CN101506358A - 使用偶合的抗体或抗体片段治疗人免疫缺陷病毒感染的方法和组合物 - Google Patents

使用偶合的抗体或抗体片段治疗人免疫缺陷病毒感染的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在受治疗者中治疗HIV感染的方法和组合物。所述组合物可包含针对HIV抗原的靶向分子，如抗－HIV抗体或抗体片段。所述抗－HIV抗体或片段可偶合至多种细胞毒剂，如阿霉素。在优选实施方案中，所述抗体或片段是P4/D10。其它实施方案可涉及使用偶合至诊断剂的抗－HIV抗体或片段在受治疗者中成像、检测或诊断HIV感染的方法。在可选实施方案中，可施用具有至少一个HIV抗原结合位点和至少一个载体分子结合位点的双特异性抗体，任选地接着施用清除剂，接着施用偶合至治疗剂的载体分子。

Description

使用偶合的抗体或抗体片段治疗人免疫缺陷病毒感染的方法和组合物
背景
相关申请
本申请根据35C.F.R.§119(e)要求享有2006年5月15日提交的序列第60/800,342号临时申请的权益，其完整内容通过引用结合入本文。
发明领域
本发明涉及在受感染的受治疗者中治疗和在优选的实施方案中消除人免疫缺陷病毒(HIV)的方法和组合物。在特别的实施方案中，所述组合物和方法涉及靶向分子，如针对HIV抗原，例如针对HIV包膜抗原的抗体或抗体片段。在更特别的实施方案中，所述抗体或抗体片段可偶合至一个或多个试剂，如治疗剂、诊断剂、抑制病毒生长剂和/或细胞毒剂，包括但不限于化疗剂如阿霉素。在可选实施方案中，可使用具有针对HIV抗原的一个或多个结合位点和对载体分子亲和的一个或多个结合位点的双特异性或多特异性抗体或其片段，所述载体分子可连接细胞毒剂、抑制病毒生长剂或其它治疗和/或诊断剂。
相关领域描述
虽然使用抗逆转录病毒治疗(ART)在治疗人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)中取得振奋人心的进展，但是对外周血和淋巴结的分析已证明存在容纳潜伏原病毒的静止T细胞的持久库，所述潜伏的原病毒可在甚至终止治疗后的岁月里自发性活化(Berger等，Proc Natl Acad Sci USA 1998，95：11511-11513；Blankson等，Annu Rev Med 2002，53：557-593)。
结合和中和抗体可防止游离病毒与细胞的受体连接，所述抗体可与病毒表面结合，并可诱导补体介导的对游离病毒粒子的病毒溶解(Parren等，AIDS 1999，13[增刊A]：S137-162)。抗体还可通过抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、通过将NK-细胞偶联至受感染的靶细胞介导受感染细胞的杀伤(Broliden等，J Virol 1990，64：936-940)。但是，单独使用抗病毒抗体作为感染HIV的患者的免疫治疗部分未实现其最初的诺言(Hinkula等，J AcquirImmune Defic Syndr 1994，7：940-951；Trkola等，Nat Med 2005，11：615-622)。
已尝试使用各种病毒或细胞组分作为通过抗体向感染HIV的细胞递送治疗剂的靶(Davey等，J Infect Dis 1994，170：1180-1188；Pincus等，JImmunol 2003，170：2236-2241；Ramachandran等，J Infect Dis 1994，170：1009-1013；Saavedra-Lozano等，Proc Natl Acad Sci USA 2004，101：2494-2499)。相似的免疫毒素已证明在癌症患者中有前途(Wu和Senter，Nar Biotechnol 2005，23：1137-1146)。但是，仍需要更有效的方法和组合物来治疗感染HIV的细胞。
发明概述
本发明通过提供抑制、阻抑、检测、识别、定位和/或消除感染HIV的细胞的方法和组合物解决了本领域未解决的问题。在某些实施方案中，所述组合物和/或方法可涉及针对HIV抗原的靶向分子。所述靶向分子可包括但不限于肽、抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或任何此类抗体的片段和/或抗体类似物。在某些实施方案中，所述靶向分子可是未偶合的，例如“裸露”抗体或抗体片段。在其它实施方案中，所述靶向分子可偶合至一个或多个治疗和/或诊断剂。所述剂可包括但不限于药物、前体药物、抑制病毒生长剂、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、放射性核素、免疫调节剂、细胞因子、标记物、荧光标记物、发光标记物、顺磁标记物、MRI标记物、胶团、脂质体、纳米粒子或其组合。在特别的实施方案中，偶合的抗-HIV抗体或片段可在体内施用至具有已知或疑似的HIV感染的患者。所述施用可阻止或防止患者细胞感染HIV、可减少或消除患者中感染HIV的细胞，和/或可减少或消除先前和/或同时使用其它已知的抗逆转录病毒治疗的患者中的感染HIV的细胞的残留病灶。
其它实施方案涉及治疗受治疗者，如感染HIV、SIV、其它逆转录病毒的受治疗者的方法和/或组合物。受治疗者可包括但不限于人、动物、猫、狗、牛、羊、山羊、马和哺乳动物。所述方法和组合物可包含将为受治疗者施用的一个或多个裸露或偶合的靶向分子。在优选的实施方案中，所述靶向分子是抗体或抗体片段，包括嵌合、人源化或人抗体或片段的任何变化。施用可以是通过本领域已知的任何路径，如口服、鼻、口腔、吸入、直肠、阴道或局部。可选地，施用可以是通过原位、皮内、皮下、肌内、腹腔内、动脉内、鞘内或静脉内注射。
熟练的技术人员应理解，一个或多个HIV靶向分子，无论是偶合还是未偶合的，均可单独施用或可选地与HIV感染的其它已知的治疗性治疗，如叠氮胸苷、其它核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂和/或融合抑制剂联合施用。在某些实施方案中，偶合的HIV靶向分子可与HAART(高效抗逆转录病毒治疗)组合使用。许多抗-HIV治疗剂在本领域为已知，可单独或以任何组合使用任何此类已知的试剂，包括但不限于施多宁、齐多夫定、替诺福韦、拉米夫定、恩曲他滨、去羟肌苷、阿巴卡韦、司他夫定、奈韦拉平、洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦、福沙那韦、茚地那韦、奈非那韦、沙奎那韦。
在一些实施方案中，抗-HIV抗体或片段可作为双特异性或多特异性抗体复合体的一部分施用，所述双特异性或多特异性抗体具有至少一个HIV抗原结合位点和针对第二个靶如半抗原或载体分子的第二个结合位点。在其它实施方案中，抗-HIV抗体或片段可共价连接至抗体、抗体片段、单克隆抗体、Fc片段、Fc-结合蛋白或抗体结合蛋白，或作为与抗体、抗体片段、单克隆抗体、Fc片段、Fc-结合蛋白或抗体结合蛋白的融合蛋白提供。
在不同的实施方案中，抗-HIV抗体或片段可通过本领域公知的方法如使用共价交联试剂，共价或非共价连接至不同的部分。许多此类试剂，如碳二亚胺、双亚氨酸酯(bisimidate)、辛二酸的N-羟基丁二酰亚胺酯、二甲基-3，3′-二硫-双丙亚氨酸酯、叠氮乙二醛(azidoglyoxal)、1，5-二氟-2，4-(二硝基苯)和用于蛋白质和/或肽的其它交联剂为已知，并可使用。
在其它实施方案中，所述抗-HIV抗体或片段可用作诊断和/或成像用途的组剂(adjunct)。例如，抗-HIV抗体或片段可用任何已知的造影或检测剂标记，或可使用任何已知的方法如ELISA等检测。所述抗-HIV抗体或片段可间接体内使用，例如通过组织切片的免疫组织化学，以检测残留的HIV感染。可选地，抗-HIV抗体或片段可施用至受治疗者以在体内检测感染HIV的组织。所述组合物和方法可用于检测和/或诊断HIV感染的存在，以监控治疗后残留的HIV感染，和/或监控抗-HIV治疗的有效性。
附图简述
附图构成本说明书的一部分，并被包括以进一步示范本发明特定实施方案的某些方面。通过参考这些附图的一个或多个并结合下文显示的详细描述，可更好地理解所述实施方案。
图1A.HIV-1IIIB在体外中和HIV感染。通过将不同浓度的免疫球蛋白与HIV-1IIIB孵育，然后分析HIV易感的JurkatT-细胞的病毒感染，测试免疫球蛋白的中和能力。10μg/ml阿霉素-P4/D10和未标记的P4/D10二者对HIV-1IIIB的中和均显著好于HIV阴性血清(p＝0.001)。
图1B.HIV-1IIIB在体外抑制HIV感染在细胞间的扩散。为了测试所述免疫球蛋白是否可以限制HIV-1感染的细胞间扩散，将Jurkat T-细胞按0.2％、1％、3％和5％感染细胞和99.8％、99％、97％和95％未感染细胞的比例进行混合。显示了使用不同浓度的免疫球蛋白处理3％感染HIV-1IIIB的JurkatT-细胞和97％未感染细胞后的HIV-1p24产生。结果显示为培养7天后p24产生的抑制百分比。在0.5或0.05μg/ml的浓度下，阿霉素-P4/D10对HIV-1p24的产生的抑制效应显著好于未标记的P4/D10、对照抗体阿霉素-LL1、游离阿霉素和HIV-阴性血清(p＝0.002)。
图2.针对HIV-1/MuLV感染的体内保护。使用HIV-1/MuLV感染的脾细胞i.p.攻击小鼠(6-12只/组)，然后立即用单克隆抗体(Mab)或游离阿霉素治疗。按每只小鼠100-800μg未偶合的P4/D10Mab、100-400μg游离阿霉素和100-200μg无关的阿霉素-hRS7进行滴定。所有其它治疗均按每只小鼠100μg进行。攻击后10天，收集腹膜细胞并将其与HIV易感的JurkatT-细胞混合。每3-4天测量这些细胞培养物中的HIV p24产生，持续18天。显示了使用100μg Mab或游离阿霉素治疗后具有p24阳性细胞培养物的小鼠的百分比。仅有来自使用100μg阿霉素-P4/D10治疗的小鼠的细胞不含感染性HIV，这显著不同(p＝0.0001)于所有其它组。
示例性实施方案描述
本申请引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍和论著，均明确地通过引用整体结合入本文。
定义
如本文所用，“一个(a)”或“一种(an)”可指一个(种)或多于一个(种)的项目。
如本文所用，术语“和”和“或”可用于表示合取或析取。即，除非另外指明，二者均应理解为等同于“和/或”。
如本文所用，“大约”指在一个数字的加或减10％范围内。例如，“大约100”指90和110之间的任何数字。
如本文所述，“抗体”指全长(即天然存在的或者通过正常的免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(如IgG抗体)，或者免疫球蛋白分子的免疫活性(即特异性结合)部分或类似物，像抗体片段。
“抗体片段”是抗体的一部分，如F(ab)2、F(ab′)2、Fab、Fv、sFv和类似物。无论结构如何，抗体片段与完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”还包括通过结合特异抗原形成复合体，执行抗体类似作用的任何合成或基因工程蛋白质。例如，抗体片段包括由可变区组成的分离片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段，其中轻链和重链可变区通过肽连接体连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)和由氨基酸残基组成的模仿高变区的最小识别单位(CDR)。
“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、抑制病毒生长剂、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光敏剂、染料和放射性同位素。其它示例性治疗剂和使用方法请参见美国专利申请公布第20050002945、20040018557、20030148409和20050014207号，其均通过引用结合入本文。
“中和抗体”或“中和抗体片段”在本文中用于指与感染性病原体(如病毒)反应并破坏或抑制其感染性和/或毒性的抗体或片段。
“诊断剂”是用于诊断疾病的原子、分子或化合物。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(如生物素-链霉亲和素复合体)、造影剂、荧光化合物或分子，和磁共振成像(MRI)的增强剂(如顺磁离子)。
“免疫偶合物”是结合分子(如抗体组分)与原子、分子或高阶结构(如载体、治疗剂或诊断剂)的偶合物。
“裸露抗体”是未与任何其它试剂偶合的抗体。
“载体”是能够与治疗或诊断剂缔合以利于此试剂向靶细胞运输的原子、分子或高阶结构。载体可包括脂类(如能够形成高阶结构的两亲性脂)、多糖(如葡聚糖)、蛋白质、肽、肽类似物、肽衍生物或其它高阶结构(如胶团、脂质体或纳米粒子)。在某些实施方案中，可将载体设计为抗蛋白酶解或其它酶降解，例如通过用D-氨基酸取代蛋白质或肽中天然存在的L-氨基酸。
如本文所用，术语“抗体融合蛋白”指重组制备的抗原结合分子，其中连接了具有相同或不同特异性的两个或多个相同或不同的scFv或抗体片段。融合蛋白的价位指示融合蛋白对单个抗原或表位具有多少结合臂或位点；即单价、双价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价位意味着它在与抗原结合时可以利用多个相互作用，因而可以增强与抗原结合的亲和力。特异性指示抗体融合蛋白能与多少种抗原或表位结合；即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。根据这些定义，天然抗体如IgG为双价，因为它有两个结合臂，但是它是单特异性，因为它结合一个表位。单特异性、多价融合蛋白具有多于一个的表位结合位点，但是只与一个此类表位结合，例如具有两个与同一抗原反应性的结合位点的二链抗体。融合蛋白可包含单个抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合、或者同一抗体组分的多个拷贝。融合蛋白可额外包含抗体或抗体片段和治疗剂。适合此类融合蛋白的治疗剂实例包括免疫调节剂(“抗体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体-毒素融合蛋白”)。一个优选的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶)，优选为重组RNA酶。
“双特异性抗体”是可同时与具有不同结构的两个靶结合的抗体。特别关注的双特异性抗体和双特异性抗体片段具有至少一个与例如HIV包膜蛋白特异性结合的臂和至少一个与可靶向的携带治疗或诊断剂的偶合物特异性结合的其它臂。
如果抗体或者免疫偶合物制剂，或者本文所述的组合物的施用量在生理学上是显著的，即被称为施以“有效治疗量”。如果试剂的存在引起受体哺乳动物发生可检测的生理学变化，即被视为生理学上显著的。特别地，如果抗-HIV抗体制剂的存在减少、抑制或消除感染HIV的细胞或减少、抑制或消除未感染细胞的HIV感染，即被视为生理学上显著的。
如果组合物的施用可被受体患者耐受，其即被称为“药学可接受载体”。无菌磷酸盐缓冲液是药学可接受载体的一个实例。其它合适的载体对本领域技术人员为公知。例如，参见REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES(雷明顿氏药物科学)，第19版(Mack Publishing Co.1995)和古德曼和吉尔曼的THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(治疗学的药理学基础)(Goodman等编，Macmillan Publishing Co.，NewYork，1980和2001年版)。
使用的缩写词如下：
ABS，含有150mM氯化钠的醋酸钠缓冲液；
ADCC，抗体依赖性细胞毒作用；
DTT，二硫苏糖醇；
ELISA，酶联免疫吸附分析；
ART，抗逆转录病毒治疗；
HIV，人免疫缺陷病毒；
Mab，单克隆抗体；
MuLV，小鼠白血病病毒；
PBMC，外周血单核细胞；
TCID50，50％组织培养物感染剂量。
抗体
不同的实施方案可涉及针对一个或多个HIV抗原或表位的抗体配体。在优选的实施方案中，所述抗原或表位是展示于感染HIV的细胞表面的抗原或表位，如HIV包膜蛋白。制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域为公知。制备和鉴定抗体的方法也是本领域公知的(例如，参见Harlowe和Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体实验手册)，Cold Spring Harbor Laboratory)。使用的抗体也可从许多已知的来源通过商业获得。例如，多种分泌抗体的杂交瘤系可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。
单克隆抗体
虽然优选的实施方案可涉及P4/D10抗体的使用，但是同样可获得、制备和/或使用其它抗-HIV抗体。已报告了多种针对HIV的抗体，并且在某些实施方案中，可以利用任何此类已知的抗-HIV抗体。例如，4E10(Rosa等，Immunity 2：163-73，2005)；2F5(Bryson等，Protein and Peptide Letters，8：413-18，2001)；3D6(Ruker等，Ann.NYAcad.Sci.646：212-19，1991)；C37(Cao等，DNA and Cell Biology，12：836-41，2004)；1ACY、1F58、1GGGC(Berry等，Proteins，45：281-82，2001)；2G12(Armbruster等，J.Antimicrob.Chemother.54：915-20，2004)，其均通过引用结合入本文。在可选实施方案中，单克隆抗体可通过使用公知技术如美国专利4,196,265中举例的技术很容易地获得。典型地，此技术包括用选择的免疫原组合物免疫合适的动物。优选的是啮齿动物如小鼠和大鼠的细胞。更优选地是小鼠，最优选地是BALB/c小鼠，因为BALB/c小鼠是最常规使用的，并且一般产生较高百分比的稳定融合。
免疫之后，选择具有生产抗体潜能的体细胞，特别是B-淋巴细胞(B-细胞)用于Mab生产方案。这些细胞可从活组织检查的脾、扁桃体或淋巴结，或从外周血样品中获得。通常应免疫一组动物，然后摘取具有最高抗体滴度的动物的脾，通过用注射器匀浆所述脾获得脾淋巴细胞。典型地，免疫小鼠的脾含有大约5 x 107至2 x 108个淋巴细胞。
然后将所述免疫动物的产生抗体的B-淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞的细胞融合，所述永生骨髓瘤细胞一般是与被免疫动物属于同一物种的动物。适合在生产杂交瘤融合程序中使用的骨髓瘤细胞系优选是不产生抗体、融合效率高和具有酶缺陷的细胞系，所述酶缺陷使该细胞系不能在某些仅支持融合细胞(杂交瘤)生长的选择培养基上生长。
如本领域技术人员已知的，可使用许多骨髓瘤细胞中的任何一种。例如，当被免疫的动物是小鼠时，技术人员可使用P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠，技术人员可使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210；以及U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均可用于细胞融合。
制备生产抗体的脾或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂种的方法通常包括在存在促进细胞膜融合的一种试剂或多种试剂(化学或电的)下将体细胞与骨髓瘤细胞按2:1的比率混合，但是此比率可分别为从大约20:1至大约1:1不等。已描述了使用仙台病毒的融合方法和使用聚乙二醇(PEG)如37％(v/v)PEG的融合方法。使用电诱导的融合方法也是适合的。
融合程序通常以低频率(约1 x 10-6至1 x 10-8)产生可存活杂种。不过这并不会产生问题，因为通过在选择培养基上培养，将从亲本未融合细胞(特别是未融合的骨髓瘤细胞，其正常情况下将继续无限分裂)中分化出存活的融合杂种。所述选择培养基一般是含有阻止在组织培养基上从头合成核苷酸的试剂的培养基。示例性试剂有氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻止嘌呤和嘧啶两者的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻止嘌呤的合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，向培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，则向培养基中添加次黄嘌呤。
优选的选择培养基是HAT。只有能够操纵核苷酸补救途径的细胞能够在HAT培养基上存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)，因而无法存活。B-细胞可以操纵此途径，但是其在培养中的寿命有限，一般在大约两周内死亡。因此，唯一可以在所述选择培养基上存活的细胞是骨髓瘤细胞和B-细胞形成的那些杂种。
此培养提供了一群杂交瘤，从中可以选择特定的杂交瘤。典型地，杂交瘤的选择通过下述方法执行：在微滴定板上进行单克隆稀释来培养细胞，然后对各个克隆上清液(大约两至三周以后)进行需要的反应性测试。所述分析应灵敏、简单和快速，如放射免疫分析、酶免疫分析、细胞毒性分析、噬菌斑分析、斑点免疫结合分析和类似分析。
然后将所选杂交瘤进行连续稀释并克隆至产生各个生产抗体的细胞系，然后可无限繁殖其克隆以提供Mab。所述细胞系可通过两个基本方法用于Mab生产。杂交瘤样品可注射至(通常是至腹膜腔)组织相容性动物，所述动物是用于为原始融合提供体细胞和骨髓瘤细胞的类型。注射后的动物形成分泌特异性单克隆抗体的肿瘤，所述特异性单克隆抗体由融合的细胞杂种产生。然后可选择所述动物的体液如血清或腹水以提供高浓度的Mab。所述各个细胞系也可在体外培养，其中Mab被天然分泌至培养基，从中可以容易地获得高浓度的Mab。如果需要，任一方法产生的Mab可进一步使用过滤、离心和各种层析方法如HPLC或亲和层析进行纯化。
抗体片段的生产
本发明要求保护的方法和/或组合物的一些实施方案可涉及抗体片段。此类抗体片段可通过传统方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体获得。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶酶解抗体产生，以提供表示为F(ab′)2的5S片段。此片段可进一步使用硫醇还原剂进行裂解和任选地使用针对裂解二硫键产生的巯基的封闭基团，以生产3.5S Fab′单价片段。可选地，使用胃蛋白酶的酶解产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。生产抗体片段的示例性方法参见美国专利第4,036,945号；美国专利第4,331,647号；Nisonoff等，1960，Arch.Biochem.Biophys.，89：230；Porter，1959，Biochem.J.，73：119；Edelman等，1967，METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法)，第422页(Academic Press)和Coligan等(编)，1991，CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(免疫学最新实验方案)，(John Wiley &Sons)。
也可使用其它裂解抗体的方法，如分离重链以形成单价的轻-重链片段、进一步裂解片段或其它酶学、化学或遗传技术，只要所述片段与完整抗体识别的抗原结合。例如，Fv片段包含VH和VL链的缔合。此缔合可以是非共价的，参见Inbar等，1972，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，69：2659。可选地，所述可变链可通过分子内二硫键连接或通过化学剂如戊二醛交联。参见Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12：437。
优选地，所述Fv片段包含通过肽连接体连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)是通过构建包含编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因制备的，所述序列用寡核苷酸连接体连接。将所述结构基因插入表达载体，然后将所述表达载体导入宿主细胞如大肠杆菌(E.coli)。重组的宿主细胞即合成由连接体肽连接所述两个V结构域的单个多肽链。生产sFv的方法在本领域为公知。参见Whitlow等，1991，Methods：A Companionto Methods in Enzymology 2：97；Bird等，1988，Science，242：423；美国专利第4,946,778号；Pack等，1993，Bio/Technology，11：1271和Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12：437。
抗体片段的另一形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可通过构建编码感兴趣的抗体的CDR的基因获得。例如，通过使用聚合酶链式反应从生产抗体的细胞的RNA合成可变区制备此类基因。参见Larrick等，1991，Methods：A Companion to Methods inEnzymology 2：106；Ritter等(编)，1995，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION(单克隆抗体：生产、加工和临床应用)，第166-179页(Cambridge University Press)；Birch等，(编)，1995，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS(单克隆抗体：原理和应用)，第137-185页(Wiley-Liss，Inc.)。
嵌合和人源化抗体
嵌合抗体是其中例如人抗体的可变区被例如小鼠抗体的可变区取代，而包括小鼠抗体的互补决定区(CDR)的重组蛋白。嵌合抗体在被施用至受治疗者时表现出降低的免疫原性和增加的稳定性。构建嵌合抗体的方法在本领域为公知(例如，Leung等，1994，Hybridoma 13：469)。
嵌合单克隆抗体可通过将小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的小鼠CDR转移至人抗体的相应结构域进行人源化。所述嵌合单克隆抗体的小鼠骨架区(FR)也被替换为人FR序列。为了保留人源化单克隆的稳定性和抗原特异性，可将一个或多个人FR残基替换为小鼠的对等残基。人源化单克隆抗体可用于受治疗者的治疗性治疗。还可通过所述CDR序列的选择修饰增加人源化抗体的靶亲和性(WO0029584A1)。生产人源化单克隆抗体的技术在本领域为公知。(例如，参见Jones等，1986，Nature，321：522；Riechmann等，Nature，1988，332：323；Verhoeyen等，1988，Science，239：1534；Carter等，1992，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，89：4285；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，1992，12：437；Tempest等，1991，Biotechnology 9：266；Singer等，J.Immun.，1993，150：2844。)
其它实施方案可涉及非人灵长类动物抗体。在狒狒中培养治疗有用抗体的一般技术可参见，例如Goldenberg等，WO91/11465(1991)和Losman等，Int.J.Cancer 46：310(1990)。
人抗体
在另一实施方案中，抗体可以是人单克隆抗体。此类抗体可从已加工为响应抗原攻击生产特异性人抗体的转基因小鼠中获得。在此技术中，人重链和轻链基因座的元件被引入小鼠系中，所述小鼠系是从含有内源重链和轻链基因座的靶向阻断的胚胎干细胞系产生的。所述转基因小鼠可合成对人抗原特异的人抗体，因此所述小鼠可用于生产分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法参见Green等，Nature Genet.7∶13(1994)，Lonberg等，Nature 368：856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6：579(1994)。
使用组合方法或使用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物生产完全人抗体的方法在本领域为已知(例如，Mancini等，2004，New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol.3：544-50；其均通过引用结合入本文)。所述完全人抗体预期表现出比嵌合或人源化抗体更少的副作用，并在体内充当基本内源人抗体。在某些实施方案中，本发明要求保护的方法和程序可利用通过所述技术生产的人抗体。
在一个可选实施方案中，可使用噬菌体展示技术生产人抗体(例如，Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40，通过引用结合入本文)。人抗体可从正常人或表现出特定疾病状态(如HIV感染或AIDS)的人中生产。从患病个体构建人抗体的优点是循环抗体库可能偏好针对疾病相关抗原的抗体。
在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)从骨肉瘤患者构建了人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般而言，从循环血淋巴细胞(Id.)获得总RNA。从μ、γ和κ链抗体库克隆重组的Fab并将其插入噬菌体展示文库(Id.)。RNA可通过使用对重链和轻链免疫球蛋白序列特异的引物转化为cDNA，并用于制备Fab cDNA文库(Marks等，1991，J.Mol.Biol.222：581-97，通过引用结合入本文)。文库构建根据下列文献执行：Andris-Widhopf等(2000，选自：Phage Display Laboratory Manual(噬菌体展示实验手册)，Barbas等(编)，第1版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY第9.1至9.22页，通过引用结合入本文)。用限制性内切酶消化最终的Fab片段，将其插入噬菌体基因组以制备噬菌体展示文库。所述文库可通过标准噬菌体展示方法如生物淘选进行筛选。熟练的技术人员应理解此技术仅是示例性的，可使用任何已知的通过噬菌体展示制备和筛选人抗体或抗体片段的方法。
在另一可选实施方案中，可使用上述标准免疫方案，可以使用经过基因工程改造以生产人抗体的转基因动物来生产针对基本上任何免疫原性靶的抗体。所述系统的非限制性实例如Abgenix(Fremont，CA)的Xeno小鼠(例如，Green等，1999，J.Immunol.Methods 231：11-23)。在Xeno小
Figure A200780026776D00231
和类似动物中，小鼠抗体基因已被灭活，并替换为功能性人抗体基因，而小鼠免疫系统的剩余部分则保持完整。
Xeno小鼠
Figure A200780026776D00232
已转化了种系配置的YAC(酵母人工染色体)，所述YAC包含部分人IgH和IgK基因座，包括可变区序列的大部分以及辅助基因和调控序列。可使用人可变区库生产产生抗体的B细胞，所述B细胞可通过已知的技术加工成杂交瘤。使用靶抗原免疫的Xeno小鼠将通过正常的免疫应答产生人抗体，所述人抗体可通过上述标准技术进行收获和/或生产。有多个种系的Xeno小鼠可用，每个种系均能产生不同类别的抗体。所述人抗体可通过化学交联或其它已知的方法偶联至其它分子。已显示转基因生产的人抗体具有治疗潜力，并保留普通人抗体的药代动力学特性(Green等，1999)。熟练的技术人员应理解，本发明要求保护的组合物和方法不限于使用Xeno小鼠
Figure A200780026776D00233
系统，而可利用经过基因工程改造以生产人抗体的任何转基因动物。
中和抗体
在某些实施方案中，优选使用能够破坏或抑制HIV的感染性和/或毒性的中和抗体或其片段。多种HIV中和抗体在本领域为已知，可使用任何此类已知的抗体或其片段，包括但不限于P4/D10、2G12(例如，Joos等，Antimicrob Agents Chemother 2006，50：1773-79)、4E10(Joos等，2006)、2F5(Joos等，2006)、b12(例如，Wu等，J Virol 2006，80：2585)、X5(Moulard等，Proc Natl Acad Sci 2002，99：6913-18)或其任何组合。当使用多特异性抗体或片段时，熟练的技术人员应理解，可组合与相同或不同HIV表位结合的多个抗体或片段。虽然优选针对HIV包膜蛋白(gp120)和/或gp41的抗体，但是熟练的技术人员应理解，可利用其它HIV靶抗原以形成靶向感染HIV的细胞的抗体或其片段。在一些情况下，可利用与一个或多个HIV抗原以及T-细胞抗原(例如，CD4、CCR5和/或CXCR4)结合的抗体或片段。
融合蛋白
不同的实施方案可涉及融合蛋白。一般地，在这些分子中，一个肽的全部或大部分在N-或C-末端连接至第二个多肽或蛋白质的全部或大部分。例如，融合可利用其它物种的先导序列以允许蛋白在异源宿主中的重组表达。另一种有用的融合包括将具有免疫活性的结构域(如抗体或片段)连接至治疗剂(如肽或蛋白质毒素或酶)。融合的另一有用形式可包括连接可用于纯化的部分，如FLAG表位(Prickett等，1989，Biotechniques7：580-589；Castrucci等，1992，J Virol 66：4647-4653)。生产融合蛋白的方法对本领域技术人员为公知。例如，所述蛋白可通过下述方法生产：使用双功能交联试剂进行化学连接，从头合成完整的融合蛋白，或将编码第一个蛋白质或肽的DNA序列连接至编码第二个肽或蛋白质的DNA序列，然后表达完整的融合蛋白。
双特异性抗体
在某些实施方案中，可使用双特异性或多特异性抗体或片段。此类抗体或片段包含至少一个HIV-相关抗原的结合位点和至少一个，例如针对偶合至治疗和/或诊断剂的载体分子、细胞因子、细胞表面受体或其它抗原的其它结合位点。
一般而言，通过重组DNA技术产生的离散的抗体VH和VL结构域可彼此配对形成具有结合能力的二聚体(重组Fv片段)(美国专利第4,642,334号)。但是，此类非共价缔合的分子在生理条件下不够稳定，因而没有任何实际的用途。同类的VH和VL结构域可用具有适当组成和长度的肽连接体(通常由超过12个的氨基酸残基组成)连接以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。生产scFv的方法公开于美国专利第4,946,778号和美国专利第5,132,405号。将所述肽连接体的长度减至小于12个氨基酸残基阻止位于同一条链的VH和VL结构域配对，而强制在不同链上的具有互补结构域的VH和VL结构域进行配对，形成有功能的多聚体。用3至12个氨基酸残基的连接体连接的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为二链抗体)。使用0至2个氨基酸残基的连接体，则有利于形成三聚体(称为三链抗体)和四聚体(称为四链抗体)，但是除连接体长度之外，寡聚化的准确模式似乎还依赖于V-结构域的组成以及方向(VH-连接体-VL或VL-连接体-VH)。
使用由5个或更少氨基酸残基组成的肽连接体获得了多价的单特异性二链抗体、三链抗体和四链抗体。还使用双顺反子表达载体制备了双特异性二链抗体，所述双特异性二链抗体是两个不同scFv的异二聚体，每个scFv均由用短的肽连接体连接的一个抗体的VH结构域和另一抗体的VL结构域组成；所述双顺反子表达载体在一个顺反子中含有包含VH1-连接体-VL2的重组基因构建体，而在另一顺反子中含有包含VH2-连接体-VL1的重组基因构建体(Holliger等Proc Natl Acad Sci USA.1993；90：6444-6448；Atwell等Mol Immunol.1996；33：1301-1302；Holliger等Nature Biotechnol.1997；15：632-631；Helfrich等Int.J Cancer.1998；76：232-239；Kipriyanov等Int J Cancer.1998；77：763-772；Holliger等Cancer Res.1999；59：2909-2916)。
近来，还报告了具有双特异性的四价串联二链抗体(称为tandab)(Cochlovius等Cancer Res.2000；60：4336-4341)。所述双特异性tandab是两个相同多肽的二聚体，每个多肽均含有两个不同抗体的四个可变结构域(VH1、VL1、VH2、VL2)，所述四个可变结构域的连接方向有利于在自缔合后形成两个各自具有两个不同特异性的潜在的结合位点。
通过改变连接体长度制备基于scFv的多价和多特异性剂的方法公开于美国专利第5,844,094号、美国专利第5,837,242号和WO 98/44001。通过构建一个包含来自至少两个抗体的VH结构，而另一个包含相应的VL结构域的两个多肽链制备基于scFv的多价和多特异性剂的方法公开于美国专利第5,989,830号和美国专利第6,239,259号。美国专利第6,809,185号公开了重组制备的双特异性或三特异性抗体，其中Fab的CH1和CL的c-末端均与衍生自相同或不同单克隆抗体的scFv融合。
构建和使用双特异性和多特异性抗体的方法参见，例如2004年2月11日提交的美国专利申请公布第20050002945号，其完整内容通过引用结合入本文。多种重组方法可用于生产双特异性抗体和抗体片段。例如，可在转基因家畜的乳中生产双特异性抗体和抗体片段(例如参见Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63：141-147，1998；美国专利号5,827,690，其均通过引用结合入本文。)制备两个DNA构建体，所述构建体分别含有编码配对的免疫球蛋白重链和轻链的DNA区段。将所述片段克隆至含有优先在乳腺上皮细胞表达的启动子序列的表达载体。实例包括但不限于下述基因的启动子：兔、牛和羊酪蛋白基因，牛α-乳球蛋白基因，羊β-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸蛋白基因。优选地，所述插入片段的3′端侧翼是来自乳腺特异性基因的同类基因组序列。这提供了多聚腺苷酸化位点和转录子稳定序列。将所述表达盒共注射至受精的哺乳动物卵的原核中，然后将所述卵移植到受体雌性的子宫中进行孕育。通过Southern分析对出生的后代进行筛选，筛选同时存在两个转基因的后代。为了形成所述抗体，两个重链和轻链基因必须同时表达于同一细胞。使用本领域已知的标准免疫学方法分析转基因雌性的乳中所述抗体或抗体片段的存在和功能。可使用本领域已知的标准方法从乳中纯化所述抗体。
预靶向
使用双特异性抗体的一个策略包括预靶向方法，其中效应分子在施用双特异性抗体之后施用至受治疗者。所述双特异性抗体(其应包括HIV抗原的结合位点和一个针对偶合至一个或多个效应分子的载体的结合位点)定位至发病组织，增加效应子定位至发病组织的特异性(美国专利申请第20050002945号)。因为所述效应分子从循环中清除的速度大大快于所述双特异性抗体，所以使用预靶向策略时正常组织接触效应分子的机会小于直接将效应分子连接至疾病靶向抗体的情况。
已开发了预靶向方法以增加检测或治疗剂的靶：本底比值。预靶向和生物素/亲和素方法的实例参见，例如，Goodwin等，美国专利第4,863,713号；Goodwin等，J.Nucl.Med.29：226，1988；Hnatowich等，J.Nucl.Med.28：1294，1987；Oehr等，J.Nucl.Med.29：728，1988；Klibanov等，J.Nucl.Med.29：1951，1988；Sinitsyn等，J.Nucl.Med.30：66，1989；Kalofonos等，J.Nucl.Med.31：1791，1990；Schechter等，Int.J.Cancer48：167，1991；Paganelli等，Cancer Res.51：5960，1991；Paganelli等，Nucl.Med.Commun.12：211，1991；美国专利第5,256,395号；Stickney等，Cancer Res.51：6650，1991；Yuan等，Cancer Res.51：3119，1991；美国专利第6,077,499号；美国序列第09/597,580号；美国序列第10/361,026号；美国序列第09/337,756号；美国序列第09/823,746号；美国序列第10/116,116号；美国序列第09/382,186号；美国序列第10/150,654号；美国专利第6,090,381号；美国专利第6,472,511号；美国序列第10/114,315号；美国临时申请第60/386,411号；美国临时申请第60/345,641号；美国临时申请第60/3328,835号；美国临时申请第60/426,379号；美国序列第09/823,746号；美国序列第09/337,756号；和美国临时申请第60/342,103号，其均通过引用结合入本文。
在某些实施方案中，双特异性抗体和可靶向的构建体可用于治疗和/或成像发病组织，例如使用美国专利第6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093；5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；5,128,119；5,101,827；和4,735,210号(其均通过引用结合入本文)所述的方法。其它方法参见1999年6月22日提交的美国申请序列第09/337,756号和2001年4月3日提交的美国申请序列第09/823,746号。
停靠和锁定(DNL)
在某些实施方案中，双特异性抗体或片段、或抗体或片段的偶合物可使用称为停靠和锁定(DNL)的技术进行组装。DNL技术的进一步详情可参见2005年3月24日提交的美国专利申请序列第11/389,358号；2006年3月28日提交的11/391,584号；2006年6月29日提交的11/478,021；2007年6月21日提交的11/633,729；和2006年11月6日提交的美国临时专利申请序列第60/864,530号，其内容均通过引用整体结合入本文。
概要而言，DNL技术包括两个或多个互补序列之间的靶向结合，所述互补序列如，例如c-AMP依赖性蛋白激酶A的调节亚基的二聚化和停靠结构域(DDD)和介导与PKA的R亚基缔合的各种A-激酶锚定蛋白(AKAP)中发现的锚定结构域。但是，本领域技术人员应理解已知存在其它二聚化和停靠结构域以及锚定结构域，并且任何此类已知的结构域均可在本发明要求保护的主题范围内使用。其他示例性4-螺旋束型DDD结构域可获自p53、DCoH(蝶呤4α甲醇胺脱水酶/肝细胞核因子1α(TCF1)二聚化的辅因子)和HNF-1(肝细胞核因子1)。具有潜在用途的其它AD序列可参见美国专利申请序列第20003/0232420A1号，其完整内容通过引用结合入本文。
这些互补结合对可共价连接至各种功能单元，如抗体或抗体片段，或治疗或诊断剂，形成具有确定特异性和活性的治疗或诊断复合体。熟练的技术人员应理解可通过多种途径形成所述复合体，例如通过将AD或DDD序列掺入包含Fab、Fab′、IgG、scFc或具有已知的结合特异性的其它抗体或片段的融合蛋白。例如，可通过将AD和DDD序列掺入对两个不同靶抗原的具有特异性的抗体或片段形成双特异性复合体。可选地，连接至DDD或AD部分的抗体或片段可与治疗蛋白质或肽，如激素、酶、核糖核酸酶、豹蛙酶(onconase)或连接至互补AD或DDD部分的其它试剂结合。许多此类潜在的复合体在上文列出的专利申请中已有描述，可以使用任何此类已知的复合体。
治疗或诊断剂与抗-HIV抗体的偶合
在不同的实施方案中，治疗剂可偶合至抗-HIV抗体、片段或其它靶向分子以递送至感染HIV的细胞。使用的治疗剂可包含一个或多个aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮杂胞苷、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯咪胺、放线菌素、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、氟尿嘧啶脱氧核苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟羟甲睾酮、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、甲基苄肼、喷司他丁、PSI-341、司莫司汀、链脲菌素、紫杉烷类、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶氮芥、万珂(velcade)、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、豹蛙酶、rapLR1、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、绿脓杆菌内毒素、反义寡核苷酸、干扰RNA或其组合。
本文所述HIV靶向分子还可与其它部分偶合。例如，药物、毒素、放射性化合物、酶、激素、细胞毒蛋白、螯合剂、细胞因子和其它功能剂可偶合至所述HIV靶向分子。例如，可通过共价连接与侧链含有氨基、羧基、硫醇或羟基的氨基酸残基偶合。各种常规连接体均可用于此目的，例如，二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰亚胺-羟基丁二酰亚胺酯、戊二醛和类似物。与未修饰结构相比，试剂与所述HIV靶向分子的偶合优选不显著影响其结合活性或特异性。此外，可首先将细胞毒剂和/或抑制病毒生长剂偶联至多聚物载体，然后将所述载体偶合至HIV靶向分子。有关此方法，参见Ryser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：3867-3870，1978，U.S.4,699,784和U.S.4,046,722，其通过引用结合入本文。
本文所述偶合物可通过已知的连接抗体和脂类、糖类、蛋白、放射性核素或其它原子和分子的方法制备。例如，本文所述HIV靶向分子可连接至一个或多个本文所述载体(例如，脂类、聚合体、脂质体、胶团或纳米粒子)以形成偶合物，然后所述偶合物可以共价、非共价或其它方式结合治疗或诊断剂。可选地，本文所述的任何HIV靶向分子均可直接偶合至本文所述的一个或多个治疗或诊断剂。
例如，HIV靶向分子可用131I进行放射性标记，然后偶合至脂，以便得到的偶合物可形成脂质体。所述脂质体可包括一个或多个治疗剂(例如药物，如FUdR-dO)或诊断剂。脂质体和胶团的形成在本领域为已知。例如，参见Wrobel和Collins，Biochimica et Biophysica Acta(1995)，1235：296-304；Lundberg等，J.Pharm.Pharmacol.(1999)，51：1099-1105；Lundberg等，Int.J.Pharm.(2000)，205：101-108；Lundberg，J.Pharm.Sci.(1994)，83：72-75；Xu等，Molec.Cancer Ther.(2002)，1：337-346；Torchilin等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.、U.S.A.(2003)，100：6039-6044；U.S.5,565,215；U.S.6,379,698；和U.S.2003/0082154。
聚合体、二氧化硅或金属形成的纳米粒子或纳米胶囊(nanocapsule)也已有报道，其可用于药物递送或成像。例如，参见West等，Applications ofNanotechnology to Biotechnology(2000)，11：215-217；U.S.5,620,708；U.S.5,702,727；和U.S.6,530,944。还报道了将抗体或结合分子偶合至脂质体以形成治疗或诊断剂的靶向载体。例如，参见Bendas，Biodrugs(2001)，15：215-224；Xu等，Mol.Cancer Ther(2002)，1：337-346；Torchilin等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A(2003)，100：6039-6044；Bally等，J.Liposome Res.(1998)，8：299-335；Lundberg，Int.J.Pharm.(1994)，109：73-81；Lundberg，J.Pharm.Pharmacol.(1997)，49：16-21；Lundberg，Anti-cancer Drug Design(1998)，13：453-461。另请参见U.S.6,306,393；美国序列第10/350,096号；美国序列第09/590,284号和1999年6月9日提交的美国序列第60/138,284号。所有这些参考文献均通过引用结合入本文。
多种诊断和治疗剂可有利地用于形成所述HIV靶向分子的偶合物或可连接至与所述HIV靶向分子上的识别位点结合的半抗原。诊断剂可包括放射性同位素、用于MRI的增强剂或用于超声成像的造影剂和荧光化合物。许多适当的显像剂以及将它们与蛋白质或肽连接的方法在本领域为已知(例如，参见美国专利5,021,236和4,472,509，二者均通过引用结合入本文)。某些连接方法涉及金属螯合物复合体的使用，所述复合体使用例如有机螯合剂如与蛋白质或肽连接的DTPA(美国专利4,472,509)。
为了向HIV靶向分子加载放射性金属或顺磁离子，可能有必要首先将其与已连接了多个拷贝的螯合基团的载体反应，所述螯合基团用于结合所述放射性金属或顺磁离子。所述载体可以是聚赖氨酸、多糖或已衍生的或可衍生的具有可与螯合基团结合的侧基的聚合物，所述螯合基团如，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟(polyoxime)和已知可用于此目的的类似物。使用标准化学方法以最大限度地减少聚集和免疫反应性损失的方式将含有螯合剂的载体偶合至所述HIV靶向分子。
可用于制备所述偶合物的其它更罕见的方法和试剂参见U.S.4,824,659，其通过引用整体结合入本文。特别有用的金属-螯合剂组合包括2-苄基-DTPA和其单甲基和环己基类似物，与总能量在60至4,000keV范围内的诊断同位素配合使用。一些有用的诊断核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111In。当与本文所述的HIV靶向分子和载体一起使用时，与非放射性金属如锰、铁和钆复合的相同的螯合剂可用于MRI。大环螯合剂如NOTA、DOTA和TETA可与多种金属和放射性金属，最特别地分别与放射性核素镓、钇和铜，配合使用。通过调节环大小使之适合所感兴趣的金属，可使此类金属-螯合剂复合体非常稳定。也可使用其它环型的螯合剂，如用于复合223Ra的大环聚酯。
治疗剂包括，例如化疗药物如长春碱类、蒽环类、表叶毒素(epidophyllotoxin)、紫杉烷类、抗代谢物、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和促凋亡剂，特别是来自这些和其它细胞毒剂类别的阿霉素、甲氨蝶呤、红豆衫醇(taxol)、CPT-11、喜树碱和其它物质。其它细胞毒剂包括氮芥类、烷基磺酸盐、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配合物和类似物。合适的细胞毒剂参见REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿氏药物科学)，第19版(Mack Publishing Co.1995)和古德曼和吉尔曼的THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(治疗学的药理学基础)，第7版(MacMillan Publishing Co.1985)，以及这些出版物的修订版。其它合适的细胞毒剂(如实验药)对本领域技术人员为已知，并可用本领域已知的方法偶合至本文所述的HIV靶向分子。
另一类治疗剂由发射α-粒子(如212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、225Ac)、β-粒子(如32P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、90Y、111Ag、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、188Re、189Re)，或俄歇电子(如111In、125I、67Ga、191Os、193mPt、195mPt、195mHg)的放射性核素组成。所述HIV靶向分子可使用上述一个或多个放射性核素进行标记，使用方法同上文对诊断剂所述方法。
在某些实施方案中，所用的治疗剂可包含一个或多个聚集体抑制剂。聚集体是大的分子内复合体，认为其形成是响应错误折叠的蛋白(例如，参见Heath等，J.Cell Biol.153：449-55，2001；Johnstone等，J.Cell Biol.143：1883-98、1998；Wileman，Science 312：875-78，2006)。近来，已暗示聚集体可能在病毒粒子的组装中发挥作用(Heath等，2001；Wileman，2006)。因此，聚集体抑制剂可以发挥作用以阻止或抑制感染HIV或其他病毒的细胞形成新的感染性病毒粒子。多种聚集体抑制剂为已知，如ALLN、红豆衫醇、秋水仙碱和长春碱(Johnston等，1998)、其它微管抑制剂(Gerdes和Katsanis，Hum.Molec.Genet.14：R291-300，2005)；硼替佐米(万珂)(Catley等，Blood 108：3441-49，2006)、tubacin、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Corcoran等，Curr.Biol.14：488-92，2004)，可使用任何此类已知的聚集体抑制剂。
在不同的实施方案中，一个或多个免疫调节剂可被偶合至抗-HIV抗体或片段以施用至患者，或可选地被共施用至患者。如本文所用，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素和造血因子，如白介素、集落刺激因子、干扰素(例如，干扰素-α、-β和-γ)和命名为“S1因子”的干细胞生长因子。合适的免疫调节剂部分的实例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-γ、TNF-α和类似物。
术语“细胞因子”是对由一个细胞群体释放的、作为细胞间介导子作用于另一细胞的蛋白质或肽的总称。如本文广泛所用，细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、生长因子和常规的多肽激素。属于细胞因子的有生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit配体或FLT-3、血管抑制素、血小板反应素、内皮抑制素、肿瘤坏死因子和LT。如本文所用，术语细胞因子包括天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白和天然序列细胞因子的生物活性同等物。
趋化因子一般充当化学引诱物，以将免疫效应细胞募集至趋化因子表达位点。组合表达特定的趋化因子基因和例如细胞因子基因可能是有利的，以增强治疗位点其它免疫系统组分的募集。趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。熟练的技术人员应理解，某些细胞因子已知同样具有化学引诱效应，并可同样归于术语趋化因子下。相似地，术语免疫调节剂和细胞因子各自的成员也有重叠。
含有可检测标记物(例如，荧光分子)或抑制病毒生长剂和/或细胞毒剂(例如放射碘)的合适的肽可共价、非共价或以其它方式与HIV靶向分子缔合。例如，通过将光敏剂或染料掺入HIV靶向分子可获得治疗上有用的偶合物。荧光组合物如荧光染料和对可见光敏感的其它色原或染料(如卟啉)已用于检测和治疗病变，方法是用合适的光照射病变部位。在治疗中，这被称为光辐射、光疗法或光动力学治疗。参见Jori等编，PHOTODYNAMICTHERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(肿瘤和其它疾病的光动力学治疗)(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh，Chem.Britain(1986)，22：430。此外，已将单克隆抗体与光活化染料偶联以实现光治疗。参见Mew等，J.Immunol.(1983),130：1473；idem.，Cancer Res.(1985)，45：4380；Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)，83：8744；idem.，Photochem.Photobiol.(1987)，46：83；Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288：471；Tatsuta等，Lasers Surg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等，Cancer(1991)，67：2529。
适体
在可选实施方案中，本发明公开的组合物和方法可利用抗体或抗体片段的可选结合分子形式，如适体。适体典型地是可采用为所选择的靶分子提供抗体样结合亲和性和特异性的三维构象的合成的寡核苷酸。构建适体和确定适体结合特性的方法在本领域为公知。例如，此类技术可参见美国专利第5,582,981、5,595,877和5,637,459号，其均通过引用结合入本文。
适体可通过任何已知的方法，包括合成、重组和纯化方法制备，并可单独或与对相同靶具有特异性的其它配体组合使用。一般而言，必须有最少约3个核苷酸，优选地至少5个核苷酸以实现特异性结合。虽然适体的序列长度可短于10个碱基，但是优选具有10、20、30或40个核苷酸的适体。
适体需要含有赋予结合特异性的序列，但是可以用侧翼区对其进行扩展和以其它方式对其进行衍生。在优选的实施方案中，适体的结合序列的侧翼可具有引物结合序列，以便通过PCR或其它扩增技术扩增所述适体。在进一步的实施方案中，所述侧翼序列可包含特异序列，该特异序列优先识别或结合能够增强所述适体对底物的固定作用的部分。
适体可像常规DNA或RNA分子一样进行分离、测序和/或扩增或合成。可选地，所感兴趣的适体可包含经过修饰的低聚物。适体内通常包含的任何羟基都可替换为膦酸酯基、磷酸酯基团，用标准保护基保护，或被活化以生成与其它核苷酸的附加连接，或可被偶合至固体支持物。一个或多个磷酸二酯连接可替换为可选的连接基团，如P(O)O替换为P(O)S、P(O)NR2、P(O)R、P(O)OR’、CO或CNR2，其中R是H或烷基(1-20C)，并且R′是烷基(1-20C)；此外，此基团可通过O或S连接至相邻的核苷酸。低聚物中的所有连接不必全部相同。
制备和筛选与感兴趣的特定靶结合的适体的方法为公知，例如美国专利第5,475,096号和美国专利第5,270,163号，其均通过引用结合入本文。该技术一般包括从候选适体混合物中进行选择和逐步反复结合，分离结合适体与未结合适体，和扩增。由于所述混合物中仅有少量序列(也许仅有一个适体分子)对应具有最高的亲和力的适体，因此通常需要设定分离标准，以便分离过程中混合物中能够保留大量适体(大约5-50％)。每个循环都富集对靶具有高亲和性的适体。可重复3-6个选择和扩增循环，以产生以高亲和性和特异性结合所述靶的适体。适体可通过本领域公知的标准核酸标记技术偶合至治疗剂。
Avimer
在某些实施方案中，本发明公开的组合物或方法可利用一个或多个avimer序列。Avimer是针对各种靶分子的亲和性和特异性有些类似于抗体的一类结合蛋白。它们是通过体外外显子改组和噬菌体展示从人胞外受体结构域生成的(Silverman等，2005，Nat.Biotechnol.23：1493-94；Silverman等，2006，Nat.Biotechnol.24：220。)得到的多结构域蛋白可包含多个独立的结合结构域，与单表位结合蛋白相比，此蛋白可表现出改善的亲和性(一些情况下为次纳摩)和特异性。(Id.)在不同的实施方案中，可使用本文讨论的标准蛋白交联或标记技术将avimer连接至治疗剂以用于本发明要求保护的方法和组合物。有关构建和使用avimer的方法的其它详情，请参见，例如美国专利申请公布第20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384号，其各自的实施例部分均通过引用结合入本文。
制剂和施用
HIV靶向分子(包括其偶合物)可进一步配制，以获得包括一个或多个药学合适的赋形剂、一个或多个附加成分或赋形剂和附加成分的某种组合的组合物。这些可通过制备药学有用的制剂的已知方法实现，其中活性成分(即HIV靶向分子或偶合物)与一个或多个药学合适的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲液是药学合适的赋形剂的一个实例。其它合适的赋形剂对本领域技术人员为公知。例如，参见Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS(药物制剂形式和药物释放系统)，第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro编，REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿氏药物科学)，第18版(MackPublishing Company 1990)，及其修订版本。
本文所述组合物的一个施用路径是肠胃外注射。在肠胃外施用中，所述组合物将与药学可接受赋形剂一起配制成可单位剂量注射形式，如溶液、悬浮液或乳剂。所述赋形剂本身无毒，并且无治疗作用。所述赋形剂的实例有生理盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和Hank′s溶液。也可使用非水性赋形剂如固定油和油酸乙酯。优选的赋形剂为5％葡萄糖生理盐水溶液。赋形剂可包含少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质，包括缓冲液和防腐剂。也考虑包括口服在内的其它施用方法。
包含HIV靶向分子的配制组合物可用于静脉内施用，例如通过推注或持续输注。用于注射的组合物可与添加的防腐剂制成单位剂量形式，如用安瓿或多次给药容器。组合物还可采取诸如油性或水性介质的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并可包含制剂用剂，如悬浮、稳定和/或分散剂。可选地，所述组合物可以是粉末形式，以便在使用前用合适介质(例如，无菌无热原水)制成溶液。
所述组合物可以溶液形式施用。所述溶液的pH应在pH5至9.5，优选地pH6.5至7.5范围内。其制剂应为含有合适的药学可接受缓冲剂的溶液，所述药学可接受缓冲剂如磷酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷-HCl或柠檬酸盐和类似物。缓冲剂浓度应在1-100mM范围内。配制的溶液还可包含盐，如50-150mM浓度的氯化钠或氯化钾。还可包括有效量的稳定剂，如甘油、白蛋白、球蛋白、去污剂、明胶、精蛋白或精蛋白盐。如果所述HIV靶向分子使用抗体的人源化形式作为模板，则配制的组合物的全身用药通常为每两天、三天一次或者一周一次。可选地，每天施用是有效的。通常的施用方式为肌肉注射或血管内输注。
所述组合物可通过皮下或其它肠胃外途径施用至哺乳动物。此外，可通过持续输注或者单次或多次推注施用。对抗体或免疫偶合物有用的方法可用于本文所述组合物。一般而言，人的免疫偶合物、融合蛋白或裸露抗体施用剂量根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、身体总体状况和先前的治疗历史等因素而变化。典型地，需要向受体提供约1mg/kg至20mg/kg范围内的活性成分剂量作为单次静脉内输注量，但是也可根据情况需要而施用更低或更高的剂量。可按需要重复此剂量，例如，每周一次，共计4-10周；优选为每周一次，共计8周；更优选地，每周一次，共计4周。给药频率也可降低，如每两周一次，共计若干个月。可通过不同的肠胃外途径给药，并相应调整剂量和用药时间。
可对本文所述的配制组合物应用用于控制免疫偶合物或抗体作用持续时间的药学方法。控释释放制剂可通过使生物相容性聚合物复合或者吸附所述免疫偶合物或裸露抗体来实现，所述生物相容性聚合物例如聚(乙烯-共-醋酸乙烯)基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。请参见Sherwood等，Bio/Technology(1992)，10：1446。免疫偶合物或抗体从这种基质释放的速率取决于该免疫偶合物或抗体的分子量、基质内的免疫偶合物、抗体量和分散粒子的大小。请参见Saltzman等，Biophys.J(1989)，55：163；Sherwood等，同上。其它固体制剂请参见Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMS ANDDRUGDELIVERYSYSTEMS(药物制剂形式和药物释放系统)，第5版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro编，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿氏药物科学)，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版本。
用于治疗目的时，所述组合物按有效治疗量施用至哺乳动物。本发明公开的治疗和诊断方法的合适受治疗者通常为人，但是也考虑非人动物受治疗者。
所述组合物可通过气溶胶施用，以实现到肺部的局部递送。可使用水性气溶胶或非水性(如氟碳推进剂)悬浮液。制备气溶胶时优选使用声波喷雾器，以最大限度减少组合物中的HIV靶向分子面对剪切力的情况，那样会导致其降解和活性的损失。
连接放射性核素的HIV靶向分子可有效用于治疗。确定所述HIV靶向分子位于受治疗者的一个或多个感染部位之后，注射更高剂量的标记的组合物，一般为单位剂量20mCi至150mCi(131I)，单位剂量5mCi至30mCi(90Y)，或者单位剂量5mCi至20mCi(186Re)，均根据患者体重为70kg确定。可采取静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘内、或腔内(即肠胃外)注射，并可重复注射。对于某些治疗，施用多次、分开的剂量是有利的，从而提供较高的毒性剂量，而没有通常导致正常组织辐射的相应增加。
在其它实施方案中，抗-HIV抗体或片段可通过偶合至某些蛋白(如IgGl的Fc区)进行修饰，以用于口服或吸入施用(参见实施例3-7)。制备和使用肽-Fc偶合物的方法参见，例如Low等(2005，Hum.Reprod.20：1805-13)和Dumont等(2005，J.Aerosol.Med.18：294-303)，其均通过引用结合入本文。Low等(2005)公开了通过在CHO细胞中重组表达，将FSH的α和β亚基以单链或异型二聚体形式偶合至IgG1的Fc区。所述偶合Fc的肽通过肺或肠的表皮细胞被新生Fc受体介导的运输系统吸附。与原来的肽相比，所述偶合的Fc肽表现出增强的体内稳定性和吸收性。同时还观察到异型二聚体共轭物的活性要高于单链形式。使用Fc偶合，更大的蛋白如促红细胞生成素也可通过吸入有效递送(Dumont等，2005)。
治疗和诊断用途：不包括预靶向的应用
预期可使用连接至HIV靶向分子的放射性和非放射性诊断剂。合适的非放射性诊断剂是那些用于磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)或超声的诊断剂。例如，MRI剂包括与合适的螯合剂(如2-苄基-DTPA及其单甲基类似物和环己基类似物)复合的非放射性金属，如锰、铁和钆。请参见2001年10月10日提交的美国序列第09/921,290号，其通过引用整体结合入本文。
可使用有助于进行诊断成像的放射性同位素标记所述HIV靶向分子。合适的放射性同位素可包括处于60-4,000KeV能量范围内的同位素，或者更具体地，18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、45Ti、111In、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、177Lu、32P、188Re和类似物或其组合。例如，参见题为“Labeling Targeting Agents withGallium-68”(使用镓-68标记靶向剂)的美国专利申请(发明人：G.L.Griffiths和W.J.McBride)，和美国临时申请第60/342,104号，其公开了用于成像的正电子辐射源，如18F、68Ga、94mTc和类似物；(通过引用结合入本文)。例如，可通过单光子发射计算机断层显像(SPECT)或正电子发射断层显像(PET)进行检测。
在另一实施方案中，可使用有效杀伤感染HIV的细胞的放射性同位素标记所述HIV靶向分子，所述放射性同位素包括β-辐射源(如32P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、90Y、111Ag、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、188Re、189Re)，俄歇电子辐射源(如111In、125I、67Ga、191Os、193mPt、195mPt、195mHg)，α-辐射源(如212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、225Ac)，或其组合。
所述HIV靶向分子可通过连接一个或多个成像增强剂而用于MRI’所述成像增强剂可包括金属的复合体，所述金属选自由铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、铷(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)组成的组。相似地，所述HIV靶向分子可通过连接一个或多个市售的成像增强剂而用于超声成像。美国专利第6,331,175号介绍了MRI技术和偶合MRI增强剂的抗体的制备，其通过引用整体结合入本文。
功能蛋白(如毒素)可以多种方式存在于所述HIV靶向分子中。例如，使用标准分子生物学技术可将功能蛋白直接连接至抗-HIV抗体或片段成为融合蛋白。可选地，可通过已知的化学交联方法将功能蛋白共价偶合至抗-HIV抗体或片段。可用于此用途的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素和绿脓杆菌内毒素。(例如，请参见Pastan等，Cell(1986)，47：641；Goldenberg，CA-A Cancer Journalfor Clinicians(1994)，44：43；Sharkey和Goldenberg，CA Cancer J.Clin.56：226(2006)，其均通过引用结合入本文。)适合用于本发明的其它毒素对本领域技术人员为已知，并可参见U.S.6,077,499，其通过引用整体结合入本文。其它值得关注的功能蛋白包括各种细胞因子、酶和荧光蛋白。
治疗和诊断用途：包括预靶向的应用
预靶向是最初为了解决直接靶向的抗体血液清除慢而开发的多步骤过程，直接靶向的抗体对正常组织(特别是骨髓)有不良毒性。在预靶向中，放射性核素或其它治疗剂连接至可在几分钟内从血液中清除的小化合物。先施用能够识别放射标记的小化合物和靶抗原的预靶向剂；当所述预靶向剂稍后从血液中充分清除时再施用所述放射标记化合物。
治疗或诊断受治疗者的疾病或病症的预靶向方法提供如下：(1)向受治疗者施用上述双特异性HIV-靶向分子，其中至少一个抗原结合位点是针对HIV标志物，且另一抗原结合位点是针对含有双价半抗原的可靶向构建体；(2)任选地向该受治疗者施用清除组合物，并允许该组合物将所述结合结构从循环中清除；和(3)向该受治疗者施用所述含有双价半抗原的可靶向构建体，其中所述可靶向构建体进一步含有一个或多个螯合或者化学结合的治疗或诊断剂。多种清除剂和方法在本领域为已知，并可用于预靶向(如与HIV-靶向抗体复合的抗-独特型抗体)或将标签或标记物(例如，单糖)连接至HIV-靶向抗体，所述HIV-靶向抗体可与其它试剂(如单糖-结合抗体)复合。将亲和素-生物素结合相互作用用于清除方法在本领域同样为已知。
还提供了抗体依赖性酶前体药物疗法(ADEPT)：(1)如上向患者施用HIV靶向分子，其中该结构包含共价连接的、能够激活前体药物的酶，(2)任选地向该患者施用清除组合物，并允许该组合物将所述结合结构从循环中清除，和(3)向该患者施用所述前体药物。
IMP411可靶向的构建体
在优选的实施方案中，可靶向的构建体可包含一个或多个组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)部分，而抗原结合位点可与HSG-结合抗体或片段，如679抗体或片段缔合(例如，参见美国专利第6,962,702号，通过引用结合入本文)。可使用已知的预靶向技术将可靶向的构建体偶合至任何已知的诊断和/或治疗剂(例如，美国专利第6,962,702号)。包含两个HSG部分的示例性可靶向构建体(称为IMP411)具有式DOTA-D-Cys(3-SP-Gly-20-O-SN38)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2。例如，如上式所示，IMP411可连接至SN38化疗剂。可选地，其它治疗或诊断剂可掺入或偶合至相同的肽主链。
其它用途
在某些实施方案中，HIV靶向分子可用于感染HIV的组织的治疗和/或成像，例如使用下述专利中介绍的方法：美国专利第6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093；5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；5,128,119；5,101,827；和4,735,210号，其均通过引用结合入本文。其它方法参见1999年6月22日提交的美国申请序列第09/337,756号和2001年4月3日提交的美国申请序列第09/823,746号。所述成像可通过直接标记所述HIV靶向分子或者通过预靶向成像方法执行，请参见Goldenberg等，“Antibody Pretargeting AdvancesCancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy”(抗体预靶向改善了放射免疫检测和放射免疫治疗)，(J.Clin.Oncol，200624：823-34)，另请参见美国专利公布第20050002945，20040018557，20030148409和20050014207号，其均通过引用结合入本文。
在一些实施方案中，本发明公开和要求保护的HIV靶向分子可用于放射性核素治疗或放射免疫治疗方法(例如，请参见Govindan等，2005，Technology in Cancer Research & Treatment，4：375-91；Sharkey和Goldenberg，2005，J.Nucl.Med.46：115S-127S；Goldenberg等，2006，J.Clin.Oncol.24：823-34，其均通过引用结合入本文。)
在另一实施方案中，放射增敏剂可与裸露或偶合的HIV靶向分子、抗体或抗体片段组合使用。例如，所述放射增敏剂可与放射标记的HIV靶向分子组合使用。与单独使用放射标记的HIV靶向分子进行治疗相比，加入放射增敏剂可增强效力。放射增敏剂请参见D.M.Goldenberg编，CANCERTHERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES(使用放射标记的抗体治疗癌症)，CRC Press(1995)，其通过引用结合入本文。
对于本发明要求保护的任何方法，所使用的HIV靶向分子均可与细胞因子和免疫调节剂缔合或与其一起施用。这些细胞因子和免疫调节剂至少包括α、β和γ干扰素以及集落刺激因子。但是，其它免疫调节剂为已知，并可使用，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、TNF-α、干细胞生长因子、淋巴毒素、促红细胞生成素、血小板生成素、G-CSF、GM-CSF、S1因子或其组合。
可选的实施方案涉及通过施用有效量的HIV靶向分子和可靶向的构建体，血管内确定受治疗者感染HIV的组织的方法。所述HIV靶向分子包含至少一个特异性结合HIV抗原的ABS和至少一个特异性结合可靶向的构建体的ABS。
试剂盒
一些实施方案涉及用于实施本发明要求保护的方法的试剂盒。所述试剂盒可包括HIV靶向分子。所述靶向分子可使用上述任何试剂进行标记。此外，所述靶向分子可不进行标记，但是所述试剂盒可包含标记所述靶向分子的标记试剂。所述标记试剂(如果包括)可包含标记物和交联剂。所述试剂盒还可含有HIV靶向分子，所述HIV靶向分子包含至少一个特异性针对HIV抗原的抗体和至少一个特异性针对载体的抗体。所述试剂盒可任选地含有清除组合物，以从循环中清除HIV靶向分子。
所述试剂盒组分可包装在一起或者分开包装在两个或更多独立的容器中。在一些实施方案中，所述容器可以是包含适合重建的组合物的无菌、冻干制剂的小瓶。试剂盒还可包含适于重建和/或稀释其它试剂的一种或多种缓冲液。可使用的其它容器包括但不限于：袋、盘、盒、管或类似容器。试剂盒组成部分可无菌包装并保存在所述容器中。可包括的另一组成部分为给使用试剂盒的人员的使用说明。
疾病组织检测、诊断和成像的方法
体内诊断
抗-HIV抗体或片段可用于体内诊断。使用标记的Mab进行诊断成像的方法为公知。例如，在免疫显像技术中，抗-HIV抗体使用γ辐射放射性同位素标记，然后导入患者体内。使用γ摄像机检测γ辐射放射性同位素的位置和分布。例如，请参见Srivastava(编)，RADIOLABELEDMONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY(用于成像和治疗的放射性标记单克隆抗体)(Plenum Press 1988)；Chase，“MedicalApplications of Radioisotopes”(放射性同位素的医学应用)，REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿氏药物科学)，第18版，Gennaro等(编)，第624-652页(Mack Publishing Co.，1990)；和Brown，“ClinicalUse of Monoclonal Antibodies”(单克隆抗体的临床应用)，选自BIOTECHNOLOGYAND PHARMACY(生物技术与制药)227-49，Pezzuto等(编)(Chapman & Hall 1993)。同样优选的还有正电子辐射放射性核素(PET同位素)，如能量为511keV的放射性核素，如氟-18(18F)、镓-68(68Ga)和碘-124(124I)。所述成像可通过直接标记所述抗-HIV抗体或片段或使用预靶向成像方法执行，请参见Goldenberg等，2006，J.Clin.Oncol.24：823-834；另请参见美国专利公布第20050002945、20040018557、20030148409和20050014207号，其均通过引用结合入本文。
对于诊断成像，可通过使用中间官能团将放射性同位素直接或间接结合至所述抗-HIV抗体或片段。有用的中间官能团包括螯合剂，如乙二胺四乙酸和二乙三胺五乙酸。例如，参见Shih等(同上)和美国专利第5,057,313号。
向患者施用的放射剂量保持在尽可能低的水平，这通过选择半衰期最短，在体内停留时间最短，以及进行检测和精确测量所需的同位素量最小的最佳组合同位素实现。可与抗-HIV抗体结合并适合进行诊断成像的放射性同位素的实例包括99mTc和111In。
所述抗-HIV抗体或其片段也可用顺磁离子和多种放射性造影剂进行标记，以用于体内诊断。对磁共振成像特别有用的造影剂包括钆、锰、镝、镧或铁离子。其它试剂包括铬、铜、钴、镍、铼、铕、铽、钬或钕。抗-HIV抗体或其片段也可偶合至超声造影剂/增强剂。例如，一个超声造影剂为包含人源化抗-HIV IgG或其片段的脂质体。同样优选地，所述超声造影剂为充气的脂质体。
在优选实施方案中，双特异性抗体可与造影剂偶合。例如，所述双特异性抗体可包含多于一个成像增强剂以用于超声成像。在优选实施方案中，所述造影剂是脂质体。优选地，所述脂质体包含共价连接至所述脂质体的外表面的二价DTPA-肽。更优选地，所述脂质体是充气的脂质体。
显像剂和放射性同位素
在某些实施方案中，本发明要求保护的肽或蛋白质可连接至用于不同发病器官、组织或细胞类型的成像和诊断的显像剂。许多合适的显像剂，以及将它们连接至蛋白质或肽的方法在本领域为已知(例如，参见美国专利5,021,236和4,472,509，二者均通过引用结合入本文)。某些连接方法包括使用金属螯合复合体，例如，所述复合体使用连接至蛋白质或肽的有机螯合剂(如DTPA)(美国专利4,472,509)。蛋白质或肽也可在存在偶联剂(如戊二醛或高碘酸)下与酶反应。在存在这些偶联剂下，或者通过与异硫氰酸酯反应来制备具有荧光标记的偶合物。
可用作显像剂的顺磁离子的非限制性实例包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、铷(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，其中特别优选的为钆。可用于其它方法(如X射线成像)的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)，尤其是铋(III)。
可用作显像剂或治疗剂的放射性同位素包括砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜62、铜64、铜67、152Eu、氟18、镓67、镓68、3氢、碘123、碘124、碘125、碘131、铟111、52铁、59铁、32磷、33磷、铼186、铼188、Sc47、75硒、银111、35硫、锝94m、锝99m、钇86和钇90。某些实施方案经常优选使用I125，而锝99m和铟111也由于其低能量和适合远程探测而经常是优选的。
放射性标记的蛋白质或肽可根据本领域公知的方法制备。例如，它们可以通过与碘化钠或碘化钾，和化学氧化剂(如次氯酸钠)或酶氧化剂(如乳过氧化物酶)接触进行碘标记。蛋白质或肽可通过配体交换过程或直接标记技术进行锝99m标记，所述配体交换过程例如，使用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合至Sephadex柱，然后将所述肽加至此柱；所述直接标记技术例如，将高锝酸盐、还原剂(如SNCl2)、缓冲液(如邻苯二甲酸钠钾溶液)和所述肽一起孵育。经常用于将金属离子形式的放射性同位素结合至肽的中间官能团包括二乙三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、卟啉螯合剂和乙二胺四乙酸(EDTA)。同样可用的还有荧光标记物，包括若丹明、荧光素异硫氰酸酯和肾造影剂。
在某些实施方案中，所述抗HIV抗体或片段可连接至二级结合配体或与显色底物接触后生成有色产物的酶(酶标签)。合适酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根过氧化物酶)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。优选的二级结合配体为生物素和亲和素或链霉亲和素化合物。此类标记物的用途对本领域的技术人员为公知，并可参见，例如美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241；其均通过引用结合入本文。这些荧光标记物优选用于体外用途，但也可用于体内用途，特别是内窥镜或血管内检测程序。
在可选实施方案中，抗-HIV抗体或片段可用荧光标志物进行标记。光检测标记物的非限制性实例包括Alexa350、Alexa430、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基胺、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5，6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑)、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、甲亚胺、菁、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、铕三二吡啶二胺、铕穴状化合物或螯合物、二胺、二花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白(allopycocyanin)、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺素、藻红蓝蛋白、藻红蛋白R、REG、若丹明绿、若丹明异硫氰酸酯、若丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、四甲基若丹明和得克萨斯红。这些和其它荧光标记物可获自商业来源，如MolecularProbes(Eugene，OR)。
有用的化学发光标记化合物可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳基吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯或生物发光化合物，如荧光素、荧光素酶和水母素。
在不同的实施方案中，有用的标记物可包含金属纳米粒子。制备纳米粒子的方法为已知(例如，参见美国专利第6,054,495；6,127,120；6,149,868号；Lee和Meisel，J.Phys.Chem.86：3391-3395，1982)。纳米粒子也可获自商业来源(例如，Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)。经过修饰的纳米粒子已实现商业化，如Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)的Nanogold纳米粒子。用于偶合蛋白质或肽的功能化纳米粒子也可通过商业途径购得。
交联剂
在一些实施方案中，抗-HIV抗体或片段或其它HIV靶向分子可使用本领域已知的各种交联试剂进行标记，所述交联试剂如同型双功能、异型双功能和/或光敏交联试剂。所述试剂的非限制性实例包括：双亚氨酸酯；1，5-二氟-2，4-(二硝基苯)；辛二酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯；二琥珀酰亚胺酒石酸酯；二甲基-3，3′-二硫-双丙亚氨酸酯；N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯叠氮化物(nitrophenylazide)；和4-叠氮乙二醛。在示例性实施方案中，碳二亚胺交联剂，如DCCD或EDC可用于将酸性残基交联至氨基或其它基团。此类试剂可进行修饰，以连接不同类型的标记物，如荧光标记物。
双功能交联试剂已广泛用于各种用途。携带两个相同官能团的同型双功能试剂已证明在诱导相同和不同大分子或大分子的亚基之间的交联，以及将多肽配体连接至其特异性结合位点方面非常有效。异型双功能试剂包含两个不同的官能团。通过利用所述两个不同官能团的不同反应活性，可以同时控制交联的选择性和顺序性。所述双功能交联试剂可根据其官能团的特异性进行划分，例如，氨基、巯基、胍基、吲哚、羧基特异性基团。其中，针对自由氨基的试剂由于其已实现商业化、易于合成和它们能够应用的反应条件温和而特别受欢迎。大部分异型双功能交联试剂包含伯胺反应基团和硫醇反应基团。
另一实例描述了异型双功能交联试剂和使用这些交联试剂的方法(美国专利5,889,155，通过引用结合入本文)。所述交联试剂使亲核肼残基和亲电马来酰亚胺残基结合，允许在一个实例中将醛偶联至自由巯基。所述交联试剂可进行修饰以交联不同的官能团。
实施例
下列实施例的并入是为了示范本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，下列实施例中公开的技术代表被发现在实施本发明时表现好的技术，因此可被视为构成实施本发明的优选方式。但是，根据本公开，本领域技术人员应理解，可对本发明公开的具体实施方案进行许多变化并仍得到类似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1.使用偶合的抗-HIV抗体在体外和体内抑制HIV感染
概述
为了证明针对HIV-1的免疫偶合物的效力，将针对HIV的包膜抗原的鼠单克隆抗体(Mab)(P4/D10)与常规抗癌药物阿霉素偶合，并进行针对感染病毒和感染细胞的体外和体内测试。P4/D10抗体与游离病毒(中和)或感染HIV的细胞(抑制)孵育，通过p24捕获酶联免疫吸附分析测量造成的感染。在HIV-1/MuLV小鼠攻击模型中，测量了偶合物在体内抑制感染的能力。
在体外，阿霉素-偶合的P4/D10中和HIV-1IIIB，消除感染的Jurkat细胞中的细胞间传播和HIV复制。其还在比游离抗体需要的浓度低8倍的浓度下保护小鼠免受HIV-1IIIB/MuLV的攻击，而游离药物或无关的偶合物对照则未观察到效果。
这些结果表明，阿霉素被P4/D10抗体集中至感染HIV的细胞，显著(p＝0.0001)促进HIV的消除。相同的组合物和方法可用于根除进行ART(抗逆转录病毒治疗)治疗的患者中残留的表达抗原的T-细胞。
在此研究中，我们将在患者中具有已知的药理学、毒理学和抗癌活性的蒽环类抗癌药物阿霉素，偶合至针对HIV-1外包膜gp120(第三可变环区)而开发的中和性和ADCC-介导性单克隆抗体(Mab)。
测试了偶合至阿霉素的P4/D10抗体在体外从非感染细胞中消除感染HIV-1的细胞的效力，和其在小鼠模型中从腹腔清除感染HIV-1/MuLV(小鼠白血病病毒)的同源细胞的效力。抗-gp120抗体P4/D10中和HIV-1病毒并介导ADCC(Broliden等，1990)。其还以未偶合形式用于晚期HIV-1感染个体的I期临床试验，在所述试验中，其减少HIV抗原持续延长的时段(Hinkula等，1994)。本研究首次在临床前HIV模型中检验了以药物偶合形式组合的P4/D10，并与游离Mab、游离药物和无关抗体hRS7(Stein等，IntJCancer1993，55：938-946)和hLL1Griffiths等，Clin Cancer Res 2003，9：6567-6571；Sapra等，Clin Cancer Res 2005，11：5257-5264)进行了比较，所述无关抗体以相似方式与阿霉素偶合。
材料和方法
抗体和药物偶合。阿霉素与IgG1K抗-gp120抗体P4/D10(Broliden等，1990)和对照抗体的偶合、以及具有马来酰亚胺基团的双功能阿霉素腙衍生物的制备根据Griffiths等(2003)执行。简单而言，终浓度为大约9mg/ml的抗体P4/D10、hLL1(人源化抗-CD74)和hRS7(人源化抗-EGP-1)用DTT(二硫苏糖醇)(PBS(pH7.5)，含有5mM EDTA)进行温和还原，使用大约2.2mM的DTT终浓度，相当于还原剂相对抗体过量38倍。所述溶液在37℃孵育40分钟。还原的Mab用Sephadex G50/80离心柱(spin-column)，含有150mM NaCl和2mM EDTA(pH5.3)的50mM醋酸钠缓冲液纯化。所述抗体上产生的硫醇基团的数量通过Ellman′s分析确定。对于偶合，将温和还原的抗体(6.5mg/ml)与所述双功能阿霉素混合。孵育物在冰上放置15分钟，用G50/80离心柱，0.1M醋酸钠(pH6.5)纯化，然后通过用相同缓冲液平衡的Bio-Beads SM2(Bio-Rad，Hercules，CA)短柱纯化。通过测量吸光度分析产物的阿霉素/Mab替换比率。尺寸排阻HPLC分析在分析型BioSil 250柱上执行。
使用GMP-生产的感染HIV的患者的IgG批次(HIVIgG)(Guay等AIDS2002，16：1391-1400)作为阳性对照，HIV-阴性个体的血清作为阴性对照。包括游离阿霉素，以及抗癌人源化Mab LL1和RS7(以相似方式与阿霉素偶合)以作为偶合的P4/D10抗体的对照。
HIV-1中和分析。阿霉素P4/D10、未标记的P4/D10、HIV免疫球蛋白(HIVIgG)和HIV-阴性血清与所述HIV-1分离物HIV-1IIIB(LAI)混合，在37℃孵育1小时，然后加入50,000个JurkatT-细胞/孔。孵育1小时后，用培养基漂洗细胞并加入新的完全培养基(200μl/孔)。培养7天后，通过p24捕获ELISA(酶联免疫吸附分析)测量产生的p24的量，并计算HIV-1p24产生的抑制百分比。
体外HIV-1抑制。用HIV-1IIIB感染Jurkat T-细胞，方法是将5-10 x 106个细胞与100 x TCID50HIV-1IIIB混合，在37℃孵育1小时。用培养基漂洗所述细胞并在37℃孵育。每三天更换一次培养基并检查上清液中的p24产生。当接近100％的所述细胞被感染时，将不同比例的感染HIV-1IIIB的细胞与未感染细胞混合。用100至0.00001μg/ml系列稀释的抗体、血清或游离阿霉素处理所述细胞。在37℃培养7天后，测量HIV-1p24抑制，收集先前用0.1-10μg/ml阿霉素-P4/D10、未偶合的P4/D10和0.05-0.5mg/mlHIV-阴性血清处理的细胞的上清液，并转移至新鲜的Jurkat T-细胞，以测试培养开始后3、7、10、12和15天能否通过p24ELISA鉴定感染性HIV。
HIV-1/MuLV攻击模型。使用HIV-1IIIB感染遗传整合了MuLV基因组的人T-细胞系CEM-1B，这将导致产生具有HIV-1基因组和MuLV包膜的假病毒(Adang等，PNAS USA 1999，96：12749-753；Hinkula等，Cells TissuesOrgans 2004，177：169-184)。使用这些病毒上清液感染C57B1/6xDBA F1Kb/d小鼠(HLA-A201转基因)的脾细胞。使用感染HIV-1IIIB/MuLV的脾细胞i.p.攻击同基因的小鼠，并立即向其i.p.给予偶合的抗体、游离抗体或游离阿霉素。攻击后10天，处死小鼠并收集腹膜细胞。沉淀腹膜细胞并加入1 x 106个HIV易感的JurkatT-细胞或在24孔板中生长的人PBMC。每3-4天除去这些二级培养物的上清液并加入新鲜培养基。3周内通过p24ELISA测量所述上清液中回收的感染性HIV的量。
统计分析。为了比较抗-gp120Mab和对照抗体的体外HIV-1中和能力，使用了Student t检验和非参数Kruskal-Wallis检验。使用非参数Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis检验执行用不同抗体处理的小鼠组之间的统计比较。当获得<0.05的p值时，认为差异显著。非参数单向ANOVA检验使用GraphPad Prism 4.0a版(GraphPad Software，San Diego，CA)执行，并用于比较研究组之间的HIV-1分离和p24抗原阳性。
结果
所述各个抗体通过温和还原产生的硫醇基团的数量，以及最终的纯化偶合物中阿霉素/Mab替换比率在8.8(P4/D10，hRS7)至9.4(hLL1)范围内，比率为每个IgG替换大约9个药物分子。高压液相层析分析显示所述偶合物和天然Mab具有相似的保留时间，零至最小聚集(数据未显示)。
阿霉素-偶合的P4/D10Mab和未偶合的P4/D10Mab或HIVIgG抗体之间未显示对游离HIV-1病毒(图1A)的HIV-1中和能力的显著差异。但是，所有抗HIV-1特异性抗体在中和HIV-1IIIB方面均显著好于阴性对照血清(p＝0.001)。
当3％感染HIV-1IIIB的Jurkat细胞与97％未感染的细胞混合时，在0.5或0.05μg/ml浓度下，阿霉素-P4/D10介导的对HIV-1感染细胞间传播的抑制显著(p＝0.002)强于游离P4/D10、阿霉素偶合的对照抗体、hLL1或游离阿霉素(图1B)。所有其它浓度的感染和未感染细胞得到了相似的结果。特别值得关注的是，对感染的细胞间传播的抑制甚至比使用阿霉素-P4/D10作为中和试剂时获得的效应更强。此外，用高剂量阿霉素-P4/D10处理的培养物中未发现感染性病毒，因为将这些细胞培养物的上清液转移至未感染的Jurkat细胞后未检测到p24产生(数据未显示)。无法从游离HIV-1病毒的中和结果中预知阿霉素-P4/D10和未偶合的P4/D10之间的效应存在显著差异(图1A)。
为了测试阿霉素-P4/D10抗体在体内的效力，腹腔内给予小鼠同基因的感染HIV/MuLV的细胞和偶合物。10天后收集腹膜细胞，所有对照中均显示感染性HIV，此结果与先前研究的结果相似(Hinkula等，2004)。阿霉素-P4/D10抗体保护小鼠完全抗感染HIV-1的初生淋巴样(lympoid)细胞的攻击(p＝0.0001)(图2)。用100μg阿霉素-P4/D10抗体进行攻击和治疗后的腹膜细胞中未回收到感染性HIV。当用100μg未偶合的P4/D10抗体处理小鼠时，p24产生全部为阳性。抗体单独提供完全保护仅见于当剂量增加8倍，至每只小鼠800μg未偶合的P4/D10时。阿霉素-偶合的对照抗体(hLL1或hPvS7)在100-200μg剂量下，以及100-400μg游离阿霉素剂量均未提供任何保护。
讨论
上述结果显示可通过与阿霉素偶联显著增强抗体针对HIV-1包膜的总病毒抑制特性。阿霉素-P4/D10能够在体外以及实验性体内攻击模型中消除感染HIV-1的细胞。未偶合的P4/D10 Mab介导针对感染HIV-1的靶细胞的ADCC，以及中和HIV-1的能力(Broliden等，1990；Hinkula等，1994)可以无毒的方式增强其作为药物免疫偶合物的效力。
在非常低的剂量下，抗癌的抗-CD74 Mab LL1(以相似方式与阿霉素偶合)在体外和在非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤的人异种移植物模型中显示出非凡的活性(Griffiths等，2003；Sapra等，2005)。这些研究以及猴中的毒理学研究表明只有非常高剂量的免疫偶合物能产生明显的骨髓抑制，但是未观察到与阿霉素相关的心脏毒性(Sapra等，2005)。为了避免病毒逃逸，应同时测试针对HIV可及表位的保守和可变位点的抗体(Trkola等，2005；Ferrantelli等，J Infect Dis 2004，189：2167-2173)。
在先前的体外研究中，偶合至绿脓杆菌外毒素A(PE40)的HIV-1特异性免疫球蛋白清除感染HIV-1的细胞(Pincus等，2003；Ashorn等，Proc NatlAcad Sci USA 1990，87：8889-8893)。但是，在临床试验中，与CD4细胞偶联的PE40证明具有免疫原性和肝毒性(Davey等，1994；Ramachandran等，1994)。因此，本结果显示具有很少或无副作用的阿霉素-Mab偶合物的效力是令人惊讶和出乎意料的。PE40-CD4的毒性可解释为与游离gp120形成毒性复合体，游离gp120以高浓度存在于具有高病毒载量的非ART治疗患者中(Berger等，1998)。为了避免与高病毒载量相关的潜在毒性问题，应优选在病毒负荷低时，如在ART过程中、HIV感染早期或甚至在已知或可能接触HIV感染后立即使用靶向HIV-包膜特异性表位的分子。例如，医务工作人员意外受到含有HIV污染的或可能污染的血液或其它液体的针刺时，可根据本发明公开的方法用偶合的抗体进行治疗。由于阿霉素-P4/D10偶合物的抗细胞活性，向进行ART治疗的患者添加药物偶合物可消除携带抗原的细胞以及游离的病毒粒子，从而可进一步减少病毒载量。熟练的技术人员应理解，本发明要求保护的组合物和方法不限于P4/D10的阿霉素偶合物，而可能利用与P4/D10或与其它已知的抗-HIV抗体的偶合的其它已知的细胞毒剂。
在其它实施方案中，为了避免非特异性毒性，可使用双特异性抗体和其它预靶向策略，其中抗体靶向和毒性试剂的递送是分开的(Wu等，2005)。此策略在临床前和在临床癌症试验中均显示出有希望的结果(Forero等，Blood 2004，104：227-236；Rossi等，Clin Cancer Res 2005，11：7122s-7129s)。对于在人受治疗者中的体内应用，优选人抗体或抗体的人源化形式进行重复的临床应用。
实施例2.治疗接受过ART的感染HIV的患者
一位47岁的男性患者被确定为HIV血清反应阳性。该患者的CD4计数小于200/mm3。使用非核苷逆转录酶抑制剂奈韦拉平的标准方案对该患者进行治疗。CD4细胞计数增加至300/mm3，但是该患者仍为HIV血清反应阳性。使用人源化阿霉素-P4/D10抗体治疗该患者。该患者的CD4计数增加至超过350/mm3，并且该患者不再显示HIV血清反应阳性。一年后，该患者保持无症状，并且未检测到HIV感染的存在。
实施例3.治疗意外被针刺的医务工作人员
一位30岁的从业护士意外受到HIV阳性血液的针刺。在1小时内对该受治疗者进行人源化阿霉素-P4/D10抗体治疗。一年后，该受治疗者无HIV感染迹象。
实施例4.使用其它细胞毒素和/或抗体进行治疗
一位28岁的男性患者被确定为HIV血清反应阳性。该患者的CD4计数小于200/mm3。使用非核苷逆转录酶抑制剂奈韦拉平的标准方案对该患者进行治疗。CD4细胞计数增加至300/mm3，但是该患者仍为HIV血清反应阳性。使用包含人源化4E10 Fab-734 scFv的双特异性抗体治疗该患者，所述双特异性抗体使用美国专利第7,052,872号(通过引用结合入本文)公开的方法制备。注射后24小时孵育用以允许游离的双特异性抗体从循环中清除，然后注射偶合至靶向肽IMP-156(Id.)的5-氟尿嘧啶。该患者的CD4计数增加至超过350/mm3，并且该患者不再显示HIV血清反应阳性。一年后，该患者保持无症状，并且未检测到HIV感染的存在。
实施例5.使用IMP411进行预靶向
一位35岁的男性患者被确定为HIV血清反应阳性。该患者的CD4计数小于180/mm3。使用非核苷逆转录酶抑制剂奈韦拉平的标准方案对该患者进行治疗。CD4细胞计数增加至250/mm3，但是该患者仍为HIV血清反应阳性。使用包含双特异性抗-gp120 P4/D10IgG1 x Fab-679的双特异性抗体治疗该患者，所述双特异性抗体使用美国专利申请序列第11/389,358、11/391,584、11/478,021和11/633,729号(通过引用结合入本文)公开的方法通过DNL技术制备。注射后24小时孵育用以允许游离的双特异性抗体从循环中清除，然后注射偶合至靶向肽IMP-411的SN38。该患者的CD4计数增加至超过325/mm3，并且该患者不再显示HIV血清反应阳性。一年后，该患者保持无症状，并且未检测到HIV感染的存在。
实施例6.抗-HIV抗体的人源化
分离编码针对HIV包膜蛋白的小鼠单克隆抗体的VL和VH区的cDNA，并将其分别重组亚克隆至含有分别编码人抗体K和IgG1的恒定区的基因的哺乳动物表达载体。使用这两个重组DNA共转染哺乳动物细胞，以表达与亲本小鼠Mab具有相同结合和治疗特性的人源化Mab。
将VK和VH DNA的CDR分别重组连接至人VK和VH区的构架(FR)序列，然后将后者分别连接至人κ和IgG1恒定区，以在哺乳动物细胞中进行表达。一般而言，如此处所述，“嵌合”Mab是通过将鼠VK和VH区分别连接或亚克隆至人恒定轻链和重(heay)链形成的，而“人源化”Mab则通过将嵌合Mab中的鼠构架(FR)序列替换为相应的人FR序列而进一步衍生的。如下文所述，可通过用相应的鼠FR氨基酸替换一个或多个人FR氨基酸，特别是接触或靠近CDR氨基酸残基的FR残基，对所述人源化Mab进行进一步的优化。
在不同的实施方案中，可通过计算机建模模拟抗体可变结构域(例如，参见Dion，“Humanization of Monoclonal Antibodies：Molecular Approachesand Applications”(单克隆抗体的人源化：分子方法和应用)，选自Goldenberg等编，Cancer Therapy With Radiolabeled Antibodies(使用放射标记的抗体治疗癌症)，第19章，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1994)，其通过引用结合入本文。一般而言，通过同源性实现对Mab的3-D结构的最好模拟，优选通过鉴定显示与待替换的鼠FR序列具有高(75％以上、优选85％以上、更优选90％以上、更优选95％以上)同源性的人FR序列。只要可能，应进行侧基替换以保持Cα和Cβ之间的扭转角。可使用收敛方法通过AMBER力场(Weiner等，J.Amer.Chem.Soc.106：765，1984)实现能量最小化。可通过初始模拟轻链和重链的可变链确定可能重要的FR-CDR相互作用。因而可确定每个CDR内所有原子4.5埃半径以内的所有鼠FR残基，并将其保留在所述人源化抗体的最终设计模型中。
设计好VK和VH结构域的序列之后，即可通过基因合成实现CDR嫁接，所述基因合成是使用长的合成DNA寡核苷酸作为模板和短的寡核苷酸作为引物在PCR反应中进行的。在大多数情况下，编码VK或VH结构域的DNA为大约350bp长。通过利用密码子简并性，可容易地在靠近V基因DNA序列中部的区域引入独特的限制性位点，而不改变所编码的氨基酸。可通过自动化DNA寡核苷酸合成仪(Cyclone Plus DNA Synthesizer，Milligen-Biosearch)生成所述限制性位点上游和下游大约150bp处的两个长的非重叠单链DNA寡核苷酸。由于可预期到全长DNA寡核苷酸的产量非常低，因此可以通过两对侧翼引物对它们进行PCR反应扩增。
可在所述引物中设计必要的限制性位点以利于后续的亚克隆。低聚物A和低聚物B的引物应在所述限制性位点处含有重叠序列，以便分别得到的低聚物A和B的PCR产物可以在所述限制性位点处进行符合读码框架的连接，以形成编码VH结构域的全长DNA序列(约350bp)。
低聚物A和B的PCR产物的连接和它们向工作载体(staging vector)的合适限制性位点的亚克隆可通过一个三片段连接步骤完成。可首先通过限制酶切消化分析对正确序列亚克隆至所述工作载体进行分析，然后通过测序反应(根据Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463(1977))对其进行确认。
可将含有Ig启动子、先导序列和VH序列的限制性片段从所述工作载体上切下，然后亚克隆至基于pSVgpt的载体的相应位点，所述载体含有形成最终表达载体的人IgG恒定区、Ig增强子和gpt选择标志物基因组序列。VK序列的构建可采用相似的策略。
可通过用适当的核酸内切酶处理将含有Ig启动子、先导序列和抗-HIVVK序列的DNA序列从所述工作载体上切下，然后亚克隆至基于pSVhyg的载体pKh的相应位点，pKh含有形成最终表达载体的人κ链恒定区、潮霉素选择标志物、Ig和κ增强子基因组序列。
由于人源化有时造成抗体亲和性的降低或者甚至损失，因此可能需要其它修饰以恢复原始亲和性(例如，参见Tempest等，Bio/Technology9：266(1991)；Verhoeyen等，Science 239：1534(1988))，其通过引用结合入本文。一般而言，为了制备嵌合抗-HIV Mab，可使用DNA产物和引物通过PCR克隆获得所述抗-HIV Mab的VH和VK链。Orlandi等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1989，86：3833)和Leung等(Biotechniques，1993，15：286)。VK PCR引物可按上述方法亚克隆至基于pBR327的工作载体(VKpBR)。VH PCR产物可按上述方法亚克隆至相似的基于pBluescript的工作载体(VHpBS)。可使用适当的限制性内切酶将含有VK和VH序列，以及启动子和信号肽序列的片段从所述工作载体上切下。VK片段(大约600bp)可按传统方法亚克隆至哺乳动物表达载体(例如，pKh)。pKh是含有人κ恒定区、Ig增强子、κ增强子和潮霉素抗性基因基因组序列的基于pSVhyg的表达载体。相似地，大约800bp的VH片段可亚克隆至pGlg，pGlg是携带人IgG1恒定区、Ig增强子和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)基因的基因组序列的基于pSVgpt的表达载体。所述的两个质粒可通过电穿孔转染哺乳动物表达细胞，如Sp2/O—Ag14细胞，并通过潮霉素抗性进行选择。扩增选择中存活的克隆，通过ELISA方法监控上清液中嵌合抗-HIV Mab的产生。理想的转染效率为大约1-10 x 106个细胞。此系统的抗体表达水平预期为0.10至2.5μg/ml。
可按下述方法执行RNA分离、cDNA合成和扩增。从抗-HIV杂交瘤细胞系中制备总细胞RNA，使用总计大约107个细胞，根据Sambrook等，(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，第二版，Cold Spring Harbor Press，1989)，其通过引用结合入本文。使用传统方法从总RNA逆转录生成第一链cDNA，如通过使用SuperScript预扩增系统(Gibco/BRL.，Gaithersburg，MD)。简单而言，在20μl反应体积中，50ng随机引物可与5μgRNA在下述物质存在下退火：2μl10X合成缓冲液[200mM Tris-HCl(pH8.4)，500mM KCl，25mM MgCl2，1mg/ml BSA]、1μl10mM dNTP混合物、2μl0.1M DTT和200单位SuperScript逆转录酶。延伸步骤开始在室温下进行10分钟，然后在42℃孵育50分钟。将反应混合物在90℃加热5分钟可终止反应。
可通过PCR扩增嵌合或人抗-HIV Mab的VK和VH序列，参见Orlandi等，(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86：3833(1989))，其通过引用结合入本文。VK序列可使用引物CK3BH和VK5-3进行扩增(Leung等，Biotechniques，15：286(1993)，其通过引用结合入本文)，而VH序列可使用引物CH1B和VHIBACK进行扩增，CH1B可与鼠IgG的CH1区退火(Orlandi等，1989)。含有10μl第一链cDNA产物、9μl10X PCR缓冲液[500mM KCl、100mMTris-HCl(pH8.3)、15mM MgCl2和0.01％(w/v)明胶](Perkin Elmer Cetus，Norwalk，Conn.)的PCR反应混合物可进行30个PCR循环。每个PCR循环优选由94℃变性1分钟，50℃退火1.5分钟和72℃聚合1.5分钟组成。扩增的VK和VH片段可在2％琼脂糖(BioRad，Richmond，Calif)上进行纯化。
VK的PCR产物可亚克隆至含有Ig启动子、信号肽序列和方便的限制性位点的工作载体(如基于pBR327的工作载体VKpBR)，以利于VK PCR产物进行符合读码框架的连接。VH的PCR产物可亚克隆至相似的工作载体，如基于pBluescript的VHpBS。含有各自PCR产物的各个克隆可通过例如Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74：5463(1977)(其通过引用结合入本文)的方法进行测序。
所述的两个质粒可共转染合适的细胞，例如，骨髓瘤Sp2/O--Ag14，对克隆进行潮霉素抗性选择，通过例如ELISA分析监控上清液中嵌合或人源化抗-HIV抗体的产生。
可按下述方法执行转染和通过ELISA分析分泌抗体的克隆。可使用大约10μg轻链表达载体和20μg重链表达载体通过电穿孔(BioRad，Richmond，Calif.)转染5 x 106个SP2/O骨髓瘤细胞，参见Co等，J.Immunol，148：1149(1992)，其通过引用结合入本文。转染后，细胞可在96孔微滴定板，完全HSFM培养基(GIBCO，Gaithersburg，Md.)，37℃，5％ CO2下培养。两天后可通过添加潮霉素终浓度为500μg/ml的潮霉素选择培养基(Calbiochem，San Diego，Calif.)开始选择过程。克隆典型地在电穿孔后2-3周出现。然后扩增所述培养物以用于进一步的分析。
分泌嵌合或人源化重链阳性转染瘤克隆可通过ELISA分析鉴定。简单而言，将转染瘤培养物的上清液样品(100μl)加入预涂了羊抗人(GAH)-IgG，F(ab′)2片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pa.)的ELISA微滴定板中，三份重复。平板在室温孵育1小时。用漂洗缓冲液(含有0.05％聚山梨醇酯20的PBS)漂洗三次以除去未结合的蛋白。向孔中加入偶合辣根过氧化物酶(HRP)的GAH-IgG，Fc片段特异性抗体(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)(100μl抗体贮液稀释x104，添加未偶合的抗体至终浓度为1.0μg/ml)。孵育1小时后漂洗所述平板，典型地为三次。向孔中加入反应溶液[100μl，含有167μg邻苯二胺(OPD)(Sigma，St.Louis，MO)、0.025％过氧化氢PBS溶液]。在黑暗条件下显色30分钟。向每个孔中加入50μl 4 N HCl溶液终止反应，然后使用自动化ELISA读取仪(Bio-Tek instruments，Winooski，Vt.)测量490nm处的吸光度。然后根据无关的嵌合抗体标准品(可从Scotgen，Ltd.，Edinburg，Scotland获得)确定结合的嵌合抗体。
可按下述方法从细胞培养基中分离抗体。转染瘤培养适合使用无血清培养基。对于嵌合抗体的生产，使用HSFM在滚瓶中培养细胞(500ml培养物)。将培养物离心，上清液通过0.2微米膜过滤。过滤后的培养基以1ml/分钟的流速通过蛋白A柱(1 x 3cm)。然后用大约10倍柱体积的PBS漂洗树脂，用含有10mM EDTA的0.1M甘氨酸缓冲液(pH3.5)从柱中洗脱结合蛋白A的抗体。使用含有10μl 3 M Tris(pH8.6)的管收集1.0ml组分，根据280/260nm的吸光度确定蛋白浓度。合并峰组分，对PBS透析，然后使用例如Centricon 30(Amicon，Beverly，MA)浓缩抗体。按前述方法通过ELISA确定抗体浓度，使用PBS将其浓度调节至大约1mg/ml。向样品中方便地加入0.01％(w/v)叠氮化钠作为防腐剂。
可通过直接放射免疫分析确定由此分离的小鼠、嵌合和人源化抗体的对比结合亲和性。经确定，所述嵌合和人源化抗-HIV抗体具有与所述小鼠Mab相同的结合特异性和亲和性。
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可在无过量实验下根据本公开制备和实施本发明公开和要求保护的所有组合物和方法。虽然已通过优选实施方案描述了所述组合物和方法，但是对本领域技术人员明显的是，可对本文所述组合物和方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行变化，而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体地，当可获得相同或相似的结果时，某些同时在化学和生理学上相关的试剂可替换本文所述试剂。对本领域技术人员明显的所有此类相似的替换和修饰均被视为在所附权利要求中确定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (57)

1.一种用于在受治疗者中治疗HIV感染的方法，所述方法包括为受治疗者施用针对HIV表面包膜抗原的抗体或其片段，所述抗体或片段偶合至治疗剂，其中与所述偶合的抗体或片段的接触在体内有效减少、消除或防止HIV感染或防止HIV向未感染的细胞的细胞间传播。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂是细胞毒药物、抑制病毒生长剂、毒素、放射性同位素、寡核苷酸、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、小干扰RNA(siRNA)或酶。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂是阿霉素。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述偶合的抗体或片段是阿霉素-P4/D10。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或片段是P4/D10。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述受治疗者是人受治疗者。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述抗体或片段是嵌合、人源化或人抗体或片段。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述偶合的抗体或片段在已知或可能感染HIV后施用至受治疗者。
9.如权利要求8所述的方法，其中已知或可能的感染和为受治疗者施用所述偶合的抗体或片段之间的时间段为小于1小时、1至5小时、小于12小时、1天或更少、2天或更少、1周或更少、或1个月或更少。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述偶合的抗体或片段的施用有效阻止受治疗者的HIV感染。
11.如权利要求6所述的方法，其中所述偶合的抗体或片段在受治疗者用抗-逆转录病毒治疗(ART)来治疗之后施用至所述受治疗者。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述治疗剂是aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮杂胞苷、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯咪胺、多西紫杉醇、放线菌素、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、氟尿嘧啶脱氧核苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、甲基苄肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、司莫司汀、链脲菌素、他莫昔芬、紫杉烷类、红豆衫醇、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶氮芥、万珂、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、豹蛙酶、rapLR1、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、绿脓杆菌内毒素、反义寡核苷酸、干扰RNA、siRNA、聚集体抑制剂或其组合。
13.如权利要求2所述的方法，其中所述放射性同位素选自由下述同位素组成的组：225Ac、211At、212Bi、213Bi、14C、51Cr、36C1、45Ti、57Co、58Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、152Eu、18F、67Ga、68Ga、195mHg、166Ho、3H、111In、123I、124I、125I、131I、52Fe、59Fe、177Lu、191Os、212Pb、32P、33P、142Pr、195mPt、223Ra、186Re、188Re、189Re、47Sc、75Se、111Ag、153Sm、89Sr、35S、161Tb、94mTc、99mTc、86Y、90Y和89Zr。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或片段是双特异性抗体、双特异性抗体片段、scFv、Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、Fv、sFv、scFv、scFv-Fc融合体、单链抗体、二链抗体、三链抗体或四链抗体。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述ART是HAART(高效抗逆转录病毒治疗)。
16.如权利要求11所述的方法，其中所述抗逆转录病毒治疗包括使用施多宁、齐多夫定、替诺福韦、拉米夫定、恩曲他滨、去羟肌苷、阿巴卡韦、司他夫定、奈韦拉平、洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦、福沙那韦、茚地那韦、奈非那韦、沙奎那韦或其组合进行治疗。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或片段是中和抗体或片段。
18.如权利要求2所述的方法，其中所述免疫调节剂选自由细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、白介素、集落刺激因子、干扰素、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、命名为“S1因子”的干细胞生长因子、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21和TNF-α组成的组。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞因子选自由下述细胞因子组成的组：淋巴因子、单核因子、生长因子、人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝细胞生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I和-II、促红细胞生成素(EPO)、骨生成因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、kit配体、FLT-3、血管抑制素、血小板反应素、内皮抑制素、肿瘤坏死因子和LT。
20.如权利要求2所述的方法，其中所述趋化因子选自由RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10组成的组。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述施用是口服、鼻、口腔、吸入、直肠、阴道、局部、原位、皮内、皮下、肌内、腹腔内、动脉内、鞘内或静脉内施用。
22.如权利要求2所述的方法，其中所述放射性同位素是α辐射源或俄歇电子辐射源。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述α辐射源是212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra或225Ac，或其中所述俄歇电子辐射源是111In、125I、67Ga、191Os、193mPt、195mPt或195mHg。
24.一种用于在受治疗者中成像、检测或诊断HIV感染的方法，所述方法包括：
a)为受治疗者施用针对HIV表面包膜抗原的抗体或抗体片段，所述抗体偶合至显像剂；和
b)检测结合至感染HIV的细胞的偶合抗体或片段的存在，其中所述偶合抗体或片段与感染HIV的细胞的结合有效成像、诊断或检测HIV感染在受治疗者中的存在。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述显像剂是放射性同位素、酶、光检测标记物、造影剂、超声标记物或顺磁标记物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述显像剂选自由下述显像剂组成的组：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III)。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述显像剂是18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、45Ti、111In、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、177Lu、32P或188Re。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述显像剂是Alexa 350、Alexa430、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑)、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、甲亚胺、菁、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、铕三二吡啶二胺、铕穴状化合物或螯合物、二胺、二花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺素、藻红蓝蛋白、藻红蛋白R、REG、若丹明绿、若丹明异硫氰酸酯、若丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、四甲基若丹明或得克萨斯红。
29.一种用于在受治疗者中治疗HIV感染的方法，所述方法包括：
a)为受治疗者施用双特异性抗体或其片段，所述双特异性抗体包含一个或多个HIV表面包膜抗原特异的结合位点和一个或多个载体的结合位点；
b)任选地为所述受治疗者施用清除剂；和
c)为所述受治疗者施用偶合至治疗剂的载体，所述载体的所述施用在所述受治疗者中有效减少、消除或防止HIV感染或防止HIV向未感染细胞的细胞间传播。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述治疗剂是细胞毒药物、抑制病毒生长剂、毒素、放射性同位素、寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)或酶。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述治疗剂是阿霉素。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述受治疗者是人受治疗者。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述抗体或片段是嵌合、人源化或人抗体或片段。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述抗体或片段、任选的清除剂和载体在受治疗者用抗逆转录病毒治疗来治疗后施用至所述受治疗者。
35.如权利要求29所述的方法，其中所述治疗剂是aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮杂胞苷、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯咪胺、多西紫杉醇、放线菌素、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、氟尿嘧啶脱氧核苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、甲基苄肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、司莫司汀、链脲菌素、他莫昔芬、紫杉烷类、红豆衫醇、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶氮芥、万珂、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、豹蛙酶、rapLR1、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、绿脓杆菌内毒素、反义寡核苷酸、干扰RNA、siRNA、聚集体抑制剂或其组合。
36.如权利要求30所述的方法，其中所述放射性同位素选自由下述同位素组成的组：225Ac、211At、212Bi、213Bi、14C、51Cr、36Cl、45Ti、57Co、58Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、152Eu、18F、67Ga、68Ga、195mHg、166Ho、3H、111In、123I、124I、125I、131I、52Fe、59Fe、177Lu、191Os、212Pb、32P、33P、142Pr、195mPt、223Ra、186Re、188Re、189Re、47Sc、75Se、111Ag、153Sm、89Sr、35S、161Tb、94mTc、99mTc、86Y、90Y和89Zr。
37.如权利要求29所述的方法，其中所述双特异性抗体或片段包含至少一个scFv、Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、Fv、sFv、scFv-Fc融合体、单链抗体、二链抗体、三链抗体或四链抗体。
38.如权利要求29所述的方法，其中所述双特异性抗体或片段包含至少一个P4/D10抗体或片段。
39.如权利要求29所述的方法，其中所述载体包含一个或多个HSG(组胺-琥珀酰-甘氨酸)部分，并且所述双特异性抗体或片段与HSG结合。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述双特异性抗体或片段包含一个或多个与HSG结合的679抗体或抗体片段。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述载体是DOTA-D-Cys(3-SP-Gly-20-O-SN38)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP-411)。
42.如权利要求29所述的方法，其中所述双特异性抗体或片段包含停靠和锁定(DNL)结构。
43.一种组合物，其包含偶合至治疗剂的抗-HIV抗体或其片段，所述偶合的抗体或其片段在施用至受治疗者时有效减少、消除或防止HIV感染或防止HIV向未感染细胞的细胞间传播。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述受治疗者是人受治疗者。
45.如权利要求43所述的组合物，其中所述偶合的抗体或片段是嵌合、人源化或人抗体或片段。
46.如权利要求43所述的组合物，其中所述抗体或片段是P4/D10。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述偶合的抗体或其片段是阿霉素-P4/D10。
48.如权利要求43所述的组合物，其中所述抗体或片段偶合至aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮杂胞苷、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯咪胺、多西紫杉醇、放线菌素、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、氟尿嘧啶脱氧核苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、甲基苄肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、司莫司汀、链脲菌素、他莫昔芬、紫杉烷类、红豆衫醇、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓泊替康、尿嘧啶氮芥、万珂、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、豹蛙酶、rapLR1、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、绿脓杆菌内毒素、反义寡核苷酸、干扰RNA、siRNA、聚集体抑制剂或其组合。
49.如权利要求43所述的组合物，其中所述抗体或片段偶合至212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、225Ac、32P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、90Y、111Ag、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、188Re、189Re、111In、125I、67Ga、191Os、193mPt、195mPt或195mHg。
50.如权利要求43所述的组合物，其中所述抗体或片段是双特异性抗体、双特异性抗体片段、scFv、Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2、Fv、sFv、scFv、scFv-Fc融合体、单链抗体、二链抗体、三链抗体或四链抗体。
51.如权利要求43所述的组合物，其中所述抗体或片段是中和抗体。
52.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括为受治疗者施用两种或多种抗体或片段，其中每种抗体或片段均与HIV表面包膜抗原结合。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述两种或多种抗体或片段结合相同的HIV表面包膜抗原。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述两种或多种抗体或片段结合不同的HIV表面包膜抗原。
55.如权利要求52所述的方法，其中所述两种或多种抗体或片段与HIV可及表位的保守和可变位点结合。
56.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其片段选自由4E10、2F5、3D6、C37、1ACY、1F58、1GGGC、2G12和X5组成的组。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述抗体或片段是嵌合、人源化或人抗体或片段。
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