーを用いて逆転写されたＲＮＡから得られた。増幅産物は、ＩｇκＶＬ逆転写プライマーおよびκ軽鎖プライマープールＢ、Ｃ、およびＧを用いて得られた。上記プールのそれぞれに由来するＰＣＲ産物を精製してクローニングし、各産物につき少なくとも４つのクローンを配列決定した。
Ｈ１Ｍ１産生クローンＨ１、Ｈ１７、およびＨ２７について、単一機能性重鎖および軽鎖Ｖ領域配列を各試料に対して同定し、その３つの抗体は同一であることが判明した（表２）。重鎖および軽鎖Ｖ領域配列をそれぞれ、それらのＣＤＲ配列と共に、図３３および３４に示す。
３つのＨ１Ｍ１ハイブリドーマクローンからの重鎖および軽鎖Ｖ領域は、それらの最近接ヒト生殖細胞系配列と良好な相同性（それぞれ６４％および８２％）を示し、個々のフレームワーク配列は、ヒト生殖細胞系データベースの中に類似したホモログがある（表２）。この高度な相同性により、ヒト化抗体の産生に成功するために広範な工学を必要とする可能性は低い。
Figure 0006223483
Figure 0006223483
Figure 0006223483
実施例１３：ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体の生成
ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体可変領域配列の設計
ＳＹＮ００１２抗体とも称される、本明細書に記載のマウスＨ１Ｍ１モノクローナル抗体の抗体可変（Ｖ）領域の構造モデルを、スイスタンパク質データベースを使用して作製し、ＳＹＮ００１２／Ｈ１Ｍ１抗体の結合特性にとって必須であると予測される、Ｖ領域の重要な「拘束」アミノ酸を同定するために分析した。ＣＤＲ（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両定義を使用）内に含有される残基は、いくつかのフレームワーク残基と共に、重要であると考えられた。ＳＹＮ００１２／Ｈ１Ｍ１抗体のＶＨおよびＶκ配列は両方とも、典型的なフレームワーク残基を含有し、そのＣＤＲ１、２、および３のモチーフは多くのマウス抗体と比較可能である。
上記の分析から、ＣＤＲ配列内の可能な代替残基は狭い選択幅しかないが、ＣＤＲの外側の自由度の高い代替配列を用いることにより、ＳＹＮ００１２／Ｈ１Ｍ１抗体の複合ヒト配列を作製することができると考えられた。予備分析から、いくつかのヒト抗体からの対応する配列セグメントを組み合わせて、マウスＳＹＮ００１２／Ｈ１Ｍ１抗体配列に類似または同一のＣＤＲの作製が可能であることが示された。ＣＤＲの外側および隣接領域については、ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体Ｖ領域の可能な構成要素としてヒト配列セグメントの幅広い選択が確認された。
変異体の設計
上記の分析に基づいて、ＳＹＮ００１２ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体の作製のために使用することができる配列セグメントの大きな予備セットを選択し、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（Ｐｅｒｒｙら ２００９）に結合するペプチドのインシリコ分析に関し、公知の抗体配列に関連するＴ細胞エピトープ（Ｂｒｙｓｏｎ Ｃ，Ｊｏｎｅｓ ＴＤ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ ＭＰ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｖａｌｉｄｉｔｙ ｏｆ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｄｒｕｇｓ ２０１０，２４（１）：１−８）のＴＣＥＤＴＭ（Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｎｔｉｔｏｐｅ ＬＬＣ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）を使用して分析した。ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する顕著な非ヒト生殖細胞系バインダーと同定されたか、またはＴＣＥＤＴＭに対して顕著なヒット得点を得た配列セグメントは廃棄された。これにより、縮小したセグメントセットが得られ、これらの組合せを、上記のように再度分析し、セグメント間の接合部に潜在的なＴ細胞エピトープが確実に含有されないようにした。次いで、選択されたセグメントを組み合わせて、合成のための重鎖および軽鎖Ｖ領域配列を作製した。ＳＹＮ００１２ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体のために、図３５Ａ〜３５Ｈに詳述されている配列を有する５つのＶＨ鎖（ＶＨ１〜ＶＨ５；配列番号６１、６３、６５、６７、６９）および３つのＶκ鎖（Ｖκ１〜Ｖκ３；配列番号７１、７３、７５）を設計した。
複合ヒト抗体変異体の構築
ＳＹＮ００１２／Ｈ１Ｍ１のための複合ヒト抗体ＶＨおよびＶκ領域の変異遺伝子をすべて、アニールされ、連結され、ＰＣＲ増幅されて、完全長の合成Ｖ領域を与える一連の重複オリゴヌクレオチドを使用して合成した。ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）ＶＨ鎖およびＶκ鎖のためのｐＡＮＴ発現ベクターシステム（Ａｎｔｉｔｏｐｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）の中に直接、構築されたＶＨ変異体をＭｌｕ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を使用してクローニングし、構築されたＶκ変異体をＢｓｓ ＨＩＩおよびＢａｍ Ｈ１制限部位を使用してクローニングした（図３６）。構築物はすべて配列決定により確認された。
抗体の構築、発現、および精製
複合ヒト化ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）ＶＨおよびＶκ鎖の１５の組合せをすべて、電気穿孔法によってＮＳ０細胞の中に安定的に形質移入し、２００ｎＭメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ８４０７，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）を使用して選択した。各構築物のメトトレキサート耐性コロニーを、ＩｇＧ４のＥＬＩＳＡを使用してＩｇＧ発現レベルについて試験し、最良の発現系を選択し、増殖させ、液体窒素中に凍結した。１５のヒト化抗体変異体のそれぞれを発現する細胞を生成するのに成功した。
ＳＤＰ０１１（Ｖκ１／ＶＨ１）、ＳＤＰ０２１（Ｖκ１／ＶＨ２）、ＳＤＰ０３１（Ｖκ１／ＶＨ３）、ＳＤＰ０４１（Ｖκ１／ＶＨ４）、ＳＤＰ０５１（Ｖκ１／ＶＨ５）、ＳＤＰ０６１（Ｖκ２／ＶＨ１）、ＳＤＰ０７１（Ｖκ２／ＶＨ２）、ＳＤＰ０８１（Ｖκ２／ＶＨ３）、ＳＤＰ０９１（Ｖκ２／ＶＨ４）、ＳＤＰ１０１（Ｖκ２／ＶＨ５）、ＳＤＰ１１１（Ｖκ３／ＶＨ１）、ＳＤＰ１２１（Ｖκ３／ＶＨ２）、ＳＤＰ１３１（Ｖκ３／ＶＨ３）、ＳＤＰ１４１（Ｖκ３／ＶＨ４）、およびＳＤＰ１５１（Ｖκ３／ＶＨ５）と命名された、ＳＹＮ００１２の１５のヒト化ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）複合変異体を、ＮＳ０細胞培養上清からプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．１１００３４−９３）で精製し、予測アミノ酸配列に基づいた吸光係数（Ｅｃ（０．１％）＝１．５１）を使用して、ＯＤ２８０ｎｍにより抗体を定量した。マウスＩｇＧ１抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体（ＳＹＮ００１１）の精製中に、この抗体が約７．５のｐＨで塊として沈殿することが分かった。したがって、抗体はすべて、酸溶出後に約６．５のｐＨに中和し、緩衝液を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５（１．４ｍＭ酢酸、８．６ｍＭ酢酸ナトリウム）に交換した。各ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体変異体を精製し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＮｕＰａｇｅ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０３２２ＢＯＸ）に試料をロードして、２００Ｖで３０分間泳動させた。ＶＨおよびＶκ鎖の予測サイズに対応するバンドが観察され、混入タンパク質の証拠は認められなかった（図３７）。
実施例１４：ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体のＣａｄ−１１タンパク質への結合の特徴づけ
材料および方法
精製抗体の組換えヒトＣａｄ−１１ ＥＣ１への結合
精製されたヒト化複合変異抗体（ＳＤＰ０１１〜ＳＤＰ１５１）の組換えＣａｄ−１１ ＥＣ１ヒトＩｇＧ１融合タンパク質への結合を、競合結合ＥＬＩＳＡで評価した。５μｇ／ｍｌ〜０．００２２μｇ／ｍｌの希釈系列のヒト化抗体または対照抗体（ＳＹＮ００１２／Ｈ１Ｍ１）を、一定濃度のビオチン化マウス抗Ｃａｄ−１１抗体のＳＹＮ００１２／Ｈ１Ｍ１（０．１μｇ／ｍｌ、最終濃度）と前混合した後、ＰＢＳで希釈された０．２５μｇ／ｍｌの組換えヒトＣａｄ−１１ ＥＣ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．１７９０−ＣＡ−０５０）で前コーティングされたＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＩＳ−９７１−０３０Ｊ）上で室温にて１時間インキュベートした。ビオチン化ｍＡｂの結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ５５１２）およびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．００−２０２３）を用いて検出した。
カドヘリン−ペプチド交差反応性ＥＬＩＳＡ
ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体のいずれがＣａｄ−１１に対して最大の特異性を示すかを評価するために、Ｃａｄ−１１免疫原、またはカドヘリン−７、−８、−９、−１８、−２０、および−２４から取り出した、Ｃａｄ−１１免疫原に最も関連した６つの配列に対応する配列を包含した、ＢＳＡに連結された３７−ｍｅｒのアミノ酸長のペプチドに対する結合能について、ヒト化抗体をＥＬＩＳＡフォーマットで試験した。
Ｒｅａｃｔｉｂｉｎｄプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、カドヘリン−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４に対応する、５００ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ結合カドヘリン３７−ｍｅｒのアミノ酸長ペプチド（ＮＥペプチド）を用いて、ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）（Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），＃２００１２）中０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＥＭＤ，ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｄｅ ９４８０）の中で、１００μｌ容量／ウェルにて４℃で一晩コーティングした。ペプチド含有溶液をウェルから除去し、プレートを、ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて、２００μｌ容量／ウェルにて２２℃で２時間ブロッキングした。次いで、プレートを、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％を用いて、２２℃で２回洗浄し、ブロットを乾燥させた。ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体それぞれの５μｇ／ｍｌ〜８ｎｇ／ｍｌの希釈系列１００μｌ／ウェルを、ペチド（ｐｅｔｉｄｅ）コーティングされたウェル中でインキュベートし、２２℃で１時間インキュベートした。抗体溶液をウェルから除去し、プレートを、２００μｌ／ウェルの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて２２℃で２回洗浄し、ブロットを乾燥させた。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３１４３２）を、１：１０００希釈、１００μｌ／ウェルでプレートの各ウェルに加え、２２℃で３０分間インキュベートした。二次抗体溶液を除去し、プレートを、２００μｌ／ウェルの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて２２℃で２回洗浄し、ブロットを乾燥させた。１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬ＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３４０２２，１ステップＴｕｒｂｏ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ）をプレートに加えて、反応を促し、２２℃で５分間進行させた。１００μｌの室温２Ｎ硫酸を使用して反応を停止し、マイクロプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ １４２０）上で４５０ｎｍにてプレートを読み取った。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）におけるＣａｄ−１１への結合
組換えｈｉｓタグ付きヒトＣａｄ−１１に対するＳＤＰ０５１の親和性を決定するために、ｒｈＣａｄ−１１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を単一濃度でチップに固定化し、ＳＤＰ０５１について高解像度カイネティックスを測定し、２状態反応結合モデルをカイネティックデータに適合させるのに成功した。
カイネティックデータを４０μＬ／分の流速で得ることにより、いかなる潜在的な質量移動効果も最小化した。１２．５ｎＭ〜０．１９５ｎＭの範囲の分析物濃度系列を段階希釈により調製した。カイネティックサイクルを通して、表面および分析物の両方の安定性を確認するために、ブランク（ｍＡｂを含まず）および３．１２５ｎＭ（最初のサイクルおよび最後のサイクル）濃度の分析物の２回反復のカイネティック実験をプログラムした。結合段階の湾曲を観察するのに十分長い３６０秒間、ＳＤＰ０５１をＦｃｓ上に注入した。
Ｃａｄ−１１細胞結合アッセイ
凍結されたＣａｄ−１１発現４３１Ｄ細胞（Ｋ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｕ．Ｎｅｂｒａｓｋａ，Ｏｍａｈａ）または非Ｃａｄ−１１発現親４３１Ｄ細胞（Ｋ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｕ．Ｎｅｂｒａｓｋａ，Ｏｍａｈａ）を解凍して洗浄し、２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁して、各ウェルに５０μｌずつ加えた。次いで、１ｎｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌに濃度を増加させたヒト化ＳＤＰ０５１またはＳＤＰ０７１抗体を用いて、氷上で４５分間細胞を染色した。染色後、細胞を、１％ウシ胎児溶液（ＦＢＳ）含有ハンクス緩衝生理食塩液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、再懸濁し、マウス抗ヒトＩｇＧ４−ＰＥ（１００倍希釈）で、光遮断下、氷上で４５分間染色した。二次試薬で染色後、細胞を１％ＦＢＳ含有ＨＢＳＳで２回洗浄し、１％ＦＢＳ含有ＨＢＳＳ中の２％ホルムアルデヒド２００μｌに再懸濁した後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて分析した。
カドヘリン−ペプチド交差反応性ＦＡＣＳアッセイ
凍結されたＣａｄ−１１発現４３１Ｄ細胞または非Ｃａｄ−１１発現親４３１Ｄ細胞を解凍して洗浄し、２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁して、各ウェルに１００，０００細胞ずつ加えた。次いで、濃度を増加させた３７−ｍｅｒのアミノ酸長のＣａｄ−１１ペプチドまたはＣａｄ−７、Ｃａｄ−８、Ｃａｄ−９、Ｃａｄ−１８、Ｃａｄ−２０、もしくはＣａｄ−２４ペプチドのいずれかと共に、氷上で４５分間、０．５μｇ／ｍｌ ＳＤＰ０５１を用いて細胞を染色した。染色後、細胞を、１％ウシ胎児溶液（ＦＢＳ）含有ハンクス緩衝生理食塩液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、再懸濁した後、１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（１００倍希釈）で、光遮断下、氷上で３０分間染色した。二次試薬で染色後、細胞を１％ＦＢＳ含有ＨＢＳＳで２回洗浄し、再懸濁し、１％ＦＢＳ含有ＨＢＳＳ中の２％ホルムアルデヒド２００μｌ中で固定した後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて分析した。
結果
ヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体はすべて、Ｃａｄ−１１融合タンパク質への結合に対して、ＳＹＮ００１２と有効に競合した（図３８Ａ〜Ｃ）。これにより、それらの抗体がＳＹＮ００１２と同じエピトープまたはＣａｄ−１１上の重複エピトープに結合すること、およびそれらの抗体が、組換えヒトＣａｄ−１１に対して、ＳＹＮ０１２と少なくとも同様にまたはそれよりも良好に結合することが示された。曲線を使用して各抗体に対するＩＣ５０値を計算し、それらの値をＳＹＮ００１２のＩＣ５０に対して規準化した。ＳＹＮ００１２は、プレート間の比較がなされうるように各ＥＬＩＳＡプレートに含まれた（表３）。各細胞系の発現レベルおよび各抗体の計算等電点（ｐＩ）も示される（表３）。
Ｖκ１／ＶＨ５抗体であるＳＤＰ０５１は、最大の特異性でＣａｄ−１１に結合し、Ｃａｄ−１１抗原に対して、他のカドヘリンからの関連抗原よりも１００倍を超える結合性を示した（図３９Ａ〜Ｏ）。最大の交差反応性はＣａｄ−８に対して観察された。ＳＤＰ０３１、ＳＤＰ０６１、およびＳＤＰ０７１もまた、Ｃａｄ−１１に対して顕著な特異性を示し、Ｃａｄ−１１抗原に対して、他のカドヘリンからの関連抗原よりも２０倍を超える結合性を示した。ＳＤＰ０３１、ＳＤＰ０５１、ＳＤＰ０６１、およびＳＤＰ０７１の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を、図４０Ａ〜４０Ｄに示す。
Figure 0006223483
５００ｎｇ／ｍｌでコーティングされたＣａｄ−１１抗原およびＣａｄ−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、−２４抗原に対するヒト化抗Ｃａｄ−１１抗体の初期スクリーニングでは（図４１Ａ）、ＳＤＰ０５１は、Ｃａｄ−１１に対して、他のいずれのカドヘリンよりもはるかに高い結合性を示した。最大の交差反応性はＣａｄ−８抗原で観察された。このアッセイを、５０ｎｇ／ｍｌのより低い抗原コーティング濃度のＣａｄ−１１、Ｃａｄ−８、およびＣａｄ−１８抗原およびより広範な希釈系列のＳＤＰ０５１抗体を用いて繰り返した（図４１Ｂ）。このアッセイでは、ＳＤＰ０５１は、Ｃａｄ−１１に対して６．８ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示し、Ｃａｄ−８に対して１４２１ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示し、結合に２００倍を超える相違があった。Ｃａｄ−１８に対するＥＣ５０は、観察された結合が低レベルであったため、確定することができなかった。これらの結果から、ＳＤＰ０５１がＣａｄ−１１に対して高度に特異的であることが確認された。Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン配列に関するＢＬＡＳＴ検索により、Ｃａｄ−７、−８、−９、−１１、−１８、−２０、および−２４抗原の間に最近接マッチがあることが示された。Ｃａｄ−１１ ＥＣ１ドメイン中の解明されたヘキサペプチドＳＤＰ０５１結合エピトープに関するＢＬＡＳＴ検索により、他の公知のヒトタンパク質の中にこの配列を有するものはないことが示された。
ＳＤＰ０５１は、ｒｈＣａｄ−１１タンパク質に対してサブナノモルの親和性を有し、その平衡解離定数（ＫＤ）は０．３７ｎＭであった（表４）。
Figure 0006223483
チップ表面に関する特徴づけおよび対照実験により、単一密度に固定化されたｒｈＣａｄ−１１が、抗Ｃａｄ−１１抗体相互作用のカイネティック値を測定するのに適していることが示唆された。
カイネティック分析については、一旦抗原が抗体に結合すると、さらなる時間依存的事象が生じることを示す連結反応制御結果に基づいて、２状態反応モデルを使用した（式１、図４２）。ｒｈＣａｄ−１１はホモダイマーであり、したがって、２つの同一の結合エピトープを含有しているので、個々のｍＡｂ分子が、第１の結合部位、次いで両方の結合部位を介して連続して結合するようになると考えられる。
Figure 0006223483
細胞結合アッセイでは、ＳＤＰ０５１およびＳＤＰ０７１が、Ｃａｄ−１１発現細胞には用量依存的に結合し、Ｃａｄ−１１陰性親細胞系には結合しないことが示された（図４３）。
Ｃａｄ−１１に対するＳＤＰ０５１の特異性を決定するための代替法として、ＳＤＰ０５１のＣａｄ−１１発現細胞への結合を遮断する、様々なカドヘリンの能力の測定がある。これを、カドヘリン−７、−８、−９、−１８、−２０、−２４、または−ＭＮのそれぞれについて実施した。Ｃａｄ−１１ペプチドのみが、Ｃａｄ−１１＋細胞に結合するＳＤＰ０５１を顕著に遮断した。分析結果を図４４Ａ〜Ｃに示す。
実施例１５：ヒト化抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体であるＳＤＰ０５１は、ヒト細胞を使用するアッセイにおいて低い免疫原性を示す
材料および方法
抗体の精製
飽和するまで増殖した抗体発現細胞の５Ｌ培養物からＳＤＰ０５１を精製した。上清を細胞およびデブリから分離して、ｐＨ７．４に調整し、濾過滅菌し、０．５Ｍ ＮａＯＨであらかじめ衛生化した５ｍｌのＨｉ−Ｔｒａｐ Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡアフィニティカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）に、５ｍｌ／分の流速で流した。カラムを１００ｍｌのＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄した。抗体を０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ ３．０を用いて５ｍｌ分画で溶出し、各分画を直ちに０．２５ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌで中和した。各分画のタンパク質含量を２８０ｎｍのＵＶ吸収でモニターして、タンパク質含有分画をプールし、緩衝液を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５に交換して濃縮した。１６／６０Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより、抗体をさらに精製した。主要ピーク分画を集めてプールし、濾過滅菌して、エンドトキシンレベルについて、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳＴＭ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｍａｒｇａｔｅ，ＵＫ）を使用して試験した。精製された抗体は、＋４℃に保存した。最終濃度は、計算モル吸光係数、Ａ２８０ １．０＝１．５１ｍｇ／ｍｌを使用して、ＵＶ吸収により決定した。次いで、抗体をそれぞれ、ＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中、１００μｇ／ｍｌに希釈した。
免疫原性アッセイ
ＰＢＭＣは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から入手した健常ドナーバフィーコート（２４時間以内に採血された血液に由来）から単離した。ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ，Ｄｕｎｄｅｅ，ＵＫ）および密度遠心分離によりバフィーコートから単離し、ＣＤ８＋ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。Ｂｉｏｔｅｓｔ ＳＳＰ−ＰＣＲに基づいた組織適合試験キット（Ｂｉｏｔｅｓｔ，Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、ＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定すること、および「再現性」対照抗原（ＫＬＨ：Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）に対するＴ細胞応答を測定することにより、ドナーを特徴づけた。次いで、ＰＢＭＣを凍結して、必要になるまで液体窒素に保存した。
各ドナーからのＰＢＭＣを解凍して、カウントし、生存率を評価した。細胞を室温ＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で復活させ、ＡＩＭＶ中に４〜６×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌで再懸濁した。各ドナーについて、大量培養物を確保して、合計１ｍｌの増殖細胞ストックを２４ウェルプレートに加えた。合計１ｍｌの各希釈試験試料を、試料あたり最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように、ＰＢＭＣに加えた。各ドナーについて、陽性対照（１００μｇ／ｍｌ ＫＬＨと共にインキュベートされた細胞）および陰性対照（培地のみとインキュベートされた細胞）も含めた。最初の４ドナーについては、試験試料によるＴ細胞応答の調節を試験するために、試験試料およびＫＬＨの両方をＰＢＭＣに加える、さらなる対照を含めた。これらの試料とＫＬＨ単独との比較を用いて、増殖に対する試験試料の効果を評価することができる。
培養物を５％ＣＯ２、３７℃で合計８日間インキュベートした。５、６、７、および８日目に、各ウェルの細胞を穏やかに再懸濁し、３×１００μｌアリコートを丸底９６ウェルプレートの個々のウェルに移した。培養物に、ＡＩＭＶ培地１００μｌ中の１μＣｉ［３Ｈ］チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標），Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）をパルスし、さらに１８時間インキュベートした後、ＴｏｍＴｅｃ（登録商標）Ｍａｃｈ ＩＩＩセルハーベスターを使用して、フィルターマット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標），Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）上に収集した。各ウェルのｃｐｍを、視差低バックグラウンド計数モードにおける、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｂｅｔａ Ｃｏｕｎｔｅｒ上のＭｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標），Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）シンチレーション計数測定により決定した。
細胞増殖アッセイ
増殖アッセイについては、ＳＩが２以上（ＳＩ≧２．０）の経験的閾値が以前から確立されており、それによって、この閾値を上回る増殖応答を誘導する試料が陽性と見なされる（含まれる場合、境界線ＳＩ≧１．９０が強調表示される）。広範なアッセイの展開および以前の研究により、これが、多数の偽陽性応答を検出することなく、最大の感度を可能にする最小の信号対雑音閾値であることが示されている。増殖データセット（ｎ＝３）については、陽性応答は統計的かつ経験的な閾値により以下のように定義された。
１．培地対照に対する試験ウェルのｃｐｍを比較し、独立２試料スチューデントｔ検定を使用することによる応答の有意性（ｐ＜０．０５）
２．２以上のＳＩ（ＳＩ≧２．０）。
結果
さらに潜在的な免疫原性を評価するために、ヒト化抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体ＳＤＰ０５１を、８日アッセイにおいて、２５の異なるヒトＴ細胞ドナーからのＣＤ８枯渇ＰＢＭＣ（ＣＤ４ Ｔ細胞）の増殖を誘導するその能力について試験した。マウスＨ１Ｍ１／ＳＹＮ００１２親抗体のマウス−ヒトＩｇＧ４ Ｆｃキメラ型であるキメラＳＹＮ００１４抗体は、ドナーの２８％に増殖を誘導したが、ＳＤＰ０５１抗体は、いずれのＴ細胞ドナーの増殖も誘導しなかった。これらの結果は、ＳＤＰ０５１が低い免疫原性プロフィールを有するという以前のインシリコでの発見を支持する。
対照キメラＳＹＮ００１４抗体およびヒト化ＳＤＰ０５１抗体に関する、免疫原性タイムコース増殖アッセイからの結果を、それぞれ図４５ＡおよびＢに示す。マウス−ヒトキメラＳＹＮ００１４抗体は、２５ドナーのうち７ドナー（ドナーの２８％）に応答を刺激し、ドナー応答の１つは境界線上（ドナー１６に対して１．９８）であるがバックグラウンドからはなお有意に異なるものであった（ｐ＜０．０５、図４５Ａ）。ヒト化抗体ＳＤＰ０５１は、いずれのドナーの応答もまったく刺激せず（２５のうち０、すなわちドナーの０％）、潜在的な免疫原性が低いことが示された。
実施例１６：ヒト化抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体であるＳＤＰ０５１は、滑膜細胞の浸潤およびＭＭＰ３の発現を阻害する
材料および方法
ＦＬＳ浸潤アッセイ
初代ヒトＦＬＳ系を、ＦＬＳ ＭＭ培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン、０．０５％ゲンタマイシン、１％ＨＥＰＥＳ）中で、９０〜１００％コンフルエントになるまで培養した。アッセイの開始前日に、無血清ＦＬＳ培地中で２４時間、ＦＬＳから血清を枯渇させた。アッセイの日に、血清枯渇ＦＬＳから培地を除去し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用してフラスコから細胞を取り出した後、カルシウム含有ＨＢＳで２回洗浄した。トリプシン処理されたＦＬＳを、４×１０５細胞／ｍｌでＭＭ培地に再懸濁した。調製したマトリゲルコーティングインサートを、ＦＬＳに対して走化性因子として作用する５％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むＭＭ培地を含有する２４ウェルプレートに配置した。チャンバーの反対側に、６μｇ／ｍｌもしくは０．６μｇ／ｍｌのＳＤＰ０５１（作用濃度の２倍）または６μｇ／ｍｌの対照ＡＣ１−Ｐ抗体のいずれかを含有するＭＭ培地５０μｌを入れ、次いで、４×１０５細胞／ｍｌの細胞懸濁液５０μｌを各ウェルに加えた。ＦＬＳおよび抗体を含有するチャンバーを、３７Ｃインキュベーター中で１８時間インキュベートした。
２４時間後、細胞含有インサートを、１００％メタノール中で、−２０℃にて３０分間固定し、マトリゲルコーティングされた膜の内部に固着した非浸潤ＦＬＳを、綿棒を使用して除去した。膜を乾燥した後、暗所にて室温で３０分間ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて染色した。ＰＩ染色剤を除去し、インサートをＤ−グルコース（１ｍｇ／ｍｌ）で洗浄した後、暗所で乾燥した。膜を切除し、螢光顕微鏡を使用してスライド上で画像化し、膜に中に遊走していたＦＬＳの数を定量した。
結果
Ｃａｄ−１１は、ＦＬＳ生物学にとって必要とされる重要なカドヘリンである。その結果、Ｃａｄ−１１アンタゴニストは、２つのウェルを分離するマトリゲル層を分解し、その中に浸潤するヒト初代ＦＬＳの能力を阻害すると期待される。マトリゲルは種々の細胞外マトリックスタンパク質からなる。ＦＬＳ生物学のこのインビトロモデルは、軟骨を分解し、その中に穴を空けるＦＬＳの能力を含むＦＬＳ生物学の態様を再現する。
ＳＤＰ０５１は、マトリゲルへのＦＬＳの浸潤を顕著に阻害した。０．３μｇ／ｍｌのＳＤＰ０５１抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、マトリゲル膜への初代ヒトＦＬＳの浸潤を５０％阻害するのに十分であった（図４６）。
ＦＬＳはＭＭＰ３を発現するが、このＭＭＰ３は、インビボにおける軟骨の分解およびインビトロ浸潤アッセイにおけるマトリゲルの分解に関与する酵素の１つであると考えられている。細胞の固定前に浸潤アッセイから上清を採取し、−８０℃で凍結した。これらの上清を解凍し、培地中のＭＭＰ３の存在について試験した。ＭＭＰ３レベルは、ＦＣＳで遊走するように刺激された対照抗体（ＡＣ１−Ｐ）処理ＦＬＳを含有するウェル中で顕著に増加した（図４７）。ＭＭＰ３レベルは、ＦＣＳで刺激されたＳＤＰ０５１処理ＦＬＳでは顕著に低下した。対照抗体処理細胞と比較して、レベルの低下は約５０％であった。
実施例１７：ヒト化抗Ｃａｄ−１１ ＥＣ１抗体であるＳＤＰ０５１は、関節炎の動物モデルにおける関節炎症を阻害する
関節炎の動物モデルにおいてＳＤＰ０５１抗体を試験するために、Ｄ．ＭａｔｈｉｓおよびＣ．Ｂｅｎｏｉｓｔにより開発された関節炎のＫ／ＢｘＮ血清移入モデルが選ばれた（Ｋｏｒｇａｎｏｗ ＡＳ，Ｊｉ Ｈ，Ｍａｎｇｉａｌａｉｏ Ｓ，Ｄｕｃｈａｔｅｌｌｅ Ｖ，Ｐｅｌａｎｄａ Ｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｍ ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉａ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９９；１０：４５１−６１）。このモデルは広範な関節滑膜炎を提供し、したがって、ＳＤＰ０５１抗体の抗炎症および関節保護特性に対する良好な試験となった。
６〜８週齢Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ＫＢＮ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を７５μｌ、０日目および２日目の両日に、腹腔内に（ＩＰ）注射した。−１、０、１、２、４、および６日目に、１０ｍｇ／ｋｇのＳＤＰ０５１または対照（ＡＣ１−Ｐ）のいずれかをマウスにＩＰ投与した。関節腫脹、すなわち足首の厚さを、試験の０、２、４、６、８、および１０日目に、ばね式ダイヤルキャリパー（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｇａｇｅ ｍｏｄｅｌ ７３０８，Ｌｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ）を使用して、完全に屈曲した位置に足首を保持しながら各マウスの両足首後部の踝で測定した。０日目と測定日との間の関節の厚さの差を決定した。試験期間中の足首の厚さの変化を図４８に図示する。足首の厚さの測定値における差は、６、８、および１０日目に顕著であった。１０日目において、ＳＤＰ０５１群の足首の腫脹は、対照群の腫脹よりも４７％低下していた。
１０日目に、各試験マウスの終末出血から血清を集めた。血清をドライアイス上で凍結して、−８０℃に保存した。ＳＤＰ０５１の血清レベルは、捕獲試薬としてＣａｄ−１１ペプチドを使用し、次いで抗ヒトＩｇＧでＳＤＰ０５１を検出するＥＬＩＳＡによる血清試験により決定した。ＳＤＰ０５１は、マウスの血清中に容易に検出することができた（図４９）。
足首を１０日目に摘出し、病理組織を評価した。軟骨侵食、骨侵食および炎症（細胞の浸潤）の重症度は、試験群に対して盲検化された有資格技術者により、０〜５のスコアで評価された。１０日目における病理組織の結果を、表５にまとめた。ＳＤＰ０５１処置動物は、軟骨侵食のスコアで３５％の低下、骨侵食のスコアで２７％の低下、炎症のスコアで２５％の低下を示した。
Figure 0006223483
実施例１８：ＫＢＮ関節炎モデルにおけるＳＤＰ０５１の用量応答
０および２日目に、ＫＢＮ血清をマウスに投与した。０、２、４、および６日目に、１０、３、もしくは１ｍｇ／ｋｇのＳＤＰ０５１または対照ＡＣ３−１−ＰをマウスにＩＰ投与した。足首の厚さの変化を図５０に示す。足首の厚さの低下傾向が、３または１０ｍｇ／ｋｇのＳＤＰ０５１で処置されたマウスに観察された。１０ｍｇ／ｋｇ群における足首の腫脹は、６、８、および１０日目に有意に低下した。１０日目では、この群の足首の腫脹は、対照群の腫脹よりも４４％低下した。一連の試験を通して、１０ｍｇ／ｋｇのＳＤＰ０５１は、足首の腫脹を有意に低下させた。３ｍｇ／ｋｇでは、足首の腫脹は低下傾向にあった。
実施例１９．ＳＤＰ０５１は、リウマチ様関節炎の病態に関係するサイトカインを低下させる
１、２、４、および６日目に、１０ｍｇ／ｋｇのＳＤＰ０５１またはＡＣ３−１−Ｐ対照抗体を尾静脈ＩＶによりマウスに投与した。６日目において、ＳＤＰ０５１群では、対照群よりも足関節腫脹が３３％低下することが示された（表６）。これらのマウスから７日目に摘出した足首について、サイトカイン分析を以下のように実施した。足首関節を摘出して、皮膚および毛皮を除去し、関節を液体窒素中で即座に凍結した。次いで、ホモジナイゼーション緩衝液（２ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ ｐａｒｔ＃ Ｐ７６２６）および１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ ｐａｒｔ＃ Ｐ８３４０）、０．１Ｍインドメタシンを添加されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ組織ホモジナイゼーション緩衝液（ｐａｒｔ＃ ＰＣ６００２））中に関節を溶解して、遠心分離し、得られた上清を、複数アッセイ系（ＯｃｅａｎＲｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、種々のサイトカインおよびケモカインのレベルについてアッセイした。
ＳＤＰ０５１処置群では、破骨細胞分化因子、可溶性核因子カッパーＢ活性化受容体リガンド（ｓＲＡＮＫＬ）、破骨細胞性／リンパ性ケモカイン、マクロファージ炎症性タンパク質−１（ＭＩＰ１α）、単球ケモカインの単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および白血球ケモカインのＲｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）のレベルが２９％〜５１％低下することが示された（表６）。ＩＬ−６またはＴＮＦαのレベルには、ほとんどまたはまったく効果が観察されなかった。試験群では、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）で中程度の増加が観察されたが、ＩＬ−２３は検出することができなかった。
ＳＤＰ０５１の提案される作用機序は、この抗体がマウス関節の線維芽細胞様滑膜細胞上のＣａｄ−１１に結合し、炎症促進性サイトカインおよびケモカインの発現の低下をもたらすというものである。実際、ＳＤＰ０５１処置マウスでは、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、およびＭＩＰ１αを含む、ＦＬＳ生物学に関与すると示唆される数種の白血球ケモカイン（Ｇａｒｃｉａ−Ｖｉｃｕｎａ Ｒ，Ｇｏｍｅｚ−Ｇａｖｉｒｏ Ｍ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｌｕｉｓ Ｍ，Ｐｅｃ Ｍ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｌｖａｒｏ Ｍ，Ａｌｖａｒｏ−Ｇｒａｃｉａ Ｍ ａｎｄ Ｄｉａｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｆ，２００４ Ａｒｔｈ ＆ Ｒｈｅｕｍ，５０，ｐｐ３８６６−３８７７）が、ＲＡ患者の関節において低下していた（表６）。さらに、ｓＲＡＮＫＬは、骨芽細胞分化の重要なメディエーターであり、ＲＡＮＫＬの発現は、種々の炎症性サイトカインによりＦＬＳ上に誘導される（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ Ｍ，Ｈａｙａｋａｗａ Ｎ ａｎｄ Ｍｉｈａｒａ Ｍ，２００８，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ４７ ｐｐ．１６３５−１６４０）。ＳＤＰ０５１処置マウスでは、関節におけるｓＲＡＮＫＬレベルの低下が示された（表６）。これらの効果は中程度であったが、これらの変化の局所領域効果は増幅されうるものであった。
Figure 0006223483
本明細書中に引用されるすべての特許、公開された出願および参考文献の関連の教示は、それら全体が参照により援用される。
本発明は、特にその例示的な実施形態を参照して示され、説明されている一方、形式および詳細における様々な変更が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく本明細書中でなされうることが当業者によって理解されるであろう。

Claims (4)

  1. 癌の治療を必要とする哺乳動物被験体における癌の治療のための医薬の製造におけるヒト化抗体の使用であって、該抗体は、哺乳動物カドヘリン−１１タンパク質のＥＣ１ドメインに特異的に結合し、配列番号：６９を含む抗体重鎖可変領域および配列番号：７１を含む抗体軽鎖可変領域を含む、使用。
  2. 癌が、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、脳腫瘍、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、上皮癌、鼻咽腔癌、リンパ腫、子宮癌、肝癌、頭頸部癌、腎癌、雄性胚細胞腫瘍、悪性中皮腫、骨髄異形成症候群、卵巣癌、膵臓または胆汁癌、前立腺癌、甲状腺癌、および尿路上皮癌からなる群より選択される、請求項１記載の使用。
  3. 癌が乳癌である、請求項２記載の使用。
  4. 癌が前立腺癌である、請求項２記載の使用。
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