CN102665757A

CN102665757A - 通过双特异性抗体预靶向的用于细胞毒性药物的递送系统

Info

Publication number: CN102665757A
Application number: CN2010800526498A
Authority: CN
Inventors: W·J·麦克布莱德; C·A·德索扎; C-H·张; D·M·戈德堡
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2012-09-12
Also published as: CA2782398A1; EP2509630A1; CA2782398C; EP2509630A4; WO2011072124A1

Abstract

本发明涉及用于治疗剂的预靶向递送的方法和组合物。在优选的实施方案中，所述预靶向方法包括：a)施用具有第一结合位点的针对疾病相关抗原和可靶向构建体上的半抗原的双特异性抗体；b)施用包含至少一种治疗剂的可靶向构建体。在优选实施方案中，所述双特异性抗体是通过所述对接锁定(DNL)技术制备。在一更优选实施方案中，所述可靶向构建体包含一个或多个SN-38部分。

Description

通过双特异性抗体预靶向的用于细胞毒性药物的递送系统

相关申请

本申请要求11/18/2010提交的美国专利申请No.12/949,536；10/29/2010提交的美国专利申请No.12/915,515；8/30/2010提交的美国专利申请No.12/871,345；8/27/2010提交的美国专利申请No.12/869,823；4/6/2010提交的美国专利申请No.12/754,740；4/1/2010提交的美国专利申请No.12/752,649；3/25/2010提交的美国专利申请No.12/731,781；12/22/2009提交的美国专利申请No.12/644,146的优先权。

本申请还要求2009年12月9日提交的美国临时专利申请61/267,998的权益。各优先权申请的正文全部以引用的方式并入本文。

发明领域

本发明涉及具有改良的靶向以下疾病的能力的治疗偶联物：如癌症、感染性疾病、自体免疫性疾病、免疫功能障碍(例如移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反应)、心血管疾病、代谢疾病和神经(例如神经退化性)疾病。优选地，递送系统包含预靶向方法，其中双特异性抗体具有针对疾病相关抗原的一个或多个结合位点和针对可靶向构建体上的半抗原的一个或多个结合位点。可靶向构建体可包含治疗剂(如细胞毒性药物)和/或诊断剂(如放射性核素)。更优选地，细胞毒性药物可为SN-38。更优选地，双特异性抗体是通过对接锁定(DNL)技术制备。

发明背景

已使用单克隆抗体来将毒性剂靶向递送到癌症和其它患病细胞。然而，抗体和毒性剂的免疫偶联物已在癌症或自体免疫性疾病的治疗中获得各种成功，而在其它疾病，如感染性疾病中却极少应用。毒性剂最通常为化学疗法药物，不过已将粒子发射性放射性核素或细菌或植物毒素与抗体偶联，尤其用于治疗癌症(Sharkey和Goldenberg,2006,CA Cancer J Clin 56:226-243)，以及利用放射性免疫偶联物用于某些感染性疾病的临床前治疗(Dadachova和Casadevall,2006,Q J NuclMed Mol Imaging 50:193-204)。

喜树碱(Camptothecin；CPT)和其衍生物是一类有效抗肿瘤剂。伊立替康(Irinotecan)(也称为CPT-11)和拓扑替康(topotecan)是已批准用作癌症治疗剂的CPT类似物(Iyer和Ratain,1998,Cancer ChemotherPhamacol 42:S31-S43)。CPT通过抑制拓扑异构酶I起作用(Hsiang等,1985,J Biol Chem 260:14873-78)。尽管作为有效细胞毒性剂，但喜树碱的治疗用途仍受其在水溶液中相对不溶和高全身性毒性限制，这使得可递送到所靶向疾病细胞的有效剂量受到限制。在本领域中对更有效的用于喜树碱和其它治疗剂的靶向递送方法存在需要。

发明概要

本发明通过提供改良的用于靶向递送治疗剂的方法和组合物解决本领域中未满足的需要。在优选实施方案中，方法和组合物包括用新颖双特异性抗体构建体进行预靶向，所述构建体含有至少一个针对疾病相关抗原(如肿瘤相关抗原、B细胞相关抗原或病原体相关抗原)的结合位点，和至少一个针对可靶向构建体上的半抗原的结合位点。可靶向构建体用作治疗剂或诊断剂的载体。

更优选地，所述双特异性抗体构建体是通过对接锁定(DNL)技术制备(参见例如美国专利No.7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400，各专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。DNL技术利用来自蛋白激酶A的二聚化与对接结构域(DDD部分)与来自多种已知A激酶锚定蛋白(AKAP)中任一种的锚定结构域(AD部分)之间发生的特异性结合相互作用。DDD部分自发地形成二聚体，其接着结合AD部分。通过将适当效应部分(如抗体或其片段)连接于AD和DDD部分，DNL技术允许特异性共价形成任何期望靶向递送复合物。在效应部分为蛋白质或肽的情况下，AD和DDD部分可并入与效应部分偶联的融合蛋白中。

所使用的抗体或其它靶向分子可结合本领域中已知的任何疾病相关抗原。举例来说，在疾病病况是癌症的情况下，由肿瘤细胞表达或以其它方式与肿瘤细胞相关的许多抗原在本领域中是已知的，包括但不限于：碳酸酐酶IX、α-胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GROB、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和其亚基、HER2/neu、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、肌腱蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原(Thomson-Friedenreich antigens)、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤维连接蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、致癌基因标志和致癌基因产物(参见例如Sensi等,Clin Cancer Res2006,12:5023-32；Parmiani等,J Immunol 2007,178:1975-79；Novellino等Cancer Immunol Immunother 2005,54:187-207)。

可利用的示例性抗体包括但不限于：hR1(抗IGF-1R，3/12/10提交的美国专利申请No.12/722,645)、hPAM4(抗粘蛋白，美国专利No.7,282,567)、hA20(抗CD20，美国专利No.7,251,164)、hA19(抗CD19，美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(抗AFP，美国专利No.7,300,655)、hLL1(抗CD74，美国专利No.7,312,318)、hLL2(抗CD22，美国专利No.7,074,403)、hMu-9(抗CSAp，美国专利No.7,387,773)、hL243(抗HLA-DR，美国专利No.7,612,180)、hMN-14(抗CEACAM5，美国专利No.6,676,924)、hMN-15(抗CEACAM6，美国专利No.7,541,440)、hRS7(抗EGP-1，美国专利No.7,238,785)、hMN-3(抗CEACAM6，美国专利申请No.7,541,440)、Ab124和Ab125(抗CXCR4，美国专利No.7,138,496)，各引用专利或申请的实施例部分以引用的方式并入本文。

所使用的抗体或抗原结合片段可以是嵌合、人源化或人的。对于亲本鼠类抗体，优选使用嵌合抗体，因为其具有人抗体恒定区序列并且因此不会引发同鼠类抗体一样强的人抗小鼠抗体(HAMA)反应。甚至更优选使用人源化抗体，以便进一步降低诱发HAMA反应的可能性。如下文所论述，通过将鼠类框架区和恒定区序列置换为相应人抗体框架区和恒定区序列对鼠类抗体进行人源化的技术在本领域中是熟知的并且已应用于众多鼠类抗癌抗体。抗体人源化还可能涉及将一个或多个人框架氨基酸残基取代为来自亲本鼠类框架区序列的相应残基。同样如下文所论述，用于制造人抗体的技术也是熟知的。

各种实施方案可能涉及使用主题方法和组合物来治疗疾病，包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas)、B细胞急性和慢性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞白血病、急性和慢性骨髓性白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤和皮肤癌。癌瘤可选自由口腔癌、胃肠道癌、结肠癌、胃癌、肺气管癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌、皮肤癌和睾丸癌组成的组。

此外，可使用主题方法和组合物来治疗自体免疫性疾病，例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合症、大疱性类天包疮、糖尿病、亨诺克-斯奇赖恩紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、爱迪生氏病(Addison's disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合症(Goodpasture's syndrome)、血管闭塞性脉管炎、休格伦氏综合症(Sjogren's syndrome)、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、甲状腺素症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨(tabes dorsalis)、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。

在某些实施方案中，疾病疗法可通过与一种或多种其它治疗剂的组合疗法来增强。所使用的已知治疗剂包括毒素、免疫调节剂(如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子和肿瘤坏死因子)、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸(如siRNA或RNAi)、光敏治疗剂、抗血管生成剂和促细胞凋亡剂。治疗剂可通过与相同或不同抗体或其它靶向分子偶联进行递送或可以未偶联形式递送。其它治疗剂可在双特异性抗体和可靶向构建体之前、同时或之后施用。

在一优选实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂，如药物或毒素。同样优选的是，药物选自由以下组成的组：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、吉西他滨(gemcitabine)、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉酚、喜树碱、SN-38、阿霉素(doxorubicins)和其类似物、抗代谢物、烷基化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、促细胞凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-11和其组合。

在另一优选实施方案中，治疗剂选自由以下组成的组的毒素：蓖麻毒素(ricin)、相思豆毒素(abrin)、α毒素(alpha toxin)、皂草素(saporin)、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A(Staphylococcalenterotoxin-A)、美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、白树毒素(gelonin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)和假单胞菌内毒素(Pseudomonas endotoxin)以及其组合。或者选自由以下组成的组的免疫调节剂：细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、群落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素和其组合。

在其它优选实施方案中，治疗剂选自由以下组成的组的放射性核素：¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹¹At、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³³P、⁴⁷Sc、¹¹¹Ag、⁶⁷Ga、¹⁴²Pr、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁸⁹Re、²¹²Pb、²²³Ra、²²⁵Ac、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁹Mo、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹⁴³Pr、¹⁴⁹Pm、¹⁶⁹Er、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au和²¹¹Pb。随俄歇发射粒子(Auger-emitting particle)实质上衰变的放射性核素也是优选的。例如Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。适用β粒子发射核素的衰变能优选为<1,000keV，更优选为<100keV，并且最优选为<70keV。随着α粒子产生而实质上衰变的放射性核素也是优选的。所述放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。适用α粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选为3,000-8,000keV，并且最优选为4,000-7,000keV。其它潜在适用放射性同位素包括¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁷⁵Br、¹⁹⁸Au、²²⁴Ac、¹²⁶I、¹³³I、^77Br、^113mIn、⁹⁵Ru、⁹⁷Ru、¹⁰³Ru、¹⁰⁵Ru、¹⁰⁷Hg、²⁰³Hg、^121mTe、^122mTe、^125mTe、¹⁶⁵Tm、¹⁶⁷Tm、¹⁶⁸Tm、¹⁹⁷Pt、¹⁰⁹Pd、¹⁰⁵Rh、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁹⁹Au、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵¹Cr、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、²⁰¹Tl、²²⁵Ac、⁷⁶Br、¹⁶⁹Yb等。在其它实施方案中，治疗剂是选自由色原体和染料组成的组的光敏治疗剂。

或者，治疗剂是选自由以下组成的组的酶：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。所述酶可与例如以相对无毒形式施用且在靶位点由酶转化成细胞毒性剂的前药组合使用。在其它替代方案中，药物可在受试者体内由内源性酶转化成毒性较低形式，但可能由治疗性酶再转化成细胞毒性形式。

因此，可应用所公开的方法和组合物来治疗疾病和病状，其中靶向部分是用来递送细胞毒性剂。所述疾病或病状的特征可在于存在当在如对癌症或病原性生物体感染进行的免疫治疗中使用未偶联或裸靶向部分时影响不充分的靶分子或靶细胞。(关于制备抗体与同位素、药物和毒素的免疫偶联物供在疾病疗法中使用的方法，请参见例如美国专利No.4,699,784；4,824,659；5,525,338；5,677,427；5,697,902；5,716,595；6,071,490；6,187,284；6,306,393；6,548,275；6,653,104；6,962,702；7,033,572；7,147,856；7,259,240和美国专利申请公布No.20050175582(现已放弃)；20050136001；20040166115(现已放弃)；20040043030(现已放弃)；20030068322(现已放弃)和20030026764(现已放弃)，各文献的实施例部分以引用的方式并入本文。)

喜树碱(CPT)和其类似物及衍生物是优选的化学治疗部分，不过本发明不限于此。本发明范围内的其它化学治疗部分为紫杉烷(例如浆果赤霉素III(baccatin III)、紫杉酚)、卡奇霉素(calicheamicin)、埃坡霉素(epothilones)、蒽环类药物(anthracycline drugs)(例如阿霉素(DOX)、表柔比星(epirubicin)、吗啉基阿霉素(吗啉基-DOX)、氰基吗啉基-阿霉素(氰基吗啉基-DOX)和2-吡咯啉基阿霉素(2-PDOX)；参见PriebeW(编著),ACS symposium series 574,由American Chemical Society出版,Washington D.C.,1995(第332页)和Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:2464-2469,1996)、由格尔德霉素(geldanamycin)作为实例的苯奎类安莎霉素(benzoquinoid ansamycins)(DeBoer等,Journal ofAntibiotics 23:442-447,1970；Neckers等,Invest.New Drugs 17:361-373,1999)等。

在涉及治疗癌症的某些实施方案中，药物偶联物可与手术、放射疗法、化学疗法、利用裸抗体的免疫疗法、放射性免疫疗法、免疫调节剂、疫苗等组合使用。类似组合在适于靶向部分的其它疾病的治疗中是优选的，如自体免疫性疾病。例如，喜树碱偶联物可与TNF抑制剂、B细胞抗体、干扰素、白介素和其它有效治疗自体免疫性疾病的药剂组合，所述自体免疫性疾病如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、休格伦氏综合症、多发性硬化症、脉管炎以及I型糖尿病(青少年糖尿病)。这些组合疗法可允许在所述组合中给予较低剂量的各治疗剂，由此减少某些严重副作用，并且可能缩短所需的疗程。在病毒性疾病中，药物偶联物可与其它治疗性药物、免疫调节剂、裸抗体或疫苗(例如针对肝炎、HIV或乳头状瘤病毒的抗体，或者基于这些病毒的免疫原的疫苗)组合。针对这些和其它病毒性病原体的抗体和抗原基疫苗在本领域中是已知的，并且在一些情况下已在商业上使用。

附图简述

图1.IMP 453的合成。

图2.活化SN-38以供肽偶联。

图3.用于SN-38的树突载体。

图4.合成叠氮基-SN-38以供连接至树突。

发明详述

定义

除非另外规定，否则“一(a/an)”意指一个(种)或多个(种)。

如本文所用，“约”意指加或减10%。例如，“约100”将包括90与110之间的任何数值。

如本文所述，抗体是指全长(即，天然存在的或通过免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。

抗体片段是抗体的一部分，如F(ab')₂、Fab'、Fab、Fv、sFv等。与结构无关，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”也包括由抗体的可变区组成的分离片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段，和重链和轻链可变区由肽连接子连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。

嵌合抗体是一种重组蛋白，其含有来源于一个物种的抗体，优选啮齿动物抗体的可变结构域，包括互补决定区(CDR)，而抗体分子的恒定结构域是来源于人抗体的恒定结构域。对于兽医学应用，嵌合抗体的恒定结构域可来源于其它物种，如猫或狗的恒定结构域。

人源化抗体是一种重组蛋白，其中将来自一个物种的抗体，例如啮齿动物抗体的CDR从啮齿动物抗体的可变重链和可变轻链转移到人重链和轻链可变结构域(例如框架区序列)中。抗体分子的恒定结构域是来源于人抗体的恒定结构域。在某些实施方案中，可将有限数量的亲本(啮齿动物)抗体的框架区氨基酸残基取代成人抗体框架区序列。

人抗体是例如从已进行“工程改造”以回应于抗原激发而产生特定人抗体的转基因小鼠获得的抗体。在此技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入由胚胎干细胞系获得的小鼠品系中，所述品系含有内源性鼠类重链和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可合成对特定抗原具特异性的人抗体，并且所述小鼠可用于产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等,Nature Genet.7:13(1994)；Lonberg等,Nature 368:856(1994)；和Taylor等,Int.Immun.6:579(1994)描述。还可通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建完全人抗体，所述方法和技术在本领域中都是已知的。参见例如McCafferty等,Nature 348:552-553(1990)，其描述从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因谱系体外产生人抗体和其片段。在此技术中，将抗体可变结构域基因同框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体粒子的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质进行选择也导致选择编码呈现所述性质的抗体的基因。以此方式，噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种格式执行，关于综述，请参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion inStructural Biology 3:5564-571(1993)。人抗体也可由体外活化B细胞产生。参见美国专利No.5,567,610和5,229,275，其实施例部分以引用的方式并入本文。

治疗剂是与抗体部分分开、同时或依序施用或者与抗体部分偶联(即，抗体或抗体片段，或子片段)并且适用于治疗疾病的化合物、分子或原子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促细胞凋亡剂、抗血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料以及放射性同位素。所使用的治疗剂在下文更详细描述。

免疫偶联物是与至少一种治疗剂和/或诊断剂偶联的抗体、抗体片段或融合蛋白。

CPT是喜树碱的缩写，且如本申请中所用，CPT表示喜树碱本身或喜树碱的类似物或衍生物。喜树碱和其一些类似物的结构在下文示出，其中指定编号并且环标记为字母A-E。

在一优选实施方案中，化学治疗部分选自由以下组成的组：阿霉素(DOX)、表柔比星、吗啉基阿霉素(吗啉基-DOX)、氰基吗啉基-阿霉素(氰基吗啉基-DOX)、2-吡咯啉基-阿霉素(2-PDOX)、CPT、10-羟基喜树碱、SN-38、拓扑替康、勒托替康(lurtotecan)、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、紫杉烷、格尔德霉素、安莎霉素和埃坡霉素。在一更优选实施方案中，化学治疗性部分是SN-38。

可靶向构建体

在某些实施方案中，经过一种或多种诊断剂和/治疗剂标记的部分包括可包含肽或其它可靶向构建体。经过标记的肽(或蛋白质)可经过选择以直接结合靶细胞、组织、病原性生物体或其它标靶。在其它实施方案中，经过标记的肽可经过选择以例如使用具有针对可靶向构建体肽的一个或多个结合位点和针对与疾病或病状相关的靶抗原的一个或多个结合位点的双特异性抗体间接结合。双特异性抗体可用于例如预靶向技术中，其中所述抗体可首先施用于受试者。可给予足够时间让双特异性抗体结合靶抗原和使未结合抗体从循环清除。接着可向受试者施用可靶向构建体(如经过标记的肽)并让其结合双特异性抗体和定位于患病细胞或组织。

所述可靶向构建体可具有多种结构并且经过选择以便不仅可利用以高亲和力结合所述可靶向构建体的抗体或片段，而且还在用于预靶向方法和双特异性抗体或多特异性抗体中时在体内快速清除。疏水性药剂对于引发强免疫反应来说最佳，而亲水性药剂对于在体内快速清除是优选的。因此，建立疏水性特征与亲水性特征之间的平衡。此可部分通过使用亲水性螯合剂来抵消许多有机部分的固有疏水性来实现。同样，可选择具有相反溶液性质的可靶向构建体的亚基，例如所含有的一些氨基酸是疏水性并且一些氨基酸是亲水性的肽。除肽以外，也可使用碳水化合物。

可使用具有少至两个氨基酸残基，优选两个至十个残基的肽，并且还可与其它部分偶联，如螯合剂。连接子应为低分子量偶联物，优选具有低于50,000道尔顿，并且有利地低于20,000道尔顿、10,000道尔顿或5,000道尔顿的分子量。可靶向构建体肽更通常具有四个或更多个残基，如肽DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH₂(SEQ IDNO:81)，其中DOTA是1,4,7,10-四氮杂环十二烷1,4,7,10-四乙酸并且HSG是组胺琥珀酰基甘氨酰基。或者，DOTA可置换为NOTA(1,4,7-三氮杂-环壬烷-1,4,7-三乙酸)、TETA(对溴乙酰胺基-苯甲酰基-四乙胺四乙酸)、NETA([2-(4,7-双羧甲基[1,4,7]三氮杂环壬-1-基-乙基]-2-羰甲基-氨基]乙酸)、DTPA或其它已知螯合部分。

可靶向构建体还可在主链结构中包含非天然氨基酸(例如D-氨基酸)以增强肽在体内的稳定性。在替代实施方案中，可使用其它主链结构，如由非天然氨基酸或类肽构建的结构。

用作可靶向构建体的肽在自动肽合成仪上使用固相载体和重复正交保护基脱除和偶合的标准技术便利地合成。肽中欲稍后用于偶联螯合部分或其它药剂的游离氨基宜用标准保护基(如Boc基团)阻断，而N-端残基可进行乙酰化以增加血清稳定性。所述保护基为熟练技术人员所熟知。参见Greene和Wuts Protective Groups in OrganicSynthesis,1999(John Wiley and Sons,N.Y.)。当制备肽以供稍后用于双特异性抗体系统中时，宜将其从树脂裂解以产生相应C-端酰胺，以便抑制体内羧肽酶活性。肽合成的示例性方法公开于以下实施例中。

当使用双特异性抗体进行预靶向时，抗体将含有针对由靶组织产生或与靶组织有关的抗原的第一结合位点和针对可靶向构建体上的半抗原的第二结合位点。示例性半抗原包括但不限于HSG和In-DTPA。针对HSG半抗原产生的抗体是已知的(例如679抗体)并且可容易地并入适当双特异性抗体中(参见例如美国专利No.6,962,702；7,138,103和7,300,644，关于实施例部分以引用的方式并入本文)。然而，其它半抗原和与其结合的抗体在本领域中是已知的并且可使用，如In-DTPA和734抗体(例如美国专利No.7,534,431，实施例部分以引用的方式并入本文)。

在替代实施方案中，点击化学反应的特异性可用作双特异性抗体预靶向中所用的抗体-半抗原结合反应的替代。如下文所论述，例如叠氮化物部分的环辛炔部分或硝酮部分的炔部分的特异性反应性可用于体内环加成反应中。抗体或其它靶向分子通过并入经过取代的环辛炔、叠氮化物或硝酮部分来活化。可靶向构建体用一种或多种诊断剂或治疗剂和互补反应性部分标记。即，在靶向分子包含环辛炔的情况下，可靶向构建体将包含叠氮化物；在靶向分子包含硝酮的情况下，可靶向构建体将包含炔等。将经过活化的靶向分子施用至受试者并且允许定位于靶细胞、组织或病原体，如关于预靶向方案所公开。接着施用经过标记的反应性可靶向构建体。因为可靶向构建体上的环辛炔、硝酮或叠氮化物不与内源性生物分子反应并且不与靶向分子上的互补部分高度反应，所以结合反应的特异性导致可靶向构建体与组织定位靶向分子的高度特异性结合。

熟练技术人员将认识到，尽管大部分下文实施例中公开的可靶向构建体是肽，但也可使用其它类型的分子作为可靶向构建体。例如，如聚乙二醇(PEG)等聚合分子可用官能团容易地衍生化以结合诊断剂或治疗剂。在连接了适当反应性基团之后，如经过取代的环辛炔、硝酮或叠氮化物，可利用经过标记的聚合物来递送诊断剂或治疗剂。所述载体分子的许多实例在本领域中是已知的并且可资利用，包括但不限于聚合物、纳米粒子、微球体、脂质体和微胞。

抗体

靶抗原

所使用的靶向抗体可对多种细胞表面或疾病相关抗原具有特异性或选择性。成像或治疗各种疾病、病状、综合症或病症，如恶性疾病、心血管疾病、感染性疾病、炎症性疾病、自体免疫性疾病、代谢性(例如内分泌)疾病或神经(例如神经退化性)疾病(如阿兹海默氏病(Alzheimer's))所使用的示例性靶抗原可包括碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM6、c-met、B7、纤维连接蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、1L-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、肌腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、P1GF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、PLAGL2和致癌基因产物。

在某些实施方案中，如治疗肿瘤，所使用的抗体可靶向肿瘤相关抗原。这些抗原性标志可为肿瘤所产生的物质或者可为在肿瘤部位、在肿瘤细胞表面上或在肿瘤细胞内部积累的物质。所述肿瘤相关标志部分由以下公开：Herberman,"Immunodiagnosis of Cancer",Fleisher编著,"The Clinical Biochemistry of Cancer",第347页(美国临床化学家协会(American Association of Clinical Chemists),1979)和美国专利No.4,150,149；4,361,544；和4,444,744，所述各文献的实施例部分以引用的方式并入本文。关于肿瘤相关抗原(TAA)的报导包括Mizukami等,(2005,Nature Med.11:992-97)；Hatfield等,(2005,Curr.CancerDrug Targets 5:229-48)；Vallbohmer等(2005,J Clin.Oncol.23:3536-44)；和Ren等(2005,Ann.Surg.242:55-63)，关于所鉴别的TAA的各文献以引用的方式并入本文。

肿瘤相关标志已由Herberman,同上归类于多种类别中，包括癌胚抗原、胎盘抗原、致癌或肿瘤病毒相关抗原、组织相关抗原、器官相关抗原、异位激素和正常抗原或其变体。有时候，有利地使用肿瘤相关标志的亚基来产生具有较高肿瘤特异性的抗体，例如人绒毛膜促性腺激素(HCG)的β亚基或癌胚抗原(CEA)的γ区，其刺激与非肿瘤物质的交叉反应性显著降低的抗体产生，如美国专利No.4,361,644和4,444,744中所公开。

另一目标标志是跨膜活化因子和CAML-交互因子(TACI)。参见Yu等Nat.Immunol.1:252-256(2000)。简单地说，TACI是B细胞恶性疾病(例如淋巴瘤)的标志。TACI和B细胞成熟抗原(BCMA)由肿瘤坏死因子同源物增殖诱导配体(APRIL)结合。APRIL刺激初级B细胞和T细胞的体外增殖并且在体内因积累B细胞而使脾肿瘤增加。APRIL还与TALL-I(也称为BLyS或BAFF)竞争受体结合。可溶性BCMA和TACI特异性阻止APRIL的结合并且阻断初级B细胞的APRIL刺激的增殖。BCMA-Fc在小鼠体内还抑制针对钥孔螺血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)和肺炎疫苗(Pneumovax)的抗体的产生，表明通过BCMA和/或TACI进行的APRIL和/或TALL-I信号转导为产生体液免疫所需。因此，APRIL-TALL-I和BCMA-TACI形成参与刺激B细胞和T细胞功能的双配体-双受体路径。

在疾病包括淋巴瘤、白血病或自体免疫性疾病的情况下，靶抗原可选自由以下组成的组：CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUC1、Ia、Ii、HM1.24、HLA-DR、肌腱蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纤维连接蛋白、致癌基因、致癌基因产物(例如c-met或PLAGL2)、CD66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。

产生抗体的方法

MAb可通过多种已确立的技术从杂交瘤培养物分离和纯化。所述分离技术包括蛋白质A或蛋白质G琼脂糖亲和色谱、尺寸排阻色谱和离子交换色谱。参见例如Coligan的第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。另外参见Baines等,"Purification of Immunoglobulin G(IgG),"METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第10卷,第79-104页(TheHumana Press,Inc.1992)。初始产生了针对免疫原的抗体之后，可对抗体进行测序并随后通过重组技术进行制备。鼠类抗体和抗体片段的人源化和嵌合为本领域的技术人员所熟知，如下文所论述。

嵌合抗体

嵌合抗体是一种重组抗体，其中人抗体的可变区已置换为例如小鼠抗体的可变区，包括小鼠抗体的互补决定区(CDR)。嵌合抗体在施用至受试者时显示降低的免疫原性和增强的稳定性。克隆鼠类免疫球蛋白可变结构域的通用技术公开于例如Orlandi等,Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 6:3833(1989)中。构建嵌合抗体的技术为本领域的技术人员所熟知。举例来说，Leung等,Hybridoma 13:469(1994)通过将编码鼠类抗CD22抗体LL2的V_κ和V_H结构域与相应人κ和IgG₁恒定区结构域的DNA序列组合产生了LL2嵌合体。

人源化抗体

产生人源化MAb的技术在本领域中是熟知的(参见例如Jones等,Nature 321:522(1986)；Riechmann等,Nature 332:323(1988)；Verhoeyen等,Science 239:1534(1988)；Carter等,Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)；和Singer等,J.Immun.150:2844(1993))。嵌合或鼠类单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的可变重链和轻链的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变结构域中来进行人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也可置换为人FR序列。因为简单地将小鼠CDR转移到人FR中通常导致抗体亲和力降低或甚至丧失，所以可能需要进行额外修饰以恢复鼠类抗体的初始亲和力。此举可通过将FR区中的一个或多个人残基置换为其鼠类对应物以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等,Biotechnology 9:266(1991)和Verhoeyen等,Science 239:1534(1988)。用于取代的优选残基包括位于CDR残基侧链的1、2或3埃以内、位于CDR序列附近或预测与CDR残基相互作用的FR残基。

人抗体

使用组合方法或经过人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物产生完全人抗体的方法在本领域中是已知的(例如Mancini等,2004,NewMicrobiol 27:315-28；Conrad和Scheller,2005,Comb.Chem.HighThroughput Screen.8:117-26；Brekke和Loset,2003,Curr.Opin.Pharmacol.3:544-50)。还可通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建完全人抗体，所述方法和技术在本领域中都是已知的。参见例如McCafferty等,Nature 348:552-553(1990)。预期所述完全人抗体表现比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内起基本上内源性人抗体的作用。

在一个替代方案中，可使用噬菌体展示技术来产生人抗体(例如Dantas-Barbosa等,2005,Genet.Mol.Res.4:126-40)。人抗体可由正常人或由表现特定疾病病况(如癌症)的人产生(Dantas-Barbosa等,2005)。由患病个体构建人抗体的优势在于循环抗体谱系可能偏向针对疾病相关抗原的抗体。

在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)由骨肉瘤患者构建了人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说，从循环血液淋巴细胞获得总RNA(同上)。从μ、γ和κ链抗体谱系克隆重组Fab并插入噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转变成cDNA并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备Fab cDNA文库(Marks等,1991,J Mol.Biol.222:581-97)。文库构建是根据Andris-Widhopf等进行(2000:Phage Display Laboratory Manual,Barbas等(编著),第1版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY第9.1至9.22页)。最终Fab片段用限制性核酸内切酶消化并插入噬菌体基因组中以制备噬菌体展示文库。可如本领域中所已知，通过标准噬菌体展示方法对所述文库进行筛选。噬菌体展示可以多种格式执行，关于其综述，请参见例如Johnson和Chiswell,CurrentOpinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。

人抗体也可由体外活化B细胞产生。参见美国专利No.5,567,610和5,229,275，其以引用的方式整体并入本文。熟练技术人员将认识到，这些技术是作为示例并且可利用制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。

在另一替代方案中，可使用已进行遗传工程改造以产生人抗体的转基因动物来使用标准免疫方案产生针对基本上任何免疫原性标靶的抗体。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等,NatureGenet.7:13(1994)；Lonberg等,Nature 368:856(1994)；和Taylor等,Int.Immun.6:519(1994)公开。所述系统的非限制性实例为来自Abgenix(Fremont,CA)的

(例如Green等,1999,J.Immunol.Methods 231:11-23，以引用的方式并入本文)。在

和类似动物中，已使小鼠抗体基因失活并置换为功能性人抗体基因，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。

将

用含有部分人IgH和Igκ基因座，包括大部分可变区序列连同辅助基因和调控序列的生殖系构型YAC(酵母人工染色体)转化。可使用人可变区谱系来产生抗体产生B细胞，其可通过已知技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的

将通过正常免疫反应产生人抗体，其可通过上文所论述的标准技术进行收集和/或制造。可获得

的多种品系，其各自能够产生不同类别的抗体。已证明转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药物动力学性质(Green等,1999)。熟练技术人员将认识到，所主张的组合物和方法不限于使用

系统，而是可利用已进行遗传工程改造以产生人抗体的任何转基因动物。

已知抗体

熟练技术人员将认识到，所使用的靶向分子可包含本领域中已知的对与疾病病况或病状相关的靶抗原具有结合特异性的任何抗体或片段。所述已知抗体包括但不限于：hR1(抗IGF-1R，3/12/10提交的美国专利申请No.12/772,645)、hPAM4(抗胰腺癌粘蛋白，美国专利No.7,282,567)、hA20(抗CD20，美国专利No.7,251,164)、hA19(抗CD19，美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(抗AFP，美国专利No.7,300,655)、hLL1(抗CD74，美国专利No.7,312,318)、hLL2(抗CD22，美国专利No.7,074,403)、hMu-9(抗CSAp，美国专利No.7,387,773)、hL243(抗HLA-DR，美国专利No.7,612,180)、hMN-14(抗CEACAM5，美国专利No.6,676,924)、hMN-15(抗CEACAM6，美国专利No.7,662,378，7/29/10提交的美国专利申请No.12/846,062)、hRS7(抗EGP-1，美国专利No.7,238,785)和hMN-3(抗CEACAM6，美国专利申请No.7,541,440)、Ab124和Ab125(抗CXCR4，美国专利No.7,138,496)，各引用专利或申请的实施例部分以引用的方式并入本文。

候选抗HIV抗体包括Johansson等(AIDS.2006 Oct 3;20(15):1911-5)描述的抗包膜抗体，以及由Polymun(Vienna,Austria)描述和出售的抗HIV抗体，也描述于美国专利5,831,034、美国专利5,911,989和Vcelar等,AIDS 2007;21(16):2161-2170和Joos等,Antimicrob.AgentsChemother.2006;50(5):1773-9中，所有文献都以引用的方式并入本文。

在一个实施方案中，可使用本发明的药物组合物来治疗患有代谢性疾病(如淀粉样变性病)或神经退化性疾病(如阿兹海默氏病)的受试者。巴匹珠单抗(Bapineuzumab)正处于阿兹海默氏病疗法的临床试验中。其它提出用于治疗阿兹海默氏病的抗体包括Alz50(Ksiezak-Reding等,1987,J Biol Chem 263:7943-47)、甘替鲁单抗(gantenerumab)和索兰珠单抗(solanezumab)。已报导抗TNF-α抗体英利昔单抗(Infliximab)减少淀粉样斑块并且改良认知。已提出抗CD3抗体用于治疗1型糖尿病(Ceraea等,2010,Diabetes Metab Rev 26:602-05)。另外，可使用本发明的药物组合物来治疗患有免疫失调病症的受试者，如移植物抗宿主疾病或器官移植排斥反应。

在一优选实施方案中，可使用所主张的组合物和方法治疗的疾病包括心血管疾病，如纤维蛋白凝块、动脉粥样硬化、心肌缺血和梗塞。纤维蛋白抗体(例如scFv(59D8)；T2G1s；MH1)是已知的并且正作为显露所述凝块和肺栓塞的成像剂进行临床试验，而抗粒细胞抗体(如MN-3、MN-15、抗NCA95和抗CD15抗体)可靶向心肌梗塞和心肌缺血。(参见例如美国专利Nos.5,487,892；5,632,968；6,294,173；7,541,440，各专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。可使用抗巨噬细胞、抗低密度脂蛋白(LDL)和抗CD74(例如hLL1)抗体来靶向动脉粥样硬化斑。阿昔单抗(Abciximab)(抗糖蛋白IIb/IIIa)已批准在经皮冠状动脉介入干预和治疗不稳定型心绞痛中辅助用于预防再狭窄(Waldmann等,2000,Hematol 1:394-408)。已报导抗CD3抗体减少动脉粥样硬化的发生和发展(Steffens等,2006,Circulation 114:1977-84)。针对氧化型LDL的抗体在小鼠模型中诱导已建立的动脉粥样硬化的好转(Ginsberg,2007,J Am Coll Cardiol 52:2319-21)。已显示抗ICAM-1抗体在大鼠中减少脑动脉闭塞后的缺血性细胞损伤(Zhang等,1994,Neurology 44:1747-51)。针对白细胞抗原的市售单克隆由以下代表：OKT抗T细胞单克隆抗体(可获自Ortho Pharmaceutical Company)，其结合正常T淋巴细胞；由具有ATCC保藏编号HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体；G7E11、W8E7、NKP15和G022(Becton Dickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；和FMC11(Sera Labs)。针对纤维蛋白和血小板抗原的抗体的描述含于Knight,Semin.Nucl.Med.,20:52-67(1990)中。

当使用双特异性抗体时，第二MAb可选自本领域中已知的任何抗半抗原抗体，包括但不限于h679(美国专利No.7,429,381)和734(美国专利No.7,429,381；7,563,439；7,666,415；和7,534,431)，各专利的实施例部分以引用的方式并入本文。

所使用的各种其它抗体在本领域中是已知的(例如美国专利No.5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239和美国专利申请公布No.20060193865；各自以引用的方式并入本文。)所述已知抗体可用于检测和/或治疗多种疾病病况或病状(例如hMN-14或TF2(表达CEA的癌瘤)、hA20或TF-4(淋巴瘤)、hPAM4或TF-10(胰腺癌)、RS7(肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌)、hMN-15或hMN3(炎症)、抗gp120和/或抗gp41(HIV)、抗血小板和抗凝血酶(血液凝块)、抗肌球蛋白(心脏坏死)、抗CXCR4(癌症和炎症性疾病))。

所使用的抗体可从多种已知来源购得。例如，多种分泌抗体的杂交瘤细胞系可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection；ATCC,Manassas,VA)获得。大量针对各种疾病标靶(包括但不限于肿瘤相关抗原)的抗体已保藏于ATCC和/或已公布可变区序列并且可获得以用于所主张的方法和组合物中。参见例如美国专利No.7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,15；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572,856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040，6,451,310；6,444,206；6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953；5,525,338。这些仅为示例性的且多种其它抗体和其杂交瘤在本领域中是已知的。熟练技术人员将认识到，可通过简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO资料库中针对所选目标疾病相关标靶的抗体获得针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌杂交瘤。所克隆抗体的抗原结合结构域可使用本领域中熟知的标准技术进行扩增、切除、连接至表达载体中、转染至适应宿主细胞中和用于蛋白质产生。

抗体片段

可通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的抗原结合部分，如F(ab')₂、Fab'、F(ab)₂、Fab、Fv、sFv等。F(ab')₂片段可通过用胃蛋白酶消化抗体分子而产生，而Fab'片段可通过还原F(ab')₂片段的二硫键桥而产生。或者，可构建Fab'表达文库(Huse等,1989,Science,246:1274-1281)以允许快速且容易地鉴别具有期望特异性的单克隆Fab'片段。抗体片段可通过对全长抗体进行蛋白水解或通过在大肠杆菌或另一宿主中表达编码所述片段的DNA来制备。这些方法由例如Goldenberg,美国专利No.4,036,945和4,331,647以及其中所含的参考文献描述，所述专利以引用的方式整体并入本文。还参见Nisonoff等,Arch Biochem.Biophys.89:230(1960)；Porter,Biochem.J.73:119(1959)；Edelman等,METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷,第422页(Academic Press 1967)；和Coligan第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。

单链Fv分子(scFv)包含V_L结构域和V_H结构域。V_L和V_H结构域缔合形成标靶结合位点。这两个结构域由肽连接子(L)进一步共价连接。制备scFv分子和设计适合肽连接子的方法描述于以下文献中：美国专利No.4,704,692；美国专利No.4,946,778；R.Raag和M.Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB第9卷:73-80(1995)和R.E.Bird和B.W.Walker,"Single Chain Antibody Variable Regions,"TIBTECH,第9卷:132-137(1991)，所述文献以引用的方式并入本文。

具有大谱系的scFv文库可通过使用对应于所有已知V_H、V_κ和V₈₀基因家族的PCR引物从未免疫人供体分离V-基因进行构建。参见例如Vaughn等,Nat.Biotechnol.,14:309-314(1996)。扩增后，将V_κ和V_λ池组合形成一个池。将这些片段连接至噬菌粒中。接着将scFv连接子连接至噬菌粒中V_L片段的上游。扩增V_H和连接子-V_L片段并在J_H区上组装。所得V_H-连接子-_VL片段连接至噬菌粒载体中。可根据与所选抗原的结合对噬菌粒文库进行淘选。

其它抗体片段，例如单结构域抗体片段，在本领域中是已知的并且可用于所主张的构建体中。单结构域抗体(VHH)可通过标准免疫技术从例如骆驼、羊驼或美洲驼获得。(参见例如Muyldermans等,TIBS26:230-235,2001；Yau等,J Immunol Methods 281:161-75,2003；Maass等,J Immunol Methods 324:13-25,2007)。VHH可具有有效抗原结合能力并且可与常规VH-VL对不可接近的新颖表位相互作用。(Muyldermans等,2001)羊驼血清IgG含有约50%仅有重链的骆驼IgG抗体(Cab)(Maass等,2007)。羊驼可用已知抗原免疫并且可分离结合并中和靶抗原的VHH(Maass等,2007)。已鉴别出扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物并且可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库，所述文库可用于通过本领域中熟知的标准生物淘选技术分离抗体片段(Maass等,2007)。这些和其它已知抗原结合抗体片段可用于所主张的方法和组合物中。

用于抗体克隆和制造的一般技术

各种技术，如制造嵌合或人源化抗体，可能涉及抗体克隆和构建的程序。目标抗体的抗原结合V_κ(可变轻链)和V_H(可变重链)序列可通过多种分子克隆程序获得，如RT-PCR、5'-RACE和cDNA文库筛选。来自表达鼠类MAb的细胞的MAb的V基因可通过PCR扩增进行克隆并测序。为证实其可靠性，可使克隆的V_L和V_H基因在细胞培养物中表达为嵌合Ab，如Orlandi等所述(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:3833(1989))。基于V基因序列，接着可如Leung等(Mol Immunol,32:1413(1995))所述设计和构建人源化MAb。

可通过一般分子克隆技术从产生鼠类MAb的任何已知杂交瘤细胞系或转染细胞系制备cDNA(Sambrook等,Molecular Cloning,Alaboratory manual,第2版(1989))。MAb的V_κ序列可使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等,1989)或Leung等(BioTechniques,15:286(1993))所述的扩展引物组进行扩增。V_H序列可使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等,1989)或Leung等(Hybridoma,13:469(1994))所述的与鼠类IgG恒定区退火的引物进行扩增。可如Leung等(Mol.Immunol,32:1413(1995))所述通过组合长寡核苷酸模版合成和PCR扩增构建人源化V基因。

V_κ的PCR产物可亚克隆到支架载体中，如基于pBR327的支架载体VKpBR，其含有Ig启动子、信号肽序列和适宜的限制性位点。V_H的PCR产物可亚克隆到类似支架载体中，如基于pBluescript的VHpBS。含有V_κ和V_H序列连同启动子和信号肽序列的表达盒可从VKpBR和VHpBS切除并分别连接至适当表达载体中，如pKh和pG1g(Leung等,Hybridoma,13:469(1994))。所述表达载体可共转染至适当细胞中并监测上清液的嵌合、人源化或人MAb产生。或者，可切除V_κ和V_H表达盒并亚克隆至单一表达载体中，如pdHL2，如Gillies等所述(J Immunol.Methods 125:191(1989)，并且还在Losman等,Cancer,80:2660(1997)中示出)。

在一替代实施方案中，可将表达载体转染至已预先适应在无血清培养基中转染、生长和表达的宿主细胞中。

可使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见例如美国专利No.7,531,327；7,537,930和7,608,425；各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。这些示例性细胞系是基于以突变型Bcl-EEE基因转染、暴露于甲氨蝶呤以扩增所转染基因序列并且预先适应无血清细胞系以供蛋白质表达的Sp2/0骨髓瘤细胞系。

双特异性和多特异性抗体

在某些实施方案中，本文公开的用于治疗剂递送的技术和组合物可与作为靶向部分的双特异性或多特异性抗体一起使用。众多制造双特异性或多特异性抗体的方法是已知的，如例如美国专利No.7,405,320所公开，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。双特异性抗体可通过四重杂交瘤方法制造，所述方法包括使各自产生识别不同抗原位点的单克隆抗体的两种不同杂交瘤融合(Milstein和Cuello,Nature,1983;305:537-540)。

另一制造双特异性抗体的方法使用异双官能性交联剂以化学系栓两个不同单克隆抗体(Staerz等Nature.1985;314:628-631；Perez等Nature.1985;316:354-356)。双特异性抗体还可通过将两个亲本单克隆抗体各自还原成相应半分子，接着将其混合并使其再氧化以获得杂交结构来制造(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci U S A.1986;83:1453-1457)。另一替代方案涉及使用适当连接子使两种或三种经过单独纯化的Fab'片段化学交联。(参见例如欧洲专利申请0453082)。

其它方法包括通过以逆转录病毒来源的穿梭载体将不同可选择标志基因转移至各别亲本杂交瘤中，随后进行融合(DeMonte等ProcNatl Acad Sci U S A.1990,87:2941-2945)；或者用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系来提高产生杂种杂交瘤的效率。

可将同源V_H和V_L结构域与具有适当组成和长度(通常由多于12个氨基酸残基组成)的肽连接子接合以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。制造scFv的方法公开于美国专利No.4,946,778和美国专利No.5,132,405中，所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。将肽连接子长度缩减至少于12个氨基酸残基阻止同一链上的V_H与V_L结构域配对并且迫使V_H和V_L结构域与其它链上的互补结构域配对，导致形成功能性多聚体。与3至12个氨基酸残基的连接子接合的V_H和V_L结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双功能抗体)。使用0至2个氨基酸残基的连接子，有利于形成三聚体(称为三功能抗体)和四聚体(称为四功能抗体)，但除连接子长度外，寡聚化的确切模式似乎还取决于组成以及V-结构域取向(V_H-连接子-V_L或V_L-连接子-V_H)。

制造多特异性或双特异性抗体的这些技术呈现各种难处，在于技术的产率低、需要纯化、稳定性低或耗费大量劳力。最近，已利用一种称为“对接锁定”(dock and lock；DNL)的技术来制造几乎任何期望抗体、抗体片段或其它效应分子的组合(参见例如美国专利No.7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和USSN 11/925,408，所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。所述技术利用称为锚定结构域(AD)和二聚化与对接结构域(DDD)的互补蛋白质结合结构域，其彼此结合并且允许组装范围为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体的复杂分子。其以高产率形成稳定复合物而并不需要广泛纯化。DNL技术允许组装单特异性、双特异性或多特异性抗体。实施本发明所主张的方法时可利用本领域中已知用于制造双特异性或多特异性抗体的任何技术。

在各种实施方案中，如本文所公开的偶联物可为复合多特异性抗体的部分。所述抗体可含有两个或多个具有不同特异性的不同抗原结合位点。多特异性复合物可结合相同抗原的不同表位，或者可结合两个不同抗原。

对接锁定(DNL)

在优选实施方案中，双特异性或多特异性抗体或其它构建体可使用对接锁定技术制造(参见例如美国专利No.7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400，各专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。DNL方法利用cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的调控(R)亚基与A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间发生的特异性蛋白质/蛋白质相互作用(Baillie等,FEBS Letters.2005;579:3264。Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004;5:959)。在研究最多的通过第二信使cAMP结合于R亚基触发的信号转导路径之一中起中枢作用的PKA于1968年首先从兔骨骼肌分离出(Walsh等,J.Biol.Chem.1968;243:3763)。全酶的结构由两个通过R亚基保持为非活性形式的催化亚基组成(Taylor,J.Biol.Chem.1989;264:8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和RII)，并且各类型具有α和β亚型(Scott,Pharmacol.Ther.1991;50:123)。R亚基仅分离为稳定二聚体并且显示二聚化结构域由前44个氨基端残基组成(Newlon等,Nat.Struct.Biol.1999;6:222)。cAMP与R亚基结合导致释放广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基，其通过使PKA与AKAP对接而使PKA区室化来限定于所选底物(Scott等,J.Biol.Chem.1990;265;21561)。

自从第一种AKAP微管相关蛋白-2于1984年表征以来(Lohmann等,Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984;81:6723)，又在从酵母到人范围内的物种中鉴别出具有多种结构的超过50种AKAP，其定位于各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网(Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004;5:959)。AKAP中用于PKA的AD是具有14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等,J.Biol.Chem.1991;266:14188)。AD的氨基酸序列在个别AKAP之间十分不同，其中针对RII二聚体所报导的结合亲和力在2至90nM范围内(Alto等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003;100:4445)。AKAP仅结合二聚R亚基。对于人RIIα，AD结合由23个氨基端残基形成的疏水性表面(Colledge和Scott,Trends Cell Biol.1999;6:216)。因此，人RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域都定位在N端同一44氨基酸的序列内(Newlon等,Nat.Struct.Biol.1999;6:222；Newlon等,EMBO J.2001;20:1651)，其在本文被称为DDD。

我们已发展出一种平台技术，其利用人RIIα的DDD和AKAP的AD作为一对优良的连接子模块用于将任何两个实体(在下文称为A与B)对接成非共价复合物，所述复合物可通过在DDD与AD的至关重要的位置中引入半胱氨酸残基以促进形成二硫键而进一步锁定为稳定系栓结构。“对接锁定”法的一般方法如下。实体A通过将DDD序列连接至A的前驱体进行构建，产生下文称为a的第一组分。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将由a₂构成。实体B通过将AD序列连接至B的前驱体进行构建，产生下文称为b的第二组分。a₂中所含的DDD的二聚基元将产生用于结合b中所含的AD序列的对接位点，由此促进a₂与b容易地缔合形成由a₂b构成的二元三聚复合物。利用通过二硫桥共价固定两个实体的后续反应使此结合事件不可逆转，基于有效局部浓度的原理，此反应极其有效地发生，因为初始结合相互作用应使安置于DDD与AD两者上的反应性硫醇基接近(Chmura等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001;98:8480)从而位点特异性连接。使用连接子、接头模块和前驱体的各种组合，可产生和使用不同化学计量的多种DNL构建体，包括但不限于二聚、三聚、四聚、五聚和六聚DNL构建体(参见例如U.S.No.7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400。)

通过远离两个前驱体的官能团连接DDD和AD，预期所述位点特异性连接还将保留两个前驱体的原始活性。此方法在性质上是模块化的并且可潜在应用于位点特异性共价连接多种物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有多种活性的其它效应部分。利用构建以下实施例中所述的偶联AD和DDD的效应物的融合蛋白法，可将几乎任何蛋白质或肽并入DNL构建体中。然而，所述技术并不具限制性并且可利用其它偶联方法。

已知用于制备融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将所述双链核酸插入用于制造融合蛋白的表达载体中(参见例如Sambrook等,Molecular Cloning,A laboratory manual,第2版,1989)。在所述优选实施方案中，AD和/或DDD部分可连接于效应蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练技术人员将认识到，AD或DDD部分连接于效应部分的位点可根据效应部分的化学性质和效应部分中参与其生理活性的部分而改变。多种效应部分的位点特异性连接可使用本领域中已知的技术执行，如使用二价交联试剂和/或其它化学偶联技术。

在其它替代实施方案中，可使用点击化学反应来产生与效应部分偶联的AD或DDD肽，或者甚至使AD和DDD部分彼此共价连接从而提供不可逆共价键，以使DNL复合物稳定。

预靶向

双特异性或多特异性抗体可用于预靶向技术中。预靶向是一种多步骤方法，其最初发展用来解决直接靶向抗体的血液清除缓慢的问题，血液清除缓慢会造成对正常组织(如骨髓)的不当毒性。利用预靶向时，将放射性核素或其它治疗剂连接于在数分钟内从血液清除的小递送分子(可靶向构建体)。首先施用具有针对可靶向构建体以及靶抗原的结合位点的预靶向双特异性或多特异性抗体，让游离抗体从循环中清除并接着施用可靶向构建体。

预靶向方法公开于以下文献中，例如Goodwin等,美国专利No.4,863,713；Goodwin等,J.Nucl.Med.29:226,1988；Hnatowich等,J.Nucl.Med.28:1294,1987；Oehr等,J.Nucl.Med.29:728,1988；Klibanov等,J.Nucl.Med.29:1951,1988；Sinitsyn等,J.Nucl.Med.30:66,1989；Kalofonos等,J.Nucl.Med.31:1791,1990；Schechter等,Int.J.Cancer 48:167,1991；Paganelli等,Cancer Res.51:5960,1991；Paganelli等,Nucl.Med.Commun.12:211,1991；美国专利No.5,256,395；Stickney等,Cancer Res.51:6650,1991；Yuan等,Cancer Res.51:3119,1991；美国专利No.6,077,499；7,011,812；7,300,644；7,074,405；6,962,702；7,387,772；7,052,872；7,138,103；6,090,381；6,472,511；6,962,702；和6,962,702，各文献以引用的方式并入本文。

治疗或诊断受试者的疾病或病症的预靶向方法可通过以下提供：(1)向受试者施用双特异性抗体或抗体片段；(2)任选地向受试者施用清除组合物，并让所述组合物从循环中清除所述抗体；和(3)向受试者施用含有一种或多种螯合或化学结合的治疗剂或诊断剂的可靶向构建体。

免疫偶联物

在优选实施方案中，可将治疗剂或诊断剂共价连接至抗体或抗体片段以形成免疫偶联物。可将载体部分连接至例如经过还原的SH基团和/或碳水化合物侧链上。载体部分可通过形成二硫键连接于经过还原的抗体组分的铰链区。或者，所述药剂可使用异双官能交联剂(如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP))连接。Yu等,Int.J.Cancer 56:244(1994)。所述偶联的一般技术在本领域中是熟知的。参见例如Wong,CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION ANDCROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis等,"Modification ofAntibodies by Chemical Methods,"MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Birch等(编著),第187-230页(Wiley-Liss,Inc.1995)；Price,"Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies,"MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICALAPPLICATION,Ritter等(编著),第60-84页(Cambridge UniversityPress 1995)。或者，可通过抗体Fc区中的碳水化合物部分偶联载体部分。

通过抗体碳水化合物部分偶联官能团与抗体的方法为本领域的技术人员所熟知。参见例如Shih等,Int.J.Cancer 41:832(1988)；Shih等,Int.J.Cancer 46:1101(1990)；和Shih等,美国专利No.5,057,313，所述文献的实施例部分以引用的方式并入本文。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能团的载体聚合物反应。此反应产生初始希夫碱(Schiff base)(亚胺)键联，其可通过还原成仲胺而稳定以形成最终偶联物。

在免疫偶联物的抗体组分是抗体片段的情况下可能不存在Fc区。然而，有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见例如Leung等,J.Immunol.154:5919(1995)；美国专利No.5,443,953和6,254,868，所述文献的实施例部分以引用的方式并入本文。使用经过工程改造的碳水化合物部分来连接治疗剂或诊断剂。

连接载体部分与靶向分子的替代方法涉及使用点击化学反应。点击化学法最初构想成通过以模块化方式将小亚基接合在一起快速产生复杂物质的方法。(参见例如Kolb等,2004,Angew Chem Int Ed40:3004-31；Evans,2007,Aust J Chem 60:384-95。)各种形式的点击化学反应在本领域中是已知的，如胡伊斯根(Huisgen)1,3-偶极环加成铜催化反应(Tornoe等,2002,J Organic Chem 67:3057-64)，其通常称为“点击反应”。其它替代方案包括环加成反应，如狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)、亲核取代反应(尤其与如环氧和环乙亚胺化合物等小应变环反应)、脲化合物的羰基化学形成和涉及碳碳双键的反应，如硫醇-炔反应中的炔。

叠氮化物炔胡伊斯根环加成反应使用还原剂存在下的铜催化剂以催化连接于第一分子的末端炔基的反应。在包含叠氮化物部分的第二分子存在下，叠氮化物与活化炔反应形成1,4-取代的1,2,3-三唑。铜催化的反应在室温下进行并且具有足够特异性，从而通常不需要对反应产物进行纯化。(Rostovstev等,2002,Angew Chem Int Ed 41:2596；Tornoe等,2002,J Org Chem 67:3057。)叠氮和炔官能团对水性介质中的生物分子基本上呈惰性，从而允许反应在复杂溶液中进行。形成的三唑在化学上为稳定的并且不经历酶促裂解，使得点击化学产物在生物系统中高度稳定。尽管铜催化剂对活细胞有毒，但可在体外使用基于铜的点击化学反应形成免疫偶联物。

已提出无铜点击反应用于生物分子的共价修饰。(参见例如Agard等,2004,J Am Chem Soc 126:15046-47。)无铜反应使用环应变替代铜催化剂来促进[3+2]叠氮化物-炔环加成反应(同上)。例如，环辛炔是包含内部炔键的8碳环结构。闭合环结构诱发乙炔的实质性键角变形，其极易与叠氮基反应形成三唑。因此，环辛炔衍生物可用于无铜点击反应(同上)。

另一类型的无铜点击反应由Ning等报导(2010,Angew Chem IntEd 49:3065-68)，其涉及应变促进的炔-硝酮环加成。为解决原始环辛炔反应速率缓慢的问题，与三键相邻连接吸电子基团(同上)。所述经过取代的环辛炔的实例包括二氟化环辛炔、4-二苯并环辛炔醇和氮杂环辛炔(同上)。一替代无铜反应涉及应变促进的炔-硝酮环加成来得到N-烷基化异噁唑啉(同上)。所述反应据报导具有特别快的反应动力学并且用于一锅式三步方案中以供对肽和蛋白质进行位点特异性修饰(同上)。硝酮是通过使适当醛与N-甲基羟胺缩合来制备并且环加成反应在乙腈与水的混合物中进行(同上)。可使用这些和其它已知点击化学反应来在体外将载体部分连接至抗体。

Agard等(2004,J Am Chem Soc 126:15046-47)证明在过氧乙酰化N-叠氮乙酰基甘露糖胺存在下在CHO细胞中表达的重组糖蛋白导致在糖蛋白的碳水化合物中生物并入相应N-叠氮乙酰基唾液酸。叠氮基衍生化糖蛋白与生物素化环辛炔特异性反应形成生物素化糖蛋白，而无叠氮基部分的对照糖蛋白保持未标记(同上)。Laughlin等(2008,Science 320:664-667)使用类似技术对与过氧乙酰化N-叠氮乙酰基半乳糖胺一起孵育的斑马鱼胚胎中的细胞表面聚糖进行代谢标记。叠氮基衍生化聚糖与二氟化环辛炔(DIFO)试剂反应，从而允许在体内观测聚糖。

狄尔斯-阿尔德反应已用于分子的体内标记。Rossin等(2010,Angew Chem Int Ed 49:3375-78)报导带有反式环辛烯(TCO)反应性部分的肿瘤定位抗TAG72(CC49)抗体与¹¹¹In标记四嗪DOTA衍生物之间在体内52%的产率。向带有直肠癌异种移植物的小鼠施用TCO标记的CC49抗体，接着1天后注射经过¹¹¹In标记的四嗪探针(同上)。放射性标记探针与肿瘤定位抗体的反应产生放射性在肿瘤中的显著定位，如通过注射放射性标记探针三小时后对活小鼠的SPECT成像所证实，其中肿瘤:肌肉比为13:1(同上)。结果证实TCO与四嗪标记分子的体内化学反应。

使用标记部分的生物并入的抗体标记技术进一步公开于美国专利No.6,953,675中(所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。所述“修饰(landscaped)”抗体制备成在糖基化位点上具有反应性酮基。所述方法包括在包含糖或糖前驱体的酮衍生物的培养基中表达用编码在CH1或Vκ结构域中具有一个或多个N-糖基化位点的抗体的表达载体转染的细胞。酮衍生化糖或前驱体包括N-乙酰丙酸基甘露糖胺和N-乙酰丙酸基海藻糖。随后使经过修饰的抗体与包含酮反应性部分(如酰肼基、肼基、羟胺基或氨基硫脲基)的试剂反应形成经过标记的靶向分子。连接于经过修饰的抗体的示例性试剂包括螯合剂(如DTPA)、大药物分子(如阿霉素-葡聚糖)和含有酰基-酰肼的肽。修饰技术不限于产生包含酮部分的抗体，而且可替代地用于在抗体或其它生物分子上引入点击化学反应性基团，如硝酮、叠氮化物或环辛炔。

点击化学反应的修改形式适合于在体外或体内使用。反应靶向分子可通过化学偶联或通过生物并入形成。靶向分子(如抗体或抗体片段)可用叠氮基部分、经过取代的环辛炔或炔基或者硝酮部分活化。如果靶向分子包含叠氮基或硝酮基，那么相应可靶向构建体将包含经过取代的环辛炔或炔基，并且反之亦然。所述活化分子可通过在活细胞中进行代谢性并入来产生，如上文所论述。或者，将所述部分化学与生物分子偶联的方法在本领域中是熟知的，并且可利用任何所述已知方法。

治疗剂和诊断剂

在某些实施方案中，本文公开的靶向分子或可靶向构建体可连接于一种或多种治疗剂和/或诊断剂。治疗剂优选选自由以下组成的组：放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、药物、前药、酶、寡核苷酸、促细胞凋亡剂、干扰RNA、光敏治疗剂、细胞毒性剂(其可为化学治疗剂或毒素)和其组合。所使用的药物可具有选自由以下组成的组的药学性质：抗有丝分裂、抗激酶、烷基化、抗代谢物、抗生素、生物碱、抗血管生成、促细胞凋亡剂和其组合。

所使用的示例性药物包括但不限于5-氟尿嘧啶、阿普利啶(aplidin)、阿扎利平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、蒽环霉素、苯达莫司汀(bendamustine)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、苔藓虫素-1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、卡奇霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀(carmustine)、西乐葆(Celebrex)、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨(cladribine)、喜树碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、多西紫杉醇(docetaxel)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素、2-吡咯啉基阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉基阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表柔比星、雌氮芥、表鬼臼毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP 16)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺(lenolidamide)、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、诺维本(navelbine)、亚硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、PSI-341、雷洛昔芬(raloxifene)、司莫司汀(semustine)、链佐星(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉酚(taxol)、替莫唑胺(temazolomide)(DTIC的水性形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨(vinorelbine)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)和长春花生物碱(vinca alkaloids)。

所使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)(例如抗肿瘤核糖核酸酶(onconase))、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。

所使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、群落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素和其组合。特别适用者为淋巴毒素，如肿瘤坏死因子(TNF)；造血因子，如白介素(IL)；群落刺激因子，如粒细胞群落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ；和干细胞生长因子，如称为“S1因子”者。细胞因子包括生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；副甲状腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；前列腺素；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；群落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit-配体或FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT。

所使用的趋化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。

适用于治疗患病组织的放射性同位素包括但不限于¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹¹At、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³³P、⁴⁷Sc、¹¹¹Ag、⁶⁷Ga、¹⁴²Pr、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁸⁹Re、²¹²Pb、²²³Ra、²²⁵Ac、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁹Mo、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹⁴³Pr、¹⁴⁹Pm、¹⁶⁹Er、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au和²¹¹Pb。治疗性放射性核素优选具有20至6,000keV范围内的衰变能，优选对于俄歇发射体在60至200keV范围内，对于β发射体在100-2,500keV范围内，并且对于α发射体在4,000-6,000keV范围内。适用β粒子发射核素的最大衰变能优选为20-5,000keV，更优选为100-4,000keV，并且最优选为500-2,500keV。随俄歇发射粒子实质上衰变的放射性核素也是优选的。例如Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。适用β粒子发射核素的衰变能优选为<1,000keV，更优选为<100keV，并且最优选为<70keV。随着α粒子产生而实质上衰变的放射性核素也是优选的。所述放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。适用α粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选为3,000-8,000keV，并且最优选为4,000-7,000keV。其它潜在适用放射性同位素包括¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁷⁵Br、¹⁹⁸Au、²²⁴Ac、¹²⁶I、¹³³I、⁷⁷Br、^113mIn、⁹⁵Ru、⁹⁷Ru、¹⁰³Ru、¹⁰⁵Ru、¹⁰⁷Hg、²⁰³Hg、^121mTe、^122mTe、^125mTe、¹⁶⁵Tm、¹⁶⁷Tm、¹⁶⁸Tm、¹⁹⁷Pt、¹⁰⁹Pd、¹⁰⁵Rh、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁹⁹Au、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵¹Cr、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、²⁰¹Tl、²²⁵Ac、⁷⁶Br、¹⁶⁹Yb等。

治疗剂可包括光敏剂或染料。荧光组合物(如荧光染料)和其它色原体或对可见光敏感的染料(卟啉)已用于通过将适合光引导至病变来检测和治疗病变。在疗法中，此称为光辐射、光线疗法或光动力疗法。参见Jori等(编著),PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORSAND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh,Chem.Britain(1986),22:430。此外，已将单克隆抗体与光活化染料偶合以供达成光线疗法。参见Mew等,J.Immunol.(1983),130:1473；同上,Cancer Res.(1985),45:4380；Oseroff等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:8744；同上,Photochem.Photobiol.(1987),46:83；Hasan等,Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288:471；Tatsuta等,Lasers Surg.Med.(1989),9:422；Pelegrin等,Cancer(1991),67:2529。

皮质类固醇激素可增加其它化学治疗剂的有效性，并且因此其常用于组合治疗中。泼尼松(Prednisone)和地塞米松(dexamethasone)是皮质类固醇激素的实例。.

在某些实施方案中，可使用抗血管生成剂，如血管抑素、baculostatin、血管生成抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白、抗胎盘生长因子(PlGF)肽和抗体、抗血管生长因子抗体(如抗VEGF和抗PlGF)、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗Kras抗体、抗cMET抗体、抗MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤维连接蛋白肽、纤溶酶原活化因子抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、多育曲菌素(proliferin)相关蛋白、羧酰胺三唑、CM101、马力马司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸盐、血管位蛋白-2、干扰素-α、除莠霉素A(herbimycinA)、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺(Linomide)、沙利度胺、己酮可可碱(pentoxifylline)、染料木素(genistein)、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、尖吻蝮毒肽(accutin)、血管抑素、西多福韦(cidofovir)、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或二甲胺四环素(minocycline)。

治疗剂可包含任何寡核苷酸，如siRNA。熟练技术人员将认识到，任何siRNA或干扰RNA物质都可连接至可靶向构建体以供递送到靶组织。针对多种标靶的许多siRNA物质在本领域中是已知的，并且在所主张的方法和组合物中可利用任何所述已知siRNA。

有可能使用的已知siRNA物质包括对以下具有特异性者：IKK-γ(美国专利7,022,828)；VEGF、Flt-1和Flk-1/KDR(美国专利7,148,342)；Bcl2和EGFR(美国专利7,541,453)；CDC20(美国专利7,550,572)；转导蛋白(β)样蛋白3(美国专利7,576,196)；KRAS(美国专利7,576,197)；碳酸酐酶II(美国专利7,579,457)；补体组分3(美国专利7,582,746)；白介素-1受体相关激酶4(IRAK4)(美国专利7,592,443)；存活素(美国专利7,608,7070)；超氧化物歧化酶1(美国专利7,632,938)；MET原癌基因(美国专利7,632,939)；淀粉样蛋白β前驱体蛋白(APP)(美国专利7,635,771)；IGF-1R(美国专利7,638,621)；ICAM1(美国专利7,642,349)；补体因子B(美国专利7,696,344)；p53(7,781,575)和载脂蛋白B(7,795,421)，各参考专利的实施例部分以引用的方式并入本文。

其它siRNA物质可从已知商业来源获得，如Sigma-Aldrich(StLouis,MO)、Invitrogen(Carlsbad,CA)、Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz,CA)、Ambion(Austin,TX)、Dharmacon(Thermo Scientific,Lafayette,CO)、Promega(Madison,WI)、Mirus Bio(Madison,WI)和Qiagen(Valencia,CA)以及许多其它来源。siRNA物质的其它可公开获得的来源包括位于斯德哥尔摩生物信息学中心(StockholmBioinformatics Centre)的siRNAdb数据库、MIT/ICBP siRNA数据库、位于博得研究院(Broad Institute)的RNAi联合shRNA文库(RNAiConsortium shRNA Library)和位于NCBI的探针数据库(Probe database)。例如，在NCBI探针数据库中存在30,852种siRNA物质。熟练技术人员将认识到，对于任何目标基因，或者siRNA物质已进行了设计，或者其可容易地使用可公开获得的软件工具进行设计。任何所述siRNA物质都可使用主题DNL复合物进行递送。

本领域中已知的示例性siRNA物质列于表1中。尽管siRNA是作为双链分子递送，但为简单起见，表1中仅示出有义链序列。

表1.示例性siRNA序列

标靶	序列	SEQ ID NO
			VEGF R2	AATGCGGCGGTGGTGACAGTA	SEQ ID NO:1
VEGF R2	AAGCTCAGCACACAGAAAGAC	SEQ ID NO:2
			CXCR4	UAAAAUCUUCCUGCCCACCdTdT	SEQ ID NO:3
CXCR4	GGAAGCUGUUGGCUGAAAAdTdT	SEQ ID NO:4
			PPARC1	AAGACCAGCCUCUUUGCCCAG	SEQ ID NO:5
发动蛋白2	GGACCAGGCAGAAAACGAG	SEQ ID NO:6
			连环蛋白	CUAUCAGGAUGACGCGG	SEQ ID NO:7
E1A结合蛋白	UGACACAGGCAGGCUUGACUU	SEQ ID NO:8
			纤溶酶原活化因子	GGTGAAGAAGGGCGTCCAA	SEQ ID NO:9
K-ras	GATCCGTTGGAGCTGTTGGCGTAGTT	SEQ ID NO:10
			分拣蛋白1	AGGTGGTGTTAACAGCAGAG	SEQ ID NO:11
载脂蛋白E	AAGGTGGAGCAAGCGGTGGAG	SEQ ID NO:12
			载脂蛋白E	AAGGAGTTGAAGGCCGACAAA	SEQ ID NO:13
Bcl-X	UAUGGAGCUGCAGAGGAUGdTdT	SEQ ID NO:14
			Raf-1	TTTGAATATCTGTGCTGAGAACACAGTTC	SEQ ID NO:15
热休克转录因子2	AATGAGAAAAGCAAAAGGTGCCCTGTCTC	SEQ ID NO:16
			IGFBP3	AAUCAUCAUCAAGAAAGGGCA	SEQ ID NO:17
硫氧还蛋白	AUGACUGUCAGGAUGUUGCdTdT	SEQ ID NO:18
			CD44	GAACGAAUCCUGAAGACAUCU	SEQ ID NO:19
MMP14	AAGCCTGGCTACAGCAATATGCCTGTCTC	SEQ ID NO:20
			MAPKAPK2	UGACCAUCACCGAGUUUAUdTdT	SEQ ID NO:21
FGFR1	AAGTCGGACGCAACAGAGAAA	SEQ ID NO:22
			ERBB2	CUACCUUUCUACGGACGUGdTdT	SEQ ID NO:23
BCL2L1	CTGCCTAAGGCGGATTTGAAT	SEQ ID NO:24
			ABL1	TTAUUCCUUCUUCGGGAAGUC	SEQ ID NO:25
CEACAM1	AACCTTCTGGAACCCGCCCAC	SEQ ID NO:26
			CD9	GAGCATCTTCGAGCAAGAA	SEQ ID NO:27
CD151	CATGTGGCACCGTTTGCCT	SEQ ID NO:28

卡斯蛋白酶8	AACTACCAGAAAGGTATACCT	SEQ ID NO:29
			BRCA1	UCACAGUGUCCUUUAUGUAdTdT	SEQ ID NO:30
p53	GCAUGAACCGGAGGCCCAUTT	SEQ ID NO:31
			CEACAM6	CCGGACAGTTCCATGTATA	SEQ ID NO:32

熟练技术人员将认识到，表1呈示本领域中已知的siRNA物质总数中的极少量样本，并且任何所述已知siRNA都可用于所主张的方法和组合物中。

诊断剂优选自由以下组成的组：放射性核素、放射性造影剂、顺磁性离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。所述诊断剂是熟知的并且可使用任何所述已知诊断剂。诊断剂的非限制性实例可包括放射性核素，如¹⁸F、⁵²Fe、¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、^94mTc、⁹⁴Tc、^99mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、^52mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、^82mRb、⁸³Sr或其它γ、β或正电子发射体。

所使用的顺磁性离子可包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可包括镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。

超声造影剂可包含脂质体，如气体填充脂质体。不透辐射诊断剂可选自化合物、钡化合物、镓化合物和铊化合物。多种荧光标记在本领域中是已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate)、若丹明(rhodamine)、藻红蛋白(phycoerytherin)、藻蓝蛋白(phycocyanin)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin)、邻苯二甲醛(o-phthaldehyde)和荧光胺(fluorescamine)。所使用的化学发光标记可包括鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)、芳香族吖锭酯、咪唑、吖锭盐或草酸酯。

治疗性治疗

在另一方面，本发明涉及治疗受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的治疗性偶联物。可用本文所述的治疗性偶联物治疗的疾病包括但不限于B细胞恶性疾病(例如非霍奇金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病，使用例如LL2抗体；参见美国专利No.6,183,744)、内胚层起源的消化系统上皮的腺癌、癌症(如乳癌和非小细胞肺癌)和其它癌瘤、肉瘤、神经胶质肿瘤、骨髓性白血病等。具体地说，宜使用针对由恶性实体肿瘤或造血赘生物产生或与其相关的抗原(例如癌胚抗原)的抗体，所述肿瘤或赘生物例如为胃肠、肺、乳房、前列腺、卵巢、睾丸、脑或淋巴肿瘤、肉瘤或黑素瘤。所述治疗剂可根据疾病病况和偶联物的耐受性给予一次或重复给予，并且最佳还可与其它治疗模态组合使用，所述其它治疗模态如手术、外部辐射、放射性免疫疗法、免疫疗法、化学疗法、反义疗法、干扰RNA疗法、基因疗法等。各组合将适于肿瘤类型、病期、患者病状和先前疗法，和由管理医师考虑的其它因素。

如本文所用，术语“受试者”是指任何动物(即，脊椎动物和无脊椎动物)，包括但不限于哺乳动物，包括人。并不希望所述术语限于特定年龄或性别。因此，成年和新生受试者以及胎儿，无论为雄性(男性)还是雌性(女性)，都由所述术语涵盖。

在一优选实施方案中，可使用包含Mu-9抗体的治疗性偶联物来治疗结肠直肠癌以及胰腺癌和卵巢癌，如美国专利No.6,962,702和7,387,772中所公开，所述各专利的实施例部分以引用的方式并入本文。另外，可使用包含PAM4抗体的治疗性偶联物来治疗胰腺癌，如美国专利No.7,238,786和7,282,567中所公开，所述各专利的实施例部分以引用的方式并入本文。

在另一优选实施方案中，可使用包含RS7抗体(结合上皮糖蛋白-1[EGP-1]抗原)的治疗性偶联物来治疗癌瘤，如肺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、卵巢癌、子宫癌和前列腺癌，如美国专利No.7,238,785中所公开，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。

在另一优选实施方案中，可使用包含抗AFP抗体的治疗性偶联物来使用人源化、嵌合和人抗体形式治疗肝细胞癌、胚细胞瘤和其它产生AFP的肿瘤，如美国专利No.7,300,655中所公开，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。

在另一优选实施方案中，可使用包含抗肌腱蛋白抗体的治疗性偶联物来治疗造血肿瘤和实体肿瘤，并且可使用包含肌腱蛋白抗体的偶联物治疗实体肿瘤，优选为脑癌，如成胶质细胞瘤。

在一优选实施方案中，用于治疗人疾病的抗体是抗体的人或人源化(CDR移植)型式；不过也可使用抗体的鼠类和嵌合型式。与递送剂相同物种的IgG分子对于使免疫反应降至最低是最优选的。此情形在考虑重复治疗时特别重要。对于人，人或人源化IgG抗体由患者产生抗IgG免疫反应的可能性较低。如hLL1和hLL2等抗体在结合靶细胞上的内化抗原后快速内化，此意指所携带的化学治疗性药物也快速内化至细胞中。然而，具有较慢内化速率的抗体也可用于实施选择性疗法。

在另一实施方案中，可使用针对病原体的治疗性偶联物，因为针对病原体的抗体是已知的。例如，以下文献中已特别公开特异性结合由感染性病变(包括病毒性、细菌性、真菌性和寄生虫性感染，例如，由如细菌、立克次氏体、支原体、原生动物、真菌和病毒引起)产生或与其相关的标志以及与所述微生物相关的抗原和产物的抗体和抗体片段：Hansen等,美国专利No.3,927,193和Goldenberg美国专利No.4,331,647、4,348,376、4,361,544、4,468,457、4,444,744、4,818,709和4,624,846，所述各文献的实施例部分以引用的方式并入本文，以及上文引用的Reichert和Dewitz。在一优选实施方案中，病原体选自由以下组成的组：HIV病毒、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophila)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、流感嗜血杆菌B(Hemophilus influenzae B)、梅毒密螺旋体(Treponemapallidum)、莱姆病螺旋菌(Lyme disease spirochetes)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布氏杆菌(Brucella abortus)、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I、单纯疱疹病毒II、人血清细小病毒样病毒、呼吸道合胞体病毒、水痘-带状疱疹病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus)、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱型口炎病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、淋巴细胞性脉络从脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病病毒、仙台病毒(Sendai virus)、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、猿病毒40、小鼠乳腺肿瘤病毒、登革热病毒、风疹病毒、西尼罗河病毒(West Nile virus)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、港丽锥虫(Trypanosoma rangeli)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫(Schistosomajaponicum)、牛巴贝虫(Babesia bovis)、柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、热带利什曼虫(Leishmania tropica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、小泰雷尔梨浆虫(Theileria parva)、水疱绦虫(Taenia hydatigena)、羊绦虫(Taenia ovis)、牛肉绦虫(Taeniasaginata)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、科氏中殖孔绦虫(Mesocestoides corti)、关节支原体(Mycoplasma arthritidis)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、拉氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、唾液支原体(M.salivarium)和肺炎支原体(M.pneumoniae)，如美国专利No.6,440,416所公开，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。

在一更优选实施方案中，可使用包含抗gp120和其它此类抗HIV抗体的本发明药物偶联物作为AIDS患者中HIV的治疗剂；并且结核分枝杆菌抗体的药物偶联物适合作为药物难治性结核病的治疗剂。已对抗gp120抗体(抗HIV抗体)和毒素(如假单胞菌外毒素)的融合蛋白的抗病毒性质进行检验(Van Oigen等,J Drug Target，5:75-91,1998)。治疗AIDS患者中HIV感染的尝试失败可能是因为功效不足或不可接受的宿主毒性。本发明的药物偶联物有利地缺乏蛋白质毒素的此类毒性副作用，且因此有利地用于治疗AIDS患者中的HIV感染。这些药物偶联物可单独给予或与在单独给予时在这些患者中有效的其它抗生素或治疗剂组合给予。候选抗HIV抗体包括Johansson等(AIDS.2006 Oct3;20(15):1911-5)描述的抗包膜抗体，以及由Polymun(Vienna,Austria)描述和出售的抗HIV抗体，也描述于美国专利5,831,034、美国专利5,911,989和Vcelar等,AIDS 2007;21(16):2161-2170和Joos等,Antimicrob.Agents Chemother.2006;50(5):1773-9中，所有文献都以引用的方式并入本文。用于HIV的优选靶向剂是这些的各种组合以克服抗性。

在另一优选实施方案中，可使用本发明优选实施方案的治疗性偶联物治疗的疾病包括但不限于免疫失调疾病和相关自体免疫性疾病，包括第III类自体免疫性疾病，如免疫介导的血小板减少症，如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、休格伦氏综合症、多发性硬化症、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合症、大疱性类天包疮、糖尿病、亨诺克-斯奇赖恩紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、爱迪生氏病、类风湿性关节炎、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合症、血管闭塞性脉管炎、休格伦氏综合症、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺素症、硬皮病、慢性活动性肝炎、类风湿性关节炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎和纤维性肺泡炎，以及青少年糖尿病，如2002年3月1日提交的美国临时申请No.60/360,259(现已过期)所公开。适用于这些疾病的典型抗体包括但不限于可与以下反应者：HLA-DR抗原、B细胞和浆细胞抗原(例如CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、CD138、B7、MUC1、Ia、HM1.24和HLA-DR)、IL-6、IL-17。因为许多这些自体免疫性疾病是受由异常B细胞群体产生的自体抗体影响，所以通过包括本文所述的此类抗体-治疗剂偶联物的治疗性偶联物耗乏这些B细胞是自体免疫性疾病疗法的优选方法，尤其在某些情况下当将B细胞抗体与HLA-DR抗体和/或T细胞抗体(包括靶向IL-2作为抗原的抗体，如抗TAC抗体)进行组合时。在一优选实施方案中，治疗患有自体免疫性疾病的患者所用的抗B细胞、抗T细胞或抗巨噬细胞或其它此类抗体可进行偶联以产生更有效控制所述自体免疫性疾病中所涉及的宿主反应的治疗剂，并且可单独给予或与其它治疗剂(如TNF抑制剂或TNF抗体)、未偶联B细胞或T细胞抗体等组合给予。

在一优选实施方案中，更有效地并入细胞和病原体中可通过使用多价多特异性或多价单特异性抗体实现。所述二价和双特异性抗体的实例可见于美国专利No.7,387,772；7,300,655；7,238,785；和7,282,567中，所述各专利的实施例部分以引用的方式并入本文。这些多价或多特异性抗体在靶向表达多个抗原标靶和甚至相同抗原标靶的多个表位，但通常因细胞和病原体上单一抗原标靶的表达或可利用性不足而避开免疫疗法的抗体靶向和充分结合的癌症和感染性生物体(病原体)时特别优选。通过靶向多个抗原或表位，所述抗体显示对标靶的较高结合和滞留时间，因此利用本发明中所靶向的药物得到较高饱和度。

施用方法

经过诊断剂或治疗剂标记的主题分子可进行配制以获得包括一种或多种药学上适合的赋形剂、一种或多种其它成分或其一些组合的组合物。其可通过已知方法实施以制备药学上适用的剂量，由此将活性成分(即经过标记的分子)与一种或多种药学适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其它适合赋形剂为本领域的技术人员所熟知。参见例如Ansel等,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS,第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(编著),REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(MackPublishing Company 1990)和其修订版。

本文所述组合物的优选施用途径是肠胃外注射。注射可以是静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘内或腔内(即肠胃外)注射。在肠胃外施用时，组合物将配制成与药学上可接受的赋形剂相结合的可注射单位剂型，如溶液、混悬液或乳液。所述赋形剂本身无毒并且无治疗活性。所述赋形剂的实例为盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和汉克氏溶液(Hank's solution)。也可使用非水性赋形剂，如不挥发性油和油酸乙酯。一优选赋形剂是含5%右旋糖的盐水。赋形剂可含有少量添加剂，如增强等张性和化学稳定性的物质，包括缓冲剂和防腐剂。也预期其它施用方法，包括口服施用。

包含经过标记的分子的配制组合物可用于通过例如快速注射或连续输注进行静脉内施用。用于注射的组合物可以单位剂型，例如于添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中提供。组合物也可采用诸如溶于油性或水性媒剂中的混悬液、溶液或乳液等形式，并且可含有配方剂，如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，组合物可呈在使用前用适合媒剂(例如无菌无热原质水)复原的粉末形式。

组合物可以溶液施用。溶液的pH值应在pH 5至9.5范围内，优选为pH 6.5至7.5。其制剂应为具有适合药学上可接受的缓冲剂(如磷酸盐、TRIS(羟甲基)氨基甲烷-HCl或柠檬酸盐等)的溶液。缓冲剂浓度应在1至100mM范围内。配制溶液还可含有盐，如浓度为50至150mM的氯化钠或氯化钾。还可包括有效量的稳定剂，如甘露糖醇、海藻糖、山梨糖醇、甘油、白蛋白、球蛋白、清洁剂、明胶、鱼精蛋白或鱼精蛋白的盐。组合物可皮下、静脉内、肌肉内或通过其它肠胃外途径施用至哺乳动物。此外，可通过连续输注或通过单次或多次推注进行施用。

当在例如预靶向技术中施用双特异性抗体时，所施用抗体用于人的剂量将根据以下因素而变化，如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医疗条件和先前医学病史。通常，需要向接受者提供的双特异性抗体的剂量在作为单次静脉内输注时在约1mg至200mg范围内，不过还可根据环境要求施用较低或较高剂量。通常，需要向接受者提供的剂量在每平方米体表面积约10mg的范围内，或者对于典型成人为17至18mg，不过还可根据环境要求施用较低或较高剂量。可施用于人受试者的双特异性抗体的剂量的实例为1至200mg，更优选为1至70mg，最优选为1至20mg，不过可使用较高或较低剂量。治疗性双特异性抗体的剂量可较高，如1至200mg、1至100mg、100至1000mg、100至500mg、200至750mg或其间的任何范围。

一般来说，欲施用的标记分子的剂量将根据以下因素而变化，如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医疗条件和先前医学病史。优选向患者施用饱和剂量的标记分子。对于施用放射性标记的分子，剂量可以毫居里(millicurie)衡量。

在优选实施方案中，经过标记的肽、蛋白质和/或抗体是用于治疗癌症。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性疾病。所述癌症的更特定实例如下所述并且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌瘤、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如细胞未迁移至受试者体内原始恶性疾病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移产生的肿瘤，转移为恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位)。

癌症或恶性疾病的其它实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金氏病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性淋巴瘤、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关性淋巴瘤、AIDS相关性恶性疾病、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤(Ewing's Sarcoma)和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、戈谢氏病(Gaucher's Disease)、胆囊癌、胃部癌、胃肠良性肿瘤、胃肠肿瘤、胚细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌、喉癌、唇口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合症、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、妊娠期间的非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、原发灶隐匿性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、紫癜、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞赘瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉状瘤病肉瘤、塞扎里综合症(SezarySyndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、韦尔姆斯氏瘤(Wilms'Tumor)，和除赘瘤以外位于上列器官系统中的任何其它过度增生性疾病。

本文描述和主张的方法和组合物可用于检测或治疗恶性或恶变前病状。所述用途适用于已知或怀疑提前发展成赘瘤或癌症的病状，尤其是在已发生由增生、转化或最特别是发育异常组成的非赘生性细胞生长的情况下(关于所述异常生长病状的综述，请参见Robbins和Angell,Basic Pathology,第2版,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,第68-79页(1976))。

发育异常常常是癌症的前兆，并且主要发现于上皮中。其是非赘生性细胞生长的最无序形式，涉及个别细胞一致性和细胞结构定向的丧失。在存在慢性刺激或炎症的情况下，发育异常特征性地发生。可检测的发育异常病症包括但不限于：无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发育不良、大脑发育不良、子宫颈非典型增生、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨干发育不良、颅腕跗发育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育异常、骨干结构不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮异常增生、面指生殖器发育异常、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱褶性发育异常、纤维肌肉发育异常、骨纤维性结构不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌骨颜面发育不良、干骺端发育不良、蒙蒂尼氏发育异常(Mondinidysplasia)、单骨纤维性骨发育不良、粘液上皮发育异常、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不全、牙原性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质异常增生、多骨纤维性结构不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发育不良、中隔-眼发育不良、脊椎骨骺发育不良和脑室径向发育不良。

可检测和/或治疗的其它赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例如良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉、结肠息肉和食道异常增生)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病(Bowen's disease)、农夫皮肤(Farmer's Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。

其它过度增生性疾病、病症和/或病状包括但不限于恶性疾病和相关病症的进展和/或转移，如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病(包括成骨髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

可治疗的上文所列示例性病状并不具限制性。熟练技术人员将明了，用于多种病状的抗体、抗体片段或靶向肽是已知的，如自体免疫性疾病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反应、心血管疾病、神经退化性疾病、代谢性疾病、癌症、感染性疾病和过度增生性疾病。

示例性自体免疫性疾病包括急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合症、大疱性类天包疮、青少年糖尿病、亨诺克-斯奇赖恩紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、爱迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合症、血管闭塞性脉管炎、休格伦氏综合症、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺素症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣和纤维性肺泡炎。

试剂盒

各种实施方案可涉及含有适于治疗患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可含有至少一种偶联抗体或如本文所述的其它靶向分子。如果含有用于施用的组分的组合物未配制成通过消化道递送，如通过口服递送，那么可包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。用于如肠胃外递送等应用的一种类型装置是注射器，其用于将组合物注射至受试者体内。还可使用吸入装置。

试剂盒组分可包装于一起或分隔于两个或多个容器中。在一些实施方案中，容器可为容纳适于复原的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒还可含有一种或多种适于复原和/或稀释其它试剂的缓冲液。可使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可无菌包装和保持于容器中。可包括的另一组分是提供给使用试剂盒的人员的使用说明书。

实施例

以下实施例说明本发明的各种实施方案，而不限制其范围。

实施例1.制备对接锁定(DNL)构建体

DDD和AD融合蛋白

可使用DNL技术来制备包含几乎任何抗体、抗体片段或其它效应部分的二聚体、三聚体、四聚体、六聚体等。对于某些优选实施方案，抗体和抗体片段可制造为包含二聚化与对接结构域(DDD)或锚定结构域(AD)序列的融合蛋白。然而，熟练技术人员将认识到，存在其它偶联方法，如化学交联、点击化学反应等。

所述技术不具限制性并且可将所使用的任何蛋白质或肽制造为AD或DDD融合蛋白以供并入到DNL构建体中。在利用化学交联的情况下，AD和DDD偶联物可包含可使用本领域中已知的任何交联技术与AD或DDD序列交联的任何分子。在某些示例性实施方案中，可将树枝状聚合物或其它聚合部分(如聚乙二醇(PEG))并入DNL构建体中，如下文进一步详细描述。

对于不同类型的DNL构建体，可利用不同AD或DDD序列。示例性DDD和AD序列提供于下文中。

DDD1：SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO：33)

DDD2：CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO：34)

AD1：QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：35)

AD2：CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：36)

熟练技术人员将认识到，DDD1和DDD2包含蛋白激酶A的人RIIα形式的DDD序列。然而，在替代实施方案中，DDD和AD部分可以基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应AKAP序列，如下文DDD3、DDD3C和AD3中所例示。

DDD3

SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ IDNO：37)

DDD3C

MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：38)

AD3

CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQ ID NO：39)

表达载体

已使用质粒载体pdHL2来产生多种抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等,J Immunol Methods(1989),125:191-202；Losman等,Cancer(Phila)(1997),80:2660-6。所述双顺反子哺乳动物表达载体引导IgG的重链和轻链的合成。许多不同IgG-pdHL2构建体的载体序列基本上相同，仅有的差异存在于可变结构域(VH和VL)序列中。使用本领域的技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为产生Fab-DDD表达载体，将重链的铰链、CH2和CH3结构域的编码序列置换成编码铰链的前4个残基、14个残基的Gly-Ser连接子和人RIIα的前44个残基(称为DDD1)的序列。为产生Fab-AD表达载体，将IgG的铰链、CH2和CH3结构域的序列置换成编码铰链的前4个残基、15个残基的Gly-Ser连接子和称为AKAP-IS的17个残基的合成AD(称为AD1)的序列，所述合成AD是使用生物信息学和肽阵列技术产生并且证实以极高亲和力(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto等Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A(2003),100:4445-50。

设计两个穿梭载体以促进IgG-pdHL2载体向Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体的转化，如下文所述。

制备CH1

使用pdHL2质粒载体作为模版通过PCR扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5')端和SacII限制性核酸内切酶位点(其为CH1编码序列的5')组成。右侧引物由编码铰链的前4个残基(PKSC)接着四个甘氨酸和丝氨酸组成，其中最后两个密码子(GS)构成Bam HI限制性位点。将410bp PCR扩增物克隆到PCR克隆载体(

Inc.)中并根据T7(5')方向上的插入物对克隆进行筛选。

合成双链体寡核苷酸以编码前有11个连接子肽残基的DDD1氨基酸序列，其中前两个密码子构成BamHI限制性位点。终止密码子和EagI限制性位点接附于3'端。所编码的多肽序列于下文示出。

GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：40)

合成在3'端上有30个碱基对重叠的两个寡核苷酸，命名为RIIA1-44top和RIIA1-44bottom，并将其组合以构成174bp DDD1序列的中心154个碱基对。使所述寡核苷酸退火并用Taq聚合酶进行引物延伸反应。引物延伸后，通过PCR扩增双链体。将扩增物克隆到

中并根据T7(5')方向上的插入物进行筛选。

合成双链体寡核苷酸以编码前有11个连接子肽残基的AD1氨基酸序列，其中前两个密码子构成BamHI限制性位点。终止密码子和EagI限制性位点接附于3'端。所编码的多肽序列于下文示出。

GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：41)

合成编码上述肽序列的两个互补重叠寡核苷酸，命名为AKAP-ISTop和AKAP-IS Bottom，并进行退火。通过PCR扩增双链体。将扩增物克隆到

载体中并根据T7(5')方向上的插入物进行筛选。

连接DDD1与CH1

用BamHI和NotI限制酶将编码DDD1序列的190bp片段从

中切除并接着连接至CH1-

中的相同位点中以产生穿梭载体CH1-DDD1-

连接AD1与CH1

用BamHI和NotI将含有AD1序列的110bp片段从中切除并接着连接至CH1-中的相同位点中以产生穿梭载体CH1-AD1-

将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的载体中

根据此模块化设计，可将CH1-DDD1或CH1-AD1并入pdHL2载体中的任何IgG构建体中。通过从pdHL2移除SacII/EagI限制性片段(CH1-CH3)并将其置换为从相应pGemT穿梭载体切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI限制性片段将整个重链恒定结构域置换为上述构建体之一。

构建h679-Fd-AD1-pdHL2

h679-Fd-AD1-pdHL2是用于制造有AD1通过由14个氨基酸残基构成的柔性Gly/Ser肽间隔子偶合于Fd的CH1结构域的羧基末端的h679Fab的表达载体。通过将SacII/EagI片段置换为用SacII和EagI从CH1-AD1-SV3切除的CH1-AD1片段将含有h679的可变结构域的基于pdHL2的载体转化为h679-Fd-AD1-pdHL2。

构建C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2

C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于制造包含两个拷贝的融合蛋白C-DDD1-Fab-hMN-14的稳定二聚体的表达载体，其中DDD1通过柔性肽间隔子连接于hMN-14 Fab上CH1的羧基端。通过用SacII和EagI限制性核酸内切酶消化以移除CH1-CH3结构域并插入用SacII和EagI从CH1-DDD1-SV3穿梭载体切除的CH1-DDD1片段将已用于制造hMN-14 IgG的质粒载体hMN-14(I)-pdHL2转化成C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2。

已利用相同技术来制造用于多种已知抗体的Fab表达的质粒，所述抗体如hLL1、hLL2、hPAM4、hR1、hRS7、hMN-14、hMN-15、hA19、hA20和许多其它抗体。一般来说，抗体可变区编码序列存在于pdHL2表达载体中并且如上所述转化表达载体用于制造AD或DDD融合蛋白。可按每一个AD融合蛋白对应两个DDD融合蛋白的大致比率组合包含任何所述抗体的Fab片段的AD和DDD融合蛋白，以产生包含第一抗体的两个Fab片段与第二抗体的一个Fab片段的三聚DNL构建体。

构建N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2

N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于制造包含两个拷贝的融合蛋白N-DDD1-Fab-hMN-14的稳定二聚体的表达载体，其中DDD1通过柔性肽间隔子连接于hMN-14 Fab上VH的氨基端。表达载体如下进行工程改造。通过PCR扩增DDD1结构域。

作为PCR的结果，分别将NcoI限制性位点和含有BamHI限制性的连接子的部分编码序列接附于5'和3'端。将170bp PCR扩增物克隆到pGemT载体中并根据T7(5')方向上的插入物对克隆进行筛选。用NcoI和SalI限制酶从pGemT载体切除194bp插入物并克隆到通过用相同酶消化制备的SV3穿梭载体中以产生中间载体DDD1-SV3。

通过PCR扩增hMN-14Fd序列。作为PCR的结果，将BamHI限制性位点和部分连接子的编码序列接附于扩增物的5'端。终止密码子和EagI限制性位点接附于3'端。将1043bp扩增物克隆到pGemT中。用BamHI和EagI限制酶从pGemT切除hMN-14-Fd插入物并接着与通过用相同酶消化制备的DDD1-SV3载体连接以产生构建体N-DDD1-hMN-14Fd-SV3。

用XhoI和EagI限制酶切除N-DDD1-hMN-14Fd序列并将1.28kb插入物片段与通过用相同酶消化C-hMN-14-pdHL2制备的载体片段连接。最终表达载体是N-DDD1-Fd-hMN-14-pDHL2。N-连接型Fab片段显示与C-连接型Fab片段类似的DNL复合物形成和抗原结合特征(未示出)。

C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2

C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于制造具有DDD2的二聚化与对接结构域序列通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子接附于hMN-14的Fd的羧基端的C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体。所分泌的融合蛋白由通过DDD2结构域的非共价相互作用保持在一起的两个相同拷贝的hMN-14Fab构成。

表达载体如下进行工程改造。合成制备包含部分连接子肽和DDD2的残基1-13的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸。将所述寡核苷酸退火并用T4 PNK磷酸化，在5'和3'端上产生适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接的悬突。

将双链体DNA与通过用BamHI和PstI消化制备的穿梭载体CH1-DDD1-连接以产生穿梭载体CH1-DDD2-

用SacII和EagI从CH1-DDD2-

切除507bp片段并与通过用SacII和EagI消化制备的IgG表达载体hMN-14(I)-pdHL2连接。最终表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已利用类似技术来产生多种不同人源化抗体的Fab片段的DDD2融合蛋白。

h679-Fd-AD2-pdHL2

设计h679-Fab-AD2作为B与作为A的C-DDD2-Fab-hMN-14配对。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于制造具有AD2的锚定结构域序列通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子接附于CH1结构域的羧基末端的h679-Fab-AD2的表达载体。AD2在AD1的锚定结构域序列之前具有一个半胱氨酸残基并且在其后具有另一个半胱氨酸残基。

表达载体如下进行工程改造。合成制备包含AD2和部分连接子序列的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸(AD2 Top和AD2 Bottom)。将所述寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化，在5'和3'端上产生适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的悬突。

将双链体DNA连接到通过用BamHI和SpeI消化制备的穿梭载体CH1-AD1-

中以产生穿梭载体CH1-AD2-

用SacII和EagI限制酶从所述穿梭载体切除含有CH1和AD2编码序列的429碱基对片段并连接到通过用相同酶消化制备的h679-pdHL2载体中。最终表达载体为h679-Fd-AD2-pdHL2。

实施例2.产生TF1 DNL构建体

如下进行称为TF1的DNL构建体的大规模制备。首先将N-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白质L纯化)和h679-Fab-AD2(IMP-291纯化)以大致化学计量浓度于1mM EDTA、PBS(pH 7.4)中混合。添加TCEP前，SE-HPLC未显示任何a₂b形成的迹象(未示出)。而是存在代表a₄(7.97min；200kDa)、a₂(8.91min；100kDa)和B(10.01min；50kDa)的峰。添加5mM TCEP快速引起a₂b复合物形成，如8.43min时与150kDa蛋白质一致的新峰所证明(未示出)。在此实验中显然存在过量B，因为归属于h679-Fab-AD2的峰(9.72min)仍然明显而并未观察到对应于a₂或a₄的明显峰。还原一小时后，通过若干次改变PBS透析过夜将TCEP移除。使所得溶液达到10%DMSO并在室温下保持过夜。

当通过SE-HPLC进行分析时，代表a₂b的峰似乎更尖锐，其中滞留时间稍降0.1min成为8.31min(未示出)，根据我们先前的发现结果，这表明结合亲和力增加。复合物通过IMP-291亲和色谱进一步纯化以移除κ链污染物。如所预期，共纯化出过量h679-AD2并在稍后通过制备型SE-HPLC移除(未示出)。

TF1是高度稳定的复合物。当测试TF1与HSG(IΜΡ-239)感测芯片的结合时，在样品注射结束时所观测到的反应并无明显下降。相反，当在类似条件下测试含有C-DDD1-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD1两者的等摩尔浓度混合物的溶液时，在样品注射期间和紧接其后观测到反应单位增加时伴随明显下降，表明最初形成的a₂b结构不稳定。此外，尽管后续注射WI2使TF1的反应单位获得实质性增加，但C-DDD1/AD1并无明显增加。

由WI2与固定于感测芯片上的TF1结合引起的反应单位的额外增加与各自由N-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基促成的两个完全功能性结合位点相符。此由TF1结合WI2的两个Fab片段的能力所证实(未示出)。当通过BIAcore分析含有已还原并精确氧化成TF1的h679-AD2和N-DDD1-hMN14的混合物时，存在极少WI2的额外结合(未示出)，表明二硫键稳定的a₂b复合物(如TF1)可能仅通过DDD2与AD2的相互作用形成。

实施方法的两处改良以减少方法的时间和效率。第一，使用稍微摩尔过量的以a₄/a₂结构混合物形式存在的N-DDD2-Fab-hMN-14来与h679-Fab-AD2反应，以使得无游离h679-Fab-AD2残留并且未系栓于h679-Fab-AD2的任何a₄/a₂结构以及轻链将通过IMP-291亲和色谱移除。第二，用疏水性相互作用色谱(HIC)替代透析或渗滤作为还原后移除TCEP的手段，其将不仅减少方法时间，而且还增加潜在病毒移除步骤。混合N-DDD2-Fab-hMN-14与679-Fab-AD2并在室温下用5mMTCEP还原1小时。使溶液达到0.75M硫酸铵并接着加载至丁基FF HIC管柱上。管柱用0.75M硫酸铵、5mM EDTA、PBS洗涤以移除TCEP。还原的蛋白质用PBS从HIC管柱洗脱并使其达到10%DMSO。在室温下孵育过夜后，通过IMP-291亲和色谱分离高度纯化的TF1(未示出)。不需要如凝胶过滤等额外纯化步骤。

实施例3.产生TF2 DNL构建体

通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应获得三聚DNL构建体，命名为TF2。如下以>90%产率产生TF2的试验批次。将蛋白质L纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4:1摩尔比混合。总蛋白质浓度为于含1mM EDTA的PBS中1.5mg/ml。后续步骤包括TCEP还原、HIC色谱、DMSO氧化和IMP 291亲和色谱。添加TCEP前，SE-HPLC未显示任何a₂b形成的迹象。添加5mM TCEP快速引起与针对二元结构预期的157kDa蛋白质一致的a₂b复合物形成。通过IMP 291亲和色谱将TF2纯化至接近均质(未示出)。IMP 291是含有679Fab所结合的HSG半抗原的合成肽(Rossi等,2005,Clin Cancer Res 1l:7122s-29s)。IMP 291未结合部分的SE-HPLC分析证明a₄、a₂和游离κ链从产物的移除(未示出)。

通过

测定法测定TF2的功能性。将TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a₂b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未还原a₂和b组分的对照样品)稀释至1μg/ml(总蛋白质)并流经固定有HSG的感测芯片。TF2的反应约为两个对照样品的反应的两倍，表明对照中仅h679-Fab-AD组分结合并保留于感测芯片上。后续注射hMN-14的抗个体基因型抗体WI2 IgG证明，仅TF2具有与h679-Fab-AD紧密缔合的DDD-Fab-hMN-14组分，如另一信号反应所指示。由WI2与固定于感测芯片上的TF2结合引起的反应单位的额外增加与各自由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基促成的两个完全功能性结合位点相符。此由TF2结合WI2的两个Fab片段的能力所证实(未示出)。

实施例4.制造TF10双特异性抗体

使用类似方案产生包含两个拷贝C-DDD2-Fab-hPAM4和一个拷贝C-AD2-Fab-679的三聚TF10 DNL构建体。TF10中的癌症靶向抗体组分是来源于hPAM4，其为已作为放射性MAb详细研究的人源化抗胰腺癌粘蛋白MAb(例如Gold等,Clin.Cancer Res.13:7380-7387,2007)。半抗原结合组分是来源于h679，其为人源化抗组氨酰基-琥珀酰基-甘氨酸(HSG)MAb。使用如上所述关于制造(抗CEA)₂×抗HSGbsAb TF2所公开的方法制造TF10双特异性([hPAM4]₂×h679)抗体。TF10带有两个人源化PAM4Fab和一个人源化679Fab。

在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立地表达两个融合蛋白(hPAM4-DDD和h679-AD2)。组合组织培养上清液，得到两倍摩尔过量的hPAM4-DDD。反应混合物在室温下在使用1mM还原型谷胱甘肽的弱还原性条件下孵育24小时。还原后，DNL反应通过使用2mM氧化型谷胱甘肽轻微氧化而完成。通过亲和色谱使用IMP 291-affigel树脂分离TF10，所述树脂以高特异性结合h679Fab。

熟练技术人员将认识到，可使用上文公开的DNL技术制造包含抗体、免疫偶联物或可连接于AD或DDD部分的其它效应部分的任何组合的复合物。

实施例5.由多种抗体制造AD和DDD连接的Fab和IgG融合蛋白

使用前述实施例中描述的技术，构建表2中所示的IgG和Fab融合蛋白并且并入DNL构建体中。融合蛋白保留亲本抗体的抗原结合特征并且DNL构建体显示所并入抗体或抗体片段的抗原结合活性。

实施例6.DNL的序列变体

在某些优选实施方案中，并入DNL构建体中的AD和DDD序列包含如上文所公开的AD1、AD2、AD3、DDD1、DDD2、DDD3或DDD3C的氨基酸序列。然而，在替代实施方案中，在DNL复合物的构建中可利用AD和/或DDD部分的序列变体。例如，人PKA DDD序列仅存在四种变体，对应于PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIαDDD序列是上文公开的DDD1和DDD2的基础。四种人PKA DDD序列于下文示出。DDD序列代表RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(应注意，DDD1的序列与人PKA RIIαDDD部分相比稍有改变。)

PKA RIα

SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQ IDNO：42)

表2.包含IgG或Fab的融合蛋白

PKA RIβ

SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA(SEQID NO：43)

PKA RIIα

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQ ID NO：44)

PKA RIIβ

SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQ ID NO：45)

已对AD和DDD结构域的结构功能关系进行了研究。(参见例如Burns-Hamuro等,2005,Protein Sci 14:2982-92；Carr等,2001,J BiolChem 276:17332-38；Alto等,2003,Proc Natl Acad Sci USA100:4445-50；Hundsrucker等,2006,Biochem J 396:297-306；Stokka等,2006,Biochem J 400:493-99；Gold等,2006,Mol Cell 24:383-95；Kinderman等,2006,Mol Cell 24:397-408，所述各文献的整个正文以引用的方式并入本文。)

例如，Kinderman等(2006)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构并且得出结论，人DDD序列含有多个在二聚体形成或AKAP结合中重要的保守氨基酸残基，在下文SEQ ID NO:33中加下划线显示。(参见Kinderman等,2006的图1，以引用的方式并入本文。)熟练技术人员将认识到，在设计DDD序列的序列变体时，将希望避免改变任何加下划线残基，而对于二聚化和AKAP结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO：33)

Alto等(2003)对各种AKAP蛋白的AD序列进行了生物信息学分析以设计RII选择性AD序列，称为AKAP-IS(SEQ ID NO:35)，对DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列设计成AKAP与PKA结合的肽拮抗剂。AKAP-IS序列中取代倾向于使与DDD的结合减弱的残基在SEQID NO:35中加下划线显示。熟练技术人员将认识到，在设计AD序列的序列变体时，将希望避免改变任何加下划线残基，而对于DDD结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。

AKAP-IS序列

QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:35)

Gold(2006)利用结晶学和肽筛选来开发SuperAKAP-IS序列(SEQID NO:46)，显示对于PKA的RII亚型的选择性高达RI亚型的5个量级。加下划线的残基指示相对于AKAP-IS使得与RIIα的DDD部分的结合增强的氨基酸取代的位置。在此序列中，N-端Q残基编号为残基编号4并且C-端A残基为残基编号20。可进行取代以影响对于RIIα的亲和力的残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等,2006)。预期在某些替代实施方案中，可用SuperAKAP-IS序列取代AKAP-IS AD部分序列来制备DNL构建体。可用来取代AKAP-IS AD序列的其它替代序列于SEQ ID NO:47-49中示出。相对于AKAP-IS序列的取代加下划线显示。预期如同SEQ ID NO:46中所示的AD2序列，AD部分还可包括额外N-端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-端残基甘氨酸和半胱氨酸。

SuperAKAP-IS

QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO:46)

替代AKAP序列

QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:47)

QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:48)

QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:49)

Gold等的图2公开来自多种AKAP蛋白的其它DDD结合序列，如下所示。

RII特异性AKAP

AKAP-KL

PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO:50)

AKAP79

LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO:51)

AKAP-Lbc

LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO:52)

RI特异性AKAP

AKAPce

ALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO:53)

RIAD

LEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO:54)

PV38

FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQ ID NO:55)

双重特异性AKAP

AKAP7

ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO:56)

MAP2D

TAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO:57)

DAKAP1

QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO:58)

DAKAP2

LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO:59)

Stokka等(2006)还开发了AKAP与PKA的结合的竞争剂，如SEQID NO:60-62中所示。肽拮抗剂命名为Ht31(SEQ ID NO:60)、RIAD(SEQ ID NO:61)和PV-38(SEQ ID NO:62)。Ht-31肽对于PKA的RII亚型显示较高亲和力，而RIAD和PV-38对于RI显示较高亲和力。

Ht31

DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO:60)

RIAD

LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO:61)

PV-38

FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO:62)

Hundsrucker等(2006)开发了AKAP与PKA的结合的其它肽竞争剂，与PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4nM。各种AKAP拮抗性肽的序列提供于Hundsrucker等的表1中，复制于下文表3中。AKAPIS代表一种合成RII亚基结合肽。所有其它肽都来源于所指定AKAP的RII结合结构域。

表3.AKAP肽序列

肽序列

AKAPIS QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：35)

AKAPIS-P QIEYLAKQIPDNAIQQA(SEQ ID NO：63)

Ht31 KGADLIEEAASRIVDAVIEQVKAAG(SEQ ID NO：64)

Ht31-P KGADLIEEAASRIPDAPIEQVKAAG(SEQ ID NO：65)

AKAP7δ-wt-pep PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：66)

AKAP7δ-L304T-pep PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：67)

AKAP7δ-L308D-pep PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：68)

AKAP7δ-P-pep PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：69)

AKAP7δ-PP-pep PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY(SEQ ID NO：70)

AKAP7δ-L314E-pep PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY(SEQ ID NO：71)

AKAP1-pep EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA(SEQ ID NO：72)

AKAP2-pep LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ(SEQ ID NO：73)

AKAP5-pep QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL(SEQ ID NO：74)

AKAP9-pep LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA(SEQ ID NO：75)

AKAP10-pep NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA(SEQ ID NO：76)

AKAP11-pep VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL(SEQ ID NO：77)

AKAP12-pep NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF(SEQ ID NO：78)

AKAP14-pep TQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA(SEQ ID NO：79)

Rab32-pep ETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH(SEQ ID NO：80)

在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基在下文通过参考AKAP IS序列(SEQ ID NO:35)加下划线显示。残基与Alto等(2003)所观察到者相同，其中添加有C-端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等(2006)的图4，以引用的方式并入本文。)对于RII DDD序列具有极高亲和力的肽拮抗剂的序列为AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的序列。

AKAP-IS

QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:35)

Carr等(2001)检查了来自人和非人蛋白质的不同AKAP结合DDD序列之间序列同源性的程度，并且鉴别出DDD序列中似乎在不同DDD部分中最高度保守的残基。其在下文通过参考SEQ ID NO:33的人PKA RIIα DDD序列加下划线表示。特别保守的残基进一步以斜体表示。所述残基与由Kinderman等(2006)提出对于与AKAP蛋白结合来说重要的残基重叠但不相同。熟练技术人员将认识到，在设计DDD的序列变体时，最优选的是避免改变最保守的残基(斜体)，并且优选还避免改变保守残基(加下划线)，而既未加下划线也不是斜体的残基可考虑进行保守氨基酸取代。

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQOPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：33)

熟练技术人员将认识到，DNL构建体的抗体部分或连接子部分中的这些和其它氨基酸取代可用来增强所得DNL构建体的治疗和/或药物动力学性质。

实施例7.抗体-树枝状聚合物DNL复合物

我们合成并表征了一种新颖免疫偶联物，命名为E1-G5/2，其是通过DNL方法制备以包含一半第5代(G5)PAMAM树枝状聚合物(G5/2)位点特异性连接于来源于在结合至表达于各种实体肿瘤上的Trop-2抗原时快速内化的人源化抗体hRS7的Fab的稳定化二聚体。

方法

通过在弱氧化还原条件下组合两个自组装模块AD2-G5/2和hRS7-Fab-DDD2，接着在蛋白质L管柱上进行纯化来制备E1-G5/2。为制备AD2-G5/2，我们用马来酰亚胺基对AD2肽进行衍生化以与通过用胱胺核心还原G5 PAMAM产生的单个硫醇反应，并且使用逆相HPLC来分离AD2-G5/2。我们在骨髓瘤细胞中将hRS7-Fab-DDD2制造为融合蛋白，如上文实施例中所述。

通过尺寸排阻HPLC、SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹分析E1-G5/2的分子大小、纯度和组成。通过与针对hRS7的抗个体基因型抗体的结合、凝胶阻滞测定和DNA酶保护测定来评估E1-G5/2的生物功能。

结果

通过尺寸排阻HPLC证实E1-G5/2由侧接有若干次要峰的主峰(>90%)组成。E1-G5/2的三个主要组分(Fd-DDD2、轻链和AD2-G5/2)通过还原性SDS-PAGE检测到并通过蛋白质免疫印迹得到证实。抗个体基因型结合分析揭示E1-G5/2含有一群不同大小的抗体-树枝状聚合物偶联物，均能够识别抗个体基因型抗体，因此表明所购得G5树枝状聚合物具有大小的结构变化性。

结论

可使用DNL技术来建立可用抗体靶向的基于树枝状聚合物的纳米粒子。所述药剂作为用于在体外和体内应用的药物、质粒或siRNA的载体具有改良的性质。

实施例8.DNL树枝状聚合物的马来酰亚胺AD2偶联物

IMP 498(SEQ ID NO:83)

利用Protein Technologies PS3肽合成仪通过Fmoc方法在西伯尔酰胺树脂(Sieber Amide resin)上合成肽IMP 498直至并包括PEG部分(0.1mmol规模)。通过混合含二异丙基乙胺的β-马来酰亚胺基丙酸NHS酯和含树脂的DMF持续4小时手动添加马来酰亚胺。用15mLTFA、0.5mL H2O、0.5mL三异丙基硅烷和0.5mL硫代苯甲醚使肽从树脂裂解。通过逆相HPLC使用H₂O/CH₃CN TFA缓冲液纯化肽，冻干后获得约90mg纯化产物。

合成还原型G5树枝状聚合物(G5/2)

用0.1426 TCEP.HCl 1:1 MeOH/H₂O(约4mL)还原2.03g 7.03×10^-6mol G-5树枝状聚合物(MeOH中10%，Dendritic Nanotechnologies)并且在室温下搅拌过夜。通过逆相HPLC在C-18管柱上用0.1%TFAH₂O/CH₃CN缓冲液洗脱对反应混合物进行纯化，冻干后获得0.0633g期望产物。

合成G5/2树枝状聚合物-AD2偶联物

将0.0469g(3.35×10^-6mol)G5/2树枝状聚合物与0.0124g(4.4×10^-6mol)IMP 498混合并溶解于1:1 MeOH/1M NaHCO₃中并且在室温下混合19小时，接着用0.0751g二硫苏糖醇和0.0441g TCEP HCl处理。溶液在室温下混合过夜并在C4逆相HPLC管柱上使用0.1%TFAH₂O/CH₃CN缓冲液纯化，根据凝胶电泳和蛋白质免疫印迹判断获得0.0033g含有偶联的AD2和树枝状聚合物的物质。

实施例9.通过双特异性抗体的用于细胞毒性药物的递送系统

如上文所论述，预靶向方法已采用双特异性抗体和可靶向构建体用于改良治疗剂的靶向递送以使全身性毒性降低。在预靶向时，首先向受试者施用双特异性抗体(bsMAb)并接着使其定位于靶细胞或组织。任选地，可施用清除剂以促进bsMAb从循环中的清除。在bsMAb已从循环中清除后，施用结合定位于靶组织中的bsMAb的可靶向构建体。可靶向构建体与一种或多种治疗剂和/或诊断剂偶联。因为可靶向构建体从循环中极快清除并且通常主要在尿液中完整排泄，所以细胞毒性治疗剂在循环中耗时极短并且不被非靶向组织吸收，因此降低全身性毒性。

本发明实施例的目标是开发用于治疗性预靶向的新颖试剂。使用抗癌胚抗原(CEACAM5)双特异性抗体在人结肠直肠癌的动物模型中对其进行测试。预靶向研究中所用的一种示例性细胞毒性药物是SN-38。

开发了一种核心肽可靶向构建体，其在下文详细描述(IMP 457)。可靶向构建体经过修饰以连接SN-38并且每个核心肽可连接多达4个SN-38部分。还制备了每个聚合物分子可结合8至16个SN-38部分的树突聚合物。可靶向构建体具有同时结合治疗性放射性核素和化学治疗剂的能力以用于患病组织(如癌症)的组合疗法。

所用的一种示例性双特异性抗体为以上实施例中所述的TF2DNL构建体。TF2含有两个CEACAM5结合hMN-14 Fab部分和一个HSG结合h679 Fab部分。可靶向构建体中每个肽含有两个HSG半抗原以允许在肿瘤表面交联两个TF2bsMAb。两个双特异性抗体的交联增强预靶向肽在肿瘤表面上的保留(Barbet等,1999,Cancer BiotherRadiopharm 14:153-66)。

优选的是，肽-药物偶联物设计成允许药物的缓慢释放，例如药物键联稳定多达1天，但接着以时间依赖性方式释放。此与预靶向的动力学相匹配，其中肽在肿瘤中在1小时内达到最大累积，并且在接下来的数小时内超过90%通过尿排泄从血流中清除。不同于在体内长期保留，从而在肝脏和其它器官中进行代谢的直接药物-抗体偶联物，在预靶向中，大部分注射产物完整排泄以使全身性副作用降至最低。但定位于肿瘤中的药物-肽偶联物在肿瘤内缓慢释放。

合成可靶向构建体肽

通过固相肽合成法使用Aloc与Fmoc保护基的组合来合成肽以允许在肽合成期间选择性修饰肽侧链和延长肽。最初合成IMP 402并根据图1用于制备IMP 453。IMP 402也适于与树突药物载体偶联。

如下在西伯尔酰胺树脂上合成IMP 402。将Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH连接于树脂。移除赖氨酸侧链Fmoc并连接N-三苯甲基-组氨酰基-琥珀酰基-甘氨酰基(三苯甲基-HSG-OH)。从赖氨酸移除Aloc基团并向肽添加Fmoc-D-Tyr(But)-OH。向肽添加另一Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH并向所述赖氨酸侧链添加三苯甲基-HSG-OH基团。从赖氨酸移除Aloc基团并使用标准肽偶合方法向肽添加Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和三叔丁基-DOTA-OH。将肽从树脂裂解并通过HPLC进行纯化。

合成肽药物偶联物

肽偶合所需的SN-38前驱体的合成于图2中示出。SN-38的位置10首先用Boc基团保护并且位置20接着用氯甲酸对硝基苯酯修饰以产生10-Boc-20-对硝基苯基碳酸酯SN-38前驱体。活化的SN-38接着与肽混合以产生Boc-SN-38保护型偶联物，将其通过HPLC进行纯化。接着在温和条件下移除Boc基团以产生期望产物，整个偶联过程的总体产率为20%。所得SN-38偶联肽IMP 453含有一个DOTA、一个SN-38和两个HSG部分。

最初用经过¹¹¹In标记的IMP 453进行的研究显示对LS174人结肠癌细胞系的极佳肿瘤靶向(28%ID/g)(表4)。大部分肽通过尿排泄清除(表4)。3小时时的肾吸收升高(21%ID/g)，高于用双-DTPA肽所观察到的吸收(未示出)，但50%的初始肾吸收到24小时时消除。当将肽注射到未接受双特异性抗体的小鼠体内时，肾吸收仅为9.97%ID/g(表5)。经过预靶向的小鼠肾内的吸收较高可能是因为在体内或肾内存在双特异性抗体。对肽进行修饰以含有DTPA替代DOTA螯合部分可使肾吸收降至与用双-DTPA肽(如IMP 225和IMP 274)所见相同的范围。不存在TF2时，极少有经过标记的肽吸收至肿瘤中(表5)。

表4.经过TF2预靶向的带有scLS174T肿瘤的裸小鼠体内的¹¹¹InIMP 453生物分布。组织吸收表示为%ID/g。

组织	3小时	24小时	48小时
				肿瘤	28.32±4.03	15.44±1.18	9.69±1.97
肝脏	0.56±0.08	0.53±0.19	0.36±0.06
				脾	0.37±0.11	0.66±0.89	0.25±0.07
肾	21.10±4.14	10.00±2.45	7.11±1.17
				肺	0.56±0.10	0.18±0.07	0.14±0.03
血液	0.29±0.03	0.09±0.04	0.04±0.01
				胃	0.41±0.33	0.20±0.12	0.07±0.01
小肠	0.68±0.45	0.22±0.09	0.12±0.03
				大肠	1.23±1.41	0.23±0.05	0.16±0.07

表5.无bsMAb的带有scLS174T肿瘤的裸小鼠体内的¹¹¹In IMP453生物分布。

组织	3小时
		肿瘤	0.37±0.09
肝脏	0.37±0.18
		脾	0.22±0.07
肾	9.97±0.94
		肺	0.31±0.14
血液	0.24±0.01
		胃	0.11±0.06
小肠	0.20±0.10
		大肠	0.52±0.27

DTPA偶联的肽

如上所述合成IMP 453的类似物，其中DOTA基团置换为DTPA基团。将肽用¹¹¹In标记并且在带有LS174T肿瘤的裸小鼠体内检查肽的肿瘤靶向和清除。所述肽在体内显示与DOTA标记肽类似的靶向，但在3小时时的肾吸收较低。将肽毒性在添加有赋形剂的pH值在5-6之间的乙酸盐缓冲液中配制并且冻干用于治疗用途。

树突偶联

树突载体分子的优势在于其为不对称的，具有表面基团和局灶官能团用于进行不同取代。在规定局灶位点连接双-HSG肽得到位点特异性安置。PAMAM树突于图3中例示，不过可使用具有多达16个表面基团的树突。简单地说，此涉及用乙炔基进行多次衍生化以通过叠氮化物-炔点击环加成引入多个SN-38分子，如上文所论述。

局灶官能团通过‘BOC’保护基脱除和衍生化转化成马来酰亚胺，将其与含半胱氨酸的双-HSG肽偶联用于预靶向。相同肽还含有DOTA分子，其使得能够用In-111放射性标记进行标记用于测定体内靶向。如果发现合算的话，那么表面上具有氨基或一些其它基团的树突可购买。或者，指定树突通过以经过单保护的1,6-二氨基乙烷开始反复进行一系列甲基丙烯酸酯反应与基于乙烯二胺的酯解内部制备。经过BOC保护的氨基充当将最终位点选择性承载双-HSG肽的局灶官能团。

叠氮基-SN-38制备

对于点击化学反应，如SN-38与可靶向构建体的点击化学加成，可制备叠氮基-SN-38部分以供与可靶向构建体上的环辛炔或炔部分反应。一示例性制备于图4中示出。已在多次小规模反应中以及一次大规模反应使用3.43g SN-38制备了SN-38硅烷基醚(中间物1)，产率始终>74%。使用量在0.24-2.0g范围内的交联剂作为限制性试剂5次制备碳酸酯(中间物3)，获得0.33-2.63g(77-90%)经过纯化的碳酸酯。在此阶段，实现硅烷基的解块并且通过简单水性处理纯化物质，以确保移除氟化物试剂。作为图4中的中间物4的叠氮基-SN-38用于与树枝状聚合物上的乙炔基进行点击环加成。

点击环加成已根据公开文献(Moon等,2008,Chemotherapy.Med.Chem.51:6916-6926)通过借助于二氯甲烷中的均质反应使用0.1至0.2当量的三苯基膦和溴化亚铜进行了简化，并且产物的量和产率也随之得到提高。用老方法时，产率为58-82%，而用新方法时，产率为86%。鉴于均质反应条件，我们相信此新方法可以使规模扩大变得容易。合成顺序中的最终反应是使用如二氯乙酸等弱酸移除‘MMT’基团，其将以高产率进行。还将在包含硫酸铜和抗坏血酸盐的水性反应条件下使用DMSO作为共溶剂检查点击环加成。

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根据以上描述，本领域的技术人员可容易地确定本发明的基本特征，并且在不悖离本发明的精神和范围的情况下，无需进行过度实验即可对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用法和条件。本文引用的所有专利、专利申请和公布以引用的方式并入本文。

Claims

1.一种将治疗剂递送至靶细胞或组织的方法，其包括：

a)施用包含针对疾病相关抗原的第一结合位点和针对半抗原的第二结合位点的靶向分子；

b)施用包含所述半抗原和治疗剂的可靶向构建体，其中所述半抗原结合所述靶向分子；

其中所述可靶向构建体包含多个拷贝的治疗剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向分子是DNL构建体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向分子是TF2。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述可靶向构建体是IMP453。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂是SN-38。

6.根据权利要求1所述的方法，其中多个拷贝的所述治疗剂连接于所述可靶向构建体。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结合位点结合选自由以下组成的组的抗原：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM6、B7、纤维连接蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、肌腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原(Thomson-Friedenreich antigen)、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、P1GF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和致癌基因产物。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向分子是双特异性抗体。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向分子是通过对接锁定(DNL)技术制备。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结合位点选自由以下组成的组：hR1、hPAM4、hA20、hA19、hIMMU31、hLL1、hLL2、hMu-9、hL243、hMN-14、hMN-15、hRS7、hMN-3、Ab124和Ab125。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：毒素、药物、放射性核素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、siRNA、RNAi、光敏治疗剂、抗血管生成剂和促细胞凋亡剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述药物选自由以下组成的组：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、吉西他滨(gemcitabine)、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉酚、喜树碱、SN-38、阿霉素(doxorubicin)、阿霉素类似物、抗代谢物、烷基化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、促细胞凋亡剂、甲氨蝶呤和CPT-11。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述毒素选自由以下组成的组：蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素(gelonin)、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述放射性核素选自由以下组成的组：^103mRh、¹⁰³Ru、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁵Ru、¹⁰⁷Hg、¹⁰⁹Pd、¹⁰⁹Pt、¹¹¹Ag、¹¹¹In、^113mIn、¹¹⁹Sb、¹¹C、^121mTe、^122mTe、¹²⁵I、^125mTe、¹²⁶I、¹³¹I、¹³³I、¹³N、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁴⁹Pm、¹⁵²Dy、¹⁵³Sm、¹⁵O、¹⁶¹Ho、¹⁶¹Tb、¹⁶⁵Tm、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁷Tm、¹⁶⁸Tm、¹⁶⁹Er、¹⁶⁹Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、^189mOs、¹⁸⁹Re、¹⁹²Ir、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁷Pt、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²⁰¹Tl、²⁰³Hg、²¹¹At、²¹¹Bi、²¹¹Pb、²¹²Bi、²¹²Pb、²¹³Bi、²¹⁵Po、²¹⁷At、²¹⁹Rn、²²¹Fr、²²³Ra、²²⁴Ac、²²⁵Ac、²²⁵Fm、³²P、³³P、⁴⁷Sc、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁷⁵Br、⁷⁵Se、⁷⁶Br、⁷⁷As、⁷⁷Br、^80mBr、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、⁹⁵Ru、⁹⁷Ru、⁹⁹Mo和^99mTc。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

16.一种组合物，其包含IMP 453。

17.根据权利要求16所述的组合物，其进一步包含树突。

18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物包含4至16个拷贝的1种治疗剂。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：毒素、药物、放射性核素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、siRNA、RNAi、光敏治疗剂、抗血管生成剂和促细胞凋亡剂。

20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述治疗剂是喜树碱。

21.根据权利要求18所述的组合物，其中所述治疗剂是SN-38。

22.根据权利要求18所述的组合物，其中所述治疗剂选自由以下组成的组的酶：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

23.根据权利要求18所述的方法，其中所述药物选自由以下组成的组：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉酚、喜树碱、SN-38、阿霉素、阿霉素类似物、抗代谢物、烷基化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、促细胞凋亡剂、甲氨蝶呤和CPT-11。

24.根据权利要求18所述的方法，其中所述毒素选自由以下组成的组：蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。

25.根据权利要求18所述的方法，其中所述放射性核素选自由以下组成的组：^103mRh、¹⁰³Ru、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁵Ru、¹⁰⁷Hg、¹⁰⁹Pd、¹⁰⁹Pt、¹¹¹Ag、¹¹¹In、^113mIn、¹¹⁹Sb、¹¹C、^121mTe、^122mTe、¹²⁵I、^125mTe、¹²⁶I、¹³¹I、¹³³I、¹³N、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁴⁹Pm、¹⁵²Dy、¹⁵³Sm、¹⁵O、¹⁶¹Ho、¹⁶¹Tb、¹⁶⁵Tm、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁷Tm、¹⁶⁸Tm、¹⁶⁹Er、¹⁶⁹Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、^189mOs、¹⁸⁹Re、¹⁹²Ir、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁷Pt、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²⁰¹Tl、²⁰³Hg、²¹¹At、²¹¹Bi、²¹¹Pb、²¹²Bi、²¹²Pb、²¹³Bi、²¹⁵Po、²¹⁷At、²¹⁹Rn、²²¹Fr、²²³Ra、²²⁴Ac、²²⁵Ac、²²⁵Fm、³²P、³³P、⁴⁷Sc、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁷⁵Br、⁷⁵Se、⁷⁶Br、⁷⁷As、⁷⁷Br、^80mBr、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、⁹⁵Ru、⁹⁷Ru、⁹⁹Mo和^99mTc。