CN117362419A - 柯萨奇病毒a16型保护性单克隆抗体的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了柯萨奇病毒A16型保护性单克隆抗体的制备及其应用，具体地，本发明公开了一株针对CVA16病毒的单克隆抗体、编码抗体和抗体片段的核酸序列及其制备方法。体外实验证实本发明的抗体对CVA16病毒都显示很强的预防和治疗作用，证实其具备广谱中和能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及柯萨奇病毒A16型保护性单克隆抗体的制备及其应用。
背景技术
柯萨奇病毒A16(CVA16)是小核糖核酸病毒科肠道病毒属的成员，是婴幼儿流行的手足口病的主要病原体之一。CVA16感染可能导致轻度和自限性症状以及严重的临床疾病，如脑炎、心肌炎、肺炎，甚至死亡。
CVA16是一种直径约为30nm的无包膜病毒，其单链正义RNA基因组长度约为7.4kb，包装在蛋白质衣壳中。病毒基因组编码一个大的多聚蛋白前体，该前体随后被加工成结构蛋白P1和非结构蛋白P2和P3。P1可进一步被病毒蛋白酶切割，产生衣壳亚基蛋白VP0、VP1和VP3，其中VP0可通过自切割产生VP2和VP4。从感染的细胞培养物中制备的CVA16主要以两种颗粒形式存在，包括含有病毒RNA基因组的成熟病毒(也称为实心颗粒)和缺乏病毒RNA的空心颗粒。CVA16成熟病毒和空心颗粒的衣壳结构相似，均由60个对称排列的结构单元组成，但成熟病毒中的每个结构单元由VP1、VP2、VP3和VP4四种亚基组成，而空心颗粒中包含VP1、VP3和未切割的VP0。对于大多数肠道病毒来说，成熟病毒处于天然/紧凑状态，而空心颗粒则相对膨胀。然而，也有紧凑状态的空心CVA16颗粒的报道。
因此，本领域迫切需要开发一种有效的治疗CVA16感染的抗体药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效的治疗CVA16感染的抗体药物。
本发明第一方面提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:1所示的CDR1，
SEQ ID NO:2所示的CDR2，和
SEQ ID NO:3所示的CDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留CVA16病毒颗粒结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
本发明第二方面提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明第三方面提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:5所示的CDR1'，
CDR2'，氨基酸序列为GAT；和
SEQ ID NO:6所示的CDR3'。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留CVA16病毒颗粒结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
本发明第四方面提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明第五方面提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗CVA16病毒的抗体。
在另一优选例中，所述抗体结合天然成熟病毒颗粒和紧凑的空颗粒，不结合膨胀的空颗粒。
在另一优选例中，所述抗体对CVA16病毒的中和强度(IC50)为≤100ng/mL，较佳地，≤80ng/mL，更佳地，≤74ng/mL。
在另一优选例中，所述抗体对CVA16病毒的亲和力的KD(M)≤50nM，较佳地，较佳地，≤10nM，更佳地，≤8，更佳地，≤7.34nM。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述人源化抗体的CDR区包含1、2、或3个氨基酸的变化。
在另一优选例中，所述的动物为非人哺乳动物，较佳地为鼠、羊、兔。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:4所示；和/或
所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，较佳地为20％，更佳地为10％。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代的至少一个氨基酸序列为同源性为至少80％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的衍生序列具有结合CVA16病毒的活性。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述的抗体为IgG类型。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
本发明第六方面提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合CVA16病毒。
本发明第七方面提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合区为特异性结合于CVA16病毒的scFv，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如本发明第三方面所述的轻链可变区。
本发明第八方面提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第七方面所述的CAR构建物；或所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明第五方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
本发明第九方面提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133Yb-169、Yb-177、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：
耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(如DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(如顺铂)。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的(a)。
在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的(a)。
本发明第十发明提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或其组合，所述活性成分用于(a)制备CVA16病毒感染的诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗CVA16病毒感染的药物。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：检测样品中的CVA16病毒蛋白。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
本发明第十一方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防和/或治疗CVA16病毒感染。
本发明第十二方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；或
(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白；
(3)如本发明第七方面所述的CAR构建物。
本发明第十三方面提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明第十四方面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
本发明第十五方面提供了一种体外检测样品中CVA16病毒的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CVA16病毒。
在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
本发明第十六方面提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物。
本发明第十七方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第五方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗如本发明第五方面所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如本发明第十六方面所述的检测板。
本发明第十八方面提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十四方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第六方面所述的重组蛋白。
本发明第十九方面提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括其他治疗CVA16病毒感染的药物。
在另一优选例中，所述其他治疗CVA16病毒感染的药物包括干扰素。
本发明第二十方面提供了一种CVA16病毒感染的诊断方法，包括步骤：
(i)从诊断对象获取一样品，将所述的样品与如本发明第五方面所述的抗体接触；和
(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示所述的对象为CVA16病毒确诊患者。
在另一优选例中，所述的样品为血液样品、粪便样品或咽拭子样品，或其他组织器官中的样品。
本发明第二十一方面提供了一种治疗CVA16病毒感染的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第七方面所述的CAR构建物、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、本发明第十一方面所述的药物组合物、本发明第十九方面所述的药物组合、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了CVA16单抗8C4的中和、结合活性。(A)8C4的型别和中和活性。中和浓度定义为完全防止细胞病变效应的最低抗体浓度。(B)通过细胞活力实验测定8C4对CVA16毒株SZ05的中和作用。新冠单抗2H2用作阴性对照(IgG-ctr)。(C)通过生物膜干涉法测定8C4与CVA16/SZ05病毒颗粒的结合动力学。
图2显示了单抗8C4对CVA16感染的体内预防(A)和治疗(B)功效。上图：动物研究方案。下图：存活率和临床评分。临床评分如下：0，健康；1，行动缓慢；2，四肢无力；3，肢体瘫痪；4，死亡。抗体处理组小鼠的存活率与PBS对照组进行比较。***，P<0.001。
图3显示了8C4与CVA16复合物的冷冻电镜结构。(A-C)CVA16-8C4的冷冻电镜密度图，解析为三种不同的构象，命名为C1(A)、C2(B)和C3(C)。(D-F)构象C1(D)、C2(E)和C3(F)密度图的中心截面。(G)CVA16的结构单元1的VP3(红色)、结构单元2的VP2'(绿色)的结构元件与8C4重链(青色)及轻链(粉红色)的CDR、FR区域之间相互作用的放大视图。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，首次意外地开发了一类对CVA16病毒具有高特异性和高亲和力的抗体，以及基于所述抗体的高特异性的嵌合抗原受体免疫细胞。具体地，本发明意外地获得具有极其优异的亲和力和特异性的针对CVA16病毒的单克隆抗体。本发明的结果显示，本发明的抗体对CVA16病毒显示很强的预防和治疗作用，证实其具备广谱中和能力。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。
如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。
如本文所用，"单链可变区片段(ScFv)"是指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。ScFv的实例包括经重组DNA技术形成的抗体多肽，并且其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。改造ScFv的各种方法是本领域技术人员已知的。
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗人CVA16抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种抗CVA16病毒的抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
CVA16病毒
CVA16是一种直径约为30nm的无包膜病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员，是导致手足口病的重要病原体之一。其单链正义RNA基因组长度约为7.4kb，包装在蛋白质衣壳中。病毒基因组编码一个大的多聚蛋白前体，该前体随后被加工成结构蛋白P1和非结构蛋白P2和P3。P1可进一步被病毒蛋白酶切割，产生衣壳亚基蛋白VP0、VP1和VP3，其中VP0可通过自切割产生VP2和VP4。从感染的细胞培养物中制备的CVA16主要以两种颗粒形式存在，包括含有病毒RNA基因组的成熟病毒(也称为实心颗粒)和缺乏病毒RNA的空心颗粒。CVA16成熟病毒和空心颗粒的衣壳结构相似，均由60个对称排列的结构单元组成，但成熟病毒中的每个结构单元由VP1、VP2、VP3和VP4四种亚基组成，而空心颗粒中包含VP1、VP3和未切割的VP0。对于大多数肠道病毒来说，成熟病毒处于天然/紧凑状态，而空心颗粒则相对膨胀。然而，也有紧凑状态的空心CVA16颗粒的报道。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的CVA16单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的CVA16单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的CVA16抗单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗CVA16单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于10-8M、10-9M或l0-10M或更小的亲和力(KD)结合。如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的针对CVA16的单克隆抗体。术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区和轻链可变区分别包括如下表A所示的三个互补决定区CDR(氨基酸序列和核苷酸序列)：
表A
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:4所示，其中下划线标注的依次为重链可变区CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示，其中下划线标注的依次为轻链可变区CDR1’，CDR2’，CDR3’的氨基酸序列。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
本发明抗体的功能是由此抗体轻链和重链可变区基因特异性基因序列决定，可以特异性的结合CVA16病毒，能够阻止CVA16病毒侵染易感细胞。利用此抗体可变区基因或互补决定区(CDR)基因，可在利用原核和真核细胞的任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合CVA16的抗体，例如具有重链可变区(如SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.:7所示的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中，所述的抗体为抗CVA16的鼠或人或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有CVA16病毒结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约60个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表B进行氨基酸替换而产生。
表B
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本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:8-13、15、17-18所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ IDNO.:8-13、15、17-18所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:4和/或SEQ ID NO.:7所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可偶联的治疗剂包括但不限于：胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子、和激素。
此外还可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合新型冠状病毒RBD蛋白分子，因而可用于延长药物的半衰期，此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报告基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为质粒。
制剂
本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第七方面所述的CAR构建物、本发明第八方面所述的免疫细胞、或本发明第九方面所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明的针对CVA16病毒的抗体具有高特异性和高亲和力。
(2)本发明首次开发了一类对CVA16病毒具有高特异性和高亲和力的抗体，本发明的结果显示，本发明的抗体对CVA16病毒显示很强的预防和治疗作用，在细胞上对CVA16各毒株具有广谱中和能力。
(3)本发明全面表征了一种CVA16特异性的鼠源中和性单抗8C4。8C4抗体在CVA16小鼠感染模型中显示出有效的预防和治疗功效。冷冻电镜结构分析显示，8C4只结合CVA16成熟病毒和紧凑空壳颗粒，而无法结合膨胀空壳颗粒。本发明的研究结果对CVA16疫苗和抗体开发具有重要意义。
(4)本发明首次发现，单抗8C4是CVA16特异性的广谱中和单抗，可以很好地预防和治疗CVA16的体内感染。8C4仅结合成熟病毒颗粒和紧凑型空颗粒，不结合膨胀型空颗粒，考虑到膨胀型空颗粒不适合作为疫苗免疫原，8C4抗体可以作为CVA16灭活疫苗开发的重要质控试剂。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
材料和方法
1.1细胞和病毒。Vero和横纹肌肉瘤RD细胞在含有5％胎牛血清的DMEM(Gibco,美国)中生长。小鼠SP2/0细胞在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco)中生长。CVA16毒株包括CVA16/SZ05、CVA16/GX08和小鼠适应株CVA16/MAV(8)。EV71毒株EV71/G082之前已经描述过(9)。
1.2蛋白和抗体。为了获得CVA16病毒颗粒，Vero细胞以0.01的感染复数感染CVA16/SZ05。在感染后2天，收集培养上清液和细胞裂解物。接下来，用10％聚乙二醇(PEG)8000和200mM NaCl沉淀。高速离心后，收集沉淀并重悬于0.15M PBS缓冲液中。离心，将上清液以25,000rpm的速度进行20％蔗糖垫超速离心5小时。将所得沉淀重悬于0.15M PBS缓冲液中，并离心。接下来，上清液通过10-50％蔗糖梯度超速离心39,000rpm 3小时。使用Amicon Ultra 100K超滤管(Millipore，美国)浓缩含有病毒抗原的组分。最终的CVA16病毒样品通过SDS-PAGE分析并通过Bradford测定浓度。
单抗2H2是一种针对SARS-CoV-2的IgG抗体(10)，在本研究中用作阴性对照。单抗D5是针对EV71的抗体(9)。
1.3单抗制备。动物研究由上海巴斯德研究所的动物福利和使用委员会批准。
成年雌性BALB/c小鼠免疫铝佐剂吸附的灭活CVA16病毒(4μg/剂)(8)，免疫3次，每次间隔两周。第三次免疫后约两周，给一只小鼠静脉注射含10μg灭活CVA16的PBS溶液。加强免疫后三天，取出脾细胞并使用PEG 1450(Sigma，美国)与SP2/0骨髓瘤细胞融合，然后在HAT培养基(Sigma)中选择10天。接下来，通过使用CVA16/SZ05中和测定来筛选杂交瘤上清。将阳性杂交瘤克隆2-4次以产生单克隆稳定细胞系。使用SBA Clonotyping System/HRPELISA试剂盒(Southern Biotech，美国)测量抗体型别。使用5'RACE系统(Invitrogen，美国)或小鼠Ig引物(Novagen，Merck)确定重链和轻链可变区序列，然后使用IgBLAST工具进行分析。
使用蛋白G琼脂糖树脂4FF(Yeasen，中国)从腹水中纯化单抗。通过木瓜蛋白酶消化CVA16单抗获得Fab(抗原结合片段)，然后使用蛋白G柱和Sephacryl S-100柱(GEHealthcare，美国)进行纯化。
1.4中和测定。通过微量中和测定确定杂交瘤上清液和纯化的单抗对CVA16或EV71的中和活性。简言之，将50μl/孔的未稀释的杂交瘤培养上清或连续稀释的纯化单抗与50μl/孔(100TCID50)的CVA16/SZ05、CVA16/GX08、CVA16/MAV或EV71/G082在96孔板中混合，然后37℃孵育1小时。接下来，将100μl/孔(20,000个细胞)的RD细胞添加到板中并在37℃下孵育。大约3天后，观察细胞病变效应，然后使用CellTiter-Glo 2.0检测试剂盒(Promega,美国)测量细胞活力。根据如下公式计算中和百分比：100×(给定样品的荧光-单纯病毒对照样品的荧光)/(单纯细胞对照样品的荧光-单纯病毒对照样品的荧光)。使用GraphPadPrism软件，通过非线性回归方法计算单抗的半数抑制浓度(IC50)。IC50定义为与单纯病毒对照样品的感染相比，抑制50％病毒感染所需的抗体浓度。
1.5生物膜干涉测量(BLI)测定。在BLI测定之前，用EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-LC-生物素(Thermo Fisher)标记纯化的CVA16/SZ05病毒颗粒，然后使用Zeba脱盐柱(ThermoFisher)进行纯化。亲和力通过Octet RED96系统(PallFortéBio，美国)测定。简言之，将生物素化的CVA16/SZ05病毒颗粒固定在链霉亲和素生物传感器上。接下来，将这些生物传感器转移到含有一系列稀释的抗体样品的孔中，以允许病毒-抗体结合，然后转移到解离缓冲液(0.01M PBS，含0.1％牛血清白蛋白和0.02％Tween 20)中。使用Octet数据分析软件计算平衡解离常数(KD)。
1.6体内保护能力测定。在基于小鼠适应株CVA16/MAV的小鼠感染模型中评估CVA16单抗的保护功效(8)。对于预防性实验，1日龄ICR小鼠腹腔注射PBS或10μg/g CVA16单抗8C4。24小时后，小鼠腹腔注射感染1875TCID50的CVA16/MAV。
对于治疗性实验，两天大的ICR小鼠腹腔注射1875TCID50的CVA16/MAV。24小时后，小鼠腹腔注射PBS或10μg/g单抗8C4。对于预防性和治疗性实验，每天观察所有感染小鼠的存活和临床症状，持续14天。临床分级标准如下：0，健康；1，嗜睡和行动不便；2，四肢无力；3，肢体瘫痪；4，死亡。
1.7冷冻电镜结构测定。将CVA16和8C4 Fab在室温下以1:120的摩尔比孵育20分钟。将3μL的CVA16-8C4复合物置于覆盖有连续超薄碳膜的铜网(Ted Pella)，用Mark IVVitrobot(Thermo Fisher)机器冷冻制样。在300kV Titan Krios透射电子显微镜(ThermoFisher)上收集照片。然后用Relion 3.1和cryoSPARC软件进行数据处理和三维重构，用COOT软件进行模型搭建。最后Chimera进行作图。
1.8统计分析。所有统计分析均使用GraphPad Prism版本8进行。
实施例1CVA16中和性单抗的制备和鉴定
为了制备CVA16特异性中和单抗，用灭活CVA16病毒免疫的小鼠制备杂交瘤，然后筛选对亲本病毒CVA16/SZ05的中和能力。最后，获得了一株具有中和活性的杂交瘤克隆8C4。基于细胞病变效应(CPE)观察，单抗8C4的中和浓度(完全保护细胞免受CPE影响的最低抗体浓度)为1000ng/mL(图1A)。当使用细胞活力测定法进行分析时，8C4以抗体剂量依赖性方式表现出对CVA16/SZ05的中和活性(图1B)，半数最大抑制浓度(IC50)为74ng/mL(图1A)；相反，IgG对照抗体2H2未表现出任何中和作用(图1B)。分型鉴定显示8C4是IgG2b型抗体。抗体序列如下所示：
单抗8C4重链的核苷酸序列(SEQ ID NO.13)：
注：黑色加粗部分为可变区序列(SEQ ID NO.17)，黑色斜体部分为恒定区序列。
单抗8C4重链的氨基酸序列(SEQ ID NO.14)：
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注：黑色加粗部分为可变区序列(SEQ ID NO.4)，黑色斜体部分为恒定区序列，*为终止密码子。加粗和下划线标出的是互补决定区(CDR)。
单抗8C4轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO.15):
注：黑色加粗部分为可变区序列(SEQ ID NO.18)，黑色斜体部分为恒定区序列。
单抗8C4轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO.16)
注：黑色加粗部分为可变区序列(SEQ ID NO.7)，黑色斜体部分为恒定区序列，*为终止密码子。加粗和下划线标出的是互补决定区(CDR)。
进一步测试了8C4交叉中和两种异源CVA16毒株(CVA16/GX08和CVA16/MAV[小鼠适应病毒])和EV71毒株EV71/G082的能力。8C4能够有效地中和CVA16/GX08，中和浓度(100％保护)为500ng/mL,对CVA16/MAV的中和浓度为2000ng/mL,但是即使在最高测试浓度(100μg/mL)下未能中和EV71/G082(图1A)。
实施例2CVA16单抗8C4的结合特性
本发明通过生物膜干涉法测定CVA16单抗8C4与纯化的CVA16病毒颗粒的结合亲和力。简言之，将生物素化的CVA16/SZ05病毒颗粒固定在传感器上，然后使其与不同浓度的单抗相互作用。如图1C所示，8C4对CVA16/SZ05病毒颗粒表现出高结合亲和力，平衡解离常数(KD)为7.34nM。
实施例3CVA16单抗8C4的体内预防和治疗功效
单抗8C4的保护作用在先前报道的CVA16小鼠感染模型上进行评估，该模型基于小鼠适应株CVA16/MAV(8)。对于预防研究，给空白的一日龄ICR小鼠注射PBS或10μg/g单抗8C4。24小时后，用CVA16/MAV攻击小鼠。每天记录存活率和临床评分，如图2A所示。接受PBS的小鼠在感染后4天时开始表现出特征性临床症状，包括活动能力下降、肢体无力和瘫痪，54％的小鼠最终死亡。相比之下，所有用8C4处理的小鼠都完全免于死亡，都没有表现出疾病症状。这些数据证明了8C4的有效体内预防功效。
为了评估单抗的治疗效果，两日龄ICR小鼠感染CVA16/MAV，24小时后用PBS或10μg/g单抗8C4处理。每天监测存活率和临床评分(图2B)。给予PBS的小鼠在感染后4天时出现明显的疾病临床症状，并在感染后14天时表现出显著的死亡率(70％)。相比之下，给予8C4处理的小鼠在14天时表现出100％的存活率，并且没有一只小鼠表现出任何感染迹象。这些结果清楚地表明8C4具有非凡的治疗效果。
实施例4 8C4与CVA16复合物的冷冻电镜结构
为了剖析8C4中和CVA16的结构基础，我们测定了8C4 Fab与CVA16病毒颗粒复合物的冷冻电镜结构。从同一个CVA16-8C4数据集中，得出了三种构象状态，即C1、C2和C3，分辨率分别为和/>占比分别为15.5％、27.0％和57.5％(图3A-C)。然后我们构建了对应的原子模型。如图3A-C所示，对于CVA16-8C4 C3，病毒衣壳半径为/>略大于C1和C2(分别为162.2和/>)。C3衣壳中的2重轴通道为打开状态，而C1和C2衣壳中的2重轴通道是关闭的。此外，病毒RNA密度存在于C1中，但在C2和C3中不存在(图3D-F)。这些数据表明C1、C2和C3中的病毒颗粒分别采用天然紧凑型成熟病毒颗粒、紧凑型空颗粒和膨胀型空颗粒构象。
8C4 Fab仅与天然成熟病毒颗粒(C1)和紧凑的空颗粒(C2)结合，而不与膨胀的空颗粒(C3)结合(图3A-C)。此外，8C4 Fab与二十面体3重轴的凸起紧密结合，每个Fab与两个相邻的结构单元相互作用。8C4的重链和轻链都参与了与来自一个结构单元的VP3和来自相邻结构单元的VP2(命名为VP2')的结合(图3G)。更具体地说，VP3 BC和HI环分别与重链互补决定区3(HCDR3)和轻链互补决定区1(LCDR1)结合(图3G①)；VP2'HI环与LCDR3和HCDR3结合(图3G②)；VP2'βB和βC与HCDR2相互作用，而VP2'BC环与重链框架区3(HFR3)相互作用(图3G③)；VP2'EF环结合HCDR2(图3G④)。CVA16-8C4相互作用界面在病毒衣壳上的总表面积为8C4重链和轻链分别占界面的56.2％和43.8％。
总结
单抗8C4是CVA16特异性的广谱中和单抗，可以很好地预防和治疗CVA16的体内感染。8C4仅结合成熟病毒颗粒和紧凑型空颗粒，不结合膨胀型空颗粒，考虑到膨胀型空颗粒不适合作为疫苗免疫原，8C4抗体可以作为CVA16灭活疫苗开发的重要质控试剂。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:1所示的CDR1，
SEQ ID NO:2所示的CDR2，和
SEQ ID NO:3所示的CDR3。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:5所示的CDR1'，
CDR2'，氨基酸序列为GAT；和
SEQ ID NO:6所示的CDR3'。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的轻链可变区。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或权利要求5所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的抗原结合区为特异性结合于CVA16病毒的scFv，并且所述scFv具有如权利要求1所述的重链可变区和如权利要求3所述的轻链可变区。
8.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求7所述的CAR构建物；或所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求5所述的抗体。
9.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
10.一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或权利要求5所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、或其组合，所述活性成分用于(a)制备CVA16病毒感染的诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗CVA16病毒感染的药物。
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