BRPI0711586A2 - método para tratamento de infecção por hiv em um indivìduo, método para imagem latente detectar ou diagnosticar a infecção por hiv em um indivìduo, composição - Google Patents

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David M Goldenberg
Chien Hsing Chang
Edmund A Rossi
William J Mcbride
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Immunonomedics Inc
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Abstract

MéTODO PARA TRATAMENTO DE INFECçãO POR HIV EM UM INDIVìDUO, MéTODO PARA IMAGEM LATENTE DETECTAR OU DIAGNOSTICAR A INFECçãO POR HIV EM UM INDIVìDUO, COMPOSIçãO. A presente invenção refere-se a métodos e composições para tratamenro de infecção por HIV em um indivíduo. As composições podem compreender uma molécula alvo contra um anrigeno HIV, tal como um anticorpo anti-HIV ou fragmento de anricorpo. O anticorpo anti-HIV ou fragmento pode ser conjugado para uma variedade de agentes citotóxicos, tal como doxorrubrc±n. Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou fragmento é P4/D1O. Outras modalidades podem dizer respeito a métodos de imagem, detecção ou diagnóstico de infecção por HIV em um indivíduo usando um anticorpo anti-HIV ou fragmento conjugado para um agente diagnóstico. Em modalidades alternativas, um anticorpo biespecífico com pelo menos um local de aglutinação para um antígeno HIV e pelo menos um local de aglutinação para uma molécula veículo poder ser administrado, opcionalmente seguido por uma agente clareador, seguido por administração de uma molécula veículo conjugada para um agente terapêutico.

Description

MÉTODO PARA TRATAMENTO DE INFECÇAO POR HIV EM UM INDIVÍDUO, MÉTODO PARA IMAGEM LATENTE DETECTAR OU DIAGNOSTICAR A INFECÇÃO POR HIV EM UM INDIVÍDUO, COMPOSIÇÃO
FUNDAMENTOS
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a métodos e composições para tratar e nas modalidades preferidas eliminar o virus de imunodeficiência humana (HIV) em indivíduos infectados. Em modalidades particulares, as composições e os métodos referem-se a moléculas alvo, tais como anticorpos ou fragmentos de anticorpos contra antígenos HIV, por exemplo, contra antígeno de envelope HIV. Em modalidades mais particulares, os anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser conjugados a um ou mais agentes, tais como agentes terapêuticos, agentes de diagnósticos, agentes virostáticos e/ou agentes citotóxicos, incluindo mas não limitados a agentes quimioterapêuticos, tal como doxorrubicin. Em modalidades alternativas, os anticorpos biespecificos ou multiespecíficos ou fragmentos dos mesmos podem ser usados, com um ou mais locais de aglutinação direcionados para antígenos HIV e um ou mais locais de aglutinação com afinidade para uma molécula veículo a que agentes citotóxicos, virostáticos ou outros terapêuticos e/ou de diagnósticos podem ser unidos.
Descrição da Técnica Anterior
Apesar dos avanços de incentivo no tratamento do vírus de imunodeficiência humana 1 (HIV-I) · com terapia anti- retroviral (ART), análises do sangue periférico e nódulos linfáticos documentaram a presença de reservatórios persistentes de células T restantes que abrigam o provírus latente que pode ativar espontaneamente mesmo anos após o término da terapia (Berger et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:11511-11513; Blankson et al., Annu Ver Med 2002, 53:557-593).
Os anticorpos de ligação e neutralização podem impedir fixação do vírus livre ao receptor celular, eles podem se ligar à superfície viral, e podem induzir virólise mediada por complemento de virions livres (Parren et al., AIDS 1999, 13 [Suppl A]: S137-162). Os anticorpos podem igualmente mediar a matança de células infectadas por citotoxidade celular anticorpo-dependente (ADCC), acoplando células-NK às células de alvo infectadas (Broliden et al., J Virol 1990, 64:936-940). Entretanto, o uso de anticorpos antivirais sozinho como parte de uma imunoterapia dos pacientes infectados com HIV não cumpriu sua promessa inicial (Hinkula et al., J Acquir Immune Defic Syndr 1994, 7:940-951; Trkola et al., Nat Med 2005, 11: 615-622).
As tentativas foram feitas para usar vários componentes virais ou celulares como alvos para a entrega do anticorpo de agentes terapêuticos às células infectadas HIV (Davey et al., J Infect Dis 1994, 170:1180-1188; Pincus et al., J Immunol 2003, 170:2236-2241; Ramachandran et al., J Infect Dis 1994, 170:1009-1013; Saavedra-Lozano et al., Proc Natl Aead Sci USA 2004, 101: 2494-2499). As imunotoxinas similares comprovaram a promessa nos pacientes que sofrem de cânncer (Wu e Senter, Nat Bioteehnol 2005, 23:1137-1146). Entretanto, uma necessidade existe para métodos mais eficazes e composições para tratamento de células infectadas HIV.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção cumpre uma necessidade não resolvida na técnica fornecendo métodos e composições para inibir, suprimir, detectar, identificar, localizar e/ou eliminar células infectadas HIV. Em determinadas modalidades, as composições e/ou os métodos podem referir-se a moléculas alvo contra os antígenos HIV. Tais moléculas alvo podem incluir, mas não ser limitadas a, peptídeos, anticorpos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos humanos ou fragmentos de quaisquer anticorpos, e/ou de análogos de anticorpo. Em determinadas modalidades, as moléculas alvo podem ser não conjugadas, por exemplo, anticorpos "nús" ou fragmentos de anticorpos. Em outras modalidades, as moléculas alvo podem ser conjugadas a um ou mais agentes terapêuticos e/ou de diagnósticos. Tais agentes podem incluir, mas não ser limitados a, uma droga, pró-droga, agente virostático, toxina, enzima, oligonucleotideo, radioisótopo, radionuclideo, imunomodulador, citocina, etiqueta, etiqueta fluorescente, etiqueta luminescente, etiqueta paramagnética, etiqueta de MRI, micela, lipossoma, nanoparticula, ou combinação do mesmo. Em modalidades particulares, os anticorpos anti-HIV conjugados ou fragmentos podem ser administrados in vivo aos pacientes com uma infecção por HIV conhecida ou suspeitada. Tal administração pode bloquear ou impedir infecção de células de pacientes com HIV, pode reduzir ou eliminar células infectadas HIV no paciente, e/ou pode reduzir ou eliminar focos residuais de células infectadas HIV nos pacientes tratados previamente e/ou simultaneamente com outras terapias anti-retrovirais conhecidas.
Outras modalidades referem-se a métodos e/ou composições tratar assuntos, tais como os assuntos infectados com HIV, SIV, outros retrovirus. Os assuntos podem incluir, mas não são limitados a, seres humanos, animais, gatos, cães, vacas, carneiros, cabras, cavalos, e mamíferos. Os métodos e as composições podem compreender umas ou mais moléculas alvo conjugadas ou nuas a ser administradas a um indivíduo. Em modalidades preferidas, as moléculas alvo são anticorpos ou fragmentos de anticorpos, incluindo qualquer variação de anticorpos ou fragmentos quiméricos, humanizados ou humanos. A administração pode ser por qualquer rota conhecida na técnica, tal como oral, nasal, bucal, inalacional, retal, 30 pela injeção ortotópica, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intra-arterial, intratecal ou intravenosa.
O versado na técnica realizará que uma ou mais moléculas alvo HIV, seja conjugadas ou não conjugadas, podem ser administradas sozinho ou alternativamente em conjunto com outros tratamentos terapêuticos conhecidos para a infecção por HIV, tal como azidotimidina, outros inibidores de transcriptase reversa nucleosideo/nucleotideo, inibidores de transcriptase reversa não-nucleosideo, inibidores protease HIV e/ou inibidores de fusão. Em determinadas modalidades, moléculas alvo HIV conjugadas podem ser usadas em combinação com HAART (terapia anti-retroviral altamente ativa). Muitos agentes terapêuticos anti-HIV são conhecidos na técnica e qualquer agente conhecido pode ser usado, incluindo mas não limitado a efavirenz, zidovudine, tenofovir, lamivudine, emtricitabine, didanosine, abacavir, stavudine, nevirapine, lopinavir, ritonavir, atazanavir, fosamprenavir, indinavir, nelfmavir, saquinavir, sozinho ou em qualquer combinação.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-HIV ou fragmentos podem ser administrados como parte de um complexo de cinticorpo biespecifico ou multiespecifico, com pelo menos um local de aglutinação para o antígeno HIV e um segundo local de aglutinação para um segundo alvo, tal como uma molécula veiculo ou hapteno. Em outras modalidades, os anticorpos anti-HIV ou fragmentos podem ser covalentemente unidos a ou fornecidos como uma proteína de fusão com um anticorpo, fragmento do anticorpo, anticorpo monoclonal, fragmento de Fc, proteína de ligação Fc ou proteína de ligação de anticorpo.
Em várias modalidades, os anticorpos anti-HIV ou fragmentos podem ser covalentemente ou não covalentemente unidos às várias porções por métodos bem conhecidos na técnica, tal como o uso de reagentes reticulados covalentes. Muitos de tais agentes, tais como carbodiimidas, bisimidatos, éster N-hidroxissuccinimida de ácido subérico, dimetil-3,3'- ditio-bispropionimidato, azidoglioxal, 1, 5-diflúor-2,4- (dinitrobenzeno) e outros reticuladores de uso para proteínas e/ou peptídeos são conhecidos e podem ser usados.
Em outras modalidades, os anticorpos anti-HIV ou fragmentos podem ser usados como adjuntos para finalidades de diagnóstico e/ou imagem. Por exemplo, os anticorpos anti-HIV ou fragmentos podem ser alvejados com qualquer agente de contraste ou de deteção conhecido ou podem ser detectados usando quaisquer metodologias conhecidas, tais como ELISA, etc. Os anticorpos anti-HIV ou fragmentos podem ser usados ex vivo, por exemplo, pela imunohistoquímica de seções do tecido, para detectar a infecção por HIV residual. Alternativamente, os anticorpos anti-HIV ou fragmentos podem ser administrados a um indivíduo para deteção in vivo dos tecidos infectados com HIV. Tais composições e métodos podem ser usados para detectar e/ou diagnosticar a presença de infecção por HIV, para monitorar para a infecção por HIV residual após a terapia, e/ou para monitorar a eficácia da terapia anti-HIV.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Os seguintes desenhos fazem parte do presente relatório e são incluídos para demonstrar ainda determinados aspectos de modalidades particulares da invenção. As modalidades podem ser melhor compreendidas por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada apresentada aqui.
FIG. IA. Neutralização HIV-I1I1b da infecção por HIV in vitro. As capacidades de neutralização das imunoglobulinas foram testadas por concentrações diferentes de incubação das imunoglobulinas com HIV-Iiiib e então a análise da infecção viral de células T Jurkat suscetíveis de HIV. Ambos 10 yg/ml doxorrubicin-P4 /DlO e HIV-Iiiib neutralizado P4/D10 não rotulado significativamente melhor do que os soros negativos de HIV (p=0.001).
FIG. IB. Inibição HIV-I1I1b de propagação intercelular da infecção por HIV in vitro. Para testar se as imunoglobulinas poderiam limitar a propagação intercelular de células T Jurkat da infecção de HIV-I foram misturadas nas proporções 0.2%, 1%, 3%, e 5% de células infectadas e 99.8%, 99%, 97%, e 95% de células não infectadas. A produção de HIV-I p24 após tratar 3% de células T Jurkat infectadas com HIV-Iiiib e 97% de células não infectadas com concentrações diferentes de imunoglobulinas é mostrada. Os resultados são mostrados como a inibição da porcentagem de produção p24 após 7 dias na cultura. Doxorrubicin-P4/DlO teve um efeito de inibição significativamente melhor na produção de HIV-I p24 comparado a P4/D10 não rotulado, doxorrubicin-LLl de anticorpo de controle, doxorrubicin livre e soro negativo HIV em uma concentração de 0.5 ou 0.05 pg/ml (p=0.002).
FIG. 2. Proteção contra infecção de HIV-l/MuLV in vivo. Os ratos (6-12/grupo) foram desafiados i.p. com esplenócitos infectados HIV-l/MuLV do e tratados imediatamente com os anticorpos monoclonais (Mab) ou doxorrubicin livre. P4/D10 Mab não conjugado foi titulado com 100-800 μg por camundongo, 100-400 yg de doxorrubicin livre e doxorrubicin-hRS7 irrelevante de 100-200 yg. Todos os tratamentos restantes foram dados em 100 μg por camundongo. Dez dias após o desafio, as células peritoneais foram coletadas e misturadas com células T Jurkat suscetíveis de HIV. A produção de HIV p24 nestas culturas de célula foi medida a cada 3-4 dias por 18 dias. A porcentagem do rato com uma cultura de célula positiva p24 após o tratamento com 100 yg de Mab ou doxorrubicin livre é mostrada. Somente as células de ratos tratados com 100 yg de doxorrubicin-P4/D10 continham nenhum HIV infeccioso, que era significativamente diferente (p=0.0001) de todos os grupos restantes.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS
Todos os documentos, ou partes dos documentos, mencionados neste pedido, incluindo mas não limitados às patentes, pedidos de patente, artigos, livros, e tratados, são por meio deste expressamente incorporados por referência em sua totalidade.
Definições
Como usado aqui, "um" ou "uma" pode significar um ou mais do que um de um artigo.
Como usado aqui, os termos "e" e "ou" podem ser usados para significar conjuntivo ou disjuntivo. Isto é, ambos os termos devem ser compreendidos como equivalente a "e/ou" a menos que indicado de outra maneira. Como usado aqui, "cerca de" significa dentro de mais ou menos dez por cento de um número. Por exemplo, "cerca de 100" deve significar qualquer número entre 90 e 110.
Um "anticorpo", como descrito aqui, refere-se a uma molécula de imunoglobulina completa (isto é, de ocorrência natural ou formada por processos recombinatoriais de fragmento de gene de imunoglobulina normal) (por exemplo, um anticorpo de IgG) ou uma porção ou análogo de uma molécula de imunoglobulina imunologicamente ativa (isto é, especificamente de ligação), como um fragmento de anticorpo.
Um "fragmento de anticorpo" é uma porção de um anticorpo tal como F(ab)2, F(ab')2, Fab, Fv, sFv, e semelhante. Não obstante da estrutura, um fragmento do anticorpo se liga com o mesmo antigeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. O termo "fragmento do anticorpo" igualmente inclui qualquer proteína sintética ou geneticamente projetada que atua como um anticorpo ligado a um antigeno específico para formar um complexo. Por exemplo, os fragmentos do anticorpo incluem fragmentos isolados que consistem nas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, moléculas de polipeptídeos de cadeia única recombinante em que regiões variáveis pesadas e leves são conectadas por um ligante de peptídeo ("proteínas scFv"), e unidades de reconhecimento mínimas (CDR) que consistem nos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável.
Um "agente terapêutico" é um átomo, molécula, ou composto que seja útil no tratamento de uma doença. Os exemplos de agentes terapêuticos incluem anticorpos, fragmentos de anticorpos, drogas, agentes virostáticos, toxinas, enzimas, nucleases, hormônios, imunomoduladores, oligonucleotídeos de anti-sentido, RNA de interferência pequeno (siRNA), queladores, compostos de boro, agentes fotoativos, corantes, e radioisótopos. Outros agentes e métodos terapêuticos exemplares de uso são descritos nas Publicações do Pedido de Patente US números 20050002945, 20040018557, 20030148409 e 20050014207, cada uma incorporada aqui por referência. Um "anticorpo de neutralização" ou "fragmento de anticorpo de neutralização" é usado aqui para referir-se a um anticorpo ou fragmento que reaja com um agente infeccioso (tal como, um virus) e destrua ou iniba suas infectividades e/ou virulência.
Um "agente de diagnóstico" é um átomo, molécula, ou composto que seja útil em diagnosticar uma doença. Os agentes de diagnósticos úteis incluem, mas não são limitados a, radioisótopos, corantes (tal como com o complexo de biotin- streptavidin), agentes de contraste, compostos ou moléculas fluorescentes, e agentes de intensificação (por exemplo, ions paramagnéticos) para imagem de ressonância magnética (MRI).
Um "imunoconjugado" é um conjugado de uma molécula de ligação (por exemplo, um componente de anticorpo) com um átomo, molécula, ou uma estrutura de ordem maior (por exemplo, com um veiculo, um agente terapêutico, ou um agente de diagnóstico).
Um "anticorpo nu" é um anticorpo que não seja conjugado a qualquer outro agente.
Um "veiculo" é um átomo, molécula, ou estrutura de maior ordem que é capaz de se associar com um agente terapêutico ou de diagnóstico para facilitar a entrega de tal agente a uma célula alvejada. Os veículos podem incluir lipideos (por exemplo, lipideos anfifílicos que são capazes de formar estruturas de maior ordem), polissacarídeos (tal como, dextrano), proteínas, peptídeos, análogos de peptídeos, derivados de peptídeo ou outras estruturas de maior ordem, tais como micelas, lipossomas, ou nanopartículas. Em determinadas modalidades, um veículo pode ser projetado para ser resistente à degradação proteolítica ou outra enzimática, por exemplo, substituindo D-amínoácidos para L-aminoácidos de ocorrência natural em uma proteína ou peptídeo.
Como usado aqui, o termo "proteína de fusão de anticorpo" refere-se a uma molécula de ligação de antígeno produzida recombinantemente em que dois ou mais dos mesmos ou diferentes fragmentos de anticorpo ou scFv com as mesmas ou diferentes especificidades são ligados. A valência da proteína de fusão indica como muitos braços de ligação ou locais a proteína de fusão tem para um único antígeno ou epítopo; isto é, monovalente, bivalente, trivalente ou multivalente. A multivalência da proteína de fusão do anticorpo significa que a mesma pode se aproveitar de interações múltiplas na ligação a um antígeno, assim aumentando a avidez da ligação ao antígeno. A especificidade indica quantos antígenos ou epítopos uma proteína de fusão de anticorpo pode ligar; isto é, monoespecífica, biespecífica, triespecífica, multiespecífica. Usando estas definições, um anticorpo natural, por exemplo, um IgG, é bivalente porque tem dois braços de ligação mas é monoespecífico porque se liga a um epítopo. As proteínas de fusão monoespecíficas, multivalentes têm mais de um local de aglutinação para um epítopo mas somente se liga a um tal epítopo, por exemplo, um diabody com dois locais de aglutinação reativos com o mesmo antígeno. A proteína de fusão pode compreender um único componente de anticorpo, uma combinação multivalente ou multiespecífica de componentes diferentes de anticorpo, ou cópias múltiplas do mesmo componente de anticorpo. A proteína de fusão pode adicionalmente compreender um anticorpo ou um fragmento de anticorpo e um agente terapêutico. Os exemplos dos agentes terapêuticos adequados para tais proteínas de fusão incluem imunomoduladores ("proteína de fusão anticorpo- imunomoduladora") e toxinas ("proteína de fusão anticorpo- toxina). Uma toxina preferida compreende uma ribonuclease (RNase), preferivelmente uma RNase recombinante.
Um "anticorpo biespecífico" é um anticorpo que pode ligar-se simultaneamente a dois alvos de estrutura diferente. Os anticorpos biespecíficos e os fragmentos de anticorpo biespecíficos que são de interesse particular têm pelo menos um braço que especificamente se liga, por exemplo, a uma proteína de envelope HIV e pelo menos outro braço que especificamente se liga a um conjugado alvejável que carrega um agente terapêutico ou de diagnóstico. Uma preparação de anticorpo ou de imunoconjugado, ou uma composição descrita aqui, é para ser administrada em uma "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada é fisiologicamente significante. Um agente é fisiologicamente significante se sua presença resulta em uma mudança detectável na fisiologia de um mamífero destinatário. Em particular, uma preparação de anticorpo anti-HIV é fisiologicamente significante se sua presença reduz, inibe ou elimina células infectadas por HIV ou reduz, inibe ou elimina a infecção por HIV de células não infectadas.
Uma composição é dita ser um "veículo farmaceuticamente aceitável" se sua administração pode ser tolerada por um paciente destinatário. Solução salina tamponada-fosfato estéril é um exemplo de um veículo farmaceuticamente aceitável. Outros veículos adequados são bem conhecidos àqueles na técnica. Veja, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co, 1995), e Goodman e Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Goodman et al. , Eds. Macmillan Publishing Co., New York, Edições de 1980 e 2001).
As abreviaturas usadas são:
ABS, tampão de acetato de sódio contendo 150 mM de cloreto de sódio;
ADCC, citotoxidade celular anticorpo-dependente; DTT, ditiotreitol; ELISA, ensaio de imunoabsorção ligado à enzima; AJRT, terapia anti-retroviral; HIV, vírus de imunodeficiência humana; Mab, anticorpo monoclonal; MuLV, vírus murino leucemia; PBMC, células mononucleares de sangue periférico; TCID50, 50% de dose infecciosa de cultura de tecido. Anticorpos
As várias modalidades podem referir-se a ligandos de anticorpo contra um ou mais antígenos ou epítopos de HIV. Em modalidades preferidas, o antígeno ou epítopo é um que é exposto na superfície de células infectadas por HIV, tal como a proteína de envelope HIV. As técnicas para preparar e usar vários constructos e fragmentos baseados em anticorpo são bem conhecidas na área. Meios para preparar e caracterizar anticorpos são igualmente conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Harlowe e Lane, 1988, Antibodies: A Laboratoty Manual, Cold Spring Harbor Laboratiry). Os anticorpos de uso podem ser igualmente obtidos de uma grande variedade de fontes conhecidas. Por exemplo, uma variedade de linhagens de hibridoma separando anticorpo está disponível de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) .
Anticorpos Monoclonais
Enquanto as modalidades preferidas podem referir-se ao uso do anticorpo P4/D10, outros anticorpos anti-HIV podem ser obtidos, preparados e/ou usados. Uma variedade de anticorpos contra HIV foi relatada e em determinadas modalidades qualquer anticorpo anti-HIV conhecido pode ser utilizado. Por exemplo, 4E10 (Rosa et al., 2:163-73, 2005); 2F5 (Bryson et al., Protein and Peptídeo Letters, 8:413-18, 2001); 3D6 (Ruker et al., Ann. NY Acad. Sei. 646:212-19, 1991); C37 (Cao et al., DNA and Cell Biology, 12:836-41, 2004); 1ACY, 1F58, IGGGC (Berry et al., Proteins, 45:281-82, 2001); 2G12 (Armbruster et al. , J. Antimicrob. Chemother. 54:915-20, 2004), cada um incorporado aqui por referência. Em modalidades alternativas, anticorpos monoclonais podem prontamente ser preparados com o uso das técnicas bem conhecidas, tais como aquelas exemplificadas na Patente U.S. 4.196.265. Tipicamente, esta técnica envolve imunizar um animal adequado com uma composição imunogênica selecionada.
As células dos roedores tais como ratos e ratinhos são preferidas. Os ratos são mais preferidos, com o rato de BALB/c que é o mais preferido porque este é usado o mais rotineiramente e dá geralmente uma porcentagem mais elevada de fusões estáveis.
Depois da imunização, as células somáticas com o potencial para produzir anticorpos, especificamente B- linfócitos (células Β), são selecionadas para o uso no Mab que gera o protocolo. Estas células podem ser obtidas de biópsia de baços, amigdalas ou nódulos linfáticos, ou de uma amostra de sangue periférica. Freqüentemente, um painel dos animais deverá ser imunizado e o baço do animal com o grau de anticorpo mais elevado será removido e os linfócitos do baço serão obtidos homogeneizando o baço com uma seringa. Tipicamente, um baço de um rato imunizado contém aproximadamente 5 χ IO7 a 2 χ IO8 linfócitos.
Os linfócitos B produzindo anticorpo do animal imunizado são fundidos então com células de uma célula imortal de mieloma, geralmente uma da mesma espécie que o animal que foi imunizado. As linhagens de célula de mieloma adequadas para uso em procedimentos de fusão produzindo hibridoma são não- anticorpo, têm a eficiência elevada de fusão, e as deficiências de enzima que tornam então incapaz o crescimento em determinados meios seletivos que suportam o crescimento somente das células fundidas desejadas (hibridomas) .
Qualquer um de número de células de mieloma pode ser usado, como é conhecido por aqueles versados na técnica. Por exemplo, onde o animal imunizado é um camundongo, um pode usar P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-Il, MPCl1-X45-GTG 1.7 e S194/5XX0 Bul; para ratos, um pode usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210; e U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6 são todos úteis em relação às fusões de célula.
Os métodos para gerar híbrido de baço produzindo anticorpo ou células de nodos linfáticos e células de mieloma compreendem geralmente células somáticas de mistura com células de mieloma em uma relação de 2:1, embora a relação pode variar aproximadamente de 20:1 a aproximadamente 1:1, respectivamente, na presença de um agente ou agentes (químicos ou elétricos) que promovam a fusão das membranas de célula. Métodos de fusão usando o vírus Sendai, e aqueles que usam o polietileno glicol (PEG) , tal como 37% (v/v) de PEG, foram descritos. 0 uso de métodos de fusão eletricamente induzidos é igualmente adequado.
Os procedimentos de fusão produzem geralmente híbridos viáveis nas baixas freqüências, em torno de 1 χ 10^-6 a 1 χ 10- 8. Entretanto, isto não levanta um problema, como os híbridos viáveis, fundidos são diferenciados das células parentais, não fundidas (particularmente as células de mieloma não fundidas que continuariam normalmente a se dividir indefinidamente) cultivando em um meio seletivo. 0 meio seletivo é geralmente um que contém um agente que bloqueia a síntese de novo dos nucleotídeos nos meios de cultura do tecido. Os agentes exemplares são aminopterin, metotrexato, e azaserina. Aminopterin e metotrexato bloqueiam a síntese de novo de ambas purinas e pirimidinas, visto que azaserina bloqueia somente a síntese de purina. Onde aminopterin ou metotrexato são usados, os meios são suplementados com a hipoxantina e timidina como uma fonte de nucleotídeos (meio HAT). Onde azaserina é usada, os meios são suplementados com hipoxantina.
Um meio de seleção preferido é HAT. Somente as células capazes de operar caminhos de salvamento de nucleotídeo são capazes de sobreviver no meio HAT. As células de mieloma são defeituosas nas enzimas chaves do caminho de salvamento, por exemplo, hipoxantina fosforibosil transferase (HPRT), e não podem sobreviver. As células B podem operar este caminho, mas têm uma esperança de vida limitada na cultura e morrem geralmente dentro de aproximadamente duas semanas. Conseqüentemente, as únicas células que podem sobreviver nos meios seletivos são aqueles híbridos formados de mieloma e células B.
Ista cultivação fornece uma população de hibridomas de que os hibridomas específicos são selecionados. Tipicamente, a seleção de hibridomas é executada cultivando as células por diluição de clone única nas placas de microtítulo, seguidas testando os sobrenadantes de clone individuais (após aproximadamente duas a três semanas) para a reatividade desejada. 0 ensaio deve ser sensível, simples e rápido, como radioimunoensaios, imunoensaios de enzima, ensaios de citotoxidade, ensaios de placa, ensaios de imunoligação de ponto, e semelhante.
Os hibridomas selecionados seriam diluídos em série e clonados em linhagem celular de produção de anticorpo individual, os clones podem então ser propagados indefinidamente para fornecer Mabs. As linhagens celulares podem ser exploradas para a produção de Mab em duas maneiras básicas. Uma amostra do hibridoma pode ser injetada (freqüentemente na cavidade peritoneal) em um animal histocompat ível do tipo que foi usado para fornecer as células somáticas e de mieloma para a fusão original. 0 animal injetado desenvolve tumores separando o anticorpo monoclonal específico produzido pelo híbrido de célula fundido. Os fluidos do corpo do animal, tal como soro ou fluido ascite, podem então ser batidos para fornecer Mabs em alta concentração. As linhagens de células individuais igualmente poderiam ser cultivadas in vitro, onde o Mabs é separado naturalmente no meio de cultura de que podem prontamente ser obtidos em concentrações elevadas. Mabs produziu por qualquer um significa poder mais purificado, se desejado, usando filtração, centrifugação, e vários métodos cromatográficos tal como cromatografia HPLC ou de afinidade.
Produção de Fragmentos de Anticorpo
Algumas modalidades dos métodos e/ou das composições reivindicados podem referir-se a fragmentos de anticorpo. Tais fragmentos de anticorpo podem ser obtidos pela digestão de pepsin ou papain de anticorpos inteiros por métodos convencionais. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos pela clivagem enzimática dos anticorpos com pepsin para fornecer um fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento pode mais ser ainda clivado usando um agente de redução de tiol e, opcionalmente, um grupo de bloqueio para os grupos sulfidrila resultando da clivagem de enlaces de dissulfeto, para produzir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Alternativamente, uma clivagem enzimática que usa pepsin produz dois fragmentos monovalentes Fab e um fragmento Fe. Os métodos exemplares para produzir fragmentos de anticorpo são descritos na Patente U.S. N0 4.036.945; Patente U.S. N0 4.331.647; Nisonoff et al., 1960, Arch. Biochem. Biophys. 89:230; Porter, 1959, Biochem. J., 73:119; Edelman et al., 1967, METHODS IN ENZYMOLOGY, página 422 (Academic Press), e Coligan et al. (eds.), 1991, CURRENT PR0T0C0LS IN IMMUNOLOGY, (John Wiley & Sons).
Outros métodos de clivar anticorpos, tais como a separação de cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia pesada-pesados monovalentes, uma clivagem adicional dos fragmentos ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas também podem ser usadas, contanto que os fragmentos se ligam ao antígeno que está reconhecido pelo anticorpo intacto. Por exemplo, os fragmentos Fv compreendem uma associação de cadeias Vh e VL. Esta associação pode ser não covalente, como descrito em Inbar et al., 1972, Proc. Nat1I. Acad. Sei. USA, 69:2659. Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação dissulfeto intermolecular ou reticuladas por ligação química tal como glutaraldeído. Ver Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437.
Preferivelmente, os fragmentos Fv compreendem as cadeias Vh e Vl conectadas por um ligante de peptídeo. Estas proteínas de ligação de antígeno de cadeia única (sFv) são preparadas construindo um gene estrutural que compreende seqüências de DNA que codificam os domínios de Vh e VL, conectados por uma seqüência ligante de oligonucleotídeo. 0 gene estrutural é introduzido em um vetor de expressão que seja introduzido subseqüentemente em uma célula hospedeira, tal como E. Coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma cadeia de polipeptídeo única com um peptídeo ligante que constrói uma ponte sobre os dois domínios de V. Os métodos para produzir sFvs são bem conhecidos na técnica. Veja Whitlow et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97; Bird et al. , 1988, Science, 242:423; Patente U.S. N0 4.946.778; Pack et al., 1993, Bio/Technology, 11:1271, e Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437.
Outra forma de um fragmento de anticorpo é um peptideo codificando para uma única região de determinação complementar (CDR) . Peptideos CDR ("unidades de reconhecimento mínimo") podem ser obtidos construindo genes codificando o CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, usando a reação em cadeia polimerase para sintetizar a região variável de RNA de células de produção de anticorpo. Veja Larrick et al. , 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106; Ritter et al. (eds.), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, páginas 166-179 (Cambridge University Press); Birch et al., (eds.), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, páginas 137-185 (Wiley-Liss, Inc.).
Anticorpos Químéricos e Humanizados
Um anticorpo quimérico é uma proteína recombinante em que as regiões variáveis de, por exemplo, um anticorpo humano, foram substituídas pelas regiões variáveis de, por exemplo, um anticorpo de camundongo, incluindo as regiões de determinação complementares (CDRs) do anticorpo de camundongo. Anticorpos quiméricos exibem imunogenecidade aumentada e estabilidade diminuída quando administrados a um indivíduo. Os métodos para construir anticorpos quiméricos são bem conhecidos na técnica (por exemplo, Leung et al., 1994, Hybridoma 13:469).
Um anticorpo monoclonal quimérico pode ser humanizado transferindo o camundongo CDRs das cadeias variáveis pesadas e leves da imunoglobulina do camundongo nos domínios variáveis correspondentes de um anticorpo humano. As regiões da estrutura do camundongo (FR) no anticorpo monoclonal quimérico são substituídas igualmente com as seqüências FR humanas. Para preservar a estabilidade e a especificidade do antígeno do monoclonal humanizado, um ou mais resíduos FR humanos podem ser substituídos pelos resíduos das contrapartes do camundongo. Os anticorpos monoclonais humanizados podem ser usados para o tratamento terapêutico dos indivíduos. A afinidade de anticorpos humanizados para um alvo pode igualmente ser aumentada pela modificação selecionada das seqüências CDR (W00029584A1). As técnicas para a produção de anticorpos monoclonais humanizados são bem conhecidas na área. (Veja, por exemplo, Jones et al. , 1986, Nature, 321:522/ Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534; Carter et al. , 1992, Proc. Nat1I Acad. Sei. USA, 89:4285; Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 1992, 12:437; Tempest et al. , 1991, Biotechnology 9:266; Singer et al., J. Immun., 1993, 150:2844.)
Outras modalidades podem referir-se a anticorpos do primata não humano. As técnicas gerais para promover anticorpos úteis terapeuticamente nos babuínos podem ser encontradas, por exemplo, em Goldenberg et al., em WO 91/11465 (1991), e em Losman et al., Int. J. Câncer 46:310 (1990).
Anticorpos Humanos
Em outra modalidade, um anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos podem ser obtidos dos ratos transgênicos que foram projetados para produzir anticorpos humanos específicos em resposta ao desafio antigênico. Nesta técnica, os elementos do locus humano de cadeia pesada e leve são introduzidos em cepas dos ratos derivados das linhagens de células tronco embrionárias que contêm rompimentos alvejados dos locus de cadeia pesada endógena e da cadeia leve. Os ratos transgênicos podem sintetizar os anticorpos humanos específicos para antígenos humanos, e os ratos podem ser usados para produzir hibridomas de separação de anticorpo humano. Os métodos para obter anticorpos humanos dos ratos transgênicos são descritos por Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), e Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994).
Os métodos para produzir anticorpos inteiramente humanos usando as aproximações combinatórias ou os animais transgênicos transformados com locus de imunoglobulina humanos são sabidos na técnica (por exemplo, Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Conrad e Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26; Brekke e Loset, 2003, Curr. Opin. Phamacol. 3:544-50; cada um incorporado aqui por referência) . Tais anticorpos inteiramente humanos são esperados exibir mesmo poucos efeitos colaterais do que anticorpos quiméricos ou humanizados e funcionar in vivo essencialmente como anticorpos humanos endógenos. Em determinadas modalidades, os métodos e os procedimentos reivindicados podem utilizar os anticorpos humanos produzidos por tais técnicas.
Em uma alternativa, a técnica da exposição do fago pode ser usada para gerar anticorpos humanos (por exemplo, Dantas- Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40, incorporado aqui por referência). Os anticorpos humanos podem ser gerados dos seres humanos normais ou dos seres humanos que exibem um estado particular da doença, tal como a infecção por HIV ou AIDS. A vantagem para construir anticorpos humanos de um indivíduo doente é que o repertório de circulação do anticorpo pode ser inclinado para anticorpos contra os antigenos associados à doença.
Em um exemplo não limitante desta metodologia, Dantas- Barbosa et al. (2005) construiu uma biblioteca de exposição do fago de fragmentos de anticorpo Fab humanos dos pacientes de osteosarcoma. Geralmente, o RNA total foi obtido dos linfócitos de circulação do sangue (IcL). Fab recombinante foi clonado dos repertórios do anticorpo de cadeia μ, γ e k e introduzido em uma biblioteca de exposição do fago [Id.) RNAs foram convertidos aos cDNAs e usados para fazer bibliotecas cDNA Fab usando iniciadores específicos contra as seqüências de imunoglobulina de cadeia pesada e leve (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97, incorporado aqui por referência). A construção da biblioteca foi executada de acordo com Andris-Widhopf et al. (2000, In: Phage Display Laboratiry Manual, Barbas et al. (eds), Ia edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 9.1 a 9.22, incorporado aqui por referência). Os fragmentos Fab finais foram digeridos com endonucleases de restrição e introduzidos no genoma bacteriófago para fazer a biblioteca de exposição do fago. Tais bibliotecas podem ser selecionadas por métodos padrão de exposição do fago, tais como biopanning. O versado na técnica realizará que esta técnica é exemplar somente e qualquer método conhecido para fazer e selecionar anticorpos humanos ou fragmentos do anticorpo pela exposição do fago pode ser utilizado.
Em outra alternativa, os animais transgênicos que foram projetados geneticamente para produzir anticorpos humanos podem ser usados para gerar anticorpos contra essencialmente qualquer alvo imunogênico, usando protocolos padrão de imunização como discutido acima. Um exemplo não limitante de tal sistema é o XenoMouse® (por exemplo, Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231: 11-23) de Abgenix (Fremont, CA). Em XenoMouse® e nos animais similares, os genes de anticorpo de camundongo foram inativados e substituídos por genes de anticorpo humano funcional, quando o restante do sistema imune do camundongo permanecer intacto.
0 XenoMouse® foi transformado com linhagem de germe configurada YACs (cromossomas artificiais de levedura) que continha porções dos locus humanos IgH e Igkappa, incluindo a maioria das seqüências variáveis da região, ao longo dos genes acessórios e das seqüências reguladoras. 0 repertório da região variável humano pode ser usado para gerar o anticorpo produzindo células B, que podem ser processadas em hibridomas por técnicas conhecidas. Um Xeno Mouse® imunizado com um antígeno alvo produzirá anticorpos humanos pela resposta imune normal, que pode ser colhida e/ou produzida pelas técnicas padrão discutidas acima. Uma variedade de cepas de XenoMouse® estão disponíveis, cada qual é capaz de produzir uma classe diferente de anticorpo. Tais anticorpos humanos podem ser acoplados a outras moléculas pela reticulação química ou outras metodologias conhecidas. Anticorpos humanos produzidos transgenicamente mostraram ter potencial terapêutico, ao reter as propriedades farmacocinéticas de anticorpos humanos normais (Green et al., 1999) . O versado na técnica realizará que as composições e os métodos reivindicados não são limitados ao uso do sistema XenoMouse® mas podem utilizar qualquer animal transgênico que tenha sido projetado geneticamente para produzir anticorpos humanos.
Anticorpos de Neutralização
Em determinadas modalidades, os anticorpos de neutralização ou fragmentos dos mesmos que são capazes de destruir ou inibir a infectividade e/ou virulência de HIV são preferidos. Uma variedade de anticorpos de neutralização de HIV é conhecida na técnica e quaisquer anticorpos ou fragmentos conhecidos dos mesmos podem ser usados, incluindo mas não limitados a P4/D10, 2G12 (por exemplo, Joos et al., Antimicrob Agents Chemother 2006, 50:1773-79), 4E10 (Joos et al., 2006), 2F5 (Joos et al., 2006), bl2 (por exemplo, Wu et al., J Virol 2006, 80:2585), X5 (Moulard et al., Proc Natl Acad Sci 2002, 99:6913-18) ou qualquer combinação dos mesmos. Onde os anticorpos ou fragmentos multiespecificos são usados, o versado na técnica realizará que anticorpos ou fragmentos múltiplos que se ligam aos mesmos ou diferentes epitopos de HIV podem ser combinados. Embora os anticorpos contra a proteína de envelope HIV (gpl20) e/ou a gp41 sejam preferidos, o versado na técnica realizará que outros antigenos alvo HIV podem ser utilizados para desenvolver anticorpos ou fragmentos dos mesmos que alvejarão células infectadas HIV. Em alguns casos, os anticorpos ou fragmentos que se ligam a um ou mais antigenos HIV em combinação com os antigenos de célula T (por exemplo, CD4, CCR5 e/ou CXCR4) podem ser utilizados.
Proteínas de Fusão
Várias modalidades podem referir-se a proteínas de fusão. Estas moléculas têm geralmente toda ou uma porção substancial de um peptídeo, ligado à terminação N ou C, a toda a uma porção de um polipeptídeo ou proteína secundária. Por exemplo, as fusões podem empregar seqüências líderes de outras espécies para permitir a expressão recombinante de uma proteína em um hospdedeiro heterólogo. Outra fusão útil inclui a fixação de um domínio imunologicamente ativo, tal como um anticorpo ou um fragmento, a um agente terapêutico, tal como um peptídeo ou toxina proteína ou enzima. Contudo outra forma útil de fusão pode incluir anexação de uma porção de uso para purificação, tal como epítopo FLAG (Prickett et al., 1989, Biotechniques 7:580-589; Castrucci et al. , 1992, J Virol 66:4647-4653). Os métodos de gerar proteínas de fusão são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais proteínas podem ser produzidas, por exemplo, pela anexação química usando reagentes reticuladores bifuncionais, pela síntese de novo da proteína completa de fusão, ou pela anexação de uma seqüência de DNA que codifica uma primeira proteína ou peptídeo a uma seqüência de DNA que codifica um segundo peptídeo ou proteína, seguido pela expressão da proteína de fusão intacta.
Anticorpos Biespecificos
Em determinadas modalidades, os anticorpos ou os fragmentos biespecíficos ou multiespecíficos podem ser utilizados. Tais anticorpos ou fragmentos compreenderão pelo menos um local de aglutinação para um antígeno associado a HIV e pelo menos um outro local de aglutinação, por exemplo, contra uma molécula veículo conjugada aos agentes terapêuticos e/ou de diagnósticos, uma citocina, um receptor de superfície celular ou outro antígeno.
Geralmente, os domínios Vh e Vl discretos dos anticorpos produzidos pela tecnologia de DNA recombinante podem emparelhar-se um com o outro para formar um dímero (fragmento Fv recombinante) com capacidade de ligação (Patente U.S. N0 4.642.334). Entretanto, tais moléculas associadas não covalentemente não são suficientemente estáveis sob condições físiológías para ter qualquer uso prático. Os domínios cognatos Vh e Vl podem ser juntados com um ligante de peptídeo da composição adequada e do comprimento (que consistem geralmente em mais de 12 resíduos de aminoácidos) para formar uma cadeia única Fv (scFv) com atividade de ligação. Os métodos de fabricação scFvs são descritos na Patente U.S. N0 4.946.778 e Patente U.S. N0 5.132.405. A redução do comprimento do ligante de peptídeo a menos de 12 resíduos de aminoácido impede o emparelhamento de domínios Vh e Vl no mesmo emparelhamento da cadeia e das forças de domínios Vh e Vl com os domínios complementares em outras cadeias, tendo por resultado a formação de multímeros funcionais. As cadeias de polipeptídeo dos domínios Vh e Vl que são juntados com ligantes entre 3 e 12 resíduos de aminoácido formam predominante dímeros (denominados diabodies) . Com ligantes entre 0 e 2 resíduos de aminoácido, os trímeros (denominados triabodies) e tetrâmeros (denominados tetrabodies) são favorecidos, mas os testes padrões exatos de oligomerização parecem depender da composição assim como a orientação dos domínios V (VH- lingante-VL ou VL-ligante-VH) , além do comprimento do ligante.
Os diabodies, triabodies, e tetrabodies monoespecíficos com valências múltiplas foram obtidos usando os ligantes do peptídeo que consistem em 5 resíduos ou em menos de aminoácidos. Os diabodies biespecíficos que são heterodímeros de dois scFvs diferentes, cada scFv que consiste no domínio Vh de um anticorpo conectado por um ligante curto de peptídeo ao domínio Vl de um outro anticorpo, foram feitos igualmente usando um vetor de expressão dicistrônico que contém em um cistron um constructo de gene recombinante compreendendo VHi~ lingante-VL2 e no outro cistron um segundo constructo de gene recombinante compreendendo VH2~lingante-VL1 (Holliger, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90:6444 - 6448; Atwell, et al. Mol Immunol. 1996; 33:1301-1302; Holliger, et al. Nature Biotechnol. 1997; 15:632-631; Helfrich, et al. Int. J Câncer.1998; 76:232-239; Kipriyanov, et al. Int J. Câncer 1998; 77:763-772; Holliger, et al. Câncer Res.1999; 59:2909- 2916). Mais recentemente, um diabody em tandem tetravalente (denominado tandab) com especificidade dupla também foi relatado (Cochlovius, et al. Câncer Res. 2000; 60:4336-4341).
O tandab biespecifico é um dimero de dois polipept ideos idênticos, cada um contendo quatro domínios variáveis de dois anticorpos diferentes (VHi, VLi, VH2, VL2) ligados em uma orientação para facilitar a formação de dois locais de aglutinação potenciais para cada uma das duas especificidades diferentes em cima da auto-associação.
Métodos de fabricar agentes baseados em scFv de multivalência e multiespecificidade variando o comprimento do ligante foram descritos na Patente U.S. N0 5.844.094, Patente U.S. N0 5.837.242, e em WO 98/44001. Os métodos de fabricar agentes baseados em scFv de multivalência e multiespecif icidade construindo duas cadeias de polipeptídeo, uma que compreende domínios Vh de pelo menos dois anticorpos e a outra, os domínios correspondentes de Vl foram descritos na Patente U.S. N0 5.989.830 e Patente U.S. N0 6.239.259. Um anticorpo biepecífico ou triespecífico recombinantemente produzido em que os términos c de CHl e Cl de um Fab são, cada um, fundidos a um scFv derivado dos mesmos ou diferentes anticorpos monoclonais descritos na Patente U.S. N°. 6.809.185.
Os métodos para construção e uso de anticorpos biespecíficos e multiespecificos são descritos, por exemplo, na publicação do Pedido de Patente N0 20050002945, depositada em 11/02/2004, o texto inteiro do qual é incorporado aqui por referência. Uma variedade de métodos recombinantes pode ser usada para produzir anticorpos e fragmentos de anticorpos biespecíficos. Por exemplo, os anticorpos e os fragmentos de anticorpos biespecíficos podem ser produzidos no leite de criação transgênico. (Veja, por exemplo, Colman, A., Biochem. Soe. Symp., 63:141-147, 1998; Patente U.S. N0 5.827.690, cada uma incorporada aqui por referência.) Dois constructos de DNA são preparados contendo, respectivamente, segmentos de DNA codificando cadeias leves e pesadas de imunoglobulina emparelhadas. Os fragmentos são clonados nos vetores da expressão que contêm uma seqüência de promotor que é expressada preferencialmente em células epiteliais mamárias. Os exemplos incluem, mas não são limitados a, promotores de coelho, dos genes de caseina dos carneiros e da vaca, e, o gene alf a-lactoglobulin dos carneiros e o camundongo gene de proteína ácida do leite. Preferivelmente, o fragmento introduzido é flanqueado em seu lado 3' por seqüências genômicas cognatas de um gene mamário específico. Isto fornece um local de poliadenilação e seqüências de estabilização transcriptase. Os cassetes de expressão coinjetados no pronuclei dos ovos fertilizados, mamíferos, que então são implantados no útero de uma fêmea destinatária e permitidos para gestação. Após o nascimento, a prole é selecionada para a presença de ambos os transgenes pela análise Southern. Para que o anticorpo esteja presente, ambos os genes de cadeia leve e pesada devem ser expressados simultaneamente na mesma célula. 0 leite das fêmeas transgênicas é analisado para a presença e funcionalidade do anticorpo ou fragmento do anticorpo usando os métodos imunológicos padrão conhecidos na técnica. 0 anticorpo pode ser purificado do leite usando métodos padrões conhecidos na técnica.
Pré-alvejamento
Uma estratégia para uso de anticorpos biespecíficos inclui as metodologias pré-alvejamento, em que uma molécula efetora é administrada a um indivíduo depois que um anticorpo biespecífico for administrado. 0 anticorpo biespecífico, que incluiria um local de aglutinação para um antígeno HIV e um para um veículo conjugado a uma ou mais moléculas efetoras, localiza-se ao tecido doente e aumenta a especificidade da localização do efetor ao tecido doente (Pedido de Patente U.S. N° 20050002945). Porque a molécula efetora pode ser liberada da circulação muito mais rápido do que o anticorpo biespecífico, os tecidos normais podem ter uma exposição diminuída à molécula efetora quando uma estratégia pré- alvejamento é usada quando a molécula efetora é ligada diretamente ao anticorpo alvo de doença.
Os métodos de pré-alvejamento foram desenvolvidos para aumentar o alvo: razões de fundamento de agentes de detecção e terapêuticos. Exemplos de aproximações pré-alvejamento e biotin/avidin são descritos, por exemplo, em Goodwin et al., Patente U.S. N0 4.863.713; Goodwin et al., J. Nucl. Med. 29:226, 1988; Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28:1294, 1987; Oehr et al., J. Nucl. Med. 29:728, 1988; Klibanov et al., J. Nucl. Med. 29:1951, 1988; Sinitsyn et al., J. Nucl. Med. 30:66, 1989; Kalofonos et al., J. Nucl. Med. 31: 1791, 1990; Schechter et al., Int. J. Câncer 48:167, 1991; Paganelli et al., Câncer Res. 51: 5960, 1991; Paganelli et al. , Nucl. Med. Commun. 12:211, 1991; Patente U.S. N0 5.256.395; Stickney et al., Câncer Res. 51: 6650, 1991; Yuan et al., Câncer Res. 51: 3119, 1991; Patente U.S. N0 6.077.499; Número de série U.S. 09/597.580; Número de série U.S. 10/361.026; Número de série U.S. 09/337.756; Número de série U.S. 09/823.746; Número de série U.S. 10/116.116; Número de série U.S. 09/382.186; Número de série U.S. 10/150.654; Patente U.S. N0 6.090.381; Patente U.S. N0 6.472.511; Número de série U.S. 10/114.315; Pedido Provisional U.S. N0 60/386.411; Pedido Provisional U.S. N0 60/345.641; Pedido Provisional U.S. N0 60/3328.835; Pedido Provisional U.S. N0 60/426.379; Número de série U.S. 09/823.746; Número de série U.S. 09/337.756; e Pedido Provisional U.S. N0 60/342.103, que são todos incorporados aqui por referência.
Em determinadas modalidades, os anticorpos biespecificos e os constructos alvejáveis podem ser de uso em tecidos doentes em tratamento e/ou de imagem, por exemplo, usando os métodos descritos em Patentes U.S. Números 6.126.916; 6.077.499; 6.010. 68 0; 5.776.095; 5.776.094; 5. 776.093; 5.772.981; 5.753.206; 5.746.996; 5.697.902; 5.32 8.679; 5.128.119; 5.101.827; e 4.735.210, cada uma incorporada aqui por referência. Os métodos adicionais são descritos no Pedido U.S. número de série 09/337.756 depositado em 22 de Junho de 1999 e no Pedido U.S. número de série 09/823.746, depositado em 3 de Abril de 2001.
"Dock and Lock" (DNL)
Em determinadas modalidades, os anticorpos ou os fragmentos biespecificos, ou conjugados dos anticorpos ou dos fragmentos, podem ser montados usando uma tecnologia conhecida como "dock and lock" (DNL). Detalhes adicionais de tecnologia de DNL podem ser encontrados no Pedido de Patente U.S. N0 de série 11/389.358, depositado em 24 de Março de 2005; 11/391.584, depositado em 28 de Março de 2006; 11/478.021, depositado em 29 de Junho de 2006; 11/633.729, depositado em 21 de Junho de 2007; e Pedido de Patente U.S. Provisional N0 de série 60/864.530, depositado em 6 de Novembro de 2006, o texto de cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Para sintetizar, a tecnologia de DNL envolve alvejar uma ligação entre duas ou mais seqüências complementares, como um domínio de dimerização e bloqueio (DDD) de, por exemplo, subunidades regulatórias de cinas A de proteína dependente c- AMP, e domínio de ancoragem encontrado em várias proteínas de ancoragem cinase A (AKAPs) que mediam associação com as subunidades R de PKA. Entretanto, o versado realizará que outros domínios de dimerização e bloqueio e domínios de ancoragem são conhecidos e quaisquer domínios conhecidos podem ser usados dentro do escopo do assunto reivindicado. Outros domínios exemplares do tipo feixe de 4 hélices DDD podem ser obtidos de p53, DCoH (co-fator dehidratase carbinolamina pterin 4 alfa/ dimerização de fator 1 alfa nuclear hepatócito (TCFl)) e HNF-I (fator 1 nuclear hepatócito) . Outras seqüências AD de uso potencial podem ser encontradas no Pedido de Patente N0 de série US2 0003/023242OAl, o texto inteiro do qual é aqui incorporado por referência.
Estes pares de ligação complementares podem covalentemente ser unidos às várias unidades funcionais, tais como anticorpos ou fragmentos do anticorpo, ou agentes terapêuticos ou de diagnóstico, formando complexos terapêuticos ou de diagnóstico de especificidade e atividade determinadas. O versado realizará que há uma multiplicidade de maneiras em que tais complexos poderiam ser formados, por exemplo, incorporando seqüências de AD ou DDD nas proteínas de fusão compreendendo Fab, Fab', IgG, scFc ou outro anticorpo ou fragmento com especificidade de ligação conhecida. Por exemplo, um complexo biespecífico pode ser formado incorporando seqüências de AD ou DDD em anticorpos ou fragmentos específicos para dois antígenos alvo diferentes. Alternativamente, um anticorpo ou um fragmento unido a uma porção AD ou DDD pode ser combinado com uma proteína terapêutica ou peptídeo, tal como hormônio, enzima, ribonuclease, onconase ou outro agente que é unido a uma porção complementar AD ou DDD. Um número de tais complexos potenciais é descrito nos pedidos de patente listados acima e quaisquer complexos conhecidos podem ser utilizados.
Conjugação de Agentes Terapêuticos ou de Diagnósticos aos Anticorpos anti-HIV
Em várias modalidades, os agentes terapêuticos podem ser conjugados aos anticorpos anti-HIV, fragmentos ou outras moléculas alvo para entregar às células infectadas por HIV. Os agentes terapêuticos de uso podem compreender um ou mais de aplidin, azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicin, bortezomib, briostatin-1, bussulfan, calicheamicin, camptotecin, 10-hidroxicamptotecin, carmustina, celebrex, clorambucil, cisplatin, irinotecan (CPT-11), SN-38, carboplatin, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicin, glucuronídeo de daunomicin, daunorubicin, doxorrubicin, 2-pirrolinodoxorrubicina (2P- DOX), ciano-morfolino doxorrubicin, glucuronídeo de doxorrubicin, glucuronídeo de epirubicin, estramustina, etoposídeo, glucuronídeo de etoposídeo, fosfato de etoposídeo, floxuridina (FUdR), 3',5'-O-dioleoil-FudR (FUdR- dO), fludarabina, flutamida, fluorouracil, fluoximesterona, gemcitabina, hidroxiuréia, idarubicin, ifosfamida, L- asparaginase, leucovorin,. lomustina, mecloretamina, melphalan, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicin, mitomicin, mitotano, butirato de fenila, procarbazina, pentostatin, PSI-341, semustina, streptozocin, taxanos, tioguanina, tiotepa, teniposideo, topotecan, mostarda de uracil, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricin, abrin, ribonuclease, onconase, rapLRl, DNase I, enterotoxin-A Staphylococcal, proteína antiviral pokeweed, gelonin, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudoraonas, um oligonucleotideo de anti-sentido, um RNA de interferência, ou uma combinação do mesmo.
As porções adicionais podem ser conjugadas às moléculas alvo HIV descritas aqui. Por exemplo, drogas, toxinas, compostos radioativos, enzimas, hormônios, proteínas citotóxixcas, quelatos, citocinas, e outros agentes funcionais podem ser conjugados às moléculas alvo HIV. A conjugação pode ser através, por exemplo, de fixação covalente aos resíduos de aminoácidos contendo grupos amina, carboxila, tiol ou hidroxila suas cadeias laterais. Vários ligantes convencionais podem ser usados para esta finalidade, por exemplo, diisocianatos, diisotiocianatos, ésteres de bis (hidroxissuccinimida), carbodiimidas, ésteres de maleimida- hidroxissuccinimida, glutaraldeído e semelhante. A conjugação dos agentes às moléculas alvo HIV preferivelmente não afeta significativamente a atividade de ligação ou especificidade comparada às estruturas não modificadas. Além disso, os agentes citotóxicos e/ou virostáticos podem ser primeiramente acoplados a um veículo polimérico, que seja conjugado a uma molécula alvo HIV. Para este método, veja Ryser et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:3867-3870, 1978, U.S. 4.699.784, e U.S. 4.046.722, que são incorporados aqui por referência.
Os conjugados descritos aqui podem ser preparados pelos métodos conhecidos por anticorpos de ligação com lipídeos, carbohidratos, proteínas, radionuclídeos, ou outros átomos e moléculas. Por exemplo, moléculas alvo HIV descritas aqui podem ser ligadas a um ou mais veículos descritos aqui (por exemplo, lipídeos, polímeros, lipossomas, micelas, ou nanopartículas) para formar um conjugado, que pode então incorporar um agente terapêutico ou de diagnóstico covalentemente, não covalentemente, ou de outra maneira. Alternativamente, qualquer uma das moléculas alvo HIV descritas aqui pode ser conjugada diretamente com um ou mais agentes terapêuticos ou de diagnósticos descritos aqui.
Por exemplo, uma molécula alvo HIV pode ser radiorrotulada com 131I e ser conjugada a um lipídeo, tal que o conjugado resultante pode formar um lipossoma. 0 lipossoma pode incorporar um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, uma droga tal como FUdR-dO) ou de diagnósticos. A formação de lipossomas e micelas é conhecida na técnica. Veja, por exemplo, Wrobel e Collins, Biochimica et Biophysica Acta (1995), 1235:296-304; Lundberg et al., J. Pharm. Pharmacol. (1999), 51: 1099-1105; Lundberg et al., Int. J. Pharm. (2000), 205:101-108; Lundberg, J. Pharm. Sei. (1994), 83:72- 75; Xu et al., Molec. Câncer Ther (2002), 1:337-346; Torchilin et al., Proc. Nat1I. Acad. Sei., U.S.A. (2003), 100:6039-6044; U.S. 5.565.215; U.S. 6.379.698; e U.S. 2003/0082154.
Nanoparticulas ou nanocápsulas formadas de polímeros, silica, ou metais, que são úteis para a entrega ou imagem da droga, foram descritas também. Veja, por exemplo, West et al., Applications of Nanotechnology to Biotecnology (2000), 11:215-217; U.S. 5.620.708; U.S. 5.702.727; e U.S. 6.530.944. A conjugação das moléculas de anticorpos ou de ligação aos lipossomas forma um veículo alvejado para agentes terapêuticos ou de diagnósticos descritos. Veja, por exemplo, Bendas, Biodrugs (2001), 15:215-224; Xu et al., Mol. Câncer Ther (2002), 1:337-346; Torchilin et al., Proc. Nat1I. Acad. Sei. U.S.A. (2003), 100:6039-6044; Bally, et al., J. Liposome Res. (1998), 8:299-335; Lundberg, Int. J. Pharm. (1994), 109:73-81; Lundberg, J. Pharm. Pharmacol. (1997), 49:16-21; Lundberg, Anti-cancer Drug Design (1998), 13:453-461. Veja também U.S. 6.306.393; U.S. N0 de série 10/350.096; U.S. N0 de série 09/590.284, e U.S. N0 de série 60/138.284, depositado em 9 de Junho de 1999. Todas estas referências são incorporadas aqui por referência.
Uma grande variedade de agentes de diagnósticos e terapêuticos pode vantajosamente ser usada para formar os conjugados das moléculas alvo HIV, ou pode ser ligada aos haptenos que ligam a um local de reconhecimento nas moléculas alvo HIV. Os agentes diagnósticos podem incluir radioisótopos, agentes de realce para uso em agentes MRI ou de contraste para . imagem de ultra-som, e compostos fluorescentes. Muitos agentes de imagem adequados são conhecidos na técnica, como são métodos para sua fixação às proteínas ou peptídeos (veja, por exemplo, Patentes U.S. 5.021.236 e 4.472.509, ambas incorporadas aqui por referência) . Determinados métodos de fixação envolvem o uso de um complexo de quelato de metal empregando, por exemplo, um agente de quelação orgânico tal como DTPA unido à proteína ou peptídeo (Patente U.S. 4.472.509).
A fim de carregar uma molécula alvo HIV com os metais radioativos ou íons paramagnéticos, pode ser necessário primeiramente reagi-la com um veículo o qual cópias múltiplas de um grupo de quelação para ligar os metais radioativos ou íons paramagnéticos foram unidas. Tal veículo pode ser uma polilisina, polissacarídeo, ou uma substância polimérica derivatizada ou derivatizável tendo grupos pendentes a que podem ser ligados grupos de quelação tais como, por exemplo, ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA), porfirins, poliaminas, éteres de coroa, bis-tiosemicarbazonas, polioximas, e semelhantes conhecidos ser úteis com esta finalidade. Os veículos contendo quelatos são acoplados à molécula alvo HIV usando química padrão em uma maneira de minimizar a agregação e a perda de imunorreatividade.
Outros métodos e reagentes mais incomuns que podem ser aplicados para preparar tais conjugados são descritos na U.S. 4.824.659, que são incorporados aqui em sua totalidade por referência. Particularmente, combinações metal-quelato úteis incluem 2-benzil-DTPA, e seus análogos monometila e ciclohexila, usados com os isótopos de diagnósticos na escala geral de energia de 60 a 4.000 keV. Alguns nuclideos de diagnósticos úteis podem incluir F, Fe, Cu, Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr, 94Tc, 94mTc, 99mTc, or 111In. Os mesmos quelatos complexados com metais não radioativos, tais como o manganês, ferro e gadolinio, são úteis para MRI, quando usados junto com moléculas alvo HIV e veículos descritos aqui. Os quelatos macrocíclicos tais como NOTA, DOTA, e TETA são de uso com uma variedade de metais e radiometais, mais particularmente com radionuclídeos de gálio, ítrio e cobre, respectivamente. Tais complexos metal-quelato podem ser feitos muito estável costurando o tamanho do anel ao metal de interesse. Outros quelatos tipo anel, tais como poliéteres macrocíclicos para complexar 223Ra, podem ser usados.
Os agentes terapêuticos incluem, por exemplo, drogas quimioterapêuticas tais como os alcalóides de vinca, os antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabólitos, agentes de alquilação, antibióticos, inibidores Cox-2, antimitóticos, agentes antiangiogênicos e proapoptóticos, particularmente doxorrubicin, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecans, e outras formas destes e outras classes de agentes citotóxicos. Outros agentes citotóxicos incluem mostardas de nitrogênio, sulfonatos de alquila, nitrosouréias, triazenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, complexos de coordenação de platina, e semelhante. Os agentes citotóxicos adequados são descritos em REMINGTON1S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19a Ed. (Mack Publishing Co. 1995), e em GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7a Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985), assim como edições revisadas destas publicações. Outros agentes citotóxicos adequados, tais como drogas experimentais, são conhecidos por aqueles versados na técnica, e podem ser conjugados ás moléculas alvo HIV descritas aqui usando os métodos que são conhecidos na técnica.
Outra classe de agentes terapêuticos consiste nos radionuclideos que emitem α-partículas (tais como, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 211At, 223Ra, 225Ac), β-partículas (tais como, 32P, 33P, 47Sc, 67Cu, 67Ga, 89Sr, 90Y, 111Ag, 125I, 131I, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 166Dy, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, ou elétrons Auger (tais como, 111In, 125I, 67Ga, 191Os, 193mPt, 195mPt, 195mHg). As moléculas alvo HIV podem ser rotuladas com um ou mais radionuclideos acima usando métodos como descritos para os agentes de diagnósticos.
Em determinadas modalidades, os agentes terapêuticos de uso podem compreender um ou mais inibidores agressoma. Agressomas são grandes complexos intracelulares que foram pensados para formar em resposta à proteína desdobrada (veja, por exemplo, Heath et al., J. Cell Biol. 153:449-55, 2001; Johnstone et al., J. Cell Biol. 143:1883-98, 1998; Wileman, Science 312:875-78, 2006). Mais recentemente, sugeriu-se que as agressomas pudessem funcionar no conjunto de partículas virais (Heath et al., 2001; Wileman, 2006). Os inibidores de agressoma podem conseqüentemente funcionar para bloquear ou inibir a formação de novas partículas virais infecciosas das células infectadas com HIV ou outros vírus. Uma variedade de inibidores de agressoma é conhecida, tais como ALLN, nocodazol, colchicina e vinblastina (Johnston et al. , 1998), outros inibidores de microtúbulo (Gerdes e Katsanis, Hum. Molec. Genet. 14: R291-300, 2005); bortezomib (Velcade) (Catley et al., Blood 108:3441-49, 2006), tubacin, inibidores histona deacetilase (Corcoran et al., Curr. Biol. 14:488-92, 2004), e qualquer inibidor de agressoma conhecido podem ser usados.
Em várias modalidades, um ou mais imunomoduladores podem ser conjugados a um anticorpo anti-HIV ou fragmento para a administração a um paciente, ou alternativamente podem ser co-administrados ao paciente. Como usado aqui, o termo "imunomodulator" inclui citocinas, fatores de crescimento de célula tronco, linfotoxinas e fatores hematopoiéticos, tais como interleucinas, fatores de estimulação de colônia, interferons (por exemplo, interferons-α, -β e -γ) e o fator de crescimento da célula tronco designado "fator SI".
Exemplos de porções imunomoduladoras adequadas incluem IL-2, IL-6, IL-IO, IL-12, IL-18, IL-21, interferon-gama, TNF-alfa, e semelhante.
O termo "citocina" é um termo genérico para as proteínas ou peptídeos liberados por uma população de célula que atua em uma outra célula como mediadores intercelulares. Como usado amplamente aqui, os exemplos das citocinas incluem linfocinas, monocinas, fatores de crescimento e hormônios de peptídeo tradicionais. São incluídos entre citocinas hormônios de crescimento, tais como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano de N-metionila, e hormônio de crescimento bovino; hormônio de paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxin; prorelaxin; hormônios de glicoproteína, tais como hormônio de estimulação de folículo (FSH), hormônio de estimulação de tiróide (TSH), e hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; prostaglandin, fator de crescimento de fibroblasto; prolactin; lactogen placental, proteína de OB; fatores α e β de necrose de tumor e; substância de inibição do mullerian; peptídeo associado à gonadotropin de camundongo; inhibin; activin; fator de crescimento endotelial vascular; integrin; trombopoietin (TPO); fatores de crescimento do nervo, tais como NGF-β; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento de transformação (TGFs), tais como TGF-α e TGF-β; fatores de crescimento I e II tipo insulina; eritropoietin (EPO); fatores osteoindutivos; interferons, tais como o interferon-α, β, e γ; fatores de estimulação da colônia (CSF) como macrófago-CSF (M-CSF); Granulócito-macrófago-CSF (GM- CSF) ; e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs), tais como IL-I, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, kit-ligando ou FLT-3, angiostatin, trombospondin, endostatin, fator de necrose de tumor e LT. Como usado aqui, o termo citocina inclui proteínas das fontes naturais ou da cultura de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de seqüência nativas.
Quemocinas atuam geralmente como quimioattractants para recrutar células efetoras imunes ao local de expressão quemocina. Pode ser vantajoso expressar um gene quemocina particular em combinação com, por exemplo, um gene citocina, para realçar o recrutamento de outros componentes do sistema imune a um local de tratamento. Quemocinas incluem, mas não são limitadas a, RANTES, MCAF, ΜΙΡΙ-alfa, MlPl-beta, e IP-IO. O versado na técnica reconhecerá que determinadas citocinas são igualmente conhecidas para ter efeitos quimioattractant e poderiam igualmente ser classificadas sob os termos quemocinas. Similarmente, os termos imunomoduladores e citocina sobrepõem em seus membros respectivos.
Um peptídeo adequado que contêm uma etiqueta detectável (por exemplo, uma molécula fluorescente), ou um agente virostático e/ou citotóxico, (por exemplo, radioiodina), podem para associar covalentemente, não-covalentemente, ou de outra forma associados com moléculas alvo HIV. Por exemplo, um conjugado terapeuticamente útil pode ser obtido incorporando um agente ou corante fotoativo em moléculas alvo HIV. As composições fluorescentes, tais como fluorocromo, e outros cromogêneos, ou corantes, tais como porfirins sensíveis à luz visível, foram usados para detectar e tratar lesões dirigindo a luz adequada à lesão. Na terapia, isto foi denominado a terapia de fotorradiação, fototerapia, ou fotodinâmica. Veja Jori et al. (eds.) , PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985) ; van den Bergh, Chem. Britain (1986), 22:430. Além disso, os anticorpos monoclonais foram acoplados com corantes fotoativados para alcançar fototerapia. Veja Mew et al., J. Immunol. (1983), 130:1473; idem., Câncer Res. (1985), 45:4380; Oseroff et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986), 83:8744; idem., Photochem. Photobiol. (1987), 46:83; Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. (1989), 288:471; Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. (1989), 9:422; Pelegrin et al., Câncer (1991), 67:2529.
Aptâmeros
Em modalidades alternativas, as composições e métodos descritos podem utilizar formas alternativas de moléculas de ligação aos anticorpos ou fragmentos de anticorpo, tais como aptâmeros. Aptâmeros são tipicamente oligonucleotideos sintéticos que podem adotar as conformações tridimensionais que proevêem anticorpo como afinidades de aglutinação e especificidades para moléculas alvo selecionadas. Os métodos de construir e de determinar as características de ligação dos aptâmeros são conhecidos na técnica. Por exemplo, tais técnicas são descritas nas Patentes U.S. N0 5.582.981, 5.595.877 e 5.637.459, cada uma aqui incorporada por referência.
Aptâmeros podem ser preparados por qualquer método conhecido, incluindo métodos sintéticos, recombinantes, e de purificação, e podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros ligandos específicos para o mesmo alvo. Geralmente, um mínimo de aproximadamente 3 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 5 nucleotídeos, é necessário para efetuar ligação específica. Aptâmeros de seqüências menores de 10 bases podem ser praticáveis, embora os aptâmeros de 10, 20, 30 ou 40 nucleotídeos possam ser preferidos.
A necessidade de aptâmeros de conter a seqüência que confere especificidade de ligação, porém pode ser estendida com regiões flanqueando e de outra maneira derivatizeda. Em modalidades preferidas, as seqüências de ligação dos aptâmeros podem ser flanqueadas pelas seqüências de ligação- iniciacor, facilitando a amplificação dos aptâmeros por PCR ou outras técnicas da amplificação. Em uma modalidade adicional, a seqüência de flanqueação pode compreender uma seqüência específica que preferencialmente reconhece ou liga uma porção para realçar a imobilização do aptêmro a um substrato.
Aptâmeros podem ser isolados, arranjados em seqüência, e/ou amplificados ou sintetizados como moléculas convencionais de DNA ou RNA. Alternativamente, os aptâmeros de interesse podem compreender oligômeros modificados. Qualquer grupo hidroxila ordinariamente atual nos aptâmeros pode ser substituído por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por um grupo de proteção padrão, ou ativados para preparar enlaces adicionais a outros nucleotídeos, ou podem ser conjugados às sustentações sólidas. Um ou mais enlaces de fosfodiéster podem ser substituídos por grupos de ligação alternativos, tais como P(O)O substituído por P(O)S, P(O)NR2, P(O)R, P(O)OR', CO, ou CNR2, onde R é H ou alquila (1-20C) e R' é alquila (1-20C); além disso, este grupo pode ser unido a nucleotídeos adjacentes através de 0 ou S. Nem todos 'os enlaces em um oligômero precisam ser idênticos.
Os métodos para a preparação e a seleção dos aptâmeros que ligam aos alvos particulares de interesse são conhecidos, por exemplo, Patente U.S. N0 5.475.096 e Patente U.S. N0 5.270.163, cada uma incorporada por referência. A técnica envolve geralmente a seleção de uma mistura de aptâmeros do candidato e de iterações por etapas da ligação, da separação de .limite dos aptâmeros não ligados da amplificação. Porque somente um pequeno número de seqüências (possivelmente somente uma molécula de aptâmero) que corresponde aos aptâmeros de afinidade os mais elevados existe na mistura, é geralmente desejável ajustar os critérios de divisão de modo que uma quantidade significativa de aptâmeros na mistura (aproximadamente 5-50%) seja retida durante a separação. Cada ciclo resulta em um enriquecimento de aptâmeros com afinidade elevada para o alvo. A repetição para entre três a seis seleções e ciclos de amplificação podem ser usados para gerar os aptâmeros que ligam com afinidade e especificidade elevadas ao alvo. Aptâmeros podem ser conjugados aos agentes terapêuticos pelas técnicas de rotulagem de ácido nucléico padrão também conhecidas na área. Avimeros
Em determinadas modalidades, as composições ou métodos descritos podem utilizar umas ou várias seqüências de avimero. Avimeros é uma classe de proteínas de ligação um tanto similares aos anticorpos em suas afinidades e especificidades para várias moléculas alvo. Eles foram desenvolvidos dos domínios receptores extracelulares humanos "exon shuffling" in vitro e por exposição do fago. (Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-94; Silverman et al. , 2006, Nat. Biotechnol. 24:220). As proteínas de multidomínio resultantes podem compreender os múltiplos domínios de ligação independentes que podem exibir a afinidade melhorada (em alguns casos subnanomolar) e especificidade comparada com as proteínas de ligação epítopo únicas. (Id.) Em várias modalidades, os avímeros podem ser unidos aos agentes terapêuticos para o uso nos métodos e nas composições reivindicados usando as técnicas de reticulação de proteína padrão ou de rotulagem aqui. Os detalhes adicionais a respeito dos métodos de construção e uso dos avímeros são descritos, por exemplo, na publicação do Pedido de Patente U.S. Números 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 e 20050221384, seção dos exemplos de cada qual é incorporada aqui por referência.
Formulação e Administração
As moléculas alvo de HIV, incluindo seus conjugados, podem ser formuladas para obter composições que incluem um ou mais excípientes farmaceuticamente adequados, um ou mais ingredientes adicionais, ou alguma combinação destes. Estes podem ser realizados por métodos conhecidos para preparar dosagens f armaceut icamente úteis, por meio de ingredientes ativos (isto é, moléculas alvo de HIV ou conjugados), são combinados em uma mistura com um ou mais excípientes farmaceuticamente adequados. Solução salina tamponada-fosfato estéril é um exemplo de um excipiente farmaceuticamente adequado. Outros excípientes adequados são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5a edição (Lea & Febiger 1990), e Gennaro (ed.), REMINGTON1S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edição (Mack Publishing Company 1990), e edições revisadas dos mesmos.
Uma rota para administração das composições descritas aqui é injeção parenteral. Na administração parenteral, as composições serão formuladas em uma forma de unidade de dosagem injetável tal como uma solução, suspensão ou emulsão, em associação com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Tais excipientes são inerentemente não tóxicos e não terapêuticos. Os exemplos de tais excipientes são: solução salina, solução de Ringer, solução dextrose e solução de Hank. Os excipientes não aquosos tais como óleos fixos e oleato de etila podem igualmente ser usados. Um excipiente preferido é dextrose de 5% em solução salina.O excipiente pode conter quantidades menores de aditivos tais como as substâncias que realçam a estabilidade de isotonicidade e química, incluindo tampões e conservantes. Outros métodos de administração, incluindo administração oral, são também contemplados.
As composições formuladas que compreendem moléculas alvo de HIV podem ser usadas para a administração intravenosa através de, por exemplo, a injeção de bolus ou infusão contínua. As composições para a injeção podem ser apresentadas na forma de unidade de dosagem, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de multidoses, com um conservante adicionado. As composições podem igualmente tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formuladores, tais como agentes de suspensão, de estabilização e/ou de dispersão. Alternativamente, as composições podem estar na forma de pó para a constituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogênio estéril, antes de usar.
As composições podem ser administradas na solução. O pH da solução deve estar na escala do pH 5 a 9.5, preferivelmente pH 6.5 a 7.5. A formulação disso deve estar em uma solução que tem um tampão farmaceuticamente aceitável adequado tal como o fosfato, tris (hidroximet il) aminometano- HCl ou citrato e semelhante. As concentrações de tampão devem estar na escala de 1 a 100 mM. A solução formulada pode igualmente conter um sal, tal como o cloreto de sódio ou o cloreto do potássio em uma concentração de 50 a 150 mM. Uma quantidade eficaz de um agente de estabilização tal como o glicerol, albumina, uma globulina, um detergente, uma gelatina, uma protamina ou um sal de protamina pode igualmente ser incluído. A administração sistemática da composição formulada é feita tipicamente a cada dois a três dias ou uma vez por semana se uma forma humanizada do anticorpo for usada como um molde para moléculas alvo de HIV. Alternativamente, a administração diária é útil. Geralmente a administração é pela injeção intramuscular ou pela infusão intravenosa.
As composições podem ser administradas a um mamífero subcutaneamente ou por outras vias parenterais. Além disso, a administração pode ser pela infusão contínua ou por bolus único ou múltiplo. Os métodos úteis para os anticorpos ou imunoconjugados podem ser aplicados às composições descritas aqui. Geralmente, a dosagem de um imunocon jugado administrado, a proteína de fusão ou anticorpo nu para seres humanos variará dependendo de fatores como a idade do paciente, peso, altura, sexo, condição médica geral e história médica precedente. Tipicamente, é desejável fornecer o receptor com uma dosagem do ingrediente ativo que está na escala de aproximadamente 1 mg/kg a 20 mg/kg como uma única infusão intravenosa, embora uma dosagem mais baixa ou mais elevada igualmente possa ser administrada como a ordem das circunstâncias. Esta dosagem pode ser repetida como necessário, por exemplo, uma vez por semana por 4-10 semanas, pref erivelmente uma vez por semana por 8 semanas, e mais preferivelmente, uma vez por semana por 4 semanas. Pode igualmente ser dado menos freqüentemente, tal como toda outra semana por diversos meses. A dosagem pode ser dada através das várias vias parenterais, com ajuste adequado da dose e da programação.
Os métodos farmacêuticos empregados para controlar a duração da ação de imunoconjugados ou anticorpos podem ser aplicados às composições formuladas descritas aqui. As preparações de liberação de controle podem ser alcançadas com o uso de polímeros biocompativeis para complexar ou absorver o anticorpo imunoconjugado ou nu, por exemplo, as matrizes de poli (acetato etileno-co-vinila) e as matrizes de um copolímero do polianidrido de um dímero de ácido esteárico e ácido sebácico. Veja Sherwood et al., Bio/Tecnology (1992), 10:1446. A taxa de liberação de um imunoconjugado ou forma de anticorpo tal como uma matriz depende do peso molecular do imunoconjugado ou anticorpo, a quantidade de imunoconjugado, anticorpo dentro da matriz, e tamanho de partículas dispersadas. Veja Saltzman et al., Biophys. J (1989), 55:163; Sherwood et al., supra. Outras formas de dosagem sólidas são descritas em Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SUSTEMS, 5a edição (Lea & Febiger 1990), e Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edição (Mack Publishing Company 1990), e edições revisadas dos mesmos.
Para finalidades de terapia, a composição é administrada a um mamífero em uma quantidade terapeutícamente eficaz. Um indivíduo adequado para os métodos terapêuticos e de diagnósticos descritos aqui é geralmente um ser humano, embora um animal não humano seja contemplado igualmente.
As composições podem ser administradas por aerossol para conseguir a entrega localizada aos pulmões. Uma suspensão de aerossol aquoso ou não aquoso (por exemplo, um propelente de fluorocarbono) poderia ser usada. Os nebulizadores sônicos são usados preferivelmente em preparar aerossóis para minimizar a exposição da molécula alvo de HIV nas composições para cortar, que podem conduzir em suas degradações e perda de atividade.
Uma molécula alvo de HIV ligada a um radionuclídeo pode ser eficaz para terapia. Depois que se determinou que a molécula alvo de HIV está localizada em um ou mais locais infecciosos em um indivíduo, doses mais elevadas da composição rotulada, geralmente de 20 mCi a 150 mCi por dose para 131I, 5 mCi a 30 mCi por dose para 90Y, ou 5 mCi a 20 mCi por dose de 186Re, cada um baseado em um peso de paciente de 70 kg, são injetadas. A injeção pode ser intravenosa, intra- arterial, intralinfática, intratecal, ou intracavidade (isto é, parenteralmente) , e pode ser repetida. Pode ser vantajoso para algumas terapias administrar doses múltiplas, divididas, assim fornecendo umas doses tóxicas mais elevadas sem geralmente efetuar um aumento proporcional na radiação de tecidos normais.
Em outras modalidades, anticorpos anti-HIV ou fragmentos podem ser modificados para a administração oral ou inalacional pela conjugação a determinadas proteínas, tais como a região de Fc de IgGl (veja exemplos 3-7) . Os métodos para a preparação e uso de conjugados de peptídeo-Fc são descritos, por exemplo, em Low et al. (2005, Hum Reprod. 20:1805-13) e Dumont et al. (2005, J. Aerosol. Med. 18:294- 303), cada um incorporado aqui por referência. Low et al. (2005) descreve a conjugação das subunidades alfa e beta de FSH à região de Fc de IgGl na forma heterodímero ou de cadeia única, usando a expressão recombinante em células de CHO. Os peptídeos conjugados Fc foram absorvidos através das células epiteliais no pulmão ou intestino pelo receptor neonatal de Fc mediado sistema de transporte. Os peptídeos de Fc conjugados exibem estabilidade e absorção melhoradas comparadas in vivo aos peptídeos nativos. Igualmente observou-se que o conjugado de heterodímero era mais ativo do que a forma de cadeia única. As proteínas maiores, tal como eritropoietina, podem ser eficazmente pela inalação usando a conjugação de Fc (Dumont et al., 2005).
Usos para Tratamento e Diagnóstico: aplicações que não envolvem pré-alvejamento
O uso dos agentes de diagnósticos radioativos e não radioativos que são ligados a moléculas alvo de HIV, é contemplado. Os agentes de diagnósticos não radioativos adequados são aqueles usados para imagem de ressonância magnética (MRI) , tomografia computadorizada (CT) ou ultra- som. Os agentes de MRI incluem, por exemplo, metais não radioativos, tais como manganês, ferro e gadolinio, que são complexados com os quelato adequados tais como 2-benzil-DTPA e seus análogos de monometila e de ciclohexila. Veja N0 de série U.S. 09/921.290, depositado em 10 de outubro de 2001, que é incorporado em sua totalidade por referência.
As moléculas alvo de HIV podem ser rotuladas com um radioisótopo útil para imagem de diagnóstico. Os radioisótopos adequados podem incluir aqueles na escala de energia de 60 a 4.000 KeV, ou mais especificamente, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr 94mTc, 94Tc, 99raTc, 45Ti, 111In, 123I, 124I, 125I, 131If 154"158Gd, 177Lu, 32P, 188Re, e semelhante, ou uma combinação dos mesmos. Veja, por.exemplo, o Pedido de Patente U.S. intitulado "Labeling Targeting Agents with Gallium-68''- Inventores G.L.Griffϊths e W.J. McBride, e Pedido Provisional U.S. N0 60/342.104, que descreve emissores positron, tais como 18F, 68Ga, 94mTc, e semelhante, para finalidades de imagem; (incorporados aqui por referência). A detecção pode ser conseguida, por exemplo, por tomografia computadorizada de emissão de fóton única (SPECT), ou tomografia de emissão de positron (PET).
Em outra modalidade moléculas alvo de HIV podem ser rotuladas com um ou mais radioisótopos úteis para as células infectadas por HIV de matança, que incluem β-emissores (tais como 32P, 33P, 47Sc, 67Cu, 67Ga, 89Sr, 90Y, 111Ag, 125I, 131I7 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166 Ho, 166Dy, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re), emissores de elétron Auger (tais como 111In, 125I, 67Ga, 191Os, 193mPt, 195mPt, 195mHg), α-emissores (tais como 212Pb, 212Bi, 213Bi, 211At, 223Ra, 225Ac), ou uma combinação dos mesmos.
As moléculas alvo de HIV podem ser usadas para MRI por ligação a um ou mais agentes de intensificação de imagem, que podem incluir complexos dos metais selecionados do grupo consistindo em cromo (III), manganês (II), ferro (III), ferro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodímio (III), samário (III), itérbio (III), gadolínio (III), vanádio (III), terbio (III), disprósio (III), holmio (III) e érbio (III).
Similarmente, as moléculas alvo de HIV podem ser usadas para imagem de ultra-som ligando a um ou mais agentes de intensificação de imagem atualmente no mercado. Patente U.S. N0 6.331.175 descreve a técnica de MRI e a preparação dos anticorpos conjugados a um agente de intensificação de MRI e é incorporada em sua totalidade por referência.
Uma proteína funcional, tal como uma toxina, pode estar presente em moléculas alvo de HIV em diversas maneiras. Por exemplo, uma proteína funcional pode diretamente ser unida a um anticorpo anti-HIV ou fragmento como uma proteína de fusão, usando técnicas padrão de biologia molecular. As proteínas alternativamente funcionais podem covalentemente ser conjugadas aos anticorpos anti-HIV ou aos fragmentos por métodos de reticulação químicos conhecidos. As toxinas que podem ser usadas nesta consideração incluem ricin, abrin, ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxin-I Staphylococcal, proteína antiviral pokeweed, gelonin, toxina de difterin, exotoxina de Pseudomonas, e endotoxina de Pseudomonas. (Veja, por exemplo, Pastan et al., Cell (1986), 47:641; Goldenberg, CA-A Câncer Journal for Clinicians (1994), 44:43; Sharkey e Goldenberg, CA Câncer J. Clin. 56:226 (2006), cada um incorporado aqui por referência.) As toxinas adicionais adequadas para o uso aqui são conhecidas por aqueles versados na técnica e descritas nos U.S. 6.077.499, que são incorporadas em sua totalidade por referência. Outras proteínas funcionais de interesse incluem várias citocinas, enzimas, e proteínas fluorescentes.
Usos para Tratamento e Diagnóstico: aplicações que envolvem pré-alvejamento
Pré-alvejamento é um processo de multietapas desenvolvido originalmente para resolver a liberação do sangue lenta de anticorpos alvo diretamente, que contribui com a toxicidade indesejável aos tecidos normais, em particular, medula óssea. Com pré-alvejamento, um radionuclideo ou outro agente terapêutico é unido a um composto pequeno que é livre dentro dos minutos do sangue. 0 agente pré-alvejamento, que é capaz de reconhecer o composto radiorrotulado pequeno em adição ao antigeno alvo, é administrado primeiramente, e o composto radiorrotulado é suficientemente livre do sangue.
Um método pré-alvejamento de tratar ou de diagnosticar uma doença ou desordem em um indivíduo é fornecido por: (1) administrar ao indivíduo uma molécula alvo de HIV biespecífica como descrita acima, onde pelo menos um local de aglutinação de antigeno é dirigido contra um marcador de HIV, e o outro local de aglutinação de antigeno é dirigido á um constructo alvejável que contém um hapteno bivalente ; (2). opcionalmente administrar ao indivíduo uma composição transparente, e permitir que a composição clareie a estrutura de ligação da circulação; e (3) administrar ao indivíduo o constructo alvejável que contém um hapteno bivalente, onde o constructo alvejável mais adicional contém um ou mais agentes terapêuticos ou de diagnósticos quelatados ou ligados quimicamente. Uma variedade de agentes e métodos de clareamento é conhecida na técnica e pode ser usada para pré- alvejamento, tais como os anticorpos antiidiotípicos que complexam com um anticorpo alvo de HIV ou um "acessório de Tag ou etiquetas (por exemplo, monossacarídeos) a um anticorpo alvo de HIV que possa ser complexado com outros agentes (tal como, anticorpo de ligação monossacarídeo). O uso de interações de ligação avidin-biotin para métodos de clareamento é conhecido na técnica.
Igualmente é fornecido um método de terapia de pró-droga de enzima dependente de anticorpo (ADEPT) (1) administrando a um paciente uma molécula alvo de HIV como acima, onde a estrutura contém uma enzima covalentemente unida capaz de ativar uma pró-droga, (2) opcionalmente administrando ao indivíduo uma composição de clareamento, e permitindo que a composição clareie a estrutura de ligação da circulação, e (3) administrando a pró-droga ao paciente.
Constructo Alvejável IMP 411
Em modalidades preferidas, um constructo alvejável pode compreender uma ou mais porções histamina-succinil-glicina (HSG) e um local de aglutinação-antigeno pode ser associado com um anticorpo ou um fragmento de ligação HSG, tal como os 679 anticorpos ou fragmentos, (veja, por exemplo, a Patente U.S. N0 6.962.702, incorporada aqui por referência). Um constructo alvejável pode ser conjugado a qualquer agente de diagnóstico e/ou terapêutico conhecido, usando técnicas de pré-alvejamento conhecidas (por exemplo, Patente U.S. N0 6.962.702). Um constructo alvejável exemplar, conhecido como o IMP 411, que compreende duas porções HSG tem a fórmula DOTA-D-Cys (3-SP-Gly-20-0- SN38)-D-Als-D-Lys (HSG)-D-Tyr-D- Lys(HSG)-NH2. O IMP 411 pode ser ligado, por exemplo, aos agentes SN38 quimioterapêuticos, como indicado na fórmula acima. Alternativamente, outros agentes terapêuticos ou de diagnósticos podem ser incorporados em ou conjugados a mesma estrutura principal do peptideo.
Usos adicionais
Em determinadas modalidades, as moléculas alvo de HIV podem ser de uso no tratamento e/ou imagem de tecidos infectados por HIV, por exemplo, usando os métodos descritos nas Patentes U.S. Números 6.126.916; 6.077.499; 6.010.680; 5.776.095; 5.776.094; 5.776.093; 5.772.981; 5.753.206; 5. 7 4 6.996; 5.697.902; 5.32 8.67 9; 5.128.119; 5.101.827; e 4.735.210, cada uma incorporada aqui por referência. Os métodos adicionais são descritos no Pedido U.S. N0 de série 09/337.756 depositado em 22 de junho 1999 e no Pedido U.S. N0 de série 09/823.746 depositado em 3 de abril de 2001. Tal imagem pode ser conduzida pela rotulagem direta da molécula alvo de HIV, ou por um método de imagem pré-alvejado, como descrito em Goldenberg et al., "Antibody Pretargeting Advances Câncer Radioimmunodetection and Radiotherapy", (J. Clin. Oncol, 2006 24:823-34), veja também Publicação da Patente U.S. N0 20050002945, 20040018557, 20030148409 e 20050014207, cada uma incorporada aqui por referência.
Em algumas modalidades, as moléculas alvo de HIV descritas e reivindicadas aqui podem ser de uso em métodos de radioimunoterapia ou de terapia de radionuclideo (veja, por exemplo, Govindan et al., 2005, Tecnology in Câncer Research & Treatment, 4:375-91; Sharkey e Goldenberg, 2005, J. Nucl. Med. 46:115S-127S; Goldenberg et al. , 2006, J. Clin. Oncol. 24:823-34, cada um incorporado aqui por referência).
Em outra modalidade, um radiossensitizador pode ser usado em combinação com uma molécula alvo de HIV nua ou conjugada, anticorpo ou fragmento de anticorpo. Por exemplo, o radiossensitizador pode ser usado em combinação com uma molécula alvo de HIV radiorrotulada. A adição do radiossensitizador pode conduzir à eficácia realçada quando comparada ao tratamento com a molécula alvo de HIV radiorrotulada sozinha. Radiossensitizadores são descritos em D. M. Goldenberg (ed.), CÂNCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRC Press (1995), que é incorporado aqui por referência.
A molécula alvo de HIV, para uso em qualquer dos métodos reivindicados, pode ser associada ou administrada com citocinas e moduladores imune. Estas citocinas e moduladores imune, incluem pelo menos, interferons de alfa, beta e a gama, e fatores de estimulação de colônia. Entretanto, outros moduladores imune são conhecidos e podem ser usados, tais como IL-I, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, TNF-α, fatores de crescimento de célula tronco, Iinfotoxinas, eritropoietina, trombopoietina, G-CSF, GM-CSF, fator Sl ou uma combinação do mesmo.
As modalidades alternativas referem-se a métodos para a identificação intravenosa de tecidos infectados por HIV, em um indivíduo administrando uma quantidade eficaz de uma molécula alvo de HIV e um constructo alvejável. A molécula alvo de HIV compreende pelo menos um ABS que especificamente se liga a um antígeno de HIV, e pelo menos um ABS que especificamente se liga um constructo alvejável.
Kits
Algumas modalidades refrem-se a kits para praticar os métodos reivindicados. 0 kit pode incluir uma molécula alvo de HIV. A molécula alvo pode ser rotulada por qualquer um dos agentes descritos acima. Mais, a molécula alvo pode ser não rotulada mas o kit pode compreender reagentes de rotulagem para rotular a molécula alvo. Os reagentes de rotulagem, se incluídos, podem conter a etiqueta e um reticulador. 0 kit pode igualmente conter uma molécula alvo de HIV que compreende pelo menos um específico do anticorpo para um antígeno de HIV e pelo menos um específico do anticorpo para um veículo. O kit pode opcionalmente conter uma composição transparente para remover a molécula alvo de HIV de circulação.
Os componentes do kit podem ser empacotados juntos ou separados em dois ou mais recipientes separados. Em algumas modalidades, os recipientes podem ser tubos de ensaio que contêm as formulações estéreis, liofilizadas de uma composição que são adequadas para a reconstituição. Um kit pode igualmente conter um ou mais tampões adequados para a reconstituição e/ou a diluição de outros reagentes. Outros recipientes que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, um malote, bandeja, caixa, tubo, ou semelhante. Os componentes do kit podem ser empacotados e mantidos de forma esterilizada dentro dos recipientes. Outro componente que pode ser incluído é instruído a uma pessoa que usa um kit para seu uso.
Métodos de deteção, de diagnóstico e imagem do tecido da doença
Diagnóstico in vivo
Os anticorpos anti-HIV ou fragmentos são de uso para diagnóstico in vivo. Os métodos de imagem diagnostica com Mabs rotulados são bem conhecidos. Por exemplo, na técnica da imunoscintigrafia, os anticorpos anti-HIV são rotulados com um radioisótopo emitindo gama e introduzido em um paciente. Uma câmera gama é usada para detectar a posição e a distribuição de radioisótopos emitindo gama. Veja, por exemplo, Srivastava (ed.), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY (Plenum Press 1988), Chase, "Medicai Applications of Radioisotopes" em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edição, Gennaro et al. (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990), e Brown, "Clinicai Use of Monoclonal Antibodies", em BIOTECHNOLOGY AND PHARMAVY 227-4 9, Pezzuto et al. (eds.) (Chapman & Hall 1993) . Igualmente é preferido o uso de radionuclideos emitindo positron (isótopos PET) , tal como uma energia de 511 keV, tal como flúor-18 (18F), gálio-68 (68Ga), e iodo-124 (124I). Tal imagem pode ser conduzida pela rotulagem direta de anticorpo ou fragmento anti-HIV, ou por um método de imagem pré-alve j ado, como descrito em Goldenberg et al., 2006, J. Clin. Oncol. 24:823- 34; veja igualmente as publicações das Patentes U.S. números 20050002945, 20040018557, 20030148409 e 20050014207 da patente dos E.U., cada uma incorporada aqui por referência.
Para a imagem de diagnostica, os radioisótopos podem ser limitados ao anticorpo anti-HIV ou fragmentar diretamente ou indiretamente usando um grupo funcional intermediário. Os grupos funcionais intermediários úteis incluem queladores tais como ácido etilenodiaminatetraacético e ácido dietilenotriaminapentaacético. Por exemplo, veja Shih et al., supra, e Patente U.S. N0 5.057.313.
A dose de radiação entregada ao paciente é mantida a tão baixo nivel como possível com a escolha do isótopo para a melhor combinação de meia-vida mínima, retenção mínima no corpo, e quantidade mínima de isótopo que permitirá a deteção e a medida exata. Os exemplos dos radioisótopos que podem ser limitados ao anticorpo anti-HIV e são adequados para diagnóstico de imagem incluem 99mTc e 111In.
O anticorpo anti-HIV ou fragmentos do mesmo igualmente podem ser rotulados com íons paramagnéticos e uma variedade de agentes de contraste radiológico para finalidades de~ diagnóstico in vivo. Os agentes de contraste que são particularmente úteis para imagem de ressonância magnética compreendem gadolinio, manganês, disprósio, lantânio, ou ions de ferro. Os agentes adicionais incluem cromo, cobre, cobalto, níquel, rênio, európio, terbium, holmium, ou neodímio. O anticorpo anti-HIV ou fragmentos do mesmo podem igualmente ser conjugados ao contraste de ultra-som/aos agentes de intensificação. Por exemplo, um agente de contraste de ultra-som é um lipossoma que compreende um anti- HIV IgG humanizado ou fragmento do mesmo. Igualmente preferido, o agente de contraste de ultra-som é um lipossoma que seja gás enchido.
Em uma modalidade preferida, um anticorpo biespecífico pode ser conjugado a um agente de contraste. Por exemplo, o anticorpo biespecífico pode compreender mais de um agente de intensificação de imagem para uso em imagem de ultra-som. Em uma modalidade preferida, o agente de contraste é um lipossoma. Preferivelmente, o lipossoma compreende um DTPA- peptídeo bivalente unido covalentemente à superfície exterior do lipossoma. Ainda mais preferido, o lipossoma é gás enchido.
Agentes de imagem e radioisótopos
Em determinadas modalidades, os peptídeos ou proteínas reivindicados podem ser unidos aos agentes de imagem do uso para imagem e diagnóstico de vários órgãos, tecidos ou tipos de célula doentes. Muitos agentes de imagem adequados são conhecidos na técnica, como são métodos para seu acessório a proteínas ou peptídeos (veja, por exemplo, as Patentes U.S. 5.021.236 e 4.472.509, ambas incorporadas aqui por referência). Determinados métodos de acessório envolvem o uso de um complexo quelato metal empregando, por exemplo, um agente de quelação orgânico tal como DTPA unido à proteína ou peptídeo (Patente U.S. 4.472.509). As proteínas ou peptídeos igualmente podem ser reagidos com uma enzima na presença de um agente do acoplamento tal como glutaraldeído ou periodato. Os conjugados com marcadores de fluoresceína são preparados na presença destes agentes de acoplamento ou pela reação com um isotiocianato.
Exemplos não-limitantes de íons paramagnéticos de uso potencial como agentes de imagem incluem cromo (III), manganês (II), ferro (III), ferro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodímio (III), samarium (III), ytterbium (III), gadolínio (III), vanádio (II), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III) e érbio (III), com gadolínio sendo particularmente preferido. Os íons úteis em outros contextos, tais como imagem de raio-X, incluem mas não são limitados a lantânio (III), ouro (III), ligação (II), e especialmente bismuto (III).
Os radioisótopos de uso potencial como agentes de imagem ou agentes terapêuticos incluem astatina211, "carbono, 51cromo, 36Cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre62, cobre64, cobre67, 152Eu, flúor18, gálio67, gálio68, 3hidrogênio, iodo123, iodo124, iodo125, iodina131, ídio111, 52ferro, 59ferro, 32fósforo, 33fósforo, rênio186, rênio188, Sc47, 75selênio, prata111, 35enxofre, tecnício94m tecnício99m ítrio86 e ítrio90 . 125I é também freqüentemente preferido devido a sua baixa energia e adequabilidade para detecção da escala longa.
As proteínas ou peptídeos radioativamente rotulados podem ser produzidos de acordo com métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, podem ser iodinados pelo contato com iodeto de potássio ou sódio e um agente de oxidação químico tal como o hipocloreto de sódio, ou um agente de oxidação enzimático, tal como lactoperoxidase. As proteínas ou peptídeos podem ser rotulados com Tc99m pelo processo da troca de ligando, por exemplo, reduzindo pertechnate com solução estanosa, quelando o Tc reduzido em uma coluna de Sephadex e aplicando o peptídeo a esta coluna ou por técnicas de rotulagem diretas, por exemplo, incubando o pertechnate, um agente de redução tal como SNCl2, uma solução tampão tal como solução ftalato de potássio-sódio, e o peptídeo. Grupos funcionais intermediários que são usados freqüentemente para ligar os radioisótopos que existem enquanto os íons metálicos aos peptídeos incluem o ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) , DOTA, ΝΟΤΑ, os queladores de porfirin e o ácido etileno diaminatetracético (EDTA). Igualmente são contempladas para o uso as etiquetas fluorescentes, incluindo rodamina, isotiocianato de fluoresceina e o renografin.
Em determinadas modalidades, os anticorpos anti-HIV ou os fragmentos podem ser ligados a um ligando de ligação secundária ou a uma enzima (uma enzima Tag) que irá gerar um produto colorido em cima do contato com um substrato cromogênico. Os exemplos de enzimas adequadas incluem urease, fosfatase alcalina, peroxidase de hidrogênio (rábano silvestre) e oxidase de glicose. Ligandos de aglutinação secundários preferidos são compostos de biotina e avidin ou streptavidin. 0 uso de tais etiquetas é conhecido por aqueles versados na técnica naa luz e é descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 e 4.366.241; cada uma incorporada aqui por referência. Estas etiquetas fluorescentes são preferidas para usos in vitro, mas podem igualmente ser de utilidade in vivo em aplicações, particularmente em procedimentos de detecção endoscópica ou intravenosa.
Em modalidades alternativas, o anticorpo anti-HIV ou os fragmentos podem ser rotulados com um marcador fluorescente. Exemplos não-limitantes de etiquetas fotodetectáveis incluem Alexa 350, Alexa 430, AMCA, aminoacridina, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, B0DIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY- TRX, 5-carbóxi-4',5'-dicloro-2', 7 '-dimetóxi fluoresceina, 5- carbóxi-21,41,51,71 -tetraclorofluoresceina, 5- carboxifluoresceina,5-carboxirrodamina, 6-carboxirrodamina, 6-carboxitetrametil amino, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5,6-FAM, cloreto de dansila,Fluoresceina, HEX, 6-JOE, NBD (7- nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, ácido ftálico, ácido tereftálico, ácido isoftálico, cresil violeta rápida, cresil violeta azul, cresil azul brilhante, ácido para- aminobenzóico, eritrosina, ftalocianinas, azometinas, cianinas, xantinas, succinilfluoresceinas, criptatos de metal alcalino-terroso, trisbipiridina diamina európio, um criptato ou quelato de európio, diamina, dicianinas, corante azul La Jolla, alopicocianina, alococianina B, ficocianina C, ficocianina R, tiamina, ficoeritrocianina, ficoeritrina R, REG, Rodamina Verde, isocianato de rodamina, rodamina vermelha, ROX, TAMRA, ΤΕΤ, TRIT (tetrametil rodamina isotiol), tetrametilrodamina, e Texas Red. Estas e outras etiquetas luminescentes podem ser obtidas das fontes comerciais tais como Molecular Probes (Eugene, OR).
Os compostos de rotulagem quimiluminescentes de uso podem incluir o luminol, o isoluminol, um éster aromático do acridinio, um imidazol, um sal de acridinio e um éster oxalato, ou um composto bioluminescente tais como luciferin, luciferase e aequorin.
Em várias modalidades, as etiquetas de uso podem compreender nanoparticulas de metal. Os métodos de preparar nanoparticulas são conhecidos. (Veja, por exemplo, Patentes U.S. números 6.054.495; 6.127.120; 6.149.868; Lee e Meisel, J. Phys. Chem. 8 6:3391-3395, 1982). Nanoparticulas podem igualmente ser obtidas das fontes comerciais (por exemplo, Nanoprobes Inc., Yaphank, NY; Polysciences, Inc., Warrington, PA). As nanoparticulas modificadas estão disponíveis comercialmente, como nanoparticulas Nanogold® de Nanoprobes, Inc. (Yaphank, NY). As nanoparticulas funcionalizadas de uso para conjugação às proteínas ou peptídeos podem comercialmente ser obtidas.
Reticulantes
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-HIV ou fragmentos ou outras moléculas alvo de HIV podem ser rotulados usando os vários reagentes de reticulação conhecidos na técnica, tal como reagentes de reticulação homo-bifuncionais, hetero-bifuncionais e/ou fotoativáveis. Os exemplos não-limitantes de tais reagentes incluem bisimidatos; 1,5-diflúor-2,4-(dinitrobenzeno); N- hidroxissuccinimida éster de ácido subérico; tartarato do dissuccinimidila; dimetil-3,3'-ditio-bispropionimidato; N- succinimidil-3-(2-piridilditίο)propionato; 4- (bromoaminoetil)-2-nitrofenilazida; e 4-azidoglioxal. Em uma modalidade exemplar, um ligante reticulante de carbodiimida, tal como DCCD ou EDC, pode ser usado aos resíduos acidicos reticulados a amino ou outros grupos. Tais reagentes podem ser modificados para unir vários tipos de etiquetas, tais como etiquetas fluorescentes.
Os reagentes de reticulação bifuncionais foram usados extensivamente para uma variedade de finalidades. Reagentes homobifuncionais que carregam dois grupos funcionais idênticos provaram ser altamente eficientes em induzir reticulação entre macromoléculas ou subunidades idênticas e diferentes de uma macromolécula, e ligamento de ligandos de polipeptídeo a seus locais de aglutinação específicos. Os reagentes heterobifuncionais contêm dois grupos funcionais diferentes. Aproveitando-se as vantagens das reatividades diferenciais dos dois grupos funcionais diferentes, a reticulação pode ser controlada seletivamente e seqüencialmente. Os reagentes de reticulação bifuncionais podem ser divididos de acordo com a especificidade de seus grupos funcionais, por exemplo, amino, sulfidrila, guanidino, indol, grupos específicos carboxila. Destes reagentes direcionados para grupos aminos livres tornaram-se especialmente populares por causa de sua disponibilidade comercial, facilidade da síntese e das condições suaves de reação sob as quais podem ser aplicadas. Uma maioria de reagentes de reticulação heterobifuncionais contém um grupo reativo amina primária e um grupo reativo tiol.
Em outro exemplo, os reagentes de reticulação heterobifuncionais e os métodos de usar os reagentes de reticulação são descritos (Patente U.S. 5.889.155, incorporada aqui por referência). Os reagentes de reticulação combinam um resíduo hidrazida nucleofílico com um resíduo maleimida eletrofílico, permitindo que o acoplamento em um exemplo, dos aldeídos a tióis livres. O reagente de reticulação pode ser modificado aos vários grupos funcionais de reticulação.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam as técnicas descobertas para funcionar bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas para constituir modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente descrição, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obtém como ou resultado semelhante sem partir do espírito e do espaço da invenção.
Exemplo 1. Inibição de inf ecção por HIV in vi tiro e in vivo usando anticorpos anti-HIV conjugados
Sumário
Para demonstrar a eficácia de um imunoconjugado contra HIV-I, o anticorpo monoclonal murino (Mab) contra o antígeno de envelope HIV (P4/D10) foi conjugado com a droga anticancerosa convencional, doxorrubicin, e testado contra o vírus infeccioso e às células infectadas, in vitro e in vivo. O anticorpo P4/D10 foi incubado com vírus livre (neutralização) ou células infectadas por HIV (inibição) e a infecção resultante foi medida por um ensaio de imunoabsorção ligado à enzima de captura p24. Em um modelo de desafio de camundongo HIV-l/MuLV a habilidade do conjugado para inibir a infecção foi medida in vivo.
P4/D10 Doxorrubicin conjugado neutraliza HIViiib e elimina a propagação intercelular e a réplica de HIV em células Jurkat infectadas in vitro. Igualmente protegeu ratos do desafio com HIVIIIB/MuLV em uma concentração mais baixa óctupla do que necessário para o anticorpo livre, visto que nenhum efeito foi observado para a droga livre ou controles conjugados irrelevantes.
Estes resultados demonstram que o doxorrubicin foi concentrado a células infectadas por HIV pelo anticorpo P4/D10, significativamente (p=0.0001) contribuindo à eliminação do HIV. As mesmas composições e métodos são de uso para erradicar células T expressando antigeno remanescente nos pacientes tratados com ART (terapia anti-retroviral) .
Neste estudo, nós conjugamos doxorrubicin, uma antraciclina anticancerosa com farmacologia conhecida, toxicologia, e atividade antitumor nos pacientes, a uma neutralização e a um ADCC negociando o anticorpo monoclonal (Mab) desenvolvido contra o envelope exterior gpl20 de HIV-I (terceira região variável do laço).
O anticorpo P4/D10 conjugado a doxorrubicin foi testado in vitro para sua eficácia em eliminar as células infectadas por HIV-I entre células não infectadas e em um modelo de camundongo removendo HIV-I/MuLV (virus murino de leucemia) células singênicas infectadas da cavidade intraperitoneal. O anticorpo anti-gpl20, P4/D10, neutraliza o virus de HIV-I e negocia ADCC (Broliden et al., 1990) . Foi usado igualmente em sua forma não conjugada em um ensaio clinico da fase-I para os indivíduos infectados no último estágio de HIV-I, onde diminuiu antígenos de HIV por um período de tempo prolongado (Hinkula et al. , 1994). 0 estudo presente foi o primeiro a examinar a combinação de P4/D10 em uma forma de droga conjugada em um modelo pré-clínico de HIV, em comparação com o Mab livre, droga livre, e os anticorpos irrelevantes hRS7 (Stein et al. , Int J Câncer 1993, 55:938-946) e hLLl Griffiths et al., Clin Câncer Res 2003, 9:6567-6571; Sapra et al., Clin Câncer Res 2005, 11:5257-52 64), que foram conjugados similarmente com doxorrubicin.
Materiais e Métodos
Anticorpos e conjugação da droga. A conjugação de doxorrubicin com o anticorpo anti-gpl20 P4/D10 de IgGlK (Broliden et al. , 1990) e os anticorpos do controle, assim como a preparação do derivado bifuncional de hidrazona de doxorrubicin com um grupo maleimida, foi executada de acordo com Griffiths et al. (2003). Momentaneamente, os anticorpos P4/D10, hLLl (anti-CD74 humanizado), e hRS7 (anti-EGP-1 humanizado) em uma concentração final de aproximadamente 9 mg/ml, foram reduzidos suavemente com DTT (ditiotreitol) em PBS (pH 7.5) contendo EDTA de 5 mM, usando aproximadamente 2.2 mM de concentração final de DTT, correspondendo a um excesso molar de 38 dobras do reductante no que diz respeito aos anticorpos. As soluções foram incubadas em 37°C por 40 min. Os Mabs reduzidos foram purificados em colunas de rotação de Sephadex G50/80 no tampão de acetato de sódio de 50 mM contendo 150 mM de NaCl e EDTA de 2 mM (pH 5.3). 0 número de grupos tiolato gerado nos anticorpos foi determinado pelo ensaio Ellman1 s. Para a conjugação, os anticorpos suavemente reduzidos em 6.5 mg/ml foram misturados com doxorrubicin bifuncional. Os incubados foram mantidos no gelo por 15 minutos, e purificados nas colunas de rotação de G50/80 em acetato do sódio de 0.1 M (pH 6.5), seguido pela passagem através de uma coluna curta de Bio-Grânulos SM2 (Bio-Rad, Hercules, CA) equilibrada no mesmo tampão. Os produtos foram analisados para relações de substituição doxorrubicin/Mab medindo a absorvência. As análises de HPLC de exclusão de tamanho foram executadas em uma coluna analítica BioSil 250.
Um lote produzido por GMP de IgG dos pacientes infectados por HIV (HIVIgG) (Guay et al., AIDS 2002, 16:1391- 1400) foi usado como controle positivo e o soro dos indivíduos HIV negativos como controles negativos. Doxorrubicin livre, assim como Mabs humanizado anticanceroso LLl e RS7, conjugados similarmente com doxorrubicin, foram incluídos como controles para o anticorpo P4/D10 conjugado.
Ensaio de neutralização de HIV-I. Doxorrubicin P4/D10, imunoglobulina não rotulada P4/D10, HIV (HIVIgG), e soro HIV negativo foram misturados com HIV-inB (LAI) isolado de HIV-I e incubados por Ih em 37°C antes que 50.000 células T Jurkat/cavidades forem adicionadas. Após Ih de incubação, as células foram lavadas com meio e meio completo novo adicionado (200 μl/cavidade). Após 7 dias de cultura, a quantidade de p24 produzido foi medida por uma captação p24 ELISA (ensaio de imunoabsorção ligado à enzima) e a inibição em por cento de produção HIV-I p24 foi calculada.
Inibição de HIV-I ín vitro. As células T Jurkat foram infectadas com o HIV-me misturando células 5-10xl06 com IOOx TCID50 e incubando por Ih a 37°C. As células foram lavadas no meio e incubadas em 37°C. Cada terceiro dia, meio foi mudado e o sobrenadante foi verificado para produção p24. Quando perto de 100% as células foram infevtadas, as proporções diferentes de células infectadas por HIV-IIIB foram misturadas com as células não infectadas. As células foram tratadas com as diluições seriais dos anticorpos, soro, ou doxorrubicin livre de 100 a 0.00001 yg/ml. Após sete dias de cultura em 37°C, a inibição de HIV-I p24 foi medida e os sobrenadantes das células tratadas previamente com 0.1-10 yg/ml de doxorrubicin-P4/DlO, P4/D10 não conjugado, e 0.05-0.5 mg/ml soro HIV negativo foram coletados e transferidos às células T Jurkat frescas para testar se o HIV infeccioso foi identificado pelo p24 ELISA nos dias 3, 7, 10, 12, e 15 após a iniciação da cultura.
Modelo de desafio de HIV-l/MuLV. Uma linhagem de célula T humana, CEM-IB, com um genoma MuLV geneticamente integrado, foi infectada com HIV-Iiiib, que conduziu à produção de pseudovirus com o genoma de HIV-I e o envelope de MuLV (Adang et al., PNAS USA 1999, 96:127 4 9-7 53; Hinkula et al. , Cells Tissues Organs 2004, 177:169-184). Estes virus sobrenadantes foram usados para contaminar esplenócitos dos ratos transgênicos de C57Bl/6xDBA Fl Kb/d para HLA-A201. Os ratos isogênicos foram desafiados com esplenócitos infectados HIV- luib/MuLV i.p. e foram imediatamente dados os anticorpos conjugados, anticorpos livres ou doxorrubicin livre i.p. Dez dias após o desafio, os ratos foram sacrificados e as células peritoneais coletadas. As células peritoneais foram peletizadas e adicionadas a células T Jukart suscetíveis de HIV IxlO6 ou PBMC humano crescido em placas de 24 cavidades. Destas culturas secundárias, o sobrenadante foi removido e o meio fresco adicionou cada 3-4 dias. A quantidade de HIV infeccioso recuperada no sobrenadante foi medida por 3 semanas por p24 ELISA.
Análise Estatística. Para comparar as capacidades de neutralização de HIV-1 in vitro do anti-gp120 Mabs e controlar anticorpos, teste-t de estudantes e o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foram usados. As comparações estatísticas entre os grupos de ratos tratados com os anticorpos diferentes foram executadas usando os testes não paramétricos de Mann-Whitney U e de Kruskal-Wallis. Uma diferença foi considerada significativa quando um p-valor de <0,05 foi obtido. Uma vez o teste ANOVA não paramétrico foi realizado usando versão 4.0a de GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) e foi usado para comparações de isolação de HIV-1 e positividade de antígeno p24 entre grupos de estudo.
Resultados
O número de grupos tiol gerado nos anticorpos respectivos pela redução suave, assim como as relações da substituição de doxorrubicin/Mab nos conjugados purificados finais, variou entre 8.8 (P4/D10, hRS7) e 9.4 (hLL1), dando uma relação de aproximadamente 9 moléculas de droga por IgG. As análises cromatográficas líquidas de alta pressão mostraram que os conjugados e o Mabs nativo possuíram tempos de retenção similares, com zero à agregação mínima (dados não mostrados).
Nenhuma diferença significativa na capacidade de neutralização de HIV-1 de vírus livre de HIV-1 (FIG. 1A) podia ser mostrada entre o P4/D10 Mab conjugado de doxorrubicin e P4/D10 Mab não conjugado ou os anticorpos de HIVIgG. Entretanto, todos os anticorpos específicos de HIV-1 foram significativamente melhores do que o soro negativo de controle (p=0.001) na neutralização HIV-IIIB.
Quando as células Jurkat infectadas HIV-1IIIB de 3% foram misturadas com as células não infectadas de 97%, doxorrubicin-P4/DlO negociou uma inibição mais forte de propagação intercelular de significativamente (p=0.002) da infecção de HIV-I do que livre P4/D10, o anticorpo de controle conjugado de doxorrubicin, hLLl, ou doxorrubicin livre em uma concentração de 0.5 ou 0.05 pg/ml (FIG. 1B). Os resultados semelhantes foram considerados em todas as concentrações restantes de células infectadas e não infectadas. Era do interesse particular que a propagação intercelular da infecção pareceu ser inibida mais potencialmente do que o efeito obtido com doxorrubicin-P4/D10 como um agente de neutralização. Também, nenhum virus infeccioso poderia ser encontrado nas culturas tratadas com as doses elevadas de doxorrubicin-P4/D10, desde que nenhuma produção p24 foi detectada após transferência dos sobrenadantes destas culturas de célula às células Jurkat não infectadas (dados não mostrados). A diferença significativa de fato entre doxorrubicin-P4/D10 e P4/D10 não conjugado não poderia ter sido prevista dos resultados na neutralização do virus livre de HIV-I (FIG. IA).
Para testar a eficácia do anticorpo doxorrubicin-P4/DlO in vivo, os ratos foram dados a células infectadas de HIV/MuLV isogênicas junto com conjugado intraperitonealmente. As células peritoneais foram colhidas 10 dias mais tarde e o HIV infeccioso foi demonstrado em todos os controles, estudos precedentes a similares (Hinkula et al., 2004). O anticorpo doxorrubicin-P4/D10 protegeu ratos completamente contra desafio com as células linfóides primárias infectadas por HIV-I (p=0.0001) (FIG. 2). Nenhum HIV infeccioso foi recuperado das células peritoneais após o desafio e o tratamento com 100 pg do anticorpo doxorrubicin-P4/DlO.
Quando os ratos foram tratados com 100 pg do anticorpo P4/D10 não conjugado, todos eram positivos para a produção p24. A proteção completa pelo anticorpo sozinho foi considerada somente quando a dose era a dobra oito aumentada, 800 pg de P4/D10 não conjugado por camundongo. Nenhum dos anticorpos de controle conjugados doxorrubicin (hLLl ou hRS7) forneceu qualquer proteção em doses de 100-200 μς, nem fizeram doses de 100-400 μg de doxorrubicin livre. Discussão
Os resultados acima mostram que as propriedades de inibição de virus totais de um anticorpo dirigido contra o envelope de HIV-I poderiam ser amplificadas significativamente acoplando a doxorrubicin. Doxorrubicin- P4/D10 era capaz de eliminar células infectadas HIV-I in vitro, assim como um modelo de desafio experimental in vivo. A habilidade de P4/D10 Mab não conjugado para negociar ADCC contra HIV-I contaminou células alvo assim como a neutralização de HIV-I (Broliden et al., 1990; Hinkula et al., 1994) pode realçar sua eficácia como um imunoconjugado de droga em uma maneira não tóxica.
Um anti-CD74 Mab anticanceroso, LLl, conjugado similarmente a doxorrubicin, tem nas doses muito baixas mostradas a atividade notável in vitro e em modelos humanos xenógrafos de linfoma não-Hodgkin1s ou mieloma múltiplo (Griffiths et al., 2003; Sapra et al., 2005). Estes estudos, assim como a toxicologia nos macacos, indicaram que somente as doses muito elevadas do imunoconjugado conduziriam à evidência da supressão de medula óssea, mas nenhuma toxicidade cardíaca relativa a doxorrubicin foi observada (Sapra et al., 2005). Para evitar o escape do vírus, os anticorpos dirigiram contra ambos os locais variáveis e conservados de epítopos acessíveis de HIV devem ser testados juntos (Trkola et al., 2005; Ferrantelli et al., J Infect Dis 2004, 189:2167-2173).
Em estudos in vitro anteriores, as imunoglobulina específicas de HIV-I conjugadas às células infectadas HIV- lremovidas de Pseudomonas exotoxina A (PE4 0) (Pincus et al., 2003; Ashorn et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87:8889- 8893). Entretanto, nos ensaios clínicos, PE40 acoplou-se às células CD4 provadas ser imunogênicas e hepatotóxicas (Davey et al., 1994; Ramachandran et al., 1994). Assim, os presentes resultados, mostrando a eficácia de um conjugado Mab de doxorrubicin com quase ou nenhum efeito secundário, são surpreendentes e inesperados. A toxicidade de PE40-CD4 pôde ser explicada pela formação de complexos tóxicos com gpl20 livre, que está presente em concentrações elevadas em pacientes tratados não-ART com carga viral elevada (Berger et al., 1998). A fim de evitar os problemas potenciais de toxicidade associados com as cargas virais elevadas, as moléculas que alvejam epitopos de envelope HIV devem preferivelmente ser usadas no ajuste quando a carga viral é baixa, como durante ART, cedo na infecção por HIV ou mesmo imediatamente depois de uma exposição conhecida ou potencial à infecção com HIV. Por exemplo, os trabalhadores da área médica se expõem à agulha acidental com HIV contaminado ou potencialmente sangue contaminado ou outros fluidos podem ser tratados com um anticorpo conjugado de acordo com os métodos descritos. Em conseqüência da atividade anticelular do conjugado doxorrubicin-P4/D10, a adição de um conjugado de droga aos pacientes tratados com ART pode eliminar células carregando antigeno assim como virions livres, e reduzir assim a carga viral mesmo mais adicional. O versado realizará que as composições e os métodos reivindicados não estão limitados a um conjugado de doxorrubicin P4/D10, mas um pouco pode utilizar outros agentes citotóxicos conhecidos conjugados a P4/D10 ou a outros anticorpos anti-HIV conhecidos.
Em outras modalidades, a fim de evitar a toxicidade não especifica, os anticorpos biespecificos e outras estratégias de pré-alvejamento podem ser usados, em que o anticorpo alvo e a entrega do agente tóxico são separados (Wu et al., 2005) . Esta estratégia mostrou resultados prometedores em experimentações pré-clinicas e em clinicas de câncer (Forero et al., Blood 2004, 104:227 - 236; Rossi et al., Clin Câncer Res 2005, 11: 7122s-7129s) . Para o uso in vivo em indivíduos humanos, as formas humanas ou humanizadas do anticorpo para o uso clínico repetido são preferidas.
Exemplo 2 . Tratamento de um paciente infectado por HIV depois de ART
Um paciente masculino idoso de 47 anos é determinado ser seropositivo por HIV. 0 paciente tem uma contagem CD4 de menos do que 200/mm3. 0 paciente é tratado com um regime padrão de inibidor nevirapina de transcriptase reversa de não nucleosideo. A contagem de célula CD4 melhora a 300/mm3, mas o paciente é ainda soropositivo para HIV. 0 paciente é tratado com o anticorpo doxorrubicin-P4/DlO humanizado. O paciente de contagem CD4 melhora a 350/mm3 excedente e o paciente não é soropositivo para HIV. Um ano mais tarde, o paciente permanece assintomático e não há nenhuma presença detectável de infecção por HIV.
Exemplo 3. Tratamento de um trabalhador da área médica após a agulha acidental
Uma médica idosa, enfermeira de 30 anos é exposta a uma agulha acidental com sangue soropositivo. Dentro de 1 hora, o indivíduo é tratado com o anticorpo doxorrubicin-P4/DlO humanizado. Um ano mais tarde, não há nenhum sinal da infecção por HIV no indivíduo.
Exemplo 4. Tratamento com outras Citotoxinas e/ou anticorpos
Um paciente masculino idoso de 28 anos é determinado ser soropositivo para HIV. O paciente tem uma contagem CD4 de menos do que 200/mm3. O paciente é tratado com um regime padrão de inibidor nevirapina de transcriptase reversa de não nucleosideo. Δ contagem de .célula CD4 melhora a 300/mm3, mas o paciente é ainda soropositivo para HIV. 0 paciente é tratado com um anticorpo biespecífico que compreende um scFv humanizado, preparado usando os métodos descritos na Patente U.S. N0 7.052.872 (incorporada aqui por referência). Uma incubação 24h após injeção foi usada para permitir anticorpo biespecífico para liberar circulação, seguido por injeção de 5-fluorouracil conjugado a peptídeo IMP-I56 alvo (Jd.). 0 paciente de contagem CD4 melhora a 350/mm3 excedente e o paciente não é soropositivo para HIV. Um ano mais tarde, o paciente permanece assintomático e não há nenhuma presença detectável de infecção por HIV.
Exemplo 5. Pré-alvejamento com IMP411 Um paciente masculino idoso de 35 anos é determinado ser soropositivo por HIV. 0 paciente tem uma contagem CD4 de menos do que 180/mm3. 0 paciente é tratado com um regime padrão de inibidor nevirapina de transcriptase reversa de não nucleosideo. A contagem de célula CD4 melhora a 250/mm3, mas o paciente é ainda soropositivo para HIV. 0 paciente é tratado com um anticorpo biespecifico que compreende um anti- gpl20 P4/D10 IgGl χ Fab-679 biespecifico, preparado pela técnica de DNL usando os métodos descritos nos Pedidos de Patente U.S. Números de série 11/389.358, 11/391.584, 11/478.021 e 11/633.729, incorporados aqui por referência. Uma incubação de 24h após injeção foi usada para permitir que o anticorpo biespecifico livre libere circulação, seguida por injeção de SN38 conjugado a peptideo IMP-411 alvo. O paciente de contagem CD4 melhora a 325/mm3 excedente e o paciente não é soropositivo para HIV. Um ano mais tarde, o paciente permanece assintomático e não há nenhuma presença detectável de infecção por HIV.
Exemplo 6. Humanização de anticorpo anti-HIV
cDNAs que codificam as regiões VL e VH de um anticorpo monoclonal de camundongo contra proteína de envelope HIV são isolados e separada recombinantemente subclonados em vetores de expressão mamíferos contendo os genes que codificam kappa e regiões constantes de IgGi, respectivamente, de anticorpos humanos. Cotransfecção de células mamíferas com estes dois resultados de DNAs recombinantes na expressão de um Mab humanizado que tenha as mesmas características terapêuticas e de aglutinação do camundongo Mab de origem.
Os CDRs de VK e VH DNAs são recombinantemente ligados às seqüências de estrutura (FR) das regiões humanas de VK e VH, respectivamente, que são ligadas subseqüentemente, respectivamente, ao kappa humano e às regiões constantes de IgGi, para expressar em células mamíferas. Geralmente, como discutido aqui, Mabs "quimérico" são formados juntando ou subclonando regiões murino de VK e VH à luz constante humana e às cadeias leves e pesadas, respectivamente, enquanto Mabs "humanizados" são mais derivatizados substituindo as seqüências de estrutura murino (FR) no Mab quimérico com as seqüências humanas correspondentes FR. Como discutido abaixo, o Mab humanizado pode mais ser aperfeiçoado pela recolocação de um ou mais aminoácidos humanos FR com ácidos aminoácidos murino FR correspondentes, particularmente para os resíduos FR que tocam ou perto dos resíduos de aminoácidos de CDR.
Em várias modalidades, os domínios variáveis do anticorpo podem ser modelados pela modelagem de computador (veja, por exemplo, Dion, "Humanization of Monoclonal Antibodies: Molecular Approaches and Applications", em Goldenberg et al. Eds., Câncer Therapy With Radiolabeled Antibodies, Ch. 19 CRC Press, Boca Raton, Fla., 1994), que é incorporado aqui por referência. Geralmente, a estrutura 3-D para Mabs é modelada melhor por homologia, preferivelmente seguindo identificação das seqüências FR humanas que mostram (sobre 75%, preferivelmente sobre 85%, mais preferivelmente sobre 90%, mais preferivelmente sobre 95%) homologia elevada com as seqüências murino FR a serem substituídas. Na medida do possível, as recolocações dos grupos laterais devem ser executadas para manter o ângulo de torsão entre Cα e Cβ. A minimização da energia pode ser realizada pelo campo de força AMBER (Weiner et al. , J. Amer. Chem. Soe. 106:765, 1984) usando o método convergente. As interações potencialmente críticas de FR-CDR podem ser determinadas inicialmente modelando as cadeias variáveis leves e pesadas. Todos os resíduos murino FR dentro de um raio de 4.5 angstrom de todos os átomos dentro de cada CDR podem desse modo ser identificados e retidos no modelo final do projeto do anticorpo humanizado.
Uma vez as seqüências para os domínios de VK e VH são projetadas, o enxerto de CDR pode ser realizado pela síntese do gene usando oligonucleotídeos longos de DNA sintético como moldes e oligonucleotídeos curtos como iniciadores em uma reação de PCR. Na maioria dos casos, o DNA que codifica o domínio de VK ou VH será aproximadamente de 350 bp por muito tempo. Aproveitando-se a degeneração do códon, um local de restrição único pode facilmente ser introduzido, sem mudar os aminoácidos codificados, em regiões perto do meio da seqüência de DNA de gene V. Dois oligonucleotideos de DNA de duplo filamento não sobrepostos longos de cerca de 150 bp a jusante e a montante do local de restrição podem ser gerados pelo sintetizador de oligonucleotideo de DNA automatizado (Cyclone Plus DNA Synthesizer, Milligen-Biosearch). Enquanto os rendimentos de oligonucleot ideos de DNA de comprimento total podem ser esperados ser baixos, eles podem ser amplificados por dois pares de iniciadores flanqueando em uma reação de PCR.
Os iniciadores podem ser projetados com os locais de restrição necessários para facilitar subclonagem subseqüente.
Os iniciadores para oligo A e para oligo B devem conter a seqüência de sobreposição no local de restrição de modo que o produto resultante PCR para oligos AeB, respectivamente, possa ser juntado em estrutura no local de restrição para formar uma seqüência de DNA de comprimento total (ca 350 bp) que codifica o domínio de VH.
A ligadura dos produtos de PCR para oligos AeBe sua subclonagem em locais de restrição adequados do vetor de plataforma podem ser terminadas em uma única etapa de ligadura de três fragmentos. A subclonagem da seqüência correta no vetor de plataforma pode primeiramente ser analisada pela análise de digestão de restrição e subseqüentemente ser confirmada por reação de seqüenciamento de acordo com Sanger et al., Proc. Nacional. Acad. Sei. USA 74:5463 (1977).
Um fragmento de restrição que contém o promotor de Ig, a seqüência líder e a seqüência de VH podem ser extirpadas do vetor da plataforma e subclonadas aos locais correspondentes em um vetor baseado em pSVgpt, que contém a seqüência genômica da região constante humana de IgG, de um intensif icador de Ig e de um marcador de seleção gpt, formando o vetor de expressão final. As estratégias similares podem ser empregadas para a construção da seqüência de VK.
A seqüência de DNA contendo promotor de Ig, seqüência lider e a seqüência do anti-HIV VK podem ser extirpadas do vetor da plataforma pelo tratamento com endonucleases adequadas, e podem ser subclonadas nos locais correspondentes de um vetor baseado em pSVhyg, o pKh, que contém a seqüência genômica de regiões constantes de cadeia kappa humana, um marcador de seleção higromicin, um intensificador Ig e um kappa, formando o vetor de expressão final.
Porque a humanização conduz às vezes a uma redução ou mesmo a uma perda de afinidade do anticorpo, a modificação adicional pôde ser exigida a fim de restaurar a afinidade original (veja, por exemplo, Tempest et al., Bio/tecnology 9:266 (1991); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), que são incorporados por referência. Geralmente, para preparar anti-HIV Mab quimérico, as cadeias de VH e VK do anti-HIV Mab podem ser obtidas pelo clonagem de PCR usando produtos e iniciadores de DNA. Orlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1989, 86:3833), e Leung et al. (BioTechniques, 1993, 15:286). Os iniciadores de PCR VK podem subclonados em um vetor de plataforma baseado pBR327 (VKpBR) como descrito acima. Os produtos de PCR VH podem ser subclonados em um vetor de plataforma baseado em Bluescript similar (VHpBS) como descrito acima. Os fragmentos que contêm as seqüências de VK e VH, junto com as seqüências de promotor e de peptideo de sinal, podem ser extirpados dos vetores de plataforma usando endonucleases de restrição adequadas. Os fragmentos de VK (aproximadamente 600 bp) podem ser subclonados em um vetor de expressão mamífero (por exemplo, pKh) convencionalmente. 0 pKh é um vetor de expressão baseado em pSVhyg que contém a seqüência genômica da região constante kappa humana, de um intensificador de Ig, um intensificador kappa e o gene resistente a higromicin. Similarmente, os aproximadamente 800 fragmentos VH de bp podem ser subclonados em pGlg, um vetor de expressão baseado em pSVgpt que carrega a seqüência genômica da região constante humana de IgGl, um intensificador de Ig e o gene xantina guanina fosforibosil transferase (gpt). Os dois plasmídeos podem ser transfectados em células de expressão mamíferas, tais como células de Sp2/O--Agl4, por eletroporação e selecionados para a resistência de higromicin. As colônias que sobrevivem à seleção são expandidas, e os líquidos dos sobrenadantes são monitorados para a produção de anti-HIV Mab quimérico por um método de ELISA. Uma eficiência de transfecção de aproximadamente células 1-10x106 é desei ável. Um nível de expressão do anticorpo dentre 0.10 e 2.5 yg/ml pode ser esperado com este sistema.
A isolação de RNA, síntese de cDNA, e amplificação podem ser realizadas como segue. 0 RNA total de célula pode ser preparado de uma linhagem celular do hibridoma anti-HIV, usando um total de aproximadamente 107 células, de acordo com Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second ed., Cold Spring Harbor Press, 1989), que é incorporado por referência. 0 primeiro filamento cDNA pode ser reverso transcrito de RNA total convencionalmente, como pela utilização do sistema Superscript de pré-amplificação (Gibco/BRL., Gaithersburg, MD). Momentaneamente, em um volume da reação de 20 μΐ, 50 ng de iniciadores aleatórios podem ser recozidos a 5 yg de RNAs na presença de 2 μl do tampão de síntese IOX [Tris-HCl de 200 mM (pH 8.4), 500 mM de KCl, 25 mM de MgCl2, 1 mg/ml de BSA] , 1 μΐ da mistura de dNTP de 10 mM, 2 μl de 0.1 M DTT, e 200 unidades de transcriptase reversa Superscript. A etapa do alongamento é permitida inicialmente prosiguer à temperatura ambiente por 10 minutos seguidos pela incubação em 42°C por 50 min. A reação pode ser terminada aquecendo a mistura de reação em 9°C por 5 min.
As seqüências de VK e VH para anti-HIV Mab quimérico ou humano podem ser amplificadas por PCR como descrito por Orlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:3833 (1989)) que é incorporado por referência. As seqüências de VK podem ser amplificadas usando os iniciadores CK3BH e VK5-3 (Leung et al., BioTechniques, 15:286 (1993), que é incorporado por referência), enquanto as seqüências de VH podem ser amplificadas usando o iniciador CHlB que tempera à região de CHl de murino IgG, e VHIBAC K (Orlandi et al., 1989). As misturas de reação PCR contendo 10 μl do primeiro produto cDNA de filamento simples, 9 μl do tampão de PCR IOX [500 mM de KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 15 mM MgC12, e 0.01% (p/v) gelatin] (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn.), podem ser sujeitadas a 30 ciclos de PCR. Cada ciclo de PCR consiste preferivelmente de desnaturação em 94°C por 1 minuto, temperando em 5°C por 1.5 min., e a polimerização em 72°C por 1.5 min. Os fragmentos amplificados de VK e VH podem ser purificados em 2% de agarose (BioRad, Richmond, Calif).
Os produtos de PCR para VK podem ser subclonados em um vetor de plataforma, tal como um vetor VKpBR de plataforma baseado em pBR327 que contém um promotor de Ig, uma seqüência de peptideo de sinal e locais de restrição convenientes para facilitar a ligadura em estrutura dos produtos de PCR de VK. Os produtos de PCR para VH podem ser subclonados em um vetor de plataforma similar, tal como o VHpBS baseado em pBluescript. Os clones individuais contendo os produtos de PCR respectivos podem ser seqüenciados por, por exemplo, o método de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463 (1977) que é incorporado por referência.
Os dois plasmideos podem ser co-transfectados em uma célula adequada, por exemplo, mieloma Sp2/0--Agl4, colônias selecionadas para a resistência de higromicin, e fluidos sobrenadantes monitorados para a produção dos anticorpos anti-HIV quiméricos ou humanizados por, por exemplo, um ensaio de ELISA.
A transfecção e o ensaio para o anticorpo que segrega clone por ELISA, podem ser realizados como seguem. Aproximadamente 10 yg do vetor de expressão de cadeia leve e 20 ug do vetor de expressão de cadeia pesada podem ser usados para a transfecção de células de mieloma 5 χ 10^6 SP2/0 poro eletroporação (BioRad, Richmond, Calif.) de acordo com Co et al., J. Immunol, 148:1149 (1992) que é incorporado por referência. Depois de transfecção, as células podem ser crescidas em 96 placas de microtítulo de 96 cavidades em meio completo de HSFM (GIBCO, Gaithersburg, Md.) em 37°C, 5% de CO2. O processo de seleção pode ser iniciado após dois dias pela adição de meio de seleção de higromicin (Calbiochem, San Diego, Calif.) em uma concentração final de 500 pg/ml de higromicin. As colônias emergem tipicamente de 2-3 semanas pós-eletroporação. As culturas podem então ser expandidas para uma análise mais adicional.
Os clones de transfectoma que são positivos para a secreção de cadeia pesada humanizada ou quimérica podem ser identificados pelo ensaio de ELISA. Momentaneamente, as amostras dos sobrenadantes (100 μl) das culturas de transfectoma são adicionadas em três exemplares às placas de microtítulo de ELISA pré-revestidas com cabra anti-humana (GAH)-IgG, F(ab')2 fragmento de anticorpo específico (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa.). As placas são incubadas por 1h à temperatura ambiente. As proteínas não ligadas são removidas lavando três vezes com tampão de lavagem (PBS contendo 0.05% polissobato 20). A peroxidase de rábano silvestre (HRP) conjugada GAH-IgG, anticorpos específicos- fragmento de Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) são adicionados às cavidades, (100 μl do estoque de anticorpo diluído χ 10^4, suplementadas com o anticorpo não conjugado a uma concentração final de 1.0 μg/ml). Depois de uma incubação de lh, as placas são lavadas, tipicamente três vezes. Uma solução de reação, [100 μl, contendo 167 μg de ortofenileno- diamina (OPD) (Sigma, St Louis, MO), 0.025% de peróxido de hidrogênio em PBS], é adicionada às cavidades. A cor é permitida tornar-se no escuro por 30 minutos. A reação é parada pela adição de 50 μl de solução HCl de 4 N em cada cavidade bem antes de medir a absorvência em 490 nm em um leitor automatizado de ELISA (Bio-Tek instruments, Winooski, Vt.). Os anticorpos quiméricos ligados são então determinados em relação a um padrão de anticorpo quimérico irrelevante (obtenível de Scotgen, Ltd., Edinburg, Scotland). Os anticorpos podem ser isolados dos meios de cultura da célula como seguem. As culturas de transfectoma são adaptadas ao meio livre de soro. Para a produção de anticorpo quimérico, as células são crescidas enquanto uma cultura de 500 ml no frasco de cilindro usando HSFM. As culturas são centrifugadas e o sobrenadante é filtrado através de uma membrana de 0.2 micron. O meio filtrado é passado através de uma coluna da proteína A (1 x 3 cm) em uma taxa de fluxo de 1 ml/min. A resina é lavada então com aproximadamente 10 volumes de coluna de PBS e a proteína de anticorpo ligada-A é eluída da coluna com o tampão de glicina de 0.1 M (pH 3.5) contendo EDTA de 10 mM. As frações de 1.0 ml são coletadas nos tubos que contêm o 10 μΐ de 3M Tris (pH 8.6), e nas concentrações de proteína determinadas dos absorbâncias em 280/260 nm. As frações máximas são vertidas, dializadas contra PBS, e o anticorpo concentrado, por exemplo, com o Centricon 30 (Amicon, Beverly, MA). A concentração do anticorpo é determinada por ELISA, como antes, e sua concentração é ajustada a aproximadamente 1 mg/ml usando PBS. Azido de sódio, 0.01% (p/v), é adicionado convenientemente à amostra como conservante.
As afinidades de aglutinação comparativas dos anticorpos de camundongo, quiméricos e humanizados assim isolados podem ser determinadas pelo radioimunoensaio direto. Os anticorpos anti-HIV quiméricos e humanizados são determinados ter a mesma especificidade e afinidade de aglutinação como o camundongo Mab.
Todas as COMPOSIÇÕES e MÉTODOS descritos e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação imprópria à luz da presente descrição. Quando as composições e os métodos forem descritos nos termos de modalidades preferidas, é aparente para aqueles versados na técnica que as variações podem ser aplicadas às COMPOSIÇÕES e aos MÉTODOS e nas etapas ou na seqüência das etapas dos métodos descritos aqui sem partir do conceito, do espírito e do escopo da invenção. Mais especificamente, determinados agentes que são ambos química e fisiologicamente relativos podem ser substituídos para os agentes descritos aqui quando os mesmos ou os semelhantes resultados seriam conseguidos. Todos tais substitutos e modificações similares aparentes por aqueles versados na técnica são julgados estar dentro do espírito, do escopo e do conceito da invenção como definidos pelas reivindicações apensas.

Claims (57)

1. Método para tratamento de infecção por HIV em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo um anticorpo ou fragmento do mesmo contra um antígeno de envelope superficial HIV, o anticorpo ou fragmento conjugado a um agente terapêutico, onde a exposição ao anticorpo ou ao fragmento conjugado é eficaz para reduzir, eliminar ou impedir a infecção' por HIV ou impedir a transmissão intercelular do HIV às células não infectadas in vivo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma droga citotóxica, agente virostático, toxina, radioisótopo, oligonucleotídeo, imunomodulador, citocina, quemocina, RNA de interferência pequeno (siRNA) ou enzima.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é doxorrubicin.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento conjugado é doxorrubicin-P4/DlO.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é P4/D10.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo ou fragmento quimérico, humanizado ou humano.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento conjugado é administrado ao indivíduo após uma infecção conhecida ou potencial com HIV.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o período de tempo entre a infecção conhecida ou potencial e administração do anticorpo ou fragmento conjugado ao indivíduo é menos de 1 hora, 1 a 5 horas, menos de 12 horas, 1 dia ou menos, 2 dias ou menos, 1 semana ou menos, ou 1 mês ou menos.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo ou fragmento conjugado é eficaz para obstruir a infecção por HIV no indivíduo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento conjugado é administrado ao indivíduo depois que o indivíduo for tratado com terapia anti-retroviral (ART).
12. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é aplidin, azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicin, bortezomib, briostatin-1, bussulfan, calicheamicin, camptotecin, 10-hidroxicamptotecin, carmustina, celebrex, clorambucil, cisplatin, irinotecan (CPT-Il), SN-38, carboplatin, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicin, glucuronídeo de daunomicin, daunorubicin, doxorrubicin, 2- pirrolinodoxorrubicina (2P-D0X), ciano-morfolino doxorrubicin, glucuronídeo de doxorrubicin, glucuronídeo de epirubicin, estramustina, etoposídeo, glucuronídeo de etoposídeo, fosfato de etoposídeo, floxuridina (FUdR), 3',5 ' — 0-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, fluorouracil, gemcitabina, hidroxiuréia, idarubicin, ifosfamida, L-asparaginase, leucovorin, lomustina, mecloretamina, melphalan, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicin, mitomicin, mitotano, butirato de fenila, procarbazina, paclitaxel, pentostatin, PSI-341, semustina, streptozocin, tamoxifen, taxanos, taxol, talidomida, tioguanina, tiotepa, teniposídeo, topotecan, mostarda de uracil, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricin, abrin, ribonuclease, onconase, rapLRl, DNase I, enterotoxin-A Staphylococcal, proteína antiviral pokeweed, gelonin, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudomonas, um oligonucleotideo de anti-sentido, um RNA de interferência, um siRNA, um inibidor agressoma ou uma combinação do mesmo.
13. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o radioisótopo é selecionado do grupo consistindo em 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 14C, 51Cr, -36Cl, 45Ti, 57Co, 58Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 166Dy, 152Eu, 18F, 67Ga, -68Ga, 195mHg, 166Ho, 3H, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 52Fe, 59Fe -177Lu, 191Os, 212Pb, 32P, 33P, 142Pr, 195mPt, 223Ra, 186Re, 188Re, -189Re, 47Sc, 75Se 111Ag, 153Sm, 89Sr, 35S, 161Tb, 94mTc, 99mTc, 86Y, -90Y e 89Zr.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo biespecifico, um fragmento de anticorpo biespecifico, uma fusão scFv, Fab, Fab', F(ab)2, F (ab')2, Fv, sFv, scFv, scFv-Fc, um anticorpo de cadeia única, um diabody, um triabody ou um tetrabody.
15. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que ART é HAART (terapia anti- retroviral altamente ativa).
16. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a terapia anti-retroviral compreende o tratamento com efavirenz, zidovudine, tenofovir, lamivudine, emtricitabine, didanosine, abacavir, stavudine, nevirapine, lopinavir, ritonavir, atazanavir, fosamprenavir, indinavir, nelfinavir, saquinavir, ou uma combinação do mesmo.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo ou fragmento de neutralização.
18. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o imunomodulator é selecionado do grupo consistindo em uma citocina, um fator de crescimento de célula tronco, um limfotoxin, um fator hematopoiético, uma interleucina, um fator de estimulação de colônia, um interferon, interferon-α, interferon-γ, interferon-β, o fator de crescimento de célula tronco designou o "Fator SI, " IL-2, IL-6, IL-IO, IL-12, IL-18, IL-21 e TNF-α.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a citocina é selecionada do grupo cocnsistindo em uma linfocina, uma monocina, um fator de crescimento, um hormônio de crescimento humano, um hormônio de crescimento humano N-metionila, um hormônio de crescimento bovino, um hormônio de paratireóide, tiroxina, insulina, proinsulina, relaxina, prorelaxin, hormônio de estimulação de foliculo (FSH), hormônio de estimulação de tiróide (TSH), hormônio luteinizante (LH), fator de crescimento hepático, prostaglandina, fator de crescimento de fibroblasto, prolactina, lactogênio placental, proteína OB, fator-α de necrose de tumor, fator-β de necrose de tumor, substância de inibição mullerian, peptídeo associado a gonadotropin de camundongo, inhibin, activin, fator de crescimento endotelial vascular, integrin, trombopoietin (TPO), NGF-β, fator de crescimento de plaqueta, um fator de crescimento de transformação (TGF), TGF-α, TGF- β, fatores I e II de crescimento tipo insulina, eritropoietin (EPO), fator osteoindutivo, interferon-a, interferon-β, interferon-γ, um fator de estimulação de colônia, macrófago-CSF (M-CSF), granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF), granulócito-CSF (G-CSF), IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-Il, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL- - 18, IL-21, LIF, kit-ligando, FLT-3, angiostatina, trombospondin, endostatina, fator de necrose de tumor e LT.
20. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a quemocina é selecionada do grupo consistindo em RANTES, MCAF, ΜΙΡΙ-alfa, MIPI-Beta e IP-10.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração é oral, nasal, bucal, inalacional, retal, vaginal, tópica, ortotópica, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intratecal ou intravenosa.
22. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o radioisótopo é um emissor alfa ou um emissor de elétron Auger.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o emissor alfa é 212Pb, 212Bi, -213Bi, 211At, 223Ra ou 225Ac ou onde o emissor de elétron Auger é -111In, 125I, 67Ga, 191Os, 193mPt, 195mPt ou 195mHg.
24. Método para imagem latente detectar ou diagnosticar a infecção por HIV em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar ao indivíduo um anticorpo ou fragmento de anticorpo contra um antígeno de envelope superficial HIV, o anticorpo conjugado a um agente de imagem latente; e b) detectar a presença de anticorpo ou fragmento conjugado ligado às células infectadas por HIV, onde a ligação do anticorpo ou fragmento conjugado às células infectadas por HIV é eficaz à imagem, diagnosticar ou detectar a presença de infecção por HIV no indivíduo.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o agente de imagem latente é um radioisótopo, uma enzima, uma etiqueta fotodetectável, um agente de contraste, uma etiqueta de ultra-som ou uma etiqueta paramagnética.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o agente de imagem latente é selecionado do grupo consistindo em cromo (III), manganês (II), ferro (III), ferro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodímio (III), samarium (III), ytterbium (III), gadolínio (III), vanádio (II), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III) érbio (III), lantânio (III), ouro (III), lide (II) e bismuto (III).
27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o agente de imagem latente é -18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr 94mTc, 94Tc, -99mTc, 45Ti, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 154"158Gd, 177Lu, 32P ou 188Re.
28. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o agente de imagem latente é Alexa 350, Alexa 430, AMCA, aminoacridina, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, B0DIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY- TRX, 5-carbóxi-4',5'-dicloro-2', 7'-dimetóxi fluoresceina, 5- carbóxi-2',4',5',T-tetraclorofluoresceina, 5- carboxifluoresceina, 5-carboxirrodamina, 6-carboxirrodamina, 6-carboxitetrametil amino, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, 6- FAM, cloreto de dansila, Fluoresceina, HEX, 6-JOE, NBD (7- nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol) , Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, ácido ftálico, ácido tereftálico, ácido isoftálico, cresil violeta rápida, cresil violeta azul, cresil azul brilhante, ácido para- aminobenzóico, eritrosina, ftalocianinas, azometinas, cianinas, xantinas, succinilfluoresceinas, criptatos de metal alcalino-terroso, trisbipiridina diamina európio, um criptato ou quelato de európio, diamina, dicianinas, corante azul La Jolla, alopicocianina, alococianina B, ficocianina C, ficocianina R, tiamina, ficoeritrocianina, ficoeritrina R, REG, Rodamina Verde, isocianato de rodamina, rodamina vermelha, R0X, TAMRA, ΤΕΤ, TRIT (tetrametil rodamina isotiol), tetrametilrodamina, ou Texas Red.
29. Método para tratamento de infecção por HIV em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar ao indivíduo um anticorpo ou fragmento biespecífico do mesmo, o anticorpo biespecífico compreendendo um ou mais locais de aglutinação específicos para um antígeno de envelope superficial HIV e um ou mais locais de aglutinação para um veículo; b) opcionalmente, administrar um agente de clareamento ao indivíduo; e c) administrar ao indivíduo um veículo conjugado a um agente terapêutico, a dita administração do dito veículo eficaz para reduzir, eliminar ou impedir a infecção por HIV ou impedir a transmissão intercelular do HIV às células não infectadas no indivíduo.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma droga citotóxica, agente virostático, toxina, radioisótopo, oligonucleotídeo, RNA de interferência pequeno (siRNA) ou enzima.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é doxorrubicin.
32. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo ou fragmento quimérico, humanizado ou humano.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento, agente de clareamento opcional e veículo são administrados ao indivíduo depois que o indivíduo é tratado com terapia anti- retroviral.
35. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é aplidin, azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicin, bortezomib, briostatin-1, bussulfan, calicheamicin, camptotecin, 10-hidroxicamptotecin, carmustina, celebrex, clorambucil, cisplatin, irinotecan (CPT-Il), SN-38, carboplatin, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicin, glucuronídeo de daunomicin, daunorubicin, doxorrubicin, 2- pirrolinodoxorrubicina (2P-DOX) , ciano-morfolino doxorrubicin, glucuronídeo de doxorrubicin, glucuronídeo de epirubicin, estramustina, etoposídeo, glucuronídeo de etoposídeo, fosfato de etoposídeo, floxuridina (FUdR), 3',5'~ O-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, fluorourací1, gemcítabina, hidroxiuréia, idarubicin, ifosfamida, L-asparaginase, leucovorin, lomustina, mecloretamina, melphalan, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicin, mitomicin, mitotano, butirato de fenila, procarbazina, paclitaxel, pentostatin, PSI-341, semustina, streptozocin, tamoxifen, taxanos, taxol, talidomida, tioguanina, tiotepa, teniposídeo, topotecan, mostarda de uracil, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricin, abrin, ribonuclease, onconase, rapLRl, DNase I, enterotoxin-A Staphylococcal, proteína antiviral pokeweed, gelonin, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudomonas, um oligonucleotideo de anti-sentido, um RNA de interferência, um siRNA, um inibidor agressoma ou uma combinação do mesmo.
36. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o radioisótopo é selecionado do grupo consistindo em 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 14c, 51Cr, -36Cl, 45Ti, 57Co, 58Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 166Dy, 152Eu, 18F, 67Ga, -68Ga, 195mHg, 166Ho, 3H, 111In, 123I, 124I 125T 131-, 52Fe, 59Fe -177Lu, 191Os, 212Pb, 32P 33p 142pr 195m Pt, 223Ra, 18 16Re, 188Re, -189Re, 47Sc, 75Se 111Ag, 153Sm, 89Sr, 35S, 161Tb, 94mTc, 99mTc, 86Y, -90Y e 89Zr.
37. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento biespecífico compreende pelo menos uma fusão scFv, Fab, Fab', F(ab)2, F (ab')2/ Fv, sFv, scFv-Fc, um anticorpo de cadeia única, diabody, triabody ou tetrabody.
38. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento biespecífico compreende pelo menos um anticorpo ou fragmento P4/D10.
39. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o veículo compreende uma ou mais porções de HSG (histamina-succinil-glicina) e o anticorpo ou fragmento biespecífico se liga à HSG.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento biespecífico compreende um ou mais anticorpos 679 ou fragmentos de anticorpo que se ligam à HSG.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o veículo é DOTA-D-Cys (3-SP- Gly-20-0-SN38)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys (HSG)-NH2 (IMP- -411).
42. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento biespecífico compreende uma estrutura "dock and lock" (DNL).
43. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-HIV ou fragmento do mesmo, conjugado a um agente terapêutico, o dito anticorpo ou fragmento conjugado do mesmo eficaz para reduzir, eliminar ou impedir a infecção por HIV ou impedir a transmissão intercelular do HIV às células não infectadas quando administradas a um indivíduo.
44. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.
45. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento conjugado é um anticorpo ou fragmento quimérico, humanizado ou humano.
46. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é P4/D10.
47. Composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento conjugado do mesmo é doxorrubicin-P4/DlO .
48. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é conjugado para aplidin, azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicin, bortezomib, briostatin-1, bussulfan, calicheamicin, camptotecin, 10-hidroxicamptotecin, carmustina, celebrex, clorambucil, cisplatin, irinotecan (CPT-Il), SN-38, carboplatin, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicin, glucuronídeo de daunomicin, daunorubicin, doxorrubicin, 2- pirrolinodoxorrubicina(2P-DOX),ciano-morfolino doxorrubicin, glucuronídeo de doxorrubicin, glucuronídeo de epirubicin, estramustina, etoposídeo, glucuronídeo de etoposídeo, fosfato de etoposídeo, floxuridina (FUdR), 31,5 ' — O-dioIeoiI-FudR(FUdR-dO), fludarabina,flutamida, fluorouracil, gemcitabina, hidroxiuréia, idarubicin, ifosfamida,L-asparaginase, leucovorin,lomustina, mecloretamina, melphalan, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicin, mitomicin, mitotano, butirato de fenila, procarbazina, paclitaxel, pentostatin, PSI-341, semustina, streptozocin, tamoxifen, taxanos, taxol, talidomida, tioguanina, tiotepa, teniposídeo, topotecan, mostarda de uracil, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricin, abrin, ribonuclease, onconase, rapLRl, DNase I, enterotoxin-A Staphylococcal, proteína antiviral pokeweed, gelonin, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudomonas, um oligonucleotídeo de anti-sentido, um RNA de interferência, um siRNA, um inibidor agressoma ou uma combinação do mesmo.
49. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é conjugado para 212Pb, 212Bi, 213Bi, 211At, 223Ra, 225Ac, 32P, 33P, -47Sc, 67Cu, 67Ga, 89Sr, 90Y, 11Ag, 125I, 131I, 142Pr, 153Sm, 161Tb, -166Ho, 166Dy, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 111In, 125I, 67Ga, 191Os, -193mPt, 195mPt ou 195mHg.
50. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo biespecífico, um fragmento de anticorpo biespecífico, uma fusão scFv, Fab, Fab', F(ab)2, F (ab')2, Fv, sFv, scFv-Fc, um anticorpo de cadeia única, diacorpo, triacorpo ou tetracorpo.
51. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo de neutralização.
52. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar dois ou mais anticorpos ou fragmentos ao indivíduo, onde cada anticorpo ou fragmento se liga a um antígeno de envelope superficial HIV.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que dois ou mais anticorpos ou fragmentos se ligam ao mesmo antígeno de envelope superficial HIV.
54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que dois ou mais anticorpos ou fragmentos se ligam ao antígeno de envelope superficial HIV diferente.
55. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que dois ou mais anticorpos ou fragmentos se ligam aos locais conservados e variáveis de epítopos acessíveis de HIV.
56. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é selecionado do grupo consistindo em 4E10, 2F5, 3D6, C37, IACY, 1F58, IGGGC, 2G12 e X5.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo ou um fragmento quimérico, humanizado ou humano.
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