BR112021003609A2 - produtos e composições - Google Patents

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Dmitry Samarsky
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Sirnaomics, Inc.
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Abstract

PRODUTOS E COMPOSIÇÕES. A presente invenção refere-se a desencadeamentos de RNAi inovadores que podem ser sintetizados quimicamente e usados para modular a expressão gênica dentro de células animais para estudar várias funções gênicas em laboratórios ou como um ingrediente ativo para aplicações agrícolas, veterinárias, cosméticas e/ou terapêuticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PRODUTOS E COMPOSIÇÕES”.
[0001] A presente invenção refere-se a desencadeamentos de RNAi inovadores que podem ser sintetizados quimicamente e usados para modular a expressão de gene dentro de células animais para estu- dar várias funções gênicas em laboratórios ou como um ingrediente ativo para aplicações agrícolas, veterinárias, cosméticas e/ou terapêuti- cas.
ANTECEDENTES
[0002] RNA de interferência ou RNAi é um fenômeno biológico ca- racterizado pela capacidade das moléculas de RNA de fita dupla de re- gular decrescentemente genes individuais em animais. Foi descoberto em 1998 por Craig Mello e Andrew Fire, e recebeu o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 2006 devido à promessa de oferecer um novo tipo de terapêutico. Desde 2001, quando os desencadeamentos de RNAi sintetizados quimicamente (pequenos RNAs ou siRNAs de inter- ferência) mostraram funcionar em cultura de células de mamíferos, os siRNAs foram amplamente usados para estudar várias funções de ge- nes em laboratórios de pesquisa em todo o mundo. O primeiro fármaco de RNAi, Onpattro™, foi aprovado pelo FDA em agosto de 2018 para ajudar pacientes com amiloidose ATTR hereditária. Inúmeros outros fár- macos de RNAi estão sendo desenvolvidos e testados em estudos pré- clínicos e clínicos.
[0003] Embora o RNAi prometa se tornar uma das principais novas modalidades de fármacos, existem certos desafios associados ao mesmo. Um deles é o alto custo de produção do ingrediente ativo. O desencadeamento de RNAi convencional - o RNA de interferência curto (ou siRNA) é composto por dois oligonucleotídeos de 19 a 25 nt de com- primento (totalizando cerca de 40 a 50 nucleotídeos) emparelhados um com o outro. A produção de tais moléculas requer uma síntese sofisti- cada em várias etapas, seguida, em alguns casos, por extensos proce- dimentos de purificação, resultando em custos de produção relativa- mente altos. O primeiro fármaco de RNAi, Onpattro™, custará 450.000 dólares por tratamento anualmente, e um dos fatores que contribuem para um preço tão alto provavelmente será o custo de produção do fár- maco.
SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO
[0004] A terminologia usada no presente documento tem o propó- sito de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser uma limitação da invenção. Conforme usado no presente docu- mento, o termo “e/ou” inclui qualquer e todas as combinações de um ou mais dos itens associados. Conforme usado no presente documento, as formas singulares “um”, “uma” e “o(a)” se destinam a incluir as formas plurais, bem como as formas singulares, a menos que o contexto indi- que claramente o contrário. Será ainda entendido que os termos “com- preende” e/ou “que compreende” quando usados neste relatório descri- tivo especificam a presença de recursos, etapas, operações, elementos e/ou componentes, mas não impedem a presença ou adição de um ou mais outros recursos, etapas, operações, elementos, componentes e/ou grupos dos mesmos.
[0005] A menos que definido de outra forma, todos os termos (inclu- indo termos técnicos e científicos) usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica, ao qual esta invenção pertence. Será ainda entendido que termos, tais como aqueles definidos em dicionários comumente usados, devem ser interpretados como tendo um significado que é consistente com seu significado no contexto da técnica relevante e da presente di- vulgação e não serão interpretados de forma idealizada ou sentido ex- cessivamente formal, a menos que expressamente definido no presente documento.
[0006] Ao descrever a invenção, será entendido que uma série de características, etapas, operações, elementos e/ou componentes é di- vulgada. Cada um dos mesmos tem benefício individual e cada um tam- bém pode ser usado em conjunto com um ou mais dentre, ou em alguns casos todos, os outros recursos, etapas, operações, elementos e/ou componentes divulgados. Consequentemente, por uma questão de cla- reza, esta descrição se absterá de repetir todas as combinações possí- veis dos recursos, etapas, operações, elementos e/ou componentes in- dividuais de uma forma desnecessária. No entanto, os relatórios descri- tivos devem ser lidos com o entendimento de que tais combinações es- tão inteiramente dentro do escopo da invenção.
[0007] Os novos desencadeamentos de RNAi em gancho miniaturi- zado (mxRNA) e métodos de uso dos mesmos são discutidos no pre- sente documento. Na seguinte descrição, para fins de explicação, nu- merosos detalhes específicos são apresentados a fim de fornecer uma compreensão completa da presente invenção. Será evidente, no en- tanto, para um versado na técnica que a presente invenção pode ser praticada sem esses detalhes específicos.
[0008] A presente divulgação deve ser considerada como uma exemplificação da invenção e não se destina a limitar a invenção às modalidades específicas ilustradas pelas figuras ou descritas abaixo.
[0009] A presente invenção será agora descrita com referência às figuras anexas que representam certas modalidades. A mesma apre- senta moléculas de desencadeamento de RNAi em gancho miniaturi- zado (mxRNA) que compreendem os seguintes componentes:
[0010] 1) um segmento 5' da haste em gancho (segmento A);
[0011] 2) uma alça em gancho (segmento B);
[0012] 3) um segmento 3' da haste em gancho (segmento C);
[0013] em que:
[0014] 1) o comprimento total de (A) + (B) + (C) é de 17 a 40 nucle- otídeos;
[0015] 2) (B) é de 0 a 10 nucleotídeos;
[0016] 3) (A) é 0 a 4 nucleotídeos mais longos ou 0 a 4 nucleotídeos mais curtos que (B)
[0017] 4) 17 ou mais nucleotídeos da extremidade 5' da molécula são complementares ao RNA-alvo, por exemplo, mRNA, IncRNA e/ou outras moléculas de RNA;
[0018] também (opcionalmente) em que:
[0019] os nucleotídeos internos tanto na região de fita simples quanto na região de fita dupla ou ambos são quimicamente modificados em porções de açúcar e/ou base e/ou fosfodiéster da molécula, por exemplo, com 2'OMe, 2'F, LNA, PMO, fosforotioato (PS, PS2), ou outras modificações químicas, para melhorar a propriedade desejada da molé- cula (por exemplo, para aumentar a estabilidade contra as nucleases intra e/ou extracelulares);
[0020] as extremidades da molécula são capeadas ou quimica- mente modificadas, por exemplo, com vinilfosfonato, nucleotídeos inver- tidos ou outras modificações, para melhorar a propriedade desejada da molécula (por exemplo, para aumentar a estabilidade contra as nuclea- ses intra e/ou extracelulares);
[0021] a molécula de mxRNA é conjugada a várias porções quími- cas de entrega, por exemplo, colesterol, carboidrato (GalNAc, outro), aptâmero, peptídeo, molécula pequena e/ou outro, para direcionar e fa- cilitar a entrega extra e intracelular das moléculas.
[0022] De acordo com a presente invenção, também é fornecido um conjugado para modular, preferencialmente inibir, a expressão de um gene-alvo em uma célula, em que o dito conjugado compreende um ácido nucleico fixado a um ou mais aglomerantes, em que o dito ácido nucleico não é preferencialmente um substrato para dicer, e compre- ende:
[0023] primeira, segunda e terceira porções de ácido nucleico;
[0024] em que a dita primeira porção (i) é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito do dito gene-alvo, e (ii) tem uma direcionalidade de 5' para 3', definindo, assim, as regiões 5' e 3' da dita primeira porção;
[0025] em que a dita segunda porção (i) é pelo menos parcialmente complementar à dita primeira porção e (ii) tem uma direcionalidade de 5' para 3', definindo, assim, as regiões 5' e 3' da dita segunda porção;
[0026] em que a dita primeira e a dita segunda porções dimerizam para formar um duplex pelo menos parcialmente complementar;
[0027] em que a terceira porção de ácido nucleico liga a região 3' da dita primeira porção à região 5' da dita segunda porção.
[0028] Um conjugado de acordo com a presente invenção compre- ende uma terceira porção de ácido nucleico que é pelo menos parcial- mente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito do dito gene-alvo. Além disso, um conjugado de acordo com a presente invenção pode compreender uma segunda porção de ácido nucleico que é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma por- ção do RNA transcrito do dito gene-alvo.
[0029] Preferencialmente, um conjugado de acordo com a presente invenção compreende um ou mais aglomerantes que são conjugados com a segunda porção de ácido nucleico. Adequadamente, o um ou mais aglomerantes são conjugados na região 3' da segunda porção de ácido nucleico. Alternativamente, o um ou mais aglomerantes são con- jugados na região 3' da primeira porção de ácido nucleico e/ou na região 5' da segunda porção de ácido nucleico. Uma alternativa adicional é quando o um ou mais aglomerantes são conjugados em uma ou mais regiões intermediárias das regiões 5' e 3' da primeira porção de ácido nucleico e/ou são conjugados em uma ou mais regiões intermediárias das regiões 5' e 3' da segunda porção de ácido nucleico. Ainda como outra alternativa, o um ou mais aglomerantes são conjugados em uma ou mais regiões da terceira porção de ácido nucleico.
[0030] Normalmente, o um ou mais aglomerantes são qualquer por- ção química de direcionamento de célula, como lipídios, carboidratos, aptâmeros, vitaminas e/ou peptídeos que se aglutinam à membrana ce- lular ou a um alvo específico na superfície celular. Em uma modalidade preferencial, o um ou mais aglomerantes compreendem um ou mais car- boidratos, tais como um monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeo. Ainda mais prefe- rencialmente, o um ou mais carboidratos compreendem uma ou mais porções químicas de galactose, uma ou mais porções químicas de lac- tose, uma ou mais porções químicas de N-Acetil-Galactosamina e/ou uma ou mais porções químicas de manose, tais como uma ou mais por- ções químicas de N-Acetil-Galactosamina, preferencialmente duas ou três porções químicas de N-Acetil-Galactosamina.
[0031] O um ou mais aglomerantes podem ser fixados ao ácido nu- cleico em uma configuração linear ou em uma configuração ramificada, de modo que, por exemplo, o um ou mais aglomerantes são fixados ao ácido nucleico como uma configuração biantenária ou triantenária, ou como uma configuração baseada em aglomerantes únicos em diferen- tes posições.
[0032] Um conjugado de acordo com a presente invenção compre- ende um ácido nucleico que é uma fita simples que se dimeriza, por meio de que a primeira e a segunda porções formam um duplex pelo menos parcialmente complementar. Tipicamente, o ácido nucleico tem 17 a 40 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento ou, mais preferencialmente, tem pelo me- nos 25 nucleotídeos de comprimento.
[0033] Em um conjugado de acordo com a presente invenção, a pri- meira porção de ácido nucleico tem 7 a 20 nucleotídeos de compri- mento, preferencialmente 10 a 18 nucleotídeos de comprimento, mais preferencialmente menos de 18 nucleotídeos de comprimento. Do modo similar, em um conjugado de acordo com a presente invenção, a se- gunda porção de ácido nucleico tem 7 a 20 nucleotídeos de compri- mento, preferencialmente 10 a 18 nucleotídeos de comprimento, mais preferencialmente menos de 18 nucleotídeos de comprimento. Ainda mais, é preferencial que em um conjugado de acordo com a presente invenção a terceira porção de ácido nucleico tenha 1 a 10 nucleotídeos de comprimento, tal como 4 a 9 nucleotídeos de comprimento, tal como 4, 5, 7 ou 9 nucleotídeos de comprimento.
[0034] Um conjugado de acordo com a presente invenção compre- ende ainda uma ou mais ligações entre nucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato, tais como 1 a 15 ligações entre nucleotídeos de fosforo- tioato ou fosforoditioato. Tipicamente, a uma ou mais ligações entre nu- cleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato em uma ou mais das regi- ões 5' e/ou 3' da primeira e/ou da segunda porções de ácido nucleico. Em uma modalidade preferencial, um conjugado de acordo com a pre- sente invenção compreende ligações de entre nucleotídeos de fosforo- tioato ou fosforoditioato entre pelo menos dois, preferencialmente, pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro, preferencialmente pelo menos cinco, preferencialmente pelo menos seis, preferencial- mente pelo menos sete, preferencialmente pelo menos oito, preferenci- almente pelo menos nove, preferencialmente dez, nucleotídeos adja- centes da terceira porção de ácido nucleico, dependente do número de nucleotídeos presentes na terceira porção de ácido nucleico. Além disso, um conjugado de acordo com a presente invenção pode compre- ender uma ligação entre nucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato entre cada nucleotídeo adjacente que está presente na terceira porção de ácido nucleico. Além disso, um conjugado de acordo com a presente invenção pode compreender uma ligação entre nucleotídeos de fosforo- tioato ou fosforoditioato que liga a primeira porção de ácido nucleico à terceira porção de ácido nucleico e/ou a segunda porção de ácido nu- cleico à terceira porção de ácido nucleico.
[0035] Um conjugado de acordo com a presente invenção de acordo com a presente invenção compreende ainda pelo menos um nu- cleotídeo da primeira e/ou da segunda e/ou da terceira porção de ácido nucleico que é modificada. Por exemplo, em um conjugado de acordo com a presente invenção, o um ou mais dos nucleotídeos ímpares que começam na região 5' da primeira porção de ácido nucleico são modifi- cados, e/ou em que o um ou mais dos nucleotídeos pares que começam na região 5' da primeira porção de ácido nucleico são modificados, em que tipicamente a modificação dos nucleotídeos pares é uma segunda modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos ímpares. Tipicamente, o um ou mais dos nucleotídeos ímpares que começam na região 3' da segunda porção de ácido nucleico são modificados por uma modificação que é diferente da modificação de nucleotídeos ímpares da primeira porção de ácido nucleico.
[0036] Outras características do padrão de modificação podem ser as seguintes, mas para evitar dúvidas, as seguintes declarações não são limitativas do escopo da invenção, conforme descrito no presente documento:
[0037] um ou mais dos nucleotídeos pares que começam na região 3' da segunda porção de ácido nucleico são modificados por uma modi- ficação que é diferente da modificação de nucleotídeos ímpares da se- gunda porção de ácido nucleico; e/ou
[0038] pelo menos um ou mais dos nucleotídeos pares modificados da primeira porção de ácido nucleico são adjacentes a pelo menos um ou mais dos nucleotídeos ímpares modificados diferentemente da pri- meira porção de ácido nucleico; e/ou
[0039] pelo menos um ou mais dos nucleotídeos pares modificados da segunda porção de ácido nucleico são adjacentes a pelo menos um ou mais dos nucleotídeos ímpares modificados diferentemente da se- gunda porção de ácido nucleico; e/ou
[0040] uma pluralidade de nucleotídeos adjacentes da primeira por- ção de ácido nucleico é modificada por uma modificação comum; e/ou
[0041] uma pluralidade de nucleotídeos adjacentes da segunda por- ção de ácido nucleico é modificada por uma modificação comum; e/ou
[0042] a pluralidade de nucleotídeos comumente modificados adja- centes é de 2 a 4 nucleotídeos adjacentes, preferencialmente 3 ou 4 nucleotídeos adjacentes, de modo que tipicamente a pluralidade de nu- cleotídeos comumente modificados adjacentes estão localizados na re- gião 5' da segunda porção de ácido nucleico, quando a terceira porção de ácido nucleico liga a região 3' da dita primeira porção à região 5' da dita segunda porção; e/ou
[0043] a pluralidade de nucleotídeos comumente modificados adja- centes está localizada na terceira região de ácido nucleico; e ou
[0044] uma pluralidade de nucleotídeos ímpares da primeira e/ou da segunda porções de ácido nucleico é modificada, de modo que tipi- camente a pluralidade de nucleotídeos ímpares é modificada por uma modificação comum; e/ou
[0045] uma pluralidade de nucleotídeos pares da primeira e/ou da segunda porções de ácido nucleico é modificada por uma segunda mo- dificação, de modo que, tipicamente, a pluralidade de nucleotídeos pa- res é modificada por uma segunda modificação comum; e/ou
[0046] o um ou mais dos nucleotídeos modificados da primeira por- ção de ácido nucleico não têm uma modificação comum presente no nucleotídeo correspondente da segunda porção de ácido nucleico do duplex; e/ou
[0047] o um ou mais dos nucleotídeos modificados da primeira por- ção de ácido nucleico são deslocados por pelo menos um nucleotídeo em relação a um nucleotídeo comumente modificado da segunda por- ção de ácido nucleico.
[0048] Normalmente, em um conjugado de acordo com a presente invenção, a modificação e/ou modificações são, cada uma e individual- mente, modificações de açúcar, estrutura principal ou base, e são ade- quadamente selecionadas a partir do grupo que consiste em desóxi-ti- mina 3'-terminal, 2'-0-metila, uma modificação 2'-desóxi, uma modifica- ção 2'-amino, uma modificação 2'-alquila, uma modificação morfolino, uma modificação fosforamidato, modificação do grupo fosforotioato ou fosforoditioato, uma modificação de 5' fosfato ou imitação de 5' fosfato e um derivado de colesteril ou uma modificação de grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico.
[0049] A modificação pode ser qualquer um dentre um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural que com- preende nucleotídeo.
[0050] Em uma modalidade preferencial, pelo menos uma modifica- ção é 2'-0-metila. Em uma outra modalidade preferencial, pelo menos uma modificação é 2'-F.
[0051] Em outra modalidade preferencial, os nucleotídeos em qual- quer uma das posições 2 e 14 a jusante do primeiro nucleotídeo da re- gião 5' da primeira porção de ácido nucleico não contêm modificações 2'-0-metila em porções químicas de ribose e/ou os nucleotídeos da se- gunda porção de ácido nucleico, que correspondem em posição a qual- quer um dos nucleotídeos da primeira porção de ácido nucleico em qual- quer uma das posições 9 a 11 a jusante do primeiro nucleotídeo da re- gião 5' da primeira porção de ácido nucleico, não contêm modificações 2'-0-metila em porções químicas de ribose.
[0052] Um conjugado de acordo com a presente invenção preferen- cialmente compreende adicionalmente um ou mais nucleotídeos não modificados, que podem tipicamente substituir qualquer nucleotídeo modificado como descrito anteriormente. Tais um ou mais nucleotídeos não modificados podem ser posicionados na região 5' da segunda por- ção de ácido nucleico e/ou podem ser posicionados na terceira porção de ácido nucleico em posições próximas à segunda porção de ácido nucleico.
[0053] Preferencialmente, o um ou mais, preferencialmente um, nu- cleotídeos não modificados representam o nucleotídeo ou nucleotídeos da região 5' da segunda porção de ácido nucleico, tipicamente o nucle- otídeo da segunda porção de ácido nucleico que está diretamente ligado à terceira porção de ácido nucleico, e/ou o nucleotídeo ou nucleotídeos da terceira porção de ácido nucleico proximal à região 5' da segunda porção de ácido nucleico, tipicamente o nucleotídeo da terceira porção de ácido nucleico que está diretamente ligado à segunda porção de ácido nucleico e, preferencialmente, representa qualquer um dos nucle- otídeos em qualquer uma das posições 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e/ou 25 a jusante do primeiro nucleotídeo da região 5' da primeira por- ção de ácido nucleico, preferencialmente nas posições 18, 19, 20 e/ou
21.
[0054] Em um conjugado de acordo com a presente invenção, nor- malmente todos os nucleotídeos que não os nucleotídeos não modifica- dos e/ou os nucleotídeos em qualquer uma das posições 2 e 14 a ju- sante do primeiro nucleotídeo da região 5' da primeira porção de ácido nucleico, e/ou os nucleotídeos da segunda porção de ácido nucleico, que correspondem em posição a qualquer um dos nucleotídeos da pri- meira porção de ácido nucleico em qualquer uma das posições 9 a 11 a jusante do primeiro nucleotídeo da região 5' da primeira porção de ácido nucleico, contêm modificações 2'-0-metila em porções químicas de ri- bose.
[0055] Em uma modalidade preferencial, todos os nucleotídeos ím- pares da primeira região de ácido nucleico, que começam na região 5' da primeira porção de ácido nucleico, são modificados com 2'-0-metila e todos os nucleotídeos pares da primeira região de ácido nucleico, que começam na região 5' da primeira porção de ácido nucleico, são modi- ficados com 2'-F.
[0056] Em uma modalidade particular, diferente do nucleotídeo ou nucleotídeos não modificados da segunda porção de ácido nucleico, to- dos os nucleotídeos ímpares da segunda região de ácido nucleico, que começam da região 3' da segunda porção de ácido nucleico, são modi- ficados com 2'-F, e todos os nucleotídeos pares da segunda região de ácido nucleico, que começam na região 3' da segunda porção de ácido nucleico, são modificados com 2'-0-metila. Por exemplo, uma plurali- dade de nucleotídeos comumente modificados adjacentes de 2 a 4 nu- cleotídeos adjacentes, preferencialmente 3 ou 4 nucleotídeos adjacen- tes, estão localizados a jusante do nucleotídeo ou nucleotídeos não mo- dificados da segunda porção de ácido nucleico e para os nucleotídeos restantes da segunda porção de ácido nucleico todos os nucleotídeos ímpares da segunda região de ácido nucleico, começando na região 3' da segunda porção de ácido nucleico, são modificados com 2'-F, e todos os nucleotídeos pares da segunda região de ácido nucleico, que come- çam na região 3' da segunda porção de ácido nucleico, são modificados com 2'-0-metila.
[0057] Em uma outra modalidade da presente invenção, em um conjugado como descrito no presente documento, os nucleotídeos na terceira porção de ácido nucleico são modificados em um padrão alter- nativo com 2'-0-metila, 2'-F, que começam com uma modificação 2'-0- metila adjacente à região 3' da primeira porção de ácido nucleico.
[0058] Um conjugado de acordo com a presente invenção pode ainda compreender pelo menos uma modificação de vinilfosfonato, tal como pelo menos uma modificação de vinilfosfonato na região 5' da pri- meira porção de ácido nucleico.
[0059] Em um conjugado de acordo com a presente invenção, um ou mais nucleotídeos de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a segunda porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 3' do nucleotídeo e o carbono 3' do nucleotídeo adjacente e/ou um ou mais nucleotídeos de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nu- cleico e a segunda porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 5' do nucle- otídeo e o carbono 5' do nucleotídeo adjacente.
[0060] Um conjugado de acordo com a presente invenção pode compreender ainda um ou mais nucleotídeos na região 3' de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a segunda porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 3' do nucleotídeo terminal e do carbono 3' do nucleotídeo adjacente, e/ou um ou mais nucleotídeos na região 5' de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a se- gunda porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 5' do nucleotídeo termi- nal e do carbono 5' do nucleotídeo adjacente e/ou um ou mais nucleotí- deos intermediários das regiões 3' e 5' de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a segunda porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 3' do nucleotídeo terminal e do carbono 3' do nucleotí- deo adjacente e/ou um ou mais nucleotídeos intermediários das regiões 3' e 5' de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a segunda porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 5' do nucleotídeo terminal e do carbono 5' do nucleotídeo adjacente e/ou um ou mais nu- cleotídeos de pelo menos uma da terceira porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 3' do nucleotídeo terminal e do carbono 3' do nucleotí- deo adjacente e/ou um ou mais nucleotídeos de pelo menos um dentre a terceira porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 5' do nucleotídeo terminal e do carbono 5' do nucleotídeo adjacente. Tipicamente, o nu- cleotídeo invertido 3' e/ou 5' da primeira e/ou da segunda fita é fixado ao nucleotídeo adjacente por meio de um grupo fosfato por meio de uma ligação fosfodiéster; ou o nucleotídeo invertido 3' e/ou 5' da primeira e/ou da segunda fita está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio de um grupo fosforotioato; ou o nucleotídeo invertido 3' e/ou 5' da primeira e/ou da segunda fita está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio de um grupo fosforoditioato.
[0061] Um conjugado de acordo com a presente invenção pode ter uma extremidade romba em uma extremidade. Alternativamente, um conjugado de acordo com a presente invenção pode compreender uma primeira ou segunda porção de ácido nucleico que tem uma saliência.
[0062] De acordo com a presente invenção, é ainda fornecida uma molécula de RNA de homodímero que compreende duas moléculas de ácido nucleico, conforme descrito anteriormente, em que as moléculas de ácido nucleico são aglutinadas entre si por meio de interações com- plementares, em que a primeira porção da primeira molécula interage com a segunda porção da segunda molécula e há uma terceira porção em cada molécula que gera uma estrutura protuberante intermediária da primeira e da segunda porções das respectivas moléculas de ácido nucleico.
[0063] Um conjugado ou molécula de RNA de homodímero e/ou conjugado como descrito no presente documento é direcionado a um RNA-alvo que é selecionado a partir de pelo menos um de: mRNA, In- cRNA e/ou outras moléculas de RNA.
[0064] A presente invenção compreende ainda:
[0065] Uma composição que compreende um conjugado ou molé- cula como descrito no presente documento e um excipiente fisiologica- mente aceitável;
[0066] Um conjugado ou molécula como descrito no presente docu- mento, para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio;
[0067] Uso de um conjugado ou molécula como descrito no pre- sente documento, na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio;
[0068] Um método de tratamento de uma doença ou distúrbio que compreende a administração de um conjugado ou molécula como des- crito no presente documento, a um indivíduo em necessidade de trata- mento, por exemplo, por administração subcutânea ou intravenosa ao indivíduo;
[0069] Uso de um conjugado ou molécula como descrito no pre- sente documento, para uso como um cosmético;
[0070] Uso de um conjugado ou molécula como descrito no pre- sente documento, para uso em pesquisa como ferramenta de análise de função gênica;
[0071] Um processo de preparação de um conjugado conforme des- crito no presente documento.
[0072] É também fornecido pela presente invenção um conjugado como descrito anteriormente em que o conjugado compreende uma se- quência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 15, 16,17 e 18, o ligante e a porção química GalNAc trivalente estando na extremidade 3' da porção química de ácido nucleico. Para cada uma das sequências de SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17 e 18, essas compreen- dem primeira, segunda e terceira porções de ácido nucleico como se- gue:
[0073] em que a dita primeira porção começa no início de cada SEQ ID NO e (i) é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito do dito gene-alvo (MAP4K4 neste caso), e (ii) tem um direcionalidade 5' a 3', definindo, assim, as regiões 5' e 3' da dita primeira porção;
[0074] em que a dita segunda porção (i) é pelo menos parcialmente complementar à dita primeira porção e (ii) tem uma direcionalidade de 5' para 3', definindo, assim, as regiões 5' e 3' da dita segunda porção;
[0075] em que a terceira porção de ácido nucleico liga a região 3' da dita primeira porção à região 5' da dita segunda porção,
[0076] e em que:
[0077] Para SEQ ID NO 14: A primeira porção compreende 14 nu- cleotídeos, a segunda porção compreende 14 nucleotídeos e a terceira porção compreende 5 nucleotídeos;
[0078] Para SEQ ID NO 15: A primeira porção compreende 14 nu- cleotídeos, a segunda porção compreende 14 nucleotídeos e a terceira porção compreende 4 nucleotídeos;
[0079] Para SEQ ID NO 16: A primeira porção compreende 12 nu- cleotídeos, a segunda porção compreende 12 nucleotídeos e a terceira porção compreende 7 nucleotídeos;
[0080] Para SEQ ID NO 17: A primeira porção compreende 13 nu- cleotídeos, a segunda porção compreende 13 nucleotídeos e a terceira porção compreende 4 nucleotídeos;
[0081] Para SEQ ID NO 18: A primeira porção compreende 10 nu- cleotídeos, a segunda porção compreende 10 nucleotídeos e a terceira porção compreende 9 nucleotídeos.
[0082] Para as sequências conforme estabelecido acima, a primeira e a segunda porções dimerizam para formar um duplex pelo menos par- cialmente complementar como descrito acima.
[0083] Normalmente, tais sequências compreendem ligações inter- nucleotídicas de fosforotioato ou fosforoditioato entre cada um dos nu- cleotídeos da terceira porção de ácido nucleico do mesmo e/ou nucleo- tídeos não modificados nas posições 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e/ou 25 da região 5' da primeira porção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0084] A Figura 1 mostra exemplos esquemáticos dos desencadea- mentos de RNAi em gancho miniaturizado (mxRNA™). Em cada exem- plo, o segmento A representa a porção 5' do duplex do gancho, o seg- mento B representa a alça de fita simples para o gancho, e o segmento C representa a porção 3' do duplex do gancho. As linhas grossas repre- sentam a sequência complementar a uma sequência correspondente do transcrito de RNA direcionado.
[0085] O Exemplo 1 da Figura 1 mostra esquemáticos para um dos menores mxRNA possíveis, em que o segmento A tem 7 nucleotídeos, o segmento B tem 4 nucleotídeos, o segmento C tem 7 nucleotídeos, e todos os 18 nucleotídeos são complementares ao RNA-alvo.
[0086] O Exemplo 2 da Figura 1 mostra esquemáticos para um mxRNA, em que o segmento A tem 14 nucleotídeos, o segmento B tem 4 nucleotídeos, o segmento C tem 14 nucleotídeos (32 nucleotídeos no total) e 18 nt da extremidade 5' da molécula são complementares ao RNA direcionado (linha grossa) e o triângulo na extremidade 5' da mo- lécula representa uma porção química, como uma capa, por exemplo, vinilfosfonato para aumentar a resistência contra nucleases e uma por- ção química trivalente (linhas e círculos), por exemplo GalNAc, é conju- gado por meio de ligante (linha wiggled) com a extremidade 3' da molé- cula para facilitar a entrega da molécula às células, por exemplo, hepa- tócitos in vitro e/ou in vivo.
[0087] O Exemplo 3 da Figura 1 mostra esquemáticos para um mxRNA, em que o segmento A tem 18 nucleotídeos, o segmento B tem 4 nucleotídeos, o segmento C tem 18 nucleotídeos (40 nucleotídeos no total) e os primeiros 18 nucleotídeos da extremidade 5' da molécula são complementares ao RNA-alvo (linha grossa) e a molécula inteira é qui- micamente modificada com modificações de açúcar, por exemplo 2'OMe e/ou 2'F (não mostrado) para aumentar a estabilidade da nu- clease e 2 nucleotídeos em cada extremidade da molécula e nucleotí- deos na alça são modificados nas posições de fosfodiéster, por exem- plo, fosforotioatos (estrelas), para aumentar a estabilidade da nuclease, e as porções químicas do conjugado de entrega (por exemplo, GalNAc, colesterol, outro) são fixadas à região da alça de fita simples da molé- cula.
[0088] A Figura 1 representa três exemplos das moléculas de mxRNA conforme descrito acima. A configuração de haste e alça no Exemplo 1 exemplifica uma das menores versões do mxRNA - 18 nu- cleotídeos de comprimento. Essencialmente, toda a sequência da mo- lécula é complementar ao RNA-alvo. Entende-se que em tal caso parti- cular quase extremo, a sequência alvo teria que possuir sequências pa- lindrômicas relativamente longas (7 nucleotídeos) separadas por 4 nu- cleotídeos. O Exemplo 3, em contrapartida, descreve a molécula com uma das maiores (40 nucleotídeos no total) configurações de haste e alça de mxRNA. Tal configuração é semelhante à estrutura dos shRNAs convencionais, com a importante diferença de que muito provavelmente não seriam processados dentro das células pela enzima Dicer (devido à região de fita simples no local onde seria esperado que o Dicer cli- vasse e/ou devido às modificações químicas que provavelmente seriam usadas para estabilizar a molécula contra endonucleases) para produzir moléculas de siRNA convencionais. O Exemplo 2 representa uma ver- são intermediária (entre a configuração representada no Exemplo 1 e no Exemplo 3) da configuração de haste e alça de mxRNA. Tais confi- gurações não impõem restrições à sequência de direcionamento, mas são muito mais compactas do que siRNAs e shRNAs convencionais. Entende-se que várias outras permutações no projeto de configuração de haste e alça são possíveis.
[0089] A Figura 1, em particular os Exemplos 2 e 3, também repre- senta onde certas modificações químicas e conjugações podem ser apli- cadas. Em particular, qualquer nucleotídeo (em ligação de açúcar, base e/ou fosfodiéster) da estrutura principal interna da molécula pode ser modificado com várias modificações químicas para melhorar as propri- edades da molécula (por exemplo, para aumentar a estabilidade contra as nucleases intra e extracelular). Além disso, as extremidades das mo- léculas podem ser ainda melhoradas pelas estruturas de capeamento e modificações químicas. Vários ácidos nucleicos e porções químicas de ácido não nucleico também podem ser conjugados às várias partes do mxRNA para adicionar propriedades adicionais (por exemplo, capacida- des de entrega aprimoradas e/ou direcionadas).
[0090] As Figuras 2 e 3 apresentam os gráficos dos resultados dos experimentos descritos na seção Exemplos do pedido (abaixo).
[0091] A Figura 4 representa as estruturas secundárias (2D) das moléculas de mxRNA usadas em experimentos descritos na seção Exemplos do pedido (abaixo).
[0092] As moléculas de mxRNA podem ser sintetizadas quimica- mente usando abordagens convencionais e/ou avançadas e podem ser usadas como ferramentas de pesquisa para estudar várias funções de genes em laboratórios e/ou como ingredientes ativos para aplicações agrícolas, veterinárias, cosméticas e/ou terapêuticas.
[0093] Aspectos da invenção são demonstrados pelos seguintes exemplos não limitativos.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: TRANSFECÇÃO DE DOSE ÚNICA EM CÉLULAS AML- 12
[0094] Os testes de atividade para mxRNAs versus construtos de siRNA de fita dupla convencionais que foram direcionados contra MAP4K4 foram conduzidos. As células Hep3B foram incubadas em pla- cas de 96 poços a uma densidade de 15.000 células por cada poço. Os compostos testados com este estudo estavam em uma concentração final de 50 nM. A transfecção reversa foi realizada usando RNAiMax a 0,3 µL por poço. Além dos compostos de teste, dois controles ((TTR PC) siRNA dirigido por TTR e (INT PC) siRNA dirigido por aha-1) também foram usados (Tabelas 3 e 4). A duração da incubação foi de 24 horas. Posteriormente, o mRNA foi isolado e quantificado usando um ensaio de bDNA (Quantigene 1.0/2.0). As leituras foram normalizadas para a transcrição GAPDH e a média dos quadruplicados foi determinada. Os valores das células falsamente tratadas foram estabelecidos em 1.
[0095] Um sumário dos resultados obtidos neste experimento é apresentado na Tabela 1 e Figura 2. TABELA 1: SUMÁRIO DOS RESULTADOS PARA O EXEMPLO 1
EXEMPLO 2: INCUBAÇÃO DIRETA DE DOSE ÚNICA DE COMPOS- TOS CONJUGADOS COM GalNAc EM HEPATÓCITOS PRIMÁRIOS
[0096] Hepatócitos primários de camundongo (Lote nº MC830; ThermoFisher Scientific) foram incubados em uma placa de 96 poços a uma densidade de 60.000 células por poço. Os compostos testados com este estudo foram adicionados a uma concentração final de 500 nM. Além dos compostos de teste, dois controles ((XD-12171) siRNA dirigido por TTR e (XD-00033) siRNA dirigido por aha-1 como controle negativo) também foram usados (Tabelas 3 e 4). Foi utilizado um método de trans- fecção de incubação direta (sem lipídio de transfecção). A duração da incubação foi de 72 horas. Posteriormente, o mRNA foi isolado e quan- tificado usando um ensaio de bDNA (Quantigene 1.0/2.0). As leituras foram normalizadas para GAPDH, e a média dos quadruplicados foi de- terminada. Os valores das células falsamente tratadas foram estabele- cidos em 1.
[0097] Um sumário dos resultados obtidos neste experimento é apresentado na Tabela 2 e Figura 3. TABELA 2: SUMÁRIO DOS RESULTADOS DO EXEMPLO 2 mRNA restante Descrição do construto ID de construto SEQ ID NO(s). média SD C19 23 0,28 0,02 C20 24 0,39 0,01 sem fosforotioato C21 25 0,52 0,03 C22 26 0,63 0,01 C23 27 0,99 0,08 C24 28 0,15 0,01 C25 29 0,16 0,01 com fosforotioato C26 30 0,18 0,06 C27 31 0,32 0,02 C28 32 0,69 0,04 duplex não estabilizado C15 1, 19 0,99 0,03 duplex estável V1 (PC) C16 3, 20 0,67 0,01 duplex estável V2 (PC) C17 5, 21 0,69 0,04 NC1 (parte central invertida) C18- 7, 22 0,96 0,05 NC2 (alvejando TTR) C29- 33, 34 1,23 0,05 NC3 (sem GalNAc) INT NC- XD-00033- 1,01 0,07 PC1 ALNYTTR C29+ 33, 34 0,12 0,01 PC2 AXO TTR INT PC+ XD-12171+ 0,18 0,02 “-“ Denota um controle negativo e “+” denota um controle positivo SUMÁRIO DE RESULTADOS DOS EXEMPLOS 1 E 2
[0098] Os resultados confirmam que as estruturas em gancho mini- aturizadas de oligo único (mxRNA) podem eliciar a desativação do gene-alvo se usadas com reagente de transfecção e desobstruídas com porções químicas conjugadas, como foi demonstrado anteriormente em Lapierre et al, 2011.
[0099] Demonstrou-se que as moléculas de mxRNA conjugadas com uma porção química volumosa (GalNAc, neste caso) ainda podem eliciar a desativação do gene-alvo, quando usadas com um reagente de transfecção. Esta é uma constatação nova e não trivial, uma vez que adicionar um conjugado à extremidade 3' da fita ativa poderia ter afetado a capacidade dos mxRNAs de serem reconhecidos pela maquinaria de RNAi, para entrar em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) e/ou permanecer ativo dentro do RISC.
[0100] Em seguida, os conjugados de mxRNA (conjugados com GalNAc, neste caso) demonstraram entrar nas células por meio de cap- tação mediada por receptor e produzir atividades maiores do que aque- las do siRNA convencional direcionado exatamente à mesma porção do mRNA (por exemplo, construtos mxRNA C24, C25, C26 comparados com construtos convencionais C16, C17). Esta é uma constatação nova e sem o desejo de estar vinculado a uma teoria em particular, tal melho- ria pode ser devido ao tamanho menor das moléculas de mxRNA-con- jugado (aproximadamente 32 nucleotídeos no total), se comparado com siRNAs convencionais (aproximadamente 42 nucleotídeos no total).
[0101] Finalmente, os resultados mostraram que o uso de diversos padrões de modificação química que compreendem modificações de li- gação de fosfodiéster (por exemplo, modificações de fosforotioato) e/ou modificações de açúcar (por exemplo, posições 2'OH) pode melhorar ainda mais o desempenho de mxRNAs.

Claims (74)

REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado para modular, preferencialmente inibir, a ex- pressão de um gene-alvo em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico fixado a um ou mais ligantes, em que o dito ácido nucleico não é preferencialmente um substrato para dicer e compreende: primeira, segunda e terceira porções de ácido nucleico; em que a dita primeira porção (i) é pelo menos parcialmente comple- mentar a pelo menos uma porção do RNA transcrito do dito gene-alvo, e (ii) tem uma direcionalidade de 5' para 3', definindo, assim, as regiões 5' e 3' da dita primeira porção; em que a dita segunda porção (i) é pelo menos parcialmente comple- mentar à dita primeira porção e (ii) tem uma direcionalidade de 5' para 3', definindo, assim, as regiões 5' e 3' da dita segunda porção; em que a dita primeira e a dita segunda porções dimerizam para formar um duplex pelo menos parcialmente complementar; em que a terceira porção de ácido nucleico liga a região 3' da dita pri- meira porção à região 5' da dita segunda porção.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a dita terceira porção de ácido nucleico é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito do dito gene-alvo.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que a dita segunda porção de ácido nucleico é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito do dito gene-alvo.
4. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais ligantes são conjugados à dita segunda porção de ácido nucleico.
5. Conjugado, de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zado pelo fato de que o dito um ou mais ligantes são conjugados na região 3' da segunda porção de ácido nucleico.
6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais ligantes são conjugados em uma ou mais regiões intermediárias das regiões 5' e 3' da primeira porção de ácido nucleico.
7. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais ligantes são conjugados em uma ou mais regiões intermediárias das regiões 5' e 3' da segunda porção de ácido nucleico.
8. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais ligantes são conjugados em uma ou mais regiões da terceira porção de ácido nucleico.
9. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais ligantes são qualquer porção química de direcionamento de célula, como lipí- dios, carboidratos, aptâmeros, vitaminas e/ou peptídeos que se agluti- nam à membrana celular ou a um alvo específico na superfície celular.
10. Conjugado, de acordo com a reivindicação 9, caracteri- zado pelo fato de que o dito um ou mais ligantes compreendem um ou mais carboidratos.
11. Conjugado, de acordo com a reivindicação 10, caracteri- zado pelo fato de que o dito um ou mais carboidratos podem ser um monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossa- carídeo ou polissacarídeo.
12. Conjugado, de acordo com a reivindicação 11, caracteri- zado pelo fato de que o dito um ou mais carboidratos compreendem uma ou mais porções químicas de galactose, uma ou mais porções quí- micas de lactose, uma ou mais porções químicas de N-acetil-Galacto- samina e/ou uma ou mais porções químicas de manose.
13. Conjugado, de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zado pelo fato de que o dito um ou mais carboidratos compreendem uma ou mais porções químicas N-Acetil-Galactosamina.
14. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zado pelo fato de que compreende duas ou três porções químicas N- Acetil-Galactosamina.
15. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais ligantes são fixados ao dito ácido nucleico em uma configuração linear ou em uma configuração ramificada.
16. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que o dito um ou mais ligantes são fixados ao dito ácido nucleico como uma configuração biantenária ou triantenária, ou como uma configuração baseada em aglomerantes únicos em diferen- tes posições.
17. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico é uma fita simples que se dimeriza, por meio de que a dita primeira e a dita segunda porções formam o dito duplex pelo menos parcialmente com- plementar.
18. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem 17 a 40 nucleotídeos de comprimento.
19. Conjugado, de acordo com a reivindicação 18, caracteri- zado pelo fato de que o dito ácido nucleico tem pelo menos 20 nucleo- tídeos de comprimento ou, mais preferencialmente, tem pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento.
20. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a dita primeira porção de ácido nucleico tem 7 a 20 nucleotídeos de comprimento, preferencial- mente 10 a 18 nucleotídeos de comprimento, mais preferencialmente menos de 18 nucleotídeos de comprimento.
21. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a dita segunda porção de ácido nucleico tem 7 a 20 nucleotídeos de comprimento, preferencial- mente 10 a 18 nucleotídeos de comprimento, mais preferencialmente menos de 18 nucleotídeos de comprimento.
22. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a dita terceira porção de ácido nucleico tem 1 a 10 nucleotídeos de comprimento, tal como 4 a 9 nucleotídeos de comprimento, tal como 4, 5, 7 ou 9 nucleotídeos de comprimento.
23. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais ligações entre nucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato.
24. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 23, caracterizado pelo fato de que compreende 1 a 15 ligações entre nucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato.
25. Conjugado, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma ou mais ligações entre nucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato em uma ou mais das re- giões 5' e/ou 3' da primeira e/ou da segunda porções de ácido nucleico.
26. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 23 a 25, caracterizado pelo fato de que compreende ligações entre nucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato entre pelo menos dois, preferencialmente pelo menos três, preferencialmente, pelo menos qua- tro, preferencialmente pelo menos cinco, preferencialmente pelo menos seis, preferencialmente pelo menos sete, preferencialmente pelo menos pelo menos oito, preferencialmente pelo menos nove, preferencialmente dez nucleotídeos adjacentes da terceira porção de ácido nucleico, de- pendendo do número de nucleotídeos presentes na terceira porção de ácido nucleico.
27. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 23 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende uma ligação entre nucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato entre cada nucle- otídeo adjacente que está presente na dita terceira porção de ácido nu- cleico.
28. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 27, caracterizado pelo fato de que compreende uma ligação entre nucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato que liga a primeira porção de ácido nucleico à terceira porção de ácido nucleico e/ou a se- gunda porção de ácido nucleico à terceira porção de ácido nucleico.
29. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 28, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nucleotídeo da primeira e/ou da segunda e/ou terceira porção de ácido nucleico é modificado.
30. Conjugado, de acordo com a reivindicação 29, caracteri- zado pelo fato de que um ou mais dos nucleotídeos ímpares que come- çam na região 5' da primeira porção de ácido nucleico são modificados, e/ou em que um ou mais dos nucleotídeos pares que começam na re- gião 5' da primeira porção de ácido nucleico é modificada, em que tipi- camente a modificação dos nucleotídeos pares é uma segunda modifi- cação que é diferente da modificação dos nucleotídeos ímpares.
31. Conjugado, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, ca- racterizado pelo fato de que um ou mais dos nucleotídeos ímpares que começam na região 3' da segunda porção de ácido nucleico são modi-
ficados por uma modificação que é diferente da modificação de nucleo- tídeos ímpares da primeira porção de ácido nucleico, como definido na reivindicação 30.
32. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 31, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos nucleotí- deos pares que começam na região 3' da segunda porção de ácido nu- cleico são modificados por uma modificação que é diferente da modifi- cação dos nucleotídeos ímpares da segunda porção de ácido nucleico, como definido na reivindicação 31.
33. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 32, caracterizado pelo fato de que pelo menos um ou mais dos nucleotídeos pares modificados da primeira porção de ácido nu- cleico são adjacentes a pelo menos um ou mais dos nucleotídeos ímpa- res modificados de forma diferente da primeira porção de ácido nucleico.
34. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 33, caracterizado pelo fato de que pelo menos um ou mais dos nucleotídeos de numeração par modificados da segunda porção de ácido nucleico é adjacente a pelo menos um ou mais dos nucleotídeos de numeração ímpar modificados de forma diferente da segunda porção de ácido nucleico.
35. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 34, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de nucle- otídeos adjacentes da primeira porção de ácido nucleico são modifica- dos por uma modificação comum.
36. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 35, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de nucle- otídeos adjacentes da segunda porção de ácido nucleico são modifica- dos por uma modificação comum.
37. Conjugado, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, ca-
racterizado pelo fato de que a dita pluralidade de nucleotídeos adjacen- tes comumente modificados é de 2 a 4 nucleotídeos adjacentes, prefe- rencialmente 3 ou 4 nucleotídeos adjacentes.
38. Conjugado, de acordo com a reivindicação 37, caracteri- zado pelo fato de que a dita pluralidade de nucleotídeos comumente modificados adjacentes está localizada na região 5' da segunda porção de ácido nucleico.
39. Conjugado, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, ca- racterizado pelo fato de que a dita pluralidade de nucleotídeos comu- mente modificados adjacentes está localizada na terceira região de ácido nucleico.
40. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 39, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de nucle- otídeos ímpares da primeira e/ou da segunda porções de ácido nucleico são modificados.
41. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 40, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de nucle- otídeos pares da primeira e/ou da segunda porções de ácido nucleico são modificados por uma segunda modificação.
42. Conjugado, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, ca- racterizado pelo fato de que a dita pluralidade de nucleotídeos ímpares é modificada por uma modificação comum.
43. Conjugado, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, ca- racterizado pelo fato de que a dita pluralidade de nucleotídeos pares é modificada por uma segunda modificação comum.
44. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 43, caracterizado pelo fato de que o um ou mais dos nucleo- tídeos modificados da primeira porção de ácido nucleico não têm uma modificação comum presente no nucleotídeo correspondente da se- gunda porção de ácido nucleico do duplex.
45. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 43, caracterizado pelo fato de que o um ou mais dos nucleo- tídeos modificados da primeira porção de ácido nucleico têm uma mo- dificação comum presente no nucleotídeo correspondente da segunda porção de ácido nucleico do duplex.
46. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 45, caracterizado pelo fato de que o um ou mais dos nucleo- tídeos modificados da primeira porção de ácido nucleico são deslocados por pelo menos um nucleotídeo em relação a um nucleotídeo comu- mente modificado da segunda porção de ácido nucleico.
47. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 46, caracterizado pelo fato de que a modificação e/ou modifi- cações são, cada uma individualmente, modificações de açúcar, estru- tura principal ou base e são adequadamente selecionadas a partir do grupo que consiste em desóxi-timina 3'-terminal, 2’-0-metila, uma modi- ficação 2'-desóxi, uma modificação 2'-amino, uma modificação 2’-al- quila, uma modificação morfolino, uma modificação fosforamidato, fos- forotioato ou modificação do grupo fosforoditioato, uma modificação de fosfato 5' ou mimetizador de fosfato 5' e um derivado de colesteril ou uma modificação de grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico.
48. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 47, caracterizado pelo fato de que a modificação é qualquer uma dentre um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural que compreende nucleotídeo.
49. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 48, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modifica- ção é uma modificação 2’-0-metila em uma porção química de ribose.
50. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 49, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modifica- ção é uma modificação 2'-F em uma porção química de ribose.
51. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 50, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos em qual- quer uma das posições 2 e 14 a jusante do primeiro nucleotídeo da re- gião 5' da primeira porção de ácido nucleico não contêm modificações 2’-0-metila em porções químicas de ribose.
52. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 51, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos da se- gunda porção de ácido nucleico, que correspondem em posição a qual- quer um dos nucleotídeos da primeira porção de ácido nucleico em qual- quer uma das posições 9 a 11 a jusante do primeiro nucleotídeo da re- gião 5' da primeira porção de ácido nucleico não contém modificações 2’-0-metila em porções químicas de ribose.
53. Conjugado, de acordo com a reivindicação 51 ou 52, ca- racterizado pelo fato de que os nucleotídeos em qualquer uma das po- sições 2 e 14 a jusante do primeiro nucleotídeo da região 5' da primeira porção de ácido nucleico contêm modificações 2'-F em porções quími- cas de ribose.
54. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 51 a 53, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos da se- gunda porção de ácido nucleico, que correspondem em posição a qual- quer um dos nucleotídeos da primeira porção de ácido nucleico em qual- quer uma das posições 9 a 11 a jusante do primeiro nucleotídeo da re- gião 5' da primeira porção de ácido nucleico contém modificações 2'-F nas porções químicas de ribose.
55. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 54, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais nucleotídeos não modificados.
56. Conjugado, de acordo com a reivindicação 55, caracteri- zado pelo fato de que o dito um ou mais nucleotídeos não modificados podem substituir qualquer nucleotídeo modificado, como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 55.
57. Conjugado, de acordo com a reivindicação 56, caracteri- zado pelo fato de que o dito um ou mais, preferencialmente um, nucle- otídeos não modificados representam qualquer um dos nucleotídeos em qualquer uma das posições 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e/ou 25 a jusante do primeiro nucleotídeo da região 5' da primeira porção de ácido nucleico, preferencialmente nas posições 18, 19, 20 e/ou 21.
58. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 51 a 57, caracterizado pelo fato de que todos os nucleotídeos que não os nucleotídeos não modificados e/ou os nucleotídeos em qualquer uma das posições 2 e 14 a jusante do primeiro nucleotídeo da região 5' da primeira porção de ácido nucleico, e/ou os nucleotídeos da segunda porção de ácido nucleico, que correspondem em posição a qualquer um dos nucleotídeos da primeira porção de ácido nucleico em qualquer uma das posições 9 a 11 a jusante do primeiro nucleotídeo da região 5' da primeira porção de ácido nucleico, contêm modificações 2’-0-metila em porções químicas de ribose.
59. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 58, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compre- ende pelo menos uma modificação de vinilfosfonato, tal como pelo me- nos uma modificação de vinilfosfonato na região 5' da primeira porção de ácido nucleico.
60. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 59, caracterizado pelo fato de que um ou mais nucleotídeos de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a segunda porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 3' do nucleotídeo e do car- bono 3' do nucleotídeo adjacente, e/ou um ou mais nucleotídeos de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a segunda porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 5' do nucleotídeo e do car- bono 5' do nucleotídeo adjacente.
61. Conjugado, de acordo com a reivindicação 60, caracteri- zado pelo fato de que um ou mais nucleotídeos na região 3' de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a segunda porção de ácido nucleico são um nucleotídeo invertido e estão fixados ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 3' do nucleotídeo termi- nal e do carbono 3' do nucleotídeo adjacente, e/ou um ou mais nucleo- tídeos na região 5' de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a segunda porção de ácido nucleico é um nucleotídeo inver- tido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 5' do nucleotídeo terminal e do carbono 5' do nucleotídeo adjacente, e/ou um ou mais nucleotídeos intermediários às regiões 3' e 5' de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a segunda parte por- ção de ácido é um nucleotídeo invertido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 3' do nucleotídeo terminal e do carbono 3' do nucleotídeo adjacente e/ou um ou mais nucleotídeos intermediá- rios a regiões 3' e 5' de pelo menos uma dentre a primeira porção de ácido nucleico e a segunda porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 5' do nucleotídeo terminal e do carbono 5' do nucleotídeo adjacente, e/ou um ou mais nucleotídeos de pelo menos uma da terceira porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 3' do nucleotídeo terminal e do carbono 3' do nucleotídeo adjacente e/ou um ou mais nucleotídeos de pelo me- nos uma da terceira porção de ácido nucleico é um nucleotídeo invertido e está fixado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 5' do nucle- otídeo terminal e do carbono 5' do nucleotídeo adjacente.
62. Conjugado, de acordo com a reivindicação 60 ou 61, ca-
racterizado pelo fato de que o nucleotídeo invertido está fixado ao nu- cleotídeo adjacente por meio de um grupo fosfato por meio de uma liga- ção fosfodiéster; ou o nucleotídeo invertido 3' e/ou 5' da primeira e/ou da segunda fita está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio de um grupo fosforotioato; ou o nucleotídeo invertido 3' e/ou 5' da primeira e/ou da segunda fita está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio de um grupo fosforoditioato.
63. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 62, caracterizado pelo fato de que tem extremidade romba.
64. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 63, caracterizado pelo fato de que a primeira ou a segunda porção de ácido nucleico tem uma saliência.
65. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que é uma molécula de RNA de homodímero que compreende duas moléculas de ácido nucleico, como definido na reivindicação 1, em que as ditas moléculas de ácido nucleico são ligadas entre si por meio de interações complementares, em que a primeira porção da primeira molécula interage com a segunda porção da segunda molécula e há uma terceira porção em cada molécula que gera uma estrutura protuberante intermediária da primeira e da segunda porções das respectivas moléculas de ácido nucleico.
66. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 65, caracterizado pelo fato de que o RNA-alvo é selecionado a partir de pelo menos um dentre: mRNA, IncRNA e/ou outras moléculas de RNA.
67. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 66, e um excipiente fisiologicamente aceitável.
68. Conjugado ou molécula, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio.
69. Uso de um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio.
70. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio carac- terizado pelo fato de que compreende a administração de um conju- gado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 66, a um indivíduo com necessidade de tratamento.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o conjugado é administrado por via subcutânea ou in- travenosa ao indivíduo.
72. Uso de um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que é para uso como cosmético.
73. Uso de um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que é para uso em pesquisa como ferramenta de análise de função gênica.
74. Processo, caracterizado pelo fato de que é para produzir um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
66.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023220744A2 (en) * 2022-05-13 2023-11-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded loop oligonucleotides
WO2023245126A2 (en) * 2022-06-15 2023-12-21 Sirnaomics, Inc. Products and compositions

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9074205B2 (en) * 2006-10-18 2015-07-07 Marina Biotech, Inc. Nicked or gapped nucleic acid molecules and uses thereof
EP2205740A2 (en) * 2007-10-02 2010-07-14 Rxi Pharmaceuticals Corp. Tripartite rnai constructs
EP2438168B1 (en) * 2009-06-01 2020-02-12 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
EP2454371B1 (en) * 2009-07-13 2021-01-20 Somagenics, Inc. Chemical modification of small hairpin rnas for inhibition of gene expression
EP3865576A1 (en) * 2014-12-15 2021-08-18 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Ligand-modified double-stranded nucleic acids
US10689647B2 (en) * 2015-05-08 2020-06-23 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of antithrombin 3 (AT3) by double-stranded RNA
CN113694077A (zh) * 2015-08-13 2021-11-26 索马根尼科斯公司 用于伤口愈合的短小发夹rna与微rna的组合物以及方法

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