ES2432112T3 - Inhibición del factor B, de la vía alternativa del complemento y métodos relacionados - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antígeno que se une selectivamente al factor B dentro del tercer dominio de la repetición corta de consenso (SCR) y que se une selectivamente al factor B procedente de al menos ser humano y ratón, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno evita la formación de un complejo C3bBb.

Description

Inhibici6n del factor B, de la via alternativa del complemento y metodos relacionados
Campo de la invenci6n
Esta invenci6n se refiere en general a nuevos inhibidores de la via alternativa del complemento y, en particular, a nuevos anticuerpos anti-factor B. La invenci6n tambien se refiere en general al uso de tales inhibidores para reducir
o prevenir la hiperreactividad de las vias respiratorias y la inflamaci6n de las vias respiratorias y tratar de ese modo enfermedades en las que tales afecciones tienen una funci6n.
Antecedentes de la Invenci6n
La activaci6n del complemento se produce principalmente a traves de tres vias: la denominada via clasica, la via de las lectinas y la via alternativa. Las principales proteinas implicadas en la activaci6n de la via alternativa son el factor B (fB) y el factor D (fD). Estas proteinas actuan conjuntamente para iniciar y/o para amplificar la activaci6n de C3, lo que conduce entonces a la iniciaci6n de una serie de eventos inflamatorios. Una tercera proteina, properdina, estabiliza el complejo de C3 y el factor B, pero no es absolutamente necesaria para que funcione la via alternativa. El factor B tambien ayuda a solubilizar complejos inmunes, se ha notificado que actua como un factor de crecimiento de los linfocitos B y puede activar los monocitos (Takahashi, 1980; Hall, 1982; Peters, 1988). Se han generado ratones carentes del factor B (ratones fB-/-) y la respuesta del anticuerpo IgG1 frente a antigenos dependientes de linfocitos T y la sensibilidad al choque endot6xico parecen normales en estos ratones (Matsumoto, 1997).
La via alternativa del complemento se inicia generalmente a traves de bacterias, parasitos, virus u hongos, aunque los Acs IgA y ciertas cadenas L de la Ig tambien se ha descrito que activan esta via. La activaci6n de la via alternativa se inicia cuando el factor B circulante se une a C3 activado (ya sea C3b o C3H20). Este complejo se escinde a continuaci6n, a traves de factor D circulante, para proporcionar un fragmento enzimaticamente activo, C3Bb. C3Bb escinde C3 que genera C3b, el cual dirige la inflamaci6n y tambien amplifica adicionalmente el proceso de activaci6n, generando un bucle de retroalimentaci6n positiva. Se requieren ambos componentes (el factor B y el factor D) para permitir la activaci6n de la via alternativa.
Estudios recientes han mostrado que la via alternativa del complemento desempefa un papel importante en la patogenesis de varios modelos animales de enfermedad. La activaci6n del complemento dentro del rif6n despues de I/R esta mediada casi exclusivamente por la via alternativa (Thurman) y la via alternativa tiene un papel decisivo en el desarrollo de la artritis. Tal vez lo mas sorprendente es que se ha mostrado que ratones carentes de la via alternativa estan protegidos contra la nefritis en el modelo MRL/lpr de nefritis lupica (Watanabe) y contra la perdida fetal mediada por antifosfolipidos (Girardi), modelos en los que se habia asumido tradicionalmente que estaban mediados por la via clasica del complemento.
Ya se han desarrollado varios inhibidores para inhibir el sistema del complemento en diversas fases de activaci6n (Holers), aunque no se han descrito ampliamente inhibidores especificos de la via alternativa antes de la presente invenci6n. El documento de publicaci6n PCT W0 01/47963, publicado el 4 de julio de 2001, describe polipeptidos procedentes de sanguijuelas ectoparasitas que inhiben la via alternativa de activaci6n del complemento in vitro y que no tienen sustancialmente ningun efecto sobre la activaci6n del complemento por la ruta clasica. Se mostr6 que estos peptidos se unen al factor D; sin embargo, no se mostr6 ninguna aplicaci6n in vivo de estos polipeptidos. Un reactivo con la capacidad de inhibir especificamente la via alternativa in vivo tendria te6ricamente varias ventajas, en comparaci6n con los inhibidores existentes de la cascada del complemento. En primer lugar, para modelos tales como la I/R renal y la perdida fetal mediada y antifosfolipidos, que estan mediadas principalmente por la via alternativa, un inhibidor de este tipo deberia ser igualmente eficaz como inhibidor universal del complemento, sin embargo, deberia tener menos efectos secundarios inmunosupresores. Aunque solo se ha descrito un paciente humano con carencia congenita del factor B (Densen), estudios de genes dirigidos a ratones carentes del factor B (fB-/-) aun no han demostrado un efecto inmunomodulador de este factor (Densen; Matsumoto). Los pacientes con carencias congenitas de los componentes de la via clasica, por el contrario, parecen tener un mayor riesgo de infecci6n (mas comunmente estafilococos y estreptococos). La inhibici6n de los componentes de la via clasica o C3 (comun a todas las vias del complemento) tambien podria estar asociada con la autoinmunidad (Figueroa), quizas explicando por que la carencia de factor B protege a los ratones MRL/lpr de desarrollar glomerulonefritis, pero la carencia de C3 no lo hace (Watanabe). Por lo tanto, la inhibici6n de la via alternativa se puede tolerar mejor y en algunos casos de forma mas eficaz que la inhibici6n de la via clasica del complemento.
El asma alergica es un sindrome comun asociado con la inflamaci6n y la hiperreactividad de las vias respiratorias (AHR) (Busse). En los pacientes con asma alergica, la exposici6n a un alergeno inhalado conduce a un incremento de la AHR y la inflamaci6n de las vias respiratorias y unos estudios han mostrado niveles incrementados de fragmentos biol6gicamente activos obtenidos a partir de la familia de proteinas C3, C4 y C5 del complemento, especialmente C3a (Humbles) y C5a (Krug) en el fluido del lavado broncoalveolar (BAL). Esto sugiere que en estos pacientes, despues de la exposici6n al alergeno, la activaci6n de la via del complemento a traves de un mecanismo inducido por alergeno se produce en el pulm6n. Los modelos animales han aportado una mayor comprensi6n de la funci6n del complemento en el desarrollo de una enfermedad alergica de las vias respiratorias. Animales carentes de receptores de C3 o C3a parecen estar protegidos contra el desarrollo de una enfermedad de las vias respiratorias inducida por alergeno (Humbles, Drouin; Bautsch; Walters).
Se han propuesto diversas posibilidades diferentes para inducir la activaci6n del complemento despues de una exposici6n a alergeno. Por ejemplo, los complejos inmunes de alergeno-IgG podrian desencadenar la activaci6n de la via clasica y ciertos antigenos pueden activar directamente C3 a traves de la via alternativa (Kohl). Ademas, la triptasa neutra liberada por los mastocitos o los macr6fagos pulmonares puede escindir de forma directa (proteolitica) C3 o C5 (Schwartz; Mulligan). Las tres vias de activaci6n del complemento (clasica, alternativa y lectina) convergen en el componente central del complemento C3. Por lo tanto, la inhibici6n de la activaci6n de C3 impide la escisi6n en fragmentos C3 activos, pero tambien reduce en gran medida la activaci6n posterior de C5 y la liberaci6n de fragmentos activados obtenidos a partir de C5 (Sahu). Estudios recientes han mostrado que la inhibici6n de la activaci6n del complemento durante la exposici6n de animales sensibilizados a alergenos mediante el uso de inhibidores de la convertasa C3, y por lo tanto la inhibici6n de las tres vias de activaci6n, reduce la respuesta tardia de las vias respiratorias (Abe), asi como el desarrollo de AHR y la inflamaci6n de las vias respiratorias (Taube). El documento de publicaci6n PCT n° W0 2004/022096, publicado el 18 de marzo de 2004, describe la inhibici6n de la via del complemento, preferentemente a traves de los componentes terminales del complemento de C5-C9 que participan en todas las vias y, lo mas preferiblemente, a traves de la inhibici6n de C5a.
Actualmente, la terapia para el tratamiento de enfermedades inflamatorias que implican AHR, tales como el asma de moderada a grave y la enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica, implica predominantemente el uso de glucocorticosteroides y otros agentes antiinflamatorios. Estos agentes, sin embargo, tienen el peligro de efectos secundarios graves, incluyendo, pero no limitados a, aumento de la susceptibilidad a una infecci6n, toxicidad hepatica, enfermedad pulmonar inducida por farmacos y supresi6n de la medula 6sea. Por lo tanto, tales farmacos estan limitados en su uso clinico para el tratamiento de enfermedades pulmonares asociadas con la hiperreactividad de las vias respiratorias. El uso de reactivos antiinflamatorios y de alivio sintomatico es un problema grave debido a sus efectos secundarios o a su deficiencia para atacar la causa subyacente de una respuesta inflamatoria. Existe una necesidad constante de reactivos menos perjudiciales y mas eficaces para el tratamiento de la inflamaci6n. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de procedimientos que utilizan reactivos con perfiles de efectos secundarios menores, menos toxicidad y mas especificidad para la causa subyacente de las enfermedades alergicas de las vias respiratorias, tales como el asma y la afecci6n conocida como AHR.
Compendio de la invenci6n
Una realizaci6n de la presente invenci6n se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento del mismo que se une a antigeno que se une selectivamente al factor B procedente al menos de ser humano o rat6n, dentro del tercer dominio de la repetici6n corta de consenso (SCR), en donde el anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno evita la formaci6n de un complejo C3bBb. En un aspecto, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, se une al factor B y evita o inhibe la escisi6n del factor B por el factor D. En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno, se une al tercer dominio de la repetici6n corta de consenso (SCR) del factor B humano. En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se une a un epitopo en el tercer dominio de la SCR del factor B seleccionado entre: (a) un epitopo del factor B que incluye al menos una porci6n del factor B humano (SEQ ID N0: 2) que comprende desde aproximadamente la posici6n Tyr139 hasta aproximadamente la posici6n Ser185, o posiciones equivalentes a las mismas en una secuencia del factor B no humano; (b) un epitopo del factor B que incluye al menos una porci6n de factor B humano (SEQ ID N0: 2) que comprende desde aproximadamente la posici6n Tyr139 hasta aproximadamente la posici6n Ser141, o posiciones equivalentes a las mismas en una secuencia del factor B no humano; (c) un epitopo del factor B que incluye al menos una porci6n del factor B humano (SEQ ID N0: 2) que comprende desde aproximadamente la posici6n Glu182 hasta aproximadamente la posici6n Ser185, o posiciones equivalentes a las mismas en una secuencia del factor B no humano; o (d) un epitopo del factor B que incluye al menos una porci6n del factor B humano (SEQ ID N0: 2) que comprende una cualquiera o mas de las siguientes posiciones o de sus posiciones equivalentes en una secuencia del factor B no humano: Tyr139, Cys140, Ser141, Glu182, Gly1 84 o Ser185. En aun otro aspecto, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, se une selectivamente a un epitopo en el tercer dominio de la SCR del factor B (SEQ ID N0: 2) que comprende una o varias de las siguientes posiciones de aminoacidos o sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190 y Ser192. En otro aspecto, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, se une selectivamente a un epitopo en el tercer dominio de la SCR del factor B (SEQ ID N0: 2) que comprende las siguientes posiciones de aminoacidos o sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glul190 y Ser192. En aun otro aspecto, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, se une selectivamente a un epitopo en el tercer dominio de la SCR del factor B (SEQ ID N0: 2) que consiste en las siguientes posiciones de aminoacidos o sus posiciones equivalentes en una secuencia del factor B no humano: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190 y Ser192. El anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se puede unir a un epitopo no lineal dentro de la estructura tridimensional de una porci6n del tercer dominio de la SCR del factor B, en donde la porci6n se define por al menos las posiciones de aminoacidos Ala137-Ser192 de SEQ ID N0: 2 o posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano. En otro aspecto, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, se une selectivamente a un factor B procedente de multiples especies de mamiferos (por ejemplo, ser humano y un animal seleccionado entre el grupo que consiste en primate no humano, rat6n, rata, cerdo, caballo y conejo). El anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno puede tener un isotipo o una subclase que no activa el complemento, puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecifico o un anticuerpo monovalente. El fragmento que se une a antigeno puede incluir un fragmento Fab. En una realizaci6n preferida, el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 1379 (producido por la ATCC n° de dep6sito PTA-6230).
0tra realizaci6n de la presente invenci6n se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento del mismo que se une a antigeno que se une selectivamente al factor B y evita la formaci6n de un complejo C3bBb, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo inhibe competitivamente la uni6n especifica del anticuerpo monoclonal 1379 (producido por la ATCC n° de dep6sito PTA-6230) al factor B humano y de rat6n, y en donde la capacidad del anticuerpo monoclonal 1379 para inhibir la via alternativa del complemento se inhibe cuando el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, se une al factor B humano. En un aspecto, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, inhibe competitivamente la uni6n del anticuerpo monoclonal 1379 con el factor B humano, en donde la especificidad comparativa de la uni6n se determina mediante un ensayo de competencia anticuerpoanticuerpo en presencia de factor B humano.
0tra realizaci6n de la presente invenci6n se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento del mismo que se une selectivamente al factor B humano y que evita la formaci6n de un complejo C3bBb, en donde el anticuerpo aislado o un fragmento del mismo inhibe competitivamente la uni6n especifica al factor B humano de un segundo anticuerpo o de un fragmento del mismo que se une a antigeno, y en donde el segundo anticuerpo o el fragmento del mismo que se une a antigeno se une al tercer dominio de la SCR del factor B humano, y se une selectivamente al factor B procedente de al menos ser humano y rat6n.
Tambien se incluyen en la presente invenci6n composiciones que comprenden cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente y fragmentos que se unen a antigeno.
Ademas, otra realizaci6n de la presente invenci6n se refiere a un anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno para uso en un metodo para reducir o prevenir la hiperreactividad (AHR) de las vias respiratorias o la inflamaci6n de las vias respiratorias en un animal. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno tal como se ha descrito anteriormente, se administra a un animal que tiene hiperreactividad de las vias respiratorias asociada con inflamaci6n o inflamaci6n de las vias respiratorias, o que tiene el riesgo de desarrollarlas. En un aspecto, el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra a traves de una via seleccionada entre el grupo que consiste en las vias oral, nasal, t6pica, inhalada, intratraqueal, transdermica, rectal y parenteral. En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra al animal en una cantidad eficaz para reducir sensiblemente la hiperreactividad de las vias respiratorias en el animal, en comparaci6n con antes de la administraci6n del anticuerpo o del fragmento que se une a antigeno. En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra al animal en una cantidad eficaz para reducir sensiblemente la hiperreactividad de las vias respiratorias en el animal, en comparaci6n con un nivel de hiperreactividad de las vias respiratorias en una poblaci6n de animales que tienen inflamaci6n en donde el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno no se habia administrado. En un aspecto, la administraci6n del anticuerpo o del fragmento que se une a antigeno disminuye la capacidad de respuesta del animal a la metacolina o la histamina. En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra con un vehiculo farmaceuticamente aceptable seleccionado entre el grupo que consiste en: un polvo seco dispersable; etanol anhidro; capsulas pequefas; liposomas; una pulverizaci6n nebulizada; y un excipiente inyectable. En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra en un vehiculo o un dispositivo seleccionado entre el grupo que consiste en: etanol anhidro; un sistema de inhalaci6n de polvo seco; un sistema de inhalaci6n por ultrasonidos; un inhalador de dosis medidas presurizado; y un dispositivo de soluci6n medida. En aun otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra a dicho mamifero en combinaci6n con un agente seleccionado entre el grupo que consiste en: corticosteroides, ?-agonistas (de acci6n prolongada o corta), modificadores de leucotrienos, antihistaminicos, inhibidores de fosfodiesterasas, cromoglicato de sodio, Nedocromil, teofilina, antagonistas de citocinas, antagonistas del receptor de citocinas, anti-IgE e inhibidores de la funci6n de linfocitos T. En aun otro aspecto, la hiperreactividad de las vias respiratorias o la inflamaci6n de las vias respiratorias se asocia con una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en asma, enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica (EP0C), aspergilosis broncopulmonar alergica, neumonia por hipersensibilidad, neumonia eosinofilica, enfisema, bronquitis, bronquiectasia, bronquitis alergica, fibrosis quistica, tuberculosis, neumonitis por hipersensibilidad, asma ocupacional, sarcoidosis, sindrome de la enfermedad de las vias respiratorias reactivas, enfermedad pulmonar intersticial, sindrome hipereosinofilico, rinitis, sinusitis, asma inducida por el ejercicio, asma inducida por la contaminaci6n, tos variante de asma, enfermedad pulmonar parasitaria, infecci6n por el virus sincitial respiratorio (VSC), infecci6n por el virus de la parainfluenza (VPI), infecci6n por rinovirus (RV) e infecci6n por adenovirus. En un aspecto, la hiperreactividad de las vias respiratorias se asocia con la inflamaci6n alergica. El anticuerpo o el fragmento de la presente invenci6n se puede administrar, en una realizaci6n preferida, a mamiferos, y mas preferiblemente, a seres humanos.
Breve Descripci6n de las Figuras
La Fig. 1 es un diagrama esquematico que muestra la construcci6n de una proteina de fusi6n de factor B-Ig.
La Fig. 2A es un grafico de lineas que muestra que el anti-factor B inhibia completamente la via alternativa del complemento en un ensayo con zimosano cuando se afadieron 3 Ig a una reacci6n que contenia 10 Il de suero.
La Fig. 2B es un grafico de lineas que muestra que el anti-factor B inhibia completamente la via alternativa del complemento en un ensayo de lisis de eritrocitos de conejo cuando se afadieron 6 Ig de anticuerpo a 10 Il de suero humano.
La Fig. 3 es un grafico de lineas que muestra que la administraci6n de anti-factor B a ratones inhibe la via alternativa del complemento.
La Fig. 4A es un grafico de lineas para la resistencia de las vias respiratorias (RL) que muestra que ratones fB +/+ sensibilizados al alergeno y estimulados mostraron un aumento de la capacidad de respuesta a la metacolina en comparaci6n con ratones fB +/+ solamente estimulados, mientras que los ratones fB -/-mostraron una respuesta significativamente menor a la metacolina.
La Fig. 4B es un grafico de lineas para la distensibilidad dinamica (Cdyn) que muestra que ratones fB +/+ sensibilizados al alergeno y estimulados mostraban una mayor capacidad de respuesta a la metacolina en comparaci6n con ratones fB +/+ unicamente estimulados, mientras que los ratones fB -/- mostraron una respuesta significativamente menor a la metacolina.
La Fig. 5 es un grafico de barras que caracteriza el fluido del BAL y el tejido pulmonar de ratones fB -/- despues de sensibilizaci6n y estimulaci6n de las vias respiratorias.
La Fig. 6A es un grafico de lineas para la resistencia de las vias respiratorias (RL) que muestra que ratones fB -/sensibilizados a la ambrosia y estimulados mostraban una disminuci6n en la capacidad de respuesta a la metacolina, mientras que los fB +/+ desarrollaron una fuerte respuesta a la metacolina.
La Fig. 6B es un grafico de lineas para la distensibilidad dinamica (Cdyn) que muestra que ratones fB -/sensibilizados a la ambrosia y estimulados mostraban una disminuci6n en la capacidad de respuesta a la metacolina, mientras que los fB +/+ desarrollaron una fuerte respuesta a la metacolina.
La Fig. 6C es un grafico de barras que caracteriza el fluido del BAL y el tejido pulmonar y que muestra la inflamaci6n de las vias respiratorias en el fluido del BAL se redujo en los ratones fB -/- sensibilizados a la ambrosia y estimulados, en comparaci6n con los ratones fB +/+.
La Fig. 7A es un grafico de lineas que muestra que ratones fB -/- sensibilizados y estimulados tratados con el factor B antes de cada estimulaci6n, mostraban una disminuci6n de la respuesta a la metacolina similar a la de ratones fB /- sensibilizados y estimulados tratados con PBS, pero significativamente menor en comparaci6n con ratones fB +/+ sensibilizados y estimulados.
La Fig. 7B es un grafico de barras que muestra que la administraci6n del factor B reconstituye la capacidad de desarrollar AHR e inflamaci6n de las vias respiratorias en ratones fB -/-.
La Fig. 8A es un grafico de lineas de la resistencia de las vias respiratorias (RL) que muestra que tanto la administraci6n sistemica como nebulizada de un anticuerpo que neutraliza el factor B, inhibe el desarrollo de AHR en ratones sensibilizados y estimulados.
La Fig. 8B es un grafico de lineas para la distensibilidad dinamica (Cdyn) que muestra que tanto la administraci6n sistemica como nebulizada de un anticuerpo que neutraliza el factor B, inhibe el desarrollo de AHR en ratones sensibilizados y estimulados.
La Fig. 8C es un grafico de barras que caracteriza el fluido del BAL y el tejido pulmonar y que muestra que el tratamiento con anti-factor B tanto sistemico como nebulizado reduce el numero de eosin6filos en el fluido del BAL, la inflamaci6n peribronquial, el numero de eosin6filos peribronquiales, asi como el numero de celulas mucosas positivas en el epitelio de las vias respiratorias.
La Fig. 9 es un grafico de lineas que muestra que ratones C4 -/- sensibilizados y estimulados (rombo negro, n= 10) mostraban una respuesta similar frente a MCh inhalada que los ratones C4 +/+ sensibilizados y estimulados (cuadrado negro, n= 10) y unas respuestas significativamente mayores en comparaci6n con ratones C4 -/unicamente estimulados (rombo blanco, n = 10) y ratones C4 +/+ unicamente estimulados (cuadrado blanco, n= 10) (*p lt;0,05 comparado con fB -/- sensibilizado y estimulado, fB +/+ estimulado y fB -/- estimulado; # p lt;0,05 comparado con fB +/+ estimulado y fB -/- estimulado; 1 p lt;0,05 comparado con C4 +/+ estimulado y C4 -/estimulado).
La Fig. 10 es un grafico de lineas que muestra que ratones C4 -/- sensibilizados y estimulados (cuadrado negro, n = 8) mostraban una mayor resistencia de las vias respiratorias frente a MCh inhalada, en comparaci6n con ratones C4 -/- unicamente estimulados (cuadrado blanco, n = 8), y que el tratamiento de los ratones C4 -/- sensibilizados y estimulados con anticuerpo monoclonal sistemico anti-factor B disminuia la respuesta de las vias respiratorias frente a MCh (circulo negro, n = 8).
La Fig. 11 es un dibujo esquematico que muestra un modelo del cartografiado de los epitopos para AcM1379 en la superficie del factor B humano.
La Fig. 12 es un dibujo esquematico que muestra un complejo modelado de AcM1379 (un fragmento Fab) que se une al factor B, en el que los lados que se unen al antigeno del Fab se han modelado para cubrir toda la regi6n del epitopo cartografiado.
La Fig. 13 es un grafico de barras que muestra que los ratones que se trataron previamente con 1379 mostraron aumentos leves en nitr6geno ureico serico, 24 horas despues de la reperfusi6n, en comparaci6n con los testigos de tipo silvestre.
Descripci6n detallada de la invenci6n
Una realizaci6n de la presente invenci6n se refiere a proporcionar nuevos anticuerpos del factor B que bloquean selectivamente la via alternativa del complemento, y al uso de tales anticuerpos para inhibir la via alternativa del complemento en cualquier afecci6n o enfermedad en la que tal inhibici6n es deseada, es util o se espera que sea util. En concreto, dado el gran potencial en ventajas terapeuticas de un inhibidor especifico de la via alternativa del complemento para uso en metodos de tratamiento de muchas enfermedades, los presentes inventores han desarrollado varios anticuerpos monoclonales nuevos, inhibidores dirigidos contra el factor B. Varios de estos anticuerpos se han caracterizado y uno de estos anticuerpos se ha caracterizado con mas detalle. Este anticuerpo se ha sometido a ensayo in vitro, asi como in vivo, tanto en un modelo bien aceptado de inflamaci6n alergica y asma, como en un modelo de lesi6n renal por isquemia-reperfusi6n, que es generalmente aplicable a la lesi6n por isquemia-reperfusi6n. Para producir tales anticuerpos, a ratones carentes de factor B por selecci6n de gen (fB -/-) se les inyect6 una proteina de fusi6n constituida por el segundo y tercer dominios de la repetici6n corta de consenso (SCR) del factor B, unida a una inmunoglobulina. En los ratones se escrut6 una respuesta inmune frente al factor B, y se fusionaron celulas esplenicas de uno de los ratones inyectados, con celulas de mieloma. Uno de los hibridomas resultantes, denominado 1379, produce un anticuerpo IgG1 que inhibe la activaci6n de la via alternativa del complemento in vitro e in vivo, aunque los presentes inventores han producido y caracterizado multiples anticuerpos monoclonales con la capacidad de inhibir la via alternativa del complemento (vease la Tabla 4). El anticuerpo 1379 (tambien denominado en esta memoria AcM 1379) inhibe la activaci6n de la via alternativa en suero procedente de diversas especies animales incluyendo, ratones, ratas, seres humanos, babuinos, monos Rhesus, macacos cangrejeros, cerdos, conejos y caballos. Fragmentos Fab preparados a partir de este anticuerpo tambien dieron como resultado la inhibici6n completa de la via alternativa. Los inventores tambien han mostrado que el anticuerpo puede inhibir completamente la lisis de eritrocitos a traves del suero humano, lo que confirma la capacidad de este reactivo para bloquear completamente la activaci6n de la via alternativa del complemento. El cartografiado de epitopos se utiliz6 para mostrar que este anticuerpo se une al factor B dentro del tercer dominio de la repetici6n corta de consenso (SCR), y que el anticuerpo impide la formaci6n del complejo C3bBb. Una descripci6n detallada del epitopo reconocido por este anticuerpo se proporciona a continuaci6n. Por lo tanto, en esta memoria se describen inhibidores selectivos de la via alternativa del complemento, y en particular estos nuevos anticuerpos del factor B, que tienen una amplia especificidad de la reactividad, una eficacia demostrada in vitro e in vivo, y que son herramientas terapeuticas muy eficaces para uso en cualquiera entre una variedad de afecciones y enfermedades en las que la inhibici6n selectiva de la via del complemento es util, necesaria y/o preferida (por ejemplo, afecciones asociadas con la hiperreactividad de las vias respiratorias y la inflamaci6n de las vias respiratorias (ver mas abajo), lesi6n por isquemia-reperfusi6n, etc.). Estos anticuerpos tambien pueden estar humanizados o manipulados de otra manera para reducir los efectos secundarios potenciales sobre el sistema inmune y, por lo tanto, son un nuevo reactivo terapeutico, valioso.
Los anticuerpos que han sido producidos por los presentes inventores reconocen un sitio en el factor B que se comparte en diversas especies de mamiferos (incluidos los humanos) en el que se realizan experimentos preclinicos de prueba de principio, permitiendo de este modo que descubrimientos en modelos de enfermedades humanas se trasladen facilmente a terapias humanas. Antes de la presente invenci6n, los inventores no tenian conocimiento de ningun otro anticuerpo contra el factor B que mostrara una inhibici6n de amplio espectro de la proteina, como la que tiene el anticuerpo de la presente invenci6n. Por lo tanto, los presentes inventores tambien han identificado un sitio unico en el factor B contra el que se pueden desarrollar nuevos reactivos inhibidores. La identificaci6n del factor B y de las otras proteinas en la via alternativa del complemento, como dianas terapeuticas especificas, proporciona tanto una estrategia terapeutica racional, como compuestos guias que se pueden seguir para el tratamiento de enfermedades inflamatorias de las vias respiratorias y otras enfermedades. Existen ventajas en el bloqueo selectivo de la via alternativa. Por ejemplo, ratones C4 -/- (ratones que carecen del componente C4 del complemento que es generico para las vias del complemento clasica, alternativa y de lectinas), pero no ratones fB -/- (carentes del factor B), parecen mas susceptibles a una infecci6n bacteriana experimental, lo que sugiere que al dejar la via clasica intacta, un inhibidor de la via alternativa plantea menos riesgo de infecci6n grave. El bloqueo de la via clasica tambien puede dar como resultado una autoinmunidad y los pacientes con carencias congenitas de componentes de la via clasica tienen un mayor riesgo de infecci6n y de autoinmunidad. La inhibici6n selectiva de la via alternativa evita la generaci6n de ligandos obtenidos a partir de C3 para el receptor C3a, asi como para los receptores del complemento 1-4 y C5a. Los efectos del bloqueo de la via alternativa pueden ser, de hecho, mas directos, debido a que los receptores, todavia mal caracterizados, para los productos de la activaci6n de Ba o Bb del factor B que se generan durante el proceso de activaci6n.
0tra realizaci6n de la presente invenci6n se refiere a un descubrimiento sorprendente de los presentes inventores en el que la activaci6n de la cascada del complemento a traves de la via alternativa es decisiva y, de hecho, necesaria y suficiente para el desarrollo de hiperreactividad de las vias respiratorias e inflamaci6n de las vias respiratorias. Mas particularmente, los presentes inventores describen en este documento el descubrimiento de que la inhibici6n de la via alternativa, pero no de la via clasica del complemento, evita la hiperreactividad de las vias respiratorias y reduce la inflamaci6n de las vias respiratorias. Los inventores muestran este descubrimiento usando ratones carentes de factor B (es decir, a traves de tecnologia de genes inactivados) y mediante la inhibici6n del factor B con anticuerpos monoclonales (administrados de forma sistemica y mediante aerosol). Por tanto, los inventores describen en este documento la inhibici6n selectiva de la via alternativa del complemento a traves de este medio o de cualquier otro (por ejemplo, mediante una carencia o una inhibici6n del factor D o de properdina), para inhibir la hiperreactividad de las vias respiratorias y la inflamaci6n de las vias respiratorias. Los presentes inventores han mostrado que el factor B es necesario para la inducci6n del asma experimental. Es importante destacar que el factor B es esencial para la fase de estimulaci6n (o efectora) de este modelo, y la inhalaci6n de un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente al factor B en el pulm6n o que se administra sistemicamente, bloquea el desarrollo de la hiperreactividad de las vias respiratorias (AHR) y la inflamaci6n de las vias respiratorias asociada con la enfermedad alergica inflamatoria, como se ejemplifica en un modelo experimental de asma. Por otra parte, los presentes inventores han descubierto que esta inhibici6n se logra especificamente a traves de la inhibici6n de la via alternativa del complemento, ya que unos resultados adicionales mostraron que ratones con el gen de C4 inactivado (C4 -/-) no estaban protegidos contra la AHR, mientras que ratones con el gen del factor B inactivado (fB -/-) estaban protegidos contra la AHR en este sistema de modelo. Por lo tanto, los presentes inventores han descubierto que la inhibici6n de la via alternativa del complemento (por cualquier medio) es necesaria y suficiente para inhibir la AHR y la inflamaci6n de las vias respiratorias y de ese modo para tratar o prevenir afecciones y enfermedades relacionadas con las mismas. Ademas, los inventores muestran que la inhibici6n de la via clasica del complemento no es necesaria para inhibir la AHR o la inflamaci6n de las vias respiratorias y, por lo tanto, tal y como se ha descrito anteriormente, se pueden evitar unas consecuencias no deseables asociadas con la inhibici6n de la via clasica del complemento, siguiendo las ensefanzas de la presente invenci6n.
Anticuerpos del ffctor B
Por consiguiente, una primera realizaci6n de la presente invenci6n se refiere a un anticuerpo o a un fragmento del mismo que se une a antigeno que inhibe selectivamente la via alternativa del complemento y, en particular, a un anticuerpo del factor B. En un aspecto, el anticuerpo se une selectivamente a la proteina de la via alternativa del complemento de una manera tal que la proteina se inhibe o se evita que se una a otra proteina con la que normalmente interacciona (en condiciones naturales o fisiol6gicas). En otro aspecto, el anticuerpo se une selectivamente a la proteina de tal manera que la proteina se inhibe o se evita la activaci6n de otra proteina con la que normalmente interacciona, a pesar de que la proteina puede unirse al menos parcialmente a la otra proteina. Anticuerpos particularmente preferidos y fragmentos de los mismos que se unen a antigeno para uso en la inhibici6n selectiva de la via alternativa del complemento, incluyen los anticuerpos del factor B descritos en este documento y, en particular, el anticuerpo AcM 1379 descrito con detalle en este documento.
Los anticuerpos (y fragmentos de los mismos que se unen a antigeno) que se unen selectivamente al factor B e inhiben la via alternativa del complemento de acuerdo con la invenci6n, se describen y se ejemplifican con detalle en este documento. En una realizaci6n, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, se une a una superficie de uni6n conservada o a un epitopo de una proteina de este tipo (por ejemplo, el factor B) que se conserva entre las especies animales, y particularmente las especies de mamiferos (es decir, el anticuerpo tiene reactividad cruzada con la proteina procedente de dos o mas especies de diferentes mamiferos). En particular, la presente invenci6n incluye un anticuerpo que se une al factor B, procedente de al menos dos y, preferentemente, varias especies de diferentes mamiferos, incluyendo, pero no limitadas a, ser humano, primate no humano, rat6n, rata, cerdo, caballo y conejo. La presente invenci6n incluye un anticuerpo que se une al factor B procedente del ser humano y del rat6n. En una realizaci6n, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, se une a la tercera repetici6n corta de consenso (SCR) del factor B. En una realizaci6n, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, se une a una regi6n del factor B que impide la escisi6n del factor B a traves del factor D. En una realizaci6n, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una realizaci6n, el anticuerpo es el anticuerpo denominado en este documento 1379 (es decir, el anticuerpo producido por la linea celular de hibridoma del mismo numero, que tambien tiene la Designaci6n de Dep6sito PTA-6230 en la ATCC), o un fragmento del mismo que se une a antigeno.
El hibridoma descrito en este documento como 1379 (o AcM 1379) se deposit6 el 21 de septiembre de 2004, en la American Type Culture Collection (ATCC, situada en 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209), segun los terminos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Dep6sito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes, y ha recibido la Designaci6n de Dep6sito PTA-6230 en la ATCC.
De acuerdo con la presente invenci6n, el tamafo minimo de una proteina, una porci6n de una proteina (por ejemplo, un fragmento, una porci6n, un dominio, etc.), o una regi6n o un epitopo de una proteina, es un tamafo suficiente para servir como un epitopo o una superficie conservada de uni6n para la generaci6n de un anticuerpo o como una diana en un ensayo in vitro. En una realizaci6n, una proteina de la presente invenci6n tiene una longitud de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 o 8 aminoacidos (por ejemplo, adecuada para un epitopo de anticuerpo o como un peptido detectable en un ensayo), o de al menos aproximadamente 25 aminoacidos de longitud, o al menos aproximadamente 50 aminoacidos de longitud, o al menos aproximadamente 100 aminoacidos de longitud, o al menos aproximadamente 150 aminoacidos de longitud, y asi sucesivamente, con cualquier longitud entre 4 aminoacidos y hasta la longitud total de una proteina o de una porci6n de la misma o mas larga, en numeros enteros (por ejemplo, 8, 9, 10,...25, 26,...500, 501,...).
La secuencia de nucle6tidos del gen y la regi6n codificadora que codifica el factor B humano y otras proteinas del complemento, asi como la secuencia de aminoacidos de tales proteinas, son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, el gen que codifica el factor B humano y otras proteinas del complemento se encuentra en la base de datos de NCBI con el n° de orden NG 000013. La secuencia codificadora del factor B se encuentra en la base de datos de NCBI con el n° de orden NM 001710 y la secuencia de aminoacidos de la preproteina del factor B se encuentra en la base de datos de NCBI con el n° de orden NP 001701 o P00751. La secuencia de aminoacidos del n° de orden P00751 de la base de datos de NCBI, que es una secuencia de la preproteina del factor B humano, se representa en este documento por SEQ ID N0: 1. Las secuencias procedentes de otras especies animales tambien son conocidas en la tecnica. A modo de comparaci6n, en la secuencia del factor B de rat6n (por ejemplo, vease en la base de datos de NCBI, el n° de orden P04186, representado en este documento por SEQ ID N0: 6), el tercer dominio de la SCR se encuentra en las posiciones 160 a 217 de esta preproteina de 761 aminoacidos, y la proteina madura del factor B de murido abarca las posiciones 23 a 761 de SEQ ID N0: 6.
La preproteina del factor B humano representada por SEQ ID N0: 1, es una proteina de 764 aminoacidos con un peptido sefal que abarca las posiciones de los aminoacidos 1-25. La cadena madura del factor B se corresponde a las posiciones 26-764 de SEQ ID N0: 1 y se representa en esta memoria por SEQ ID N0: 2. Las tres regiones de la SCR del factor B humano estan representadas en este documento por SEQ ID N0: 3 (SCR1, tambien conocida como Sushi 1, que abarca desde aproximadamente la posici6n 35 a aproximadamente la posici6n 100 de SEQ ID N0: 1 o desde aproximadamente la posici6n 5 a aproximadamente la posici6n 75 de SEQ ID N0: 2), SEQ ID N0: 4 (SCR2, tambien conocida como Sushi 2, que abarca desde aproximadamente la posici6n 101 hasta aproximadamente la posici6n 160 de SEQ ID N0: 1 o desde aproximadamente la posici6n 76 a aproximadamente la posici6n 135 de SEQ ID N0: 2), y SEQ ID N0: 5 (SCR3, tambien conocida como Sushi 3, que se extiende desde aproximadamente la posici6n 163 hasta aproximadamente la posici6n 220 de SEQ ID N0: 1 o desde aproximadamente la posici6n 138 hasta aproximadamente la posici6n 195 de SEQ ID N0: 2).
Basandose en el cartografiado de los epitopos de un anticuerpo ejemplar de la invenci6n, empleando los fragmentos descritos por Hourcade, 1995, J. Biol. Cher. (veanse los Ejemplos), un anticuerpo anti-factor B de la presente invenci6n se une preferentemente a un epitopo o a una superficie de uni6n conservada dentro del tercer dominio de SCR o que contiene una parte del mismo, y mas preferentemente, a un epitopo del factor B humano que incluye al menos una porci6n de la secuencia que comprende desde aproximadamente la posici6n Tyr139 hasta aproximadamente la posici6n Ser185, con respecto a la proteina madura del factor B (SEQ ID N0: 2), a un epitopo del factor B humano que incluye al menos una porci6n de la secuencia que comprende desde aproximadamente la posici6n Tyr139 hasta aproximadamente la posici6n Ser141, con respecto a la proteina madura del factor B (SEQ ID N0: 2), a un epitopo del factor B humano que incluye al menos una porci6n de la secuencia que comprende desde aproximadamente la posici6n Glu182 hasta aproximadamente la posici6n Ser185, con respecto a la proteina madura del factor B (SEQ ID N0: 2), a un epitopo del factor B que incluye al menos una porci6n del factor B humano (SEQ ID N0: 2) que comprende una cualquiera o mas de las siguientes posiciones o sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano: Tyr139, Cys140, Ser141, Glu182, Gly184 o Ser185, o a un epitopo del factor B que incluye al menos una porci6n de las posiciones equivalentes con respecto a especies animales no humanas. Un experto en la tecnica puede alinear facilmente la secuencia del factor B humano con la secuencia del factor B de otra especie animal y determinar las posiciones de las regiones SCR y las porciones especificas de las terceras regiones SCR correspondientes a las posiciones de aminoacidos anteriores. Por ejemplo, dos secuencias especificas se pueden alinear entre si utilizando la secuencia BLAST2, tal y como se describe en Tatusova y Madden, (1999), quot;Blast 2 sequences -a new tool for comparing protein and nucleotide sequencesquot;, FEMS Microbiol. Lett. 174:247
250.
Basandose en la creaci6n de modelos de epitopos adicionales y el cartografiado de un anticuerpo ejemplar de la invenci6n, en otra realizaci6n preferida, un anticuerpo anti-factor B de la presente invenci6n se une preferentemente a un epitopo (una superficie de uni6n conservada) dentro del tercer dominio de la SCR del factor B o que contiene una parte o porci6n del mismo, que incluye al menos una o varias de las siguientes posiciones de aminoacido con respecto a SEQ ID N0: 2, o a sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano: A137, Y139, S141, E182, S185, T189, E190 y S192. En un aspecto de la invenci6n, el epitopo esta dentro del tercer dominio de la SCR del factor B o contiene una parte de la porci6n del mismo que incluye la totalidad o sustancialmente la totalidad (al menos cinco, seis o siete) de las siguientes posiciones de aminoacidos de SEQ ID N0: 2, o de sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190 y Ser192. En aun otro aspecto, el epitopo reconocido por un anticuerpo anti-factor B de la presente invenci6n esta dentro o contiene una parte o una porci6n del tercer dominio de la SCR del factor B que consiste en las siguientes posiciones de aminoacidos de SEQ ID N0: 2, o sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190 y Ser192.
En una realizaci6n, el epitopo reconocido por un anticuerpo del factor B de la invenci6n tambien puede definirse mas particularmente como un epitopo no lineal, situado dentro de la estructura tridimensional de una porci6n del tercer dominio de la SCR del factor B. La porci6n que contiene el epitopo es la estructura tridimensional del factor B que esta definida por sustancialmente todas (por ejemplo, al menos aproximadamente 90%) las posiciones de aminoacidos Ala137-Ser192 de SEQ ID N0: 2, o posiciones equivalentes en una secuencia no-humana del factor B, cuando dicha secuencia tiene la misma disposici6n conformacional que la secuencia de factor B de longitud completa natural. Un modelo de la estructura tridimensional del factor B, que ilustra un epitopo de AcM 1379 se ilustra en la Fig. 11 y la Fig. 12, por ejemplo. Tal y como se emplea en este documento, la quot;estructura tridimensionalquot;
o quot;estructura terciariaquot; de una proteina se refiere a la disposici6n de los componentes de la proteina en tres dimensiones. Tal expresi6n es bien conocida por los expertos en la tecnica. Tal y como se usa en este documento, el termino quot;modeloquot; se refiere a una representaci6n en un medio tangible de la estructura tridimensional de una proteina, polipeptido o peptido. Por ejemplo, un modelo puede ser una representaci6n de la estructura tridimensional en un archivo electr6nico, en una pantalla de ordenador, en un trozo de papel (es decir, en un medio bidimensional) y/o como una figura de barras y esferas.
De acuerdo con la presente invenci6n, un quot;epitopoquot; de una proteina o un peptido dados u otra molecula se define generalmente con respecto a los anticuerpos, como una parte o un sitio en una molecula mas grande a la que se unira un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, y contra el cual se producira un anticuerpo. El termino epitopo se puede utilizar de forma intercambiable con la expresi6n quot;determinante antigenicoquot;, quot;sitio de uni6n del anticuerpoquot; o quot;superficie de uni6n conservadaquot; de una proteina o un antigeno dados. Mas especificamente, un epitopo se puede definir tanto por los residuos de aminoacidos implicados en la uni6n del anticuerpo como por su conformaci6n en el espacio tridimensional (por ejemplo, un epitopo conformacional o la superficie de uni6n conservada). Un epitopo puede estar incluido en peptidos tan pequefos como aproximadamente 4-6 residuos de aminoacidos, o puede estar incluido en segmentos mas grandes de una proteina, y no tiene que estar compuesto por residuos de aminoacidos contiguos cuando se refiere a una estructura tridimensional de un epitopo, en particular con respecto a un epitopo que se une a anticuerpo. Los epitopos que se unen a anticuerpos son frecuentemente epitopos conformacionales en lugar de un epitopo secuencial (es decir, un epitopo lineal), o en otras palabras, un epitopo definido por residuos de aminoacidos dispuestos en tres dimensiones en la superficie de una proteina o de un polipeptido al que se une un anticuerpo. Tal y como se ha mencionado anteriormente, el epitopo conformacional no se compone de una secuencia contigua de residuos de aminoacidos, pero en su lugar, los residuos estan tal vez muy separados en la secuencia primaria de la proteina, y se juntan para formar una superficie de uni6n por la forma en que la proteina se pliega en su conformaci6n natural en tres dimensiones. El epitopo reconocido por el AcM 1379 es un epitopo conformacional que no es un epitopo lineal.
Un experto en la tecnica puede identificar y/o ensamblar epitopos conformacionales y/o epitopos secuenciales utilizando tecnicas conocidas, incluyendo el analisis con mutaciones (por ejemplo, mutagenesis dirigida al sitio); protecci6n contra la degradaci6n proteolitica (obtenci6n de la huella de la proteina); analisis de mimotopos usando, por ejemplo, peptidos sinteticos y Pepscan, BIAcore o ELISA; cartografiado de la competencia de anticuerpos; selecci6n de una genoteca combinatoria de peptidos; espectrometria de masas que acopla una fuente de laser asistida por una matriz y un analisis por tiempo de vuelo (MALDI-T0F); o creaci6n de modelos tridimensionales (por ejemplo, usando cualquier programa informatico adecuado, incluyendo, pero no limitado a, M0LSCRIPT 2.0 (Avatar Software AB, Heleneborgsgatan 21C, SE-11731 Estocolmo, Suecia), el programa 0de pantalla grafica (Jones et. al., Actf Crystfllogrfphy, vol. A47, pag. 110, 1991), el programa GRASP de pantalla grafica, o el programa INSIGHT de pantalla grafica). Por ejemplo, se puede utilizar la sustituci6n molecular u otras tecnicas y la estructura tridimensional conocida de una proteina relacionada para crear el modelo de la estructura tridimensional del factor B y predecir el epitopo conformacional del anticuerpo que se une a esta estructura. En efecto, se puede utilizar una o cualquier combinaci6n de tales tecnicas para definir el epitopo que se une a los anticuerpos. Las Figs. 11 y 12 ilustran el uso de creaci6n de modelos tridimensionales, combinado con la informaci6n procedente del analisis de mimotopos y el analisis mutacional, para identificar el epitopo de un anticuerpo del factor B de la presente invenci6n.
Tal y como se usa en este documento, la expresi6n quot;se une selectivamente aquot; se refiere a la uni6n especifica de una proteina con otra (por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento del mismo o un ligando de un antigeno), en donde el nivel de la uni6n, tal como se mide mediante cualquier ensayo convencional (por ejemplo, un inmunoensayo), es estadisticamente significativamente mayor que el testigo de ruido de fondo para el ensayo. Por ejemplo, cuando se realiza un inmunoensayo, los testigos incluyen tipicamente un pocillo/tubo de reacci6n que contiene solo un anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno (es decir, en ausencia de antigeno), en donde una cantidad de reactividad (por ejemplo, la uni6n no especifica al pocillo) del anticuerpo o del fragmento del mismo que se une a antigeno, en ausencia del antigeno, se considera ruido de fondo. La uni6n puede medirse utilizando una variedad de metodos convencionales en la tecnica, incluyendo, pero no limitados a: transferencia Western, inmunotransferencia, ensayo de inmunoabsorci6n enzimatica (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitaci6n, resonancia de plasm6n superficial, quimioluminiscencia, polarizaci6n fluorescente, fosforescencia, analisis inmunohistoquimico, espectrometria de masas que acopla una fuente de laser asistida por una matriz y un analisis por tiempo de vuelo (MALDI-T0F), microcitometria, micromatrices, microscopia, clasificaci6n celular activada por fluorescencia (FACS) y citometria de flujo.
Una realizaci6n de la presente invenci6n incluye un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno que es un inhibidor competitivo de la uni6n del factor B con el anticuerpo anti-factor B (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 1379). De acuerdo con la presente invenci6n, un inhibidor competitivo del factor B que se une a un anticuerpo anti-factor B de la presente invenci6n, es un inhibidor (por ejemplo, otro anticuerpo o fragmento o polipeptido que se une a antigeno) que se une al factor B en el mismo epitopo o en un epitopo similar al del anticuerpo anti-factor B conocido de la presente invenci6n (por ejemplo, AcM 1379) de tal manera que se inhibe la uni6n del anticuerpo anti-factor B conocido con el factor B. Un inhibidor competitivo puede unirse a la diana (por ejemplo, el factor B) con una mayor afinidad hacia la diana que el anticuerpo anti-factor B. Se puede utilizar un inhibidor competitivo de una manera similar a la descrita en este documento para el anticuerpo 1379 anti-factor B (por ejemplo, para inhibir la via alternativa del complemento, para inhibir la hiperreactividad de las vias respiratorias en un animal, para inhibir la inflamaci6n de las vias respiratorias en un animal, para inhibir la lesi6n por isquemia reperfusi6n en un animal, etc.). Por ejemplo, una realizaci6n de la invenci6n se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento del mismo que se une a antigeno, que se une especificamente al factor B, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo inhibe competitivamente AcM 1379 en la uni6n especifica al factor B, y en donde, cuando el anticuerpo o el fragmento del mismo se une al factor B, la via alternativa del complemento se inhibe o, alternativamente, se inhibe la capacidad del AcM 1379 para inhibir la via alternativa del complemento. 0tra realizaci6n se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento del mismo que se une especificamente al factor B, en donde el anticuerpo aislado o un fragmento del mismo inhibe competitivamente un segundo anticuerpo o un fragmento del mismo en la uni6n especifica al factor B, y en donde el segundo anticuerpo o un fragmento del mismo se une al tercer dominio de la SCR del factor B.
Los ensayos de competencia se pueden realizar utilizando tecnicas convencionales en la tecnica (por ejemplo, ELISA de competencia u otros ensayos de uni6n). Por ejemplo, los inhibidores competitivos se pueden detectar y cuantificar por su capacidad para inhibir la uni6n del factor B a un anticuerpo anti-factor B marcado (por ejemplo, el AcM 1379). Ensayos de competencia anticuerpo-anticuerpo en presencia de factor B humano, se describen, por ejemplo, en el Ejemplo 3. Los inhibidores competitivos de la uni6n del factor B al anti-factor B 1379, se describen en el Ejemplo 3 y la Tabla 4.
De acuerdo con la presente invenci6n, los anticuerpos se caracterizan porque comprenden dominios de inmunoglobulinas y, como tales, son miembros de la superfamilia de proteinas inmunoglobulinas. En terminos generales, una molecula de anticuerpo comprende dos tipos de cadenas. Un tipo de cadena se denomina cadena pesada o H y la otra se denomina cadena ligera o L. Las dos cadenas estan presentes en una relaci6n equimolar, teniendo tipicamente cada molecula de anticuerpo dos cadenas H y dos cadenas L. Las dos cadenas H estan unidas entre si por enlaces disulfuro y cada cadena H se une a una cadena L a traves de un enlace disulfuro. Solo hay dos tipos de cadenas L denominadas cadenas lambda (A) y kappa (K). Por el contrario, existen cinco clases principales de cadena H denominadas isotipos. Las cinco clases incluyen inmunoglobulina M (IgM o I), inmunoglobulina D (IgD
o 5), inmunoglobulina G (IgG o y), inmunoglobulina A (IgA o a) y la inmunoglobulina E (IgE o E). Las caracteristicas distintivas entre dichos isotipos se definen por el dominio constante de la inmunoglobulina y se describen con detalle a continuaci6n. Las moleculas de inmunoglobulinas humanas comprenden nueve isotipos, IgM, IgD, IgE, cuatro subclases de IgG que incluyen IgG1 (y1), IgG2 (y2), IgG3 (y3) e IgG4 (y4), y dos subclases de IgA que incluyen IgA1 (a1) e IgA2 (a2). En los seres humanos, la subclase 3 de IgG e IgM son los activadores mas potentes del complemento (sistema de complemento clasico), mientras que la subclase 1 de IgG y en un grado aun menor, la 2, son activadores de moderados a bajos del sistema de complemento clasico. La subclase IgG4 no activa el sistema de complemento (clasico o alternativo). El unico isotipo de inmunoglobulina humana conocido por activar el sistema de complemento alternativo es IgA. En los ratones, las subclases de IgG son IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3. La IgG1 de murido no activa el complemento, mientras que IgG2a, IgG2b e IgG3 son activadoras del complemento.
Cada cadena H o L de una molecula de inmunoglobulina comprende dos regiones denominadas dominios variables de la cadena L (dominios VL) y dominios constantes de la cadena L (dominios CL), y dominios variables de la cadena H (dominios VH) y dominios constantes de la cadena H (dominios CH). Un dominio CH completo comprende tres subdominios (CH1, CH2, CH3) y una regi6n bisagra. En conjunto, una cadena H y una cadena L pueden formar un brazo de una molecula de inmunoglobulina que tiene una regi6n variable de inmunoglobulina. Una molecula de inmunoglobulina completa comprende dos brazos asociados (por ejemplo, unidos por disulfuro). Por lo tanto, cada brazo de una inmunoglobulina completa comprende una regi6n VH+L y una regi6n CH+L. Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresi6n quot;regi6n variablequot; o quot;regi6n Vquot; se refiere a una regi6n VH+L (tambien conocida como fragmento Fv), una regi6n VL o una regi6n VH. Tambien, tal y como se usa en este documento, la expresi6n quot;regi6n constantequot;
o quot;regi6n Cquot; se refiere a una regi6n CH+L, una regi6n CL o una regi6n CH.
Una digesti6n limitada de una inmunoglobulina con una proteasa puede producir dos fragmentos. Un fragmento que se une a antigeno se conoce como un fragmento Fab, Fab' o F(ab')2. Un fragmento que carece de la capacidad de unirse a antigeno se conoce como un fragmento Fc. Un fragmento Fab comprende un brazo de una molecula de inmunoglobulina que contiene una cadena L (dominios VL + CL) apareada con la regi6n VH y una porci6n de la regi6n CH (dominio CH1). Un fragmento Fab' se corresponde a un fragmento Fab con parte de la regi6n bisagra fijada al dominio CH1. Un fragmento F(ab')2 se corresponde a dos fragmentos Fab' que normalmente estan unidos covalentemente entre si a traves de un enlace disulfuro, tipicamente en las regiones bisagra.
El dominio CH define el isotipo de una inmunoglobulina y confiere diferentes caracteristicas funcionales dependiendo del isotipo. Por ejemplo, las regiones constantes I permiten la formaci6n de agregados pentamericos de moleculas IgM y las regiones constantes a permiten la formaci6n de dimeros.
La especificidad antigenica de una molecula de inmunoglobulina es conferida por la secuencia de aminoacidos de una regi6n variable o V. Como tales, las regiones V de diferentes moleculas de inmunoglobulinas pueden variar significativamente dependiendo de su especificidad antigenica. Ciertas porciones de una regi6n V estan mas conservadas que otras y se denominan regiones armaz6n (regiones FW). Por el contrario, ciertas porciones de una regi6n V son muy variables y se denominan regiones hipervariables. Cuando los dominios VL y VH se emparejan en una molecula de inmunoglobulina, las regiones hipervariables de cada dominio se asocian y crean bucles hipervariables que forman los sitios de uni6n al antigeno. Por lo tanto, los bucles hipervariables determinan la especificidad de una inmunoglobulina y se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) debido a que sus superficies son complementarias a antigenos.
Una variabilidad adicional de las regiones V es conferida por la variabilidad combinatoria de segmentos de genes que codifican una regi6n V de inmunoglobulina. Los genes de la inmunoglobulina comprenden varios segmentos genicos de la linea germinal que se reorganizan somaticamente para formar un gen de inmunoglobulina reordenado que codifica una molecula de inmunoglobulina. Las regiones VL estan codificadas por un segmento del gen V de la cadena L y un segmento del gen J (segmento de uni6n). Las regiones VH estan codificadas por un segmento del gen V de la cadena H y un segmento del gen D (segmento de diversidad) y un segmento del gen J (segmento de uni6n).
Ambos segmentos del gen V de una cadena L y una cadena H contienen tres regiones con variabilidad sustancial de la secuencia de aminoacidos. Tales regiones se denominan CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena L, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena H, respectivamente. La longitud de una CDR1 de la cadena L puede variar sustancialmente entre las diferentes regiones VL. Por ejemplo, la longitud de CDR1 puede variar desde aproximadamente 7 aminoacidos a aproximadamente 17 aminoacidos. Por el contrario, las longitudes de CDR2 y CDR3 de la cadena L tipicamente no varian entre las diferentes regiones VL. La longitud de una CDR3 de la cadena H puede variar sustancialmente entre diferentes regiones VH. Por ejemplo, la longitud de CDR3 puede variar desde aproximadamente 1 aminoacido a aproximadamente 20 aminoacidos. Cada regi6n CDR de la cadena H y L esta flanqueada por regiones FW.
0tros aspectos funcionales de una molecula de inmunoglobulina incluyen la valencia de una molecula de inmunoglobulina, la afinidad de una molecula de inmunoglobulina y la avidez de una molecula de inmunoglobulina. Ta y como se usa en este documento, la afinidad se refiere a la fuerza con la que una molecula de inmunoglobulina se une a un antigeno en un solo sitio en una molecula de inmunoglobulina (es decir, un fragmento Fab monovalente que se une a un antigeno monovalente). La afinidad difiere de la avidez que se refiere a la suma total de la fuerza con la que una inmunoglobulina se une a un antigeno. La afinidad de la uni6n de una inmunoglobulina se puede medir usando tecnicas convencionales, tales como tecnicas de uni6n competitiva, dialisis en equilibrio o metodos de BIAcore. Tal y como se usa en este documento, la valencia se refiere al numero de diferentes sitios que se unen a antigeno por molecula de inmunoglobulina (es decir, el numero de sitios que se unen a antigeno por molecula de anticuerpo del fragmento que se une a antigeno). Por ejemplo, una molecula de inmunoglobulina monovalente solo se puede unir a un antigeno en un momento, mientras que una molecula de inmunoglobulina bivalente puede unirse a dos o mas antigenos a la vez, y asi sucesivamente. Ambos anticuerpos monovalentes y bivalentes que se unen selectivamente a proteinas de la via alternativa del complemento estan incluidos en esta memoria.
En una realizaci6n, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico o multiespecifico. Un anticuerpo biespecifico (o multiespecifico) es capaz de unirse a dos antigenos (o mas), como un anticuerpo divalente (o multivalente), pero en este caso, los antigenos son antigenos diferentes (es decir, el anticuerpo muestra una especificidad dual o mayor). Por ejemplo, un anticuerpo que se une selectivamente a una proteina en la via alternativa del complemento de acuerdo con la presente invenci6n (por ejemplo, un anticuerpo anti-factor B tal y como se describe en este documento) se puede construir como un anticuerpo biespecifico, en el que la segunda especificidad de uni6n a antigeno es para una diana deseada. Por lo tanto, un anticuerpo biespecifico incluido en la presente invenci6n incluye un anticuerpo que tiene: (a) una primera porci6n (por ejemplo, una primera porci6n que se une a antigeno) que se une a una proteina en la via alternativa del complemento (por ejemplo, el factor B); y (b) una segunda porci6n que se une a una molecula de la superficie celular expresada por una celula. En esta realizaci6n, la segunda porci6n puede unirse a cualquier molecula de la superficie celular. Una molecula de la superficie celular preferida es un receptor o ligando, de modo que el anticuerpo se dirige a un tipo particular de celula o de tejido y/o a un sitio particular en un animal en el que se administra el anticuerpo. En una realizaci6n, la segunda especificidad de uni6n a antigeno es para un receptor del complemento. Un receptor del complemento particularmente preferido incluye, pero no se limita a, un receptor del complemento de tipo 2 (CR2). Los anticuerpos que se unen selectivamente a CR2 y que, por lo tanto, se podrian utilizar en esta realizaci6n de la invenci6n se describen, por ejemplo, en el documento de Patente de EE.UU. n° 6.820.011.
En una realizaci6n, los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen anticuerpos humanizados. Los anticuerpos humanizados son moleculas que tienen un sitio de uni6n a antigeno obtenido a partir de una inmunoglobulina de una especie no humana, obteniendose las partes restantes de la molecula derivadas de inmunoglobulina, a partir de una inmunoglobulina humana. El sitio de uni6n a antigeno puede comprender o bien regiones variables completas fusionadas a dominios constantes humanos o solo las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) injertadas sobre las regiones armaz6n humanas adecuadas en los dominios variables. Los anticuerpos humanizados se pueden producir, por ejemplo, mediante la creaci6n de modelos de los dominios variables del anticuerpo, y la producci6n de anticuerpos utilizando tecnicas de ingenieria genetica, tales como el injerto de CDRs (descrito a continuaci6n). Una descripci6n de diversas tecnicas para la producci6n de anticuerpos humanizados se encuentra, por ejemplo, en Morrison y col. (1984) Proc. Nftl. Acfd. Sci. USA. 81:6851-55; Whittle et al. (1987) Prot. Eng. 1:499505; Co et al. (1990) J. Irrunol. 148:1149-1154; Co et al. (1992) Proc. Nftl. Acfd. Sci. USA. 88:2869-2873; Carter et al. (1992) Proc. Nftl. Acfd. Sci. USA. 89: 4285-4289; Routledge et al. (1991) Eur. J. Irrunol. 21:2717-2725 y los documentos de Publicaci6n de Patentes PCT n°W0 91/09967; W0 91/09968 y W0 92/113831.
Anticuerpos aislados de la presente invenci6n pueden incluir suero que contiene tales anticuerpos, o anticuerpos que se han purificado en diversos grados. Los anticuerpos completos de la presente invenci6n pueden ser policlonales o monoclonales. Alternativamente, equivalentes funcionales de anticuerpos completos, tales como fragmentos que se unen a antigeno, en los que uno o varios dominios del anticuerpo estan truncados o ausentes (por ejemplo, los fragmentos Fv, Fab, Fab' o F(ab')2), asi como anticuerpos modificados geneticamente o fragmentos de los mismos que se unen a antigeno, que incluyen anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos humanizados (descritos anteriormente), anticuerpos que se pueden unir a mas de un epitopo (por ejemplo, anticuerpos biespecificos) o anticuerpos que se pueden unir a uno o a varios antigenos diferentes (por ejemplo, anticuerpos biespecificos o multiespecificos), tambien se pueden emplear en la invenci6n.
Anticuerpos de la invenci6n modificados geneticamente incluyen los producidos por tecnicas convencionales de ADN recombinante que implican la manipulaci6n y la expresi6n de nuevo de ADN que codifica regiones variables y/o constantes de anticuerpos. Ejemplos particulares incluyen, anticuerpos quimericos, en los que los dominios VH y/o VL del anticuerpo provienen de una fuente diferente, en comparaci6n con el resto del anticuerpo, y anticuerpos con CDRs injertadas (y fragmentos de las mismas que se unen a antigeno), en los que al menos una secuencia de CDR y, opcionalmente, al menos un aminoacido del armaz6n de la regi6n variable se obtiene(n) a partir de una fuente y las porciones restantes de las regiones variables y constantes (segun proceda) se obtienen a partir de una fuente diferente. La construcci6n de anticuerpos quimericos y de anticuerpos con CDRs injertadas se describe, por ejemplo, en los documentos de Solicitud de Patentes Europeas: EP-A 0194276, EP-A 0239400, EP-A 0451216 y EP-A 0460617.
En una realizaci6n, los anticuerpos quimericos se producen de acuerdo con la presente invenci6n y comprenden dominios variables de anticuerpos que se unen a una proteina en la via alternativa del complemento (por ejemplo, el factor B) y se fusionan con estos dominios, una proteina que sirve como un segundo resto dirigido a una diana. Por ejemplo, el resto que se dirige a una diana puede incluir una proteina que se asocia con la celula o el tejido contra el que va a ser dirigido o con un sistema particular en el animal. Por ejemplo, el resto que se dirige a una diana puede ser una porci6n de un receptor del complemento. Un receptor del complemento preferido para usar en este aspecto de la invenci6n incluye el receptor del complemento de tipo 2 (CR2). El uso de CR2 y de porciones del mismo en una proteina de fusi6n o quimerica (por ejemplo, como un sistema de entrega) se describe con detalle en el documento de patente de EE.UU. n° 6.820.011.
En general, en la producci6n de un anticuerpo, un animal experimental adecuado, tal como, por ejemplo, pero no limitado a, un conejo, una oveja, un hamster, un conejillo de indias, un rat6n, una rata o un pollo, se expone a un antigeno contra el que se desea un anticuerpo. Tipicamente, un animal se inmuniza con una cantidad eficaz de antigeno que se inyecta en el animal. Una cantidad eficaz de antigeno se refiere a una cantidad necesaria para inducir la producci6n de anticuerpos en el animal. A continuaci6n, se deja que el sistema inmune del animal responda durante un periodo de tiempo predeterminado. El proceso de inmunizaci6n se puede repetir hasta que el sistema inmune produce anticuerpos contra el antigeno. Con el fin de obtener anticuerpos policlonales especificos del antigeno, se recoge suero del animal que contiene los anticuerpos deseados (o en el caso de un pollo, el anticuerpo se puede recoger de los huevos). Tal suero es util como un reactivo. Los anticuerpos policlonales se pueden purificar adicionalmente a partir del suero (o los huevos), por ejemplo, mediante el tratamiento del suero con sulfato de amonio.
Los anticuerpos monoclonales se pueden producir segun la metodologia de Kohler y Milstein (Nfture 256:495497,1975). Por ejemplo, los linfocitos B se recuperan a partir del bazo (o cualquier tejido adecuado) de un animal inmunizado y luego se fusionan con celulas de mieloma para obtener una poblaci6n de celulas de hibridoma capaces de un crecimiento continuo en un medio de cultivo adecuado. Los hibridomas que producen el anticuerpo deseado se seleccionan sometiendo a ensayo la capacidad del anticuerpo producido por el hibridoma para unirse al antigeno deseado.
Un metodo preferido para producir anticuerpos de la presente invenci6n incluye (a) administrar a un animal una cantidad eficaz de una proteina o peptido (por ejemplo, una proteina del factor B o un peptido que incluye dominios del mismo) para producir los anticuerpos y (b) recuperar los anticuerpos. En otro metodo, los anticuerpos de la presente invenci6n se producen de forma recombinante. Por ejemplo, una vez que se ha obtenido una linea celular, por ejemplo un hibridoma, que expresa un anticuerpo de acuerdo con la invenci6n, es posible clonar en la misma el ADNc e identificar los genes de la regi6n variable que codifican el anticuerpo deseado, incluyendo las secuencias que codifican las CDRs. A partir de aqui, los anticuerpos y los fragmentos que se unen a antigeno de acuerdo con la invenci6n, se pueden obtener mediante la preparaci6n de uno o varios vectores de expresi6n replicables que contienen al menos la secuencia de ADN que codifica el dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo y, opcionalmente, otras secuencias de ADN que codifican porciones restantes de las cadenas pesada y/o ligera como se desee, y transformar/transfectar una celula hospedadora apropiada, en la que tendra lugar la producci6n del anticuerpo. Los hospedadores con expresi6n adecuada incluyen bacterias, (por ejemplo, una cepa de
E. coli), hongos, (en particular, levaduras, por ejemplo, miembros de los generos Pichif, Sfcchfroryces o Kluyveroryces) y lineas celulares de mamifero, por ejemplo, una linea celular no productora de mieloma, tal como una linea NS0 de rat6n, o las celulas CH0. Con el fin de obtener una transcripci6n y traducci6n eficaces, la secuencia de ADN en cada vector debe incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente una secuencia promotora y lider ligadas funcionalmente a la secuencia del dominio variable. Los metodos particulares para producir anticuerpos de esta manera son generalmente bien conocidos y se utilizan rutinariamente. Por ejemplo, los procedimientos basicos de biologia molecular se describen en Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989); la secuenciaci6n del ADN se puede realizar tal y como se describe en Sanger et al. (PNAS 74,5463, (1977)) y el manual de secuenciaci6n de Amersham International plc; y la mutagenesis dirigida al sitio se puede llevar a cabo de acuerdo con el metodo de Kramer et al. (Nucl. Acids Res. 12, 9441, (1984)) y el manual de Anglian Biotechnology Ltd. Ademas, existen numerosas publicaciones, que incluyen memorias descriptivas de patentes, que detallan tecnicas adecuadas para la preparaci6n de anticuerpos mediante la manipulaci6n de ADN, la creaci6n de vectores de expresi6n y la transformaci6n de celulas apropiadas, por ejemplo, tal como la revisi6n de Mountain A y Adair, J R en quot;Biotechnology and Genetic Engineering Reviewsquot; (compilador Tombs, M P, 10, capitulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido) y en los documentos de solicitudes de patente europea, mencionados anteriormente.
Los metodos alternativos que emplean, por ejemplo, la tecnologia de presentaci6n en fagos (vease, por ejemplo, los documentos de patentes de EE.UU. 5.969.108, 5.565.332, 5.871.907, 5.858.657) o el metodo de anticuerpo con linfocito seleccionado del documento de patente de EE.UU. 5.627.052, tambien se pueden usar para la producci6n de anticuerpos y/o de fragmentos de antigeno de la invenci6n, como sera bastante evidente para una persona experta.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invenci6n se refiere en general a composiciones para uso en la inhibici6n selectiva de la via alternativa del complemento en un animal que tiene una afecci6n o enfermedad, o tiene riesgo de desarrollarla, en la que la activaci6n de la via alternativa del complemento desempefa una funci6n (por ejemplo, la activaci6n de la via alternativa del complemento contribuye a la afecci6n o a la enfermedad, agrava al menos un sintoma de la afecci6n o la enfermedad, o causa la afecci6n o la enfermedad). Se incluye el uso de los nuevos anticuerpos del factor B de la presente invenci6n, que se han descrito con detalle anteriormente. Tales afecciones o enfermedades incluyen, pero no se limitan a, afecciones asociadas con la hipersensibilidad de las vias respiratorias (incluyendo la hiperreactividad de las vias respiratorias que esta asociada con inflamaci6n), la lesi6n por isquemiareperfusi6n y la perdida fetal. Las composiciones y formulaciones que comprenden tales anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a antigeno, asi como polipeptidos que se unen a antigeno que imitan la especificidad de los anticuerpos del factor B descritos en este documento, asi como la exposici6n de los metodos de administraci6n y las dosis, se describen con detalle a continuaci6n.
Metodo pfrf prevenir o inhibir lf hiperrefctividfd de lfs vifs respirftorifs y lf inflfrfci6n de lfs vifs respirftorifs
Basandose en el presente descubrimiento de los inventores en el que la via alternativa del complemento es necesaria y suficiente para inhibir la hiperreactividad de las vias respiratorias y la inflamaci6n de las vias respiratorias, otra realizaci6n de la presente invenci6n se refiere a una composici6n para uso en la inhibici6n de la hiperreactividad de las vias respiratorias y/o la inflamaci6n de las vias respiratorias en un animal que tiene hiperreactividad de las vias respiratorias asociada con inflamaci6n o inflamaci6n de las vias respiratorias o que tiene riesgo de desarrollarla. El metodo descrito en esta memoria incluye una etapa de inhibici6n selectiva de la via alternativa del complemento en un animal que tiene hiperreactividad de las vias respiratorias o tiene riesgo de desarrollarla, incluyendo hiperreactividad de las vias respiratorias que esta asociada con inflamaci6n (es decir, la hiperreactividad de las vias respiratorias se produce como resultado de una inflamaci6n o de un proceso inflamatorio, o se produce junto con la inflamaci6n de las vias respiratorias de forma simultanea o previa).
La siguiente exposici6n se proporciona para elaborar el aspecto del tratamiento o prevenci6n de la hiperreactividad de las vias respiratorias y/o inflamaci6n de las vias respiratorias en un animal, o afecciones o enfermedades relacionados con las mismas. Sin embargo, se debe entender que la consideraci6n general de los inhibidores, las vias de administraci6n, las dosis, los indicadores de tratamiento, la descripci6n de las formulaciones y similares, se puede aplicar a cualquiera de las realizaciones de la invenci6n descrita en este documento (es decir, a otras afecciones o enfermedades distintas de las asociados con la hiperreactividad de las vias respiratorias y la inflamaci6n de las vias respiratorias). Por ejemplo, muchos de los aspectos generales de la invenci6n que se describe a continuaci6n, se pueden aplicar a la inhibici6n especifica de la via alternativa del complemento para tratar otras afecciones, tales como la lesi6n por isquemia-reperfusi6n.
De acuerdo con la presente invenci6n, inhibir la via alternativa del complemento en un animal se refiere a la inhibici6n de la expresi6n y/o de la actividad biol6gica de al menos una proteina que forma parte de la via alternativa del complemento. Tales proteinas incluyen, pero no se limitan a, el factor B, el factor D o la properdina. Inhibir quot;selectivamentequot; la via alternativa del complemento significa que la presente invenci6n inhibe preferente o exclusivamente la via alternativa del complemento, pero no inhibe o al menos no inhibe sustancialmente otras vias para la activaci6n del complemento, incluyendo la via clasica del complemento o la via de las lectinas. Por ejemplo, los nuevos anticuerpos del factor B y fragmentos de los mismos que se unen a antigeno de la presente invenci6n, son un ejemplo de un reactivo que inhibe selectivamente la via alternativa del complemento. Esta definici6n se aplica a otros metodos descritos en este documento en los que la via alternativa del complemento se inhibe selectivamente.
La inhibici6n de la via alternativa del complemento de acuerdo con la presente invenci6n se puede realizar afectando directamente la expresi6n (transcripci6n o traducci6n) o la actividad biol6gica de una proteina en la via alternativa del complemento, o afectando directamente la capacidad de una proteina para unirse a una proteina en la via alternativa del complemento, o para contribuir de otro modo a la activaci6n del complemento por la via alternativa. Mas especificamente, en una realizaci6n, la expresi6n de una proteina se refiere tanto a la transcripci6n de la proteina como a la traducci6n de la proteina. Por lo tanto, la presente invenci6n puede inhibir la transcripci6n y/o la traducci6n de una proteina en el animal que expresa naturalmente la proteina (por ejemplo, mediante la administraci6n de un agente que inhibe la expresi6n de la proteina y modificando geneticamente un animal para que tenga una expresi6n reducida de la proteina). En otra realizaci6n, la inhibici6n de la via alternativa del complemento se define en esta memoria como cualquier reducci6n medible (detectable) (es decir, disminuci6n, regulaci6n a la baja, inhibici6n) de la actividad de la via, como mediante cualquier reducci6n medible de la expresi6n y/o de la actividad biol6gica de una proteina dentro de la via alternativa del complemento.
De acuerdo con la presente invenci6n, quot;hiperreactividad de las vias respiratoriasquot; o quot;AHRquot; se refiere a una anormalidad de las vias respiratorias que les permite estrecharse demasiado facilmente y/o demasiado como respuesta a un estimulo capaz de inducir una limitaci6n en el flujo de aire. La AHR puede ser una alteraci6n funcional del sistema respiratorio como resultado de una inflamaci6n en las vias respiratorias (es decir, la AHR que esta asociada con inflamaci6n) o como resultado de una remodelaci6n de las vias respiratorias (por ejemplo, mediante el dep6sito de colageno). Una limitaci6n del flujo de aire se refiere al estrechamiento de las vias respiratorias que puede ser irreversible o reversible. Una limitaci6n del flujo de aire o hiperreactividad de las vias respiratorias puede estar causada por el dep6sito de colageno, el broncoespasmo, la hipertrofia del musculo liso bronquial, la contracci6n del musculo liso bronquial, la secreci6n mucosa, los dep6sitos celulares, la destrucci6n del epitelio, la alteraci6n de la permeabilidad epitelial, las alteraciones de la funci6n o la sensibilidad del musculo liso, las anormalidades del parenquima pulmonar y las enfermedades infiltrativas en las vias respiratorias y alrededor de las mismas. Muchos de estos factores causantes pueden estar asociados con la inflamaci6n, aunque la AHR es un sintoma que se puede distinguir de la inflamaci6n (es decir, la AHR es una afecci6n o un sintoma especifico tal como se ha descrito anteriormente, que puede estar asociado, pero no es siempre, con una inflamaci6n previa o simultanea de las vias respiratorias). La AHR se puede desencadenar en un paciente con una afecci6n asociada con los factores causantes anteriores, mediante la exposici6n a un agente provocador o estimulo, tambien denominado en esta memoria un estimulo provocador de AHR. Tales estimulos incluyen, pero no se limitan a, alergeno, metacolina, histamina, leucotrieno, soluci6n salina, hiperventilaci6n, ejercicio, di6xido de azufre, adenosina, propranolol, aire frio, un antigeno, bradiquinina, acetilcolina, una prostaglandina, ozono, contaminantes del medio ambiente y mezclas de los mismos. La presente invenci6n se dirige a la hiperreactividad de las vias respiratorias asociada con cualquier afecci6n respiratoria que implica inflamaci6n y, en particular, a la hiperreactividad de las vias respiratorias inducida por alergenos.
La hiperreactividad de las vias respiratorias se asocia generalmente con inflamaci6n alergica y/o con inflamaci6n inducida por virus. La hiperreactividad de las vias respiratorias asociada con una inflamaci6n alergica puede tener lugar en un paciente que tiene una afecci6n o tiene riesgo de desarrollarla, que incluye, pero no esta limitada a, cualquier enfermedad obstructiva cr6nica de las vias respiratorias. Tales afecciones incluyen, pero no se limitan a: asma, enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica, aspergilosis broncopulmonar alergica, neumonia por hipersensibilidad, neumonia eosinofilica, enfisema, bronquitis, bronquitis alergica, bronquiectasias, fibrosis quistica, tuberculosis, neumonitis por hipersensibilidad, asma ocupacional, sarcoidosis, sindrome de vias respiratorias reactivas, enfermedad pulmonar intersticial, sindrome hipereosinofilico, rinitis, sinusitis, asma inducida por el ejercicio, asma inducida por contaminaci6n y enfermedad pulmonar parasitaria. La hiperreactividad de las vias respiratorias asociada con una inflamaci6n inducida por virus puede tener lugar en un paciente que tiene una infecci6n por un virus, o que tiene riesgo de desarrollarla, incluyendo, pero no limitado a, virus respiratorio sincitial (VRS), virus de la parainfluenza (VPI), rinovirus (RV) y adenovirus. 0tras enfermedades o afecciones a tratar utilizando el metodo y los agentes de la presente invenci6n, incluyen cualquier afecci6n pulmonar o complicaci6n pulmonar que implica inflamaci6n y/o hiperreactividad de las vias respiratorias, siendo el resultado de una enfermedad, por ejemplo, de una enfermedad autoinmune sistemica. Por ejemplo, en el lupus eritematoso sistemico, las complicaciones pulmonares podrian ser tratadas usando la presente invenci6n.
La inflamaci6n se caracteriza tipicamente por la liberaci6n de mediadores inflamatorios (por ejemplo, citocinas o quimiocinas) que reclutan celulas implicadas en la inflamaci6n de un tejido. La inflamaci6n de las vias respiratorias es la inflamaci6n que se produce en las vias respiratorias (tejido pulmonar, celulas y tejido de las vias respiratorias) de un animal. Una afecci6n o una enfermedad asociada con la inflamaci6n alergica es una afecci6n o enfermedad en la que la estimulaci6n de un tipo de respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta inmune de tipo Th2) contra un agente sensibilizante, tal como un alergeno, puede dar como resultado la liberaci6n de mediadores inflamatorios que reclutan celulas implicadas en la inflamaci6n en un animal, cuya presencia puede conducir a un dafo tisular y a veces a la muerte. Tal y como se ha expuesto anteriormente, la AHR se asocia frecuentemente con (ocurre junto con
o tal vez como resultado de) una inflamaci6n de las vias respiratorias. Se observa que el sintoma o la afecci6n de la AHR a veces se puede tratar a veces independientemente de los sintomas de la inflamaci6n y viceversa (por ejemplo, un tratamiento de la AHR puede tener un impacto sobre la inflamaci6n o puede no tenerlo -estas son afecciones separables).
La AHR se puede medir por una prueba de esfuerzo que comprende medir la funci6n del sistema respiratorio de un animal como respuesta a un agente provocador (es decir, el estimulo). La AHR se puede medir como un cambio en la funci6n respiratoria desde la linea basal trazada frente a la dosis de un agente provocador (un procedimiento para dicha medici6n y un modelo de mamifero util para ello, se describen con detalle a continuaci6n en los Ejemplos). La funci6n respiratoria (y, por lo tanto, las caracteristicas biol6gicas de la AHR) se puede medir, por ejemplo, mediante espirometria, pletismografia, flujos maximos, puntuaciones de los sintomas, signos fisicos (es decir, la frecuencia respiratoria), respiraci6n sibilante, tolerancia del ejercicio, uso de medicaci6n de rescate (es decir, broncodilatadores), tos y gases en sangre. En los seres humanos, la espirometria se puede utilizar para medir el cambio en la funci6n respiratoria junto con un agente provocador, tal como metacolina o histamina. En los seres humanos, la espirometria se realiza diciendo a una persona que realice una inspiraci6n profunda y sople, lo mas fuerte, rapido y prolongado como sea posible en un calibrador que mide el flujo de aire y el volumen. El volumen de aire espirado en el primer segundo se conoce como volumen espiratorio forzado (VEF1), y la cantidad total de aire espirado se conoce como capacidad vital forzada (CVF). En los seres humanos, los VEF1 y CVF previstos normales estan disponibles y estandarizadas en funci6n del peso, la talla, el sexo y la raza. Un individuo exento de enfermedad tiene un VEF1, y una CVF de al menos aproximadamente el 80% de los valores normales previstos para una persona en particular y una relaci6n de VEF1/CVF de al menos aproximadamente el 80%. Los valores se determinan antes (es decir, que representan el estado de reposo de un paciente) y despues de la inhalaci6n (es decir, que representan el estado mas elevado de resistencia pulmonar de un paciente) del agente provocador. La posici6n de la curva resultante indica la sensibilidad de las vias respiratorias hacia el agente provocador.
El efecto de aumentar las dosis o las concentraciones del agente provocador sobre la funci6n pulmonar se determina midiendo el volumen espiratorio forzado en 1 segundo (VEF1,) y el VEF1 sobre la capacidad vital forzada (relaci6n VEF1/CVF) del animal estimulado con el agente provocador. En los seres humanos, la dosis o la concentraci6n de un agente provocador (es decir, metacolina o histamina) que provoca una caida del 20% en el VEF1, (PC20VEF1) es indicativa del grado de AHR. Los valores de VEF1 y CVF se pueden medir utilizando metodos conocidos por los expertos en la tecnica.
Las mediciones de la funci6n pulmonar de resistencia de las vias respiratorias (RL) y la distensibilidad dinamica (CL) y la hiperreactividad se pueden determinar midiendo la presi6n transpulmonar como la diferencia de presi6n entre la abertura de las vias respiratorias y el pletism6grafo corporal. El volumen es el cambio de presi6n calibrada en el pletism6grafo corporal y el flujo es la diferenciaci6n digital de la sefal de volumen. La resistencia (RL) y la distensibilidad (CL) se obtienen utilizando metodos conocidos por los expertos en la tecnica (por ejemplo, mediante el uso de una soluci6n de minimos cuadrados recursiva de la ecuaci6n de movimiento). Cabe sefalar que la medici6n del valor de la resistencia de las vias respiratorias (RL) en un mamifero no humano (por ejemplo, un rat6n) se puede utilizar para diagnosticar una obstrucci6n del flujo de aire, de forma similar a la medici6n de VEF1 y/o de la relaci6n VEF1/CVF en un ser humano.
Una variedad de agentes provocadores son utiles para la medici6n de los valores de AHR. Agentes provocadores adecuados incluyen estimulos directos e indirectos, y son tipicamente agentes provocadores que desencadenan AHR in vivo. Tal como se usa en esta memoria, la expresi6n quot;agente provocadorquot; se puede utilizar indistintamente con la frase quot;estimulo provocador de AHRquot;. Los agentes provocadores o estimulos preferidos incluyen, por ejemplo, un alergeno, metacolina, histamina, agentes irritantes organicos, gases y productos quimicos irritantes, un leucotrieno, soluci6n salina, hiperventilaci6n, ejercicio, di6xido de azufre, adenosina, propranolol, aire frio, un antigeno, bradiquinina, acetilcolina, una prostaglandina, ozono, contaminantes del medio ambiente y mezclas de los mismos. Preferiblemente, para la inducci6n experimental de AHR, la metacolina (MCh) se utiliza como agente provocador. Las concentraciones preferidas de MCh para usar en una curva de concentraci6n-respuesta, son entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 100 miligramos por mililitro (mg/ml). Las concentraciones mas preferidas de MCh para usar en una curva de concentraci6n-respuesta son entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 50 mg/ml. Las concentraciones incluso mas preferidas de MCh para usar en una curva de concentraci6n-respuesta son entre aproximadamente 0,02 y aproximadamente 25 mg/ml. Cuando se utiliza MCh como agente provocador, el grado de AHR se define por la concentraci6n provocadora de MCh, necesaria para causar una caida del 20% del VEF1, de un animal (PC20metacolinaVEF1). Por ejemplo, en los seres humanos y empleando protocolos convencionales en la tecnica, una persona normal tiene tipicamente un PC20metacolinaVEF1gt; 8 mg/ml de MCh. Por lo tanto, en los seres humanos, la AHR se define como PC20metacolinaVEF1 lt;8 mg/ml de MCh.
De acuerdo con la presente invenci6n, la funci6n respiratoria tambien se puede evaluar con una variedad de pruebas estaticas que comprenden medir la funci6n del sistema respiratorio de un animal en ausencia de un agente provocador. Ejemplos de pruebas estaticas incluyen, por ejemplo, espirometria, pletismografia, flujos maximos, puntuaciones de los sintomas, signos fisicos (es decir, la frecuencia respiratoria), respiraci6n sibilante, tolerancia al ejercicio, uso de medicaci6n de rescate (es decir, broncodilatadores), gases en sangre y tos. La evaluaci6n de la funci6n pulmonar en pruebas estaticas se puede realizar midiendo, por ejemplo, la capacidad pulmonar total (CPT), el volumen toracico de gas (VTG), la capacidad residual funcional (CRF), el volumen residual (VR) y la conductancia especifica (SGL) para volumenes pulmonares, la capacidad de difusi6n del pulm6n para mon6xido de carbono (DLC0), la gasometria arterial, incluyendo pH, P02 y PC02 para el intercambio gaseoso. Tanto VEF1 y VEF1/CVF se pueden utilizar para medir limitaci6n del flujo de aire. Si la espirometria se utiliza en los seres humanos, el VEF1, de un individuo se puede comparar con el VEF1, de los valores previstos. Los valores previstos de VEF1 estan disponibles para normogramas convencionales basados en la edad del animal, el sexo, el peso, la talla y la raza. Un animal normal tiene tipicamente un VEF1, al menos aproximadamente el 80% del VEF1 previsto para el animal. La limitaci6n del flujo de aire da como resultado un VEF1 o CFV inferior al 80% de los valores previstos. Un metodo alternativo para medir la limitaci6n del flujo de aire se basa en la relaci6n entre VEF1 y CFV (VEF1/CVF). Individuos exentos de enfermedad se definen por tener una relaci6n VEF1/CFV de al menos aproximadamente 80%. La obstrucci6n del flujo de aire hace que la relaci6n VEF1/CVF descienda a menos del 80% de los valores previstos. Por lo tanto, un animal que tiene limitaci6n del flujo de aire esta definido por un VEF1/CVF menor de aproximadamente 80%.
Tal y como se usa en este documento, reducir la hiperreactividad de las vias respiratorias se refiere a cualquier reducci6n medible de la hiperreactividad de las vias respiratorias y/o a cualquier reducci6n de la ocurrencia o la frecuencia con la que se produce hiperreactividad de las vias respiratorias en un paciente. Una reducci6n de AHR se puede medir usando cualquiera de las tecnicas descritas anteriormente, o cualquier otro metodo adecuado conocido en la tecnica. Preferiblemente, la hiperreactividad de las vias respiratorias, o el potencial para ello, se reduce de manera 6ptima en una medida que el animal ya no sufre molestias y/o una funci6n alterada da como resultado una hiperreactividad de las vias respiratorias o asociada con la misma. Evitar la hiperreactividad de las vias respiratorias se refiere a prevenir o detener la inducci6n de una hiperreactividad de las vias respiratorias antes de que las caracteristicas biol6gicas de la hiperreactividad de las vias respiratorias tal y como se han descrito en este documento, se puedan detectar o medir sustancialmente en un paciente. Una vez que una o varias de las caracteristicas biol6gicas de la hiperreactividad de las vias respiratorias se puede detectar o medir sustancialmente, se considera que ha tenido lugar el inicio agudo de una hiperreactividad de las vias respiratorias.
En una realizaci6n, la presente invenci6n disminuye la capacidad de respuesta a metacolina en el animal. Preferiblemente, la presente invenci6n da como resultado una mejora en el valor de PC20metacolinaVEF1 de un animal, de tal manera que el valor de PC20metacolina VEF1 obtenido antes del uso del presente metodo, cuando se ha provocado al animal con una primera concentraci6n de metacolina, es el mismo que el valor de PC20metacolinaVEF1 obtenido despues del uso del presente metodo, cuando se provoca al animal con el doble de la cantidad de la primera concentraci6n de metacolina. Preferiblemente, la presente invenci6n da como resultado una mejora en el valor de PC20metacolinaVEF1 de un animal, de tal manera que el valor de PC20metacolinaVEF1 obtenido antes del uso del presente metodo, cuando el animal es provocado con entre aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml de metacolina, es el mismo que el valor de PC20metacolinaVEF1 obtenido despues de la utilizaci6n del presente metodo, cuando el animal es provocado con entre aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 16 mg/ml de metacolina.
En otra realizaci6n, la presente invenci6n mejora el VEF1 de un animal, en al menos aproximadamente el 5%, y mas preferiblemente entre aproximadamente el 6% y aproximadamente el 100%, mas preferiblemente entre aproximadamente el 7% y aproximadamente el 100%, y aun mas preferiblemente entre aproximadamente el 8% y aproximadamente el 100% del VEF1 previsto del animal. En otra realizaci6n, la presente invenci6n mejora un VEF1 de un animal en al menos aproximadamente el 5%, y preferiblemente, en al menos aproximadamente el 10%, y aun mas preferiblemente, en al menos aproximadamente el 25%, e incluso mas preferiblemente, en al menos aproximadamente el 50%, e incluso mas preferiblemente, en al menos aproximadamente el 75%.
En aun otra realizaci6n, la presente invenci6n da como resultado un aumento en el PC20metacolinaVEF1 de un animal mediante aproximadamente una concentraci6n doble de PC20metacolinaVEF1 de un animal normal. Un animal normal se refiere a un animal del que se conoce que no padece o que no es susceptible de AHR anormal. Un paciente, o un animal de ensayo, se refiere a un animal sospechoso de padecer AHR anormal o que es susceptible de la misma.
Por lo tanto, un animal que tiene hiperreactividad de las vias respiratorias es un animal en el que la hiperreactividad de las vias respiratorias se puede medir o detectar, utilizando uno de los metodos anteriores para la medici6n de la hiperreactividad de las vias respiratorias, en el que la hiperreactividad de las vias respiratorias se induce normalmente por la exposici6n a un estimulo provocador de AHR, tal como se ha descrito anteriormente. Del mismo modo, un animal que tiene una hiperreactividad de las vias respiratorias inducida por alergeno es un animal en el que la hiperreactividad de las vias respiratorias se puede medir o detectar, utilizando uno de los metodos anteriores para medir la hiperreactividad de las vias respiratorias, en el que la hiperreactividad de las vias respiratorias se induce por la exposici6n a un alergeno. Para que la hiperreactividad de las vias respiratorias sea inducida por un estimulo provocador de AHR, tal como un alergeno, la hiperreactividad de las vias respiratorias se desencadena aparente u obviamente, directa o indirectamente (por ejemplo, causada por, un sintoma de, indicativa de, simultanea a) por la exposici6n al estimulo. Los sintomas o las caracteristicas biol6gicas de la AHR incluyen, pero no se limitan a, indicadores de una funci6n respiratoria alterada (descritos con mas detalle anteriormente), un cambio en la frecuencia respiratoria, sibilancia, disminuci6n de la tolerancia al ejercicio, tos y gases sanguineos alterados. La detecci6n o medici6n de uno cualquiera o varios de estos sintomas es indicativa de la aparici6n de AHR aguda.
En el caso de un alergeno, la hiperreactividad de las vias respiratorias se desencadena aparente u obviamente, directa o indirectamente por un alergeno contra el cual un animal ha sido sensibilizado previamente. La sensibilizaci6n contra un alergeno se refiere a haberse expuesto con anterioridad una o varias veces a un alergeno, de tal manera que se desarrolla una respuesta inmune contra el alergeno. Las respuestas asociadas con una reacci6n alergica (por ejemplo, liberaci6n de histaminas, rinitis, edema, vasodilataci6n, constricci6n bronquial o hiperreactividad de las vias respiratorias, inflamaci6n de las vias respiratorias), normalmente no ocurren cuando un individuo sin tratamiento previo se expone al alergeno por primera vez, pero una vez que se ha producido una respuesta inmune celular y humoral contra el alergeno, el individuo esta quot;sensibilizadoquot; contra el alergeno. Las reacciones alergicas tienen lugar a continuaci6n cuando el individuo sensibilizado se vuelve a exponer al mismo alergeno (por ejemplo, una exposici6n al alergeno). Una vez que un individuo esta sensibilizado contra un alergeno, las reacciones alergicas pueden llegar a ser peores con cada exposici6n posterior al alergeno, debido a que cada vez que se vuelve a exponer no solo se producen sintomas alergicos, sino que aumenta adicionalmente el nivel de anticuerpo producido contra el alergeno y el nivel de respuesta de los linfocitos T contra el alergeno.
Tipicamente, las afecciones asociadas con respuestas alergicas a antigenos (es decir, alergenos) se caracterizan al menos parcialmente por inflamaci6n de los tejidos pulmonares. Tales afecciones o enfermedades se han descrito anteriormente. 0bservese que esta realizaci6n de la presente invenci6n se refiere especificamente al tratamiento de AHR y, como tal, no se requiere que la afecci6n relacionada o el factor causal que provoc6 la AHR, tal como una inflamaci6n alergica, se reduzca significativamente o se quot;curequot;, a pesar de que los efectos del presente metodo probablemente se extienden a la inhibici6n de la inflamaci6n alergica. La presente invenci6n es completamente eficaz para reducir la AHR incluso despues de que la respuesta inflamatoria en los pulmones de los animales esta totalmente implantada. Un animal que tiene riesgo de desarrollar una hiperreactividad de las vias respiratorias, es un animal que se expuesto o tiene riesgo de estar expuesto a un estimulo provocador de AHR que es suficiente para desencadenar la AHR, pero todavia no muestra caracteristicas o sintomas medibles o detectables de una hiperreactividad de las vias respiratorias, en donde tales sintomas se han descrito anteriormente en este documento. Un animal que tiene riesgo de desarrollar hiperreactividad de las vias respiratorias inducida por alergenos, es un animal que ha sido sensibilizado previamente contra un alergeno, y que se ha expuesto o tiene riesgo de ser expuesto a una cantidad del alergeno que es suficiente para desencadenar la AHR (es decir, una dosis de alergeno desencadenante o estimulante), pero todavia no muestra caracteristicas o sintomas medibles o detectables de la hiperreactividad de las vias respiratorias. Un animal que tiene riesgo de desarrollar hiperreactividad de las vias respiratorias tambien incluye un animal que se identifica como predispuesto o susceptible a tal afecci6n o enfermedad.
La presente invenci6n tambien puede inhibir o reducir la inflamaci6n de las vias respiratorias en un animal. La inflamaci6n y, en particular, la inflamaci6n eosinofilica, es un distintivo de muchas enfermedades respiratorias, tales como el asma. La inflamaci6n de las vias respiratorias se puede evaluar utilizando varios parametros, que incluyen pero no estan limitados a, la acumulaci6n de celulas inflamatorias (por ejemplo, eosin6filos, macr6fagos, neutr6filos, linfocitos) en los pulmones, niveles alterados de diversas citocinas (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13 e IFNy) en el fluido del lavado broncoalveolar (BALF) y/o un cambio en la producci6n mucosa en los pulmones. La medici6n de muchos de estos parametros se ejemplifica en los Ejemplos.
Los agentes y las formulaciones para uso en la presente invenci6n se pueden administrar a cualquier paciente animal, y preferentemente a los seres humanos. De acuerdo con la presente invenci6n, la administraci6n de un agente o una formulaci6n es util para inhibir la AHR, la inflamaci6n de las vias respiratorias o para el tratamiento de una enfermedad asociada con tales afecciones. Los pacientes que son candidatos adecuados para la presente invenci6n incluyen, pero no se limitan a pacientes que tienen riesgo de tal afecci6n o enfermedad o que tienen riesgo de desarrollarla (por ejemplo, estan predispuestos). Tal y como se ha descrito anteriormente, la presente invenci6n se dirige principalmente al tratamiento de AHR y/o de la inflamaci6n de las vias respiratorias y, por ello, no se requiere que la afecci6n o el factor causante que provoc6 la AHR o la inflamaci6n de las vias respiratorias, o la enfermedad asociada con estas afecciones, se reduzca significativamente o se quot;curequot;, aunque los efectos del presente metodo probablemente se extienden a un beneficio terapeutico significativo para el paciente. Este concepto tambien se aplica generalmente a otras afecciones y enfermedades en las que la via alternativa del complemento desempefa una funci6n.
Como tal, un beneficio terapeutico no es necesariamente una cura de una enfermedad o una afecci6n particular (incluyendo cualquier enfermedad o afecci6n descrita en este documento), sino que preferiblemente abarca un resultado que incluye mas tipicamente el alivio de la enfermedad o la afecci6n, la eliminaci6n de la enfermedad o la afecci6n, la reducci6n de un sintoma asociado con la enfermedad o la afecci6n, la prevenci6n o alivio de una enfermedad o una afecci6n secundaria que da como resultado la presencia de una enfermedad o afecci6n primarias, y/o la prevenci6n de la enfermedad o la afecci6n. Tal y como se usa en este documento, la frase quot;protegido contra una enfermedadquot; se refiere a la reducci6n de los sintomas de la enfermedad; la reducci6n de la aparici6n de la enfermedad, y/o la reducci6n de la gravedad de la enfermedad. La protecci6n de un paciente se puede referir a la capacidad de una composici6n de la presente invenci6n, cuando se administra a un paciente, para evitar que se produzca una enfermedad y/o para curar o aliviar los sintomas signos o causas de una enfermedad. Como tal, proteger a un paciente de una enfermedad incluye tanto la prevenci6n de la aparici6n de una enfermedad (tratamiento profilactico) como el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad (tratamiento terapeutico). Un efecto beneficioso lo puede determinar facilmente un experto normal en la tecnica y/o un medico especialista que este tratando al paciente. El termino quot;enfermedadquot; se refiere a cualquier desviaci6n de la salud normal de un mamifero e incluye un estado en el que estan presentes sintomas de la enfermedad, asi como afecciones en las que ha tenido lugar una desviaci6n (por ejemplo, infecci6n, mutaci6n genica, defecto genetico, etc.), pero los sintomas no se manifiestan todavia.
En consecuencia, en esta memoria se describe el uso de una variedad de agentes (es decir, compuestos reguladores) que al actuar directamente sobre una proteina en la via alternativa del complemento, inhiben selectivamente la expresi6n y/o la actividad biol6gica de una o varias proteinas en la via alternativa del complemento, de tal manera que se reduce la hiperreactividad de las vias respiratorias y/o la inflamaci6n de las vias respiratorias en un animal. Los agentes utiles en la presente invenci6n incluyen, por ejemplo, proteinas, moleculas de acido nucleico, anticuerpos y compuestos que son productos del disefo racional de farmacos (es decir, farmacos). Tales agentes se denominan generalmente en este documento, inhibidores. De acuerdo con la presente invenci6n, un inhibidor es cualquier agente que inhibe, ya sea mediante la inhibici6n directa o la inhibici6n competitiva, la expresi6n y/o la actividad biol6gica de una proteina (por ejemplo, una proteina en la via alternativa del complemento), e incluye agentes que actuan sobre el factor B, el factor D o la properdina. En una realizaci6n de la presente invenci6n, la inhibici6n de la via alternativa del complemento o de una proteina de la via alternativa del complemento se define en esta memoria como cualquier reducci6n medible (detectable) (es decir, disminuci6n, regulaci6n a la baja, inhibici6n) de la actividad biol6gica de una proteina en la via alternativa del complemento. La actividad biol6gica o la acci6n biol6gica de una proteina se refiere a cualquier funci6n mostrada o realizada por una forma natural de la proteina, tal y como se mide o se observa in vivo (es decir, en el entorno fisiol6gico natural de la proteina) o in vitro (es decir, en condiciones de laboratorio). Por ejemplo, una actividad biol6gica del factor B puede incluir, pero no se limita a, la uni6n a C3 activado, la solubilizaci6n de complejos inmunes, la actividad del factor de crecimiento de linfocitos B y la activaci6n de monocitos. De acuerdo con la presente invenci6n, la actividad biol6gica de una proteina se puede inhibir mediante la prevenci6n o la inhibici6n directa (reducci6n, disminuci6n) de la capacidad de la proteina para unirse y/o activar otra proteina (por ejemplo, C3), inhibiendo de ese modo los eventos aguas abajo que son el resultado de tal uni6n. Preferiblemente, la actividad biol6gica de la via alternativa del complemento se inhibe administrando un agente que inhibe al menos una proteina en la via, incluyendo tal agente, pero no limitado a, un agente que se une a una proteina en la via o que compite con la proteina en la via, de manera que la capacidad de la proteina para unirse y/o activar otra proteina esta inhibida o impedida. Tal agente incluye, pero no se limita a, antagonistas de la proteina, anticuerpos (incluyendo fragmentos de los mismos que se unen a antigeno), otros polipeptidos que se unen a antigeno y moleculas pequefas (por ejemplo, compuestos sinteticos o farmacos).
Un agente util en la presente invenci6n es un antagonista de la via alternativa del complemento, que incluye un antagonista de una proteina dentro de esta via. De acuerdo con la presente invenci6n, un quot;antagonistaquot; se refiere a cualquier compuesto que inhibe (por ejemplo, antagoniza, reduce, disminuye, bloquea, invierte o altera) el efecto de una proteina dada. Mas particularmente, un antagonista es capaz de actuar de una manera relacionada con la actividad de la proteina dada, de tal manera que la actividad biol6gica de la proteina dada, se reduce o se bloquea de una forma antagonista (por ejemplo, contra, la inversa de, al contrario de) de la acci6n natural de la proteina dada. Los antagonistas pueden incluir, pero no se limitan a, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, una proteina, un peptido, un acido nucleico (incluyendo ribozimas y no codificante), o un producto del disefo o la selecci6n de farmaco/compuesto/peptido que proporciona el efecto antagonista. Por ejemplo, en esta memoria se describen antagonistas de las proteinas naturales, factor B, factor de D o properdina, incluyendo antagonistas de anticuerpos, antagonistas de proteina/peptido, antagonistas de acido nucleico o antagonistas de moleculas pequefas (por ejemplo, un inhibidor de molecula pequefa).
El agente utilizado para inhibir una proteina de la via alternativa del complemento es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno. En un aspecto, el anticuerpo se une selectivamente a la proteina de la via alternativa del complemento de una manera tal, que la proteina se inhibe o se impide que se una a otra proteina con la que interacciona normalmente (en condiciones naturales o fisiol6gicas). En otro aspecto, el anticuerpo se une selectivamente a la proteina de tal manera, que la proteina se inhibe o se impide que active otra proteina con la que normalmente interacciona, a pesar de que la proteina puede estar unida, al menos parcialmente, a la otra proteina. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a antigeno para uso en la inhibici6n selectiva de la via alternativa del complemento, se han descrito anteriormente con detalle (los anticuerpos del factor B descritos en este documento y, en particular, el anticuerpo AcM 1379 descrito con detalle en este documento).
Preferiblemente, un antigeno o un fragmento del mismo que se une a antigeno, util en la presente invenci6n se une al factor B. Los anticuerpos (y fragmentos de los mismos que se unen a antigeno) que se unen selectivamente al factor B e inhiben la via alternativa del complemento de acuerdo con la invenci6n, se describen y se ejemplifican con detalle en esta memoria. En una realizaci6n, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, se une a una superficie de uni6n conservada o a un epitopo de una proteina tal, que se conserva entre las especies animales y particularmente las especies de mamiferos (es decir, el anticuerpo tiene una reacci6n cruzada con la proteina procedente de dos o mas especies de mamiferos diferentes). En particular, la presente invenci6n incluye un anticuerpo que se une a una proteina en la via alternativa del complemento, procedente de al menos dos especies de mamiferos diferentes y preferentemente de varias especies, incluyendo pero no limitadas a, ser humano, primate no humano, rat6n, rata, cerdo, caballo y conejo.
En esta memoria se describen polipeptidos que no son anticuerpos, a veces denominados ligandos de antigeno o polipeptidos que se unen a antigeno, que se han disefado para unirse selectivamente y causar la neutralizaci6n o inhibici6n de una proteina de acuerdo con la presente invenci6n. Ejemplos del disefo de tales polipeptidos que poseen una especificidad de ligando prescrita, se proporcionan en Beste et al. (Proc. Nftl. Acfd. Sci. 96:1898-1903, 1999).
En esta memoria se describen ademas de los anticuerpos, fragmentos de los mismos que se unen a antigeno y polipeptidos que se unen a antigeno, otros agentes que inhiben una proteina en la via alternativa del complemento. Tales agentes incluyen, por ejemplo, compuestos que son productos del disefo racional de farmacos, productos naturales y compuestos que tienen propiedades reguladoras definidas parcialmente. Un agente regulador, que incluye un antagonista de una proteina dada, puede ser un compuesto a base de proteinas, un compuesto a base de carbohidratos, un compuesto a base de lipidos, un compuesto a base de acidos nucleicos, un compuesto organico natural, un compuesto organico obtenido sinteticamente, un anticuerpo o fragmentos de los mismos. Tales agentes reguladores incluyen farmacos, incluyendo peptidos, oligonucle6tidos, hidratos de carbono y/o moleculas organicas sinteticas que regulan la producci6n y/o la funci6n de una o varias proteinas en la via alternativa del complemento. Tal agente se puede obtener, por ejemplo, a partir de estrategias de diversidad molecular (una combinaci6n de estrategias relacionadas que permiten la rapida construcci6n de grandes bancos de moleculas quimicamente diversas), bancos de compuestos naturales o sinteticos, en particular, procedentes de genotecas combinatorias o quimicas (es decir, genotecas de compuestos que difieren en la secuencia o el tamafo, pero que tienen los mismos bloques estructurales) o mediante el disefo racional de farmacos. Vease, por ejemplo, Maulik et al., 1997, Moleculfr Biotechnology: Therfpeutic Applicftions fnd Strftegies, Wiley-Liss, Inc.
En una estrategia de diversidad molecular, se sintetizan bancos de compuestos de gran tamafo, por ejemplo, de peptidos, oligonucle6tidos, hidratos de carbono y/o moleculas organicas sinteticas, utilizando metodos biol6gicos, enzimaticos y/o quimicos. Los parametros decisivos en el desarrollo de una estrategia de diversidad molecular incluyen la diversidad de subunidades, el tamafo molecular y la diversidad del banco. El objetivo general del escrutinio de tales bancos es utilizar una aplicaci6n secuencial de una selecci6n combinatoria para obtener ligandos de alta afinidad hacia a una diana deseada, y luego optimizar las moleculas guia mediante estrategias de disefo al azar o dirigidas. Los metodos de diversidad molecular se describen con detalle en Maulik, et al., suprf.
En un procedimiento de disefo racional de farmacos, la estructura tridimensional de un compuesto regulador se puede analizar, por ejemplo, mediante resonancia magnetica nuclear (RMN) o cristalografia con rayos-x. Esta estructura tridimensional se puede utilizar despues para predecir estructuras de compuestos potenciales, tales como agentes reguladores potenciales, por ejemplo, mediante la creaci6n de modelos por ordenador. La estructura prevista del compuesto, se puede utilizar para optimizar los compuestos guia obtenidos, por ejemplo, por metodos de diversidad molecular. Ademas, la estructura prevista del compuesto se puede producir, por ejemplo, mediante sintesis quimica, tecnologia de ADN recombinante o aislando un mimotopo a partir de una fuente natural (por ejemplo, plantas, animales, bacterias y hongos).
Varios otros metodos de disefo de farmacos basados en la estructura se describen en Maulik et al., 1997, suprf. Maulik et al. describen, por ejemplo, metodos de disefo dirigido, en los que el usuario dirige el proceso de creaci6n de moleculas nuevas a partir de un banco de fragmentos seleccionados de manera apropiada; el disefo al azar, en el que el usuario utiliza un algoritmo genetico o de otro tipo para mutar aleatoriamente fragmentos y sus combinaciones, mientras que se aplica simultaneamente un criterio de selecci6n para evaluar la aptitud de los ligandos candidatos; y un metodo basado en una cuadricula en la que el usuario calcula la energia de la interacci6n entre las estructuras tridimensionales del receptor y sondas de pequefos fragmentos, seguido por el enlace entre si de sitios de sondas favorables.
Una molecula de acido nucleico aislada que es util como un agente para inhibir una proteina en la via alternativa del complemento, es una molecula de acido nucleico no codificante, una ribozima o un ARNsi. Tal y como se usa en este documento, una molecula de acido nucleico no codificante se define como una molecula aislada de acido nucleico que reduce la expresi6n de una proteina mediante la hibridaci6n, en condiciones muy rigurosas, con un gen que codifica la proteina. Tal molecula de acido nucleico es suficientemente similar al gen que codifica la proteina que la molecula es capaz de hibridarse en condiciones muy rigurosas con la hebra codificante o la cadena complementaria del gen o del ARN que codifica la proteina natural. La interferencia de ARN (ARNi) es un procedimiento por el cual un ARN bicatenario y, en sistemas de mamiferos, un ARN de interferencia corto (ARNsi), se utiliza para inhibir o silenciar la expresi6n de genes complementarios. En la celula diana, el ARNsi esta desenrollado y se asocia con un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que es guiado a continuaci6n a las secuencias de ARNm que son complementarias al ARNsi, en donde el RISC escinde el ARNm. Una ribozima es un segmento de ARN que actua uniendose al resto de ARN diana y lo inactiva escindiendo la cadena principal de fosfodiester en un sitio de corte especifico.
Un gen incluye regiones reguladoras que controlan la producci6n de la proteina codificada por ese gen (tal como, pero no limitado a las regiones de control de la transcripci6n, traducci6n o post-traducci6n), asi como la regi6n codificadora misma. Los genes que codifican diversas proteinas de la via alternativa del complemento, incluyendo el factor B, el factor D o la properdina, han sido identificados y son conocidos en la tecnica. Una molecula aislada de acido nucleico es una molecula de acido nucleico que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulaci6n humana) y puede incluir ADN, ARN o derivados de ADN o ARN. Como tal, quot; aislada quot;, no refleja el grado de pureza de la molecula de acido nucleico. Una molecula aislada de acido nucleico de la presente invenci6n se puede aislar a partir de su fuente natural o se puede producir utilizando tecnologia de ADN recombinante (por ejemplo, reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR), amplificaci6n, clonaci6n) o sintesis quimica.
Tal y como se usa en este documento, la referencia a las condiciones de hibridaci6n se refiere a condiciones de hibridaci6n convencionales en las que se utilizan moleculas de acido nucleico para identificar moleculas de acido nucleico similares. Tales condiciones convencionales se describen, por ejemplo, en Sambrook et al, Moleculfr Cloning:. A Lfborftory Mfnufl, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989 (vease especificamente, las paginas 9.319.62). Ademas, se describen f6rmulas para calcular la hibridaci6n apropiada y las condiciones de lavado para conseguir una hibridaci6n que permita diferentes grados de desemparejamiento de nucle6tidos, por ejemplo, en Meinkoth et al., 1984, Anfl. Biocher. 138, 267-284.
Lesi6n por isquemia-reperfusi6n
Aun otra realizaci6n de la presente invenci6n se refiere al descubrimiento de los inventores de que la inhibici6n del factor B, por ejemplo, usando los anticuerpos anti-factor B o fragmentos de los mismos que se unen a antigeno descritos en este documento, tambien inhibe la lesi6n por isquemia-reperfusi6n. Esto se demostr6 en un modelo de lesi6n renal por isquemia-reperfusi6n. Por lo tanto, las composiciones de la presente invenci6n tambien tienen utilidad terapeutica en unas afecciones relacionadas con la lesi6n por isquemia-reperfusi6n y, en un aspecto de la invenci6n, la lesi6n renal por isquemia-reperfusi6n. 0tros tipos de lesi6n por isquemia-reperfusi6n que se pueden evitar o reducir incluyen, pero no se limitan a la lesi6n cardiaca por isquemia-reperfusi6n, lesi6n del sistema nervioso central por isquemia-reperfusi6n, lesi6n de las extremidades o dedos por isquemia-reperfusi6n, lesi6n de los 6rganos internos tales como el pulm6n, el higado o el intestino por isquemia-reperfusi6n o lesi6n de cualquier 6rgano o tejido trasplantado por isquemia-reperfusi6n.
En esta memoria se describe una etapa de inhibici6n selectiva de la via alternativa del complemento en un animal que padece isquemia-reperfusi6n o que tiene riesgo de experimentarla o desarrollarla. Preferiblemente, se evita o se inhibe al menos un sintoma o un tipo de lesi6n debida a la isquemia-reperfusi6n. La lesi6n por isquemia-reperfusi6n puede causar aumentos en la producci6n o en la oxidaci6n de diversos compuestos potencialmente dafinos, producidos por celulas y tejidos, los cuales pueden conducir a un dafo oxidativo a o la muerte de las celulas y los tejidos. Por ejemplo, la lesi6n renal por isquemia-reperfusi6n puede dar como resultado un deterioro histol6gico de los rifones, incluyendo lesiones tubulares en el rif6n y cambios caracteristicos de la necrosis tubular aguda. La disfunci6n renal resultante permite la acumulaci6n de desechos nitrogenados normalmente excretados por el rif6n, como el nitr6geno ureico serico (SUN). La isquemia-reperfusi6n tambien puede causar lesiones en 6rganos alejados, tales como el pulm6n. El metodo utiliza preferiblemente los nuevos anticuerpos del factor B de la presente invenci6n, tal y como se han descrito con detalle anteriormente, los cuales, cuando se administran a un animal que tiene isquemia-reperfusi6n o tiene riesgo de experimentarla o desarrollarla, se evita, reduce o inhibe al menos un sintoma de la lesi6n por isquemia-reperfusi6n. Cualquiera de los anticuerpos del factor B de la presente invenci6n tal y como se describen en este documento, o fragmentos de los mismos que se unen a antigeno, son utiles en esta realizaci6n de la invenci6n. Una descripci6n de las dosis, las vias de administraci6n preferidas y las composiciones y formulaciones que comprenden tales anticuerpos y reactivos relacionados, se proporciona en este documento y esta incluida en esta realizaci6n.
0bservese que esta realizaci6n de la presente invenci6n se refiere especificamente al tratamiento de la lesi6n por isquemia-reperfusi6n y, como tal, no se requiere que la afecci6n relacionada o el factor causante que provoc6 la lesi6n por isquemia-reperfusi6n se reduzcan significativamente o se quot;curenquot;. La presente invenci6n es totalmente eficaz para evitar o reducir el dafo o la lesi6n asociados con la isquemia-reperfusi6n o para mejorar o reducir al menos un sintoma de dicha lesi6n. Por lo tanto, la administraci6n de un agente o una formulaci6n descrita en este documento es util para la prevenci6n o la inhibici6n de la lesi6n por isquemia-reperfusi6n, aunque no se requiere que una lesi6n de este tipo se evite completamente, pero se prefiere que el paciente experimente al menos un beneficio terapeutico procedente del uso del agente o formulaci6n.
Forrulfciones, corposiciones y retodos relfcionfdos con lfs reflizfciones de lf invenci6n
En esta memoria se describe una formulaci6n o composici6n que comprende un inhibidor de la via alternativa del complemento y, en particular, un inhibidor selectivo de la via alternativa del complemento tal y como se describe en este documento. Las formulaciones o composiciones se pueden utilizar en cualquiera de los metodos descritos en este documento y con cualquiera de los reactivos descritos en este documento (por ejemplo, los nuevos anticuerpos del factor B descritos en este documento). En una realizaci6n, la composici6n es util para reducir o evitar la hiperreactividad de las vias respiratorias en un animal. En otra realizaci6n, la composici6n es util para reducir o evitar la lesi6n por isquemia-reperfusi6n en un animal. En aun otra realizaci6n, la composici6n es util para tratar o evitar una afecci6n o enfermedad mediante la inhibici6n selectiva de la via alternativa del complemento. La formulaci6n comprende: (a) un inhibidor de la via alternativa del complemento tal y como se describe en este documento; y (b) un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
En una realizaci6n, la formulaci6n o composici6n puede incluir uno o varios agentes adicionales, tales como un agente antiinflamatorio adecuado para reducir la inflamaci6n en un animal que tiene hiperreactividad de las vias respiratorias o tiene riesgo de desarrollarla y, en particular, hiperreactividad de las vias respiratorias que esta asociada con inflamaci6n. El agente antiinflamatorio puede ser cualquier agente antiinflamatorio, que sea adecuado para uso en la reducci6n de la inflamaci6n en un paciente que tiene una afecci6n inflamatoria asociada con hiperreactividad de las vias respiratorias, incluyendo pero sin estar limitado a: corticosteroides (orales, inhalados e inyectados), -agonistas (de acci6n prolongada o corta), modificadores de leucotrienos (inhibidores o antagonistas de los receptores), antagonistas de citocinas o del receptor de citocinas, anti-IgE, inhibidores de fosfodiesterasa, cromoglicato de sodio, nedocrimal, teofilina e inhibidores de la funci6n de linfocitos T. Los agentes antiinflamatorios particularmente preferidos para uso en la presente formulaci6n incluyen corticosteroides, modificadores de leucotrienos y antagonistas de citocinas o de receptores de citocinas.
En otra realizaci6n, la formulaci6n o composici6n puede incluir uno o varios agentes adicionales, tales como un agente adicional adecuado para prevenir o reducir la lesi6n por isquemia-reperfusi6n en un animal. Tales agentes incluyen pero no se limitan a, agentes antiinflamatorios; o inhibidores de la lesi6n por oxidaci6n y por radicales libres.
En otra realizaci6n, la formulaci6n o composici6n puede incluir uno o varios agentes adicionales, tales como un agente adicional adecuado para el tratamiento de otra enfermedad o afecci6n asociada con la activaci6n de la via alternativa del complemento.
De acuerdo con la presente invenci6n, un quot;vehiculo farmaceuticamente aceptablequot; incluye excipientes farmaceuticamente aceptables y/o vehiculos de administraci6n farmaceuticamente aceptables, que son adecuados para uso en la administraci6n de una formulaci6n o composici6n en un sitio in vivo adecuado. Un sitio in vivo adecuado es preferiblemente cualquier sitio en el que se puede inhibir la via alternativa del complemento. En una realizaci6n preferida, cuando el paciente tiene hipersensibilidad de las vias respiratorias y/o inflamaci6n de las vias respiratorias o tiene riesgo de desarrollarla, un sitio in vivo adecuado es preferiblemente el tejido pulmonar o las vias respiratorias. 0tros sitios preferidos in vivo incluyen otros tejidos u 6rganos, en donde se pueden centrar afecciones asociadas con la via alternativa del complemento. En otra realizaci6n preferida, un sitio in vivo adecuado es cualquier sitio en el que se produce la lesi6n por isquemia-reperfusi6n, como en el coraz6n o el sistema pulmonar, el sistema nervioso central, las extremidades o dedos, los 6rganos internos (por ejemplo, pulm6n, higado o intestino) o en cualquier 6rgano o tejido trasplantado. Los vehiculos farmaceuticamente aceptables preferidos son capaces de mantener un agente utilizado en una formulaci6n de la invenci6n, de forma que cuando el agente llega en el sitio diana en un paciente, el agente es capaz de actuar sobre su diana (por ejemplo, una proteina que es un componente de la via alternativa del complemento), lo que produce preferentemente un beneficio terapeutico para el paciente.
Los excipientes adecuados de la presente invenci6n incluyen excipientes o medicamentos disponibles que transportan o ayudan al transporte, pero no dirigen especificamente una composici6n a una celula o tejido (tambien denominados en este documento como vehiculos no dirigidos). Ejemplos de excipientes farmaceuticamente aceptables incluyen pero no se limitan a agua, soluci6n salina tamponada con fosfato, soluci6n de Ringer, soluci6n de dextrosa, soluciones que contienen suero, soluci6n de Hank, otras soluciones acuosas fisiol6gicamente equilibradas, aceites, esteres y glicoles. Los vehiculos acuosos pueden contener sustancias auxiliares adecuadas, necesarias para aproximarse a las condiciones fisiol6gicas del receptor, por ejemplo, mejorando la estabilidad quimica y la isotonicidad. Las sustancias auxiliares adecuadas incluyen, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, lactato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y otras sustancias usadas para producir tamp6n fosfato, tamp6n Tris y tamp6n bicarbonato. Las sustancias auxiliares tambien pueden incluir conservantes, tales como timerosal, m-cresol u o-cresol, formalina y alcohol benzol. Las formulaciones de la presente invenci6n se pueden esterilizar por metodos convencionales y/o liofilizarse.
Un tipo de vehiculo farmaceuticamente aceptable incluye una formulaci6n de liberaci6n controlada que es capaz de liberar lentamente una composici6n de la presente invenci6n en un animal. Tal y como se emplea en este documento, una formulaci6n de liberaci6n controlada comprende un agente de la presente invenci6n en un vehiculo de liberaci6n controlada. Los vehiculos de liberaci6n controlada adecuados incluyen pero no se limitan a, polimeros biocompatibles, otras matrices polimericas, capsulas, microcapsulas, microparticulas, preparaciones de bolo, bombas osm6ticas, dispositivos de difusi6n, liposomas, lipoesferas y sistemas de administraci6n transdermica. 0tros vehiculos adecuados incluyen cualquier vehiculo que se puede unir o incorporar al agente, de modo que alarga la semivida del agente que se va a administrar. Un vehiculo de este tipo puede incluir cualquier proteina portadora adecuada o incluso un segmento de fusi6n que alarga la semivida de una proteina cuando se administra in vivo. Los vehiculos de administraci6n adecuados se han descrito previamente en este documento, e incluyen pero no se limitan a liposomas, vectores viricos u otros vehiculos de administraci6n, que incluyen las ribozimas. Los vehiculos de administraci6n que contienen lipidos naturales incluyen celulas y membranas celulares. Los vehiculos de administraci6n que contienen lipidos artificiales incluyen liposomas y micelas. Tal y como se ha descrito anteriormente, un vehiculo de administraci6n de la presente invenci6n se puede modificar para dirigirlo a un sitio particular en un paciente, dirigiendo a la diana y haciendo uso de este modo de un agente inhibidor en ese sitio. Las modificaciones adecuadas incluyen manipular la f6rmula quimica de la porci6n lipidica del vehiculo de administraci6n y/o introducir en el vehiculo un agente que se dirige a la diana capaz de dirigir especificamente un vehiculo de administraci6n a un lugar preferido, por ejemplo, un tipo de celula preferida. 0tros vehiculos de administraci6n adecuados incluyen particulas de oro, conjugados de poli-L-lisina/ADN-molecular y cromosomas artificiales.
En una realizaci6n, un agente util en los presentes metodos se administra en una formulaci6n adecuada para la administraci6n pulmonar o nasal, y en particular, la administraci6n en aerosol, tambien denominada en este documento una formulaci6n en aerosol. Dicha via de administraci6n es particularmente util en el metodo para prevenir o inhibir la AHR y/o la inflamaci6n de las vias respiratorias de un paciente, pero se puede utilizar en otras afecciones, cuando se desea la administraci6n al pulm6n o a las vias respiratorias. Ademas, estas formulaciones son particularmente utiles para la administraci6n de anticuerpos. Una formulaci6n de este tipo incluye por lo general un vehiculo y, preferiblemente, un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Los vehiculos que son particularmente utiles para la administraci6n en aerosol de acuerdo con la presente invenci6n, incluyen pero no se limitan a: etanol anhidro; polvos secos dispersables; capsulas pequefas (por ejemplo, microcapsulas o microparticulas); liposomas; excipientes inyectables; y aerosoles nebulizados. El etanol anhidro para la administraci6n de proteinas y peptidos se describe, por ejemplo, en Choi et al., 2001, PNAS USA 98(20):11103-11107. Los polvos secos dispersables adecuados para la administraci6n en aerosol de los agentes se describen con detalle, por ejemplo, en el documento de Patente de EE.UU. n° 6.165.463. (Veanse tambien los productos de Inhale Therapeutic Systems, Inc., ahora Nektar, y Quadrant Technology). Los liposomas adecuados para uso en aerosoles incluyen cualquier liposoma y, en particular, cualquier liposoma que sea suficientemente pequefo para ser administrado en aerosol en el metodo de la invenci6n. Las microcapsulas y las microparticulas son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, Alliance Pharmaceutical Corporation cuenta con una tecnologia de ingenieria de particulas, denominada PulroSphere, preparadas por un procedimiento registrado de secado por pulverizaci6n y estan disefadas para ser huecas y porosas. Un producto de Ventolin consiste en particulas de albuterol micronizado (base libre), suspendidas en una mezcla de propelentes a base de CFC. Proventil HFA contiene sulfato de albuterol micronizado y un pequefo porcentaje de un codisolvente de etanol para estabilizar el tensioactivo de acido oleico. La incorporaci6n de farmacos dentro de liposomas tiene varias ventajas para la administraci6n en aerosol. Ya que los liposomas son relativamente insolubles, el tiempo de retenci6n de algunos farmacos en el pulm6n se puede prolongar para aumentar la eficacia. Los liposomas tambien son absorbidos principalmente por las celulas fagociticas, lo que les vuelve particularmente adecuados para la administraci6n de ciertos farmacos. Las formulaciones nebulizadas se describen en los Ejemplos. Los dispositivos para la entrega de formulaciones en aerosol incluyen pero no se limitan a, inhaladores presurizados de dosis medida (MDI), inhaladores de polvo seco (DPI), dispositivos de soluci6n medida (MSI) e inhaladores por ultrasonidos, e incluyen dispositivos que son nebulizadores e inhaladores. Se pueden utilizar diversos agentes en las formulaciones administradas por tales dispositivos en forma de ayudas para la suspensi6n y solubilizantes que son particularmente utiles para la administraci6n de proteinas (por ejemplo, acido oligolactico, acido acil-amida y M-PEGS monofuncionalizados; vease, McKenzie y 0liver; 2000; quot;Formulating Therapeutic Proteins and Peptides in Pressurized Metered Dose Inhalers For Pulmonary Deliveryquot;, 3M Health Care Ltd., Morley Street, Loughborough, Leicesteshire LE11 1EP, Reino Unido).
Un vehiculo farmaceuticamente aceptable que es capaz de dirigirse a una diana se denomina en este documento un quot;vehiculo de entrega dirigidoquot;. Los vehiculos de entrega dirigidos de la presente invenci6n son capaces de entregar una formulaci6n, que incluye un agente inhibidor, en un sitio diana en un paciente. Un quot;sitio dianaquot; se refiere a un sitio en un paciente al que se desea administrar una formulaci6n terapeutica. Por ejemplo, un sitio diana puede ser cualquier celula o tejido al que esta dirigido un anticuerpo de la presente invenci6n, o mediante inyecci6n directa o la administraci6n usando liposomas, vectores viricos u otros vehiculos de entrega, incluyendo las ribozimas. Un vehiculo de entrega o un anticuerpo de la presente invenci6n se puede modificar para dirigirlo a un sitio particular en un animal, dirigiendolo de este modo a una diana y haciendo uso de un compuesto particular, anticuerpo, proteina o molecula de acido nucleico en ese sitio. Las modificaciones adecuadas incluyen la manipulaci6n de la f6rmula quimica de la porci6n lipidica de un vehiculo de entrega y/o la introducci6n en el vehiculo de un compuesto capaz de dirigir especificamente un vehiculo de entrega a un lugar preferido, por ejemplo, una celula o un tipo de tejido preferido. Especificamente, dirigir a una diana se refiere a provocar que un vehiculo de entrega se una a una celula particular, mediante la interacci6n del compuesto en el vehiculo con una molecula en la superficie de la celula. Los compuestos que se dirigen a una diana adecuados incluyen ligandos capaces de unirse selectivamente (es decir, especificamente) a otra molecula en un sitio particular. Ejemplos de tales ligandos incluyen anticuerpos, antigenos, receptores y ligandos de receptores. Ejemplos particularmente utiles incluyen cualquier ligando que esta asociado con la via del complemento (por ejemplo, CR2, C3, C3d, C3dg, iC3b, C3b) o cualquier ligando que esta asociado con el tipo de celula, tipo de tejido o el sitio en el animal que se va a tratar. La manipulaci6n de la f6rmula quimica de la porci6n lipidica del vehiculo de entrega puede modular la orientaci6n extracelular o intracelular hacia la diana del vehiculo de entrega. Por ejemplo, una sustancia quimica se puede afadir a la f6rmula lipidica de un liposoma lo que altera la carga de la bicapa lipidica del liposoma, de manera que el liposoma se fusiona con celulas particulares que tienen caracteristicas de carga particulares.
Un vehiculo de entrega util para una variedad de vias de administraci6n y agentes es un liposoma. Un liposoma es capaz de permanecer estable en un animal durante el tiempo suficiente para entregar una molecula de acido nucleico, o incluso una proteina o un anticuerpo, tal y como se describe en la presente invenci6n, en un sitio preferido en el animal. Un liposoma, de acuerdo con la presente invenci6n, comprende una composici6n lipidica que es capaz de entregar una molecula de acido nucleico descrita en la presente invenci6n a un sitio particular o seleccionado, en un animal. Un liposoma de acuerdo con la presente invenci6n comprende una composici6n lipidica que es capaz de fusionarse con la membrana plasmatica de la celula diana para entregar una molecula de acido nucleico en una celula. Los liposomas adecuados para uso en la presente invenci6n incluyen cualquier liposoma. Los liposomas preferidos de la presente invenci6n incluyen aquellos liposomas usados tipicamente, por ejemplo, en metodos de entrega de genes, conocidos por los expertos en la tecnica. Los liposomas mas preferidos comprenden liposomas que tienen una composici6n lipidica policati6nica y/o liposomas que tienen un esqueleto de colesterol conjugado con polietilenglicol. La formaci6n de un complejo a base de un liposoma con una molecula de acido nucleico o un agente inhibidor de la presente invenci6n, se puede lograr usando metodos convencionales en la tecnica.
0tro vehiculo de entrega comprende un vector virico. Un vector virico que incluye una molecula de acido nucleico aislada, util en el metodo de la presente invenci6n, en donde las moleculas de acido nucleico se empaquetan en una cubierta virica que permite la entrada de ADN en una celula. Se puede utilizar una variedad de vectores viricos, incluyendo, pero no limitado a, los basados en alfavirus, poxvirus, adenovirus, herpesvirus, lentivirus, virus adenoasociados y retrovirus.
De acuerdo con la presente invenci6n, la determinaci6n de protocolos aceptables para administrar un agente, composici6n o formulaci6n, que incluyen la via de administraci6n y la cantidad eficaz de un agente que se va a administrar a un animal, la pueden realizar los expertos en la tecnica. Un agente de la presente invenci6n se puede administrar in vivo o ex vivo. Las rutas de administraci6n adecuadas in vivo pueden incluir, pero no estan limitadas a, las vias oral, nasal, inhalada, t6pica, intratraqueal, transdermica, rectal y parenteral. Las rutas parenterales preferidas pueden incluir pero no se limitan a las rutas subcutanea, intradermica, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal. Las rutas t6picas preferidas incluyen la inhalaci6n con aerosol (es decir, pulverizaci6n) o la administraci6n superficial t6pica en la piel de un animal. Preferiblemente, un agente se administra por las rutas nasal, inhalada, intratraqueal, t6pica o sistemica (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa). Ex vivo se refiere a la realizaci6n de parte de la etapa de la administraci6n fuera del paciente. Las vias preferidas de administraci6n de anticuerpos incluyen las rutas parenterales y las rutas en aerosol/nasal/inhalada.
Las administraciones intravenosa, intraperitoneal e intramuscular se pueden realizar utilizando metodos convencionales en la tecnica. La administraci6n en aerosol (inhalaci6n) se puede realizar utilizando metodos convencionales en la tecnica (vease, por ejemplo, Stribling y col., Proc. Nftl. Acfd. Sci. USA. 189:1127711281,1992. Los vehiculos adecuados para la administraci6n en aerosol se han descrito anteriormente. Los dispositivos para la administraci6n de formulaciones en aerosol incluyen pero no se limitan a inhaladores presurizados de dosis medida (MDI), inhaladores de polvo seco (DPI) y dispositivos de soluci6n medida (MSI), e incluyen dispositivos que son nebulizadores e inhaladores. La administraci6n oral se puede realizar formando complejos de una composici6n terapeutica de la presente invenci6n con un vehiculo capaz de resistir la degradaci6n con enzimas digestivas en el intestino de un animal. Ejemplos de tales vehiculos incluyen, capsulas o comprimidos de plastico, tales como los conocidos en la tecnica. Las tecnicas de inyecci6n directa son particularmente utiles para la administraci6n de una molecula de acido nucleico recombinante a una celula o tejido que es accesible por medio de cirugia, y en particular, en la superficie del cuerpo o cerca de la misma. La administraci6n de una composici6n a nivel local dentro del area de una celula diana, se refiere a inyectar la composici6n a centimetros y preferiblemente, a milimetros de la celula o tejido diana.
Varios metodos de administraci6n y vehiculos de entrega descritos en este documento han mostrado ser eficaces para la entrega de una molecula de acido nucleico a una celula o un tejido diana, transfectando la molecula de acido nucleico a la celula y expresandose. En muchos estudios, la administraci6n y expresi6n satisfactorias de un gen heter6logo se logr6 en tipos de celulas preferidas y/o empleando vehiculos de entrega preferidos y vias de administraci6n de la presente invenci6n. Por ejemplo, utilizando la entrega de liposomas, documento de patente de EE.UU. n° 5.705.151, publicado el 6 de enero de 1998, de Dow et al., se mostraba el exito de la administraci6n intravenosa in vivo de una molecula de acido nucleico que codificaba un superantigeno y una molecula de acido nucleico que codificaba una citocina en un vehiculo de entrega de liposoma cati6nico, en donde las proteinas codificadas se expresaban en tejidos del animal y, en particular, en los tejidos pulmonares. Liu et al., 1997 mostraron que la entrega intravenosa de liposomas cati6nicos que contienen colesterol que contienen genes, se dirige preferentemente a los tejidos pulmonares y media eficazmente en la transferencia y la expresi6n de los genes in vivo. La entrega de numerosas secuencias de acido nucleico se ha logrado administrando vectores viricos que codifican las secuencias de acido nucleico.
Una dosis unica preferida de un agente que incluye proteinas, moleculas pequefas y anticuerpos, para uso en cualquier metodo descrito en este documento, comprende entre aproximadamente 0,01 microgramos x kilogramo-1 y aproximadamente 10 miligramos x kilogramo-1 de peso corporal de un animal. Una sola dosis mas preferida de un agente comprende entre aproximadamente 1 microgramo x kilogramo-1 y aproximadamente 10 miligramos x kilogramo-1 de peso corporal de un animal. Una dosis unica aun mas preferida de un agente comprende entre aproximadamente 5 microgramos x kilogramo-1 y aproximadamente 7 miligramos x kilogramo-1 de peso corporal de un animal. Una dosis unica aun mas preferida de un agente comprende entre aproximadamente 10 microgramos x kilogramo-1 y aproximadamente 5 miligramos x kilogramo-1 de peso corporal de un animal. Una dosis unica particularmente preferida de un agente comprende entre aproximadamente 0,1 miligramo x kilogramo-1 y aproximadamente 5 miligramos x kilogramo-1 de peso corporal de un animal, si el agente se administra en aerosol. 0tra dosis unica particularmente preferida de un agente comprende entre aproximadamente 0,1 microgramos x kilogramo-1 y aproximadamente 10 microgramos x kilogramo-1 de peso corporal de un animal, si el agente se administra parenteralmente.
En una realizaci6n, una dosis unica adecuada de un complejo de acido nucleico:liposoma de la presente invenci6n es desde aproximadamente 0,1 Ig a aproximadamente 100 Ig por kg de peso corporal del paciente al que se administra el complejo. En otra realizaci6n, una dosis unica adecuada es desde aproximadamente 1 Ig hasta aproximadamente 10 Ig por kg de peso corporal. En otra realizaci6n, una sola dosis apropiada de complejo acido nucleico:lipido es de al menos aproximadamente 0,1 Ig de acido nucleico, mas preferiblemente al menos aproximadamente 1 Ig de acido nucleico, incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 10 Ig de acido nucleico, incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 50 Ig de acido nucleico, e incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 100 Ig de acido nucleico.
En una realizaci6n, una dosis adecuada de un agente de la presente invenci6n para uso en cualquier metodo descrito en este documento, es una dosis eficaz para inhibir la expresi6n o la actividad de al menos una proteina en la via alternativa del complemento tal y como se describe en esta memoria (por ejemplo, factor B, factor de D o properdina), en comparaci6n con la ausencia de administraci6n del agente. Los metodos para medir la expresi6n o la actividad biol6gica de una proteina se han descrito anteriormente. En otra realizaci6n, una dosis adecuada de un agente de la presente invenci6n, es una dosis que inhibe de forma medible la via alternativa del complemento de la invenci6n. La activaci6n del complemento y su inhibici6n se puede medir usando tecnicas/ensayos que son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se puede realizar un analisis in vitro de la deposici6n de C3 sobre particulas de zimosano A, tal y como se describe en los ejemplos. Tambien se puede someter a ensayo la capacidad del agente para inhibir la lisis de eritrocitos no sensibilizados con suero humano. La extrapolaci6n de los resultados in vitro a dosificaciones in vivo, basandose en estos ensayos, esta dentro de la capacidad de los expertos en la tecnica.
En los seres humanos, se conoce en la tecnica que usando metodos convencionales para la administraci6n en aerosol, solo aproximadamente el 10% de la soluci6n administrada entra tipicamente en las vias respiratorias profundas, incluso empleando un inhalador. Si la administraci6n en aerosol es por inhalaci6n directa, se puede asumir una dosificaci6n de aproximadamente el 10% de la administrada por metodos de nebulizaci6n. Por ultimo, un experto en la tecnica sera capaz con facilidad de convertir una dosificaci6n de rat6n a una dosificaci6n humana utilizando una escala alometrica. Esencialmente, una escala de dosificaci6n de rat6n a humano se basa en la tasa de aclaramiento de un compuesto y en la superficie corporal del rat6n. La conversi6n para mg/kg es 1/12° del quot;nivel sin efecto adverso observadoquot; (N0EL) para obtener la concentraci6n de la dosificaci6n humana. Este calculo asume que la eliminaci6n entre rat6n y ser humano es la misma, lo que se cree que es el caso para los anticuerpos.
Por consiguiente, una dosis unica preferida de un anticuerpo comprende entre aproximadamente 1 ng x kilogramo-1 y aproximadamente menos de 1 mg x kilogramo-1 de peso corporal de un animal. Una sola dosis mas preferida de un anticuerpo comprende entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 600 Ig x kilogramo-1 de peso corporal del animal. Una dosis unica aun mas preferida de un anticuerpo, particularmente cuando la formulaci6n del anticuerpo es administrada por nebulizaci6n, comprende entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 600 Ig x kilogramo-1 de peso corporal del animal, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 500 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 400 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 300 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 200 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 100 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 20 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 50 Ig x kilogramo-1 de peso corporal del animal.
0tra dosis unica preferida de un anticuerpo, particularmente cuando la formulaci6n del anticuerpo se administra por nebulizaci6n, comprende entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 600 Ig x kilogramo-1 de peso corporal del animal, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 500 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 400 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 300 pg x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 200 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 100 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 200 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 50 Ig x kilogramo-1 de peso corporal del animal.
0tra dosis unica preferida de un anticuerpo, particularmente cuando la formulaci6n del anticuerpo se administra por inhalaci6n directa a partir de un inhalador, comprende entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 100 Ig x kilogramo-1 de peso corporal del animal, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 50 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 10 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 2 ng kilogramo-1 y aproximadamente 5 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 1 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 0,5 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 0,25 Ig x kilogramo-1, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 2 ng x kilogramo-1 y aproximadamente 0,1 Ig x kilogramo-1 peso corporal del animal.
En otra realizaci6n, el anticuerpo se administra a una dosis menor de aproximadamente 500 Ig de anticuerpo por mililitro de formulaci6n y, preferiblemente, menor de aproximadamente 250 Ig de anticuerpo por mililitro de formulaci6n y, mas preferiblemente, menor de aproximadamente 100 Ig de anticuerpo por mililitro de formulaci6n, y mas preferiblemente, menor de aproximadamente 50 Ig de anticuerpo por mililitro de formulaci6n, y mas preferiblemente, menor de aproximadamente 40 Ig de anticuerpo por mililitro de formulaci6n, y mas preferiblemente, menor de aproximadamente 30 Ig de anticuerpo por mililitro de formulaci6n, y mas preferiblemente, menor de aproximadamente 20 Ig de anticuerpo por mililitro de formulaci6n, y mas preferiblemente, menor de aproximadamente 10 Ig de anticuerpo por mililitro de formulaci6n, e incluso mas preferiblemente, entre aproximadamente 5 Ig de anticuerpo y aproximadamente 10 Ig de anticuerpo por mililitro de formulaci6n.
Considerando mas en particular el metodo de reducci6n o prevenci6n de la hiperreactividad de las vias respiratorias y/o la inflamaci6n de las vias respiratorias o una afecci6n o una enfermedad relacionada con ellas, una dosis unica adecuada de un agente inhibidor para administrar a un animal, es una dosis que es capaz de reducir o prevenir la hiperreactividad de las vias respiratorias y/o la inflamaci6n de las vias respiratorias, o la reducci6n de al menos otro sintoma de una enfermedad que se va a tratar (por ejemplo, asma), en un animal cuando se administra una o varias veces durante un periodo de tiempo adecuado. Cuando el paciente tiene AHR o tiene riesgo de desarrollar AHR, una dosis unica adecuada de un agente comprende una dosis que mejora la AHR con una duplicaci6n de la dosis de un agente provocador o que mejora la funci6n respiratoria estatica de un animal.
De acuerdo con la presente invenci6n, una cantidad eficaz de un agente que inhibe la AHR para administrar a un animal, comprende una cantidad que es capaz de reducir la hiperreactividad de las vias respiratorias (AHR) o la inflamaci6n de las vias respiratorias sin ser t6xica para el animal. Una cantidad que es t6xica para un animal comprende cualquier cantidad que causa dafos en la estructura o la funci6n de un animal (es decir, venenosa).
En una realizaci6n, la eficacia de un agente inhibidor de la AHR para proteger a un animal de la AHR, en un animal que tiene AHR o tiene riesgo de desarrollarla, se puede medir en cantidades duplicadas. Por ejemplo, la capacidad de un animal para estar protegido contra la AHR (es decir, experimentar una reducci6n o una prevenci6n) mediante la administraci6n de un agente dado, es significativa si PC20metacolinaVEF1 del animal, es de 1 mg/ml antes de la administraci6n del agente y es 2 mg/ml de MCh despues de la administraci6n del agente. Del mismo modo, un agente se considera eficaz si el PC20metacolinaVEF1 del animal es de 2 mg/ml antes de la administraci6n del agente y es de 4 mg/ml de MCh despues de la administraci6n del agente. Una cantidad eficaz preferida de un agente comprende una cantidad que es capaz de aumentar el PC20metacolinaVEF1 de un animal tratado con el agente por aproximadamente una concentraci6n de duplicaci6n frente al PC20metacolinaVEF1 de un animal normal. Tal y como se ha descrito anteriormente, un animal normal se refiere a un animal conocido por no padecer o ser susceptible de AHR anormal. Un animal del ensayo se refiere a un animal sospechoso de padecer o que es susceptible de padecer AHR anormal.
En una realizaci6n de la presente invenci6n, en un animal que tiene AHR, una cantidad eficaz de un agente que se va a administrar a un animal es una cantidad que reduce sensiblemente la AHR en el animal, en comparaci6n con antes de la administraci6n del agente. En otra realizaci6n, una cantidad eficaz de un agente que se va a administrar a un animal, es una cantidad que reduce sensiblemente la AHR en el animal, en comparaci6n con un nivel de AHR de las vias respiratorias en una poblaci6n de animales con inflamaci6n que esta asociada con AHR, en la que no se administr6 el agente. El agente es capaz preferiblemente de reducir la AHR en un animal, incluso cuando el agente se administra despues de la aparici6n de los sintomas fisicos de la AHR (es decir, despues del inicio de AHR aguda). Lo mas preferiblemente, una cantidad eficaz del agente es una cantidad que reduce los sintomas de la AHR hasta el punto en el que ya no se detecta la AHR en el paciente. En otra realizaci6n, una cantidad eficaz del agente es una cantidad que previene o inhibe sustancialmente la aparici6n de la AHR cuando el agente se administra antes de la exposici6n del paciente a un estimulo provocador de AHR, tal como un alergeno, de una manera que es suficiente para inducir la AHR en ausencia del agente.
En otra realizaci6n, una cantidad eficaz de un agente para uso en la presente invenci6n, comprende una cantidad que da como resultado una mejora en el valor de PC20metacolinaVEF1 de un animal, de tal manera que el valor de PC20metacolinaVEF1 obtenido antes de la administraci6n del agente cuando el animal se provoca con una primera concentraci6n de metacolina, es el mismo que el valor de PC20metacolinaVEF1 obtenido despues de la administraci6n del agente cuando el animal se provoca con una cantidad doble de la primera concentraci6n de metacolina. Una cantidad preferida de un agente comprende una cantidad que da como resultado una mejora en el valor de PC20metacolinaVEF1 de un animal, de tal manera que el valor de PC20metacolinaVEF1 obtenido antes de la administraci6n del agente esta entre aproximadamente 0,01 mg/ml y aproximadamente 8 mg/ml de metacolina, es el mismo que el valor de PC20metacolinaVEF1 obtenido despues de la administraci6n del agente que es de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 16 mg/ml de metacolina.
Tal y como se ha descrito anteriormente en este documento, la eficacia de un agente para proteger a un animal que tiene AHR o es susceptible de AHR se puede determinar midiendo el porcentaje de mejora en VEF1 y/o la relaci6n de VEF1/CVF antes y despues de la administraci6n del agente. En una realizaci6n, una cantidad eficaz de un agente comprende una cantidad que es capaz de reducir la limitaci6n del flujo de aire de un animal, de modo que el valor de VEF1/CVF del animal es de al menos aproximadamente el 80%. En otra realizaci6n, una cantidad eficaz de un agente comprende una cantidad que es capaz de reducir la limitaci6n del flujo de aire de un animal de tal manera que el valor de VEF1/CVF del animal mejora en al menos aproximadamente el 5%, o al menos aproximadamente 100 cc o PGFRG de 10L/min. En otra realizaci6n, una cantidad eficaz de un agente comprende una cantidad que mejora el VEF1 de un animal, en al menos aproximadamente el 5%, y mas preferiblemente entre aproximadamente el 6% y aproximadamente el 100%, mas preferiblemente entre aproximadamente el 7% y aproximadamente el 100%, e incluso mas preferiblemente entre aproximadamente el 8% y aproximadamente el 100% (o aproximadamente 200 ml) del VEF1 previsto del animal. En otra realizaci6n, una cantidad eficaz de un agente comprende una cantidad que mejora el VEF1 de un animal, en al menos aproximadamente el 5% y preferiblemente en al menos aproximadamente el 10%, e incluso mas preferiblemente en al menos aproximadamente el 25%, e incluso mas preferiblemente en al menos aproximadamente el 50%, e incluso mas preferiblemente en al menos aproximadamente el 75%.
Un experto en la tecnica sera capaz de determinar que el numero de dosis de un agente que se va a administrar a un animal depende del grado de la hiperreactividad de las vias respiratorias y de la afecci6n subyacente, de la cual la AHR es un sintoma, y de la respuesta de un paciente individual al tratamiento. Ademas, el medico sera capaz de determinar el momento apropiado para la administraci6n del agente de una manera eficaz para reducir la AHR en el animal. Preferiblemente, el agente se administra hasta 48 horas antes de la exposici6n del paciente a una cantidad de un estimulo provocador de AHR, eficaz para inducir AHR, y mas preferiblemente hasta 36 horas, y mas preferiblemente hasta 24 horas, y mas preferiblemente hasta 12 horas, y mas preferiblemente hasta 6 horas, hasta 5 horas, hasta 4 horas, hasta 3 horas, hasta 2 horas o hasta 1 hora antes de la exposici6n del paciente a una cantidad del estimulo provocador de AHR, eficaz para inducir AHR. En una realizaci6n, el agente se administra tan pronto como el paciente o el medico reconocen (es decir, inmediatamente) que el paciente ha estado expuesto o esta a punto de ser expuesto a un estimulo que provoca AHR, y especialmente un estimulo que provoca AHR, frente al cual el paciente esta sensibilizado (es decir, un alergeno). En otra realizaci6n, el agente se administra a la primera sefal de desarrollo de AHR (es decir, AHR de inicio agudo), y preferentemente en el intervalo de al menos 2 horas desde la aparici6n de los sintomas de AHR, y mas preferiblemente, al menos 1 hora, y mas preferiblemente al menos 30 minutos, y mas preferiblemente al menos 10 minutos, y mas preferiblemente al menos 5 minutos despues de la aparici6n de los sintomas de AHR. Los sintomas de la AHR y los metodos para medir o detectar tales sintomas se han descrito con detalle anteriormente. Preferiblemente, tales administraciones se proporcionan hasta que aparecen signos de reducci6n de la AHR, y luego segun sea necesario hasta que hayan desaparecido los sintomas de la AHR.
Haciendo referencia en particular al metodo de inhibir o prevenir la lesi6n por isquemia-reperfusi6n, una cantidad eficaz de un agente, y en particular un anticuerpo del factor B o un fragmento del mismo que se une a antigeno (o un polipeptido que se une a antigeno) para administrar a un animal, es una cantidad que inhibe de forma medible el dafo histol6gico, incluyendo el dafo oxidativo o la muerte celular, en el animal, en comparaci6n con la ausencia de administraci6n del agente. En el caso de lesi6n renal por isquemia-reperfusi6n, una cantidad eficaz de un agente que se va a administrar a un animal, es una cantidad que inhibe de forma medible el aumento del nitr6geno ureico serico o disminuye de forma medible la lesi6n histol6gica de los tejidos renales de los animales, en comparaci6n con la ausencia de administraci6n del agente. Una dosis unica adecuada de un agente inhibidor que se va a administrar a un animal, es una dosis que es capaz de reducir o prevenir por lo menos uno de los sintomas, un tipo de lesi6n o los dafos resultantes de la lesi6n por isquemia-reperfusi6n en un animal, cuando se administra una o varias veces durante un periodo de tiempo adecuado. Las dosis adecuadas de anticuerpos, que incluyen diversas vias de administraci6n, se han descrito con detalle anteriormente. En un aspecto, una cantidad eficaz de un agente que inhibe la lesi6n por isquemia-reperfusi6n para administrar a un animal, comprende una cantidad que es capaz de inhibir al menos un sintoma o un dafo causado por la lesi6n por isquemia-reperfusi6n, sin ser t6xica para el animal.
Cualquiera de los metodos descritos en esta memoria se pueden utilizar en cualquier animal y, en particular, en cualquier animal de la clase de vertebrados, Mfrrflif (es decir, mamiferos), que incluyen sin limitaci6n, primates, roedores, ganado y animales domesticos. Los mamiferos preferidos para el tratamiento utilizando la presente invenci6n son los seres humanos.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar y no estan destinados a limitar el alcance de la presente invenci6n.
Ejemplos
Ejemplo 1
El siguiente ejemplo describe la producci6n de un nuevo inhibidor de la via alternativa del complemento.
Los presentes inventores han creado varios hibridomas que producen anticuerpos monoclonales de rat6n que se unen al factor B de rat6n. En este estudio, los inventores se proponen caracterizar la capacidad de uno de estos anticuerpos para inhibir la via alternativa del complemento. Los inventores tambien estudiaron este anticuerpo en un modelo de perdida fetal mediada con antifosfolipido. Tal y como se inform6 anteriormente (Girardi), los ratones carentes de factor B estaban protegidos en gran medida contra la perdida fetal en este modelo, y los inventores plantearon la hip6tesis de que un inhibidor ex6geno de la via alternativa seria un agente terapeutico eficaz en este modelo de enfermedad.
Metodos
Construcci6n de unf proteinf de fusi6n ffctor B-Ig y purificfci6n del ffctor B de rft6n. Se construy6 un plasmido que codificaba dos de las repeticiones cortas de consenso (SCR) del gen del factor B unido a los dominios de bisagra, CH2 y CH3 de un isotipo IgG1 de rat6n (Fig. 1). Estos dominios de SCR se escogieron porque forman parte del segmento eliminado del gen del factor B en los ratones fB-/- utilizados en estos estudios.
Purificfci6n del ffctor B de rft6n. El factor B del complemento se purific6 a partir de suero de rat6n normal mediante purificaci6n por afinidad. La columna de afinidad se cre6 mediante la uni6n de factor B de cabra anti-humano properdina (Diasorin, Stillwater, MN) a sefarosa activada con CNBr (Amersham, Arlington Heights, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A los ratones C57/B6J se les extrajo sangre mediante punci6n cardiaca, y la sangre se recogi6 en jeringas que contenian 50 Il de EDTA 500 mM con el fin de evitar la activaci6n de la via alternativa. La sangre se centrifug6 a 2000 rpm durante 15 minutos y se recogi6 el plasma. El plasma se diluy6 a continuaci6n 1:1 con tamp6n (EACA 50 mM, EDTA 10 mM, benzamidina 2 mM en PBS, pH 7,4) y se pas6 a traves de un filtro de 0,22, Im (GE Water Technologies). El plasma se afadi6 a la columna de afinidad y la columna se lav6 con 10 volumenes de columna de tamp6n. El factor B se eluy6 usando LiCl2 5 M y se dializ6 durante una noche frente a PBS. La pureza del factor B, se verific6 despues por electroforesis en un gel de Tris-glicina al 10% y se tif6 con Coomassie (no se muestran los datos).
Obtenci6n de fnticuerpos ronoclonfles inhibidores que se dirigen fl ffctor B del corplerento. La deleci6n dirigida del factor B de rat6n se llev6 a cabo tal y como se ha descrito previamente (Matsumoto). Los ratones carentes de factor B se crearon con celulas madre embrionarias de la cepa Sv129 y a continuaci6n se cruzaron con ratones C57BL/6 antes de la expansi6n de la colonia en F1. Los ratones carentes del factor B fueron inmunizados con 125 Ig de la proteina de fusi6n recombinante factor B-Ig, emulsionada con adyuvante incompleto de Freund y luego se estimul6 cuatro veces con intervalos de tres semanas. Los ratones se seleccionaron por el desarrollo de anticuerpos inhibidores del factor B, sometiendo a ensayo sus sueros en un ensayo de inmunoabsorci6n enzimatica (ELISA) usando placas recubiertas con factor B de rat6n y un ensayo in vitro de inhibici6n de la via alternativa del complemento (descrito mas abajo). Un dia despues de la ultima inyecci6n, celulas esplenicas de un rat6n identificado por tener una fuerte respuesta inmune hacia el factor B, se fusionaron con la linea celular de mieloma en el Centro de Anticuerpos Monoclonales de la Universidad de Colorado. Los hibridomas candidatos se clonaron mediante diluci6n limitante, y se identificaron los clones capaces de inhibir la actividad de la via alternativa. Uno de los hibridomas, A1379, se utiliz6 para estos experimentos. A1379 se purific6 a partir del material sobrenadante del cultivo de tejidos con una columna de Proteina G-Sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Suecia). LPS fue retirado del AcM purificado usando polimixina (Sigma). El ensayo del material lisado de amebocitos de Limulus (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD) se us6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante para verificar que el AcM tenia niveles de LPS inferiores a 1 UE/mg de AcM. La pureza del AcM se verific6 a continuaci6n por electroforesis en un gel de Trisglicina al 10% y se tif6 con azul de Coomassie.
Analisis ELISA de los niveles de fnticuerpo fnti-ffctor B.
Los ratones se escrutaron en busca de una respuesta inmune frente a las inmunizaciones, sometiendo a ensayo sus sueros en un ensayo de inmunoabsorci6n enzimatica (ELISA) frente a factor B purificado. Placas de ELISA de noventa y seis pocillos (Costar, Corning, NY) fueron recubiertas con 125 ng de factor B purificado en tamp6n de recubrimiento (Na2C03 15 mM, Na2HC03 35 mM) y se almacenaron durante una noche a 4°C. Las placas se lavaron despues con 200 Il de PBS. La uni6n no especifica fue bloqueada incubando las placas con 200 Il de 5% de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0) en PBS. Las placas se lavaron dos veces con 200 Il de PBS con 0,1% de Tween 20, a continuaci6n, se incubaron con suero diluido durante una hora. Las muestras se diluyeron 1:100 en PBS con 0,1% de Tween 20 y 0,1% de BSA, a continuaci6n, las muestras se diluyeron adicionalmente en serie 1:1, siete veces. Las placas se lavaron despues dos veces y se incubaron con 50 Il de IgG anti-rat6n de cabra conjugada con peroxidasa (Cappel, Durham, Carolina del Norte). Las placas se lavaron despues cuatro veces y se incubaron con 100 Il de H202 al 30% 1:1000 que contenia ABTS (Sigma), y se ley6 la absorbancia a 405 nm con un lector de microplacas (Biorad, Richmond, CA).
Ensfyos de inhibici6n de lf vif flternftivf del corplerento. Los sueros con titulos detectables de anticuerpos antifactor B se escrutaron luego en busca de la capacidad para inhibir la via alternativa. Esto se realiz6 mediante un analisis in vitro de deposici6n de C3 sobre particulas de zimosano A (Sigma) (Quigg). Cincuenta mg de particulas de zimosano en 10 ml de NaCl 0,15 M se hirvieron durante 60 minutos, despues se lavaron dos veces en PBS. Los sueros se sometieron a ensayo mezclando 1x107 particulas de zimosano en una mezcla de reacci6n con una concentraci6n final de EGTA 10 mM y MgCl2 5 mM. Se afadieron diez microlitros de sueros procedentes de ratones C57/B6 no manipulados como una fuente de complemento. Los ensayos de inhibici6n se llevaron a cabo con un maximo de 70 Il de suero procedente de ratones inmunizados (para detectar la generaci6n de anticuerpos inhibidores) o con anticuerpo purificado con una dosis ajustada desde 0,0625 Ig hasta 8 Ig por reacci6n. Las muestras se llevaron hasta un volumen final de 100 Il con PBS y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Las particulas de zimosano se lavaron dos veces con PBS frio, 1% de suero bovino fetal, y luego se incubaron con C3 anti-rat6n de cabra conjugado con FITC (Cappel, Durham, Carolina del Norte) durante una hora en hielo. Las muestras se lavaron de nuevo dos veces, se resuspendieron en 0,5 ml de PBS, 1% de suero bovino fetal, y luego se analizaron por citometria de flujo. El porcentaje de inhibici6n se calcul6 usando la f6rmula:
100 x [1 - (fluorescencia del canal medio de la muestra - ruido de fondo (sin suero)] (fluorescencia del canal medio del testigo positivo - ruido de fondo)
Los fragmentos Fab del clon 1379 tambien se sometieron a ensayo para determinar la capacidad de inhibir la ruta alternativa utilizando el ensayo de zimosano. Los fragmentos Fab se generaron incubando el anticuerpo purificado con papaina-agarosa (ICN Biomedicals, Aurora, 0H) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos Fc y la IgG sin digerir se retiraron a continuaci6n, aplicando el anticuerpo digerido a una columna de proteina G. Los fragmentos Fab se recogieron en el flujo a traves, y los fragmentos Fc y la IgG sin digerir se eluyeron posteriormente con glicina-HCl 0,1 M, pH 2,8. Se utiliz6 1 Ig del Fab en la reacci6n de zimosano. Se encontr6 que el anticuerpo C3 anti-rat6n policlonal utilizado en este ensayo tenia reactividad cruzada con varias especies. Por tanto, este ensayo se utiliz6 para someter a ensayo la inhibici6n con el clon 1379 de la via alternativa en esas especies. El ajuste de la dosis del anticuerpo inhibidor se llev6 a cabo tal y como se ha descrito anteriormente.
En otro ensayo de la capacidad del clon 1379 para inhibir la via alternativa del complemento, los inventores sometieron a ensayo la capacidad de este anticuerpo para inhibir la lisis de eritrocitos de conejo no sensibilizados por suero humano. La sangre de conejo se mezcl6 1:1 con una soluci6n tamp6n compuesta por 20,5 g de dextrosa, 8,0 g de citrato de sodio (dihidratado), 4,0 g de NaCl, 0,55 g de acido citrico en un litro de agua destilada. Cinco ml de soluci6n de eritrocitos se mezcl6 a continuaci6n 1:9 con una soluci6n de 1,1% de NaCl, 0,0025% de Na-5,5-dietil barbiturato, pH 7,35, EGTA 8 mM, MgCl2 2 mM. La mezcla se incub6 a 37°C durante varios minutos y despues se centrifug6 a 1000 x g durante 10 minutos a 4°C. Los eritrocitos se lavaron tres veces mas antes de ser resuspendidos en 40 ml de la misma soluci6n. Cincuenta Il de la suspensi6n anterior se afadieron a suero humano (5 a 100 Il), se afadi6 soluci6n tamp6n para llevar el volumen final hasta 150 Il. Los eritrocitos en el tamp6n sin suero fueron utilizados como un testigo negativo, y los eritrocitos afadidos a 100 Il de agua destilada se utilizaron como testigos positivos (lisis completa). Las muestras se incubaron a 37°C durante 30 minutos con agitaci6n ocasional para mantener las celulas en suspensi6n. Las reacciones se detuvieron afadiendo 1,5 ml de PBS frio y las muestras se centrifugaron a 1000 x g durante cinco minutos. La densidad 6ptica de cada material sobrenadante se ley6 a 415 nm utilizando un espectrofot6metro (Biorad). Se observ6 que la lisis completa de los eritrocitos se provocaba con 10 Il de suero. La misma reacci6n se llev6 a cabo a continuaci6n, utilizando 10 Il de suero y concentraciones crecientes del clon 1379 (1 Ig a 12 Ig por reacci6n). El porcentaje de inhibici6n de la actividad de la via alternativa se determin6 utilizando la f6rmula:
100 x[1 - (D0muestra - D0de fondo) ]
(D0testigo positivo -D0de fondo)
Ffrrfcocineticf in vivo del clon 1379. A los ratones se les extrajo previamente la sangre y luego se les inyect6 por via intraperitoneal (IP) o intravenosa (IV) dosis de uno o dos mg del clon 1379 del anticuerpo. Estas dosis fueron elegidas porque se estim6 que serian equimolares con el factor B. El factor B esta presente en el suero a aproximadamente -200 Ig/ml (o -2,2 IM dado que el factor B es una proteina de 90 kD). Debido a que el anticuerpo 1379 tiene 150 kD y el volumen intravascular de un rat6n adulto es de aproximadamente 3 ml, una inyecci6n de un mg (6,7 IMol) deberia dar como resultado una concentraci6n circulante de -2,2 IM. Debido a que el anticuerpo es divalente, se anticip6 que esta inyecci6n equimolar seria mas que suficiente para provocar una inhibici6n completa de la via alternativa. A los ratones se les extrajo sangre 1, 2, 6, 24, 48 y 96 horas despues de la inyecci6n del inhibidor. Los sueros de estos momentos de extracci6n se utilizaron a continuaci6n en el ensayo de zimosano para evaluar la actividad de la via alternativa.
Resultados
Generaci6n de anticuerpos monoclonales inhibidores de la porci6n Ba del factor B. Los anticuerpos monoclonales para el factor B de rat6n se generaron tal y como se ha descrito en la secci6n de metodos. El suero procedente de ratones inmunizados se someti6 a ensayo para determinar la presencia de anticuerpos anti-factor B (datos no mostrados). Un clon, denominado 1379, fue elegido para una caracterizaci6n adicional debido al hecho observado de que el hibridoma crecia rapidamente, el anticuerpo es de la subclase IgG1 (no es activador del complemento), y se observ6 que su material sobrenadante era un potente inhibidor de la via alternativa del complemento. Despues de la purificaci6n del anticuerpo (datos no mostrados), el anticuerpo fue sometido a dos ensayos in vitro de la actividad de la via alternativa (Figs. 2A y 2B). Usando el ensayo de zimosano, se encontr6 que el inhibidor inhibia completamente la via alternativa cuando se afadian tres Ig a una reacci6n que contenia 10 Il de suero. El antifactor B y el factor B son aproximadamente equimolares a esta concentraci6n (suponiendo que el factor B esta presente a 200 Ig/ml y tiene un peso molecular de 90.000 kD, hay 0,022 nMol en 10 Il de suero y 3 Ig de anticuerpo con un peso molecular de 150.000 kD es igual a aproximadamente 0,02 nMol). En el ensayo de lisis de eritrocitos de conejo, la inhibici6n completa se logr6 con 6 Ig de anticuerpo por 10 Il de suero humano en la reacci6n. La inhibici6n de la via alternativa se someti6 a ensayo a continuaci6n utilizando fragmentos Fab preparados a partir del clon 1379. Cuando se utiliz6 un exceso molar de Fab procedente del clon 1379, se observ6 una inhibici6n completa de la actividad de la via alternativa con este ensayo.
La capacidad de 1379 para inhibir la actividad de la via alternativa en los sueros procedentes de multiples especies de mamiferos diferentes, se someti6 a ensayo despues con el ensayo de zimosano. El anticuerpo 1379 era capaz de inhibir completamente la activaci6n de la via alternativa en la mayoria de las especies sometidas a ensayo (Tabla 1). El anticuerpo inhibia completamente la actividad de la via alternativa en el suero procedente de ratones, ratas, seres humanos y varias especies de monos. Sin embargo, no se mostr6 ninguna actividad inhibidora frente al suero de perros o cobayas.
45 Tabla 1
Especies en las que la via alternativa se inhibe totalmente con el AcM 1379
? Rat6n ? Ser humano ? Rata ? Babuino ? Rhesus ? Cerdo ? Mono cangrejero ? Caballo
Especies en las que la via alternativa no se inhibe con el AcM 1379
? Perro ? Cobaya
Ffrrfcocineticf del fnticuerpo 1379. Los ratones fueron sometidos a ensayo para estudiar la inhibici6n de la via alternativa en diversos momentos despues de una unica inyecci6n del anticuerpo inhibidor. Un mg de anticuerpo produjo la inhibici6n completa en una hora, cuando se inyect6 IV y en dos horas cuando se inyect6 IP (Fig. 3). Los ratones que recibieron una inyecci6n IP de un mg conservaban la inhibici6n completa de la via alternativa a las 24 horas y los que recibieron una inyecci6n de dos mg conservaban la inhibici6n completa hasta 48 horas despues de la inyecci6n. Los inventores tambien han inyectado 2 mg del anticuerpo 1379 repetitivamente i.p. cada dos dias durante 14 dias y han mostrado que se mantuvo la inhibici6n completa de la via alternativa del complemento durante al menos 48 horas despues de la ultima inyecci6n (datos no mostrados). Estos datos sugieren fuertemente que este AcM de rat6n no es reconocido como quot;extrafoquot; y respalda su uso cr6nico in vivo. Finalmente, experimentos que utilizaban fragmentos F(ab) del anticuerpo, han mostrado que se consigue una inhibici6n de la via alternativa a niveles aproximadamente equimolares como con el anticuerpo 1379 intacto (datos no mostrados).
1379 se une f un epitopo en lf regi6n SCR3 de Bf. La capacidad del anticuerpo 1379 para unirse a un panel de mutantes del factor B se estudi6 como se ha descrito previamente (Hourcade, 1995, J. Biol. Cher.) con el fin de caracterizar el sitio de uni6n del AcM. Los experimentos han mostrado que la introducci6n de ciertas sustituciones de alanina en las SCRs 2 y 3 del factor B humano, pero no en SCR1, da como resultado la perdida de la uni6n del anticuerpo 1379 con el factor B. A partir de los 25 mutantes diferentes sometidos a ensayo, 1379 practicamente no se unia a los mutantes B17 y B23 y conservaba menos de 20% de su capacidad de uni6n con el mutante B18. Estas son todas mutaciones de SCR3. Mas especificamente, el mutante B17 sustituye 139-Tyr-140-Cys-141-Ser por His-Cys-Pro, las posiciones que son relevantes para el factor B maduro humano representado por SEQ ID N0: 2; el mutante B23 sustituye 182-Glu-183-Gly-184-Gly-185-Ser por Gly-Asn-Gly-Val, las posiciones tambien son relevantes para el factor B maduro humano representado por SEQ ID N0: 2. Por lo tanto, el anticuerpo 1379 se une al tercer dominio de SCR del factor B.
Conclusiones
Los presentes inventores han generado un nuevo anticuerpo monoclonal para el factor B de rat6n identificado como el clon 1379. Este anticuerpo es un inhibidor especifico de la via alternativa del complemento y conduce a una inhibici6n completa de esta via in vitro e in vivo. Una sola inyecci6n i.p. de 1 mg condujo a una inhibici6n completa de la via alternativa durante un maximo de 48 horas, y multiples inyecciones dieron como resultado una inhibici6n prolongada de esta via.
Empleando ensayos in vitro, se demostr6 que 1379 inhibe totalmente la actividad de la via alternativa en el suero procedente de multiples especies, incluyendo ratones, ratas, monos y seres humanos. Empleando ensayos de afinidad de la uni6n del anticuerpo con un panel de mutantes del factor B, se determin6 que el sitio antigenico estaba en el dominio de SCR3 del factor B, parte de la regi6n eliminada en los ratones fB-/-. Esta regi6n de la proteina del factor B es adyacente al sitio de escisi6n del factor D. La capacidad del fragmento Fab de 1379 para inhibir la actividad de la via alternativa sugiere que no es unicamente un impedimento esterico de 1379 lo que impide la escisi6n, si no que el sitio de uni6n especifica es un lugar decisivo en la escisi6n de la proteina mediada por el factor
D. La eficacia de 1379 contra el suero procedente de tantas especies diferentes, sugiere que este sitio esta muy conservado entre los mamiferos superiores.
Varios otros inhibidores solubles del complemento ya se han desarrollado y caracterizado (Quigg; Weisman; Heller; Granger; Pratt), pero el inhibidor descrito en este documento se cree que es el primero que inhibe selectivamente la via alternativa en una amplia gama de especies animales. Al inhibir selectivamente la via alternativa, 1379 puede tener varias ventajas en comparaci6n con los inhibidores que funcionan a nivel de la convertasa C3. Al dejar intacta la via clasica, este inhibidor puede tener menos efectos inmunosupresores. Por otra parte, el bloqueo de la via clasica puede inducir realmente una autoinmunidad. El bloqueo selectivo de la via alternativa ha mejorado un modelo de rat6n de nefritis lupica (Watanabe), mientras que la carencia de C3 no lo hizo. La via alternativa se ha implicado especificamente en una variedad de modelos de enfermedad (Thurman; Watanabe; Girardi), destacando el potencial terapeutico de un inhibidor especifico de la via alternativa.
Referencias
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Ejemplo 2
El siguiente ejemplo muestra que la activaci6n del complemento a traves de la via alternativa es decisiva para el desarrollo de la hiperreactividad y la inflamaci6n de las vias respiratorias, y muestra ademas que la inhibici6n de la via alternativa de activaci6n del complemento inhibe la hiperreactividad de las vias respiratorias.
Dada la eficacia de la inhibici6n de la activaci6n del complemento antes de la exposici6n al alergeno, los presentes inventores determinaron ademas la via de activaci6n del complemento. En el presente estudio los inventores informan de que la activaci6n de la cascada del complemento a traves de la via alternativa es decisiva para el desarrollo de hiperreactividad de las vias respiratorias e inflamaci6n de las vias respiratorias.
Metodos
Anirfles
Ratones hembra C57BL/6, de 8 a 12 semanas de edad, se obtuvieron de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME). Tal y como se ha descrito anteriormente, ratones que carecian de forma heterocigota el factor B (fB +/-) se entrecruzaron en F1 despues de un cruce inicial con la cepa C57BL/6 y luego se entrecruzaron para generar una cepa fB -/-. Estos ratones luego se retrocruzaron durante 7 generaciones con ratones C57BL/6. Como ratones testigos se utilizaron ratones de la misma camada fB +/+. Ratones carentes de C4 ((C4 -/-) retrocruzados durante 17 generaciones con ratones C57BL/6) se mantuvieron en las instalaciones de los animales. Todos los animales experimentales utilizados en este estudio se mantuvieron con dietas exentas de ovoalbumina (0VA) y estaban bajo un protocolo aprobado por el Comite Institucional para el Cuidado y Uso de Animales del National Jewish Medical and Research Center.
Protocolo experirentfl
Se sensibilizaron ratones mediante inyecci6n intraperitoneal (i.p.) de 20 Ig de 0VA (calidad V; Sigma Chemical Co.; St. Louis, M0) o de ambrosia (Arbrosif frterisiifolif, Laboratorios Greer, Lenoir, NC) suspendida en 2,25 mg de hidr6xido de aluminio (Alum Imuject; Pierce, Rockford, IL) los dias 1 y 14 y despues se estimularon las vias respiratorias, usando 0VA o ambrosia nebulizadas (1% en PBS), con un nebulizador ultras6nico (DeVilbiss Health Care, Somerset, PA) durante diariamente 20 minutos, los dias 27, 28 y 29.
Para la reconstituci6n de fB se administraron 10 Ig, 1 Ig o 0,1 Ig de fB purificado (50 Il en PBS) mediante aplicaci6n intranasal 1 hora antes de cada estimulo de las vias respiratorias a ratones no sensibilizados y ratones sensibilizados fB -/-. Como testigo se administr6 PBS.
En un estudio diferente 2 horas antes de cada estimulo con 0VA, se administr6 un anticuerpo contra fB (anti-FB) a ratones sensibilizados, ya sea por inyecci6n i.p. (2mg/tratamiento/rat6n) o por nebulizaci6n. Para la nebulizaci6n, 4 ratones fueron colocados en una caja de plexiglas, y 0,5 mg de anticuerpos anti-fB (en 5 ml de PBS) fueron nebulizados empleando un nebulizador ultras6nico (DeVilbiss Health Care). Como testigo, IgG de rata con la misma dosis y volumen se inyect6 i.p. o se nebuliz6 en los mismos momentos especificos. El dia 31, la AHR se evalu6 y los animales fueron sacrificados el mismo dia para la recogida de fluido del BAL, sangre y tejido pulmonar.
Purificfci6n del ffctor B
Para reconstituir la actividad de la via alternativa en ratones B-/-, el factor B del complemento de rat6n se purific6 a partir de suero de rat6n normal mediante purificaci6n por afinidad. La columna de afinidad se cre6 uniendo factor B de cabra anti-humano y properdina (Diasorin, Stillwater, MN) a sefarosa activada con CNBr (Amersham, Arlington Heights, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se extrajo sangre de ratones C57/B6J mediante punci6n cardiaca, y la sangre se recogi6 en jeringas que contenian 50 Il de EDTA 500 mM con el fin de evitar la activaci6n de la via alternativa. La sangre se centrifug6 a 2000 rpm durante 15 minutos y se recogi6 el plasma. El plasma se diluy6 a continuaci6n 1:1 con tamp6n (EACA 50 mM, EDTA 10 mM, benzamidina 2 mM en PBS, pH 7,4) y se pas6 a traves de un filtro de 0,22 Im (GE Water Technologies). El plasma se afadi6 a la columna de afinidad y la columna se lav6 con 10 volumenes de columna, de tamp6n. El factor B se eluy6 usando LiCl2 5 M y se dializ6 durante una noche frente a PBS. La pureza del factor B se verific6 a continuaci6n mediante electroforesis en un gel de Trisglicina al 10% y se tif6 con azul de Coomassie. La concentraci6n de LPS se determin6 mediante el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD) y se encontr6 que era inferior a 1 UE/mg de factor B purificado.
?enerfci6n de fnticuerpos fnti-ffctor B
Anticuerpos monoclonales anti-factor B de rat6n se produjeron tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1. Brevemente, ratones carentes de factor B fueron inmunizados con una proteina de fusi6n recombinante creada a partir del segundo y tercer dominios de la repetici6n corta de consenso (SCR) del gen del factor B y una inmunoglobulina. Los dominios de SCR se eligieron porque forman parte del segmento delecionado del gen del factor B en los ratones fB-/-. Los ratones fB-/- fueron inmunizados despues con esta proteina y, a continuaci6n se estimularon cuatro veces a intervalos de tres semanas. Un dia despues de la ultima inyecci6n, las celulas del bazo se fusionaron con celulas de mieloma en el Centro de Anticuerpos Monoclonales de la Universidad de Colorado. Los clones que secretaban anticuerpos monoclonales (AcM) anti-factor B fueron identificados y caracterizados. Uno de los hibridomas, A1379, se utiliz6 para estos experimentos. A1379 se purific6 a partir del material sobrenadante de cultivo de tejidos con una columna de Proteina G-Sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Suecia). LPS se elimin6 del AcM purificado usando polimixina (Sigma-Aldrich, St Louis, M0). El ensayo de material lisado de amebocitos de Limulus (Bio Whittaker, Inc., Walkersville, MD) se us6 de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes para verificar que el AcM tenia niveles de LPS inferiores a 1 UE/mg de AcM. La pureza del AcM se verific6 a continuaci6n mediante electroforesis en un gel de Tris-glicina al 10% y se tif6 con azul de Coomassie.
?eterrinfci6n de lf funci6n de lfs vifs respirftorifs
La capacidad de respuesta de las vias respiratorias se evalu6 como un cambio en la funci6n de las vias respiratorias despues estimular con metacolina en aerosol (MCh) administrada durante 10 segundos (60 respiraciones/min, 500 Il de volumen de ventilaci6n pulmonar) en concentraciones crecientes (6,25, 12,5, 25, 50 y 100 mg/ml). Ratones anestesiados (pentobarbital s6dico, i.p., 70 a 90 mg/kg), con traqueotomia (canula 18G) fueron sometidos a ventilaci6n mecanica (160 respiraciones por minuto, volumen de ventilaci6n pulmonar de 150 Il, presi6n espiratoria final positiva de 2-4 cm H20) y se determin6 la funci6n pulmonar (Takeda, 1997). La resistencia de las vias aereas (RL) se calcul6 continuamente (Labview, National Instruments, Tx) adaptando el flujo, el volumen y la presi6n a una ecuaci6n de movimiento. Se tomaron los valores maximos de RL y se expresaron como un porcentaje de cambio respecto al valor de referencia despues del aerosol en PBS. No habia diferencias significativas en los valores de referencia de RL entre los ratones carentes o testigos respectivos.
Lfvfdo broncoflveolfr y redici6n de lfs citocinfs
Despues de determinar la funci6n de las vias respiratorias, los pulmones se lavaron a traves del tubo de la traquea con soluci6n salina equilibrada con Hank (1x1 ml, 37°C). El numero de celulas del BAL se obtuvieron utilizando un contador de celulas (Coulter Counter, Coulter Co., Hialeah, FL). Los recuentos diferenciales de celulas se hicieron a partir de preparaciones citocentrifugadas y se calcul6 el porcentaje y el numero absoluto de cada tipo de celula. Los niveles de citocinas se determinaron mediante ELISA en el fluido del BAL (Tompkinson). Los ELISAs de IFN-y, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 (todos PharMingen, San Diego, CA) e IL-13 (R?D Systems, Minneapolis, MN) se realizaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Los niveles de C3a desArg en el fluido del BAL se midieron por ELISA en ratones no sensibilizados y sensibilizados, 24 horas despues de la primera o segunda exposici6n al alergeno, y 24 y 48 horas despues de la tercera y la ultima exposici6n siguiendo las instrucciones de los fabricantes (Cedarlane Laboratories, Hornby, 0ntario, Canada).
Estudios histol6gicos e inrunohistoquiricos
Despues de obtener el liquido del BAL, los pulmones se inflaron a traves de la traquea con 2 ml de formalina al 10% y despues se fijaron en la misma soluci6n por inmersi6n. Las secciones de tejido se tiferon con hematoxilina y eosina, acido peri6dico de Schiff (PAS) e inmunohistoquimicamente las celulas que contenian la proteina eosin6fila basica principal (MBP), usando un anticuerpo de MBP de conejo anti-rat6n (proporcionado por J.J. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, A?). Los portaobjetos fueron examinados de forma ciega y una variedad de eosin6filos en el tejido peribronquial y las celulas caliciformes se analizaron por separado usando el programa informatico NIH Scion Image (versi6n 1.62, desarrollado en el Instituto Nacional de Salud de los EE.UU. y disponible en Internet).
Medici6n de IgE totfl y de fnticuerpos especificos de OVA
Los niveles sericos de IgE total y de IgE e IgG1 especifica de 0VA se midieron mediante ELISA tal y como se ha descrito previamente (Tompkinson). Los titulos de anticuerpos especificos de 0VA de las muestras se relacionaron con patrones internos combinados, a los que se asign6 arbitrariamente que tenian 500 unidades de ELISA (UE). El nivel total de IgE se calcul6 por comparaci6n con un patr6n conocido de IgE de rat6n convencional (55 3481, PharMingen).
Analisis estfdistico
El analisis de la varianza (AN0VA) se utiliz6 para determinar el nivel de diferencia entre todos los grupos. Las comparaciones de todas las parejas se llevaron a cabo por la diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey-Kramer. Los valores de la probabilidad (p) para significaci6n se fijaron en 0,05. Los valores de todas las mediciones se expresan como el error medio ? estandar de la media (SEM).
Resultados
Lf fctivfci6n del corplerento f trfves de lf vif flternftivf es decisivf pfrf el desfrrollo de AHR despues de lf exposici6n de rftones sensibilizfdos fl flergeno
Para determinar el papel de la via alternativa en el desarrollo de AHR y la inflamaci6n de las vias respiratorias, ratones fB -/- sensibilizados con 0VA y no sensibilizados y ratones testigo correspondientes (fB +/+) se estimularon con un aerosol de 0VA al 1% durante 3 dias consecutivos. Los ratones fB +/+ sensibilizados y estimulados mostraron una mayor capacidad de respuesta frente a MCh, en comparaci6n con ratones fB +/+ unicamente estimulados (Fig. 4). Por el contrario, los ratones fB -/- sensibilizados y estimulados mostraron una respuesta significativamente menor (p lt;0,01) frente a MCh a lo largo de la curva de dosis-respuesta, en comparaci6n con los ratones fB +/+ sensibilizados y estimulados, y por lo tanto mostraron una marcada incapacidad para desarrollar AHR despues de la sensibilizaci6n y la estimulaci6n.
Lf fctivfci6n del corplerento f trfves de lf vif flternftivf es decisivf pfrf el desfrrollo de inflfrfci6n de lfs vifs respirftorifs despues de lf exposici6n fl flergeno de rftones sensibilizfdos
La inflamaci6n de las vias respiratorias es un rasgo caracteristico de una enfermedad alergica de las vias respiratorias. Para evaluar la inflamaci6n de las vias respiratorias, se obtuvo liquido del BAL y de tejido pulmonar 48 horas despues de la ultima estimulaci6n de las vias respiratorias. Ratones fB +/+ sensibilizados y estimulados mostraron un aumento en el recuento total de celulas y especialmente en el numero de eosin6filos en el fluido del BAL, en comparaci6n con ratones unicamente estimulados que no tenian eosin6filos en el fluido del BAL (Fig. 5). Ratones fB -/- sensibilizados y estimulados mostraron un recuento total de celulas significativamente menor, asi como un numero menor de eosin6filos (p lt;0,01) en el fluido del BAL, en comparaci6n con ratones fB +/+ sensibilizados y estimulados, pero aun significativamente mayor (p lt;0,01) en comparaci6n con los testigos unicamente estimulados. Del mismo modo, ratones fB -/- mostraron tambien un numero menor de eosin6filos en el fluido del BAL despues de la sensibilizaci6n y la estimulaci6n con ambrosia, en comparaci6n con testigos sensibilizados y estimulados con ambrosia (Fig. 5).
La sensibilizaci6n al alergeno y la estimulaci6n de las vias respiratorias conducen a un incremento de la inflamaci6n peribronquial y en especial de la infiltraci6n de eosin6filos, en comparaci6n con unicamente la estimulaci6n (Fig. 3). Sin embargo, ratones fB -/- sensibilizados y estimulados mostraban una inflamaci6n peribronquial marcadamente reducida (Tabla 2) en comparaci6n con ratones testigos sensibilizados y estimulados. Para cuantificar la infiltraci6n de eosin6filos en el pulm6n, se tiferon secciones de tejidos con anti-proteina basica principal (datos no mostrados). En los ratones unicamente estimulados se detectaron solo algunos eosin6filos en el tejido peribronquial. La sensibilizaci6n y la estimulaci6n posterior con alergeno de ratones fB +/+, dio lugar a un aumento significativo en el numero de eosin6filos peribronquiales (Tabla 2). Por el contrario, ratones fB -/- sensibilizados y estimulados mostraron una infiltraci6n peribronquial con eosin6filos significativamente menor (Tabla 2).
0tra caracteristica distintiva de la enfermedad alergica de las vias respiratorias es la hiperplasia de celulas caliciformes de las celulas epiteliales de las vias respiratorias. Los pulmones se tiferon con acido peri6dico de Schiff para identificar las celulas mucosas en el epitelio de las vias respiratorias. En ratones sensibilizados y estimulados se encontr6 una gran cantidad de celulas mucosas tefidas positivas (Tabla 2) en contraste con los ratones unicamente estimulados, en los que no habia celulas PAS positivas detectables (Tabla 2). Los ratones fB -/sensibilizados y estimulados mostraban significativamente (p lt;0,001) menos celulas mucosas en el epitelio de las vias respiratorias, que en comparaci6n con ratones de tipo silvestre sensibilizados y estimulados.
Lf fctivfci6n del corplerento f trfves de lf vif flternftivf ffectf f lf producci6n citocinfs en el fluido del BAL
La producci6n de citocinas Th2 en los linfocitos T tiene una funci6n clave en la inducci6n de la inflamaci6n alergica de las vias respiratorias y AHR. Para evaluar la respuesta de las citocinas despues de la exposici6n al alergeno, se determinaron las concentraciones de IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13 e IFN-y en el fluido del BAL, 48 h despues de la ultima exposici6n a ovoalbumina. La sensibilizaci6n y la estimulaci6n de ratones de tipo silvestre dio como resultado un aumento significativo (p lt;0,05) en IL-4, IL-5 e IL-13 y una disminuci6n significativa (p lt;0,05) en IL-10, IL-12 e IFN-y, en comparaci6n con los testigos unicamente estimulados (datos no mostrados). Los niveles de citocinas TH2 (IL-4, IL-5 e IL-13) en el fluido del BAL se redujeron en los ratones fB -/- (datos no mostrados).
Lf cfrencif de fB no ffectf f los niveles sericos de fnticuerpos especificos de fntigeno
Los niveles sericos de IgE total e IgE e IgG1 especificas de 0VA se midieron 48 horas despues del ultimo estimulo de las vias respiratorias. Ratones fB +/+ sensibilizados y estimulados mostraron un aumento de los niveles de IgE total y de IgE e IgG1 especificas de 0VA, en comparaci6n con ratones testigos unicamente estimulados (Tabla 3). Del mismo modo, los ratones fB -/- mostraron un aumento de los niveles de IgE total y de IgE e IgG1 especificas de 0VA, que no eran estadisticamente diferentes de los ratones fB +/+ sensibilizados y estimulados, lo que indica que la respuesta humoral a la sensibilizaci6n y exposici6n a alergenos permanece intacta en estos ratones.
Tabla 2. Cuantificaci6n de la hiperplasia de las celulas caliciformes e inflamaci6n eosinofilica peribronquial
f? +/+solo estimulado
f? +/+sensibilizado y estimulado f? -/sensibilizado y estimulado C4 +/+sensibilizado y estimulado C4 -/-sensibilizado y estimulado Ac testigosensibilizado y estimulado anti-f? i.p. sensibilizado y estimulado anti-f? neb sensibilizado y estimulado
celulas PAS-positivas (celulas/mm de MB) celulas aMBP-positivas(celulas/mm de MB)
N.D.1,3 ? 0,9 132 ? 35 * 80 ? 16 * 36 ? 19 # 24 ? 14 # 156 ? 27 * 95 ? 20 * 149 ? 15 * 87 ? 21 * 153 ? 33 * 95 ? 28 * 26 ? 10 # 20 ? 9 # 43 ? 12 # 33 ? 16 #
Los ratones fueron sensibilizados y estimulados tal y como se describe en los Metodos. El numero de celulas caliciformes (celulas PAS positivas) y de eosin6filosperibronquiales (celulas positivas anti-proteina basica principal (MBP)) se determin6 48 h despues de la ultima estimulaci6n. Los valores medios ? SEM se muestran; f? -/-: ratones carentes de factor B; fB +/+: ratones testigos de tipo silvestre congenitos; C4 -/-: ratones carentes del factor 4 del complemento; C4 +/+: ratones testigos de tiposilvestre congenitos; Ac testigo: ratones C57BL/6 sensibilizados y estimulados tratados con el Ac testigo i.p.; anti-fB i.p.: ratones C57BL/6 sensibilizados y estimuladostratados con anticuerpo anti-fB i.p.; anti-fB neb: ratones C57BL/6 sensibilizados y estimulados tratados con anticuerpo anti-fB por inhalaci6n; MB (membrana basal).*plt;0,05 en comparaci6n con fB +/+ unicamente estimulado, fB -/-estimulado; anti-fB i.p. sensibilizado y estimulado y anti-fB neb sensibilizado y estimulado. #p lt;0,05 encomparaci6n con fB +/+ unicamente estimulado.
Tabla 3. Niveles de inmunoglobulinas sericas
f? +/+solo estimulado
f? +/+sensibilizado y estimulado f? -/solo estimulado f? -/sensibilizfdo y estirulfdo C?7BL/?sensibilizado y estimulado Ac testigosensibilizado y estimulado anti-f? i.p. sensibilizado y estimulado anti-f? neb sensibilizado y estimulado
IgE total(ng/ml) IgE especifica de 0VA(UE/ml) IgG1 especifica de 0VA(UE/ml)
47,3 ? 11,2 lt;10 lt;10 219,8 ? 48,4 * 145,1 ? 36,7 * 189,1 ? 20,5 * 38,5 ? 12,5 lt;10 lt;10 198,3 ? 31,2 * 166,2 ? 42,1 * 155,9 ? 38,8 * 241,1 ? 37,6 * 153,8 ? 47,4 * 171,8 ? 71,1 * 238,5 ? 41,1 * 128,1 ? 30,8 * 146,5 ? 61,2 * 189,6? 33,2 * 99,1 ? 27,4 * 106,5 ? 28,9 * 229,5 ? 44 * 122,5 ? 39,5 * 120,1 ? 30,8 *
Los ratones fueron sensibilizados y estimulados tal y como se describe en los Metodos. Los niveles sericos de inmunoglobulinas se determinaron 48 h despues de la ultimaestimulaci6n. Los valores medios ? EEM se muestran; f? -/-: ratones carentes de factor B; fB +/+: ratones testigos de tipo silvestre congenitos; Ac testigo: ratones C57BL/6sensibilizados y estimulados tratados con el Ac testigo i.p.; anti-fB i.p.: ratones C57BL/6 sensibilizados y estimulados tratados con anticuerpo anti-fB i.p.; anti-fB neb: ratones C57BL/6 sensibilizados y estimulados tratados con anticuerpo anti-fB por inhalaci6n; UE/ml (unidades/ml de ELISA). *plt;0,05 en comparaci6n con fB +/+ unicamente estimulado y fB -/- estimulado.
Lf fctivfci6n de lf vif clasicf en este rodelo no es esencifl pfrf el desfrrollo de lf enferredfd flergicf de lfs vifs respirftorifs
Para definir adicionalmente la via del complemento decisiva para el desarrollo de respuestas alergicas en los pulmones de ratones sensibilizados y estimulados, los inventores usaron ratones carentes del componente 4 del complemento (C4 -/-), que es esencial para la activaci6n de las vias clasica y de lectinas, en comparaci6n con ratones fB -/-.
Para evaluar la activaci6n de la via del complemento, se determinaron los niveles de C3a desArg en el fluido del BAL. Los ratones unicamente estimulados mostraron bajos niveles de C3a desArg (datos no mostrados). Por el contrario, los ratones sensibilizados mostraron un aumento de los niveles de C3a desArg en el fluido del BAL despues de la primera, segunda y tercera estimulaci6n, presentando los valores mas altos 48 horas despues de la ultima estimulaci6n (datos no mostrados). Curiosamente, los ratones C4 -/- sensibilizados y estimulados mostraron niveles similares de C3a en comparaci6n con los ratones de tipo silvestre sensibilizados y estimulados, en contraste con ratones fB -/-sensibilizados y estimulados, que mostraron una disminuci6n de los niveles de C3a desArg en comparaci6n con sus respectivos ratones de tipo silvestre sensibilizados y estimulados (datos no mostrados). Estos datos sugieren que tras la exposici6n al alergeno de ratones sensibilizados, la activaci6n del complemento se produce a traves de la via alternativa.
Los ratones C4 -/- desarrollaban niveles similares de AHR que los ratones C4 +/+ sensibilizados y estimulados (Fig. 9). Del mismo modo, ratones C4 -/- no mostraron ninguna disminuci6n en los recuentos totales de celulas (media ? SEM, n = 10; 163 ? 35 x103 celulas), o del numero de linfocitos (28 ? 9 x103 celulas) y eosin6filos (98 ? 23 x103 celulas) en el fluido del lavado broncoalveolar (BAL), en comparaci6n con los ratones testigos sensibilizados y estimulados (n = 10; 175 ? 53; 35 ? 12; 115 ? 32 x103 celulas, respectivamente) (datos no mostrados). Ratones C4 /- sensibilizados y estimulados adicionalmente mostraron aumentos similares en el numero de eosin6filos peribronquiales y en el numero de celulas caliciformes, en comparaci6n con los respectivos ratones de tipo silvestre sensibilizados y estimulados (Tabla 2). Estos hallazgos sugieren que la activaci6n de la via clasica en este modelo no es esencial para el desarrollo de la enfermedad alergica de las vias respiratorias.
Lf ffltf de desfrrollo de AHR y de inflfrfci6n de lfs vifs respirftorifs en rftones cfrentes de fB no es especificf de OVA
Para evaluar si la falta de hiperreactividad de las vias respiratorias despues de la sensibilizaci6n y el estimulo con alergenos se debia a una falta de respuesta especifica a la 0VA, ratones fB -/- y de tipo silvestre fueron sensibilizados y estimulados con ambrosia. Los ratones fB -/- sensibilizados y estimulados con ambrosia mostraron una disminuci6n en la capacidad de respuesta a MCh, mientras que los fB +/+ desarrollaron una fuerte respuesta a MCh (Figs. 6A y 6B). Del mismo modo, la inflamaci6n de las vias respiratorias en el fluido del BAL se redujo en ratones fB -/- sensibilizados y estimulados con ambrosia en comparaci6n con los fB +/+ (Fig. 6C).
Lf fdrinistrfci6n del ffctor B reconstituye lf cfpfcidfd de desfrrollfr AHR e inflfrfci6n de lfs vifs respirftorifs en rftones fB -/-
Para reconstituir el factor B en el pulm6n, ratones fB -/- recibieron una sola aplicaci6n intranasal de 10 Ig, 1 Ig, 0,1 Ig de factor B purificado (Fig. 7) o un PBS antes de cada estimulo de las vias respiratorias. Ratones fB -/sensibilizados y estimulados tratados con 0,1 Ig de factor B antes de cada estimulaci6n, mostraron una disminuci6n de la respuesta a MCh, similar a los ratones fB -/-sensibilizados y estimulados tratados con PBS, pero significativamente menor en comparaci6n con los ratones fB +/+ sensibilizados y estimulados (Fig. 7A). Los ratones sensibilizados y estimulados tratados con 1 Ig de factor B purificado mostraron un ligero incremento, pero no estadisticamente diferente, en la reactividad de las vias respiratorias, en comparaci6n con ratones fB -/sensibilizados y estimulados tratados con PBS o 0,1 Ig de factor B purificado (Fig. 7A). Por el contrario, ratones fB /- sensibilizados y estimulados tratados con 10 Ig de factor B purificado antes de cada estimulo de las vias respiratorias, mostraron un aumento de la respuesta a MCh, similar a la de los ratones fB +/+ sensibilizados y estimulados.
Tambien el tratamiento de ratones fB -/- sensibilizados y estimulados con 10 Ig de factor B purificado, antes de cada estimulaci6n de las vias aereas, aument6 la inflamaci6n de las vias respiratorias y especialmente el numero de eosin6filos en el fluido del BAL, similar al numero observado en ratones fB +/+ sensibilizados y estimulados, mientras que el tratamiento con 0,1 Ig o 1 Ig de factor B purificado no pudo aumentar el numero de eosin6filos en el fluido del BAL (Fig. 7B). Si el factor B se administraba antes de cada estimulo de las vias respiratorias pero a receptores no sensibilizados, no se observ6 AHR o respuestas inflamatorias de las vias respiratorias, lo que indica que la fase de sensibilizaci6n era necesaria para que las respuestas se desarrollaran despues del estimulo, y tambien muestra que la fase de sensibilizaci6n en los ratones fB -/- estaba intacta. Estos datos en los ratones fB -/- muestran directamente que el factor B de la via alternativa es decisivo para el desarrollo de una enfermedad alergica de las vias respiratorias.
El trftfriento con un fnticuerpo neutrflizfnte de fB inhibe el desfrrollo de AHR en rftones sensibilizfdos y estirulfdos
Para evaluar el papel de la activaci6n del complemento a traves de la via alternativa en ratones sensibilizados y estimulados que no carecian del gen, ratones C57BL/6 fueron sensibilizados tal y como se describe en los Metodos. El anticuerpo 1379 anti-factor B descrito en el Ejemplo 1 se administr6 por via sistemica o local mediante nebulizaci6n, lo que ha demostrado ser una via eficaz para la administraci6n de otros inhibidores del complemento. Ratones normales, tratados despues de la sensibilizaci6n, pero durante la fase de estimulaci6n con anti-factor B de modo sistemico o local (nebulizaci6n), mostraron una disminuci6n significativa de la AHR (Figs. 8A y 8B), asi como una inhibici6n de la inflamaci6n de las vias respiratorias y de la eosinofilia en las vias respiratorias (Fig. 8C). Ademas, la inflamaci6n del tejido, el numero de eosin6filos peribronquiales (Tabla 2), asi como el numero de celulas caliciformes (Tabla 2) se redujeron en estos ratones tratados con anti-fB. Ademas, los niveles de IL-4, IL-5 e IL-13 eran significativamente mas bajos en el fluido del BAL de ratones tratados con el anticuerpo de fB (datos no mostrados). Del mismo modo, el tratamiento de ratones C4 -/- sensibilizados y estimulados con anti-factor B disminuy6 la capacidad de respuesta de sus vias respiratorias y la inflamaci6n de las vias respiratorias (Fig. 10). Estos resultados estan de acuerdo con estudios que utilizan inhibidores del complemento que no discriminan entre las vias clasica y alternativa, pero que bloquean el desarrollo de una respuesta tardia de las vias respiratorias, asi como AHR.
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Ejemplo 3
El siguiente ejemplo describe datos adicionales de la uni6n para un panel de anticuerpos anti-factor B producidos
por los presentes inventores. Los ensayos se utilizaron para someter a ensayo la uni6n y/o la inhibici6n de la uni6n 25 del factor B de rat6n y del factor B humano, con diversos anticuerpos. Como se puede observar, el AcM 1379 se une
e inhibe tanto el factor B de rat6n como el humano. Por el contrario, el AcM denominado 624 se puede unir tanto al
factor B de rat6n como humano, pero no inhibe la via alternativa humana. Un ELISA de competencia se utiliz6 para
evaluar adicionalmente los anticuerpos. Como se puede observar, los anticuerpos 624, 691 y 1231 no bloquean la
uni6n con 1379. Por tanto, estos anticuerpos se tienen que unir a la proteina en un sitio diferente, explicando por que 30 se unen al factor B sin inhibir su funci6n in vitro. Sin embargo, los anticuerpos 395, 1322 y 1060 son inhibidores
competitivos de 1379.
Tabla 4
Clon
Isotipo Se une a fB de rat6n Se une a fB humano Inhibe la via alternativa de rat6n (ensayo de zimosano) Inhibe la via alternativa humana (ensayo de lisis eritrocitaria de conejo) Compite con 1379 en la uni6n a fB humano
1379
IgG1 K +++ +++ +++ +++ +++
395
IgG1 K +++ ++ ++ +++ +++
1322
IgG2b K +++ +++ + ++ +++
624
IgG1 K +++ +++ + - -
691
IgG1 K +++ +++ + - -
1060
IgG2b K +++ +++ + ++ ++
1231
IgG1 +++ +++ + - -
E1128
- +++ - 0 NA
Ejemplo 4
El siguiente ejemplo describe el cartografiado de epitopos de AcM 1379 en la superficie del factor B humano.
Los primeros experimentos para cartografiar el epitopo para el anticuerpo AcM 1379 indican que el epitopo o el sitio de uni6n del anticuerpo sobre el factor B no era lineal. El anticuerpo se une avidamente a la proteina de longitud completa cuando se adhiere a una placa de ELISA. Los peptidos que tenian 10 aminoacidos de longitud se construyeron para abarcar la regi6n de la proteina en donde se sabe que se produce la uni6n (SCR2-3). Cuando estos peptidos se adhirieron a una placa de ELISA, el anticuerpo no los reconoci6, lo que indica que ninguna de estas secuencias lineales era reconocida como el epitopo.
Se cre6 un modelo de la superficie de uni6n conservada prevista o del epitopo del factor B humano que es reconocido por el AcM 1379. En pocas palabras, la estructura terciaria del factor B humano se construy6 basandose en la estructura tridimensional determinada de CR2-SCR1-2 (identificaci6n del Protein Data Bank (PDB) 1GHQ). El modelo final fue refinado al estado de energia minima, con las limitaciones fijadas en los cuatro residuos Cys absolutamente conservados de cada SCR. La identidad de secuencia de SCR2-3 del factor B con SCR1-2 de CR2 es del 30% (la mas alta), con SCR 15-16 del factor H del 25%, con CD46 del 20%. La Fig. 11 muestra el modelo de la estructura del factor B indicando las posiciones de los aminoacidos correspondientes al epitopo de AcM 1379 (en relaci6n a SEQ ID N0: 2). Los residuos que se cree que forman el epitopo conformacional para el anticuerpo AcM 1379 son: Ala137, Tyr139, Ser141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190 y Ser192, aunque el epitopo puede contener solo unos pocos, sustancialmente todos o mas residuos de los que se representan en la Fig. 11.
Este modelo se puede utilizar ahora para predecir los efectos de los mutantes del factor B descritos previamente por Hourcade (Hourcade, 1995, J. Biol. Cher.) que se emplearon inicialmente para caracterizar el epitopo del anticuerpo AcM 1379 (vease el Ejemplo 1). A continuaci6n se muestran cuatro mutantes de este panel que contienen residuos pertenecientes al modelo de epitopo de AcM 1379, tal y como se muestra en la Fig. 11. Como se muestra a continuaci6n, los mutantes B17 y B23, que mostraron en el Ejemplo 1 reducir la uni6n de AcM 1379, tienen sustituciones particulares (indicadas en negrita y cursiva) que se han previsto que esten hacia adentro y, por lo tanto, que tal vez alteren la estructura del epitopo o de la superficie de uni6n conservada de AcM 1379. El mutante B16/17, a pesar de que contiene residuos que se encuentran dentro del epitopo modelado para AcM 1379, no se preve que tenga mutaciones que puedan alterar la estructura del epitopo, lo que puede explicar por que este mutante se une al anticuerpo en los experimentos iniciales de cartografiado. Del mismo modo, aunque el mutante B23/24 tambien contiene residuos que estan dentro del epitopo modelado para AcM 1379, este mutante tambien se une al anticuerpo en los experimentos iniciales de cartografiado, en donde los residuos que forman los sitios de contacto del anticuerpo no estan probablemente alterados por las mutaciones. Este experimento tambien ilustra que el anticuerpo de la invenci6n se puede unir a proteinas del factor B, o a porciones de las mismas, que tienen mutaciones conservadoras o mutaciones que no alteran sustancialmente este epitopo.
B17: Y139-C140-S141
Sus: H p
B23: E182-G183-G184-S185
Sus: G N V
B16/17: G136-A137-G138
Sus: N S S
B23/24: S187-G188-T189-E190-P191-S192
Sus: D E T A V
La Fig. 12 es un dibujo esquematico que muestra un complejo modelado de AcM 1379 (un fragmento Fab) que se une al factor B, en donde los lados que se unen al antigeno del Fab se han modelado para cubrir toda la regi6n del epitopo cartografiada, tal y como se defini6 anteriormente en la Fig. 11.
Ejemplo 5
El ejemplo siguiente muestra que la inhibici6n de la via alternativa del complemento y, especificamente, la inhibici6n del factor B, inhibe y protege a los animales de una lesi6n renal por isquemia-reperfusi6n.
Se han realizado experimentos para someter a ensayo la eficacia del AcM 1379 para mejorar la lesi6n en el modelo de insuficiencia renal aguda isquemica. En este modelo, la insuficiencia renal aguda isquemica es inducida anestesiando los ratones y sujetando con pinzas los pediculos renales durante 24 minutos. A los ratones se les inyect6 por via intraperitoneal 1 mg del AcM una hora antes de la inducci6n de la lesi6n. Este protocolo provoca una forma reversible de insuficiencia renal aguda isquemica, en donde la lesi6n maxima se presenta tipicamente 24 horas despues de que se retiran las pinzas de los pediculos renales y se restaurara el flujo sanguineo en el rif6n. La lesi6n renal se evalu6 a continuaci6n midiendo la acumulaci6n de desechos nitrogenados tales como SUN y creatinina serica y determinando la lesi6n morfol6gica de los rifones a traves de un pat6logo renal. Los inventores han mostrado que la via alternativa del complemento se activa poco despues de la reperfusi6n de los rifones y que esta activaci6n contribuye a la lesi6n renal resultante.
El examen de los rifones por inmunofluorescencia y analisis de transferencia Western confirm6 que el anticuerpo 1379 descrito en este documento, evitaba eficazmente la activaci6n del complemento despues de I/R. Tal y como se muestra en la Fig. 13, los ratones que se habian tratado previamente con 1379 mostraban aumentos leves en nitr6geno ureico serico (SUN) 24 horas despues de la reperfusi6n, en comparaci6n con testigos de tipo silvestre (78 ? 15 mg/dL frente a 119 ? 15 mg/dL, p lt;0,05, n = 11 para cada grupo). La lesi6n histol6gica tambien fue mas leve en los ratones que se habian tratado con 1379. Cuando fueron catalogados por un pat6logo de una manera ciega, los ratones tratados con 1379 mostraron una lesi6n tubular significativamente menor que los ratones testigos (3,3 ? 0,5 frente a 4,9 ? 0,1, p lt;0,01, n = 10 para cada grupo). Por lo tanto, 1379 impide eficazmente la activaci6n del complemento en el rif6n de rat6n despues de I/R, y el tratamiento previo con 1379 aminora la lesi6n funcional e histol6gica despues de I/R.
En otro experimento, celulas epiteliales tubulares renales en cultivo se sometieron a dos horas de anoxia quimica, incubandolas con antimicina. Las celulas se expusieron a continuaci6n a suero de rat6n de nuevo aporte (como fuente de complemento), y la deshidrogenasa de lactato (LDH) se midi6 como un marcador de la muerte celular, y se expres6 en unidades arbitrarias utilizando un ensayo comercial (Promega, Madison, WI). Las celulas que se habian expuesto a antimicina y a suero liberaban una cantidad significativamente mayor de LDH que las celulas expuestas unicamente a suero (100.140 ? 3307 para antimicina + suero frente a 69.255 ? 9754, p lt;0,05; datos no mostrados). Sin embargo, cuando el suero se incub6 con el AcM 1379 antes de la incubaci6n con las celulas, la liberaci6n de LDH se redujo a 76.471 ? 7720 (p lt;0,01 frente a las celulas tratadas con antimicina + suero; datos no mostrados). Por ello, el AcM 1379 protege a las celulas epiteliales tubulares renales hip6xicas que estan expuestas a componentes de la via alternativa ya sea in vivo o in vitro.
Si bien diversas realizaciones de la presente invenci6n se han descrito con detalle, es evidente que los expertos en la tecnica podran realizar modificaciones y adaptaciones de esas realizaciones. Se debe entender expresamente, sin embargo, que tales modificaciones y adaptaciones estan dentro del alcance de la presente invenci6n, tal y como se establece en las siguientes reivindicaciones.
LISTA DE SECUENCIAS
lt;110gt; Holers, Vernon Thurman, Joshua Taube, Christian Gelfand, Erwin Gilkeson, Gary lt;120gt;Inhibici6n del factor B, de la via alternativa del complemento y metodos relacionados.
lt;130gt; 2848-66-PCT
lt;150gt; 60/543,594
lt;151gt;
lt;150gt; 60/636,239
lt;151gt;
lt;150gt; US04/015040
lt;151gt;
lt;160gt; 6
lt;170gt; PatentIn versi6n 3.3
lt;210gt; 1
lt;211gt; 764
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 1
lt;210gt; 2
lt;211gt; 739
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 2
405 410
lt;210gt; 3
lt;211gt; 70
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 3
lt;210gt; 4
lt;211gt; 60
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens 15
lt;400gt; 4
lt;210gt; 5 20 lt;211gt; 48
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 5
5
lt;210gt; 6
lt;211gt; 761
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Mus musculus
10
lt;400gt; 6

Claims (34)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno que se une selectivamente al factor B dentro del tercer dominio de la repetici6n corta de consenso (SCR) y que se une selectivamente al factor B procedente de al menos ser humano y rat6n, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno evita la formaci6n de un complejo C3bBb.
  2. 2.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno se une al factor B y evita o inhibe la escisi6n del factor B por el factor D.
  3. 3.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se une al tercer dominio de la repetici6n corta de consenso (SCR) del factor B humano.
  4. 4.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno se une selectivamente a un epitopo en el tercer dominio de SCR del factor B seleccionado entre el grupo que consiste en:
    (a)
    un epitopo del factor B que incluye al menos una porci6n del factor B humano (SEQ ID N0: 2) que comprende desde la posici6n Tyr139 hasta la posici6n Ser185, o posiciones equivalentes a las mismas en una secuencia de factor B no humano;
    (b)
    un epitopo del factor B que incluye al menos una porci6n del factor B humano (SEQ ID N0: 2) que comprende desde la posici6n Tyr139 hasta la posici6n Ser141, o posiciones equivalentes a las mismas en una secuencia de factor B no humano;
    (c)
    un epitopo del factor B que incluye al menos una porci6n del factor B humano (SEQ ID N0: 2) que comprende desde la posici6n Glu182 hasta la posici6n Ser185, o posiciones equivalentes a las mismas en una secuencia de factor B no humano; y
    (d)
    un epitopo del factor B que incluye al menos una porci6n del factor B humano (SEQ ID N0: 2) que comprende una cualquiera o varias de las siguientes posiciones o de sus posiciones equivalentes en una secuencia de factor B no humano: Tyr139, Cys140, Ser141, Glu182, Gly184 o Ser185.
  5. 5.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo es de una subclase o de un isotipo que no activa el complemento.
  6. 6.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  7. 7.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el fragmento que se une a antigeno es un fragmento Fab.
  8. 8.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
  9. 9.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico.
  10. 10.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monovalente.
  11. 11.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 1379 producido por la ATCC n° de dep6sito PTA-6230.
  12. 12.
    El anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo que se une a antigeno se une al factor B en el mismo epitopo que el anticuerpo monoclonal 1379 producido por la ATCC n° de dep6sito PTA-6230.
  13. 13.
    Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno que se une selectivamente al factor B, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo que se une a antigeno evita la formaci6n de un complejo C3bBb; en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo que se une a antigeno inhibe competitivamente la uni6n especifica del anticuerpo monoclonal 1379 producido por el dep6sito de la ATCC n° PTA-6230 con el factor B humano y de rat6n; y en el que, cuando el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno se une al factor B humano, se inhibe la capacidad del anticuerpo monoclonal 1379 para inhibir la via alternativa del complemento.
  14. 14.
    El anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 13, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo que se une a antigeno inhibe competitivamente la uni6n del anticuerpo
    monoclonal 1379 al factor B humano, en donde la especificidad de uni6n comparativa se determina por un ensayo de competencia anticuerpo-anticuerpo en presencia de factor B humano.
  15. 15.
    Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno que se une selectivamente al factor B humano, en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo que se une a antigeno evita la formaci6n de un complejo C3bBb; en donde el anticuerpo aislado o el fragmento del mismo que se une a antigeno inhibe competitivamente la uni6n especifica de un segundo anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno, al factor B humano; y en donde el segundo anticuerpo o el fragmento del mismo que se une a antigeno se une al tercer dominio de SCR del factor B humano, y se une selectivamente al factor B procedente de al menos ser humano y rat6n.
  16. 16.
    Una composici6n que comprende el anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antigeno, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
  17. 17.
    Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso en un metodo para reducir o prevenir la hiperreactividad de las vias respiratorias (AHR) o la inflamaci6n de las vias respiratorias en un animal que tiene hiperreactividad de las vias respiratorias asociada con inflamaci6n o inflamaci6n de las vias respiratorias o que tiene riesgo de desarrollarlas.
  18. 18.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 17, para el uso segun se ha reivindicado en la reivindicaci6n 17, en donde el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra al animal en una cantidad eficaz para reducir de forma medible la hiperreactividad de las vias respiratorias en el animal, en comparaci6n con antes de la administraci6n del anticuerpo o del fragmento que se une a antigeno.
  19. 19.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 17, para el uso segun se ha reivindicado en la reivindicaci6n 17, en donde el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra al animal en una cantidad eficaz para reducir de forma medible la hiperreactividad de las vias respiratorias en el animal, en comparaci6n con el nivel de hiperreactividad de las vias respiratorias en una poblaci6n de animales que tienen inflamaci6n en la que no se administr6 el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno.
  20. 20.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 17, para el uso segun se ha reivindicado en la reivindicaci6n 17, en donde la administraci6n del anticuerpo o del fragmento que se une a antigeno disminuye la capacidad de respuesta del animal frente a metacolina o histamina.
  21. 21.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 17, para el uso segun se ha reivindicado en la reivindicaci6n 17, en donde el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra con un vehiculo farmaceuticamente adecuado seleccionado entre el grupo que consiste en: un polvo seco, dispersable; etanol anhidro; capsulas pequefas; liposomas; una pulverizaci6n nebulizada; y un excipiente inyectable.
  22. 22.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 17, para el uso segun se ha reivindicado en la reivindicaci6n 17, en el que el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra en un vehiculo o un dispositivo seleccionado entre el grupo que consiste en: etanol anhidro; un sistema de inhalaci6n de polvo seco; un sistema de inhalaci6n por ultrasonidos; un inhalador de dosis medida a presi6n; y un dispositivo de soluci6n medida.
  23. 23.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 17, para el uso segun se ha reivindicado en la reivindicaci6n 17, en el que dicho anticuerpo o fragmento que se une a antigeno se administra a dicho mamifero en combinaci6n con un agente seleccionado entre el grupo que consiste en: corticosteroides, agonistas (de acci6n prolongada o corta), modificadores de leucotrienos, antihistaminicos, inhibidores de fosfodiesterasas, cromoglicato de sodio, Nedocromil, teofilina, antagonistas de citocinas, antagonistas del receptor de citocinas, anti-IgE e inhibidores de la funci6n de los linfocitos T.
  24. 24.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 17, para el uso segun se ha reivindicado en la reivindicaci6n 17, en el que dicha hiperreactividad de las vias respiratorias o inflamaci6n de las vias respiratorias esta asociada con una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en asma, enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica (EP0C), aspergilosis broncopulmonar alergica, neumonia por hipersensibilidad, neumonia eosinofilica, enfisema, bronquitis, bronquitis alergica, bronquiectasia, fibrosis quistica, tuberculosis, neumonitis por hipersensibilidad, asma ocupacional, sarcoidosis, sindrome de enfermedad de las vias respiratorias reactivas, enfermedad pulmonar intersticial, sindrome hipereosinofilico, rinitis, sinusitis, asma inducida por el ejercicio, asma inducida por la contaminaci6n, tos variante de asma, enfermedad pulmonar parasitaria, infecci6n por el virus sincitial respiratorio (VSR), infecci6n por el virus de la parainfluenza (VPI), infecci6n por rinovirus (RV) e infecci6n por adenovirus.
  25. 25.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 17, para el uso segun se ha reivindicado en la reivindicaci6n 17, en el que la hiperreactividad de las vias respiratorias esta asociada con la inflamaci6n alergica.
  26. 26.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 17, para el uso segun se ha
    reivindicado en la reivindicaci6n 17, en el que la hiperreactividad de las vias respiratorias o la inflamaci6n de las vias respiratorias esta asociada con asma.
  27. 27.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 17, para el uso segun se ha reivindicado en la reivindicaci6n 17, en el que la hiperreactividad de las vias respiratorias o la inflamaci6n de las vias respiratorias esta asociada con EP0C.
  28. 28.
    El anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antigeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso en un metodo para reducir o evitar la lesi6n por isquemia-reperfusi6n en un animal que tiene lesi6n por isquemia-reperfusi6n o que tiene el riesgo de desarrollarla.
  29. 29.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 28, para uso segun se reivindica en la reivindicaci6n 28, en donde la lesi6n por isquemia-reperfusi6n es una lesi6n renal por isquemiareperfusi6n.
  30. 30.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 28, para uso segun se reivindica en la reivindicaci6n 28, en donde el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra al animal en una cantidad eficaz para inhibir de forma medible incrementos en el nitr6geno serico ureico en el animal en comparaci6n con la ausencia de administraci6n del anticuerpo o del fragmento que se une a antigeno.
  31. 31.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun la reivindicaci6n 28, para uso segun se reivindica en la reivindicaci6n 28, en donde el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra al animal en una cantidad eficaz para disminuir de forma medible la lesi6n histol6gica de los tejidos del rif6n del animal en comparaci6n con la ausencia de administraci6n del anticuerpo o del fragmento que se une a antigeno.
  32. 32.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 17-31, para el uso segun se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 17-31, en donde el anticuerpo o el fragmento que se une a antigeno se administra a traves de una via seleccionada entre el grupo que consiste en las vias oral, nasal, t6pica, inhalada, intratraqueal, transdermica, rectal y parenteral.
  33. 33.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 17-32, para el uso segun se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 17-32, en donde el animal es un mamifero.
  34. 34.
    El anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 17-32, para el uso segun se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 17-32, en donde el animal es un ser humano.
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