CN103820442B

CN103820442B - 水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列及应用

Info

Publication number: CN103820442B
Application number: CN201410082118.3A
Authority: CN
Inventors: 郭立华; 邱德文; 杨秀芬; 曾洪梅; 袁京京; 赵成金
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2034-03-07
Also published as: CN103820442A

Abstract

本发明涉及一种优选的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，依次包括水稻黑条矮缩病毒S8编码区的206bp片段；和S10编码区的205bp；和S4编码区的203bp；在S8的5’端加入BamH1酶切位点和CCG三个保护碱基，在S4的3’端加入XhoI酶切位点和ACA三个保护碱基。本发明通过特殊设计并优化，针对RBSDV S8、S10、S4三个基因共614bp的RNAi靶序列，获得特定的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，克隆并构建到RNAi载体pBDL03中，获得RNA沉默载体pBDL03-S8+S10+S4，然后通过农杆菌转化法转到水稻品种泰粳394中。T1代阳性植株对RBSDV具有良好的抗性。

Description

水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用RNAi介导技术构建抗水稻黑条矮缩病毒载体的方法及应用。

背景技术

水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）隶属呼肠孤病毒（Reoviridae）科斐济病毒（Fijivirus）属，主要由灰飞虱（Laodelphax striatellus fallen）以持久性不经卵方式传播（Milne and Lovisolo,1977;Azuhata et al.,1993)。该病毒主要引起水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病，可侵染水稻、大麦、小麦、玉米等禾本科植物。RBSDV于20世纪40年代首先在日本发现，之后在20世纪60年代和90年代在我国华北、华东等地大规模流行，造成严重的经济损失(徐秋芳等，2012)。近年来，RBSDV危害成逐年加重趋势，造成了严重的经济损失。该病在江苏省2007年的发生面积为2.0×10⁴hm²，至2008年迅速上升至2.6×10⁵hm²，2009年则发展到约3.3×10⁵hm²(季英华等，2009)。RBSDV在我国引起了的病害日益严重，给我国的粮食安全带来了严峻的挑战，如何控制并降低RBSDV的危害已是一个极具现实意义的问题。选育和推广抗病品种是防治水稻病毒病最经济、有效的方法，但存在抗性资源缺乏、育种周期长、效率低等问题，因此，充分利用各种分子手段有利于加速水稻抗病育种的进程。

随着近年来RNA干扰(RNA interference，RNAi)机制研究的不断深入，利用RNAi的高效性和特异性来控制植物的病毒病已开始得到重视和应用(Cogoni and Macino,2000)。1998年waterhouse等（Waterhouseet et al.,1998)首次报导了利用RNAi技术防治马铃薯Y病毒。Shimizu等（Shimizuet et al.,2009)利用RNAi沉默了水稻矮缩病毒(RDV)的pns12基因，获得了具有RDV抗性的转基因水稻。因此，采用RNAi技术培育抗病毒植物具有高度可行性。

RBSDV含有10条双链RNA（S1-S10），目前已知RBSDV多个分离物的基因组全序列，而且部分编码蛋白的功能已得到初步验证。如S8编码的蛋白P8为最小的结构蛋白，P8进入寄主并在病毒与寄主互作过程中对寄主基因的表达起负调控的作用(Li et al.,2007)；S10编码蛋白（63.3kDa）为病毒粒子的外层衣壳蛋白（Liu et al.,2007）；S4可编码结构蛋白B-突起（Zhang et al.,2001）。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种优选的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，所述基因序列是特定选取了水稻黑条矮缩病毒RBSDV的S8、S10、S4编码区基因序列的组合，设计构建了抗RBSDV的多价RNA沉默载体，通过试验证明了其转化后具有很好的抗病毒活性。

本发明的技术方案是：一种水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，依次包括水稻黑条矮缩病毒S8编码区的206bp片段，对应S8基因30～131bp，1015～1118bp；和S10编码区的205bp，对应S10基因的433～637bp；和S4编码区的203bp，对应S4基因的2218～2420bp；在S8的5’端加入BamH1酶切位点和CCG三个保护碱基，在S4的3’端加入XhoI酶切位点和ACA三个保护碱基。

优化后的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的RNAi靶序列，可以克隆并构建到RNAi中间载体中，进而获得RNA沉默载体，然后再通过农杆菌转化法转到植物植株中。所述中间载体可以为tENTRA-S8+S10+S4，也可以为其他已知的载体；获得的多价RNA沉默载体为pBDL03-S8+S10+S4。

只要含有本发明的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列的载体都可以应用于转基因植物的培育中，用于防治水稻黑条矮缩病毒病。植物优选为水稻，也可以为其他同源性高的植物植株。

本发明通过特殊设计并优化，针对RBSDV S8、S10、S4三个基因共614bp的RNAi靶序列，获得特定的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，克隆并构建到RNAi载体pBDL03中，获得RNA沉默载体pBDL03-S8+S10+S4，然后通过农杆菌转化法转到水稻品种泰粳394中。T1代阳性植株对RBSDV具有良好的抗性。

附图说明

图1是本发明的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列图；

图2是RNAi表达载体双酶切验证，其中：M：Trans2k plusⅡ；1：质粒pBDL03-S8+S10+S4的KpnI/SacI双酶切；2：质粒pBDL03-S8+S10+S4；

图3是T0代转基因植株的PCR检测，其中M：分子标量Trans2K；1～7转基因植株；8野生型植株；

图4是T0代转基因植株的荧光检测，其中A转基因阳性植株；B野生型植株；

图5是T1代转基因水稻的dot-ELISA检测，其中：A～D行：转基因阴性植株；E～J行：转基因阳性植株（A1，E1：健康的泰粳394；A2，E2：健康的日本晴；A3，E3：感病的玉米）。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：

实施例1三价RNAi基因片段的核苷酸序列与克隆

根据NCBI上提交的RBSDV序列，将其在DNAMAN6.0.3.99上进行多序列比对与限制性酶分析，选取相对保守且不含BamHI和XhoI酶切位点的S8、S10、S4编码区基因片段，用武汉晶赛生物工程技术公司的在线设计软件进行siRNA靶位点预测，在水稻基因组数据库(http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)进行脱靶效应预测。优化获得614bp的RNAi多价靶基因序列（如图1所示；如SEQ ID NO.1所示），依次包括S8编码区的206bp片段(对应S8基因30～131bp，1015～1118bp)、S10编码区的205bp（对应S10基因的433～637bp）、S4编码区的203bp（对应S4基因的2218～2420bp），在S8的5’端加入BamH1酶切位点和CCG三个保护碱基，在S4的3’端加入XhoI酶切位点和ACA三个保护碱基。将设计好的目的基因序列送上海捷瑞生物工程有限公司进行合成，并构建到tENTRA入门载体中，质粒命名为tENTRA-S2+S6+S10。根据载体tENTRA序列设计引物：Tentra-forward（5’-CCATGGGAACCAATTCAGTCGAC-3’）和Tentra-reverse（5’-GTACAAGAAAGCTGGGTCTAG-3’）；以质粒tENTRA-S2+S6+S10为模板扩增目的基因片段，送上海生工北京测序部进行测序验证，序列用软件DNAMAN6.0.3.99进行分析。

实施例2三价RNAi植物表达载体的构建

利用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别检测入门载体tENTRA-S2+S6+S10和目的载体pBDL03的浓度和纯度，然后将入门载体和目的载体按照1：1的比例进行LR反应。按照Gat LR Clonase ^TM II Enzyme Mix(Invitrogen)试剂盒说明书构建10ul反应体系，25℃过夜，加入1ul的Proteinase K溶液，37℃处理10min终止反应。取1ul上述反应液转化trans5α感受态细胞，离心后将其均匀的涂布在含50mg/L卡那霉素的固体LB平板上，挑取单克隆用于质粒提取和双酶切验证（图2），并根据目的载体pBDL03上的Gus-linker序列设计引物GUS3(5’-CAGTCCATTAATGCGTGGTCGT-3’)和GUS4(5’-TGTATCACCGCGTCTTTGATCG-3’)，对阳性克隆进行测序验证。测序验证正确的RNAi植物表达载体命名为pBDL03-S8+S10+S4。

实施例3农杆菌转化及转基因水稻的获得

通过农杆菌介导法将RNAi植物表达载体pBDL03-S8+S10+S4转化水稻品种泰粳394，具体实验步骤：

（1）诱导愈伤组织

a:选取优良水稻成熟种子并脱壳成糙米。将适量的糙米转移到50ml离心管中（以下步骤均需无菌操作），加入75%的乙醇溶液浸润并清洗糙米2min，倒掉乙醇溶液，并用无菌水冲洗种子2次。

b:用有效氯为2%的次氯酸钠清洗种子一次，间歇摇动离心管30分钟。倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗种子4次，前三次每次五分钟，最后一次浸泡30分钟，间歇摇动离心管。

c:将种子转移到无菌滤纸上吸干水分，种子晾干后转移到愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿分散放置10-20粒种子，并用无菌胶带把培养皿封口。

d:2000Lx、28℃、光周期14/24h诱导愈伤组织。

（2）农杆菌培养

农杆菌接种于2mL YEB液体培养基中，加入相应种类和浓度的抗生素，本实验所用卡那霉素和利福平的浓度均为50mg/L，28℃、180r/min培养过夜。菌液5000r/min离心3min，倒掉上清液，菌体重悬后加入N6-As液体培养基中，As的浓度为400mg/L。测定菌体浓度，OD600在0.4-0.6之间。

（3）侵染和共培养

选取淡黄色、紧凑、质量好的愈伤组织放入无菌的50mL离心管，将制备好的农杆菌菌液倒入离心管内，完全浸过愈伤组织，轻轻摇动10min，室温静置5min。倒掉菌液，用无菌吸水纸完全吸干愈伤组织表面残留的菌液，然后将愈伤组织转移到N6-As共培培养基上，22℃黑暗条件下共培养2-3d。

（4）筛选

共培养后的愈伤组织转移到无菌的50mL离心管中，用含有500mg/L卡那霉素的无菌水冲洗三次，每次轻轻摇动3min，再用含有600mg/L卡那霉素的无菌水清洗一次，倒掉无菌水，用无菌吸水纸吸干愈伤组织表面多余的液体。然后转移到含有500mg/L卡那霉素和0.5g/L水解酪蛋白的N6筛选培养基，25℃光照培养15d后更换一次培养基。

（5）分化和生根

筛选培养30d后，将愈伤组织转移到含有0.1mg/L KT(激动素)和0.1mg/L NAA（α-萘乙酸）的N6分化培养基，28℃光照培养14h，25℃暗培养10h。30d左右分化出小苗后，转移到含有1/2MS和0.5mg/L NAA的固体培养基生根，根系发达后移栽到温室培养。

实施例4转基因水稻的分子生物学检测

（1）转基因水稻的PCR检测

用DNA快速提取法（苟小清等2012）提取T0代转基因水稻总DNA，根据目的载体pBDL03上的Gus-linker序列设计引物：GUS-F（5’-CGATCAAAGACGCGGTGATACA-3’）和GUS-R（5’-ACGACCACGCATTAATGGACTG-3’），进行PCR检测，均扩出大约650bp的片段，与目的片段大小一致，而野生型水稻没有扩出目的片段（图3只显示部分结果）。初步证实所获得的水稻为转基因阳性苗。

（2）转基因水稻的荧光检测

质粒pBDL03包含红色荧光蛋白mCherry基因，PCR鉴定为阳性的转基因苗用BLS灯式荧光检测器（绿色激发光光源）在黑暗条件下均可观察到红光，而野生型未见红光（图4）。结果进一步对PCR鉴定为阳性的水稻苗进行验证，而且BLS灯式荧光检测器检测mCherry基因的表达可以用于转基因水稻阳性株的快速筛选。

（3）TaqMan技术初步鉴定T0代转基因水稻的拷贝数

TaqMan实验由大北农生物技术中心完成。

综上所述，通过PCR和荧光检测，共获得T0代转基因阳性苗60株，TaqMan技术初步鉴定T0代转基因水稻有44株单拷贝，11株中拷贝，5株多拷贝。

实施例5转基因水稻的抗RBSDV鉴定

（1）T1代转基因阳性苗的准备

利用TaqMan技术鉴定为单拷贝的T0代苗编号8，9，10，11，收获种子后种植T1代苗，经PCR及荧光检测（未显示）鉴定为阳性的8号株系12株（编号8-1～18-12），9号株系5株（编号9-1～9-5），10号株系20株（编号10-1～10-20），11号株系8株（编号11-1～11-8）。

（2）室内接种RBSDV

在接种笼内用带毒灰飞虱按照4头/株群体接种2-3叶期T1代转基因阳性苗及阴性苗，在25±3℃的温室接种3天，每天赶虫2-3次。三天后用杀虫剂杀死介体灰飞虱，将接种幼苗移植无虫温室进行培养，接种45天后进行dot-ELISA检测及病情指数调查。病情指数分级标准参考路银贵等人的玉米粗缩病分级标准（路银贵等，2006）和农技植保函[2011]219号：关于印发《南方水稻黑条矮缩病测报调查技术规范暂行办法》的通知制定（表1）。

表1水稻黑条矮缩病病情严重度分级指标

（3）转基因水稻抗病情况观察与dot-ELISA检测

在接种带毒灰飞虱45天后接种水稻表现出稳定的发病症状，经发病情况调查，发现转基因阳性株发病较轻，0级10株，1级15株，2级13株，3级4株，4级3株；而T1代转基因阴性苗作为阴性对照，发病多为3级和4级，没有0级（表2），也说明病毒接种率为100％；0级的10株转基因水稻可能对RBSDV表现为免疫。转基因水稻的综合病情指数为36.11，而转基因阴性苗病情指数高达74.07。

进一步通过dot-ELISA技术对目测结果进行验证。dot-ELISA检测参照浙江大学赠送的水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）dot-ELISA植物检测试剂盒说明书，将试剂盒中的二抗换成辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，用全式金公司的Western Blot Kit试剂盒进行显色曝光。dot-ELISA结果显示接种植株基本上都已经发病，转基因阴性水稻的斑点颜色明显比转基因阳性株的深，这与病情指数调查结果相吻合（图5）。

综上所述，以RBSDV的S8、S10、S4为靶基因构建的三价RNAi植物表达载体转化水稻，可以有效地提高水稻对RBSDV的抗性。

表2转基因水稻发病情况调查

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，其特征在于：所述序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列的RNAi中间载体。

3.含有权利要求1所述的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列的多价RNA沉默载体。

4.用权利要求2所述的RNAi中间载体构建的多价RNA沉默载体。

5.权利要求3所述的多价RNA沉默载体用于培育转基因植物的用途，所述植物为水稻。

6.权利要求4所述的多价RNA沉默载体用于培育转基因植物的用途，所述植物为水稻。

7.一种防治水稻黑条矮缩病毒病的方法，其特征在于：将权利要求3所述的多价RNA沉默载体转化入水稻植株中，获得抗水稻黑条矮缩病毒的水稻植株。