KR20210109537A - 아시네토박터 바우마니의 검출을 위한 비-복제 형질 도입 입자 및 형질 도입 입자 기반의 리포터 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)에 특이적인 신규 박테리오파지, 상기 박테리오파지로부터 유래된 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)을 생성하기 위한 방법들, 및 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)의 검출을 위한 상기 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)의 사용에 관한 것이다.

Description

아시네토박터 바우마니의 검출을 위한 비-복제 형질 도입 입자 및 형질 도입 입자 기반의 리포터 시스템

본 발명은 표적 세포를 검출하기 위한 비-복제 형질 도입 리포터 분자의 패키징 및 전달을 위한 방법들 및 조성물들에 관한 것이다.

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 12월 27일에 출원한 미합중국 가출원 제62/785,510호 및 2019년 9월 13일에 출원한 미합중국 가출원 제62/899,985호의 우선권 이익을 주장하며, 그 각각의 내용은 전체가 본원에 원용된다.

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 2019년 11월 20일에 생성된 46 kb 크기의 "P35222-WO PCT 출원 서열 목록"이라는 명칭의 전자 문서 파일로 제출된 서열 목록을 포함한다.

형질 도입 입자는 비-바이러스성 핵산을 세포 내로 전달할 수 있는 바이러스를 지칭한다. 바이러스 기반 리포터 시스템은 세포의 존재를 감지하기 위해 사용되었으며, 세포로부터 리포터 분자가 발현될 수 있도록 바이러스의 용원기를 사용한다. 상기 바이러스 기반 리포터 시스템은 리포터 분자를 발현하고 표적 세포로 하여금 검출 가능한 신호를 방출하도록 하는 복제 가능한 형질 도입 입자를 사용한다.

하지만, 바이러스의 용균 주기는 바이러스 기반 리포터 분석을 저해하는 것으로 나타났다. Carri

re, C. et al., Conditionally replicating luciferase reporter phages: Improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, 1997. 35(12): p. 3232-3239. Carri

re et al.은 용균 주기가 30°C에서 억제되지만 37°C에서 활성화되는 결핵균(M. tuberculosis)/바실러스 칼메테-구에린(bacillus Calmette-Gu

rin, BCG) 발광 효소 리포터 파지를 개발하였다. 상기 시스템을 사용하여 Carri

re et al.은 억제된 용균 주기를 갖는 파지 리포터를 사용하여 BCG의 검출을 입증하였다.

하지만, 박테리오파지 기반 리포터 분석에서 박테리오파지의 복제 기능을 억제하지만 제거하지는 않는 것과 관련된 단점이 있다. 첫째, 박테리오파지의 복제 기능의 제어는 제한된 분석 조건을 야기한다. 예를 들어, Carri

re et al.이 사용한 리포터 파지 phAE40의 용균 주기는 30°C의 비-허용 온도에서 세포를 감염시키기 위해 파지가 사용되었을 때 억제되었다. 상기 온도 요건은 표적 박테리아의 최적 온도가 37°C라는 점에서 리포터 분석에 제한 조건을 부과하였다. 상기 제한 조건은 최적의 분석 성능을 방해한다.

또한, 바이러스의 복제 기능을 제어하기가 어렵다. 리포터 시스템으로서 형질 도입 입자를 사용하는 동안 바이러스의 복제를 억제해야 한다. 예를 들어, Carri

re et al.이 보고한 리포터 파지 phAE40의 용균 활성은 감소되었지만 제거되지 않았으며, 결과적으로 분석에서 발광 효소 신호의 감소를 초래하였다. Carri

re et al.은 리포터 신호의 하락을 초래하는 가능한 원인들, 예컨대 온전한 파지 발현 유전자 및 분석의 온도 제한을 강조하였으며, 이는 모두 파지 리포터의 용균 주기가 제거되지 않았기 때문이다.

파지의 자연 용원 주기에 의존하는 리포터 분석은 용균 활성을 산발적으로 나타낼 것으로 예상할 수 있다. 또한, 파지의 용원 주기에 의존하는 분석은 유사한 파지로 이미 용원화된 표적 세포뿐만 아니라 유입되는 바이러스 핵산을 표적으로 하는 자연 발생 숙주 제한 시스템으로부터 중복 감염 면역이 되기 쉬우므로, 상기 리포터 파지의 숙주 범위를 제한할 수 있다.

다른 예에서, 형질 도입 입자 생성 시스템은 외인성 핵산 분자를 패키징하도록 설계되지만, 형질 도입 입자는 종종 외인성 핵산 분자 및 고유 자손 바이러스 핵산 분자의 조합을 함유한다. 고유 바이러스는 분석 성능을 저해하는 용균 활성을 나타낼 수 있으며, 형질 도입 입자를 정제하려면 바이러스의 용균 활성을 제거해야 한다. 하지만, 상기 정제는 일반적으로 불가능하다. Reporter Plasmid Packaging System for Detection of Bacteria 라는 제목의 미국 특허 2009/0155768 A에서 Scholl et al.은 상기 형질 도입 입자 시스템의 개발을 설명한다. 상기 시스템의 생성물은 리포터 형질 도입 입자 및 고유 박테리오파지의 조합이다(참조 문헌의 도 8). 저자들은 형질 도입 입자 및 고유 박테리오파지가 초원심 분리에 의해 분리될 수 있다고 지적하지만, 상기 분리는 형질 도입 입자 및 고유 바이러스가 초원심 분리에 의해 분리가 가능한 상이한 밀도를 나타내는 시스템에서만 가능하다. 상기 특성은 참고 문헌에 설명된 박테리오파지 T7 기반 패키징 시스템에서 보여지지만, 일반적으로 다른 바이러스 시스템에 적용할 수 있는 특성은 아니다. 바이러스 패키징 기구는 고유 바이러스 및 형질 도입 입자가 초원심 분리로 분리할 수 없는 구별 불가한 밀도를 나타내는 헤드풀(headful) 패키징을 나타내는 것이 일반적이다. 바이러스 패키징 시스템은 또한 구별 불가한 밀도를 갖는 고유 바이러스 및 형질 도입 입자를 초래하는 적절한 바이러스 구조 조립을 위한 요건으로서 최소량의 패키징에 의존한다.

따라서, 바이러스의 용균 기능으로 인한 해로운 영향을 받지 않고, 또한 검출 한계를 높이고 거짓 음성 결과를 초래함으로써 리포터 분석 성능을 제한할 수 있는 바이러스 핵산 분자 및 바이러스 기능을 표적으로 하는 숙주 제한 메커니즘 및 중복 감염 면역에 의해 제한될 가능성의 영향을 받지 않는 비-복제 형질 도입 입자가 필요하다.

형질 도입 입자가 조작된 경우에도, 상기 형질 도입 입자를 사용하여 세포에서 표적 핵산 분자의 존재를 검출하고 보고하는 방법에는 한계가 있다. 일부 방법은 세포를 파괴하고 용해물에서 전사체를 분리하고 검출하기 위해 번거로운 기술을 필요로 한다. 검출 방법은 표지된 프로브, 예컨대 항체, 압타머 또는 핵산 프로브의 사용을 포함한다. 표적 유전자에 대한 표지된 프로브는 의도하지 않은 표적에 대한 비특이적 결합을 유발하거나 높은 신호 대 잡음비를 갖는 신호를 생성할 수 있다. 따라서, 세포에서 내인성 핵산 분자를 검출하고 보고하기 위한 구체적이고 효과적이며 정확한 방법이 필요하다.

보다 최근에는, 리포터 핵산 분자를 본원에서 스마티클(Smarticles)이라고도 지칭한 비-복제 형질 도입 입자(non-replicative transduction particle, NRTP) 내로 패키징하는 방법 및 시스템이 미국 특허 제9,388,453호(전체 내용이 본원에 참조로서 포함됨)에 설명되었으며, 여기서 복제 가능한 고유 자손 바이러스 핵산 분자의 생성은 박테리오파지 유전체에서 패키징 개시 부위의 파괴로 인해 크게 감소하였다.

아시네토박터 바우마니(A. Baumannii)는 병원 내 감염 및 전 세계 전염병의 주요 원인으로 점점 더 문제가 되고 있는 그람-음성 구간균이다. 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii)에 의한 감염은 패혈증, 인공 호흡기 관련 폐렴, 요로 감염 및 특정 위험에 있는 면역 손상 개체의 상처 감염(Beggs et al., 2006; Peleg et al. 2008)을 초래할 수 있다. 감염을 유발하는 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 균주는 종종 항생제에 광범위하게 내성이 있으며 공중 보건을 심각하게 위협한다. 이로 인해 세계 보건기구(WHO)는 최근 아시네토박터 바우마니를 새로운 표적화 항생제 개발 목록에서 위기 수준의 '우선 순위 1’ 병원균으로 선언하였다(WHO, 2017). 또한, 더욱이 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 감염의 경우 사망률이 특히 높으며, 인공 호흡기 관련 폐렴 및 혈류 감염 환자의 사망률은 35%로 높았다(Antunes et al., 2014). 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 감염에서 관찰된 높은 사망률에 대한 한 가지 위험 요인은 부적절한 항생제 치료에서 기인한다(Lemos EV et al., 2014).

아시네토박터 바우마니(A. Baumannii)의 신속한 진단은 적절한 항생제 치료를 확인하고 임상 환경에서 감염 확산을 제어하는데 중요하다. 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 감염을 검출하기 위해 현재 상업적으로 입수 가능한 방법은 표현형 방법(예컨대, VITEK 2, 비오메리으(Biomerieux) 및 DNA 기반 방법(예컨대, 16s rRNA의 PCR 증폭)(Li P, et al., 2015)을 포함한다. 하지만, 고유 파지의 사용을 필요로 하지 않고 생물학적 샘플에서 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii)의 존재를 신속하게 검출할 수 있는 분석법이 필요하며, 이는 숙주 박테리아를 감염시켜 용균 수명 주기를 완료하고 박테리아 숙주 방어 메커니즘을 다뤄야 한다.

본 발명은 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii)에 특이적이고 상기 종 내에서 넓은 숙주 범위를 갖는 신규 박테리오파지를 포함하는 조성물들에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 신규 박테리오파지는 미오비리대(Myoviridae) 과에 속하는 Abi 33이다. 다른 구현예에서, 상기 신규 박테리오파지는 시포비리대(Siphoviridae) 과에 속하는 Abi 49 또는 Abi 147이다. 본 발명은 또한 상기 신규 박테리오파지들의 유전체로부터 유래된 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii)에 대한 특이성을 나타내는 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)의 생성에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 박테리오파지 유전체를 포함하는 조성물로서, 상기 박테리오파지 유전체는 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리오파지로부터 유래되고, 상기 박테리오파지 유전체는 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 파괴를 함유하는, 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자는 terS 유전자, terL 유전자 또는 terS 및 terL 유전자 둘 모두를 포함한다. 일 구현예에서, 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자의 파괴는 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열의 결실을 포함한다.

본 발명은 또한 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 세포 내 도입을 위해 리포터 유전자를 포함하는 리포터 플라스미드를 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)인 스마트티클(Smarticles) 내로 패키징하는 박테리아 세포 패키징 시스템에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 패키징 시스템은 숙주 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 세포, 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 파괴를 갖는 박테리오파지 유전체를 포함하거나 구성된 상기 숙주 아시네토박터 바우마니(A. baumannii) 세포 내의 제1 핵산 구조물로서, 상기 파괴는 상기 박테리오파지 유전체의 비-복제 형질 도입 입자(NRTP) 내로의 패키징을 막고, 상기 박테리오파지 유전체는 박테리오파지 Abi 33의 유전체, 박테리오파지 Abi 49의 유전체, 및 박테리오파지 147의 유전체로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1 핵산 구조물, 및 상기 숙주 아시네토박터 바우마니(A. baumannii) 세포 내 또는 상기 제1 핵산 구조물로부터 분리된 제2 핵산 구조물을 포함하며, 상기 제2 핵산 구조물은 리포터 핵산 분자를 포함하고, 상기 리포터 핵산 분자는 리포터 유전자, 및 상기 박테리오파지 유전체의 파괴를 보완하고 상기 리포터 핵산 분자의 레플리콘의 상기 비-복제 형질 도입 입자(NRTP) 내로의 패키징을 촉진하는 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자는 terS 유전자, terL 유전자 또는 terS 및 terL 유전자 둘 모두를 포함한다. 일 구현예에서, 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자의 파괴는 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열의 결실을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 파괴는 결실, 삽입, 돌연변이 또는 치환을 통해 이루어진다. 다른 구현예에서, 상기 리포터 핵산 분자는 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 박테리아 세포 패키징 시스템의 용해기를 유도하는 단계 및 리포터 분자의 레플리콘이 상기 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)을 생성하도록 패키징되는 단계를 포함하는, 상술한 박테리아 세포 패키징 시스템으로부터 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)을 생성하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자는 terS 유전자, terL 유전자 또는 terS 및 terL 유전자 둘 모두를 포함한다. 일 구현예에서, 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자의 파괴는 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열의 결실을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 리포터 핵산 분자는 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 샘플 내 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)를 검출하는 방법으로서, 상술한 비-복제 형질 도입 입자(NRTP) 생성 방법에 의해 생성된 박테리오파지 Abi 33으로부터 유래된 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs), 박테리오파지 Abi 49로부터 유래된 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs), 박테리오파지 Abi 147로부터 유래된 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs), 또는 이들의 임의의 조합을 상기 샘플에 제공하는 단계, 검출 가능한 신호를 생성하기 위한 상기 리포터 유전자의 조건들을 제공하는 단계; 및 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)의 존재 또는 부재를 나타내기 위해 상기 검출 가능한 신호의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)을 상기 샘플에 제공하기 전 또는 후에 항미생물제를 상기 샘플에 제공하고, 상기 샘플이 상기 항미생물제에 내성이 있거나 민감한 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)를 함유하는지 여부를 나타내기 위해 상기 검출 가능한 신호의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)은 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열을 포함하는 리포터 핵산 분자를 포함한다.

도 1a는 2개의 미오비리대(Myoviridae) 파지군을 함유하는 Abi 33 용해물의 TEM 이미지를 도시한다.
도 1b는 시포비리대(Siphoviridae) 파지를 함유하는 Abi 49 용해물의 TEM 이미지를 도시한다.
도 1c는 시포비리대(Siphoviridae) 파지를 함유하는 Abi 147 용해물의 TEM 이미지를 도시한다.
도 2는 결실/상보성 전략을 사용하는 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)인 스마티클(Smarticles) 기술의 개략도를 도시한다. 각 후보 파지는 패키징 자리/패키징 기능이 결실시키도록 조작된 다음, 패키지 관련 DNA 서열 및 유전자를 운반하는 플라스미드로 다시 보완되었다. 상기 상보적 플라스미드는 또한 리포터 유전자로서 발광 효소를 운반한다. 스마티클 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)은 패키징/리포터 플라스미드를 포함하는 조작된 프로파지로부터 생성된다.
도 3은 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)의 생성을 위한 패키징/리포터 플라스미드의 대표적인 개략도이다.
도 4a는 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 교차-반응성 상대 발광 단위(Relative-Light Units, RLU) 분석에 대한 그람(-) 균주 배치를 도시한다. 균주의 약어는 하기와 같이 나타낸다. Kpn: 폐렴(K. pneumoniae), Eco: 대장균(E. coli), Kox: 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca), Eae: 엔테로박터 에어로게네스(E. aerogenes), Ecl: 엔테로박터 클로아케균(E. cloacae), Cfi: 시트로박터 프룬디(C. freundii), Cko: 시트로박터 코세리(C. koseri), Sms: 세라티아 마르세센스(S. marcescens), Pae: 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa), Pms: 파르툴라 미라빌리스(P. mirabilis), Abi: 아시네토박터 바우마니(A. baumannii).
도 4b는 도 4a의 장내 세균 및 다른 그람(-) 박테리아에 대한 교차 반응성에 대해 시험된 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 스마티클 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)의 RLU 기반 커버리지를 도시한다. RLU 양성 결과는 관찰되지 않았다. C1 및 G1의 피크는 주입 스파이크이며 실제 양의 신호가 아니다. 컬럼 12의 RLU 양성 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 균주는 분석에서 양성 대조군으로 사용되어 전형적인 Abi 49 역가를 나타낸다.
도 5는 Abi 패키징/리포터 플라스미드 pZX057의 대표적인 개략도이다.
도 6은 새로운 Abi 33 스마티클 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)을 생성하기 위해 Abi 33으로부터 유래된 9247 bp 플라스미드 pZX058의 대표적인 개략도이다.
도 7-I, 도 7-II, 도 7-III 및 도 7-IV는 플라스미드 pZX058(서열 번호 4)의 주석이 달린 뉴클레오티드 염기 서열을 도시한다.
도 8은 새로운 Abi 49 스마티클 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)을 생성하기 위해 Abi 49로부터 유래된 9464 bp 플라스미드 pZX065의 대표적인 개략도이다.
도 9-I, 도 9-II, 도 9-III 및 도 9-IV는 플라스미드 pZX065(서열 번호 5)의 주석이 달린 뉴클레오티드 염기 서열을 도시한다.
도 10은 새로운 Abi 147 스마티클 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)을 생성하기 위해 Abi 147로부터 유래된 9768 bp 플라스미드 pZX066의 대표적인 개략도이다.
도 11-I, 도 11-II, 도 11-III 및 도 11-IV는 플라스미드 pZX066(서열 번호 6)의 주석이 달린 뉴클레오티드 염기 서열을 도시한다.

I. 정의

청구 범위 및 명세서에 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 아래에 명시된 대로 정의한다.

본원에 사용된 "리포터 핵산 분자"는 DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 뉴클레오티드 염기 서열을 지칭한다. 상기 리포터 핵산 분자는 자연적으로 발생하거나 또는 인공 또는 합성 분자일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 리포터 핵산 분자는 숙주 세포에 대해 외인성이고 플라스미드 또는 벡터와 같은 외인성 핵산 분자의 일부로서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 리포터 핵산 분자는 세포에서 표적 유전자에 상보적일 수 있다. 다른 구현예들에서, 상기 리포터 핵산 분자는 리포터 분자(예컨대, 리포터 효소, 단백질)를 암호화하는 리포터 유전자를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 리포터 핵산 분자는 "리포터 구조물” 또는 "핵산 리포터 구조물"로 지칭된다.

"리포터 분자” 또는 "리포터"는 유기체에 검출 가능하거나 선택 가능한 표현형을 부여하는 분자(예컨대, 핵산 또는 단백질)를 지칭한다. 상기 검출 가능한 표현형은, 예를 들어 비색, 형광 또는 발광일 수 있다. 리포터 분자는 발광 반응을 매개하는 효소(LuxA, LuxB, LuxAB, Luc, Ruc, nLuc)를 암호화하는 리포터 유전자, 비색 반응을 매개하는 효소(LacZ, HRP)를 암호화하는 유전자, 형광 단백질(GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, 근적외선 형광 단백질)을 암호화하는 유전자, 친화성 펩타이드(His-tag, 3X-FLAG)를 암호화하는 핵산 분자, 및 선택 가능한 마커(예컨대, ampC, tet(M), zeoR, hph, CAT, erm)를 암호화하는 유전자로부터 발현될 수 있다. 상기 리포터 분자는 핵산 분자 또는 외인성 서열(플라스미드)을 세포 내로 성공적으로 흡수시키기 위한 마커로 사용할 수 있다. 상기 리포터 분자는 또한 본원에 기재된 바와 같이 표적 유전자, 표적 핵산 분자, 표적 세포 내 분자 또는 세포의 존재를 나타내기 위해 사용할 수 있다. 대안적으로, 상기 리포터 분자는 압타머 또는 리보자임과 같은 핵산일 수 있다.

본 발명의 일부 양태들에서, 상기 리포터 핵산 분자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명의 다른 양태들에서, 상기 프로모터는 다른 세포가 아닌 특정 세포(예컨대, 특정 종)에서 프로모터의 활성에 기초하여 리포터 시스템의 반응성 및 교차-반응성에 기여하도록 선택되거나 설계될 수 있다. 특정 양태들에서, 상기 리포터 핵산 분자는 복제 기점을 포함한다. 다른 양태들에서, 복제 기점의 선택은 다른 세포가 아닌 특정 세포(예컨대, 특정 종)의 복제 기점의 활성에 기초하여 표적 세포 내의 리포터 핵산 분자의 복제가 리포터 신호 생성에 기여하거나 이에 필요한 경우 리포터 시스템의 반응성 및 교차 반응성에 유사하게 기여할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 리포터 핵산 분자는 바이러스 복제 중에 자손 바이러스 내로 연쇄체 DNA로서 패키징될 수 있는 레플리콘을 형성한다.

본원에 사용된 "표적 전사체"는 DNA 서열의 뉴클레오티드 염기 서열의 일부 또는 표적 유전자의 전사 중에 형성된 것을 포함하여 표적 세포에 의해 자연적으로 형성된 mRNA 분자 및 1차 전사 생성물의 RNA 처리의 생성물인 mRNA를 지칭한다. 상기 표적 전사체는 세포 전사체 또는 자연 발생 전사체라고도 할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "전사체"는 DNA 또는 RNA 주형 서열 또는 유전자로부터 전사된 뉴클레오티드 염기 서열(DNA 또는 RNA)의 길이를 지칭한다. 상기 전사체는 RNA 주형으로부터 전사된 cDNA 서열 또는 DNA 주형으로부터 전사된 mRNA 서열일 수 있다. 상기 전사체는 단백질 부호화 또는 비-부호화일 수 있다. 상기 전사체는 또한 조작된 핵산 구조물로부터 전사될 수 있다.

리포터 핵산 분자에서 유래된 전사체는 "리포터 전사체"로 지칭될 수 있다. 상기 리포터 전사체는 리포터 서열 및 시스-억제 서열을 포함한다. 상기 리포터 전사체는 상보성 영역을 형성하는 서열을 가질 수 있어, 상기 전사체가 이중체를 형성하는 두 영역(예컨대, 분자간 이중체 영역)을 포함할 수 있도록 한다. 일 영역은 "시스-억제 서열"로 지칭될 수 있으며 표적 전사체 및/또는 리포터 서열의 일부 또는 전부에 대해 상보성을 갖는다. 상기 전사체의 제2 영역은 "리포터 서열"이라고 하며 시스-억제 서열에 대한 상보성을 가질 수 있다. 상보성은 완전한 상보성 또는 실질적 상보성일 수 있다. 상기 시스-억제 서열의 존재 및/또는 리포터 서열과의 결합은 상기 리포터 전사체에서 입체 형태를 형성 할 수 있고, 이는 리포터 분자의 추가 발현을 차단할 수 있다. 상기 리포터 전사체는 헤어핀 구조와 같은 2차 구조를 형성할 수 있어, 서로 상보적인 리포터 전사체 내의 영역들이 서로 혼성화될 수 있다.

핵산 분자 또는 외인성 서열(예컨대, 플라스미드, 벡터, 구조물)을 지칭 할 때 "세포 내로의 도입"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 세포 내로의 활용 또는 흡수를 촉진하는 것을 의미한다. 핵산 구조물 또는 전사체의 흡수 또는 활용은 비보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해 또는 박테리오파지, 바이러스 및 형질 도입 입자의 사용을 포함하는 보조제 또는 장치에 의해 발생할 수 있다. 상기 용어의 의미는 시험관 내 세포로 제한되지 않고, 핵산 분자는 또한 "세포 내로 도입"될 수 있으며, 여기서 세포는 살아 있는 유기체의 일부이다. 이 경우, 세포 내로의 도입은 유기체로의 전달을 포함하게 된다. 예를 들어, 생체 내 전달을 위해, 본 발명의 핵산 분자, 구조물 또는 벡터는 조직 부위에 주사되거나 전신 투여될 수 있다. 세포 내로의 시험관내 도입은 전기 천공 및 리포펙션과 같은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 추가적인 접근법이 본원에 설명되거나 당업계에 공지되어 있다.

"형질 도입 입자"는 비-바이러스성 핵산 분자를 세포 내로 전달할 수 있는 바이러스를 지칭한다. 상기 바이러스는 박테리오파지, 아데노바이러스 등일 수 있다.

"비-복제 형질 도입 입자” 또는 "NRTP"는 비-바이러스성 핵산 분자를 세포 내로 전달할 수 있지만 자가 복제된 바이러스 유전체를 형질 도입 입자 내로 패키징할 수는 없는 바이러스를 지칭한다. 상기 바이러스는 박테리오파지, 아데노바이러스 등일 수 있다.

"플라스미드"는 세포 내의 염색체 DNA와 물리적으로 분리되고 독립적으로 복제할 수 있는 작은 DNA 분자이다. 가장 일반적으로 박테리아에서 작은 원형의 이중 가닥 DNA 분자로 발견되는 플라스미드는 고세균 및 진핵 생물 내에 때때로 존재한다. 플라스미드는 적절한 숙주 내에서 자가 복제할 수 있는 레플리콘으로 간주된다.

"벡터"는 외래 유전자 물질을 다른 세포 내로 인공적으로 운반하기 위한 담체로서 사용되는 핵산 분자이며, 상기 세포 내에서 복제 및/또는 발현될 수 있다.

"바이러스"는 다른 유기체의 살아있는 세포 내에서만 복제되는 작은 감염원이다. 바이러스 입자(비리온으로 공지됨)는 2개 또는 3개의 부분을 포함한다: i) 유전 정보를 전달하는 DNA 또는 RNA 분자로 만들어진 유전자 물질; ii) 상기 유전자를 보호하는 단백질막; 및 일부 경우에 iii) 9388 지질의 외피.

본원에 사용된 용어 "보체"는 파괴된 동일한 서열의 존재 하에 있는 비-파괴 서열, 또는 파괴된 서열에 대한 비-파괴 서열의 관계를 지칭한다. 일 구현예에서, 상기 보체는 기능적이고 발현 가능한 세포 내 폴리뉴클레오티드 상에 암호화된 유전자를 포함하고, 파괴 이전에 박테리오파지 상에서 파괴된 유전자와 동일한 기능을 갖는 단백질을 발현한다. 일부 구현예들에서, 보체 유전자는 파괴 이전에 파괴된 박테리오파지 유전자, 즉 고유 박테리오파지 유전자와 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 보체 유전자는 파괴 이전에 파괴된 박테리오파지 유전자, 즉 고유 박테리오파지 유전자와 동일하다. 일부 구현예들에서, 상기 보체 유전자는 박테리오파지로부터 결실된 폴리뉴클레오티드 염기 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 보체 유전자는 동일한 유전자가 박테리오파지에서 파괴된 플라스미드 상에서 박테리오파지의 패키징 기구를 암호화하는 유전자를 지칭한다. 따라서, 상기 플라스미드는 폴리뉴클레오티드를 형질 도입 입자 내로 패키징하는 데 필요한 패키징 기구를 제공하기 위해 돌연변이된 패키징 기구 유전자를 가진 박테리오파지의 존재 하에 있어야 한다.

본원에 사용된 용어 "패키징-관련 효소 활성"은 폴리뉴클레오티드를 형질 도입 입자 내로 패키징하기 위한 패키징 개시 부위 서열과의 상호 작용에 중요한 하나 이상의 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예들에서, 상기 상호 작용을 위해 한 쌍의 티미나아제 유전자가 필요하며, 여기서 각각의 티미나아제는 패키징-관련 효소 활성을 암호화한다. 일부 구현예들에서, 상기 효소 활성은 본 발명에서 발견된 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 박테리오파지로부터 terS 및/또는 terL 유전자에 의해 암호화된다. 상기 구현예들에서, 각각의 티미나아제 유전자 쌍은 패키징-관련 효소 활성을 발현하고, 둘 모두의 기능적 버전은 패키징 개시 부위를 갖는 폴리뉴클레오티드의 패키징에 필요하다. 일부 구현예들에서, 패키징-관련 효소 활성과 관련된 복수의 유전자 중 하나의 파괴는 패키징-관련 효소 활성을 제거한다. 일부 구현예들에서, 티미나아제 유전자 쌍은 모두 박테리오파지 유전체 상에서 파괴되고, 따라서 박테리오파지 상에서 전체 세트의 패키징-관련 효소 활성 암호화 유전자들을 파괴한다.

용어 "개선시키는"은 질병 상태의 치료, 예컨대 이의 예방, 중증도 또는 진행의 감소, 완화 또는 치료를 포함하는 질병 상태의 치료에서 임의의 치료적으로 유익한 결과를 지칭한다.

용어 "인시투"는 살아있는 유기체와 별도로 성장하는, 예를 들어 조직 배양에서 성장하는 살아있는 세포에서 일어나는 과정을 지칭한다.

용어 "생체 내"는 살아있는 유기체에서 발생하는 과정을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "포유 동물"은 인간 및 비인간 둘 모두를 포함하고 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 쥐, 소, 말 및 돼지를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

"G", "C", "A” 및 "U"는 일반적으로 각각 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실을 함유하는 뉴클레오티드를 각각 나타낸다. "T” 및 "dT"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고 핵염기가 티민, 예컨대 데옥시리보티민인 데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 하지만, 용어 "리보뉴클레오티드” 또는 "뉴클레오티드” 또는 "데옥시리보뉴클레오티드"는 또한 하기에 추가로 상세하게 설명되는 바와 같이 변형된 뉴클레오티드 또는 대리 대체 모이어티를 지칭할 수 있음이 이해될 것이다. 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 상기 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 형성 특성을 실질적으로 변경하지 않고 다른 모이어티로 대체될 수 있다는 것을 잘 알고 있다. 예를 들어, 제한없이 이노신을 염기로 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드는, 예를 들어 이노신을 함유하는 뉴클레오티드로 본 발명의 뉴클레오티드 서열에서 대체될 수 있다. 상기 대체 모이어티를 포함하는 서열은 본 발명의 구현예이다.

본원에 사용된 용어 "상보적"은 제2 뉴클레오티드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오티드 서열을 설명하는 데 사용될 때, 특정 조건 하에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드로 이중체 구조를 혼성화하고 형성하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 지칭한다. 상보적 서열은 또한 서로 결합하는 것으로 기재되고 결합 친화성을 특징으로 한다.

예를 들어, 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화(예컨대, 어닐링)될 때 제1 뉴클레오티드 서열은 제2 뉴클레오티드 서열에 상보적인 것으로 기재될 수 있다. 혼성화 조건은 어닐링 및/또는 세척 단계를 위한 온도, 이온 강도, pH 및 유기 용매 농도를 포함한다. 용어 엄격한 혼성화 조건은 제1 뉴클레오티드 서열이 이의 표적 서열, 예컨대 제2 뉴클레오티드 서열에 우선적으로 혼성화되고, 다른 서열들에 대해 더 적은 정도로 또는 전혀 혼성화되지 않게 되는 조건을 지칭한다. 엄격한 혼성화 조건은 서열에 따라 다르며 환경 매개 변수에 따라 상이하다. 일반적으로, 엄격한 혼성화 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 뉴클레오티드 서열에 대한 열 융점(T_m)보다 약 5°C 낮도록 선택된다. T_m은 상기 제1 뉴클레오티드 서열의 50%가 완벽하게 일치하는 표적 서열에 혼성화되는 온도(정의된 이온 강도 및 pH)이다. 핵산 혼성화에 대한 광범위한 안내는, 예컨대 Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, chap. 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” Elsevier, N.Y. ("Tijssen")에서 찾을 수 있다. 다른 조건들, 예컨대 유기체 내부에서 접할 수 있는 생리학적 관련 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 최종적인 적용에 따라 두 서열의 상보성 시험에 가장 적절한 세트의 조건들을 결정할 수 있을 것이다.

이는 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 염기쌍을 포함한다. 상기 서열은 본원에서 서로에 대해 "완전히 상보적"인 것으로 지칭될 수 있다. 하지만, 제1 서열이 본원에서 제2 서열에 대해 "실질적으로 상보적"이라고 지칭되는 경우, 2개의 서열은 혼성화 시에 완전히 상보적일 수 있거나, 1개 이상이지만 일반적으로 4, 3 또는 2개 이하의 불일치 염기 쌍을 이룰 수 있지만, 동시에 최종적인 적용과 가장 관련있는 조건에서 혼성화될 수 있는 능력을 유지한다. 하지만, 혼성화 시에 1개 이상의 단일 가닥 돌출부(overhang)을 형성하도록 2개의 올리고뉴클레오티드가 설계되는 경우, 상기 돌출부는 상보성 결정과 관련하여 불일치로 간주되지 않는다. 예를 들어, 21개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 하나의 올리고뉴클레오티드 및 23개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA(여기서 길이가 더 긴 올리고뉴클레오티드는 길이가 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적인 21개의 뉴클레오티드 서열을 포함함)는 본원에 기재된 목적을 위해 아직은 "완전히 상보적"인 것으로 지칭될 수 있다.

본원에 사용된 "상보적” 서열은 또한 혼성화 능력과 관련된 상기 요건이 충족되는 경우 비-왓슨-크릭 염기 쌍 및/또는 비-천연 및 변형된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기 쌍을 포함하거나 이로부터 완전히 형성될 수 있다. 상기 비-왓슨-크릭 염기 쌍은 G:U 워블(Wobble) 또는 후그스타인(Hoogstein) 염기쌍 형성을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본원에서 용어 "상보적", "완전히 상보적” 및 "실질적으로 상보적"은 이의 사용 맥락에서 이해되는 바와 같이 dsRNA의 두 가닥 사이, 또는 dsRNA의 안티센스 가닥 및 표적 서열 사이, 단일 가닥 RNA 서열 또는 단일 가닥 DNA 서열의 상보적 가닥 사이의 염기 매칭과 관련하여 사용할 수 있다.

본원에 사용된 "이중체 구조"는 2개의 역병렬 및 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 핵산 구조물 내, 두 전사체 사이, 전사체 내 두 영역 사이, 또는 전사체 및 표적 서열 사이의 상보적 서열은 "이중체 구조"를 형성할 수 있다. 일반적으로, 각 가닥의 대부분의 뉴클레오티드는 본원에서 상세히 설명된 바와 같이 리보뉴클레오티드이지만, 각각 또는 두 가닥은 또한 적어도 하나의 비-리보뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 이중체 구조를 형성하는 두 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있거나, 또는 별도의 RNA 분자일 수 있다. 두 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부이고, 따라서 이중체 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단 및 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 뉴클레오티드의 끊김없는 사슬로 연결되는 경우, 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프"라고 한다. 두 가닥이 한 가닥의 3'-말단 및 이중체 구조를 형성하는 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 뉴클레오티드의 끊김없는 사슬이 아닌 다른 수단에 의해 공유적으로 연결된 경우, 상기 연결 구조는 "링커”로 지칭된다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 염기 쌍의 최대 수는 이중체의 가장 짧은 가닥의 뉴클레오티드 수에서 이중체에 존재하는 임의의 돌출부를 뺀 수이다. 일반적으로, 이중체 구조는 15 및 30개 사이, 25 및 30개 사이, 18 및 25개 사이, 19 및 24개 사이, 19 및 21개 사이, 또는 19, 20 또는 21개의 염기쌍 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 이중체는 19개의 염기쌍 길이를 갖는다. 다른 구현예에서, 이중체는 21개의 염기쌍 길이를 갖는다. 2개의 상이한 siRNA가 조합에 이용될 때, 이중체의 길이는 동일하거나 상이할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "상보성 영역"은 본원에 정의된 바와 같이, 서열, 예를 들어 표적 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상기 상보성 영역이 상기 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우, 불일치는 말단 영역에서 가장 용인되며, 존재하는 경우 일반적으로 말단 영역 또는 영역들, 예컨대 5’ 및/또는 3’ 말단의 6, 5, 4, 3 또는 2개의 뉴클레오티드 내에 있다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락 내에서 용어 "동일성 비율"은 하기에 기재된 서열 비교 알고리즘 중 하나(예컨대, BLASTP 및 BLASTN 또는 숙련된 사람에게 입수 가능한 다른 알고리즘들) 또는 육안 검사에 의해 측정 된 최대의 일치를 위해 비교되고 정렬될 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 명시된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 적용에 따라, "동일성” 비율은 비교 중인 서열의 영역에 걸쳐, 예컨대 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나, 또는 대안적으로 비교될 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.

서열 비교를 위해, 일반적으로 하나의 서열이 시험 서열들이 비교되는 참조 서열로서 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 하위 서열 좌표를 지정하며, 서열 알고리즘 프로그램 매개 변수를 지정한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개 변수에 기초하여 참조 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성 비율을 계산한다.

비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 예컨대 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국부 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 검색 방법, 상기 알고리즘의 컴퓨터화된 구현에 의해(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA - 지네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package), 575 Science Dr., Madison, Wis. 소재), 또는 육안 검사(일반적으로 하기 Ausubel et al.를 참조)에 의해 실시할 수 있다.

서열 동일성 및 서열 유사성 비율을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 한 예는 BLAST 알고리즘이며, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에 기재되어 있다. BLAST 분석을 실시하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수 가능하다.

용어 "충분한 양"은 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양, 예컨대 세포로부터 검출 가능한 신호를 생성하기에 충분한 양을 의미한다.

용어 "치료적 유효량"은 질병의 증상을 개선하는데 효과적인 양이다. 예방이 치료로 간주될 수 있기 때문에 치료적 유효량은 "예방적 유효량"일 수 있다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태(“a”, “an” 및 “the”)는 문맥에서 별도로 다르게 지시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다.

II. 바이러스의 용원 및 용균 주기

바이러스는 숙주 세포에서 용원 및 용균 주기를 거친다. 상기 용원 주기가 채택되면, 파지 염색체는 박테리아 염색체 내로 통합되거나, 또는 숙주에서 안정된 플라스미드로 자리를 잡을 수 있어 오랜 시간 동안 휴면 상태를 유지할 수 있다. 용원이 유도되면, 파지 유전체는 박테리아 염색체로부터 절제되고 용균 주기를 개시하여, 세포의 용균 및 파지 입자의 방출에서 절정에 이른다. 용균 주기는 숙주의 용균에 의해 방출되는 새로운 파지 입자들의 생성으로 이어진다.

또한, 파지 기반 리포터와 같은 바이러스 기반 리포터 분석은 숙주 기반 및 프로파지 유래 파지 내성 메커니즘으로 인한 파지 숙주 범위의 한계로 인해 제한된 반응성(즉, 분석적 포괄성)을 겪을 수 있다. 상기 내성 메커니즘은 파지 DNA 및 기능의 분해 또는 그렇지 않으면 억제를 초래할 수 있는 고유 파지 핵산을 표적으로 한다. 상기 내성 메커니즘은 파지 DNA를 절단하는 제한 시스템 및 파지 유래 전사체를 억제하는 CRISPR 시스템을 포함한다.

용균 활성 및 파지 내성은 모두 리포터 파지에 기반한 분석에 대해 억제될 수 있다. 용균 활성은 검출 가능한 신호를 생성하는 능력에서 세포를 파괴하거나 또는 그렇지 않으면 억제하고, 따라서 검출 가능한 신호의 양을 줄이거나 검출 가능한 신호의 생성을 방지함으로써 검출 한계에 영향을 미침으로써 신호를 억제할 수 있다. 파지 내성 메커니즘은 파지의 숙주 범위를 제한하고 파지 기반 리포터의 포괄성을 제한할 수 있으며, 마찬가지로 검출 가능한 신호의 양을 줄이거나 검출 가능한 신호의 생성을 방지하여 검출 한계에 영향을 미칠 수 있다. 리포터 파지 내에 파지 DNA를 통합함으로써 야기되는 용균 활성 및 파지 내성은 상기 파지 리포터를 통합하는 분석에서 거짓 음성 결과를 초래할 수 있다.

III. 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)를 생성하는 방법

비-복제 형질 도입 입자를 생성하기 위한 파괴/상보성 기반 방법들.

본원에서는 바이러스 패키징 기구에 의해 바이러스 생성 중에 유전체 패키징이 시작되는 요소로서 인식되는 바이러스 유전체의 구성 요소의 파괴를 기반으로 하는 비-복제 형질 도입 입자 패키징 시스템(본원에서는 스마티클(Smarticles) 시스템이라고도 함)이 개시된다. 한 구현예에서, 상기 파괴는 박테리오파지로부터 패키징 개시 부위를 파괴하고, 또한 터미나아제 기능을 파괴한다. 파괴된 요소의 예로는 pac-형 박테리오파지의 pac-자리 서열 및 cos-형 박테리오파지의 cos-자리 서열을 포함한다. 파지 내의 패키징 개시 부위 서열이 파괴되면, 파지가 기능적 터미나아제를 생성할 수 없다. 일례에서, pac-자리는 pacA 유전자 서열 내에서 암호화되고, 터미나아제 기능은 기능적 PacA 및 PacB를 모두 필요로 한다. 플라스미드 DNA는 상기 파괴된 터미나아제를 보완하고 플라스미드 DNA 상의 인식 가능한 패키징 개시 부위를 포함함으로써 파지 캡시드 내로 패키징된다.

패키징 개시 부위는 바이러스 생성에 필수적인 유전자의 부호화 영역 내에서 종종 발견된다. 박테리오파지 유전체의 영역은 패키징 개시 부위를 파괴하는 삽입, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 파괴될 수 있다. 이를 달성하는 파괴의 예로는 패키징 개시 부위 서열을 함유하는 박테리오파지 유전체 상의 서열을 다른 서열, 예컨대 항생제 내성 유전자의 서열로 대체하는 대립 유전자의 교환, 또는 크고 작은 터미나아제의 완전한 결실이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 터미나아제 유전자 pacA 및 pacB를 사용하는 예에서, pacA는 pacB 발현 및/또는 PacA 및 PacB에 의해 매개되는 전체 터미나아제 기능을 또한 파괴하는 극성 효과를 유발하는 방식으로 파괴될 수 있다. 다른 예들로는 터미나아제 유전자의 파괴를 포함할 수 있으며, 또한 본 발명에서 발견된 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 박테리오파지의 terS 및 terL 유전자를 포함할 수 있다.

일례에서, 세포의 유전체는 패키징 개시 부위가 파괴된 바이러스 유전체로 용원화된다. 세포는 그람 음성 또는 그람 양성일 수 있다. 상보적인 플라스미드(또는 리포터 핵산 분자)가 세포 내로 도입되고, 플라스미드 DNA는 적어도 박테리오파지에서 파괴된 최소한의 유전자 뿐만 아니라, 패키징 개시 부위 서열, 및 선택적으로 추가적인 박테리오파지 유전자, 그리고 검출 가능한 및/또는 선택 가능한 마커를 암호화할 수 있는 리포터 유전자를 포함한다. 상기 플라스미드는 미국 특허 제9,388,453호에 기재된 방법들을 사용하여 구축될 수 있으며, 그 내용은 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 플라스미드의 하나 이상의 유전자는 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터(박테리오파지를 유도하여 패키징이 시작될 때 유도될 수 있음)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 프로모터는 작은 터미나아제 유전자(terS) 또는 큰 터미나아제(terL) 유전자의 고유 프로모터일 수 있다. 상기 고유 프로모터는 박테리오파지에 의해 제어될 수 있으며, 따라서 패키징 중에 유도되는 조건부 프로모터로서 효과적으로 작용한다.

일부 예들에서, 파괴/상보성은 돌연변이된 바이러스 DNA 및 보완하는 외인성 DNA 사이에 상동성이 없도록 설계되는 것이 바람직하다. 이는 돌연변이된 바이러스 DNA 및 보완하는 외인성 DNA 사이의 상동성이 결여되어 바이러스 유전체 내로 패키징 서열을 재도입할 수 있는 두 DNA 분자 사이의 상동성 재조합의 가능성을 피할 수 있기 때문이다. 상동성의 결여를 달성하기 위해, 한 가지 전략은 바이러스 유전체로부터 패키징 개시 부위 서열을 함유하는 전체 유전자(또는 유전자들)를 결실시킨 다음, 상기 유전자를 바람직하게는 바이러스로부터 결실된 DNA 서열만을 정확히 함유하는 외인성 DNA 분자로 보완하는 것이다. 상기 전략에서, 보완하는 DNA 분자는 상기 바이러스로부터 결실된 유전자를 발현하도록 설계된다. 상기 시스템의 다른 예는 pac-형 파지인 박테리오파지 φ80α를 사용하여 제공된다. 파지 유전체는 숙주 박테리아 세포 내에서 용원화되고, 파지 유전체는 pac-형 프로파지 φ80α의 pac-자리가 결실된 작은 터미나아제 유전자를 포함한다. 고유 pac-자리를 갖는 상보적인 작은 터미나아제 유전자를 포함하는 플라스미드가 세포 내로 형질 전환된다. 용원화된 파지의 용균 주기가 유도되면, 박테리오파지 패키징 시스템은 고유 박테리오파지 DNA를 패키징하기 보다는 플라스미드 DNA를 자손 박테리오파지의 구조적 구성 요소로 패키징한다. 따라서, 패키징 시스템은 플라스미드 DNA를 운반하는 비-복제 형질 도입 입자를 생성한다.

파지는 생물권에서 가장 풍부한 생명체이며(Clokie et al., 2011), 염기 서열화된 박테리아 유전체의 70%는 프로파지 유사 구조를 함유한다(Chen, et al., 2006). Touchon, et al. 등은 133 아시네토박터 종의 박테리아 유전체를 분석할 때 완전한 파지(즉, 박테리아 유전체 내로 통합된 파지)가 우세한 것으로 관찰하였다(Touchon et al., 2014). 자연에서 프로파지의 자연적 풍부함은 상기 종 내에서 넓은 숙주 범위를 가진 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii)에 특이적인 데노보(de novo) 파지를 분리하는 데 활용되었다. 상기 파지는 발광 분석에서 우수한 포괄성 및 배타성을 산출하는 비-복제 형질 도입 입자로 전환되었다.

아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 균주의 광범위한 유전적 다양성 및 유전체 가소성을 감안할 때(Sahl, JW et al., 2015; Snitkin et al., 2011), 비-복제 형질 도입 입자는 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 세포 상의 파지 수용체에서 잠재적 다양성을 설명하기 위해 단일 분석에서 칵테일로 조합되었다. 그렇게 하여, 분석에서 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 균주의 포괄성은 간섭 효과없이 개선되었다. 상기 접근법은 파지 칵테일이 파지 요법에서 치료적으로 사용되는 것과 동일한 방식으로 실시되었다(Chan, BK et al., 2013). 상기 기술의 장점은 상기 분석은 파지가 용균 수명 주기를 완료하거나 박테리아 숙주 방어 메커니즘을 접할 필요없이 DNA 전달 및 발광 반응만이 단기간에 발생할 것을 요구한다는 것이다.

리포터 유전자는 검출 가능한 마커 또는 선택 가능한 마커를 암호화한다. 일례에서, 상기 리포터 유전자는 발광 반응을 매개하는 효소(LuxA, LuxB, LuxAB, Luc, Ruc, nLuc), 비색 반응을 매개하는 효소(LacZ, HRP), 형광 단백질(GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, 근적외선 형광 단백질), 친화성 펩타이드(His-tag, 3X-FLAG) 및 선택 가능한 마커(ampC, tet (M), CAT, erm)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 리포터 유전자는 luxA이다. 일부 구현예들에서, 저항성 마커는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 저항성 마커는 카나마이신 내성 유전자(kan)이다. 일부 구현예들에서, 구성 프로모터는 pBla(암피실린 내성 유전자에 대한 프로모터)를 포함한다. 일부 구현예들에서, 박테리오파지 유전체 파괴는 패키징 개시 부위 서열을 함유하는 박테리오파지 유전체 상의 서열을 대체하거나 파괴하는 대립 유전자 교환에 의해 달성된다.

일례에서, 박테리오파지 유전체 상의 한 쌍의 터미나아제 유전자, 예컨대 terS 및 terL은 터미나아제 유전자 중 하나의 발현 및/또는 터미나아제 유전자에 의해 매개되는 전체 터미나아제 기능을 방해하는 극성 효과를 유발하는 방식으로 파괴될 수 있다. 파괴된 박테리오파지는 박테리오파지 유전체의 터미나아제 유전자, 예컨대 terS 및 terL을 포함하는 플라스미드로 보완될 수 있다. 돌연변이된 바이러스가 용균 주기를 겪고 있을 때, 박테리오파지 유전체 또는 (파괴된 경우)보완하는 플라스미드로부터 생성된 바이러스 패키징 단백질은 플라스미드 DNA의 레플리콘을 패키징포장 개시 부위를 포함하기 때문에 패키징 단위 내로 패키징하고, 비-복제 형질 도입 입자는 복제된 플라스미드 DNA를 운반하면서 생성된다.

VI. 리포터

일부 구현예들에서, 본 발명의 비-복제 형질 도입 입자(NRTP) 및 구조물은 리포터 유전자를 포함하는 리포터 핵산 분자를 포함한다. 상기 리포터 유전자는 리포터 분자를 암호화 할 수 있으며, 상기 리포터 분자는 검출 가능하거나 선택 가능한 마커일 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 리포터 유전자는 세포에서 발현될 때 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터 분자를 암호화한다.

특정 구현예들에서, 상기 리포터 분자는 형광 리포터 분자, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 GFP, 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 청색 형광 단백질(BFP), 적색 형광 단백질(RFP) 또는 mCherry 뿐만 아니라 근적외선 형광 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

다른 구현예들에서, 상기 리포터 분자는 발광 반응을 매개하는 효소(LuxA, LuxB, LuxAB, Luc, Ruc, nLuc 등)일 수 있다. 리포터 분자는 박테리아 발광 효소, 진핵생물 발광 효소, 비색 검출에 적합한 효소(LacZ, HRP), 면역 검출에 적합한 단백질, 예컨대 친화성 펩티드(His-tag, 3X-FLAG), 압타머로서 기능하거나 또는 효소 활성을 나타내는 핵산(리보 자임), 또는 선택 가능한 마커, 예컨대 항생제 내성 유전자(ampC, tet (M), CAT, erm)를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 다른 리포터 분자들은 표적 핵산 또는 세포를 검출하기 위한 신호를 생성하는 데 사용될 수 있다.

다른 양태들에서, 상기 리포터 분자는 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 리포터 분자는 특이적 결합 활성을 갖거나 효소 활성을 나타내는 압타머(예컨대, 앱타자임, DNA자임, 리보자임)이다.

리포터 및 리포터 분석은 본원의 섹션 V에 추가로 기재된다.

V. 비-복제 형질 도입 입자(NRTP) 및 리포터 분석

유도인자 리포터 분석

일부 구현예들에서, 본 발명은 생존 세포 내에서 유전자 프로모터를 표적화하는 내인성 또는 고유 유도인자와 함께 사용하기 위한 리포터 분자로서 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)를 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명의 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)는 섹션 III 및 하기의 실시예 1-2에 기재된 방법들을 사용하여 조작될 수 있다.

일부 구현예들에서, 상기 방법은 리포터로서 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)를 사용하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)는 표적 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 제어하는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함한다. 상기 리포터 유전자를 포함하는 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)가 표적 세포 내로 도입될 때, 리포터 핵산 분자에서 표적 유전자 프로모터의 유도를 통해 리포터 유전자의 발현이 가능하다.

전사체

전술한 바와 같이, 전사체는 DNA 또는 RNA 주형 서열 또는 유전자로부터 전사된 뉴클레오티드 염기 서열(DNA 또는 RNA)의 길이를 갖는다. 상기 전사체는 RNA 주형으로부터 전사된 cDNA 서열 또는 DNA 주형으로부터 전사된 mRNA 서열일 수 있다. 상기 전사체는 조작된 핵산 구조물로부터 전사될 수 있다. 상기 전사체는 그 자체 내에 상보성 영역을 가질 수 있으므로, 전사체는 분자 내 이중체를 형성할 수 있는 두 영역을 포함한다. 한 영역은 리포터 서열에 결합하고 이의 번역을 차단하는 "시스-억제 서열"이라고 지칭될 수 있다. 전사체의 제2 영역은 리포터 분자, 예컨대 검출 가능하거나 선택 가능한 마커를 암호화하는 "리포터 서열"이라고 한다.

본 발명의 전사체는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 전사체 서열일 수 있다. 다른 구현예들에서, 상기 전사체는 적어도 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 시스-억제 서열 및 리포터 서열은 동일하거나 상이한 길이를 가질 수 있다.

일부 구현예들에서, 상기 시스-억제 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개 이상의 스페이서 뉴클레오티드에 의해 리포터 서열로부터 분리된다.

벡터

다른 양태에서, 본 발명의 전사체(안티센스 및 센스 서열을 포함)는 DNA 또는 RNA 벡터 내로 삽입된 전사 단위로부터 발현된다(예컨대, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., 국제 PCT 공보 제 WO 00/22113호, 콘래드(Conrad), 국제 PCT 공보 제 WO 00/22114호, 및 콘래드, 미국 특허 제6,054,299호를 참조). 상기 서열은 숙주 유전체 내로 통합된 이식 유전자로서 통합되고 유전될 수 있는 또는 박테리오파지 기반 벡터를 포함한 선형 구조물, 원형 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있다. 전사체는 또한 염색체 외 플라스미드로서 유전되도록 구성 될 수 있다(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).

전사체 서열은 발현 플라스미드 상에 위치한 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 일 구현예에서, 시스-억제 및 리포터 서열은 전사체가 머리핀(stem and loop) 구조를 갖도록 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 연결된 역위 반복으로서 발현된다.

재조합 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 전사체를 발현할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 전사체를 발현하는 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(검토를 위해, Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); 아데노바이러스(예를 들어, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616를 참조), Rosenfeld et al. (1991, Science 252 : 431-434), 및 Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)를 참조); 또는 알파바이러스 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 것들을 기반으로 구축될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 레트로바이러스는 상피 세포를 포함하여 시험관 내 및/또는 생체 내 많은 상이한 세포 유형 내로 다양한 유전자를 도입하는 데 사용되었다(예컨대, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; 미국 특허 제4,868,116호; 미국 특허 제4,980,286호; PCT 출원 WO 89/07136; PCT 출원 WO 89/02468; PCT 출원 WO 89/05345; 및 PCT 출원 WO 92/07573을 참조). 세포의 유전체 내로 삽입된 유전자를 형질 도입하고 발현할 수 있는 재조합 레트로바이러스 벡터는 재조합 레트로바이러스 유전체를 적합한 패키징 세포주, 예컨대 PA317 및 Psi-CRIP 내로 형질 감염시켜 생성할 수 있다(Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349). 재조합 아데노바이러스 벡터는 감수성 숙주 내 다양한 세포 및 조직을 감염시키는데 사용될 수 있고(예컨대, 쥐, 햄스터, 개 및 침팬지) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), 또한 감염을 위해 유사 분열 활성 세포를 필요로 하지 않는 이점이 있다.

발현될 전사체(들)에 대한 부호화 서열을 수용할 수 있는 임의의 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스(AV); 아데노 관련 바이러스(AAV); 레트로바이러스(예컨대, 렌티바이러스(LV), 랍도 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스); 및 헤르페스 바이러스 등으로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 벡터의 향성은 벡터를 외피 단백질 또는 다른 바이러스의 다른 표면 항원으로 위형화하거나, 적절한 경우 상이한 바이러스 캡시드 단백질로 대체함으로써 변형할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에서 특징적으로 다룬 렌티바이러스 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), 광견병, 에볼라 및 모콜라 등의 표면 단백질로 위형화될 수 있다. 본 발명에서 특징적으로 다룬 AAV 벡터는 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하도록 벡터를 조작함으로써 상이한 세포를 표적화하도록 만들 수 있다. 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하는 AAV 벡터를 구축하는 기술은 당업계의 기술 내에 있다. 예를 들어, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801를 참조하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다.

본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 바이러스 벡터의 선택, 전사체를 벡터 내로 발현시키기 위한 핵산 서열을 삽입하는 방법, 및 바이러스 벡터를 관심 세포에 전달하는 방법은 당업계의 기술 내에 있다. 예를 들어, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; and Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406을 참조하고, 이의 전체 개시 내용은 본원에 참조로서 포함된다.

바이러스 벡터는 AV 및 AAV에서 유래될 수 있다. 본 발명에서 특징적으로 다룬 전사체를 발현하기 위한 적합한 AV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구축하는 방법, 및 벡터를 표적 세포 내로 전달하는 방법은 Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010에 기재되어 있다. 본 발명에서 특징적으로 다룬 전사체를 발현하기 위한 적합한 AAV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구축하는 방법, 및 벡터를 표적 세포 내로 전달하는 방법은 Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; U.S. Pat. No. 5,252,479; U.S. Pat. No. 5,139,941; 국제특허출원 제WO 94/13788호; 및 국제특허출원 제WO 93/24641호에 기재되어 있고, 이의 전체 개시 내용은 본원에 참조로서 포함된다.

본 발명에서 특징적으로 다룬 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터에서 전사체 발현을 유도하는 프로모터는 진핵생물 RNA 중합 효소 I(예컨대, 리보솜 RNA 프로모터), RNA 중합 효소 Ii(예컨대, CMV 초기 프로모터 또는 액틴 프로모터 또는 U1 snRNA 프로모터) 또는 일반적으로 RNA 중합 효소 III 프로모터(예컨대, U6 snRNA 또는 7SK RNA 프로모터) 또는 원핵생물 프로모터, 예를 들어 T7 프로모터일 수 있다. 단, 발현 플라스미드는 또한 T7 프로모터로부터의 전사에 필요한 T7 RNA 중합효소를 암호화한다. 상기 프로모터는 또한 이식 유전자 발현을 췌장으로 지시할 수 있다(예컨대, 췌장에 대한 인슐린 조절 서열(Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)을 참조).

또한, 전사체의 발현은, 예를 들어 특정 생리적 조절인자, 예컨대 순환성 포도당 수준 또는 호르몬에 민감한 조절 서열과 같은 유도 가능한 조절 서열 및 발현 시스템을 사용하여 정확하게 조절될 수 있다(Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). 세포 또는 포유류에서 이식 유전자 발현의 조절에 적합한 상기 유도성 발현 시스템은 엑디손, 에스트로겐, 프로게스테론, 테트라시클린, 이량체화의 화학적 유도제, 및 이소프로필-베타-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)에 의한 조절을 포함한다. 당업자는 dsRNA 이식 유전자의 의도된 사용에 기초하여 적절한 조절/프로모터 서열을 선택할 수 있을 것이다.

일반적으로, 전사체 분자를 발현할 수 있는 재조합 벡터는 하기에 기재된 바와 같이 전달되어 표적 세포에서 지속된다. 대안적으로, 전사체 분자의 일시적인 발현을 제공하는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 상기 벡터는 필요에 따라 반복적으로 투여할 수 있다. 일단 발현되고 나면, 전사체는 표적 RNA에 결합하여 이의 기능 또는 발현을 조절한다. 전사체 발현 벡터의 전달은, 예컨대 정맥 내 또는 근육 내 투여에 의해, 환자로부터 외식된 표적 세포로의 투여 후 환자 내로의 재도입, 또는 원하는 표적 세포 내로의 도입을 허용하는 임의의 다른 수단에 의해 전신에 영향을 줄 수 있다.

전사체 발현 DNA 플라스미드는 일반적으로 양이온성 지질 담체(예컨대, 올리고펙타민) 또는 비-양이온성 지질 기반 담체(예컨대, Transit-TKO^TM)와의 복합체로서 표적 세포 내로 형질 감염된다. 1 주일 이상의 기간에 걸쳐 단일 PROC 유전자 또는 다중 PROC 유전자의 상이한 영역을 표적으로 하는 dsRNA-매개 녹다운에 대한 다중 지질 형질 감염이 또한 본 발명에 의해 고려된다. 벡터의 숙주 세포 내로의 성공적인 도입은 다양한 공지된 방법을 사용하여 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 일시적 형질 감염은 리포터, 예컨대 형광 마커, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP)을 통해 신호를 보낼 수 있다. 생체 외 세포의 안정적인 형질 감염은 형질 감염된 세포에 특정 환경 요인(예컨대, 항생제 및 약물)에 대한 내성, 예컨대 히그로마이신 B 내성을 제공하는 마커를 사용하여 보장할 수 있다.

재조합 DNA를 함유하는 벡터의 전달은 비생물학적 또는 생물학적 시스템에 의해 실시할 수 있다. 전기 천공(실시예에 기재된 바와 같음), 리포좀, 바이러스-유사 입자, 파지 또는 바이러스로부터 유래된 형질 도입 입자 및 접합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

전사체 분석을 위한 리포터

일부 구현예들에서, 핵산 구조물은 리포터 서열(예컨대, 리포터 유전자 서열)을 포함한다. 상기 리포터 유전자는 세포 내에서 발현될 때 신호를 생성하는 리포터 분자를 암호화한다. 일부 구현예들에서, 상기 리포터 분자는 검출 가능하거나 선택 가능한 마커일 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 리포터 분자는 형광 리포터 분자, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 청색 형광 단백질(BFP), 또는 적색 형광 단백질(RFP)일 수 있다. 다른 구현예들에서, 상기 리포터 분자는 화학 발광 단백질일 수 있다.

리포터 분자들은 박테리아 발광 효소, 진핵생물 발광 효소, 형광 단백질, 비색 검출에 적합한 효소, 면역 검출에 적합한 단백질, 면역 검출에 적합한 펩티드, 또는 압타머로 기능하거나 효소 활성을 나타내는 핵산일 수 있다.

선택 가능한 마커는 리포터로도 사용할 수 있다. 상기 선택 가능한 마커는, 예를 들어 항생제 내성 유전자일 수 있다.

실시예

다음은 본 발명을 실시하기 위한 특정 구현예들의 실시예이다. 상기 실시예는 예시 목적으로만 제공되며 그 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려고 의도하지 않는다. 사용된 숫자(예컨대, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 물론 일부 실험적 오류 및 편차는 허용되어야 한다.

본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 상기 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예컨대, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3 ^rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)를 참조한다.

실시예 1 아시네토박터 바우마니( A. Baumannii ) 분리균으로부터 데노보 박테리오파지의 동정 및 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)의 생성.

물질 및 방법

박테리아 균주 및 성장 조건

288개의 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 임상 분리균 세트를 파스퇴르 연구소(Pasteur Institute) 및 IHMA 사의 CDC로부터 수집하고, 생화학 시험 및 MALDI-TOF를 통해 사내에서 종을 확인하였다. 각각의 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 분리균을 'Abi’로 동정한 후, 수탁의 순서에 따른 번호로 동정하였다. 분리균을 37°C에서 225 rpm으로 교반하여 루리아-베르타니(Luria Bertani, LB) 배지 내에서 또는 37°C에서 정상 조건 하의 LB 한천 플레이트 상에서 배양하였다. 패키징 플라스미드를 포함하는 균주는 대장균(E. Coli) 복제 균주 또는 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 분리균에서 각각 150 μg/ml 또는 250 μg/ml 히그로마이신 B 골드(Gold, 인비보겐, 캘리포니아 산디에고 소재)로 보충된 LB 레녹스(Lennox, 저염) 배지 또는 한천에서 성장시켜 선택하였다. 유전자 파괴 터미나아제 영역을 가진 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 균주는 200 μg/ml 제오신(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 캘리포니아 칼스배드 소재) 또는 플레오마이신(인비보겐, 캘리포니아 샌디에고 소재)으로 보충된 LB 레녹스(저염) 배지 또는 한천에서 선택하였다.

용원성 파지의 유도 및 정제

아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 용원성 균주를 4 μg/ml의 미토마이신 C를 첨가하기 전에 LB 배지에서 37°C에서 225 rpm의 진탕 속도로 로그기(OD₆₀₀ ~ 0.6-0.8)까지 성장시켜 존재할 수 있는 임의의 용원성 파지를 유도하였다. 미토마이신 C를 30분 동안 처리한 후, 세포를 3750 rpm에서 10분 동안 원심 분리하고, 신선한 LB 배지에 재현탁시켰다. 세포를 4시간 동안 150 rpm의 감소된 진탕 속도로 37°C에서 배양하였다. 파지 함유 상청액을 원심 분리하여 3750 rpm에서 10분 동안 세포 파편을 펠릿화하고, 0.2 μM 필터 장치를 통과시켜 남아있는 임의의 세포 파편을 제거하였다. 용해물은 사용 시까지 4°C의 어두운 곳에 보관하였다.

플라크 형성(plaquing) 방법에 의한 숙주 범위의 평가

288개의 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 임상 분리균 각각을 5 mM CaCl₂로 보충한 LB 배지 내에서 성장시켰다. OD₆₀₀~0.4-0.6에서 로그기에 도달한 후, 300 μl의 박테리아 배지를 0.5% 한천 및 5 mM CaCl₂으로 구성된 4 ml의 상부가 녹은 한천에 첨가하였다. 상부 한천 및 박테리아 배양 혼합물을 일반 LB 한천 플레이트 상에 붓고, 즉시 5 μl의 여과된 용해물을 스팟팅하였다. 상기 플레이트를 37°C에서 밤새 배양하고, 다음 날에 정의된 플라크의 존재 또는 부재에 대해 매겼다.

유도성 데노보 파지의 파지 유전체 DNA 서열화

파지 유전체 DNA를 데노보 Abi phi 33, 49 및 147 파지로부터 분리하여, 광범위한 플라크 형성 숙주 범위를 산출하였다. 용해물을 14,000 rpm에서 2시간 동안 원심 분리하여 파지를 펠릿화하고, 1x SM 완충액에 재현탁시켰다. 파지 용해물을 DNase I(써모 피셔 사이언티픽, CA 칼스배드 소재)로 처리하고, 파지 DNA 분리 키트(노르겐 바이오텍(Norgen Biotek Corp., 캐나다의 ON 토롤드 소재)으로 처리하여 파지 유전체 DNA(gDNA)를 분리하였다. 정제된 파지 gDNA 샘플을 데노보 파지 유전체 서열화, 조립 및 MiSeq 서열화 플랫폼(일루미나(Illumina), CA 샌디에고 소재)을 사용하는 개방형 해독틀의 추정되는 주석을 위해 ACGT 사(휠링(Wheeling), IL)로 보냈다.

투과 전자 현미경에 의한 파지 시각화

파지를 펠렛화하기 위해, 파지 용해물을 14,000 rpm의 속도로 실온에서 2시간 동안 원심 분리하고, 50-100 ㎕ SM 완충액에 재현탁시켰다. 샘플은 네거티브 염색 및 투과 전자 현미경 검사를 위해 콜로라도 대학의 볼더 전자 현미경 서비스(Boulder Electron Microscopy Services, 미국의 CO 볼더 소재)에 제출하였다.

파지 패키징을 위한 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 플라스미드의 구축

플라스미드 구축은 결과 섹션에 상세하게 기재되었다. 본 연구에 사용된 모든 플라스미드는 표 1에 나열되어 있다.

플라스미드 수탁 번호	복제 기점(대장균, 아시네토박터 바우마니)	luxAB 프로모터	luxAB(WT 또는 돌연변이)	terSL(원천; 길이)	luxAB의 3' 말단의 TT 플랭킹(flanking)	항생제 선택 마커(들)
p3028	pUC; pWH1266	pBla	WT	없음	없음	kanR; zeoR
p3033	pUC; pWH1266	pBla	WT	Abi 147; terSL	없음	kanR; zeoR
p3066	pUC; pWH1266	pBla	WT	Abi 147; terS + terSL의 250 bp 상류	없음	kanR; zeoR
p3073	pUC; pWH1266	pBla	WT	Abi 147; terS + terSL의 250 bp 상류	있음	hph
p3074	pUC; pWH1266	pBla	돌연변이	Abi 33; terS + terSL의 250 bp 상류	있음	hph
p3075	pUC; pWH1266	pBla	돌연변이	Abi 49; terS + terSL의 100 bp 상류	있음	hph

터미나아제 영역 결실의 설계 및 구축

Aranda, et al.에 의해 개발된 유전자 파괴 방법(Aranda, et al., 2010)은 이중 교차 재조합을 통해 터미나아제 영역을 선택 마커로 대체하는 데 사용하였다. 재조합을 위한 기질은 terS 상류 영역의 600 bp으로 5’ 말단 또는 terL 하류의 600 bp으로 3’말단의 측면에 형성된 제오신 내성 카세트(zeoR)로 구성되었다. 각각의 상기 서열은 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 터미나아제 영역을 위해 특별히 설계되었으며, gBlocks(IDT, 캘리포니아 레드우드 시티 소재)로 합성하고, pCR-BluntII-TOPO 벡터 내로 서브클로닝하고, 푸젼 고충실도(Phusion High-Fidelity) DNA 중합 효소(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠 입스위치 소재)로 PCR 증폭시켰다. 선형 재조합 DNA는 PCR 정제 키트(뉴잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 정제하고 농축하여 ~ 5 μg/ml의 농도를 수득하였다.

터미나아제 영역 녹아웃 생성을 위한 전기적격 세포의 제조

아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 균주를 Jacobs, et al로부터 조정된 방법을 사용하여 전기 적격으로 만들었다(Jacobs AC, et al., 2014). 세균 배양물을 225 rpm에서 진탕시키면서 37°C에서 50ml 의 LB 레녹스 배지에서 밤새 성장시켰다. 상기 배지를 50 ml의 원뿔형 관으로 옮기고, 3750 rpm의 속도로 실온에서 10분 동안 원심 분리하여 세포를 펠릿화하였다. 모든 후속 단계는 실온에서 실시하였다. 상청액을 피펫으로 제거하고, 세포 펠릿을 10%(v/v) 글리세롤과 함께 25 ml(시작 배양 부피의 절반)에 부드럽게 재현탁시켰다. 세포를 3750 rpm에서 10분 동안 펠릿화하고, 10% 글리세롤로 세척을 반복하였다. 펠릿화된 세포를 1.5 ml의 10% 글리세롤에 재현탁시켰다.

전기 천공을 통한 유전자 녹아웃 생성물의 형질전환

선형 재조합 DNA(≤10 μl)를 50 μl 분취량의 신선한 전기 적격 세포와 혼합하였다. 혼합물을 1 mm 전기 천공 큐벳(불독(Bulldog))에 넣고, 바이오-래드 진 푸셔(Bio-Rad Gene Pulser)에서 25 μF, 100 ohm 및 1.8 kV로 펄싱하였다. 세포를 900 μl의 SOC 배지(인비트로겐(Invitrogen))에서 37°C에서 2-3 시간 동안 배양하여 세포를 회수하고 재조합을 발생하도록 하였다. 세포를 200 ㎍/ml의 제오신 또는 이의 유도체인 플레오마이신을 함유하는 LB 레녹스 한천 플레이트에 분주하였다.

플라스미드를 보완하는 터미나아제 녹아웃 균주의 형질전환

터미나아제 녹아웃 균주는 200 μg/ml의 제오신 또는 이의 유도체인 플레오마이신을 함유하는 LB 레녹스에서 밤새 성장시켰다. Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 터미나아제 녹아웃 균주의 배양물을 이전에 설명한 대로 전기 적격으로 만들고, 각각 플라스미드 p3074, p3075 및 p3073으로 형질 전환하였다. 형질 전환체는 200 μg/ml의 제오신 및 250 μg/ml의 히그로마이신 B 골드를 함유하는 LB 레녹스 한천에서 선택하였다.

비-복제 형질 도입 입자의 용해물을 생성하기 위한 돌연변이 균주의 유도

갓 도말 배양된 균락으로부터 Abi 33 ΔterSL::p3074, Abi 49 ΔterSL::p3075, 및 Abi 147 ΔterSL::p3073을 250 ㎍/ml의 히그로마이신 B 골드를 함유하는 LB 레녹스 배지에서 37°C에서 225 rpm 속도로 교반하여 밤새 성장시켰다. 세포를 LB 배지 내에서 3% 밤새 배양물로 배양하고 OD600이 1.6-1.8에 도달할 때까지 37°C에서 225 rpm의 속도로 교반하여 배양하였다. 파지 생성을 유도하기 위해, 4 ㎍/ml의 미토마이신 C(밀리포어 시그마(Millipore Sigma), 미주리 세인트루이스 소재)를 배양물에 첨가하고 37℃에서 150 rpm의 속도로 교반하여 40분 동안 배양하였다. 미토마이신 C를 제거하기 위해, 세포를 실온에서 10분 동안 3750 rpm의 속도로 원심 분리하고 펠릿을 신선한 LB 배지에 재현탁시켰다. 배양물은 150 rpm의 속도로 교반하여 37°C에서 밤새 배양하였다. 세포 파편을 제거하고 각각의 용해물을 정제하기 위해, 배양물을 15분 동안 5000 rpm의 속도로 원심 분리하였다. 비-복제 형질 도입 입자 용해물 함유 상청액을 0.2 μm 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)™ 날겐 래피드 플로우(Nalgene Rapid Flow) 필터(써모 피셔)에 통과시키고 사용 시까지 4°C의 어두운 곳에 보관하였다.

비-복제 형질 도입 입자를 함유하는 용해물의 농도

조 용해물을 10,000xg, 4°C에서 15분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거하고, 0.2 μm 써모 사이언티픽™ 날겐 래피드 플로우 필터에 통과시켜 필터 멸균하였다. 멸균 용해물을 30,000xg로 4°C에서 16-18 시간 동안 원심 분리하여 형질 도입 입자를 펠릿화하였다. 상층액을 제거한 후, 파지 펠릿을 1x SM 완충액(100 mM NaCl, 8 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl)에 10배 또는 20배의 농도로 재현탁하고, 0.2 μm 써모 사이언티픽™ 날겐 래피드 플로우 필터를 통해 필터 멸균하였다.

비-복제 형질 도입 입자를 사용한 표적 균주 내 발광 검출

96 웰 균주 패널의 글리세롤 원액을 37°C에서 500 rpm의 속도로 교반하여 밤새 성장시키기 위해 딥 웰플레이트에서 500 μl의 LB 밀러(Miller) 배지 내로 접종하였다. 약 107 cfu/ml의 시작 세포 부하에 대해 25 mM CaCl₂ 및 50 mM MgCl₂로 보충된 800 μl의 LB 밀러 배지에 1 μl의 밤새 배양물을 접종함으로써 일령 배양물을 제조하였다. 세포를 37°C에서 1.5 시간 동안 500 rpm의 속도로 교반하면서 성장시켰다. 흰색 96 웰 플레이트에 120 μl의 일령 배양물 및 50 μl의 형질 도입 입자를 혼합하였다. 형질 도입 입자 칵테일 분석을 위해, 120 μl의 일령 배양물을 각 3x 농축 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 형질 도입 입자 25 μl와 혼합하였다. 분석 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 100 rpm의 속도로 교반하여 배양한 다음, 최적의 luxAB 발현을 허용하기 위해 30°C에서 30분 동안 100 rpm의 속도로 교반하여 냉각 단계를 실시하였다. 플레이트는, 상대 발광 단위(RLU) 방출을 위한 기질로 노나날(nonanal)을 사용하여 스펙트라맥스(SpectraMax) L 기기(모레큘라 디바이스(Molecular Devices), 캘리포니아 새너제이 소재)에서 판독하였다.

형질 도입 입자(Tc) 스팟팅에 의한 숙주 범위의 평가

Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 형질 도입 입자의 숙주 범위는 5 μl의 배양된 세포를 스팟팅함으로써 평가하였다(Westwater 논문 참조). 발광 분석 판독 값 직전에 세포를 250 μg/ml의 히그로마이신 B를 함유하는 LB 레녹스 한천 플레이트에 스팟팅하였다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양하고 다음 날 박테리아 성장의 존재 또는 부재에 대해 점수를 매겼다(즉, 히그로마이신 내성을 부여하는 플라스미드를 포함하는 형질도입체). 형질도입체를 확인하고 임의의 자연적인 히그로마이신 내성 세포를 제거하기 위해, 균락을 LB 배지에 재현탁하고 RLU 방출을 시험하였다.

결과

광범위한 플라크 형성 숙주 범위를 가진 유도성, 용원성 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 파지를 동정하고 특성화하였다.

유도 가능하고 광범위한 숙주 범위 프로파지 후보를 동정하고 범위를 좁히기 위해, 288개의 고유한 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 임상 분리균을 수탁하고 박테리아 SOS 반응의 강력한 유도제인 미토마이신 C로 개별적으로 처리하여 박테리아가 보유한 모든 리소겐을 용균 주기로 전환하였다. 상기 제조로부터의 용해물은 파지 플라크 형성(plaquing) 방법을 사용하여 동일한 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 균주의 서브 세트에 스팟팅하였다. 플라크의 존재를 점수로 매기고 숙주 범위에 대한 스프레드 시트 내에 유지하였다. 누계로, 양성 플라크가 있는 용해물은 숙주 범위 및 보완 범위를 기준으로 순위를 매겼다. 가장 넓은 숙주 범위를 갖는 용해물은 각각 25%(72/287), 23%(61/269) 및 4%(7/163), 누계로 32%(93/288)의 플라크 형성 숙주 범위를 갖는 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147로 동정하였다.

Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 용해물로부터의 파지 유전체 DNA를 정제하고 서열화하여 파지 패키징(즉, 터미나아제) 영역을 동정하였다. Abi 33, Abi 49 및 Abi 147에 대한 완전한 파지 유전체의 크기는 각각 53, 40 및 36kb였다. Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 파지는 손상되지 않은 파지의 존재를 확인하고, 파지 군의 균질성을 결정하고, 형태를 기반으로 파지 과를 동정하기 위해 투과 전자 현미경으로 이미지화하였다. Abi 33 용해물은 미오비리대(Myoviridae) 파지의 이종 군을 함유하였고, Abi 49 및 Abi 147 용해물은 시포비리대(Siphoviridae) 파지의 동종 군을 함유하였다(도 1a, 도 1b, 도1c).

비-복제 형질 도입 입자는 숙주 균주 터미나아제 영역의 결실 및 파지 패키징 플라스미드 상의 상보성에 의해 생성될 수 있다.

비-복제 형질 도입 입자 기술은 결실 및 상보성에 의존하여 고유 파지 DNA 대신 리포터 DNA를 운반하는 조작된 프로파지를 생성한다. Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 형질 도입 입자는 각각 플라스미드를 포함하는 패키징이 부족한 파지 껍질로 구성되어 합성되었다: 1) 숙주 파지 유전체의 손실을 보완하기 위한 파지 패키징 유전 요소, 및 2) 발광 분석을 위한 리포터 유전자, luxAB (도 2). 숙주 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 유전체 상에서 terSL에 의해 암호화된 터미나아제 서브 유닛 및 ≤250 bp 상류 영역을 각 균주에 대해 녹아웃시키고 zeoR 선택 카세트로 교체하였다. 플라스미드의 백본은 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 숙주 균주에서 터미나아제 영역의 손실을 보완하기 위해 파지 패키징을 위해 구축되었다(도 3). 결실된 터미나아제 영역의 실제 뉴클레오티드 염기 서열은 표 2에 나타내었다.

설명	서열 번호:	서열
Abi 33 terSL 영역 결실: terS(전체), terL - 3’ 종결 코돈 전의 150 bp까지	1
Abi 49 terSL 영역 결실: terS의 58 bp 상류, terS(전체), terL - 3’ 종결 코돈 전의 92 bp까지	2
Abi 147 terSL 영역 결실: terS의 128 bp 상류, terS(전체), terL(전체)	3

각 셔틀 플라스미드 백본은 각각 대장균 및 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii)에 대한 2개의 복제 기점을 함유하였다: pCR-Blunt II-TOPO 벡터(써모 피셔 사이언티픽, CA 칼스배드 소재)에서 유래된 pUC18, 및 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus)로부터 분리된 pWH1266 플라스미드에서 유래된 pWH1277 (Hunger M, et al., 1990). 파지-패키징 플라스미드는 모든 임상적 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 분리균에서의 거의 보편적인 항생제 선택을 위해 pMQ300 플라스미드(펜실베니아 피츠버그 대학의 Robert M.Q. Shanks 교수 제공)로부터 유래된 히그로마이신 B 내성에 대해 암호화하는 hph 카세트를 함유하였다. 파지-패키징 플라스미드 p3073, p3074 및 p3075는 Abi 147, Abi 33 및 Abi 49 각각의 전장 터미나아제 서브 유닛 및 터미나아제 영역의 상류 영역 내에서 클로닝에 의해 생성되었다. 구체적으로, p3073은 Abi 147로부터의 terS ORF 및 terSL의 상류에 250 개의 염기쌍을 함유하였고; p3074는 Abi 33으로부터의 terS ORF 및 terSL의 상류에 250 개의 염기쌍을 함유하였고; p3075는 Abi 49로부터의 terS ORF 및 terSL의 상류에 150 개의 염기쌍을 함유하였다. 플라스미드 p3073은 비브리오 피셔리(Vibrio fischerii)로부터의 야생형 pBla 프로모터 구동 luxAB를 함유하였고; p3074 및 p3075는 또한 향상된 발광 효소 활성을 위해 LuxA에서 2개의 점 돌연변이, C170R 및 N264D를 갖는 비브리오 피셔리로부터의 pBla 프로모터 구동 luxAB를 함유하였다. 플라스미드 p3073, p3074 및 p3075는 luxAB의 3'말단에 삽입 된 rrnG 전사 종결인자(TT)를 가졌다. TT 영역은 OXB19 플라스미드(영국 옥스포드의 옥스포드 제네틱스 사(Oxford Genetics Ltd.))에서 유래되었다.

Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 스마티클의 칵테일은 고유한 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 임상 분리균의 패널에서 높은 포괄성 분석 결과를 산출한다.

Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 비-복제 형질 도입 입자는 파지 유도 방법에 의해 생성되고 원심 분리에 의해 3배 농축되었다. 96개의 고유한 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 임상 분리균의 패널을 2.5 시간 동안 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 스마티클과 함께 배양하기 전에 ~ 107 cfu/ml 세포 부하로 성장시켰다. 발광 반응 기질을 주입했을 때, 균주의 47%, 54% 및 59%는 각각 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 개별 형질 도입 입자에 의해 RLU 양성이었다(표 2). 칵테일로서, 82%의 균주가 RLU-양성이므로 부가적인 효과가 있었다(표 2).

	Phi 147 NRTP	Phi 33 NRTP	Phi 49 NRTP	Phi 33/49/147 NRTP 칵테일
Abi 균주패널	59% (56/95)	47% (45/95)	54% (51/95)	82% (78/95)

Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 형질 도입 입자를 파지 유도 방법에 의해 생성하고 분석에서 양성 대조군 역할을 하는 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 균주의 서브 세트를 사용하여 그람 음성 박테리아 균주의 패널에서 교차 반응성에 대해 시험하였다(도 4a). 균주 패널을 2.5 시간 동안 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 스마티클과 함께 배양하기 전에 ~ 107 cfu/ml 세포 부하로 성장시켰다. 비-아시네토박터 바우마니(A. Baumannii)에 대한 액체 분석에서는 교차 반응이 관찰되지 않았다(도 4b).

실시예 2 안정화된 패키징 플라스미드 및 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)의 생성

아시네토박터 바우마니(Abi) 패키징 플라스미드의 새로운 시리즈 구축

단일 계대 후 플라스미드를 상실한 용원성 균주 Abi33 Δ terSL::p3074에서 안정성 문제가 관찰되었다. 유사한 플라스미드 불안정성 문제는 다른 스마티클 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)의 연구에서도 관찰되었다. 상기 효과는 터미나아제 유전자의 상류 hph 프로모터로부터의 누출된 발현으로 인한 것일 수 있으며, 이로 인해 플라스미드 자가 절단 및 과도한 터미나아제 활성으로 인한 플라스미드 손실이 발생할 수 있다는 가설이 세워졌다. 특정 패키징 플라스미드의 경우, 터미나아제가 hph와 동일한 방향에 있을 때 균주가 불안정하고 스마티클은 RLU 분석에서 불량한 적용 범위를 산출하였다. 하지만, 터미나아제 방향이 hph와 반대 방향으로 벡터에서 뒤집혔을 때 균주 안정성 및 스마티클 적용 범위가 크게 향상되었다(데이터는 표시되지 않음). 따라서, hph 종결 코돈 뒤에 전사 종결인자를 추가하여 1) 균주 안정성, 2) 가능한 파지 머리 내로 플라스미드의 패키징 효율, 결과적으로 3) 스마티클 RLU 분석 범위를 개선하여 새로운 구조물 백본을 구축하였다.

빈 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 패키징 벡터 pZX057(도 5)은 하기와 같은 최적화로 구축되었다: 1) luxA 유전자는 분석에서 활성이 더 높은 효소이고 더 높은 RLU 신호를 생성하는 이중 돌연변이 luxA로 대체되었고; 2) 박테리아 전사 종결인자 T7 및 rrnG는 hph 프로모터로부터 하류 유전자의 누출 발현을 방지하기 위해 hph 유전자 다음에 클로닝되었으며; 3) 사용되지 않은 lacZ 유전자(원래 벡터의 잔류 물)를 제거하고 임의의 예기치 않은 누출 발현을 방지하기 위해 다른 양방향 이중 전사 종결인자 BBa-B0014로 대체하였다. 벡터 지도에 표시된 바와 같이 벡터 상의 2개의 클로닝 부위를 사용하여 터미나아제 유전자 영역에서 클로닝하였다.

Abi 33 패키징 벡터 pZX058(도 6)은 추가 700 bp 상류 및 270 bp 하류 서열을 갖는 전장 Abi 33 노드3 terS 및 terL 터미나아제 유전자를 클로닝 영역 1에 각각 클로닝하여 생성하였다. Abi 49 및 Abi 147 터미나아제를 클로닝 영역 1에 클로닝하는 데 기술적인 어려움이 있었으므로, 클로닝 영역 2에 터미나아제를 클로닝하여 pZX065(도 8) 및 pZX066(도 10) 구조물을 구축하였다. 구체적으로, pZX065는 전장 Abi 49 terS 및 terL에 더하여 700bp 상류 366 bp 하류 영역 서열을 각각 함유하였다. 플라스미드 pZX066은 전장 Abi 147 terS 및 terL에 더하여 414 bp 상류 및 284 bp 하류 서열을 함유하였다. 플라스미드 pZX058, pZX065 및 pZX066의 주석이 달린 뉴클레오티드 염기 서열은 도 7-I, 도 7-II, 도 7-III, 도 7-IV(서열 번호 4), 도 9-I, 도 9-II, 도 9-III, 도 9-IV(서열 번호 5) 및 도 11-I, 도 11-II, 도 11-III, 도 11-IV(서열 번호 6)에 각각 나타내었다.

상기 안정화된 패키징 플라스미드를 사용하는 새로운 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 비-복제 형질 도입 입자는 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성되었다. 발광 반응 기질을 주입했을 때, 균주의 61%, 42% 및 41%는 각각 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147 개별 형질 도입 입자에 의해 RLU 양성이었다. 칵테일로서, 78%의 균주가 RLU-양성이므로 부가적인 효과가 있었다(95개의 아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 균주 중 74개). 또한, 비-아시네토박터 바우마니(A. Baumannii) 균주와 교차 반응이 RLU로 측정할 때 칵테일로서 사용된 Abi 33, 49 및 147 스마티클 비-복제 형질 도입 입자(NRTP)로 관찰되지 않았다. 결과는 표 4에 나타내었으며, 여기서 음성 RLU는 시험된 총 95개의 장내 세균 및 그람(-) 균주의 독점성을 나타낸다. 약어는 하기와 같다: Abi(아시네토박터 바우마니), Kpn(폐렴), Eco(대장균), Ecl(엔테로박터 클로아케균), Pae(슈도모나스 에루지노사), Kox(클렙시엘라 옥시토카), Eae(엔테로박터 에어로게네스), Cfi(시트로박터 프룬디), Cko(시트로박터 코세리), Sms(세라티아 마르세센스).

종	시험 균주의 #	RLU+/-; (양성의 #)
Abi	95	+(74)
Kpn	24	-(0)
Eco	24	-(0)
Ecl	23	-(0)
Pae	16	-(0)
Kox	2	-(0)
Eae	2	-(0)
Cfi	2	-(0)
Cko	1	-(0)
Sms	1	-(0)

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ggatgtcaaa acttccaagc ccttcgccgt tggacaccgc cccccatcgc acgcacaaaa 60 aaaattccct ctcagaaaaa gttaaagcaa aaagttaaaa tcaagttaaa ggtagagcaa 120 tggcattaac agagaaaatg gaaaaatttg ctcttgccat tgttgacggc aagacaaata 180 aagaagcagc aatttcagca ggttatgcgg aaaaaactgc atccgccgca ggtgctaggt 240 tagcaaaaga tcctgaaatt attgtctata ttgaaatgtt aaaggcccaa aaagaagggc 300 gctctttaac atctaattca ccaaaagtta aacctaaaga tacacccgaa aatagtggtg 360 aagatgaaaa ccctattgag gaatttcaat ttgaaggtga tgatccttta gattttttaa 420 ttaaggtcat gaacttcaat ggcaacaagc tgccacttag aatgcaagca gcaattgcag 480 cattgcctta taaacacggg aaggttgcgg aaaaaggcaa aaaagaaact aaacaagaca 540 aggcaaagga agcgaccaga acaggaaaat acgccacatt ggacaatcag ttgccaagct 600 aactattaag aggaactttg catgcaaagt ctagaatacg aaaccgtaag tggtgaaact 660 atcactattc aaaatatcaa agatggccct tgctgtcatg actctattga aaagttgcca 720 gcaacagaaa ggttggtgaa gattacttat caatgtcgca agtgcttttc cagattttcc 780 gaagaagatt atcaattgat tgttaatcaa taaaaggttt tgtatggatc cgtaggcgat 840 acggtgcgtt ggaggaagga 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attgcgttgc 7260 gctcacgatc gtagaaatat ctatgattat cttgaagaac gcaaccctat agcagctatt 7320 gaaattgatg atttaattga agaaaagaca gatttacttg ttgataatcg actgatgggg 7380 cgcacaggca gacagaaaga tactagggag ttagtgatac atccgcatta tgtggttgta 7440 tatgacatca ctgatataat acggatactc agagtgctac acacatcgca ggagtggtca 7500 tgacttactc atgtactttg gattatttag tgttataaaa tcctgattta taaatttttt 7560 ttgttaaaaa agataaaagc cccttgcaat tgcttggggc tttaccgtaa tttatggggt 7620 acagatcttc gatactgaca tatcggcaat cgaaagcatt aaggtttgac gaccgctaat 7680 gatttcacca caggggctta atgtacctgt cttaaattct aaggttttaa ctcgctttgt 7740 caagcataga ccccaaaaat ttagccaatg tctgtaactc aatctgtcca tgtgtgggtg 7800 atgaggtaca gtgacgctag cacacatcgg aaaaacgcta ttactagggg aactgaacag 7860 agtagcggac gcaatgagta gtcatttaat tggcggttat gagcgtgttc aggcggtgct 7920 atcaatcgta atcataacag tggcagcttg atacagtgat gtcatccctg atgcgaaagc 7980 gaccgaccga cggtacatcg aatgggaata ctttagggtg atttttaaga atcgctctag 8040 ggtgagtatt tcccattcag ctctgctccc tccctctggt actttaatca 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aggaagagtc gatcgatgaa gtttggaaat 240 atttgttttt cgtatcaacc accaggtgaa actcataagc aagtaatgga tcgctttgtt 300 cggcttggta tcgcctcaga agaggtaggg tttgatacat attggacctt agaacatcat 360 tttacagagt ttggtcttac gggaaattta tttgttgctg cggctaacct gttaggaaga 420 actaaaacat taaatgttgg cactatgggg gttgttattc cgacagcaca cccagttcga 480 cagttagaag acgttttatt attagatcaa atgtcgaaag gtcgttttaa ttttggaacc 540 gttcgagggc tataccataa agattttcga gtatttggtg ttgatatgga agagtctcga 600 gcaattactc aaaatttcta ccagatgata atggaaagct tacagacagg aaccattagc 660 tctgatagtg attacattca atttcctaag gttgatgtat atcccaaagt gtactcaaaa 720 aatgtaccaa cccgtatgac tgctgagtcc gcaagtacga cagaatggct agcaatacaa 780 gggctaccaa tggttcttag ttggattatt ggtactaatg aaaaaaaagc acagatggaa 840 ctctataatg aaattgcgac agaatatggt catgatatat ctaaaataga tcattgtatg 900 acttatattt gttctgttga tgatgatgca caaaaggcgc aagatgtttg tcgggagttt 960 ctgaaaaatt ggtatgactc atatgtaaat gcgaccaata tctttaatga tagcgatcaa 1020 actcgtggtt atgattatca taaaggtcaa tggcgtgatt ttgttttaca aggacataca 1080 aacaccaatc gacgtgttga ttatagcaat ggtattaacc ccgtaggcac tcctgagcag 1140 tgtattgaaa tcattcaacg tgatattgat gcaacgggta ttacaaacat tacatgcgga 1200 tttgaagcta atggaactga agatgaaata attgcttcca tgcgacgctt tatgacacaa 1260 gtcgctcctt tcttaaaaga acctaaataa attacttatt tgatactaga gataataagg 1320 aacaagttat gaaatttgga ttattttttc taaactttca gaaagatgga ataacatctg 1380 aagaaacgtt ggataatatg gtaaagactg tcacgttaat tgattcaact aaatatcatt 1440 ttaatactgc ctttgttaat gaacatcact tttcaaaaaa tggtattgtt ggagcaccta 1500 ttaccgcagc tggtttttta ttagggttaa caaataaatt acatattggt tcattaaatc 1560 aagtaattac cacccatcac cctgtacgtg tagcagaaga agccagttta ttagatcaaa 1620 tgtcagaggg acgcttcatt cttggtttta gtgactgcga aagtgatttc gaaatggaat 1680 tttttagacg tcatatctca tcaaggcaac aacaatttga agcatgctat gaaataatta 1740 atgacgcatt aactacaggt tattgccatc cccaaaacga cttttatgat tttccaaagg 1800 tttcaattaa tccacactgt tacagtgaga atggacctaa gcaatatgta tccgctacat 1860 caaaagaagt cgtcatgtgg gcagcgaaaa aggcactgcc tttaacgttt aagtgggagg 1920 ataatttaga aaccaaagaa cgctatgcaa ttctatataa taaaacagca caacaatatg 1980 gtattgatat ttcggatgtt gatcatcaat taactgtaat tgcgaactta aatgctgata 2040 gaagtacggc tcaagaagaa gtgagagaat acttaaaaga ctatatcact gaaacttacc 2100 ctcaaatgga cagagatgaa aaaattaact gcattattga agagaatgca gttgggtctc 2160 atgatgacta ttatgaatcg acaaaattag cagtggaaaa aacagggtct aaaaatattt 2220 tattatcctt tgaatcaatg tccgatatta aagatgtaaa agatattatt gatatgttga 2280 accaaaaaat cgaaatgaat ttaccataag gatcctaaaa ttaaaggcaa tttctatatt 2340 agattgcctt tttggcgcgc ctattctaat gcataataaa tactgataac atcttatatt 2400 ttgtattata ttttgtatta tcgttgacat gtataatttt gatatcaaaa actgattttc 2460 cctctattat tttcgagatt tattttctta attctcttta acaaactaga aatattgtat 2520 atacaaaaaa ttataaataa tagatgaata gtttaattat aggtgttcat caatcgaaaa 2580 agcaacgtat cttatttaaa gtgcgttgct tttttctcat ttataaggtt aaataattct 2640 catatatcaa gcaaagtgac agagctcggt actctcggct tgaacgaatt ggcggccgcc 2700 ctgcagtgat gatgagttgg ttcaaaagta tttagaagag gatggctgaa tgacttcaaa 2760 actagttcat gtgaaagatg cagacaaagg ctctgacatc tactttgatc cacagggcct 2820 tgaaggcgcc gtttttaatt ggaatggaca gaaagattac agccaataca tttataacgc 2880 tatgttgtat atgcgaagcg gtagtttgat ttgttgtgtt gtgaatgacg atggcaagaa 2940 gaagattctt gaacatgttc aggaagcacc ataatgatgc aaaaaatcca gcaggcaggg 3000 gggatgtcaa aacttccaag cccttcgccg ttggacaccg ccccccatcg cacgcacaaa 3060 aaaaattccc tctcagaaaa agttaaagca aaaagttaaa atcaagttaa aggtagagca 3120 atggcattaa cagagaaaat ggaaaaattt gctcttgcca ttgttgacgg caagacaaat 3180 aaagaagcag caatttcagc aggttatgcg gaaaaaactg catccgccgc aggtgctagg 3240 ttagcaaaag atcctgaaat tattgtctat attgaaatgt taaaggccca aaaagaaggg 3300 cgctctttaa catctaattc accaaaagtt aaacctaaag atacacccga aaatagtggt 3360 gaagatgaaa accctattga ggaatttcaa tttgaaggtg atgatccttt agatttttta 3420 attaaggtca tgaacttcaa tggcaacaag ctgccactta gaatgcaagc agcaattgca 3480 gcattgcctt ataaacacgg gaaggttgcg gaaaaaggca aaaaagaaac taaacaagac 3540 aaggcaaagg aagcgaccag aacaggaaaa tacgccacat 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gaccaactcg cagcaattgc 5280 taagaaggtt tatgacagtg gaaagcttaa taagatcgga ctagatccat tgggcttagg 5340 cggtctttta gatggcttac ttgaggcagg aattccagag gaaagcatgt ttgctgtgcc 5400 acaaggctac aaactcatgt cctacatcct tactactgag cgcaaattgg cagaaggcaa 5460 tctgtaccat gctggacaac agctaatgac ttgggcggca ggtaatgccc gtgtcgtgat 5520 ggtcggcaat ggtatgcgaa taaccaagca agaatcaggt gttgggaaga ttgacccatt 5580 gattgccaca tttaacgcag ttgctttgat gtcaagcaat cctgagcctg ccaatcgcgt 5640 tgatattgac gaatacttag aggatgtcgt gatagcatga gtaccacaca agagccgggg 5700 ttttggtccc gcttctggtc acgattgact ggaaatacac aattaaaaaa aggcgattcg 5760 tcttatccat ttgatagtta tttgtcaccc ggtggatcgg ttgtcacacc agaaacagct 5820 ttgaaacttt ccgcagtctg ggcgtgtgta aaattaagag ctgaaactat ctcaactctt 5880 cctttacagt tgtacgacaa caataaacgt cttgctactg atcattacct ttaccgtatt 5940 ttgcacgatt cacccaatgc cgatgatagc tgacgacctt aaggataaat ttctggtaag 6000 gaggacacgt atggaagtgg gcaagttggg gaagccgtat ccgttgctga atctggcata 6060 tgtgggagta taagacgcgc agcgtcgcat caggcatttt 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gttccacgca agttttagct 8640 atggtgctaa acagaaattt gctgaaaaag aacttttcac tgaactggtt aaaatgtaag 8700 cagcctgaga gccgccaaaa attttaaaaa caaaccgcct taatcatctt caaaaaatac 8760 ctctaaaacc tcaccatttg cgttttaaga cccatatttc atcctgccct tatgttccca 8820 tgctgatagc tataaagtgt ctgtaatcgc ttcctatgac gttctaggct gttgataact 8880 tttggaacaa cgcaaaatgt taaaatcctg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 8940 cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 9000 tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 9060 gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 9120 atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 9180 ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 9240 cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 9300 tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 9360 gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 9420 aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 9480 tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 9540 aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 9600 aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 9660 ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 9720 ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaa 9768

Claims (13)

1. 박테리오파지 유전체를 포함하는 조성물로서, 상기 박테리오파지 유전체는 Abi 33, Abi 49 및 Abi 147로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리오파지로부터 유래되고, 상기 박테리오파지 유전체는 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 파괴를 함유하는, 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자는 terS 유전자, terL 유전자, 또는 terS 및 terL 유전자 둘 모두를 포함하는, 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자의 파괴는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 또는 서열 번호 3으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열의 결실을 포함하는, 조성물.
4. 아시네토박터 바우마니(A. baumannii) 세포 내 도입을 위해 리포터 유전자를 포함하는 리포터 플라스미드를 비-복제 형질 도입 입자(NRTP) 내로 패키징하는 박테리아 세포 패키징 시스템으로서:
   - 숙주 아시네토박터 바우마니(A. baumannii) 세포;
   - 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 파괴를 갖는 박테리오파지 유전체를 포함하는 숙주 아시네토박터 바우마니(A. baumannii) 세포 내의 제1 핵산 구조물로서, 상기 파괴는 상기 박테리오파지 유전체의 비-복제 형질 도입 입자(NRTP) 내로의 패키징을 막고, 상기 박테리오파지 유전체는 박테리오파지 Abi 33의 유전체, 박테리오파지 Abi 49의 유전체, 및 박테리오파지 147의 유전체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제1 핵산 구조물; 및
   - 상기 숙주 아시네토박터 바우마니(A. baumannii) 세포 내에서 상기 제1 핵산 구조물로부터 분리된 제2 핵산 구조물을 포함하며, 상기 제2 핵산 구조물은 리포터 핵산 분자를 포함하고, 상기 리포터 핵산 분자는 리포터 유전자, 및 상기 박테리오파지 유전체의 파괴를 보완하고 상기 리포터 핵산 분자의 레플리콘의 상기 비-복제 형질 도입 입자(NRTP) 내로의 패키징을 촉진하는 패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
5. 제4항에 있어서,
   패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자는 terS 유전자, terL 유전자, 또는 terS 및 terL 유전자 둘 모두를 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
   패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자의 파괴는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 또는 서열 번호 3으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열의 결실을 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 리포터 핵산 분자는 서열 번호 4, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 6으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열을 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 세포 패키징 시스템을 이용한 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)을 생성하는 방법으로서:
   a) 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 세포 패키징 시스템의 용해기를 유도하는 단계, 및
   b) 리포터 분자의 레플리콘이 상기 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)을 생성하도록 패키징되는 단계를 포함하는, 방법.
9. 제8항에 있어서,
   패키징-관련 효소 활성을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전자의 파괴는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 또는 서열 번호 3으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열의 결실을 포함하는, 방법.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 리포터 핵산 분자는 서열 번호 4, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 6으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열을 포함하는, 방법.
11. 샘플 내 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)를 검출하는 방법으로서:
    a) 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 박테리오파지 Abi 33으로부터 유래된 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs), 박테리오파지 Abi 49로부터 유래된 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs), 박테리오파지 Abi 147로부터 유래된 비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs), 또는 이들의 임의의 조합을 상기 샘플에 제공하는 단계;
    b) 검출 가능한 신호를 생성하기 위한 상기 리포터 유전자의 조건들을 제공하는 단계; 및
    c) 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)의 존재 또는 부재를 나타내기 위해 상기 검출 가능한 신호의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
12. 제11항에 있어서,
    비-복제 형질 도입 입자들(NRTPs)을 상기 샘플에 제공하기 전 또는 후에 항미생물제를 상기 샘플에 제공하고, 상기 샘플이 상기 항미생물제에 내성이 있거나 민감한 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)를 함유하는지 여부를 나타내기 위해 상기 검출 가능한 신호의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 리포터 핵산 분자는 서열 번호 4, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 6으로부터 선택된 뉴클레오티드 염기 서열을 포함하는, 방법.

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