MX2013000434A - Anticuerpos humanizados que tienen como objetivo el dominio ec1 de cadherina-11 y composiciones y metodos relacionados. - Google Patents

Anticuerpos humanizados que tienen como objetivo el dominio ec1 de cadherina-11 y composiciones y metodos relacionados.

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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos humanizados que se unen de manera específica a un dominio EC1 de un proteína Cadherina-1l mamífera y composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que comprenden estos anticuerpos. La invención también se refiere a métodos para tratar trastornos mediados por Cadherina-11 en un sujeto mamífero al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo humanizado de la invención. Los trastornos mediados por Cadherina-11 adecuados para el tratamiento por los métodos de la invención incluyen trastornos inflamatorios (por ejemplo, trastornos inflamatorios de articulación, tal como artritis reumatoide), fibrosis y cáncer.

Description

ANTICUERPOS HUMANIZADOS QUE TIENEN COMO OBJETIVO EL DOMINIO ECl DE CADHERINA-11 Y COMPOSICIONES Y MÉTODOS RELACIONADOS Antecedentes de la Invención Los pacientes con inflamación crónica avanzada de articulaciones padecen de deterioro severo de articulación que incluye destrucción de hueso y de cartílago, dando por resultado dolor a largo plazo, deformidad, pérdida de función de la articulación, movilidad reducida y expectativa reducida de vida. La inflamación de articulación se asocia con un número incrementado de células y sustancias inflamatorias en la articulación, que provocan irritación, cansancio de cartílago e hinchazón del forro de articulación. Se conocen varios trastornos autoinmunitarios diferentes que activación inflamación inapropiada o desorientada en una articulación, que da por resultado inflamación crónica en las articulaciones de individuos quienes padecen de estos trastornos. Los trastornos inflamatorios comunes de articulación incluyen artritis reumatoide, artritis psoriásica, síndrome de Reiter y espondilitis anquilosante.
La artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) es la forma más común de artritis inflamatoria y se estima que afecta a aproximadamente 1 por ciento de la población de Estados Unidos de América, o aproximadamente 2.1 millones de norteamericanos. La RA es una enfermedad crónica Ref . : 238332 que se caracteriza por inflamación del forro, o sinovio, de las articulaciones, y. puede conducir a daño significativo de hueso y cartílago con el paso del tiempo.. La RA es más común en mujeres que en hombres y tanto como 3% de las mujeres pueden desarrollar artritis reumatoide en su vida. Actualmente, se desconoce la causa de RA.
La RA puede conducir a daño de articulación a largo plazo, dando por resultado dolor crónico, pérdida de función e incapacidad. Además, la investigación reciente indica que las personas con RA, particularmente aquellos cuya enfermedad no está bien controlada, pueden tener , un mayor riesgo de enfermedad cardíaca, ataque y el desarrollo de fibrosis, particularmente fibrosis pulmonar.
La fibrosis pulmonar, que incluye fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis inducida por radiación, así como la fibrosis provocada por fumar, exposición química, esclerodermia, sarcoidosis, radiación terapéutica, AR, o lupus, aflige a 5,000,000 de pacientes a nivel mundial, y a más de 500,000 individuos en los Estados Unidos de América. La mortalidad a 5 años de la fibrosis pulmonar idiopática es de aproximadamente 80%, dando cuenta de 40,000 muertes por año solo en los Estados Unidos de América. Actualmente, no hay una terapia aprobada para la fibrosis pulmonar idiopática en los Estados Unidos de América o en Europa.
De esta manera, la fibrosis y la inflamación crónica de articulación provocada por RA y otras condiciones inflamatorias son cargas internacionales de salud. Existe la necesidad de desarrollar nuevos agentes para la prevención y tratamiento de estos y otros trastornos.
Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere, en una modalidad, a un anticuerpo humanizado que se une específicamente a un dominio EC1 de un proteína Cadherina-11 mamífera, que comprende una región de cadena pesada variable de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69. En una modalidad particular, el anticuerpo humanizado antagoniza la proteína Cadherina-11 mamífera. En una modalidad adicional, el anticuerpo humanizado comprende una región de cadena pesada variable de anticuerpo que comprende SEC ID NO: 69.
En otra modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado que se une específicamente a un dominio EC1 de una proteína Cadherina-11 mamífera, que comprende una región de cadena pesada variable de anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 69 y una región de cadena ligera variable de anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 71. En una modalidad particular, el anticuerpo - humanizado antagoniza la proteína Cadherina-11 mamífera.
En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para tratar un trastorno mediado por Cadherina-11 (por ejemplo, un trastorno inflamatorio de articulación) en un sujeto mamífero (por ejemplo, un humano) en necesidad de esto. El método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo humanizado que se une específicamente a un dominio ECl de una proteína Cadherina-11 mamífera y antagoniza la proteína Cadherina-11 mamífera, dando por resultado de este modo un efecto terapéutico deseado en el sujeto. En una modalidad particular, el anticuerpo humanizado comprende una región de cadena pesada variable de anticuerpo que comprende SEC ID NO: 69. En una modalidad preferida, el trastorno mediado por Cadherina-11 es artritis reumatoide.
En aun otra modalidad, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado que se une específicamente a un dominio ECl de una proteína Cadherina-11 mamífera y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad particular, el anticuerpo humanizado comprende una región de cadena pesada variable dé anticuerpo que comprende SEC ID NO: 69. En una modalidad adicional, la composición farmacéutica comprende además un segundo agente, tal como un fármaco antireumático modificador de la enfermedad o un agente antiinflamatorio.
La presente invención proporciona nuevos agentes y terapias que tienen eficiencia mejorada para el tratamiento de inflamación y otras afecciones mediadas por Cadherina-11 en humanos . .
Breve Descripción de las Figuras El archivo de la patente o solicitud contiene al menos una Figura ejecutada en color. Las copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con Figuras a color se proporcionarán por la oficina a petición y pago de la tasa necesaria.
La Figura 1A es Western Blot que muestra la detección de la proteína de fusión Cadherina-11-ECl- 5 -Fe usando los anticuerpos 23C6, 13C2 y 27F3 antiCad-11 (ver flechas sólidas) . Estos anticuerpos no reconocen las proteínas de fusión Cadherina-ll-ECl-Fc y Cadherina-ll-ECl/2-Fc que también estuvieron presentes en la membrana (ver flechas abiertas para posiciones de las proteínas Cadherina-11-Fc y ECl-Cadherina-ll-ECl/2-Fc en la transferencia) .
La. Figura IB es una gráfica que representa la unión de los anticuerpos 13C2, 23C6 y 5F82 de Cadherina-11 públicos a la proteína de fusión Cad-ll-ECl-5-Fc , pero no la proteína de fusión Cad-ll-ECl-Fc , como se determina por ELISA. En contraste, el anticuerpo H1M1 de ECl se une tanto a la proteína de fusión Cad-ll-ECl-Fc como a la proteína de fusión Cad-ll-ECl-5-Fc.
La Figura 2 es una alineación de secuencias de aminoácidos de los primeros 34 aminoácidos de los dominios ECl-de Cad-11 humana (SEQ ID NO: 3), MN-Cad (SEQ ID NO: 4), y Cad-8 (SEQ ID NO: 5) que están comprendidas en la unión de cadherina. Las secuencias donadoras que contienen residuos que se extienden en la cavidad de un contra-receptor de cadherinas se indican por el subrayado de la mitad izquierda de la secuencia y los residuos de la secuencia de cavidad de indican por el subrayado de la mitad derecha de la secuencia en SEQ ID NO: 3.
La Figura 3 es una gráfica que representa la unión de un Fab de unión a Cadherina-11 a una Cad-11 humana. El péptido del dominio EC1, así como la proteína de fusión Cad-11-EC1-Fe, pero no los péptidos de dominio EC1 de Cad-8 o MN-Cad, como se determina por ELISA. El clon 7 demostró unión significativa al péptido de dominio EC1 de Cad-11 y a la proteína de fusión, pero no a los péptidos de dominio EC1 de MN-CAD o CAD-8.
La Figura 4 es una gráfica que representa datos de un ensayo de agregación celular de Cad-11 in vitro. Los antagonistas de Cad-11 adicionados al medio, tal como Fab elaborados del anticuerpo 13C2 antiCad-11, o concentraciones variables de un Fab de antiECl de Cadherina- 11 dirigido a los primeros 35 aminoácidos del dominio EC1 de Cadherina-11 (designado clon. 7 de Fab de EC1) , bloquean la agregación celular de 431-D-ll mediada por Cad-11. El Fab de antiECl de Cadherina-11 (clon 7) inhibió la agregación de células de carcinoma epidermoide A-431-D-11 a todas las concentraciones probadas en el intervalo de 0.3 g/ml a 10 g/ml . En contraste, el Fab elaborado del anticuerpo 13C2 antiCadherina-11 solo inhibió la agregación celular a una concentración de 10 g/ml .
La Figura 5 es una gráfica que representa datos de un segundo ensayo de agregación celular de Cad-11 in vi tro. El por ciento de agregación de células 431-D-ll se muestra a 40 min. Después de la adición de ya sea medio SME (control designado) , concentraciones variables de una proteína de fusión que comprende el dominio EC1 de Cad-11 fusionado a la bisagra de IgG2 humana, dominios CH2 y CH3 (designados Cad-11-ECl-Fc) , concentraciones variables de un Fab antiECl de Cadherina-ll dirigido a los primeros 35 aminoácidos del dominio ECl de Cadherina-ll (designado Fab de EC1 de Cad-11) o concentraciones variables de un Fab antiproteína fluorescente verde (antiGFP) de control (designado GFP fAb) . El Fab antiECl de Cadherina-ll (clon 7) inhibió la agregación de células 431-D-ll que expresan Cad-11 a concentraciones de 3 g/ml, 1 pg/ml y 0.1 pg/ml . La proteína de fusión ECl-Fc inhibió la agregación de células 431-D-ll a concentraciones de 3 pg/ml. En contraste, el Fab antiGFP falló en inhibir la agregación celular de forma significativa a cualquiera de las concentraciones de prueba.
La Figura 6 es una gráfica que representa la inhibición de la agregación celular mediada por Cad-11 por varios Fab antiECl' de Cadherina-11 que tienen especificidad de unión para Cad-11 sola (clon 7 y clon 4 de fAb), CAD-11 y Cad-8 (clon 6 de EC1 fAb), o Cad-11 y MN-Cad (clon 5 de EC1 fAb) , usando un ensayo de agregación celular in vitro. Todos los Fab probados inhibieron la agregación de células 431-D-ll con relación al control (D-ll SME; barra izquierda) .
La Figura 7 es una gráfica que representa la inhibición de la agregación celular mediada por Cad-11 por fAb antiCad-ll que tienen especificidad de unión para Cad-11 sola (clon 7 de EC1 fAb) , o 11-Cad y M -Cad (clon 8 de EC1 fAb) , usando un ensayo de agregación celular in vitro. La especificidad de los Fab probados se muestra en paréntesis cerca a cada designación de Fab. Ambos Fab específicos de cadherina inhibieron la agregación celular (barras intermedia y derecha) con relación a un Fab de control que fue específico para GFP (barra izquierda) .
La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos (ADN) (SEQ ID NO: 6) de la proteína de fusión Cad-ll-ECl-hIgG2-Fcl humana (Cad-ll-ECl-Fc) . La secuencia del dominio extracelular de Cadherina-11 humana se muestra en cursivas, el sitio BglII est subrayado, y la secuencia que codifica para región IgG2-Fcl humana se muestra en negritas.
La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de la proteína de fusión Cad-ll-ECl-hIgG2-Fcl humana (Cad-ll-ECl-Fc) . La secuencia del dominio extracelular de Cadherina-11 humana se muestra en cursivas, la secuencia codificada por el sitio BglII está subrayada, la secuencia de la región IgG2-Fcl humana se muestra en negritas.
La Figura 10 es una imagen de un gel de SDS-poliacrilamida que . se ha teñido con azul de Coomassie, que muestra las bandas intensas predominantes que corresponden a la forma monomérica de las proteínas de fusión purificadas Cad-ll-ECl-hIgG2-Fcl (senda intermedia) y Cad-ll-ECl/2-hIgG2-Fcl (senda derecha) , respectivamente, después de la purificación del medio de cultivo Celular usando una columna de proteína A. En la senda izquierda se muestran las normas de peso molecular.
La Figura 11 es Western Blot que muestra' la detección de las proteínas de fusión Cad-ll-ECl-hIgG2-Fcl (senda intermedia) y Cad-ll-ECl/2-hIgG2-Fcl (senda derecha) humanas usando un anticuerpo antilgG humana conjugado a peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) . La banda predominante observada en cada senda corresponde a las ubicaciones de las formas monoméricás de las proteínas de fusión. Las ubicaciones de las formas diméricas de las proteínas de fusión también están visibles (ver bandas menos intensas de mayor peso molecular) , debido a condiciones de reducción incompleta. En la senda izquierda se muestran las normas de peso molecular.
La Figura 12 es una gráfica que representa que una proteína de fusión Cad-ll-ECl-Fc y un anticuerpo antiCad-11 de ratón, 13C2, inhiben la invasión, de sinoviocitos tipo fibroblastos, humanos, que expresan Cad-11 en un tapón de matrigel a las concentraciones indicadas en comparación a las células no tratadas, marcadas Invasión. Los datos se mezclas de dos experimentos independientes .
Las Figuras 13A y 13B son gráficas que representan datos de dos ensayos de agregación celular de Cad-11 in vitro. El porcentaje de agregación de células 431-D-ll que expresan Cad-11 que se muestra a 40 min. Después de la adición de ya sea medio SME (control designado) o una proteína de fusión de Cad-11. La Figura 13A muestra la inhibición de la agregación en la presencia de concentraciones variables de una proteína de fusión que comprende los 5 dominios extracelulares de Cad-11 fusionados a los dominios CH2 y CH3, de bisagra de IgG2 humana (designado Cad-ll-ECl-5-Fc) .
La Figura 13B muestra la inhibición de la agregación de concentraciones variables de una proteína de fusión que comprende ya sea el dominio extracelular N-terminal (dominio EC1) de Cad-11 fusionado a los dominios CH2 y CH3, de bisagra de IgG2 humana (designado Cad-ll-ECl-Fc) o CAD-ll-ECl-5-Fc.
Las Figuras 14A-14C muestran la secuencia de ADNc de Cadherina-11 humana (SEQ ID NO: 1; ver Acceso al Genbank No. NM001797) .
La Figura^ 15 muestra la secuencia de proteína de Cadherina-11 humana (SEQ ID NO: 2; ver acceso al GenBank No. NP001788) .
La Figura 16 es una gráfica que representa el nivel de unión de los anticuerpos en medio de hibridomas de péptido 4 (HL) , o medio de hibridoma de control (Medio) , a proteínas que contienen los dominios EC1-2 de Cad-11, Cad-8 o MN-Cad, como se determina por ELISA.
Las Figuras 17A-17C son gráficas representativas que representa la intensidad de la tinción celular (MFI; intensidad de fluorescencia media) como una medida de la unión del anticuerpo H14 a células 431-D-ll que expresan Cad-11.
Las Figuras 17D-17F son gráficas representativas que representan la ausencia de tinción de células 431-D (MFI; siglas en inglés para intensidad de fluorescencia media) con relación a las Figuras 17A-17C, indicado una carencia de unión del anticuerpo H14 a las células negativas a Cad-11.
Las Figuras 17G-17I son gráficas representativas que representan la intensidad de tinción celular (MFI; intensidad de fluorescencia media) como una medida de la unión de anticuerpo HlMl a células 431-D-ll que expresan Cad-11.
La Figura 18A es una gráfica que representa la unión del anticuerpo H14 a células que expresan Cad-11, y la ausencia de la unión de H14 a células de control negativo de Cad-11, a concentraciones variables de anticuerpo, como se mide por la intensidad de tinción celular (MFI; intensidad de fluorescencia media) .
La Figura 18B es una gráfica que representa la unión del anticuerpo HlMl a células que expresan Cad-11, y la ausencia de unión de HlMl a células de control negativo de CAD-11, a concentraciones variables de anticuerpo, como se mide por intensidad de tinción celular (MFI; intensidad de fluorescencia media) .
La Figura 19A es una gráfica que representa el grado de unión del anticuerpo H14 antiCad-11 a péptidos del dominio ECl de Cad-11 y de Cad-8 a concentraciones variables de anticuerpo, como se determina por ELISA.
La Figura 19B es una gráfica que representa la ausencia de unión del anticuerpo H14 antiCad-11 a los péptidos del dominio ECl de Cad7 , MNCad, Cad9 , Cadl8, Cad20 o Cad24 a concent aciones variables de anticuerpo, como se determina por ELISA.
La Figura 20 es una gráfica que representa la unión del anticuerpo HlMl antiCad-11 a los péptidos de dominio ECl de Cad-11, Cad-8, Cad-7, MN-Cad, Cad-9, Cad-18, Cad-20 y Cad-24 a concentraciones variables de anticuerpos, como se determina por ELISA.
La Figura 21A es una gráfica que representa el grado de unión del anticuerpo H1M1 antiCad-11 a varios inmunógenos de péptido de dominio ECl de Cad-11 (PEP1, PEP2, PEP3 y PEP4), así como la proteína de fusión de dominio ECl de CAD-11 (EFL) y el control de IgG humana (bloque Fe) , como se determina por ELISA.
La Figura 2IB es una gráfica que representa el grado de unión del anticuerpo H14 antiCad-11 a varios inmunógenos de péptido de dominio ECl de Cad-11 (PEP1, PEP2, PEP3 y PEP4) , así como la proteína de fusión de dominio ECl de CAD-11 (EFL) y control de IgG humana (bloque Fe) , como se determina por ELISA.
La Figura 22 es un diagrama esquemático que representa la secuencia de los primeros 37 aminoácidos del dominio ECl de Cadherina-11 humana y las porciones de esta secuencia abarcadas por cada uno de los péptidos 1-4. Los residuos de aminoácido compartidos por los péptidos 2 y 4 que están en la dirección del péptido 3 se resaltan en la región en cuadro. Los aminoácidos comprendidos directamente en la unión de Cad-11 a Cad-11 están subrayados.
.La Figura 23A es una fotografía que muestra una gran masa de células agregadas que expresan Cad-11 que se - trataron con un anticuerpo de isotipo de control.
La Figura 23B es una fotografía que muestra pequeñas aglomeraciones de células que expresan Cad-11 tratadas con H1M1 que no progresan para formar las grandes masas observadas en la Figura 23A.
La Figura 23C es una fotografía que muestra que las células negativas a Cad-11 parentales no tratadas permanecen como grupos de células individuales o dobles .
La Figura 24A es una fotografía que representa un cultivo de células que expresan Cad-11 con grandes masas de células agregadas.
La Figura 24B es una fotografía que muestra un cultivo de células que expresan Cad-11 con células predominantemente individuales con pequeñas e infrecuentes agrupaciones celulares con relación a aquellas mostradas en la Figura 24A después del tratamiento con el anticuerpo H14 antidominio EC1 de Cad-11.
La Figura 25 es una gráfica que representa la inhibición de la hinchazón de la articulación asociada artritis en ratones tratados con dosis incrementadas de anticuerpo H1M1 antiCad-11 con relación a ratones de control no tratados .
La Figura 26 es una gráfica que representa la inhibición de hinchazón de articulación asociada a artritis en ratones tratados con 0.3 mg de ya sea los anticuerpos H14 o H1M1 antiCad-11 cada segundo día con relación a ratones de control no tratados .
La Figura 27 es una gráfica que muestra que el tratamiento con 0.3 mg de anticuerpo ya sea H1M1 o H14 retrasó el desarrollo de artritis en un modelo de ratón en comparación a un control no tratado.
La Figura 28 es una gráfica que representa el grado de unión de medio que contiene anticuerpo de hibridomas de péptido 3 (HL) , o medio de. hibridoma de control (Medio) , a los dominios EC1-2 de Cad-11, Cad-8, y MN-cadherina, o una proteína de fusión de Cad-11 ECl-Fc.
La Figura 29 es una gráfica que representa el grado de unión de anticuerpos antiCad-11 de los hibridomas de péptido 3 a células que expresan proteína Cad-11 humana (ver flecha) y células, de control que no expresan Cad-11 que expresaron Neos.
La Figura 30A es una fotografía que representa sinovios tipo fibroblasto (FLS, por sus siglas en inglés) incubados con medio. Son visibles los agregados celulares y las células que se asocian a través de procesos celulares .
La Figura 30B es una fotografía que representa FLS incubado con 30 pg/ml de anticuerpo de control. Son visibles los agregados celulares y las células que se asocian a través de procesos celulares.
La Figura 30C es una fotografía que representa FLS incubados con 30 g/ml de anticuerpo -H1M1. Son visibles pocos agregados celulares y procesos celulares .
La Figura 31 es una gráfica que representa la inhibición de la invasión de FLS en membrana revestida con matrigel después del contacto con anticuerpos H1M1 con relación a controles, incluyendo otros anticuerpos de Cad-11 que se unen fuera de la región EC1.
La Figura 32 es una gráfica que representa la inhibición de la hinchazón de articulación en un modelo de ratón KBN de artritis después de la administración de anticuerpos H1M1 con relación al control.
La Figura 33 representa las secuencias de aminoácidos deducidas y dé nucleótidos de cadena pesada variable de H1M1. Las definiciones de CDR y la numeración de la secuencia de proteína están de acuerdo a Kabat. Se muestran en gris las secuencias de proteína y de nucleótidos de CDR.
La Figura 34 representa las secuencias de aminoácidos deducidas y de nucleótidos de cadena ligera variable de H1M1. Las definiciones de CDR y la numeración de secuencia de proteína están de acuerdo a Kabat. Se muestran en gris las secuencias de proteína de nucleótidos de CDR.
Las Figuras 35A-35H representan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las 5. cadenas VH (35A-35E) (SEC'ID Nos: 60-69) y las 3 cadenas V (35F-35H) (SEC ID Nos : 70-75) usadas en el diseño de variantes de anticuerpos humanizados antiCad-11 H1M1/SYN0012. Las definiciones de CDR y la numeración de secuencia de proteína están de acuerdo a Kabat. Se resaltan en rojo las secuencias de proteína nucleótidos de CDR.
La Figura 36 es un diagrama de vector que ilustra los vectores pANTVK y pANTVhG . Ambos vectores pANTVK y pA TVhG4 contienen fragmentos de ADN genómico que incorporan intrones y secuencias de poli A. La expresión de ambas cadenas se activa por un promotor CMV. El minigen de DHFR en el vector de cadena pesada se usa para selección.
Las Figuras 37A-37B representan un gel SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de anticuerpos purificados por proteína A. (Fig.37A) IgG4 quimérica antiCad-11 EC1 (SYN0014); (Fig. 37B) variantes de anticuerpos humanizados antiCad-11 (SDP011-SDP151) . El marcador de tamaño es la norma de proteína pre-teñida Fermentas PageRuler (Cat. No. SM1811) . Nota: no se corrió SDP111.
Las Figuras 38A-38C son gráficas que representan los resultados de un ELISA de competición antiCad-11. Se probó una serie de dilución de anticuerpos humanizados antiECl de Cad-11 (SDP011 a SDP151) contra una concentración fija de anticuerpo SYN0012 murino biotinilado para la unión a una proteína de fusión de Cad-11 humana recombinante . La unión del anticuerpo biotinilado disminuye con cantidades crecientes de anticuerpos de control. A: SDP011 a SDP051 B: SDP061 a SDP101; C: SDP111 a SDP151.
Las Figuras 39A-390 son gráficas que representan la titulación de anticuerpos humanizados antiCad-11 en un ensayo de reactividad cruzada de cadherina con péptidos que abarcan el inmunógeno de péptido de Cad-11 (línea roja en cada curva) y las secuencias homólogas correspondientes para cadherinas-7, -8, -9, -11, -18, -20, y -24. Las concentraciones de revestimiento de péptido fueron 500 ng/ml.
A: SDP011; B: SDP021; C: SDP031, D: SDP041, E: SDP051; F: SDP061; G: SDP071, H: SDP081; I: SDP091; J: SDP101; K: SDP111; L: SDP121; M: SDP131: N: SDP141; y O: SDP151.
Las Figuras 40A-40D representan secuencias de aminoácidos de los dominios de región variable de cadena ligera y pesada de los anticuerpos humanizados antiCad-11 (40A) SDP031 (SEQ ID NOS: 71, 65), (40B) SDP051 (SEQ ID Nos: 71, 69), (40C) SDP061 (SEQ ID Nos : 73,61), (40D) , SDP071 (SEQ ID Nos : 73, 63) .
La Figura 41A es una gráfica que representa la titulación de SDP051 en un ensayo de reactividad cruzada de cadherina con péptidos que abarcan el inmunógeno de péptido de Cad-11 (rojo) o las correspondientes secuencias homólogas para cadherinas-7, -8, -9, -11, -18, -20 , y -24. La concentración revestimiento de péptido fue 500 ng/ml.
La Figura 41B es una gráfica que representa la titulación de SDP051 en un. ensayo de reactividad cruzada de cadherina con péptidos que abarcan el inmunógeno de péptido de Cad-11 (rojo) o las correspondientes secuencias homólogas para cadherinas-8 y -18. La concentración de revestimiento de péptido fue 50 ng/ml.
La Figura 42 es una gráfica de Sensograma para la unión de SDP051 a Cad-11 humana recombinante (rhCad-11) .
La Figura 43 es una gráfica que representa la unión, dependiente de la concentración de anticuerpo, de los anticuerpos SDP051 y SDP071 antiECl de Cad-11 humanizados a células 43ID-1.1 que expresan Cad-11, como se mide por FACS (intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) ) . También se muestra la ausencia de unión de células 431D que no expresan Cad-11.
Las Figuras 44A-44C son gráficas que representan la especificidad del anticuerpo SDP051 para Cad-11 usando un ensayo que mide el efecto de un péptido que abarca el antígeno de Cad-11 en la capacidad del anticuerpo SDP051 para unirse a células que expresan Cad-11 con relación a péptidos que abarcan los antígenos relacionados de Cad-20 o Cad-24 (figura 44A) , Cad-7 o Cad-18 (figura 44B) , o Cad-8 o Cad-9 (figura 44C) , en la capacidad del anticuerpo . SDP051 para unirse a células que expresan Cad-11, como se mide por FACS (intensidad de fluorescencia media (MFI)) .
Las Figuras 45A y 45B son gráficas que representan la inmunogenicidad de (45A) el anticuerpo SYN0014 antiECl de Cad-11 quimérico murino/humano y (45B) el anticuerpo SDP051 humanizado antiECl de Cad-11 como se determina por un ensayo de células T de transcurso de tiempo de inmunogenicidad usando PBMC de 25 donadores. Los resultados de cada muestra en triplicado se promediaron y se normalizaron por conversión a índice de Estimulación (SI) . El SI para cada punto de tiempo con cada donador se muestra. El corte para determinar las respuestas positivas con SI = 2.0 se resalta por la línea roja y se indican las respuestas significativas (p <0.05 en una prueba t de student) (*) .
La Figura 46 es una gráfica que muestra que SDP-051 a una dosis de 0.3 g/ml inhibe la invasión de FLS por 50% en comparación a üna dosis de 3 pg/ml de anticuerpo de control de isótipo (AC1-P) .
La Figura 47 es una gráfica. que muestra que SDP-051 a una dosis de 0.3 g/ml inhibe la expresión de MMP en comparación a una dosis de 3 g/ml de anticuerpo de control de isotipo (AC1-P) .
La Figura 48 es una gráfica que ilustra una reducción de 47%' en la hinchazón de articulación en ratones tratados . con SDP051 con relación ratones tratados con el anticuerpo de control AC1-P.
La Figura 49 es una gráfica que representa los niveles en suero del anticuerpo SDP051 después de la administración a ratones (modelo de artritis KBN) .
La Figura 50 es una gráfica que representa los cambios en el espesor de tobillo en ratones tratados con diferentes dosis de anticuerpo SDP051 con relación a ratones tratados con el anticuerpo de control AC3-1P (modelo de artritis KBN murino; Estudio KBN024) .
Descripción Detallada de la Invención Definiciones Como se usa en la presente, los términos "Cadherina-11" , "Cad-11" y "OB-cadherina" se refieren a una proteína Cadherina-11 que se presenta de manera natural o endógena (por ejemplo, mamífera, por ejemplo humana), y a proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que es la misma como aquella de la proteína Cadherina-11 que se presenta de forma natural o endógena (por ejemplo, proteínas recombinantes , proteínas sintéticas) . Por consiguiente, los términos "Cadherina-11", "Cad-11" y "OB-cadherina," que se usan de manera indistinta en la presente, incluyen variantes polimórficas o alélicas y otras isoformas de una proteína Cadherina-11 (por ejemplo, mamífera, humana) producida por, por ejemplo, por empalme alternativo u otros procesos celulares, que se presentan de forma natural en mamíferos (por ejemplo, humanos, primates no humanos) . De manera preferente, la proteína Cadherina-11 es una proteína humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (ver, acceso a Genbank No. NP001788 y Figura 15) .
Como se define en la presente, un "antagonista de Cadherina-11" es un agente (por ejemplo, proteína de fusión, anticuerpo, péptido, péptido mimético, molécula pequeña, ácido nucleico) que se une de manera específica a un dominio ECl de una proteína Cadherina-11 e inhibe (por ejemplo, reduce, previene) una o más actividades mediadas por Cadherina-11 en una célula. Las actividades mediadas por Cadherina-11 incluyen, pero no se limitan a, unión de una proteína Cadherina-11 a una o más proteínas Cadherina-11 diferentes de una manera homotípica, agregación de células que expresan Cadherina-11, inducción de la actividad o expresión de enzimas (por ejemplo, colagenasa, serina-proteasas, MMP1, P3 , MMP13) y la inducción de citocinas (por ejemplo, citocinas inflamatorias) o factores de crecimiento (por ejemplo, IL-6, IL-8 o RANKL o TRANCE), migración de células que expresan Cadherina-11 y destrucción de cartílago por células que expresan Cadherina-11. En una modalidad, el antagonista de Cadherina-11 puede inhibir la unión de un proteína Cadherina-11 a una o más proteínas Cadherina-11 diferentes, por ejemplo, al bloquear la interacción entre las secuencias donadoras en el dominio ECl de una proteína Cad-11 (por ejemplo, una proteína Cad-11 expresada en la superficie de una célula) con la secuencia de cavidad en el dominio ECl de una o más proteínas de Cad-11 diferentes (por ejemplo, una o más proteínas Cad-11 expresadas en la . superficie de otra célula).
Como se usa en la presente, un antagonista de Cadherina-11 que "se une de manera específica" a un dominio ECl de una proteína Cadherina-11 se refiere a un antagonista de Cadherina-11 que se une (por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas) a un dominio ECl de una proteína Cadherina-11 con una afinidad (por ejemplo, una afinidad de unión) que es al menos aproximadamente 5 veces, de manera preferente al menos aproximadamente 10 veces, mayor que la afinidad con la cual el antagonista de Cadherina-11 se une a un dominio ECl de otra proteína de cadherina (por ejemplo, M -cadherina, Cadherina-8) . En una modalidad particular, el antagonista de Cadherina-11 que se une de manera específica a un dominio ECl de una proteína de Cadherina-11 se une a un epítopo presente en SEQ ID NO: 3, y la porción N-terminal del dominio ECl de Cadherina-11 humana, con una afinidad que es al menos aproximadamente 5 veces, de manera preferente al menos aproximadamente 10 veces, mayor que la afinidad con la cual el antagonista de Cadherina-11 se une a un epítopo presente en SEQ ID NO: 4, la porción N-terminal del dominio ECl de MN-cadherina humana, y la afinidad con la cual el antagonista de Cadherina-11 se une a un epítopo presente en SEQ ID NO: 5, la porción N-terminal del dominio ECl de Cadherina-8 humana.
Como como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se propone que abarque tanto anticuerpos enteros como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, por ejemplo fragmentos, Fv, Fe, Fd, Fab, Fab', F(ab') y dAb) . "Anticuerpo" se refiere tanto a anticuerpos policlonales como monoclonales e incluye anticuerpos manejados y que se presentan de forma natural. De esta manera, el término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, humanos, quiméricos, humanizados, primatizados , revestidos, de cadena individual y anticuerpos de dominio (dAbs) . (Ver, por ejemplo, Harlow et al. , Antijbodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) .
El término "epítopo" se refiere a una unidad de estructura conveñcionalmente unida por un par VH/VL de inmunoglobulina. Un epítopo define el sitio de unión mínima para un anticuerpo, y dé esta manera representa el objetivo de especificidad de un anticuerpo.
El término "proteína de fusión" se refiere a una molécula de proteína individual se presenta de forma natural, sintética, semisintética o recombinante que abarca todos o una porción de dos o más polipéptidos heterólogos.
El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos, y no a una longitud específica, de esta manera, se incluyen péptidos, oligopéptidos y proteínas dentro de la definición de un polipéptido.
Como se usa en la presente, el término "péptido" se refiere a un compuesto que consiste de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 residuos de aminoácido en donde el grupo amino de un aminoácido se enlaza al grupo carboxi de otro aminoácido por un enlace peptídico. Estos péptidos son. típicamente de menos de aproximadamente 100 residuos de aminoácido de longitud y de manera preferente son de aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40 o aproximadamente 50 residuos.
Como, se usa en la presente, el término "peptidomimético" se refiere a moléculas que no son péptidos o proteínas, pero que imitan aspectos de sus estructuras. Se pueden preparar antagonistas peptidomiméticos por métodos químicos convencionales (ver, por ejemplo, Damewood J.R. "Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry" in Reviews in Computational Biology, 2007, Vol . 9, páginas 1-80, John iley and Sons, Inc., Nueva York, 1996; Kazmierski W.K., "Methods of Molecular Medicine: Peptidomi-netic Protocole," Humana Press, Nueva Jersey, 1999).
Como se define en la presente, "terapia" es la administración de un agente terapéutico o profiláctico particular a un sujeto (por ejemplo, un mamífero, un humano) , que da por resultado un beneficio terapéutico o profiláctico deseado al sujeto.
Como se define en la presente, un "régimen de tratamiento" es un régimen en el cual se administran uno o más agentes terapéuticos o profilácticos a un sujeto mamífero a una dosis particular (por ejemplo, nivel, cantidad) y en un programa particular o a intervalos particulares (por ejemplo, minutos, días, semanas, meses) .
Como se define en la presente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad suficiente para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado bajo las condiciones de administración, tal como, pero no limitado a, cantidad suficiente para inhibir (es decir, reducir, prevenir) inflamación en una articulación (por ejemplo^ al inhibir la agregación de células, por ejemplo, sinoviocitos , que expresan Cadherina-11) o la formación, crecimiento o metástasis de un tumor. La efectividad de una terapia (por ejemplo, la reducción de inflamación en una articulación y/o prevención de inflamación en una articulación) se puede determinar por métodos adecuados (por ejemplo, métodos de formación de imagen, tal como MRI, RMN, CT) .
Cadherinas Las cadherinas corresponden a una gran familia de moléculas de adhesión dependientes de Ca2+- que median la adhesión celular por unión a otras cadherinas de una manera homotípica (MJ Wheelock y KR Johnson, Ann Rev. Cell Dev. Biol. 19:207-235 (2003) . Las cadherinas clásicas son proteínas de transmembrana de una pasada que contienen cinco dominios extracelulares de cadherina (EC) , cada uno de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud, una región transmembrana y un dominio citoplasmático conservado. Las cadherinas se dividen en ya sea cadherinas del tipo I o del tipo II en base al grado de homología entre los dominios EC. Las cadherinas del tipo II incluyen cadherinas-5 , -6, -8, -11, y -12, humanas y MN-cadherina. La importancia relativa del papel de cada uno de los dominios extracelulares en la mediación de la unión inter-celular no es clara.
Actividad de cadherina-11 en sinoviocitos La Cadherina-11 media la unión sinoviocito a sinoviocito en el forro sinovial de articulaciones articuladas (Valencia et al., J. Exp. Med. 200(12) : 1673-1679 (2004) ; Kiener and Brenner, Arthritis Res Ther. 7(2) : 49-54 (2005) ) . Una proteína de fusión que. comprendió los cinco dominios extracelulares de cadherina de la Cadherina-11 humana, fusionados al dominio bisagra-CH2-CH3 de IgG2 humana, inhibió la formación de forro de sinoviocitos in vitro (Kiener et al., A . J. Pathol. 168 (2006)). Además, los anticuerpos antagonistas antiCadherina-11 y una proteína de fusión que comprendió ECl-5 de Cadherina-11 murina, fusionada a los dominios de bisagra-CH2-CH3 de IgG2a murina, inhibió la inflamación e hinchazón de articulación en modelos murinos de artritis reumatoide (Lee et al., Science 315:1006-1010 (2007) ) .
Antagonistas de Cadherina-11 Un antagonista de Cadherina-11 de la invención puede ser cualquier agente que se una de manera específica a un dominio EC1 de una proteína Cadherina-11 e inhiba (por ejemplo, reduzca, prevenga) una o más actividades mediadas por Cadherina-11 en una célula. Las actividades mediadas por Cadherina-11 incluyen, pero no se limitan a, agregación de células que expresan Cadherina-11 en la superficie celular, y expresión o secreción de factores tal como, por ejemplo, colagenasa, serina-proteasas, MMP1, MMP3 , IL-6, ' IL-8 o RANKL/TRANCE . El agente puede ser un anticuerpo, una proteína de fusión, un péptido, un peptidomimético, una molécula pequeña, o un ácido nucleico, entre otros.
Anticuerpos de Cadherina-11 Como se describe en la presente, los anticuerpos que se unen a un epítopo dentro de una porción N-terminal del dominio EC1 de Cadherina-11 humana que comprende las secuencias donadoras y la cavidad de unión a cadherina de Cad-11 (por ejemplo, SEQ . ID NO: 3), bloquean la actividad de Cadherin-11 in vitro de manera más efectiva que los anticuerpos que se unen a los epitopos en otras regiones de esta proteína (ver ejemplos 1 y 2) .
Por consiguiente, en una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une (por ejemplo, se une de manera específica) a un epítopo que está presente en la porción N-terminal del dominio EC1 de una proteína Cadherina-11 que comprende la secuencias donadoras y la cavidad de unión a cadherina de Cad-11. El término "anticuerpo" se propone que abarque todos los tipos de anticuerpos policlonales y monoclonales (por ejemplo, anticuerpos humanos, quiméricos, humanizados, primatizados, revestidos, de cadena individual, de dominio (dA s) ) y fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos (por ejemplo, Fv, Fe, Fd, Fab, Fab' , F(ab'), dAb) . (Ver, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) . En una modalidad particular, el anticuerpo específico del dominio ECl de Cad-11 es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos específicos del domino ECl de Cad-11 también se pueden enlazar directamente o de forma indirecta a un agente citotóxico.
Otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen específicamente a una porción N-terminal del dominio ECl de una proteína Cad-11 e inhiben la actividad de la proteína Cad-11 también se pueden producir, construir, manejar y/o aislar por métodos convencionales u otras técnicas adecuadas. Por ejemplo, los anticuerpos que son específicos para el dominio ECl de una proteína Cadherina-11 se pueden formular contra un inmunógeno apropiado, tal como un péptido de dominio ECl de Cadherina-11 mamífera recombinante (por ejemplo, humana) (por ejemplo, SEQ ID NO: 3) o una porción del mismo (incluyendo moléculas sintéticas, por ejemplo, péptidos, sintéticos) . Se han descrito una variedad de métodos (ver, por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) and Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,172,124; Harlow, E. and D. Lañe, 1988, Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY) ; Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, Verano del 94), Ausubel, F.M. et al., Eds . , (John Wiley & Sons: Nueva York, NY) , Capítulo 11, (1991)). También se pueden formular anticuerpos al inmunizar un hospedador adecuado (por ejemplo, un ratón) con células que expresan el dominio ECl de Cadherina-11 (por ejemplo, células de cáncer/líneas celulares) o células manejadas para expresar el dominio ECl de Cadherina-11 (por ejemplo, células transfectadas) . (Ver, por ejemplo, Chuntharapai et al, J. Immunol, 152:1783-1789 (1994) ; Chuntharapai et al, patente de los Estados Unidos No. 5,440,021.). Para la producción de anticuerpos monoclonales , se puede producir un hibridoma al fusionar una línea adecuada de células inmortales (por ejemplo; una línea de células de mieloma tal como SP2/0 o P3X63Ag8.653 ) con células que producen anticuerpos. Las células productoras de anticuerpos se pueden obtener de la sangre periférica, o de manera preferente, del bazo o nodulos linfáticos, de humanos u otros animales adecuados inmunizados con el antígeno de interés. Las células fusionadas (hibridomas) se pueden aislar usando condiciones selectivas de cultivo, y clonar por dilución limitada. Las células que producen anticuerpo con la especificidad deseada se pueden seleccionar por un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA) .
Se pueden producir fragmentos de anticuerpo por escisión enzimática o por técnicas recombinantes . Por ejemplo, la escisión con papaína o pepsina puede generar fragmentos Fab o F(ab')2/ respectivamente. También se pueden usar otras proteasas con la especificidad necesaria de sustrato para generar fragmentos Fab o F(ab' )2- También se pueden producir anticuerpos en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpo en los cuales se han introducido uno o más codones finalizadores en la dirección 5' del sitio finalizador natural. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica para una porción de cadena pesada de F (ab')2 se puede diseñar para incluir secuencias de ADN que codifican para el dominio CHi y la región de bisagra de la cadena pesada. En la presente invención también se abarcan anticuerpos de cadena individual, y anticuerpos humanos, quiméricos, humanizados o primatizados (injertados con CDR) , o revestidos, asi como quiméricos, injertados con CDR o de cadena individual revestidos, que comprende porciones derivadas de diferentes especies, y similares, y el término "anticuerpo" . Las varias porciones de estos anticuerpos se pueden unir conjuntamente de forma química por técnicas convencionales, o se pueden preparar como una proteína contigua usando técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, se pueden expresar ácidos nucleicos que codifican para una cadena humanizada o quimérica para para producir una proteína contigua. Ver, por ejemplo, Cabilly et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Cabilly et al., Patente Europea No. 0,125,023 Bl; Boss et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,816,397; Boss et al., Patente Europea No. 0,120,694 Bl; Neuberger, M.S. t al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., Patente Europea No. 0,194,276 Bl; inter, Patente de los Estados Unidos No. 5,225,539; Winter, Patente Europea No. 0,239,400 Bl; Queen et al., Patente Europea No. 0 451 216 Bl; y Padlan, E.A. efe al., EP 0 519 596 Al. Ver también, Newman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992), con respecto a anticuerpos primatizados , y Ladner et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778 y Bird, R.E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)) con respecto a anticuerpos de cadena individual .
Los anticuerpos humanizados se pueden producir usando tecnología de ADN recombinante o sintético, usando métodos normales u otras técnicas adecuadas. También se pueden construir secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADNc) que codifican para regiones variables humanizadas usando métodos de mutagénesis por PCR para alterar las secuencias¦ de ADN que codifican para una cadena- humana o humanizada, tal como una plantilla de ADN de una región variable previamente humanizada (ver, por ejemplo, Kamman, M . , et al., Nucí. Acids Res., 17:5404 (1989)); Sato, K. , et al., Cáncer Research, 53:851-856 (1993); Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); y Lewis, A.P. y J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)). Usando estos u otros métodos adecuados, también se pueden producir fácilmente variantes. En una modalidad, las regiones variables clonadas (por ejemplo, dAbs) se pueden mutar, y secuencias que codifican para variantes con la especificidad deseada se pueden seleccionar (por ejemplo, de una biblioteca de fagos; ver,' por ejemplo, rebber et al, U.S. 5,514,548; Hoogenboom et al., WO 93/06213, publicada el 01 de Abril de 1993) .
Otros métodos adecuados para producir o aislar anticuerpos de la especificidad necesaria se pueden usar, incluyendo, por ejemplo, métodos que seleccionan un anticuerpo recombinante o fragmento de unión a anticuerpo (por ejemplo, dAbs) de una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de visüalización en fago) , o que dependen de la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones) . • Los animales transgénicos capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanizados son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) ) y se pueden producir usando métodos adecuados (ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Lonberg et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,545,806; Surani et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,545,807; Lonberg et al., O 97/13852).
La invención abarca, en una modalidad, un anticuerpo de Cad-11 que se une a un epítopo que está presente en los aproximadamente primeros 37 aminoácidos del dominio EC1 de Cad-11 humana (SEQ ID NO: 13) . En una modalidad particular, la invención se refiere a un anticuerpo de Cad-11 que se une a un epítopo que está presente en SEQ ID NO: 10. En una modalidad adicional, la invención se refiere a un anticuerpo de Cad-11 que se une a un epítopo que comprende SEC ID NO: 11. En otra modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo de Cad-11 que se une a un epítopo que está presente en SEQ ID NO: 12.
En una modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo de Cad-11 producido por el hibridoma H1M1 (Designación PTA-9699 de depósito de patente de ATCC) , que se ha depositado el 8 de Enero del 2009 en la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, Virginia 20108, Estados Unidos de América. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo de Cad-11 producido por el hibridoma H14 (Designación PTA-9701 de depósito de patente de ATCC) , que se ha depositado el 9 de Enero del 2009 en la American Type Culture Collection (ATCC),. P.O. Box 1549, Manassas, Virginia 20108, Estados Unidos de América.
La invención también abarca anticuerpos que compiten específicamente con un anticuerpo de Cad-11 producido por el hibridoma H1M1 y/o un anticuerpo de Cad-11 producido por el hibridoma H14 para la unión a una proteína Cad-11 humana o a una porción que contiene el dominio ECl del mismo (por ejemplo, SEQ ID NO: 3, 10, 12, 13) . En una modalidad particular, un anticuerpo que compite específicamente con un anticuerpo de Cad-11 producido por el hibridoma H1M1 y/o el hibridoma H14 bloquea (por ejemplo, inhibe, disminuye, previene) la unión de un anticuerpo de Cad-11 producido por el hibridoma H1M1 y/o hibridoma H14 a una proteína Cad-11 humana o dominio ECl que contienen una porción de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO: 3, 10, 12, 13) .
Además, la invención abarca anticuerpos que tienen una afinidad de unión para una proteína Cad-11 humana o dominio ECl que contiene una porción de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO: 3, 10, 12, 13) que es al menos tan grande como la afinidad de unión de un anticuerpo de Cad-11 producido por el hibridoma H1M1 y/o un anticuerpo Cad-11 producido por el hibridoma H14 para una proteína Cad-11 Cad-11 o dominio ECl que contiene una porción de la misma.
Proteínas de fusión de Cadherina-11 Además, las proteínas de fusión de inmunoglobulina que contienen solo el dominio ECl de Cad-11 humana (por ejemplo, el dominio EC1 de Cad-11 humana fusionado a una porción de IgG humana) inhibió la actividad de Cad-11 in vitro más eficientemente que una proteína de fusión que incluyó una porción más grande de la región EC de Cad-11, que contuvo todo los 5 dominios EC.
La antagonistas de Cadherina-11 también abarcan proteínas quiméricas, o de fusión comprenden al menos aproximadamente los 35 aminoácidos N-terminales del dominio ECl de Cad-11 humana (SEQ ID NO: 2) operativamente enlazados a toda una porción de una proteína heterologa. "Operativamente enlazado" indica que la porción del dominio ECl de Cad-11 y la proteína heterologa están fusionados en cuadro. La proteína heterologa se puede fusionar al N-término o C-terminal de la proteína. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión GST en la cual las secuencias de proteína se fusionan al C-términal de una secuencia de GST. Otros tipos de proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión enzimáticas, por ejemplo, proteínas de fusión de ß-galactosidasa, proteínas de fusión de GAL de dos híbridos de levadura, fusiones de poli-His, proteínas de fusión marcadas con FLAG, proteínas de fusión de GFP, y proteínas de fusión de inmunoglobulina (Ig) . Esta proteína de fusión puede facilitar la purificación (por ejemplo, de una proteína de fusión recombinante) . En ciertas células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras raamíferas) , se pueden incrementar la expresión y/o secreción de una proteína al usar una secuencia de señal heterologa. Por lo tanto, en otra modalidad, la proteína de fusión contiene una secuencia de señal heterologa en su N-término.
La EP-A-0 464 533 describe proteínas de fusión que comprenden varias porciones de regiones constantes de inmunoglobulina. El Fe es útil en terapia y diagnosis y de esta manera da por resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (ver, por ejemplo, EP-A 0232 262) . En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas con porciones Fe para el propósito de ensayos de examen de alto rendimiento para identificar "antagonistas (Bennett et al., Journal of Molecular Recognition 8:52-58 (1995); Johanson et al., J. Biol. Chem. , 270 (16) : 9459-9471 (1995)). De esta manera, esta invención también abarca proteínas de fusión solubles que contiene un antagonista de la proteína Cad-11 de la invención y varias porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas y/o ligeras de inmunoglobulinas de varias subclases (por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgE) . Las ventajas de las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la presente invención incluyen una o más de las siguientes: (1) avidez incrementada para ligandos multivalentés debido a la bivalencia resultante' de las proteínas de fusión diméricas, (2) mayor vida media en suero, (3) la capacidad para activar células efectoras mediante el dominio Fe, (4) facilidad de purificación (por ejemplo, por cromatografía de proteína A) , (5) afinidad para Cad-11 y (6) la capacidad de bloquear la actividad mediada por Cad-11.
Por consiguiente, en modalidades particulares, el antagonista de Cad-11 es una proteína de fusión que comprende una porción de la región extracelular de una proteína Cadherina-11 que incluye una porción N-terminal del dominio EC1 (aminoácidos 54-90 de SEQ ID NO: 2), operativamente enlazado a toda, o una porción de, o una proteína de inmunoglobulina mamífera. En una modalidad particular, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención no comprenden una porció de la región extracelular de Cadherina-11 que incluye los cinco dominios EC que están contenidos dentro de los aminoácidos 1-609 de SEQ ID NO:2. En ciertas modalidades, la porción de la región extracelular de Cadherina-11 humana puede incluir, por ejemplo, los aminoácidos 1-160, aminoácidos 1-259 o aminoácidos 1-269 de SEQ ID NO: 2. En una modalidad particular, la proteína de fusión carece de la guía y pro-región de Cadherina-11 humana (aminoácidos 1-53 de SEQ ID NO: 2) y usa una secuencia guía heteróloga. La porción de inmunoglobulina puede ser de cualquier fuente vertebrada, tal como murina, pero de manera preferente, es una proteína de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la proteína de inmunoglobulina mamífera es una proteína de IgG2 humana o una porción de esta, tal como la porción de bisagra-CH2-CH3 de IgG2 humana.
Se puede producir una proteína quimérica o de fusión de la invención por técnicas normales de ADN recombinante . Por ejemplo, se ligan fragmentos de ADN que codifican para diferentes secuencias de proteína (por ejemplo, un péptido de dominio EC1 de Cad-11 y una inmunoglobulina mamífera) conjuntamente en cuadro de acuerdo con técnicas convencionales. En otra modalidad, el gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automatizados de ADN. De manera alternativa, se puede llevar a cabo la amplificación por PCR de fragmentos de ácido nucleico usando cebadores de ancla para dar lugar a salientes complementarias entre dos fragmentos consecutivos de aminoácido que se pueden fijar subsiguientemente y re-amplificar para generar una secuencia quimérica de ácido nucleico (ver Ausubel et al., Current Protocole in Molecular Biology, 1992) . Además, muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles que codifican ya para una proteína de fusión (por ejemplo, una porción GST, una porción Fe) . Una molécula de ácido nucleico que codifica para el antagonista de la proteína Cad-11 se puede clonar en este vector de expresión tal que l porción de fusión (por ejemplo, inmunoglobulina) se enlaza en cuadro a la proteína.
Las proteínas de fusión de inmunoglob lina de la invención se pueden proporcionar como monómeros, dímeros, tetrámeros u otros multímeros (por ejemplo, polímeros) . Por ejemplo, se pueden enlazar conjuntamente dominios variables de la porción de inmunoglobulina de la proteína de fusión para formar ligandos multivalentes , por ejemplo, por provisión de una región de bisagra en el C-términal de cada dominio V y unión de disulfuro entre cisteínas en las regiones de bisagra; o la provisión de cadenas pesada cada una con una cisteína en el C-términal del dominio, las cisteínas que están conjuntamente unidas por disulfuro; o la producción de V-CH y V-CL para producir un formato Fab; o el uso de ligadores peptídicos (por ejemplo ligadores Gly4Ser) para producir dímeros, trímeros y multímeros adicionales. Por ejemplo, estos ligandos se pueden enlazar a una región Fe de anticuerpo que comprende uno o ambos de los dominios CH2 y CH3, y opcionalmente una región de bisagra. Por ejemplo, se pueden usar vectores que codifican para ligandos enlazados como una secuencia individual' de nucleótidos a una región Fe, para preparar estos ligandos (por ejemplo, por expresión) .
Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención se pueden conjugar a otras porciones que incluyen, pero no se limitan a, multímeros de polietilenglicol (PEG) o sus derivados (por ejemplo, polimetileno-glicol) , radionúclidos, agentes citotóxicos y fármacos, y usar subsiguientemente para terapia in vivo. Los ejemplos de radionúclidos incluyen 212Bi, 131I, 186Re, e 90Y, entre otros. Los radionúclidos ejercen su efecto citotóxico al irradiar localmente las células, conduciendo as varias lesiones intracelulares , como se conoce en la técnica de radioterapia. Los fármacos citotóxicos que se pueden conjugar a las proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan a, daunorubíciña, doxorubicina, metotrexato, y Mi omicina C. Los fármacos citotóxicos interfieren con los procesos celulares críticos que incluyen ADN, ARN, y síntesis de proteína. Para una exposición más completa de estas clases de fármacos, que se conocen en la técnica, y sus mecanismos de acción, ver Goodman, A.G., et al, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Ed., acmillan Publishing Col, 1990. Katzung, ed. , Basic y Clinical Pharmacology, Quinta Edición, p 768-769, 808-809, 896, Appleton and Lange, Norwalk, Conn.
Como se usa en la presente, el término "proteína de fusión de inmunoglobulina" incluye fragmentos . de las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención. Se propone que estos fragmentos estén dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, una vez que se aislan las moléculas, se pueden escindir con proteasa para generar fragmentos que permanecen capaces para unirse al dominio EC1 de Cad-11 humana .
Antagonistas Peptídicos El antagonista de Cadherina-11 de la invención también puede ser un péptido que se une al dominio ECl de una proteína Cadherina-11. El péptido puede comprender cualquier L- y/o D-aminoácido adecuado, por ejemplo, OÍ-aminoácidos comunes (por ejemplo, alanina, glicina, valina) , no o¡-aminoácidos (por ejemplo, ß-alanina, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, sarcosina, estatina) , y aminoácidos inusuales (por ejemplo, citrulina, homocitrulina, homoserina, norleucina, norvalina,' ornitiha) . Los grupos amino, carboxilo y/u otros funcionales en un péptido pueden estar libres (por ejemplo, no modificados) o protegidos por un grupo protector adecuado. Los grupos protectores adecuados para grupos amino y carboxilo, y los métodos para adicionar o remover grupos protectores se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, por ejemplo, Green y Wuts, "Protectingr Groups in Organic Synthesis", John Wiley y Sons, 1991. Los grupos funcionales de un péptido también se pueden derivatizar (por ejemplo, alquilar) usando métodos conocidos en la técnica.
El antagonista peptídico de Cad-11 puede comprender una o más modificaciones (por . ejemplo, ligadores de aminoácido, acilación, cetilación, amidación, metilación, modificadores terminales (por ejemplo, modificaciones de ciclización) ) , si se desea. El péptido también puede contener modificaciones químicas (por ejemplo, sustitución de grupo N-metil-Oí-amino) . Además, el antagonista peptídico puede ser un análogo de un péptido conocido y/o que se presenta de forma natural, por ejemplo, un análogo peptídico ' que tiene sustituciones conservadoras de residuos de aminoácido. Estas modificaciones pueden mejorar varias propiedades del péptido (por ejemplo, solubilidad, unión) , incluyendo su actividad antagonista de Cadherina-11.
Los antagonistas de Cad-11 que son péptidos pueden ser lineales, ramificados o cíclicos, por ejemplo, un péptido que tiene una estructura de anillo de heteroátomo que incluye varios enlaces de amida. En una modalidad particular, el péptido se un péptido cíclico. Estos péptidos se pueden producir por un experto en la técnica usando técnicas normales. Por ejemplo, un péptido se puede derivar o remover de una proteína nativa por escisión enzimática o química o se puede sintetizar por métodos · adecuados , por ejemplo, síntesis de péptidos en fase sólida (por ejemplo, síntesis tipo Merrifield) (ver, por ejemplo, Bodanszky et al. "Péptido Synthesis," John Wiley & Sons, Second Edition, 1976). Los péptidos que son antagonistas de Cadherina-11 también se pueden producir, por ejemplo, usando metodologías de ADN recombinante u otros métodos adecuados (ver, por ejemplo, Sambrook J. and Russell D. . , Molecular Cloning: A La.hora.tory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,.2001) .
Se pueden sintetizar y montar péptidos en bibliotecas que comprenden unas pocas o muchas especies moleculares discretas. Estas bibliotecas se pueden preparar usando métodos de química combinatoria, y se pueden examinar usando cualquier método adecuado para determinar si la biblioteca comprende péptidos con una actividad biológica deseada. Estos antagonistas peptídicos entonces se pueden aislar usando métodos adecuados.
Antagonistas Peptidomiméticos Los antagonistas de Cadherina-11 también pueden ser peptidomiméticos. Por ejemplo, se pueden preparar polisacáridos que tienen los mismos grupos funcionales como los péptidos. Se pueden diseñar peptidomiméticos, por ejemplo, al establecer la estructura tridimensional de un agente peptídico en el ambiente en el cual se une o se unirá a una molécula objetivo. El peptidomimético comprende al menos dos componentes, la porción o porciones de unión y la estructura o estructura de soporte.
Las porciones . de unión son los átomos o grupos químicos que reaccionarán o formarán un complejo (por ejemplo, a través de interacciones hidrófobas o iónicas) con una molécula objetivo o diana, por ejemplo, con aminoácidos en el dominio EC1 de Cad-11. Por ejemplo, las proporciones de unión en un peptidomimético pueden ser las mismas como aquellas en un antagonista peptídico o proteico. Las porciones de unión pueden ser un átomo o un grupo químico que reaccione con el receptor de la misma o similar manera como la porción de uriión en el antagonista peptídico. Por ejemplo, se puede usar química computacional para diseñar imitadores peptídicos de las secuencias donadoras del dominio ECl de una proteína Cadherina-11 , por ejemplo, que puede unirse a la secuencia de cavidad en el dominio ECl de proteínas Cad-11. Los ejemplos de porciones de unión adecuadas para el uso en el diseño de un peptidomimético para un aminoácido básico en un péptido incluyen grupos que contienen nitrógeno, tal como aminas, amonios, guanidinas y amidas o fosionios. Los ejemplos de porciones de unión adecuadas para el uso en el diseño de un peptidomimético para un aminoácido ácido incluyen, por ejemplo, carboxilo, éster de ácido carboxílico de alquilo inferior, ácido sulfónico, éster de ácido sulfónico de alquilo inferior o un ácido fosforoso o éster del mismo.
La estructura de soporte es la entidad química que, cuando se une a la porción o porciones de unión, proporciona la configuración tridimensional del peptidomimético. La estructura de soporte puede ser orgánica o inorgánica. Los ejemplos de estructuras de soporte orgánicas incluyen polisacáridos, polímeros u oligómeros de polímeros sintéticos orgánicos (tal como, alcohol polivinílico o poliláctidos) . Se prefiere que la estructura de. soporte posea sustancialmente el mismo tamaño y dimensiones como la estructura peptídica o estructura de soporte. Esto se puede determinar al calcular o medir el tamaño de los átomos y uniones del péptido y peptidomimético . En una modalidad, el nitrógeno del enlace peptídico se puede sustituir con oxígeno o azufre, por ejemplo, formando una estructura de poliéster. En otra modalidad, el carbonilo se puede sustituir con un grupo sulfonilo o grupo sulfinilo, formando de este ¦ modo una poliamida (por ejemplo, una polisulfonamida) . Las amidas inversas del péptido se pueden hacer (por ejemplo, sustituyendo uno o más grupos CONH por un grupo -NHCO-) . En aún otra modalidad, la estructura peptídica se puede sustituir con una estructura de polisilano.
Estos compuestos se pueden elaborar por métodos conocidos. Por ejemplo, un peptidomimético de poliéster se puede preparar el sustituir un grupo hidroxilo por el correspondiente grupo a-amino en los aminoácidos, preparando de este modo un hidroxiácido y esterificando secuencialmente los hidroxiácidos , bloqueando opcionalmente las cadenas laterales básicas y ácidas para reducir al mínimo las reacciones secundarias. La determinación de una ruta apropiada de síntesis química se puede identificar en general fácilmente al determinar, la estructura química.
Los peptidomiméticos se pueden sintetizar y montar en bibliotecas que comprenden unas pocas a muchas especies moleculares discretas. Estas bibliotecas se pueden preparar usando métodos bien conocidos de química combinatoria, . y se pueden examinar para determinar si la biblioteca comprende uno o más peptidomiméticos que tienen la actividad deseada.
Estos, antagonistas peptidomiméticos entonces se pueden aislar por métodos adecuados .
Antagonistas de Molécula Pequeña Los antagonistas de ' Cadherina-11 también pueden ser moléculas pequeñas. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen compuestos orgánicos, compuestos organometálicos, compuestos inorgánicos, y sales de compuestos orgánicos, organometálicos o inorgánicos. Los átomos en una molécula pequeña se enlaza típicamente junto con un enlace covalente y/o iónico. El arreglo de átomo en una molécula orgánica pequeña puede representar una cadena (por ejemplo, una cadena carbono-carbono o una carbono-heteroátomo) , o pueden representar un anillo que contiene átomos de carbono, por ejemplo benceno o un sistema policíclico, o una combinación de carbono y heteroátomos , es decir, heterociclos tal como una pirimidina o quinazolina. Aunque las moléculas pequeñas pueden tener cualquier peso molecular, incluyen en general moléculas que son de menos de aproximadamente 5,000 daltones. Por ejemplo, estas moléculas pequeñas pueden se menores de aproximadamente 1000 daltones y de manera preferente, son de menos de aproximadamente 750 daltones o de manera más preferente, son de menos de aproximadamente 500 daltones. Las moléculas pequeñas y otros antagonistas no peptídicos de Cadherina-11 se pueden encontrar en la naturaleza (por ejemplo, identificar, aislar, purificar) y/o producir de forma sintética (por ejemplo, por síntesis orgánica tradicional, síntesis bio-mediadas, o una combinación de esto) . Ver, por ejemplo Ganesan, Drug Discov.
Today 7 (1) : 47-55 (Enero 2002) ; Lou, Drug Discov. Today, 6(24): 1288-1294 (Diciembre de 2001). Los ejemplos de moléculas pequeñas que se presentan de forma natural incluyen, pero no se limitan a, hormonas, neurotransmisores, nucleótidos, aminoácidos, azúcares, lípidos, y sus derivados.
Un antagonistas de Cadherina-11 de molécula pequeña de acuerdo a la presente invención, y sales fisiológicamente aceptables del mismo, puede inhibir la unión homotípica de una proteína Cadherina-11 (por ejemplo, al competir directamente con una secuencia donadora en el dominio ECl de una proteína Cad-11 para la unión de la cavidad de unión de otra Cadherina-11, al competir directamente con la cavidad de unión en el dominio ECl de una proteína Cad-11 para la unión de una secuencia donadora de otra Cadherina-11) .
Antagonistas de Ácido Nucleico Los antagonistas de Cad-11 de la invención también pueden ser moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótidps) que se unen al dominio EC1 de una Cadherina-11 humana. Los antagonistas adecuados de Cad-11 de ácido nucleico incluyen aptámeros que son capaces de unirse a una molécula particular de interés (por ejemplo, el dominio EC1 de Cadherina-11 humana) con alta afinidad y especificidad a través de interacciones diferentes del clásico apareamiento de bases de Watson-Crick (Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990); Ellington y Szostak, Nature 346:818 (1990)).
Los aptámeros, como los péptidos generados por visualización en fagos o anticuerpos monoclonales ( Ab) , son capaces de la unión específica a objetivos seleccionados, y a través de la unión, bloquean la capacidad para funcionar de sus objetivo. Creados por un proceso de selección in vitro de mezclas de oligonucleótidos de secuencias aleatorias, los aptámeros se han generado para más de 100 proteínas incluyendo factores de crecimiento, factores de transcripción, enzimas, inmunoglobulinas , y receptores. Un aptámero típico es de 10-15 kDa de tamaño (30-45 nucleótidos) , se une a su objetivo con afinidad sub-nanomolar, y discrimina contra objetivos cercanamente relacionados (por ejemplo, no se unirá típicamente a otras proteínas de la misma familia génica) . Una serie de estudios estructurales ha mostrado que los aptámeros son capaces de usar los mismos tipos de interacciones de unión (unión por hidrógeno, complementariedad electrostática, contactos hidrófobos, exclusión estérica, etc.) que activan la afinidad y especificidad en los complejos de anticuerpo-antígeno .
Un aptámero que se une a un objetivo de interés (por ejemplo, un dominio ECl de una proteína Cad-11 humana) se puede generar e identificar usando un proceso normal conocido como "Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial" (SELEX, por sus siglas en inglés) , descrito por ejemplo en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,475,096 y No. 5,270,163.
Identificación de Antagonistas de Cadherina-11 Se pueden identificar agentes que tienen especificidad de unión a Cadherina-11, incluyendo moléculas pequeñas, en un examen, por ejemplo, un examen de alto rendimiento de compuestos químicos y/o bibliotecas (por ejemplo, bibliotecas químicas, peptídicas y de ácidos nucleicos) .
Los anticuerpos que se unen de manera específica al dominio ECl de Cadherina-11 humana se pueden identificar, por ejemplo, al examinar bibliotecas combinatorias de anticuerpos comercialmente disponibles (Dyax Corp., MorphoSys AG) . Las bibliotecas combinatorias de anticuerpos, adecuadas y los métodos normales para examinar estas bibliotecas se describen en Hoet et al., iVature Biotechnology 23 (3) : 344-348 (2005) y Rauchenberger e al., J. Biol. Chem. 278 (40) : 38194-38205 (2003) , los contenidos de lo cual se incorpora en la presente como referencia. Estas bibliotecas o colecciones de moléculas también se pueden preparar usando métodos químicos bien conocidos .
De manera alternativa, se pueden identificar anticuerpos murinos que se unen de manera específica al dominio ECl de Cadherina-11 humana, por ejemplo, al inmunizar ratones con dominios ECl de proteína o péptidos ECl junto con un adyuvante para romper la tolerancia al antígeno. Estos anticuerpos se pueden examinar para la especificidad y actividad deseadas y luego se humanizan usando técnicas conocidas para crear agentes adecuados para él tratamiento de enfermedad humana.
Los compuestos o moléculas pequeñas se pueden identificar de- numerosas bibliotecas disponibles de compuestos químicos de, por ejemplo, el Chemical Repository of the National Cáncer Institute y las Molecular. Librarles Small Molecules Repository (PubChem) , así como bibliotecas del Institute of Chemistry and Cell Biology en la Universidad de Harvard y otras bibliotecas que están disponibles de fuentes comerciales (por ejemplo, Chembridge, Peakdale, CEREP, MayBridge, Bionet) . Estas bibliotecas o colecciones de moléculas también se pueden preparar usando métodos químicos bien conocidos, tal como métodos bien conocidos de química combinatoria. Las bibliotecas se pueden examinar para identificar compuestos que se unen e inhiben Cadherina-11.
Los compuestos identificados pueden servir como compuestos guía para diversificación adicional usando métodos bien conocidos de química medicinal. Por ejemplo, se puede preparar una colección de compuestos que son variantes estructurales de la guía y se examinan para la actividad inhibitoria y/o de unión a Cadherina-11. Esto puede dar por resultado el desarrollo de una relación estructura-actividad que enlaza la estructura de los compuestos a la actividad biológica. Los compuestos que tienen actividad inhibitoria y de unión adecuada se pueden desarrollar para uso in vivo.
Los agentes que se unen a Cadherina-11 se pueden evaluar para la actividad antagonista de Cadherina-11. Por ejemplo, se puede usar una composición que comprende una proteína de Cadherina-11 en un ensayo de examen o de unión para detectar y/o identificar agentes que se unen y antagonizan la proteína de Cadherina-11. Las composiciones adecuadas para el uso incluyen, por ejemplo, células que expresan de manera natural una proteína de Cadherina-11 (por ejemplo, un sinoviocito) , extractos de estas células, y proteína Cadherina-11 recombinante .
Un agente que se une a una proteína Cadherina-11 se puede identificar en un ensayo de unión competitiva, por ejemplo, en el cual se valora la capacidad de un agente de prueba para inhibir la unión de Cadherina-11 a un agente de referencia. El agente de referencia puede se proteína Cad-11 de longitud completa o una porción de la misma que comprende el dominio EC1. El agente de referencia se puede marcar mediante una marca adecuada (por ejemplo, radioisótopo, marca de epítopo, marca de afinidad (por ejemplo, biotina y avidina o estreptavidina) , marca giratoria, enzima, grupo fluorescente, grupo quimioluminiscente, tinte, metal (por ejemplo, oro, plata) , cuenta magnética) y se puede determinar la cantidad de agente de referencia marcado requerida para saturar la proteína de Cadherina-11 en el ensayo. La especificidad de la formación del complejo entre la proteína de Cadherina-11. y el agente de prueba se puede determinar usando un control adecuado (por ejemplo, agente no marcado, marca sola) .
La capacidad de un agente de prueba para inhibir la formación de un complejo entre el agente de referencia y una proteína Cadherina-11 se puede determinar como la concentración de agente de prueba requerida para la inhibición de 50 % (valor IC50) de unión específica del agente de referencia marcado. La unión específica se define preferentemente como la unión total (por ejemplo, marca total en el complejo) menos la unión no específica. La unión no específica se define de manera preferente como la cantidad de marca aún detectada en complejos formados en la presencia de agente de referencia, no marcado, en exceso. Los agentes de referencia adecuados para el uso en el método 'incluyen moléculas y compuestos que se unen de manera específica a Cadherina-11, por ejemplo, un anticuerpo que se une a Cadherina-11.
Un agente que antagoniza una proteína de Cadherina-11 se puede identificar al examinar agentes que tienen la capacidad para antagonizar (reducir, prevenir, inhibir) una o más actividades de Cadherina-11, tal como, por ejemplo, una actividad de unión (por ejemplo, unión homotípica a Cad-11) . Estas actividades se pueden valorar usando un ensayo in vitro o in vivo apropiado. Los ensayos de ejemplo para la actividad de Cadherina-11 se han descrito previamente (Patel, SD, et al., Cell 124:1255-1268 (2006); Lee et al., Science 315:1006-1010 (2007) ) .
Una vez que se identifica un antagonista de Cadherina-11, se puede valorar la capacidad del antagonistas de Cadherina-11 para interferir con (por ejemplo, reducir, inhibir, prevenir) una o más funciones o propiedades biológicas asociadas con. la actividad de Cadherina-11 en una célula, por ejemplo, usando un ensayo basado en células diseñado para medir una propiedad o función biológica particular asociadas con Cadherina-11. Las funciones y propiedades biológicas que se conoce que están asociadas con la expresión y/o actividad de Cadherina-11 incluyen, pero no se limitan a, adhesión celular, migración celular, invasión celular, clasificación celular, condensación celular, rearreglo celular, mantenimiento de integridad y arquitectura de tejido, inhibición de contacto de proliferación celular y transformación maligna de células de cáncer (por ejemplo, tumorales) (Kiener y Brenner, Arthritis Res Ther. 7(2):49-54 (2005)). Además, se muestra en la presente que los antagonistas de Cad-11 inhiben la producción de MMP activos por sinoviocitos . Los ensayos adecuados para valorar una ó más funciones biológicas de Cadherinas se conocen por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Patel, SD, et al., Cell 124:1255-1268 (2006)) e incluyen, por ejemplo, el ensayo de agregación celular descrito en la presente (ver Ej emplificación, sección de Materiales y Métodos) .
Métodos de Terapia Sin que se desee que se una a ninguna teoría, se cree que los aproximadamente primeros 35 aminoácidos (por ejemplo, de aproximadamente 33 a aproximadamente 37 aminoácidos) del dominio EC1 de Cad-11 se requieren para unión homotípica de Cadherina y que agente que se unen de manera específica a esta región de Cad-11 pueden inhibir de manera efectiva la unión entre moléculas de Cad-11. Por consiguiente, estos agentes son útiles en el tratamiento y prevención de trastornos (por ejemplo, trastornos inflamatorios, fibrosis, cáncer) asociados con expresión o actividad de Cad-11 en células (por ejemplo, sinoviocitos) . De esta manera, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para tratar un trastorno mediado por Cadherina-ll en un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Cadherina-ll que se une a un péptido de dominio EC1 de Cadherina-ll humana (SEQ ID NO: 3) .
Como se usa en la presente, un "trastorno mediado por Cadherina-ll" se refiere a una enfermedad, trastorno o condición que comprende, o se media (por ejemplo, se provoca por), células que expresan la proteína Cadherina-ll. Los trastornos mediados por Cadherina-ll que se pueden tratar por los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos inflamatorios (por ejemplo, trastornos inflamatorios de articulaciones) , trastornos de fibrosis (por ejemplo, fibrosis dérmica, fibrosis pulmonar) y cáncer.
Usando los métodos de la invención, un trastorno mediado por Cadherina-ll en un mamífero (por ejemplo, un humano) se puede tratar al administrar un antagonista de Cadherina-ll de la invención (por ejemplo, anticuerpos, proteínas de fusión, moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, péptidos, peptidomiméticos) en una cantidad que es suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico, por ejemplo, al inhibir la agregación de células, al inhibir la migración de células, o al inhibir la expresión de proteasas activas o moléculas inflamatorias por células, que expresan Cadherina-11 (por ejemplo, sinoviocitos , fibroblastos, células tumorales) .
Por consiguiente, un aspecto de la invención se refiere a un método para tratar un trastorno inflamatorio en un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Cadherina-11 de la invención. Los trastornos inflamatorios se caracterizan en general por la expresión de moléculas pro-inflamatorias (por ejemplo, citocinas inflamatorias y factores de crecimiento) y la activación de células inmunitarias (por ejemplo, macrófagos, monocitos, linfocitos, células de plasma, leucocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T) . Los trastornos inflamatorios incluyen, por ejemplo, trastornos inflamatorios de articulaciones, enfermedad inflamatoria de intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa), psoriasis, dermatitis (por ejemplo, eccema) , amiloidosis renal, nefritis glomerular, vasculitis, enfermedad inflamatoria pélvica, prostatitis crónica, optalmopatía de Graves. En una modalidad particular, el trastorno inflamatorio es un trastorno autoinmunitario .
En una modalidad particular, la invención se refiere a un método para tratar un trastorno inflamatorio de articulación en un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un Antagonista de Cadherina-11 de la invención. El trastorno inflamatorio de articulación puede ser cualquier trastorno que esté asociado con o caracterizado por expresión de Cadherina-11 en células de una articulación articulada (por ejemplo, sinoviocitos) . Los ejemplos de trastornos inflamatorios de articulaciones que se pueden tratar por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, artritis psori tica, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante, artritis crónica juvenil, enfermedad crónica de Lytne y artritis de articulación asociada con lupus eritematoso sistémico. En un modalidad particular, el trastorno inflamatorio de articulaciones artritis reumatoide.
En otro aspecto, lá invención se refiere a un método para tratar fibrosis en un sujeto' mamífero que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Cadherina-11 de la invención. Como se usa en la presente, el término "fibrosis" se refiere a la formación o desarrollo de tejido conectivo fibroso en exceso en un órgano o tejido como un proceso reactivo o de reparación. Los ejemplos de fibrosis incluyen, pero no se limitan a, fibrosis vascular (por ejemplo, fibrosis vascular asociada con hipertensión pulmonar) , fibrosis de riñon, fibrosis de hígado (por ejemplo, cirrosis) , fibrosis de piel/dérmica (por ejemplo, escleroderma) , fibrosis de pulmón/pulmonar (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática) , mielofibrosis , fibrosis endomiocárdica, fibrosis de la articulación, fibrosis del mesotelio, fibrosis de los ojos, fibrosis del intestino y fibrosis intersticial. En una modalidad particular, la fibrosis es fibrosis pulmonar o de pulmón. En otra modalidad, la fibrosis es fibrosis dérmica o de piel.
Sin que se desee que se una por ninguna teoría particular, se cree que ciertos tipos de células tumorales expresan Cadherina-11, que pueden promover la metástasis tumoral . Por consiguiente, un antagonista de Cad-11 de la invención se puede usar para inhibir la formación de tumores, crecimiento tumoral y/o metástasis tumoral en un sujeto. De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar un cáncer (por ejemplo, un cáncer por células que expresan Cad-11) en un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Cadherina-11 de la invención. Los cánceres que comprenden células que expresan proteína Cad-11 pueden incluir, por ejemplo, leucemia (por ejemplo, AML, CLL, leucemia pro- linfocítica) , cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón de células pequeñas y de células no pequeñas) , cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer colorectal, cáncer de cerebro (por ejemplo, astrocitoma, glioma, glioblastoma, medulloblastoma, meningioma, neuroblastoma) , cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer epitelial, cáncer nasofaringio (por ejemplo, carcinoma de células escamosas oral o laríngeo) , linfoma (por ejemplo, linfoma folicular) , cáncer uterino (por ejemplo, histiocitoma fibroso maligno) , cáncer hepático (por ejemplo, carcinoma hepatocelular) , cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello) , cáncer renal, tumores de células germinales masculinas, mesotelioma maligno, síndrome mielodisplástico, cáncer ovárico, cáncer pancreático biliar, cáncer de próstata, cáncer de tiroides (por ejemplo, tumores esporádicos foliculares de tiroides), y cáncer urotelial.
En un aspecto, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Cadherina-11 a un paciente en necesidad del mismo. La cantidad del antagonista de Cadherina-11 que se va a administrar (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva) se puede determinar por un facultativo usando la guía proporcionada en la presente y otros métodos conocidos en la técnica y es dependiente de varios factores que incluyen, por ejemplo, el agente particular elegido, la edad, sensibilidad, tolerancia a fármacos y bienestar general del sujeto. Por ejemplo, las dosis adecuadas para antagonistas de Cad-11 que son anticuerpos puede ser de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal por tratamiento y de manera preferente de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por tratamiento. Las dosis adecuadas para un antagonista de Cad-11 de molécula pequeña pueden ser de aproximadamente 0.001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal por tratamiento . Las dosis adecuadas para antagonista de Cadherina-11 que son proteínas o péptidos (lineales, cíclicos, miméticos) , dará por resultado una concentración en plasma del péptido de aproximadamente 0.1 pg/mL a aproximadamente 200 g/mL. La determinación de la dosis para un agente particular, paciente y cáncer está bien dentro de las capacidades de un experto en la técnica. De manera preferente, la dosis no provoca, ni produce efectos secundarios adversos mínimos (por ejemplo, respuesta inmunogénica, nausea, mareo, trastorno gástrico, síndromes de hiperviscosidad, falla cardíaca congestiva, ataque, edema pulmonar) .
Una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Cadherina-11 se puede administrar sola, o en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes (por ejemplo, agentes antiinflamatorios, agentes quimioterapéuticos) . Los agentes antiinflamatorios adecuados que son útiles para tratar trastornos inflamatorios de articulaciones, particularmente RA, que se pueden administrar en combinación con antagonistas de Cad-11 de la invención, incluyen, pero no se limitan a, (i) fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAID; por ejemplo, detoprofeno, diclofenaco, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, meclofenameato, ácido mefenámico, meloxicam, nabumeona, naproxeno sódico, oxaprozina, piroxicam, sulindac, tolmetina, celecoxib, rofecoxib, aspirina, salicilato de colina, salsalto, y salicilato de sodio y magnesio) ; (ii) esteroides (por ejemplo, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona) ; (iii) DMARD, es decir, fármacos antireumáticos modificadores de la enfermedad (por ejemplo, ciclosporina, azatioprina, metotréxato, leflunomida, ciclofosfamida, hidroxicloroquina, sulfasalazina, D-pénicilamina, minociclina, y oro) ; o (iv) proteínas recombinantes (por ejemplo, ENBRELR (etanercept, un receptor soluble de TNF) , REMICADEMR (infliximab, un anticuerpo antiTNF 1 monoclonal quimérico) , ORENCIAMR (abatabacept , un receptor soluble de CTLA4 ) , ACTEMRAMR (Tocilizumab, un anticuerpo monoclonal al receptor de IL-6) , y RITUXA MR (rituximab, un anticuerpo monoclonal a CD20) .
De esta manera, se puede administrar un antagonista de Cadherina-11 como parte de una terapia de combinación (por ejemplo, con uno o más agentes terapéuticos diferentes) . El antagonista de Cad-11 se puede administrar antes, después o concurrentemente con uno o más agentes terapéuticos diferentes. En algunas modalidades, el antagonista de Cadherina-11 y otro agente terapéutico se pueden coadministrar simultáneamente (por ejemplo, de forma concurrente) como ya sea formulaciones separadas o como una formulación conjunta. De manera alternativa, los agente se puederi administrar de manera secuencial, como composiciones separadas, dentro de un intervalo apropiado de tiempo como se determine por el facultativo experto (por ejemplo, un tiempo suficiente para permitir un traslape de los efectos farmacéuticos de las terapias) . El antagonista de Cadherina-11 y uno o más agentes terapéuticos diferentes se pueden administrar en una dosis individual o en múltiples dosis, en un orden y un programa adecuado para lograr un efecto terapéutico deseado (por ejemplo, una reducción en y/o inhibición de la inflamación de la articulación) . Las dosis y regímenes adecuados de administración se pueden determinar por un facultativo y son dependientes de los agentes elegidos, de .la formulación farmacéutica y la ruta de administración, de- varios factores del paciente y de otras consideraciones.
La efectividad de una terapia (por ejemplo, la reducción o eliminación de la inflamación de la articulación y/o la prevención o inhibición de la inflamación de la articulación) se. puede determinar por cualquier método adecuado (por ejemplo, formación de imágenes (MRI, N R) ) .
De acuerdo a los métodos de la invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Cad-11 se administra a un sujeto mamífero para tratar un trastorno inflamatorio de articulación. El término "sujeto mamífero" se define en la presente que incluyen mamíferos tal como primates (por ejemplo, humanos) vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, cobayos, ratas, ratones u otra especie bovina, ovina, equina, canina, felina, de roedor y murina .
Los agentes que son antagonistas de Cad-11 se pueden administrar a un sujeto mamífero por una variedad de rutas. Por ejemplo, el agente se puede administrar por cualquier ruta parenteral o no parenteral adecuada, incluyendo, por ejemplo, de forma tópica (por ejemplo, crema, ungüento) , o nasalmente (por ejemplo, solución, suspensión) . La administración parenteral puede incluir, por ejemplo, administración intraarticular, intramuscular, intravenosa, intraventricular, intraárterial , intratecal, subcutánea, o intraperitoneal . El agente también se puede administrar de manera oral (por ejemplo, en cápsulas, suspensiones, tabletas o dieta) , de forma transdérmica, intradérmicamente, tópicamente, por inhalación (por ejemplo, gotas intrabronquiales , intranasal, inhalación oral o gotas intranasales) , de forma transmucosa o rectalmente. La administración puede ser local o sistémica como sea apropiado, y se puede usar más de una ruta concurrentemente, si se desea. La administración localizada de un antagonista de Cad-11 se puede lograr por inyección intraarticular (por ejemplo, inyección directa del agente en una articulación) . El modo preferido de administración puede variar dependiendo del agente particular elegido. Sin embargo, se prefiere en general la administración sistémica, intravenosa o subcutánea para los anticuerpos.
La distribución también puede ser por inyección en una cavidad del cerebro o cuerpo de un paciente o por el uso de sistemas de distribución de matriz de liberación programada o liberación sostenida, o por distribución en el sitio usando micelas, geles y liposomas. Los dispositivos nebulizadores, inhaladores de polvo y soluciones en aerosol son representativos de los métodos que se pueden usar para administrar estas preparaciones al tracto respiratorio. La distribución puede ser in vitro, in vivo, o ex vivo.
Los agentes que son proteínas (por ejemplo, proteína de fusión) se pueden administrar mediante expresión in vivo de protéína ' recombinante . Se puede lograr la expresión in vivo por expresión de células somáticas de acuerdo al métodos adecuados (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,399,346). Adicionalmente, un ácido nucleico que codifique para la proteína también se puede incorporar en vectores retrovirales , adenovirales u otros adecuados (de manera preferente, un vector infeccioso deficiente en la replicación) para distribución, se pueden introducir en una célula hospedadora transfectada o transformada capaz de expresar la proteína para la distribución. En esta última modalidad, las células se pueden implantar (solas o en un dispositivo de barrera) , inyectar o introducir de otro modo en una cantidad efectiva para expresar la proteína en una cantidad terapéuticamente efectiva.
Los antagonistas de Cadherina-11 basados en ácido nucleico (por ejemplo, aptámeros) se pueden introducir en un sujeto mamífero de interés de varias maneras. Por ejemplo, si se pueden expresar ácidos nucleicos de manera endógena de vectores de expresión o productos de PCR en células hospedadoras o envasar en composiciones sistémicas o manejadas (por ejemplo, liposomas, polímeros, nanopartículas) que entonces se pueden introducir directamente en la corriente sanguínea de un sujeto mamífero (por ejemplo, por inyección, infusión) . Los vectores dé expresión de ácido nucleico o los ácidos ' nucleicos AntiCadherina-11 (por ejemplo, vectores retrovirales, adenovirales, adeno-asociados y virales de herpes simplex, vectores manejados, vectores no viralmente mediados) también se pueden introducir en un sujeto mamífero usando directamente estrategias y protocolos de terapia génica, establecidos (ver por ejemplo, Tochilin V.P. Annu Rev BiomedEng 8:343-375, 2006; Recombinant DNA and Gene Transfer, Office of Biotechnology Activities, National Institutes of Health Guidelines) .
Los agentes que son antagonistas de Cadherina-11 (por ejemplo, moléculas pequeñas) se pueden administrar a un sujeto mamífero como parte de una composición farmacéutica o fisiológica, por ejemplo, como parte de una composición farmacéutica que comprende un antagonista de Cadherina-11 y un portador farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones o composiciones que comprenden un antagonista de Cadherina-11 o las composiciones que comprenden un antagonista de Cadherina-11 y uno o más agentes terapéuticos diferentes (por ejemplo, un agente antiinflamatorio) variarán de acuerdo a la ruta de administración seleccionada (por ejemplo, solución, emulsión o cápsula) . Los portadores farmacéuticos adecuados pueden contener ingredientes inertes que no interactúan con el antagonista de Cadherina-11. Se pueden emplear técnicas de formulación farmacéutica normales, tal como aquellas descritas en Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eas on, PA. Los portadores armacéuticos adecuados para administración parenteral incluyen, por ejemplo, agua estéril, solución salina fisiológica, solución salina bacterioestática (solución salina que contiene aproximadamente- 0.9 % mg/ml de alcohol bencílico), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Hank, lactato de Ringer y similares. Las formulaciones también pueden incluir pequeñas cantidades de sustancias que mejoran la efectividad del ingrediente activo (por ejemplo, agentes emulsionadores , agentes solubilizadores , agentes amortiguadores de pH, agentes humectadores) . En la técnica se conocen métodos de encapsulación de composiciones (tal como en un revestimiento de gelatina dura o ciclodextrano) . Para inhalación, el agente se puede solubilizar y cargar en un dispensador adecuado para administración (por ejemplo, un atomizador o nebulizador o dispensador en aerosol presurizado) .
El agente farmacéutico se puede administrar como un componente neutral o como una sal o éster. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tal como aquellas derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico o tartárico, y aquellas formadas con grupos carboxilo libres tal como aquellas derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol , histidina, procaína, etc. 'Las sales de compuestos que contienen una amina u otro grupo básico se pueden obtener, por ejemplo, al reaccionar con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, tal como, cloruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno, ácido .acético, ácido perclórico y similares. Los compuestos con un grupo amonio cuaternario también contienen un contraión tal como cloruro, bromuro, yoduro, acetato, perclorato y similares. Las sales de compuestos que contienen un ácido carboxílieo u otro grupo funcional ácido se pueden preparar por reacción con una base adecuada, por ejemplo, una base de hidróxido. Las sales de grupos funcionales ácidos contienen un contracatión tal como sodio o potasio.
La presente invención ahora se ejemplificará por los siguientes ejemplos, que no se proponen que sean limitantes de ninguna manera.
Ej emplificación Ejemplo 1: Identificación de Fab que tienen especificidad de unión para un epitopo dentro de los 35 aminoácidos N-terminales del dominio EC1 de Cadherina-11 humana Materiales y Métodos Transferencia Western Se separaron proteínas por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (NC) usando métodos normales. Brevemente, se enjuaga la membrana de NC con solución salina amortiguada con Tris-tween (TBST) (8.8 g/L de NaCl, 0.2g/L de KC1, 3g/L de base Tris, 500ul/L de Tween-20, pH a 7.4) . La membrana se bloqueó con BSA al 4 % disuelto en TBST durante una hora a 22°C. La membrana de NC se enjuagó 3X durante 5 minutos cada uno con TBST. Se diluyó anticuerpo antiCad-11 humana de ratón a 0.5 µg/ml en TBST y la NC se incubó durante 1 hora a 22 °C. La membrana de NG se enjuagó 3X durante 5 minutos cada uno en TBST. El anticuerpo antilg de ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) se diluyó a 1 g/ml en TBST y la membrana de NC se incubó en solución secundaria durante un tiempo mínimo de 1 hora a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés) a 22 °C. La membrana de NC se enjuagó 3X durante 5 min cada uno en TBST. La señal se reveló usando método normal de HRP.
ELISA El antígeno (ya sea 5 g/ml o 50 pg de Cad-11-EC-l-Fc o 5 pg/ral péptido de Cadherina) se diluyó en un amortiguador y se usó para revestir placas durante la noche durante 4°C. Las placas se lavaron y luego se bloquearon con BSA al 1.5 %, polvo de leche baja en grasa al 5 % en amortiguador de dilución PBS : BSA al 1.5 %, polvo de leche baja en grada al 2.5 %, Tween-20 al 0.1 % en PBS. Las placas entonces se incubaron con lisado bacteriano que contiene los fAb antiCad-11 humana o los fAb antiCad-11 humana purificados durante 1 hora. Después del lavado, el anticuerpo secundario (a-hu-Fab conjugado a Cy5 diluido 1/100) se aplicó durante 25 minuto. Las placas entonces se lavaron y se leyó la fluorescencia resultante.
Resultados Tres conjuntos de anticuerpos específicos de Cadherina-11 previamente reportados se probaron para la capacidad para unirse al dominio ECl de Cadherina-11 humana. Estos anticuerpos incluyeron anticuerpo que se formularon contra un inmunógeno de proteína de fusión Cadherina-ll-Fc de ratón en ratones deficientes o con supresión de Cadherina-11 (Lee et al., Science 315:1006-1010 (2007)), anticuerpos que se formularon en ratones tipo silvestre de Cadherina-11 ' contra un inmunógeno de proteína -de fusión Cadherina-ll-Fc de humano que se ha producido en células CHO (Valencia et al., J". Exp. Med. 200 (12) : 1673-1679 (2004)), y anticuerpos que se formularon en ratones tipo silvestre de Cadherina-11 contra una proteína producida bacterianamente que contiene los dominios EC1-3 de Cadherina-11 humana. Estos anticuerpos se probaron por análisis western para la capacidad para unirse a proteína de fusión que contuvieron solo el dominio ECl de Cad-11 humana (Cadherina-ll-ECl-Fc) , los dominios ECl y EC2 de Cad-11 (Cad-ll-ECl/2-Fc) o los 5 dominios EC de Cad-11 (Cadherina-ll-ECl-5-Fc) . Ninguno de los anticuerpos probador reconoció las proteínas de fusión ECl-Fc o ECl-2-Fc en la transferencia Western (Figura 1A) . Sin embargo, los anticuerpos de cada uno de los tres conjuntos probador reconoció la proteína de fusión Cad-ll-Fc humana que incluyó los dominios 1 hasta 5 extracelulares (Figura IB) . Estos resultados indican que los anticuerpos probados no se unen a los dominios ECl o EC2 de Cad-11 humana, pero reconocieron epítopos de otro modo en la región . extracelular de esta proteína.
Los anticuerpos antiCad-11 publicados disponibles que se unen a células que expresan Cad-11, 13C2, 23C6, 5F82 (Lifespan Science) y 283416 (R&D Systems) , asi como el anticuerpo H1M1 que se une a ECl de Cad-11, y el anticuerpo de control, MOPC, se probaron por ELISA para la capacidad para unirse a proteínas de fusión que contuvieron sólo el dominio ECl de Cad-11 humana (Cadherina-ll-ECl-Fc) o los 5 dominios EC de Cad-11 (Cadherina-ll-ECl-5-Fc) . Ninguno de los anticuerpos antiCad-11 publicados disponibles probados reconoció ECl-Fc (Figura IB, barras abiertas) (datos para 283416 no se muestra aquí) . Sin embargo, el anticuerpo H1M1 de unión a ECl de Cad-11 se unió tanto a Cadherina-ll-ECl-Fc como a Cadherina-ll-ECl-5-Fc (Figura IB, barras cerradas) . El anticuerpo de control MOPC no se unió a ninguna proteína de fusión. Estos resultados indican que los anticuerpos antiCad-11 publicados disponibles no se unen al dominio ECl de Cad-11 humana, pero reconocen epítopos donde quiera en la región extracelular de la proteína.
Para crear un anticuerpo específico de un epítopo dentro de los 35 aminoácidos N-terminales del dominio ECl de Cadherina-11 humana, se examinó una biblioteca de visualización en fago (MorphoSys AG) que codifica para los Fab humanos. Los Fab candidatos se identificaron usando dos criterios de selección. - una selección positiva para la unión a un péptido que incluyó los primeros 35 aminoácidos del dominio ECl de Cadherina-11 humana, y una selección negativa para la unión a péptidos correspondientes de los dominios ECl de dos Cadherinas cercanamente relacionadas y altamente homologas, Cadherina-8 y MN-Cadherina (Figura 2) . Se usó ELISA para probar la unión.
Se llevaron a cabo dos exámenes. En el primer examen, 96 clones de Fab que se unieron al péptido de ECl de Cadherina-11 se identificaron por ELISA. Siete (7) Fab candidatos se unieron al péptido EC-1 de cad-11; sin embargo, sólo dos de estos se unieron tanto al péptido EC-1 como a la proteína de fusión ECl-2-Fc. Uno de estos dos Fab también se unió al péptido MN-Cad. Por consiguiente, sólo uno de los siete clones de Fab se unió específicamente a la proteína de fusión ECl-Fc, pero no se une a los péptidos de dominio ECl de Cadherina-8 y de MN-Cad. En un segundo examen, se observaron resultados similares, puesto que sólo uno de 96 Fab (clon F9) que muestra especificidad para el péptido ECl de Cadherina-11 y la proteína de fusión ECl-2-Fc, falló en unirse a los péptidos de dominio ECl de Cadherina-8 y de MN-Cad (Figura 3) . La mayoría de los Fab que se unen al dominio ECl de Cad-11 probados mostraron reactividad cruzada con el péptido de MN-Cad, que contiene unan secuencia EEY CAR que se traslapa con la secuencia EEY CAR de Cad-11.
Ejemplo 2: Un Fab que se Une al Dominio EC1 de Cadherina-11 Inhibe la Relación Celular Mediada por Cad-11 en un Ensayo in vitro Materiales y Métodos Ensayo de agregación de Cadherina-11 In vitro Células 431-D crecen en suspensión y no expresan normalmente ninguna Cadherina ni se agregan. Las células 431-D-ll se han modificado genéticamente para expresar Cad-11. Cuando las células 431-D-ll se incuban en medio solo y empiezan a agregarse durante 40 minutos y los gromulos de las células se asientan en el fondo de la concavidad y las células no agregadas restantes en suspensión se pueden medir y se calcula el porcentaje de 431-D-ll agregadas. Para el ensayo de agregación, se cultivaron células 431-D-ll (células D-ll) a sub-confluencia en un matraz y luego se removieron del matraz usando Tripsina al 0.05 % más EDTA 0.53 mM. Aproximadamente se adicionaron 2 x 106 células 431-D-ll a 2 mi de medio SME (Eagle Modificado de Dulbécco, de alto contenido de glucosa, Hepes 0.1M pH 7.4 y ADNsa 5U/ml) y se preincubaron durante 15 minutos en hielo, ya sea en la ausencia o presencia de un agente de prueba (por ejemplo, anticuerpo, Fab, proteína de fusión) . Después de la pre-incubación con el agente de prueba, las células se transfirieron a una concavidad de fondo redondo en una placa de 24 concavidades y se incubaron a 37°C en tanto que giran a 130 rpm en un agitador giratorio. Conforme las células se agregan, se asientan en el fondo de la concavidad. A 0 minutos y a 40 min, se removieron 200 µ? de la parte media de la muestra de la concavidad y se mezclaron con 25 µ? de glutaraldehxdo al 8 % para fijar las células. Se adicionaron 200 µ? de la muestra fijada de las células a 9.8 mi de solución salina isotónica de Contador Coulter y se contaron usando un Contador Coulter ajustado en el umbral de 8 µp? a 24 µ??. Se registraron 3 cuentas celulares por muestra. El porcentaje de disminución célula o de células agregadas a 40 minutos en comparación al porcentaje al punto de tiempo a 0 minutos se calculó.
Resultados Un Fab candidato (clon F9) que. tiene especificidad de unión para un epítopo dentro de los 35 aminoácidos N-terminales del dominio EC1 de Cadherina-11 , que no se une a los dominios EC1 de MN-Cad o Cad- 8, se probó para la capacidad para inhibir la agregación celular mediada por Cad-11 usando un ensayo de agregación celular in vitro de Cadherina-11. El Fab candidato inhibió significativamente la agregación de células mediada ¦ por Cadherina-11 a concentraciones de 1 g/ml o menores (Figuras 4 y 5) . En contraste, un Fab elaborado del anticuerpo 13C2 que se une a un epítopo en la región extracelular de Cad-11 fuera de los dominios ECl/2 inhibió la agregación de Cadherina-11 sólo a una concentración de 10 g/ml, sugiriendo que el Fab F9 inhibe la actividad de Cad-11 más efectivamente a menores concentraciones que los anticuerpos que se unen a otras porciones del dominio extracelular de Cad-11.
La agregación celular mediada por Cad-11 también se inhibió por varios Fab antidominio ECl de Cadherina-11 que fueron específicos ya sea para Cad-11 sola, Cad-11 y Cad-8, cad-11 y MN-Cad, o Cad-11, Cad-8 y MN-Cad (Figuras 6 y 7) . Todos los Fab específicos del dominio ECl de Cadherina que se probaron e inhibieron la agregación celular in vitro con relación a las muestras de control (por ejemplo, medio SME (Figura 6) , un Fab específico para GFP (Figura 7).
Ejemplo 3: Generación de proteínas de fusión de Cadherina-11/inmunoglobulina que contienen el dominio ECl de Cadherina-11 humana La región ECl de Cadherina-11 se preparó de un vector que codifica para el ADNc de Cadherina-11 humana de longitud completa (Cad-11 humana clonada en los sitios Notl y Kpn-1 del vector Invitrogen pCEP4MR) usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) realizada bajo condiciones normales usando los siguiente cebadores de oligonucleótido para introducir los sitios EcoRl y BglII (ver secuencia subrayadas en cebadores directo o inverso, respectivamente) en el producto amplificado: Cebador Directo: tttttttttgaattcatgaaggagaactactgtttac aagc (SEQ ID NO: 8) EcoRl .
Cebador Inverso Primer: tttttttttagatctctggaccttgacaatgaattccgacgg (SEQ ID NO: 9) Bglii El producto amplificado se digirió con las enzimas de restricción EcoRl y Bglll, y el producto de digestión se aisló y ligo en el vector pFUSE-hIgG2el-Fcl (InvivoGen) usando los sitios EcoRl y Bglll correspondientes. Se transformaron bacterias competentes TOP10 (Invitrogen) como se describe por el fabricante con el producto de ligación y bacterias con el plásmido Cadherinaa-ll-ECl-Fc se seleccionaron .con zeomicina. Se aisló el plásmido Cadherina-ll-ECl-Fc, se secuenció y luego se usó para transfectar transcientemente células 293F. se recolectó el medio condicionado y la proteina de fusión Cadherina-ll-ECl-Fc (SEQ ID NO: 9) se purificó usando filtración de flujo tangencial seguido por aislamiento en una columna de mezcla de proteína A/proteína G 50/50 puesta en equilibrio en HEPES 20 mM pH 7.4, NaCl 137mM, KCl 3mM y CaC12 lmM. La proteína de fusión Cadherina-ll-ECl-Fc purificada se eluyó de la columna usando Glicina 0.1 M (pH 3) y CaCl2 1 mM tubos que contienen 200 µ? de Tris 1M pH 7.4, y CaCl2 lmM. Los productos eluidos con la proteína de fusión de Cad-11 entonces se dializaron usando Hepes 20 mM (pH 7.4), NaCl 137 mM, KCl 3 mM y CaCl2 1 mM. El tamaño de la proteína se confirmó por SDS-PAGE (Figura 10) y se confirmó la identidad por análisis Western usando un anticuerpo que reconoce la región Fe humana (Figura 11) y la secuenciación N-terminal (no mostrada). Se produjo Cad-11-ECl-2-Fc usando técnicas y condiciones similares a aquellas descritas anteriormente.
Ejemplo 4: Una proteína de fusión de inmunoglobulina Cad-11-ECl-Fc inhibe la agregación celular mediada por Cad-11 en un ensayo in vi tro Materiales y Métodos Invasión/migración celular en un tapón de matrigel Se valoró la actividad migratoria de sinoviocitos tipo fibroblasto (FLS, por sus siglas en inglés) en' transconcavidades revestidas con Matrigel ECM en medio de FLS (medio Eagle Modificado de Dulbecco de alto contenido de glucosa [Sigma #D7777] , Suero Bovino Fetal al 10% [Benchmark #100-106] , 1% de Pencilina-Estreptomicina [Gibco 315140-122] , 1% de L-Glutamina [Gibco #25030], 0.5% de Gentamicina [Gibco #15710-064] . Las suspensiones de células FLS humanas en el medio de FLS que contienen lxlO4 células se adicionaron a la inserción de control o a la inserción revestida con matrigel colocada en la concavidad de una placa de 24 concavidades que contiene 0.750 mL del medio de FLS. Las placas entonces se incubaron en una incubadora humidificada de cultivo de tejido a 37°C, atmósfera de 5% de C02 durante 22 horas.
Para calcular el número de células que migraron, se removieron las células no invasoras de la superficie superior de la membrana de las inserciones de control al enjuagar con un algodón. Se repitió una segunda limpieza usando un algodón humectado con medio de FLS . Entonces se. fijaron las inserciones de control y se tiñeron usando un equipo de tinción diferencial [Fisher #122-911] . Las inserciones se dejaron secar y las células se contaron en 4 cuadrantes de la inserción de control usando un microscopio con un objetivo lOx. Se contaron inserciones en triplicado y se promediaron los totales.
Para calcular el número de células que invadieron las inserciones de matrigel, se removieron solamente las células no invasoras de la superficie de la inserción de matrigel al limpiar o enjuagar con un algodón. Se repitió una segunda limpieza usando un algodón humectado con medio de FLS. Las inserciones entonces se fijaron y se tiñeron usando un equipo de tinción diferencial [Fisher #122-911] . Las inserciones se dejaron secar y las células sé juntaron en cuatro cuadrantes de la inserción de control usando un microscopio con un objetivo lOx. Las inserciones de triplicado se contaron y se promediaron los totales.
Resultados Cad-ll-ECl-Fc inhibió significativamente la agregación celular a una concentración de 3 pg/ml, en tanto que la proteína Cad-ll-ECl-5-Fc de longitud completa que contiene los 5 dominios EC de Cad-11 humana inhibió la agregación mediada por Cad-11 a una concentración de 100 pg/ml (Figura 13) . Estos datos muestran que la proteína de fusión de inmunoglobuina Cad-ll-ECl-Fe inhibe efectivamente la agregación celular mediada por Cad-11 en un ensayo in vitro.
Además, se probó in vitro la capacidad de l proteína de fusión de inmunoglobulina de Cad-ll-ECl-Fc para inhibir la invasión de sinovios tipo fibroblasto (FLS, por sus siglas en inglés) humanos en un tapón de matrigel. La invasión de los FLS en el matrigel es un proceso complejo que comprende la expresión de complex process that involves the expression MMP1, MMP-3, MMP-13, serina-protesas y otras proteínas por los FLS para degradar el matrigel así como la migración de los FLS en matrigel . En un ensayo separado no se vio¦ inhibición de la migración de los FLS a través de una inserción de fibras normales. Esto sugiere el impacto de EC-Fc o 13C2 mAb es para inhibir la degradación del matrigel (un sustituto para cartílago de articulación) . Tanto la Cad-ll-ECl-Fc como mAb 13C2 antiCad-11 murino inhibieron la invasión de FLS en un tapón de matrigel en dos experimentos independientes .
Ejemplo 5: Generación de anticuerpos contra un péptido de dominio EC1 de Cadherina-11 humana Materiales y Métodos Se inmunizaron bisemanalmente ratones Balb/c en la almohadilla del pie nueve veces durante un período de un mes con 0.01 mg de un péptido que corresponde a los primeros 33 aminoácidos del dominio EC1 de Cad-11 humana (GWVWN QFFVI EEYTG PDPVL VGRLH SDIDS GDG (SEQ ID N0:10)), covalentemente enlazados a BSA. Este péptido se refiere en la presente como péptido 4. Los vasos de los ratones inmunizados se recolectaron y fusionaron con un compañero de fusión murino P3X63-Ag8.653 , para crear hibridomas productores de anticuerpo. Los hibridomas se expandieron y subclonaron a ya sea. 10, 3 o 0.5 células/concavidad, y los medios que contienen anticuerpo antiCad-11 de los hibridomas se examinaron en un ELISA para la capacidad par a unirse específicamente a la proteína que contiene el dominio ECl-2 de Cad-11 producida en la bacteria. El medio que contiene anticuerpo antiCad-11 de estos cuatro hibridomas peptídicos se examinó concurrentemente para la ausencia de unión a proteínas que abarcan los dominios ECl-2 de Cad-8 humana y MN-Cadherina . Se revistieron durante la noche placas EIA de 96 concavidades a 4°C con 0.05 mi de 0.0 a 0.3 mg/ml de cada una de las proteínas Cad de ECl-2 y luego se lavaron varias veces con amortiguador de solución salina. Las placas entonces se bloquearon con 0.25 mi de amortiguador de caseína-PBS y se lavaron varias veces con amortiguador de solución salina. El medio de hibridoma que contiene el anticuerpo antiCAD-11 se incubó puro en cada concavidad durante 1 hora a 22°C y luego se lavó dos veces con PBS-Tweeri (0.05%). 100 µ? de una dilución 1/1000 de un anticuerpo secundario antilgG de ratón, de cabra, se adicionaron a cada concavidad, se incubaron durante 30 minutos a 22°C, y luego se lavaron dos veces con PBS-Tween (0.05%) . A cada concavidad se adicionaron 100 µ?/concavidad de reactivo TMB (3, 3', 5, 5 ' -tetrametilbenzidina) a temperatura ambiente y se dejó desarrollar el color durante 5 minutos a 22 °C. La reacción se detuvo con 100 µ? de ácido sulfúrico 2N a temperatura ambiente y la placa se eluyó a 450 nm en un lector de microplaca allac 1420.
Se probó la especificidad de los anticuerpos HlMl y H14 antiCad-11 adicionalmente usando un ELISA contra los primeros 33. aminoácidos de los dominios EC1 de Cad-11, Cad-7, Cad-8, Cad-20, Cad-24, Cad-9,, Cad-18, y MN-Cad. Los péptidos que corresponden a la región de Cad-7, Cad-8, Cad-20, Cad-24, Cad-9, Cad-18, MN-Cad que se traslapó con la región G1-G33 del dominio EC1 de Cad-11 se sintetizaron y conjugaron a biotina. 100 µ? de una solución a 30 ng/ml de cada uno de estos péptidos en PBS-Tween (0.05%) se incubaron en cada concavidad de una placa Netravidin de a 96 concavidades durante 2-3 horas a 4°C y luego se lavaron dos veces con PBS-Tween (0.05%). En cada concavidad durante 1 hora a 22°C se incubaron varias concentraciones del anticuerpo antiCad-11 y luego se lavaron dos veces con PBS-Tween (0.05%) . A cada concavidad se adicionaron 100 µ? de una dilución 1/1000 de anticuerpos secundario antilgG de ratón, de cabra, se incubó durante 30 minutos a 22 °C, y luego se lavó dos veces con PBS-Tween (0.05%). A cada concavidad se adicionaron 100 µ?/concavidad de reactivo TMB (3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina) a temperatura ambiente y se dejó desarrollar el color durante 5 minutos a 22 °C. La reacción se detuvo con 100 µ? de ácido sulfúrico 2N a temperatura ambiente y la placa se leyó a 450 nm en un lector de microplaca Wallac 1420.
Los medios de las concavidades que contienen hibridomas positivos de anticuerpo antiCad-11 se probaron para la capacidad para unirse a células que expresan Cad-11. Se descongelaron células 431D congeladas que expresan Cad-11 y se lavaron dos veces en- solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, por sus siglas en inglés) que contiene Ca2+ (NaCl 0.137 M, KC1 5.4 mM, Na2HPQ4 0.25 mM, KH2P04 0.44 mM, CaCh 1.3 mM, MgS04 1.0 mM y NaHCO 4.2 mM) y luego se resuspendió en 106 células/ml en HBSS que contiene Ca2+. Se tiñeron 105 células/concavidad con ya sea un medio de anticuerpo antiCad-11 al 50% o 16% durante 45 minutos en hielo, se lavó dos veces en HBSS que contiene Ca+, se tiñó con un anticuerpo secundario antilgG de ratón, de cabra conjugado con fitoeriterina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a una concentración de 1% durante 45 min en hielo y luego se lavó nuevamente dos veces en HBSS que contiene Ca2+. Las células entonces se resuspendieron en 400 µ? de HBSS que contiene Ca2+ y 1% de formaldehído y se analizaron subsiguientemente en un FACScálibur (Becton 25 Dickenson, Franklin Lakes, NJ) para células positivas a PE.
Resultados Medios que contienen anticuerpo antiCad-11 de los 4 hibridomas peptídicos se unieron a la proteína ECl-2. de Cad-11 (Figura 16, HL vs Cad-11), pero no a las proteínas que contienen los dominios ECl-2 de Cad-8 y MN-Cad (Figura 16, HL vs Cad8 y HL 30 vs MNCad, respectivamente) . Los medios de hibridp a de control no se unieron a ninguna de las proteínas Cadherinas probadas (Figura 16, Media vs Cad-11, Media vs Cad8, y Media vs MNCad). Estos datos demuestran la presencia de anticuerpos específicos a Cad-11 al péptido 4 en los hibridomas .
Dos hibridomas del péptido 4, referidos en la presente como H1M1 y H14, se unieron a células que expresan la proteína Cad-11 (FIGS. 17A-C y 17G-I) , pero no a células 431-D de control sin Cad-11 (FIGS. 17D-17F) . La línea de células de hibridoma referida como HlMl tiene la Designación de Depósito de Patente A.T.C.C. PTA-9699, que se ha depositado el 8 de Enero de 2009. La línea de células de hibridoma referida como H14 tiene la designación PTA-9701 ATCC de Depósito de Patente A.T.C.C, que se ha depositado el 9 de Enero del 2009. Estos hibridomas contienen anticuerpos antiCad-ll que reconocen tanto el péptido 4 como células que expresan Cad-11 in vitro. La unión de estos anticuerpos a células que expresan a Cad-11 se muestra que se titula con la cnatidad. de anticuerpo de péptido 4 que se usó, como se muestra en las gráficas de la titulación de HlMl (Figura 18A) y H14 (Figura 18B) versus la intensidad de la tinción celular de la intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) .
Los anticuerpos HlMl y H14 de Péptido 4 antiCad-ll demostraron una unión >100 mayor a Cad-11 que cualquiera de las otras Cadherinas probadas, que incluyeron Cad-7, Cad-8, Cad-20, Cad-24, Cad-9, Cad-18, y MN-Cad. La mayoría de los casos, no se observó unión de anticuerpos HlMl y H14 antiCad-11 a las otras Cadherinas. El anticuerpo H14 antiCad-ll mostró fuerte unión a Cad-11 20 (Figura 19A) , con una unión 468 veces menor a Cad-8 (Figura 19A) , y virtualmente ninguna unión a Cad-7, MN-Cad, Cad-9, Cad-18, Cad-20 o Cad-24 (Figura 19B) . de manera similar, el anticuerpo HlMl antiCad-ll mostró fuerte unión a Cad-11 (Figura 20), con una unión 1500 veces menor a Cad-8, y sustancialmente ninguna unión a Cad-7, MN-Cad, Cad-9, Cad-18, Cad-20 o Cad-24 (Figura 20).
Ejemplo 6: Los anticuerpos HlMl y H14 antidominio ECl de antiCad-11 se unen a los epítopos en el dominio ECl de Cad-11 que incluye la secuencia de aminoácidos GPDP Materiales y Métodos Para determinar el epítopo dentro del dominio ECl de Cad-11 ECl al que se unen los anticuerpos HlMl y H14 de péptido 4 de ECl de Cad-11, se inmovilizaron en un formato de ELISA cuatro diferentes péptidos que abarcan los primeros 37 aminoácidos de la región ECl (ver Figura 22) y se determinó la capacidad de los anticuerpso HlMl y H14 para unirse a cada uno de los cuatro péptidos. Se revistieron durante la noche a 4°C placas Reactibind de 96 concavidades con 0.3 ng/concavidad de Péptido 1 (aminoácidos G1-P18 del dominio ECl de Cad-11), 0.3 ng/concavidad de Péptido 2 ' (aminoácidos G15-N34 del dominio ECl de Cad-11), 0.3 ng/concavidad de Péptido 3 (aminoácidos V19-Y37 del dominio ECl de Cad-11) , 0.3 ng/concavidad del Péptido 4 de inmunógeno (aminoácidos G1-G33 del dominio ECl de Cad-11) , 20 ng de una proteína de fusión que incluye el dominio ECl completo (EFL) , o 20 ng de Ig humana de control (Fe-) . Las concavidades se lavaron dos veces con PBS-Tween (0.05%), se bloquearon con caseína en dH20 durante 3 horas a 22°C y luego se lavaron nuevamente dos veces con PBS-Tween (0.05%). A las concavidades revestidas con Péptido o proteína se transfirieron varias diluciones de diferentes anticuerpos de péptido 4 de dominio ECl de Cad-11, se incubaron durante 45 minutos a 22°C y luego se lavaron dos veces con PBS-Tween (0.05%) . A cada concavidad se adicionaron 100 µ? de una dilución 1/1000 de anticuerpo secundario antilgG de ratón, de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) se incubó durante 30 minutos a 22°C y luego se lavó dos veces con PBS-Tween (0.05%). A cada concavidad se adicionaron 100 µ?/concavidad de reactivo TMB a temperatura ambiente y se dejó desarrollar el color durante 5 minutos a 22°C. La reacción se detuvo con 100 µ? de ácido sulfúrico 2 N a temperatura ambiente y la placa se leyó a una longitud de onda de 450 nm en un lector de raicroplaca Wallac 1420.
Resultados Los anticuerpos H1M1 de Péptido 4 antiCad-11 a 1:11 (Figura 21A) y H14 a 1:23 (Figura 21B) se unieron ambos al inmunógeno de Péptido 4 (PEP4) , así como a la proteína de fusión de dominio ECl (EFL) , en un ELISA como se indica por las lecturas elevadas de OD450 con relación al control. Ninguno de estos anticuerpos se unió al control de IgG humana (bloque de Fe) . Además, ambos anticuerpos se unieron al Péptido 2 (PEP2) , pero no al Péptido 1 (PEP1) o al Péptido 3 (PEP3 ) , en el ELISA (FIGS. 21A y 21B) .
Estos resultados sugieren que los anticuerpos H1M1 y H14 antidominio ECl de Cad-11 se unen a un epítopo común en los Péptidos 2 y 4 que no está presente en el Péptido 3 de traslape. Los aminoácidos compartidos por los Péptidos 2 y 4 que están en la dirección 5' del 3 se resaltan en la región en cuadro mostrado en la Figura 22. Estos cuatro aminoácidos, GPDP (SEQ ID N0:11), que empiezan en G15 del dominio DC1 de Cad-11, son probablemente parte del epítpo reconocido por los anticuerpos H1M1 y H14.
Ejemplo 7: Los anticuerpos H1M1 y H14 antidominioDCl de Cad-11 inhiben la agregación de células que expresan Cad-11 in vitro Materiales y Métodos Para probar la capacidad de los anticuerpos de Cad-11 para inhibir la agregación celular mediada por Cad-11, se cultivaron 30 g/ml del anticuerpo H1M1 de Péptido 4 con 75,000 células de carcinoma epidermoide a A-431-D que expresan Cad-11 en 0.5 mi de DMEM-alto contenido de glucosa, Hepes 20mM pH 7.4, 10% de FCS y 10U/ml de DNAsa en una placa de polipropileno de fondo redondo de 24 concavidades . Las placas de 24 concavidades se colocaron en una plataforma giratoria a aproximadamente 60 rpm y se incubaron con 5% C02 durante la noche a 37°C. El siguiente día, se ¦ valoró la agregación celular después de fotografiar las placas a un aumento de lOOx (para el experimento con H1M1) o 40x (para el experimento de H14) .
Resultados En la presencia de un anticuerpo de isotipo de control (30 pg/ml) , las células que expresan Cad-11 formaron grandes masas (Figura 23A) , en tanto que las células negativas a Cad-11 parentales permanecen como grupos celulares individuales o dobles (Figura 23C) . las células de Cad-11 tratadas con HlMl permanecierno como pequeños granulos de células (Figura 23B) que no progresan para formar las grandes masas obtenidas usando el anticuerpo de control.
Usando el mismo ensayo, el anticuerpo H14 antiCad-11 también se mostró que inhibe la agregación mediada por Cad-11. En tanto que las células parentales que expresan Cad-11 formaron grandes agrupaciones de células agregadas (Figura 24A) , el anticuerpo H14 (Figura 24B) inhibió la agregación a una concentración de 30 g/ml, puesto que las agrupaciones celulares fueron pequeñas e infrecuentes. Estos resultados indican que los anticuerpos HlMl y H14 antiCad-11 inhiben la agregación celular mediada por Cad-11 in vitro.
Ejemplo 8: Los anticuerpos HlMl y H14 antidominio de Cad-11 inhiben la hinchazón de articulación asocia a artritis in vivo en un modelo murino de artritis reumatoide Materiales y Métodos Estudio 1.- Se inyectaron ratones C57/B16 machos de 6 semanas de edad con µ? de suero KBN en el dia 0 y en el día 2. Los ratones tratados con suero KBN recibieron ya sea inyecciones de solución salina (Figura 25, triángulos no rellenos) o se trataron con diferentes dosis del anticuerpo H1M1 antiECl de Cad-11. Los regímenes de tratamiento incluyeron dosificación en el día 0 con 0.5 mg de anticuerpo/ratón y cada segundo día (q2d) posteriormente con 0.1 mg de anticuerpo/ratón (0.5 mg+0.1 mg) (Figura 25, triángulos rellenos); dosificación en el día 0 con 0.5 mg de anticuerpo/ratón (0.5 mg) (Figura 25, diamantes); dosificación cada segundo día (q2d) con 0.1 mg de anticuerpo/ratón (0.1 mg+0.1 mg) (Figura 25, cuadrados); o dosificación cada segundo día (q2d) con 0.3 mg de anticuerpo/ratón (0.3 mg+0.3 mg) (Figura 25, círculos). El grupo de control consistió cde 5 ratones y el grupo de tratamiento consistió de 7 ratones. La hinchazón de articulación asociada a artritis se determinó por mediciones de calibrador tomadas cada segundo día.
Estudio 2. - Se inyectaron ratones C57/B16 machos de 6 semanas de edad con 150 µ? de suero KBN en el día 0 y en el día 2, y luego se trataron con ya sea solución salida cada segundo día (q2d) (Figura 26, triángulos), o uno de los anticuerpos antiCad-ll, H1M1 (Figura 26, cuadrados) o H14 (Figura 26, círculos), a 0.3mg/dosis q2d. El grupo de control consistió de 5 ratones y el grupo de tratamiento consistió de 7 ratones . Se determinó la hinchazón de articulación asociada a artritis por mediciones de calibrador tomadas cada segundo día.
Resultados Estudio 1.- El anticuerpo H1M1 antiCad-ll inhibió la hinchazón de articulación con relación a los ratones de control. La mayor inhibición de la hinchazón de articulación asociada a artritis se observó al dosificar ratones tratados con KBN con 0.3 mg de anticuerpo H1M1 cada segundo día (Figura 25, círculos) . i Estudio 2. - Ambos anticuerpos antiCad-11 inhibieron la hinchazón de articulación con relación al control. En este estudio, el anticuerpo H14 retrasó significativamente el comienzo de artritis en comparación a los animales de control (Figura 27) . Todos los ratones en el grupo de control desarrollaron artritis por día 3, en tanto que los ratones tratados con H14 requirieron 6 días antes de que todos los animales desarrollaron artritis .
Estos estudios indican que los anticuerpos contra el dominio ECl de Cad-11 humana pueden inhibir el desarrollo y severidad de artritis in vivo.
Ejemplo 9: Generación de anticuerpos contra otro péptido de dominio ECl de Cadherina-11 humana Materiales y Métodos Se inmunizaron bisemanalmente ratones Balb/c . en la almohadilla del pie nueve veces durante un período de 1 mes con 0.01 mg del péptido V19-Y37 (VL VGRLH SDIDS GDGNI KY (SEQ ID N0:12)), que corresponde a 19 aminoácidos del dominio ECl de Cad-11 de humano, enlazado covalentemente a BSA. Este péptido se refiere en la presente como Péptido 3. Los bazos de los ratones inmunizados se recolectaron y fusionaron con un compañero de fusión murino P3X63 -Ag8.653 , para crear hibridomas productores de anticuerpos. Estos hibridomas se expandieron y el medio que contiene anticuerpo antiCad-11 de los hibridomas se examinó para su capacidad para unirse a una proteína que corresponde al dominio ECl-2 de Cad-11, que se produjo en bacterias. El medio que contiene anticuerpo antiCad-11 de estos hibridomas de Péptido 3 se examinó concurrentemente para la ausencia de unión a proteínas que abarcan los dominios ECl-2 de Cad-8 y MN-Cadherina. Durante la noche se revistieron a 4°C placas EIA de 96 concavidades con 0.05 mi de 0 a 300 mg/ml de una de cada una de las proteínas Cad de ECl-2, o proteína de fusión ECl-Fc producida por células CHO y luego se lavaron varias veces con amortiguador de solución salina. Las placas entones se bloquearon usando 0.25 mi de amortiguador de caseína-PBS y se lavaron subsiguientemente varias veces con amortiguador de solución salina. El medio de hibridoma que contiene los anticuerpos de Péptido 3 antiCad-11 se incubaron puros en cada concavidad durante 1 hora a 22 °C y luego se lavaron dos veces con PBS-Tween (0.05%). A cada concavidad se adicionaron 100 µ? de una dilución 1/1000 de un anticuerpo secundario antilgG de ratón, de cabra, se incubó durante 30 minutos a 22°C, y se lavó dos veces con PBS-Tween (0.05%). A cada concavidad se adicionaron 100 µ?/concavidad de reactivo TMB (3, 3', 5, 5 ' -tetrametilbenzidina) a temperatura ambiente y se dejó desarrollar el color durante 5 minutos a 22°C. La reacción se detuvo con 100 µ? de ácido sulfúrico 2N a temperatura atnbiente y la placa seleyó a 450 nm en un lector de microplaca Wallac 1420.
El medio de los hibridomas de Péptido 3 también se probó para la capacidad para unirse a proteína Cad-11 humana expresadas en células. Se descongelaron células 431D congeladas que expresan Cad-11 y se lavaron dos veces en HBSS con Ca2+ y luego se resuspendieron a 106 células/ml en HBSS que contiene Ca2+. Se tiñeron 105 células/concavidad con ya se a un medio de anticuerpo antiCad-11 al 50% y 16% durante 45 minutos en hielo, se lavaron dos veces en HBSS que contiene Ca2+, y luego se tiñó con un anticuerpo secundario antilgG de ratón, de cabra conjugado con anticuerpo itoeritrina a una concentración de 1% durante 45 en hielo y lueto se lavó nuevamente dos veces en HBSS que contiene Ca2+. Las células entonces se resuspendieron en 400 µ? de HBSS que contiene Ca2+ y 1% de formaldehído y se analizó subsiguientemente en un FACScalibur para células positivas a PE.
Resultados Los medios que contienen anticuerpo-que antiCad-11 de los hibridomas de Péptido 3 se unieron a la proteína ECl-2 de Cad-11 ECl-2 y a la proteína de fusión ECl-Fc (Figura 28, HL vs 10 Cad-11 y HL vs Cad-11-ECl, respectivamente) , pero no se unieron a las proteínas que contienen los dominios ECl-2 de Cad- 8 y MN-Cad (Figura 28, HL vs Cad8 y HL vs M Cad, respectivamente) . Los medios de hibridoma de control no se unen a ninguna de las proteínas de Cadherina (Figura 28, Media vs Cad-11, Media vs Cada, y Media vs MNCad) .
Los anticuerpos antiCad-11 de los hibridomas de Péptido 3 también se unen a células que exprasan proteína Cad- 11 (Figura 29, ver flecha) , pero no a células de control que no expresan Cad-11 que expresan Neos. Este resultado confirmó la presencia de anticuerpos antiCad-11 en los hibridomas que reconocen tanto el Péptido 3 como células que expresan Cad-11 in vitro.
Ejemplo 10: El anticuerpo específico antidominio CD1 de Cad-11, H1M1, impide la agregación in vitro de sinoviocitos tipo fibroblasto, primarios, humanos Materiales y Métodos Ensayo de Agregación En este ensayo, se cultivaron líneas de sinoviocitos tipo fibroblasto humanos (FLS, por sus siglas en ingles) en medio de FLS (DMEM, 10% de FCS, 1% de Penicilina-Estreptomicina, 1% de L-Glutamina, 0.05% de Gentamicina, 1% de HEPES) hasta 90-100% confluente. El día del ensayo, el medio se removió de los FLS y las células se removieron del matraz usando tripsina-EDTA al 0.05%, se lavó con medio MM (DMEM, 10% de FCS, 1% de Penicilina-Estreptomicina, 1% de L- Glutamina, 0.05% de Gentamicina, 1% de HEPES) y luego se lavó dos veces con HBS con calcio (NaCl 0.137 M, KC1 5.4 mM, x Na2HP04 5.4. mM, KH2P04 0.44 mM, CaCb 1.3 mM, MgS04 1.0 mM y NaHCO 4.2 mM) . Los FLS tripspnizados se resuspendierno en medio MM a 4xl04 células/ml, y se colocaron 2xl04 células/concavidad en una caja de 24 concavidades que contiene ya sea medio solo, anticuerpo de control de isotipo o varios anticuerpos antiCad-11 a 30 g/ml . La placa se incubó durante 24 hrs en una incubadora de C02 al 5% y el siguiente día las concavidades se examinaron con un microscopio de luz y se fotografiaron.
Ensayo de invasión de FLS para probar la capacidad del anticuerpo H1M1 para inhibir la invasión de FLS en matrigel, que consiste de una variedad de proteínas de matriz extracelular, se empleó un ensayo de invasión usando un sistema de concavidad dividido de matrigel. Este modelo in vitro de biología de FLS imita la capacidad de los FLS para degradarse y perforar en cartílago humano en articulaciones articuladas. En este ensayo, se cultivaron líneas de FLS de humano en medio MM de FLS hasta 90-100% confluente. El día antes de que se empezara el ensayo, los FLS se ayunaron en suero durante 24 horas en medio de FLS sin suero. En el día del ensayo, el medio se removió de los FLS ayunados en suero y las células se removieron del matraz usando Tripsina-ÉDTA al 0.05%, se lavó con medio MM y luego se lavó 2x con HBS con calcio. Los FLS tripsonizados se resuspendieron en medio MM a 4xl05 células/ml. .Las inserciones preparadas revestidas con matrigel se colocaron en una placa de 24 concavidades que contiene el medio MM con FCS, que actúa como un mitógeno para los FLS. En el otro lado de la cámara, en cada concavidad se introdujeron 50 µ? de medio MM que ya sea no contiene anticuerpo o que contiene dos veces la concentración de trabajo del anticuerpo de tratamiento, al cual se adicionan 50 µ? de 4xl05 células/ml de suspensión celular. Las cámaras co los FLS y los anticuerpos se incubaron durante 18 hrs en una incubadora a 37°C.
Después de 24 hrs, las inserciones con células se fijaron en metanol, los FLS pegados al exterior . de la membrana revestida con matrigel se removieron usando un algodón, y las membrana se secaron y luego se tiñeron con yoduro de propidio (PI) durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. La tinción con PI se removió y las inserciones se lavaron con D-glucosa (1 mg/ml) y luego se secaron en la oscuridad. Las membranas se cortaron y formaron en imágenes en portaobjetos usando microscopio fluorescente y se cuantificó el número de FLS que migraron en la membrana. Resultados Los FLS incubados con ya sea medio o anticuerpo de control formaron agregados celulares y una red amplia de células que se asocia a través de todos los procesos celulares (Figuras 30A y 30B) . En contraste, las células tratadas con el anticuerpo antiCad-11, H1M1, formaron pocos agregados celulares yo pocas conexiones (Figura 30C) .
En una serie de ensayos de invasión de FLS con diferente FLS primario, 30 pg/ml de anticuerpo H1M1 inhibió consistentemente la invasión de los FLS en la membrana. Específicamente, H1M1 a una dosis de 30 pg/ml inhibió la invasión de FLS por 80% en comparación al anticuerpo de control. Esta actividad fue mayor que aquella observada con otros anticuerpos de Cad-11 que se unen fuera de la región EC1, incluyendo el anticuerpo 13C2 (Figura 31) .
Ejemplo 11: anticuerpos H1M1 inhiben la hinchazón de articulación en un modelo de artritis en ratón KBN Materiales y Métodos El anticuerpo H1M1 antiCad-11, se probó en un modelo KBN de artritis donde se indujo enfermedad por la administración de dos dosis de 75 µ? de suero KBN distribuido en los días 0 y 2. Grupos de 7 ratones C57BL/6 machos se administraron a 10 mg/kg de H1M1 intraperitonealmente cada segundo día iniciando en el día 0 y se monitorizó diariamente la hinchazón de articulación en los ratones . La hinchazón de las articulaciones o el espesor de tobillo, se midió en los maleólos con el tobillo en una posición completamente flexcionada, usnado calibradores circulares accionados por muelle (Long Island Indicator Service, Hauppauge, NY) .
Resultados El anticuerpo H1M1 suprimió la hinchazón de articulación por 53% (p<0.001) en comparación al grupo de control (Figura 32) .
Ejemplo 12: Secuenciación de dominios variables H1M1 y regiones determinantes de complementariedad Materiales y Métodos Se extrajo ARN 'de 3 clones de células de hibridoma productoras de H1M1 (Hl, H17 y H27) . Se realizó la RT-PCR usando mezclas de cebadores degenerados para secuencias de señal murinas con cebadores de región constante para cada uno de IgGVH, IgMVH, IgKVL y IGXVL. Se amplificó el ARN de región variable (V) de cadena pesada usando un conjunto de seis mezclas de cebadores degenerados (HA a HF) y se amplificó el ARNm de región V de cadena ligera usando un, conjunto de siete mezclas de cebadores degenerados para la agrupación ? (??- a KG) y un cebador degenerado para la agrupación ? (ver Tabla 1) · Para todas las muestras de ARN, los productos de amplificación de la cadena pesada se obtuvieron del ARN inverso transcrito con el cebador de transcripción inversa IgGVH combinado con las mezclas B y E de cebadores de cadena pesada. Los productos de amplificación se obtuvieron del cebador de transcripción inversa IgKVL y con las mezcla B,.C y G del cebador de cadena ligera ?. Los productos de PCR de cada una de las mezclas anteriores se purificaron y se clonaron, y se secuenciaron al menos cuatro clones para cada producto.
Para los clones Hl, H17 y H27 productores de HlMl, se identificaron secuencias de la región V de cadena ligera y de cadena pesada funcionales, individuales para cada muestra y se encontraron que los tres anticuerpos son idénticos (Tabla 2) . Las secuencias de región V de cadena pesada y ligera, y sus secuencias de CDR, se muestran respectivamente en las Figuras 33 y 34.
Las regiones V de cadena pesada y ligera de los tres clones de hibridoma HlMl mostraron buena homología a sus secuencias de línea germinal humana más cercanas (64% y 82%, respectivamente) y las secuencias variables individuales tienen homólogos cercanos en la base de datos de línea germinal humana (Tabla 2) . Este alto grado de homología reduce la probabilidad que se necesitarán manejo extensivo para producir un anticuerpo humanizado exitoso.
Tabla 1. Cebadores Usados para Secuenciar Dominios Variables de H1M1 y Regiones Determinantes de Complementariedad 10 15 *Posición de aminoácido del cebador con relación al codón de inicio de la secuencia codificadora de región variable de Ig 5' cebadores A-B de ratón y los cebadores 3' contienen 500 pmol de cada cebador a una concentración dé 10 pmol/µ?. 5' cebadores guía C-F de ratón (cadena pesada) y D-G (cadena ligera) contiene una mezcla equimolar (100 pmol de cada cebador a una concentración de 5 pmol/µ?) de las secuencias indicadas. 15 Tabla 2: Análisis de secuencia de los clones Hl, H17 y H27 de hibridoma de H1M1 a Definiciones de CDR y numeración de secuencia de acuerdo a Kabat b ID de línea germinal indicada después por % de homología Ejemplo 13: Generación de anticuerpos humanizados AntiCad-11 Diseño de secuencias de región variable de anticuerpo umanizado AntiCad-11 Modelos estructurales de las regiones variables (V) del anticuerpo monoclonal H1M1 murino descrito en la presente, también referido como anticuerpo SYN0012, se produjeron usando la base de datos de proteína Swiss y se analizaron a fin de identificar aminoácidos "limitantes" importantes en las regiones V que se predice que son esenciales para las propiedades de unión del anticuerpo SYN0012/H1M1. Se consideraron importantes los residuos conteinidos dentro de las CDR (usando las definiciones tanto de Kabat como de Chothia) conjuntamente con varios residuos variables. Tanto las secuencias VH como Vk del anticuerpo SYN0012/H1M1 contienen residuos variables típicos y los motivos de CDR 1, 2 y 3 son comparables muchos anticuerpos murinos .
Del análisis anterior, se considera que las secuencias humanas compuestas del anticuerpo SYN0012/H1M1 se pueden crear con una amplia latitud de alternativas fuera de las CDR pero con solo una selección estrecha de posibles residuos alternativos . dentro de las secuencias de CDR. El análisis preliminar indicó que los correspondientes cementos de secuencia de varios anticuerpos humanos se pueden combinar para crear CDR similares o idénticas a aquellas en las secuencias de anticuerpo SYN0012/H1M1 murino . Para regiones fuera de y que flanquean las CDR, se identificó una amplia selección de segmentos de secuencia de humano como posibles componentes de regiones anticuerpo de anticuerpo humanizado antiCad-11.
Diseño de Variantes En base al análisis anterior, . un conjunto preliminar grande de segmentos de secuencia que se puede usar para crear variantes del anticuerpo humanizado SYN0012 antiCad-11 se seleccionaron y analizaron para análisis in silico de la unión peptídica a los alelos de HC clase II de humano (Perry et al 2009) , y usando el TCEDTM (T Cell Epitope Datábase of Antitope LLC, Cambridge Ru) de epítopos de células T relacionados a la secuencia del anticuerpo conocido (Bryson C, Jones TD y Baker MP. Prediction of immunogenicity of therapeutic proteins: validity óf computational tools . Biodrugs 2010, 24 (1): 1-8). Los segmentos de secuencia que se identificaron como aglutinantes de línea germinal no humana significativos a la MHC clase II humana o que marcaron a ciertos significativos contra el TCEDTM se descartaron. Esto dio por resultado un conjunto reducido de segmentos, y se analizaron nuevamente las combinaciones de estos, como antes, para asegurarse que las uniones entre los elementos no contengan epítopos potenciales potenciales de células T. entonces los segmentos seleccionados se combinaron para producir secuencias de región V de cadena pesada y ligera para la síntesis. Las variantes del anticuerpo humanizado SY 0012 antiCad-11, 5 cadenas VH (VH1-VH5; SEQ ID Nos: 61, 63, 65, 67, 69) y tres cadenas VK (VKI- VK3; SEQ ID Nos: 71, 73, 75) se diseñaron consecuencias como se detalla en las Figuras 35A-35H. Construcción de variantes de Anticuerpo Humanos Compuestos Todos los genes de las regiones VH y VK de anticuerpos humanos compuestos variantes para SYN0012/H1M1 se sintetizaron usando una serie de oligonucleótidos de traslape que se fijaron,, ligaron y amplificaron por PCR para dar regiones V sintéticas de longitud completa. Las variantes de VH montadas se clonaron usando los sitios Mlu I y Hind III, y las variantes VK montadas se clonaron usando los sitios de restricción Bss HII y Bam Hl directamente en el sistema de vector dé expresión pANT (Antitope, Cambridge U) para las cadenas VH y cadenas VK de IgG4 (S241P) (Figura 36) . Todas las conátrucciones se confirmaron por secuenciación .
Construcción, expresión y purificación de anticuerpos Todas las 15 combinaciones de las cadenas VH y VK de IgG4 (S241P) humanizadas compuestas se transfectan de manera estable en células NSO con electroporación y se seleccionaron usando metotrexato 200 nM (Sigma Cat . No. M8407, Sigma Aldrich, RU) . Las colonias resistentes a metotrexato para cada construcción se probaron para los niveles de expresión IgG usando un ELISA de IgG4 , y las mejores líneas de expresión se seleccionaron, se expandieron y se congelaron en nitrógeno líquido. Se generaron exitosamente células que expresan cada una de las 15 variantes de anticuerpos humanizados.
Quince variantes compuestas de IgG4 (S241P) humanizadas de SYN0012, nombradas SDP011 (VKI/VHI) , SDP021 (VK1/VH2) , SDP031 (VK1/VH3) , SDP041 (VK1/VH4), SDP051 (VK.1/VH5) , (SDP061 VK2/VH1) , SDP071 (VK2/VH2) , SDP081 (VK2/VH3) , SDP091 (VK2/VH4) , SDP101 (VK2/VH5) , SDP111 (VK3/VH1) , SDP121 (V 3/VH2), SDP131 (VK3/VH3) , SDP141 (V 3/VH4) , y SDP151 (VK3/VH5) , se purificaron de los sobrenadantes de cultivo de células NSO en una columna de Proteína A Sefarosa (GE Healthcare Cat . No. 110.034-93) y el anticuerpo se cuantificó por OD280nm usando un coeficiente de extinción (Ec(0.1%) = 1.51) en base a la secuencia de aminoácidos prevista. Se notó durante, la purificación del anticuerpo antiECl de Cad-11 de IgGl murina (SYN0011) que el anticuerpo precipitó como un floculado a un pH de aproximadamente 7.5, por lo tanto todos los anticuerpos se neutralizaron después de la elución con ácido a un pH de aproximadamente 6.5 y se intercambiaron con amortiguador en amortiguador de acetato de sodio 10 m pH 5.5 (ácido acético 1.4 mM, acetato de sodio 8.6 mM) . Cada variante de anticuerpo antiCad-11 humanizado se purificó y analizó por SDS-PAGE de reducción. Las muestras se cargaron en un gel de NuPage 4-12% Bis-Tris (Invitrogen cat. No. NP0322BOX) y se corrieron a 200 V durante 30 min. Las bandas que corresponden a los tamaños previstos de las cadenas VH y VK se observaron sin evidencia en ninguna proteína contaminante (figura 37) .
Ejemplo 14: Caracterización de unión de anticuerpos antiCad-11 humanizados a proteínas Cad-11 Materiales y métodos Unión de anticuerpos purificados a EC1 de Cad-11 humana recombinante Se valoró mediante una ELISA de unión de competición la unión de los anticuerpos variantes compuestos humanizados purificados (SDP011 a SDP151) a una proteína de fusión de IgGl humana de EC1 de Cad-11 recombinante. Una serie de dilución de 5 pg/ml a 0.0022 g/ml de anticuerpos humanizados o de control (SYN0012/H1M1) se premezcló con una concentración constante de anticuerpo antiCad-11 murino biotinilado, SY 0012/H1M1 (0.1 pg/ml, concentración final), antes de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en una placa de microtítulo de fondo plano de 96 concavidades Nunc Immuno MaxiSorp (Cat Fisher. No. DIS-971-030J) pre-revestida con 0.25 g/ml de EC1 dé Cad-11 humana recombinante (R&D Systems Cat. No. 1790-CA-050) diluido en PBS . La unión del mAb biotinilado se detectó con estreptavidina-HRP (Sigma Cat. No. S5512) y sustrato de tetrametilbencidina (TMB) (Invitrogen cat. No. 00-2023) .
ELISA de reactividad cruzada de cadherina-péptido Para valorar cuál de los anticuerpos antiCad-11 humanizados mostraron la más grande especificidad para Cad-11, se probaron los anticuerpos humanizados en un formato de ELISA para. la capacidad de unión a péptidos 37-mer enlazados a BSA que abarcaron el inmunógeno Cad-11 con las secuencias correspondientes de las 6 secuencias más cercanas relacionadas al inmunógeno de Cad-11, tomado de las cadherinas-7 , -8, -9, -18, -20, y -24.
Se revistieron placas Reactibind (ThermoScientific) con 500ng/ml del péptido 37-mer de cadherina acoplado a BSA (péptido NE) que corresponde a las cadherinas-7, -8, -9, -11, -18, -20, y -24 en Tween al 0.05% de (E D, código de producto 9480) en PBS (pH 7.2) (Gibco (Invitrogen) , #20012) a 100 µ?/concavidad durante la noche a 4°C. La solución que contiene el péptido se removió de la concavidad y la placa se bloqueó con una albúmina de suero al 2% (BSA) en PBS, 200 µ? de volumen/concavidad, durante 2 horas a 22°C. La placa entonces se lavó dos veces con 200 µ?/concavidad de PBS-Tween 0.05% a 22°C y se secó por transferencia. Una serie de dilución de 5 g/ml a 8 g/ml en un volumen de 100 µ?/concavidad de cada uno de los anticuerpos antiCad-11 humanizados se incubó en las concavidades revestidas con péptido y se incubó a 22°C durante 1 hora. La solución de anticuerpo se removió de las concavidades y la placa se lavó dos veces con 200 µ?/concavidad de Tween-PBS al 0.05% a 22°C y se secó por transferencia. La IgG antiratón de cabra (Pierce # 31432) se adicionó a cada concavidad a la placa a una dilución 1:1000, 100 µ?/concavidad y se incubó a 22°C durante 30 min. La solución de anticuerpo secundario se removió y la placa se lavó dos veces con 200 µ?/concavidad de Tween-PBS al' 0.05% a 22°C y se secó por transferencia. La reacción se reveló al adicionar ???µ?/concavidad de IgG de reactivo de tetrametilbencidina (TMB) (Pierce # 34022, 1 etep Turbo TMB-ELISA) a la placa y se reveló a 22 °C durante 5 min. La reacción se detuvo usando 100 µ? de ácido sulfúrico 2N R y la placa se leyó a 450 nm en un lector de microplaca (Wallac 1420) .
Unión a Cad-11 en resonancia de plasmón superficial ,(SPR, por sus siglas en inglés) Para determinar la afinidad de SDP051 para Cd-11 humana marcada con his recombinante , se inmovilizó rhCad-11 (R&D Systems) al chip en una concentración individual, se determinaron las cinéticas de alta resolución para SDP051, y un modelo de unión de reacción de 2 estados se ajustó exitosamente a los datos cinéticos .
Se obtuvieron datos cinéticos a una velocidad de flujo de 40 µ?/min para reducir al mínimo cualesquiera de los efectos potenciales de transferencia de masa. Mediante dilución en serie se. preparó una serie de concentraciones de analito que varía desde 12.5 nM a 0.195 nM. Dos repeticiones de la pieza en blanco (sin mAb) y la concentración 3.125 nM (primero y último ciclo) del analito se programaron en las corridas cinéticas a fin de verificar la estabilidad tanto de la superficie como del analito durante los ciclos cinéticos. Se inyectó el SDP051 sobre los Fe durante 360 segundos, suficientemente prolongado para observar la curvatura en la fase de asociación.
Ensayo de unión a células de Cad-11 Células 43ID congeladas que expresa Cad-11 (K. Johnson, U. Nebraska, Omaha) o las células 431D parentales que no expresan Cad-11 (K. Johnson, U. Nebraska, Omaha) se descongelaron, se lavaron y se resuspendieron a 2?10e células/ml y 50µ1 se adicionó a a cada concavidad. Entonces las células se tiñeron en hielo durante 45 minutos con concentraciones crecientes de los anticuerpos SDP071 o SDP051 humanizados de 1 ng/ml a 30µ?/p?1. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, por sus siglas en inglés) con solución bovina fetal al 1% (FBS, por sus siglas en inglés) , se resuspendieron y tiñeron con IgG4-PE antihumano (dilución lOOx) en hielo durante por 45 segundos protegido de la luz. Después de la tinción de las células con el agente secundario, las células se lavaron dos veces con HBSS con FBS al 1%, se resuspendieron en 200 µ? de formaldehído al 2% en HBSS con FBS al 1% y luego se analizaron con un BD FACSCalibur.
Ensayo de FACS de reactividad cruzada de cadherina-péptido . Células 431D congeladas que expresan Cad-11 o las células 431D parentales que no expresan Cad-ll descongelaron, se lavaron y se resuspendieron a 2xl06 células/ml y las 100,000 células se aislaron a cada concavidad. Las células se tiñeron en hielo hielo durante 45 minutos con concentración creciente de ya sea el péptido 37-mer Cad-ll o ya sea los péptidos 7-Cad, Cad-8, Cad-9, Cad-18, Cad-20, o Cad-24 con 0.5 g/ml de SDP051. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, por sus siglas en inglés) que contenía solución bovino fetal al 1% (FBS, por sus siglas en inglés) , se resuspendieron y luego se tiñeron con ???µ? de IgG-PE antiratón de cabra (dilución lOOx) en hielo durante 30 segundos protegido de la luz. Después de la tinción de las células con el agente secundario, las células se lavaron dos veces con HBSS con FBS al 1%, se resuspendieron y fijaron en 200 µ? de formaldehído al 2% en HBSS con FBS al 1% y luego se analizaron con un BD FACSCalibur.
Resultados Todos los anticuerpos humanizados antiCad-11 compitieron de manera eficiente con SYN0012 para la unión a la proteína de fusión de Cad-ll (figuras 38A a C) . Esto india que se unen al mismo epítopo como SYN0012 o un epítopo saliente en Cad-ll y que se unen al menos tan bien o mejor que SYN0012 a Cad-ll humana recombinante . Las curvas se usaron para calcular los valores de IC50 para cada anticuerpo y estos se normalizaron a la IC50 de SYN0012, que se incluyó en cada placa de ELISA de modo que se pueden hacer comparaciones entre las placas (Tabla 3) . Los niveles de expresión de cada línea celular y el punto isoeléctrico (pl) calculado de cada anticuerpo también se muestran (Tabla 3) .
SDP051, un anticuerpo V 1/VH5, se unió a Cad-11 con la mayor especificidad, demostrando una unión mayor de 100 veces al antígeno de Cad-11 que los antígenos relacionados de las otras cadherinas (figuras 39A-390) . La mayor reactividad cruzada se vio contra Cad-8. SDP031, SDP061 y SDP071 también mostraron especificidad significativa para Cad-11, demostrando una unión mayor de 20 veces al antígeno de Cad-11 que los antígenos relacionados de las otras cadherinas. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada para SDP031, SDP051, SDP061 y SDP071 se muestran en las Figuras 40A-40D.
Tabla 3: Caracterización de anticuerpos antiCad-ll, humanos, com uestos .
La IC50 relativa se calculó AL DIVIDIR el valor para el anticuerpo de prueba por aquel de SYN0012. Los niveles de expresión de anticuerpo dados son para cultivos estáticos en matraces T. Se calcularon los PI.
En el examen inicial de los anticuerpos humanizados antiCad-11 contra el antígeno de Cad-11 y los antígenos de Cad-7, -8, -9, -11, -18, -20, -24 a un revestimiento de 500ng/ml (figura 41A) , SDP051 demostró la mayor afinidad a Cad-11 que cualquier otro cadherina. El mayor grado de reactividad cruzada se vio con el antígeno de Cad-8. Este ensayo se repitió con los antígenos de Cad-11, 8 -Cad y Cad- 18 con una menor concentración de revestimiento de antígeno de 50ng/ml y una serie de más amplia dilución anticuerpo SDP051 (figura 41B) . En este ensayo, SDP051 tiene una CE50 de 6.8 ng/ml para Cad-11 y una EC50 de 1421 ng/ml de Cad-8, una diferencial de unión de más de 200 veces. Una EC50 para Cad-18 no se puede establecer debido al bajo nivel de unión observada. Estos resultados confirmaron que SDP051 fue altamente específico para Cad-11. Una búsqueda BLAST con la secuencia del dominio EC1 de Cad-11 indicó que las correspondencias más cercanas estuvieron entre los antígenos de Cád-7, -8, -9, -11, -18, -20, y -24. Una búsqueda BLAST con el epítopo de unión a SDP051 de hexapéptido puesto en claro en el dominio EC1 de Cad-11 indicó que ninguna otra proteína humana conocida posee esta secuencia. SDP051 tiene afinidad sub-nanomolar para la proteína rhCad-11 con una constante de disociación de equilibrio (KD) de 0.37 nM (Tabla 4) .
Tabla 4: Pro iedades físicas de SDP051 Los experimentos de control y de caracterización para superficie de chip sugirieron que la rhCad-11 inmovilizada a la densidad individual fue adecuada para determinar los valores cinéticos para las interacciones de anticuerpo antiCad-11.
Para el análisis cinético, se usó un modelo de reacción de 2 estados (ecuación 1, Figura 42) en base a los resultados del control de reacción enlazada,, que indicaron que otro evento dependiente del tiempo estuvo presentándose una vez que el antlgeno se ha unido al anticuerpo. Puesto que rhCad-11 es homodimérica y por lo tanto contuvo dos epítopos idénticos de unión, es probable que las moléculas individuales de mAb se lleguen a unir secuencialmente a través del primer 'sitio de unión y, a luego en ambos sitios de unión. kaí kal Ecuación 1: Reacción de Dos Estados A+ B AB AB* En los ensayos de unión celular, SDP051 y SDP071 demostraron unión dependiente a la dosis a células que expresan Cad-11 y ninguna unión a la línea de células parentales negativas a Cad-11 (figura 43) .
Una manera alternativa para determinar la especificidad de SDP051 para Cad- 11 es medir la capacidad de diferentes cadherinas para bloquear la unión de SDP051 a células que expresan Cad-11. Esto se realizó para cada una de Cadherinas-7 , -8, -9, -18, -20, -24 o -MN. Solo el péptido de Cad-11 bloqueó significativamente la unión de SDP051 a células Cad-ll+. Los resultados del análisis se muestran en las Figuras 44A-C.
Ejemplo 15: SDP051, un anticuerpo humanizado antiECl de Cad-11, exhibe baja inmunogenicidad en ensayos que usan células humanas Materiales y Métodos Purificación de anticuerpos Se purificó SDP051 de cultivos de 5L de células que expresan anticuerpo cultivadas a saturación. Se separaron los sobrenadantes de las células y de los desechos, se ajustaron a pH 7.4, se filtraron estériles y se corrieron en columnas de afinidad de proteína A 5 mi Hi-Trap Mab Select Sure (GE Healthcare, Amersham, RU) , que se han esterilizado previamente con NaOH 0.5 M, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La columna se lavó con 100 mi de PBS, pH 7.4. El anticuerpo se eluyó en fracciones de 5 mi con citrato de sodio 0.1 M pH 3.0 y cada fracción se neutralizó inmediatamente con 0.25 mi de.Tris-HCl 1M. El contenido de proteína de cada fracción se monitorizó por absorción UV a 280 nm y se mezclaron las fracciones que contienen proteína, se intercambiaron con amortiguador en acetato de sodio 10 mM pH 5.5 y se concentraron. El anticuerpo se purificó adicionalmente por cromatografía de exclusión de tamaño usando un columna 16/60 Sephacryl S200 (GE Healthcare, Amersham, RU) . Las fracciones pico principales se recolectaron, se mezclaron, se esterilizaron con filtro y se probaron para niveles de endotoxina usando un Endosafe®-PTSMR (Charles River, Márgate, RU) . El anticuerpo purificado se almacenó a +4°C. Las concentraciones finales se' determinaron por absorción UV usando coeficientes calculados de extinción molar, donde A280 1.0 = 1.51 mg/ml. Cada anticuerpo entonces se diluyó a 100 g/ml en medio de cultivo AIMV (Invitrogen, Paisley, RU) .
Ensayo de inmunogenicidad Se aislaron PBMC de capas leucocitarias de donadores saludables (de sangre retirada en el espacio de 24 horas) obtenidas del National Blood Transfusión Service (Addenbrooke ' s Hospital, Cambridge, RU) . Las PBMC se aislaron de las capas leucocitarias por Lymphoprep® (Axis-Shield, Dundee, RU) y centrifugación de densidad, y las células T CD8+ se agotaron usando CD8+ RosetteSep® (StémCell Technologies Inc., Londres, RU) . Los donadores se caracterizaron al identificar los haplotipos HLA-DR usando un equipo de tipificación de tejido basados en Biotest SSP-PCR (Biotest, LandsteinerstraSe, Dinamarca) y al determinar las respuestas de células T a un antígeno de control de "reproducibilidad" (KLH: Pierce, Cramlington, RU) . Las PBMC entonces se congelaron y almacenaron en nitrógeno líquido hasta que se requieren.
Las PBMC de cada donador se descongelaron, se contaron y se valoraron para viabilidad. Las células se revivieron en medio de cultivo AIMV a temperatura ambiente (Invitrogen, Paisley, RU) y se resuspendieron en AIMV a 4-6xl06 PBMC/ml. Para cada donador, se establecieron cultivos volumétricos en los cuales se adicionó un total de 1 mi de solución concentrada de células de proliferación en una placa de 24 concavidades. Un total de 1 mi de cada muestra de prueba diluida se adicionó a las PBMC para dar una concentración final de 50 g/ml por muestra. Para cada donador, un control positivo (células incubadas con 100 g/ml de KLH) y un control negativo (células incubadas con solo medio de cultivo) también se incluyeron. Para los primeros 4 donadores, se incluye un control adicional para probar la. modulación de las respuestas de células T por las muestras de prueba, donde la muestra de prueba y KLH se adicionaron ambos a las PBMC. La comparación de estas muestras con KLH solo se puede usar para valorar los efectos de las muestras de prueba en la proliferación.
Se incubaron cultivos durante un total de 8 días a 37°C con C02 al 5%. En los días 5, 6, 7 y 8, las células en cada concavidad se resuspendieron suavemente y se transfirieron 3 x alícuotas de ???µ? a concavidades individuales de una placa de 96 concavidades de fondo redondo. Los cultivos se sometieron a impulsos con l Ci [3H] -timidina (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts , EUA) en ???µ? de medio de cultivo AIMV y se incubaron durante 18 horas adicionales antes de recolectar sobre esteras de filtro (Perkin Elmer®, Waltham, . Massachusetts, EUA) usando un recolector de células TomTec®Mach III. Las Cpm para cada concavidad se determinaron por cuenta de escentilación MeltilexMR (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, EUA) en un Microplate Beta Counter in paralux en modo de conteo de fondo bajo para paralux.
Ensayos de .proliferación celular Para los ensayos de proliferación, se ha establecido previamente un umbral empírico de un SI igual a o mayor que 2 (SI=2.0) por lo que las muestras que inducen respuestas proliferatxvas por arriba de este umbral se juzgan positivas (si se incluye, se resaltan los Sis = 1.90 limítrofe) . El desarrollo de ensayo extensivo y los estudios previos han mostrado que este es el umbral mínimo de señal a ruido que permite sensibilidad máxima sin detectar grandes números de respuestas positivas falsas. Para los conjuntos de datos de proliferación (n = 3) , se definieron respuestas positivas por umbrales estadísticos y empíricos: 1. Significancia (p<0.05) de la respuesta al comparar cpm de las · concavidades de prueba contra las concavidades de control de medio usando la prueba t de student de dos muestras no apareadas. 2. SI igual a o mayor que 2 (SI=2.0) .
Resultados Para valorar adicionalmente la inmunogenicidad potencial, el anticuerpo SDP051 humanizado antiECl de Cad-11 se probó para su potencial para inducir la proliferación de PBMC agotadas de CD8 (células T CD4) de 25 diferentes donadoras humanos de células T en un ensayo de 8 días. En tanto que el anticuerpo quimérico SYN0014, que es una versión quimérica de Fe de IgG4 de ratón-humano del anticuerpo murino parental H1M1/SYN0012 , indujo proliferación en 28% de los donadores, él anticuerpo SDP051 no induce la proliferación de ningún donador de células T. Estos resultados soportan el hallazgo in silico anterior que SDP051 tiene un bajo perfil de inmunogenicidad.
Los resultados del ensayo de proliferación de transcurso de tiempo de inmunogenicidad con el anticuerpo quimérico SYN0014 de control y el anticuerpo humanizado SDP051 se muestran en las Figuras 45A y 45B, respectivamente. El anticuerpo quimérico es SYN0014 de ratón-humano estimuló respuestas en 7 de los 25 donadores (28% de los donadores) con una de las respuestas de los donadores que es limítrofe (1.98 para el donador 16), pero aun significativamente diferente del fondo (p <0.05, Figura 45A) . El anticuerpo humanizado SDP051 no estimula ninguna respuestas en ninguno de los donadores (0 de los 25 o 0% de los donadores) indicando su baja inmunogenicidad potencial.
Ejemplo 16: SDP051, un anticuerpo humanizado antiECl de Cad-11, inhibe, la invasión sinoviocitos y la expresión de MMP3 Materiales y Métodos Ensayo de invasión de FLS Líneas de FLS humanas primarias se cultivaron en medio FLS MM (DMEM, 10% de FCS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de L-glutamina, 0.05% de gentamicina, 1% de HEPES%) y 90-100% confluente. El día antes que empecerá el ensayo, los FLS se ayunaron en suero durante 24 horas en medio FLS sin suero. El día del ensayo el medio de removió de los FLS ayunados en suero y las células se removieron del matraz usando tripsina-EDTA al 0.05% y luego se lavaron 2 veces con HBS con calcio. Los FLS ' tripsinizados se resuspendieron en medio MM a 4xl05 células/ml. Se coloraron inserciones revestidas con matrigel preparadas, en la placa de 24 concavidades que contiene el medio MM con suero de becerro fetal al 5% (FCS, por sus siglas en inglés) que actúa como un quimioatrayente para los FLS. En el otro lado de la cámara se colocaron 50µ1 de medio mM que contenía ya sea 6pg/ml o 0.6 g/ml de SDP051 (dos veces la concentración de trabajo) " o 6 g/ml de anticuerpo AC1-P de control, al cual entonces se adicionaron 50 µ? de 4xl05 células/ml de suspensión celular a cada concavidad. Las cámaras con los FLS y los anticuerpos se incubaron durante 18 h en una incubadora a 37°C.
Después de 24 horas, las inserciones se fijaron con metanol al 100% durante 30 minutos a -20°C y los FLS no invasores pegados al interior de la membrana revestida con atrigel se removieron usando un algodón. Las membranas se secaron y luego se tiñeron con yoduro de propidio (Pl) durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La tinción con PI se removió y las inserciones se lavaron con D-glucosa (lmg/ml) y luego se secaron en la oscuridad. Las membranas se cortaron y se formaron en imágenes en portaobjetos usando un microscopio fluorescente y se cuantificó el número de FLS que ha migrado a través de la membrana .
Resultados Cad-11 es un cadherina crítica requerida para la biología de los FLS. Como resultado, se espera que los antagonistas de Cad-11 inhiban la capacidad de los FLS humanos primarios para degradar e invadir una capá de matrigel, que separa dos concavidades. El matrigel consiste de una variedad de proteínas de matriz extracelular . Este modelo in vitro de biología de FLS replica los aspectos de la biología de FLS incluyendo su capacidad para degradar y perforar en cartílago.
SDP051 inhibió significativamente la invasión de FLS en matrigel. 0.3 g/ml de anticuerpo SDP051 fue suficiente para inhibir 50% de la invasión de FLS humanos primarios en la membrana de Matrigel en comparación al anticuerpo de control de isotipo (figura 46).
Los FLS expresan MMP3 , que se piensa que es una de las enzimas comprendidas en la degradación de cartílago in vivo y matrigel en el ensayo de invasión in vitro. Los sobrenadantes del ensayo de invasión se recolectaron antes de la fijación de las células y se congelaron a -80°C. Estos sobrenadantes se descongelaron y probaron para la presencia de MMP3 en el medio de cultivo. Los niveles de MMP3 se incrementaron significativamente en la concavidad que contiene los FLS tratados con el anticuerpo de control (AC1-P) que se estimularon para migrar con FCS (figura 47) . Los niveles de MMP3 se redujeron significativamente en los FLS tratados con SDP051 estimulados con FCS. Los niveles se redujeron aproximadamente 50% en comparación a las células tratadas con anticuerpo de control.
Ejemplo 17: SDP051, un anticuerpo humanizado antiECl de Cad-11, inhibe la inflamación de articulación en un modelo animal de artritis Para probar el anticuerpo SDP051 en un modelo animal de artritis, se eligió el modelo de trasferencia en suero de K/BxN de artritis desarrollado por D. Mathis y C. Benoist (Korganow AS, Ji H, Mangialaio S, Duchatelle V, Pelanda R, Martin T, et al, From systemic T cell self-reactivity to organ-specific autoimmune disease vía immunoglobulins . Immunity 1999;10:451-61). Este modelo presenta sinovitis extensiva, y por lo tanto fue una buena prueba para las propiedades protectoras de articulación y antiinflamatorias del anticuerpo SDP051.
Se inyectaron ratones C57B1/6 de seis a ocho semanas de edad de forma intraperitoneal (IP) con 75µ1 de suero KBN (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) tanto en el día 0 como en el día 2. Los ratones se dosificaron IP, con ya se 10 mg/kg de SDP051 o control (AC1-P) en los días -1, 0, 1, 2, 4 y 6. Se midió la hinchazón de la articulación, o el espesor del tobillo, en los maléolos de ambos tobillos traseras de cada ratón manteniendo el tobillo en una posición completamente flexionada en los días 0, 2, 4, 6, 8, y 10 del estudio, usando calibradores circulares accionados con muelle (calibrador de espesor Mitutoyo modelo 7308, Long Island Indicador Service, Hauppauge, NY) . El diferencial entre el espesor de articulación en día 0 y el día de la medición se determinó. En la Figura 48 se grafican los cambios en el espesor de tobillo durante el transcurso del estudio. Las diferencias en las puntuaciones del espesor de tobillo fueron significativas en los días 6, 8 y 10. En el día 10, la hinchazón del tobillo en el grupo SDP051 fue 47% menor que la hinchazón en el grupo de control.
En el día 10, se recolectó suero de un sangrado terminal de cada ratón de estudio. Se congeló el suero en hielo seco y se almacenó a-80°C. Se determinaron los niveles en suero de SDP051 al probar sueros en un ELISA usando péptído de Cad-11 como un reactivo de captura, y luego se detecta SDP051 con una IgG antihumano. El SDP051 se puede detectar fácilmente en los sueros de ratones (figura 49) .
Se recolectaron tobillos en el día 10 y se valoró la histopatología . Se valoró la severidad de la erosión de cartílago, la erosión de hueso e inflamación de hueso (infiltrado celular) en una puntuación de 0-5 por un técnico calificado que no sabe nada acerca de los grupos de. estudio. En la Tabla 5 se resumen los resultados de histopatología en el día 10. Los animales tratados con SDP051 demostraron una reducción de 35% en las puntuaciones de erosión de cartílago, una reducción de 27% en las puntuaciones de erosión hueso y una reducción de 25% en las puntuaciones de inflamación.
Tabla 5. Resultados de histo atolo ía en el día 10 (KBN013) *=p<0.05; ± = Error estándar de la media Ejemplo 18: Respuesta a dosis de SDP051 en modelo de artritis KBN Se dosificaron ratones con suero KBN en los días 0 y 2. Los ratones se dosificaron IP con 10, 3, o 1 mg/kg de SDP051 o control AC3-1-P en los días 0, 2, 4 y 6. En la Figura 59 se muestran los cambios en el espesor de tobillo. Se vio una tendencia a reducción en el espesor de tobillo en ratones tratados con 3 o 10 mg/kg de SDP051. La reducción de la hinchazón de tobillo en el grupo de 10 mg/kg fue significativa en los días 6, 8 y 10. En el día 10, la hinchazón de tobillo en este grupo fue 44% menor que la hinchazón en el grupo de control. Con respecto a una serie de estudios, 10mg/kg de SDP051 redujo significativamente la hinchazón de tobillo. A 3mg/kg hubo una tendencia de hinchazón reducida de tobillo.
Ejemplo 19. SDP051 Reduce citocinas implicadas en patología de artritis reumatoide Se dosificaron ratones por vena de cola IV con 10mg/kg de SDP051 o anticuerpo de control AC3-1-P en los días 0, 1, 2, 4 y 6. En el día 6, el grupo SDP051 demostró 33% menor hinchazón de articulación de tobillo que el grupo de control (Tabla 6). Se realizó el análisis de citocinas en los tobillos recolectados en el día 7 como sigue: se recolectaron articulaciones de tobillo, la piel y el pelaje se removieron y las articulaciones se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Las articulaciones entonces se solubilizaron en amortiguador de homogeneización (amortiguador de homogeneización de tejido Affymetrix (parte # PC6002) , complementado PMSF 2 mM (Sigma parte # P7626) y cóctel de inhibidor de proteasa IX (Sigma parte # P8340) , indometacina 0.1 M) y se centrifugó, y los sobrenadantes resultantes se valoraron para los niveles de varias citocinas y quimiocinas en múltiples ensayos (OceanRidge Biosciences) .
El grupo con tratamiento con SDP051 demostró una reducción de 29% a 51% en los niveles, del factor de diferenciación de osteoclastos , el activador de receptor soluble del ligando kappa-B de factor nuclear (sRA KL) , la quimiocina osteoclástica/linfóide, proteína-1 inflamatoria de macrófagos (MIPlx) la proteína-1 quimiotáctica de monocitos de quimiocina de monocitos (MCP1) , factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , y la quimiocina de leucocitos, regulada en la activación, células T normales expresadas y segregadas (RANTES) (Tabla 6). Se vio poco efecto en los niveles de IL-6 o TNFOÍ . Se vio un incremento modesto en el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) , en tanto que no se puede detectar IL-23 en los grupos de prueba.
El mecanismo de propuesto de acción SDP051 es que el anticuerpo se une Cad-11 en los sinoviocitos tipo fibroblastos en la articulación de ratón dando por resultado expresión reducida de citocinas y quimiocinas pro-inflamatorias. En realidad, en los ratones tratados con SDP051, hubo una reducción en varias quimiocinas de leucocitos que se sugirieron que están comprendidas en la biología de los FLS, incluyendo MCP-1, RANTES y ????a, en las articulaciones de pacientes con RA (Garcia-Vicuna R, Gomez-Gaviro M, Domínguez-Luis M, Pee M, González-Alvaro M, Alvaro-Gracia M y Diaz-Gonzalez F, 2004 Arth & Rheum, 50, pp3866-3877) (Tabla 6) . Además, sRANKL es un importante mediador del desarrollo de osteoblastos y se induce a la expresión de RANKL en los FLS por varias citocinas inflamatorias (Hashizume , N y M Hayakawa Mihara, 2008, Rheumatology _7 páginas 1635-1640). Los ratones tratados con SDP051 demostraron una reducción en los niveles de sRANKL en sus articulaciones (Tabla 6) . En tanto que estos efectos fueron modestos, se pueden amplificar los efectos a región local de estos cambios.
Tabla 6. Resultados de citocinas del día 7 del estudio con Las enseñanzas pertinentes de todas las patentes solicitudes publicadas y referencias citadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad.
En tanto que esta invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a modalidades de ejemplo de la misma, se entenderá por los expertos en la técnica que se pueden hacer varios cambios en la forma y detalles sin que se aparten del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones anexas.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente' invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (63)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un anticuerpo humanizado que se une específicamente a un dominio ECl de una proteína Cadherina-11 mamífera y antagoniza la proteína Cadherina-11 mamífera, caracterizado porque comprende una región de cadena pesada variable de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69.
2. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe una o más actividades mediadas por Cadherina-11 seleccionadas del grupo que consiste de unión de la proteína Cadheriha-11 mamífera a una o. más proteínas Cadherina-11 diferentes, la agregación de células que expresan la proteína Cadherina-11 mamífera, inducción de expresión de enzimas, inducción de expresión de citocinas, inducción de expresión de factores de crecimiento, migración de células que expresan la proteína Cadherina-11 mamífera y destrucción de cartílago.
3. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 69.
4. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una región de cadena ligera variable de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 75.
5. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 61 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 71.
6. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 61 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 73.
7. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 61 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 75.
8. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 63 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 71.
9. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 63 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 73.
10. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 63 y. la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 75.
11. El anticuerpo humanizado, de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 65 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 71.
12. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada · variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 65 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 73.
13. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 65 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 75.
14. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 67 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 71.
15. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpp comprende SEQ ID. NO: 67 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 73.
16. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 67 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 75.
17. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 71.
18. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 69 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 73.
19. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la región de cadena pesada variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 69 y la región de cadena ligera variable de anticuerpo comprende SEQ ID NO: 75.
20. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a un epítopo que está presente en SEQ ID NO: 3.
21. El . anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a un epítopo que está presente en SEQ ID NO: 10.
22. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a un epítopo que comprende SEC ID NO: 11.
23. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo entero.
24. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo.
25. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un Fab, un Fab', un F(ab' )2 y un scFv.
26. Un anticuerpo humanizado que se une específicamente a un dominio ECl de un proteína Cadherina-11 mamífera y antagoniza la proteína Cadherina-11 mamífera, caracterizado porque comprende un región de cadena pesada variable de anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 69 y una región de cadena ligera variable de anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 71.
27. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque inhibe una o más actividades mediadas por Cadherina-11 seleccionados del grupo que consiste de la unión de la proteína de Cadherina-11 mamífera a una o más proteínas de Cadherina-11 diferentes, la agregación de células que expresan la proteína Cadherina-11 mamífera, inducción de expresión de enzimas, inducción de expresión de citocinas, inducción de expresión de factores de crecimiento, migración de células que expresan la proteína Cadherina-11 mamífera y destrucción de cartílago.
28. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo entero.
29. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
30. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el . fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un Fab, un Fab', un F(ab' )2 y un scFv.
31. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo humanizado que se une de manera específica a un dominio ECl de una proteína Cádherina-11 mamífera y antagoniza la proteína Cadherina-11 mamífera, y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo comprende una región de cadena pesada variable de anticuerpo que comprende SEC ID NO: 69 y antagoniza esta proteína Cadherina-11 mamífera.
32. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el anticuerpo comprende una región de cadena ligera variable de anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 71.
33. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el anticuerpo inhibe la agregación de células que expresan la Cadherina-11 mamífera.
34. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo entero.
35. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
36. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque además comprende un fármaco antireumáticó modificador de la enfermedad.
37. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el fármaco antireumático modificador de la enfermedad es metotrexato.
38. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque además comprende un agente antiinflamatorio.
39. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque el agente antiinflamatorio es un NSAID o un esteroide.
40. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica para el anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1.
41. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el ácido nucleico está presente en un vector.
42. Una célula aislada, caracterizada porque expresa el anticuerpo humanizado de la reivindicación 1.
43. Un método para tratar un trastorno mediado Cadherina-ll en un sujeto mamífero en necesidad de lo mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo humanizado que se une específicamente a un dominio ECl de un proteína Cadherina-ll mamífera, en donde el anticuerpo comprende un región de cadena pesada variable de anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 69 y antagoniza esta proteína Cadherina-11 mamífera.
.44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la agregación de células que expresan la proteína Cadherina-11 mamífera se inhibe en una o más articulaciones del sujeto *¦
45. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de cadena ligera variable de anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 71.
46. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo es un. anticuerpo entero.
47. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
48. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el trastorno mediado por Cadherina-11 se selecciona del grupo que consiste de un trastorno inflamatorio, una fibrosis, y un cáncer.
49. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el trastorno mediado por de Cadherina-11 es un trastorno inflamatorio de articulación seleccionado del grupo que consiste de artritis reumatoide, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante, artritis crónica juvenil, enfermedad crónica de Lyme y artritis de articulación asociada con lupus eritrematoso sistémico.
50. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el sujeto mamífero es un humano.
51. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo se. administra de manera sistémica.
52. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo se administra de manera intravenosa..
53. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo se administra por inyección directa en una articulación.
54. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la migración, adhesión, invasión en cartílago, o señalización intercelular de células que expresan' esta proteína Cadherina-11 mamífera en una o más articulaciones del sujeto.
55. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la inducción de la expresión o actividad de una enzima seleccionada del grupo que consiste de una colagenasa, una serina-proteasa, y una metaloproteinasa de matriz en células que expresan la proteína Cadherina-11 mamífera en una o más articulaciones del sujeto.
56. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la inducción de la expresión o actividad de una citosina o factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste de una IL-6, IL-8, RA KL y .TRANCE en células que expresan la proteína Cadherina-11 mamífera en una o más articulaciones del sujeto.
57. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo se administra en combinación con al menos un agente seleccionado del grupo que consiste de un fármaco antirreumático o modificador de la enfermedad y un agente antiinflamatorio.
58. Uso de un anticuerpo humanizado para el tratamiento de un trastorno mediado por Cadherina-11 .en un sujeto mamífero en necesidad de los mismo, en donde el anticuerpo se une de manera específica a un dominio EC1 de una proteína Cadherina-11 mamífera y comprende una región de cadena pesada variable de anticuerpo que comprende SEC ID NO: 69.
59. El uso de conformidad con la reivindicación 58, en donde el trastorno mediado por Cadherina-11 es un trastorno inflamatorio.
60. El uso de conformidad con la reivindicación 59, en donde el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio de articulación.
61. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el trastorno inflamatorio de articulación es artritis reumatoide.
62. El uso de conformidad con la reivindicación 58, en donde el trastorno mediado por Cadherina-l es fibrosis.
63. El uso de conformidad con la reivindicación 58, en donde el trastorno mediado por Cadherina-11 el cáncer.
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