KR20230002327A - Snca 조절을 위한 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

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아나스타샤 크보로바
샹탈 퍼거슨
사라 데이비스
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유니버시티 오브 매사추세츠
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Abstract

본 개시는 신규 SNCA 표적화 서열에 관한 것이다. 신경변성 질병의 치료를 위한 신규 SNCA 표적화 올리고뉴클레오티드가 또한 제공된다.

Description

SNCA 조절을 위한 올리고뉴클레오티드
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 3월 18일에 출원된 미국 가출원 일련 제62/991,406호 및 2020년 8월 27일에 출원된 미국 가출원 일련 제63/071,115호의 이익을 청구하며, 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시는 신규 SNCA 표적화 서열, 신규 분지형 올리고뉴클레오티드, 및 SNCA-관련 신경변성을 치료 및 예방하기 위한 신규 방법에 관한 것이다.
파킨슨병은 서구 세계에서 두 번째로 흔한 신경변성 장애이다. 전세계적으로 파킨슨병은 대략 600만 명, 또는 65세 이상 인구의 2~3%에 영향을 미친다. 이 질병은 임상적으로 경련, 운동완화, 및 근육 경직과 함께 자세 및 보행 장애로 나타난다. 증상은 뇌의 흑질에 있는 도파민성 뉴런의 손실과 관련되며, 이는 선조체 도파민 결핍을 야기한다. 신경 세포 사멸은 단백질 알파 시누클레인의 봉입체 및 응집체 축적으로 인해 유발된다.
알파 시누클레인은 SNCA 유전자에 의해 암호화된다. SNCA는 뇌, 심장, 근육 및 폐에서 두드러지게 발현된다. SNCA의 기능은 잘 알려져 있지 않지만 시냅스 전파 및 DNA 복구에 관여된다. 병리학적 조건 하에, SNCA는 응집하여 루이 소체로 불리는 불용성 섬유를 형성한다. 루이 소체는 총칭하여 시누클레인병증으로 불리는, 파킨슨병, 루이 소체 치매 및 다계통 위축을 포함하는 신경변성 장애의 특징적인 특성이다. SNCA 유전자의 많은 돌연변이는 신경변성 질환을 야기할 수 있으며, 야생형 및 돌연변이체 SNCA의 과발현은 응집체의 침착을 초래한다.
현재 이용 가능한 파킨슨병에 대한 치료법은 본질적으로 도파민 작용제(즉, 레보도파) 형태의 약리학적 접근, 또는 운동 및 언어 치료법과 같은 비약리학적 접근을 포함한다. 현재의 접근으로는 파킨슨병을 중단시키거나 근치할 수 없다. 따라서, 모든 시누클레인병증의 치료를 위한 새로운 치료법의 개발이 절실히 필요하다. 질병 발병기전에서 SNCA가 관여된다는 관점에서, 본 출원에서 다루어지는 SNCA mRNA 발현을 효율적이고 강력하게 침묵화시킬 필요가 있다.
제1 측면에서, 본 개시는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖는 RNA 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 1의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 2의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 3의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 4의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 5의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 6의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 7의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 8의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 9의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 10의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 11의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 12의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 13의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 서열 번호 14~28 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖는 RNA를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 14의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 15의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 16의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 17의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 18의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 19의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 20의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 21의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 22의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 23의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 24의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 25의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 26의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 27의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 28의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 갖는 RNA 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 29의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 30의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 31의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 32의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 33의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 34의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 35의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 36의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 37의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 38의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 39의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 40의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 41의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 42의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 43의 핵산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)와 동일한 핵산 서열을 갖는다.
한 측면에서, 본 개시는 약 8개 뉴클레오티드 내지 약 80개 뉴클레오티드의 길이; 및 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖는 RNA 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, RNA 분자는 8개 뉴클레오티드 내지 80개 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 21개 뉴클레오티드, 22개 뉴클레오티드, 23개 뉴클레오티드, 24개 뉴클레오티드, 25개 뉴클레오티드, 26개 뉴클레오티드, 27개 뉴클레오티드, 28개 뉴클레오티드, 29개 뉴클레오티드, 30개 뉴클레오티드, 31개 뉴클레오티드, 32개 뉴클레오티드, 33개 뉴클레오티드, 34개 뉴클레오티드, 35개 뉴클레오티드, 36개 뉴클레오티드, 37개 뉴클레오티드, 38개 뉴클레오티드, 39개 뉴클레오티드, 40개 뉴클레오티드, 41개 뉴클레오티드, 42개 뉴클레오티드, 43개 뉴클레오티드, 44개 뉴클레오티드, 45개 뉴클레오티드, 46개 뉴클레오티드, 47개 뉴클레오티드, 48개 뉴클레오티드, 49개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 51개 뉴클레오티드, 52개 뉴클레오티드, 53개 뉴클레오티드, 54개 뉴클레오티드, 55개 뉴클레오티드, 56개 뉴클레오티드, 57개 뉴클레오티드, 58개 뉴클레오티드, 59개 뉴클레오티드, 60개 뉴클레오티드, 61개 뉴클레오티드, 62개 뉴클레오티드, 63개 뉴클레오티드, 64개 뉴클레오티드, 65개 뉴클레오티드, 66개 뉴클레오티드, 67개 뉴클레오티드, 68개 뉴클레오티드, 69개 뉴클레오티드, 70개 뉴클레오티드, 71개 뉴클레오티드, 72개 뉴클레오티드, 73개 뉴클레오티드, 74개 뉴클레오티드, 75개 뉴클레오티드, 76개 뉴클레오티드, 77개 뉴클레오티드, 78개 뉴클레오티드, 79개 뉴클레오티드, 또는 80개 뉴클레오티드 길이)이다.
특정 실시양태에서, RNA 분자는 10 내지 50개 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 21개 뉴클레오티드, 22개 뉴클레오티드, 23개 뉴클레오티드, 24개 뉴클레오티드, 25개 뉴클레오티드, 26개 뉴클레오티드, 27개 뉴클레오티드, 28개 뉴클레오티드, 29개 뉴클레오티드, 30개 뉴클레오티드, 31개 뉴클레오티드, 32개 뉴클레오티드, 33개 뉴클레오티드, 34개 뉴클레오티드, 35개 뉴클레오티드, 36개 뉴클레오티드, 37개 뉴클레오티드, 38개 뉴클레오티드, 39개 뉴클레오티드, 40개 뉴클레오티드, 41개 뉴클레오티드, 42개 뉴클레오티드, 43개 뉴클레오티드, 44개 뉴클레오티드, 45개 뉴클레오티드, 46개 뉴클레오티드, 47개 뉴클레오티드, 48개 뉴클레오티드, 49개 뉴클레오티드, 또는 50개 뉴클레오티드 길이)이다.
특정 실시양태에서, RNA 분자는 약 15개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이를 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 분자는 15 내지 25개 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 21개 뉴클레오티드, 22개 뉴클레오티드, 23개 뉴클레오티드, 24개 뉴클레오티드, 또는 25개 뉴클레오티드 길이)이다.
특정 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 14~28 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, RNA 분자는 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, RNA 분자는 단일 가닥(ss) RNA 또는 이중 가닥(ds) RNA를 포함한다.
특정 실시양태에서, RNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 dsRNA이다. 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 1의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 2의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 3의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 4의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 5의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 6의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 7의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 8의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 9의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 10의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 11의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 12의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호 13의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열의 적어도 10, 11, 12 또는 13개의 인접 뉴클레오티드와 상보성을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, dsRNA는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절(예를 들어, 서열 번호 1의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 2의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 3의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 4의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 5의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 6의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 7의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 8의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 9의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 10의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 11의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 12의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 또는 서열 번호 13의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절)과 상보성을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 핵산 서열의 15 내지 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 가닥은 서열 번호 1의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 2의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 3의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 4의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 5의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 6의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 7의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 8의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 9의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 10의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 11의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 12의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 13의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 3개 이하의 미스매치를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 가닥은 서열 번호 1의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 2의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 3의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 4의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 5의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 6의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 7의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 8의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 9의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 10의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 11의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 12의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 13의 핵산 서열과 비교하여 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 완전히 상보적인 안티센스 가닥을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 약 13개 뉴클레오티드 내지 35개 뉴클레오티드 길이를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개 뉴클레오티드 길이이다.
상기 측면 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 31개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 32개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 33개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 34개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 35개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥은 13개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 31개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 32개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 33개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 34개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 35개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이 또는 16개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이 또는 16개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이 또는 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이 또는 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 14개 염기쌍 내지 35개 염기쌍(예를 들어, 14개 염기쌍, 15개 염기쌍, 16개 염기쌍, 17개 염기쌍, 18개 염기쌍, 19개 염기쌍, 20개 염기쌍, 21개 염기쌍, 22개 염기쌍, 23개 염기쌍, 24개 염기쌍, 25개 염기쌍, 26개 염기쌍, 27개 염기쌍, 28개 염기쌍, 29개 염기쌍, 또는 30개 염기쌍)의 이중 가닥 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 14개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 15개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 16개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 17개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 18개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 19개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 20개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 21개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 22개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 23개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 24개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 25개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 26개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 27개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 28개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 29개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 30개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 31개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 32개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 33개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 34개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 35개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 평활 말단을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 하나의 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 약 2-뉴클레오티드 내지 5-뉴클레오티드 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 자연 발생 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기, 또는 이의 혼합물을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 4~16개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 포스포로티오에이트 연결)을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 8~13개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결(예를 들어, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의 포스포로티오에이트 연결)을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 하나의 화학식 I의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
식 중,
B는 염기쌍 형성 모이어티이고;
W는 O, OCH2, OCH, CH2, 및 CH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
X는 할로, 하이드록시, 및 C1-6 알콕시로 구성되는 군으로부터 선택되고;
Y는 O-, OH, OR, NH-, NH2, S-, 및 SH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
Z는 O 및 CH2로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R은 보호기이고;
Figure pct00002
는 선택적 이중 결합이다.
특정 실시양태에서, W가 CH인 경우,
Figure pct00003
는 이중 결합이다.
특정 실시양태에서, W가 O, OCH2, OCH, CH2로 구성되는 군으로부터 선택되는 경우,
Figure pct00004
는 단일 결합이다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 70%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드)를 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 완전히 화학적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 60%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 약 70% 내지 약 90%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 또는 90%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형)을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 약 83% 내지 약 86%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 83%, 84%, 85%, 또는 86%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 약 70% 내지 약 80%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 또는 80%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형)을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 약 75% 내지 약 78%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 75%, 76%, 77%, 또는 78%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
상기 측면 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, dsRNA는 약 60% 내지 약 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 또는 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형)을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 약 60% 내지 약 65%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 60%, 61%, 62%, 또는 63%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 70%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 완전히 화학적으로 변형된다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 55%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 약 55% 내지 90%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 또는 90%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 약 70% 내지 90%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 또는 90%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 약 85% 내지 약 90%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 약 75% 내지 85%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 또는 85%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 약 76% 내지 약 80%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 76%, 77%, 78%, 79%, 또는 80%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥은 적어도 70%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥은 완전히 화학적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 적어도 55%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다.
상기 측면 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 약 55% 내지 약 65%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 또는 65%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥은 약 70% 내지 약 85%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 또는 85%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 약 75% 내지 약 80%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 또는 80%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥은 약 65% 내지 약 75%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% 또는 75%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 약 67% 내지 약 73%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% 또는 73%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥 및 센스 가닥 간에 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치는 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 및 12에 존재한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 미스매치는 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 및 12에 존재한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 5' 포스페이트, 5'-알킬 포스포네이트, 5' 알킬렌 포스포네이트, 또는 5' 알케닐 포스포네이트를 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 5' 비닐 포스포네이트를 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 가지며, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 교대하는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오티드를 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 교대하는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오티드를 포함하고; (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 가지며, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 55%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 적어도 55%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 85%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 가지며, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 4, 5, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 가지며, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 85%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 85% 내지 약 90%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고(예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 뉴클레오티드일 수 있음); (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 75% 내지 약 80%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고(예를 들어, 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 뉴클레오티드임); (8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 가지며, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 75% 내지 약 80%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 4, 5, 6, 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고(예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 뉴클레오티드일 수 있음); (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 가지며, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 75% 내지 약 80%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고(예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 뉴클레오티드일 수 있음); (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 적어도 65%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 65% 내지 약 75%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 9, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고(예를 들어, 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 9, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 뉴클레오티드임); (8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 가지며, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 적어도 80%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 안티센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다.
특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 소수성 모이어티를 포함한다.
특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 지방산, 스테로이드, 세코스테로이드, 지질, 갱글리오시드, 뉴클레오시드 유사체, 엔도칸나비노이드, 비타민 및 이의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 스테로이드는 콜레스테롤 및 리토콜산(LCA)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 지방산은 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 및 베헨산(DCA)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 비타민은 콜린, 비타민 A, 비타민 E, 이의 유도체, 및 이의 대사물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 비타민은 레티노산 및 알파-토코페릴 숙시네이트로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 링커에 의해 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥에 연결된다.
특정 실시양태에서, 링커는 2가 또는 3가 링커를 포함한다.
특정 실시양태에서, 2가 또는 3가 링커는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
및
Figure pct00007
식 중, n은 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
특정 실시양태에서, 링커는 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 아미드, 카바메이트, 또는 이의 조합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 링커가 3가 링커인 경우, 링커는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유도체를 추가로 연결한다.
특정 실시양태에서, 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유도체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
[화학식 Zc1]
Figure pct00008
;
[화학식 Zc2]
Figure pct00009
;
[화학식 Zc3]
Figure pct00010
; 및
[화학식 Zc4]
Figure pct00011
식 중, X는 O, S 또는 BH3이다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드, 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된다.
한 측면에서, 본 개시는 상기 언급된 dsRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 유기체에서 시누클레인(SNCA) 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 50% 억제한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 80% 억제한다.
한 측면에서, 본 개시는 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 상기 언급된 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)을 세포에 도입하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 생산된 세포를 SNCA 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 얻기 충분한 시간 동안 유지하여 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시는 신경변성 질병의 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에 치료 유효량의 상기 언급된 상기 dsRNA를 투여하는 단계를 포함하는, 신경변성 질병을 치료 또는 관리하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 환자의 뇌에 투여된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 뇌실내(ICV) 주사, 선조체내(IS) 주사, 정맥내(IV) 주사, 피하(SQ) 주사 또는 이의 조합에 의해 투여된다.
특정 실시양태에서, dsRNA의 투여는 해마, 선조체, 피질, 소뇌, 시상, 시상하부 및 척수 중 하나 이상에서 SNCA 유전자 mRNA의 감소를 유발한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 50% 억제한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 80% 억제한다.
한 측면에서, 본 개시는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 RNA 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
특정 실시양태에서, RNA 분자는 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 50% 억제한다. 특정 실시양태에서, RNA 분자는 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 80% 억제한다.
특정 실시양태에서, RNA 분자는 ssRNA 또는 dsRNA를 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시는 상기 언급된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시는 상기 벡터 및 AAV 캡시드를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시는 각각 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 뉴클레오티드 길이)를 포함하는 2개 이상의 RNA 분자와 같은, 2개 이상의 RNA 분자를 포함하는 분지형 RNA 화합물을 제공하며, 각각의 RNA는 분자는 SNCA mRNA의 분절과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖는 부분을 포함한다. 2개의 RNA 분자는 링커, 스페이서 및 분기점으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 모이어티에 의해 서로 연결될 수 있다.
특정 실시양태에서, 분지형 RNA 분자는 ssRNA 및 dsRNA 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
특정 실시양태에서, 분지형 RNA 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 각각의 RNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 dsRNA를 포함하고, 각각의 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 독립적으로 포함한다.
특정 실시양태에서, 분지형 RNA 화합물은(예를 들어, 링커, 스페이서 또는 분기점에 의해) 서로 공유 결합된 본 개시의 임의의 상기 측면 또는 실시양태의 RNA 분자의 2개 이상의 카피를 포함한다.
특정 실시양태에서, 분지형 RNA 화합물은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열 부분을 포함한다. 예를 들어, 분지형 RNA 화합물은(예를 들어, 링커, 스페이서 또는 분기점에 의해) 서로 공유 결합되고 각각 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열의 적어도 10, 11, 12 또는 13개의 인접 뉴클레오티드와 상보성을 갖는 안티센스 가닥을 포함하는 2개 이상의 dsRNA 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, dsRNA는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 핵산 서열의 10 내지 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절(예를 들어, 서열 번호 1의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 2의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 3의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 4의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 5의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 6의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 7의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 8의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 9의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 10의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 11의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 서열 번호 12의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절, 또는 서열 번호 13의 핵산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 뉴클레오티드의 분절)과 상보성을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다.
특정 실시양태에서, 분지형 RNA 화합물의 각각의 dsRNA는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 핵산 서열의 15 내지 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 가닥은 서열 번호 1의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 2의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 3의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 4의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 5의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 6의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 7의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 8의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 9의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 10의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 11의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 12의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 13의 핵산 서열의 15개의 인접 뉴클레오티드, 16개의 인접 뉴클레오티드, 17개의 인접 뉴클레오티드, 18개의 인접 뉴클레오티드, 19개의 인접 뉴클레오티드, 20개의 인접 뉴클레오티드, 21개의 인접 뉴클레오티드, 22개의 인접 뉴클레오티드, 23개의 인접 뉴클레오티드, 24개의 인접 뉴클레오티드, 25개의 인접 뉴클레오티드, 26개의 인접 뉴클레오티드, 27개의 인접 뉴클레오티드, 28개의 인접 뉴클레오티드, 29개의 인접 뉴클레오티드, 30개의 인접 뉴클레오티드, 31개의 인접 뉴클레오티드, 32개의 인접 뉴클레오티드, 33개의 인접 뉴클레오티드, 34개의 인접 뉴클레오티드, 또는 35개의 인접 뉴클레오티드의 분절과 상보성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 분지형 RNA 화합물의 각각의 dsRNA는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 3개 이하의 미스매치를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 가닥은 서열 번호 1의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 2의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 3의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 4의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 5의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 6의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 7의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 8의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 9의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 10의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 11의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 12의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 서열 번호 13의 핵산 서열 대비 0~3개의 미스매치(예를 들어, 0개의 미스매치, 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 3개의 미스매치)를 갖는다.
특정 실시양태에서, 분지형 RNA 화합물의 각각의 dsRNA는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 완전히 상보적인 안티센스 가닥을 포함한다.
특정 실시양태에서, 분지형 RNA 화합물은 서열 번호 14~28 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열 중 하나 이상과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖는 부분을 포함한다.
특정 실시양태에서, RNA 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 각각의 RNA 분자는 13 내지 35개 뉴클레오티드 길이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 약 13개 뉴클레오티드 내지 35개 뉴클레오티드 길이를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥은 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개 뉴클레오티드 길이이다.
상기 측면 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다. 상기 측면 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 31개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 32개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 33개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 34개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 35개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 13개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 31개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 32개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 33개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 34개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 35개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
상기 측면 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 14개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 16개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 17개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 22개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 24개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 26개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 27개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 28개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 29개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이고 센스 가닥은 30개 뉴클레오티드 길이이다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, dsRNA는 14개 염기쌍 내지 35개 염기쌍(예를 들어, 14개 염기쌍, 15개 염기쌍, 16개 염기쌍, 17개 염기쌍, 18개 염기쌍, 19개 염기쌍, 20개 염기쌍, 21개 염기쌍, 22개 염기쌍, 23개 염기쌍, 24개 염기쌍, 25개 염기쌍, 26개 염기쌍, 27개 염기쌍, 28개 염기쌍, 29개 염기쌍, 또는 30개 염기쌍)의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 14개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 15개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 16개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 17개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 18개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 20개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 19개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 20개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 21개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 22개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 23개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 24개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 25개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 26개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 27개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 28개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 29개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 30개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 31개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 32개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 33개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 34개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 35개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 평활 말단을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 하나의 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 2-뉴클레오티드 내지 5-뉴클레오티드 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 자연 발생 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기를 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, 분지형 RNA 화합물은 4~16개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, 분지형 RNA 화합물은 8~13개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 하나의 화학식 I의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00012
식 중,
B는 염기쌍 형성 모이어티이고;
W는 O, OCH2, OCH, CH2, 및 CH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
X는 할로, 하이드록시, 및 C1-6 알콕시로 구성되는 군으로부터 선택되고;
Y는 O-, OH, OR, NH-, NH2, S-, 및 SH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
Z는 O 및 CH2로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R은 보호기이고;
Figure pct00013
는 선택적 이중 결합이다.
특정 실시양태에서, W가 CH인 경우,
Figure pct00014
는 이중 결합이다.
특정 실시양태에서, W가 O, OCH2, OCH, CH2로 구성되는 군으로부터 선택되는 경우,
Figure pct00015
는 단일 결합이다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 80%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드)를 포함한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 완전히 화학적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 적어도 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 80%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 완전히 화학적으로 변형된다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 약 70% 내지 90%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 약 85% 내지 약 90%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 약 75% 내지 85%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 또는 85%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 약 76% 내지 약 80%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 76%, 77%, 78%, 79%, 또는 80%의 2'-O-메틸 변형)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥은 적어도 80%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 완전히 화학적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 적어도 65%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥 및 센스 가닥 간에 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치는 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 및 12에 존재한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 미스매치는 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 및 12에 존재한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 5' 포스페이트, 5'-알킬 포스포네이트, 5' 알킬렌 포스포네이트, 5' 알케닐 포스포네이트, 또는 이의 혼합물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 5' 비닐 포스포네이트를 포함한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 교대하는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오티드를 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 교대하는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오티드를 포함하고; (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 55%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 적어도 55%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 85%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 4, 5, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 가지며, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 85%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 85% 내지 약 90%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고(예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 뉴클레오티드일 수 있음); (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 75% 내지 약 80%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고(예를 들어, 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 뉴클레오티드임); (8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 75% 내지 약 80%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 4, 5, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고(예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 4, 5, 6, 14 및 16의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 뉴클레오티드일 수 있음); (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 75% 내지 약 80%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고(예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 뉴클레오티드일 수 있음); (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 적어도 65%의 2'-O-메틸 변형(예를 들어, 약 65% 내지 약 75%의 2'-O-메틸 변형)을 포함하고; (7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 9, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖고; (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고; (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며; (6) 센스 가닥은 적어도 80%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고; (7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고; (8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 안티센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다.
특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 소수성 모이어티를 포함한다.
특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 지방산, 스테로이드, 세코스테로이드, 지질, 갱글리오시드, 뉴클레오시드 유사체, 엔도칸나비노이드, 비타민, 및 이의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 스테로이드는 콜레스테롤 및 리토콜산(LCA)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 지방산은 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 및 베헨산(DCA)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 비타민은 콜린, 비타민 A, 비타민 E, 이의 유도체, 및 이의 대사물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 비타민은 레티노산 및 알파-토코페릴 숙시네이트로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 링커에 의해 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥에 연결된다.
특정 실시양태에서, 링커는 2가 또는 3가 링커를 포함한다.
특정 실시양태에서, 2가 또는 3가 링커는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00016
Figure pct00017
; 및
Figure pct00018
,
식 중, n은 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
특정 실시양태에서, 링커는 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 아미드, 카바메이트, 또는 이의 조합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 링커가 3가 링커인 경우, 링커는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유도체를 추가로 연결한다.
특정 실시양태에서, 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유도체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
[화학식 Zc1]
Figure pct00019
;
[화학식 Zc2]
Figure pct00020
;
[화학식 Zc3]
Figure pct00021
; 및
[화학식 Zc4]
Figure pct00022
;
식 중, X는 O, S 또는 BH3이다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드, 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된다.
한 측면에서, 본 개시는 화학식 I의 화합물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00023
식 중,
L은 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸 또는 이의 조합을 포함하며, 화학식 I은 선택적으로 하나 이상의 분기점 B, 및 하나 이상의 스페이서 S를 추가로 포함하고,
B는 각각의 경우에 독립적으로 다가 유기 종 또는 이의 유도체이고;
S는 각각의 경우에 독립적으로 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸 또는 이의 조합을 포함하고;
n은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고;
N은 본 개시의 임의의 상기 측면 또는 실시양태의 dsRNA 분자와 같은 이중 가닥 핵산이다. 특정 실시양태에서, 각각의 N은 15 내지 40개 염기 길이이다.
특정 실시양태에서, 각각의 N은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고;
안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 하나 이상의 화학적 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화합물은 화학식 I-1 내지 I-9로부터 선택되는 구조를 포함한다:
Figure pct00024
특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 5' 말단기 R을 포함한다:
Figure pct00025
Figure pct00026
특정 실시양태에서, 화합물은 화학식 II의 구조를 포함한다:
[화학식 II]
Figure pct00027
식 중,
X는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고;
Y는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고;
-는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 나타내고;
=는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 나타내고;
---는 각각의 경우에 개별적으로 염기쌍 형성 상호작용 또는 미스매치를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 화합물은 화학식 IV의 구조를 포함한다:
[화학식 IV]
Figure pct00028
식 중,
X는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고;
Y는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고;
-는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 나타내고;
=는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 나타내고;
---는 각각의 경우에 개별적으로 염기쌍 형성 상호작용 또는 미스매치를 나타낸다.
특정 실시양태에서, L은 구조 L1이다:
[화학식 L1]
Figure pct00029
.
특정 실시양태에서, R은 R3이고 n은 2이다.
특정 실시양태에서, L은 구조 L2이다:
[화학식 L2]
Figure pct00030
.
특정 실시양태에서, R은 R3이고 n은 2이다.
한 측면에서, 본 개시는 화학식 VI의 구조를 갖는 치료용 핵산을 위한 전달 시스템을 제공한다:
[화학식 VI]
Figure pct00031
식 중,
L은 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸, 또는 이의 조합을 포함하고, 화학식 VI는 선택적으로 하나 이상의 분기점 B, 및 하나 이상의 스페이서 S를 추가로 포함하고,
B는 각각의 경우에 독립적으로 다가 유기 종 또는 이의 유도체를 포함하고;
S는 각각의 경우에 독립적으로 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸 또는 이의 조합을 포함하고;
각각의 cNA는 독립적으로 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 담체 핵산이고;
각각의 cNA는 독립적으로 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고;
n은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
특정 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 VI-1 내지 VI-9로부터 선택되는 구조를 포함한다:
Figure pct00032
특정 실시양태에서, 각각의 cNA는 독립적으로 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 전달 시스템은 n개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함하고, 각각의 NA는 적어도 하나의 cNA에 혼성화된다.
특정 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개 이상의 인접 뉴클레오티드)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 14~35개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 14개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 16개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 18개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 20개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 21개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 22개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 23개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 24개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 25개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 26개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 27개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 28개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 29개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 30개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 31개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 32개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 33개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 34개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 35개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 2개의 뉴클레오티드의 쌍을 이루지 않은 오버행을 포함한다.
특정 실시양태에서, 오버행의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결된다.
특정 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 DNA, siRNA, antagomiR, miRNA, 갭머, 믹스머, 및 가이드 RNA로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 각각의 NA는 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적이다.
한 측면에서, 본 개시는 상기 언급된 화합물 또는 상기 언급된 시스템, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 유기체에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 화합물 또는 시스템은 SNCA 유전자의 발현을 적어도 50% 억제한다. 특정 실시양태에서, 화합물 또는 시스템은 SNCA 유전자의 발현을 적어도 80% 억제한다.
한 측면에서, 본 개시는 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 상기 언급된 화합물 또는 상기 언급된 시스템을 세포에 도입하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 생산된 세포를 SNCA 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 얻기 충분한 시간 동안 유지하여 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시는 신경변성 질병의 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에 치료 유효량의 상기 언급된 화합물 또는 상기 언급된 시스템을 투여하는 단계를 포함하는, 신경변성 질병을 치료 또는 관리하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 환자의 뇌에 투여된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 뇌실내(ICV) 주사, 선조체내(IS) 주사, 정맥내(IV) 주사, 피하(SQ) 주사, 또는 이의 조합에 의해 투여된다.
특정 실시양태에서, dsRNA의 투여는 해마, 선조체, 피질, 소뇌, 시상, 시상하부 및 척수 중 하나 이상에서 SNCA 유전자 mRNA의 감소를 유발한다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 50% 억제한다. 특정 실시양태에서, dsRNA는 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 80% 억제한다.
본 개시의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부 도면과 함께 취해진 예시적인 실시양태의 하기 상세한 설명으로부터 보다 완전히 이해될 것이다. 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 청에서 제공될 것이다.
도 1a~1f는 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 인간 SNCA mRNA의 서열을 표적화하는 siRNA의 스크리닝을 도시한다. 도 1a, 유효한 표적화 영역으로서 SNCA 919, SNCA 1133, SNCA 258, SNCA 1054 및 SNCA 1175를 확인하는 12개 서열의 스크리닝; 도 1b~1e, SNCA 919(b), SNCA 1133(c), SNCA 258(d), SNCA 1054(e) 및 SNCA 1175(f) siRNA로 얻은 8-포인트 용량 반응 곡선.
도 2는 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 인간 및 마우스 SNCA mRNA의 서열을 표적화하는 siRNA의 스크리닝을 도시한다. 11개 서열의 스크리닝으로 유효한 표적화 영역으로서 SNCA 270, SNCA 753, SNCA 963 및 SNCA 1094를 확인하였다.
도 3은 도 4a~4c에서 SNCA에 대해 평가된 siRNA 화학적 스캐폴드를 도시한다.
도 4a~4c는 3개의 상이한 화학적 스캐폴드가 적용된 SNCA를 표적화하는 48개 서열의 스크리닝을 도시한다. 히트 서열은 노란색으로 나타낸다. 도 4a, P3 평활 스캐폴드; 도 4b, P3 비대칭 스캐폴드; 도 4c, 2'-O-메틸 풍부 비대칭 스캐폴드.
도 5는 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 SNCA mRNA의 서열을 표적화하는 siRNA의 스크리닝을 도시한다.
도 6은 siRNA SNCA 270, SNCA 753, SNCA 963 및 SNCA 1094로 얻은 8-포인트 용량 반응 곡선을 도시한다. 결과는 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 얻어졌다.
도 7a~7b는 뇌실내(ICV) 주사 1개월 후 몇몇 마우스 뇌 영역에서 표준화된 SNCA mRNA(도 7a) 및 단백질(도 7b) 발현 수준을 도시한다. SNCA 963으로 지정된 SNCA 표적 부위를 표적화하는 siRNA의 10 μl 주사 부피 중 10 nmol 용량이 사용되었다.
신규 SNCA 표적 서열이 제공된다. 또한, 본 개시의 하나 이상의 표적 서열과 같은 SNCA mRNA를 표적화하는 siRNA 및 이를 포함하는 분지형 RNA 화합물과 같은 신규 RNA 분자가 제공된다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 그리고 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법은 당분야에 널리 알려지고 일반적으로 사용되는 것이다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 제공된 방법 및 기술은 당분야에 널리 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 표시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당분야에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이, 제조업체의 사양에 따라 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 그리고 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 그리고 실험실 절차 및 기술은 당분야에 널리 알려지고 일반적으로 사용되는 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약학 제조, 제형, 전달 및 환자 치료에 대한 표준 기술이 사용된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 임의의 잠재적인 모호성이 있는 경우, 본원에 제공된 정의가 임의의 사전 또는 외부 정의보다 우선한다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함되는" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한하는 것이 아니다.
본 개시가 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 먼저 특정 용어가 정의된다.
용어 "뉴클레오시드"는 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유 연결된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 갖는 분자를 지칭한다. 예시적인 뉴클레오시드는 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘 및 티미딘을 포함한다. 추가의 예시적인 뉴클레오시드는 이노신, 1-메틸 이노신, 슈도우리딘, 5,6-다이하이드로우리딘, 리보티미딘, 2N-메틸구아노신 및 N2,N2-디메틸구아노신("희귀" 뉴클레오시드로도 지칭됨)을 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 당 모이어티에 에스테르 연결로 연결된 하나 이상의 포스페이트 기를 갖는 뉴클레오시드를 지칭한다. 예시적인 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 5' 및 3' 탄소 원자 사이의 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결에 의해 함께 연결된 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다.
용어 "RNA" 또는 "RNA 분자" 또는 "리보핵산 분자"는 리보뉴클레오티드(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30개 이상의 리보뉴클레오티드)의 중합체를 지칭한다. 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자" 또는 "데옥시리보핵산 분자"는 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. DNA 및 RNA는 자연적으로 합성될 수 있다(예를 들어, 각각 DNA 복제 또는 DNA 전사에 의해). RNA는 전사 후 변형될 수 있다. DNA 및 RNA는 또한 화학적으로 합성될 수 있다. DNA 및 RNA는 단일 가닥(즉, 각각 ssRNA 및 ssDNA) 또는 다중 가닥(예를 들어, 이중 가닥, 즉, 각각 dsRNA 및 dsDNA)일 수 있다. "mRNA" 또는 "메신저 RNA"는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 특정하는 단일 가닥 RNA이다. 이 정보는 리보솜이 mRNA에 결합할 때 단백질 합성 동안 번역된다.
본원에 사용된 용어 "작은 간섭 RNA"("siRNA")(당분야에서 "짧은 간섭 RNA"로도 지칭됨)는 약 10~50개 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함하는 RNA(또는 RNA 유사체)를 지칭하며, 이는 RNA 간섭을 지시하거나 매개할 수 있다. 특정 실시양태에서, siRNA는 약 15~30개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 또는 약 16~25개 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체), 또는 약 18~23개 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체), 또는 약 19~22개 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체)(예를 들어, 19, 20, 21 또는 22개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함한다. 용어 "짧은" siRNA는 약 21개 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체), 예를 들어 19, 20, 21 또는 22개 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA를 지칭한다. "긴" siRNA는 약 24~25개 뉴클레오티드, 예를 들어, 23, 24, 25 또는 26개 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA를 지칭한다. 짧은 siRNA는 더 짧은 siRNA가 RNAi를 매개하는 능력을 보유하는 한, 일부 경우에 19개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어, 16, 17 또는 18개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 긴 siRNA는 더 긴 siRNA가 짧은 siRNA에 대한 추가 가공, 예를 들어 효소적 가공 없이 RNAi를 매개하는 능력을 보유하는 한, 일부 경우에 26개 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
용어 "뉴클레오티드 유사체" 또는 "변경된 뉴클레오티드" 또는 "변형된 뉴클레오티드"는 비-자연 발생 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 비표준 뉴클레오티드를 지칭한다. 예시적인 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드의 특정 화학적 특성을 변경하면서도 의도된 기능을 수행하는 뉴클레오티드 유사체의 능력을 보유하도록 임의의 위치에서 변형된다. 유도체화될 수 있는 뉴클레오티드의 위치의 예는 5-위치, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘, 5-프로핀 우리딘, 5-프로페닐 우리딘 등; 6 위치, 예를 들어, 6-(2-아미노)프로필 우리딘; 및 아데노신 및/또는 구아노신에 대한 8-위치, 예를 들어 8-브로모 구아노신, 8-클로로 구아노신, 8-플루오로구아노신 등을 포함한다. 뉴클레오티드 유사체는 또한 데아자 뉴클레오티드, 예를 들어 7-데아자-아데노신; O- 및 N-변형(예를 들어, 알킬화된, 예를 들어, N6-메틸 아데노신, 또는 당분야에서 달리 알려진 바와 같은) 뉴클레오티드; 및 문헌(Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310)에 기재된 것들과 같은 다른 헤테로사이클릭 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
뉴클레오티드 유사체는 또한 뉴클레오티드의 당 부분에 대한 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' OH-기는 H, OR, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 COOR로부터 선택된 기로 대체될 수 있으며, R은 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 등이다. 다른 가능한 변형은 미국 특허 제5,858,988호 및 제6,291,438호에 기재된 것들을 포함한다.
뉴클레오티드의 포스페이트기는 또한 예를 들어 포스페이트기의 산소 중 하나 이상을 황으로 치환하여(예를 들어, 포스포로티오에이트) 또는 예를 들어, 문헌(Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85, 및 미국 특허 제5,684,143호)에 기재된 바와 같이 뉴클레오티드가 의도되는 기능을 수행할 수 있도록 하는 다른 치환을 제조함으로써 변형될 수 있다. 상기 언급된 특정 변형(예를 들어, 포스페이트기 변형)은, 예를 들어 생체내 또는 시험관내 상기 유사체를 포함하는 폴리뉴클레오티드의, 가수분해 속도를 감소시킨다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체의 짧은 중합체를 지칭한다.
용어 "RNA 유사체"는 상응하는 변경되지 않은 또는 변형되지 않은 RNA와 비교하여 적어도 하나의 변경되거나 변형된 뉴클레오티드를 갖지만 상응하는 변경되지 않은 또는 변형되지 않은 RNA와 동일하거나 유사한 성질 또는 기능을 보유하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드)를 지칭한다. 상기 논의된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 연결로 연결될 수 있으며, 이는 포스포디에스테르 연결을 갖는 RNA 분자와 비교하여 RNA 유사체의 더 낮은 가수분해 속도를 초래한다. 예를 들어, 유사체의 뉴클레오티드는 메틸렌디올, 에틸렌 디올, 옥시메틸티오, 옥시에틸티오, 옥시카보닐옥시, 포스포로디아미데이트, 포스포로아미데이트, 및/또는 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 일부 RNA 유사체는 당 및/또는 골격-변형 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 변경 또는 변형은 RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로(RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서)와 같은 비-뉴클레오티드 물질의 부가를 추가로 포함할 수 있다. RNA 유사체는 RNA 간섭을 매개하는 능력을 가질 정도로만 천연 RNA와 충분히 유사하면 된다.
본원에 사용된 용어 "RNA 간섭"("RNAi")은 RNA의 선택적 세포내 분해를 지칭한다. RNAi는 외래 RNA(예를 들어, 바이러스 RNA)를 제거하기 위해 세포에서 자연적으로 발생한다. 천연 RNAi는 분해 메커니즘을 다른 유사한 RNA 서열에 지시하는, 자유 dsRNA에서 절단된 단편을 통해 진행된다. 대안적으로, RNAi는 예를 들어 표적 유전자의 발현을 침묵화하기 위해 인공적으로 개시될 수 있다.
"표적 특이적 RNA 간섭(RNAi)을 지시하기 위해 표적 mRNA 서열과 충분히 상보적인 서열"인 가닥을 갖는 RNAi 제제, 예를 들어 RNA 침묵화제는 가닥이 RNAi 기구 또는 과정에 의해 표적 mRNA의 파괴를 촉발하기 충분한 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단리된 RNA"(예를 들어, "단리된 siRNA" 또는 "단리된 siRNA 전구체")는 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 RNA 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "RNA 침묵화"는 RNA 분자에 의해 매개되는 일 군의 서열 특이적 조절 메커니즘(예를 들어, RNA 간섭(RNAi), 전사 유전자 침묵화(TGS), 전사-후 유전자 침묵화(PTGS), 진압, 공동 억제, 및 번역 억제)을 지칭하며, 이는 상응하는 단백질-코딩 유전자 발현의 억제 또는 "침묵화"를 초래한다. RNA 침묵화는 식물, 동물 및 진균을 포함한 많은 유형의 유기체에서 관찰되었다.
용어 "차별적 RNA 침묵화"는 예를 들어, 두 폴리뉴클레오티드 서열이 모두 동일한 세포에 존재할 때 "제2" 또는 "비표적" 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 실질적으로 억제하지 않으면서 "제1" 또는 "표적" 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 실질적으로 억제하는 RNA 분자의 능력을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 유전자에 상응하는 반면, 비-표적 폴리뉴클레오티드 서열은 비-표적 유전자에 상응한다. 다른 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 대립유전자에 상응하는 반면, 비-표적 폴리뉴클레오티드 서열은 비-표적 대립유전자에 상응한다. 특정 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 유전자의 조절 영역(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 요소)을 암호화하는 DNA 서열이다. 다른 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 유전자에 의해 암호화되는 표적 mRNA이다.
용어 "시험관내"는 예를 들어 정제된 시약 또는 추출물, 예를 들어 세포 추출물이 관여되는, 당분야에서 인식된 의미를 갖는다. 용어 "생체내"는 또한 예를 들어 살아있는 세포, 예를 들어 불멸화된 세포, 1차 세포, 세포주 및/또는 유기체 내 세포가 관여되는, 당분야에서 인식된 의미를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "트랜스유전자"는 인공에 의해 세포에 삽입되고 세포로부터 발생하는 유기체의 게놈의 일부가 되는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 트랜스유전자는 트랜스제닉 유기체에 대해 부분적으로 또는 전체적으로 이종성(즉, 외래)인 유전자를 포함할 수 있거나, 유기체의 내인성 유전자와 상동성인 유전자를 나타낼 수 있다. 용어 "트랜스유전자"는 또한 트랜스제닉 동물에 대해 부분적으로 또는 완전히 이종성인, 즉, 외래인, 또는 트랜스제닉 동물의 내인성 유전자와 상동성이지만, 천연 유전자의 위치와 다른 위치에서 동물의 게놈에 삽입되도록 설계되는, 트랜스제닉 유기체, 예를 들어 동물에서 발현될 하나 이상의 조작된 RNA 전구체를 암호화하는 하나 이상의 선택된 핵산 서열, 예를 들어 DNA를 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 트랜스유전자는 모두 선택된 서열에 작동 가능하게 연결된, 선택된 핵산 서열의 발현에 필요한 하나 이상의 프로모터 및 인트론과 같은 임의의 다른 DNA를 포함하고, 인핸서 서열을 포함할 수 있다.
질병 또는 장애에 "관여되는" 유전자는 그 정상 또는 비정상 발현 또는 기능이 질병 또는 장애 또는 상기 질병 또는 장애의 적어도 하나의 증상에 영향을 미치거나 유발하는 유전자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "기능 획득 돌연변이"는 그 유전자에 의해 암호화된 단백질(즉, 돌연변이체 단백질)이 단백질(즉, 야생형 단백질)과 정상적으로 연관되지 않는 기능을 획득하고 질병 또는 장애를 유발하거나 기여하는, 유전자에서의 임의의 돌연변이를 지칭한다. 기능 획득 돌연변이는 암호화된 단백질의 기능에 변화를 일으키는, 유전자의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 결실, 부가 또는 치환일 수 있다. 한 실시양태에서, 기능 획득 돌연변이는 돌연변이체 단백질의 기능을 변화시키거나 다른 단백질과의 상호작용을 유발한다. 또 다른 실시양태에서, 기능 획득 돌연변이는 예를 들어 변경된 돌연변이체 단백질과 상기 정상 야생형 단백질의 상호작용에 의해, 정상 야생형 단백질의 감소 또는 제거를 유발한다.
본원에 사용된 용어 "표적 유전자"는 발현이 실질적으로 억제되거나 "침묵화"되어야 하는 유전자이다. 이러한 침묵화는 RNA 침묵화에 의해, 예를 들어 표적 유전자의 mRNA 절단에 의해 또는 표적 유전자의 번역 억제에 의해 달성될 수 있다. 용어 "비표적 유전자"는 발현이 실질적으로 침묵화되지 않아야 하는 유전자이다. 한 실시양태에서, 표적 및 비-표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표적 및 비-표적 유전자에 의해 암호화된 mRNA)은 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 상이할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적 및 비-표적 유전자는 하나 이상의 다형성(예를 들어, 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 SNP)에 의해 상이할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적 및 비-표적 유전자는 100% 미만의 서열 동일성을 공유할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 비-표적 유전자는 표적 유전자의 상동체(예를 들어, 오르토로그 또는 파라로그)일 수 있다.
"표적 대립유전자"는 발현이 선택적으로 억제되거나 "침묵화"되어야 하는 대립유전자(예를 들어, SNP 대립유전자)이다. 이러한 침묵화는 RNA 침묵화에 의해, 예를 들어 siRNA에 의한 표적 유전자 또는 표적 대립유전자의 mRNA를 절단함으로써 달성될 수 있다. 용어 "비표적 대립유전자"는 발현이 실질적으로 침묵되지 않아야 하는 대립유전자이다. 특정 실시양태에서, 표적 및 비-표적 대립유전자는 동일한 표적 유전자에 상응할 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적 대립유전자는 표적 유전자에 상응하거나 이와 연관되고, 비표적 대립유전자는 비표적 유전자에 상응하거나 이와 연관된다. 한 실시양태에서, 표적 및 비-표적 대립유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 상이할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적 및 비-표적 대립유전자는 하나 이상의 대립유전자 다형성(예를 들어, 하나 이상의 SNP)에 의해 상이할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적 및 비-표적 대립유전자는 100% 미만의 서열 동일성을 공유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "다형성"은 상이한 원천 또는 대상체로부터의(그러나 동일한 유기체로부터의) 동일한 유전자 서열이 비교될 때 확인되거나 검출되는 유전자 서열의 변이(예를 들어, 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환)를 지칭한다. 예를 들어, 다형성은 상이한 대상체로부터의 동일한 유전자 서열이 비교될 때 확인될 수 있다. 이러한 다형성의 확인은 당분야에서 일상적이며, 방법론은 예를 들어 유방암 점 돌연변이를 검출하는 데 사용되는 것과 유사하다. 예를 들어, 대상체의 림프구로부터 추출된 DNA로부터 이어서 상기 다형성 영역에 대해 특이적 프라이머를 사용하는 다형성 영역의 증폭에 의해 확인이 수행될 수 있다. 대안적으로 동일한 유전자의 두 대립유전자가 비교될 때 다형성이 확인될 수 있다. 특정 실시양태에서, 다형성은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)이다.
유기체에서 동일한 유전자의 2개의 대립유전자 사이의 서열 변이는 본원에서 "대립유전자 다형성"으로 지칭된다. 특정 실시양태에서, 대립유전자 다형성은 SNP 대립유전자에 상응한다. 예를 들어, 대립유전자 다형성은 SNP의 두 대립유전자 사이의 단일 뉴클레오티드 변이를 포함할 수 있다. 다형성은 코딩 영역 내의 뉴클레오티드에 있을 수 있지만, 유전 코드의 축퇴성으로 인해 아미노산 서열의 변화는 암호화되지 않는다. 대안적으로, 다형성 서열은 특정 위치에서 상이한 아미노산을 암호화할 수 있지만, 아미노산의 변화는 단백질 기능에 영향을 미치지 않는다. 다형성 영역은 유전자의 비암호화 영역에서도 발견될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 다형성은 유전자의 코딩 영역 또는 유전자의 비번역 영역(예를 들어, 5' UTR 또는 3' UTR)에서 발견된다.
본원에 사용된 용어 "대립유전자 빈도"는 개체 집단의 단일 유전자좌에서 대립유전자(예를 들어, SNP 대립유전자)의 상대 빈도의 척도(예를 들어, 비율 또는 백분율)이다. 예를 들어, 개체 집단이 각각의 체세포에서 특정 염색체 유전자좌(및 해당 유전자좌를 차지하는 유전자)의 n개 유전자좌를 갖고 있는 경우, 대립유전자의 대립유전자 빈도는 대립유전자가 집단에서 차지하는 유전자좌의 분율 또는 백분율이다. 특정 실시양태에서, 대립유전자(예를 들어, SNP 대립유전자)의 대립유전자 빈도는 샘플 집단에서 적어도 10%(예를 들어, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 이상)이다.
본원에 사용된 용어 "샘플 집단"은 통계적으로 유의한 수의 개체를 포함하는 개체의 집단을 지칭한다. 예를 들어, 샘플 집단은 50, 75, 100, 200, 500, 1000명 이상의 개체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플 집단은 적어도 공통 질병 표현형(예를 들어, 기능 획득 장애) 또는 돌연변이(예를 들어, 기능 획득 돌연변이)를 공유하는 개체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이형접합성"은 특정 유전자좌에서(예를 들어, SNP에서) 이형접합성인(예를 들어, 2개 이상의 상이한 대립유전자를 포함하는) 집단 내 개체의 분율을 지칭한다. 이형접합성은 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 샘플 집단에 대해 계산할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리글루타민 도메인"은 펩티드 결합에 연결된 연속 글루타민 잔기로 구성되는 단백질의 분절 또는 도메인을 지칭한다. 한 실시양태에서, 연속 영역은 적어도 5개의 글루타민 잔기를 포함한다.
본원에 기재된 용어 SNCA는 단백질 알파 시누클레인, 또는 α-시누클레인을 암호화하는 유전자를 지칭한다. SNCA 유전자는 염색체 4q22.1에 위치한다. SNCA는 140개 아미노산으로 구성되고 3개의 상이한 도메인: (1) N-말단 지질-결합 알파-나선형 도메인; (2) 비-아밀로이드-성분(NAC); 및 (3) 산성 C-말단 도메인을 포함하는 풍부한 14 kDa 단백질이다. SNCA의 N-말단 도메인은 7개의 11-잔기 반복부를 포괄하며, 각각 고도로 보존된 KTKEGV 모티프를 포함한다. 중앙 영역인 NAC 도메인은 β-시트를 형성하며 고도로 소수성인 아미노산으로 구성되어, 응집체를 형성하는 그 경향성에 기여한다. SNCA의 주로 구조화되지 않은 입체형태는 인산화와 같은 번역-후 변형에 대한 그 민감성을 증가시킨다. 단량체 SNCA는 독성이 아니지만, SNCA 올리고머 및 피브릴은 신경 독성과 상관관계가 있다. SNCA의 과발현 또는 3배화는 SNCA 응집을 개시하기 충분하며, 이는 도파민성 뉴런의 사멸을 유발한다.
본원에 기재된 용어 시누클레인병증은 파킨슨병, 파킨슨병 치매, 루이 소체를 갖는 치매, 다계통 위축 및 소수의 다른 덜-특성규명된 신경축삭 이영양증을 포함하는 신경변성 질환의 한 패밀리를 지칭한다. α-시누클레인병증의 중복되는 특징은 α-시누클레인의 응집체를 포함하는 단백질성 소체의 존재이다. 이들 단백질성 소체는 상이한 α-시누클레인병증에서 외관이 상이하며, 파킨슨병 및 루이 소체를 갖는 치매에서는 루이 소체로, 다계통 위축에서는 아교세포 세포질 봉입체로, 그리고 신경축삭 이영양증에서는 축삭 구형체로 불린다. 최근 증거는 헌팅턴병을 갖는 환자가 뇌에서 SNCA의 증가된 응집을 나타낼 수 있음을 제시한다. 또한 시누클레인병증은 시누클레인과 타우 단백질 사이의 잠재적인 상호작용으로 인해, 알츠하이머병과 같은 타우병증과 중복될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "확장된 폴리글루타민 도메인" 또는 "확장된 폴리글루타민 분절"은 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 35개의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 단백질의 분절 또는 도메인을 지칭한다. 이러한 확장된 분절은 대상체가 증상을 나타내든 나타내지 않든, 본원에 기재된 바와 같이 폴리글루타민 장애를 앓고 있는 대상체에서 발견된다.
본원에 사용된 용어 "트리뉴클레오티드 반복부" 또는 "트리뉴클레오티드 반복부 영역"은 특정 트리뉴클레오티드 서열의 연속 반복부로 구성되는 핵산 서열의 분절을 지칭한다. 한 실시양태에서, 트리뉴클레오티드 반복부는 적어도 5개의 연속 트리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예시적인 트리뉴클레오티드 서열은 CAG, CGG, GCC, GAA, CTG 및/또는 CGG를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "트리뉴클레오티드 반복부 질병"은 유전자 내에 위치한 확장된 트리뉴클레오티드 반복부 영역을 특징으로 하는 임의의 질병 또는 장애를 지칭하며, 확장된 트리뉴클레오티드 반복부 영역은 질병 또는 장애의 원인이 된다. 트리뉴클레오티드 반복부 질병의 예는 헌팅턴병(HD), 척수-소뇌 운동실조 유형 12 척수-소뇌 운동실조 유형 8, 취약 X 증후군, 취약 XE 정신 지체, 프리드라이히 운동실조 및 근긴장성 이영양증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 개시에 따른 치료를 위한 예시적인 트리뉴클레오티드 반복부 질병은 질병 또는 장애를 유발하거나 원인이 되는 돌연변이체 단백질을 암호화하는 유전자의 코딩 영역의 5' 말단에서 확장된 트리뉴클레오티드 반복부 영역을 특징으로 하거나 이에 의해 유발되는 것들이다. 특정 트리뉴클레오티드 질병, 예를 들어 돌연변이가 코딩 영역과 연관되지 않는 취약 X 증후군은 RNAi에 의해 표적화될 적합한 mRNA가 없기 때문에 본 개시의 방법론에 따른 치료에 적합하지 않을 수 있다. 대조적으로, 프리드라이히 운동실조와 같은 질병은 원인 돌연변이가 코딩 영역 내에 있지 않지만(즉, 인트론 내에 있음) 돌연변이가 예를 들어, mRNA 전구체(예를 들어, 사전-스플라이싱 mRNA 전구체) 내에 있을 수 있으므로, 본 개시의 방법론에 따른 치료에 적합할 수 있다.
문구 "세포 또는 유기체에서 유전자의 기능 조사"는 그로부터 발생하는 발현, 활성, 기능 또는 표현형을 조사하거나 연구하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "RNA 침묵화제"는 표적 유전자의 발현을 억제 또는 "침묵화"할 수 있는 RNA를 지칭한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 전사-후 침묵화 메카니즘을 통해 mRNA 분자의 완전한 가공(예를 들어, 전체 번역 및/또는 발현)을 방지할 수 있다. RNA 침묵화제는 작은(<50 b.p.) 비코딩 RNA 분자, 예를 들어 쌍을 이룬 가닥을 포함하는 RNA 이중체 뿐만 아니라 이로부터 이러한 작은 비코딩 RNA가 생성될 수 있는 전구체 RNA를 포함한다. 예시적인 RNA 침묵화제는 siRNA, miRNA, siRNA-유사 이중체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, GAPMER 분자, 및 이중 기능 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라 이의 전구체를 포함한다. 한 실시양태에서, RNA 침묵화제는 RNA 간섭을 유도할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RNA 침묵화제는 번역 억제를 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "희귀 뉴클레오티드"는 드물게 발생하는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 예를 들어 구아노신, 아데노신, 시토신 또는 우리딘이 아닌 자연 발생 리보뉴클레오티드를 포함하는, 드물게 발생하는 자연 발생 뉴클레오티드를 지칭한다. 희귀 뉴클레오티드의 예는 이노신, 1-메틸 이노신, 슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 리보티미딘, 2N-메틸구아노신 및 2,2N,N-디메틸구아노신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
조작된 RNA 전구체 또는 조작된 핵산 분자에서와 같이 용어 "조작된"은 전구체 또는 분자의 핵산 서열의 전부 또는 일부가 인간에 의해 생성되거나 선택된다는 점에서 전구체 또는 분자가 자연에서 발견되지 않음을 시사한다. 일단 생성되거나 선택되면, 서열은 복제, 번역, 전사되거나 세포 내의 메커니즘에 의해 다르게 가공될 수 있다. 따라서, 조작된 핵산 분자를 포함하는 트랜스유전자로부터 세포 내에서 생성된 RNA 전구체는 조작된 RNA 전구체이다.
당분야에서 "작은 시간적 RNA"("stRNA")로도 알려져 있는, 본원에 사용된 용어 "마이크로RNA"("miRNA")는 유전적으로(예를 들어, 바이러스, 포유류 또는 식물 게놈에 의해) 암호화되고 RNA 침묵화를 지시하거나 매개할 수 있는 작은(10~50개 뉴클레오티드) RNA를 지칭한다. "miRNA 장애"는 miRNA의 비정상적인 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질병 또는 장애를 지칭할 것이다.
본원에 사용된 용어 "이중 기능성 올리고뉴클레오티드"는 화학식 T-L-μ를 갖는 RNA 침묵화제를 지칭하며, T는 mRNA 표적화 모이어티이고, L은 연결 모이어티이고, μ는 miRNA 모집 모이어티이다. 본원에 사용된 용어 "mRNA 표적화 모이어티", "표적화 모이어티", "mRNA 표적화 부분" 또는 "표적화 부분"은 침묵화를 위해 선택되거나 표적화된 mRNA의 일부 또는 영역과 충분한 크기 및 충분한 상보성을 갖는(즉, 모이어티는 표적 mRNA를 포획하기 충분한 서열을 가짐) 이중 기능성 올리고뉴클레오티드의 도메인, 부분 또는 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "연결 모이어티" 또는 "연결 부분"은 mRNA를 공유 연결시키거나 연결하는 RNA-침묵화제의 도메인, 부분 또는 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 RNA 침묵화제, 예를 들어 siRNA 또는 RNA 침묵화제의 "안티센스 가닥"은 침묵화를 위해 표적화된 유전자의 mRNA의 약 10~50개 뉴클레오티드, 예를 들어, 약 15~30, 16~25, 18~23 또는 19~22개 뉴클레오티드 섹션과 실질적으로 상보적인 가닥을 지칭한다. 안티센스 가닥 또는 제1 가닥은 표적 특이적 침묵화를 지시하기 위해 원하는 표적 mRNA 서열과 충분히 상보적인, 예를 들어 RNAi 기구 또는 과정(RNAi 간섭)에 의한 원하는 표적 mRNA의 파괴를 촉발하기 충분히 상보적인 또는 원하는 표적 mRNA의 번역 억제를 촉발하기 충분히 상보적인 서열을 갖는다.
용어 RNA 침묵화제, 예를 들어, siRNA 또는 RNA 침묵화제의 "센스 가닥" 또는 "제2 가닥"은 안티센스 가닥 또는 제1 가닥과 상보적인 가닥을 지칭한다. 안티센스 및 센스 가닥은 제1 또는 제2 가닥으로도 지칭될 수 있으며, 제1 또는 제2 가닥은 표적 서열과 상보성을 갖고 각각의 제2 또는 제1 가닥은 상기 제1 또는 제2 가닥과 상보성을 갖는다. miRNA 이중체 중간체 또는 siRNA-유사 이중체는 침묵화를 위해 표적화된 유전자의 mRNA의 약 10~50개 뉴클레오티드 섹션과 충분한 상보성을 갖는 miRNA 가닥 및 miRNA 가닥과 이중체를 형성하기 충분한 상보성을 갖는 miRNA* 가닥을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "가이드 가닥"은 RISC 복합체로 들어가 표적 mRNA의 절단을 지시하는, RNA 침묵화제의 가닥, 예를 들어 siRNA 이중체 또는 siRNA 서열의 안티센스 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "비대칭"은 RNA 침묵화제의 이중체 영역(예를 들어, shRNA의 줄기)의 비대칭에서와 같이, 이중체의 한 가닥의 5' 말단이 상보적 가닥의 5' 말단보다 더 빈번하게 일시적인 쌍을 이루지 않은, 예를 들어 단일-가닥 상태이도록 하는, RNA 침묵화제의 말단 간(예를 들어, 제1 가닥 또는 줄기 부분의 말단 뉴클레오티드 및 반대되는 제2 가닥 또는 줄기 부분의 말단 뉴클레오티드 간) 결합 강도 또는 염기쌍 형성 강도의 불평등을 지칭한다. 이러한 구조적 차이가 이중체의 한 가닥이 RISC 복합체에 우선적으로 포함됨을 결정한다. 5' 말단이 상보적 가닥에 덜 단단히 쌍을 이룬 가닥이 우선적으로 RISC에 포함되고 RNAi를 매개할 것이다.
본원에 사용된 용어 "결합 강도" 또는 "염기쌍 강도"는 주로 상기 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 간 H-결합, 반 데르 발스 상호작용 등으로 인한 올리고뉴클레오티드 이중체(예를 들어 siRNA 이중체)의 반대 가닥 상의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 쌍 간 상호작용의 강도를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 안티센스 가닥의 5' 말단에서와 같은 "5' 말단"은 5' 말단 뉴클레오티드, 예를 들어 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 1개 내지 약 5개 뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 센스 가닥의 3' 말단에서와 같은 "3' 말단"은 상보적인 안티센스 가닥의 5' 말단의 뉴클레오티드와 상보적인 영역, 예를 들어 1 내지 약 5개 뉴클레오티드의 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "탈안정화 뉴클레오티드"는 염기쌍이 통상적인 염기쌍(즉, 왓슨-크릭 염기쌍)보다 작은 결합 강도를 갖도록 하는 제2 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체와 염기쌍을 형성할 수 있는 제1 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 탈안정화 뉴클레오티드는 제2 뉴클레오티드와 미스매치 염기쌍을 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 탈안정화 뉴클레오티드는 제2 뉴클레오티드와 워블 염기쌍을 형성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 탈안정화 뉴클레오티드는 제2 뉴클레오티드와 모호한 염기쌍을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "염기쌍"은 주로 상기 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 간 H-결합, 반 데르 발스 상호작용 등으로 인한 올리고뉴클레오티드 이중체(예를 들어, RNA 침묵화제의 가닥 및 표적 mRNA 서열에 의해 형성된 이중체)의 반대 가닥 상의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 쌍 간의 상호작용을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "결합 강도" 또는 "염기 쌍 강도"는 염기쌍의 강도를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "미스매치된 염기쌍"은 비-상보적 또는 비-왓슨-크릭 염기쌍으로 구성되는 염기쌍, 예를 들어 정상 상보적 G:C, A:T 또는 A:U 염기쌍이 아닌 염기쌍을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "모호한 염기쌍"(비-차별적 염기쌍으로도 알려짐)은 보편적 뉴클레오티드에 의해 형성된 염기쌍을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "보편적 뉴클레오티드"("중성 뉴클레오티드"로도 알려져 있음)는 염기싸응ㄹ 형성할 때 상보적 폴리뉴클레오티드 상의 염기 간에 유의하게 구별되지 않는 염기("보편적 염기" 또는 "중성 염기")를 갖는 뉴클레오티드(예를 들어, 특정 탈안정화 뉴클레오티드)를 포함한다. 보편적 뉴클레오티드는 적층 상호작용으로 인해 역평행 이중체 핵산(예를 들어, 이중 가닥 DNA 또는 RNA)으로 효율적으로 패킹될 수 있는 주로 소수성 분자이다. 보편적 뉴클레오티드의 염기 부분은 전형적으로 질소 포함 방향족 헤테로사이클릭 모이어티를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "충분한 상보성" 또는 "충분한 정도의 상보성"은 RNA 침묵화제가 원하는 표적 RNA에 각각에 결합하고 표적 mRNA의 RNA 침묵화를 촉발하기 충분한 서열을(예를 들어 안티센스 가닥, mRNA 표적화 모이어티 또는 miRNA 모집 모이어티에서) 가짐을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "번역 억제"는 mRNA 번역의 선택적 억제를 지칭한다. 자연적 번역 억제는 shRNA 전구체로부터 절단된 miRNA를 통해 진행된다. RNAi 및 번역 억제는 모두 RISC에 의해 매개된다. RNAi 및 번역 억제는 모두 자연 발생하거나 예를 들어 표적 유전자의 발현을 침묵화하기 위해 인공적으로 개시될 수 있다.
본 개시의 다양한 방법론은 값, 수준, 특징, 특색, 특성 등을 본원에서 "적절한 대조군"으로 상호교환 가능하게 지칭되는 "적합한 대조군"과 비교하는 것이 관여되는 단계를 포함한다. "적합한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 비교 목적에 유용한 당업자에게 친숙한 임의의 대조군 또는 표준이다. 한 실시양태에서, "적합한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 방법론을 수행하기 전에 결정된 값, 수준, 특징, 특색, 특성 등이다. 예를 들어, 전사 속도, mRNA 수준, 번역 속도, 단백질 수준, 생물학적 활성, 세포 특색 또는 특성, 유전형, 표현형 등은 본 개시의 RNA 침묵화제를 세포 또는 유기체에 도입하기 전에 결정될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, "적합한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 예를 들어, 정상적인 특질을 나타내는 세포 또는 유기체, 예를 들어 대조군 또는 정상 세포 또는 유기체에서 결정된 값, 수준, 특징, 특색, 특성 등이다. 또 다른 실시양태에서, "적합한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 미리 정의된 값, 수준, 특징, 특색, 특성 등이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 아래에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 상충 시, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.
본 개시의 다양한 측면은 하기 하위섹션에서 더욱 상세하게 기재된다.
I. 신규 표적 서열
특정한 예시적 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제는 표 4~6에 언급된 바와 같이 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열을 표적화할 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제는 표 7~8에 언급된 바와 같이 서열 번호 14~28로 구성되는 군으로부터 선택되는 SNCA 핵산 서열 중 하나 이상을 표적화할 수 있다.
각 표적 서열에 대한 게놈 서열은 예를 들어 NCBI에서 관리되는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
II. siRNA 설계
일부 실시양태에서, siRNA는 하기와 같이 설계된다. 먼저, 표적 유전자(예를 들어, SNCA 유전자)의 일부, 예를 들어, 표 4-6에 제시된 표적 서열 중 하나 이상 이 선택된다. 이들 부위에서 mRNA의 절단은 상응하는 단백질의 번역을 제거할 것이다. 안티센스 가닥은 표적 서열에 기반하여 설계되었으며 센스 가닥은 안티센스 가닥과 상보적으로 설계되었다. 안티센스 및 센스 가닥의 혼성화가 siRNA 이중체를 형성한다. 안티센스 가닥은 약 19 내지 25개 뉴클레오티드, 예를 들어, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20, 21, 22 또는 23개 뉴클레오티드를 포함한다. 센스 가닥은 약 14 내지 25개 뉴클레오티드, 예를 들어, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드이다. 그러나, 당업자는 19개 미만의 뉴클레오티드 또는 25개 초과의 뉴클레오티드 길이를 갖는 siRNA가 또한 RNAi를 매개하는 기능을 할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 이러한 길이의 siRNA는 RNAi를 매개하는 능력을 보유하는 한, 본 개시의 범위 내에 속한다. 더 긴 RNAi 제제는 바람직하지 않을 수 있는 특정 포유류 세포에서 인터페론 또는 PKR 반응을 유도하는 것으로 실증되었다. 특정 실시양태에서, 본 개시의 RNAi 제제는 PKR 반응을 유도하지 않는다(즉, 충분히 짧은 길이를 가짐). 그러나 더 긴 RNAi 제제는 예를 들어 PKR 반응을 생성할 수 없는 세포 유형에서 또는 PKR 반응이 하향 조절되거나 대안적 수단에 의해 약화되는 상황에서 유용할 수 있다.
센스 가닥 서열은 표적 서열이 본질적으로 가닥의 중간에 있도록 설계될 수 있다. 표적 서열을 중심에서 벗어난 위치로 이동시키는 것은 일부 경우에 siRNA에 의한 절단 효율을 감소시킬 수 있다. 이러한 조성물, 즉 덜 효율적인 조성물은 야생형 mRNA의 침묵화-제거가 검출되는 경우 사용하기 위해 바람직할 수 있다.
안티센스 가닥은 센스 가닥과 동일한 길이일 수 있으며 상보적 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 가닥은 완전히 상보적이며, 즉 가닥은 정렬되거나 어닐링될 때 평활 말단이다. 또 다른 실시양태에서, 가닥은 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-뉴클레오티드 오버행이 생성되도록, 즉 센스 가닥의 3' 말단이 안티센스 가닥의 5' 말단보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 뉴클레오티드 더 연장되고/되거나 안티센스 가닥의 3' 말단이 센스 가닥의 5' 말단보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 뉴클레오티드 더 연장되도록 정렬하거나 어닐링된다. 오버행은 표적 유전자 서열(또는 이의 상보체)에 상응하는 뉴클레오티드를 포함할(또는 이로 구성될) 수 있다. 대안적으로, 오버행은 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 dT, 또는 뉴클레오티드 유사체, 또는 다른 적합한 비-뉴클레오티드 물질을 포함할(또는 이로 구성될) 수 있다.
안티센스 가닥의 RISC로의 진입을 용이하게 하기 위해(이에 따라 표적 절단 및 침묵화 효율을 증가시키거나 개선하기 위해), 센스 가닥의 5' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단 간 염기쌍 강도가 변경될 수 있다, 예를 들어 "Methods and Compositions for Controlling Efficacy of RNA Silencing"(2003년 6월 2일 출원)을 표제로 하는 미국 특허 제7,459,547호, 제7,772,203호 및 제7,732,593호 및 "Methods and Compositions for Enhancing the Efficacy and Specificity of RNAi"(2003년 6월 2일 출원)를 표제로 하는 미국 특허 제8,309,704호, 제7,750,144호, 제8,304,530호, 제8,329,892호 및 제8,309,705호에 상세히 기재된 바와 같이 절감 또는 감소될 수 있으며, 그 내용은 전체가 참조로 포함된다. 본 개시의 이러한 측면의 한 실시양태에서, 염기쌍 강도는 제1 또는 안티센스 가닥의 3' 말단 및 제2 또는 센스 가닥의 5' 말단 간에서보다 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 말단 및 제2 또는 센스 가닥의 3' 말단 간의 더 적은 G:C 염기쌍으로 인해 더 작다. 또 다른 실시양태에서, 염기쌍 강도는 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 말단 및 제2 또는 센스 가닥의 3' 말단 간 적어도 하나의 미스매치 염기쌍으로 인해 더 작다. 특정한 예시적 실시양태에서, 미스매치된 염기쌍은 G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C 및 U:U로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 염기쌍 강도는 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 말단 및 제2 또는 센스 가닥의 3' 말단 간 적어도 하나의 워블 염기쌍, 예를 들어 G:U로 인해 더 작다. 또 다른 실시양태에서, 염기쌍 강도는 희귀 뉴클레오티드, 예를 들어 이노신(I)을 포함하는 적어도 하나의 염기쌍으로 인해 더 작다. 특정한 예시적 실시양태에서, 염기쌍은 I:A, I:U 및 I:C로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 염기쌍 강도는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 염기쌍으로 인해 더 작다. 특정한 예시적 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2-아미노-G, 2-아미노-A, 2,6-디아미노-G, 및 2,6-디아미노-A로 구성되는 군으로부터 선택된다.
표 4~6에 제시된 SNCA 표적 서열을 표적화하기 적합한 siRNA의 설계가 아래에 상세히 기재된다. siRNA는 SNCA 유전자에서 발견되는 임의의 다른 표적 서열에 대한 상기 예시적인 교시에 따라 설계될 수 있다. 또한, 이 기술은 임의의 다른 표적 서열, 예를 들어 질병을 유발하지 않는 표적 서열을 표적화하는 데 적용 가능하다.
siRNA가 mRNA(예를 들어, SNCA mRNA)를 파괴하는 효율성을 검증하기 위해, siRNA는 초파리 기반 시험관내 mRNA 발현 시스템에서 cDNA(예를 들어, SNCA cDNA) 와 함께 인큐베이션될 수 있다. 32P로 방사성표지된, 새로 합성된 mRNA(예를 들어, SNCA mRNA)는 아가로스 겔에서 자가방사선 사진으로 검출된다. 절단된 mRNA의 존재는 mRNA 뉴클레아제 활성을 시사한다. 적절한 대조군은 siRNA의 생략을 포함한다. 대안적으로, 선택된 siRNA와 동일한 뉴클레오티드 조성을 갖지만 적절한 표적 유전자와 유의한 서열 상보성을 갖지 않는 대조군 siRNA가 선택된다. 이러한 음성 대조군은 선택된 siRNA의 뉴클레오티드 서열을 무작위로 스크램블링함으로써 설계될 수 있으며; 상동성 검색이 수행되어 음성 대조군이 적절한 게놈에서 임의의 다른 유전자와 상동성이 결여되어 있음을 확인할 수 있다. 또한, 하나 이상의 염기 미스매치를 서열에 도입하여 음성 대조군 siRNA가 설계될 수 있다. 최적의 mRNA 특이성 및 최대 mRNA 절단을 초래하는 siRNA-mRNA 보완 부위가 선택된다.
III. RNAi 제제
본 개시는 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 설계된 siRNA 분자와 같은 RNAi 분자를 포함한다. 본 개시의 siRNA 분자는 화학적으로 합성될 수 있거나, DNA 주형으로부터 시험관내, 또는 예를 들어, shRNA로부터 생체내 전사될 수 있거나, 재조합 인간 다이서(DICER) 효소를 사용하여 시험관내 전사된 dsRNA 주형을 RNAi를 매개하는 20-, 21- 또는 23-bp 이중체 RNA 풀로 절단할 수 있다. siRNA 분자는 당분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 설계될 수 있다.
한 측면에서, RNAi 제제가 간섭 리보핵산, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 siRNA 또는 shRNA인 대신에, RNAi 제제는 상기 기재된 바와 같은 간섭 리보핵산, 예를 들어 shRNA를 암호화할 수 있다. 다시 말하면, RNAi 제제는 간섭 리보핵산의 전사 주형일 수 있다. 따라서, 본 개시의 RNAi 제제는 또한 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 및 shRNA를 발현하도록 조작된 발현 작제물을 포함할 수 있다. shRNA의 전사는 중합효소 III(pol III) 프로모터에서 개시되고 4-5-티민 전사 종결 부위의 위치 2에서 종결되는 것으로 생각된다. 발현 시 shRNA는 3' UU 오버행을 갖는 줄기 루프 구조로 폴딩되는 것으로 생각된다; 이어서, 이들 shRNA의 말단이 가공되어 shRNA를 약 21~23개 뉴클레오티드의 siRNA 유사 분자로 전환한다(Brummelkamp et al., 2002; Lee et al., 2002, 상기 문헌; Miyagishi et al., 2002; Paddison et al., 2002, 상기 문헌; Paul et al., 2002, 상기 문헌; Sui et al., 2002 상기 문헌; Yu et al., 2002, 상기 문헌. shRNA 설계 및 사용에 대한 추가 정보는 인터넷 상에서 하기 주소에서 발견될 수 있다: katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/BseRI-BamHI_Strategy.pdf 및 katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/Web_version_of_PCR_strategy1.pdf).
본 개시의 발현 작제물은 적절한 발현 시스템에서 사용하기 적합한 임의의 작제물을 포함하고, 당분야에 알려진 바와 같이 레트로바이러스 벡터, 선형 발현 카세트, 플라스미드 및 바이러스 또는 바이러스 유래 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 발현 작제물은 하나 이상의 유도성 프로모터, U6 snRNA 프로모터 또는 H1 RNA 중합효소 III 프로모터와 같은 RNA Pol III 프로모터 시스템, 또는 당분야에 알려진 다른 프로모터를 포함할 수 있다. 작제물은 siRNA의 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 포함할 수 있다. 두 가닥을 모두 발현하는 발현 작제물은 또한 두 가닥을 연결하는 루프 구조를 포함할 수 있거나, 각 가닥은 동일한 작제물에서 별도의 프로모터로부터 별도로 전사될 수 있다. 각 가닥은 또한 별도의 발현 작제물로부터 전사될 수 있다(Tuschl, T., 2002, 상기 문헌).
합성 siRNA는 양이온성 리포솜 형질감염 및 전기천공을 포함하는 당분야에 알려진 방법에 의해 세포에 전달될 수 있다. 표적 유전자(예를 들어, SNCA 유전자)의 장기 억제를 얻고 특정 상황에서 전달을 용이하게 하기 위해, 하나 이상의 siRNA가 재조합 DNA 작제물로부터 세포에서 발현될 수 있다. 기능성 이중 가닥 siRNA를 발현할 수 있는 포유류 Pol III 프로모터 시스템(예를 들어, H1 또는 U6/snRNA 프로모터 시스템(Tuschl, T., 2002, 상기 문헌)을 포함하는, 세포에서 장기 표적 유전자 억제를 허용하기 위해 재조합 DNA 작제물로부터 세포에서 siRNA 이중체를 발현하는 이러한 방법은 당분야에 알려져 있다(Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, 상기 문헌; Miyagishi et al., 2002, 상기 문헌; Paul et al., 2002, 상기 문헌; Yu et al., 2002, 상기 문헌; Sui et al., 2002, 상기 문헌). RNA Pol III에 의한 전사 종결은 DNA 주형에서 4개의 연속 T 잔기의 진행에서 발생하여, 특정 서열에서 siRNA 전사를 끝내는 메커니즘을 제공한다. siRNA는 5'-3' 및 3'-5' 배향으로 표적 유전자의 서열과 상보적이며, siRNA의 두 가닥은 동일한 작제물 또는 별도의 작제물로 발현될 수 있다. H1 또는 U6 snRNA 프로모터에 의해 유도되고 세포에서 발현되는 헤어핀 siRNA는 표적 유전자 발현을 억제할 수 있다(Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, 상기 문헌; Miyagishi et al., 2002, 상기 문헌; Paul et al., 2002, 상기 문헌; Yu et al., 2002), 상기 문헌; Sui et al., 2002, 상기 문헌). T7 프로모터의 제어 하에 siRNA 서열을 포함하는 작제물은 또한 T7 RNA 중합효소를 발현하는 벡터로 세포에 동시 형질감염될 때 기능성 siRNA를 만든다(Jacque et al., 2002, 상기 문헌). 단일 작제물은 동일한 유전자 또는 다중 유전자를 표적화하는 SNCA를 암호화하는 유전자의 다중 영역과 같은 siRNA를 코딩하는 다중 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 별도의 PolIII 프로모터 부위에 의해 유도될 수 있다.
동물 세포는 동물 발생 동안 전사-후 또는 번역-후 수준에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 마이크로 RNA(miRNA)로 명명된 대략 약 22개 뉴클레오티드의 다양한 비코딩 RNA를 발현한다. miRNA의 공통된 특징 중 하나는 이들이 모두 대략 70개 뉴클레오티드 전구체 RNA 줄기 루프에서 아마도 다이서, RNase III-유형 효소 또는 이의 상동체에 의해 모두 절제된다는 것이다. miRNA 전구체의 줄기 서열을 표적 mRNA와 상보적인 서열로 대체함으로써, 조작된 전구체를 발현하는 벡터 작제물이 포유류 세포에서 특정 mRNA 표적에 대해 RNAi를 개시하기 위한 siRNA를 생산하는 데 사용될 수 있다(Zeng et al., 2002, 상기 문헌). 중합효소 III 프로모터를 포함하는 DNA 벡터에 의해 발현될 때, 마이크로-RNA 설계된 헤어핀은 유전자 발현을 침묵화할 수 있다(McManus et al., 2002, 상기 문헌). 다형성을 표적화하는 마이크로RNA는 또한 siRNA 매개 유전자 침묵화의 부재 하에, 돌연변이체 단백질의 번역을 차단하는 데 유용할 수 있다. 이러한 적용은 예를 들어 설계된 siRNA가 야생형 단백질의 표적외 침묵화를 유발한 상황에서 유용할 수 있다.
바이러스 매개 전달 메커니즘은 또한 예를 들어 RNA Pol II 프로모터 전사 제어 하에 siRNA를 보유하는 재조합 아데노바이러스를 생성함으로써 siRNA의 발현을 통해 표적화된 유전자의 특이적 침묵화를 유도하는 데 사용될 수 있다(Xia et al., 2002, 상기 문헌). 이러한 재조합 아데노바이러스에 의한 HeLa 세포의 감염은 감소된 내인성 표적 유전자 발현을 허용한다. 재조합 아데노바이러스 벡터를 siRNA의 표적 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스에 주사하면 표적 유전자 발현의 생체내 감소를 초래한다. 동물 모델에서 전체 배아 전기천공은 합성 siRNA를 착상 후 마우스 배아로 효율적으로 전달할 수 있다(Calegari et al., 2002). 성체 마우스에서 siRNA의 효율적인 전달은 꼬리 정맥을 통해 동물에 다량의 siRNA 포함 용액을 신속하게 주사(5초 이내)하는 "고압" 전달 기술에 의해 달성될 수 있다(Liu et al., 1999, 상기 문헌; McCaffrey et al., 2002, 상기 문헌; Lewis et al., 2002. 나노입자 및 리포솜은 또한 동물에 siRNA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 및 이의 연관된 벡터는 다음과 같을 수 있다. 하나 이상의 siRNA를 세포, 예를 들어 신경 세포(예를 들어, 뇌 세포)에 전달하는 데 사용될 수 있다(미국 특허 출원 2014/0296486, 2010/0186103, 2008/0269149, 2006/0078542 및 2005/0220766).
본 개시의 핵산 조성물은 변형되지 않은 siRNA 및 가교된 siRNA 유도체 또는 비-뉴클레오티드 모이어티가 예를 들어 3' 또는 5' 말단에 연결된 유도체와 같은 변형된 siRNA를 모두 포함한다. 이러한 방식으로 siRNA 유도체를 변형하는 것은 상응하는 siRNA에 비해 생성된 siRNA 유도체의 세포 흡수를 개선하거나 세포 표적화 활성을 향상시킬 수 있으며, 상응하는 siRNA와 비교하여 세포 내 siRNA 유도체를 추적하거나 siRNA 유도체의 안정성을 개선하는 데 유용하다.
본원에 기재된 바와 같이 세포 또는 전체 유기체에 도입된 조작된 RNA 전구체는 원하는 siRNA 분자의 생산을 야기할 것이다. 그런 다음 이러한 siRNA 분자는 RNAi 경로의 내인성 단백질 성분과 연합하여 절단 및 파괴를 위한 특정 mRNA 서열에 결합하고 이를 표적화할 것이다. 이러한 방식으로 mRNA는 조작된 RNA 전구체로부터 생성된 siRNA에 의해 표적화되고 세포 또는 유기체로부터 고갈되어, 세포 또는 유기체에서 해당 mRNA에 의해 암호화된 단백질 농도의 감소를 야기할 것이다. RNA 전구체는 전형적으로 dsRNA의 한 가닥을 개별적으로 암호화하거나 RNA 헤어핀 루프 구조의 전체 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 핵산 분자이다.
본 개시의 핵산 조성물은 접합되지 않을 수 있거나 나노입자와 같은 또 다른 모이어티에 접합되어 조성물의 특성, 예를 들어, 흡수, 유효성, 생체이용률 및/또는 반감기와 같은 약동학적 매개변수를 향상시킬 수 있다. 접합은 당분야에 알려진 방법, 예를 들어 문헌(Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001))(폴리알킬시아노아크릴레이트(PACA) 나노입자에 로딩된 핵산을 기재함); 문헌(Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998))(나노입자에 결합된 핵산을 기재함); 문헌(Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994))(삽입제, 소수성 기, 다중양이온 또는 PACA 나노입자에 연결된 핵산을 기재함); 및 문헌(Godard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995))(나노입자에 연결된 핵산을 기재함)의 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
본 개시의 핵산 분자는 또한 당분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 표지될 수 있다. 예를 들어, 핵산 조성물은 형광단, 예를 들어 Cy3, 플루오레세인 또는 로다민으로 표지될 수 있다. 표지화는 키트, 예를 들어 SILENCER™ siRNA 표지화 키트(Ambion)를 사용하여 수행될 수 있다. 추가로, siRNA는 예를 들어 3H, 32P 또는 다른 적절한 동위원소를 사용하여 방사성표지될 수 있다.
더욱이, RNAi는 적어도 하나의 단일 가닥 RNA 중간체를 통해 진행되는 것으로 믿어지기 때문에, 당업자는 ss-siRNA(예를 들어, ds-siRNA의 안티센스 가닥)가 또한 본원에 기재된 바와 같이 설계되거나(예를 들어, 화학적 합성을 위해) 생성되거나(예를 들어, 효소적으로 생성된) 발현되고(예를 들어, 벡터 또는 플라스미드로부터) 청구되는 방법론에 따라 활용될 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 무척추동물에서, RNAi는 RNAi의 효과기로 작용하는 긴 dsRNA(예를 들어, 약 100~1000개 뉴클레오티드 길이, 예컨대, 약 200~500개, 예를 들어, 약 250, 300, 350, 400 또는 450개 뉴클레오티드 길이의 dsRNA)에 의해 효과적으로 촉발될 수 있다(Brondani et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Dec. 4; 98(25):14428-33. Epub 2001 Nov. 27).
IV. 항-SNCA RNA 침묵화제
특정 실시양태에서, 본 개시는 신규 항-SNCA RNA 침묵화제(예를 들어, siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드), 상기 RNA 침묵화제를 제조하는 방법, 및 SNCA 단백질의 RNA 침묵화를 위해 상기 개선된 RNA 침묵화제(또는 이의 일부)를 사용하는 방법(예를 들어, 연구 및/또는 치료 방법)을 제공한다. RNA 침묵화제는 안티센스 가닥(또는 이의 부분)을 포함하며, 안티센스 가닥은 RNA 매개 침묵화 메커니즘(예를 들어, RNAi)을 매개하는 표적 SNCA mRNA와 충분한 상보성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 하기 특성 중 하나 또는 임의의 조합을 갖는 siRNA 화합물이 제공된다: (1) 완전히 화학적으로 안정화됨(즉, 변형되지 않은 2'-OH 잔기 없음); (2) 비대칭; (3) 11~20개의 염기쌍 이중체; (4) 교대 패턴의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 2'-플루오로 및 2'-메톡시 변형)가 또한 고려되지만, 50% 초과의 2'-메톡시 변형, 예컨대 70%~100%의 2'-메톡시 변형, 및 (5) 단일 가닥, 5-8개 염기의 완전히 포스포로티오에이트화된 꼬리. 특정 실시양태에서, 포스포로티오에이트 변형의 수는 총 4 내지 16개로 다양하다. 특정 실시양태에서, 포스포로티오에이트 변형의 수는 총 8 내지 13개로 다양하다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 siRNA 화합물은 콜레스테롤, 도코사헥사엔산(DHA), 페닐트로판, 코르티솔, 비타민 A, 비타민 D, N-아세틸갈락토사민 (GalNac), 및 갱글리오시드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 표적화제에 접합될 수 있다. 콜레스테롤 변형 버전은 광범위한 세포 유형(예를 들어, HeLa, 뉴런, 간세포, 영양막)에서 이전에 사용된 화학적 안정화 패턴(예를 들어, 피리미딘이 아닌 모든 퓨린이 변형됨)에 비해 시험관내 유효성에서 5~10배 개선을 나타내었다.
상기 및 본원에 기재된 구조적 특성을 갖는 본 개시의 특정 화합물은 "hsiRNA-ASP"(고급 안정화 패턴을 특징으로 하는 소수성으로 변형된 작은 간섭 RNA)로 지칭될 수 있다. 또한, 이 hsiRNA-ASP 패턴은 극적으로 개선된 뇌, 척수를 통한 분포, 간, 태반, 신장, 비장 및 몇몇 다른 조직으로의 전달을 나타내어, 이들을 치료 개입에 접근 가능하게 만들었다.
본 개시의 화합물은 하기 측면 및 실시양태로 기재될 수 있다.
제1 측면에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 본원에 제공되고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며,
(1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
(2) 안티센스 가닥은 교대하는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오티드를 포함하고;
(3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
(4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
(5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
(6) 센스 가닥은 교대하는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오티드를 포함하고;
(7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
제2 측면에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 dsRNA가 본원에 제공되고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며,
(1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
(2) 안티센스 가닥은 적어도 70%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
(4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
(5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
(6) 센스 가닥은 적어도 70%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
제3 측면에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 dsRNA가 본원에 제공되고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고,
(1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
(2) 안티센스 가닥은 적어도 85%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
(4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
(5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
(6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
제4 측면에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 dsRNA가 본원에 제공되고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며,
(1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
(2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 4, 5, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
(4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
(5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
(6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
제5 측면에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 dsRNA가 본원에 제공되고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며,
(1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
(2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 4, 5, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
(4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
(5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
(6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
제6 측면에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 dsRNA가 본원에 제공되고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며,
(1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
(2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
(4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
(5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
(6) 센스 가닥은 적어도 70%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 9, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
(8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
제7 측면에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 dsRNA가 본원에 제공되고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며,
(1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
(2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
(4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
(5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
(6) 센스 가닥은 적어도 80%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
(7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
(8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결된다.
a) 항-SNCA siRNA 분자의 설계
본 출원의 siRNA 분자는 센스 가닥 및 상보적 안티센스 가닥으로 제조되는 이중체이며, 안티센스 가닥은 RNAi를 매개하기 위해 SNCA mRNA와 충분한 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, siRNA 분자는 약 10~50개 이상의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 즉, 각각의 가닥은 10~50개 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함한다. 다른 실시양태에서, siRNA 분자는 각 가닥에 약 15~30개, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 가닥 중 하나는 표적 영역과 충분히 상보적이다. 특정 실시양태에서, 가닥은 가닥이 어닐링될 때 이중체의 한쪽 또는 양쪽 말단에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 잔기의 오버행이 발생하도록, 정렬되지 않는 가닥의 말단에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 염기가 있도록 정렬된다(즉, 반대 가닥에 상보적 염기가 발생하지 않음).
일반적으로, siRNA는 예를 들어 다음 프로토콜을 사용하여 당분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 설계될 수 있다.
1. siRNA는 표적 서열, 예를 들어 실시예에 제시된 표적 서열에 대해 특이적이어야 한다. 제1 가닥은 표적 서열과 상보적이어야 하고, 다른 가닥은 제1 가닥과 실질적으로 상보적이어야 한다(예시적인 센스 및 안티센스 가닥에 대해서는 실시예를 참고한다). 예시적인 표적 서열은 강력한 유전자 침묵화를 야기하는 표적 유전자의 임의의 영역으로부터 선택된다. 표적 유전자의 영역은 표적 유전자의 5' 비번역 영역(5'-UTR), 표적 유전자의 3' 비번역 영역(3'-UTR), 표적 유전자의 엑손 또는 표적 유전자의 인트론을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 부위에서 mRNA의 절단은 상응하는 SNCA 단백질의 번역을 제거할 것이다. SNCA 유전자의 다른 영역으로부터의 표적 서열도 표적화에 적합하다. 센스 가닥은 표적 서열에 기반하여 설계된다.
2. siRNA의 센스 가닥은 선택된 표적 부위의 서열에 기반하여 설계된다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 약 15 내지 25개 뉴클레오티드, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 15개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 18개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 20개 뉴클레오티드 길이이다. 그러나, 당업자는 15개 미만의 뉴클레오티드 또는 25개 초과의 뉴클레오티드 길이를 갖는 siRNA도 RNAi를 매개하는 기능을 할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 이러한 길이의 siRNA는 RNAi를 매개하는 능력을 보유하는 한 본 개시의 범위 내에 또한 속한다. 더 긴 RNA 침묵화제는 바람직하지 않을 수 있는 특정 포유류 세포에서 인터페론 또는 단백질 키나제 R(PKR) 반응을 유도하는 것으로 실증되었다. 특정 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제는 PKR 반응을 유도하지 않는다(즉, 충분히 짧은 길이를 가짐). 그러나 더 긴 RNA 침묵화제는 예를 들어 PKR 반응을 생성할 수 없는 세포 유형이나 PKR 반응이 하향 조절되거나 대안적 수단에 의해 약화되는 상황에서 유용할 수 있다.
본 개시의 siRNA 분자는 siRNA가 RNAi를 매개할 수 있도록 표적 서열과 충분한 상보성을 갖는다. 일반적으로, 표적 유전자의 RISC-매개 절단에 영향을 미치기 위해 표적 유전자의 표적 서열 부분과 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA가 고려된다. 따라서, 특정 실시양태에서, siRNA의 안티센스 가닥은 표적의 일부와 충분히 상보적인 서열을 갖도록 설계된다. 예를 들어, 안티센스 가닥은 표적 부위와 100% 상보성을 가질 수 있다. 그러나 100% 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 안티센스 가닥과 표적 RNA 서열 간 80% 초과 동일성, 예를 들어 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100% 상보성이 고려된다. 본 출원은 RNAi의 효율성 및 특이성을 향상시키기 위해 특정 서열 변이를 관용할 수 있다는 이점을 갖는다. 한 실시양태에서, 안티센스 가닥은 야생형 및 돌연변이체 대립유전자 간 적어도 하나의 염기쌍이 상이한 표적 영역, 예를 들어, 기능 획득 돌연변이를 포함하는 표적 영역과 같은 표적 영역과 4, 3, 2, 1 또는 0개의 미스매치 뉴클레오티드(들)를 갖고, 다른 가닥은 제1 가닥과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 더욱이, 1 또는 2개 뉴클레오티드의 작은 삽입 또는 결실을 갖는 siRNA 서열도 RNAi를 매개하는 데 효과적일 수 있다. 대안적으로, 뉴클레오티드 유사체 치환 또는 삽입을 갖는 siRNA 서열이 억제에 효과적일 수 있다.
서열 동일성은 당분야에 알려진 서열 비교 및 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 2개의 핵산 서열(또는 2개의 아미노산 서열)의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭이 최적 정렬을 위해 제1 서열 또는 제2 서열에 도입될 수 있음). 이어서 상응하는 뉴클레오티드(또는 아미노산) 위치에서의 뉴클레오티드(또는 아미노산 잔기)가 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 잔기에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간 동일성 퍼센트는 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이며(즉, 상동성% = 동일한 위치의 수 / 총 위치의 수 x 100), 선택적으로 도입된 갭의 수 및/또는 도입된 간격의 길이에 패널티 점수를 부과한다.
두 서열 간 서열 비교 및 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 정렬은 동일성 정도가 낮은 부분(즉, 국소 정렬)에 대해서가 아니라 충분한 동일성을 갖는 정렬된 서열의 특정 부분에 걸쳐 생성된다. 서열 비교에 활용되는 국소 정렬 알고리즘의 비제한적인 예는 문헌(Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77에서 변형됨)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)의 BLAST 프로그램(버전 2.0)에 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 정렬은 적절한 갭을 도입함으로써 최적화되고 동일성 퍼센트는 정렬된 서열의 길이에 걸쳐 결정된다(즉, 갭 포함 정렬). 비교 목적을 위한 갭 포함 정렬을 얻기 위해 Gapped BLAST는 문헌(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)에 기재된 바와 같이 활용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 정렬은 적절한 갭을 도입함으로써 최적화되고 동일성 퍼센트는 정렬된 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정된다(즉, 전체 정렬). 서열의 전체 비교에 활용되는 수학적 알고리즘의 비제한적 예는 문헌(Myers and Miller, CABIOS (1989))의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 활용할 때, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다.
3. siRNA의 안티센스 또는 가이드 가닥은 일반적으로 센스 가닥과 길이가 동일하고 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 가이드 및 센스 가닥은 완전히 상보적이며, 즉 가닥은 정렬되거나 어닐링될 때 평활 말단이다. 또 다른 실시양태에서, siRNA의 가닥은 1 내지 7개(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개), 또는 1 내지 4개, 예를 들어, 2, 3 또는 4개 뉴클레오티드의 3' 오버행을 갖도록 하는 방식으로 쌍을 이룰 수 있다. 오버행은 표적 유전자 서열(또는 이의 상보체)에 상응하는 뉴클레오티드를 포함할(또는 이로 구성될) 수 있다. 대안적으로, 오버행은 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 dT, 또는 뉴클레오티드 유사체, 또는 다른 적합한 비-뉴클레오티드 물질을 포함할(또는 이로 구성될) 수 있다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 TT와 같은 2개 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가질 수 있다. 돌출된 뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 상기 주지된 바와 같이, 돌연변이체:야생형 미스매치가 퓨린:퓨린 미스매치인 표적 영역을 선택하는 것이 바람직하다.
4. 당분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 잠재적 표적을 적절한 게놈 데이터베이스(인간, 마우스, 래트 등)와 비교하고 다른 코딩 서열과 상당한 상동성을 갖는 임의의 표적 서열을 고려에서 제거한다. 이러한 서열 상동성 검색을 위한 이러한 방법 중 하나는 BLAST로 알려져 있으며, 이는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트에서 이용 가능하다.
5. 평가 기준을 충족하는 하나 이상의 서열을 선택한다.
siRNA의 설계 및 사용에 대한 추가 일반 정보는 막스 플랑크 생물 물리 화학 연구소(The Max-Plank-Institut fur Biophysikalische Chemie) 웹사이트에서 이용 가능한 "The siRNA User Guide"에서 발견될 수 있다.
대안적으로, siRNA는 표적 서열과 혼성화할 수 있는(예를 들어, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃에서 12~16시간 동안 혼성화; 이어서 세척) 뉴클레오티드 서열(또는 올리고뉴클레오티드 서열)로 기능적으로 정의될 수 있다. 추가 혼성화 조건은 1xSSC에서 70℃ 또는 1xSSC에서 50℃, 50% 포름아미드에서 혼성화 후 70℃에서 0.3xSSC에서 세척 또는 70℃에서 4xSSC 또는 50℃에서 4xSSC, 50% 포름아미드에서 혼성화 후 67℃에서 1xSSC에서 세척을 포함한다. 길이가 50개 염기쌍 미만으로 예상되는 하이브리드에 대한 혼성화 온도는 하이브리드의 용융 온도(Tm) 보다 5~10℃ 낮아야 하며, Tm은 하기 식에 따라 결정된다. 길이가 18개 염기쌍 미만인 하이브리드의 경우, Tm(℃)=2(A+T 염기의 수)+4(G+C 염기의 수). 18~49개 염기쌍 길이의 하이브리드의 경우, Tm(℃) =81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(G+C %)-(600/N)으로, N은 하이브리드에서 염기의 수이고, [Na+]는 혼성화 완충액에서 나트륨 이온의 농도이다(1xSSC=0.165 M에 대해 [Na+]). 폴리뉴클레오티드 혼성화를 위한 엄격성 조건의 추가 예는 문헌(Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11, 및 Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4)에 제공되며, 본원에 참조로 포함된다.
음성 대조군 siRNA는 선택된 siRNA와 동일한 뉴클레오티드 조성을 가져야 하지만 적절한 게놈과 상당한 서열 상보성이 없어야 한다. 이러한 음성 대조군은 선택된 siRNA의 뉴클레오티드 서열을 무작위로 스크램블링함으로써 설계될 수 있다. 음성 대조군이 적절한 게놈에서 임의의 다른 유전자와 상동성이 없음을 확인하기 위해 상동성 검색이 수행될 수 있다. 또한, 하나 이상의 염기 미스매치를 서열에 도입하여 음성 대조군 siRNA가 설계될 수 있다.
6. siRNA가 표적 mRNA(예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 SNCA mRNA)를 파괴하는 효율성을 검증하기 위해, siRNA는 초파리 기반 시험관내 mRNA 발현 시스템에서 표적 cDNA(예를 들어, SNCA cDNA)와 함께 인큐베이션될 수 있다. 32P로 방사성표지된, 새로 합성된 표적 mRNA(예를 들어, SNCA mRNA)는 아가로스 겔에서 자가방사선 사진으로 검출된다. 절단된 표적 mRNA의 존재는 mRNA 뉴클레아제 활성을 시사한다. 적절한 대조군은 siRNA의 생략 및 비표적 cDNA의 사용을 포함한다. 대안적으로, 선택된 siRNA와 동일한 뉴클레오티드 조성을 갖지만 적절한 표적 유전자와 상당한 서열 상보성을 갖지 않는 대조군 siRNA가 선택된다. 이러한 음성 대조군은 선택된 siRNA의 뉴클레오티드 서열을 무작위로 스크램블링하여 설계될 수 있다. 음성 대조군이 적절한 게놈에서 임의의 다른 유전자와 상동성이 없음을 확인하기 위해 상동성 검색이 수행될 수 있다. 또한, 하나 이상의 염기 미스매치를 서열에 도입하여 음성 대조군 siRNA가 설계될 수 있다.
항-SNCA siRNA는 상기 기재된 표적 서열 중 임의의 것을 표적화하도록 설계될 수 있다. 상기 siRNA는 표적 서열의 침묵화를 매개하기 위해 표적 서열과 충분히 상보적인 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 siRNA이다.
특정 실시양태에서, siRNA는 표 7 및 표 8에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 표 7 및 표 8에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
siRNA-mRNA 보완 부위가 선택되어, 최적 mRNA 특이성 및 최대 mRNA 절단을 초래한다.
b) siRNA 유사 분자
본 개시의 siRNA-유사 분자는 RNAi 또는 번역 억제에 의해 유전자 침묵화를 지시하기 위해 SNCA mRNA의 표적 서열과 "충분히 상보적인" 서열을 갖는다(즉, 서열을 갖는 가닥을 가짐). siRNA 유사 분자는 siRNA 분자와 동일한 방식으로 설계되지만 센스 가닥과 표적 RNA 간 서열 동일성 정도는 miRNA와 그 표적 RNA 간에 관찰되는 것과 유사하다. 일반적으로 miRNA 서열과 상응하는 표적 유전자 서열 간 서열 동일성 정도가 감소할수록 RNAi보다는 번역 억제에 의해 전사 후 유전자 침묵화를 매개하는 경향이 증가한다. 따라서, 표적 유전자의 번역 억제에 의한 전사-후 유전자 침묵화가 바람직한 대안적인 실시양태에서, miRNA 서열은 표적 유전자 서열과 부분적 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, miRNA 서열은 표적 mRNA 내에(예를 들어, 표적 mRNA의 3'-UTR 내에) 분산된 하나 이상의 짧은 서열(상보성 부위)과 부분적 상보성을 갖는다(Hutvagner and Zamore, Science, 2002; Zeng et al., Mol. Cell, 2002; Zeng et al., RNA, 2003; Doench et al., Genes & Dev., 2003). 번역 억제의 메커니즘이 협력적이기 때문에, 특정 실시양태에서 다중 상보성 부위(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6개)가 표적화될 수 있다.
RNAi 또는 번역 억제를 매개하는 siRNA-유사 이중체의 능력은 상보성 부위에서 표적 유전자 서열과 침묵화제의 뉴클레오티드 서열 간 동일하지 않은 뉴클레오티드의 분포에 의해 예측될 수 있다. 한 실시양태에서, 번역 억제에 의한 유전자 침묵화가 바람직한 경우, miRNA 가이드 가닥 및 표적 mRNA에 의해 형성되는 이중체가 중심 "팽창부"를 포함하도록 상보성 부위의 중심 부분에 적어도 하나의 동일하지 않은 뉴클레오티드가 존재한다(Doench JG et al., Genes & Dev., 2003). 또 다른 실시양태에서, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 인접하거나 인접하지 않은 동일하지 않은 뉴클레오티드가 도입된다. 동일하지 않은 뉴클레오티드는 워블 염기쌍(예를 들어, G:U) 또는 미스매치된 염기쌍(G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C, U:U)을 형성하도록 선택될 수 있다. 추가 실시양태에서, "팽창부"는 miRNA 분자의 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 위치 12 및 13에 중심을 두고 있다.
c) 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 분자
특정 특징을 가진 실시양태에서, 본 개시는 향상된 선택성으로 SNCA 표적 서열의 RNA 침묵화를 매개할 수 있는 shRNA를 제공한다. siRNA와 달리 shRNA는 마이크로 RNA(miRNA)의 천연 전구체를 모방하고 유전자 침묵화 경로의 맨 위에 들어간다. 이러한 이유로 shRNA는 전체 천연 유전자 침묵화 경로를 통해 공급되어 보다 효율적으로 유전자 침묵화를 매개하는 것으로 여겨진다.
miRNA는 대략 22개 뉴클레오티드의 비코딩 RNA로, 식물 및 동물 발생 동안 전사 후 또는 번역 수준에서 유전자 발현을 조절할 수 있다. miRNA의 공통된 특징 중 하나는 이들이 모두 pre-miRNA로 명명되는 대략 70개 뉴클레오티드 전구체 RNA 줄기 루프로부터, 아마도 다이서, RNase III 유형 효소 또는 이의 상동체에 의해 절단된다는 것이다. 자연 발생 miRNA 전구체(pre-miRNA)는 일반적으로 상보적인 두 부분을 포함하는 이중체 줄기 및 줄기의 두 부분을 연결하는 루프를 형성하는 단일 가닥을 갖는다. 전형적인 pre-miRNA에서, 줄기는 하나 이상의 팽창부, 예를 들어 줄기의 한 부분에서 단일 뉴클레오티드 "루프"를 생성하는 추가 뉴클레오티드, 및/또는 줄기의 두 부분의 서로 연결에 대한 혼성화에서 갭을 생성하는 하나 이상의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드를 포함한다. 본 출원의 짧은 헤어핀 RNA, 또는 조작된 RNA 전구체는 이러한 자연 발생 pre-miRNA에 기반하지만 원하는 RNA 침묵화제(예를 들어, 본 개시의 siRNA)를 전달하도록 조작된 인공 작제물이다. pre-miRNA의 줄기 서열을 표적 mRNA와 상보적인 서열로 치환함으로써 shRNA가 형성된다. shRNA는 세포의 전체 유전자 침묵화 경로에 의해 가공되어 RNAi를 효율적으로 매개한다.
shRNA 분자의 필수 요소는 이중체 또는 이중 가닥 줄기 부분을 형성하기 위해 어닐링 또는 혼성화하기 충분한 상보성을 갖는 제1 부분 및 제2 부분을 포함한다. 두 부분이 완전히 또는 완벽하게 상보적일 필요는 없다. 제1 및 제2 "줄기" 부분은 shRNA의 다른 부분에 어닐링 또는 혼성화하기에 불충분한 서열 상보성을 갖는 서열을 갖는 부분에 의해 연결된다. 이 후자의 부분이 shRNA 분자에서 "루프" 부분으로 지칭된다. shRNA 분자는 가공되어 siRNA를 생성한다. shRNA는 또한 하나 이상의 팽창부, 즉 줄기 부분에 작은 뉴클레오티드 "루프", 예를 들어 1개, 2개 또는 3개 뉴클레오티드 루프를 생성하는 추가 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 줄기 부분은 동일한 길이일 수 있거나, 한 부분이 예를 들어 1~5개 뉴클레오티드의 오버행을 포함할 수 있다. 돌출된 뉴클레오티드는 예를 들어 우라실(U), 예를 들어 모두 U를 포함할 수 있다. 이러한 U는 특히 전사의 종결을 신호하는 shRNA-암호화 DNA에서 티미딘(T)에 의해 암호화된다.
본 개시의 shRNA(또는 조작된 전구체 RNA)에서, 이중체 줄기의 한 부분은 SNCA 표적 서열과 상보적인(또는 안티센스) 핵산 서열이다. 특정 실시양태에서, shRNA의 줄기 부분의 한 가닥은 RNA 간섭(RNAi)을 통한 상기 표적 RNA의 분해 또는 절단을 매개하기 위해 표적 RNA(예를 들어, mRNA) 서열과 충분히 상보적(예를 들어, 안티센스)이다. 따라서, 조작된 RNA 전구체는 2개의 부분을 갖는 이중체 줄기 및 2개의 줄기 부분을 연결하는 루프를 포함한다. 안티센스 부분은 줄기의 5' 또는 3' 말단에 있을 수 있다. shRNA의 줄기 부분은 약 15개 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 2개의 줄기 부분은 약 18 또는 19 내지 약 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 37, 38, 39, 또는 40개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 줄기 부분의 길이는 21개 뉴클레오티드 이상이어야 한다. 포유류 세포에서 사용될 때, 줄기 부분의 길이는 인터페론 경로와 같은 비특이적 반응을 유발하는 것을 피하기 위해 약 30개 뉴클레오티드 미만이어야 한다. 비포유류 세포에서 줄기는 30개 뉴클레오티드보다 길 수 있다. 사실, 줄기는 표적 mRNA(전체 mRNA까지 포함)와 상보적인 훨씬 더 큰 섹션을 포함할 수 있다. 사실, 줄기 부분은 표적 mRNA(전체 mRNA까지 포함)와 상보적인 훨씬 더 큰 섹션을 포함할 수 있다.
이중체 줄기의 두 부분은 이중체 줄기를 형성하기 위해 혼성화하기 충분히 상보적이어야 한다. 따라서, 두 부분은 완전하거나 완벽하게 상보적일 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 또한, 2개의 줄기 부분은 동일한 길이일 수 있거나, 한 부분이 1, 2, 3 또는 4개 뉴클레오티드의 오버행을 포함할 수 있다. 돌출된 뉴클레오티드는 예를 들어 우라실(U), 예를 들어 모든 U를 포함할 수 있다. shRNA 또는 조작된 RNA 전구체에서 루프는 루프 서열을 변형하여 쌍을 이루는 뉴클레오티드의 수를 증가 또는 감소시키거나 루프 서열의 전체 또는 일부를 테트라루프 또는 기타 루프 서열로 대체함으로써 천연 pre-miRNA 서열과 상이할 수 있다. 따라서, shRNA 또는 조작된 RNA 전구체에서 루프는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상, 예를 들어, 15 또는 20개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
shRNA 또는 조작된 RNA 전구체에서 루프는 루프 서열을 변형하여 쌍을 이루는 뉴클레오티드의 수를 증가 또는 감소시키거나 루프 서열의 전체 또는 일부를 테트라루프 또는 기타 루프 서열로 대체함으로써 천연 pre-miRNA 서열과 상이할 수 있다. 따라서, shRNA에서 루프 부분은 약 2 내지 약 20개 뉴클레오티드 길이, 즉 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상, 예를 들어 15 또는 20개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 루프는 "테트라루프" 서열로 구성되거나 이를 포함한다. 예시적인 테트라루프 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드이고 R이 퓨린 뉴클레오티드인 서열 GNRA, GGGG, 및 UUUU를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 출원의 shRNA는 상기 기재된 원하는 siRNA 분자의 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, shRNA의 안티센스 부분의 서열은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 또는 일반적으로 표적 RNA(예를 들어, SNCA mRNA)로부터, 예를 들어, 번역 시작의 상류 또는 하류 100개 내지 200개 또는 300개 뉴클레오티드 영역으로부터 18, 19, 20, 21개 뉴클레오티드, 또는 그 이상의 서열을 선택함으로써 설계될 수 있다. 일반적으로, 서열은 5' UTR(비번역 영역), 코딩 서열, 또는 3' UTR을 포함하는 표적 RNA(예를 들어, mRNA)의 임의의 부분으로부터 선택될 수 있다. 이 서열은 선택적으로 두 개의 인접한 AA 뉴클레오티드를 포함하는 표적 유전자 영역의 바로 뒤에 올 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 마지막 두 뉴클레오티드는 UU가 되도록 선택될 수 있다. 이 21개 정도의 뉴클레오티드 서열은 shRNA에서 이중체 줄기의 한 부분을 생성하는 데 사용된다. 이 서열은 예를 들어, 효소적으로 야생형 pre-miRNA 서열의 줄기 부분을 대체할 수 있거나 합성되는 전체 서열에 포함된다. 예를 들어, 전체 줄기-루프 조작된 RNA 전구체를 암호화하거나 전구체의 이중체 줄기에 삽입될 부분만을 암호화하는 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성하고 제한효소를 사용하여, 예를 들어, 야생형 pre-miRNA로부터 조작된 RNA 전구체 작제물을 구축할 수 있다.
조작된 RNA 전구체는 이중체 줄기에 생체내 생산되기 원하는 siRNA 또는 siRNA 유사 이중체의 21~22개 정도의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 조작된 RNA 전구체의 줄기 부분은 발현이 감소되거나 억제되어야 하는 유전자의 엑손 부분의 서열에 상응하는 적어도 18 또는 19개 뉴클레오티드 쌍을 포함한다. 줄기의 이 영역의 측면에 있는 2개의 3' 뉴클레오티드는 조작된 RNA 전구체로부터 siRNA의 생산을 최대화하고 생체내 및 시험관내 RNAi에 의한 번역 억제 또는 파괴를 위해 상응하는 mRNA의 표적화에서 생성된 siRNA의 유효성을 최대화하도록 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 개시의 shRNA는 RISC로의 진입을 향상시키기 위해 miRNA 서열, 선택적으로 말단-변형 miRNA 서열을 포함한다. miRNA 서열은 임의의 자연 발생 miRNA의 서열과 유사하거나 동일할 수 있다(예를 들어, miRNA Registry; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004 참고). 현재까지 1,000개 초과의 천연 miRNA가 확인되었으며 함께 게놈에서 예측되는 모든 유전자의 약 1%를 구성하는 것으로 생각된다. 많은 천연 miRNA가 pre-mRNA의 인트론에 함께 클러스터링되어 있으며 상동성 기반 검색(Pasquinelli et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001) 또는 pri-mRNA의 줄기 루프 구조를 형성하는 후보 miRNA 유전자의 능력을 예측하는 컴퓨터 알고리즘(예를 들어, MiRScan, MiRSeeker)(Grad et al., Mol. Cell., 2003; Lim et al., Genes Dev., 2003; Lim et al., Science, 2003; Lai E C et al., Genome Bio., 2003)을 사용하여 컴퓨터내 확인될 수 있다. 온라인 레지스트리가 공개된 모든 miRNA 서열의 검색 가능한 데이터베이스를 제공한다(Sanger Institute 웹사이트의 miRNA 레지스트리; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004). 예시적인 천연 miRNA는 lin-4, let-7, miR-10, mirR-15, miR-16, miR-168, miR-175, miR-196 및 이의 상동체뿐만 아니라 국제 PCT 공개 제WO 03/029459호에 기재된 바와 같이 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 캐노랍디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans), 제브라피쉬, 아라비답시스 탈라니아(Arabidopsis thalania), 무스 무스쿨러스(Mus musculus) 및 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)를 포함하는 인간 및 특정 모델 유기체로부터의 다른 천연 miRNA를 포함한다.
자연 발생 miRNA는 생체내 내인성 유전자에 의해 발현되고 다이서 또는 다른 RNAse에 의해 헤어핀 또는 줄기 루프 전구체(pre-miRNA 또는 pri-miRNA)로부터 가공된다(Lagos-Quintana et al., Science, 2001; Lau et al., Science, 2001; Lee and Ambros, Science, 2001; Lagos-Quintana et al., Curr. Biol., 2002; Mourelatos et al., Genes Dev., 2002; Reinhart et al., Science, 2002; Ambros et al., Curr. Biol., 2003; Brennecke et al., 2003; Lagos-Quintana et al., RNA, 2003; Lim et al., Genes Dev., 2003; Lim et al., Science, 2003). miRNA는 이중 가닥 이중체로 생체내 일시적으로 존재할 수 있지만 유전자 침묵화를 지시하기 위해 RISC 복합체가 한 가닥만 차지한다. 특정 miRNA, 예를 들어, 식물 miRNA는 이의 표적 mRNA와 완벽하거나 거의 완벽한 상보성을 갖고, 따라서 표적 mRNA가 절단을 지시한다. 다른 miRNA는 이의 표적 mRNA와 완벽하지 않은 상보성을 갖고, 따라서 표적 mRNA의 번역 억제를 지시한다. miRNA와 그 표적 mRNA 간 상보성 정도가 그 작용 메커니즘을 결정하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, miRNA와 그 표적 mRNA 간 완벽하거나 거의 완벽한 상보성은 절단 메커니즘을 예측하는 반면(Yekta et al., Science, 2004), 완벽하지 않은 상보성은 번역 억제 메커니즘을 예측한다. 특정 실시양태에서, miRNA 서열은 자연 발생 miRNA 서열의 것이고, 이의 비정상적인 발현 또는 활성은 miRNA 장애와 상관된다.
d) 이중 기능성 올리고뉴클레오티드 테더
다른 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제는 miRNA의 세포간 동원에 유용한 이중 기능성 올리고뉴클레오티드 테더를 포함한다. 동물 세포는 전사 후 또는 번역 수준에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 대략 22개 뉴클레오티드의 비코딩 RNA인 다양한 miRNA를 발현한다. RISC에 결합된 miRNA에 결합하고 이를 표적 mRNA로 동원함으로써, 이중 기능성 올리고뉴클레오티드 테더는 예를 들어 동맥경화 과정에 관련된 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 테더의 사용은 특정 유전자의 발현을 억제하는 기존 기술에 비해 몇 가지 이점을 제공한다. 첫째, 본원에 기재된 방법은 miRNA인 내인성 분자(종종 풍부하게 존재함)가 RNA 침묵화를 매개할 수 있도록 한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 RNA 침묵화를 매개하기 위해 외래 분자(예를 들어, siRNA)를 도입할 필요성을 제거한다. 둘째, RNA-침묵화제 및 연결 모이어티(예를 들어, 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고뉴클레오티드)는 안정하고 뉴클레아제 활성에 대해 저항성을 갖도록 제조될 수 있다. 결과적으로, 본 개시의 테더는 직접 전달을 위해 설계되어, 세포에서 원하는 제제를 제조하도록 설계된 전구체 분자 또는 플라스미드의 간접 전달(예를 들어, 바이러스)에 대한 필요성을 제거할 수 있다. 셋째, 테더 및 이의 각각의 모이어티는 특정 mRNA 부위 및 특정 miRNA에 적응하도록 설계될 수 있다. 설계는 세포 및 유전자 산물에 특이적일 수 있다. 넷째, 본원에 개시된 방법은 mRNA를 온전한 상태로 두어, 당업자가 세포 자신의 기구를 사용하여 짧은 펄스로 단백질 합성을 차단할 수 있도록 한다. 결과적으로 이러한 RNA 침묵화 방법은 고도로 조절 가능하다.
본 개시의 이중 기능성 올리고뉴클레오티드 테더("테더")는 관심 유전자의 조절을 유도하기 위해 표적 mRNA로 miRNA(예를 들어, 내인성 세포 miRNA)를 동원하도록 설계된다. 특정 실시양태에서, 테더는 화학식 T-L-μ를 가지며, T는 mRNA 표적화 모이어티이고, L은 연결 모이어티이고, μ는 miRNA 동원 모이어티이다. 임의의 하나 이상의 모이어티는 이중 가닥일 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 모이어티는 단일 가닥이다.
테더 내의 모이어티는 화학식 T-L-μ(즉, 연결 모이어티의 5' 말단에 연결된 표적화 모이어티의 3' 말단 및 miRNA 동원 부분의 5' 말단에 연결된 연결 모이어티의 3' 말단)로 도시된 바와 같이 배열되거나 연결될 수 있다(5'에서 3' 방향으로). 대안적으로, 모이어티는 하기: μ-T-L(즉, 연결 모이어티의 5' 말단에 연결된 miRNA 동원 모이어티의 3' 말단 및 표적화 모이어티의 5' 말단에 연결된 연결 모집 모이어티의 3' 말단)과 같이 테더에서 배열되거나 연결될 수 있다.
전술된 바와 같이 mRNA 표적화 모이어티는 특정 표적 mRNA를 포획할 수 있다. 본 개시에 따르면, 표적 mRNA의 발현은 바람직하지 않으며, 따라서 mRNA의 번역 억제가 바람직하다. mRNA 표적화 모이어티는 표적 mRNA에 효과적으로 결합하기 충분한 크기여야 한다. 표적화 모이어티의 길이는 부분적으로 표적 mRNA의 길이 및 표적 mRNA와 표적화 모이어티 간 상보성 정도에 따라 크게 달라질 것이다. 다양한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 약 200, 100, 50, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5개 뉴클레오티드 길이 미만이다. 특정 실시양태에서, 표적화 모이어티는 약 15개 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이이다.
위에서 기재된 바와 같이 miRNA 동원 모이어티는 miRNA와 연합할 수 있다. 본 출원에 따르면, miRNA는 표적 mRNA를 억제할 수 있는 임의의 miRNA일 수 있다. 포유류는 250개 초과의 내인성 miRNA를 갖는 것으로 보고되어 있다(Lagos-Quintana et al. (2002) Current Biol. 12:735-739; Lagos-Quintana et al. (2001) Science 294:858-862; 및 Lim et al. (2003) Science 299:1540). 다양한 실시양태에서, miRNA는 당분야에 인정된 임의의 miRNA일 수 있다.
연결 모이어티는 표적화 모이어티의 활성이 유지되도록 표적화 모이어티를 연결할 수 있는 임의의 제제이다. 연결 모이어티는 표적화제가 이의 각각의 표적과 충분히 상호작용할 수 있도록 충분한 수의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 모이어티일 수 있다. 연결 모이어티는 세포 mRNA 또는 miRNA 서열과 서열 상동성이 거의 없거나 전혀 없다. 예시적인 연결 모이어티는 하나 이상의 2'-O-메틸뉴클레오티드, 예를 들어 2'-β-메틸아데노신, 2'-O-메틸티미딘, 2'-O-메틸구아노신 또는 2'-O-메틸우리딘을 포함한다.
e) 유전자 침묵화 올리고뉴클레오티드
특정한 예시적 실시양태에서, 유전자 발현(즉, SNCA 유전자 발현)은 SNCA 유전자 발현을 효과적으로 억제하거나 감소시키기 위해 2개 이상의 접근 가능한 3'-말단의 존재를 허용하는 5'-말단을 통해 연결된 2개 이상의 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 사용하여 조절될 수 있다. 이러한 연결된 올리고뉴클레오티드는 유전자 침묵화 올리고뉴클레오티드(GSO)로도 알려져 있다(예를 들어, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는, Idera Pharmaceuticals, Inc.에 양도된 미국 8,431,544 참고).
GSO의 5' 말단에서의 연결은 다른 올리고뉴클레오티드 연결과 독립적이며 5', 3' 또는 2' 하이드록실기를 통해 직접적으로 또는 뉴클레오시드의 2' 또는 3' 하이드록실 위치를 활용하여 비-뉴클레오티드 링커 또는 뉴클레오시드를 통해 간접적으로 이루어질 수 있다. 연결은 또한 5' 말단 뉴클레오티드의 기능화된 당 또는 핵염기를 활용할 수 있다.
GSO는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 비-뉴클레오시드 링커를 통해 이의 5'-5' 말단에서 접합된 2개의 동일하거나 상이한 서열을 포함할 수 있다. 이러한 화합물은 유전자 산물의 안티센스 하향 조절을 위한 관심 mRNA 표적의 특정 부분과 상보적인 15 내지 27개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 동일한 서열을 포함하는 GSO는 왓슨-크릭 수소 결합 상호작용을 통해 특정 mRNA에 결합하고 단백질 발현을 억제할 수 있다. 상이한 서열을 포함하는 GSO는 하나 이상의 mRNA 표적의 2개 이상의 상이한 영역에 결합하고 단백질 발현을 억제할 수 있다. 이러한 화합물은 표적 mRNA와 상보적인 헤테로뉴클레오티드 서열로 이루어지며 왓슨-크릭 수소 결합을 통해 안정한 이중체 구조를 형성한다. 특정 조건에서 2개의 자유 3'-말단(5'-5'-부착 안티센스)을 포함하는 GSO는 단일 자유 3'-말단을 포함하거나 자유 3'-말단이 없는 GSO보다 유전자 발현의 더 강력한 억제제일 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 링커는 화학식 HO--(CH2)o--CH(OH)--(CH2)p--OH의 글리세롤 또는 글리세롤 상동체이고, o 및 p는 독립적으로 1 내지 약 6, 1 내지 약 4 또는 1 내지 약 3의 정수이다. 일부 다른 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 링커는 1,3-디아미노-2-하이드록시프로판의 유도체이다. 일부 이러한 유도체는 화학식 HO--(CH2)m--C(O)NH--CH2--CH(OH)--CH2--NHC(O)--(CH2)m--OH를 가지며, m은 0 내지 약 10, 0 내지 약 6, 2 내지 약 6 또는 2 내지 약 4의 정수이다.
일부 비-뉴클레오티드 링커는 2개 초과의 GSO 성분의 부착을 허용한다. 예를 들어, 비-뉴클레오티드 링커 글리세롤은 GSO 성분이 공유 부착될 수 있는 3개의 하이드록실기를 갖는다. 따라서, 본 개시의 일부 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 개시에 따른 이러한 올리고뉴클레오티드는 "분지형"으로 지칭된다.
특정 실시양태에서, GSO는 적어도 14개 뉴클레오티드 길이이다. 특정한 예시적 실시양태에서, GSO는 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이 또는 20 내지 30개 뉴클레오티드 길이이다. 따라서, GSO의 성분 올리고뉴클레오티드는 독립적으로 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
이들 올리고뉴클레오티드는 포스포라미데이트 또는 H-포스포네이트 화학과 같은 당분야에 인정된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이는 수동으로 또는 자동화 합성장치에 의해 수행될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 또한 mRNA에 혼성화하는 능력을 손상시키지 않으면서 여러 방식으로 변형될 수 있다. 이러한 변형은 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스페이트 에스테르, 알킬포스포노티오에이트, 포스포라미데이트, 카바메이트, 카보네이트, 포스페이트 하이드록실, 아세트아미데이트, 카복시메틸 에스테르, 또는 한 뉴클레오티드의 5' 말단과 또 다른 뉴클레오티드의 3' 말단 간 이들 및 다른 뉴클레오티드간 연결의 조합인 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함할 수 있고, 5' 뉴클레오티드 포스포디에스테르 연결은 임의의 수의 화학기로 대체되었다.
V. 변형된 항-SNCA RNA 침묵화제
본 개시의 특정 측면에서, 상기 기재된 바와 같이 본 출원의 RNA 침묵화제(또는 이의 임의의 부분)는 제제의 활성이 추가로 개선되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 섹션 II에 기재된 RNA 침묵화제는 하기에 기재된 임의의 변형으로 변형될 수 있다. 변형은 부분적으로 표적 구별을 추가로 향상시키고, 제제의 안정성을 향상시키고(예를 들어, 분해를 방지하고), 세포 흡수를 촉진하고, 표적 효율을 향상시키고, 결합에서(예를 들어, 표적에 대한) 유효성을 개선하고, 제제에 대한 환자 관용성을 개선하고/하거나 독성을 감소시키는 작용을 할 수 있다.
1) 표적 구별을 향상시키는 변형
특정 실시양태에서, 본 출원의 RNA 침묵화제는 단일 뉴클레오티드 표적 구별을 향상시키기 위해 탈안정화 뉴클레오티드로 치환될 수 있다(둘 다 본원에 참고로 포함되는, 2007년 1월 25일자로 출원된 미국 출원 제11/698,689호 및 2006년 1월 25일에 출원된 미국 가출원 제60/762,225호 참고). 이러한 변형은 표적 mRNA(예를 들어, 기능-획득 돌연변이체 mRNA)에 대한 RNA 침묵화제의 특이성에 눈에 띄게 영향을 미치지 않으면서 비표적 mRNA(예를 들어, 야생형 mRNA)에 대한 RNA 침묵화제의 특이성을 제거하기 충분할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 출원의 RNA 침묵화제는 이의 안티센스 가닥에 적어도 하나의 보편적 뉴클레오티드의 도입에 의해 변형된다. 보편적 뉴클레오티드는 4개의 통상적인 뉴클레오티드 염기(예를 들어, A, G, C, U) 중 임의의 것과 비차별적으로 염기쌍을 형성할 수 있는 염기 부분을 포함한다. 보편적 뉴클레오티드는 RNA 이중체 또는 RNA 침묵화제의 가이드 가닥 및 표적 mRNA에 의해 형성되는 이중체의 안정성에 상대적으로 미미한 영향을 미치기 때문에 고려된다. 예시적인 보편적 뉴클레오티드는 데옥시이노신(예를 들어, 2'-데옥시이노신), 7-데아자-2'-데옥시이노신, 2'-아자-2'-데옥시이노신, PNA-이노신, 모르폴리노-이노신, LNA-이노신, 포스포라미데이트-이노신, 2'-O-메톡시에틸-이노신 및 2'-OMe-이노신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 이노신 염기 부분 또는 이노신 유사체 염기 부분을 갖는 것들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보편적 뉴클레오티드는 이노신 잔기 또는 이의 자연 발생 유사체이다.
특정 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제는 특이성-결정 뉴클레오티드(즉, 질병-관련 다형성을 인식하는 뉴클레오티드)로부터의 5개 뉴클레오티드에서 적어도 하나의 탈안정화 뉴클레오티드의 도입에 의해 변형된다. 예를 들어, 탈안정화 뉴클레오티드는 특이성 결정 뉴클레오티드로부터 5, 4, 3, 2 또는 1개 뉴클레오티드(들)에 있는 위치에 도입될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 탈안정화 뉴클레오티드는 특이성 결정 뉴클레오티드로부터 3개 뉴클레오티드인 위치에(즉, 탈안정화 뉴클레오티드와 특이성 결정 뉴클레오티드 간 2개의 안정화 뉴클레오티드가 있도록) 도입된다. 2개의 가닥 또는 가닥 부분을 갖는 RNA 침묵화제(예를 들어, siRNA 및 shRNA)에서, 탈안정화 뉴클레오티드는 특이성 결정 뉴클레오티드를 포함하지 않는 가닥 또는 가닥 부분에 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 탈안정화 뉴클레오티드는 특이성 결정 뉴클레오티드를 포함하는 동일한 가닥 또는 가닥 부분에 도입된다.
2) 유효성 및 특이성을 향상시키는 변형
특정 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제는 비대칭 설계 규칙에 따라 RNAi 매개에서 향상된 유효성 및 특이성을 촉진하도록 변경될 수 있다(미국 특허 제8,309,704호, 제7,750,144호, 제8,304,530호, 제8,329,892호 및 제8,309,705호 참고). 이러한 변경은 안티센스 가닥이 우선적으로 표적 mRNA의 절단 또는 번역 억제를 매개하고, 따라서 표적 절단 및 침묵화 효율을 증가시키거나 개선하도록, siRNA(예를 들어, 본 출원의 방법을 사용하여 설계된 siRNA 또는 shRNA로부터 생성된 siRNA)의 센스 가닥에 유리하게 안티센스 가닥의 RISC로의 진입을 촉진한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제의 비대칭은 RNA 침묵화제의 안티센스 가닥 3' 말단(AS 3')과 센스 가닥 5' 말단(S'5) 간 결합 강도 또는 염기쌍 강도에 비해 상기 RNA 침묵화제의 안티센스 가닥 5' 말단(AS 5')과 센스 가닥 3' 말단(S 3') 간 염기쌍 강도를 경감시킴으로써 향상된다.
한 실시양태에서, 본 출원의 RNA 침묵화제의 비대칭은 제1 또는 안티센스 가닥의 3' 말단과 센스 가닥 부분의 5' 말단 간에서보다 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 말단과 센스 가닥 부분의 3' 말단 간 더 적은 G:C 염기쌍이 있도록 향상될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제의 비대칭은 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 말단과 센스 가닥 부분의 3' 말단 간 적어도 하나의 미스매치된 염기쌍이 있도록 향상될 수 있다. 특정 실시양태에서, 미스매치된 염기쌍은 G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C 및 U:U로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제의 비대칭은 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 말단과 센스 가닥 부분의 3' 말단 간에 적어도 하나의 워블 염기쌍, 예를 들어, G:U가 있도록 향상될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제의 비대칭은 희귀 뉴클레오티드, 예를 들어, 이노신(I)을 포함하는 적어도 하나의 염기쌍이 있도록 향상될 수 있다. 특정 실시양태에서, 염기쌍은 I:A, I:U 및 I:C로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제의 비대칭은 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 염기쌍이 있도록 향상될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2-아미노-G, 2-아미노-A, 2,6-디아미노-G, 및 2,6-디아미노-A로 구성되는 군으로부터 선택된다.
3) 안정성이 향상된 RNA 침묵화제
본 출원의 RNA 침묵화제는 세포 배양을 위한 혈청 또는 성장 배지에서 안정성을 개선하도록 변형될 수 있다. 안정성을 향상시키기 위해, 3'-잔기는 분해에 대해 안정화될 수 있으며, 예를 들어 이들은 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드와 같은 퓨린 뉴클레오티드로 구성되도록 선택될 수 있다. 대안적으로, 변형된 유사체에 의한 피리미딘 뉴클레오티드의 치환, 예를 들어 2'-데옥시티미딘에 의한 우리딘의 치환은 관용되며 RNA 간섭의 효율에 영향을 미치지 않는다.
한 측면에서, 본 출원은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNA 침묵화제를 특징으로 하며, 제2 가닥 및/또는 제1 가닥은 생체내 안정성이 상응하는 비변형 RNA 침묵화제와 비교하여 향상되도록 내부 뉴클레오티드를 변형된 뉴클레오티드로 치환함으로써 변형된다. 본원에 정의된 바와 같이, "내부" 뉴클레오티드는 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 이외의 임의의 위치에서 발생하는 것이다. 내부 뉴클레오티드는 단일 가닥 분자 내에 또는 이중체 가닥 또는 이중 가닥 분자 내에 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 적어도 하나의 내부 뉴클레오티드의 치환에 의해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 내부 뉴클레오티드의 치환에 의해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 내부 뉴클레오티드의 치환에 의해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 모든 내부 뉴클레오티드의 치환에 의해 변형된다.
한 측면에서, 본 출원은 적어도 80% 화학적으로 변형된 RNA 침묵화제를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 완전히 화학적으로 변형될 수 있으며, 즉 100%의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 또 다른 측면에서, 본 출원은 적어도 80%의 화학적으로 변형된 2'-OH 리보스기를 포함하는 RNA 침묵화제를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 화학적으로 변형된 2'-OH 리보스기를 포함한다.
특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 표적-특이적 침묵화 활성, 예를 들어, RNAi 매개 활성 또는 번역 억제 활성이 실질적으로 영향을 받지 않는 위치, 예를 들어, siRNA 분자의 5'-말단 및/또는 3'-말단의 영역에 위치할 수 있다. 더욱이, 말단은 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함시킴으로써 안정화될 수 있다.
예시적인 뉴클레오티드 유사체는 당- 및/또는 골격-변형 리보뉴클레오티드를 포함한다(즉, 포스페이트-당 골격에 대한 변형을 포함함). 예를 들어, 천연 RNA의 포스포디에스테르 연결은 질소 또는 황 헤테로원자 중 적어도 하나를 포함하도록 변형될 수 있다. 예시적인 골격-변형 리보뉴클레오티드에서, 인접한 리보뉴클레오티드에 연결되는 포스포에스테르기는 변형된 기, 예를 들어 포스포티오에이트기로 대체된다. 예시적인 당-변형 리보뉴클레오티드에서, 2' OH-기는 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 ON으로부터 선택된 기로 대체되고, R은 C1 -C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다.
특정 실시양태에서, 변형은 2'-플루오로, 2'-아미노 및/또는 2'-티오 변형이다. 변형은 2'-플루오로-시티딘, 2'-플루오로-우리딘, 2'-플루오로-아데노신, 2'-플루오로-구아노신, 2'-아미노-시티딘, 2'-아미노-우리딘, 2'-아미노-아데노신, 2'-아미노-구아노신, 2,6-디아미노퓨린, 4-티오-우리딘, 및/또는 5-아미노-알릴-우리딘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2'-플루오로 리보뉴클레오티드는 모든 우리딘 및 시티딘이다. 추가의 예시적인 변형은 5-브로모-우리딘, 5-요오도-우리딘, 5-메틸-시티딘, 리보-티미딘, 2-아미노퓨린, 2'-아미노-부티릴-피렌-우리딘, 5-플루오로-시티딘, 및 5-플루오로-우리딘을 포함한다. 2'-데옥시-뉴클레오티드 및 2'-Ome 뉴클레오티드가 또한 본 개시의 변형된 RNA-침묵화제 모이어티에서 사용될 수 있다. 추가 변형된 잔기는 데옥시-무염기성, 이노신, N3-메틸-우리딘, N6,N6-디메틸-아데노신, 슈도우리딘, 퓨린 리보뉴클레오시드 및 리바비린을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2' 모이어티는 연결 모이어티가 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드이도록 하는 메틸기이다.
특정 실시양태에서, 본 출원의 RNA 침묵화제는 잠긴 핵산(LNA)을 포함한다. LNA는 뉴클레아제 활성에 저항성이고(매우 안정적임) mRNA에 대해 단일 뉴클레오티드 구별을 갖는 당-변형 뉴클레오티드를 포함한다(Elmen et al., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447; Braasch et al. (2003) Biochemistry 42:7967-7975, Petersen et al. (2003) Trends Biotechnol 21:74-81). 이들 분자는 2'-데옥시-2"-플루오로우리딘과 같은 변형이 가능한, 2'-O,4'-C-에틸렌-가교 핵산을 갖는다. 더욱이, LNA는 당 모이어티를 3'-엔도 입체형태로 제한함으로써 올리고뉴클레오티드의 특이성을 증가시켜 염기쌍 형성을 위한 뉴클레오티드를 미리 구성하고 올리고뉴클레오티드의 용융 온도를 염기당 10℃만큼 증가시킨다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, 본 출원의 RNA 침묵화제는 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다. PNA는 뉴클레오티드의 당-포스페이트 부분이 폴리아미드 골격을 형성할 수 있는 중성 2-아미노 에틸글리신 잔기로 대체되는 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, 이는 뉴클레아제 소화에 대해 큰 저항성을 갖고 분자에 향상된 결합 특이성을 부여한다(Nielsen, et al., Science, (2001), 254: 1497-1500).
핵염기-변형 리보뉴클레오티드, 즉 자연 발생 핵염기 대신에 적어도 하나의 비-자연 핵염기를 포함하는 리보뉴클레오티드가 또한 고려된다. 염기는 아데노신 데아미나제의 활성을 차단하도록 변형될 수 있다. 예시적인 변형된 핵염기는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 5-위치에서 변형된 우리딘 및/또는 시티딘, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘; 8 위치에서 변형된 아데노신 및/또는 구아노신, 예를 들어 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오티드, 예를 들어 7-데아자-아데노신; O- 및 N-알킬화 뉴클레오티드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신이 적합하다. 상기 변형이 조합될 수 있음이 주지되어야 한다.
다른 실시양태에서, 가교는 예를 들어 체내 반감기를 증가시키기 위해, RNA 침묵화제의 약동학을 변경하는 데 이용될 수 있다. 따라서, 본 출원은 2개의 상보적인 핵산 가닥을 갖는 RNA 침묵화제를 포함하고, 2개의 가닥은 가교된다. 본 출원은 또한 또 다른 모이어티(예를 들어, 펩티드와 같은 비핵산 모이어티), 유기 화합물(예를 들어, 염료) 등)에 접합되거나 접합되지 않는(그 3' 말단에서) RNA 침묵화제를 포함한다. 이러한 방식으로 siRNA 유도체를 변형하면 상응하는 siRNA와 비교하여 생성된 siRNA 유도체의 세포 흡수를 개선하거나 세포 표적화 활성을 향상시킬 수 있거나, 세포에서 siRNA 유도체를 추적하는 데 유용하거나, 상응하는 siRNA 유도체와 비교하여 siRNA 유도체의 안정성을 개선할 수 있다.
다른 예시적인 변형은 다음을 포함한다: (a) 2' 변형, 예를 들어, 센스 또는 안티센스 가닥, 특히 센스 가닥에서 U 상의 2' OMe 모이어티의 제공, 또는 3' 오버행, 예를 들어 3' 말단에서(3' 말단은 분자의 3' 원자 또는 최대 3' 부분, 예를 들어 문맥에 의해 표시된 바와 같은 최대 3' P 또는 2' 위치를 의미함) 2' OMe 모이어티의 제공; (b) 골격의 변형, 예를 들어 포스페이트 골격에서 0의 S로의 대체, 예를 들어 U 또는 A 또는 둘 다에서, 특히 안티센스 가닥에서 포스포로티오에이트 변형의 제공; 예를 들어, O의 S로의 대체; (c) U의 C5 아미노 링커로의 대체; (d) A의 G로의 대체(서열 변화는 특정 실시양태에서 안티센스 가닥이 아닌 센스 가닥에 위치할 수 있음); 및 (d) 2', 6', 7' 또는 8' 위치에서의 변형. 예시적인 실시양태는 이들 변형 중 하나 이상이 센스 상에 존재하지만 안티센스 가닥에는 존재하지 않는 실시양태, 또는 안티센스 가닥이 이러한 변형을 더 적게 갖는 실시양태이다. 또 다른 예시적인 변형은 3' 오버행, 예를 들어 3' 말단에서 메틸화된 P의 사용; 2' 변형의 조합, 예를 들어 2' O Me 모이어티의 제공 및 골격의 변형, 예를 들어 O의 S로의 대체, 예를 들어 포스포로티오에이트 변형의 제공, 또는 3' 오버행, 예를 들어 3' 말단에서 메틸화된 P; 3' 알킬로의 변형; 3' 오버행, 예를 들어 3' 말단에서 무염기성 피롤리돈으로의 변형; 3' 말단에서 분해를 억제하는 나프록센, 이부프로펜 또는 다른 모이어티로의 변형을 포함한다.
크게 변형된 RNA 침묵화제
특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 적어도 80%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 완전히 화학적으로 변형되며, 즉 100%의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다.
특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 2'-O-메틸이 풍부하며, 즉, 50% 초과의 2'-O-메틸 함량을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 함량을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 적어도 약 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 약 70% 내지 약 90%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 dsRNA이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 약 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 약 70% 내지 약 90%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 적어도 약 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 약 70% 내지 약 90%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 100% 사이의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함한다.
2'-O-메틸이 풍부한 RNA 침묵화제 및 특정 화학적 변형 패턴은 U.S.S.N. 16/550,076(2019년 8월 23일 출원) 및 U.S.S.N. 62/891,185(2019년 8월 23일 출원)에 추가로 기재되어 있으며, 각각 본원에 참조로 포함된다.
뉴클레오티드간 연결 변형
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결, 서브유닛간 연결, 또는 뉴클레오티드 골격이 RNA 침묵화제에서 변형된다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제의 모든 뉴클레오티드간 연결이 변형된다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 4~16개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 8~13개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화제는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 dsRNA이고, 각각 5' 말단 및 3' 말단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-8의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 또는 1-8의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된다.
한 측면에서, 본 개시는 변형된 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적에 상보적인 5' 말단, 3' 말단을 갖고, 올리고뉴클레오티드는 센스 및 안티센스 가닥, 및 적어도 하나의 화학식 I의 변형된 서브유닛간 연결을 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00033
식 중,
B는 염기쌍 형성 모이어티이고;
W는 O, OCH2, OCH, CH2, 및 CH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
X는 할로, 하이드록시, 및 C1-6 알콕시로 구성되는 군으로부터 선택되고;
Y는 O-, OH, OR, NH-, NH2, S-, 및 SH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
Z는 O 및 CH2로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R은 보호기이고;
Figure pct00034
는 선택적 이중 결합이다.
화학식 I의 실시양태에서, W가 CH인 경우,
Figure pct00035
는 이중 결합이다.
화학식 I의 실시양태에서, W가 O, OCH2, OCH, CH2로 구성되는 군으로부터 선택되는 경우,
Figure pct00036
는 단일 결합이다.
화학식 I의 실시양태에서, Y가 O-인 경우 Z 또는 W는 O가 아니다.
화학식 I의 실시양태에서, Z는 CH2이고 W는 CH2이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 II의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 II]
Figure pct00037
.
화학식 I의 한 실시양태에서, Z는 CH2이고 W는 O이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 III의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 III]
Figure pct00038
.
화학식 I의 한 실시양태에서, Z는 O이고 W는 CH2이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 IV의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 IV]
Figure pct00039
.
화학식 I의 한 실시양태에서, Z는 O이고 W는 CH이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 V의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 V]
Figure pct00040
.
화학식 I의 한 실시양태에서, Z는 O이고 W는 OCH2이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 VI의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 VI]
Figure pct00041
.
화학식 I의 한 실시양태에서, Z는 CH2이고 W는 CH이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 VII의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 VII]
Figure pct00042
.
화학식 I의 실시양태에서, 염기쌍 형성 모이어티 B는 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실로 구성되는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 siRNA에 포함되고, 상기 변형된 siRNA는 표적에 상보적인 5' 말단, 3' 말단을 가지며, siRNA는 센스 및 안티센스 가닥, 및 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV, 화학식 V, 화학식 VI, 또는 화학식 VII 중 임의의 하나 이상의 적어도 하나의 변형된 서브유닛간 연결을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 siRNA에 포함되고, 상기 변형된 siRNA는 표적에 상보적인 5' 말단, 3' 말단을 가지며, 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, siRNA는 화학식 VIII의 적어도 하나의 변형된 서브유닛간 연결을 포함한다:
[화학식 VIII]
Figure pct00043
식 중,
D는 O, OCH2, OCH, CH2, 및 CH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
C는 O-, OH, OR1, NH-, NH2, S-, 및 SH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
A는 O 및 CH2로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R1은 보호기이고;
Figure pct00044
는 선택적 이중 결합이고;
서브유닛간은 두 개의 선택적으로 변형된 뉴클레오시드를 가교한다.
한 실시양태에서, C가 O-일 때, A 또는 D는 O가 아니다.
한 실시양태에서, D는 CH2이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VIII의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 IX의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 IX]
Figure pct00045
.
한 실시양태에서, D는 O이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VIII의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 X의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 X]
Figure pct00046
.
한 실시양태에서, D는 CH2이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VIII의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 XI의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 XI]
Figure pct00047
.
한 실시양태에서, D는 CH이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VIII의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 XII의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 XII]
Figure pct00048
.
또 다른 실시양태에서, 화학식 VII의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 XIV의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 XIV]
Figure pct00049
.
한 실시양태에서, D는 OCH2이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VII의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 XIII의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 XIII]
Figure pct00050
.
또 다른 실시양태에서, 화학식 VII의 변형된 서브유닛간 연결은 화학식 XXa의 변형된 서브유닛간 연결이다:
[화학식 XXa]
Figure pct00051
.
변형된 siRNA 연결의 한 실시양태에서, 각각의 선택적으로 변형된 뉴클레오시드는 독립적으로 각각의 경우에 아데노신, 구아노신, 시티딘 및 우리딘으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
화학식 I의 특정한 예시적 실시양태에서, W는 O이다. 또 다른 실시양태에서, W는 CH2이다. 또 다른 실시양태에서, W는 CH이다.
화학식 I의 특정한 예시적 실시양태에서, X는 OH이다. 또 다른 실시양태에서, X는 OCH3이다. 또 다른 실시양태에서, X는 할로이다.
화학식 I의 특정 실시양태에서, 변형된 siRNA는 2'-플루오로 치환기를 포함하지 않는다.
화학식 I의 실시양태에서, Y는 O-이다. 또 다른 실시양태에서, Y는 OH이다. 또 다른 실시양태에서, Y는 OR이다. 또 다른 실시양태에서, Y는 NH-이다. 한 실시양태에서, Y는 NH2이다. 또 다른 실시양태에서, Y는 S-이다. 또 다른 실시양태에서, Y는 SH이다.
화학식 I의 실시양태에서, Z는 O이다. 또 다른 실시양태에서, Z는 CH2이다.
한 실시양태에서, 변형된 서브유닛간 연결은 안티센스 가닥의 위치 1-2에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 서브유닛간 연결은 안티센스 가닥의 위치 6-7에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 서브유닛간 연결은 안티센스 가닥의 위치 10-11에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 서브유닛간 연결은 안티센스 가닥의 위치 19-20에 삽입된다. 한 실시양태에서, 변형된 서브유닛간 연결은 안티센스 가닥의 위치 5-6 및 18-19에 삽입된다.
화학식 VIII의 변형된 siRNA 연결의 예시적인 실시양태에서, C는 O-이다. 또 다른 실시양태에서, C는 OH이다. 또 다른 실시양태에서, C는 OR1이다. 또 다른 실시양태에서, C는 NH-이다. 한 실시양태에서, C는 NH2이다. 또 다른 실시양태에서, C는 S-이다. 또 다른 실시양태에서, C는 SH이다.
화학식 VIII의 변형된 siRNA 연결의 예시적인 실시양태에서, A는 O이다. 또 다른 실시양태에서, A는 CH2이다. 또 다른 실시양태에서, C는 OR1이다. 또 다른 실시양태에서, C는 NH-이다. 한 실시양태에서, C는 NH2이다. 또 다른 실시양태에서, C는 S-이다. 또 다른 실시양태에서, C는 SH이다.
화학식 VIII의 변형된 siRNA 연결의 특정 실시양태에서, 선택적으로 변형된 뉴클레오시드는 아데노신이다. 화학식 VIII의 변형된 siRNA 연결의 또 다른 실시양태에서, 선택적으로 변형된 뉴클레오시드는 구아노신이다. 화학식 VIII의 변형된 siRNA 연결의 또 다른 실시양태에서, 선택적으로 변형된 뉴클레오시드는 시티딘이다. 화학식 VIII의 변형된 siRNA 연결의 또 다른 실시양태에서, 선택적으로 변형된 뉴클레오시드는 우리딘이다.
변형된 siRNA 연결의 한 실시양태에서, 연결은 안티센스 가닥의 위치 1-2에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 연결은 안티센스 가닥의 위치 6-7에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 연결은 안티센스 가닥의 위치 10-11에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 연결은 안티센스 가닥의 위치 19-20에 삽입된다. 한 실시양태에서, 연결은 안티센스 가닥의 위치 5-6 및 18-19에 삽입된다.
화학식 I의 특정 실시양태에서, 염기쌍 형성 모이어티 B는 아데닌이다. 화학식 I의 특정 실시양태에서, 염기쌍 형성 모이어티 B는 구아닌이다. 화학식 I의 특정 실시양태에서, 염기쌍 형성 모이어티 B는 시토신이다. 화학식 I의 특정 실시양태에서, 염기쌍 형성 모이어티 B는 우라실이다.
화학식 I의 한 실시양태에서, W는 O이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, W는 CH2이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, W는 CH이다.
화학식 I의 한 실시양태에서, X는 OH이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, X는 OCH3이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, X는 할로이다.
화학식 I의 한 예시적인 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 2'-플루오로 치환기를 포함하지 않는다.
화학식 I의 한 실시양태에서, Y는 O-이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, Y는 OH이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, Y는 OR이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, Y는 NH-이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, Y는 NH2이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, Y는 S-이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, Y는 SH이다.
화학식 I의 한 실시양태에서, Z는 O이다. 화학식 I의 한 실시양태에서, Z는 CH2이다.
화학식 I의 한 실시양태에서, 연결은 안티센스 가닥의 위치 1-2에 삽입된다. 화학식 I의 또 다른 실시양태에서, 연결은 안티센스 가닥의 위치 6-7에 삽입된다. 화학식 I의 또 다른 실시양태에서, 연결은 안티센스 가닥의 위치 10-11에 삽입된다. 화학식 I의 또 다른 실시양태에서, 연결은 안티센스 가닥의 위치 19-20에 삽입된다. 화학식 I의 실시양태에서, 연결은 안티센스 가닥의 위치 5-6 및 18-19에 삽입된다.
변형된 서브유닛간 연결은 U.S.S.N. 62/824,136(2019년 3월 26일 출원), U.S.S.N. 62/826,454(2019년 3월 29일 출원) 및 U.S.S.N. 62/864,792(2019년 6월 21일 출원)에 추가로 기재되며, 각각 본원에 참조로 포함된다.
4) 접합된 기능성 모이어티
다른 실시양태에서, RNA 침묵화제는 하나 이상의 기능성 모이어티로 변형될 수 있다. 기능성 모이어티는 RNA 침묵화제에 하나 이상의 추가 활성을 부여하는 분자이다. 특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 표적 세포(예를 들어, 신경 세포)에 의한 세포 흡수를 향상시킨다. 따라서, 본 개시는 또 다른 모이어티(예를 들어, 펩티드와 같은 비핵산 모이어티), 유기 화합물(예를 들어, 염료) 등에 접합되거나 접합되지 않은(예를 들어, 그 5' 및/또는 3' 말단에서) RNA 침묵화제를 포함한다. 접합은 당분야에 알려진 방법에 의해, 예를 들어 문헌(Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001))(폴리알킬시아노아크릴레이트(PACA) 나노입자에 로딩된 핵산을 기재함); 문헌(Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998))(나노입자에 결합된 핵산을 기재함); 문헌(Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994))(삽입제, 소수성 기, 다중양이온 또는 PACA 나노입자에 연결된 핵산을 기재함); 및 문헌(Godard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995))(나노입자에 연결된 핵산을 기재함)의 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 소수성 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 지방산, 스테로이드, 세코스테로이드, 지질, 갱글리오시드 및 뉴클레오시드 유사체, 엔도칸나비노이드, 및 비타민으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 스테로이드는 콜레스테롤 및 리토콜산(LCA)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 지방산은 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 및 베헨산(DCA)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 비타민은 콜린, 비타민 A, 비타민 E, 및 이의 유도체 또는 이의 대사물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 비타민은 레티노산 및 알파-토코페릴 숙시네이트로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제는 친지성 모이어티에 접합된다. 한 실시양태에서, 친지성 모이어티는 양이온성 기를 포함하는 리간드이다. 또 다른 실시양태에서, 친지성 모이어티는 siRNA의 하나 또는 두 가닥 모두에 부착된다. 예시적인 실시양태에서, 친지성 모이어티는 siRNA의 센스 가닥의 한쪽 말단에 부착된다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 친지성 모이어티는 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다. 특정 실시양태에서, 친지성 모이어티는 콜레스테롤, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 A, 엽산, 양이온성 염료(예를 들어, Cy3)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 친지성 모이어티는 콜레스테롤이다. 다른 친지성 모이어티는 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진을 포함한다.
특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 안정성, 표적 핵산과의 혼성화 열역학, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 표적화, 또는 세포 투과도를, 예를 들어 세포내이입-의존적 또는 -독립적 메커니즘에 의해 개선하기 위해 RNA 침묵화제에 테더링된 하나 이상의 리간드를 포함할 수 있다. 리간드 및 연관된 변형은 또한 서열 특이성을 증가시키고 결과적으로 부위-외 표적화를 감소시킬 수 있다. 테더링된 리간드는 삽입제로 기능할 수 있는 하나 이상의 변형된 염기 또는 당을 포함할 수 있다. 이들은 RNA 침묵화제/표적 이중체의 팽창부에서와 같이, 내부 영역에 위치할 수 있다. 삽입제는 방향족, 예를 들어 폴리사이클릭 방향족 또는 헤테로사이클릭 방향족 화합물일 수 있다. 폴리사이클릭 삽입제는 스태킹 능력을 가질 수 있으며 2, 3 또는 4개의 융합된 고리가 있는 시스템을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 보편적 염기가 리간드에 포함될 수 있다. 한 실시양태에서, 리간드는 표적 핵산의 절단에 의해 표적 유전자 억제에 기여하는 절단기를 포함할 수 있다. 절단기는 예를 들어 블레오마이신(예를 들어, 블레오마이신-A5, 블레오마이신-A2 또는 블레오마이신-B2), 피렌, 페난트롤린(예를 들어, O-페난트롤린), 폴리아민, 트리펩티드(예를 들어, lys-tyr-lys 트리펩티드), 또는 금속 이온 킬레이트기일 수 있다. 금속 이온 킬레이트기는 예를 들어 Lu(III) 또는 EU(III) 거대고리 착물, Zn(II) 2,9-디메틸페난트롤린 유도체, Cu(II) 터피리딘, 또는 아크리딘을 포함할 수 있으며, 이는 Lu(III)과 같은 자유 금속 이온에 의한 팽창부 부위에서의 표적 RNA의 선택적 절단을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 리간드는 예를 들어 팽창부 영역에서, 표적 RNA의 절단을 촉진하기 위해 RNA 침묵화제에 테더링될 수 있다. 예를 들어, 1,8-디메틸-1,3,6,8,10,13-헥사아자사이클로테트라데칸(사이클람)은 표적 RNA 절단을 촉진하기 위해 펩티드에(예를 들어, 아미노산 유도체에 의해) 접합될 수 있다. 테더링된 리간드는 아미노글리코시드 리간드일 수 있으며, 이는 RNA 침묵화제가 개선된 혼성화 특성 또는 개선된 서열 특이성을 갖도록 유발할 수 있다. 예시적인 아미노글리코시드는 글리코실화 폴리라이신, 갈락토실화 폴리라이신, 네오마이신 B, 토브라마이신, 카나마이신 A, 및 네오-N-아크리딘, 네오-S-아크리딘, 네오-C-아크리딘, 토브라-N-아크리딘, 및 카나A-N-아크리딘과 같은 아미노글리코사이드의 아크리딘 접합체를 포함한다. 아크리딘 유사체의 사용은 서열 특이성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 네오마이신 B는 DNA에 비해 RNA에 대해 높은 친화도를, 그러나 낮은 서열 특이성을 갖는다. 아크리딘 유사체인 네오-5-아크리딘은 HIV Rev-반응 요소(RRE)에 대해 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노글리코시드 리간드의 구아니딘 유사체(구아니디노글리코시드)가 RNA 침묵화제에 테더링된다. 구아니디노글리코시드에서, 아미노산의 아민기는 구아니딘기로 교환된다. 구아니딘 유사체의 부착은 RNA 침묵화제의 세포 투과도를 향상시킬 수 있다. 테더링된 리간드는 폴리-아르기닌 펩티드, 펩토이드 또는 펩티드 모방체일 수 있고, 이는 올리고뉴클레오티드 제제의 세포 흡수를 향상시킬 수 있다.
예시적인 리간드는 개재 테더를 통해 리간드-접합 담체에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된다. 특정 실시양태에서, 커플링은 공유 결합을 통해 이루어진다. 특정 실시양태에서, 리간드는 개재 테더를 통해 담체에 부착된다. 특정 실시양태에서, 리간드는 이것이 포함되는 RNA 침묵화제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 예를 들어, 이러한 리간드가 없는 종과 비교하여, 선택된 표적, 예를 들어 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대해 향상된 친화도를 제공한다.
예시적인 리간드는 수송, 혼성화 및 특이성 특성을 개선할 수 있고, 생성된 천연 또는 변형된 RNA 침묵화제, 또는 본원에 기재된 단량체 및/또는 천연 또는 변형된 리보뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함하는 중합체 분자의 뉴클레아제 저항성을 또한 개선할 수 있다. 일반적으로 리간드는 예를 들어 흡수를 향상시키기 위한, 치료적 변형제; 예를 들어 분포를 모니터링하기 위한, 진단 화합물 또는 리포터기; 가교제; 뉴클레아제-저항성 부여 모이어티; 및 천연 또는 비일반적 핵염기를 포함할 수 있다. 일반적인 예는 친지질, 지질, 스테로이드(예를 들어, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌), 테르펜(예를 들어, 트리테르펜, 예를 들어, 사르사사포게닌, 프리델린(Friedelin), 에피프리델라놀 유도체화 리토콜산), 비타민(예를 들어, 엽산, 비타민 A, 비오틴, 피리독살), 탄수화물, 단백질, 단백질 결합제, 인테그린 표적화 분자, 다중양이온, 펩티드, 폴리아민 및 펩티드 모방체를 포함한다. 리간드는 자연 발생 물질(예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지단백질(LDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 아미노산 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리아미노산과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리아미노산이 폴리라이신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 또는 폴리포스파진인 것을 포함한다. 폴리아민의 예는 폴리에틸렌이민, 폴리라이신(PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티드모방 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염, 또는 알파 나선형 펩티드를 포함한다.
리간드는 또한 표적화기, 예를 들어 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들어 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어 신장 세포와 같은 특화된 세포 유형에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 표적화기는 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민(GalNAc) 또는 이의 유도체, N-아세틸-글루코사민, 다가 만노스, 다가 푸코스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비오틴, 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 모방체일 수 있다. 리간드의 다른 예는 염료, 삽입제(예를 들어, 아크리딘 및 치환된 아크리딘), 가교제(예를 들어, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린(Sapphyrin)), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진, 페난트롤린, 피렌), lys-tyr-lys 트리펩티드, 아미노글리코시드, 구아니듐 아미노글리코디스, 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친지성 분자, 예를 들어 콜레스테롤(및 이의 티오 유사체), 콜산, 콜란산, 리토콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 글리세롤(예를 들어, 에스테르(예를 들어, 모노, 비스 또는 트리스 지방산 에스테르, 예를 들어, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 또는 C20 지방산) 및 이의 에테르, 예를 들어 C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 또는 C20 알킬; 예를 들어 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 1,3-비스-O(옥타데실)글리세롤), 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 스테아르산(예를 들어, 글리세릴 디스테아레이트), 올레산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진) 및 펩티드 접합체(예를 들어, antennapedia 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성표지된 마커, 효소, 합텐(예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예를 들어, 아스피린, 나프록센, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자매크로사이클의 Eu3 + 착물), 디니트로페닐, HRP 또는 AP를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 GalNAc 또는 이의 유도체이다.
리간드는 단백질, 예를 들어 당단백질, 또는 펩티드, 예를 들어 공동-리간드에 대해 특이적 친화도를 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들어, 암 세포, 내피 세포 또는 뼈 세포와 같은 특화된 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스 또는 다가 푸코스와 같은 비-펩티드 종을 포함할 수 있다. 리간드는 예를 들어 지질다당류, p38 MAP 키나제의 활성화제 또는 NF-kB의 활성화제일 수 있다.
리간드는 예를 들어 세포의 세포골격을 파괴함으로써, 예를 들어 세포의 미세소관, 미세필라멘트 및/또는 중간 필라멘트를 손상시킴으로써, 세포로 RNA 침묵화제의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들어 약물일 수 있다. 약물은 예를 들어 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리드, 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀리드 A, 인다노신 또는 미오세르빈일 수 있다. 리간드는 예를 들어 염증 반응을 활성화하여 세포로 RNA 침묵화제의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이러한 효과를 가질 예시적인 리간드는 종양 괴사 인자 알파(TNF □), 인터루킨-1 베타, 또는 감마 인터페론을 포함한다. 한 측면에서, 리간드는 지질 또는 지질 기반 분자이다. 이러한 지질 또는 지질 기반 분자는 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들어 신체의 비-신장 표적 조직으로의 접합체의 분포를 허용한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자도 리간드로 사용될 수 있다. 예를 들어, 네프록신 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질 기반 리간드는 (a) 접합체의 분해에 대한 저항성을 증가시키고, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 수송을 증가시키고, 및/또는 (c) 혈청 단백질, 예를 들어, HSA에 대한 결합을 조정하는 데 사용될 수 있다. 지질 기반 리간드는 조절, 예를 들어 표적 조직에 대한 접합체의 결합을 제어하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, HSA에 더 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 신장으로 표적화될 가능성이 더 적고 따라서 신체에서 제거될 가능성이 더 적을 것이다. HSA에 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 접합체를 신장으로 표적화하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 결합한다. 지질 기반 리간드는 접합체가 비-신장 조직에 분포될 수 있도록 하기 충분한 친화도로 HSA에 결합할 수 있다. 그러나, 친화도가 너무 강하지 않아 HSA-리간드 결합이 역전될 수 없는 것으로 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않아, 접합체는 신장에 분포될 것이다. 신장 세포를 표적화하는 다른 모이어티가 또한 지질 기반 리간드 대신에 또는 추가로 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 리간드는 표적 세포, 예를 들어 증식 세포에 의해 흡수되는 모이어티, 예를 들어 비타민이다. 이들은, 예를 들어 악성 또는 비-악성 유형, 예를 들어 암 세포의 원치 않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애를 치료하는 데 유용할 수 있다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E, 및 K를 포함한다. 다른 예시적인 비타민은 B 비타민, 예를 들어 엽산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 암 세포에 의해 흡수되는 다른 비타민 또는 영양소를 포함한다. HSA 및 저밀도 지단백질(LDL)도 포함된다.
또 다른 측면에서, 리간드는 나선형 세포 투과제와 같은 세포 투과제이다. 특정 실시양태에서, 제제는 양친매성이다. 예시적인 제제는 tat 또는 antennopedia와 같은 펩티드이다. 제제가 펩티드인 경우, 펩티드 모방체, 인버토머, 비펩티드 또는 위-펩티드 연결 및 D-아미노산의 사용을 포함하여 변형될 수 있다. 나선형 제제는 친지성 및 소수성 상을 가질 수 있는, 알파-나선형 제제일 수 있다.
리간드는 펩티드 또는 펩티드 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체(본원에서 올리고펩티드 모방체로도 지칭됨)는 천연 펩티드와 유사한 정의된 3차원 구조로 폴딩될 수 있는 분자이다. 올리고뉴클레오티드 제제에 대한 펩티드 및 펩티드 모방체의 부착은 세포 인식 및 흡수의 향상에서와 같이, RNA 침묵화제의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩티드 또는 펩티드 모방체 모이어티는 약 5~50개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드 또는 펩티드 모방체는 예를 들어 세포 투과 펩티드, 양이온성 펩티드, 양친매성 펩티드, 또는 소수성 펩티드(예를 들어, 주로 Tyr, Trp 또는 Phe로 구성됨)일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머 펩티드, 구속된 펩티드 또는 가교된 펩티드일 수 있다. 펩티드 모이어티는 L-펩티드 또는 D-펩티드일 수 있다. 또 다른 대안에서, 펩티드 모이어티는 소수성 막 전위 서열(MTS)을 포함할 수 있다. 펩티드 또는 펩티드 모방체는 파지 디스플레이 라이브러리 또는 1개-비드-1개-화합물(OBOC) 조합 라이브러리로부터 확인된 펩티드와 같은 무작위 DNA 서열에 의해 암호화될 수 있다(Lam et al., Nature 354:82-84, 1991). 예시적인 실시양태에서, 포함된 단량체 단위를 통해 RNA 침묵화제에 테더링된 펩티드 또는 펩티드 모방체는 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩티드 또는 RGD 모방체와 같은 세포 표적화 펩티드이다. 펩티드 모이어티는 약 5개 아미노산 내지 약 40개 아미노산의 길이 범위일 수 있다. 펩티드 모이어티는 안정성을 증가시키거나 입체형태 특성을 지시하기 위한 것과 같이, 구조적 변형을 가질 수 있다. 아래에 기재된 임의의 구조적 변형이 활용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 본 개시의 RNA 침묵화제의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 본 개시의 RNA 침묵화제의 안티센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 본 개시의 RNA 침묵화제의 센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 본 개시의 RNA 침묵화제의 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다.
특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 링커에 의해 RNA 침묵화제에 연결된다. 특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 링커에 의해 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥에 연결된다. 특정 실시양태에서, 기능성 모이어티는 링커에 의해 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다. 특정 실시양태에서, 링커는 2가 또는 3가 링커를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 아미드, 카바메이트, 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2가 또는 3가 링커는 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00052
Figure pct00053
; 또는
Figure pct00054
식 중, n은 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
특정 실시양태에서, 링커는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유도체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유도체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
[화학식 Zc1]
Figure pct00055
;
[화학식 Zc2]
Figure pct00056
;
[화학식 Zc3]
Figure pct00057
; 및
[화학식 Zc4]
Figure pct00058
;
식 중, X는 O, S 또는 BH3이다.
본 개시의 다양한 기능성 모이어티 및 이를 RNA 침묵화제에 접합하는 수단은 WO2017/030973A1 및 WO2018/031933A2에 추가로 상세히 기재되어 있으며, 본원에 참조로 포함된다.
VI. 분지형 올리고뉴클레오티드
상기 개시된 바와 같은 2개 이상의 RNA 침묵화제, 예를 들어 항-SNCA siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드 작제물은 링커, 스페이서 및 분기점으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 모이어티에 의해 서로 연결되어 분지형 올리고뉴클레오티드 RNA 침묵화제를 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오티드 RNA 침묵화제는 2개의 siRNA로 구성되어 2개의 siRNA를 전달하기 위한 이중-분지형 siRNA("디-siRNA") 스캐폴딩을 형성한다. 대표적인 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오티드의 핵산은 각각 안티센스 가닥(또는 이의 부분)을 포함하고, 안티센스 가닥은 RNA-매개 침묵화 메커니즘(예를 들어, RNAi)을 매개하기 위해 표적 mRNA(예를 들어 SNCA mRNA)와 충분한 상보성을 갖는다.
예시적인 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 부착된 2 내지 8개의 RNA 침묵화제를 가질 수 있다. 링커는 소수성일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 출원의 분지형 올리고뉴클레오티드는 2 내지 3개의 올리고뉴클레오티드를 갖는다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 독립적으로 실질적인 화학적 안정화를 갖는다(예를 들어, 적어도 40%의 구성 염기가 화학적으로 변형됨). 예시적인 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 완전한 화학적 안정화를 갖는다(즉, 모든 구성 염기가 화학적으로 변형됨). 일부 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2 내지 20개 뉴클레오티드를 갖는 하나 이상의 단일 가닥 포스포로티오에이트화 꼬리를 포함한다. 비제한적 실시양태에서, 각각의 단일 가닥 꼬리는 2 내지 10개 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오티드는 (1) 분지형 구조, (2) 완전한 대사 안정화, 및 (3) 포스포로티오에이트 링커를 포함하는 단일 가닥 꼬리의 존재의 3가지 특성을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오티드는 2 또는 3개의 분지를 갖는다. 분지형 구조의 증가된 전체 크기가 증가된 흡수를 촉진하는 것으로 여겨진다. 또한 특정 활성 이론에 구애받지 않고 여러 인접 분지(예를 들어, 2 또는 3개)는 각 분지가 협력하여 작용하고 이에 따라 내재화, 수송 및 방출 속도를 극적으로 향상시킬 수 있도록 한다고 믿어진다.
분지형 올리고뉴클레오티드가 다양한 구조적으로 다양한 실시양태에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 분지점에 부착된 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥이고 miRNA 억제제, 갭머, 믹스머, SSO, PMO 또는 PNA로 구성된다. 이들 단일 가닥은 3' 또는 5' 말단에 부착될 수 있다. siRNA 및 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 조합도 이중 기능을 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 갭머, 믹스머, miRNA 억제제, SSO, PMO 및 PNA와 상보적인 짧은 핵산은 이러한 활성 단일 가닥 핵산을 운반하고 분포 및 세포 내재화를 향상시키는 데 사용된다. 짧은 이중체 영역은 분지형 구조가 세포로 내재화될 때 빠른 해리를 위해 낮은 용융 온도를 갖는다(Tm 약 37℃).
디-siRNA 분지형 올리고뉴클레오티드는 전술된 기능성 모이어티와 같은 화학적으로 다양한 접합체를 포함할 수 있다. 접합된 생체활성 리간드는 세포 특이성을 향상시키고 막 결합, 내재화 및 혈청 단백질 결합을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 접합에 사용될 생체활성 모이어티의 예는 DHA, GalNAc 및 콜레스테롤을 포함한다. 이러한 모이어티는 연결 링커 또는 스페이서를 통해 디-siRNA에 부착되거나 또 다른 자유 siRNA 말단에 부착된 추가 링커 또는 스페이서를 통해 부가될 수 있다.
분지형 구조의 존재에는 동일한 화학적 조성의 비분지형 화합물에 비해 뇌에서의 조직 보유 수준을 100배 초과 개선하여, 세포 보유 및 분포의 새로운 메커니즘을 제시한다. 분지형 올리고뉴클레오티드는 척수 및 뇌에 걸쳐 예상치 못한 균일한 분포를 갖는다. 더욱이, 분지형 올리고뉴클레오티드는 다양한 조직으로의 예상치 못한 효율적인 전신 전달 및 매우 높은 수준의 조직 축적을 나타낸다.
분지형 올리고뉴클레오티드는 siRNA, ASO, miRNA, miRNA 억제제, 스플라이스 스위칭, PMO, PNA를 포함하는 다양한 치료 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오티드는 접합된 소수성 모이어티를 추가로 포함하고 시험관내 및 생체내 전례 없는 침묵화 및 유효성을 나타낸다.
링커
분지형 올리고뉴클레오티드의 한 실시양태에서, 각각의 링커는 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸, 및 이의 조합으로부터 독립적으로 선택된다; 링커의 임의의 탄소 또는 산소 원자는 질소 원자로 선택적으로 대체되거나, 하이드록실 치환기를 보유하거나, 옥소 치환기를 보유한다. 한 실시양태에서, 각각의 링커는 에틸렌 글리콜 사슬이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 알킬 사슬이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 RNA이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 DNA이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스페이트이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스포네이트이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스포라미데이트이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 에스테르이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 아미드이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 트리아졸이다.
VII. 화학식 I의 화합물
또 다른 측면에서, 화학식 I의 분지형 올리고뉴클레오티드 화합물이 본원에 제공된다:
[화학식 I]
Figure pct00059
식 중, L은 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸 및 이의 조합으로부터 선택되며, 화학식 I은 선택적으로 하나 이상의 분기점 B, 및 하나 이상의 스페이서 S를 추가로 포함하고; B는 각각의 경우에 독립적으로 다가 유기 종 또는 이의 유도체이고; S는 각각의 경우에 독립적으로 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸, 및 이의 조합으로부터 선택된다.
모이어티 N은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNA 이중체이고; n은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 한 실시양태에서, N의 안티센스 가닥은 표 4~6에 언급된 바와 같이, 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, N은 표 7~8에 언급된 바와 같이, 서열 번호 14~28로 구성되는 군으로부터 선택되는 SNCA 핵산 서열 중 하나 이상을 표적화할 수 있는 가닥을 포함한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 표 1의 화학식 I-1 내지 I-9로부터 선택되는 구조를 갖는다.
Figure pct00060
한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-1이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-2이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-3이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-4이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-5이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-6이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-7이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-8이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-9이다.
화학식 I의 화합물의 한 실시양태에서, 각각의 링커는 독립적으로 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸, 및 이의 조합으로부터 선택되고; 링커의 임의의 탄소 또는 산소 원자는 선택적으로 질소 원자로 대체되거나, 하이드록실 치환기를 보유하거나, 옥소 치환기를 보유한다. 화학식 I의 화합물의 한 실시양태에서, 각각의 링커는 에틸렌 글리콜 사슬이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 알킬 사슬이다. 화학식 I의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 펩티드이다. 화학식 I의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 RNA이다. 화학식 I의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 DNA이다. 화학식 I의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스페이트이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스포네이트이다. 화학식 I의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스포라미데이트이다. 화학식 I의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 에스테르이다. 화학식 I의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 아미드이다. 화학식 I의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 트리아졸이다.
화학식 I의 화합물의 한 실시양태에서, B는 다가 유기 종이다. 화학식 I의 화합물의 또 다른 실시양태에서, B는 다가 유기 종의 유도체이다. 화학식 I의 화합물의 한 실시양태에서, B는 트리올 또는 테트롤 유도체이다. 또 다른 실시양태에서, B는 트리- 또는 테트라-카복실산 유도체이다. 또 다른 실시양태에서, B는 아민 유도체이다. 또 다른 실시양태에서, B는 트리아민 또는 테트라아민 유도체이다. 또 다른 실시양태에서, B는 아미노산 유도체이다. 화학식 I의 화합물의 또 다른 실시양태에서, B는 다음 화학식으로부터 선택된다:
Figure pct00061
Figure pct00062
또는
Figure pct00063
.
다가 유기 종은 탄소 및 3개 이상의 원자가(즉, 상기 정의된 바와 같은 S, L 또는 N과 같은 모이어티와의 부착점)를 포함하는 모이어티이다. 다가 유기 종의 비제한적인 예는 트리올(예를 들어, 글리세롤, 플로로글루시놀 등), 테트롤(예를 들어, 리보스, 펜타에리트리톨, 1,2,3,5-테트라하이드록시벤젠 등), 트리-카복실산(예를 들어, 시트르산, 1,3,5-사이클로헥산트리카복실산, 트리메스산 등), 테트라-카복실산(예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산, 피로멜리트산 등), 3차 아민(예를 들어, 트리프로파르길아민, 트리에탄올아민 등), 트리아민(예를 들어, 디에틸렌트리아민 등), 테트라민, 및 하이드록실, 티올, 아미노 및/또는 카복실 모이어티의 조합을 포함하는 종(예를 들어, 라이신, 세린, 시스테인 등과 같은 아미노산)을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 한 실시양태에서, 각각의 핵산은 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 화학식 I의 화합물의 한 실시양태에서, 각각의 핵산은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드로 구성된다. 화학식 I의 화합물의 특정 실시양태에서, >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%의 각각의 핵산은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 각각의 안티센스 가닥은 독립적으로 표 2의 군으로부터 선택된 5' 말단기 R을 포함한다.
Figure pct00064
한 실시양태에서, R은 R1이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R2이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R3이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R4이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R5이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R6이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R7이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R8이다.
화학식 II의 구조
한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 II의 구조를 갖는다:
[화학식 II]
Figure pct00065
식 중, X는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고; -는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 나타내고; =는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 나타내고; ---는 각각의 경우에 개별적으로 염기쌍 형성 상호작용 또는 미스매치를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 화학식 II의 구조는 미스매치를 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 화학식 II의 구조는 1개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 2개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 3개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 4개의 미스매치를 포함한다. 한 실시양태에서, 각 핵산은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드로 구성된다.
특정 실시양태에서, 화학식 II의 구조의 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%의 X는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 화학식 II의 구조의 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%의 X는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
화학식 III의 구조
한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 III의 구조를 갖는다:
[화학식 III]
Figure pct00066
식 중, X는 각각의 경우에 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 변형을 포함하는 뉴클레오티드이고; X는 각각의 경우에 독립적으로 2'-O-메틸 변형을 포함하는 뉴클레오티드이고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 변형을 포함하는 뉴클레오티드이고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 2'-O-메틸 변형을 포함하는 뉴클레오티드이다.
한 실시양태에서, X는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, X는 2'-O-메틸 변형 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, Y는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, Y는 2'-O-메틸 변형 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 화학식 III의 구조는 미스매치를 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 화학식 III의 구조는 1개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 III의 화합물은 2개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 III의 화합물은 3개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 III의 화합물은 4개의 미스매치를 포함한다.
화학식 IV의 구조
한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 IV의 구조를 갖는다:
[화학식 IV]
Figure pct00067
식 중, X는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고; -는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 나타내고; =는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 나타내고; ---는 각각의 경우에 개별적으로 염기쌍 형성 상호작용 또는 미스매치를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 화학식 IV의 구조는 미스매치를 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 화학식 IV의 구조는 1개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 IV의 화합물은 2개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 IV의 화합물은 3개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 IV의 화합물은 4개의 미스매치를 포함한다. 한 실시양태에서, 각 핵산은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드로 구성된다.
특정 실시양태에서, 화학식 IV의 구조의 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%의 X는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 화학식 IV의 구조의 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%의 X는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
화학식 V의 구조
한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 V의 구조를 갖는다:
[화학식 V]
Figure pct00068
식 중, X는 각각의 경우에 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 변형을 포함하는 뉴클레오티드이고; X는 각각의 경우에 독립적으로 2'-O-메틸 변형을 포함하는 뉴클레오티드이고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 변형을 포함하는 뉴클레오티드이고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 2'-O-메틸 변형을 포함하는 뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, X는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, X는 2'-O-메틸 변형 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, Y는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, Y는 2'-O-메틸 변형 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 화학식 V의 구조는 미스매치를 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 화학식 V의 구조는 1개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 V의 화합물은 2개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 V의 화합물은 3개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 V의 화합물은 4개의 미스매치를 포함한다.
가변 링커
화학식 I의 화합물의 한 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다:
[화학식 L1]
Figure pct00069
L1의 한 실시양태에서, R은 R3이고 n은 2이다.
화학식 II의 구조의 한 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다. 화학식 III의 구조의 한 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다. 화학식 IV의 구조의 한 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다. 화학식 V의 구조의 한 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다. 화학식 VI의 구조의 한 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다. 화학식 VI의 구조의 한 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다.
화학식 I의 화합물의 한 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다:
[화학식 L2]
Figure pct00070
.
L2의 한 실시양태에서, R은 R3이고 n은 2이다. 화학식 II의 구조의 한 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다. 화학식 III의 구조의 한 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다. 화학식 IV의 구조의 한 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다. 화학식 V의 구조의 한 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다. 화학식 VI의 구조의 한 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다. 화학식 VI의 구조의 한 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다.
전달 시스템
제3 측면에서, 본원은 화학식 VI의 구조를 갖는 치료용 핵산을 위한 전달 시스템을 제공한다:
[화학식 VI]
Figure pct00071
식 중, L은 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸 및 이의 조합으로부터 선택되며, 화학식 VI는 선택적으로 하나 이상의 분기점 B, 및 하나 이상의 스페이서 S를 추가로 포함하고; B는 각각의 경우에 독립적으로 다가 유기 종 또는 이의 유도체이고; S는 각각의 경우에 독립적으로 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸, 및 이의 조합으로부터 선택되고; 각각의 cNA는 독립적으로 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 담체 핵산이고; n은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
전달 시스템의 한 실시양태에서, L은 에틸렌 글리콜 사슬이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 알킬 사슬이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 펩티드이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 RNA이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 DNA이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 포스페이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 포스포네이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 포스포라미데이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 에스테르이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 아미드이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 트리아졸이다.
전달 시스템의 한 실시양태에서, S는 에틸렌 글리콜 사슬이다. 또 다른 실시양태에서, S는 알킬 사슬이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, S는 RNA이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 DNA이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 포스페이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 포스포네이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 포스포라미데이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 에스테르이다. 또 다른 실시양태에서, S는 아미드이다. 또 다른 실시양태에서, S는 트리아졸이다.
전달 시스템의 한 실시양태에서, n은 2이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 3이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 4이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 5이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 6이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 7이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 8이다.
특정 실시양태에서, 각각의 cNA는 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 표 3의 화학식 VI-1 내지 VI-9로부터 선택되는 구조를 갖는다:
Figure pct00072
한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 화학식 VI-1의 구조이다. 한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 화학식 VI-2의 구조이다. 한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 화학식 VI-3의 구조이다. 한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 화학식 VI-4의 구조이다. 한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 화학식 VI-5의 구조이다. 한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 화학식 VI-6의 구조이다. 한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 화학식 VI-7의 구조이다. 한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 화학식 VI-8의 구조이다. 한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 화학식 VI-9의 구조이다.
한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물(예를 들어, 화학식 VI-1 내지 VI-9 포함, 각각의 cNA는 독립적으로 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 cNA는 독립적으로 화학적으로 변형된 뉴클레오티드로 구성된다.
한 실시양태에서, 전달 시스템은 n개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함하고, 각각의 NA는 표 4~6에서 언급된 바와 같은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, NA는 표 6~8에 언급된 바와 같이 서열 번호 14~28로 구성되는 군으로부터 선택되는 SNCA 핵산 서열 중 하나 이상을 표적화할 수 있는 가닥을 포함한다.
또한, 각각의 NA는 적어도 하나의 cNA에 혼성화된다. 한 실시양태에서, 전달 시스템은 2개의 NA로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 3개의 NA로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 4개의 NA로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 5개의 NA로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 6개의 NA로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 7개의 NA로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 8개의 NA로 이루어진다.
한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 15~25개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 16개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 18개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 20개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 21개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 22개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 23개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 24개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 25개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 2개의 뉴클레오티드의 쌍을 이루지 않은 오버행을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 3개의 뉴클레오티드의 쌍을 이루지 않은 오버행을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 4개의 뉴클레오티드의 쌍을 이루지 않은 오버행을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 5개의 뉴클레오티드의 쌍을 이루지 않은 오버행을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 6개의 뉴클레오티드의 쌍을 이루지 않은 오버행을 포함한다. 한 실시양태에서, 오버행의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결된다.
한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 DNA, siRNA, antagomiR, miRNA, 갭머, 믹스머, 또는 가이드 RNA로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 DNA이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 siRNA이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 antagomiR이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 miRNA이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 갭머이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 믹스머이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 가이드 RNA이다. 한 실시양태에서, 각각의 NA는 동일하다. 실시양태에서, 각각의 NA는 동일하지 않다.
한 실시양태에서, n개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함하는 전달 시스템은 본원에 기재된 화학식 I, II, III, IV, V, VI 및 이의 실시양태로부터 선택되는 구조를 갖는다. 한 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 I, II, III, IV, V, VI으로부터 선택되는 구조를 갖고 본원에 기재된 이의 실시양태는 2개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 I, II, III, IV, V, VI으로부터 선택되는 구조를 갖고 본원에 기재된 이의 실시양태는 3개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 I, II, III, IV, V, VI으로부터 선택되는 구조를 갖고 본원에 기재된 이의 실시양태는 4개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 I, II, III, IV, V, VI으로부터 선택되는 구조를 갖고 본원에 기재된 이의 실시양태는 5개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 I, II, III, IV, V, VI으로부터 선택되는 구조를 갖고 본원에 기재된 이의 실시양태는 6개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 I, II, III, IV, V, VI으로부터 선택되는 구조를 갖고 본원에 기재된 이의 실시양태는 7개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 I, II, III, IV, V, VI으로부터 선택되는 구조를 갖고 본원에 기재된 이의 실시양태는 8개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 I, II, III, IV, V, VI로부터 선택되는 구조를 갖고, 추가로 구조 L1 또는 L2의 링커를 포함하며, R은 R3이고 n은 2이다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 I, II, III, IV, V, VI로부터 선택되는 구조를 갖고, 추가로 구조 L1의 링커를 포함하고, R은 R3이고 n은 2이다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 화학식 I, II, III, IV, V, VI로부터 선택되는 구조를 갖고, 추가로 구조 L2의 링커를 포함하고, R은 R3이고 n은 2이다.
전달 시스템의 한 실시양태에서, 전달 표적은 뇌, 간, 피부, 신장, 비장, 췌장, 결장, 지방, 폐, 근육 및 가슴샘으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 뇌이다. 또 다른 실시양태에서, 전달 표적은 뇌의 선조체이다. 또 다른 실시양태에서, 전달 표적은 뇌의 피질이다. 또 다른 실시양태에서, 전달 표적은 뇌의 선조체이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 간이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 피부이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 신장이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 비장이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 췌장이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 결장이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 지방이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 폐이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 근육이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 가슴샘이다. 한 실시양태에서, 전달 표적은 척수이다.
특정 실시양태에서, 본 개시의 화합물은 하기 특성을 특징으로 한다: (1) 2개 이상의 분지형 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 동일하지 않은 수의 3' 및 5' 말단이 존재함; (2) 실질적으로 화학적으로 안정화됨, 예를 들어 40% 초과, 최적으로 100%의 올리고뉴클레오티드가 화학적으로 변형됨(예를 들어, RNA 및 선택적으로 DNA 없음); 및 (3) 적어도 3개의 포스포로티오에이트화 결합을 포함하는 포스포로티오에이트화 단일 올리고뉴클레오티드. 특정 실시양태에서, 포스포로티오에이트화 단일 올리고뉴클레오티드는 4~20개의 포스포로티오에이트화 결합을 포함한다.
본 개시에 기재된 방법은 본원에 개시된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않음이 이해되어야 한다; 이러한 방법 및 조건이 변할 수 있기 때문이다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다.
또한, 본원에 기재된 실험은 달리 표시되지 않는 한, 당분야의 기술 수준 내에서 통상적인 분자 및 세포 생물학 및 면역학 기술을 사용한다. 이러한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 문헌에 충분히 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌(Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1987-2008), including all supplements, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) by MR Green and J. Sambrook and Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2nd edition))을 참고한다.
합성 및 사용 방법을 포함하는 분지형 올리고뉴클레오티드는 WO2017/132669에 더 자세히 기재되어 있으며, 본원에 참조로 포함된다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포를 도입하는 방법
본 개시의 RNA 침묵화제는 세포(예를 들어, 신경 세포)로(즉, 세포내로) 직접 도입될 수 있거나; 공동, 간질 공간, 유기체의 순환으로 세포외 도입되거나, 경구로 도입되거나, 핵산을 포함하는 용액에 세포 또는 유기체를 침지시킴으로써 도입될 수 있다. 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프계, 및 뇌척수액이 핵산이 도입될 수 있는 부위이다.
본 개시의 RNA 침묵화제는 핵산을 포함하는 용액의 주사, 핵산에 의해 덮인 입자에 의한 충격, 핵산 용액 중 세포 또는 유기체의 침지 또는 핵산의 존재 하 세포막의 전기천공을 포함하는 당분야에 알려진 핵산 전달 방법을 사용하여 도입될 수 있다. 핵산을 세포에 도입하기 위해 당분야에 알려진 다른 방법, 예컨대 지질-매개 담체 수송, 화학물질-매개 수송, 및 인산칼슘과 같은 양이온성 리포솜 형질감염 등이 사용될 수 있다. 핵산은 하기 활동: 세포에 의한 핵산 흡수 향상 또는 다르게는 표적 유전자의 억제 증가 중 하나 이상을 수행하는 다른 성분과 함께 도입될 수 있다.
핵산을 도입하는 물리적 방법은 RNA를 포함하는 용액의 주사, RNA로 덮인 입자에 의한 충격, RNA 용액 중 세포 또는 유기체의 침지, 또는 RNA의 존재 하의 세포막의 전기천공을 포함한다. 바이러스 입자에 패키징된 바이러스 작제물은 세포로의 발현 작제물의 효율적인 도입 및 발현 작제물에 의해 암호화된 RNA의 전사 둘 다를 달성할 것이다. 핵산을 세포에 도입하기 위해 당분야에 알려진 다른 방법, 예컨대 지질-매개 담체 수송, 인산칼슘과 같은 화학물질-매개 수송 등이 사용될 수 있다. 따라서, RNA는 하기 활성: 세포에 의한 RNA 흡수 향상, 단일 가닥의 어닐링 억제, 단일 가닥의 안정화, 또는 다르게는 표적 유전자의 억제 증가 중 하나 이상을 수행하는 성분과 함께 도입될 수 있다.
RNA는 세포로 직접 도입될 수 있거나(즉, 세포내로); 공동, 간질 공간, 유기체의 순환으로 세포외 도입되거나, 경구로 도입되거나, RNA를 포함하는 용액 중 세포 또는 유기체를 침지시킴으로써 도입될 수 있다. 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프계, 및 뇌척수액이 RNA가 도입될 수 있는 부위이다.
표적 유전자를 갖는 세포는 생식선 또는 체세포, 전능 또는 만능, 분열 또는 비분열, 실질 또는 상피, 불멸화 또는 형질전환 등으로부터 유래할 수 있다. 세포는 줄기 세포 또는 분화된 세포일 수 있다. 분화되는 세포 유형은 지방세포, 섬유아세포, 근세포, 심근세포, 내피, 뉴런, 아교세포, 혈액 세포, 거핵구, 림프구, 대식구, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 백혈구, 과립구, 각질세포, 연골세포, 골모세포, 파골세포, 간세포, 및 내분비샘 또는 외분비샘의 세포를 포함한다.
특정 표적 유전자 및 전달된 이중 가닥 RNA 물질의 용량에 따라, 이 과정은 표적 유전자의 기능의 부분적인 또는 완전한 손실을 제공할 수 있다. 표적화된 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상에서의 유전자 발현의 감소 또는 손실이 예시적이다. 유전자 발현의 억제는 표적 유전자로부터의 단백질 및/또는 mRNA 산물 수준의 부재(또는 관찰 가능한 감소)를 지칭한다. 특이성은 세포의 다른 유전자에 대한 명백한 영향 없이 표적 유전자를 억제하는 능력을 지칭한다. 억제의 결과는 세포 또는 유기체의 외향 특성(실시예에서 아래에 제시됨)의 조사에 의해 또는 RNA 용액 혼성화, 뉴클레아제 보호, 노던 혼성화, 역전사, 마이크로어레이로의 유전자 발현 모니터링, 항체 결합, 효소 연관 면역흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯팅, 방사성면역검정(RIA), 기타 면역검정 및 형광 활성화 세포 정렬(FACS)과 같은 생화학적 기술에 의해 확인될 수 있다.
세포주 또는 전체 유기체에서 RNA 매개 억제를 위해, 유전자 발현은 단백질 산물이 쉽게 검정되는 리포터 또는 약물 내성 유전자를 사용하여 편리하게 검정된다. 이러한 리포터 유전자는 아세토하이드록시산 신타제(AHAS), 알칼리성 포스파타제(AP), 베타 갈락토시다제(LacZ), 베타 글루코로니다제(GUS), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 녹색 형광 단백질(GFP), 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 루시퍼라제(Luc), 노팔린 신타제(NOS), 옥토핀 신타제(OCS), 및 이의 유도체를 포함한다. 앰피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타니신, 하이그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 여러 선별 마커가 이용 가능하다. 검정에 따라, 유전자 발현량의 정량은 본 개시에 따른 미처리 세포와 비교하여 10%, 33%, 50%, 90%, 95% 또는 99% 초과인 억제 정도를 결정할 수 있도록 한다. 주사된 물질의 용량이 적을수록 및 RNAi 제제 투여 후 시간이 길수록 더 작은 분율(예를 들어, 표적화된 세포의 적어도 10%, 20%, 50%, 75%, 90% 또는 95%)의 세포에서 억제를 초래할 수 있다. 세포에서 유전자 발현의 양자화는 표적 mRNA의 축적 또는 표적 단백질의 번역 수준에서 유사한 양의 억제를 나타낼 수 있다. 예로서, 억제 효율은 세포에서 유전자 산물의 양을 평가함으로써 결정될 수 있다; mRNA는 억제 이중 가닥 RNA에 사용된 영역 외부에 뉴클레오티드 서열을 갖는 혼성화 프로브로 검출될 수 있거나, 번역된 폴리펩티드는 해당 영역의 폴리펩티드 서열에 대해 생성된 항체로 검출될 수 있다.
RNA는 세포당 적어도 하나의 카피의 전달을 허용하는 양으로 도입될 수 있다. 더 높은 용량(예를 들어, 세포당 적어도 5, 10, 100, 500 또는 1000개 카피)의 물질이 더 효과적인 억제를 생성할 수 있다; 더 낮은 용량은 또한 특정 용도에 유용할 수 있다.
예시적 측면에서, 본 개시의 RNAi 제제(SNCA 표적 서열을 표적화하는 siRNA)의 유효성은 중추 신경계의 세포와 같은 세포에서 돌연변이체 mRNA(예를 들어, SNCA mRNA 및/또는 SNCA 단백질의 생산)를 특이적으로 분해하는 능력에 대해 시험된다. 특정 실시양태에서, 중추 신경계의 세포는 뉴런(예를 들어, 선조체 또는 피질 신경 클론 라인 및/또는 일차 뉴런), 신경아교 세포, 및 성상아교세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 쉽게 형질감염 가능한 세포, 예를 들어, HeLa 세포 또는 COS 세포가 또한 세포 기반 검증 검정에 적합하다. 세포는 인간 야생형 또는 돌연변이체 cDNA(예를 들어, 인간 야생형 또는 돌연변이체 SNCA cDNA)로 형질감염된다. 표준 siRNA, 변형된 siRNA 또는 U-루프 mRNA로부터 siRNA를 생산할 수 있는 벡터가 공동 형질감염된다. 표적 mRNA(예를 들어, SNCA mRNA) 및/또는 표적 단백질(예를 들어, SNCA 단백질)의 선택적 감소가 측정된다. 표적 mRNA 또는 단백질의 감소는 RNAi 제제의 부재 하에 또는 SNCA mRNA를 표적화하지 않는 RNAi 제제의 존재 하에 표적 mRNA 또는 단백질의 수준과 비교될 수 있다. 외인성으로 도입된 mRNA 또는 단백질(또는 내인성 mRNA 또는 단백질)은 비교 목적으로 검정될 수 있다. 표준 형질감염 기술에 다소 저항성인 것으로 알려진 신경 세포를 활용할 때, 수동 흡수에 의해 RNAi 제제(예를 들어, siRNA)를 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
재조합 아데노-연관 바이러스 및 벡터
특정한 예시적 실시양태에서, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 및 그의 연관 벡터가 하나 이상의 siRNA를 세포, 예를 들어 신경 세포(예를 들어, 뇌 세포)에 전달하는 데 사용될 수 있다. AAV는 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있지만 감염 효율은 캡시드 단백질의 서열에 의해 결정되는 혈청형에 따라 다르다. 몇몇 천연 AAV 혈청형이 확인되었으며, 혈청형 1-9가 재조합 AAV에 가장 일반적으로 사용된다. AAV-2는 가장 잘 연구되고 발표된 혈청형이다. AAV-DJ 시스템은 혈청형 AAV-DJ 및 AAV-DJ/8을 포함한다. 이러한 혈청형은 다양한 세포 및 조직에서 시험관내(AAV-DJ) 및 생체내(AAV-DJ/8) 형질도입 효율을 개선한 하이브리드 캡시드를 갖는 AAV를 생산하기 위해 여러 AAV 혈청형의 DNA 셔플링을 통해 생성되었다.
특정 실시양태에서, 광범위한 중추신경계(CNS) 전달은 재조합 아데노-연관 바이러스 7(rAAV7), RAAV9 및 rAAV10, 또는 다른 적합한 rAAV의 혈관내 전달에 의해 달성될 수 있다(Zhang et al. (2011) Mol. Ther. 19(8):1440-8. doi: 10.1038/mt.2011.98. Epub 2011 May 24). rAAV 및 이의 연관 벡터는 당분야에 잘 알려져 있고 미국 특허 출원 2014/0296486, 2010/0186103, 2008/0269149, 2006/0078542 및 2005/0220766에 기재되어 있으며, 이들은 각각 모든 목적을 위해 전체가 본원에 참조로 포함된다.
rAAV는 당분야에 알려진 임의의 적절한 방법에 따른 조성물로 대상체에 전달될 수 있다. rAAV는 생리적으로 상용성인 담체 중(즉, 조성물 중) 현탁될 수 있고, 대상체, 즉 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 양, 토끼, 말, 소, 염소, 돼지, 기니피그, 햄스터, 닭, 칠면조, 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이) 등과 같은 숙주 동물에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 숙주 동물은 비인간 숙주 동물이다.
포유류 대상체에 대한 하나 이상의 rAAV의 전달은 예를 들어 근육내 주사에 의해 또는 포유류 대상체의 혈류로의 투여에 의해 수행될 수 있다. 혈류로의 투여는 정맥, 동맥 또는 임의의 기타 혈관 도관으로 주사함으로써 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 rAAV는 외과 분야에 널리 알려진 기술인 단리된 사지 관류에 의해 혈류로 투여되며, 이 방법은 본질적으로 rAAV 비리온의 투여 전에 당업자가 전신 순환으로부터 사지를 단리할 수 있게 한다. 미국 특허 제6,177,403호에 기재된 단리된 사지 관류 기술의 변형이 또한 근육 세포 또는 조직으로의 형질도입을 잠재적으로 향상시키기 위해 단리된 사지의 혈관계로 비리온을 투여하기 위해 당업자에 의해 이용될 수 있다. 더욱이, 특정 경우에는, 대상체의 중추 신경계(CNS)에 비리온을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. "CNS"는 척추동물의 뇌 및 척수의 모든 세포 및 조직을 의미한다. 따라서, 이 용어는 신경 세포, 신경아교 세포, 성상아교세포, 뇌척수액(CSF), 간질 공간, 뼈, 연골 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 재조합 AAV는 정위 주사와 같은 당분야에 알려진 신경수술 기술을 사용하여, 예를 들어, 심실 영역 뿐만 아니라 선조체(예를 들어, 선조체의 미상핵 또는 피막), 척수 및 신경근 접합부, 또는 소뇌 소엽으로의 주사에 의해, CNS 또는 뇌에 직접 전달될 수 있다(Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; 및 Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000 참고).
본 개시의 조성물은 rAAV를 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 바이러스(예를 들어, 하나 이상의 상이한 트랜스유전자를 암호화하는 제2 rAAV)와 조합하여 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 각각 하나 이상의 상이한 트랜스유전자를 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 rAAV를 포함한다.
rAAV의 유효량은 감염 동물을 표적화하고 원하는 조직을 표적화하기 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, rAAV의 유효량은 안정한 체세포 트랜스제닉 동물 모델을 생산하기 충분한 양이다. 유효량은 주로 대상체의 종, 연령, 체중, 건강 및 표적화될 조직과 같은 요인에 의존할 것이므로 동물 및 조직에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 rAAV의 유효량은 일반적으로 약 109 내지 1016 게놈 카피를 포함하는 용액의 약 1 ml 내지 약 100 ml 범위이다. 일부 경우에, 약 1011 내지 1012 rAAV 게놈 카피의 투여량이 적절하다. 특정 실시양태에서, 1012 rAAV 게놈 카피는 심장, 간 및 췌장 조직을 표적화하는 데 효과적이다. 일부 경우에, 안정한 트랜스제닉 동물은 다중 용량의 rAAV에 의해 생산된다.
일부 실시양태에서, rAAV 조성물은 특히 높은 rAAV 농도가 존재하는 경우(예를 들어, 약 1013 게놈 카피/mL 이상), 조성물에서 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 제형화된다. rAAV의 응집을 감소시키는 방법은 당분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 계면활성제의 첨가, pH 조정, 염 농도 조정 등을 포함한다(예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로 포함되는, Wright et al. (2005) Molecular Therapy 12:171-178 참고).
"재조합 AAV(rAAV) 벡터"는 최소의 트랜스유전자 및 그 조절 서열, 그리고 5' 및 3' AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 캡시드 단백질에 패키징되어 선택된 표적 세포에 전달되는 것은 이 재조합 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 트랜스유전자는 관심 폴리펩티드, 단백질, 기능성 RNA 분자(예를 들어, siRNA) 또는 다른 유전자 산물을 암호화하는, 벡터 서열에 이종성인 핵산 서열이다. 핵산 코딩 서열은 표적 조직의 세포에서 트랜스유전자 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동 가능하게 연결된다.
벡터의 AAV 서열은 전형적으로 시스-작용 5' 및 3' 역 말단 반복부(ITR) 서열을 포함한다(예를 들어, B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990) 참고). ITR 서열은 일반적으로 약 145개 염기쌍 길이이다. 특정 실시양태에서, ITR을 암호화하는 실질적으로 전체 서열이 분자에 사용되지만, 이들 서열의 어느 정도의 약간의 변형은 허용 가능하다. 이들 ITR 서열을 변형시키는 능력은 당분야의 기술 수준 내에 있다(예를 들어, Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); 및 K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)과 같은 텍스트 참고). 본 개시에 이용된 이러한 분자의 예는 선택된 트랜스유전자 서열 및 연관 조절 요소에 5' 및 3' AAV ITR 서열이 측면에 있는 트랜스유전자를 포함하는 "시스-작용" 플라스미드이다. AAV ITR 서열은 본원에 추가로 기재된 포유류 AAV 유형을 포함하는 임의의 알려진 AAV로부터 수득될 수 있다.
VIII. 치료 방법
한 측면에서, 본 개시는 SNCA를 포함하는 뇌 내 불용성 응집체가 발생할 위험이 있는(또는 이에 민감한) 대상체를 치료하는 예방적 및 치료적 방법 둘 다를 제공한다. 한 실시양태에서, 질병 또는 장애는 중추 신경계(CNS)의 SNCA 수준이 신경변성 진행을 예측하는 것으로 발견된 정도이다. 또 다른 실시양태에서, 질병 또는 장애는 잘못 폴딩된 단백질의 응집을 특징으로 하는 단백병증이다. 특정 실시양태에서, 질병 또는 장애는 CNS에서 SNCA의 감소가 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 헌팅턴병과 같은 신경변성 질병에서 나타난 임상 발현을 감소시키는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료" 또는 "치료하는"은 근치, 치유, 경감, 해소, 변경, 구제, 완화, 개선하거나 영향을 미치는 목적으로, 질병 또는 장애, 질병 또는 장애의 증상 또는 질병에 대한 소인을 갖는, 환자에 대한 치료제(예를 들어, RNA 제제 또는 이를 암호화하는 벡터 또는 트랜스유전자)의 적용 또는 투여, 또는 환자로부터 단리된 조직 또는 세포로의 치료제의 적용 또는 투여로 정의된다.
한 측면에서, 본 개시는 대상체에 치료제(예를 들어, RNAi 제제 또는 이를 암호화하는 벡터 또는 트랜스유전자)를 투여함으로써, 상기 기재된 바와 같은 질병 또는 장애를 대상체에서 예방하는 방법을 제공한다. 질병에 대한 위험이 있는 대상체는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 진단 또는 예후 검정 중 임의의 것 또는 이의 조합에 의해 확인될 수 있다. 예방제의 투여는 질병 또는 장애가 예방되거나 대안적으로 그 진행이 지연되도록, 질병 또는 장애의 특징적인 증상의 발현 전에 일어날 수 있다.
본 개시의 또 다른 측면은 대상체를 치료적으로 치료하는, 즉 질병 또는 장애의 증상의 발병을 변경하는 방법에 관한 것이다. 예시적인 실시양태에서, 본 개시의 조절 방법에는 유전자에 대한 서열 특이적 간섭이 달성되도록, SNCA를 발현하는 CNS 세포를 유전자 내의 표적 서열(예를 들어, 표 4~6의 SNCA 표적 서열)에 특이적인 치료제(예를 들어, RNAi 제제 또는 이를 암호화하는 벡터 또는 트랜스유전자)와 접촉시키는 단계가 관여된다. 이들 방법은 시험관내(예를 들어, 세포를 제제와 함께 배양함으로써) 또는 대안적으로 생체내(예를 들어, 대상체에 제제를 투여함으로써) 수행될 수 있다.
IX. 약학 조성물 및 투여 방법
본 개시는 하기에 기재된 바와 같은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위한 상기 기재된 제제의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 개시의 조절제(예를 들어, RNAi 제제)는 투여에 적합한 약학 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 핵산 분자, 단백질, 항체, 또는 조절 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용된 언어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 약학 투여와 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고, 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
본 개시의 약학 조성물은 그 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 복강내, 근육내, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(국소) 및 경점막 투여를 포함한다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 개시의 약학 조성물은 정맥내 투여되고 혈액 뇌 장벽을 통과하여 중추 신경계에 들어갈 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 개시의 약학 조성물은 선조체내(IS) 투여, 뇌실내(ICV) 투여 및 척수내(IT)투여(예를 들어, 펌프, 주입 등을 통해)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 투여 경로에 의해 뇌척수액(CSF)에 전달된다.
본 개시의 핵산 분자는 예를 들어 문헌(Xia et al., 2002, 상기 문헌)에 기재된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당분야에 알려진 방법을 사용하여, 발현 작제물, 예를 들어 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 발현 카세트, 또는 플라스미드 바이러스 벡터에 삽입될 수 있다. 발현 작제물은 예를 들어 흡입, 경구, 정맥내 주사, 국소 투여(미국 특허 제5,328,470호 참고) 또는 정위 주사(예를 들어, Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054-3057 참고)에 의해 대상체에 전달될 수 있다. 전달 벡터의 약학 제조물은 허용 가능한 희석제에 벡터를 포함할 수 있거나 전달 비히클이 포매된 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 전달 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터가 재조합 세포로부터 온전하게 생산될 수 있는 경우, 약학 제조물은 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
본 개시의 핵산 분자는 또한 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 및 shRNA를 발현하도록 조작된 발현 작제물을 포함할 수 있다. shRNA의 전사는 중합효소 III(pol III) 프로모터에서 개시되고 4-5-티민 전사 종결 부위의 위치 2에서 종결될 것으로 생각된다. 발현 시 shRNA는 3' UU 오버행을 갖는 줄기 루프 구조로 폴딩되는 것으로 생각된다; 이어서, 이들 shRNA의 말단이 가공되어 shRNA를 약 21개 뉴클레오티드의 siRNA 유사 분자로 전환시킨다(Brummelkamp et al. (2002), Science, 296, 550-553; Lee et al, (2002). 상기 문헌; Miyagishi and Taira (2002), Nature Biotechnol., 20, 497-500; Paddison et al. (2002), 상기 문헌; Paul (2002), 상기 문헌; Sui (2002) 상기 문헌; Yu et al. (2002), 상기 문헌).
발현 작제물은 적절한 발현 시스템에서 사용하기 적합한 임의의 작제물일 수 있고, 당분야에 알려진 바와 같이 레트로바이러스 벡터, 선형 발현 카세트, 플라스미드 및 바이러스 또는 바이러스-유래 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 발현 작제물은 하나 이상의 유도성 프로모터, U6 snRNA 프로모터 또는 H1 RNA 중합효소 III 프로모터와 같은 RNA Pol III 프로모터 시스템, 또는 당분야에 알려진 다른 프로모터를 포함할 수 있다. 작제물은 siRNA의 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 포함할 수 있다. 두 가닥을 모두 발현하는 발현 작제물은 또한 두 가닥을 연결하는 루프 구조를 포함할 수 있거나, 각 가닥은 동일한 작제물 내의 별도의 프로모터로부터 별도로 전사될 수 있다. 각 가닥은 또한 별도의 발현 작제물로부터 전사될 수 있다(Tuschl (2002), 상기 문헌).
특정 실시양태에서, 본 개시의 화합물을 포함하는 조성물은 다양한 경로에 의해 대상체의 신경계에 전달될 수 있다. 예시적인 경로는 척수내, 실질(예를 들어, 뇌내), 비강 및 안구 전달을 포함한다. 조성물은 또한 전신적으로, 예를 들어 정맥내, 피하 또는 근육내 주사에 의해 전달될 수 있다. 하나의 전달 경로는 뇌에 직접적으로, 예를 들어 뇌의 뇌실 또는 시상하부로, 또는 뇌의 측면 또는 등쪽 영역으로이다. 신경 세포 전달용 화합물은 투여에 적합한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
예를 들어, 조성물은 본 개시의 화합물의 하나 이상의 종 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 개시의 약학 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 및 치료될 영역에 따라 여러 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(안과, 비강, 경피 포함), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내 점적, 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 척수내, 또는 뇌실내(예를 들어, 대뇌 뇌실내) 투여를 포함한다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 개시의 RNA 침묵화제는 본원에 기재된 다양한 적합한 조성물 및 방법을 사용하여 혈액-뇌-장벽(BBB)을 통과해 전달된다.
전달 경로는 환자의 장애에 따라 의존할 수 있다. 예를 들어, 신경변성 질병으로 진단된 대상체에는 본 개시의 항-SNCA 화합물이 뇌에(예를 들어, 기저핵의 창백핵 또는 선조체로, 그리고 선조체의 중간 가시 뉴런 근처로) 직접 투여될 수 있다. 본 개시의 화합물에 더하여, 환자에는 제2 치료법, 예를 들어, 완화 치료법 및/또는 질병-특이적 치료법이 투여될 수 있다. 제2 치료법은, 예를 들어, 대증(예를 들어, 증상 경감을 위한), 신경보호(예를 들어, 질병 진행을 늦추거나 정지시키기 위한), 또는 회복(예를 들어, 질병 진행을 역전시키기 위한) 치료법일 수 있다. 다른 치료법은 심리치료법, 물리치료법, 언어 치료법, 의사소통 및 기억 보조, 사회적 지원 서비스, 및 식이 조언을 포함할 수 있다.
본 개시의 화합물은 뇌의 신경 세포에 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시의 화합물은 중추 신경계에 대한 직접 투여 없이 뇌에 전달될 수 있으며, 즉 화합물은 정맥내로 전달되고 혈액 뇌 장벽을 통과하여 뇌로 들어갈 수 있다. 혈액-뇌 장벽을 통한 조성물의 통과를 필요로 하지 않는 전달 방법이 활용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 화합물을 포함하는 약학 조성물은 질병-영향 세포를 포함하는 영역으로 직접 주사에 의해 환자에 전달될 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 뇌에 직접 주사에 의해 전달될 수 있다. 주사는 뇌의 특정 영역(예를 들어, 흑색질, 피질, 해마, 선조체, 또는 창백핵)으로의 정위 주사에 의한 것일 수 있다. 화합물은 중추 신경계의 다중 영역으로(예를 들어, 뇌의 다중 영역으로 및/또는 척수로) 전달될 수 있다. 화합물은 뇌의 확산 영역으로 전달될 수 있다(예를 들어, 뇌의 피질로의 확산 전달).
한 실시양태에서, 화합물은 캐뉼라 또는 한쪽 말단이 조직, 예를 들어 뇌, 예를 들어 뇌의 흑색질, 피질, 해마, 선조체 또는 창백핵에 임플란트된 다른 전달 장치에 의해 전달될 수 있다. 캐뉼라는 화합물을 포함하는 저장소에 연결될 수 있다. 흐름 또는 전달은 펌프, 예를 들어 Alzet 펌프(Durect, Cupertino, CA)와 같은 미니펌프 또는 삼투 펌프에 의해 매개될 수 있다. 한 실시양태에서, 펌프 및 저장소는 조직으로부터 멀리 떨어진 영역, 예를 들어 복부에 임플란트되고, 전달은 펌프 또는 저장소로부터 방출 부위로 이어지는 도관에 의해 수행된다. 뇌로의 전달을 위한 장치는 예를 들어 미국 특허 제6,093,180호 및 제5,814,014호에 기재되어 있다.
본원에 기재된 방법의 다른 적합한 변형 및 적응이 본원에 개시된 실시양태의 범위를 벗어나지 않고 적절한 동등물을 사용하여 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 이제 특정 실시예를 상세하게 기재했지만, 이는 단지 예시의 목적으로 포함되고 제한하려는 의도가 아닌, 하기 실시예를 참조하여 더 명확하게 이해될 것이다.
실시예
실시예 1. SNCA 표적화 서열의 시험관내 확인
SNCA 유전자를 mRNA 녹다운의 표적으로 사용하였다. 인간 및 마우스 SNCA mRNA의 여러 상이한 서열을 표적화하는 siRNA 패널을 시험관내 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 개발 및 스크리닝하였으며 미처리 대조군 세포와 비교하였다. SiRNA는 개방 해독 프레임(ORF) 및 3' 비번역 영역(3'UTR)을 표적화하도록 설계하였다. siRNA는 각각 1.5 μM의 농도에서 시험하였고 mRNA는 72시간 시점에 QuantiGene 유전자 발현 검정(ThermoFisher, Waltham, MA)으로 평가하였다. 도 1은 인간 SNCA mRNA에 대한 스크리닝 결과를 보고하고, 도 2는 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 인간 및 마우스 표적화 siRNA의 스크리닝 결과를 보고한다.
아래의 표 4 및 표 6은 미처리 대조군의 %에 비해 감소된 SNCA mRNA 발현을 실증한 인간 SNCA 표적 서열을 언급한다. 아래의 표 5는 미처리 대조군의 %에 비해 감소된 SNCA mRNA 발현을 실증한 교차-종 및 마우스 SNCA 표적 서열을 언급한다. 교차종 표적은 인간 및 마우스 SNCA mRNA 모두에서 발견되며 생체내 비교 연구에서 유용할 수 있다. 전반적으로, 시험된 siRNA 표적 부위의 패널 중, 미처리 대조군의 %에 비해 SNCA mRNA의 강력하고 유효한 침묵화를 산출한 13개를 확인하였다(표 4~6). 아래의 표 7 및 표 8은 SNCA mRNA의 강력하고 유효한 침묵화를 초래한 13개의 siRNA의 안티센스 및 센스 가닥을 언급한다. 안티센스 가닥은 RISC로의 로딩을 향상시키는 5' 우라실을 포함한다. 특정 경우에서, SNCA 표적에서 상응하는 상보적 아데노신이 존재하지 않아 안티센스 가닥과 표적 간에 5' 미스매치를 야기한다. 도 1, 도 2 및 도 4의 데이터에 나타낸 바와 같이, 이는 침묵화 유효성에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 또한, 몇몇 안티센스 가닥은 RISC 로딩을 추가 향상시키기 위해 SNCA 표적과 3' 말단 미스매치를 포함하며, 이것도 침묵화 유효성에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 아래의 표 8은 추가적인 안티센스 및 센스 가닥을 언급한다. 도 4는 3개의 상이한 스캐폴드로 평가된 siRNA 각각에 대해 얻은 결과를 요약한다(다양한 화학적 스캐폴드의 그래픽 도시에 대해서는 도 3 참고): P3 평활 스캐폴드(도 4a), P3 비대칭 스캐폴드(도 4b), 및 2'-O-메틸(OM)e 풍부 비대칭 스캐폴드(도 4c). 표 9는 추가 실시양태에서 언급된 SNCA mRNA 서열을 나열한다. 표 10은 신규 siRNA의 개발 후보인 컴퓨터내 스크리닝에 의해 확인된 SNCA 표적을 나열한다.
Figure pct00073
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Figure pct00096
SNCA mRNA를 침묵화하는 데 효과적인 추가 siRNA를 확인하기 위해 두 번째 시험관내 스크리닝을 수행했다. 스크리닝은 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 스크리닝의 결과를 도 5에 도시한다. 시험된 siRNA는 도 5에 도시된 바와 같이 P3 비대칭 설계였다. 두 번째 스크리닝의 결과로 SNCA mRNA 수준을 40% 미만으로 감소시키는 몇 가지를 포함하여, SNCA mRNA를 효과적으로 침묵화할 수 있는 몇몇 추가 siRNA를 확인했다. 두 번째 스크리닝에서 사용된 SNCA 유전자 및 mRNA 표적 서열, 그리고 siRNA 패널을 아래에서 표 11 및 표 12에 언급한다.
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
실시예 2. 마우스 뇌에서 SNCA 의 생체내 침묵화
생체내 설정에서 siRNA를 시험하기 전에, 선택 SNCA-표적화 siRNA로 또 다른 용량 반응성 곡선을 제조하였다. 부위 SNCA 270, SNCA 753, SNCA 963, 및 SNCA 1094를 표적화하는 SNCA siRNA를 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 8개의 상이한 농도로 시험하고 미처리 대조군 세포와 비교하였다. 세포를 72시간 동안 siRNA와 인큐베이션한 후 SNCA mRNA 수준을 측정하였다(도 6). 몇몇 SNCA-표적화 siRNA는 약 10 내지 11 nM의 IC50 값을 가지며, SNCA mRNA의 강력한 침묵화를 나타내었다.
본원의 결과 및 실시예 1에서 수행된 스크리닝에 기반하여, SNCA 963으로 지정된 SNCA 표적 부위를 마우스 뇌에서 추가 연구를 위해 선택하였다. 뇌실내(ICV) 경로를 통해 투여된 10 μl 부피 중 10 nmol 용량의 siRNA를 마우스에 제공했다. 비교를 위해 미처리 대조군 마우스를 사용하였다(군당 5마리 마우스). 1개월의 인큐베이션 기간 후, 마우스를 희생시키고 SNCA mRNA(도 7a) 및 단백질(도 7b) 수준을 결정하였다. mRNA 수준은 QuantiGene 유전자 발현 검정(ThermoFisher, Waltham, MA)으로 결정하였고 단백질 발현은 Protein Simple 웨스턴 블롯 시스템으로 결정하였다. 이 생체내 연구를 위해 하기 siRNA 화학적 변형 패턴을 이용하였다:
안티센스 가닥, 5'에서 3'으로(21개 뉴클레오티드 길이):
Figure pct00100
센스 가닥, 5'에서 3'으로(16개 뉴클레오티드 길이):
Figure pct00101
"m"은 2'-O-메틸 변형에 해당하고; "f"는 2'-플루오로 변형에 해당하고; "X"는 A, U, G 또는 C의 임의의 뉴클레오티드에 해당하고; "#"은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결에 해당하고; "VP"는 5' 비닐포스포네이트 변형에 해당한다.
상기 언급된 화학적 변형 패턴을 갖는 SNCA 963으로 지정된 표적 부위를 표적화하는 siRNA를 아래에 언급한다:
안티센스 가닥, 5'에서 3'으로(21개 뉴클레오티드 길이):
Figure pct00102
센스 가닥, 5'에서 3'으로(16개 뉴클레오티드 길이):
Figure pct00103
"m"은 2'-O-메틸 변형에 해당하고; "f"는 2'-플루오로 변형에 해당하고; "#"은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결에 해당하고; "VP"는 5' 비닐포스포네이트 변형에 해당한다.
SNCA 963 표적 부위를 표적화하는 siRNA는 전두엽 피질, 내측 피질, 해마, 시상, 선조체, 및 척수를 포함하여 시험된 여러 마우스 중추 신경계 영역에서 강력한 침묵화를 유도한다. mRNA 및 단백질 수준은 미처리 대조군과 비교하여 약 50%보다 상당히 아래였다.
참조로의 포함
본 출원 전체에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용된 참조(문헌 참조, 특허, 특허 출원 및 웹사이트 포함)의 내용은 본원에 인용된 참조와 마찬가지로 모든 목적을 위해 전체가 명시적으로 참조로 포함된다. 본 개시는 달리 표시되지 않는 한, 당분야에 널리 알려진 면역학, 분자 생물학 및 세포 생물학의 통상적인 기술을 이용할 것이다.
본 개시는 또한 분자 생물학 및 약물 전달 분야에서 잘 알려진 기술 전체를 참조로 포함한다. 이러한 기술은 하기 간행물에 기재된 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Atwell et al. J. Mol. Biol. 1997, 270: 26-35;
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균등부
본 개시는 그 사상 또는 본질적인 특성을 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 측면에서 본 개시를 제한하는 것이 아니라 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서 본 개시의 범위는 상기 기재보다는 첨부된 청구범위에 의해 표시되며, 따라서 청구범위의 균등부의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화가 본원에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (185)

  1. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자로서,
    안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는, dsRNA.
  2. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 서열 번호 14~28 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는, dsRNA.
  3. 제1항에 있어서, 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열의 적어도 10, 11, 12 또는 13개의 인접 뉴클레오티드와 상보성을 포함하는 dsRNA.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 3개 이하의 미스매치를 포함하는 dsRNA.
  5. 제1항에 있어서, 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 완전한 상보성을 포함하는 dsRNA.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 약 15개 뉴클레오티드 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 포함하는, dsRNA.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 약 15개 뉴클레오티드 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 포함하는, dsRNA.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 20개 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 21개 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 22개 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 15개 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 16개 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 18개 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 20개 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 15개 염기쌍 내지 20개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함하는 dsRNA.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 15개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함하는 dsRNA.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 16개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함하는 dsRNA.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 18개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함하는 dsRNA.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 20개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함하는 dsRNA.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 평활 말단을 포함하는 dsRNA.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 포함하는 dsRNA.
  22. 제21항에 있어서, 약 2-뉴클레오티드 내지 5-뉴클레오티드 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 포함하는 dsRNA.
  23. 제21항에 있어서, 2-뉴클레오티드 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 포함하는 dsRNA.
  24. 제21항에 있어서, 5-뉴클레오티드 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 포함하는 dsRNA.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 자연 발생 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA.
  27. 제26항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기, 또는 이의 혼합물을 포함하는, dsRNA.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNA.
  29. 제28항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는, dsRNA.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 4~16개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNA.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 8~13개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNA.
  32. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 화학식 I의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNA:
    [화학식 I]
    Figure pct00104

    [식 중,
    B는 염기쌍 형성 모이어티이고;
    W는 O, OCH2, OCH, CH2, 및 CH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    X는 할로, 하이드록시, 및 C1-6 알콕시로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    Y는 O-, OH, OR, NH-, NH2, S-, 및 SH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    Z는 O 및 CH2로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    R은 보호기이고;
    Figure pct00105
    는 선택적 이중 결합임].
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 80%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 완전히 화학적으로 변형된 dsRNA.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함하는 dsRNA.
  36. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 적어도 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함하는, dsRNA.
  37. 제36항에 있어서, 안티센스 가닥이 약 70% 내지 90%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함하는, dsRNA.
  38. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 적어도 65%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함하는, dsRNA.
  39. 제38항에 있어서, 센스 가닥이 100%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함하는, dsRNA.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 안티센스 가닥 및 센스 가닥 간에 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치를 포함하는, dsRNA.
  41. 제40항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치가 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 및 12에 존재하는, dsRNA.
  42. 제40항에 있어서, 뉴클레오티드 미스매치가 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 및 12에 존재하는, dsRNA.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 5' 포스페이트, 5'-알킬 포스포네이트, 5' 알킬렌 포스포네이트, 또는 5' 알케닐 포스포네이트를 포함하는, dsRNA.
  44. 제43항에 있어서, 안티센스 가닥이 5' 비닐 포스포네이트를 포함하는, dsRNA.
  45. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, dsRNA:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 교대하는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오티드를 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 교대하는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오티드를 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  46. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, dsRNA:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 70%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 적어도 70%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  47. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, dsRNA:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 85%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  48. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, dsRNA:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 4, 5, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  49. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, dsRNA:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 4, 5, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  50. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, dsRNA:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥이 적어도 65%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 9, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  51. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, dsRNA:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 안티센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결된, dsRNA.
  53. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결된, dsRNA.
  54. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 센스 가닥의 3' 말단에 연결된, dsRNA.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 소수성 모이어티를 포함하는, dsRNA.
  56. 제55항에 있어서, 소수성 모이어티가 지방산, 스테로이드, 세코스테로이드, 지질, 갱글리오시드, 뉴클레오시드 유사체, 엔도칸나비노이드, 비타민 및 이의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는, dsRNA.
  57. 제56항에 있어서, 스테로이드가 콜레스테롤 및 리토콜산(LCA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, dsRNA.
  58. 제56항에 있어서, 지방산이 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 및 베헨산(DCA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, dsRNA.
  59. 제56항에 있어서, 비타민이 콜린, 비타민 A, 비타민 E, 및 이의 유도체 또는 대사물로 구성되는 군으로부터 선택되는, dsRNA.
  60. 제59항에 있어서, 비타민이 레티노산 및 알파-토코페릴 숙시네이트로 구성되는 군으로부터 선택되는, dsRNA.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 링커에 의해 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥에 연결되는, dsRNA.
  62. 제61항에 있어서, 링커가 2가 또는 3가 링커를 포함하는, dsRNA.
  63. 제62항에 있어서, 2가 또는 3가 링커가 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는, dsRNA:
    Figure pct00106

    Figure pct00107
    ; 및
    Figure pct00108

    [식 중, n은 1, 2, 3, 4 또는 5임].
  64. 제61항 또는 제62항에 있어서, 링커가 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 아미드, 카바메이트, 또는 이의 조합을 포함하는, dsRNA.
  65. 제62항 또는 제63항에 있어서, 링커가 3가 링커인 경우, 링커가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유도체를 추가로 연결하는, dsRNA.
  66. 제65항에 있어서, 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유도체가 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는, dsRNA:
    [화학식 Zc1]
    Figure pct00109
    ;
    [화학식 Zc2]
    Figure pct00110
    ;
    [화학식 Zc3]
    Figure pct00111
    ; 및
    [화학식 Zc4]
    Figure pct00112

    [식 중, X는 O, S 또는 BH3임].
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드, 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접한 리보뉴클레오티드에 연결되는, dsRNA.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 dsRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 유기체에서 시누클레인(SNCA) 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학 조성물.
  69. 제68항에 있어서, dsRNA가 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 50% 억제하는, 약학 조성물.
  70. 제68항에 있어서, dsRNA가 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 80% 억제하는, 약학 조성물.
  71. 다음 단계를 포함하는, 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)을 세포에 도입하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 생산된 세포를 SNCA 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 얻기 충분한 시간 동안 유지하여 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 단계.
  72. 변성 질병의 치료를 필요로 하는 환자에 치료 유효량의 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 상기 dsRNA를 투여하는 단계를 포함하는, 신경변성 질병을 치료 또는 관리하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 dsRNA가 환자의 뇌에 투여되는, 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 dsRNA가 뇌실내(ICV) 주사, 선조체내(IS) 주사, 정맥내(IV) 주사, 피하(SQ) 주사 또는 이의 조합에 의해 투여되는, 방법.
  75. 제72항에 있어서, dsRNA의 투여가 해마, 선조체, 피질, 소뇌, 시상, 시상하부 및 척수 중 하나 이상에서 SNCA 유전자 mRNA의 감소를 유발하는 방법.
  76. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 50% 억제하는, 방법.
  77. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 80% 억제하는, 방법.
  78. 서열 번호 1~13의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 dsRNA 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 벡터.
  79. 제78항에 있어서, 상기 RNA 분자가 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 30% 억제하는, 벡터.
  80. 제78항에 있어서, 상기 RNA 분자가 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 50% 억제하는, 벡터.
  81. 제78항에 있어서, 상기 RNA 분자가 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 80% 억제하는, 벡터.
  82. 제78항에 있어서, dsRNA가 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥이 서열 번호 1~13의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는, 벡터.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  84. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터 및 AAV 캡시드를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV).
  85. 서로 공유 결합된 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 dsRNA 분자 중 2개 이상을 포함하는 분지형 RNA 화합물.
  86. 제85항에 있어서, dsRNA 분자가 링커, 스페이서 또는 분기점을 통해 서로 공유 결합된, 분지형 RNA 화합물.
  87. 분지형 RNA 화합물로서, 다음:
    15 내지 35개 뉴클레오티드 길이를 포함하는 2개 이상의 RNA 분자, 및
    SNCA mRNA와 실질적으로 상보적인 서열
    을 포함하며, 2개의 RNA 분자는 링커, 스페이서 및 분기점으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 모이어티에 의해 서로 연결되는, 분지형 RNA 화합물.
  88. 제87항에 있어서, 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 분지형 RNA 화합물.
  89. 제87항에 있어서, 서열 번호 14~28 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열 중 하나 이상과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 분지형 RNA 화합물.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 분자가 ssRNA 및 dsRNA 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 분자가 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 RNA 분자가 15 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  93. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 RNA 분자가 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 dsRNA를 포함하고, 각각의 안티센스 가닥이 독립적으로 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  94. 제93항에 있어서, 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열의 적어도 10, 11, 12 또는 13개의 인접 뉴클레오티드와 상보성을 포함하는 분지형 RNA 화합물.
  95. 제93항에 있어서, 각각의 RNA 분자가 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 3개 이하의 미스매치를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  96. 제93항에 있어서, 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 완전 상보성을 포함하는 분지형 RNA 화합물.
  97. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 서열 번호 29~43 중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 부분을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  98. 제93항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥이 약 15개 뉴클레오티드 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  99. 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 20개 뉴클레오티드 길이인, 분지형 RNA 화합물.
  100. 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 21개 뉴클레오티드 길이인, 분지형 RNA 화합물.
  101. 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 22개 뉴클레오티드 길이인, 분지형 RNA 화합물.
  102. 제93항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 15개 뉴클레오티드 길이인, 분지형 RNA 화합물.
  103. 제93항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 16개 뉴클레오티드 길이인, 분지형 RNA 화합물.
  104. 제93항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 18개 뉴클레오티드 길이인, 분지형 RNA 화합물.
  105. 제93항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 20개 뉴클레오티드 길이인, 분지형 RNA 화합물.
  106. 제90항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 15개 염기쌍 내지 20개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  107. 제90항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 15개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  108. 제90항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 16개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  109. 제90항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 18개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  110. 제90항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 20개 염기쌍의 이중 가닥 영역을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  111. 제90항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 평활 말단을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  112. 제90항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 적어도 하나의 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  113. 제90항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 2-뉴클레오티드 내지 5-뉴클레오티드 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  114. 제90항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 자연 발생 뉴클레오티드를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  115. 제90항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  116. 제115항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  117. 제90항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  118. 제117항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  119. 제90항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 4~16개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  120. 제90항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 8 내지 13개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  121. 제90항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA가 적어도 하나의 화학식 I의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는, 분지형 RNA 화합물:
    [화학식 I]
    Figure pct00113

    [식 중,
    B는 염기쌍 형성 모이어티이고;
    W는 O, OCH2, OCH, CH2, 및 CH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    X는 할로, 하이드록시, 및 C1-6 알콕시로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    Y는 O-, OH, OR, NH-, NH2, S-, 및 SH로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    Z는 O 및 CH2로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    R은 보호기이고;
    Figure pct00114
    는 선택적 이중 결합임].
  122. 제90항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA가 적어도 80%의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  123. 제90항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA가 완전히 화학적으로 변형된, 분지형 RNA 화합물.
  124. 제90항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA가 적어도 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  125. 제90항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 적어도 70%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  126. 제125항에 있어서, 안티센스 가닥이 약 70% 내지 90%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  127. 제90항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 적어도 65%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  128. 제127항에 있어서, 센스 가닥이 100%의 2'-O-메틸 뉴클레오티드 변형을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  129. 제93항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 안티센스 가닥 및 센스 가닥 간에 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  130. 제129항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치가 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 및 12에 존재하는, 분지형 RNA 화합물.
  131. 제129항에 있어서, 뉴클레오티드 미스매치가 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6 및 12에 존재하는, 분지형 RNA 화합물.
  132. 제93항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 5' 포스페이트, 5'-알킬 포스포네이트, 5' 알킬렌 포스포네이트, 5' 알케닐 포스포네이트, 또는 이의 혼합물을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  133. 제121329항에 있어서, 안티센스 가닥이 5' 비닐 포스포네이트를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  134. 제90항에 있어서, dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, 분지형 RNA 화합물:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 교대하는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오티드를 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 교대하는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오티드를 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  135. 제90항에 있어서, dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, 분지형 RNA 화합물:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 70%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 적어도 70%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  136. 제90항에 있어서, dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, 분지형 RNA 화합물:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 85%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  137. 제90항에 있어서, dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, 분지형 RNA 화합물:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 4, 5, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  138. 제90항에 있어서, dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, 분지형 RNA 화합물:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 4, 5, 6 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 100%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  139. 제90항에 있어서, dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, 분지형 RNA 화합물:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥이 적어도 65%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 9, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  140. 제90항에 있어서, dsRNA가 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 다음과 같은, 분지형 RNA 화합물:
    (1) 안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    (2) 안티센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (3) 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (4) 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-2 내지 1-7의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결되고;
    (5) 안티센스 가닥의 일부는 센스 가닥의 일부와 상보적이며;
    (6) 센스 가닥은 적어도 75%의 2'-O-메틸 변형을 포함하고;
    (7) 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 7, 10 및 11의 뉴클레오티드는 2'-메톡시-리보뉴클레오티드가 아니고;
    (8) 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-2의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로 연결됨.
  141. 제93항 내지 제 140항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 안티센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결되는, 분지형 RNA 화합물.
  142. 제93항 내지 제 140항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결되는, 분지형 RNA 화합물.
  143. 제93항 내지 제 140항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 센스 가닥의 3' 말단에 연결되는, 분지형 RNA 화합물.
  144. 제141항 내지 제 143항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 소수성 모이어티를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  145. 제144항에 있어서, 소수성 모이어티가 지방산, 스테로이드, 세코스테로이드, 지질, 갱글리오시드, 뉴클레오시드 유사체, 엔도칸나비노이드, 비타민 및 이의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는, 분지형 RNA 화합물.
  146. 제145항에 있어서, 스테로이드가 콜레스테롤 및 리토콜산(LCA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 분지형 RNA 화합물.
  147. 제145항에 있어서, 지방산이 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 및 베헨산(DCA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 분지형 RNA 화합물.
  148. 제145항에 있어서, 비타민이 콜린, 비타민 A, 비타민 E, 이의 유도체, 및 이의 대사물로 구성되는 군으로부터 선택되는, 분지형 RNA 화합물.
  149. 제145항에 있어서, 비타민이 레티노산 및 알파-토코페릴 숙시네이트로 구성되는 군으로부터 선택되는, 분지형 RNA 화합물.
  150. 제141항 내지 제 149항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 링커에 의해 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥에 연결되는, 분지형 RNA 화합물.
  151. 제150항에 있어서, 링커가 2가 또는 3가 링커를 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  152. 제151항에 있어서, 2가 또는 3가 링커가 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 분지형 RNA 화합물:
    Figure pct00115

    Figure pct00116
    및
    Figure pct00117

    [식 중, n은 1, 2, 3, 4 또는 5임]
  153. 제150항 또는 제152항에 있어서, 링커가 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 아미드, 카바메이트, 또는 이의 조합을 포함하는, 분지형 RNA 화합물.
  154. 제151항에 있어서, 링커가 3가 링커인 경우, 링커는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유도체를 추가로 연결하는, 분지형 RNA 화합물.
  155. 제151항에 있어서, 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르 유도체가 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 분지형 RNA 화합물:
    [화학식 Zc1]
    Figure pct00118
    ;
    [화학식 Zc2]
    Figure pct00119
    ;
    [화학식 Zc3]
    Figure pct00120
    ; 및
    [화학식 Zc4]
    Figure pct00121
    ;
    [식 중, X는 O, S 또는 BH3임].
  156. 제93항 내지 제 155항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드, 및 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접한 리보뉴클레오티드에 연결되는, 분지형 RNA 화합물.
  157. 화학식 I의 화합물:
    [화학식 I]
    Figure pct00122

    [식 중,
    L은 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸 또는 이의 조합을 포함하며, 화학식 I은 선택적으로 하나 이상의 분기점 B, 및 하나 이상의 스페이서 S를 추가로 포함하고,
    B는 각각의 경우에 독립적으로 다가 유기 종 또는 이의 유도체이고;
    S는 각각의 경우에 독립적으로 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸 또는 이의 조합을 포함하고;
    N은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 15 내지 35개 염기 길이를 포함하는 이중 가닥 핵산이고;
    안티센스 가닥은 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고;
    센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 하나 이상의 화학적 변형을 포함하고;
    n은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임].
  158. 제157항에 있어서, 화학식 I-1 내지 I-9로부터 선택되는 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00123
    .
  159. 제157항에 있어서, 안티센스 가닥이 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 5' 말단기 R을 포함하는, 화합물:
    Figure pct00124

    Figure pct00125
    및
    Figure pct00126
  160. 제157항에 있어서, 화학식 II의 구조를 갖는 화합물:
    [화학식 II]
    Figure pct00127

    [식 중,
    X는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고;
    Y는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고;
    -는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 나타내고;
    =는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 나타내고;
    ---는 각각의 경우에 개별적으로 염기쌍 형성 상호작용 또는 미스매치를 나타냄].
  161. 제157항에 있어서, 화학식 IV의 구조를 갖는 화합물:
    [화학식 IV]
    Figure pct00128

    [식 중,
    X는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고;
    Y는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고;
    -는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 나타내고;
    =는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 나타내고;
    ---는 각각의 경우에 개별적으로 염기쌍 형성 상호작용 또는 미스매치를 나타냄].
  162. 제157항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, L이 구조 L1인, 화합물:
    [화학식 L1]
    Figure pct00129
    .
  163. 제162항에 있어서, R이 R3이고 n이 2인, 화합물.
  164. 제157항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, L이 구조 L2인, 화합물:
    [화학식 L2]
    Figure pct00130
    .
  165. 제164항에 있어서, R이 R3이고 n이 2인, 화합물.
  166. 화학식 VI의 구조를 갖는 치료용 핵산을 위한 전달 시스템:
    [화학식 VI]
    Figure pct00131

    [식 중,
    L은 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸 또는 이의 조합을 포함하며, 화학식 VI는 선택적으로 하나 이상의 분기점 B, 및 하나 이상의 스페이서 S를 추가로 포함하고;
    B는 각각의 경우에 독립적으로 다가 유기 종 또는 이의 유도체를 포함하고;
    S는 각각의 경우에 독립적으로 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸, 또는 이의 조합을 포함하고;
    각각의 cNA는 독립적으로 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 담체 핵산이고;
    각각의 cNA는 독립적으로 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산의 적어도 15개 인접 뉴클레오티드를 포함하고;
    n은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임].
  167. 제166항에 있어서, 화학식 VI-1 내지 VI-9로부터 선택되는 구조를 갖는 전달 시스템:
    Figure pct00132
    .
  168. 제166항에 있어서, 각각의 cNA가 독립적으로 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 전달 시스템.
  169. 제166항에 있어서, n개의 치료용 핵산(NA)을 추가로 포함하고, 각각의 NA는 적어도 하나의 cNA에 혼성화되는, 전달 시스템.
  170. 제169항에 있어서, 각각의 NA가 독립적으로 적어도 16개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는, 전달 시스템.
  171. 제170항에 있어서, 각각의 NA가 독립적으로 16~20개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는, 전달 시스템.
  172. 제169항에 있어서, 각각의 NA가 적어도 2개의 뉴클레오티드의 쌍을 이루지 않은 오버행을 포함하는, 전달 시스템.
  173. 제172항에 있어서, 오버행의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되는, 전달 시스템.
  174. 제169항에 있어서, 각각의 NA가 독립적으로 DNA, siRNA, antagomiR, miRNA, 갭머, 믹스머 및 가이드 RNA로 구성되는 군으로부터 선택되는, 전달 시스템.
  175. 제169항에 있어서, 각각의 NA가 서열 번호 1~13 중 어느 하나의 SNCA 핵산 서열과 실질적으로 상보적인, 전달 시스템.
  176. 제85항 내지 제165항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제166항 내지 제175항 중 어느 한 항의 시스템, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 유기체에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학 조성물.
  177. 제176항에 있어서, 화합물 또는 시스템이 SNCA 유전자의 발현을 적어도 50% 억제하는, 약학 조성물.
  178. 제176항에 있어서, 화합물 또는 시스템이 SNCA 유전자의 발현을 적어도 80% 억제하는, 약학 조성물.
  179. 다음 단계를 포함하는, 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 방법:
    (a) 제85항 내지 제165항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제166항 내지 제175항 중 어느 한 항의 시스템을 세포에 도입하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 생산된 세포를 SNCA 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 얻기 충분한 시간 동안 유지하여 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 단계.
  180. 신경변성 질병의 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에 치료 유효량의 제85항 내지 제165항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제166항 내지 제175항 중 어느 한 항의 시스템을 투여하는 단계를 포함하는, 신경변성 질병을 치료 또는 관리하는 방법.
  181. 제180항에 있어서, 상기 dsRNA가 환자의 뇌에 투여되는, 방법.
  182. 제180항에 있어서, 상기 dsRNA가 뇌실내(ICV) 주사, 선조체내(IS) 주사, 정맥내(IV) 주사, 피하(SQ) 주사, 또는 이의 조합에 의해 투여되는, 방법.
  183. 제180항에 있어서, dsRNA의 투여가 해마, 선조체, 피질, 소뇌, 시상, 시상하부, 및 척수 중 하나 이상에서 SNCA 유전자 mRNA의 감소를 유발하는, 방법.
  184. 제179항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 50% 억제하는, 방법.
  185. 제179항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA가 상기 SNCA 유전자의 발현을 적어도 80% 억제하는, 방법.
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