CN113694077A - 用于伤口愈合的短小发夹rna与微rna的组合物以及方法 - Google Patents

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    • C12Y114/11002—Procollagen-proline dioxygenase (1.14.11.2), i.e. proline-hydroxylase

Abstract

伤口愈合是一个复杂的稳态过程，其中几种不同的类型协调以修复物理损伤。在如糖尿病，尤其是老年人的糖尿病的病况的病理学中包括伤口无法闭合。本文提供了用于将小RNA寡核苷酸技术应用于伤口愈合的分子、药物组合物和方法。如本文所公开的小RNA寡核苷酸方法提供了改善基础和病理性伤口愈合的治疗策略。

Description

用于伤口愈合的短小发夹RNA与微RNA的组合物以及方法
本申请是申请日为2016年08月12日、申请号为201680059575.8、发明名称为“用于伤口愈合的短小发夹RNA与微RNA的组合物以及方法”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2016年08月12日、申请号为PCT/US2016/046884)的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年8月13日提交的美国临时申请号 62/204,957的优先权，该美国临时申请通过引用以其全文并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且通过引用以其全文并入于此。在2016年8月10日创建的所述ASCII副本被命名为40220_710_601_SL.txt并且大小为91,733个字节。
背景技术
伤口愈合是一个精细的(orchestrated)生理过程，其中多种细胞类型相互作用以闭合物理损伤。在各种疾病的病理学中包括伤口愈合的失调。需要新的方法来改善这些病理环境中的伤口愈合。
发明内容
在某些实施方案中，本文公开了一种用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA)，其包含：(a) 反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎。在一些实施方案中，所述RNA转录物由Egl 9同源物1(EGLN1)基因编码，其中所述EGLN1基因，不含内含子，由选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列表示。在一些实施方案中，RNA转录物为对应于人PHD2(SEQ ID NO.1)的转录物。在一些实施方案中，RNA转录物为对应于小鼠Phd2的转录物(SEQ ID NO.2) 的转录物。在一些实施方案中，所述sshRNA靶向人PHD2(SEQ ID NO.1) 和小鼠Phd2(SEQ ID NO.2)二者。在一些实施方案中，所述sshRNA由反义序列、有义序列、环区域、可选的突出端序列和可选的缀合物部分组成。在一些实施方案中，环区域选自直接连接、1个核苷酸和2个核苷酸长度。在一些实施方案中，所述突出端序列为约1个核苷酸至约2 个核苷酸。在一些实施方案中，所述缀合物部分为可检测标记。在一些实施方案中，所述反义序列的长度为约15个核苷酸至约19个核苷酸。在一些实施方案中，所述反义序列的长度为约16个核苷酸至约19个核苷酸。在一些实施方案中，所述反义序列与所述PHD2转录物约60％互补至100％互补。在一些实施方案中，所述反义序列与所述PHD2转录物约80％互补至100％互补。在一些实施方案中，所述有义序列的长度为约10个核苷酸至约19个核苷酸。在一些实施方案中，所述有义序列的长度为约11个核苷酸至约19个核苷酸。在一些实施方案中，所述有义序列与所述反义序列约80％互补至100％互补。在一些实施方案中，至少一个核苷酸包含化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰使 shRNA在生物流体中的稳定性提高至少约20％。在一些实施方案中，所述化学修饰使shRNA在生物流体中的稳定性提高约1％至约10000％。在一些实施方案中，所述化学修饰为糖修饰。在一些实施方案中，所述糖修饰选自：2’-O-甲基、2'-H和2'-F。在一些实施方案中，所述sshRNA 由选自SEQ ID NO:5-8、11-31、49-325的序列表示。
在某些实施方案中，本文公开了包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂。在一些实施方案中，所述miR-210由SEQ ID NO.3表示。在一些实施方案中，所述 miRNA拮抗剂包含与由SEQ ID NO.3表示的miR-210约60％至100％互补的序列。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂将miR-210的量或活性降低约1％至约99.9％。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂将miR-210的量或活性降低约10％至约99.9％。在一些实施方案中，至少一个核糖核苷酸包含化学修饰。在一些实施方案中，每个核糖核苷酸包含化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰为糖修饰。在一些实施方案中，所述糖修饰包含2’-O-甲基修饰、LNA修饰、DNA 修饰或2'-F修饰。在一些实施方案中，所述糖修饰包含2’-O-甲基修饰、2’-H、LNA修饰、DNA修饰或2’-F修饰。在一些实施方案中，所述糖修饰为2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述糖修饰为LNA 修饰。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂包含硫代磷酸酯核苷酸间连接。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂包含骨架修饰。在一些实施方案中，骨架修饰选自C3间隔区或ZEN。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂包含在每个位置处的2’-O-甲基修饰和在5’- 端和3’-端二者的连续残基处的3个硫代磷酸酯核苷酸间连接。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂包含在每个位置处的硫代磷酸酯连接和在位置1、3、4、6、7、9、10、12、13和15处的2’-O-甲基修饰以及在位置2、5、8、11和14处的LNA修饰。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂包含在每个位置处的2’-O-甲基修饰和处于位置1 和2之间以及在3’-端处的ZEN修饰。在一些实施方案中，所述修饰将miRNA抑制活性降低约0.0000000001％至约50％。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂由选自SEQ ID NO:32-43、326-328的序列表示。
在某些实施方案中，本文公开了一种用于增加成熟miR-21的稳态水平的pre-miRNA模拟物，其包含：(a)有义序列；(b)反义序列；以及(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述成熟miR-21由SEQ ID NO.4表示。在一些实施方案中，所述有义序列和反义序列为约60％至100％互补。在一些实施方案中，所述环区域由直接连接组成，或由1-2个核苷酸或核苷酸部分组成。在一些实施方案中，所述pre-miRNA模拟物还包含约1个核苷酸至约2个核苷酸的突出端区域。在一些实施方案中，所述pre-miRNA模拟物具有至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰使miRNA介导的抑制活性降低约0.0000000001％至约 50％。在一些实施方案中，所述pre-miRNA模拟物使成熟miRNA的稳态水平增加约1％至约10000％。在一些实施方案中，所述pre-miRNA 模拟物由选自SEQ ID NO:44-48的序列表示。
在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及至少一种选自以下项的RNA：(a) 用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA (sshRNA)(该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和 (b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于 19个碱基对的茎)；(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210 的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂；以及(c)用于增加成熟miR- 21的稳态水平的pre-miRNA模拟物(该pre-miRNA模拟物包含：(a) 有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度)。在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA)，该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交的反义序列。在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及微RNA(miRNA)拮抗剂，该miRNA拮抗剂包含能够与miR- 210杂交并抑制miR-210的反义链。在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及用于增加成熟miR-21的稳态水平的pre-miRNA模拟物，该pre-miRNA模拟物包含：(a)有义序列；(b)反义序列；以及(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述短小发夹RNA(sshRNA)具有与PHD2转录物约60％互补至100％互补的反义序列。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂包含与由 SEQ ID NO.3表示的miR-210约60％至100％互补的序列。在一些实施方案中，所述pre-miRNA模拟物具有约60％至100％互补的有义序列和反义序列。在一些实施方案中，所述药学上可接受的基底为网状物或敷料。在一些实施方案中，所述网状物为分层网状物。
在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及选自以下项的RNA的组合：(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA (sshRNA)(该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和 (b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于 19个碱基对的茎)；(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂；和(c)用于增加成熟miR-21 的稳态水平的pre-miRNA模拟物(该pre-miRNA模拟物包含：(a) 有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度)。在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及包含以下项的RNA的组合：(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2) 的短小发夹RNA(sshRNA)(该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎)；以及(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂。在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及包含以下项的RNA的组合：(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA)(该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎)；和(c)用于增加成熟miR-21稳态水平的pre-miRNA模拟物(该pre- miRNA模拟物包含：(a)有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度)。在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及包含以下项的RNA的组合：(b)包含能够与miR-210 杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂，以及(c) 用于增加成熟miR-21的稳态水平的pre-miRNA模拟物，该pre-miRNA 模拟物包含：(a)有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度。在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及包含以下项的RNA的组合：(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA)(该短小发夹RNA (sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎)；(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA) 拮抗剂；以及(c)用于增加成熟miR-21的稳态水平的pre-miRNA模拟物(该pre-miRNA模拟物包含：(a)有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度)。在一些实施方案中，所述短小发夹RNA(sshRNA)具有与PHD2转录物约60％互补至100％互补的反义序列。在一些实施方案中，所述 miRNA拮抗剂包含与由SEQ ID NO.3表示的miR-210约60％至100％互补的序列。在一些实施方案中，所述pre-miRNA模拟物具有约60％至100％互补的有义序列和反义序列。在一些实施方案中，所述药学上可接受的基底为网状物或敷料。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于局部给药。
在一些实施方案中，所述网状物为分层网状物。在一些实施方案中，所述药学上可接受的基底通过逐层(LbL)制造而形成。LbL累积形成薄膜，该薄膜由带相反电荷的材料的交替层形成。层的形成可以包括选自浸没、旋涂、喷雾、电磁或流体的技术。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于局部给药。在一些实施方案中，所述分层网状物可以在水性环境中为可降解的。所述分层网状物可能与伤口共形。在一些实施方案中，逐层膜包括LayerFormTM涂层。所述 LayerFormTM涂层可以选自具有各种释放特性的涂层，从而以对受试者而言的最佳速率释放本文公开的寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文公开了用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括施用治疗有效量的选自以下的组合物：(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA) (该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎)；(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂；(c)用于增加成熟miR-21稳态水平的 pre-miRNA模拟物(该pre-miRNA模拟物包含：(a)有义序列；(b) 反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度)；以及它们的组合。在一些实施方案中，所述伤口为慢性伤口。在一些实施方案中，所述伤口为非愈合性伤口。在一些实施方案中，所述受试者患有糖尿病。在一些实施方案中，所述伤口为皮肤伤口。在一些实施方案中，所述方法包括局部施用所述组合物。在一些实施方案中，所述方法包括敷料，其中所述敷料包含所述组合物。
在某些实施方案中，本文公开了选自以下项的RNA：(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA (sshRNA)(该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和 (b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于 19个碱基对的茎)；(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210 的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂；(c)用于增加成熟miR-21的稳态水平的pre-miRNA模拟物(该pre-miRNA模拟物包含：(a)有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为 2个或更少核苷酸的长度)；以及它们的任何组合，用于在治疗动物或人的伤口的方法中使用。在一些实施方案中，本文公开了用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA)，其包含：(a)能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交的反义序列；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎，用于在治疗动物或人的伤口的方法中使用。在一些实施方案中，本文公开了包含能够与miR- 210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂，用于在治疗动物或人的伤口的方法中使用。在一些实施方案中，本文公开了用于增加成熟miR-21的稳态水平的pre-miRNA模拟物，其包含： (a)有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度，用于在治疗动物或人的伤口的方法中使用。
在某些实施方案中，本文公开了选自以下项的RNA：(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA (sshRNA)(该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和 (b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于 19个碱基对的茎)；(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210 的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂；(c)用于增加成熟miR-21稳态水平的pre-miRNA模拟物(该pre-miRNA模拟物包含：(a)有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2 个或更少核苷酸的长度)；以及它们的任何组合，用于治疗受试者的伤口。在一些实施方案中，本文公开了用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA)，其包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎，用于治疗受试者的伤口。在一些实施方案中，本文公开了包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂，用于治疗受试者的伤口。在一些实施方案中，本文公开了用于增加成熟miR-21稳态水平的pre-miRNA模拟物，其包含：(a)有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度，用于治疗受试者的伤口。
在某些实施方案中，本文公开了一种试剂盒，其包含：(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA) (该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎)；(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂；和(c)用于增加成熟miR-21稳态水平的 pre-miRNA模拟物(该pre-miRNA模拟物包含：(a)有义序列；(b) 反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度)。
在某些实施方案中，本文公开了用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括使细胞与治疗有效量的选自以下项的组合物相接触： (a)用于抑制含脯氨酰羟化酶域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA (sshRNA)(该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和 (b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于 19个碱基对的茎)；(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210 的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂；(c)用于增加成熟miR-21稳态水平的pre-miRNA模拟物(该pre-miRNA模拟物包含：(a)有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2 个或更少核苷酸的长度)；以及它们的组合。在某些实施方案中，本文公开了用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括使细胞与治疗有效量的包含用于抑制含脯氨酰羟化酶域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA)的组合物相接触，该短小发夹RNA(sshRNA) 包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2 的RNA转录物杂交。在某些实施方案中，本文公开了用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括使细胞与治疗有效量的包含微RNA (miRNA)拮抗剂的组合物相接触，所述微RNA(miRNA)拮抗剂包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链。在某些实施方案中，本文公开了用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括使细胞与治疗有效量的包含用于增加成熟miR-21稳态水平的pre-miRNA 模拟物的组合物相接触，该pre-miRNA模拟物包含：(a)有义序列； (b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度。在某些实施方案中，本文公开了用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括使细胞与治疗有效量的组合物相接触，该组合物包含(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2) 的短小发夹RNA(sshRNA)(该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a) 反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎)；和(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂。在某些实施方案中，本文公开了用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括使细胞与治疗有效量的组合物相接触，该组合物包含(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA)(该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎)；和(c)用于增加成熟miR-21稳态水平的pre-miRNA模拟物(该pre- miRNA模拟物包含：(a)有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度)。在某些实施方案中，本文公开了用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括使细胞与治疗有效量的组合物相接触，该组合物包含(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂；和(c)用于增加成熟miR-21稳态水平的pre-miRNA模拟物，该 pre-miRNA模拟物包含：(a)有义序列；(b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度。在某些实施方案中，本文公开了用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括使细胞与治疗有效量的组合物相接触，该组合物包含：(a)用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA) (该短小发夹RNA(sshRNA)包含：(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2质的RNA转录物杂交；和(b)有义序列，其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎)；(b)包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链的微RNA(miRNA)拮抗剂；以及(c)用于增加成熟miR-21稳态水平的pre-miRNA模拟物(该pre-miRNA模拟物包含：(a)有义序列； (b)反义序列；和(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度)。在一些实施方案中，所述短小发夹RNA(sshRNA) 具有与PHD2转录物约60％互补至100％互补的反义序列。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂包含与由SEQ ID NO.3表示的miR- 210约60％至100％互补的序列。在一些实施方案中，所述pre-miRNA 模拟物具有约60％至100％互补的有义序列和反义序列。在一些实施方案中，所述伤口为慢性伤口。在一些实施方案中，所述伤口为非愈合性伤口。在一些实施方案中，所述受试者患有糖尿病。在一些实施方案中，所述伤口为皮肤伤口。在一些实施方案中，所述细胞为角质形成细胞。在一些实施方案中，所述细胞为成纤维细胞。在一些实施方案中，所述方法包括局部施用所述组合物。在一些实施方案中，所述方法包括敷料，其中敷料包含所述组合物。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案进行阐述的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：
图1图示了示例性HIF-1α伤口愈合网络。
图2A-图2B图示了响应于用干扰RNA(RNAi)分子的处理， PHD2转录物的表达。图2A图示了用渐增量的靶向PHD2的sshRNA (SG302)或siRNA(SG303)或对照sshRNA(SG221c，杂乱的非特定序列)转染的人胚肾293FT细胞中人PHD2的表达。图2B图示了用渐增量的靶向PHD2的sshRNA(SG400和SG402)、靶向PHD2 的siRNA(SG403)或对照sshRNA(SG221c，杂乱的非特定序列) 转染的小鼠NIH3T3成纤维细胞中小鼠PHD2的表达。
图3A至图3C图示了响应于用RNAi分子的处理，HIF-1α途径的测量结果。图3A图示了在人胚肾293FT细胞中的萤光素酶报道基因测定的结果，该293FT细胞用在含有HIF-1α应答元件的启动子控制下的萤火虫萤光素酶(f-Luc)的质粒或组成型表达海肾萤光素酶(r-Luc)和靶向PHD2的单个sshRNA(SG300、SG301或SG302)的质粒共转染，或用对照sshRNA(NSCsshRNA)。图3B图示了人胚肾 293FT细胞中HIF-1α和核纤层蛋白(Lamin protein)的Western印迹研究。图3C图示了用渐增量的SG302转染的人胚肾293FT细胞中 VEGF(泳道1、4、7、10、13、16和19)、HSP90(泳道2、5、8、 11、14、17和20)和HSP70(泳道3、6、9、12、15、18和21)的 qRT-PCR。
图4A-图4C图示了响应于用RNAi分子的处理，PHD2转录物的表达。图4A图示了用渐增量的SG302或靶向PHD2的修饰的 sshRNA(SG302m1)转染的人原代正常人表皮角质形成细胞(NHEK) 中人PHD2转录物的qRT-PCR。图4B图示了用渐增量的SG402、靶向PHD2的修饰的sshRNA(SG402m1)或杂乱对照sshRNA(SG402- scr＝杂乱的非特定序列)转染的小鼠NIH3T3成纤维细胞中小鼠Phd2 转录物的qRT-PCR。图4C图示了用渐增量的靶向PHD2的未修饰的sshRNA(SG404)或SG402m1转染的小鼠NIH3T3成纤维细胞中小鼠PHD2(mPHD2)转录物的qRT-PCR。
图5A-图5F图示了响应于用RNAi分子的处理的细胞因子水平。图5A图示了在未用抑制剂处理、用聚肌苷/胞嘧啶(polyI:C)、 SG302或SG302m1处理的细胞中IFN-β的qRT-PCR测定。图5B图示了在未用抑制剂处理、用polyI:C、SG302或SG302m1处理的细胞中IL-6的qRT-PCR测定。图5C图示了在未用抑制剂处理、用polyI:C、 SG302或SG302m1处理的细胞中TNF-α的qRT-PCR测定。图5D图示了在未用抑制剂处理、用polyI:C、SG402、SG402m1或SG404处理的细胞中IFN-β的qRT-PCR。图5E图示了在未用抑制剂处理、用 polyI:C、SG402、SG402m1或SG404处理的细胞中IL-6的qRT-PCR 测定。图5F图示了在未用抑制剂处理、用polyI:C、SG402、SG402m1 或SG404处理的细胞中TNF-α的qRT-PCR测定。
图6图示了RNAi分子在血清中的稳定性。
图7A-图7J图示了miRNA拮抗剂的设计，以及响应于用RNAi 分子或miRNA拮抗剂的处理，PHD2转录物的表达、miR-210微RNA (miRNA)的表达和miR-210报道基因的活性。图7A图示了miR- 210miRNA拮抗剂的可能的修饰模式。图7A按照出现顺序分别公开了SEQ ID NO3和329。图7B图示了用以下物质转染的人HaCaT角质形成细胞中人PHD2转录物的qRT-PCR：无抑制剂；靶向人PHD2 的sshRNA(SG302)；对照sshRNA(ssh-NSC)；SG302和LNA修饰的miR-210，miRNA拮抗剂(SG302+LNA210)；SG302和2’-O- 甲基修饰的miR-210miRNA拮抗剂(SG302+2’-O-甲基210)；ssh- NSC和LNA修饰的对照miRNA拮抗剂(ssh-NSC+LNA-NSC)； LNA210；2’-O-甲基210；和LNA-NSC。图7C图示了用以下物质转染的人HaCaT角质形成细胞中miR-210miRNA的miRNA qRT-PCR (miR-qRT-PCR)：无抑制剂；SG302；ssh-NSC；SG302+LNA210；SG302+2’-O-甲基210；ssh-NSC+LNA-NSC；LNA210；2’-O-甲基210；和LNA-NSC。图7D图示了在无抑制剂条件下或用miR-210模拟物转染的人HaCaT角质形成细胞中miR-210报道基因的萤光素酶测定。图7E图示了用以下物质处理的人HaCaT角质形成细胞中miR-210报道基因的萤光素酶测定：无抑制剂(第1个柱)；CoCl2(第2个柱)； CoCl2和浓度渐增的DNA修饰的miR-210miRNA拮抗剂(DNA210；第3-6个柱)；CoCl2和浓度渐增的miR-210miRNA拮抗剂(RNA210；第7-10个柱)；CoCl2和浓度渐增的2’-O-甲基修饰的miR-210miRNA 拮抗剂(2’-O-甲基210；第11-14个柱)；CoCl2和浓度渐增的LNA 修饰的miR-210miRNA拮抗剂(LNA210；第15-18个柱)；以及CoCl2和浓度渐增的对照miRNA拮抗剂(NSC；第19-22个柱)。图7F图示了用渐增量的靶向人PHD2的sshRNA(SG302)和对照sshRNA (SG221c＝杂乱的非特定序列)转染的人原代角质形成细胞中人 PHD2转录物的qRT-PCR。图7G图示了用渐增量的靶向人PHD2的sshRNA(SG302)和对照sshRNA(SG221c＝杂乱的非特定序列)转染的人原代角质形成细胞中miR-210的qRT-PCR。图7H图示了用渐增量的靶向小鼠PHD2的sshRNA(SG404)转染的NIH-3T3细胞中小鼠PHD2转录物的qRT-PCR。图7I图示了用渐增量的靶向小鼠PHD2 的sshRNA(SG404)转染的NIH-3T3细胞中miR-210的qRT-PCR。图7J图示了单独的以及与靶向PHD2的SG302 sshRNA和antimiR- 210(SG603)组合的PHD2和miR-210在HaCaT细胞中的相对表达。
图8A至图8C图示了响应于用miRNA拮抗剂的处理的细胞因子水平。图8A图示了用以下物质处理的MRC-5肺成纤维细胞中IFN- β的qRT-PCR：无抑制剂；polyI:C；DNA修饰的miR-210miRNA拮抗剂(210DNA anti)；miR-210miRNA拮抗剂(210RNA anti)；2’- O-甲基修饰的miR-210miRNA拮抗剂(210 2’-O-甲基anti)；LNA修饰的miR-210miRNA拮抗剂(210LNAanti)；和LNA修饰的对照 miRNA拮抗剂(210NSC(LNA))。图8B图示了用以下物质处理的细胞中IL-6的qRT-PCR：无抑制剂；polyI:C；210DNA anti；210RNA anti；210 2’-O-甲基anti；210LNA anti；和210NSC(LNA)。图8C 图示了用以下物质处理的细胞中TNF-α的qRT-PCR：无抑制剂； polyI:C；210DNA anti；210RNA anti；210 2’-O-甲基anti；210LNA anti；和210NSC(LNA)。
图9图示了响应于用RNAi分子的处理，PHD2转录物的表达。
图10A-图10F图示了响应于用RNAi分子或miRNA拮抗剂的处理的经时伤口闭合。图10A图示了逐层组(LbL)、A6K、HiPerFect 和对照治疗组中在25天内相对于原始伤口面积的百分比。图10B图示了在LbL、A6K、HiPerFect和对照治疗组中的伤口闭合前天数。图 10C图示了未治疗、SG404、SG603和SG221c(杂乱的非特定序列) 治疗组中在25天内相对于原始伤口面积的百分比。图10D图示了在每个治疗组中的伤口闭合前天数。图10E图示了未治疗的或对照 sshRNA(SG221c)或SG404 sshRNA治疗组的LbL局部治疗在第7 天的荧光染色的代表性图像。图10F图示了每个治疗组的vWF染色的计算值(积分密度)。
图11A-图11D图示了响应于用RNAi分子的处理，PHD2转录物的表达。图11A图示了用1nM或10nM的下列物质转染的人肾 293FT细胞中人PHD2转录物的qRT-PCR：无抑制剂；被设计成靶向人PHD2的sshRNA(SG302、SG304-SG309)；和被设计成靶向小鼠 PHD2的sshRNA(SG400-SG402)；以及对照sshRNA(NSC)。图 11B图示了用渐增量的被设计成靶向小鼠PHD2的sshRNA(SG404) 或被设计成靶向人PHD2的修饰sshRNA(SG302m1)转染的小鼠 NIH3T3成纤维细胞中小鼠PHD2(mPHD2)转录物的qRT-PCR。图 11C图示了用渐增量的被设计成靶向人PHD2或小鼠PHD2的sshRNA (SG312和SG314-SG316)或被设计成靶向人PHD2的修饰的sshRNA(SG302m1)转染的人HaCaT角质形成细胞中人PHD2(hPHD2)转录物的qRT-PCR。图11D图示了用渐增量的被设计成靶向人PHD2 或小鼠PHD2的sshRNA(SG312和SG314-SG316)或被设计成靶向人PHD2的修饰的sshRNA(SG302m1)转染的小鼠NIH3T3成纤维细胞中小鼠PHD2(mPHD2)转录物的qRT-PCR。
图12A-图12B图示了响应于用RNAi分子和miRNA拮抗剂的处理的经时细胞划痕闭合。图12A图示了用以下物质转染的人HaCaT 角质形成细胞在24小时(24h)、48h和72h时的划痕闭合百分比：靶向人PHD2的sshRNA(SG302)和LNA-修饰的miR-210miRNA拮抗剂(SG302+LNA210)；SG302和2’-O-甲基修饰的miR-210miRNA 拮抗剂(SG302+2’-O-甲基210)；以及对照sshRNA(ssh-NSC)和 LNA修饰的对照miRNA拮抗剂(ssh-NSC+LNA-NSC)。图12B提供了用SG302+LNA210、SG302+2’-O-甲基210和ssh-NSC+LNA-NSC 转染的人HaCaT角质形成细胞在0小时(0h)、24h和48h时的划痕伤口的代表性图像。
图13A-图13F图示了pre-miRNA模拟物的设计。图13A至图 13E图示了miR-21的pre-miRNA模拟物的设计并分别公开了SEQ ID NO 44-48。图13F图示了用浓度渐增的以下物质处理的人293FT细胞中miR-21报道基因的萤光素酶测定：SG701(图13A)、SG702(图13B)、SG703(图13C)、SG703(第二次重复)(图13C)、SG704 (图13D)、miRIDIAN miR-21模拟物(Dharmacon，阳性对照)和 cel-67模拟物(Dharmacon，miRIDIAN miRNA模拟物阴性对照#1)。
图14A-图14B图示了用pre-miRNA模拟物处理的细胞中的 GFP阳性细胞数目。图14A图示了在转染后10、12、14和16天时模拟组、miRIDIAN组和Somagenics组中Oct4-GFP阳性集落的平均 (Ave)数目。图14B图示了在一段时间内在种子突变体处理组、 MiRIDIAN处理组和Somamics处理组中GFP阳性细胞相对于用对照载体转染的细胞的百分比。
图15图示了响应于用RNAi分子的处理，LBL-PHD2的经时摄取。
具体实施方式
本文公开了在治疗有需要的受试者的伤口中单独或组合使用的寡核苷酸。本文公开的寡核苷酸包括短小发夹RNA(sshRNA)、微 RNA(miRNA)拮抗剂和pre-miRNA模拟物。这些寡核苷酸改变RNA 的活性和/或表达。
伤口愈合是一个精细的生理过程，其中多种细胞类型相互作用以闭合物理损伤。在各种疾病的病理学中包括伤口愈合的失调。目前，伤口处理和愈合对于患有糖尿病(DM)的人类患者而言是非常关心的问题。由于周围神经病变——DM的并发症，伤口如足部溃疡可能经常被糖尿病患者忽视。因此需要新的方法来改善这些病理环境中的伤口愈合。
伤口愈合是复杂且动态的生物学过程，具有至少三个重叠期： 1)炎症期，其特征在于血管收缩、血小板聚集、血凝块形成和吞噬作用，其通常发生在最初损伤或受伤的前2-5天；2)增殖期，其特征在于肉芽形成(例如，成纤维细胞铺设胶原床)、血管生成(例如，新血管生长)、收缩(例如，伤口边缘拉到一起)和上皮形成，其通常发生在从最初损伤或受伤起的2天-3周；和3)重塑期，其中形成新的胶原蛋白以提供遍及整个伤口的拉伸强度(从最初损伤或受伤起的 3周-2年)。成功的伤口处理策略应该寻求经过有效的炎症期和增殖期的快速伤口闭合，带来具有最小化的感染风险的有效重塑期。
伤口愈合涉及几种生物途径和机制，其中任何一种均可以由本文公开的寡核苷酸靶向。然而，本文例示了涉及含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)(一种由Egl 9同源物1(EGLN1)基因编码的酶)的途径。它也被称为低氧诱导因子脯氨酰羟化酶2(HIF-PH2)。 PHD2对于靶向低氧诱导因子1α(HIF-1α)以进行多泛素化和随后的降解是关键的。在常氧条件下，PHD2羟化由VHL(一种用于引入泛素残基的泛素化信号)识别的细胞质HIF-1α中的特定脯氨酸残基。泛素化的HIF-1α通过蛋白酶体途径迅速降解。在低氧条件下，PHD2 保持无活性状态，并且因此HIF-1α变得稳定并转位至细胞核。它与 ARNT二聚化以结合大量基因启动子中的HRE元件。在与HRE结合后，HIF-1α/ARNT复合体募集CBP/p300以激活基因表达。PHD2的敲减(knockdown)导致在常氧条件下HIF-1α水平升高。HIF-1α激活多种通过刺激细胞存活、运动性和增殖、血管生成、祖细胞募集和再上皮化而增强整体伤口愈合的因子，包括但不限于VEGF、EPO、PDGF、 PLGF、VEGF-r1、ANG-1、ANG-2、iNOS、IGF2、TGF-β、PAI-1、SDF-1、TFR和TF-r。
有效的伤口愈合需要多种因子以时间和组织特异性的方式发挥其单独的作用。在这个过程中任何因素的失败都会阻碍愈合。例如，在正常的伤口愈合情况下，HSP、PDGF、FGF和VEGF在皮肤受伤 24小时内诱导，并且最终在7-14天内从这种升高的蛋白质合成水平下降至基础水平。然而，在慢性伤口中，这些蛋白质的表达得以延迟或抑制。因此，这些因子的诱导或活性增加可能是有益的。在伤口愈合过程中，多种HSP以特定的时间和空间方式表达。相比于仅提供单种HSP，广谱HSP的生物诱导可能是促进伤口愈合的更好方法。由于伤口愈合涉及几个关键的分子途径和细胞类型，所以使用多管齐下的方法来调节一系列生物分子和过程以促进伤口愈合活性的整体提高。
本发明涉及用于进行RNA干扰(RNAi)、miRNA介导的抑制和抑制miRNA的寡核苷酸、药物组合物、多核苷酸载体和方法。寡核苷酸的非限制性实例包括短干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA (shRNA)、短小发夹RNA(sshRNA)、pre-miRNA模拟物、miRNA 拮抗剂。在一些实施方案中，所述寡核苷酸为RNAi剂。RNAi剂的非限制性实例包括短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短小发夹RNA(sshRNA)和RNAi双链体如pre-miRNA模拟物。
寡核苷酸
本文公开了既可单独又可组合用于治疗有需要的受试者的伤口的寡核苷酸。这些寡核苷酸可以通过各种作用机制来改变RNA的活性和/或表达。本文公开的寡核苷酸包括RNAi剂如短小发夹RNA (sshRNA)和pre-miRNA模拟物，以及RNAi拮抗剂如微RNA (miRNA)拮抗剂。
短小发夹RNA(sshRNA)与传统的shRNA的不同之处在于它们具有足够短(19个碱基对或更短)的茎，以使得它们丧失作为Dicer 底物的资格。由于与普通shRNA相比，sshRNA不能通过Dicer进行处理，因此它们必须通过独立于Dicer的机制进行处理。sshRNA与普通shRNA的不同之处还在于环长度可以更短，从而赋予其稳定性而不丧失活性。sshRNA在未经过Dicer的事先处理的情况下主要作为完整的分子装载入含Argonaute(Ago)的复合物中，并且在没有事先切割环的情况下通过Ago2介导切割发夹的随从(passenger)臂而激活。sshRNA优于传统shRNA的优势可能包括但不限于制备成本降低、随从链的脱靶效应较低、对核酸内切酶的稳定性和抗性提高、免疫刺激活性较低和效力增加。本文公开的sshRNA可以是化学合成的。化学合成的sshRNA也可以称为“合成sshRNA”或“合成shRNA”或“短合成shRNA”。化学合成的sshRNA可以含有以精确的修饰模式修饰的核苷酸和/或骨架，它们在免疫刺激潜能降低的情况下提高了功效。
sshRNA通常抑制信使RNA的表达或活性并且是双链RNA，而miRNA拮抗剂通常抑制内源miRNA的表达或活性并且是单链的。
Pre-miRNA模拟物是合成的miRNA前体，意味着它们尚未加工成成熟miRNA。Pre-miRNA模拟物为发夹双链体(双链)RNA。本文公开的pre-miRNA模拟物可以具有比天然存在的miRNA前体更短的茎和/或更小的环区域。这可能使pre-miRNA模拟物不易受核酸内切酶降解的影响。例如，通常，天然存在的miRNA及其前体具有4 个或更多核苷酸的环区域。本文公开的pre-miRNA模拟物可以具有2 个或更少核苷酸的环区域。本文公开的pre-miRNA模拟物可以具有由 2个核苷酸或1个核苷酸组成的环区域。本文公开的pre-miRNA模拟物可以具有由2个核苷酸或1个核苷酸组成的环区域。本文公开的 pre-miRNA模拟物可以具有由直接连接组成的环区域。本文公开的 pre-miRNA模拟物可以具有长度为2个核苷酸、1个核苷酸或零个核苷酸的环区域。本文公开的pre-miRNA模拟物可以具有单个茎，其中所述茎的长度为19bp或更短。本文公开的pre-miRNA模拟物可以具有单个茎，其中所述茎的长度为10bp至19bp。本文公开的pre-miRNA 模拟物可以在有义链的末端或反义链的末端上包含不与环区域毗邻的突出端区域。本文公开的pre-miRNA模拟物可以仅包含单个突出端区域。
已经发现将pre-miRNA模拟物而不是成熟miRNA引入细胞对于提高内源miRNA的RNAi活性更有效。因此，本文公开的寡核苷酸提供了抑制(经由sshRNA和pre-miRNA模拟物)和提高(经由 miRNA拮抗剂)信使RNA表达和活性的手段。
虽然本文公开的寡核苷酸主要包含RNA，但这些寡核苷酸还可以包含一些修饰的核糖核苷酸或核糖核苷酸置换，使得其他核酸也得以掺入。这些修饰的核糖核苷酸也可以被称为具有化学修饰的核糖核苷酸。修饰的核糖核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、锁定核酸(LNA) 和肽核酸(PNA)、非核酸或其任何组合。
虽然本文公开的寡核苷酸可以包含修饰、置换、非核苷酸、核苷酸部分、缀合物部分等，但本文公开的寡核苷酸中的大多数核苷酸或核苷酸部分可能是未修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，至少 30％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。在一些实施方案中，至少35％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。在一些实施方案中，至少40％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。在一些实施方案中，至少45％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。在一些实施方案中，至少50％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。在一些实施方案中，至少51％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。在一些实施方案中，至少55％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。在一些实施方案中，至少60％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。在一些实施方案中，至少65％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。在一些实施方案中，至少70％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。在一些实施方案中，至少75％的寡核苷酸由未修饰的核糖核苷酸组成。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸至少55％为RNA。在一些实施方案中，所述寡核苷酸至少60％为RNA。在一些实施方案中，所述寡核苷酸至少70％为RNA。在一些实施方案中，所述寡核苷酸至少 80％为RNA。在一些实施方案中，所述寡核苷酸至少90％为RNA。在一些实施方案中，所述寡核苷酸至少95％为RNA。
shRNA、sshRNA和pre-miRNA模拟物是包含有义序列、环区域和反义序列的含有单分子核酸的多核苷酸，其中所述有义序列和反义序列至少部分互补。在一些实施方案中，所述有义序列和反义序列可以为约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约 90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
在一些实施方案中，所述有义序列和反义序列为至少约60％到至少约95％互补、至少约65％到至少约95％互补、至少约70％到至少约95％互补、至少约75％到至少约95％互补、至少约80％到至少约 95％互补。
在一些实施方案中，所述反义序列或有义序列各自独立地具有约10个核苷酸、约11个核苷酸、约12个核苷酸、约13个核苷酸、约14个核苷酸、约15个核苷酸、约16个核苷酸、约17个核苷酸、约18个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约21个核苷酸、约22个核苷酸、约23个核苷酸、约24个核苷酸、约25个核苷酸、约26个核苷酸、约27个核苷酸、约28个核苷酸、约29个核苷酸或约30个核苷酸、约31个核苷酸、约32个核苷酸、约33个核苷酸、约34个核苷酸、约35个核苷酸、约36个核苷酸、约37个核苷酸、约38个核苷酸、约39个核苷酸、约40个核苷酸、约41个核苷酸、约42个核苷酸、约43个核苷酸、约44个核苷酸、约45个核苷酸、约46个核苷酸、约47个核苷酸、约48个核苷酸、约49个核苷酸或约50个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，所述反义序列或有义序列可以为约10个核苷酸至约11个核苷酸、约11个核苷酸至约12个核苷酸、约12个核苷酸至约13个核苷酸、约13个核苷酸至约14个核苷酸、约14个核苷酸至约15个核苷酸、约15个核苷酸至约16个核苷酸、约16个核苷酸至约17个核苷酸、约17个核苷酸至约18个核苷酸、约18个核苷酸至约19个核苷酸、约19个核苷酸至约20个核苷酸、约20个核苷酸至约21个核苷酸、约21个核苷酸至约22个核苷酸、约22个核苷酸至约23个核苷酸、约23个核苷酸至约24个核苷酸、约24个核苷酸至约25个核苷酸、约25个核苷酸至约26个核苷酸、约26个核苷酸至约27个核苷酸、约27个核苷酸至约28个核苷酸、约28个核苷酸至约29个核苷酸、约29个核苷酸至约30个核苷酸。
在一些实施方案中，所述shRNA、sshRNA或pre-miRNA模拟物具有直接连接有义序列和反义序列的环区域。所述直接连接有义序列和反义序列的环区域也可称为具有零个核苷酸的环。在一些实施方案中，所述shRNA、sshRNA或pre-miRNA模拟物具有包含零个核苷酸的环区域。在一些实施方案中，所述环区域具有1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸、15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22 个核苷酸、23个核苷酸或24个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，小环区域赋予对核酸内切酶降解的抗性。所述小环区域可以具有约零个核苷酸、约1个核苷酸或约2个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述sshRNA由有义链、环区域、反义链和可选的一个或多个缀合物部分组成，其中所述有义链具有10-19个核苷酸的长度，所述环区域具有2个或更少核苷酸的长度，并且所述反义链具有10-19个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述 sshRNA由有义链、环区域、反义链和可选的一个或多个缀合物部分组成，其中所述有义链具有10-19个核苷酸的长度，所述环区域具有少于2个核苷酸的长度，并且所述反义链具有10-19个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，所述环区域可以包含非核苷酸部分。所述环区域可以包含约1个非核苷酸部分至约2个非核苷酸部分、约2个非核苷酸部分至约3个非核苷酸部分、约3个非核苷酸部分至约4个非核苷酸部分、约4个非核苷酸部分至约5个非核苷酸部分、约5个非核苷酸部分至约6个非核苷酸部分、约6个非核苷酸部分至约7个非核苷酸部分、约7个非核苷酸部分至约8个非核苷酸部分、约8个非核苷酸部分至约9个非核苷酸部分、约9个非核苷酸部分至约10 个非核苷酸部分、约10个非核苷酸部分至约11个非核苷酸部分、约 11个非核苷酸部分至约12个非核苷酸部分、约12个非核苷酸部分至约13个非核苷酸部分、约13个非核苷酸部分至约14个非核苷酸部分、约14个非核苷酸部分至约15个非核苷酸部分、约15个非核苷酸部分至约16个非核苷酸部分、约16个非核苷酸部分至约17个非核苷酸部分、约17个非核苷酸部分至约18个非核苷酸部分、约18 个非核苷酸部分至约19个非核苷酸部分、约19个非核苷酸部分至约 20个非核苷酸部分、约20个非核苷酸部分至约21个非核苷酸部分、约21个非核苷酸部分至约22个非核苷酸部分、约22个非核苷酸部分至约23个非核苷酸部分或约23个非核苷酸部分至约24个非核苷酸部分的非核苷酸部分。
在一些实施方案中，所述shRNA、sshRNA或pre-miRNA模拟物具有由以下部分组成的环区域：1个核苷酸或非核苷酸部分；2个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；3个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；4个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；5个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；6个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；7个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；8个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；9个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；10个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；11个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；12个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；13个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；14个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；15个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；16个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；17个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；18个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；19个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；20个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；21个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；22个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；23个核苷酸、非核苷酸部分或其组合；或24个核苷酸、非核苷酸部分或其组合。如本文所用的术语核苷酸和非核苷酸部分可以互换使用，除非另有说明。
在一些实施方案中，所述环区域的序列可以包括与靶标无关的核苷酸残基。在一些实施方案中，所述环的核苷酸选自：rA、dA、rC、 dC、rG、dG、rU、dU、rT和dT，其中r为包含核糖的核苷酸；d为包含脱氧核糖的核苷酸；A为包含腺嘌呤碱基的核苷酸；C为包含胞嘧啶碱基的核苷酸；G为包含鸟苷碱基的核苷酸；U为包含尿嘧啶碱基的核苷酸；而T为包含胸腺嘧啶碱基的核苷酸。在一些实施方案中，环序列选自：5'-rUrU-3'、5'-rTrU-3'、5'-rUrT-3'、5'-dUdU-3'、5'-dTdU- 3'、5'-dUdT-3'、5'-rTrT-3'和5'-dTdT-3'。
在一些实施方案中，所述环区域包含脱氧核糖核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸间连接、2’-O-烷基修饰、非核苷酸单体或可逆连接或其组合。在一些实施方案中，该可逆连接为二硫键。在一些实施方案中，所述2’-O-烷基修饰为2’-O-甲基修饰。
本文公开的寡核苷酸的反义序列可以基本互补于信使RNA (mRNA)、并非mRNA的RNA，或者编码或非编码DNA序列。 mRNA的非限制性实例包括5'-甲基鸟苷加帽(capped)的3'-聚腺苷酸化的mRNA；5'-甲基鸟苷加帽的去腺苷酸化的mRNA；去帽的3'- 聚腺苷酸化的mRNA；去帽的去腺苷酸化的mRNA；P-体相关的 mRNA；应激颗粒相关的mRNA；胞质mRNA；和内质网相关的mRNA。非mRNA类RNA的非限制性实例包括转运RNA(tRNA)、核糖体 RNA(rRNA)、异核RNA(hnRNA)、Piwi诱导型RNA(piRNA)、负链病毒RNA和正链病毒RNA。
当反义序列与靶转录物基本互补时，RNAi剂对于该靶转录物而言是特异性的。基本互补可以为约80％至约85％互补、约85％至约 90％互补、约90％至约95％互补、约95％至约96％互补、约96％至约 97％互补、约97％至约98％互补、约98％至约99％互补或约99％至 100％互补。
pre-miRNA模拟物的有义序列可以包含与天然存在的miRNA 具有5'至3'同一性的序列。该有义序列可以包含与天然存在的miRNA 具有约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或100％同一性的序列。该有义序列可以包含与天然存在的 miRNA具有约60％至约99％、约65％至约99％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约 99％的5'至3'同一性的序列。
pre-miRNA模拟物的反义链与pre-miRNA模拟物的有义链具有 5'至3'互补性。该反义链可以与pre-miRNA模拟物的有义链具有约 60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约 91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或100％的5'至3'互补性。该反义链可以与pre-miRNA模拟物的有义链具有约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约81％、约81％至约82％、约82％至约83％、约83％至约84％、约84％至约85％、约85％至约86％、约86％至约 87％、约87％至约88％、约88％至约89％、约89％至约90％、约90％至约91％、约91％至约92％、约92％至约93％、约93％至约94％、约94％至约95％、约95％至约96％、约96％至约97％、约97％至约 98％或约98％至约100％的5'至3'互补性。
在一些实施方案中，所述siRNA、shRNA、sshRNA或pre-miRNA 模拟物在5'端或3'端上不具有突出端或具有约1个核苷酸、约2个核苷酸、约3个核苷酸、约4个核苷酸、约5个核苷酸、约6个核苷酸、约7个核苷酸、约8个核苷酸、约9个核苷酸、约10个核苷酸、约 11个核苷酸或约12个核苷酸的突出端区域。在一些实施方案中，所述siRNA、shRNA、sshRNA或pre-miRNA模拟物可以在5'端或3'端上具有约1个核苷酸至约2个核苷酸、约2个核苷酸至约3个核苷酸、约3个核苷酸至约4个核苷酸、约4个核苷酸至约5个核苷酸、约5个核苷酸至约6个核苷酸、约6个核苷酸至约7个核苷酸、约7 个核苷酸至约8个核苷酸、约8个核苷酸至约9个核苷酸、约9个核苷酸至约10个核苷酸、约10个核苷酸至约11个核苷酸或约11个核苷酸至约12个核苷酸的突出端区域。该突出端区域的核苷酸可以是未修饰的，或者可以含有一个或多个修饰。突出端修饰的非限制性实例包括糖的2'位如卤素或O-烷基取代、胆固醇或α-生育酚的修饰以及磷酸基团的修饰如硫代磷酸修饰。突出端区域的核苷酸可以为核糖核酸、脱氧核糖核酸或其任何组合。
在一些实施方案中，所述shRNA、sshRNA或pre-miRNA模拟物包含具有碱基对错配或突起的RNA。有义序列可以与靶转录物相同，或通过错配、插入或缺失而与靶转录物具有约1个核苷酸、约2 个核苷酸、约3个核苷酸、约4个核苷酸或约5个核苷酸的差异。
miRNA拮抗剂是包含与成熟miRNA互补的序列的含有单分子核酸的多核苷酸。所述miRNA拮抗剂可以包括RNA、DNA、LNA、 PNA、一个或多个2’-O-甲基修饰、硫代磷酸酯核苷酸间连接、ZEN修饰和非核酸及其任何组合。miRNA拮抗剂的非限制性实例包括 antagomiR、全DNA anti-miR、全RNA anti-miR和LNA anti-miR。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂可具有约7个核苷酸、约8个核苷酸、约9个核苷酸、约10个核苷酸、约11个核苷酸、约12个核苷酸、约13个核苷酸、约14个核苷酸、约15个核苷酸、约16个核苷酸、约17个核苷酸、约18个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约21个核苷酸、约22个核苷酸、约23个核苷酸、约24个核苷酸、约25个核苷酸、约26个核苷酸、约27个核苷酸、约28个核苷酸、约29个核苷酸、约30个核苷酸、约31个核苷酸、约32个核苷酸、约33个核苷酸、约34个核苷酸、约35个核苷酸、约36个核苷酸、约37个核苷酸、约38个核苷酸、约39个核苷酸、约40个核苷酸、约41个核苷酸、约42个核苷酸、约43个核苷酸、约44个核苷酸、约45个核苷酸、约46个核苷酸、约47个核苷酸、约48个核苷酸、约49个核苷酸或约50个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂包含与成熟miRNA约 60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补的序列。
在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂包含与成熟miRNA约 60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约 100％、约80％至约100％、约85％至约100％或约90％至约100％互补的序列。
本文公开的RNAi剂的靶标可以是编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的RNA转录物。作为非限制性实例，PHD2可以为人PHD2、小鼠PHD2、猴PHD2、牛PHD2、犬PHD2或在任何需要伤口愈合治疗的动物中表达的PHD2。本文公开的RNAi剂的靶标可以是由EGLN1同源物编码的RNA转录物。所述EGLN1同源物可以与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2至少约70％、至少约75％、至少约 80％、至少约85％或至少约90％同源。在本文用于描述氨基酸序列或核酸序列时，相对于参考序列的术语“同源的”，“同源性”或“同源性百分比”可以使用由Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264- 2268,1990，如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877,1993中所修正的)所描述的公式来确定。将此类公式结合到Altschul等人(J.Mol. Biol.215:403-410,1990)的局部序列比对基本检索工具(BLAST)程序中。可以使用到本申请的申请日为止最新版本的BLAST来确定序列的同源性百分比。
在一些实施方案中，EGLN1选自人EGLN1(SEQ ID NO.1)和小鼠EGLN1(SEQ IDNO.2)。在一些实施方案中，RNAi剂被设计为靶向人EGLN1(SEQ ID NO.1)和小鼠EGLN1(SEQID NO.2)二者的转录物。在一些实施方案中，sshRNA被设计为靶向人EGLN1(SEQ ID NO.1)的转录物。在一些实施方案中，sshRNA被设计为靶向小鼠 EGLN1(SEQ ID NO.2)的转录物。在一些实施方案中，sshRNA被设计为靶向人EGLN1(SEQ ID NO.1)和小鼠EGLN1(SEQ IDNO.2) 二者的转录物。
靶向PHD2的RNAi剂可以将PHD2转录物的量减少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约 50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约 97％、约98％、约99％、约99.5％或约99.9％。
靶向PHD2的RNAi剂可将PHD2转录物的量减少约10％至约 99.9％、约10％至约99％、约20％至约99％、约30％至约99％、约40％至约99％、约50％至约99％、约55％至约99％、约60％至约99％、约65％至约99％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％。
在一些实施方案中，RNAi介导的PHD2消耗可以增加HIF-1α蛋白和/或HIF-1α靶基因表达的量。HIF-1α靶基因的非限制性实例包括VEGF、HSP90和HSP70。靶向PHD2的RNAi剂可以将HIF-1α蛋白和/或HIF-1α靶基因表达的量增加约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约 100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％、约1,000％、约2,000％、约3,000％、约4,000％、约5,000％、约6,000％、约7,000％、约8,000％、约9,000％或约10,000％。
靶向PHD2的RNAi剂可以将HIF-1α蛋白和/或HIF-1α靶基因表达的量增加约10％至约10,000％、约20％至约10,000％、约30％至约10,000％、约40％至约10,000％、约50％至约10,000％或约100％至约10,000％。
本文公开了分别被设计为拮抗和模拟天然存在的miRNA的 miRNA拮抗剂和pre-miRNA模拟物。在一些实施方案中，所述pre- miRNA模拟物用于“提高”成熟miRNA的表达。在一些实施方案中，天然存在的miRNA或成熟miRNA可以选自miR-210(SEQ ID NO.3) 和miR-21(SEQ ID NO.4)。在一些实施方案中，所述天然存在的 miRNA或成熟miRNA为miR-210(SEQID NO.3)。在一些实施方案中，所述天然存在的miRNA或成熟miRNA为miR-21(SEQ IDNO.4)。
pre-miRNA模拟物(在本文中也称为pre-miRNA模拟物)可以使成熟miRNA的稳态水平增加约1％、约5％、约10％、约20％、约 30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％、约1000％、约2000％、约3000％、约4000％、约5000％、约6000％、约7000％、约8000％、约9000％或约10000％。
pre-miRNA模拟物可使成熟miRNA的稳态水平增加约1％至约 5％、约5％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约 70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％、约100％至约 200％、约200％至约300％、约300％至约400％、约400％至约500％、约500％至约600％、约600％至约700％、约700％至约800％、约800％至约900％、约900％至约1000％、约1000％至约2000％、约2000％至约3000％、约3000％至约4000％、约4000％至约5000％、约5000％至约6000％、约6000％至约7000％、约7000％至约8000％、约8000％至约9000％或约9000％至约10000％。
miRNA拮抗剂可以将miRNA的量或活性降低约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约 45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约 96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或约99.9％。
miRNA拮抗剂可以将miRNA的量或活性降低约1％至约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约 25％、约25％至约30％、约30％至约35％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％、约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约 80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约91％、约91％至约92％、约92％至约93％、约93％至约94％、约94％至约95％、约95％至约96％、约96％至约97％、约97％至约98％、约98％至约99％、约99％至约99.5％或约99.5％至约99.9％。
本文公开了包含修饰的寡核苷酸。修饰可以包括对本文公开的寡核苷酸的碱基或骨架的化学修饰。对寡核苷酸的修饰可以改善寡核苷酸在细胞中、在体外、在体内或在受试者中的活性。活性的非限制性实例包括活性增加、半衰期延长、细胞摄取增加、对细胞区室的靶向增加、转录物的脱靶抑制降低和改变的免疫刺激活性。活性增加的非限制性实例包括RNAi活性增加、miRNA介导的抑制活性增加和 miRNA抑制活性增加。活性可以包括在生物流体中的稳定性提高。生物流体的非限制性实例包括血浆、血清、唾液、痰、粪便、母乳、粘液、汗液、泪液、尿液、精液、阴道分泌物、胰液、胆汁、脓液和关节液。特征可以包括改变的免疫刺激活性。免疫刺激活性的非限制性实例包括干扰素-β(IFN-β)的表达、白细胞介素-6(IL-6)分泌、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌。
活性的提高可以为约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约 200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％、约1000％、约2000％、约3000％、约4000％、约5000％、约6000％、约7000％、约8000％、约9000％或约10000％。
活性的降低可以为约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约 60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约 99％、约99.5％或约99.9％。
在一些实施方案中，对寡核苷酸的修饰降低了寡核苷酸的脱靶效应。在一些实施方案中，对寡核苷酸的修饰将寡核苷酸的脱靶效应降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％、约1000％、约2000％、约 3000％、约4000％、约5000％、约6000％、约7000％、约8000％、约9000％或约10000％。
在一些实施方案中，对寡核苷酸的修饰可以引起RNAi活性、 miRNA介导的抑制活性、miRNA抑制活性、分子半衰期、在生物流体中的稳定性、细胞摄取或靶向细胞区室的增加。所述RNAi活性、 miRNA介导的抑制活性、miRNA抑制活性、分子半衰期、在生物流体中的稳定性、细胞摄取或靶向细胞区室的增加可以为约10％、约 20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％、约1000％、约2000％、约3000％、约4000％、约 5000％、约6000％、约7000％、约8000％、约9000％或约10000％。
修饰的非限制性实例包括修饰的核苷酸、修饰的核苷酸间连接、非核苷酸、脱氧核苷酸、受约束的骨架修饰和核苷酸类似物。核苷酸修饰可以包括对核苷酸的碱基、对核苷酸的糖或对核苷酸的磷酸基团的修饰。在sshRNA、miRNA拮抗剂或pre-miRNA模拟物内的任何核苷酸均可得以修饰。在一些实施方案中，所述修饰仅针对有义序列、仅针对反义序列或仅针对环区域。在一些实施方案中，所述修饰处于有义序列、反义序列、环区域或其组合中。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含缀合物部分。在一些实施方案中，该缀合物部分可以为可检测的标记，如放射性标记、荧光标记、质量标记、转铁蛋白和胆固醇基。在一些实施方案中，小RNA 可以通过缀合特定部分而靶向某些器官，例如通过缀合甘露糖残基而靶向肝脏。
在一些实施方案中，所述缀合物部分可以增强本发明分子的递送、检测、功能、特异性或稳定性。所述缀合物部分的非限制性实例包括氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、聚合物、核苷酸和多核苷酸或其任何组合。在一些实施方案中，所述缀合物部分可以连接至shRNA、sshRNA或pre-miRNA模拟物的有义或反义序列或环区域。在一些实施方案中，所述缀合物部分可以在shRNA、sshRNA 或pre-miRNA模拟物的有义或反义序列的5'或3'端处连接。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸的缀合物部分或修饰包含烷基基团。该烷基基团可以是饱和的、不饱和的、取代的或未取代的。在一些实施方案中，该烷基基团包含为直链、支链、链烷基(alkanyl)、烯基、炔基、环状、杂环、芳基或杂芳基的烃链，其中任一个被取代或未被取代。在一些实施方案中，该烷基包含选自以下的官能团：醚、酯、酰胺、胺、羰基、酮、乙酸酐、氨基甲酸酯、硫醚、碳酸酯、砜、卤化物、硫醇、醇、硫酯、硫代磷酸酯(phosphothiorate)、磷酸酯、偶氮、酮基、醛、羧基、硝基、亚硝基、腈、咪唑、吗啉代、吡咯烷基、肼基、羟基氨基、异氰酸酯、氰酸酯、亚砜、硫化物、二硫化物、环烷基、环烯基、环炔基、环杂烷基、环杂烯基、环杂炔基、芳基和杂芳基，其中任一个被取代或未被取代。烷基基团的非限制性实例包括1个碳原子、约2个碳原子、约3个碳原子、约4个碳原子、约5 个碳原子、约6个碳原子、约7个碳原子、约8个碳原子、约9个碳原子、约10个碳原子、11个碳原子、约12个碳原子、约13个碳原子、约14个碳原子、约15个碳原子、16个碳原子、约17个碳原子、约18个碳原子、约19个碳原子、约20个碳原子、21个碳原子、约 22个碳原子、约23个碳原子、约24个碳原子、约25个碳原子、26 个碳原子、约27个碳原子、约28个碳原子、约29个碳原子和约30 个碳原子的取代和未取代的基团。
本发明的核苷酸可以包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰或类似物。核苷酸的非限制性实例包括腺嘌呤(A)、次黄嘌呤(Hy)、黄嘌呤(Xt)、鸟嘌呤(G)、肌苷(I)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)、5SICS、NaM、辫苷(Q)、嘌呤、嘧啶及其衍生物、类似物或修饰。核苷酸类似物包括在碱基、糖或磷酸的化学结构中具有修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，核苷酸修饰是对核苷酸的碱基的修饰。修饰的碱基是指已经通过置换或添加一个或多个原子或基团而得以修饰的核苷酸碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷和辫苷。核苷酸碱基修饰的非限制性实例包括5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺修饰和5-溴尿嘧啶的取代。修饰类型的非限制性实例包括烷基化、卤化、硫醇化、胺化、酰胺化和乙酰化的碱基或其任何组合。修饰的碱基的非限制性实例包括5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2′-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3- 甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷、5-甲基胸腺嘧啶、5-羟基胞苷、 5-甲酰基胞苷、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2,2-二甲基鸟苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、脱氮核苷酸如7-脱氮腺苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫代尿苷、其它硫代碱基如2-硫代尿苷和4-硫代尿苷以及2-硫代胞苷、二氢尿苷、假尿苷、古嘌苷、萘基共轭碱基和取代的萘基共轭碱基、N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修饰的苯基基团如氨基苯酚或2,4,6- 三甲氧基苯、作为G-钳核苷酸的修饰胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟基烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化核苷酸。
在一些实施方案中，对核苷酸的修饰为糖的修饰或用非核糖基糖类似物替代糖。替代糖的非限制性实例包括甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖和4-硫代核糖。对糖的修饰可以发生在1'位、 2'位、3'位、4'位、5'位或其任何组合处。在一些实施方案中，糖的修饰处于糖的2'位处。2'糖修饰的非限制性实例包括用H、OR、R、F、 Cl、Br、I、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN替代2'-OH，其中R为烷基基团。在一些实施方案中，所述2'糖修饰选自：2'-O-甲基、2'-O- 乙基、2'-O-丙基、2'-O-异丙基、2'-O-丁基、2'-O-异丁基、2'-O-乙基- O-甲基(-OCH2CH2OCH3)和2'-O-乙基-OH(-OCH2CH2OH)。在一些实施方案中，所述2'糖修饰为甲基基团。所述2'氧修饰可以发生在有义序列、反义序列或环区域的核苷酸上。
在一些实施方案中，核苷酸修饰可以是磷酸基团的修饰。磷酸基团修饰的非限制性实例包括甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和肽。
在一些实施方案中，核苷酸修饰为3'帽结构，如反向的脱氧胸苷。
在一些实施方案中，修饰为非核苷酸修饰剂，如N,N-二乙基-4- (4-硝基萘-1-基偶氮)-苯胺(ZEN)或C3间隔区(丙二醇)。可以将 ZEN修饰置于两个核苷酸之间的内部位置或末端。
本文公开的寡核苷酸可以不具有修饰，或者可以具有约1个核苷酸、约2个核苷酸、约3个核苷酸、约4个核苷酸、约5个核苷酸、约6个核苷酸、约7个核苷酸、约8个核苷酸、约9个核苷酸、约10 个核苷酸、约11个核苷酸、约12个核苷酸、约13个核苷酸、约14 个核苷酸、约15个核苷酸、约16个核苷酸、约17个核苷酸、约18 个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约21个核苷酸、约22 个核苷酸、约23个核苷酸、约24个核苷酸、约25个核苷酸、约26 个核苷酸、约27个核苷酸、约28个核苷酸、约29个核苷酸、约30 个核苷酸、约31个核苷酸、约32个核苷酸、约33个核苷酸、约34 个核苷酸、约35个核苷酸、约36个核苷酸、约37个核苷酸、约38个核苷酸、约39个核苷酸、约40个核苷酸、约41个核苷酸、约42 个核苷酸、约43个核苷酸、约44个核苷酸、约45个核苷酸、约46 个核苷酸、约47个核苷酸、约48个核苷酸、约49个核苷酸、约50 个核苷酸、约51个核苷酸、约52个核苷酸、约53个核苷酸、约54 个核苷酸、约55个核苷酸、约56个核苷酸、约57个核苷酸、约58 个核苷酸、约59个核苷酸、约60个核苷酸、约61个核苷酸、约62 个核苷酸、约63个核苷酸、约64个核苷酸、约65个核苷酸、约66 个核苷酸、约67个核苷酸、约68个核苷酸、约69个核苷酸、约70 个核苷酸、约71个核苷酸、约72个核苷酸、约73个核苷酸、约74 个核苷酸、约75个核苷酸或约76个核苷酸的修饰。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含多个修饰。所述多个修饰可以仅发生在连续的核苷酸上。所述多个修饰可以仅发生在交替的核苷酸上。所述多个修饰可以既发生在连续的核苷酸又发生在交替的核苷酸上。如本文所用的交替的核苷酸是指仅由第三核苷酸分隔开的两个核苷酸。
本文公开的寡核苷酸的有义或反义链可以不具有修饰，或者可以具有约1个核苷酸、约2个核苷酸、约3个核苷酸、约4个核苷酸、约5个核苷酸、约6个核苷酸、约7个核苷酸、约8个核苷酸、约9 个核苷酸、约10个核苷酸、约11个核苷酸、约12个核苷酸、约13 个核苷酸、约14个核苷酸、约15个核苷酸、约16个核苷酸、约17 个核苷酸、约18个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约21 个核苷酸、约22个核苷酸、约23个核苷酸、约24个核苷酸、约25 个核苷酸、约26个核苷酸、约27个核苷酸、约28个核苷酸、约29 个核苷酸、约30个核苷酸、约31个核苷酸、约32个核苷酸、约33 个核苷酸、约34个核苷酸、约35个核苷酸、约36个核苷酸、约37 个核苷酸、约38个核苷酸、约39个核苷酸、约40个核苷酸、约41 个核苷酸、约42个核苷酸、约43个核苷酸、约44个核苷酸、约45 个核苷酸、约46个核苷酸、约47个核苷酸、约48个核苷酸、约49 个核苷酸或约50个核苷酸的修饰。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸在分子的特定位置处具有修饰。在一些实施方案中，该分子在寡核苷酸的每个位置处具有修饰。在一些实施方案中，所述特定的修饰位置包括从5’至3’方向所观察到的寡核苷酸的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21或22或其任何组合。在一些实施方案中，所述特定的修饰位置包括从5’至3’方向所观察到的寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、12、13、14、16、18、20或22或其任何组合。在一些实施方案中，特定位置处的修饰为糖修饰。特定位置处的糖修饰的非限制性实例包括2’-O-甲基修饰、LNA修饰、DNA修饰和2'-F修饰。在一些实施方案中，所述糖修饰位于寡核苷酸中的每个位置处。在一些实施方案中，所述糖修饰位于寡核苷酸的位置1、 3、4、6、7、9、10、12、13和15处。在一些实施方案中，特定位置处的修饰为硫代磷酸酯核苷酸间连接。在一些实施方案中，该硫代磷酸酯连接位于寡核苷酸中的每个位置处。在一些实施方案中，该硫代磷酸酯连接位于寡核苷酸的5’端和3’端二者上的三个连续位置处。在一些实施方案中，特定位置处的修饰为ZEN修饰。在一些实施方案中，该ZEN修饰位于寡核苷酸的位置1和2之间，以及3’-端处。在一些实施方案中，在特定位置处待修饰的小RNA为miRNA拮抗剂。在一些实施方案中，该miRNA拮抗剂为miR-210拮抗剂。在一些实施方案中，该miR-210拮抗剂具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，该miR-210拮抗剂在每个位置处具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，该miR-210拮抗剂在位置2、4、6、8、10、12、13、14、 16、18、20和22处具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，该miR- 210拮抗剂在位置1、3、4、6、7、9、10、12、13和15处具有2’-O- 甲基修饰。在一些实施方案中，该miR-210拮抗剂具有硫代磷酸酯核苷酸间连接。在一些实施方案中，该miR-210拮抗剂在寡核苷酸中的每个位置处具有硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，该miR-210拮抗剂在寡核苷酸的5’端和3’端二者上的三个连续位置处具有硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，特定位置处的修饰为ZEN修饰。在一些实施方案中，所述miR-210拮抗剂具有ZEN修饰。在一些实施方案中，该miR-210拮抗剂在寡核苷酸的位置1和2之间以及3’-端处具有ZEN修饰。在一些实施方案中，该miR-210拮抗剂在位置12、 13和14处具有2’-O-甲基修饰，并且在位置2、4、6、8、10、16、 18、20和22处具有LNA修饰。在一些实施方案中，该miR-210拮抗剂在位置12、13和14处具有2’-O-甲基修饰，并且在位置2、4、6、 8、10、16、18、20和22处具有2'-F修饰。在一些实施方案中，该 miR-210拮抗剂在位置12、13和14处具有2’-O-甲基修饰；在位置 4、8、18和22处具有2'-F修饰；并且在位置2、6、10、16和20处具有LNA修饰。在一些实施方案中，该miR-210拮抗剂在位置2、 6、10、12、13、14、16和20处具有2’-O-甲基修饰，并且在位置4、 8、18和22处具有2'-F修饰。在一些实施方案中，该miRNA拮抗剂在每个位置处具有2’-O-甲基修饰，并且在5’-端和3’-端二者上的3个连续残基处具有硫代磷酸酯连接(例如，SG606，SEQ ID No.326)。在一些实施方案中，该miRNA拮抗剂为15个核苷酸并且在每个位置处具有硫代磷酸酯连接，并且在位置1、3、4、6、7、9、10、12、13 和15处具有2’-O-甲基修饰，并且在位置2、5、8、11和14处具有 LNA修饰(例如，SG607，SEQ ID No.327)。在一些实施方案中，该 miRNA拮抗剂在每个位置处具有2’-O-甲基修饰，并且在位置1和2 之间以及在3’-端处具有ZEN修饰。在一些情况下，该拮抗剂比成熟 miRNA序列的全长互补体短1个核苷酸(例如SG615，SEQ ID No.328)。
在一些实施方案中，pre-miRNA模拟物在其反义链的5'端具有核苷酸，其中磷酸基团或羟基基团已经被取代基团替换。取代基团的非限制性实例包括生物素、烷基基团、胺基团、低级烷基胺基团、乙酰基基团、2'-O-烷基、DMTO(带氧的4,4'-二甲氧基三苯甲基)、荧光素(fluorosceins)、德克萨斯红(TexasReds)、硫醇和吖啶。
治疗方法
本文公开了用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括施用治疗有效量的本文公开的寡核苷酸。该寡核苷酸可以选自sshRNA、 miRNA拮抗剂和pre-miRNA模拟物。该方法可以包括施用治疗有效量的sshRNA和治疗有效量的miRNA拮抗剂。该方法可以包括施用治疗有效量的sshRNA和治疗有效量的pre-miRNA模拟物。该方法可以包括施用治疗有效量的pre-miRNA模拟物和治疗有效量的miRNA 拮抗剂。该方法可以包括施用治疗有效量的sshRNA、治疗有效量的 pre-miRNA模拟物和治疗有效量的miRNA拮抗剂。
本文公开的寡核苷酸可用于改变与许多生物途径和条件有关的基因表达，而本文公开的实验实施例证明了这些寡核苷酸在伤口愈合中的有用性。伤口愈合是一个复杂且动态的生物过程，具有三个相互重叠的期：炎症期、增殖期和重塑期。本文公开的寡核苷酸、组合物和方法通过加速初始愈合过程而特别有益于炎症期和增殖期。
与小分子抑制剂、重组生长因子和其他蛋白质相比，寡核苷酸及其制剂可以是用于伤口愈合目的的更稳定的分子，有助于它们在临床上以及资源有限的环境中的使用。由于本文公开的寡核苷酸抑制剂的持久的药理学作用，单次施加寡核苷酸抑制剂的效果可以预期从一次换药持续到下一次换药。
本文公开的方法可以包括治疗慢性伤口。慢性伤口可以是已经存在超过24小时、超过3天、超过一周、超过两周、超过一个月、超过两个月、超过六个月或超过一年的伤口。
本文公开的方法可以包括治疗非愈合性伤口。非愈合性伤口可以是将一种或多种治疗或疗法施加于伤口后仍然存在，并且在预期的时间范围内尚未愈合的伤口。
所述方法可以包括施用sshRNA、miRNA拮抗剂和pre-miRNA 模拟物的组合，其中所述sshRNA、miRNA拮抗剂和pre-miRNA模拟物中的任何一种的量以在单独施用时达不到治疗有效量的量来施用。所述方法可以包括施用sshRNA、miRNA拮抗剂和pre-miRNA模拟物的组合，其中所述sshRNA、miRNA拮抗剂和pre-miRNA模拟物中的至少一种以在单独施用时为亚治疗剂量的剂量施用。两种或更多种本文公开的寡核苷酸的组合可以具有累加治疗效果或协同治疗效果。
本文公开了治疗受试者的伤口的方法，其包括施用抑制PHD2 的sshRNA、增强miR-21活性的pre-miRNA模拟物和抑制miR-210 的miRNA拮抗剂。该方法可通过刺激生长因子和血管生成效应物(包括HSP、VEGF、PDGF、EPO、ANG1/2和PLGF)的生成以及成纤维细胞和角质形成细胞的增殖来促进伤口愈合。HSP、VEGF、PDGF、 EPO、ANG1/2和PLGF可以促进伤口愈合，特别是在初始的炎症期和增殖期。
使用sshRNA抑制PHD2的原因是促进在伤口愈合受损中降低的HIF-1α活性。在常氧条件下，PHD2(含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2)使HIF-1α上的脯氨酸羟基化，这触发了它经由泛素-蛋白酶体途径的降解。因此，PHD2的抑制提供了在常氧条件下稳定HIF-1α水平的有效方法。以这种方式稳定HIF-1α可以诱导诸如EPO、HSF-1、 PDGF和血管生成素等因子的表达，所述因子的活性促进伤口愈合所必需的血管生成和血管重塑。HIF-1α还可以诱导巨噬细胞和内皮祖细胞从骨髓到受伤部位的募集，以促进血管发生和微生物抗性。此外，它可以通过直接上调HSF-1(诱导其他HSP合成的转录因子)促进热休克蛋白(HSP)的表达增强。在慢性人类伤口以及伤口愈合受损的动物模型中发现HSP水平降低，提示其在伤口愈合中的积极作用。
miR-210是被HIF-1α高度上调的miRNA之一。miR-210水平的增加导致角质形成细胞增殖和运动性降低，角质形成细胞增殖和运动性是伤口再上皮化过程的必需活动。因此，通过由sshRNA抑制 PHD2来稳定HIF-1α预期将上调miR-210，这不利于愈合。因此，使用anti-miR-210抑制miR-210活性的基本原理是防止对角质形成细胞生长和迁移的抑制，这种抑制是稳定HIF-1α的副作用。
miR-21发挥与miR-210相反的作用；它促进成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞的迁移，这有利于伤口愈合过程。成纤维细胞向伤口床的迁移导致单核细胞募集和诱导炎症应答，这在伤口愈合的初始阶段是重要的。miR-21的另一个关键作用是通过调节PTEN途径和抑制凋亡调节因子来促进细胞生长和增殖，这两者对于伤口愈合的初始阶段也是重要的。HIF-1α上调miR-21，但程度比其上调miR-210 小。基于这些考虑，我们假设进一步补充miR-21活性将有利于加速愈合过程。
miR-210可通过抑制角质形成细胞生长和运动性来抑制上皮形成，而miR-21可通过增强成纤维细胞和角质形成细胞的运动性来促进再上皮化。通过sshRNA抑制PHD2以稳定HIF-1α、通过抗-miR消除miR-210和通过pre-miR-21模拟物补充miR-21活性合起来可以是伤口愈合的有效治疗策略，并且可能优于单用这些RNA的效果。
靶向病毒或癌细胞的siRNA可能非常适合于组合为混合物以避免通过单个靶标的突变而削弱其有效性。由于这种混合物中的组分在化学上非常相似，并且它们可能具有的副作用性质主要是类别特异性，所以siRNA混合物可能不具有与小分子抑制剂组合相同水平的安全性风险。基于如上所述它们在伤口愈合过程中的不同作用，同时调节 PHD2、miR-210和miR-21的活性可以深刻地影响整个伤口愈合过程。这种治疗策略会诱导血管生成因子和生长因子，并且动员受伤组织内的成纤维细胞和角质形成细胞，从而通过调节多种生物途径来促进伤口愈合加速。
由于递送预计是局部的并且治疗的持续时间仅在伤口愈合之前，因此如果需要克服组织摄取效率的任何限制，施用高局部剂量应当是相对安全且合算的。虽然有基于siRNA和anti-miR的药物正在开发中，但目前还没有获批的基于RNAi的药物疗法。本项目的成功可能代表了首批基于RNAi的疗法之一，并且是任何设计的合成shRNA的第一种疗法。它将增进RNAi作为许多疾病，特别是皮肤病症的一般治疗方法的前景。
本文描述了治疗有效量的寡核苷酸、药物组合物、药物制剂、单位剂型、方法和试剂盒以治疗有需要的受试者的伤口。在一些实施方案中，治疗有效量的本发明的小RNA、药物制剂、单位剂型或药物组合物(单独或与另一种分子或药物组合物联合)可用于治疗有需要的受试者的伤口。在一些实施方案中，治疗有效量的本发明的寡核苷酸、药物制剂、单位剂型或药物组合物(单独或与另一种分子或药物组合物联合)可用于制备用于治疗有需要的受试者的伤口的药物。
在病理学上普遍存在伤口愈合中的并发症，如不能完成伤口闭合并增加感染、炎症、瘢痕形成和纤维化的风险。伤口的非限制性实例包括II型糖尿病伤口、刺伤、枪伤、手术伤口、热伤口、化学伤口、电伤、咬伤、蛰伤、动脉粥样硬化伤口、深静脉血栓形成伤口、慢性伤口、急性伤口、溃疡伤口、静脉性溃疡伤口、压力性溃疡伤口、感染伤口、炎性伤口、压力性伤口、切割伤口、浅表伤口、内脏器官伤口、脚伤、褥疮伤口、非愈合性伤口、缺血性伤口、与甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌相关的伤口、压力性溃疡伤口、糖尿病性溃疡伤口、静脉性溃疡伤口、动脉性溃疡伤口和老年人伤口。
在一些实施方案中，有需要的受试者被诊断为患有疾病或病况。在一些实施方案中，该疾病或病况为病理性伤口愈合的疾病。病理性伤口愈合的疾病或病况的非限制性实例包括II型糖尿病、糖尿病、局部缺血、静脉淤滞性疾病、外周血管疾病、自身免疫性疾病和低氧应答失调疾病。
其中可以发生伤口的器官和组织的非限制性实例包括皮肤、真皮、表皮、下皮、结缔组织、乳房、子宫颈、胃肠道、心脏、肾脏、大肠、肝脏、肺、淋巴结、卵巢、胰腺、前列腺、小肠、脊柱或脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺或子宫。其中可接触本发明的小RNA的细胞的非限制性实例包括脂肪细胞、成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞 (cardiomyocytes)、内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、血细胞、巨核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、白细胞、粒细胞、角质形成细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、肝细胞、内分泌或外分泌腺的细胞、生殖细胞、营养细胞、上皮细胞、内皮细胞、激素分泌细胞、收缩细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞(cardiac muscle cells)、血细胞，或骨、骨髓、脑、乳房、子宫颈、胃肠道、心脏、肾脏、大肠、肝脏、肺、淋巴结、卵巢、胰腺、前列腺、小肠、脊柱或脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺或子宫的细胞。
正常的伤口愈合涉及部分通过由伤口部位处的脉管系统损伤引起的低氧所刺激的事件的协调级联。该级联包括血管生成、血管发生、巨噬细胞募集、细胞凋亡的抑制以及用于再上皮化的成纤维细胞和角质形成细胞的扩充和动员。在慢性伤口中，对低氧的正常应答受损，并且许多此类细胞过程受到阻碍。
图1图示了低氧网络100在该过程中的作用。在不存在低氧的情况下，调节因子PHD2 101将转录因子HIF-1α103羟基化102，导致HIF-1α103降解。在低氧期间，PHD2 101失活，释放HIF-1α103 以参与转录激活。具体而言，HIF-1α103转录激活miRNA miR-210 105的表达104。然后MiR-210 105参与转录因子E2F3 107的由miRNA 介导的抑制106。这阻断了E2F3 107转录激活108角质形成细胞109 的能力。平行地，miRNA miR-21 110参与miRNA介导的抑制111以激活角质形成细胞109。miR-21 110还参与募集的成纤维细胞113中的miRNA介导的抑制112。激活的角质形成细胞109募集并激活114 成纤维细胞113。为了影响伤口愈合过程105，伤口部位处的细胞和募集的成纤维细胞113中的HIF-1α103分别引发基因表达程序116 和117，包括促存活因子、血管生成因子、祖细胞募集因子和募集伤口闭合所需的细胞类型的趋化因子的表达。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸或药物组合物可以增加伤口愈合、伤口闭合或再上皮化。伤口愈合增加的非限制性实例包括伤口愈合速率的增加或伤口愈合程度的增加。本公开的寡核苷酸或药物组合物相对于对照可将伤口愈合、伤口闭合或再上皮化增加约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％约800％、约900％、约1000％、约2000％、约3000％、约4000％、约5000％、约6000％、约7000％、约8000％、约9000％或约10000％。
本公开的寡核苷酸或药物组合物相对于对照可将伤口愈合、伤口闭合或再上皮化增加约1％至约5％、约5％至约10％、约10％至约 20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％、约100％至约200％、约200％至约300％、约300％至约400％、约400％至约500％、约500％至约600％、约600％至约 700％、约700％至约800％、约800％至约900％、约900％至约1000％、约1000％至约2000％、约2000％至约3000％、约3000％至约4000％、约4000％至约5000％、约5000％至约6000％、约6000％至约7000％、约7000％至约8000％、约8000％至约9000％或约9000％至约10000％。
本发明的寡核苷酸或药物组合物可将伤口大小减小约1％、约 5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约 80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.9％或约100％。
本发明的寡核苷酸或药物组合物可以将伤口大小减小约1％至约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约30％至约35％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％、约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约91％、约91％至约92％、约92％至约93％、约93％至约94％、约94％至约 95％、约95％至约96％、约96％至约97％、约97％至约98％、约98％至约99％、约99％至约99.5％、约99.5％至约99.9％或约99.9％至约 100％。
本发明可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内(intraprostaticaly)、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、经皮、囊泡内(intravesicularlly)、经粘膜、心包内、脐内(intraumbilically)、眼内(intraocularally)、口服、局部(topically)、局部(locally)、通过吸入如雾化吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注、经由导管、经由灌洗、在乳膏中、在脂质组合物如脂质体中或以其组合方式施用。向有需要的受试者施用本发明的小RNA的治疗有效量可以根据身体和生理因素如体重、病况的严重程度、先前或同时的治疗干预、患者的特发病和给药途径来确定。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的治疗有效量可以为约 1微克/千克(μg/kg)、约2μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约6μg/kg、约7μg/kg、约8μg/kg、约9μg/kg、约10μg/kg、约20 μg/kg、约30μg/kg、约40μg/kg、约50μg/kg、约60μg/kg、约70 μg/kg、约80μg/kg、约90μg/kg、约100μg/kg、约200μg/kg、约300 μg/kg、约400μg/kg、约500μg/kg、约1毫克/千克(mg/kg)、约2 mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约 30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约 80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg体重。
在一些实施方案中，寡核苷酸的治疗有效量可以为约1μg/kg至约2μg/kg、约2μg/kg至约3μg/kg、约3μg/kg至约4μg/kg、约4 μg/kg至约5μg/kg、约5μg/kg至约6μg/kg、约6μg/kg至约7μg/kg、约7μg/kg至约8μg/kg、约8μg/kg至约9μg/kg、约9μg/kg至约10 μg/kg、约10μg/kg至约20μg/kg、约20μg/kg至约30μg/kg、约30 μg/kg至约40μg/kg、约40μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约60 μg/kg、约60μg/kg至约70μg/kg、约70μg/kg至约80μg/kg、约80 μg/kg至约90μg/kg、约90μg/kg至约100μg/kg、约100μg/kg至约 200μg/kg、约200μg/kg至约300μg/kg、约300μg/kg至约400μg/kg、约400μg/kg至约500μg/kg、约500μg/kg至约600μg/kg、约600 μg/kg至约700μg/kg、约700μg/kg至约800μg/kg、约800μg/kg至约900μg/kg、约900μg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约2mg/kg、约2mg/kg至约3mg/kg、约3mg/kg至约4mg kg、约4mg/kg至约5 mg/kg、约5mg/kg至约6mg/kg、约6mg/kg至约7mg/kg、约7mg/kg 至约8mg/kg、约8mg/kg至约9mg/kg、约9mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约30mg/kg、约30mg/kg 至约40mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、约50mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约70mg/kg、约70mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg 至约90mg/kg或约90mg/kg至约100mg/kg体重。
在一些实施方案中，寡核苷酸的治疗有效量可以包含约50μg、约100μg、约150μg、约200μg、约250μg、约300μg、约350μg、约400μg、约450μg、约500μg、约600μg、约700μg、约800μg、约900μg、约1mg、约1.5mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5 mg、约4mg、约4.5mg、约5mg、约5.5mg、约6mg、约6.5mg、约7mg、约7.5mg、约8mg、约8.5mg、约9mg、约9.5mg、约10 mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约25mg、约30mg、约 35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80 mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140 mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约 200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg或约1g。
在一些实施方案中，寡核苷酸的治疗有效量可以包含约50μg 至约100μg、约100μg至约150μg、约150μg至约200μg、约200 μg至约250μg、约250μg至约300μg、约300μg至约350μg、约 350μg至约400μg、约400μg至约450μg、约450μg至约500μg、约500μg至约600μg、约600μg至约700μg、约700μg至约800 μg、约800μg至约900μg、约900μg至约1mg、约1mg至约1.5 mg、约1.5mg至约2mg、约1mg至约1.5mg、约1.5mg至约2mg、约2mg至约2.5mg、约2.5mg至约3mg、约3mg至约3.5mg、约 3.5mg至约4mg、约4mg至约4.5mg、约4.5mg至约5mg、约5 mg至约5.5mg、约5.5mg至约6mg、约6mg至约6.5mg、约6.5 mg至约7mg、约7mg至约7.5mg、约7.5mg至约8mg、约8mg 至约8.5mg、约8.5mg至约9mg、约9mg至约9.5mg、约9.5mg 至约10mg、约10mg至约11mg、约11mg至约12mg、约12mg至约13mg、约13mg至约14mg、约14mg至约15mg、约15mg至约16mg、约16mg至约17mg、约17mg至约18mg、约18mg至约19mg、约19mg至约20mg、约20mg至约25mg、约25mg至约30mg、约30mg至约35mg、约35mg至约40mg、约40mg至约45mg、约45mg至约50mg、约50mg至约60mg、约60mg至约70mg、约70mg至约80mg、约80mg至约90mg、约90mg至约100mg、约100mg至约110mg，约110mg至约120mg、约120 mg至约130mg、约130mg至约140mg、约140mg至约150mg、约150mg至约160mg、约160mg至约170mg、约170mg至约180 mg、约180mg至约190mg、约190mg至约200mg、约200mg至约300mg、约300mg至约400mg、约400mg至约500mg、约500 mg至约600mg、约600mg至约700mg、约700mg至约800mg、约800mg至约900mg或约900mg至约1g。
多核苷酸载体
本公开提供了编码本文公开的寡核苷酸的核酸，其通过合适的方法例如多核苷酸载体递送至有需要的受试者。
用多核苷酸载体将核酸递送至细胞可以通过许多方法完成。病毒核酸载体递送方法使用重组病毒进行核酸载体转移。非病毒核酸载体递送可包括注射裸DNA或RNA，使用载体，包括脂质载体、聚合物载体、化学载体和生物载体，如生物膜、细菌和病毒样颗粒，以及物理或机械方法。病毒和非病毒核酸载体递送方法的组合可用于有效的基因疗法。
非病毒核酸载体转移可包括注射裸核酸载体，例如不受保护或不含载体的核酸。在体内，裸核酸载体可以经历快速降解、低转染水平和不佳的组织靶向能力。流体动力学注射方法可以增加裸核酸载体的靶向能力。
非病毒核酸载体递送系统可以包括化学载体。这些系统可以包括lipoplex、polyplex、树状聚体和无机纳米颗粒。lipoplex是脂质与核酸的复合物，其保护核酸免于降解并促进核酸进入细胞。Lipoplex可以由中性、阴离子或阳离子脂质制备。用阳离子脂质制备lipoplex可促进带负电荷的核酸的封装。带有净正电荷的Lipoplex可以更有效地与带负电荷的细胞膜相互作用。制备带有略微过量正电荷的lipoplex 可以赋予更高的转染效率。lipoplex可以通过内吞作用进入细胞。一旦进入细胞内，lipoplex可以将核酸内含物释放到细胞质中。polyplex是聚合物与核酸的复合物。大多数polyplex由阳离子聚合物制备，其通过核酸与聚合物之间的离子相互作用促进组装。polyplex向细胞中的摄入可以通过内吞作用发生。在细胞内，polyplex需要共转染的内体破裂剂如灭活的腺病毒，用于从内吞囊泡中释放polyplex颗粒。聚合物载体的实例包括聚乙烯亚胺、壳聚糖，聚(β-氨基酯)和聚氨基磷酸酯。Polyplex表现出低毒性、高负载能力及易于制备。树状聚体是高度分支的分子。树状聚体可被构建成具有带正电荷的表面或携带帮助树状聚体与核酸临时缔合的官能团。这些树状聚体-核酸复合物可用于基因疗法。树状聚体-核酸复合物可以通过内吞作用进入细胞。由无机材料制备的纳米颗粒可用于核酸载体递送。无机材料的实例可以包括金、二氧化硅/硅酸盐、银、氧化铁和磷酸钙。尺寸小于100nm的无机纳米颗粒可以用于有效地封装核酸。纳米颗粒可以经由内吞作用被细胞吸收。在细胞内，核酸可以从内体释放而没有降解。可制备基于量子点的纳米颗粒，其提供与基因疗法相结合的稳定荧光标记物的使用。有机改性的二氧化硅或硅酸盐可用于将核酸靶向至有机体中的特定细胞。
非病毒核酸载体递送系统可以包括生物学方法，该生物学方法包括细菌转染(bactofection)、生物脂质体和病毒样颗粒(VLP)。细菌转染方法包括使用减毒细菌将核酸递送至细胞。生物脂质体如红细胞血影和分泌外来体来源于接受基因疗法的受试者以逃避免疫应答。病毒样颗粒(VLP)或空病毒颗粒通过仅用病毒的结构基因转染细胞并收获空颗粒来产生。该空颗粒负载有待转染以用于基因疗法的核酸。
核酸载体的递送可以通过物理方法增强。物理方法的实例包括电穿孔、基因枪、声孔效应和磁转染。电穿孔方法使用短高电压脉冲将核酸转移穿过细胞膜。这些脉冲可以导致在细胞膜中形成暂时孔，从而允许核酸进入细胞。电穿孔对于广泛的细胞可能是有效的。电子雪崩转染是一种电穿孔方法，其使用极短(例如，微秒)脉冲的高电压等离子体放电来提高核酸载体递送的效率。基因枪方法利用使用高压气体射入细胞的核酸包覆的金颗粒。由基因枪产生的力允许核酸渗透到细胞中，而金颗粒留在停止盘上。声孔效应方法使用超声频率来改变细胞膜的渗透性。渗透性的变化允许将核酸摄取到细胞中。磁转染方法使用磁场来增强核酸摄取。在这种方法中，核酸与磁性颗粒复合。使用磁场来聚集核酸复合物并使其与细胞接触。
病毒核酸载体递送系统使用重组病毒来递送核酸以用于基因疗法。可用于递送核酸的病毒的非限制性实例包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒、水泡性口炎病毒、呼肠孤病毒、痘苗病毒、痘病毒和麻疹病毒。
逆转录病毒载体可用于本公开中。逆转录病毒为含有单链RNA 基因组的包膜病毒。逆转录病毒可以经由逆转录整合到宿主细胞内部。逆转录病毒可以通过与特定的膜结合受体结合而进入宿主细胞。在宿主细胞的细胞质内，逆转录病毒的逆转录酶从病毒RNA基因组模板产生双链DNA。逆转录病毒的整合酶将新病毒DNA结合到宿主细胞基因组中，在其中病毒DNA随同宿主细胞基因一起转录并翻译。逆转录病毒基因疗法载体可用于转移的载体基因组的染色体整合，从而导致经处理的细胞的稳定遗传修饰。逆转录病毒载体的非限制性实例包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)载体、基于HIV的病毒载体、γ逆转录病毒载体、C型逆转录病毒载体和慢病毒载体。慢病毒是逆转录病毒的一个亚类。虽然一些逆转录病毒只能感染分裂细胞，但慢病毒可感染并整合到活跃分裂细胞和非分裂细胞的基因组中。
在本公开中可以使用基于腺病毒的载体。腺病毒是具有线性双链基因组的无包膜病毒。腺病毒可以利用病毒表面蛋白与导致腺病毒颗粒内吞作用的宿主细胞受体之间的相互作用进入宿主细胞。一旦进入宿主细胞的细胞质内，即通过内体的降解释放腺病毒颗粒。使用细胞微管，腺病毒颗粒进入宿主细胞核，在其中腺病毒DNA得以释放。在宿主细胞核内，腺病毒DNA得到转录并翻译。腺病毒DNA不整合到宿主细胞基因组中。腺病毒DNA在宿主细胞分裂过程中不复制。如果宿主细胞群体复制，那么使用腺病毒载体的基因疗法可能需要多次施用。
本公开中可以使用基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体。HSV是具有线性双链DNA基因组的包膜病毒。宿主细胞上的表面蛋白与HSV之间的相互作用导致宿主细胞膜中的孔隙形成。这些孔隙允许 HSV进入宿主细胞的细胞质。在宿主细胞内，HSV使用核入口孔隙进入宿主细胞核，在其中释放HSV DNA。HSV可以以潜伏状态持续存在于宿主细胞中。单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)也称为人疱疹病毒1和2(HHV-1和HHV-2)，其为疱疹病毒家族的成员。
可使用基于甲病毒的载体来递送核酸。基于甲病毒的载体的实例包括来源于塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)和辛德毕斯病毒 (sindbis virus)的载体。基于甲病毒的载体可提供高转基因表达和转导多种细胞的能力。可以修饰甲病毒载体以靶向特定组织。甲病毒可以在宿主细胞中保持潜伏状态，从而提供细胞中长期核酸表达的优势。
在本公开中可使用基于痘/痘苗的载体，如正痘病毒或禽痘病毒载体。痘病毒是一种双链DNA病毒，其可以感染分裂和未分裂细胞。痘病毒基因组可以容纳至多25千碱基的转基因序列。可使用单个痘苗病毒载体递送多个基因。
在一个方面，本公开提供了重组病毒，如腺相关病毒(AAV)，作为载体以将编码shRNA、sshRNA或pre-miRNA模拟物的核酸递送至有需要的受试者。
腺相关病毒(AAV)是属于细小病毒科(Parvoviridae)的小的非包膜病毒。AAV基因组为约4,800个核苷酸的线性单链DNA分子。 AAV DNA包含在基因组两端处的两个末端反向重复序列(ITR)和两组开放阅读框。ITR作为病毒DNA的复制起点并作为整合元件。所述开放阅读框编码Rep(非结构复制)和Cap(结构衣壳)蛋白。AAV 可以感染分裂细胞和静息细胞。AAV常见于普通人群，并且可以自然存留在宿主中。
AAV可以通过用将要递送至细胞的转基因(转移的核酸)替代两种AAV基因的编码序列而工程改造用作基因疗法载体。所述替代消除了由于病毒基因表达引起的免疫或毒性副作用。所述转基因可以位于AAV DNA分子上的两个ITR(145个碱基对(bp))之间。基于AAV的载体可以使基因组反式衣壳化(transsencapsidate)，从而允许载体生物学和趋向性的较大差异。
当产生重组AAV(rAAV)时，为AAV提供辅助功能的病毒基因或腺病毒基因可以反式形式供应以允许产生rAAV颗粒。如此， rAAV可以通过三质粒系统产生，从而降低野生型病毒产生的可能性。
本公开的AAV载体可以使用任何AAV血清型产生。血清型的非限制性实例包括AAV1、AAV2、AAV2.5、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10以及它们的杂合体。
AAV载体可以被修饰用于免疫逃避或增强治疗输出。修饰可以包括病毒衣壳的遗传操作。可以合理地设计病毒衣壳中的蛋白质。病毒衣壳可以通过引入外源试剂如抗体、共聚物和阳离子脂质来修饰以规避免疫系统。可以工程改造AAV载体以增强靶向能力。可以将靶向肽或配体插入到衣壳表面上以增强向特定组织中的转导。可以将来自多于一种AAV血清型的衣壳蛋白组合以产生具有增强的AAV载体靶向能力的包含衣壳颗粒的嵌合AAV载体。可以将组织特异性启动子添加至病毒载体以在所需的组织类型中表达转基因。
可以将AAV载体修饰成自我互补的。自我互补的AAV载体可以包含病毒DNA的两条链，从而减轻对宿主细胞第二链DNA合成的需求。使用自我互补的AAV载体可以促进核酸向宿主基因组中的有效转移。
假型病毒可用于递送核酸载体。假型化(Psuedotyping)涉及用来自其他病毒的包膜蛋白或嵌合蛋白来替代病毒的内源性包膜蛋白。外来包膜蛋白可以赋予宿主趋向性的变化或改变病毒的稳定性。可用于基因疗法的假型病毒的实例包括通过用来自水泡性口炎病毒的包膜G蛋白包覆慢病毒而产生的水泡性口炎病毒G假型慢病毒(VSV G假型慢病毒)。VSVG-假型慢病毒可转导几乎所有的哺乳动物细胞类型。
具有两种或更多种载体性质的杂合载体可用于将核酸载体递送至宿主细胞。可以工程改造杂合载体以降低毒性或改善在靶细胞中的治疗性转基因表达。杂合载体的非限制性实例包括AAV/腺病毒杂合载体、AAV/噬菌体杂合载体和逆转录病毒/腺病毒杂合载体。
病毒载体可以是复制型的。复制型载体含有复制所需的所有基因，使得基因组比复制缺陷型病毒载体更长。病毒载体可以是复制缺陷型的，其中将对于复制和包装所必需的基因的编码区删除或替换为其他基因。复制缺陷型病毒可以转导宿主细胞并转移遗传物质，但不能复制。可以提供辅助病毒来帮助复制缺陷型病毒复制。
病毒载体可以源自任何来源，例如人、非人灵长类、犬、家禽、小鼠、猫、绵羊和猪。
本公开的组合物和方法提供了将编码shRNA、sshRNA或pre- miRNA模拟物的核酸递送至有需要的受试者。该核酸可以通过病毒载体例如腺相关病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、日本血凝病毒(HVJ)-脂质体复合物(hemagglutinating virus of Japan-liposome(HVJ)complex)、莫洛尼鼠白血病病毒或基于 HIV的病毒来递送。该核酸可以通过合适的非病毒方法递送，例如注射裸核酸、使用载体如脂质、聚合物、生物或化学载体或物理/机械方法。该核酸可以通过病毒和非病毒方法的组合来递送。
本公开的核酸可以使用任何方法产生。该核酸可以是合成的、重组的、分离的或纯化的。该核酸可以包含例如编码shRNA、sshRNA 或pre-miRNA模拟物的核酸序列。
本公开的载体可以包含一种或多种类型的核酸。所述核酸可以包括DNA或RNA。RNA核酸可以包括感兴趣基因的转录物，例如 shRNA、sshRNA、pre-miRNA模拟物、内含子、非翻译区和终止序列。 DNA核酸可以包括感兴趣的基因、启动子序列、非翻译区和终止序列。可以使用DNA和RNA的组合。所述核酸可以是双链或单链的。所述核酸可以包括非天然的或改变的核苷酸。
本公开的载体可以包含另外的核酸序列，包括启动子、增强子、阻遏物、绝缘子、聚腺苷酸化信号(polyA)、非翻译区(UTR)、终止序列、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)、内含子、复制序列的起点、引物结合位点、att位点、衣壳化位点、多嘌呤片段、长末端重复序列(LTR)和连接体序列。可以修饰载体以靶向特定细胞例如癌细胞，或者靶向组织例如视网膜。
shRNA、sshRNA、pre-miRNA模拟物的表达可以处于调节序列的控制之下。该调节序列可以包含启动子。可以使用来自任何合适来源(包括病毒、哺乳动物、人、昆虫、植物、酵母和细菌)的启动子。可以使用组织特异性启动子。启动子可以是组成型的、诱导型的或阻遏型的。启动子可以是单向的(以一个方向启动转录)或双向的(以 3'或5'方向启动转录)。启动子的非限制性实例包括T7细菌表达系统、pBAD(araA)细菌表达系统、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40 启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、MMT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子、视蛋白启动子、HIV-1启动子、HIV-2启动子、AAV启动子、腺病毒启动子 (如来自E1A、E2A或MLP区)、花椰菜花叶病毒启动子、HSV-TK 启动子、禽肉瘤病毒启动子、MLV启动子、MMTV启动子和大鼠胰岛素启动子。诱导型启动子可包括例如Tet系统、蜕皮激素诱导型系统、T-REXTM系统、LACSWITCHTM系统和Cre-ERT他莫昔芬诱导型重组酶系统。
启动子序列、内含子序列、polyA序列、非翻译区或连接体序列可以为约1个碱基或碱基对、约10个碱基或碱基对、约20个碱基或碱基对、约50个碱基或碱基对、约100个碱基或碱基对、约500个碱基或碱基对、约1000个碱基或碱基对、约2000个碱基或碱基对、约3000个碱基或碱基对、约4000个碱基或碱基对、约5000个碱基或碱基对、约6000个碱基或碱基对、约7000个碱基或碱基对、约 8000个碱基或碱基对、约9000个碱基或碱基对或约10000个碱基或碱基对。启动子序列、内含子序列、polyA序列、非翻译区或连接序列可以为约1至约10个碱基或碱基对、约10至约20个碱基或碱基对、约20至约50个碱基或碱基对、约50至约100个碱基或碱基对、约100至约500个碱基或碱基对、约500至约1000个碱基或碱基对、约1000至约2000个碱基或碱基对、约2000至约3000个碱基或碱基对、约3000至约4000个碱基或碱基对、约4000至约5000个碱基或碱基对、约5000至约6000个碱基或碱基对、约6000至约7000个碱基或碱基对、约7000至约8000个碱基或碱基对、约8000至约9000 个碱基或碱基对或约9000至约10000个碱基或碱基对的长度。
本公开的载体可以包含编码选择性标记的核酸。该选择性标记可以是阳性、阴性或双功能的。该选择性标记可以是抗生素抗性基因。抗生素抗性基因的实例包括赋予对卡那霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、多西环素(doxycycline)、潮霉素、嘌呤霉素、zeomycin 或杀稻瘟素的抗性的标记物。该选择性标记可以允许宿主细胞成像，例如，荧光蛋白。成像标记物基因的实例包括GFP、eGFP、RFP、CFP、 YFP、dsRed、Venus、mCherry、mTomato和mOrange。
本公开的载体可以包含融合蛋白。融合配偶体可以包含将蛋白质靶向所需部位的信号多肽。融合配偶体可以包含促进蛋白质纯化的多肽标签，例如聚-His或Flag肽。融合配偶体可以包含用于对细胞成像的成像标签，例如荧光蛋白。本公开的载体可以包含化学缀合物。
本公开的载体可以包含赋予载体其他性质的组分。这些性质可以包括将载体靶向特定组织、将载体摄入宿主细胞、使核酸进入细胞核、将核酸结合到宿主细胞基因组中、宿主细胞中的转基因表达、免疫逃避和载体稳定性。
本公开的载体可以通过任何合适的方法产生。该方法可以包括使用转基因细胞，包括例如哺乳动物细胞如HEK293、昆虫细胞如Sf9、动物细胞或真菌细胞。
本公开的病毒载体可以根据噬菌斑形成单位(pfu)进行测量。病毒载体的pfu可以是例如约101至约1018pfu。本公开的病毒载体可以是例如至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少 1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017或至少1018pfu。本公开的病毒载体可以是例如至多101、至多102、至多103、至多104、至多105、至多106、至多107、至多108、至多109、至多1010、至多1011、至多1012、至多1013、至多1014、至多1015、至多1016、至多1017或至多1018pfu。
本公开的病毒载体可以根据载体基因组进行测量。本公开的病毒载体可以是例如约101至约1018个载体基因组。本公开的病毒载体可以是例如至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少 106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017或至少1018个载体基因组。本公开的病毒载体可以是例如至多101、至多102、至多 103、至多104、至多105、至多106、至多107、至多108、至多109、至多1010、至多1011、至多1012、至多1013、至多1014、至多1015、至多1016、至多1017或至多1018个载体基因组。
本公开的病毒载体可以使用感染复数(MOI)进行测量。MOI 可以是例如载体或病毒基因组与可以将核酸递送至其中的细胞的比例或倍数。本公开的病毒载体可以是例如约101至约1018MOI。本公开的病毒载体可以是例如至少约101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少 1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017或至少1018MOI。本公开的病毒载体可以是例如至多101、至多102、至多103、至多104、至多105、至多106、至多107、至多108、至多 109、至多1010、至多1011、至多1012、至多1013、至多1014、至多1015、至多1016、至多1017或至多1018MOI。
核酸载体的量可以是例如约1pg至约1ng。核酸载体的量可以是例如约1ng至约1μg。核酸载体的量可以是例如约1μg至约1mg。核酸载体的量可以是例如约1mg至约1g。核酸载体的量可以是例如约1g至约5g。核酸载体的量可以是例如约1pg、约10pg、约100 pg、约200pg、约300pg、约400pg、约500pg、约600pg、约700 pg、约800pg、约900pg、约1ng、约10ng、约100ng、约200ng、约300ng、约400ng、约500ng、约600ng、约700ng、约800ng、约900ng、约1μg、约10μg、约100μg、约200μg、约300μg、约 400μg、约500μg、约600μg、约700μg、约800μg、约900μg、约 1mg、约10mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约 500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1g、约 2g、约3g、约4g或约5g。
核酸载体的量可以是约1pg至约10pg、约10pg至约100pg、约100pg至约200pg、约200pg至约300pg、约300pg至约400pg、约400pg至约500pg、约500pg至约600pg、约600pg至约700pg、约700pg至约800pg、约800pg至约900pg、约900pg至约1ng、约1ng至约10ng、约10ng至约100ng、约100ng至约200ng、约 200ng至约300ng、约300ng至约400ng、约400ng至约500ng、约500ng至约600ng、约600ng至约700ng、约700ng至约800ng、约800ng至约900ng、约900ng至约1μg、约1μg至约10μg、约 10μg至约100μg、约100μg至约200μg、约200μg至约300μg、约300μg至约400μg、约400μg至约500μg、约500μg至约600 μg、约600μg至约700μg、约700μg至约800μg、约800μg至约 900μg、约900μg至约1mg、约1mg至约10mg、约10mg至约100 mg、约100mg至约200mg、约200mg至约300mg、约300mg至约400mg、约400mg至约500mg、约500mg至约600mg、约600 mg至约700mg、约700mg至约800mg、约800mg至约900mg、约900mg至约1g、约1g至约2g、约2g至约3g、约3g至约4 g，或约4g至约5g。
本公开的病毒载体可以根据重组病毒颗粒进行测量。本公开的病毒载体可以是例如约101至约1018个重组病毒颗粒。本公开的病毒载体可以是例如至少约101、至少约102、至少约103、至少约104、至少约105、至少约106、至少约107、至少约108、至少约109、至少约 1010、至少约1011、至少约1012、至少约1013、至少约1014、至少约 1015、至少约1016、至少约1017或至少约1018个重组病毒颗粒。本公开的病毒载体可以是例如至多约101、至多约102、至多约103、至多约104、至多约105、至多约106、至多约107、至多约108、至多约109、至多约1010、至多约1011、至多约1012、至多约1013、至多约1014、至多约1015、至多约1016、至多约1017或至多约1018个重组病毒颗粒。
药物制剂
本发明的寡核苷酸可以单独地或以药物组合物的形式施用于受试者。药物组合物可以使用一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、基底、赋形剂或助剂来配制，该药学上可接受的载体、稀释剂、基底、赋形剂或助剂有助于将寡核苷酸加工成可药用的制品。制剂取决于所选择的给药途径。
对于局部给药，本发明的寡核苷酸可以被配制为溶液、凝胶、软膏、乳膏或悬浮剂，被配制于透皮贴剂、网片或膜上。全身制剂包括被设计成通过注射如皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射给药的制剂，以及被设计成经皮、经粘膜、吸入、口服或肺部给药的制剂。对于注射，本发明的核酸可以在水性溶液中配制，优选在生理学上相容的缓冲液如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中配制。该溶液可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂或分散剂。或者，所述寡核苷酸可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物如无菌无热原水重建。对于经粘膜给药，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸可以被配制于透皮贴剂、网片或膜上。透皮贴剂、网片或膜的非限制性实例包括敷料、医用敷料、封闭敷料、透明敷料和防水敷料。本发明的寡核苷酸可以与交替的带电荷材料一起或顺序地施加，以在药学上可接受的基底如透皮贴剂、网片或膜上形成层。该层的非限制性实例包括印刷层和阳离子层。薄层生物降解以使寡核苷酸持续释放。在一些实施方案中，持续释放可以进行约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7 天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14 天或约15天。在一些实施方案中，持续释放可以进行约1天至约2 天、约2天至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天、约7天至约8天、约8天至约9天、约9 天至约10天、约10天至约11天、约11天至约12天、约12天至约 13天、约13天至约14天或约14天至约15天。
对于口服给药，所述核酸可以通过将分子与药学上可接受的载体组合而容易地配制。本发明的寡核苷酸可以与药学上可接受的载体一起配制以得到供有需要的受试者口服摄取的片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆体和悬浮液。对于口服固体制剂如粉末、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括选自以下的填充剂：糖、纤维素制品、制粒剂、粘合剂和崩解剂。糖的非限制性实例包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇。纤维素制品的非限制性实例包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。崩解剂的非限制性实例包括交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂和海藻酸或其盐如海藻酸钠。如果需要，固体剂型可以是包糖衣或包肠溶衣的。对于口服液体制品如悬浮液、酏剂和溶液，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、二醇类、油类和醇类。可以进一步加入调味剂、防腐剂和着色剂。对于含服给药，所述分子可以采取片剂或锭剂的形式。对于通过吸入给药，所述寡核苷酸可以使用合适的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和二氧化碳以来自加压包装或喷雾器的气雾剂喷雾的形式递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量量的阀来确定。可以配制用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和筒匣 (cartridges)，其含有核酸和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。所述寡核苷酸还可以配制成直肠或阴道组合物如栓剂和保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯。
除了先前描述的制剂之外，所述寡核苷酸还可以被配制成储库 (depot)制剂。这类长效制剂可以通过皮下或肌内植入或通过肌内注射来施用。对于储库制剂，寡核苷酸可以与以下物质一起配制：合适的聚合物或疏水物质，例如配制为可接受的油中的乳剂；离子交换树脂；或微溶衍生物，例如微溶盐。
在一些实施方案中，脂质体和乳液可以配制为递送媒介物以递送本发明的核酸。本发明的核酸可以与载体或脂质组合施用以增加细胞摄取。例如，小RNA可以与阳离子脂质组合施用。阳离子脂质的非限制性实例包括lipofectin、DOTMA、DOPE、DOTAP、DOTAP：胆固醇和胆固醇衍生物制剂。在一些实施方案中，脂质或脂质体制剂包含纳米颗粒。
在一些实施方案中，寡核苷酸可以与阳离子胺诸如聚(L-赖氨酸) 组合施用。
寡核苷酸可以使用持续释放系统如含有小RNA的固体聚合物的半渗透性基质来递送。取决于它们的化学性质，持续释放胶囊可以释放小RNA约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周或约16周。
核酸可作为游离酸、游离碱或作为药学上可接受的盐包含在任何上述制剂中。药学上可接受的盐包括例如酸加成盐和碱加成盐。加入到化合物中以形成酸加成盐的酸可以是有机酸或无机酸。加入到化合物中以形成碱加成盐的碱可以是有机碱或无机碱。在一些实施方案中，药学上可接受的盐为金属盐。在一些实施方案中，药学上可接受的盐为铵盐。
酸加成盐可以通过向本发明化合物添加酸而产生。在一些实施方案中，该酸是有机酸。在一些实施方案中，该酸是无机酸。在一些实施方案中，该酸为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、亚硝酸、硫酸、亚硫酸、磷酸、异烟酸、乳酸、水杨酸、酒石酸、抗坏血酸、龙胆酸(gentisinic acid)、葡糖酸、葡糖醛酸(glucaronic acid)、糖质酸(saccaric acid)、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、泛酸、乙酸、丙酸、丁酸、富马酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、草酸或马来酸。酸加成盐可以是例如单盐、二盐、三盐、四盐或更高级的盐。这样的形式可以具有全部为相同阴离子的抗衡离子，或者包含多种化学上不同的阴离子。
在一些实施方案中，所述盐为盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酒石酸盐、抗坏血酸盐盐、龙胆酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucaronate salt)、糖质酸盐(saccarate salt)、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、泛酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、甲基磺酸(甲磺酸)盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐或马来酸盐。
金属盐可以通过向本发明的化合物添加无机碱而产生。该无机碱由与碱性抗衡离子如氢氧根、碳酸根、碳酸氢根或磷酸根配对的金属阳离子组成。该金属可以是碱金属、碱土金属、过渡金属或主族金属。在一些实施方案中，该金属为锂、钠、钾、铯、铈、镁、锰、铁、钙、锶、钴、钛、铝、铜或锌。在一些实施方案中，金属盐为锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、铈盐、镁盐、锰盐、铁盐、钙盐、锶盐、钴盐、钛盐、铝盐、铜盐、镉盐或锌盐。
铵盐可以通过向本发明的化合物添加氨或有机胺而产生。在一些实施方案中，该有机胺为三乙胺、二异丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、吗啉、N-甲基吗啉、哌啶、N-甲基哌啶、N-乙基哌啶、二苄胺、哌嗪、吡啶、吡唑(pyrrazole)、哌唑(pipyrrazole)、咪唑、吡嗪或哌啶吡嗪(pipyrazine)。在一些实施方式中，铵盐为三乙胺盐、二异丙胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、吗啉盐、N-甲基吗啉盐、哌啶盐、N-甲基哌啶盐、N-乙基哌啶盐、二苄胺盐、哌嗪盐、吡啶盐、吡唑盐、哌唑盐、咪唑盐、吡嗪盐或哌啶吡嗪盐(pipyrazine salt)。
本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种在药学上可接受的载体中溶解或分散的寡核苷酸。药学上可接受的载体包括任何溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料或其组合 (参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329，通过引用并入本文)。除了在任何常规载体与活性成分不相容的情况下之外，还考虑其在治疗性或药物组合物中的应用。
所述寡核苷酸可以包含不同类型的载体，这取决于其是否以固体、液体或气雾剂形式施用，以及对于诸如注射的给药途径而言是否需要其为无菌的。
在一些实施方案中，药物组合物可包含以质量计约0.1％、约 0.5％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约 70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或约 99.9％的小RNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含以质量计约 0.1％至约0.5％、约0.5％至约1％、约1％至约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约 30％、约30％至约35％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％、约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约 85％、约85％至约90％、约90％至约95％、约95％至约96％、约96％至约97％、约97％至约98％、约98％至约99％、约99％至约99.5％或约99.5％至约99.9％的小RNA。
在一些实施方案中，本发明的组合物可具有约0.01毫克/毫升 (mg/mL)、约0.05mg/mL、约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3 mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL、约1mg/mL、约1.5mg/mL、约2mg/mL、约2.5mg/mL、约3mg/mL、约3.5mg/mL、约4mg/mL、约4.5mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL，约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL、约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL、约50mg/mL、约60mg/mL、约70mg/mL、约80mg/mL、约90mg/mL或约100mg/mL的小RNA浓度。
在一些实施方案中，本发明的组合物可具有约0.01mg/mL至约 0.05mg/mL、约0.05mg/mL至约0.1mg/mL、约0.1mg/mL至约0.2 mg/mL、约0.2mg/mL至约0.3mg/mL、约0.3mg/mL至约0.4mg/mL、约0.4mg/mL至约0.5mg/mL、约0.5mg/mL至约0.6mg/mL、约0.6 mg/mL至约0.7mg/mL、约0.7mg/mL至约0.8mg/mL、约0.8mg/mL 至约0.9mg/mL、约0.9mg/mL至约1mg/mL、约1mg/mL至约1.5 mg/mL、约1.5mg/mL至约2mg/mL、约2mg/mL至约2.5mg/mL、约2.5mg/mL至约3mg/mL、约3mg/mL至约3.5mg/mL、约3.5 mg/mL至约4mg/mL、约4mg/mL至约4.5mg/mL、约4.5mg/mL至约5mg/mL、约5mg/mL至约6mg/mL、约6mg/mL至约7mg/mL、约7mg/mL至约8mg/mL、约8mg mL至约9mg/mL、约9mg/mL至约10mg/mL、约10mg/mL至约11mg/mL、约11mg/mL至约12mg/mL、约12mg/mL至约13mg/mL、约13mg/mL至约14mg/mL、约14mg/mL至约15mg/mL、约15mg/mL至约16mg/mL、约16 mg/mL至约17mg/mL、约17mg/mL至约18mg/mL、约18mg/mL至约19mg/mL、约19mg/mL至约20mg/mL、约20mg/mL至约25 mg/mL、约25mg/mL至约30mg/mL、约30mg/mL至约35mg/mL、约35mg/mL至约40mg/mL、约40mg/mL至约45mg/mL、约45 mg/mL至约50mg/mL、约50mg/mL至约60mg/mL、约60mg/mL至约70mg/mL、约70mg/mL至约80mg/mL、约80mg/mL至约90 mg/mL或约90mg/mL至约100mg/mL的小RNA浓度。
在一些实施方案中，所述组合物可以包含抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，组合物可以包含防腐剂如各种抗细菌剂和抗真菌剂。防腐剂的非限制性实例包括对羟基苯甲酸酯(parabens)如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
在一些实施方案中，所述组合物为液体形式，其中载体可以是溶剂或分散介质，其包含水，乙醇，多元醇如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，脂类如甘油三酯，植物油和脂质体或其组合。可以通过以下方式来维持流动性：使用包衣如卵磷脂；通过分散在载体如液体多元醇或脂质中维持所需的粒径；使用表面活性剂如羟丙基纤维素；或其组合。在一些实施方案中，所述组合物将包含等渗剂，如糖、氯化钠或其组合。在一些实施方案中，本发明的组合物以冻干形式储存，以供用如本文所述的液体载体溶解。在一些实施方案中，该冻干形式储存在具有橡胶塞密封的密封容器中。
在一些实施方案中，所述组合物可以以滴眼剂、鼻溶液、鼻喷雾剂、气雾剂或吸入剂的方式施用。在一些实施方案中，所述滴剂、喷雾剂、溶液、气雾剂或吸入剂是等渗的，具有约7.0至约7.4的pH 或稍微缓冲以维持约5.5至约6.5的pH。在一些实施方案中，所述组合物可以进一步包含如上所述的抗微生物防腐剂。在一些实施方案中，所述组合物可以进一步包含药物，如抗生素或抗组胺。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸被配制成固体或液体组合物以供口服给药。在一些实施方案中，口服组合物可包含溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊如硬壳或软壳明胶胶囊、持续释放制剂、含服组合物、锭剂、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄饼剂(wafers)或其组合。口服组合物可以直接与受试者的饮食食物结合。用于口服给药的载体的非限制性实例包括惰性稀释剂、可同化的可食用载体及其组合。在一些实施方案中，糖浆或酏剂可以包含甜味剂、防腐剂、调味剂、染料、防腐剂或其组合。
在一些实施方案中，所述组合物可以包含一种或多种以下物质：粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂，如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，如薄荷、冬青油、樱桃味调味剂、橙味调味剂；或其组合。胶囊可以进一步包含载体，如液体载体。在一些实施方案中，剂量单位如片剂、胶囊或丸剂可包含包衣，如虫胶、糖或其组合。
在一些实施方案中，可注射组合物的延长吸收可通过在该组合物中使用延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝、明胶、生物可降解基质或凝胶、延时释放基质或凝胶或其组合来实现。延时释放基质或凝胶的非限制性实例包括琼脂糖、琼脂糖胶体基质(如0.4％(w/v)、12kDa) 水凝胶、羧甲基纤维素钠和聚乙烯亚胺。延迟吸收的试剂可以在约1 分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约2周、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约3周或约1个月内释放组合物。延迟吸收的试剂可以在约1分钟至约5分钟、约5分钟至约10分钟、约10分钟至约20分钟、约20分钟至约30分钟、约30分钟至约40分钟、约40分钟至约50分钟、约50分钟至约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约5小时、约5小时至约6小时、约6小时至约12小时、约12小时至约1天、约1天至约2天、约2天至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5 天至约6天、约6天至约1周、约1周至约8天、约8天至约9天、约9天至约10天、约10天至约11天、约11天至约12天、约12天至约13天、约13天至约2周、约2周至约15天、约15天至约16 天、约16天至约17天、约17天至约18天、约18天至约19天、约 19天至约20天、约20天至约3周或约3周至约1个月内释放组合物。
在一些实施方案中，所述组合物被配制成无菌的。在一些实施方案中，内毒素污染物低于约0.5纳克/毫克(ng/mg)蛋白质。
试剂盒
本发明可以包括用于调节靶转录物在细胞中的表达的试剂盒，该试剂盒包含如本文所述的寡核苷酸。该试剂盒可以包含如本文所公开的sshRNA、miRNA拮抗剂或pre-miRNA模拟物中的任何一种，或其任何组合。该试剂盒可以包含靶向PHD2的sshRNA、靶向miR-210的miRNA拮抗剂、靶向miR-21的pre-miRNA模拟物及其任何组合。在某些实施方案中，该试剂盒包括允许储存、递送反应试剂(例如，小RNA和培养基)和辅助材料(例如缓冲液，用于进行测定的书面说明)或将其从一个位置运输到另一个位置的系统。在一些实施方案中，该试剂盒可以包括一种或多种对照试剂，如非化学修饰的小RNA 或非靶向小RNA。在一些实施方案中，试剂盒包含容纳反应试剂和辅助材料的容器，如盒子。可以将此类内容物一起或分开递送至预期的接收者。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括关于使用该试剂盒的组分来实施本发明的方法的说明书。该说明书可以记录在合适的记录介质(例如纸张、塑料、纸板或数字格式)上。在一些实施方案中，该说明书可以作为包装插页(package insert)存在于试剂盒或其组分的容器的标签如试剂盒的包装或分包装上。在一些实施方案中，该说明书作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质 (例如，CD-ROM或闪存驱动器)上。在另外其他的实施方案中，试剂盒中不存在实际说明书，而是提供了用于从远程来源如因特网获得说明书的手段。在一些实例中，因特网说明书可以从可以查看或下载该说明书的网址访问。
表1中提供了本文公开的相关序列的列表。以“d”开头的核苷酸对应于2'-H修饰的核苷酸。以“1”开头的核苷酸对应于LNA修饰的核苷酸。以“f”开头的核苷酸对应于2'-F修饰的核苷酸。加下划线的核苷酸对应于2’-O-甲基修饰的核苷酸。硫代磷酸酯连接用星号标出。以+ 号开头的核苷酸对应于C6-胺-德克萨斯红缀合物部分所连接的核苷酸 (dT-C6-NH(Alexa594))。/ZEN/对应于N,N-二乙基-4-(4-硝基萘- 1-基偶氮)-苯胺化学修饰剂。
SEQ ID NO:1和2分别对应于编码人和小鼠PHD2转录物的转录物的DNA序列。SEQID NO:3和4分别对应于天然存在的miR- 210和miR-21的序列。SEQ ID NO:44-48对应于表示本文公开的pre- miRNA模拟物的序列。SEQ ID NO:5-8、11-27、30、31、49-325对应于表示本文公开的靶向PHD2的sshRNA的序列。SEQ ID NO:32- 43、326-328对应于表示本文公开的miRNA拮抗剂的序列。SEQ ID NO:9、10、28、29对应于构成靶向PHD2的siRNA的序列(引导(g)或随从(p)链)。例如，SEQ ID NO:28和29是构成siRNA的单个链——SG403g为引导(反义)链且SG403p为随从(有义)链。
表1
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本发明提供了包括但不限于以下实施方案：
1.一种用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA)，其包含：
(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的 RNA转录物杂交；和
(b)有义序列，
其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎。
2.根据实施方案1所述的sshRNA，其中所述RNA转录物由Egl 9同源物1(EGLN1)基因编码，其中所述EGLN1基因，不含内含子，由选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列表示。
3.根据实施方案1所述的sshRNA，其包含选自直接连接、1个核苷酸和2个核苷酸长度的环区域。
4.根据实施方案1所述的sshRNA，其中所述sshRNA由所述反义序列、所述有义序列、环区域、可选的突出端序列和可选的缀合物部分组成。
5.根据实施方案4所述的sshRNA，其中所述环区域具有零个核苷酸、1个核苷酸或2个核苷酸的长度。
6.根据实施方案5所述的sshRNA，其中所述环区域由零个核苷酸、 1个核苷酸或2个核苷酸组成。
7.根据实施方案1所述的sshRNA，其中所述sshRNA由所述反义序列、所述有义序列、可选的突出端序列和可选的缀合物部分组成，其中所述有义序列和所述反义序列是直接连接的。
8.根据实施方案1所述的sshRNA，其中所述反义序列与所述PHD2 转录物约80％互补至100％互补。
9.根据实施方案1所述的sshRNA，其中所述有义序列的长度为约 10个核苷酸至约19个核苷酸。
10.根据实施方案1所述的sshRNA，其中所述有义序列的长度为约11个核苷酸至约19个核苷酸。
11.根据实施方案1所述的sshRNA，其中至少一个核苷酸包含化学修饰。
12.根据实施方案11所述的sshRNA，其中所述化学修饰使所述 shhRNA在生物流体中的稳定性提高至少约20％。
13.根据实施方案1所述的sshRNA，其中所述sshRNA由选自SEQ ID NO:5-8、11-31、49-325的序列表示。
14.一种微RNA(miRNA)拮抗剂，其包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链。
15.根据实施方案14所述的miRNA拮抗剂，其中所述miR-210由 SEQ ID NO.3表示。
16.根据实施方案14所述的miRNA拮抗剂，其中所述miRNA拮抗剂使所述miR-210的量或活性降低约10％至约99.9％。
17.根据实施方案14所述的miRNA拮抗剂，其中至少一个核糖核苷酸包含化学修饰。
18.根据实施方案14所述的miRNA拮抗剂，其中每个核糖核苷酸包含化学修饰。
19.根据实施方案17或18所述的miRNA拮抗剂，其中所述化学修饰为糖修饰。
20.根据实施方案19所述的miRNA拮抗剂，其中所述糖修饰包含 2’-O-甲基修饰、LNA修饰、DNA修饰或2′-F修饰。
21.根据实施方案19所述的miRNA拮抗剂，其中所述糖修饰为2’- O-甲基修饰。
22.根据实施方案19所述的miRNA拮抗剂，其中所述糖修饰为 LNA修饰。
23.根据实施方案14所述的miRNA拮抗剂，其中所述miRNA拮抗剂包含硫代磷酸酯核苷酸间连接。
24.根据实施方案14所述的miRNA拮抗剂，其中所述miRNA拮抗剂包含骨架修饰。
25.根据实施方案24所述的miRNA拮抗剂，其中所述骨架修饰选自C3间隔区或ZEN。
26.根据实施方案14所述的miRNA拮抗剂，其中所述miRNA拮抗剂包含在每个位置处的2’-O-甲基修饰和在5’-端与3’-端二者的连续残基处的3个硫代磷酸酯核苷酸间连接。
27.根据实施方案14所述的miRNA拮抗剂，其中所述miRNA拮抗剂包含在每个位置处的硫代磷酸酯连接和在位置1、3、4、6、7、9、 10、12、13和15处的2’-O-甲基修饰以及在位置2、5、8、11和14处的LNA修饰。
28.根据实施方案14所述的miRNA拮抗剂，其中所述miRNA拮抗剂包含在每个位置处的2’-O-甲基修饰和处于位置1和2之间以及在 3’-端处的ZEN修饰。
29.根据实施方案14所述的miRNA拮抗剂，其中所述miRNA拮抗剂由选自SEQ IDNO:32-43、326-328的序列表示。
30.一种用于增加成熟miR-21的稳态水平的pre-miRNA模拟物，其包含：
(a)有义序列；
(b)反义序列；以及
(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度。
31.根据实施方案30所述的pre-miRNA，其中所述成熟miR-21由 SEQ ID NO.4表示。
32.根据实施方案30所述的pre-miRNA模拟物，其中所述环区域由直接连接组成，或由1-2个核苷酸或核苷酸部分组成。
33.根据实施方案30所述的pre-miRNA模拟物，其中所述pre- miRNA模拟物由选自SEQ ID NO:44-48的序列表示。
34.一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及至少一种选自以下项的寡核苷酸：
(a)实施方案1的sshRNA；
(b)实施方案14的miRNA拮抗剂；以及
(c)实施方案30的pre-miRNA模拟物。
35.一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及选自以下项的寡核苷酸的组合：
(a)实施方案1的sshRNA；
(b)实施方案14的miRNA拮抗剂；以及
(c)实施方案30的pre-miRNA模拟物。
36.根据实施方案34或35所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的基底为网状物或敷料。
37.根据实施方案36所述的药物组合物，其中所述网状物为分层网状物。
38.根据实施方案34或35所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于局部给药。
39.一种用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括施用治疗有效量的选自以下项的组合物：
(a)实施方案1的sshRNA；
(b)实施方案14的miRNA拮抗剂；
(c)实施方案30的pre-miRNA模拟物；以及
它们的组合。
40.根据实施方案39所述的方法，其中所述伤口为慢性伤口。
41.根据实施方案39所述的方法，其中所述伤口为非愈合性伤口。
42.根据实施方案39所述的方法，其中所述受试者患有糖尿病。
43.根据实施方案39所述的方法，其中所述伤口为皮肤伤口。
44.根据实施方案39所述的方法，其包括局部施用所述组合物。
45.根据实施方案39所述的方法，其包括敷料，其中所述敷料包含所述组合物。
46.根据实施方案1、14或30中任一项所述的寡核苷酸及其任何组合，其用于在治疗动物或人的伤口的方法中使用。
47.根据实施方案1、14或30中任一项所述的RNA寡核苷酸及其任何组合，其用于治疗受试者的伤口。
48.一种试剂盒，其包含：
(a)实施方案1的sshRNA；
(b)实施方案14的miRNA拮抗剂；以及
(c)实施方案30的pre-miRNA模拟物。
实施例
实施例1.用sshRNA靶向PHD2
图2A示出了用渐增量的靶向PHD2的sshRNA(SG302，SEQ ID NO.7)或siRNA(SG303，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)或对照sshRNA(SG221c)转染的人胚肾293FT细胞中人PHD2(SEQ ID NO.1)转录物的定量逆转录PCR(qRT-PCR)。采用2-ΔΔCt方法相对于未用抑制剂转染的细胞来定量转录物水平，并相对于GAPDH转录物进行归一化。图2B示出了用渐增量的靶向PHD2的sshRNA(SG400， SEQ ID NO.24和SG402，SEQ ID NO.26)、靶向PHD2的siRNA (SG403，SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29)或对照sshRNA(SG221c) 转染的小鼠NIH3T3成纤维细胞中小鼠PHD2(SEQ ID NO.2)转录物的qRT-PCR。采用2-ΔΔCt方法相对于未用抑制剂转染的细胞来定量转录物水平，并相对于GAPDH转录物进行归一化。
实施例2.用PHD2 sshRNA靶向HIF-1α网络
图3A示出了萤光素酶报道基因测定的结果，其中萤火虫萤光素酶(f-Luc)的质粒处于含有HIF-1α应答元件的启动子的控制之下。使用组成型表达海肾萤光素酶(r-Luc)的质粒作为转染归一化对照。用上述质粒和靶向PHD2的单个sshRNA(SG300(SEQ ID NO.5)、SG301(SEQ ID NO.6)或SG302(SEQ ID NO.7))或用对照sshRNA (NSC sshRNA)共转染人胚肾293FT细胞。转染后48小时，确定了相对于r-Luc归一化的f-Luc信号。将数值相对于NSCsshRNA对照进行归一化。图3B示出了未用抑制剂处理(泳道1)、用两种浓度的对照sshRNA(阴性对照sshRNA；泳道2和3)、各自两种浓度的SG303(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)和SG302(SEQ ID NO.7) (分别为泳道4和5以及6和7)处理的人胚肾293FT细胞中以及用氯化钴(CoCl2；泳道8)处理的未转染细胞中HIF-1α和核纤层蛋白的Western印迹研究。计算相对于无抑制剂处理的HIF-1α的值，并相对于核纤层蛋白进行归一化。图3C示出了用渐增量的SG302(SEQ ID NO.7)转染的人胚肾293FT细胞中VEGF(泳道1、4、7、10、13、 16和19)、HSP90(泳道2、5、8、11、14、17和20)和HSP70(泳道3、6、9、12、15、18和21)的qRT-PCR。转染后48小时分离总 RNA。定量表示为相对于未转染细胞的诱导倍数，并采用2-ΔΔCt方法将其相对于GAPDH进行归一化。
实施例3.sshRNA修饰对RNAi的影响
图4A示出了用渐增量的SG302(SEQ ID NO.7)或靶向PHD2 的修饰sshRNA(SG302m1，SEQ ID NO.8)转染的人原代正常人表皮角质形成细胞(NHEK)中人PHD2转录物的qRT-PCR。转染后48h 分离总RNA。PHD2转录物通过2-ΔΔCt方法来定量，相对于GAPDH进行归一化。定量表示为相对于未转染细胞的抑制倍数。图4B示出了用渐增量的SG402(SEQ IDNO.26)、靶向PHD2的修饰sshRNA (SG402m1，SEQ ID NO.27)或杂乱对照sshRNA(SG402-scr)转染的小鼠NIH3T3成纤维细胞中小鼠PHD2转录物的qRT-PCR。将值相对于对照转录物(GAPDH)以及相对于未转染的小鼠细胞进行归一化，并采用2-ΔΔCt方法进行定量。图4C示出了用渐增量的靶向PHD2的未修饰的sshRNA(SG404，SEQ ID NO.30)或SG402m1(SEQ IDNO.27) 转染的小鼠NIH3T3成纤维细胞中小鼠PHD2(mPHD2)转录物的 qRT-PCR。如图4B所述对数据进行分析。
实施例4.sshRNA对免疫刺激途径的影响
在具有含10％胎牛血清的基本必需培养基的情况下，将MRC- 5人肺成纤维细胞接种在24孔板中，每孔6×104个细胞。使用Lipofectamine 2000进行转染。20纳摩尔(nM)sshRNA或等量的聚肌苷/胞嘧啶(poly I:C)一式三份进行转染。未转染的细胞和仅接受Lipofectamine 2000的细胞用作阴性对照。24小时后，将细胞在
Figure RE-GDA0003331911510000891
((InvitrogenTM，Carlsbad，CA)中裂解，并根据制造商的说明书提取总RNA。使用具有
Figure RE-GDA0003331911510000892
通用PCR主混合物(
Figure RE-GDA0003331911510000893
Universal PCR Master Mix)、IFN-β、IL-6、TNF-α和GAPDH
Figure RE-GDA0003331911510000894
探针的高容量cDNA逆转录试剂盒(High-Capacity cDNAReverse Transcription Kit)以及7500Fast实时PCR系统(Applied Biosystems， FosterCity，CA)，遵循制造商的方案进行QRT-PCR。IFN-β、IL-6和 TNF-α转录物通过2-ΔΔCt方法进行定量，相对于GAPDH进行归一化。图5A示出了对在未用抑制剂处理、用聚肌苷/胞嘧啶(polyI:C)、SG302(SEQ ID NO.7)或SG302m1(SEQ ID NO.8)处理的细胞中 IFN-β的qRT-PCR测定。图5B示出了对在未用抑制剂处理、用polyI:C、 SG302(SEQ ID NO.7)或SG302m1(SEQID NO.8)处理的细胞中IL- 6的qRT-PCR测定。图5C示出了对在未用抑制剂处理、用polyI:C、 SG302(SEQ ID NO.7)或SG302m1(SEQ ID NO.8)处理的细胞中 TNF-α的qRT-PCR测定。图5D示出了对在未用抑制剂处理、用polyI:C、 SG402(SEQ ID NO:26)、SG402m1(SEQ IDNO.27)或SG404(SEQ ID NO.30)处理的细胞中IFN-β的qRT-PCR。图5E示出了对在未用抑制剂处理、用polyI:C、SG402(SEQ ID NO.26)、SG402m1(SEQ ID NO.27)或SG404(SEQ ID NO:30)处理的细胞中IL-6的qRT- PCR测定。图5F示出了对在未用抑制剂处理、用polyI:C、SG402(SEQ ID NO:26)、SG402m1(SEQ ID NO.27)或SG404(SEQ ID NO.30) 处理的细胞中TNF-α的qRT-PCR测定。
实施例5.sshRNA修饰对血清稳定性的影响
图6示出了未修饰的sshRNA(SG402，SEQ ID NO.26)和修饰的shRNA(SG404，SEQ IDNO.30)的血清稳定性测定。将3.35微克 (μg)的SG404(SEQ ID NO.30)和SG402(SEQ IDNO.26)与磷酸盐缓冲盐水中的10％人血清(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)在37℃温育不同时间(0分钟(0’)至24小时(24h))。在每个时间点时，取出等分试样，与2X凝胶加样缓冲液(
Figure RE-GDA0003331911510000901
Austin，TX)混合，并立即储存于-80℃下。通过12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％聚丙烯酰胺、20％甲酰胺和8M尿素)分析样品，并用SYBR Gold (InvitrogenTM，Carlsbad，CA)染色。约40个核苷酸的条带对应于全长sshRNA。
实施例6.sshRNA与miRNA拮抗剂组合的效果
图7A示出了miR-210miRNA拮抗剂的可能的修饰模式。图7B 示出了用以下物质转染的人HaCaT角质形成细胞中人PHD2转录物的qRT-PCR：无抑制剂；靶向人PHD2的sshRNA(SG302，SEQ ID NO.7)；对照sshRNA(ssh-NSC)；SG302(SEQ ID NO.7)和LNA 修饰的miR-210(SEQ ID NO.3)miRNA拮抗剂(SG302+LNA210)； SG302(SEQ ID NO.7)和2’-O-甲基修饰的miR-210miRNA拮抗剂 (SG302+2’-O-甲基210)；ssh-NSC和LNA修饰的对照miRNA拮抗剂(ssh-NSC+LNA-NSC)；LNA210；2’-O-甲基210；和LNA-NSC。将数值相对于对照转录物(GAPDH)以及相对于未转染的人HaCaT 角质形成细胞进行归一化。图7C示出了用以下物质转染的人HaCaT 角质形成细胞中miR-210miRNA的miRNA qRT-PCR(miR-qRT-PCR)：无抑制剂；SG302；ssh-NSC；SG302+LNA210；SG302+2’-O-甲基210； ssh-NSC+LNA-NSC；LNA210；2’-O-甲基210；和LNA-NSC。将数值相对于对照小核仁RNA(RNU44)以及相对于未转染的人HaCaT角质形成细胞进行归一化。图7D示出了未用抑制剂或用miR-210模拟物转染的人HaCaT角质形成细胞中miR-210报道基因的萤光素酶测定。该miR-210报道基因通过将由在E2F3的3’非翻译区(3’UTR) 中发现的靶标衍生的四个串联miR-210结合位点(各自由8个碱基对 (bp)序列分隔开)亚克隆到psiCheck-2双萤光素酶报道基因载体 (Promega)的海肾萤光素酶(r-Luc)的3’UTR中而产生。该载体还含有用于转染归一化的组成型表达的萤火虫萤光素酶(f-Luc)。图7E 示出了用以下物质处理的人HaCaT角质形成细胞中miR-210报告基因的萤光素酶测定：无抑制剂(第1柱)；CoCl2(第2柱)；CoCl2和浓度渐增的DNA修饰的miR-210miRNA拮抗剂(DNA210；第3- 6柱)；CoCl2和浓度渐增的miR-210miRNA拮抗剂(RNA210；第7- 10柱)；CoCl2和浓度渐增的2’-O-甲基修饰的miR-210miRNA拮抗剂(2’-O-甲基210；第11-14柱)；CoCl2和浓度渐增的LNA修饰的 miR-210miRNA拮抗剂(LNA210；第15-18柱)；以及CoCl2和浓度渐增的对照miRNA拮抗剂(NSC；第19-22柱)。如图7D那样将数值进行归一化。图7F示出了用渐增量的靶向人PHD2的sshRNA (SG302，SEQ ID NO.7)和对照sshRNA(SG221c)转染的人原代角质形成细胞中人PHD2转录物的qRT-PCR。采用2-ΔΔCt方法相对于未用抑制剂转染的细胞来定量转录物水平，并将其相对于GAPDH转录物进行归一化。图7G示出了用渐增量的靶向人PHD2的sshRNA (SG302，SEQ ID NO.7)和对照sshRNA(SG221c)转染的人原代角质形成细胞中miR-210的qRT-PCR。采用2-ΔΔCt方法相对于未用抑制剂转染的细胞来定量miRNA水平，并相对于RNU44小核仁RNA进行归一化。图7H示出了用渐增量的靶向小鼠PHD2的sshRNA(SG404，SEQ ID NO.30)转染的NIH-3T3细胞中小鼠PHD2转录物的qRT- PCR。采用2-ΔΔCt方法相对于未用抑制剂转染的细胞来定量转录物水平，并将其相对于GAPDH转录物进行归一化。图7I示出了用渐增量的靶向小鼠PHD2的sshRNA(SG404，SEQ ID NO.30)转染的NIH- 3T3细胞中miR-210的qRT-PCR。采用2-ΔΔCt方法相对于未用抑制剂转染的细胞来定量miRNA水平，并将其相对于sno-234小核仁RNA 进行归一化。图7J示出了单独的以及与靶向PHD2的SG302sshRNA (SEQ ID NO.7)和antimiR-210(SG603，SEQ ID NO.34)组合的PHD2 和miR-210在HaCaT细胞中的相对表达。
实施例7.miRNA拮抗剂对免疫刺激途径的影响
图8A示出了用以下物质处理的MRC-5肺成纤维细胞中IFN-β的qRT-PCR：无抑制剂；polyI:C；DNA修饰的miR-210miRNA拮抗剂(210DNA anti(SG602，SEQ ID NO.33))；miR-210miRNA拮抗剂(210RNA anti(SG601，SEQ ID NO.32))；2’-O-甲基修饰的 miR-210miRNA拮抗剂(210 2’-O甲基anti(SG603，SEQ ID NO.34))； LNA修饰的miR-210miRNA拮抗剂(210LNA anti(SG604，SEQ ID NO.35))；和LNA修饰的对照miRNA拮抗剂(210NSC(LNA)(SG605，SEQ ID NO.36))。图8B示出了用以下物质处理的细胞中IL-6的qRT-PCR：无抑制剂；polyI:C；210DNA anti；210RNA anti； 210 2’-O-甲基anti；210LNA anti；和210NSC(LNA)。图8C示出了用以下物质处理的细胞中TNF-α的qRT-PCR：无抑制剂；polyI:C； 210DNA anti；210RNA anti；210 2’-O-甲基anti；210LNA anti；和210 NSC(LNA)。
实施例8.荧光缀合物部分对sshRNA活性的影响
图9示出了小鼠细胞中小鼠PHD2(mPHD2)转录物的qRT- PCR，该小鼠细胞用渐增量的靶向PHD2的未修饰的sshRNA(SG404， SEQ ID NO.30)或修饰为具有与环的第一个核苷酸缀合的C6-胺-德克萨斯红(AlexaFluor594)的靶向PHD2的sshRNA(SG405，SEQ ID NO.31)转染。通过2-ΔΔCt方法将数值相对于对照转录物(GAPDH)以及相对于未转染的小鼠细胞进行归一化。
实施例9.sshRNA对糖尿病伤口愈合的影响
使用瘦素受体缺陷型db/db II型糖尿病小鼠模型作为糖尿病伤口愈合的模型。使用8至12周龄的雄性进行研究。异氟醚作为麻醉剂施用，并且在db/db小鼠的背部距中线等距离地成对创建全厚皮肤钻取活检(直径6mm)。将皮肤和底层膜从活检区域中去除。在钻取活检之后，将具有中心直径约为6mm的孔的橡皮圈缝合在伤口周围，以用夹板固定伤口张开，从而防止伤口挛缩并允许通过再上皮化进行愈合。从麻醉中恢复后将动物送回畜舍设施。所有步骤均使用无菌技术进行。使用无菌器械，并将动物夹住且用聚维酮碘(Betadine)进行准备。伤口用敷料覆盖以限制感染。
然后第二天将寡核苷酸制剂施加于动物。每个治疗组有4只动物，每只动物有两个伤口(伤口数＝8/组)。逐层组(LbL)接受用其上印有包含靶向小鼠PHD2的sshRNA(SG404)的网状物的敷料的局部治疗。A6K肽组(A6K)注射300皮摩尔(pmol)的SG404和A6K 肽。HiPerFect组(HiPerFect)注射300pmol SG404和HiPerFect试剂。对照组按照A6K和HiPerFect组的方式注射PBS。对于A6K、 HiPerFect和PBS组，注射为皮内注射，并在伤口周围局部施用4次注射。每隔一天拍摄伤口图像以监测伤口闭合的进展。以数字方式计算伤口面积，并产生闭合时间曲线。图10A示出了LbL、A6K、HiPerFect 和对照治疗组中在25天内相对于初始伤口面积的百分比。*图10A中的曲线图上的时间点上的*表示SG404-LbL组(菱形标记符)相比于对照组(正方形标记符)的p值<0.05。用靶向PHD2的sshRNA(SG404) 治疗改善了糖尿病伤口愈合。图10B示出了在LbL、A6K、HiPerFect 和对照治疗组中的伤口闭合前天数。SG404-LbL组中的平均伤口闭合前时间相比于对照组(20.6±0.45天)为17±1.05天。*表示SG404 LbL 组与对照组之间关于伤口闭合前天数的p值＝0.01。靶向PHD2的sshRNA在db/db小鼠中显示了治疗上显著的伤口闭合速率提高以及伤口闭合前时间缩短。
进行了进一步的研究，其中如上所述使db/db小鼠受伤。然后动物不予治疗或给予对照sshRNA(SG221c)、SG404或miR-210拮抗剂(SG603)的LbL局部治疗。图10C示出了未治疗、SG404、SG603 和SG221c治疗组中在25天内相对于初始伤口面积的百分比。图10D 示出了在每个治疗组中的伤口闭合前天数。平均伤口闭合前天数±SEM如下：SG404(14.00±0.68天)、SG603(15.33±0.61天)、SG221c 对照(16.33±0.07天)、未治疗对照(18.33±1.42天)。SG404相比于未治疗和SG404相比于SG221c对照sshRNA的P值分别为0.021 和0.034。SG603相比于未治疗对照的P值为0.08。
在如上所述使db/db小鼠受伤的进一步研究中，进行组织学分析以检查sshRNA治疗对伤口区域中的新血管形成的影响。动物不予治疗或对每个治疗组总共6个伤口给予对照sshRNA(SG221c)或 SG404 sshRNA的LbL局部治疗。受伤后第7天处死动物，并制备组织学载玻片并用针对Willebrand因子(vWF)的抗体(EMD Millipore) 进行染色。每个载玻片捕获3张图像。用通过Image J软件测量的荧光强度进行盲法分析。图10E示出了每个治疗组在第7天的荧光染色的代表性图像。在图10F中，绘制了针对每个治疗组的vWF染色的计算值(积分密度)。针对vWF的染色显示，SG404处理的伤口在受伤后第7天时，伤口区域中的新血管形成显著增加。曲线图上在治疗组之间的*代表p值<0.05。
实施例10.靶向小鼠PHD2和人PHD2二者的sshRNA的研发
图11A示出了用1nM或10nM的以下物质转染的人肾293FT 细胞中人PHD2转录物的qRT-PCR：无抑制剂；被设计成靶向人PHD2 的sshRNA(SG302(SEQ ID NO.7)、SG304-SG309(SEQ ID NO.11- SEQ ID NO.16))；和被设计成靶向小鼠PHD2的sshRNA(SG400- SG402，SEQID NO.24-SEQ ID NO.26)；和对照sshRNA(NSC)。通过2-ΔΔCt方法将数值相对于对照转录物(GAPDH)以及相对于未转染的人HaCaT角质形成细胞进行归一化。图11B示出了用渐增量的被设计成靶向小鼠PHD2的sshRNA(SG404，SEQ ID NO.30)或被设计成靶向人PHD2的修饰sshRNA(SG302m1，SEQ ID NO.8)转染的小鼠NIH3T3成纤维细胞中小鼠PHD2(mPHD2)转录物的qRT-PCR。通过2-ΔΔCt方法将数值相对于对照转录物(GAPDH)以及相对于未转染的小鼠NIH3T3成纤维细胞进行归一化。图11C示出了用渐增量的被设计成靶向人PHD2或小鼠PHD2的sshRNA(SG312(SEQ ID NO.19)和SG314-SG316(SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.23))或被设计成靶向人PHD2的修饰的sshRNA(SG302m1，SEQ ID NO.8)转染的人HaCaT角质形成细胞中人PHD2(hPHD2)转录物的qRT-PCR。通过2-ΔΔCt方法将数值相对于对照转录物(GAPDH)以及相对于未转染的人HaCaT角质形成细胞进行归一化。图11D示出了用渐增量的被设计成靶向人PHD2或小鼠phd2的sshRNA(SG312(SEQ ID NO.19) 和SG314-SG316(SEQ ID NO.21-SEQ IDNO.23))或被设计成靶向人PHD2的修饰的sshRNA(SG302m1，SEQ ID NO.8)转染的小鼠NIH3T3成纤维细胞中小鼠Phd2(mPHD2)转录物的qRT-PCR。将数值相对于对照转录物(Gapdh)以及相对于未转染的NIH3T3成纤维细胞进行归一化。
实施例11.sshRNA和miRNA拮抗剂对划痕伤口闭合的影响
为了测量细胞迁移，将人HaCaT角质形成细胞以约60％至约 70％的汇合度接种于12孔板中，并用sshRNA和微RNA拮抗剂转染。当细胞达到约100％汇合时，将培养基替换为含有0.5％胎牛血清的 Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco’s Modified EagleMedium)， 2小时后用200μL移液管尖端划伤。对于每个转染条件在6个标记位置处，在划伤后立即以及在指定时间点获取整个无细胞划痕的照片和测量结果。相对于初始划痕宽度计算每个时间点的闭合百分比。图 12A示出了用以下物质转染的人HaCaT角质形成细胞在24小时(24 h)、48h和72h时的划痕闭合百分比：靶向人PHD2的sshRNA (SG302，SEQ ID NO.7)和LNA修饰的miR-210miRNA拮抗剂 (SG302(SEQ ID NO.7)+LNA210)；SG302(SEQ ID NO.7)和2’- O-甲基修饰的miR-210miRNA拮抗剂(SG302+2’-O-甲基210)；以及对照sshRNA(ssh-NSC)和LNA-修饰的对照miRNA拮抗剂(ssh- NSC+LNA-NSC)。图12B提供了用SG302+LNA210、SG302+2’-O- 甲基210和ssh-NSC+LNA-NSC转染的人HaCaT角质形成细胞在0 小时(0h)、24h和48h时的划痕伤口的代表性图像。粗体所示为以微米(μm)为单位的划痕伤口距离。所有图像的比例尺为100μm。
如上所述用正常人表皮角质形成细胞(NHEK)进行类似的划痕伤口研究。结果在表2中示出。
表2
Figure RE-GDA0003331911510000961
实施例12.pre-miRNA模拟物的设计和功效
图13A-E示出了针对miR-21的pre-miRNA模拟物的设计。成熟miR-21(SEQ IDNO.4)为黑框内的序列。核苷酸之间的线对应于碱基配对相互作用。核苷酸之间的点对应于凸起核苷酸对面的空间。修饰的核苷酸加下划线。图13F示出了在未用模拟物或用miR-21模拟物转染的人293FT细胞中miR-21报道基因的萤光素酶测定。该 miR-21报道基因通过将四个串联miR-21互补结合位点(各自由8个碱基对(bp)序列分隔开)亚克隆到psiCheck-2双萤光素酶报道基因载体(Promega)的海肾萤光素酶(r-Luc)的3’UTR中而产生。该载体还含有用于转染归一化的组成型表达的萤火虫萤光素酶(f-Luc)。图13F示出了用浓度渐增的以下物质处理的人293FT细胞中miR-21 报道基因的萤光素酶测定：SG701，SEQ ID NO.44(图13A)；SG702， SEQ ID NO.45(图13B)；SG703，SEQ ID NO.46(图13C)；SG703， SEQ ID NO.46(第2次重复)(图13C)；SG704，SEQ ID NO.47(图 13D)；miRIDIAN miR-21模拟物(Dharmacon，阳性对照)和cel-67 模拟物(Dharmacon，miRIDIAN miRNA模拟物阴性对照#1)。如图 7D所示相对于未用模拟物转染的细胞来计算数值。
实施例13.pre-miRNA模拟物设计的效果
表达在Oct4启动子控制下的绿色荧光蛋白(Oct4-GFP)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行模拟转染，用标准miR-302b miRNA (miRIDIAN)、用miR-302b种子突变体或与图13E中的pre-miR-21 设计相当的sshRNA-pre-miR-302b(Somagenics)转染。两天后，将这些细胞用表达Oct4、Klf4和Sox2的逆转录病毒载体的混合物转导。图14A示出了在转染后10、12、14和16天，模拟转染、miRIDIAN 和Somagenics组中Oct4-GFP阳性集落的平均(Ave)数目。图14B 示出了在一段时间过程内，种子突变体、MiRIDIAN和Somagenics处理组中GFP阳性细胞相对于用对照载体转染的细胞的百分比。
实施例14.sshRNA、miRNA拮抗剂和miRNA模拟物在糖尿病伤口愈合中的组合效果
如实施例9所述进行瘦素受体缺陷型db/db II型糖尿病小鼠模型的皮肤创伤。
然后在第二天将寡核苷酸制剂施加于所述动物。所有制剂均作为在印有寡核苷酸的敷料上的LbL网状物局部给予。在组1中，寡核苷酸为SG404(SEQ ID NO.30)。在组2中，寡核苷酸为SG603(SEQ ID NO.34)。在组3中，寡核苷酸为图13C中所呈现的化学修饰的 miR-21pre-miRNA模拟物(pre-miR-21)。在组4中，寡核苷酸为 SG404(SEQ ID NO.30)和SG603(SEQ ID NO.34)。在组5中，寡核苷酸为SG404(SEQ ID NO.30)和pre-miR-21。在组6中，寡核苷酸为SG603(SEQ ID NO.34)和pre-miR-21。在组7中，寡核苷酸为 SG404(SEQ ID NO.30)、SG603(SEQ ID NO.34)和pre-miR-21。在组8中，寡核苷酸为sshRNA对照SG221c、miRNA拮抗剂对照NSC 和pre-miR-21的对照杂乱形式(pre-miR-21-sc)。如实施例9所述，拍摄伤口的图像，计算伤口面积，并且生成闭合时间曲线。在以下组之间进行比较：组1-7中的每一个与组8：组4与组1和2；组5与组1和3；组6与组2和3；组7与组4、5和6。
实施例15.对具有慢性糖尿病伤口的受试者治疗性施用寡核苷酸
被诊断为患有糖尿病的有需要的受试者经历慢性、非愈合性糖尿病足伤口。为了治疗这些伤口，将敷料施加于受试者的足部伤口。在敷料上为LbL网状物，在其上分层印有靶向人PHD2的sshRNA、 LNA、2’-O-甲基修饰的miR-210miRNA拮抗剂和2’-O-甲基修饰的pre-miR-21pre-miRNA模拟物。在清洗伤口之后，施加敷料，使得该网状物与伤口紧密物理接触。保持敷料，并且如果必要的话，用具有含寡核苷酸的LbL网状物的新鲜敷料来替换。伤口完全闭合则敷料治疗结束。
实施例16.对具有慢性糖尿病伤口的受试者治疗性施用sshRNA的多核苷酸载体
被诊断为患有糖尿病的有需要的受试者经历慢性、非愈合性糖尿病足伤口。为了治疗这些伤口，将敷料施加于受试者的足部伤口。在敷料上为LbL网状物，其上分层印有从EF1α启动子开始表达的靶向人PHD2的sshRNA的重组腺相关病毒(rAAV)。rAAV为AAV1 血清型，并生成为1011pfu。在产生病毒时，以反式方式提供为AAV 提供辅助功能的腺病毒基因，以允许产生rAAV颗粒，使得通过三质粒系统产生rAAV，以降低产生野生型AAV的可能性。在清洗伤口之后，施加敷料，使得该网状物与伤口紧密物理接触。保持敷料，并且如果必要的话，用具有含有病毒的LbL网状物的新鲜敷料来替换。伤口完全闭合后则敷料治疗结束。
实施例17.通过荧光测量的db/db小鼠中LBL-PHD2 sshRNA的摄取
如实施例9所述进行瘦素受体缺陷型db/db II型糖尿病小鼠模型的皮肤创伤。然后在第二天将含有Alexa Fluor 594标记物的寡核苷酸制剂LbL-SG405(SEQ ID NO.31)施加于所述动物。在第2天、第 4天和第6天收获伤口。制备冷冻切片并通过荧光显微术进行成像。图15示出了在每个时间点时的代表性图像，显示LbL-SG405(SEQ ID NO.31)已摄取到伤口区域的细胞中。每个时间点获得6张代表性图像，并使用Image J软件对荧光面积进行定量。结果在图15中绘出。在所有时间点均观察到SG405(SEQ ID NO.31)的摄取。
序列表
<110> 索马根尼科斯公司
<120> 用于伤口愈合的短小发夹RNA与微RNA的组合物以及方法
<130> 40220-710.601
<140>
<141>
<150> 62/204,957
<151> 2015-08-13
<160> 329
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7102
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
ttaggggcag aaaaacattt gtaataatta atggctttga gagacacaag gctttgtttg 60
ccccagagta ttagttaacc cacctagtgc tcctaatcat acaatattaa ggattgggag 120
ggacattcat tgcctcactc tctatttgtt tcaccttctg taaaattggt agaataatag 180
tacccacttc atagcattgt atgatgatta aattggttaa tatttttaaa atgcttagaa 240
cacagattgg gcacataaca gcaagcacca catgtgttta taagataaat tcctttgtgt 300
tgccttccgt taaagtttaa ataagtaaat aaataaataa atacttgcat gacattttga 360
agtctctcta taacatctga gtaagtggcg gctgcgacaa tgctactgga gttccagaat 420
cgtgttggtg acaagattgt tcaccagcat atggtgtggt gaaaactcac taatttggaa 480
ttagttcaga ttattaagcc tgaataggtg aaaatcctga aatcaaggat ctttggaact 540
atttgaaatc agtattttat attttcctgt tgtattcatt aaagtgttgc aagtgttcta 600
tttgatggat taagtatatt taggatatac atgttcaatt tgtgattttg tatacttaat 660
tggaacaaga aagctaataa aggttttgat atggacatct attcttttaa gtaaacttca 720
atgaaaatat atgagtagag catatagaga tgtaaataat ttgtggacac accacagact 780
gaaatagcaa atttaaaaga aattgttgga agaatcaagt gtttgtggaa tgagtcctcc 840
tagtaaagtt cctgctcttg tgaataatta agcctcatgt ataattacta tagcaaaagg 900
aagcctaaga agtattagac tctacttgta tttaaattac attttacata atttatgtgt 960
atgaaaaatg ttttaaatgc ttattttcgt aagccatgag atagctcctt tatattttaa 1020
gaatttctga attaatttgc ttggatttta ttagtgcaaa tggcagagct agcaattcct 1080
ttttctgtgt tcccattcca tcctattcat ccctctttta ggaaactctg aactctggat 1140
tgtccttgtt tacatacctg cctcctgcat tggactatgt gtctctgagt gtagtatgac 1200
taattcattt gtttgtcaag gactctcaat gcatttgttg aacagcctaa ttagtaatgt 1260
ctgcaacaat gacattttac tgtatttaat aaagctctgg gaaagtagga tacacataag 1320
acaggtctag gtctaaattc tttacagaaa cttggatttt tagttcggtt tgaaatttga 1380
agatgtgagt atatttatct cagtttccca aaggacaagc taattggaat tatcatcctc 1440
tttcacttga ttggatcccc agaatgccat ttacgcatgc agcaggattt tataacagtt 1500
ttaaattctg tatatttgat gaagaggttt tatatttttg gattcaagcc tctttttaaa 1560
cttctacaat atggtttaca ataattcctt atatcctgct tttgaaatac atattacaac 1620
tttttaagtt tggaaggcta tatttcaagg actgaagtta cagtatactc aagtgataca 1680
caagcctagc accccacttt ccacatagtg ttcgataaag attgataaac tcgaaatcac 1740
agacctttta attcttaaga caaatagcag cagaaagaaa catctttggc ttatttctgg 1800
taaggttttt atgctctgta aaacaaagaa ttgtattcat ccgcgcagca cagattctat 1860
taaaaataaa tgtgagagtc gttaatgtag tactgctcat ttaccatcaa aattcacttt 1920
tcaggaataa tcccatcagt ttaaattgga tattggaatg agcattgatt acatttaact 1980
tggtagccca aaatttcttc atggggtttt gaactcggcg ggatttcaaa ggttttaaaa 2040
atgagttttt gatttttttt aaaaccctca aatttcatta cctttaaact aggtcgaaac 2100
ggggcgcaag agattggatt aacaccatag taatacttat tttgttctta accatttcag 2160
ggcttcttga aatagaggct gtatggtgta atggaaaaaa cagccttgga atctgggagc 2220
ctgattcctg gattcagtcc cagttttgcg tgaccttggg caagttactt tacttctctg 2280
aatttccgtt tcctcctctg caaaatgagg atcgcaatag ccaccttgca accttgactg 2340
gagcgagcct cgcacacccc gcgccggcct ggaggaagag cagccatgat tacgccgcct 2400
tcgctccgct acccgcttgc ggctggcgcc ctcctccagc aggtgtaggc gctgccgcgc 2460
tgccccacgc ctttccgccg ctcgcgggcc tgcgcctcgg cgtccccgag gaggccgctg 2520
cgggctgagg tagcgcaccg gcctctcggc gtcccagtcc ggtcccgggc ggagggaaag 2580
cgggcgaccc acctccgagg cagaagccga ggcccggccc cgccgagtgc ggaggagcgc 2640
aggcagcccc cgcccctcgg ccctcccccc ggccctcccg gccctccctc cgccccctcc 2700
gccctcgcgc gccgcccgcc cgggtcgccg cggggccgtg gtgtacgtgc agagcgcgca 2760
gagcgagtgg cgcccgtatg ccctgcgctc ctccacagcc tgggccgggc cgcccgggac 2820
gctgaggcgg cggcggcggc cgagggggcc ggtcttgcgc tccccaggcc cgcgcgcctg 2880
agcccaggtt gccattcgcc gcacaggccc tattctctca gccctcggcg gcgatgaggc 2940
gctgaggcgg ctgccggcgc tgcgccggag cttaggactc ggaagcggcc gggccgaggg 3000
cgtggggtgc cggcctccct gaggcgaggg tagcgggtgc atggcgcagt aacggcccct 3060
atctctctcc ccgctcccca gcctcgggcg aggccgtccg gccgctaccc ctcctgctcg 3120
gccgccgcag tcgccgtcgc cgccgccgcc gccgccatgg ccaatgacag cggcgggccc 3180
ggcgggccga gcccgagcga gcgagaccgg cagtactgcg agctgtgcgg gaagatggag 3240
aacctgctgc gctgcagccg ctgccgcagc tccttctact gctgcaagga gcaccagcgt 3300
caggactgga agaagcacaa gctcgtgtgc cagggcagcg agggcgccct cggccacgga 3360
gtgggcccac accagcattc cggccccgcg ccgccggctg cagtgccgcc gcccagggcc 3420
ggggcccggg agcccaggaa ggcagcggcg cgccgggaca acgcctccgg ggacgcggcc 3480
aagggaaaag taaaggccaa gcccccggcc gacccagcgg cggccgcgtc gccgtgtcgt 3540
gcggccgccg gcggccaggg ctcggcggtg gctgccgaag ccgagcccgg caaggaggag 3600
ccgccggccc gctcatcgct gttccaggag aaggcgaacc tgtacccccc aagcaacacg 3660
cccggggatg cgctgagccc cggcggcggc ctgcggccca acgggcagac gaagcccctg 3720
ccggcgctga agctggcgct cgagtacatc gtgccgtgca tgaacaagca cggcatctgt 3780
gtggtggacg acttcctcgg caaggagacc ggacagcaga tcggcgacga ggtgcgcgcc 3840
ctgcacgaca ccgggaagtt cacggacggg cagctggtca gccagaagag tgactcgtcc 3900
aaggacatcc gaggcgataa gatcacctgg atcgagggca aggagcccgg ctgcgaaacc 3960
attgggctgc tcatgagcag catggacgac ctgatacgcc actgtaacgg gaagctgggc 4020
agctacaaaa tcaatggccg gacgaaagcc atggttgctt gttatccggg caatggaacg 4080
ggttatgtac gtcatgttga taatccaaat ggagatggaa gatgtgtgac atgtatatat 4140
tatcttaata aagactggga tgccaaggta agtggaggta tacttcgaat ttttccagaa 4200
ggcaaagccc agtttgctga cattgaaccc aaatttgata gactgctgtt tttctggtct 4260
gaccgtcgca accctcatga agtacaacca gcatatgcta caaggtacgc aataactgtt 4320
tggtattttg atgcagatga gagagcacga gctaaagtaa aatatctaac aggtgaaaaa 4380
ggtgtgaggg ttgaactcaa taaaccttca gattcggtcg gtaaagacgt cttctagagc 4440
ctttgatcca gcaatacccc acttcaccta caatattgtt aactatttgt taacttgtga 4500
atacgaataa atgggataaa gaaaaataga caaccagttc gcattttaat aaggaaacag 4560
aaacaacttt ttgtgttgca tcaaacagaa gattttgact gctgtgactt tgtactgcat 4620
gatcaacttc aaatctgtga ttgcttacag gaggaagata agctactaat tgaaaatggt 4680
ttttacatct ggatatgaaa taagtgccct gtgtagaatt tttttcattc ttatattttg 4740
ccagatctgt tatctagctg agttcatttc atctctccct tttttatatc aagtttgaat 4800
ttgggataat ttttctatat taggtacaat ttatctaaac tgaattgaga aaaaattaca 4860
gtattattcc tcaaaataac atcaatctat ttttgtaaac ctgttcatac tattaaattt 4920
tgccctaaaa gacctcttaa taatgattgt tgccagtgac tgatgattaa ttttatttta 4980
cttaaaataa gaaaaggagc actttaatta caactgaaaa atcagattgt tttgtagtcc 5040
ttccttacac taatttgaac tgttaaagat tgctgctttt tttttgacat tgtcaataac 5100
gaaacctaat tgtaaaacag tcaccattta ctaccaataa cttttagtta atgttttaca 5160
aggaaaaaga cacaagaaga gtttaaattt ttttgttttg ttttgttttt ttgagacagt 5220
cttgctctgt tacccaggct ggaggggagt ggtgcattct tggctcactg caacctccgc 5280
ctcccaggtt caagcaatcc tcccacctca gcctcccaac tagctgggac tgcaggcaca 5340
caccaccatg cctgactaat ttttgtatgt ttagtagaga cggggttttg ccatgttgcc 5400
taggctgggg tttaagttaa attttttaaa aaactaaagt gactggcact aagtgaactt 5460
gagattatcc tcagcttcaa gttcctaaga taagggcttt cttaagcttt caggtgtatg 5520
tatcctctag atgtagacaa taatgtccca tttctaagtc ttttcctttt gcttctcctt 5580
aaattgattg tacttccaaa tttgctgtta tgtttttttc ctaatactgt gatctatctg 5640
atctgcagac aagaaccttg tctctgttga agagcatcaa ggggagatta tgtacacatt 5700
gaaactgaag tgtggtgtta ctgacggaat gtgcagtaac tcctcagata tctgttaagg 5760
catttcccag atgtgatgcc agccttctta cctgtactga aagatgctta gcttagaaaa 5820
aaacaaaaca gatgcaaaat cagataattt tattttgttt catgggtttt cttatttact 5880
ttttaaacaa ggaaggaata ttagaaaatc acacaaggcc tcacatacat gttatttaaa 5940
gaatgaattg ggacggatgt cttagacttc actttcctag gctttttagc aaaacctaaa 6000
gggtggtatc catattttgc gtgaattatg ggtgtaagac cttgcccact taggttttct 6060
atctctgtcc ttgatcttct ttgccaaaat gtgagtatac agaaattttc tgtatatttc 6120
aacttaagac atttttagca tctgtatagt ttgtattcaa tttgagacct tttctatggg 6180
aagctcagta atttttatta aaagattgcc attgctattc atgtaaaaca tggaaaaaaa 6240
ttgtgtagtg aagccaacag tggacttagg atgggattga atgttcagta tagtgatctc 6300
acttaggaga atttgcagga gaaagtgata gtttattgtt ttttcctcgc ccatattcag 6360
ttttgttcta cttcctcccc ttccttccag atgataacat cacatctcta cagtaagtgc 6420
ctctgccagc ccaacccagg agcgcaagtt gtctttgcca tctggtctat agtacagtgc 6480
gcggcgttag gccacaactc aaaagcatta tcttttttag ggttagtaga aattgtttta 6540
tgttgatggg aggtttgttt gattgtcaaa atgtacagcc acagcctttt aatttgggag 6600
cccctgttgt cattcaaatg tgtacctcta cagttgtaaa aagtattaga ttctactatc 6660
tgtgggttgt gcttgccaga caggtcttaa attgtatatt ttttggaaaa gtttatatac 6720
tctcttagga atcattgtga aaagatcaag aaatcaggat ggccatttat ttaatatcca 6780
ttcatttcat gttagtggga ctattaactt gtcaccaagc aggactctat ttcaaacaaa 6840
atttaaaact gtttgtggcc tatatgtgtt taatcctggt taaagataaa gcttcataat 6900
gctgttttta ttcaacacat taaccagctg taaaacacag acctttatca agagtaggca 6960
aagattttca ggattcatat acagatagac tataaagtca tgtaatttga aaagcagtgt 7020
ttcattatga aagagctctc aagttgcttg taaagctaat ctaattaaaa agatgtataa 7080
atgttgttga aacattaaaa aa 7102
<210> 2
<211> 3524
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 2
ggctgggccc gcccgcccag ggcgctgtgc gccgcgcagg ccgcgctctc tccggcgcga 60
tgcggcgcta ggcggccccg ggcaaggcag gcgaggccag ggcgcgcgcg gcctcccgca 120
gcgggcggcg gccccgggcg ggcgccccga cggccccgcc gccgccccgc tcccggcccg 180
cggcccgccc tgccgcggcc atggccagtg acagcggcgg gcccggcgtg ctgagcgcca 240
gcgagcgcga ccggcagtac tgcgagctgt gcgggaagat ggagaacctg ctgcgctgcg 300
gccgctgccg cagctccttc tactgctgca aagagcacca gcgccaggac tggaagaagc 360
acaagctggt gtgccagggc ggcgaggccc cccgcgcgca gcccgcgccg gcgcagcccc 420
gcgtcgcgcc cccgcccggt ggggcccccg gagccgcgcg cgccggcggg gcggcccggc 480
gcggggacag cgcggcggcc tcgcgcgtac cgggcccgga ggacgcggcg caggcccgga 540
gcggccccgg cccagcagag cccggctccg aggatcctcc gcttagccgg tctccgggcc 600
ccgagcgcgc cagcctgtgc ccagcgggtg gcggccccgg ggaggcgctg agtcccggtg 660
gagggctgcg gcccaacggg cagaccaagc cgttgcccgc gttgaagctg gctctggagt 720
acatcgtgcc gtgcatgaac aagcacggca tctgcgtggt ggacgacttc ctgggcaggg 780
agaccgggca gcagatcggc gatgaggtgc gcgccctgca cgacaccggc aagttcacgg 840
acgggcagct ggtcagccag aagagtgact cttccaagga catccggggg gaccagatca 900
cctggatcga gggcaaagag cccggctgcg aaaccatcgg cctgctcatg agcagcatgg 960
acgacctgat ccgccactgc agcgggaagc tgggcaacta caggataaac ggccgaacga 1020
aagccatggt tgcttgttac ccaggcaacg gaacaggcta tgtccgtcac gttgataacc 1080
caaatggaga tggaagatgc gtgacatgta tatattatct aaataaagac tgggacgcca 1140
aggtaagtgg aggtattctt cgaatttttc cagaaggcaa agcccagttt gctgacattg 1200
aacccaaatt tgatagactg ctgtttttct ggtctgaccg gcgtaaccct catgaagtac 1260
agccagcata cgccacaagg tacgcaataa ctgtttggta ttttgatgca gatgagcgag 1320
cgagagctaa agtaaaatat ctaacaggtg agaaaggtgt gagggttgaa ctcaagccca 1380
attcagtcag caaagacgtc tagtggggcc ttgggtccgg cagtacccac gtcacctaca 1440
gcctctcagt tgccttctgt ggactcgtgg acaggatgga cagagagaca cctgcctggt 1500
atttcagctg ggagccaggc gacttcgccg ggtgtcatcc aacagagggc tccatctgct 1560
gggactgtac tgtggggtca gctccagatc tgtgactgct cttggctgct gacccaagag 1620
gagacgctgt cggaggagag tagcttttcc atctggacac gaaacaaggg ccctttgtag 1680
gaatttcttc agtcttctat tttgccagac ctgtcaccta actgagttca tttcatctct 1740
tttttatatc aagttttgaa ttcggggaat ttttgtatta ggtacaattt atcaaaactg 1800
aattaagaaa aaaaaattta cagtattatt ctcaaaataa catcaatcta tttttgtaaa 1860
cctcttcatg ctattaaatt ttgccctcaa ggcctcctgc gatgattgtt gccagtgagt 1920
gacgacgtgt tgcttctgcc tgaacgtaaa ggacgggcgg gcgctgtgtc ccagcccgag 1980
tgcacgaggt ttttcttggc ccgtctctca gtgattccaa cctgtaaagg tcactgctct 2040
cgcgcttcga ccgacctaac agtagatggt tgccactggc actcaactaa ctcaacatag 2100
ttacaagagg aaacaagcca caggagaggg tttgtctctt cagttaattt ttttaaagcg 2160
aagtgacggg cactaaatga actcggggct ctccctcagc ttcgggttcc tgagacaaag 2220
ggctttcttc tgcggcaggt ctagcctgcc tacagccgtg tcccactgcc gcaggtttcc 2280
ttgtggcttc tccgtagttt tgactgtgct tccagaccct tccaggtcag ggctgtgttc 2340
ttgtggcagg gcacctggtg gacccaggca cgtgaatgtg gtatgtggtt gtagcctcaa 2400
tcgtggccat cggctccttg gacagccacg agccattttc atacccaata atgaaagctg 2460
tgtgctagct tagaaatcaa agggggtgta aaagcacaca ttctttgttt tatgggtttt 2520
tctcttttta gaggacagag ggacaaccac acgaggctgc cagactcctg tcacctctac 2580
agtcccctta gaaagccaga gtttgcacag attgtgggta taactcctgt ccccttaggt 2640
gttctatctc cgaccttgat ctttgccaaa atgtgtgtat gcagaactat ttctgtgtat 2700
tttccttgac acccgtctta gcacctgtgt agtttgtatc cggttagaaa ccttttctat 2760
ggaaagctca gtaattctta ttaagagatt gctattgttc atgtaaaaca tgaaaacaac 2820
caagtagagc cgtgtgtgga tgagggccca ctcagcactg tgcttgcttg aggggctctc 2880
ggcaggaagt ctccttctga cccatatccg ctgaccacac ctctccagca agtgcctctg 2940
ccgctggcca gctcaaggtt tgcccacctg gccccgaagc accgtgtttc ggagttggga 3000
ggaactgttt ggcattgttg gcagaaggtg tgattgcctg gagcagcagc cttttaaatt 3060
ctggagaccc tgtagtcctt tgtatctcag acctttactg atgtaccagg tcccagattc 3120
tgtggcaggg gatggggtgg ggtgtgcttg ccagacgaaa tttaaattat ctatcttttg 3180
ggaagtgtgt gctttcctgg aggtcactgt gaaaacaaac aaacaaatca ggaccgttaa 3240
ccccttaatg cccacttaaa ctcaatttca tgttaggact cttgtttaaa accatttgtg 3300
gcctgtatgt gttcatcctg gttagagaga aagctttatg acgctgtttc tgttcaacac 3360
attaaccagc tgtggaacag ccctttttgc acgacaggca gggcacttca ggattcgcag 3420
agagactcgt gtggtttgga agtggtattt cctatgaaag cctctcacgt tgcttgtaaa 3480
gctaatctaa ttaaaaagat gtataaatgt tcttgaaaaa aatc 3524
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：
miR-210 寡核苷酸
<400> 3
cugugcgugu gacagcggcu ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：
miR-21 寡核苷酸
<400> 4
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 5
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 5
cuuccuuuug cuauaguaau uuuacuauag caaaaggaag uu 42
<210> 6
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 6
uguugcagac auuacuaauu uauuaguaau gucugcaaca uu 42
<210> 7
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 7
uauaccucca cuuaccuugu ucaagguaag uggagguaua uu 42
<210> 8
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 8
uauaccucca cuuaccuugu ucaagguaag uggagguaua uu 42
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 9
uauaccucca cuuaccuugu u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 10
caagguaagu ggagguauau u 21
<210> 11
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 11
auucgaagua uaccuccacu uguggaggua uacuucgaau uu 42
<210> 12
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 12
cgaaguauac cuccacuuau uuaaguggag guauacuucg uu 42
<210> 13
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 13
aguauaccuc cacuuaccuu uagguaagug gagguauacu uu 42
<210> 14
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 14
uaccuccacu uaccuuggcu ugccaaggua aguggaggua uu 42
<210> 15
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 15
cuccacuuac cuuggcaucu ugaugccaag guaaguggag uu 42
<210> 16
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 16
cacuuaccuu ggcaucccau uugggaugcc aagguaagug uu 42
<210> 17
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 17
agguucucca ucuucccgcu ugcgggaaga uggagaaccu uu 42
<210> 18
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 18
augccgugcu uguucaugcu ugcaugaaca agcacggcau uu 42
<210> 19
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 19
ucacucuucu ggcugaccau uuggucagcc agaagaguga uu 42
<210> 20
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 20
aucuuccauc uccauuuggu uccaaaugga gauggaagau uu 42
<210> 21
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 21
ugugcuucuu ccaguccugu ucaggacugg aagaagcaca uu 42
<210> 22
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 22
aucaggucgu ccaugcugcu ugcagcaugg acgaccugau uu 42
<210> 23
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 23
auaccuccac uuaccuuggu uccaagguaa guggagguau uu 42
<210> 24
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 24
uggcguaugc uggcuguacu uguacagcca gcauacgcca uu 42
<210> 25
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 25
cucacaccuu ucucaccugu ucaggugaga aaggugugag uu 42
<210> 26
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 26
cugaauuggg cuugaguucu ugaacucaag cccaauucag uu 42
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的描述：合成
寡核苷酸
<400> 27
cugaauuggg cuugaguucu ugaacucaag cccaauucag tt 42
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 28
gaacucaagc ccaauucagu u 21
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 29
cugaauuggg cuugaguucu u 21
<210> 30
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 30
cugaauuggg cuugaguucu ugaacucaag cccaauucag 40
<210> 31
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 31
cugaauuggg cuugaguucu gaacucaagc ccaauucag 39
<210> 32
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 32
ucagccgcug ucacacgcac ag 22
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 33
tcagccgctg tcacacgcac ag 22
<210> 34
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 34
ucagccgcug ucacacgcac ag 22
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 35
gccgctgtca cacgcaca 18
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 36
agagctccct tcaatccaaa 20
<210> 37
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 37
ucagccgcug ucacacgcac ag 22
<210> 38
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 38
ucagccgcug ucacacgcac ag 22
<210> 39
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 39
ucagccgcug ucacacgcac ag 22
<210> 40
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 40
ucagccgcug ucacacgcac ag 22
<210> 41
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 41
ucagccgcug ucacacgcac ag 22
<210> 42
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 42
ucagccgcug ucacacgcac ag 22
<210> 43
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 43
ucagccgcug ucacacgcac ag 22
<210> 44
<211> 59
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 44
uagcuuauca gacugauguu gacuguugaa ucucauggca acaccagucg augggcuuu 59
<210> 45
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 45
uagcuuauca gacugauguu gacaucaguc ugauaagcuc 40
<210> 46
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 46
uagcuuauca gacugauguu gacaucaguc ugauaagcua uu 42
<210> 47
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 47
uagcuuauca gacugauguu gauuucaaca ucagucugau aagcuauu 48
<210> 48
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 48
uagcuuauca gacugauguu gauuucaaca ucagucugau aagcuauu 48
<210> 49
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 49
ccgggcccgc cgcugucauu uaugacagcg gcgggcccgg uu 42
<210> 50
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 50
gccgggcccg ccgcugucau uugacagcgg cgggcccggc uu 42
<210> 51
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 51
cgccgggccc gccgcugucu ugacagcggc gggcccggcg uu 42
<210> 52
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 52
ccgccgggcc cgccgcuguu uacagcggcg ggcccggcgg uu 42
<210> 53
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 53
cucgcaguac ugccggucuu uagaccggca guacugcgag uu 42
<210> 54
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 54
gcucgcagua cugccggucu ugaccggcag uacugcgagc uu 42
<210> 55
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 55
agcucgcagu acugccgguu uaccggcagu acugcgagcu uu 42
<210> 56
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 56
cagcucgcag uacugccggu uccggcagua cugcgagcug uu 42
<210> 57
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 57
acagcucgca guacugccgu ucggcaguac ugcgagcugu uu 42
<210> 58
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 58
cacagcucgc aguacugccu uggcaguacu gcgagcugug uu 42
<210> 59
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 59
gcacagcucg caguacugcu ugcaguacug cgagcugugc uu 42
<210> 60
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 60
cgcacagcuc gcaguacugu ucaguacugc gagcugugcg uu 42
<210> 61
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 61
ccgcacagcu cgcaguacuu uaguacugcg agcugugcgg uu 42
<210> 62
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 62
cccgcacagc ucgcaguacu uguacugcga gcugugcggg uu 42
<210> 63
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 63
ucccgcacag cucgcaguau uuacugcgag cugugcggga uu 42
<210> 64
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 64
uucccgcaca gcucgcaguu uacugcgagc ugugcgggaa uu 42
<210> 65
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 65
cuucccgcac agcucgcagu ucugcgagcu gugcgggaag uu 42
<210> 66
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 66
ucuucccgca cagcucgcau uugcgagcug ugcgggaaga uu 42
<210> 67
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 67
aucuucccgc acagcucgcu ugcgagcugu gcgggaagau uu 42
<210> 68
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 68
caucuucccg cacagcucgu ucgagcugug cgggaagaug uu 42
<210> 69
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 69
ccaucuuccc gcacagcucu ugagcugugc gggaagaugg uu 42
<210> 70
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 70
uccaucuucc cgcacagcuu uagcugugcg ggaagaugga uu 42
<210> 71
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 71
cuccaucuuc ccgcacagcu ugcugugcgg gaagauggag uu 42
<210> 72
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 72
ucuccaucuu cccgcacagu ucugugcggg aagauggaga uu 42
<210> 73
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 73
uucuccaucu ucccgcacau uugugcggga agauggagaa uu 42
<210> 74
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 74
guucuccauc uucccgcacu ugugcgggaa gauggagaac uu 42
<210> 75
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 75
gguucuccau cuucccgcau uugcgggaag auggagaacc uu 42
<210> 76
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 76
agguucucca ucuucccgcu ugcgggaaga uggagaaccu uu 42
<210> 77
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 77
cagguucucc aucuucccgu ucgggaagau ggagaaccug uu 42
<210> 78
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 78
gcagguucuc caucuucccu ugggaagaug gagaaccugc uu 42
<210> 79
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 79
agcagguucu ccaucuuccu uggaagaugg agaaccugcu uu 42
<210> 80
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 80
cagcagguuc uccaucuucu ugaagaugga gaaccugcug uu 42
<210> 81
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 81
gcagcagguu cuccaucuuu uaagauggag aaccugcugc uu 42
<210> 82
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 82
cgcagcaggu ucuccaucuu uagauggaga accugcugcg uu 42
<210> 83
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 83
gcgcagcagg uucuccaucu ugauggagaa ccugcugcgc uu 42
<210> 84
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 84
agcgcagcag guucuccauu uauggagaac cugcugcgcu uu 42
<210> 85
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 85
cagcgcagca gguucuccau uuggagaacc ugcugcgcug uu 42
<210> 86
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 86
gcagcgcagc agguucuccu uggagaaccu gcugcgcugc uu 42
<210> 87
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 87
ugcagcgcag cagguucucu ugagaaccug cugcgcugca uu 42
<210> 88
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 88
aggagcugcg gcagcggcuu uagccgcugc cgcagcuccu uu 42
<210> 89
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 89
aaggagcugc ggcagcggcu ugccgcugcc gcagcuccuu uu 42
<210> 90
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 90
gaaggagcug cggcagcggu uccgcugccg cagcuccuuc uu 42
<210> 91
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 91
agaaggagcu gcggcagcgu ucgcugccgc agcuccuucu uu 42
<210> 92
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 92
uagaaggagc ugcggcagcu ugcugccgca gcuccuucua uu 42
<210> 93
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 93
guagaaggag cugcggcagu ucugccgcag cuccuucuac uu 42
<210> 94
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 94
aguagaagga gcugcggcau uugccgcagc uccuucuacu uu 42
<210> 95
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 95
caguagaagg agcugcggcu ugccgcagcu ccuucuacug uu 42
<210> 96
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 96
gcaguagaag gagcugcggu uccgcagcuc cuucuacugc uu 42
<210> 97
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 97
agcaguagaa ggagcugcgu ucgcagcucc uucuacugcu uu 42
<210> 98
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 98
cagcaguaga aggagcugcu ugcagcuccu ucuacugcug uu 42
<210> 99
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 99
gcagcaguag aaggagcugu ucagcuccuu cuacugcugc uu 42
<210> 100
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 100
ugcagcagua gaaggagcuu uagcuccuuc uacugcugca uu 42
<210> 101
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 101
uugcagcagu agaaggagcu ugcuccuucu acugcugcaa uu 42
<210> 102
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 102
cuugcagcag uagaaggagu ucuccuucua cugcugcaag uu 42
<210> 103
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 103
gugcuucuuc caguccugau uucaggacug gaagaagcac uu 42
<210> 104
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 104
ugugcuucuu ccaguccugu ucaggacugg aagaagcaca uu 42
<210> 105
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 105
uugugcuucu uccaguccuu uaggacugga agaagcacaa uu 42
<210> 106
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 106
cuugugcuuc uuccaguccu uggacuggaa gaagcacaag uu 42
<210> 107
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 107
gcuugugcuu cuuccagucu ugacuggaag aagcacaagc uu 42
<210> 108
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 108
agcuugugcu ucuuccaguu uacuggaaga agcacaagcu uu 42
<210> 109
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 109
gagcuugugc uucuuccagu ucuggaagaa gcacaagcuc uu 42
<210> 110
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 110
cugcccguug ggccgcaggu uccugcggcc caacgggcag uu 42
<210> 111
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 111
ucugcccguu gggccgcagu ucugcggccc aacgggcaga uu 42
<210> 112
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 112
gucugcccgu ugggccgcau uugcggccca acgggcagac uu 42
<210> 113
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 113
cgucugcccg uugggccgcu ugcggcccaa cgggcagacg uu 42
<210> 114
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 114
gcacggcacg auguacucgu ucgaguacau cgugccgugc uu 42
<210> 115
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 115
ugcacggcac gauguacucu ugaguacauc gugccgugca uu 42
<210> 116
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 116
augcacggca cgauguacuu uaguacaucg ugccgugcau uu 42
<210> 117
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 117
caugcacggc acgauguacu uguacaucgu gccgugcaug uu 42
<210> 118
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 118
ucaugcacgg cacgauguau uuacaucgug ccgugcauga uu 42
<210> 119
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 119
uucaugcacg gcacgauguu uacaucgugc cgugcaugaa uu 42
<210> 120
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 120
guucaugcac ggcacgaugu ucaucgugcc gugcaugaac uu 42
<210> 121
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 121
uguucaugca cggcacgauu uaucgugccg ugcaugaaca uu 42
<210> 122
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 122
uuguucaugc acggcacgau uucgugccgu gcaugaacaa uu 42
<210> 123
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 123
cuuguucaug cacggcacgu ucgugccgug caugaacaag uu 42
<210> 124
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 124
gcuuguucau gcacggcacu ugugccgugc augaacaagc uu 42
<210> 125
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 125
ugcuuguuca ugcacggcau uugccgugca ugaacaagca uu 42
<210> 126
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 126
gugcuuguuc augcacggcu ugccgugcau gaacaagcac uu 42
<210> 127
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 127
cgugcuuguu caugcacggu uccgugcaug aacaagcacg uu 42
<210> 128
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 128
ccgugcuugu ucaugcacgu ucgugcauga acaagcacgg uu 42
<210> 129
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 129
gccgugcuug uucaugcacu ugugcaugaa caagcacggc uu 42
<210> 130
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 130
ugccgugcuu guucaugcau uugcaugaac aagcacggca uu 42
<210> 131
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 131
augccgugcu uguucaugcu ugcaugaaca agcacggcau uu 42
<210> 132
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 132
gaugccgugc uuguucaugu ucaugaacaa gcacggcauc uu 42
<210> 133
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 133
agaugccgug cuuguucauu uaugaacaag cacggcaucu uu 42
<210> 134
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 134
cagaugccgu gcuuguucau uugaacaagc acggcaucug uu 42
<210> 135
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 135
acagaugccg ugcuuguucu ugaacaagca cggcaucugu uu 42
<210> 136
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 136
gugcagggcg cgcaccucgu ucgaggugcg cgcccugcac uu 42
<210> 137
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 137
cgugcagggc gcgcaccucu ugaggugcgc gcccugcacg uu 42
<210> 138
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 138
ucgugcaggg cgcgcaccuu uaggugcgcg cccugcacga uu 42
<210> 139
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 139
gucgugcagg gcgcgcaccu uggugcgcgc ccugcacgac uu 42
<210> 140
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 140
ugucgugcag ggcgcgcacu ugugcgcgcc cugcacgaca uu 42
<210> 141
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 141
gugucgugca gggcgcgcau uugcgcgccc ugcacgacac uu 42
<210> 142
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 142
ggugucgugc agggcgcgcu ugcgcgcccu gcacgacacc uu 42
<210> 143
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 143
cggugucgug cagggcgcgu ucgcgcccug cacgacaccg uu 42
<210> 144
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 144
ccggugucgu gcagggcgcu ugcgcccugc acgacaccgg uu 42
<210> 145
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 145
cccggugucg ugcagggcgu ucgcccugca cgacaccggg uu 42
<210> 146
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 146
cugcccgucc gugaacuucu ugaaguucac ggacgggcag uu 42
<210> 147
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 147
gcugcccguc cgugaacuuu uaaguucacg gacgggcagc uu 42
<210> 148
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 148
agcugcccgu ccgugaacuu uaguucacgg acgggcagcu uu 42
<210> 149
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 149
cagcugcccg uccgugaacu uguucacgga cgggcagcug uu 42
<210> 150
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 150
ccagcugccc guccgugaau uuucacggac gggcagcugg uu 42
<210> 151
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 151
accagcugcc cguccgugau uucacggacg ggcagcuggu uu 42
<210> 152
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 152
gaccagcugc ccguccgugu ucacggacgg gcagcugguc uu 42
<210> 153
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 153
ugaccagcug cccguccguu uacggacggg cagcugguca uu 42
<210> 154
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 154
cugaccagcu gcccguccgu ucggacgggc agcuggucag uu 42
<210> 155
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 155
gcugaccagc ugcccguccu uggacgggca gcuggucagc uu 42
<210> 156
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 156
ggcugaccag cugcccgucu ugacgggcag cuggucagcc uu 42
<210> 157
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 157
uggcugacca gcugcccguu uacgggcagc uggucagcca uu 42
<210> 158
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 158
cuggcugacc agcugcccgu ucgggcagcu ggucagccag uu 42
<210> 159
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 159
ucuggcugac cagcugcccu ugggcagcug gucagccaga uu 42
<210> 160
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 160
uucuggcuga ccagcugccu uggcagcugg ucagccagaa uu 42
<210> 161
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 161
cuucuggcug accagcugcu ugcagcuggu cagccagaag uu 42
<210> 162
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 162
ucuucuggcu gaccagcugu ucagcugguc agccagaaga uu 42
<210> 163
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 163
cucuucuggc ugaccagcuu uagcugguca gccagaagag uu 42
<210> 164
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 164
acucuucugg cugaccagcu ugcuggucag ccagaagagu uu 42
<210> 165
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 165
cacucuucug gcugaccagu ucuggucagc cagaagagug uu 42
<210> 166
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 166
ucacucuucu ggcugaccau uuggucagcc agaagaguga uu 42
<210> 167
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 167
gucacucuuc uggcugaccu uggucagcca gaagagugac uu 42
<210> 168
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 168
agucacucuu cuggcugacu ugucagccag aagagugacu uu 42
<210> 169
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 169
gagucacucu ucuggcugau uucagccaga agagugacuc uu 42
<210> 170
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 170
cgagucacuc uucuggcugu ucagccagaa gagugacucg uu 42
<210> 171
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 171
ccucgaucca ggugaucuuu uaagaucacc uggaucgagg uu 42
<210> 172
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 172
cccucgaucc aggugaucuu uagaucaccu ggaucgaggg uu 42
<210> 173
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 173
gcccucgauc caggugaucu ugaucaccug gaucgagggc uu 42
<210> 174
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 174
ugcccucgau ccaggugauu uaucaccugg aucgagggca uu 42
<210> 175
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 175
uugcccucga uccaggugau uucaccugga ucgagggcaa uu 42
<210> 176
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 176
cuugcccucg auccaggugu ucaccuggau cgagggcaag uu 42
<210> 177
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 177
gguuucgcag ccgggcuccu uggagcccgg cugcgaaacc uu 42
<210> 178
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 178
ugguuucgca gccgggcucu ugagcccggc ugcgaaacca uu 42
<210> 179
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 179
augguuucgc agccgggcuu uagcccggcu gcgaaaccau uu 42
<210> 180
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 180
aaugguuucg cagccgggcu ugcccggcug cgaaaccauu uu 42
<210> 181
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 181
caugcugcuc augagcagcu ugcugcucau gagcagcaug uu 42
<210> 182
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 182
ccaugcugcu caugagcagu ucugcucaug agcagcaugg uu 42
<210> 183
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 183
uccaugcugc ucaugagcau uugcucauga gcagcaugga uu 42
<210> 184
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 184
guccaugcug cucaugagcu ugcucaugag cagcauggac uu 42
<210> 185
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 185
cguccaugcu gcucaugagu ucucaugagc agcauggacg uu 42
<210> 186
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 186
ucguccaugc ugcucaugau uucaugagca gcauggacga uu 42
<210> 187
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 187
gucguccaug cugcucaugu ucaugagcag cauggacgac uu 42
<210> 188
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 188
ggucguccau gcugcucauu uaugagcagc auggacgacc uu 42
<210> 189
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 189
aggucgucca ugcugcucau uugagcagca uggacgaccu uu 42
<210> 190
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 190
caggucgucc augcugcucu ugagcagcau ggacgaccug uu 42
<210> 191
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 191
ucaggucguc caugcugcuu uagcagcaug gacgaccuga uu 42
<210> 192
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 192
aucaggucgu ccaugcugcu ugcagcaugg acgaccugau uu 42
<210> 193
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 193
uaucaggucg uccaugcugu ucagcaugga cgaccugaua uu 42
<210> 194
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 194
agcaaccaug gcuuucgucu ugacgaaagc caugguugcu uu 42
<210> 195
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 195
aagcaaccau ggcuuucguu uacgaaagcc augguugcuu uu 42
<210> 196
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 196
caagcaacca uggcuuucgu ucgaaagcca ugguugcuug uu 42
<210> 197
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 197
acaagcaacc auggcuuucu ugaaagccau gguugcuugu uu 42
<210> 198
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 198
aacaagcaac cauggcuuuu uaaagccaug guugcuuguu uu 42
<210> 199
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 199
uaacaagcaa ccauggcuuu uaagccaugg uugcuuguua uu 42
<210> 200
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 200
auaacaagca accauggcuu uagccauggu ugcuuguuau uu 42
<210> 201
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 201
ucuuccaucu ccauuuggau uuccaaaugg agauggaaga uu 42
<210> 202
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 202
aucuuccauc uccauuuggu uccaaaugga gauggaagau uu 42
<210> 203
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 203
caucuuccau cuccauuugu ucaaauggag auggaagaug uu 42
<210> 204
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 204
acaucuucca ucuccauuuu uaaauggaga uggaagaugu uu 42
<210> 205
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 205
auaauauaua caugucacau uugugacaug uauauauuau uu 42
<210> 206
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 206
gauaauauau acaugucacu ugugacaugu auauauuauc uu 42
<210> 207
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 207
agauaauaua uacaugucau uugacaugua uauauuaucu uu 42
<210> 208
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 208
aagauaauau auacaugucu ugacauguau auauuaucuu uu 42
<210> 209
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 209
accuccacuu accuuggcau uugccaaggu aaguggaggu uu 42
<210> 210
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 210
uaccuccacu uaccuuggcu ugccaaggua aguggaggua uu 42
<210> 211
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 211
auaccuccac uuaccuuggu uccaagguaa guggagguau uu 42
<210> 212
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 212
uauaccucca cuuaccuugu ucaagguaag uggagguaua uu 42
<210> 213
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 213
uucuggaaaa auucgaaguu uacuucgaau uuuuccagaa uu 42
<210> 214
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 214
cuucuggaaa aauucgaagu ucuucgaauu uuuccagaag uu 42
<210> 215
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 215
ccuucuggaa aaauucgaau uuucgaauuu uuccagaagg uu 42
<210> 216
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 216
gccuucugga aaaauucgau uucgaauuuu uccagaaggc uu 42
<210> 217
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 217
ugccuucugg aaaaauucgu ucgaauuuuu ccagaaggca uu 42
<210> 218
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 218
uugccuucug gaaaaauucu ugaauuuuuc cagaaggcaa uu 42
<210> 219
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 219
uuugccuucu ggaaaaauuu uaauuuuucc agaaggcaaa uu 42
<210> 220
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 220
cuuugccuuc uggaaaaauu uauuuuucca gaaggcaaag uu 42
<210> 221
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 221
gcuuugccuu cuggaaaaau uuuuuuccag aaggcaaagc uu 42
<210> 222
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 222
ggcuuugccu ucuggaaaau uuuuuccaga aggcaaagcc uu 42
<210> 223
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 223
gggcuuugcc uucuggaaau uuuuccagaa ggcaaagccc uu 42
<210> 224
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 224
ugggcuuugc cuucuggaau uuuccagaag gcaaagccca uu 42
<210> 225
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 225
cugggcuuug ccuucuggau uuccagaagg caaagcccag uu 42
<210> 226
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 226
acugggcuuu gccuucuggu uccagaaggc aaagcccagu uu 42
<210> 227
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 227
aacugggcuu ugccuucugu ucagaaggca aagcccaguu uu 42
<210> 228
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 228
aaacugggcu uugccuucuu uagaaggcaa agcccaguuu uu 42
<210> 229
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 229
caaacugggc uuugccuucu ugaaggcaaa gcccaguuug uu 42
<210> 230
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 230
gcaaacuggg cuuugccuuu uaaggcaaag cccaguuugc uu 42
<210> 231
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 231
agcaaacugg gcuuugccuu uaggcaaagc ccaguuugcu uu 42
<210> 232
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 232
cagcaaacug ggcuuugccu uggcaaagcc caguuugcug uu 42
<210> 233
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 233
ucagcaaacu gggcuuugcu ugcaaagccc aguuugcuga uu 42
<210> 234
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 234
gucagcaaac ugggcuuugu ucaaagccca guuugcugac uu 42
<210> 235
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 235
ugucagcaaa cugggcuuuu uaaagcccag uuugcugaca uu 42
<210> 236
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 236
augucagcaa acugggcuuu uaagcccagu uugcugacau uu 42
<210> 237
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 237
aaugucagca aacugggcuu uagcccaguu ugcugacauu uu 42
<210> 238
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 238
caaugucagc aaacugggcu ugcccaguuu gcugacauug uu 42
<210> 239
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 239
ucaaugucag caaacugggu ucccaguuug cugacauuga uu 42
<210> 240
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 240
uucaauguca gcaaacuggu uccaguuugc ugacauugaa uu 42
<210> 241
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 241
guucaauguc agcaaacugu ucaguuugcu gacauugaac uu 42
<210> 242
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 242
gguucaaugu cagcaaacuu uaguuugcug acauugaacc uu 42
<210> 243
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 243
ggguucaaug ucagcaaacu uguuugcuga cauugaaccc uu 42
<210> 244
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 244
uggguucaau gucagcaaau uuuugcugac auugaaccca uu 42
<210> 245
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 245
uuggguucaa ugucagcaau uuugcugaca uugaacccaa uu 42
<210> 246
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 246
uuuggguuca augucagcau uugcugacau ugaacccaaa uu 42
<210> 247
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 247
auuuggguuc aaugucagcu ugcugacauu gaacccaaau uu 42
<210> 248
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 248
aauuuggguu caaugucagu ucugacauug aacccaaauu uu 42
<210> 249
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 249
aaauuugggu ucaaugucau uugacauuga acccaaauuu uu 42
<210> 250
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 250
caaauuuggg uucaaugucu ugacauugaa cccaaauuug uu 42
<210> 251
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 251
ucaaauuugg guucaauguu uacauugaac ccaaauuuga uu 42
<210> 252
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 252
aucaaauuug gguucaaugu ucauugaacc caaauuugau uu 42
<210> 253
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 253
uaucaaauuu ggguucaauu uauugaaccc aaauuugaua uu 42
<210> 254
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 254
cuaucaaauu uggguucaau uuugaaccca aauuugauag uu 42
<210> 255
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 255
ucuaucaaau uuggguucau uugaacccaa auuugauaga uu 42
<210> 256
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 256
gucuaucaaa uuuggguucu ugaacccaaa uuugauagac uu 42
<210> 257
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 257
agucuaucaa auuuggguuu uaacccaaau uugauagacu uu 42
<210> 258
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 258
cagucuauca aauuuggguu uacccaaauu ugauagacug uu 42
<210> 259
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 259
gcagucuauc aaauuugggu ucccaaauuu gauagacugc uu 42
<210> 260
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 260
agcagucuau caaauuuggu uccaaauuug auagacugcu uu 42
<210> 261
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 261
cagcagucua ucaaauuugu ucaaauuuga uagacugcug uu 42
<210> 262
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 262
acagcagucu aucaaauuuu uaaauuugau agacugcugu uu 42
<210> 263
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 263
aacagcaguc uaucaaauuu uaauuugaua gacugcuguu uu 42
<210> 264
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 264
aaacagcagu cuaucaaauu uauuugauag acugcuguuu uu 42
<210> 265
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 265
aaaacagcag ucuaucaaau uuuugauaga cugcuguuuu uu 42
<210> 266
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 266
aaaaacagca gucuaucaau uuugauagac ugcuguuuuu uu 42
<210> 267
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 267
gaaaaacagc agucuaucau uugauagacu gcuguuuuuc uu 42
<210> 268
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 268
agaaaaacag cagucuaucu ugauagacug cuguuuuucu uu 42
<210> 269
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 269
cagaaaaaca gcagucuauu uauagacugc uguuuuucug uu 42
<210> 270
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 270
ccagaaaaac agcagucuau uuagacugcu guuuuucugg uu 42
<210> 271
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 271
accagaaaaa cagcagucuu uagacugcug uuuuucuggu uu 42
<210> 272
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 272
gaccagaaaa acagcagucu ugacugcugu uuuucugguc uu 42
<210> 273
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 273
agaccagaaa aacagcaguu uacugcuguu uuucuggucu uu 42
<210> 274
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 274
cagaccagaa aaacagcagu ucugcuguuu uucuggucug uu 42
<210> 275
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 275
ucagaccaga aaaacagcau uugcuguuuu ucuggucuga uu 42
<210> 276
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 276
gucagaccag aaaaacagcu ugcuguuuuu cuggucugac uu 42
<210> 277
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 277
ggucagacca gaaaaacagu ucuguuuuuc uggucugacc uu 42
<210> 278
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 278
cggucagacc agaaaaacau uuguuuuucu ggucugaccg uu 42
<210> 279
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 279
acggucagac cagaaaaacu uguuuuucug gucugaccgu uu 42
<210> 280
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 280
uuguacuuca ugaggguugu ucaacccuca ugaaguacaa uu 42
<210> 281
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 281
aguuauugcg uaccuuguau uuacaaggua cgcaauaacu uu 42
<210> 282
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 282
caguuauugc guaccuuguu uacaagguac gcaauaacug uu 42
<210> 283
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 283
acaguuauug cguaccuugu ucaagguacg caauaacugu uu 42
<210> 284
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 284
aacaguuauu gcguaccuuu uaagguacgc aauaacuguu uu 42
<210> 285
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 285
aaacaguuau ugcguaccuu uagguacgca auaacuguuu uu 42
<210> 286
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 286
caaacaguua uugcguaccu ugguacgcaa uaacuguuug uu 42
<210> 287
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 287
ccaaacaguu auugcguacu uguacgcaau aacuguuugg uu 42
<210> 288
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 288
accaaacagu uauugcguau uuacgcaaua acuguuuggu uu 42
<210> 289
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 289
uaccaaacag uuauugcguu uacgcaauaa cuguuuggua uu 42
<210> 290
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 290
auaccaaaca guuauugcgu ucgcaauaac uguuugguau uu 42
<210> 291
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 291
aauaccaaac aguuauugcu ugcaauaacu guuugguauu uu 42
<210> 292
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 292
aaauaccaaa caguuauugu ucaauaacug uuugguauuu uu 42
<210> 293
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 293
aaaauaccaa acaguuauuu uaauaacugu uugguauuuu uu 42
<210> 294
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 294
caaaauacca aacaguuauu uauaacuguu ugguauuuug uu 42
<210> 295
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 295
ucaaaauacc aaacaguuau uuaacuguuu gguauuuuga uu 42
<210> 296
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 296
aucaaaauac caaacaguuu uaacuguuug guauuuugau uu 42
<210> 297
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 297
caucaaaaua ccaaacaguu uacuguuugg uauuuugaug uu 42
<210> 298
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 298
gcaucaaaau accaaacagu ucuguuuggu auuuugaugc uu 42
<210> 299
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 299
ugcaucaaaa uaccaaacau uuguuuggua uuuugaugca uu 42
<210> 300
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 300
cugcaucaaa auaccaaacu uguuugguau uuugaugcag uu 42
<210> 301
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 301
ucugcaucaa aauaccaaau uuuugguauu uugaugcaga uu 42
<210> 302
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 302
aucugcauca aaauaccaau uuugguauuu ugaugcagau uu 42
<210> 303
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 303
caucugcauc aaaauaccau uugguauuuu gaugcagaug uu 42
<210> 304
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 304
ucaucugcau caaaauaccu ugguauuuug augcagauga uu 42
<210> 305
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 305
cucaucugca ucaaaauacu uguauuuuga ugcagaugag uu 42
<210> 306
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 306
ucucaucugc aucaaaauau uuauuuugau gcagaugaga uu 42
<210> 307
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 307
gauauuuuac uuuagcucgu ucgagcuaaa guaaaauauc uu 42
<210> 308
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 308
agauauuuua cuuuagcucu ugagcuaaag uaaaauaucu uu 42
<210> 309
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 309
uagauauuuu acuuuagcuu uagcuaaagu aaaauaucua uu 42
<210> 310
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 310
uuagauauuu uacuuuagcu ugcuaaagua aaauaucuaa uu 42
<210> 311
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 311
guuagauauu uuacuuuagu ucuaaaguaa aauaucuaac uu 42
<210> 312
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 312
uguuagauau uuuacuuuau uuaaaguaaa auaucuaaca uu 42
<210> 313
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 313
cuguuagaua uuuuacuuuu uaaaguaaaa uaucuaacag uu 42
<210> 314
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 314
ccuguuagau auuuuacuuu uaaguaaaau aucuaacagg uu 42
<210> 315
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 315
accuguuaga uauuuuacuu uaguaaaaua ucuaacaggu uu 42
<210> 316
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 316
caccuguuag auauuuuacu uguaaaauau cuaacaggug uu 42
<210> 317
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 317
ucaccuguua gauauuuuau uuaaaauauc uaacagguga uu 42
<210> 318
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 318
uucaccuguu agauauuuuu uaaaauaucu aacaggugaa uu 42
<210> 319
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 319
uucaacccuc acaccuuuuu uaaaaggugu gaggguugaa uu 42
<210> 320
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 320
guucaacccu cacaccuuuu uaaaggugug aggguugaac uu 42
<210> 321
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 321
aguucaaccc ucacaccuuu uaagguguga ggguugaacu uu 42
<210> 322
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 322
gaguucaacc cucacaccuu uaggugugag gguugaacuc uu 42
<210> 323
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 323
ugaguucaac ccucacaccu uggugugagg guugaacuca uu 42
<210> 324
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 324
uugaguucaa cccucacacu ugugugaggg uugaacucaa uu 42
<210> 325
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 325
auugaguuca acccucacau uugugagggu ugaacucaau uu 42
<210> 326
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 326
ucagccgcug ucacacgcac ag 22
<210> 327
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的描述：合成
寡核苷酸
<400> 327
gcugtcacac gcaca 15
<210> 328
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 328
cagccgcugu cacacgcaca 20
<210> 329
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 329
ucagccgcug ucacacgcac ag 22

Claims (10)

1.一种用于抑制含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2(PHD2)的短小发夹RNA(sshRNA)，其包含：
(a)反义序列，其能够与编码含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2的RNA转录物杂交；和
(b)有义序列，
其中所述有义序列和反义序列形成长度小于或等于19个碱基对的茎。
2.根据权利要求1所述的sshRNA，其中所述RNA转录物由Egl9同源物1(EGLN1)基因编码，其中所述EGLN1基因，不含内含子，由选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列表示。
3.根据权利要求1所述的sshRNA，其包含选自直接连接、1个核苷酸和2个核苷酸长度的环区域。
4.根据权利要求1所述的sshRNA，其中所述sshRNA由所述反义序列、所述有义序列、环区域、可选的突出端序列和可选的缀合物部分组成。
5.一种微RNA(miRNA)拮抗剂，其包含能够与miR-210杂交并抑制miR-210的反义链。
6.一种用于增加成熟miR-21的稳态水平的pre-miRNA模拟物，其包含：
(a)有义序列；
(b)反义序列；以及
(c)环区域，其中所述环区域的长度为2个或更少核苷酸的长度。
7.一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及至少一种选自以下项的寡核苷酸：
(a)权利要求1的sshRNA；
(b)权利要求5的miRNA拮抗剂；以及
(c)权利要求6的pre-miRNA模拟物。
8.一种药物组合物，其包含药学上可接受的基底、载体或盐以及选自以下项的寡核苷酸的组合：
(a)权利要求1的sshRNA；
(b)权利要求5的miRNA拮抗剂；以及
(c)权利要求6的pre-miRNA模拟物。
9.一种用于治疗有需要的受试者的伤口的方法，其包括施用治疗有效量的选自以下项的组合物：
(a)权利要求1的sshRNA；
(b)权利要求5的miRNA拮抗剂；
(c)权利要求6的pre-miRNA模拟物；以及
它们的组合。
10.一种试剂盒，其包含：
(a)权利要求1的sshRNA；
(b)权利要求5的miRNA拮抗剂；以及
(c)权利要求6的pre-miRNA模拟物。
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