CN105367660A - 一种抗cd16a抗原和抗muc1抗原的双特异性抗体 - Google Patents
一种抗cd16a抗原和抗muc1抗原的双特异性抗体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体，其包含：特异性识别免疫效应细胞的CD16A抗原的第一功能域，特异性识别肝癌细胞MUC1抗原的第二功能域，和连接上述功能域的接头。本发明的技术方案为能够同时结合肿瘤相关抗原和免疫细胞靶分子的双特异性抗体，在识别肝癌细胞MUC1抗原、诱导ADCC的同时，识别免疫效应细胞的CD16A抗原，增强了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，有效地引导免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤；且结构稳定，半衰期更长。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体。
背景技术
CD16A（FcγRⅢA）是一种跨膜结构的IgGFc受体，有190AA的胞外区和25AA的胞内区，属于Ig超家族成员，主要分布于NK（naturalkiller，自然杀伤）细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞表面。抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，简称ADCC）是抗体的一种重要的效应功能，当抗体与靶细胞（比如肿瘤细胞）结合以后，抗体的Fc端可通过Fc受体（CD16A）与NK细胞结合并激活NK细胞，后者通过释放颗粒酶及穿孔素等将靶细胞杀死。CD16A介导NK细胞和单核巨噬细胞的ADCC作用，在特异性和非特异性免疫中具有重要作用，是机体清除免疫复合物和肿瘤细胞的关键受体。因此以CD16A分子为靶标的BsAb（双特异性抗体）对于引导NK（naturalkiller，自然杀伤）细胞和巨嗜细胞可能具有优势。
MUC1（粘蛋白1）是一种具有跨膜序列的附膜糖蛋白，其cDNA克隆是通过筛选从乳腺癌、胰腺癌等细胞系构建的cDNA表达文库而得到的。MUC1在乳腺正常及瘤组织中均有表达，但在正常腺细胞表达很低，主要分布于腺细胞表面，呈顶端表达，或以分泌形式存在于腺腔内，不被免疫系统识别。MUC1在癌组织中存在畸形糖基化和糖基化不完全，使MUC1的核心蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原，分布于整个癌细胞表面，可为免疫系统识别，成为肿瘤特异的抗原，大约90%以上的乳腺癌有MUC1的过度表达。Rahn和Soares等采用免疫组化对乳腺癌及良性乳腺病变进行了研究，结果表明，正常乳腺上皮细胞可见MUC1弱阳性表达，MUC1在乳腺癌组织中的高表达与乳腺良性病态组织及乳腺正常低表达之间存在显著性差异。而乳腺良性病变组织中MUC1表达无显著差异，证实了MUC1基因的编码产物是重要的癌标志物。此外，最近的研究还发现，肿瘤细胞MUC1可抑制嗜酸粒细胞对靶细胞的ADCC作用。Ogata等报道含有STn表位的MUC1可大大提高铵离子对NK细胞的抑制作用；随后又有报道转染MUC1cDNA的肿瘤细胞对杀伤细胞的敏感性降低，肿瘤细胞分泌的MUC1可抑制T细胞的增殖，使其处于G0/G1期，这些研究均表明MUC1对抗肿瘤的细胞免疫应答具有抑制作用。因此，MUC1是肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子。目前，已有多家研究机构制备了多种MUC1单克隆抗体，其中56株已得到国际肿瘤生物医学协会(ISOBM)的确认，但由于疗效有限，远不能满足现实需求。
双特异性抗体（bispecificantibody，BsAb）是具有两个抗原结合位点，可选择性募集效应细胞到靶细胞周围，介导特异性杀伤作用的新型人工抗体。通过BsAb介导免疫细胞杀死肿瘤细胞是当前肿瘤免疫治疗应用研究的热点，其主要作用机理是BsAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。目前双特异性抗体的结构主要以ScFv为主，仅由两种抗体的重链可变区和轻链可变区构成。由于ScFv构型的双特异性抗体分子量小，结构不稳定，导致在体内半衰期短，易被清除，难以达到有效杀伤肿瘤细胞的目的。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体，基于现有技术中的单一识别在肿瘤治疗中疗效不足的问题，本发明公开了一种能够同时结合肿瘤相关抗原和免疫细胞靶分子的双特异性抗体，在识别肝癌细胞MUC1抗原，诱导ADCC的同时，识别免疫效应细胞的CD16A抗原，有效地引导免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体，包含：
特异性识别免疫效应细胞的CD16A抗原的第一功能域，
特异性识别肝癌细胞MUC1抗原的第二功能域，和
连接上述功能域的接头。
作为本发明的进一步改进，抗CD16A抗体的轻链可变区（VL）与抗MUC1抗体的重链可变区（VH）通过G4S序列连接构成第一ScFv区，抗MUC1抗体的VL和抗CD16A抗体的VH通过G4S序列连接构成第二ScFv区，所述第一ScFv区和第二ScFv区通过longlinker串联；其中，所述抗CD16A抗体的VL氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，抗MUC1抗体的VH氨基酸序列如SEQIDNO：2所示、抗MUC1抗体的VL氨基酸序列如SEQIDNO：3所示和抗CD16A抗体的VH氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，具体如下：
SEQIDNO：1：
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SEQIDNO：2：
QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGHYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPVTGGTKYAQNFQGWVTMTRDTSIRTAYMELSRLRSDDTAMYYCAREVTGDRGQFDKWGQGTLVTVAS；
SEQIDNO：3：
QSVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDWVFGGGTKLTVL；
SEQIDNO：4：
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAWFAYWGQGTLVTVSS。
作为本发明的进一步改进，所述longlinker的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。
SEQIDNO：5：GGGGSGGGGSCPPCPGGGGS。
作为本发明的进一步改进，所述第二ScFv区同时与IgG1的CH2域和CH3域连接，IgG的前导肽序列为信号肽。
采用此技术方案，将ScFv与Fc进行结合，采用ScFv-Fc构型，增加双抗的稳定性，有效延长双抗的半衰期，并通过Fc结构域介导的ADCC途径，有效的增强双抗杀瘤能力。
作为本发明的进一步改进，所述抗MUC1抗体为C595，所述抗CD16A抗体为EPR4333。
本发明还公开了如上所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体的核苷酸序列。
本发明还公开了包含上述核苷酸序列的载体。
本发明还公开了如上所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
本发明的有益效果为：
第一，采用本本发明的技术方案，克服了现有技术中的单一识别在肿瘤治疗中疗效不足的问题，同时又克服了ScFv构型的双特异性抗体分子量小，结构不稳定，半衰期短，易被清除的技术问题，将ScFv与Fc进行结合，采用ScFv-Fc构型，增加双抗的稳定性，有效延长双抗的半衰期。
第二，采用本本发明的技术方案，所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体在识别肝癌细胞MUC1抗原，诱导ADCC的同时，能识别免疫效应细胞的CD16A抗原，增强了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，有效地引导免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤，选择性杀伤肿瘤细胞，副作用小。
附图说明
图1是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体序列结构示意图。
图2是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体的SDS-PAGE蛋白电泳图。
图3是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体的流式结果图。
图4是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体的体外细胞毒分析图。
图5是本发明一种实施例在浓度为50nM下的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体与单独单抗组、同时添加两种单抗组的体外细胞毒对比分析图。
图6是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体的细胞因子分泌水平图。
图7是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体与生理盐水组和单纯NK组对照的体内介导NK抑制体内肿瘤增殖的对比图。
图8是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体与生理盐水组和单纯NK组对照的肿瘤模型鼠生存率对比图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
1、双特异性抗体的制备：
（1）双特异性抗体构建
抗CD16A抗体的VL与抗MUC1的VH通过G4S序列连接构成第一个ScFv，抗MUC1抗体的VL和抗CD16A的VH通过G4S序列连接构成第二个ScFv，将两个ScFv通过longlinker串联，同时在第二个ScFv后直接与IgG1的CH2和CH3连接，并采用IgG的前导肽序列作为信号肽，如图1所示。密码子优化后人工合成双抗的cDNA序列。所述抗CD16A抗体的VL氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，抗MUC1抗体的VH氨基酸序列如SEQIDNO：2所示、抗MUC1抗体的VL氨基酸序列如SEQIDNO：3所示和抗CD16A抗体的VH氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，所述longlinker的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。
（2）转染与表达
将双特异性抗体的全场cDNA序列克隆到pCDNA3.1质粒中，转染人HEK293细胞，3天后从培养上清中采用蛋白A亲和层析的方法纯化表达的双抗。图2为表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳图谱，由图2可见，所表达的双特异性抗体分子量大约为79KD。
2、双特异性抗体亲和性分析
1）将双抗与1X106NK细胞或MCF-7细胞共孵育2h，双抗终浓度为10nM。
2）双抗孵育后的细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm，5min，弃上清液。用含1%多聚甲醛的PBS室温固定15min，PBS清洗1遍。
3）用生物素标记的羊抗人IgG,F(ab’)2片段的特异性抗体室温孵育2h，PBS清洗1遍。
4）加入PE标记的链酶亲和素200ul，吹打混匀，室温避光孵育1h。PBS2ml离心洗涤2次。
5）将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，上机检测。
3、双特异性抗体介导的NK细胞毒实验
1）取对数生长期MCF-7细胞，5000个细胞/孔铺96孔细胞培养板。
2）第二天分别加入NK细胞、双抗加载的NK细胞，终浓度分别为2nM、10nM和50nM，以效靶比0.5:1、1:1和5:1的浓度共同培养4h,每个浓度3个平行孔。
3）加入WST1细胞计数试剂盒中应用液继续培养2小时，96孔细胞培养板放入酶联仪检测在450nm处吸光度OD值，按公式计算细胞杀伤率：
杀伤率(%)=[1-(实验组OD值-NK对照OD值)/靶细胞对照OD值]×100%
4）并按相同方法，比较抗体浓度为50nM条件下，双抗与两种单抗对NK细胞杀瘤能力的增强作用。
4、双特异性抗体介导NK细胞分泌细胞因子
1）取对数生长期肝癌细胞MCF-7以105个细胞/孔铺12孔板。
2）第二天加入NK细胞或双特异性抗体加载的NK，以效靶比10:1的浓度共同培养4小时，双抗终浓度为10mM和50nM。
3）收集上清液，ELISA检测细胞TNF-α、GranzymeB和Perforin的分泌水平。
5、双特异性抗体体内抗肿瘤实验
1）取6周龄裸鼠24只，雌雄各半，每只裸鼠右腋下皮下注射1×107人MCF-7细胞。
2）5天后肿瘤长到40mm2大小，随机分成3组：对照组、单纯NK组、双抗加载的NK组。
3）对照组尾静脉注射生理盐水200ul/次，每周3次，单纯NK组尾静脉注射NK细胞1×107个/次，每周3次；双抗加NK组尾静脉注射NK细胞1×107个/次，每周3次，连续治疗2周。游标卡尺测量瘤长度amm，宽度为bmm，按照瘤体积计算公式计算体积：瘤体积=0.5*a*b2，并统计各组生存率。
6.结果分析：
（1）亲和性分析
为了检测双特异性抗体是否既能与CD16A抗原结合，又能与MUC1抗原结合。我们将双抗分别与CD16A阳性的NK细胞和MUC1阳性的MCF-7细胞共同孵育2h，然后用生物素标记的羊抗人IgG,F(abˊ)2片段的特异性抗体与细胞孵育，最后加入PE标记的链酶亲和素。图3为双抗分别与NK细胞和MCF-7细胞共孵育后的FACS结果图。从图3中可以看出，双抗可以与NK细胞结合，也能与MCF-7细胞结合。
（2）体外细胞毒实验
以NK为效应细胞，MUC1阳性的乳腺癌细胞MCF-7为靶细胞，采用MTT法检测双抗介导的NK细胞毒性，结果如图4所示。由如图4可见，在不同效靶比的条件下，双抗在终浓度为2、10和50nM的条件下均可有效增强NK细胞对MCF-7的细胞毒作用。在浓度为50nM下，相比于单独单抗组和同时添加两种单抗组，双抗组均显示出更强的细胞毒作用，如图5所示。
（3）细胞因子分泌检测
采用ELISA法检测双抗负载NK以效靶比10:1与MCF-7共孵育4h后细胞上清中TNF-α、GranzymeB和Perforin的分泌水平，结果如图6所示。由图6可见，NK负载双抗后，所述BsAbA的终浓度为10nM；所述BsAbB的终浓度为50nM），TNF-α、GranzymeB和Perforin的分泌水平显著升高，且与双抗浓度呈正相关。
（4）体内抗肿瘤实验
构建MCF-7皮下移植瘤裸鼠模型，2天一次连续治疗2周，结果如图7和图8所示。由图7可见，相比于生理盐水组和单纯NK组，BsAb-NK组的肿瘤体积增长变缓，由图8可见，相比于生理盐水组和单纯NK组，BsAb-NK组的生存率明显提高。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体，其特征在于，其包含：
特异性识别免疫效应细胞的CD16A抗原的第一功能域，
特异性识别肝癌细胞MUC1抗原的第二功能域，和
连接上述功能域的接头。
2.根据权利要求1所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体，其特征在于：抗CD16A抗体的轻链可变区与抗MUC1抗体的重链可变区通过G4S序列连接构成第一ScFv区，抗MUC1抗体的轻链可变区和抗CD16A抗体的重链可变区通过G4S序列连接构成第二ScFv区，所述第一ScFv区和第二ScFv区通过longlinker串联；其中，所述抗CD16A抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，抗MUC1抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，抗MUC1抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，抗CD16A抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。
3.根据权利要求2所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体，其特征在于：所述longlinker的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。
4.根据权利要求2所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体，其特征在于：所述第二ScFv区同时与IgG1的CH2域和CH3域连接，IgG的前导肽序列为信号肽。
5.根据权利要求4所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体，其特征在于：所述抗MUC1抗体为C595，所述抗CD16A抗体为EPR4333。
6.编码权利要求1~5任意一项所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体的核苷酸序列。
7.包含有权利要求6所述核苷酸序列的载体。
8.如权利要求1~5任意一项所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
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