CN105457039A - 促进伤口愈合的制剂及其制备方法及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进伤口愈合的制剂,包括细胞培养基,细胞培养基将经转质的内皮前躯细胞予以培养而形成,且经转质的内皮前驱细胞为将微小核醣核酸let-7g转质至一内皮前驱细胞而形成,促进伤口愈合的制剂的制备方法包括分离步骤、转质步骤、及培养步骤,分离步骤为自人类全血分离出单核球细胞,并将单核球细胞种在涂布有人类纤维连接蛋白的孔盘(human-fibronectin-coated?plate)以得到内皮前躯细胞,转质步骤为将微小核醣核酸let-7g转质至内皮前驱细胞,以得到经转质的内皮前驱细胞,培养步骤为将经转质的内皮前驱细胞予以培养一预定时间而得到促进伤口愈合的制剂。
Description
技术领域
本发明相关于一种医药制剂,特别是相关于一种促进伤口愈合的制剂及其制备方法及使用方法。
背景技术
糖尿病为全球常见的慢性疾病,是一种生物体将葡萄糖(糖类)转换成能量的方式出现变化的疾病。原因为身体无法制造足够的胰岛素,或是无法有效利用体内制造的胰岛素以进行糖类的转换。糖尿病易引发多种并发症,其中之一为血管病变。高血糖使红血球的细胞膜变硬,导致血流不易通过微细血管而到达伤口组织。且,糖尿病患体内的血红素亦不易释放出氧气,而造成伤口组织缺氧以及营养素不足。此外,高血糖亦会影响纤维母细胞以及上皮细胞的增生,因此,糖尿病患的伤口容易停滞在发炎期,而演变成慢性溃疡。
目前相关于糖尿病患者伤口愈合的治疗方式主要包括高压氧治疗、含银活性碳纤维敷料、以及人类血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)凝胶。高压氧治疗系将病患置于高压舱内,舱内加压并维持在2.5绝对大气压下,使人经由其头上所载的氧气面罩吸取纯氧气,以提高血中含氧浓度,进而改善组织缺氧、促进伤口愈合、以及增强白血球的杀菌能力。然而此方式可能因高压造成肺部、耳膜、以及鼻窦的压力伤害、因高浓度氧气而造成抽搐、以及治疗后因水晶体变肿而导致视力改变。再者,此治疗方式对于病患极为不便,因病患无法自行于家中操作。含银活性碳纤维敷料系由PET不织布、含银活性碳纤维布、以及聚乙烯(polyethylene,PE)膜三层结构所组成。当敷料接触伤口渗液时,可藉由活性碳纤维本身良好的吸附性,以吸附血水渗液及细菌。同时,银离子可破坏细菌的细胞膜及细胞核,而达到杀菌的效果。此外,活性碳纤维的远红外线的功能具有促进血液循环以及加速新陈代谢的功效,进而缩短伤口愈合的时间。然而,此产品对于糖尿病患伤口的愈合仍需花费较长的时间。且,将纳米银粒均匀镀设于活性碳纤维布上,是一件繁复且加工不易的制作工序,加上纳米银粒的造价并不便宜,因而导致此产品的成本提高,从而降低商业竞争力。另外,人类血小板生长因子凝胶,含有基因重组的人类血小板源生长因子(Recombinatehumanplatelet-derivedgrowthfactor,rh-PDGF),藉由其所含的生长因子以促进伤口愈合,然而其费用昂贵。
发明内容
本发明的目的即在于提供一种促进伤口愈合的制剂及其制备方法及使用方法,能藉由简易且成本相对较低的制备方法以制备出具有加速伤口愈合的制剂,且此制剂能随时随地应用于病患身上。
本发明为解决习知技术的问题所采用的技术手段提供一种促进伤口愈合的制剂,包括细胞培养基(cellculturemedium),细胞培养基将经转质的内皮前躯细胞(endothelialprogenitorcell)予以培养而形成,且经转质的内皮前驱细胞为将微小核醣核酸(microRNA)let-7g转质至一内皮前驱细胞而形成。
在本发明的一实施例中系提供一种制剂,细胞培养基于培养内皮前躯细胞之前系为内皮细胞基础培养基(endothelialbasalmedium,EBM)。
在本发明的一实施例中系提供一种制剂,还包括至少一种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
在本发明的一实施例中系提供一种促进伤口愈合的制剂,赋形剂为一甘油。
本发明为解决习知技术的问题所采用的另一技术手段系提供一种促进伤口愈合的制剂的制备方法,包括以下步骤:分离步骤:自人类全血分离出单核球细胞,并将单核球细胞种在涂布有人类纤维连接蛋白的孔盘(human-fibronectin-coatedplate)以得到内皮前躯细胞;转质步骤:将微小核醣核酸let-7g转质至内皮前驱细胞,以得到经转质的内皮前驱细胞;以及培养步骤:将经转质的内皮前驱细胞予以培养一预定时间而得到促进伤口愈合的制剂。
在本发明的一实施例中系提供一种制备方法,于培养步骤中,将经转质的内皮前驱细胞的培养系为培养于内皮细胞生长培养基(endothelialgrowthmedium-2,EGM-2)7天,并于第7天将内皮细胞生长培养基更换为内皮细胞基础培养基,接着持续培养2天以收集内皮细胞基础培养基而得到促进伤口愈合的制剂。
在本发明的一实施例中系提供一种制备方法,预定时间为6至10天。
在本发明的一实施例中系提供一种制备方法,分离步骤中,藉由梯度剂Histopaque-1077以密度梯度离心法自人类全血中分离出单核球细胞。
本发明为解决习知技术的问题所采用的另一技术手段系提供一种促进伤口愈合的方法,包括:将治疗有效量的制剂投予至一生物体的伤口。
在本发明的一实施例中系提供一种促进伤口愈合的方法,生物体为一患有糖尿病的患者。
经由本发明所采用的技术手段,在本发明中,特别选用内皮前驱细胞以及微小核糖核酸let-7g以共同制备出促进伤口愈合的制剂。其系因内皮前驱细胞具有分化成血管内皮细胞,以修复不完整的血管内皮层,以及促使血管新生的能力。而微小核醣核酸中let-7g则在过往研究发现其可保护血管内皮细胞,治疗及预防血管硬化等疾病。
藉由将let-7g转质入内皮前驱细胞,以调控内皮前驱细胞的表现,并培养此经转质let-7g的内皮前驱细胞,使内皮前驱细胞释放出具有加速伤口愈合的因子至培养基中。此培养基不仅具有良好的治愈伤口的效果,且,制备方法简单,所费的时间及成本皆不高,因此可普遍地应用于伤口不易愈合的患者,例如糖尿病患,而不增加病患于经济上的压力。此外,本发明的制剂的使用方法为直接将制剂施用于病患的伤口处,操作方式简便而可随时随地使用。
附图说明
图1为显示根据本发明的一实施例的一促进伤口愈合的制剂的流程图。
图2为显示根据本发明的实施例的一促进伤口愈合的制剂用于一测试糖尿病小鼠伤口愈合表现的实验中,糖尿病小鼠的伤口建构的示意图。
图3为显示根据本发明的实施例的促进伤口愈合的制剂用于测试糖尿病小鼠伤口愈合表现的实验中,各组糖尿病小鼠伤口愈合程度的实际影像图。
图4为显示根据本发明的实施例的促进伤口愈合的制剂用于测试糖尿病小鼠伤口愈合表现的实验中,各组糖尿病小鼠伤口愈合速率的趋势的折线图。
符号说明
S1分离步骤
S2转质步骤
S3培养步骤
具体实施方式
以下根据图1,而说明本发明的实施方式。该说明并非为限制本发明的实施方式,而为本发明的实施例的一种。
依据本发明的一实施例的一促进伤口愈合的制剂,包括细胞培养基(cellculturemedium),细胞培养基将经转质的内皮前躯细胞(endothelialprogenitorcell)予以培养而形成,且经转质的内皮前驱细胞为将微小核醣核酸(microRNA)let-7g转质至一内皮前驱细胞而形成。
详细而言,细胞培养基于培养内皮前躯细胞之前为内皮细胞基础培养基(endothelialbasalmedium,EBM),用以特别培养内皮前躯细胞。
为了使本发明的促进伤口愈合的制剂稳定性佳、应用范围广泛、或减少其刺激性等因素,本发明的制剂还包括至少一种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。举例而言,将一甘油添加至制剂中,藉由甘油的黏性使得原本为液态的制剂转变为半流体,以便于本制剂应用在外敷的用途上。
在本实施例中,促进伤口愈合的制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)分离步骤:自人类全血分离出单核球细胞,并将单核球细胞种在涂布有人类纤维连接蛋白的孔盘(human-fibronectin-coatedplate)以得到内皮前躯细胞(步骤S1);
(2)转质步骤:将微小核醣核酸let-7g转质至内皮前驱细胞,以得到经转质的内皮前驱细胞(步骤S2);以及
(3)培养步骤:将经转质的内皮前驱细胞予以培养一预定时间而得到促进伤口愈合的制剂(步骤S3)。
详细而言,在本实施例中系藉由梯度剂Histopaque-1077以密度梯度离心法自人类全血中分离出单核球细胞以得到内皮前躯细胞。将10ml的梯度剂Histopaque-1077以及10ml的人类全血加入50c.c.的离心管中均匀混合后,以700g的离心速度将其离心30分钟,离心后收集含有高浓度的单核球细胞的棕黄层(buffy-coatlayer)。接着,将棕黄层悬浮于30ml的DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)中,以250g的离心速度将其离心10分钟,舍弃上清液且保留细胞团块,再将细胞团块悬浮于DMEM中并予以离心,并重复此步骤2~3次以得到单核球细胞团块。最后,将单核球细胞团块回溶于内皮细胞生长培养基-2(EndothelialCellGrowthMedium-2,EGM-2),以3x106cells/ml的密度种在涂布有人类纤维连接蛋白的孔盘以得到内皮前躯细胞。
于转质步骤中,将75ng的let-7g稀释在100μl的培养基中,并将之震荡以均匀地混合。接着,加入3μl的转质液至经稀释的let-7g,均匀混合后置于15~25℃的环境下5~10分钟以形成转质复合物。将转质复合物加到内皮前躯细胞,静置3小时后,再加入培养基以完成转质。
于培养步骤中,将经转质let-7g的内皮前驱细胞培养于内皮细胞生长培养基7天,并于第7天将内皮细胞生长培养基更换为内皮细胞基础培养基,接着持续培养2天以收集内皮细胞基础培养基而得到促进伤口愈合的制剂。当然,本发明不以此为限。根据细胞状况、转质效率或实验上等需求,经转质的内皮前驱细胞的培养时间可为6至10天。
本发明的促进伤口愈合的制剂用于促进伤口愈合的方法为将治疗有效量的制剂或经添加载剂、稀释剂或赋形剂的制剂投予至一生物体的伤口,其中,生物体可为一患有糖尿病的患者。
以下为将本发明的促进伤口愈合的制剂用于治疗糖尿病小鼠的实验。此实验的主要流程系包括糖尿病动物模型的建构、糖尿病动物伤口模型的建构、糖尿病动物伤口的治愈、以及统计分析。
首先,利用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)具有对胰岛β细胞的破坏作用,诱发C57BL/6Jk的小鼠其糖尿病的产生。在本实施例中,将链脲佐菌素以50mg/kg的剂量注射于8至12周的小鼠腹膜内连续7天,并控制小鼠的血糖浓度在150~200mg/dL。20只小鼠经诱发糖尿病后,其中6只小鼠归为EBM组、7只小鼠归为let-7g(-)-EPC组、以及7只小鼠归为let-7g(+)-EPC组总共3个组别以进行接下来的实验。详细而言,EBM组为以内皮细胞基础培养基处理糖尿小鼠的伤口;let-7g(-)-EPC组为利用经培养内皮前躯细胞的培养基处理糖尿病小鼠的伤口;let-7g(+)-EPC组则为利用经培养经转质let-7g的内皮前躯细胞的培养基处理糖尿病小鼠的伤口。
请同时参照图2,糖尿病小鼠的模型建构完后,糖尿病小鼠其背部欲形成伤口的部位的毛系为被剃掉,并予以消毒。利用6-mm的穿刺活体细胞工具于小鼠背部制造出两个左右对称且深度达肉层(Panniculuscarnosus)的伤口。将环状硅片夹板放置并固定于伤口外围,并以封闭敷料(occlusivedressing)覆盖于伤口表面。
糖尿病小鼠的伤口建立完成后,分别将50μl的内皮细胞基础培养基、经培养内皮前躯细胞的培养基、以及经培养经转质let-7g的内皮前躯细胞的培养基与甘油以1:1的比例混合,并将上述三种培养基分别用以处理EBM组、let-7g(-)-EPC-CM组、以及let-7g(+)-EPC-CM组的小鼠的右边伤口而作为实验组,左边的伤口则未经任何处理,使之自然愈合而作为控制组,控制组系用以与实验组相比较其伤口愈合的速率。处理频率为每天,实验的进行直至伤口完全愈合或其它因素而结束。
本发明的促进伤口愈合的制剂用于糖尿病小鼠伤口的实验进行至9天各组的伤口愈合程度已有显著性差异,故在所预期停止实验的时间前即停止本实验。
本实验系藉由数字影像器材每天拍摄小鼠伤口区域的影像,并利用image-J分析系统计算伤口区域的像素以得到伤口残余率、伤口愈合速率、及伤口愈合速率差。伤口残余率为将每日的伤口面积除以原始伤口面积。伤口愈合速率为以100%减掉伤口残余率。伤口愈合速率差为控制组与实验组其伤口愈合速率相减的绝对值。
如图3所示为实际拍摄各组小鼠伤口愈合状况的图片,可观察到let-7g(+)-EPC-CM组中的实验组其小鼠伤口愈合程度最为良好。
如下表1所示,其为利用McNemar检定以个别分析三个不同组别其控制组及实验组的伤口愈合速率,可得知无论是EBM组、let-7g(-)-EPC-CM组、或是let-7g(+)-EPC-CM组的实验组,相较于控制组皆有较高的伤口愈合速率。
【表1】
表1.在每个群组中伤口愈合速率的McNemar检定
SPSS统计软件分析,P<0.05具有显著性差异
下表2所示为藉由Kruskal-Wallis检定以比较EBM组、let-7g(-)-EPC-CM组、以及let-7g(+)-EPC-CM组的三个控制组的伤口愈合速率以及比较其三个实验组的伤口愈合速率,可得知其皆有显著性差异。其系因虽然控制组的伤口未经任何处理而采用自然愈合方式,然而于实验组所施用的培养基,其一部分仍可经由周边循环吸收到体内,进而影响远处(控制组)的伤口愈合。
【表2】
表2.群组之间伤口愈合还率的Kruskal-Wallis检定
SPSS统计软件,P<0.05具有显著性差异
为了进一步比较EBM组、let-7g(-)-EPC-CM组、与let-7g(+)-EPC-CM组的治愈效果,下表3~6为藉由Kruskal-Wallis检定及Mann-Whitney(M-WU)检定以分析三个组别以及三个组别中两两为一组的伤口愈合速率差。同时搭配图4所示的EBM组、let-7g(-)-EPC-CM组、以及let-7g(+)-EPC-CM组的伤口愈合速率差的趋势,可得知let-7g(+)-EPC-CM组的糖尿病小鼠其伤口治愈效果最为良好,而EBM组则为最差。亦即,经培养经转质let-7g的内皮前驱细胞的培养液具有最佳促进伤口愈合的效果。
【表3】
表3.伤口愈合速率差的Kruskal-Wallis检定
SPSS统计软件,P<0.05具有显著性差异
【表4】
表4.EBM与let7g(-)EPC-CM相比伤口愈合速率差的M-WU检定
SPSS统计软件,P<0.05具有显著性差异
【表5】
表5.EBM与let7g(+)EPC-CM相比伤口愈合速率差的M-WU检定
SPSS统计软件,P<0.05具有显著性差异
【表6】
表6.let7g(-)EPC-CM与let7g(+)EPC-CM相比伤口愈合速率差的M-WU检定
SPSS统计软件,P<0.05具有显著性差异
以上的叙述以及说明仅为本发明的较佳实施例的说明,对于此项技术具有通常知识者当可依据所界定申请专利范围以及上述的说明而作其它的修改,然而此些修改仍应是为本发明的发明精神而在本发明的权利范围中。
Claims (10)
1.一种促进伤口愈合的制剂,其特征在于,其包含细胞培养基(cellculturemedium),该细胞培养基系将经转质的内皮前躯细胞(endothelialprogenitorcell)予以培养而形成,且该转质的内皮前驱细胞系为将微小核醣核酸(microRNA)let-7g转质至一内皮前驱细胞而形成。
2.如权利要求1所述的制剂,其特征在于,该细胞培养基于培养该内皮前躯细胞之前系为内皮细胞基础培养基(endothelialbasalmedium,EBM)。
3.如权利要求1所述的制剂,其特征在于,还包括至少一种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
4.如权利要求3所述的制剂,其特征在于,该赋形剂系为一甘油。
5.一种促进伤口愈合的制剂的制备方法,其特征在于,其包含以下步骤:
分离步骤:自人类全血分离出单核球细胞,并将该单核球细胞种在涂布有人类纤维连接蛋白的孔盘(human-fibronectin-coatedplate)以得到内皮前躯细胞;
转质步骤:将微小核醣核酸let-7g转质至该内皮前驱细胞,以得到经转质的内皮前驱细胞;以及
培养步骤:将经转质的该内皮前驱细胞予以培养一预定时间而得到该促进伤口愈合的制剂。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,于培养步骤中,将经转质的该内皮前驱细胞的培养系为培养于内皮细胞生长培养基(endothelialgrowthmedium-2,EGM-2)7天,并于第7天将该内皮细胞生长培养基更换为内皮细胞基础培养基,接着持续培养2天以收集该内皮细胞基础培养基而得到该促进伤口愈合的制剂。
7.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,该预定时间系为6至10天。
8.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,于该分离步骤中,系藉由梯度剂Histopaque-1077以密度梯度离心法自该人类全血中分离出该单核球细胞。
9.一种促进伤口愈合的方法,其特征在于,其包含:将治疗有效量的如权利要求1所述的制剂或如权利要求3所述的制剂投予至一生物体的伤口。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,该生物体系为一患有糖尿病的患者。
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Application publication date: 20160406 |