CN115521375A - 抗新冠病毒广谱中和性单抗的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗新冠病毒广谱中和性单抗的制备和应用，具体地，本发明公开了多株针对新冠病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白不同表位(比如S1，RBD)的单克隆抗体、编码抗体和抗体片段的核酸序列及其制备方法。体外实验证实本发明的多株抗体能够识别SARS‑2‑CoV S蛋白的不同表位，可有效地预防及控制SARS‑CoV‑2野生型及其突变型的感染。

Description

抗新冠病毒广谱中和性单抗的制备和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及抗新冠病毒广谱中和性单抗的制 备和应用。
背景技术
SARS-CoV-2是一种带包膜的病毒，和SARS-CoV一样，同属于冠状病毒科 内的Beta-冠状病毒属。SARS-CoV-2病毒表面上的三聚体刺突(spike)糖蛋 白介导病毒对宿主细胞的进入(entry)。S蛋白具有两个功能性亚基:S1亚 基介导细胞吸附(存在四个结构域NTD,RBD,SD1,SD2)，S2亚基负责病毒包膜 和细胞膜的融合。病毒通过S1亚基中的RBD(受体结合功能域)与受体人血管紧 张素转换酶2(ACE2)蛋白相结合，从而粘附到细胞表面。
截止到现在，已有多种新冠病毒突变株在全球各地流行，其中包括在英国 被发现的B.1.1.7流行株，在南非被鉴定出来的B.1.351流行株，以及近期在 印度流行的B.1.617流行株。以上流行株均在RBD区域有所突变，其中个别位 点如L452R、E484K、E484Q、N501Y(病毒原始氨基酸在数字前，突变氨基酸在 数字后)不仅能显著逃逸已被应用于临床的单克隆抗体，更是可以使疫苗的效 价大大降低，这意味着亟需发现靶向新冠保守位点的抗体来助力疫情的防控。
因此，本领域迫切需要开发对三种针对新冠原型株及其B.1.1.7、B.1.351 和B.1.617突变株的强中和单抗。
发明内容
本发明的目的在于提供对三种针对新冠原型株及其B.1.1.7、B.1.351和 B.1.617突变株的强中和单抗。
本发明第一方面提供了一种抗体，所述抗体结合新型冠状病毒SARS-CoV-2 的S蛋白的表位NLVKN或TESNK或QTLEIL或STPCNGVEGFNCY或TFKCYGVSPT或 NGVGYQ。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为动物源抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、 嵌合抗体或人源化抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
本发明第二方面提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:1、2或3所示的CDR1，
SEQ ID NO:4、5或6所示的CDR2，和
SEQ ID NO:7、8或9所示的CDR3。
在另一优选例中，所述重链可变区的CDR包括SEQ ID NO:NH,NH+3,和NH+6所示 的3个CDR，其中NH分别为1、2或3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基 酸并能够保留新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:10-12中任一所示的氨基酸 序列。
本发明第三方面提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第二方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明第四方面提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:13、14或15所示的CDR1'，
SEQ ID NO:16、17或18所示的CDR2'，和
SEQ ID NO:19、20或21所示的CDR3'。
在另一优选例中，所述轻链可变区的CDR包括SEQ ID NO:NL,NL+3,和NL+6所示 的3个CDR，其中NL分别为13、14或15。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基 酸并能够保留新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:22－24中任一所示的氨基 酸序列。
本发明第五方面提供了一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如本发 明第四方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明第六方面提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明第二方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明第四方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第三方面所述的重链；和/或如本 发明第五方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗SARS-CoV-2的抗体，较佳地为特异 性抗SARS-CoV-2S蛋白的抗体，更佳地为特异性抗SARS-CoV-2的S1蛋白、RBD 蛋白或SD1蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述抗体对新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白的亲和力 的KD(M)≤1×10-8(例如1.0×10-13～1×10-8),较佳地≤7×10-9,更佳地≤6×10-9或≤3×10-12。
在另一优选例中，所述抗体对新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白的亲和力 的Kon(1/Ms)≥1×104(例如1×104～9×105),较佳地≥1.5×104,更佳地≥1.8 ×104。
在另一优选例中，所述抗体对新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白(请复核) 的亲和力的Kdis(1/s)≤1.5×10-4(例如2×10-8～1.5×10-4),较佳地≤1.2×10-4, 更佳地≤1×10-4。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、 或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人 源的。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗 体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗 体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:10－12中任一所 示；和/或
所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:22－24中任一所示。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如SEQ ID NO:10－12中任 一所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如SEQ ID NO:22－24中任 一所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所 示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所 示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所 示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
在另一优选例中，所述的抗体为IgG类型。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
本发明第七方面提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的重链可变区、如本 发明第三方面所述的重链、如本发明第四方面所述的轻链可变区、如本发明第五方 面所述的轻链、或本发明第六方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合SARS-CoV-2S蛋白(较佳地， 为SARS-CoV-2S1蛋白、SD1蛋白或RBD蛋白)。
本发明第八方面提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合区为特 异性结合于SARS-CoV-2S蛋白的scFv，并且所述scFv具有如本发明第二方面所 述的重链可变区和如本发明第四方面所述的轻链可变区。
本发明第九方面提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第八方面所述的CAR构建物；或所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明 第一方面或本发明第六方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
本发明第十方面提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、本发 明第二方面所述的重链可变区、如本发明第三方面所述的重链、如本发明第四方面 所述的轻链可变区、如本发明第五方面所述的轻链、或如本发明第六方面所述的抗 体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记 物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、 病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、 I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、 或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、 Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、 Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133 Yb-169、Yb-177、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟 结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗 增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基 化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀 (auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、 依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物 (maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类 (benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepinecontaining drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：
耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、 篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉 素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、 长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单 胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八 叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉 素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁 共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物 的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv 片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(如DT-心 肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(如顺铂)。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的(a)。
在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个 重复的(a)。
本发明第十一方面提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如 本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的重链可变区、如本发明第三方 面所述的重链、如本发明第四方面所述的轻链可变区、如本发明第五方面所述的轻 链、或本发明第六方面所述的抗体、如本发明第七方面所述的重组蛋白、或其组合， 所述活性成分用于(a)制备新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的诊断试剂或试剂盒； 和/或(b)制备预防和/或治疗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的药物。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：检测样品中的SARS-CoV-2S 蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在另一优选例中，所述新型冠状病毒(SARS-CoV-2)包括野生型的新型冠状病 毒(SARS-CoV-2)病毒和突变型的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
在另一优选例中，所述突变型的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)包括：新型冠状 病毒突变株B.1.1.7、B.1.351、B.1.617。
在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
本发明第十二方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、本发 明第二方面所述的重链可变区、如本发明第三方面所述的重链、如本发明第四方面 所述的轻链可变区、如本发明第五方面所述的轻链、或本发明第六方面所述的抗体、 如本发明第七方面所述的重组蛋白、如本发明第九方面所述的免疫细胞、如本发明 第十方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的重链可变区、如本发明第三方面所述的重链、如 本发明第四方面所述的轻链可变区、如本发明第五方面所述的轻链、或本发明第六 方面所述的抗体、如本发明第七方面所述的重组蛋白、如本发明第九方面所述的免 疫细胞、如本发明第十方面所述的抗体药物偶联物、或其组合和0.01～99.99％的药 用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防和/或治疗新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)感染。
本发明第十三方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多 肽：
(1)如本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的重链可变区、如本 发明第三方面所述的重链、如本发明第四方面所述的轻链可变区、如本发明第五方 面所述的轻链、或本发明第六方面所述的抗体；或
(2)如本发明第七方面所述的重组蛋白；
(3)如本发明第八方面所述的CAR构建物。
本发明第十四方面提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第十三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞 病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明第十五方面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十四方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第十三方面所述的多核 苷酸。
本发明第十六方面提供了一种体外检测样品中新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的 方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明第一方面或本发明第六方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在 SARS-CoV-2病毒或SARS-CoV-2S蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
本发明第十七方面提供了一种体外检测样品中SARS-CoV-2S蛋白或其片段的 方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明第一方面或本发明第六方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在SARS-CoV-2S蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
本发明第十八方面提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测 试条，所述的测试条含有如本发明第一方面或本发明第六方面所述的抗体或如本发 明第十方面所述的抗体药物偶联物。
本发明第十九方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第一方面或本发明第六方面所述 的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗如本发明第一方面或本发明第六方面所 述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如本发明第十八方面所述的检测板。
本发明第二十方面提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十五方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第一方面或本发 明第六方面所述的抗体或如本发明第七方面所述的重组蛋白。
本发明第二十一方面提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗 体、本发明第二方面所述的重链可变区、如本发明第三方面所述的重链、如本发明 第四方面所述的轻链可变区、如本发明第五方面所述的轻链、或本发明第六方面所 述的抗体、如本发明第七方面所述的重组蛋白、如本发明第九方面所述的免疫细胞、 如本发明第十方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括其他治疗SAR-CoV-2病毒感染的药物。
在另一优选例中，所述其他治疗SAR-CoV-2病毒感染的药物包括：其他保护 性单抗或瑞德西韦等小分子化药或其他中成药。
本发明第二十二方面提供了一种SAR-CoV-2病毒感染的诊断方法，包括步 骤：
(i)从诊断对象获取一样品，将所述的样品与如本发明第一方面或本发明第六 方面所述的抗体接触；和
(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示所述的对象为SAR-CoV-2病毒确诊患者。
在另一优选例中，所述的样品为血液样品或咽拭子样品，或其他组织器官中 的样品。
本发明第二十三方面提供了一种治疗新型冠状病毒感染的方法，所述方法包 括：给需要的对象施用如本发明第一方面或本发明第六方面所述的抗体、如本发明 第七方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的CAR构建物、如本发明第九方 面所述的免疫细胞、如本发明第十方面所述的抗体药物偶联物、本发明第十二方面 所述的药物组合物、本发明第二十一方面所述的药物组合、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了单抗对新冠病毒相关蛋白的结合活性以及受体竞争活性。(A-D) ELISA测定单抗(3H3、5D2和5G2)针对新冠病毒的靶向部位，3H3与蛋白 S-Trimer和蛋白S1反应，3H3结合区域大致在S1的非RBD以及非NTD区域。 抗体5D2和抗体5G2与蛋白S-Trimer、蛋白S1和蛋白RBD反应，抗体5D2和 抗体5G2结合区域大致在RBD。5F8为IgG阴性对照抗体。(E)单抗与受体ACE2 竞争活性ELISA。5D2与5G2有较强的受体竞争能力，3H3没有受体竞争的能力，5F8为IgG阴性对照抗体。
图2显示了单抗对原型株RBD蛋白的亲和力。BLI测定单抗(5D2与5G2) 与SARS-CoV-2原型株RBD的结合与解离时的信号强度。稳态时的结合亲和力 表示为平衡解离常数(KD)。
图3显示了单抗对原型株、B.1.1.7以及B.1.351S-Trimer蛋白的亲和力。 BLI测定单抗(3H3)与SARS-CoV-2S-Trimer的结合与解离时的信号强度。稳态 时的结合亲和力表示为平衡解离常数(KD)。
图4显示了5G2与5D2竞争结合实验。将15μg/ml(100nM)抗体5G2与 原型株RBD蛋白先结合，第一轮抗体结合稳定后，再用15μg/ml(100nM)5D2 与复合体结合。5D2 only为仅有5D2与原型株RBD蛋白结合的信号。
图5显示了单抗3H3的中和活性。将原型株、B.1.1.7、B.1.351、B.1.617 四株假病毒分别与四倍系列稀释的纯化抗体3H3温育1小时，然后加到 293T-hACE2细胞上。感染后约48小时测定细胞内荧光素酶活力，并使用 GraphPad Prism软件计算每种抗体的半数抑制浓度(IC50)。数据表示为平均 值±平均数标准误差。
图6显示了RBD单抗的中和活性。将原型株(Wt)、B.1.1.7、B.1.351、 B.1.617四株假病毒分别与四倍系列稀释的纯化抗体5D2、5G2和2H2(ctr)温 育1小时，然后加到293T-hACE2细胞上。感染后约48小时测定细胞内荧光素 酶活力，并使用GraphPad Prism软件计算每种抗体的半数抑制浓度(IC50)。 数据表示为平均值±平均数标准误差。
图7显示了嵌合单抗的表达和鉴定。(A)鼠源抗体3H3、5D2和5G2在非 还原状态下的蛋白印迹检测。(B)3H3、5D2和5G2的嵌合抗体在293T细胞中 小量表达，48小时取上清检测抗体的表达。表达的嵌合抗体在非还原状态下的 蛋白印迹检测。二抗为辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗人IgG。c3H3，嵌合 3H3抗体。c5D2，嵌合5D2抗体。c5G2，嵌合5G2抗体。
图8显示了嵌合单抗表达上清ELISA检测。3H3、5D2和5G2的嵌合抗体在 293T细胞中小量表达，48小时取上清检测抗体的活性。分别包被新冠S-Trimer、 S1、RBD、NTD蛋白100ng/孔，嵌合抗体上清包被量为50ul/孔，最后使用偶联 HRP羊抗人的抗体作为检测二抗进行检测。腺病毒抗体c6H9(IgG-ctr)为阴 性对照抗体。
图9嵌合单抗表达上清假病毒中和检测。3H3、5D2和5G2的嵌合抗体在 293T细胞中小量表达，48小时取上清检测抗体的活性。分别将90微升原型株 (Wt)、B.1.1.7、B.1.351、B.1.617四株假病毒与嵌合抗体上清50微升温育 1小时，然后加到293T-hACE2细胞上。感染后约48小时测定细胞内荧光素酶 活力，并使用GraphPad Prism软件计算每种抗体的半数抑制浓度(IC50)。 数据表示为平均值±平均数标准误差。腺病毒抗体c6H9(IgG-ctr)为阴性对 照抗体。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，首次意外地开发了一类 对新型冠状病毒SARS-CoV-2S蛋白的RBD区域以及SD1区域具有高特异性和高 亲和力的抗体，以及基于所述抗体的高特异性的嵌合抗原受体免疫细胞。抗体所靶 向RBD以及SD1亚基的保守区域，从而使其对新型冠状病毒的突变株也有较强的中 和活性。具体地，本发明意外地获得具有极其优异的亲和力和特异性的针对新 型冠状病毒(SARS-CoV-2)的单克隆抗体，并且基于该抗体获得了人源嵌合抗 体。本发明的人源嵌合抗体依然能够高特异性地结合新型冠状病毒SARS-CoV-2 的S蛋白，依然具有很高的亲和力和中和能力。本发明的中和实验能证明这三 种抗体能有效地防止新型冠状病毒感染宿主细胞，不仅是通过阻断SARS-CoV-2 受体结合区域(RBD)与其受体宿主受体血管紧张素转化酶2(ACE2)的相互 作用而发挥中和作用，更是通过结合非RBD区域依然可以有效中和病毒的感染。 在此基础上，完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的， 除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在 整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受 误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合 抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一 个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或 “嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结 合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激 活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。
如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的 区域。
如本文所用，"单链可变区片段(ScFv)"是指衍生自抗体的单链多肽，其保 留结合抗原的能力。ScFv的实例包括经重组DNA技术形成的抗体多肽，并且其 中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。改造 ScFv的各种方法是本领域技术人员已知的。
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂 或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予” 和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处 理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给 予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和 离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗人LAG-3抗体与人或动物、受试者、细胞、 组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的 任何一种抗SARS-CoV-2S蛋白的抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾 病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种 或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况 可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特 定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变 的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。 本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为 85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
2019新型冠状病毒，2020年1月12日，世界卫生组织正式将其命名为 2019-nCoV。
如本文所用，术语“新型冠状病毒”、“2019-nCov”或“SARS-CoV-2” 可互换使用，该2019新型冠状病毒是已知感染人的第7种冠状病毒，并且造 成新冠肺炎(COVID-19)，是威胁全球人类健康的严重传染性疾病之一。
冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，是一种有包膜的正链RNA病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四 属。
目前已知的感染人的冠状病毒中，HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状 病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2均为β属 冠状病毒。SARS-CoV-2也被称为2019-nCov。
2003年和2012年分别爆发的高致病性冠状病毒“非典”SARS-CoV和“中 东呼吸综合征”MERS-CoV均属于β属冠状病毒。2019年年底爆发的新型冠状 病毒(SARS-CoV-2)与SARS-CoV有约80％相似性、与MERS-CoV有40％的相似性， 也属于β属冠状病毒。
该类病毒的基因组是一条单股正链RNA，是基因组最大的RNA病毒之一， 编码包括复制酶、刺突蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制 的初始阶段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白 (Polyprotein)，随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如RNA聚合酶和 解旋酶)和结构蛋白(如刺突蛋白)及辅助蛋白。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000 道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条 轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键 数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区 (VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链 的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的 氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同， 它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分 布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超 变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的 可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR 相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠 在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ. No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合， 但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明 显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋 白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其 中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。 对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球 蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗 体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。 单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是 具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。 除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的， 不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一 的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的SARS-CoV-2S蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的 单克隆抗体、具有所述的SARS-CoV-2S蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体， 以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包 括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及 融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重 链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞 因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的SARS-CoV-2S 蛋白抗单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗 SARS-CoV-2S蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性 结合抗原的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗 原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab 片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通 过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组 成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段。Fv抗体含有 抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗 体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗 原结合所需的结构。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab 或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的 部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14或15个连续或非连续的氨基酸。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结 合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M， 例如大约小于10-8M、10- 9M或l0-10M或更小的亲和力(KD)结合。如本文所用，术语 “抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间 位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人 源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的 和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。术语“鼠源抗体”在本 发明中为根据本领域知识和技能制备的针对SARS-CoV-2S蛋白的单克隆抗体。术 语“嵌合抗体(chimericantibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区 融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。术语“人源化抗体 (humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将 鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产 生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异 源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的 参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体 可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特 异性。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。 所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区 和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区和轻链可变区 分别包括如下表A所示的三个互补决定区CDR(氨基酸序列和核苷酸序列)：
表A
Figure BDA0003134393580000171
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:10-12 所示，其中下划线标注的依次为重链可变区CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:22 －24所示，其中下划线标注的依次为轻链可变区CDR1’，CDR2’，CDR3’的 氨基酸序列。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区 和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
本发明抗体的功能是由此抗体轻链和重链可变区基因特异性基因序列决定， 可以特异性的结合SARS-CoV-2的S蛋白，能够阻止SARS-CoV-2侵染易感细胞。 利用此抗体可变区基因或互补决定区(CDR)基因，可在利用原核和真核细胞的任何 表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽” 可互换使用，都指特异性结合SARS-CoV-2S蛋白的抗体，例如具有重链可变 区(如SEQ ID NO.:10－12所示的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.: 22－24所示的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中，所述的抗体为抗SARS-CoV-2S蛋白的鼠或人或人鼠嵌 合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区 或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、 IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域 来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨 基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过 其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上 的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列 来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少 部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重 链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上， 最佳地98％以上)的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免 疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括 所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本 发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似 物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残 基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码 编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成 熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所 形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前 导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形 成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟 练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有SARS-CoV-2S蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多 肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变 异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳 地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代， 以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个 以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的 氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发 明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突 变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交 的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎 全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明 抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约60个连续氨基酸，更佳地至少 约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序 列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个 氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最 好根据表B进行氨基酸替换而产生。
表B
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本 发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码 链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:25-48所示的编码区序列 相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编 码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ IDNO.:25-48所示的编 码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成 熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加 编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以 是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至 少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与 本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃； 或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll， 42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时 才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO.:10-12和/ 或SEQ ID NO.:22-24所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法 或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序 列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接 可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His) 融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通 常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中 分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形 式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或 其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋 白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载 体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属； 鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞； CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿 主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如 果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA 转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装 等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根 据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主 细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的 方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细 胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离 和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包 括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透 破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、 高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、 PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性 标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或 能够产生可检测产物的酶。
可偶联的治疗剂包括但不限于：胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH肽、 肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子、和激素。
此外还可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核 素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒 颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶；10.化疗剂(例如，顺铂)或 任何形式的纳米颗粒等。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物， 它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通 常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质 以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给 药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部 给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合新型冠状病毒S蛋白分子，因而可用 于延长药物的半衰期，此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地 0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及 药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明 的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂 的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制 造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中 该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8 毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。 当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师 技能范围之内的。
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例 如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该 基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选 地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢 病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定 的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如 鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。 它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将 其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可 用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因 疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、 5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发 明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体， 其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴 趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本 领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物 学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、 腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中 起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标 记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如， 逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的 技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分 离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知 的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知 的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这 些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包 含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元 件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中， 启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子， 表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启 动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的 强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子 -1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿 病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末 端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔 (Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸 激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动 子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够 当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的 表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金 属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选 择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转 染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携 带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼 都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包 括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常 地，报告基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组 织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶 活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间 下进行测定。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素 乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等， 2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制 备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼 区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价 试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达 载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如， 哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物 学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子 轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本 领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细 胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载 体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺 乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病 毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合 物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合 胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系 统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂 质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面， 该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部 中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分 子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与 脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复 合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/ 表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中， 作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液 中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生 或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链 脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化 合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为质粒，比如pcDNA3.4。
制剂
本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述 的重链可变区、本发明第三方面所述的重链、本发明第四方面所述的轻链可变 区、本发明第五方面所述的轻链、第六方面所述的抗体、本发明第七方面所述 的重组蛋白、本发明第八方面所述的CAR构建物、本发明第九方面所述的免疫 细胞、或本发明第十方面所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体、 稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制 剂为注射剂。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓 冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白 质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐 剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用 的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用 的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本 发明的抗体可以固定于检测板。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明的针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白的抗体具有高特异性和 高亲和力。
(2)本发明首次从S蛋白三聚体(S-Trimer)免疫的小鼠中制备出了三种 针对新冠原型株及其B.1.1.7、B.1.351和B.1.617突变株的强中和单抗(命 名为3H3、5D2和5G2)，并初步确定其靶向区域、中和活性和抗体序列。
(3)本发明的单克隆抗体能够识别冠状病毒SARS-2-CoV S蛋白的不同表位 (比如，S1，RBD)，靶向两个不同表位的单抗组合对冠状病毒SARS-2-CoV也具 有很高的中和活性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
材料和方法
1.1细胞。小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0在补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(Gibco，美国)中培养。人胚胎肾细胞系293F在无血清培养基 FreeStyleTM293Expression Medium(Gibco，美国)中培养。
1.2蛋白。S相关蛋白：基因片段均经人偏好密码子优化，可通过GenBank号MN908947.3获得其氨基酸序列，合成的编码的S-Trimer为S蛋白(GenBank号 MN908947.3)的16-1208位残基；编码的NTD蛋白为S蛋白(GenBank号MN908947.3) 的16-294位残基；编码的S1蛋白为S蛋白(GenBank号MN908947.3)的16-685 位残基；编码的RBD蛋白为S蛋白(GenBank号MN908947.3)的320-550位残基； 以上四个片段分别克隆到pcDNA3.4质粒上，基因的上游为白介素10的信号肽，下 游为组氨酸标签。为了表达重组的ACE2受体蛋白，编码ACE2胞外区(18-740位 残基，可通过NM_001371415编号于NCBI获得其氨基酸序列)的片段，克隆到改造的 pcDNA3.4质粒上，基因的上游为白介素10的信号肽，下游为人IgG1的铰链区(hinge)和可结晶片段(Fc段)以及组氨酸标签。以上所有重组表达质粒使用聚 乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)分别瞬时转染到293F细胞中。经过4天左右的 培养后，收取上清，然后Ni柱纯化蛋白。ACE2-Fc与S-Trimer按照制造商的说明， 用EZ-Link TM Sulfo-NHS-LC-LC-生物素试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美 国)进行生物素化，然后使用ZebaTM离心脱盐柱(Thermo Fisher Scientific) 去除多余的未反应的生物素。
1.3单抗制备。动物研究由上海巴斯德研究所的动物福利和使用委员会批 准。所有小鼠均购自上海实验动物中心(SLAC，中国)。
小鼠免疫如下：0天时，将50μg/剂S-Trimer蛋白与氢氧化铝佐剂(500 μg/剂；Invivogen，美国)、CpG(25μg/剂)混合，腹腔注射6-8周龄的雌 性BALB/c小鼠。14天时，将50μg/剂的S-Trimer蛋白与等体积的弗氏完全 佐剂(sigma，美国)混合乳化后，皮下注射小鼠。28天时，将50μg/剂S-Trimer 蛋白与氢氧化铝佐剂(500μg/剂；Invivogen，美国)、CpG(25μg/剂)混 合，腹腔注射。35天将50μg/剂的S-Trimer蛋白与等体积的TiterMax佐剂(Sigma)混合乳化后，皮下注射小鼠。42天时，通过尾静脉注射100μg S-Trimer蛋白进行加强免疫。在加强免疫后四天收获脾细胞，在聚乙二醇(PEG) 1450(Sigma)的作用下与SP2/0骨髓瘤细胞融合。融合细胞在次黄嘌呤，氨 基喋呤和胸苷(HAT；Sigma)选择性生长培养基中培养12天。通过如下所述 的假病毒中和方法，筛选具有中和能力的阳性杂交瘤单克隆细胞株。将选择的 阳性杂交瘤单克隆进行扩增，随后腹腔注入液体石蜡诱发的BALB/c小鼠中。 然后收集腹水并使用Protein G亲和层析柱(Yeasen，中国)纯化单抗。
1.4酶联免疫吸附试验(ELISA)。为了检测抗体的抗原结合能力，在微量 ELISA板(Nunc，美国)中包被50ng/孔的S-Trimer蛋白，4℃过夜。然后 用溶在PBS-Tween20(PBST)中的5％脱脂奶粉进行封闭。用PBST洗涤后，加 入50μL/孔的杂交瘤上清或三倍连续稀释的纯化单抗，然后37℃温育2小时。 洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠IgG(1：10,000稀释； Sigma-Aldrich，美国)并在37℃温育1小时。显色后，用酶标仪监测450nm 处的吸光值。注：寨卡病毒(ZIKV)E蛋白特异性单抗5F8作为同型对照。
为了检测抗体的受体竞争能力，在ELISA板中包被50ng/孔的S-Trimer 蛋白，4℃过夜。然后用溶在PBST中的5％脱脂奶粉进行封闭。用PBST洗涤后， 加入25μL/孔的杂交瘤上清或两倍连续稀释的纯化单抗以及25μL/孔(20ng) 的ACE2-Fc受体蛋白或生物素化的ACE2-Fc受体蛋白，然后37℃温育2小时。 洗涤后，加入HRP偶联的抗人IgG(Abcam，美国)或HRP偶联的链亲和素 (proteintech，美国)并在37℃温育1小时。显色后，用酶标仪监测450nm 处的吸光值。
根据制造商的说明，使用SBA Clonotyping System-HRP试剂盒(SouthernBiotech，美国)通过ELISA鉴定单抗的轻重链类型。
1.5假病毒的制备和中和试验。
基于鼠白血病病毒(MLV)的SARS-CoV-2假病毒制备简述如下：将S蛋白 编码质粒、MLV Gag-Pol包装质粒和和编码荧光素酶报告基因的MLV转移质粒 与Lipofectamine 2000(Life Technologies)混合后，共转染到HEK 293T细 胞中。将细胞与转染培养基在37℃孵育18小时。然后去掉转染培养基，加入 含有10％FBS的DMEM，37℃再孵育30小时。然后收集上清液，并用0.45μm 膜过滤。SARS-CoV-2原型株(Wt)假病毒序列源自nCoV-SH01(GenBank:MT121215.1),B.1.1.7突变株序列可经GSISAID number (EPI_ISL_601443)查询，B.1.351突变株序列可经GSISAID number (EPI_ISL_660614，EPI_ISL_660629，EPI_ISL_678626)查询，B.1.617可经 GSISAID number(EPI_ISL_1360352)查询，以上三株氨基酸突变列表如(表5) 所示。
假病毒中和试验如下：培养过表达hACE2的293T细胞(293T-hACE2)， 接种到96孔板中。50μL 4倍梯度稀释的抗体样品与100μL假病毒，37℃温 育1小时后，加入到细胞上，37℃孵育18小时。去掉培养基后，加入新鲜培 养基，37℃再孵育30小时。然后利用LuciferaseAssay System(Promega)试 剂盒检测胞内荧光素酶信号，方法依据制造商的说明书。根据如下公式计算中 和百分比：100×(给定样品的荧光-单纯细胞对照样品的荧光)/(单纯假病毒 对照样品的荧光-单纯细胞对照样品的荧光)。使用GraphPad Prism软件，通 过非线性回归方法计算每种单抗的半数抑制浓度(IC50)。IC50定义为与单纯 假病毒对照样品的感染相比，抑制50％病毒感染所需的抗体浓度。
1.6生物膜干涉测量(BLI)测定。为了测定抗体与抗原的结合亲和力，根 据制造商的说明，在Octet RED96机器(Pal lFortéBio，美国)上进行BLI测 定。简言之，将能与抗体结合的相应蛋白用动力学溶液(补充有0.1％牛血清 白蛋白和0.02％吐温20的0.01M PBS)稀释到50ng/μL，然后固定在有SA-NTA 或者Ni-NTA的生物传感器(Pall FortéBio)上直至饱和。将结合上抗原的生 物传感器置于含有一系列稀释的单抗样品的孔中作用500s以允许抗原抗体结 合，然后浸入动力学溶液中作用500s来解离。使用Octet数据分析软件(PallFortéBio)计算平衡解离常数(KD)。
1.7单抗序列的测定和分析。为了鉴定抗体序列，使用PureLink RNA Mini 试剂盒(Invitrogen，美国)从杂交瘤细胞中分离总RNA。然后使用抗体型别 特异性引物和M-MLV逆转录酶(Promega,美国),合成第一链cDNA。用Ex Taq 酶(Takara，日本)和兼并引物进行PCR扩增,随后测序，以获得单抗的重链 和轻链的可变区序列。使用IgBLAST工具确定互补决定区(CDR)的位置。
1.8抗SARS-CoV-2嵌合单抗的表达和初步鉴定。为了制备嵌合单抗，将 鼠源单抗的重链和轻链可变区基因分别克隆到改造过的pcDNA3.4载体中，该 载体包含白介素10(IL-10)信号序列和人免疫球蛋白的恒定区基因(gamma 1， kappa)。将所得的轻链和重链表达质粒通过Lipofectamine 2000(Life Technologies)共转染到HEK 293T细胞中，6小时后换成无血清培养基，42 小时后收取上清，检测嵌合抗体的表达及其特性。
抗体结合新冠病毒S蛋白的表位信息。3H3结合于新冠病毒S蛋白的SD1 亚基，具体氨基酸区域在NLVKN或TESNK或QTLEIL。5D2结合于新冠病毒S蛋 白的RBD亚基，具体氨基酸区域在STPCNGVEGFNCY。5G2结合于新冠病毒S蛋 白的RBD亚基，具体氨基酸区域在TFKCYGVSPT或NGVGYQ。
实施例1抗SARS-CoV-2单抗的制备和生化鉴定
为了制备抗SARS-CoV-2的单抗，将SARS-CoV-2S-Trimer融合蛋白免疫 小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤。杂交瘤细胞的筛选是通 过假病毒中和实验的方式。阳性杂交瘤细胞通过有限稀释进行亚克隆。最后， 获得3个稳定的具有中和活性的克隆，分别命名为3H3、5D2和5G2。单抗3H3 和5D2均属于IgG1和kappa亚型，5G2属于IgG2b和kappa亚型(表1)。
表1抗SARS-CoV-2单抗中和以及靶向区域特征
Figure BDA0003134393580000311
通过ELISA检测单抗识别不同新冠病毒抗原的能力，这些抗原包括重组表 达的SARS-CoV-2原型株的S-Trimer、S1、RBD、NTD。如(图1A-D)所示， 单抗3H3、5D2和5G2均能与SARS-CoV-2的S-Trimer反应；5F8为同型阴性对 照抗体，不结合S-Trimer。此外，单抗5D2和5G2均能够结合S1和RBD，从 而确定其结合表位位于RBD区；单抗3H3仅仅能结合S-Trimer和S1，但对RBD 和NTD抗原无反应，表明该抗体结合区域应该位于S1的非RBD区域以及非NTD区域。
受体ACE2可以较高亲和力结合S-Trimer蛋白。我们通过ELISA检测单抗 与受体ACE2(已生物素化)竞争结合S-Trimer蛋白的能力，随后检测已经被 生物素化的ACE2Biotin的信号即ACE2的信号。如(图1E)所示，单抗5D2 和5G2与ACE2均有竞争活性，表明这两种抗体起中和作用的机制是抑制了S 蛋白与ACE2的结合。3H3并未有受体竞争的作用，这表明其有另一种中和机制。
为了定量测定单抗的结合亲和力，进行生物膜干涉实验(BLI)测定。在 该实验中，将RBD抗体5D2和5G2分为一组，抗体3H3分为一组。RBD抗体组 将SARS-CoV-2原型株的RBD固定到传感器上，然后使其与不同浓度的抗体5D2 和5G2相互作用。5D2的平衡解离常数(KD)低于0.001nM；5G2的KD值低于 0.001nM(表3)。这些结果表明单抗5D2和5G2对SARS-CoV-2抗原具有很高 的亲和力。对抗体3H3亲和力的检测，将SARS-CoV-2原型株、B.1.1.7、B.1.351的S-Trimer固定到传感器上,然后使其与不同浓度的抗体3H3相互作用，3H3 的平衡解离常数(KD)均在纳摩尔级别(表4)，这不仅说明3H3与S-Trimer 有较强亲和力，而且还表明其不受病毒株突变的影响。
表3 RBD抗体亲和力检测
Figure BDA0003134393580000321
注：抗体与SARS-CoV-2RBD相互作用的KD(平衡)值通过BLI测定(参 见图2)。
表4抗体3H3亲和力检测
Figure BDA0003134393580000322
注：抗体与SARS-CoV-2S-Trimer相互作用的KD(平衡)值通过BLI测定(参 见图3)
表5相比于新冠原型株，本文中用的突变株所对应的突变位点
Figure BDA0003134393580000323
Figure BDA0003134393580000331
注：S蛋白突变位点攥写规则按照：原型株氨基酸简写在前，突变氨基酸所在 位点在中间，突变成的氨基酸简写在后。
通过5G2与5D2的竞争结合实验，如(图4)所示，进一步确认单抗5G2 与5D2的确有竞争关系，但同样可以确认二者结合RBD的表位也不完全重合。
通过假病毒中和试验测定单抗对SARS-CoV-2的中和效果。5D2和5G2对原 型株的半数抑制浓度(IC50)分别被测定为0.023和0.293μg/mL(图6A)。 5D2和5G2对B.1.1.7突变株的半数抑制浓度(IC50)分别被测定为0.037和 0.482μg/mL(图6B)。5D2和5G2对B.1.351突变株的半数抑制浓度(IC50) 分别被测定为0.047和0.367μg/mL(图6C)。5D2和5G2对B.1.617.突变 株的半数抑制浓度(IC50)分别被测定为0.005和0.103μg/mL(图6D)。 抗体3H3对原型株(Wt)、B.1.1.7、B.1.351、B.1.617四株假病毒的中和IC50 分别为0.083、0.191、0.107和0.098μg/ml(图5)。
实施例2抗SARS-CoV-2单抗的序列
为了测定抗体序列，从杂交瘤细胞中提取RNA，然后兼并引物法扩得可变 区序列。测序结果显示单抗3H3、5D2和5G2的重链可变区的序列显著不同， 采用了完全不同的胚系基因家族的基因片段(表2)。这些结果表明克隆3H3、 5D2和5G2来自不同的杂交瘤细胞祖先。
表2抗SARS-CoV-2单抗可变区的胚系基因(IgBlast分析)
Figure BDA0003134393580000332
注：VH，DH，JH分别为重链可变区的V，D，J胚系基因片段。
VK，JK分别为轻链可变区的V，J胚系基因片段。
实施例3嵌合单抗的表达与鉴定
将鼠源3H3、5D2和5G2的可变区分别与人IgG1重链和人kappa轻链的恒 定区来连接以构建人-鼠嵌合单抗，并在HEK 293T细胞中进行表达。嵌合单抗 3H3(c3H3)、5D2(c5D2)和5G2(c5G2)在蛋白印迹分析中与抗人IgG二抗 反应(图7)，证实嵌合抗体中包含人源Fc。表达的c3H3、c5D2和c5G2的完 整抗体不仅能强结合SARS-CoV-2S-Trimer的蛋白，而且也可与各自对应的靶 点区域相结合(图8)。将嵌合抗体表达上清进行假病毒实验，实验结果表明 其仍有较好的中和活性(图9)，根据ELISA与中和实验结果可以说明抗体可 变区序列正确。综上所述，这些数据表明人源化抗体c3H3、c5D2和c5G2保留 了强的抗原结合活性和中和活性。
序列信息：
1.单抗3H3重链的核苷酸序列
注：划横线部分为可变区序列(SEQ ID NO.:43)，斜体部分为恒定区序 列(SEQ IDNO.:49)。
Figure BDA0003134393580000341
Figure BDA0003134393580000351
2.单抗3H3重链的氨基酸序列
Figure BDA0003134393580000352
注：黑色加粗部分为可变区序列SEQ ID NO.:10，斜体部分为恒定区序列 (SEQ IDNO.:50)，*为终止密码子。下划线标出的是互补决定区(CDR)， 依次为CDR1，CDR2和CDR3。
3.单抗3H3轻链的核苷酸序列
Figure BDA0003134393580000353
注：划横线部分为可变区序列SEQ ID NO.:44，斜体部分为恒定区序列(SEQ IDNO.:51)。
4.单抗3H3轻链的氨基酸序列
Figure BDA0003134393580000354
Figure BDA0003134393580000361
注：黑色加粗部分为可变区序列SEQ ID NO.:22，斜体部分为恒定区序列 (SEQ IDNO.:52)，*为终止密码子。下划线标出的是互补决定区(CDR)， 依次为CDR1’，CDR2’，CDR3’。
5.单抗5D2重链的核苷酸序列
Figure BDA0003134393580000362
注：划横线部分为可变区序列SEQ ID NO.:45，斜体部分为恒定区序列(SEQ IDNO.:53)。
6.单抗5D2重链的氨基酸序列
Figure BDA0003134393580000371
注：黑色加粗部分为可变区序列SEQ ID NO.:11，斜体部分为恒定区序列 (SEQ IDNO.:54)，*为终止密码子。下划线标出的是互补决定区(CDR)， 依次为CDR1，CDR2，CDR3。
7.单抗5D2轻链的核苷酸序列
Figure BDA0003134393580000372
注：划横线部分为可变区序列SEQ ID NO.:46，斜体部分为恒定区序列(SEQ IDNO.:55)。
8.单抗5D2轻链的氨基酸序列
Figure BDA0003134393580000373
Figure BDA0003134393580000381
注：黑色加粗部分为可变区序列SEQ ID NO.:23，斜体部分为恒定区序列 (SEQ IDNO.:56)，*为终止密码子。下划线标出的是互补决定区(CDR)， 依次为CDR1’，CDR2’，CDR3’。
9.单抗5G2重链的核苷酸序列
Figure BDA0003134393580000382
注：划横线部分为可变区序列SEQ ID NO.:47，斜体部分为恒定区序列(SEQ IDNO.:57)。
10.单抗5G2重链的氨基酸序列
Figure BDA0003134393580000391
注：黑色加粗部分为可变区序列SEQ ID NO.:12，斜体部分为恒定区序列 (SEQ IDNO.:58)，*为终止密码子。下划线标出的是互补决定区(CDR)， 依次为CDR1，CDR2，CDR3。
11.单抗5G2轻链的核苷酸序列
Figure BDA0003134393580000392
注：下划线部分为可变区序列SEQ ID NO.:48，斜体部分为恒定区序列(SEQ IDNO.:59)。
12.单抗5G2轻链的氨基酸序列
Figure BDA0003134393580000393
Figure BDA0003134393580000401
注：黑色加粗部分为可变区序列SEQ ID NO.:24，斜体部分为恒定区序列 (SEQ IDNO.:60)，*为终止密码子。下划线标出的是互补决定区(CDR)， 依次为CDR1’，CDR2’，CDR3’。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海巴斯德研究所
<120> 抗新冠病毒广谱中和性单抗的制备和应用
<130> P2021-1574
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> PRT
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35 40 45
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100 105 110
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Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Phe Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
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100 105 110
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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20 25 30
Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
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20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Lys Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Thr
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
ggatacacat tcactgacta caac 24
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
attaatccta acagtggttt tatt 24
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 39
gcaagagaag ggtatggtaa caactttgac tac 33
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 40
cagagcattg gcacaagc 18
<210> 41
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 41
tatgcttct 9
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 42
caacaaagtt atagctggcc aaccacg 27
<210> 43
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 43
caggtccaat tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cctcaggcta ctccttcacc aggttctgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggcatg attcatcctt ccgatagtga aactaggtta 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccac cacagcctac 240
atgcaactca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaaagac 300
tatgattacg acgcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 44
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 44
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacg 60
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt gcatctgtct atagttatat gcactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccag cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcatc acagtaggga gcttcctccg 300
gcgttcggtg gaggcaccaa actggaaatc aaa 333
<210> 45
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatc 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgtactgggt gaagcagagc 120
catggacaga gccttgagtg gattggaggc attaatccta acattgatga tactacctac 180
aaccagaact tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggaattcc gcagcctgac atttgatgat tctgcagtct attactgtgc aagagatgat 300
aaggcctcgt ttgctttctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 46
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 46
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagatggaga gagggttact 60
ttgacctgca agtccagtca gagcctttta tatagtacca atcaaaagaa ctatttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc gtcctctagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctg 336
<210> 47
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 47
gaggtcctgc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acagtggttt tattatctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggcctcattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagagaaggg 300
tatggtaaca actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tctcagtctc ctca 354
<210> 48
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
gacatcttgc tgactcagtc tccaaccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60
ttttcctgca gggccagtca gagcattggc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 120
aaaggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180
aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240
gaagatattg gagattatta ctgtcaacaa agttatagct ggccaaccac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagttgaa a 321
<210> 49
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 49
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480
gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720
agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960
tctcctggta aataa 975
<210> 50
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 50
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 51
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 51
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180
agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240
cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300
agcttcaaca ggaatgagtg ttag 324
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 52
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 53
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 53
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480
gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720
agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960
tctcctggta aataa 975
<210> 54
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 54
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 55
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 55
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180
agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240
cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300
agcttcaaca ggaatgagtg ttag 324
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 56
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 57
<211> 1011
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 57
gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ctggcccctg ggtgtggaga tacaactggt 60
tcctccgtga ctctgggatg cctggtcaag ggctacttcc ctgagtcagt gactgtgact 120
tggaactctg gatccctgtc cagcagtgtg cacaccttcc cagctctcct gcagtctgga 180
ctctacacta tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggccaag tcagaccgtc 240
acctgcagcg ttgctcaccc agccagcagc accacggtgg acaaaaaact tgagcccagc 300
gggcccattt caacaatcaa cccctgtcct ccatgcaagg agtgtcacaa atgcccagct 360
cctaacctcg agggtggacc atccgtcttc atcttccctc caaatatcaa ggatgtactc 420
atgatctccc tgacacccaa ggtcacgtgt gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca 480
gacgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac gtggaagtac acacagctca gacacaaacc 540
catagagagg attacaacag tactatccgg gtggtcagca ccctccccat ccagcaccag 600
gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc aaggtcaaca acaaagacct cccatcaccc 660
atcgagagaa ccatctcaaa aattaaaggg ctagtcagag ctccacaagt atacatcttg 720
ccgccaccag cagagcagtt gtccaggaaa gatgtcagtc tcacttgcct ggtcgtgggc 780
ttcaaccctg gagacatcag tgtggagtgg accagcaatg ggcatacaga ggagaactac 840
aaggacaccg caccagtcct ggactctgac ggttcttact tcatatatag caagctcaat 900
atgaaaacaa gcaagtggga gaaaacagat tccttctcat gcaacgtgag acacgagggt 960
ctgaaaaatt actacctgaa gaagaccatc tcccggtctc cgggtaaatg a 1011
<210> 58
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 58
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys
85 90 95
Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
130 135 140
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
145 150 155 160
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
165 170 175
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val
180 185 190
Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
195 200 205
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr
210 215 220
Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu
225 230 235 240
Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys
245 250 255
Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser
260 265 270
Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp
275 280 285
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser
290 295 300
Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly
305 310 315 320
Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 59
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 59
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180
agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240
cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300
agcttcaaca ggaatgagtg ttag 324
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 60
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105

Claims (10)

1.一种抗体，其特征在于，所述抗体结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白的表位NLVKN或TESNK或QTLEIL或STPCNGVEGFNCY或TFKCYGVSPT或NGVGYQ。
2.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:1、2或3所示的CDR1，
SEQ ID NO:4、5或6所示的CDR2，和
SEQ ID NO:7、8或9所示的CDR3。
3.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求2所述的重链可变区。
4.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:13、14或15所示的CDR1'，
SEQ ID NO:16、17或18所示的CDR2'，和
SEQ ID NO:19、20或21所示的CDR3'。
5.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求4所述的轻链可变区。
6.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求2所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求4所述的轻链可变区。
7.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的抗体、权利要求2所述的重链可变区、如权利要求3所述的重链、如权利要求4所述的轻链可变区、如权利要求5所述的轻链、或权利要求6所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
8.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的抗原结合区为特异性结合于SARS-CoV-2S蛋白的scFv，并且所述scFv具有如权利要求2所述的重链可变区和如权利要求4所述的轻链可变区。
9.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求8所述的CAR构建物；或所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求1或6所述的抗体。
10.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的抗体、权利要求2所述的重链可变区、如权利要求3所述的重链、如权利要求4所述的轻链可变区、如权利要求5所述的轻链、或如权利要求6所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
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