JP2005517450A

JP2005517450A - 短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いるＲＮＡ干渉媒介性標的発見および標的評価

Info

Publication number: JP2005517450A
Application number: JP2003569857A
Authority: JP
Inventors: ウスマン，ナシム; ポリスキー，バリー; トンプソン，ジェームズ; ベージェルマン，レオニド
Original assignee: Sirna Therapeutics Inc
Current assignee: Sirna Therapeutics Inc
Priority date: 2002-02-20
Filing date: 2003-02-14
Publication date: 2005-06-16
Also published as: WO2003070966A2; EP1474433A2; AU2003211058A8; WO2003070966A3; AU2003211058A1; US20050142578A1; EP1474433A4

Abstract

本発明は，標的発見に有用な方法および試薬に関する。詳細には，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる小核酸分子，例えば，短干渉核酸（ｓｉＮＡ）短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子，およびｓｉＲＮＡを用いて標的を発見する方法に関する。

Description

本発明は，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，米国特許出願６０／４０２，９９６（２００２年８月１３日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／３５８，５８０（２００２年２月２０日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／３６３，１２４（２００２年３月１１日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／３８６，７８２（２００２年６月６日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ米国特許出願６０／４０６，７８４（２００２年８月２９日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／４０８，３７８（２００２年９月５日出願），Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／４０９，２９３（２００２年９月９日出願），およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許出願６０／４４０，１２９（２００３年１月１５日出願）に基づく優先権を主張する。これらの出願は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。

発明の背景
本発明は，標的発見および標的確認，特にゲノム標的発見および確認に有用な方法および試薬に関する。本発明はまた，細胞においてアクセス可能な標的部位を同定して，遺伝子機能を評価するために，治療的介在のための遺伝子標的を確認するために，および生物学的プロセスに関与する遺伝子等の核酸分子を同定し単離するために，小干渉核酸（ｓｉＮＡ）媒介性ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いる方法に関する。特に，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる小核酸分子，例えば，短干渉核酸（ｓｉＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子，およびｓｉＲＮＡを用いて標的を発見する方法に関する。

以下はＲＮＡｉに関係する関連技術の説明である。この説明は，以下に記載される本発明を理解するためにのみ提供される。この概要は，以下に記載される研究のいずれかが本発明に対する先行技術であると認めるものではない。

ＲＮＡ干渉とは，動物において短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを表す（Ｆｉｒｅｅｔａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物における対応するプロセスは一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと称され，真菌においてはクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは，外来遺伝子の発現を防止するために用いられる進化的に保存された細胞防御メカニズムであると考えられており，異なる叢および門が共通して有している（Ｆｉｒｅｅｔａｌ．，１９９９，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．，１５，３５８）。そのような外来遺伝子発現からの防御は，ウイルス感染または宿主ゲノム中へのトランスポゾン要素のランダムインテグレーションから生ずる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して，相同的一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答により進化してきたのであろう。細胞におけるｄｓＲＮＡの存在は，まだ完全には特性決定されていないメカニズムにより，ＲＮＡｉ応答を引き起こす。このメカニズムは，蛋白質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介性活性化の結果リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断が生ずるインターフェロン応答とは異なるようである。

細胞中に長いｄｓＲＮＡが存在すると，ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは，ｄｓＲＮＡをプロセシングして短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる短い断片のｄｓＲＮＡにすることに関与している（Ｂｅｒｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサー活性から生ずる短干渉ＲＮＡは，典型的には約２１−２３ヌクレオチドの長さであり，約１９塩基対のデュープレックスを含む（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１５，１８８）。ダイサーはまた，翻訳制御における関与が示唆されている保存された構造の前駆体ＲＮＡから２１および２２ヌクレオチドの小さな一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を切り出すことに関与することが示唆されている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒｅｔａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた，一般にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし，これはｓｉＲＮＡデュープレックスのアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は，ｓｉＲＮＡデュープレックスのアンチセンス鎖に相補的な領域の中央部で生ずる（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１５，１８８）。

ＲＮＡｉは種々の系で研究されてきた。Ｆｉｒｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は，Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓにおいて最初にＲＮＡｉを観察した。ＷｉａｎｎｙおよびＧｏｅｔｚ（１９９９，ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌ．，２，７０）は，マウス胚においてｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉを記載する。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は，ｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記載する。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）は，培養哺乳動物細胞，例えばヒト胚性腎臓細胞およびＨｅＬａ細胞において，合成の２１ヌクレオチドＲＮＡのデュープレックスを導入することにより誘導されるＲＮＡｉを記載する。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，ＥＭＢＯＪ，２０，６８７７）は，効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ，構造，化学組成，および配列についてのある種の要件を明らかにした。これらの研究は，２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡデュープレックスは３’末端ジヌクレオチドオーバーハングを含む場合に最も活性であることを示した。さらに，一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシ（２’−Ｈ）または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が破壊されるが，３’末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドを２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）で置換することは許容されることが示された。ｓｉＲＮＡデュープレックスの中心における単一のミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を破壊することが示された。さらに，これらの研究はまた，標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなくガイド配列の５’末端により規定されることを示した（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，ＥＭＢＯＪ．，２０，６８７７）。他の研究は，ｓｉＲＮＡデュープレックスの標的相補鎖の５’−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり，ｓｉＲＮＡの５’−リン酸成分を維持するためにＡＴＰが用いられることを示した（Ｎｙｋａｎｅｎｅｔａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。

２ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡデュープレックスの３’末端ヌクレオチドのオーバーハングしているセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置き換えても，ＲＮＡｉ活性に有害な影響を有しないことが示されている。ｓｉＲＮＡの各末端で４個までのヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置き換えることはよく許容されると報告されているが，デオキシリボヌクレオチドで完全に置換するとＲＮＡｉ活性がなくなる（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，ＥＭＢＯＪ．，２０，６８７７）。さらに，Ｅｌｂａｓｈｉｒら（上掲）はまた，ｓｉＲＮＡを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換すると，ＲＮＡｉ活性が完全に破壊されたことを報告する。Ｌｉら（国際公開ＷＯ００／４４９１４）およびＢｅａｃｈら（国際公開ＷＯ０１／６８８３６）は，ｓｉＲＮＡがリン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに窒素またはイオウ複素原子の少なくとも１つを含むよう修飾することができることを予備的に示唆する。しかし，いずれの出願も，ｓｉＲＮＡ分子においてそのような修飾がどの程度許容されるかを仮定しておらず，そのような修飾ｓｉＲＮＡのそれ以上の指針または実例を提供していない。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら（カナダ特許出願２，３５９，１８０）もまた，ｄｓＲＮＡコンストラクトにおいて二本鎖ＲＮＡ依存性蛋白質キナーゼＰＫＲの活性化を妨げる目的で用いるためのある種の化学的修飾，特に２’−アミノまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド，および２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドを記載する。しかし，Ｋｒｅｕｔｚｅｒらも同様に，ｓｉＲＮＡ分子においてこれらの修飾がどの程度許容されるかについての実例または指針を提供していない。

Ｐａｒｒｉｓｈら（２０００，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，６，１９７７−１０８７）は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて長い（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写産物を用いてｕｎｃ−２２遺伝子を標的とするある種の化学的修飾を試験した。著者らは，Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼによりチオリン酸ヌクレオチド類似体を取り込ませることによりこれらのｓｉＲＮＡ転写産物中にチオリン酸残基を導入すること，および２個のホスホロチオエート修飾塩基を有するＲＮＡもＲＮＡｉとしての有効性を実質的に低下させたことを記載する。さらに，Ｐａｒｒｉｓｈらは，２残基より多いホスホロチオエート修飾は，干渉活性をアッセイすることができないほど大きくインビトロでＲＮＡを不安定化させたことを報告する（同上，１０８１）。著者らはまた，長いｓｉＲＮＡ転写産物中のヌクレオチド糖の２’位におけるある種の修飾を試験して，リボヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置換すると，特にウリジンからチミジンおよび／またはシチジンからデオキシシチジンへの置換の場合に，干渉活性が実質的に減少することを見いだした（同上）。さらに，著者らは，ある種の塩基修飾，例えば，ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖において，ウラシルの代わりに４−チオウラシル，５−ブロモウラシル，５−ヨードウラシル，および３−（アミノアリル）ウラシル，およびグアニンの代わりにイノシンの置換を試験した。４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシル置換は許容されたように見えたが，Ｐａｒｒｉｓｈは，イノシンはいずれの鎖に取り込まれたときにも干渉活性における実質的な減少を生じたことを報告している。Ｐａｒｒｉｓｈはまた，アンチセンス鎖における５−ヨードウラシルおよび３−（アミノアリル）ウラシルの取り込みによっても，ＲＮＡｉ活性が実質的に減少したことを報告している。

より長いｄｓＲＮＡの使用が記載されている。例えば，Ｂｅａｃｈら（国際公開ＷＯ０１／６８８３６）は，内因性ｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を弱めるための特定の方法を記載する。Ｔｕｓｃｈｌら（国際公開ＷＯ０１／７５１６４）は，ショウジョウバエのインビトロＲＮＡｉシステム，およびある種の機能的ゲノム用途およびある種の治療用途に特定のｓｉＲＮＡ分子を用いることを記載する。しかし，Ｔｕｓｃｈｌ（２００１，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，２３９−２４５）は，インターフェロン応答の活性化の危険性のため，遺伝的疾病またはウイルス感染を治癒させるためにＲＮＡｉを用いることができることは疑わしいと述べている。Ｌｉら（国際公開ＷＯ００／４４９１４）は，ある種の標的遺伝子の発現を弱めるために特定のｄｓＲＮＡを用いることを記載する。Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら（国際公開ＷＯ０１／３６６４６）は，ある種のｄｓＲＮＡ分子を用いて哺乳動物細胞において特別の遺伝子の発現を阻害するある種の方法を記載する。Ｆｉｒｅら（国際公開ＷＯ９９／３２６１９）は，遺伝子発現の阻害に用いるためにある種のｄｓＲＮＡ分子を細胞内に導入するための特別の方法を記載する。Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら（国際公開ＷＯ００／０１８４６）は，特定のｄｓＲＮＡ分子を用いて細胞において特別の表現型を与える原因である特定の遺伝子を同定するある種の方法を記載する。Ｍｅｌｌｏら（国際公開ＷＯ０１／２９０５８）は，ｄｓＲＮＡ媒介性ＲＮＡｉに関与する特定の遺伝子の同定を記載する。ＤｅｓｃｈａｍｐｓＤｅｐａｉｌｌｅｔｔｅら（国際公開ＷＯ９９／０７４０９）は，ある種の抗ウイルス剤と組み合わせた特別のｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物を記載する。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（国際公開９９／５３０５０）は，ある種のｄｓＲＮＡを用いて植物細胞における核酸の表現型の発現を減少させるある種の方法を記載する。Ｄｒｉｓｃｏｌｌら（国際公開ＷＯ０１／４９８４４）は，標的生物において遺伝子サイレンシングを促進するのに用いるための特定のＤＮＡコンストラクトを記載する。

他の者は，種々のＲＮＡｉおよび遺伝子サイレンシングシステムを報告している。例えば，Ｐａｒｒｉｓｈら（２０００，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，６，１９７７−１０８７）は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｕｎｃ−２２遺伝子を標的とする特定の化学的に修飾されたｓｉＲＮＡコンストラクトを記載する。Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ（国際公開ＷＯ０１／３８５５１）は，植物においてある種のｄｓＲＮＡを用いてポリコーム遺伝子発現を制御するためのある種の方法を記載する。Ｃｈｕｒｉｋｏｖら（国際公開ＷＯ０１／４２４４３）は，ある種のｄｓＲＮＡを用いて生物の遺伝的特性を改変するある種の方法を記載する。Ｃｏｇｏｎｉら（国際公開ＷＯ０１／５３４７５）は，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａのサイレンシング遺伝子を単離するある種の方法およびその用途を記載する。Ｒｅｅｄら（国際公開ＷＯ０１／６８８３６）は，植物における遺伝子サイレンシングのある種の方法を記載する。Ｈｏｎｅｒら（国際公開ＷＯ０１／７０９４４）は，ある種のｄｓＲＮＡを用いてパーキンソン病のモデルとしてトランスジェニック線虫を用いる薬剤スクリーニングのある種の方法を記載する。Ｄｅａｋら（国際公開ＷＯ０１／７２７７４）は，ショウジョウバエにおけるＲＮＡｉに関連するかもしれないある種のショウジョウバエ由来遺伝子産物を記載する。Ａｒｎｄｔら（国際公開ＷＯ０１／９２５１３）は，ＲＮＡｉを増強する因子を用いて遺伝子抑制を媒介するある種の方法を記載する。Ｔｕｓｃｈｌら（国際公開ＷＯ０２／４４３２１）は，ある種の合成ｓｉＲＮＡコンストラクトを記載する。Ｐａｃｈｕｋら（国際公開ＷＯ００／６３３６４）およびＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎら（国際公開ＷＯ０１／０４３１３）は，ある種のｄｓＲＮＡを用いてある種のポリヌクレオチド配列の機能を阻害するためのある種の方法および組成物を記載する。Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉら（国際公開ＷＯ０２／３８８０５）は，ＲＮＡｉにより同定されたある種のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子を記載する。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら（国際公開ＷＯ０２／０５５６９２，ＷＯ０２／０５５６９３，およびＥＰ１１４４６２３Ｂ１）は，ＲＮＡｉを用いて遺伝子発現を阻害するある種の方法を記載する。Ｇｒａｈａｍら（国際公開ＷＯ９９／４９０２９およびＷＯ０１／７０９４９，およびＡＵ４０３７５０１）は，ベクターから発現されるある種のｓｉＲＮＡ分子を記載する。Ｆｉｒｅら（ＵＳ６，５０６，５５９）は，ＲＮＡｉを媒介するある種のｓｉＲＮＡコンストラクトを用いてインビトロで遺伝子発現を阻害するためのある種の方法を記載する。

Ｌｏｆｑｕｉｓｔら（２００２，米国特許出願２００２００９４５３６）は，ハイスループットゲノム分析のためにポリヌクレオチドライブラリ，ポリヌクレオチドアレイ，および細胞ライブラリを製造するためのある種の方法を記載する。

Ｒｅｅｄら（豪州特許ＡＵ４０３７５０１）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（国際公開ＷＯ９９／５３０５０）；およびＧｒａｈａｍら（国際公開ＷＯ０１／７０９４９）はすべて，ある種の細胞の表現型を変更させるある種のＲＮＡｉ法および試薬を記載する。

発明の概要
本発明は，ゲノム標的発見に有用な方法および試薬を特徴とする。本発明はまた，小干渉核酸（ｓｉＮＡ）媒介性ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して細胞中のアクセス可能な標的部位を同定して，遺伝子機能を評価し，治療的介在について遺伝子標的を評価し，および／または生物学的プロセスに関与する核酸分子，例えば，遺伝子を同定および単離する方法を特徴とする。特に，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる小核酸分子，例えば，短干渉核酸（ｓｉＮＡ）短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子，およびそのような分子を用いて標的を発見する方法を特徴とする。

１つの態様においては，本発明は，１またはそれ以上の核酸分子，例えば，生物学的システムにおいてプロセスに関与する遺伝子を同定する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスが変更されるのに適した条件下で生物学的システムに提供し；（ｂ）プロセスが変更された生物学的システム中に存在するｓｉＮＡコンストラクトを同定し；そして（ｃ）（ｂ）のｓｉＮＡコンストラクトの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定して，生物学的システムにおいてプロセスに関与する１またはそれ以上の核酸分子を同定する，ことを含む。

別の態様においては，本発明は，生物学的システムにおいてプロセスを調節しうる核酸分子を同定する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを，生物学的システムにおいてプロセスを調節するのに適した条件下で該生物学的システムに導入し；そして（ｂ）プロセスが調節された生物学的システムからのｓｉＮＡコンストラクトの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定して，生物学的システムにおいてプロセスを調節しうる核酸分子を同定する，ことを含む。

別の態様においては，本発明は，生物学的システムにおいてプロセスを調節しうるｓｉＮＡコンストラクトを同定する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを調節するのに適した条件下で該生物学的システムに導入し；そしてｂ）プロセスが調節された生物学的システムからのｓｉＮＡコンストラクトを同定する，ことを含む。

１つの態様においては，本発明は，核酸分子または核酸分子のファミリー，例えば，生物学的システムにおいてプロセスに関与する遺伝子を同定する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを変化させるのに適した条件下で該生物学的システムに導入し；（ｂ）プロセスが変化した生物学的システム中に存在するｓｉＮＡコンストラクトまたはｓｉＮＡコンストラクトのファミリーを同定し；そして（ｃ）（ｂ）において同定されたｓｉＮＡコンストラクトまたはｓｉＮＡコンストラクトのファミリーの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定して，生物学的システムにおいてプロセスに関与する核酸分子または核酸分子のファミリーを同定する，ことを含む。

別の態様においては，本発明は，生物学的システムにおいてプロセスを調節しうる核酸分子または核酸分子のファミリーを同定する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを，生物学的システムにおいてプロセスを変化させるのに適した条件下で該生物学的システムに導入し；そして（ｂ）ｓｉＮＡプロセスが変化した生物学的システムからのコンストラクトまたはｓｉＮＡコンストラクトのファミリーの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定して，生物学的システムにおいてプロセスを調節しうる核酸分子または核酸分子のファミリーを同定する，ことを含む。

別の態様においては，本発明は，生物学的システムにおいてプロセスを調節しうるｓｉＮＡコンストラクトまたはｓｉＮＡコンストラクトのファミリーを同定する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを変更させるのに適した条件下で該生物学的システムに導入し；そしてｂ）プロセスが変化した生物学的システムからｓｉＮＡコンストラクトまたはｓｉＮＡコンストラクトのファミリーを同定する，ことを含む。

別の態様においては，本発明は，生物学的システムにおいてプロセスを調節する遺伝子を同定する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを調節するのに適した条件下で生物学的システムに導入し，ここで，各ｓｉＮＡはランダム化されたセンス領域および相補性を有するアンチセンス領域を含み；（ｂ）プロセスが調節された生物学的システムにおいてｓｉＮＡの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定し；そして（ｃ）（ｂ）からのヌクレオチド配列を用いて生物学的システムにおいてプロセスを調節する遺伝子を同定する，ことを含む。

別の態様においては，本発明は，生物学的システムにおいてプロセスを調節する遺伝子を同定する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを調節するのに適した条件下で生物学的システムに導入し，ここで，各ｓｉＮＡは，ランダム化された領域を含み；（ｂ）プロセスが調節された生物学的システムにおいてｓｉＮＡの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定し；そして（ｃ）（ｂ）からのヌクレオチド配列を用いて生物学的システムにおいてプロセスを調節する遺伝子を同定する，ことを含む。

別の態様においては，本発明は，生物学的プロセスに関与する遺伝子を同定する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを変化させるのに適した条件下で生物学的システムに導入し，ここで，各ｓｉＮＡはランダム化されたセンス領域および相補性を有するアンチセンス領域を含み；（ｂ）生物学的プロセスが変化した生物学的システムにおいてｓｉＮＡを同定し；そして（ｃ）工程（ｂ）からのｓｉＮＡの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定して，生物学的プロセスに関与する遺伝子を同定する，ことを含む。

別の態様においては，本発明は，生物学的プロセスに関与する遺伝子を同定する方法を特徴とし，（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを変化させるのに適した条件下で生物学的システムに導入し，ここで，各ｓｉＮＡはランダム化された領域を含み；（ｂ）生物学的プロセスが変化した生物学的システムにおいてｓｉＮＡを同定し；そして（ｃ）工程（ｂ）からのｓｉＮＡの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定して，生物学的プロセスに関与する遺伝子を同定する，ことを含む。

１つの態様においては，本発明は，（ａ）ランダムｓｉＮＡライブラリを，ライブラリからのｓｉＮＡが遺伝子の発現をダウンレギュレートするのに適した条件下で生物学的システムに提供し；（ｂ）生物学的システムにおいて遺伝子発現がダウンレギュレートしたか否かを判定し；（ｃ）（ｂ）の生物学的システムにおいてｓｉＮＡの少なくとも１つの部分のヌクレオチド配列を決定し；そして（ｄ）（ｃ）からのヌクレオチド配列を用いてその発現がダウンレギュレートされた遺伝子を同定することを含む方法を特徴とする。１つの態様においては，本発明により企図されるプロセスは，生物学的プロセス，例えば，限定されないが，細胞成長，増殖，アポトーシス，形態，血管新生，分化，移動，ウイルス増殖，薬剤耐性，シグナル伝達，細胞サイクル制御，形態形成，老化，有糸分裂，減数分裂，温度感受性，化学物質感受性，神経細胞成長，細菌細胞成長，植物細胞成長，ストレス耐性，細胞因子または代謝産物の生合成，ウイルス耐性，細菌耐性，または病原体による感染に対する耐性等のプロセスを含む。

１つの態様においては，本発明の生物学的システムは，細胞，例えば真核生物細胞，またはその抽出物を含み，例えば，限定されないが，哺乳動物細胞，例えば，ヒト細胞，植物細胞，酵母細胞，ショウジョウバエ細胞，または線虫細胞を含む。別の態様においては，生物学的システムは，組織またはその抽出物を含む。別の態様においては，生物学的システムは，生物またはその抽出物を含む。

本発明の１つの態様は，ＲＮＡ干渉により遺伝子の発現をダウンレギュレートする短干渉ＲＮＡ（ｓｉＮＡ）分子を提供し，したがって，定量することができる表現型の変化が得られる。ｓｉＮＡ分子は，本明細書に記載される生物学的プロセスに関与するかまたはこれを制御する配列および／または核酸分子の種類（例えば，遺伝子および遺伝子転写産物）を決定するのに適した条件下で使用することができる。ｓｉＮＡ分子は，二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡを含むことができる。二本鎖または一本鎖ｓｉＮＡは，センス領域およびアンチセンス領域を含むことができる。アンチセンス領域は生物学的プロセスを制御する核酸分子に相補的な配列を含むことができ，センス領域はアンチセンス領域に相補的な配列を含むことができる。

１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，細胞または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する二本鎖ｓｉＮＡ分子であり，ｓｉＮＡ分子は，センス領域およびアンチセンス領域を含み，これらの領域は自己相補的であり，アンチセンス領域は標的核酸配列に対して相補性を有する。１つの態様においては，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は，約３８−約５８ヌクレオチドを有する１本の連続するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は，別々のセンス領域およびアンチセンス領域を含み，各センス領域またはアンチセンス領域は，独立して，約１９−約２９ヌクレオチドを含む。

１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，細胞または再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であって，ｓｉＮＡ分子は，標的核酸配列に対して相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含む。１つの態様においては，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は約１９−約２９ヌクレオチドを含む。

１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡライブラリは，ランダム化されたｓｉＮＡ配列のライブラリを含む。別の態様においては，本発明のランダムｓｉＮＡ分子のライブラリは，ライブラリの任意のメンバーが生物学的システムにおいてプロセスを制御する任意の核酸分子に相補的なアンチセンス配列を有するように，配列複雑性を含む。配列は部分的にランダムであってもよく，完全にランダムであってもよい（例えば，Ｋｅｃｋｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９９／３２６１８を参照）。ｓｉＮＡライブラリは固定された配列長さのものであってもよく，可変の配列長さのものであってもよい。したがって，ライブラリの複雑性の程度は，予め決定されたｓｉＮＡコンストラクト中のヌクレオチドの数によって異なりうる。例えば，それぞれＮ個のヌクレオチドを有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むｓｉＮＡは，４^Nのライブラリ複雑性を有することができ，ここで，Ｎはアンチセンス鎖中のヌクレオチドの数である（４は，本発明の生物学的システムにおいて標的核酸配列中に存在する天然に生ずるヌクレオチド，すなわちＡ，Ｇ，ＣまたはＵに関連する）。非限定的例においては，それぞれ２１ヌクレオチドを有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むｓｉＮＡは，相補的ヌクレオチドのすべての可能な組み合わせがライブラリ中に含まれるように，４²¹のライブラリ複雑性を有することができる。さらに別の態様においては，ライブラリの複雑性は，本発明の標的核酸分子を同定するのに適した条件下で調節することができる。

ｓｉＮＡコンストラクトのランダムライブラリは，前記ｓｉＮＡコンストラクトの発現を可能とする様式で発現ベクターによりコードされるｓｉＮＡコンストラクトを含むことができる。１つの態様においては，発現ベクターは，転写開始領域，転写終止領域，および少なくとも１つのｓｉＮＡをコードする遺伝子を含む。遺伝子は，ｓｉＮＡの発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域および終止領域に動作可能なように連結させることができる。別の態様においては，発現ベクターは，転写開始領域，転写終止領域，オープンリーディングフレームおよび少なくとも１つのｓｉＮＡをコードする遺伝子を含むことができ，ここで，遺伝子は，オープンリーディングフレームの３’末端に動作可能なように連結されている。遺伝子は，ｓｉＮＡの発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域，オープンリーディングフレームおよび終止領域に動作可能なように連結させることができる。別の態様においては，発現ベクターは，転写開始領域，転写終止領域，イントロン，および少なくとも１つのｓｉＮＡをコードする遺伝子を含む。遺伝子は，ｓｉＮＡの発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域，イントロン，および終止領域に動作可能なように連結させることができる。さらに別の態様においては，発現ベクターは，転写開始領域，転写終止領域，イントロン，オープンリーディングフレーム，および少なくとも１つのｓｉＮＡをコードする遺伝子を含み，ここで，遺伝子は，オープンリーディングフレームの３’末端に動作可能なように連結されている。遺伝子は，ｓｉＮＡの発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域，イントロン，オープンリーディングフレームおよび終止領域に動作可能なように連結させることができる。

発現ベクターは，例えば，レトロウイルス，アデノウイルス，アデノ随伴ウイルス，アルファウイルスまたは細菌プラスミド，ならびに他の既知のベクターに由来するものでありうる。発現ベクターは，ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター要素またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター要素に動作可能なように連結させることができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは，例えば，トランスファーＲＮＡ遺伝子，Ｕ６小核ＲＮＡ遺伝子，またはＴＲＺＲＮＡ遺伝子から得ることができる。ｓｉＮＡ転写産物はその５’末端に，Ｕ６小核ＲＮＡ遺伝子によりコードされる末端２７ヌクレオチドと相同な配列を含むことができる。ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリはマルチマーランダムライブラリであってもよい。マルチマーランダムライブラリは少なくとも１つのｓｉＮＡを含むことができる。

本発明のｓｉＮＡは，化学的に合成してもよく，ベクターから発現させてもよく，または酵素的に合成してもよい。

１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は化学的に修飾されており，本発明の方法により同定される標的を評価するために用いられる。そのような化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトはまた，本発明の方法によりまたは他の方法により同定される標的の発現を調節する最適な活性を有する適当な医薬品開発候補を同定するために用いることができる。そのようなコンストラクトは，ハイスループットスクリーニング方法において，標的部位を最適化し，および／または医薬品リードを最適化するために用いることができる。本発明において有用な化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの設計および合成の非限定的例は，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら，米国特許出願６０／３５８，５８０（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。

１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子のセンス領域は３’末端オーバーハングを含む。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は３’末端オーバーハングを含む。別の態様においては，センス領域およびアンチセンス領域の両方が３’末端オーバーハングを含む。１つの態様においては，ｓｉＮＡはｓｉＮＡのセンス領域またはアンチセンス領域，またはセンス領域およびアンチセンス領域の両方において約１−約３ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを含む。１つの態様においては，３’末端オーバーハングはそれぞれ約２ヌクレオチドを含む。１つの態様においては，３’末端ヌクレオチドオーバーハングのアンチセンス領域は標的ＲＮＡに相補的であってもよい。ｓｉＮＡはＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さのものである。ｓｉＮＡはセンス領域およびアンチセンス領域を含むことができ，各領域は約１９−約２３ヌクレオチドの長さを有する。

１つの態様においては，本発明は，少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは哺乳動物細胞，例えば，ヒト細胞中に存在することができる。ｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含むことができる。アンチセンス領域は生物学的システムにおいてプロセスを制御する任意の核酸分子に相補的な配列を含むことができ，センス領域は，アンチセンス領域に相補的な配列を含むことができる。ｓｉＮＡ分子は相補的センスおよびアンチセンス領域を有する２つの別々の鎖を含むことができるか，または相補的センスおよびアンチセンス領域を有する単一の鎖を含むことができる。

したがって，本発明は，短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による遺伝子発現の調節による標的発見に有用な，化合物，組成物，および方法に関し，遺伝子は，例えば生物学的プロセスに関連する遺伝子である。特に，本発明は，生物学的プロセスに関連する遺伝子の発現を調節して，既知の配列の機能を決定するか，または特定の表現型に関連する核酸分子の配列を決定するｓｉＮＡ分子および方法を特徴とする。

１つの態様においては，本発明は，独立してまたは組み合わせて，特定の表現型に関連するかまたは生物学的システムにおいて特定のプロセスを制御する遺伝子の発現を調節する１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子および方法を特徴とする。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡコンストラクトによる遺伝子発現の調節に関連して観察される表現型の変化は，生物学的システム中に存在する特定の核酸分子の機能および／または配列を決定するために用いられる。

１つの態様においては，本発明は，細胞ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし，ｓｉＮＡ分子は標的ＲＮＡに相補的な配列（例えばアンチセンス配列）を含む。

１つの態様においては，ＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング応答のメディエータとして作用する本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ）は二本鎖ＲＮＡ分子である。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，約１９−約２５（例えば，約１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド間に約１９塩基対を含むデュープレックスから構成される。さらに別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，１−３（例えば，１，２，または３）ヌクレオチドのオーバーハングしている末端を有するデュープレックス，例えば，１９塩基対および２ヌクレオチド３’−オーバーハングを有する２１ヌクレオチドデュープレックスを含む。アンチセンス鎖中のこれらのヌクレオチドオーバーハングは任意に標的配列に相補的であってもよい。

１つの態様においては，ＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング応答のメディエータとして作用する本発明の核酸分子（例えば，ｓｉＮＡ）は一本鎖ＲＮＡ分子である。別の態様においては，本発明の一本鎖核酸分子（例えば，ｓｉＮＡ）は約１９−約２５（例えば，約１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）ヌクレオチドを含む配列から構成される。

１つの態様においては，ＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング応答のメディエータとして作用する本発明の核酸分子（例えば，ｓｉＮＡ）は，ステム−ループ構造を有する一本鎖ＲＮＡ分子である。ステムはｓｉＮＡの自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を含むことができ，例えば，各センス領域およびアンチセンス領域は，独立して，約１９−約２５ヌクレオチド（例えば，約１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５ヌクレオチド）を含む。ｓｉＮＡのループ部分は，約２−約１０またはそれ以上のヌクレオチド（例えば，約２，３，４，５，６，７，８，９，１０，またはそれ以上のヌクレオチド）を含む。さらに，ｓｉＮＡステム／ループコンストラクトのステム部分はまた，約１−約４またはそれ以上のヌクレオチド（例えば，約１，２，３，４，またはそれ以上のヌクレオチド）を有する３’−オーバーハングを含むことができる。

別の態様においては，本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は，例えばｓｉＮＡ分子のループ部分が生物分解性であるステムループモチーフを含む。例えば，本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子のループ部分がインビボで分解されて３’−オーバーハング（例えば約２ヌクレオチドを含む３’−オーバーハング）を有するか，あるいはオーバーハングを有しない二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成するように設計される。

別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は環状核酸分子を含み，例えば，ｓｉＮＡは，約１８−約２３（例えば，約１８，１９，２０，２１，２２，または２３）塩基対を有する約３８−約７０（例えば，約３８，４０，４５，５０，５５，６０，６５，または７０）ヌクレオチドの長さである。例えば，本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，約４２−約５０（例えば，約４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，または５０）ヌクレオチドを有する環状オリゴヌクレオチドを含み，環状オリゴヌクレオチドは１９塩基対および２つのループを有するダンベル形の構造を形成する。

別の態様においては，本発明の環状ｓｉＮＡ分子は２つのループモチーフを含み，ｓｉＮＡ分子の一方または両方のループ部分は生物分解性である。例えば，本発明の環状ｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子のループ部分がインビボで分解されて３’−オーバーハング，例えば，約２ヌクレオチドを含む３’−オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成するように設計される。

本発明のｓｉＮＡ分子は，種々のＲＮＡ分子を標的とするＲＮＡｉにより遺伝子の発現が阻害されるよう設計することができる。１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子に対応する種々のＲＮＡを標的とするよう用いられる。そのようなＲＮＡの非限定的例には，メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ），標的遺伝子の選択的ＲＮＡスプライシング変種，標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ，標的遺伝子のプレ−ｍＲＮＡ，および／またはＲＮＡテンプレートが含まれる。選択的スプライシングにより，適当なエクソンの使用により区別される転写産物のファミリーが生ずる場合には，本発明は，適当なエクソンにより遺伝子発現を阻害して，遺伝子ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害するかまたはその間を区別するために用いることができる。例えば，選択的スプライシングされた貫膜ドメインを含む蛋白質を，膜結合型および分泌型の両方の形で発現させることができる。本発明を用いて貫膜ドメインを含むエクソンを標的とすることにより，分泌型の蛋白質に対して，膜結合型の薬学的ターゲティングの機能的重要性を判定することができる。これらのＲＮＡ分子を標的とすることに関連する本発明の用途の非限定的例には，治療的医薬用途，医薬の発見用途，分子診断および遺伝子機能用途，および遺伝子マッピング，例えば本発明のｓｉＮＡ分子を用いる単一ヌクレオチド多型のマッピングが含まれる。そのような用途は，既知の遺伝子配列を用いて，または発現配列タグ（ＥＳＴ）から入手可能な部分配列から実行することができる。

別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，遺伝子ファミリーに対応する保存配列を標的とするために用いられる。そのように，多くの遺伝子標的を標的とするｓｉＮＡ分子は，増加した治療効果を提供することができる。さらに，ｓｉＮＡは，種々の応用法において遺伝子機能の経路を特性決定するために用いることができる。例えば，本発明を用いて，経路における標的遺伝子の活性を阻害して，遺伝子機能分析，ｍＲＮＡ機能分析，または翻訳分析において，特性決定されていない遺伝子の機能を決定することができる。本発明は，医薬開発に向けて，種々の疾病および健康状態に関与する可能性のある標的遺伝子経路を決定するために用いることができる。本発明は，発生，例えば出生前発生，出生後発生および／または加齢に関与する遺伝子発現の経路を理解するために用いることができる。

１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。関連する遺伝子は，典型的には互いにある程度の配列ホモロジーを共有することができるため，異なる標的遺伝子の間で共有されているか，または特定の標的遺伝子に独特の配列を選択することにより，一群の標的遺伝子または特定の標的遺伝子を標的とするようｓｉＮＡ分子を設計することができる。したがって，１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子は，１つのｓｉＮＡ分子でいくつかの遺伝子または遺伝子ファミリー（例えば，スプライシング変種，変異体遺伝子等）を標的とするように，いくつかの標的遺伝子の間でホモロジーを有するＲＮＡ配列の保存領域を標的とするよう設計することができる。別の態様においては，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を媒介するためには高度の特異性を必要とするため，ｓｉＮＡ分子は特定のＲＮＡ配列に独特の配列を標的とするよう設計することができる。１つの態様においては，本発明は，（ａ）予め決定された複雑性，例えば４^N（Ｎは，ｓｉＮＡコンストラクトの鎖のそれぞれにおいて塩基対形成したヌクレオチドの数を示し，例えば，１９塩基対を有する２１ヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を有するｓｉＮＡコンストラクトについては，複雑性は４¹⁹となる）を有するランダム化されたｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生成し；そして（ｂ）標的ＲＮＡ配列中のＲＮＡｉ標的部位を決定するのに適した条件下で，上述の（ａ）のｓｉＮＡコンストラクトをアッセイする，の各工程を含む方法を特徴とする。別の態様においては，（ａ）のｓｉＮＡ分子は，固定された長さ，例えば約２３ヌクレオチドの長さの鎖を含む。さらに別の態様においては，（ａ）のｓｉＮＡ分子は異なる長さのものであり，例えば，約１９−約２５（例えば，約１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）ヌクレオチドの長さの鎖を有する。さらに別の態様においては，アッセイは，本明細書に記載されるような，再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。別の態様においては，アッセイは，標的ＲＮＡが発現されている細胞培養系を含むことができる。別の態様においては，ＲＮＡのフラグメントを，例えば，ゲル電気泳動，ノザンブロット分析，またはＲＮＡｓｅ保護アッセイにより検出可能なレベルの切断について分析して，標的ＲＮＡ配列中の最も適当な標的部位を決定する。別の態様においては，標的配列は，当該技術分野において知られるように，例えば，クローニングおよび／またはインビトロ系については転写により，インビボ系においては細胞発現により，得ることができる。

別の態様においては，本発明は，（ａ）遺伝子によりコードされるＲＮＡ標的の配列を分析し；（ｂ）（ａ）のＲＮＡの１またはそれ以上の領域に相補的な配列を有する１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子を合成し；そして（ｃ）標的ＲＮＡ配列中のＲＮＡｉ標的を決定するのに適した条件下で（ｂ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする，の各工程を含む方法を特徴とする。別の態様においては，（ｂ）のｓｉＮＡ分子は，固定された長さ，例えば約２３ヌクレオチドの長さの鎖を有する。別の態様においては，（ｂ）のｓｉＮＡ分子は，異なる長さ，例えば，約１９−約２５（例えば，約１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５）ヌクレオチドの長さの鎖を有する。さらに別の態様においては，アッセイは，本明細書に記載されるような再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含んでいてもよい。別の態様においては，アッセイは，標的ＲＮＡが発現されている細胞培養系を含むことができる。標的ＲＮＡのフラグメントを，検出可能なレベルの切断について，例えばゲル電気泳動，ノザンブロット分析，またはＲＮＡｓｅ保護アッセイにより分析して，標的ＲＮＡ配列中の最も適当な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は，当該技術分野において知られるようにして，例えば，クローニングおよび／またはインビトロ系については転写により，インビボ系においては発現により，得ることができる。

"標的部位"とは，アンチセンス領域中に標的配列に相補的な配列を含むｓｉＮＡコンストラクトにより媒介される切断の"標的とされる"，標的ＲＮＡ中の配列を意味する。

"検出可能なレベルの切断"とは，標的ＲＮＡのランダム分解から生成するＲＮＡのバックグラウンドから切断産物を識別するのに十分な程度の標的ＲＮＡの切断（および切断産物ＲＮＡの形成）を意味する。当業者に知られるほとんどの検出方法について，標的ＲＮＡの１−５％から切断産物が生成すれば，バックグラウンドから検出するのに充分である。

１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む組成物を特徴とする。別の態様においては，本発明は，１またはそれ以上の遺伝子を標的とし，化学的に修飾されていてもよい本発明の１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む組成物を特徴とする。別の態様においては，本発明は，被験者において疾病または健康状態を治療または予防する方法を特徴とし，該方法は，被験者における疾病または健康状態の治療または予防に適した条件下で，被験者に本発明の組成物を単独でまたは１またはそれ以上の他の治療用化合物と併用して投与することを含む。さらに別の態様においては，本発明は，被験者において組織拒絶を低減または予防する方法を特徴とし，該方法は，被験者における組織拒絶の低減または予防に適した条件下で被験者に本発明の組成物を投与することを含む。

別の態様においては，本発明は，遺伝子標的を評価する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾されていてもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方は標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；（ｂ）生物学的システムにおいて標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，ｓｉＮＡ分子を生物学的システムに導入し；そして（ｃ）生物学的システムにおける表現型変化をアッセイすることにより，遺伝子の機能を決定する，ことを含む。

別の態様においては，本発明は，遺伝子標的を評価する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，これは化学的に修飾されていてもよく，ｓｉＮＡ鎖は標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；（ｂ）生物学的システムにおける標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で，ｓｉＮＡ分子を生物学的システムに導入し；そして（ｃ）生物学的システムにおける表現型の変化をアッセイすることにより，遺伝子の機能を決定する，ことを含む。

遺伝子標的を評価するための本発明の方法の１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子は一本鎖である。本発明の方法の別の態様においては，ｓｉＮＡ分子は二本鎖である。本発明の方法において用いられるｓｉＮＡ分子は，例えば，本明細書に記載されるように，化学的に修飾してもよい。本発明の方法の生物学的システムは，例えば，細胞，組織，または生物，またはそれらの抽出物でありうる。

１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子を含むキットを特徴とし，これは生物学的システムにおいて標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。別の態様においては，本発明は，化学的に修飾されていてもよい２以上の本発明のｓｉＮＡ分子を含むキットを特徴とし，これは，生物学的システムにおいて２以上の標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。

１つの態様においては，本発明は，化学的に修飾されていてもよい本発明の１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子を含む細胞を特徴とする。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子を含む細胞は哺乳動物細胞である。さらに別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子を含む細胞はヒト細胞である。

本発明は，単独で，またはインビトロまたはインビボでＲＮＡを試験サンプルおよび／または被験者に導入するのに必要な試薬の少なくとも１つを有するキットの成分として，用いることができる。例えば，キットの好ましい成分には，ｓｉＮＡおよびｓｉＮＡの導入を促進するベヒクルが含まれる。そのようなキットはまた，キットのユーザが本発明を実施できるようにするための指針を含むことができる。

"生物学的システム"とは，生物起源，例えば，限定されないが，ヒト，動物，植物，昆虫，細菌，ウイルスまたは他の起源からの，精製されたまたは精製されていない形の物質を意味し，ここで，システムはＲＮＡｉ活性に必要な成分を含む。"生物学的システム"との用語は，細胞，組織，または生物，またはそれらの抽出物を含むことができる。生物学的システムとの用語にはまた，インビトロの設定で用いることができる再構成されたＲＮＡｉ系が含まれる。

"表現型変化"とは，本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ）との接触または処理に応答して生ずる任意の検出可能な細胞の変化を意味する。そのような検出可能な変化には，限定されないが，形状，サイズ，増殖，運動性，蛋白質発現またはＲＮＡ発現，または当該技術分野において知られる方法によりアッセイすることができる他の物理学的または化学的変化が含まれる。検出可能な変化にはまた，グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等のレポーター遺伝子／分子，または発現された蛋白質を同定するために用いられる種々のタグ，またはアッセイすることができる任意の他の細胞成分の発現が含まれる。

本明細書において用いる場合，"短干渉核酸"，"ｓｉＮＡ"，"短干渉ＲＮＡ"，"ｓｉＲＮＡ"，"短干渉核酸分子"，"短干渉オリゴヌクレオチド分子"，または"化学的に修飾された短干渉核酸分子"との用語は，配列特異的様式でＲＮＡ干渉（"ＲＮＡｉ"）または遺伝子サイレンシングを媒介しうる任意の核酸分子を表す（例えば，Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ０１／３６６４６；Ｆｉｒｅ，国際公開ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ００／０１８４６；ＭｅｌｌｏａｎｄＦｉｒｅ，国際公開ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際公開ＷＯ９９／０７４０９；およびＬｉｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ００／４４９１４；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅｅｔａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌｅｔａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；ＨｕｔｖａｇｎｅｒａｎｄＺａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓｅｔａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔｅｔａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；およびＲｅｉｎｈａｒｔ＆Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照）。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的例は，本明細書の図２に示される。例えば，ｓｉＮＡは，自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってもよく，ここで，アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ，ここで一方の鎖はセンス鎖であり，他方はアンチセンス鎖であり，アンチセンス鎖およびセンス鎖は自己相補的であり（すなわち，各鎖は，他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む）；アンチセンス鎖は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。あるいは，ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立ててもよく，ここで，ｓｉＮＡの自己相補的センス領域およびアンチセンス領域は，核酸系または非核酸系のリンカーにより連結されている。ｓｉＮＡは，自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよく，ここで，アンチセンス領域は別の標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は，標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは２またはそれ以上のループ構造および自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく，ここで，アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し，環状ポリヌクレオチドは，インビボまたはインビトロでプロセシングされて，ＲＮＡｉを媒介しうる活性なｓｉＮＡ分子を生ずることができる。ｓｉＮＡはまた，標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでいてもよく（例えば，そのようなｓｉＮＡ分子がｓｉＮＡ分子中に標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない場合），ここで，一本鎖ポリヌクレオチドはさらに末端リン酸基，例えば５’−リン酸（例えば，Ｍａｒｔｉｎｅｚｅｔａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚｅｔａｌ．，２００２，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照），または５’，３’−二リン酸を含んでいてもよい。ある態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子の発現の阻害が引き起こされるように，標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書において用いる場合，ｓｉＮＡ分子はＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく，化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも包含する。ある態様においては，本発明の短干渉核酸分子は２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠失している。本出願人は，ある態様において，ＲＮＡｉを媒介するために２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としない短干渉核酸を記載する。すなわち，本発明の短干渉核酸分子は，任意にリボヌクレオチド（例えば，２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし，ＲＮＡｉを支持するためにｓｉＮＡ分子中にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなｓｉＮＡ分子は，２’−ＯＨ基を有する１またはそれ以上のヌクレオチドを含む，結合したリンカーまたは他の結合しているかまたは会合している基，成分，または鎖を有することができる。任意に，ｓｉＮＡ分子は，ヌクレオチド位置の約５，１０，２０，３０，４０，または５０％にリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の修飾短干渉核酸分子はまた，短干渉修飾オリゴヌクレオチド"ｓｉＭＯＮ"と称される。本明細書において用いる場合，ｓｉＮＡとの用語は，配列特異的ＲＮＡｉを媒介しうる核酸分子を記述するために用いられる他の用語，例えば，短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ），短干渉オリゴヌクレオチド，短干渉核酸，短干渉修飾オリゴヌクレオチド，化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ，転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ），および他のものと同等であることを意味する。さらに，本明細書において用いる場合，ＲＮＡｉとの用語は，配列特異的ＲＮＡ干渉を記述する他の用語，例えば転写後遺伝子サイレンシング，または後成遺伝学（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）と同等であることを意味する。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子を用いて，転写後レベルまたは転写前レベルの両方で後成的に遺伝子をサイレンシングさせることができる。非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的制御は，クロマチン構造のｓｉＮＡ媒介性修飾により生じて遺伝子発現を変化させることができる（例えば，Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅｅｔａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌｅｔａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。

"センス領域"とは，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対する相補性を有する，ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに，ｓｉＮＡ分子のセンス領域は，標的核酸配列とホモロジーを有する核酸配列を含むことができる。

"アンチセンス領域"とは，標的核酸配列に対する相補性を有する，ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は，ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対する相補性を有する核酸配列を任意に含むことができる。

“ｓｉＮＡコンストラクトのファミリー”とは，少なくとも１つの共通の特性，例えば，配列ホモロジー，標的特異性，作用のモード，二次構造，または生物学的システムにおいて１つのプロセスまたは２以上のプロセスを調節する能力を共有する２以上のｓｉＮＡコンストラクトの群を意味する。

“核酸分子のファミリー”とは，少なくとも１つの共通の特性，例えば，配列ホモロジー，標的特異性，作用のモード，二次構造，または生物学的システムにおいて１つのプロセスまたは２以上のプロセスを調節する能力を共有する２以上の核酸分子の群を意味する。

"調節する"とは，遺伝子の発現，または１またはそれ以上の蛋白質または蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡ分子または同等のＲＮＡ分子のレベル，または蛋白質または蛋白質サブユニットの１またはそれ以上の活性が，発現，レベル，または活性が，調節剤の非存在下で観察されるより高いかまたは低いように，アップレギュレートまたはダウンレギュレートされることを意味する。例えば，"調節する"との用語は，"阻害する"ことを意味しうるが，"調節する"との用語の使用はこの定義には限定されない。例えば，“調節する”とは，直接的または間接的な作用メカニズムのいずれかによる活性化を表すこともできる。

"阻害する"とは，遺伝子発現産物の活性または１またはそれ以上の遺伝子産物をコードするＲＮＡまたは同等のＲＮＡのレベルが，本発明の核酸分子の非存在下において観察されるレベルより減少することを意味する。１つの態様においては，ｓｉＮＡ分子による阻害は，好ましくは，ＲＮＡｉ応答を媒介することができない不活性または減弱化分子の存在下で観察されるレベルより低い。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の阻害は，ｓｉＮＡ分子の存在下において，存在しない場合よりも大きい。

"遺伝子"または"標的遺伝子"とは，ＲＮＡをコードする核酸を意味し，例えば，限定されないが，ポリペプチドをコードする構造遺伝子などの核酸配列が含まれる。標的遺伝子は，細胞に由来する遺伝子，内因性遺伝子，トランスジン，または外来遺伝子，例えば，病原体（例えばウイルス）の感染後に細胞中に存在する病原体の遺伝子でありうる。標的遺伝子を含有する細胞は，任意の生物，例えば，植物，動物，原生動物，ウイルス，細菌または真菌に由来するかその中に含まれうる。植物の非限定的例には，単子葉植物，双子葉植物，または裸子植物が含まれる。動物の非限定的例には脊椎動物または無脊椎動物が含まれる。真菌の非限定的例には糸状菌または酵母が含まれる。

"高度に保存された配列領域"とは，標的遺伝子中の１またはそれ以上の領域のヌクレオチド配列が，１つの世代と他の世代とで，または１つの生物学的システムと他の生物学的システムとで有意に相違しないことを意味する。

"相補性"または"相補的"とは，核酸が，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタイプの相互作用のいずれかにより，別の核酸配列と水素結合を形成しうることを意味する。本発明の核酸分子に関して，核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは，核酸の適切な機能，例えば，ＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分なものである。例えば，ｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の相補性の程度は，ｓｉＮＡのアンチセンス鎖と標的ＲＮＡ配列との間の相補性の程度と同じであってもよく，異なっていてもよい。ｓｉＮＡデュープレックスのアンチセンス鎖中に点突然変異を含み，標的配列に対する相補性が１００％より小さいことは，これらの変化がアンチセンスｓｉＮＡの３’末端と中程に位置している場合には許容されない（ｓｉＮＡ活性を完全に破壊する）と報告されているが，一方，アンチセンスｓｉＮＡ鎖の５’末端近くの変異は低い程度のＲＮＡｉ活性を示すことができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，２０，６８７７−６８８８）。核酸分子についての結合自由エネルギーの決定は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｔｕｒｎｅｒｅｔａｌ．，１９８７，ＣＳＨＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒｅｔａｌ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照）。相補性のパーセンテージは，核酸分子中の，第２の核酸配列と水素結合（例えば，ワトソン−クリック塩基対形成）を形成しうる連続する残基のパーセンテージを示す（例えば，１０塩基中の５，６，７．８，９，１０塩基は，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，および１００％の相補性である）。"完全な相補性"とは，核酸配列の連続する残基がすべて第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。

本発明の１つの態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子の各配列は，独立して，約１８−約２４ヌクレオチドの長さであり，特定の態様においては，約１８，１９，２０，２１，２２，２３，または２４ヌクレオチドの長さである。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡデュープレックスは，独立して，約１７−約２３（例えば，約１７，１８，１９，２０，２１，２２または２３）塩基対を含む。さらに別の態様においては，ヘアピンまたは環状構造を含む本発明のｓｉＮＡ分子は，約３５−約５５（例えば，約３５，４０，４５，５０または５５）ヌクレオチドの長さであるか，または約３８−約４４（例えば，約３８，３９，４０，４１，４２，４３または４４）ヌクレオチドの長さであり，約１６−約２２（例えば，約１６，１７，１８，１９，２０，２１または２２）塩基対を含む。

本明細書において用いる場合，"細胞"は，その通常の生物学的意味で用いられ，多細胞生物全体を指さず，特にヒトを指さない。細胞は生物中で，例えば，哺乳動物，例えばヒト，ウシ，ヤギ，無尾サル，有尾サル，ブタ，イヌおよびネコ中で存在することができる。細胞は，真核生物（例えば哺乳動物細胞）でありうる。細胞は体細胞起源でも生殖細胞系起源でもよく，全能細胞でも多能性細胞でもよく，分裂していても分裂していなくてもよい。細胞はまた，配偶子または胚，幹細胞，または完全に分化した細胞に由来するか，またはこれらを含むものであってもよい。

本発明のｓｉＮＡ分子は，直接加えてもよく，またはカチオン性脂質と複合体化して，リポソーム中に封入して，または他の方法により，標的細胞または組織にデリバリーすることができる。核酸または核酸複合体は，関連する組織にエクスビボで，または注射，注入ポンプまたはステントを用いてインビボで，バイオポリマー中に取り込ませてまたは取り込ませずに，局所的に投与することができる。

別の観点においては，本発明は本発明の１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供する。１またはそれ以上のｓｉＮＡ分子は，独立して，同じまたは異なる部位を標的とすることができる。

"ＲＮＡ"とは，少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。"リボヌクレオチド"とは，β−Ｄ−リボフラノース成分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は，二本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＲＮＡ，単離されたＲＮＡ，例えば部分的に生成されたＲＮＡ，本質的に純粋なＲＮＡ，合成ＲＮＡ，組換え的に製造されたＲＮＡ，ならびに１またはそれ以上のヌクレオチドの付加，欠失，置換および／または変更により天然に生ずるＲＮＡと異なるように変更されたＲＮＡを含む。そのような変更は，非ヌクレオチド物質の付加，例えば，ｓｉＮＡの末端または内部（例えばＲＮＡの少なくとも１またはそれ以上のヌクレオチド）への付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた，標準的ではないヌクレオチド，例えば，天然に生じないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含むことができる。これらの変更されたＲＮＡは，類似体または天然に生ずるＲＮＡの類似体と称することができる。

"被験者"とは，外植された細胞のドナーまたはレシピエントである生物または細胞それ自体を意味する。"被験者"とはまた，本発明の核酸分子を投与することができる生物を表す。１つの態様においては，被験者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。別の態様においては，被験者はヒトまたはヒト細胞である。

１つの態様においては，本発明は，本発明の少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を，そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とするように含む発現ベクターを特徴とする。例えば，ベクターは，デュープレックスを含むｓｉＮＡ分子の両方の鎖をコードする配列を含むことができる。ベクターはまた，自己相補的でありしたがってｓｉＮＡ分子を形成する１つの核酸分子をコードする配列を含むことができる。そのような発現ベクターの非限定的例は，Ｐａｕｌｅｔａｌ．，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；ＭｉｙａｇｉｓｈｉａｎｄＴａｉｒａ，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅｅｔａｌ．，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；およびＮｏｖｉｎａｅｔａｌ．，２００２，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅｏｎｌｉｎｅｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。

別の態様においては，本発明は，本発明の発現ベクターを含む哺乳動物細胞，例えば，ヒト細胞を特徴とする。

１つの態様においては，本発明の発現ベクターは，２またはそれ以上のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含み，これらは同じであっても異なっていてもよい。

本発明の別の観点においては，標的ＲＮＡ分子と相互作用して，標的ＲＮＡ分子をコードする遺伝子をダウンレギュレートするｓｉＮＡ分子は，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベクターは，ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターでありうる。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターは，本明細書に記載されるようにデリバリーされ，標的細胞中に残留する。あるいは，ｓｉＮＡ分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，ｓｉＮＡ分子は結合してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子機能または発現をダウンレギュレートする。ｓｉＮＡを発現するベクターのデリバリーは，全身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），被験者から外植された標的細胞に投与した後，被験者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる。

“ベクター”とは，所望の核酸をデリバリーするために用いられる核酸および／またはウイルスに基づく任意の手法を意味する。本発明の他の特徴および利点は，本発明の好ましい態様の以下の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。

図面の簡単な説明
図１は，ＲＮＡｉに含まれる標的ＲＮＡ分解の非限定的な提唱されるメカニズムを示す概略図である。例えば，ウイルス，トランスポゾン，または他の外因性ＲＮＡから生成した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がＤＩＣＥＲ酵素を活性化し，次にこれは末端リン酸基（Ｐ）を有するｓｉＮＡデュープレックスを生成する。活性なｓｉＮＡ複合体が形成され，これは標的ＲＮＡを認識して，ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体により標的ＲＮＡが分解されるか，またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により追加のＲＮＡが合成され，これはＤＩＣＥＲを活性化して，さらに別のｓｉＮＡ分子を生成し，このことによりＲＮＡｉ応答が増幅される。

図２は，本発明の種々のｓｉＮＡコンストラクトの非限定的例を示す。示される例（コンストラクト１，２，および３）は，代表的な１９塩基対を有する。しかし，本発明の種々の態様は，本明細書に記載される任意の数の塩基対を含む。括弧内の領域は，例えば約０，１，２，３，または４ヌクレオチドの長さ，好ましくは約２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングを示す。コンストラクト１および２は，別々に用いてＲＮＡｉ活性を誘導することができる。コンストラクト２はポリヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを含むことができ，これは，任意に，生物分解性リンカーとして設計することができる。１つの態様においては，コンストラクト２において示されるループ構造は生物分解性リンカーを含むことができ，このことによりインビボおよび／またはインビトロでコンストラクト１が形成される。別の例においては，コンストラクト３を用いて同じ原理でコンストラクト２を生成することができ，ここでは，リンカーを用いてインビボおよび／またはインビトロで活性なｓｉＮＡコンストラクト２を生成し，これは任意に，別の生物分解性リンカーを利用して，インビボおよび／またはインビトロで活性なｓｉＮＡコンストラクト１を生成することができる。このようにして，ｓｉＮＡコンストラクトの安定性および／または活性は，インビボまたはインビトロおよび／またはインビトロにおける使用のためのｓｉＮＡコンストラクトの設計に基づいて調節することができる。

図３は，本発明の完全にランダムなライブラリを生成するために用いられるｓｉＮＡコンストラクトの非限定的例を示す。示される例は二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトであるが，ヘアピンループを含む一本鎖ｓｉＮＡコンストラクトを同様に用いて，例えば標的発見において用いるための本発明のライブラリを生成することができる。

図４は，本発明における標的発見に用いられるプロセスの代表例の概略の非限定的例を示す。ｓｉＮＡのアンチセンス領域に４つの標準的ヌクレオチドがすべてランダムに組み込まれているｓｉＮＡライブラリを製造して，所定の配列長さに対する相補的センス領域を有する可能なすべてのｓｉＮＡ分子のプールを生成する。このプールを適当なベクター中にクローニングして，ランダムライブラリ発現ベクターを作成し，このプールからレトロウイルスベクター粒子を産生させる。次に，得られたランダムｓｉＮＡライブラリのレトロウイルス発現ベクターのプールを用いて，目的とする細胞タイプに形質導入する。次に，多くの可能な選択戦略を用いて，所望の表現型を示す細胞を残りの集団から分離する。次に，選択された集団に含まれるｓｉＮＡをシークエンスすることにより，選択された表現型の発現に重要な遺伝子を同定することができる。

図５は，本発明のｓｉＮＡコンストラクトを用いて植物細胞において標的を発見する一般的方法の非限定的例を示す概略図である。

図６は，本発明のｓｉＮＡコンストラクトを用いる標的発見およびアクセス可能な標的部位の決定の一般的方法の非限定的例を示す。

図７は，マルチマーおよびモノマーランダムライブラリコンストラクトの概略図である。モノマーランダムライブラリ転写産物の場合，１個のヘアピンまたは１個の二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトが転写産物から転写される。二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトは，制限酵素切断部位から生成するか，あるいは，別の転写産物により生成する。マルチマーランダムライブラリ転写産物の場合には，数個のヘアピンまたは数個の二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトが同じ転写産物にコードされる。二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトは，制限酵素切断部位から生成するか，あるいは，別の転写産物により生成する。ｓｉＮＡヘアピン発現系の非限定的例は，例えば，Ｐａｕｌｅｔａｌ．，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；ＭｉｙａｇｉｓｈｉａｎｄＴａｉｒａ，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅｅｔａｌ．，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；およびＮｏｖｉｎａｅｔａｌ．，２００２，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅｏｎｌｉｎｅｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。

図８は，発現カセットを生成して本発明のランダムｓｉＮＡヘアピンライブラリを生成するために用いられるスキームの概略図である。（Ａ）ＤＮＡオリゴマーを，５’制限部位（Ｒ１）配列，その後に例えば１９，２０，２１，または２２ヌクレオチド（Ｎ）長さのランダム化された領域，次に規定配列（Ｘ）のステム−ループ配列を有するように合成する。ランダム領域は，当該技術分野において知られるように，例えば，固相オリゴヌクレオチド合成の間にホスホルアミダイトの組み合わせを混合することにより生成する。（Ｂ）次に，合成コンストラクトをＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて，自己相補的配列を有するランダム化されたヘアピン構造を生成する。これは，ランダム化された自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を有するｓｉＮＡ転写産物を生成する。（Ｃ）コンストラクトを加熱して（例えば約９５℃で）配列を直線状とし，このことにより第１鎖の３’制限配列に対するプライマーを用いて相補的な第２ＤＮＡ鎖を伸長させることができる。次に，二本鎖ＤＮＡを細胞中での発現用に適当なベクターに挿入する。コンストラクトは，例えば，制限部位を工学操作することにより，および／またはＰａｕｌら（２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９，５０５−５０８）に記載されるようにポリＵ終止領域を利用することにより，転写により３’−オーバーハングが生ずるように設計することができる。

図９は，発現カセットを生成して本発明のランダム二本鎖ｓｉＮＡライブラリを製造するために用いられるスキームの概略図である。（Ａ）ＤＮＡオリゴマーを，５’制限（Ｒ１）部位配列，その後に，例えば，１９，２０，２１，または２２ヌクレオチド（Ｎ）の長さのランダム化された領域，次に規定の配列（Ｘ）のステム−ループ配列に隣接する３’制限部位（Ｒ２）を有するように合成する。ランダム領域は，当該技術分野において知られるように，例えば，固相オリゴヌクレオチド合成の間にホスホルアミダイトの組み合わせを混合することにより生成する。（Ｂ）次に，合成コンストラクトをＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて，自己相補的配列を有するランダム化されたヘアピン構造を生成する。（Ｃ）コンストラクトをＲ１およびＲ２に特異的な制限酵素により加工して，二本鎖ＤＮＡを生成し，次にこれを細胞における発現に適当なベクターに挿入する。Ｕ６プロモーター領域がｓｉＮＡライブラリ成分の別々のセンス鎖およびアンチセンス鎖を生成するｄｓＤＮＡの両側を挟むように転写カセットを設計する。ポリＴ終止配列をコンストラクトに加えて，得られる転写産物中にＵオーバーハングを生成してもよい。

発明の詳細な説明
本発明の核酸分子の作用のメカニズム
ＲＮＡ干渉とは，動物において短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを表す（Ｆｉｒｅｅｔａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物における対応するプロセスは一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと称され，真菌においてはクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは，外来遺伝子の発現を防止するために用いられる進化的に保存された細胞防御メカニズムであると考えられており，異なる叢および門が共通して有している（Ｆｉｒｅｅｔａｌ．，１９９９，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．，１５，３５８）。そのような外来遺伝子発現からの防御は，ウイルス感染または宿主ゲノム中へのトランスポゾン要素のランダムインテグレーションから生ずる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して，相同的一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答により進化してきたのであろう。細胞におけるｄｓＲＮＡの存在は，まだ完全には特性決定されていないメカニズムにより，ＲＮＡｉ応答を引き起こす。このメカニズムは，蛋白質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介性活性化の結果，リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断が生ずるインターフェロン応答とは異なるようである。

細胞中に長いｄｓＲＮＡが存在すると，ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは，ｄｓＲＮＡをプロセシングして短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる短い断片のｄｓＲＮＡとすることに関与している（Ｂｅｒｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサー活性から生ずる短干渉ＲＮＡは，典型的には約２１−２３ヌクレオチドの長さであり，約１９塩基対のデュープレックスを含む。ダイサーはまた，翻訳制御における関与が示唆されている保存された構造の前駆体ＲＮＡから２１および２２ヌクレオチドの小さな一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を切り出すことに関与することが示唆されている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒｅｔａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた，一般にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される，ｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし，これはｓｉＲＮＡと相同な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は，ｓｉＲＮＡデュープレックスのガイド配列に相補的な領域の中央部で生ずる（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１５，１８８）。さらに，ＲＮＡ干渉には，小さいＲＮＡ（例えば，マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）に媒介される遺伝子サイレンシングが関与する場合もある。これはおそらくは，クロマチン構造を制御する細胞性メカニズムによるものであり，このことにより標的遺伝子配列の転写が妨害される（例えば，Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅｅｔａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌｅｔａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。このように，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡ転写産物との相互作用を介して，あるいは特定の遺伝子配列との相互作用により，遺伝子サイレンシングを媒介するために用いることができ，そのような相互作用により転写レベルまたは転写後レベルのいずれかで遺伝子サイレンシングが生ずる。

短干渉ＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉは種々の系で研究されてきた。Ｆｉｒｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は，Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓにおいて最初にＲＮＡｉを観察した。ＷｉａｎｎｙおよびＧｏｅｔｚ（１９９９，ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌ．，２，７０）は，マウス胚においてｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉを記載する。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は，ｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記載する。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）は，培養哺乳動物細胞，例えばヒト胚性腎臓細胞およびＨｅＬａ細胞において，合成の２１ヌクレオチドＲＮＡのデュープレックスを導入することにより誘導されるＲＮＡｉを記載する。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究は，効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ，構造，化学組成，および配列についてのある種の要件を明らかにした。これらの研究は，２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡデュープレックスは２つの２ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む場合に最も活性であることを示した。さらに，一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が破壊されるが，３’末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置換することは許容されることが示された。ｓｉＲＮＡデュープレックスの中心におけるミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を破壊することが示された。さらに，これらの研究はまた，標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなく５’末端により規定されることを示した（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，ＥＭＢＯＪ．，２０，６８７７）。他の研究は，ｓｉＲＮＡデュープレックスの標的相補鎖の５’−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり，ｓｉＲＮＡの５’−リン酸成分を維持するためにＡＴＰが用いられることを示したが（Ｎｙｋａｎｅｎｅｔａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９），５’−リン酸を欠失したｓｉＲＮＡは外的に導入したときに活性であり，このことは，インビボでｓｉＲＮＡコンストラクトの５’−リン酸化が生じているかもしれないことを示唆する。

スクリーニング方法：
本出願人は，細胞中で所望の機能を実行することができるｓｉＮＡ分子のライブラリをスクリーニングする効率的かつ迅速な方法を開発した。本発明はまた，ｓｉＮＡライブラリを使用して，哺乳動物細胞等の生物学的システムにおいてある種の属性またはプロセスを調節し，（ａ）目的とする細胞プロセスまたは属性に関与するｓｉＮＡ分子をライブラリから，および（ｂ）ｓｉＮＡの配列を用いる所望の細胞プロセスまたは属性の調節剤を同定し単離することを特徴とする。

より詳細には，本発明の方法は，ｓｉＮＡがランダム化された配列（例えば，ランダム化されたアンチセンス鎖および相補的センス鎖）を含むｓｉＮＡライブラリを設計し構築することを含む。ランダム化された自己相補的配列を有するこのｓｉＮＡ分子のライブラリを用いて，生物学的システムにおいてある種のプロセスまたは属性を調節する。本明細書に記載される方法は，１またはそれ以上の位置において種々の置換を有するｓｉＮＡ分子のライブラリまたはプールを同時にスクリーニングして，所望の機能または特性または属性を有するｓｉＮＡを選択する。本発明はまた，ｓｉＮＡ分子を構築し，所与の標的核酸分子または未知の標的核酸分子（例えばＲＮＡ）を切断する能力，およびその標的分子またはこれにコードされる任意の蛋白質の生物学的機能を阻害する能力について選択する方法を特徴とする。

この細胞系においてＲＮＡｉに基づく標的の切断を媒介しうるｓｉＮＡ分子を選択するためには，標的核酸分子の配列または構造のいずれかを知る必要はない。本発明に記載される細胞に基づくスクリーニングのプロトコル（すなわち，細胞内部で生ずるもの）は，細胞外の系と比較して多くの利点を提供する。これは，ｓｉＮＡ分子の効力を評価する前に大量のＲＮＡを酵素的または化学的方法により合成する必要がないためである。本発明は，さらに，ｓｉＮＡライブラリを用いて細胞内部における遺伝子配列の生物学的機能を同定する迅速な方法を記述する。本出願人は，ｓｉＮＡライブラリを用いて生物学的プロセスに関与する核酸分子，例えば遺伝子を同定する方法を記載する。この核酸分子は既知の機能を有する既知の分子であってもよく，これまでに機能が明確にされていない既知の分子であってもよく，完全に新規な分子であってもよい。これは例えば，細胞増殖，細胞移動，細胞死等の細胞経路に関与する遺伝子を同定する迅速な手段である。この遺伝子発見の方法は，所望の生物学的プロセスを研究する新規な手段であるのみならず，この細胞プロセスを調節することができる活性な試薬を正確に同定する手段でもある。

本出願人は本明細書において，ｓｉＮＡライブラリの１またはそれ以上のメンバーが，植物および動物または昆虫等の生物学的システムにおいて，ある種の属性／プロセスを調節する能力を同時にアッセイする一般的方法を記載する。該方法は，ライブラリを所望の細胞中に導入し，特定の"属性"，"特徴"または"プロセス"の変化をアッセイすることを含む。特定の属性としては，例えば，細胞増殖，細胞生存，細胞死，細胞移動，血管新生，腫瘍体積，腫瘍転移，細胞中の特定のｍＲＮＡのレベル，細胞中の特定の蛋白質のレベル，分泌された特定の蛋白質のレベル，細胞表面マーカー，細胞形態，細胞分化パターン，軟骨分解，移植，再狭窄，ウイルス複製，ウイルス負荷等が挙げられる。ｓｉＮＡライブラリを用いて特定の生物学的経路を調節することにより，その経路に関与する遺伝子を同定することが可能であり，これは新規の遺伝子または新規の機能を有する遺伝子の発見につながりうる。この方法は，細胞内部の遺伝子機能を研究する強力なツールを提供する。この方法はまた，新規なｓｉＮＡコンストラクトを設計し，標的中のｓｉＮＡアクセス可能部位を同定し，遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介性調節の新規核酸標的を同定する可能性を提供する。

１つの態様においては，本発明は，ランダムなｓｉＮＡライブラリ（ランダムライブラリ）を合成し，ランダムライブラリのすべてのメンバーを細胞において同時に試験することを含む。このライブラリはランダムな自己相補的配列を有するｓｉＮＡコンストラクトを有する。ランダムライブラリのメンバーとの相互作用の結果として属性（例えば，細胞増殖の阻害）が変更された細胞を選択し，これらの細胞からのｓｉＮＡコンストラクトの配列を決定する。ｓｉＮＡ（例えば，アンチセンス鎖配列またはセンス鎖配列）からの配列情報を用いて，当該技術分野において知られる標準的な技術，例えば，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の手法を用いる核酸増幅を用いて，所望の細胞属性を担う経路に関与すると考えられる核酸分子を単離することができる。

本明細書において用いる場合，"ランダムライブラリ"とは，ｓｉＮＡのアンチセンス鎖にすべての可能な変種を含むｓｉＮＡライブラリを意味する。ここでは，ライブラリの複雑性および内容は規定されたものではない。ランダムライブラリは，選択されたｓｉＮＡについて，生物のゲノムにおけるすべての可能な標的配列に相補的な配列を含むと予測される。ランダムライブラリはモノマーであってもマルチマーランダムライブラリであってもよい（図８を参照）。モノマーランダムライブラリとは，転写ユニットがランダムな自己相補的配列を有する１つのｓｉＮＡユニットを含むことを意味する。マルチマーランダムライブラリとは，転写ユニットが２以上のｓｉＮＡユニットを含むことを意味する。ｓｉＮＡユニットの数は，好ましくは２，３，４，５，６，７，８，９，または１０である。このランダムライブラリを用いて，既知の標的配列中の，または未知の標的中のＲＮＡｉ切断部位についてスクリーニングすることができる。第１の例においては，ランダムライブラリを選択された細胞に導入し，既知の標的遺伝子の発現をアッセイする。標的の発現が変更されている細胞は，既知の標的に対して最も有効なｓｉＮＡを生ずるであろう。第２の例においては，ランダムライブラリを選択された細胞に導入し，細胞を特定の属性，例えば，細胞の生存についてアッセイする。ランダムライブラリとの相互作用から生存した細胞を単離し，これらの細胞からのｓｉＮＡ配列を決定する。次に，ｓｉＮＡのアンチセンス鎖の配列をプローブとして用いて，細胞死に関与する遺伝子を単離することができる。ランダムライブラリからのｓｉＮＡは細胞死に関与する遺伝子の発現を調節（例えばダウンレギュレート）することができるため，細胞はさもなくば死ぬであろう条件下で生存することができる。これは遺伝子発見の新規な方法である。この方法は，ある種の細胞プロセスのメディエータに関する情報を提供するのみならず，これらの調節剤の発現を調節する方法を提供する。この方法を用いて，任意の生物，例えば，限定されないが，哺乳動物，植物，および昆虫における任意の細胞プロセスの調節剤を同定することができる。

本発明は，所望の標的の核酸配列に対して高い特異性を示す一群のｓｉＮＡ分子を製造する方法を提供する。ｓｉＮＡ分子は，好ましくは，１つのｓｉＮＡで疾病または状態の特異的診断および／または治療が与えられるように，標的の高度に保存された配列領域を標的とする。

１つの態様においては，細胞におけるプロセスに関与する核酸分子を同定する方法が記載され，該方法は，（ａ）センス領域およびアンチセンス領域を有するｓｉＮＡ分子のライブラリを合成し，ここでアンチセンス領域およびセンス領域はランダムな自己相補的配列を有しており；（ｂ）ｓｉＮＡ分子のライブラリを細胞に導入し；（ｃ）細胞中でプロセスを変更させるのに適した条件下で細胞中でライブラリを試験し（例えば，細胞増殖の阻害，血管新生の阻害，成長および／または分化の調節等）；（ｄ）変更されたプロセスを有する細胞を単離および濃縮し；（ｅ）変更された細胞からのｓｉＮＡを同定し，単離し；（ｆ）変更された細胞から単離されたｓｉＮＡのアンチセンス領域の配列に相同な配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて，細胞または変更された細胞から核酸分子を単離する（または任意にゲノムデータベースのデータを用いて核酸配列を同定する），の各工程を含む。上述の選択／スクリーニング方法を用いて同定された核酸分子は，ｓｉＮＡライブラリのメンバーによる変更についてアッセイされたプロセスに関与するであろう。これらの核酸分子は，新規な遺伝子配列であるか，または新規な機能を有する遺伝子配列でありうる。この方法の１つの利点は，生物学的プロセス，例えば，分化，細胞成長，癌，腫瘍血管新生，関節炎，心臓血管疾病，炎症，再狭窄，血管疾病等の疾病プロセスに関与する遺伝子等の核酸配列を，ランダムライブラリ法を用いて容易に同定しうることである。すなわち，所与のｓｉＮＡモチーフについての１つのランダムライブラリを用いて，任意の生物学的システムにおける任意のプロセスをアッセイすることができる。

別の態様においては，本発明は，規定されたｓｉＮＡライブラリ（規定ライブラリ）を合成し，これを細胞中で既知の標的に対して同時に試験することを含む。ライブラリは，既知の複雑性（規定されている）のランダムな自己相補的配列を有するｓｉＮＡ分子を含む。ライブラリ中のｓｉＮＡ分子により標的遺伝子の発現が調節されることにより，細胞の表現型の変化が引き起こされる。そのような細胞を単離すれば，これらの細胞中のｓｉＮＡ分子は細胞における所望の遺伝子の発現を調節するのに最も適したものである。

本明細書において用いる場合，"規定ライブラリ"とは，各メンバーｓｉＮＡを個々に設計して製造し，次にライブラリに加えるような，ｓｉＮＡ分子のライブラリを意味する。すなわち，内容，複雑性（ライブラリ中に含まれる異なるｓｉＮＡ分子の数）およびライブラリメンバーの比率が最初から規定されている。規定ライブラリは３以上のｓｉＮＡ分子を含む。このプロセスは，既知の標的ＲＮＡの配列を所与のｓｉＮＡにより切断されることができるすべての可能な部位についてスクリーニングし，次に，標的配列に対する代表的な数の異なるｓｉＮＡ分子を合成し，ｓｉＮＡ分子を組み合わせ，そしてプールしたｓｉＮＡ分子を前記生物学的システムにおける標的ＲＮＡの発現の調節を容易にするのに適した条件下で，標的ＲＮＡを含む生物学的システム中に導入することを含む。

あるいは，本発明のある種のｓｉＮＡ分子は，細胞中で真核生物プロモーターから発現させることができる（例えば，ＩｚａｎｔａｎｄＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙａｎｄＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎｅｔａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔｅｔａｌ．，１９９２ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃｅｔａｌ．，１９９２Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅｅｔａｌ．，１９９１Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇｅｔａｌ．，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒｅｔａｌ．，１９９０Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２２５９；Ｇｏｏｄｅｔａｌ．，１９９７，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，４，４５）。当業者は，真核生物細胞中で任意の核酸を適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを認識するであろう。そのような核酸の活性は，酵素的核酸によりそれらを一次転写産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒｅｔａｌ．，ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９，Ｓｕｌｌｉｖａｎｅｔａｌ．，ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａｅｔａｌ．，１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａｅｔａｌ．，１９９１，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａｅｔａｌ．，１９９３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａｅｔａｌ．，１９９４Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６）。

本発明の別の観点においては，本発明のＲＮＡ分子は，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現させることができる（例えばＣｏｕｔｕｒｅｅｔａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。組換えベクターは，ＤＮＡプラスミドであってもウイルスベクターであってもよい。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができる。別の態様においては，ｐｏｌＩＩＩに基づくコンストラクトを用いて，本発明の核酸分子を発現させる（例えば，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，米国特許５，９０２，８８０および６，１４６，８８６を参照）。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターは，上述のようにデリバリーされ，標的細胞中に残留することができる。あるいは，核酸分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，ｓｉＮＡ分子は標的ｍＲＮＡと相互作用して，ＲＮＡｉ応答を生ずる。ｓｉＮＡ分子を発現するベクターの輸送は，全身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与した後，被験者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により，行うことができる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅｅｔａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。

１つの観点においては，本発明は，少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは，ｓｉＮＡデュープレックスの一方または両方の鎖，または自己ハイブリダイズしてｓｉＮＡデュープレックスを生ずる１本の自己相補的鎖をコードすることができる。本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列は，そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とする様式で動作可能なように連結することができる（例えば，Ｐａｕｌｅｔａｌ．，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；ＭｉｙａｇｉｓｈｉａｎｄＴａｉｒａ，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅｅｔａｌ．，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；およびＮｏｖｉｎａｅｔａｌ．，２００２，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅｏｎｌｉｎｅｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５を参照）。

別の観点においては，本発明は，以下を含む発現ベクターを特徴とする：ａ）転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌＩ，ＩＩまたはＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核生物ｐｏｌＩ，ＩＩまたはＩＩＩの終止領域）；およびｃ）本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を含み，前記配列は，ｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。ベクターは，任意に，本発明のｓｉＮＡをコードする配列の５'側または３’側に動作可能なように連結された蛋白質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／またはイントロン（介在配列）を含んでいてもよい。

ｓｉＮＡ分子配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ），ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ），またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）のプロモーターにより推進させることができる。ｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写産物は，すべての細胞において高いレベルで発現される。あるタイプの細胞におけるあるｐｏｌＩＩプロモーターのレベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイレンサー等）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で発現される限り，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎａｎｄＭｏｓｓ，１９９０Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；ＧａｏａｎｄＨｕａｎｇ１９９３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒｅｔ．ａｌ．，１９９３ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，１９９０Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。何人かの研究者が，そのようなプロモーターから発現した核酸分子が哺乳動物細胞中で機能しうることを示している（例えば，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔｅｔａｌ．，１９９２ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇｅｔａｌ．，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕｅｔａｌ．，１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ'Ｈｕｉｌｌｉｅｒｅｔａｌ．，１９９２ＥＭＢＯＪ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚｅｔａｌ．，１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より詳細には，転写ユニット，例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものは，細胞中において高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えばｓｉＮＡ）を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，（上掲）；ＣｏｕｔｕｒｅａｎｄＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，米国特許５，１６２４，８０３；Ｇｏｏｄｅｔａｌ．，１９９７，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒｅｌｍａｎｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１８７３６）。上述のｓｉＮＡ転写ユニットは，哺乳動物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むことができる。ベクターとしては，限定されないが，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター），またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられる（総説については，ＣｏｕｔｕｒｅａｎｄＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）。

別の観点においては，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を，そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを特徴とする。１つの態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；およびｃ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み；この配列は，ｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域および終止領域に動作可能なように連結されている。

別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）オープンリーディングフレーム；およびｄ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み，この配列は，オープンリーディングフレームの３'−末端に動作可能なように連結されており，配列は，ｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域，オープンリーディングフレームおよび終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；およびｄ）少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含み；この配列は，核酸分子の発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域，イントロンおよび終止領域に動作可能なように連結されている。

別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；およびｅ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み，この配列は，オープンリーディングフレームの３'−末端に動作可能なように連結されており，配列は，ｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能とする様式で，開始領域，イントロン，オープンリーディングフレームおよび終止領域に動作可能なように連結されている。

実施例：
以下は，本発明の核酸の選択，単離，合成および活性を示す非限定的例である。

実施例１：哺乳動物細胞における標的発見
非限定的例においては，本発明の組成物および方法は，哺乳動物細胞内で目的とするプロセス，例えば，細胞成長，増殖，アポトーシス，形態，血管新生，分化，移動，ウイルス増殖，薬剤耐性，シグナル伝達，細胞サイクル制御，または温度感受性または他のプロセスに関与する遺伝子を発見するために用いられる。最初に，ヘアピンｓｉＮＡコンストラクトについて図８に，または二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトについて図９に概説されるプロセスを用いて，ランダム化されたｓｉＮＡライブラリを作成する。これらのコンストラクトを，哺乳動物細胞内でライブラリからのｓｉＮＡを発現しうるベクター中に挿入する。

レポーター系
ある種の蛋白質，例えば，本明細書に記載される細胞プロセスに関与する蛋白質の発現において役割を果たしている遺伝子を発見するために，目的とする特定の蛋白質が発現されるときにレポーター分子が共発現されるような，容易にアッセイ可能なレポーター系を構築する。レポーター系は，レポーター遺伝子，例えば，グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）または当該技術分野において知られ容易に入手可能な他のレポーター蛋白質をコードする遺伝子を有するプラスミドコンストラクトから構成される。ＧＦＰ遺伝子のプロモーター領域を，目的とする蛋白質のＧＦＰ遺伝子の有効な転写を指示するのに十分なプロモーターの一部で置き換える。プラスミドはまた，プラスミドを含有する細胞を選択するために，薬剤耐性遺伝子，例えばネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。

標的発見のための宿主細胞株
標的発見用の宿主として細胞株を選択する。細胞株は，好ましくは，その中で発現されたｓｉＮＡコンストラクトにより調節されたときに蛋白質の発現を制御する上流の遺伝子を同定することができるように，目的とする蛋白質を発現することが知られているものである。細胞は，好ましくは培養系で蛋白質発現特性を維持している。レポータープラスミドを，例えばカチオン性脂質処方を用いて細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの後，例えば，６００μｇ／ｍＬのジェネティシンによる選択下で細胞の限界希釈クローニングを行う。プラスミドを保持する細胞はジェネティシン処理から生き残り，単一の生存細胞に由来するコロニーを形成する。得られたクローン細胞株を，フローサイトメトリにより，ＧＦＰ産生をアップレギュレーションする能力についてスクリーニングする。細胞を，例えば，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａが培養されていた滅菌Ｍ９細菌培地（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓコンディションド培地，ＰＣＭ）で処理することによりプロモーターを誘導する。ＰＣＭに酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）を補充する。プロモーター誘導に高い応答性を示すクローン細胞株を，その後の実験のためのレポーター株として選択する。

ｓｉＮＡライブラリ構築
ランダム化されたアンチセンス領域および自己相補的センス領域を有するヘアピンｓｉＮＡコンストラクトを含むオリゴヌクレオチドを用いてｓｉＮＡライブラリを構築した（例えば図８を参照。あるいは，図９に示されるように二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを利用することができる）。ｓｉＮＡの５’および３’のオリゴ配列は，クローニング用に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む。３’トレーリング配列は，ＤＮＡポリメラーゼ伸長をプライミングしてヘアピン構造を形成するためのステム−ループを形成する。ヘアピンＤＮＡコンストラクトを９０℃で溶融させて，ＤＮＡポリメラーゼがｄｓＤＮＡコンストラクトを生成できるようにする。二本鎖ｓｉＮＡライブラリは，例えば，ヒト神経成長因子レセプター（ｈＮＧＦｒ）レポーター遺伝子を含むレトロウイルスベクターの５’ＬＴＲ領域に位置するＵ６＋２７転写ユニット中にクローニングする。Ｕ６＋２７／ｓｉＮＡ転写ユニットが５’ＬＴＲに位置することにより，ベクターが宿主細胞ゲノム中にインテグレートしたときに転写ユニットの重複が生ずる。その結果，Ｕ６＋２７からＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより，５’ＬＴＲからＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性により，ｓｉＮＡが転写される。ｓｉＮＡライブラリはレトロウイルス粒子中にパッケージングされ，これを用いて上で選択されたクローン化細胞を感染させ伝達させる。ｈＮＧＦｒレポーターのアッセイを用いて，ｓｉＮＡコンストラクトを取り込んだ細胞の割合を示す。図３および４は，ｓｉＮＡライブラリ構築および標的発見において用いた一般化したスキームを示す。ランダム化された領域とは，完全にランダムな配列および／または部分的にランダムな配列の領域を意味する。完全にランダムな配列とは，配列中の各位置でＡ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド，またはこれらの修飾誘導体が理論的に同等であるように存在する配列を意味する。部分的にランダムな配列とは，配列中の各位置でＡ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチドまたはこれらの修飾誘導体が同等でなく存在する配列を意味する。したがって，部分的にランダムな配列は，完全にランダムな１またはそれ以上の位置および規定ヌクレオチドを有する１またはそれ以上の位置を有することができる。

誘導に対する非レスポンダの濃縮
ｓｉＮＡライブラリ含有細胞のソーティングを行って，プロモーター誘導剤であるＰＣＭおよびＰＭＡで処理した後に，より低い量のレポーターＧＦＰを産生する細胞を濃縮する。ＧＦＰ産生の低下は，ムチンプロモーターの活性化に関与する遺伝子に対するＲＮＡｉ活性に起因するものでありうる。あるいは，ｓｉＮＡはムチン／ＧＦＰ転写産物を直接標的としてＧＦＰ発現を低下させることができる。

細胞は，ある密度，例えば１ｘ１０⁶／１５０ｃｍ²の細胞培養フラスコで播種し，ウシ胎児血清を含む適当な細胞培養培地で成長させる。７２時間後，細胞培地を無血清培地で置き換える。血清飢餓の２４時間後，細胞をＰＣＭ（４０％に）およびＰＭＡ（５０ｎＭに）を補充した血清含有培地で処理して，ＧＦＰ産生を誘導する。２０−２２時間後，例えば，ＦＡＣＳｔａｒＰｌｕｓ細胞ソーターを用いてＧＦＰレベルについて細胞をモニターする。ソーティングは，ソーティングしていない対照サンプルからのｓｉＮＡライブラリ細胞の９０％以上がバックグラウンドレベルより高いＧＦＰを産生するよう誘導された場合に行う。ソーティングの各ラウンドで２つの細胞画分を回収する。ソーティングの適当なラウンドの後，Ｍ１画分を選択して，ソーティングした細胞中に存在するｓｉＮＡ分子のデータベースを作成する。

ソーティングした細胞からのｓｉＮＡ配列の回収
ソーティングしたｓｉＮＡライブラリ細胞から標準的な方法によりゲノムＤＮＡを得る。ｓｉＮＡの５’および３’側のレトロウイルスベクターにハイブリダイズするネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを用いて，ライブラリ細胞ＤＮＡの特定のクローンからｓｉＮＡ配列を回収し増幅する。ＰＣＲ産物を細菌クローニングベクター中にライゲーションする。プラスミドの形で回収されたｓｉＮＡライブラリを用いて，ｓｉＮＡ配列のデータベースを作成することができる。例えば，ライブラリをＥ．ｃｏｌｉ中にクローニングする。細菌コロニーからのプラスミド単離または直接コロニーＰＣＲによりＤＮＡを調製し，ｓｉＮＡ配列を決定する。第２の方法は，ｓｉＮＡライブラリを用いてクローン化細胞をトランスフェクトすることができる。安定にトランスフェクトされた細胞のクローン化株を樹立し，例えば，ＰＣＭおよびＰＭＡで誘導する。ＧＦＰ誘導に応答しない株を，単一のｓｉＮＡインテグレーション事象についてＰＣＲにより探索する。両方の方法により得られたユニークなｓｉＮＡ配列を標的配列タグ（ＴＳＴ）データベースに加える。

バイオインフォマティクス
単離されたｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域の配列を公共または私有の遺伝子データバンクと比較する。遺伝子マッチは完全および不完全マッチにしたがってコンパイルする。潜在的遺伝子標的を各遺伝子とマッチする異なるｓｉＮＡ配列の数により分類する。２以上の完全ｓｉＮＡマッチを有する遺伝子を標的評価研究のために選択する。

標的遺伝子の評価
蛋白質発現のレギュレータとして標的を評価するために，Ｇｅｎｂａｎｋからの標的遺伝子ｃＤＮＡ配列に対してｓｉＮＡ試薬を設計する。ｓｉＮＡ試薬をカチオン性脂質処方と複合体形成させた後，適当な濃度（例えば，５−５０ｎＭまたはそれ以下）でクローン化細胞に投与する。細胞をｓｉＮＡ試薬で，例えば７２−９６時間処理する。ｓｉＮＡ処理の終了の前に，例えば，ＰＣＭ（４０％に）およびＰＭＡ（５０ｎＭに）を加えてプロモーターを誘導する。２０時間の誘導の後，細胞を回収し，表現型および分子パラメータについてアッセイする。ｓｉＮＡ処理細胞におけるＧＦＰ発現の減少（フローサイトメトリにより測定）を標的遺伝子の評価の証拠として用いる。ｓｉＮＡ処理細胞における標的ＲＮＡのノックダウンを内因性ＲＮＡの減少およびＧＦＰＲＮＡの減少と相関させて，標的の評価を完了する。

実施例２：ムチン産生に関連する遺伝子の標的発見
標的発見および標的評価法を用いて，慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関与する慢性粘液分泌過多に関与する遺伝子を見いだす。

レポーター系
ムチンの発現において役割を果たす遺伝子を発見するために，容易にアッセイ可能なレポーター系を工夫する。レポーター系は，ｐＭＵＣ５ＡＣ−ＥＧＦＰと称される，グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を有するプラスミドコンストラクトから構成される。ＧＦＰ遺伝子のプロモーター領域を，ＧＦＰ遺伝子の有効な転写を指示するのに十分なムチン５ＡＣプロモーターの一部で置き換える。プラスミドはネオマイシン薬剤耐性遺伝子も含む。

標的発見用の宿主細胞株
これらの実験の宿主として選択された細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２（ＡＴＣＣＣＲＬ−１８４８）は，ヒト肺粘液性類表皮癌に由来するものである。細胞は培養中で粘液性類表皮の特性を維持し，ムチン５ＡＣおよびムチン２を内因的に発現する。ｐＭＵＣ５ＡＣ−ＥＧＦＰプラスミドを，例えばカチオン性脂質処方を用いてＮＣＩ−Ｈ２９２にトランスフェクトする。トランスフェクションの後，例えば，６００μｇ／ｍＬのジェネティシンによる選択下で細胞の限界希釈クローニングを行う。ｐＭＵＣ５ＡＣ−ＥＧＦＰプラスミドを保持する細胞はジェネティシン処理から生き残り，単一の生存細胞に由来するコロニーを形成する。得られたクローン細胞株を，フローサイトメトリにより，ムチン５ＡＣプロモーターにより指示されるＧＦＰ産生をアップレギュレーションする能力についてスクリーニングする。細胞を，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａが培養されていた滅菌Ｍ９細菌培地（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓコンディションド培地，ＰＣＭ）で処理することによりムチンプロモーターを誘導する。ＰＣＭに酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）を補充する。ムチンプロモーター誘導に高い応答性を示すクローン細胞株を，その後の実験のためのレポーター株として選択する。

ｓｉＮＡライブラリの構築
ランダム化されたアンチセンス領域および自己相補的センス領域を有するヘアピンｓｉＮＡコンストラクトを含むオリゴヌクレオチドを用いてｓｉＮＡライブラリを構築した（例えば図８を参照，あるいは，図９に示されるように二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを用いることができる）。ｓｉＮＡの５’および３’側のオリゴ配列はクローニング用の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む。３’トレーリング配列はＤＮＡポリメラーゼ伸長をプライミングしてヘアピン構造を形成するためのステム−ループを形成する。ヘアピンＤＮＡコンストラクトを９０℃で溶融させて，ＤＮＡポリメラーゼがｄｓＤＮＡコンストラクトを生成できるようにする。二本鎖ｓｉＮＡライブラリをヒト神経成長因子レセプター（ｈＮＧＦｒ）レポーター遺伝子を含むレトロウイルスベクターの５’ＬＴＲ領域に位置するＵ６＋２７転写ユニット中にクローニングする。Ｕ６＋２７／ｓｉＮＡ転写ユニットを５’ＬＴＲに配置することにより，ベクターが宿主細胞ゲノム中にインテグレートされたときに転写ユニットが重複する。その結果，ｓｉＮＡは，Ｕ６＋２７からＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより，５’ＬＴＲからＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性により転写される。ｓｉＮＡライブラリはレトロウイルス粒子中にパッケージングされ，これを用いてクローン化細胞を感染させて伝達した。ｈＮＧＦｒレポーターのアッセイを用いて，ｓｉＮＡコンストラクトを取り込んだ細胞のパーセンテージを表す。

ムチン誘導に対するノンレスポンダーの濃縮
ｓｉＮＡライブラリ含有細胞のソーティングを行って，ＰＣＭおよびＰＭＡによる処理の後により少ないＧＦＰを産生する細胞を濃縮する。ＧＦＰ産生の低下は，ムチンプロモーターの活性化に関与する遺伝子に対するＲＮＡｉ活性に起因するものでありうる。あるいは，ｓｉＮＡはムチン／ＧＦＰ転写産物を直接標的として，ＧＦＰ発現を低下させることができる。

細胞をある密度，例えば１ｘ１０⁶／１５０ｃｍ²の細胞培養フラスコで播種し，ウシ胎児血清を含む適当な細胞培養培地で成長させる。７２時間後，細胞培養培地を無血清細胞培養培地で置き換える。血清飢餓の２４時間後，細胞をＰＣＭ（４０％に）およびＰＭＡ（５０ｎＭに）を補充した血清含有培地で処理して，ムチンプロモーターからのＧＦＰ産生を誘導する。２０−２２時間後，細胞を例えばＦＡＣＳｔａｒＰｌｕｓ細胞ソーターでＧＦＰレベルについてモニターする。ソーティングは，ソーティングしていない対照サンプルからのｓｉＮＡライブラリ細胞の９０％以上がバックグラウンドレベルより高いＧＦＰを産生するよう誘導された場合に行う。ソーティングの各ラウンドで２つの細胞画分を回収する。ソーティングの適当なラウンドの後，Ｍ１画分を選択して，ソーティングされた細胞中に存在するｓｉＮＡ分子のデータベースを作成する。

ソーティングした細胞からのｓｉＮＡ配列の回収
ソーティングしたｓｉＮＡライブラリの細胞から標準的な方法によりゲノムＤＮＡを得る。ｓｉＮＡの５’および３’側のレトロウイルスベクターにハイブリダイズするネスト化ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを用いて，ライブラリ細胞ＤＮＡの特定のクローンからｓｉＮＡ配列を回収し増幅する。ＰＣＲ産物を細菌クローニングベクター中にライゲーションする。プラスミドの形の回収されたｓｉＮＡライブラリを用いて，ｓｉＮＡ配列のデータベースを作成することができる。例えば，ライブラリをＥ．ｃｏｌｉにクローニングする。細菌コロニーからのプラスミド単離または直接コロニーＰＣＲによりＤＮＡを調製し，ｓｉＮＡ配列を決定する。第２の方法は，ｓｉＮＡライブラリを用いてクローン化細胞をトランスフェクトすることができる。安定にトランスフェクトされた細胞のクローン化株を樹立し，ＰＣＭおよびＰＭＡで誘導する。ＧＦＰ誘導に応答しない株を，単一のｓｉＮＡインテグレーション事象についてＰＣＲにより探索する。両方の方法により得られたユニークなｓｉＮＡ配列を標的配列タグ（ＴＳＴ）データベースに加える。

標的遺伝子の評価
ＭＵＣ５ＡＣ発現のレギュレータとして標的を評価するために，Ｇｅｎｂａｎｋからの標的遺伝子ｃＤＮＡ配列に対してｓｉＮＡ試薬を設計する。ｓｉＮＡ試薬をカチオン性脂質処方と複合体形成させた後，適当な濃度（例えば，５−５０ｎＭまたはそれ以下）でクローン化細胞に投与する。細胞をｓｉＮＡ試薬で，例えば７２−９６時間処理する。ｓｉＮＡ処理の終了の前に，ＰＣＭ（４０％に）およびＰＭＡ（５０ｎＭに）を加えてＭＵＣ５ＡＣプロモーターを誘導する。２０時間の誘導の後，細胞を回収し，表現型および分子パラメータについてアッセイする。ｓｉＮＡ処理細胞におけるＧＦＰ発現の減少（フローサイトメトリにより測定）を標的遺伝子の評価の証拠として用いる。ｓｉＮＡ処理細胞における標的ＲＮＡのノックダウンを内因性ＭＵＣ５ＡＣＲＮＡの減少およびＧＦＰＲＮＡ（ＭＵＣ５ＡＣ／ＧＦＰコンストラクトから）の減少と相関させて，標的の評価を完了する。

実施例３：植物雄不稔性に関与する遺伝子の発見
２つの遺伝的に別個の植物系を互いに交配させると，単一のハイブリッド中で種々の有益な属性を組み合わせることができる。この手法を用いてハイブリッド種子を開発すると，農業経済学的利益を増加させることができる。植物の望ましい属性には，果実サイズ，成長速度，発芽，収穫物サイズおよび疾病，温度および昆虫耐性が含まれる。一般に，このプロセスは，近交作物系を生成し，これらの系間を育種し，次にハイブリッドが元の系より優れているか否かを決定することを含む。しかし，このプロセスを成功させるためには，他家受粉の比率を改善するために自己受粉を防止する手段を行わなくてはならない。自己受粉により生成した種子はハイブリッド種子の供給物に混入する。作物において雄または雌の不稔性を生じさせると，植物は繁殖するためには交配育種に依存しなければならなくなるであろう。本出願の文脈においては，“雄不稔性”は，植物が機能的な雌生殖器官を有するが自己受精をすることができない状態として定義される。第２の花からの花粉が雌器官と接触したときにのみ胚嚢の受精が生ずる。あるいは，“雌不稔性”は，雌配偶体，雌配偶子，雌接合子，または種子の機能の異常のため植物が生存可能な種子を生成することができない状態として定義される。

トウモロコシなどのある種の植物は，空間的に離れた雄器官および雌器官を有し，したがって，植物から受精能力のある花粉を除くだけで自己受粉を防止するには十分である。この方法は，トウモロコシでは機能しうるが，雄器官と雌器官とが同じ花の中に存在するため，他の主要な作物植物には移しかえることができない。したがって，受精可能な花粉を除去することは煩わしいこととなり，多くの場合経済的に実用可能ではない。自己受粉を防止するためのいくつかの戦略が示唆されており，これには，化学的および遺伝的不稔化が含まれる。

化学的不稔化は，殺配偶子剤として知られる，一時的に雄不稔性を引き起こすことができる化合物の使用を含む。化合物は，花における花粉生成を抑制または妨害することにより機能する。これらの化合物のコストは，特に，殺配偶子剤は花の生成が生ずるたびに適用しなければならないため，制限因子でありうる。最初に噴霧した後に生じた新たな花ごとに，交叉受粉を防止するために噴霧を行わなければならない。殺配偶子剤を噴霧するタイミングは，花の生成と一致するように注意深く適用しなければならず，このことは，花の出現を予期することが困難なため，問題となりうる。

別のメカニズムは細胞質性雄不稔性（ＣＭＳ）と証され，ここでは，欠陥のあるミトコンドリアが花粉生成の阻害または障害を引き起こす。あるいは，花粉生成の防止には，細胞の核内における変更が関与しうる。本発明は，雄および／または雌不稔性に関与する遺伝子を同定する方法を記載する。本出願人は，ｓｉＮＡ技術は植物において遺伝子発現を変更させ，雄および／または雌不稔性に関与する新規遺伝子を発見する魅力的な新規な手段を提供すると考える。

すなわち，本発明の１つの観点においては，本出願人は，雄または雌不稔性に関与する遺伝子を同定する方法を記載する。ランダムライブラリ法を用いて，そのダウンレギュレーションにより雄不稔性表現型が生ずる遺伝子を発見する。これらの遺伝子はおそらく花粒粉，タペート組織，花糸，花粉および葯の形成，ならびに葯裂開に関与するであろう。雄不稔性表現型に関与する既知の遺伝子の例としては，Ｊａｇ１８（ＷＯ９７／３０５８１）および米国特許５，４７８，３６９にそのペプチド配列が示される遺伝子が挙げられる。本明細書に記載される方法は，最初に配列情報を必要としないが，所望の表現型を示す植物において配列情報を得ることを可能とする。

雄不稔性遺伝子の同定の１つの非限定的方法が図５に示される。相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有するランダム化されたｓｉＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドからランダムライブラリを構築する。所望の表現型が見られる予測頻度は，ライブラリ（ランダムライブラリ）中のアンチセンス領域の長さおよび表現型に関与する遺伝子の数に関連する。ｓｉＮＡが各センス領域およびアンチセンス領域中に２１ヌクレオチドを有するように設計されるｓｉＮＡライブラリについては，これは４²¹個のｓｉＮＡ分子にあたる。平均して１０個の互いに共有結合したｓｉＮＡ単位を有するｓｉＮＡのマルチマーランダムライブラリ（約４２０ヌクレオチドの長さ）を合成して，トランスフェクトしなければならないクローンの数を少なくする。図８および９に記載される方法を用いて，ｓｉＮＡのランダムライブラリを転写させ，発現ベクター中にクローニングする。プラスミドはまた，細胞毒性物質に対する耐性を付与する遺伝子（例えば，クロロスルフロン，ヒグロマイシン，ＰＡＴおよび／またはｂａｒ，ブロモキシニル，カナマイシン等）を含むことができ，これらによりトランスフェクション後の選択が可能となる。次にこれらのクローンを用いて，当該技術分野において知られる手法を用いて，アグロバクテリウムをトランスフォームする（米国特許５，１７７，０１０（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｏｌｅｄｏ），５，１０４，３１０（ＴｅｘａｓＡ＆Ｍ），欧州特許出願０１３１６２４Ｂ１，欧州特許出願１２０５１６，１５９４１８Ｂ１および１７６，１１２（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ），米国特許５，１４９，６４５，５，４６９，９７６，５，４６４，７６３および４，９４０，８３８および４，６９３，９７６（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ），欧州特許出願１１６７１８，２９０７９９，３２０５００（すべてＭａｘＰｌａｎｃｋ），欧州特許出願６０４６６２および６２７７５２（ＪａｐａｎＴｏｂａｃｃｏ），欧州特許出願０２６７１５９，および０２９２４３５および米国特許５，２３１，０１９（すべてＣｉｂａＧｅｉｇｙ），米国特許５，４６３，１７４および４，７６２，７８５（いずれもＣａｌｇｅｎｅ），および米国特許５，００４，８６３および５，１５９，１３５（いずれもＡｇｒａｃｅｔｕｓ）；これらはすべて本明細書の一部としてここに引用する）。次に，組換えアグロバクテリウムを用いて，再生して全植物となることができる１個の植物細胞をトランスフォームする。また，他のトランスフェクション技術を用いてＤＮＡプラスミドを植物細胞中にデリバリーしてもよく，これには，限定されないが，エレクトロポレーション，リポソーム，カチオン性脂質，ＣａＣｌ₂沈殿および当該技術分野において知られる他の方法が含まれる。次に，植物細胞を成長させて全植物とし，分析して完全なまたは部分的な雄不稔性が存在するか否かを決定する。完全な雄不稔性とは，花粉が生成せず，および／または放出されず，植物が自己受精できなくなる状態として定義される。部分的雄不稔性とは，正常な野生型植物と比較して，花粉の生成または放出が減少するかまたは異常となっている状態として定義される。

シロイヌナズナ植物における不稔性を簡単に観察するためには，花粉特異的プロモーターの制御下でグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を発現する株を作成する。次にシロイヌナズナ株を種々のプロモーターの制御下で発現されるｓｉＮＡライブラリでトランスフォームする。ｓｉＮＡ発現については構成的プロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ等）を用い，ＧＦＰの発現には花粉または葯特異的プロモーターを用いる。ランダムライブラリからの構成的に発現するｓｉＮＡは，雄の生殖能力の制御下で組織特異的に制御されている遺伝子を同定することができるであろう。組織特異的プロモーターから構成されるランダムライブラリは，生殖には直接関連しないにもかかわらずその阻害が雄および／または雌不稔性を引き起こすかもしれない遺伝子（例えば，アクチンなどのハウスキーピング遺伝子）を同定することができるであろう。蛍光が減少すれば，これは遺伝子の阻害が雄不稔性と関連しているか関与していることを示す。

完全なまたは部分的な雄不稔性を示す植物からＲＮＡを精製し，ＲＴ−ＰＣＲによりｓｉＮＡＲＮＡを増幅しクローニングする。あるいは，またはこれに加えて，ｓｉＮＡ遺伝子は，当該技術分野において知られる標準的な分子生物学手法を用いてゲノムＤＮＡから直接増幅する。このｓｉＮＡを，上述のようにして再クローニングし再トランスフォームして，表現型の変化がｓｉＮＡ活性によるものであって，挿入変異によるものではないことを確実にする（確認する）。特徴が再現されれば，ｓｉＮＡ結合アームの配列をタグとして用いて表現型の改変に関与する遺伝子を見つける。バイオインフォマティクスを用いて，入手可能な配列をホモロジーについて検索する。関連する配列が見いだされない場合には，１５ヌクレオチドの結合アーム配列をプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして，当該技術分野において知られる標準的な分子生物学手法を用いて植物から遺伝子を単離することができる。

本発明のさらに別の観点においては，雄不稔性に関与する１またはそれ以上の遺伝子が完全にまたは部分的に阻害されているハイブリッド種子植物が製造される。遺伝子の同一性を担ったｓｉＮＡを用いることにより，または他のｓｉＮＡを用いることにより，これらの遺伝子は，個々にまたは組み合わせて阻害される。雄不稔性遺伝子の１またはそれ以上が阻害されているトランスジェニック植物を適当な雄の受精能力のある植物と交配させると，ハイブリッド種子の合成が生ずる。本出願人は，植物の生化学的経路に関与する遺伝子を同定する方法を開発したのみならず，このプロセスにおいて，次に植物中でその遺伝子を特異的にダウンレギュレートするために用いることができるｓｉＮＡを開発しうる方法を開発した。

実施例４：遺伝子標的を評価するために用いるｓｉＮＡ標的部位の選択
以下の非限定的工程を用いて，所定の遺伝子配列または転写産物を標的とするｓｉＮＡの選択を行うことができる。

１．標的配列をインシリコで解析して，標的配列中に含まれる特定の長さのすべてのフラグメントまたはサブ配列，例えば２３ヌクレオチドフラグメントのリストを作成する。この工程は，典型的にはあつらえのＰｅｒｌスクリプトを用いて行うが，市販の配列分析プログラム，例えば，Ｏｌｉｇｏ，ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，またはｔｈｅＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅも同様に用いることができる。

２．場合によっては，ｓｉＮＡは２以上の標的配列に対応する。これは，例えば，多くの異なる株のウイルス配列を標的とする場合，同じ遺伝子の異なる転写産物を標的とする場合，２以上の遺伝子の異なる転写産物を標的とする場合，またはヒト遺伝子と動物ホモログとの両方を標的とする場合に生じうる。この場合には，それぞれの標的について特定の長さのｓｉＮＡ試薬のサブ配列のリストを生成し，次にリストを比較して，各リスト中でマッチング配列を見いだす。次に，サブ配列を，所定のサブ配列を含む標的配列の数にしたがってランク付けする。この目的は，標的配列のほとんどまたはすべてに存在するサブ配列を見いだすことである。あるいは，ランク付けにより，標的配列にユニークなサブ配列，例えば変異体標的配列を同定することができる。このような方法により，変異体配列を特異的に標的とし，正常な配列の発現に影響を及ぼさないｓｉＮＡの使用が可能となるであろう。

３．場合によっては，ｓｉＮＡのサブ配列は，１またはそれ以上の配列中には存在しないが，所望の標的配列中に存在する。これは，ｓｉＮＡが標的とされないままでいるべきパラロガスファミリーのメンバーを有する遺伝子を標的とする場合に生じうる。上述のケース２におけるように，それぞれの標的について特定の長さのサブ配列のリストを生成し，次にリストを比較して，標的遺伝子中に存在するが標的ではないパラログ中には存在しない配列を見いだす。

４．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，ＧＣ含量にしたがってランク付けすることができる。３０−７０％のＧＣを含有する部位が好ましく，４０−６０％のＧＣを含有する部位がさらに好ましい。

５．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，自己フォールディングおよび内部ヘアピンにしたがってランク付けすることができる。内部フォールディングがより弱いことが好ましい。強いヘアピン構造は回避すべきである。

６．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，配列中にＧＧＧまたはＣＣＣの連続を有するか否かにしたがってランク付けすることができる。いずれかの鎖にＧＧＧ（またはさらに多いＧ）が存在すると，オリゴヌクレオチド合成に問題が生じることがある。したがって，よりよい配列が利用可能である限り，これは回避する。ＣＣＣは反対側の鎖にＧＧＧを配置するため，標的鎖中で検索する。

７．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して，配列の３’末端にジヌクレオチドＵＵ（ウリジンジヌクレオチド）を，および／または配列の５’末端にＡＡ（アンチセンス配列に３’ＵＵを生ずる）を有するか否かにしたがってランク付けする。これらの配列により，末端ＴＴチミジンジヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子を設計することが可能となる。

８．上述のようにランク付けされたサブ配列のリストから４−１０個の標的部位を選択する。次に，例えば，２３ヌクレオチドを有するサブ配列において，それぞれの選択された２３−ｍｅｒサブ配列の右側２１ヌクレオチドをｓｉＮＡデュープレックスの上側（センス）鎖用に設計し合成し，一方，それぞれの選択された２３−ｍｅｒサブ配列の左側２１ヌクレオチドの逆相補鎖をｓｉＮＡデュープレックスの下側（アンチセンス）鎖用に設計し合成する。末端ＴＴ残基が配列にとって望ましい場合には（ケース７に記載されるように），オリゴを合成する前にセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の２つの３’末端ヌクレオチドをＴＴで置き換える。

９．ｓｉＮＡ分子をインビトロ，培養細胞または動物モデル系においてスクリーニングして，最も活性なｓｉＮＡ分子，または標的ＲＮＡ配列中の最も好ましい標的部位を同定する。

実施例５：標的評価のためのｓｉＮＡの設計
ｓｉＮＡの標的部位は，本明細書の実施例７に記載されるようなインビトロｓｉＮＡシステムを用いて，ＲＮＡ標的の配列を分析し，任意にフォールディング（ｓｉＮＡの標的へのアクセス可能性を判定するために分析される任意の所与の配列の構造）に基づいて標的部位に優先順位を付けることにより，選択した。ｓｉＮＡ分子は，それぞれの標的に結合することができるように設計し，任意に個々にコンピュータフォールディングにより分析して，ｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用しうるか否かを評価する。任意にｓｉＮＡ分子の長さを変化させて，活性を最適化することができる。一般に，標的ＲＮＡと結合するかさもなくばこれと相互作用する十分な数の相補的ヌクレオチド塩基が選択されるが，種々の長さまたは塩基組成のｓｉＮＡデュープレックスに適応させるように，相補性の程度を調節することができる。そのような方法論を用いることにより，ｓｉＮＡ分子は，任意の既知のＲＮＡ配列，例えば，任意の遺伝子転写産物に対応するＲＮＡ配列中の部位を標的とするよう設計することができる。

実施例６：ｓｉＮＡの化学合成および精製
ｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡメッセージ中の種々の部位，例えば，本明細書に記載されるＲＮＡ配列中の標的配列と相互作用するよう設計することができる。ｓｉＮＡ分子の一方の鎖の配列は，上述した標的部位配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は，本明細書に記載される方法を用いて化学的に合成することができる。対照配列として用いられる不活性ｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子の配列を標的配列に相補的ではないようにスクランブル化することにより，合成することができる。一般に，ｓｉＮＡコンストラクトは，本明細書に記載されるように，固相オリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成することができる（例えば，Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，米国特許５，８０４，６８３；５，８３１，０７１；５，９９８，２０３；６，１１７，６５７；６，３５３，０９８；６，３６２，３２３；６，４３７，１１７；６，４６９，１５８；Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，米国特許６，１１１，０８６；６，００８，４００；６，１１１，０８６を参照（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。

非限定的例においては，ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，当該技術分野において知られるように，ホスホルアミダイト化学を用いて段階的様式で合成する。標準的なホスホルアミダイト化学においては，５’−Ｏ−ジメトキシトリチル，２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル，３’−Ｏ−２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト基，および環外アミン保護基（例えば，Ｎ６−ベンゾイルアデノシン，Ｎ４−アセチルシチジン，およびＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオシドを使用する。あるいは，Ｓｃａｒｉｎｇｅ（上掲）により記載されるように，ＲＮＡの合成において２’−Ｏ−シリルエーテルを酸不安定性２’−Ｏ−オルトエステル保護基と組み合わせて用いてもよい。異なる２’化学は異なる保護基を必要とし，例えば，Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，米国特許５，６３１，３６０（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるように，２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドにはＮ−フタロイル保護を用いることができる。

固相合成の間に，各ヌクレオチドを順番に（３’−から５’−方向に）固体支持体結合オリゴヌクレオチドに付加する。鎖の３’末端の最初のヌクレオシドを種々のリンカーを用いて固体支持体（例えば，調整多孔ガラスまたはポリスチレン）に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体，リボヌクレオシドホスホルアミダイト，および活性化剤を混合して，第１のヌクレオシドの５’末端上に第２のヌクレオシドホスホルアミダイトをカップリングさせる。次に支持体を洗浄し，未反応５’−ヒドロキシル基を無水酢酸等のキャッピング試薬を用いてキャッピングして，不活性な５’−アセチル成分を得る。次に３価リン結合を酸化してより安定なリン酸結合とする。ヌクレオチド付加サイクルの最後に，適当な条件下で（例えば，トリチル系の基については酸性条件，シリル系の基についてはフッ化物を用いて），５’−Ｏ−保護基を切断する。それぞれの次のヌクレオチドについてこのサイクルを繰り返す。

合成条件を改変して，例えば，合成すべきｓｉＮＡの特定の化学組成に応じて，異なるカップリング時間，異なる試薬／ホスホルアミダイト濃度，異なる接触時間，異なる固体支持体および固体支持体リンカー化学を用いることにより，カップリング効率を最適化することができる。ｓｉＮＡの脱保護および精製は，一般に記載されているようにして行うことができる（Ｖａｒｇｅｅｓｅら，米国特許出願１０／１９４，８７５（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）またはＳｃａｒｉｎｇｅ（上掲））。

さらに，脱保護条件を改変して，可能な限り最高の収量および純度のｓｉＮＡコンストラクトを得る。例えば，本出願人は，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは不適切な脱保護条件下で分解しうることを見いだした。そのようなオリゴヌクレオチドは，水性メチルアミンを用いて約３５℃で３０分間脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドをも含む場合には，水性メチルアミンで約３５℃で３０分間脱保護した後，ＴＥＡ−ＨＦを加え，反応液をさらに１５分間約６５℃に維持する。

実施例７：ｓｉＮＡ活性を評価するためのＲＮＡｉインビトロアッセイ
ＲＮＡｉを無細胞システムにおいて再現するインビトロアッセイを用いて，ＲＮＡ標的を標的とするｓｉＮＡを評価することができる。アッセイは，Ｔｕｓｃｈｌら（１９９９，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７）およびＺａｍｏｒｅら（２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３）に記載され，標的ＲＮＡ用に適合させた系を含む。シンシチウム胚盤葉に由来するショウジョウバエ抽出物を用いてインビトロでＲＮＡｉ活性を再構築する。標的ＲＮＡは，適当なプラスミドからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写することにより，または本明細書に記載されるように化学合成により作製する。センスおよびアンチセンスｓｉＮＡ鎖（例えば各２０μＭ）は，緩衝液（例えば，１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．４，２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で９０℃で１分間，次に３７℃で１時間インキュベートすることによりアニーリングさせ，次に溶解緩衝液（例えば１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４），２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈する。アニーリングは，アガロースゲルを用いてＴＢＥ緩衝液でゲル電気泳動し，臭化エチジウムで染色することによりモニターすることができる。ショウジョウバエの溶解物は，ＯｒｅｇｏｎＲハエからの０−２時間齢の胚を用いて調製し，酵母糖蜜寒天上に回収し，絨毛膜を除去し溶解する。溶解物を遠心分離し，上清を単離する。アッセイは，５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］，ＲＮＡ（１０−５０ｐＭの最終濃度），およびｓｉＮＡ（１０ｎＭの最終濃度）を含む１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物はまた，１０ｍＭのクレアチンリン酸，１０μｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ，１００μＭのＧＴＰ，１００μＭのＵＴＰ，１００μＭのＣＴＰ，５００μＭのＡＴＰ，５ｍＭのＤＴＴ，０．１Ｕ／μＬのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ），および１００μＭの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度は１００ｍＭに調節する。反応は氷上で予め組立て，２５℃で１０分間プレインキュベートした後にＲＮＡを加え，２５℃でさらに６０分間インキュベートする。４倍容量の１．２５ｘＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で反応を停止させる。標的ＲＮＡの切断は，ＲＴ−ＰＣＲ分析または当該技術分野において知られる他の方法によりアッセイし，反応からｓｉＮＡが省略されている対照反応と比較する。

あるいは，アッセイ用の内部標識した標的ＲＮＡを［α−³²Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し，さらに精製することなく標的ＲＮＡとして用いる。任意に，標的ＲＮＡはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて５’−³²Ｐ末端標識してもよい。アッセイは上述のようにして行い，標的ＲＮＡおよびＲＮＡｉにより生成する特異的ＲＮＡ切断産物をゲルのオートラジオグラフィーで可視化する。切断のパーセントは，無傷の対照ＲＮＡまたはｓｉＮＡなしの対照反応からのＲＮＡ，およびアッセイにより生成する切断産物を表すバンドをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（登録商標）で定量することにより決定する。

１つの態様においては，このアッセイを用いて，ｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉ切断のためのＲＮＡ標的中の標的部位を決定する。すなわち，例えば，標識した標的ＲＮＡの電気泳動によりアッセイ反応を分析することにより，またはノザンブロットにより，ならびに当該技術分野において知られる他の方法論により，複数のｓｉＮＡコンストラクトをＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介性切断についてスクリーニングする。

本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用されるすべての参考文献は，それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。

当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される方法および組成物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。

当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。すなわち，そのような追加の態様は，本発明および特許請求の範囲の範囲内である。

本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的になる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。

さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループまたは他の代替グループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。

図１は，ＲＮＡｉに含まれる標的ＲＮＡ分解の非限定的な提唱されるメカニズムを示す概略図である。図２は，本発明の種々のｓｉＮＡコンストラクトの非限定的例を示す。図３は，本発明の完全にランダムなライブラリを生成するために用いられるｓｉＮＡコンストラクトの非限定的例を示す。図４は，本発明における標的発見に用いられるプロセスの代表例の概略の非限定的例を示す。図５は，本発明のｓｉＮＡコンストラクトを用いて植物細胞において標的を発見する一般的方法の非限定的例を示す概略図である。図６は，本発明のｓｉＮＡコンストラクトを用いる標的発見およびアクセス可能な標的部位の決定の一般的方法の非限定的例を示す。図７は，マルチマーおよびモノマーランダムライブラリコンストラクトの概略図である。図８は，発現カセットを生成して本発明のランダムｓｉＮＡヘアピンライブラリを生成するために用いられるスキームの概略図である。図９は，発現カセットを生成して本発明のランダム二本鎖ｓｉＮＡライブラリを製造するために用いられるスキームの概略図である。

Claims

生物学的システムにおいてプロセスを調節しうる核酸分子を同定する方法であって，
ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを調節するのに適した条件下で該生物学的システムに導入し；そして
ｂ）プロセスが調節された生物学的システムからのｓｉＮＡコンストラクトの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定して，生物学的システムにおいてプロセスを調節しうる核酸分子を同定する，
の各工程を含む方法。
生物学的システムにおいてプロセスに関与する１またはそれ以上の核酸分子を同定する方法であって，
ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを調節するのに適した条件下で該生物学的システムに導入し；
ｂ）プロセスが変化した生物学的システム中に存在するｓｉＮＡコンストラクトを同定し；そして
ｃ）（ｂ）からのｓｉＮＡコンストラクトの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定して，生物学的システムにおいてプロセスに関与する１またはそれ以上の核酸分子を同定する，
の各工程を含む方法。
生物学的システムにおいてプロセスを調節しうるｓｉＮＡコンストラクトを同定する方法であって，
ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを調節するのに適した条件下で該生物学的システムに導入し；そして
ｂ）プロセスが調節された生物学的システムからのｓｉＮＡコンストラクトを同定する，
の各工程を含む方法。
前記生物学的システムが哺乳動物起源のものである，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
前記生物学的システムがヒト起源のものである，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
前記ｓｉＮＡが自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を有する二本鎖ＲＮＡである，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
前記ｓｉＮＡが一本鎖ＲＮＡである，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
前記一本鎖ｓｉＮＡが自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を有する，請求項７記載の方法。
前記プロセスが，成長，増殖，アポトーシス，形態，血管新生，分化，移動，ウイルス増殖，薬剤耐性，シグナル伝達，細胞サイクル制御，温度感受性および化学物質感受性からなる群より選択される，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
前記ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリが，前記核酸ｓｉＮＡコンストラクトの発現を可能とする様式で発現ベクターにコードされるｓｉＮＡコンストラクトを含む，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
前記発現ベクターが，
ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；および
ｃ）少なくとも１つのｓｉＮＡをコードする遺伝子，
を含み，ここで，遺伝子は，ｓｉＮＡの発現またはデリバリーまたはその両方を可能とする様式で開始領域および終止領域に動作可能なように連結されている，請求項１０記載の方法。
発現ベクターが，
ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；
ｃ）オープンリーディングフレーム；および
ｄ）少なくとも１つのｓｉＮＡをコードする遺伝子，
を含み，ここで，遺伝子は，オープンリーディングフレームの３’末端に動作可能なように連結されており，遺伝子は，ｓｉＮＡの発現またはデリバリーまたはその両方を可能とする様式で，開始領域，オープンリーディングフレームおよび終止領域に動作可能なように連結されている，請求項１１記載の方法。
発現ベクターが，
ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；
ｃ）イントロン；および
ｄ）少なくとも１つのｓｉＮＡをコードする遺伝子，
を含み，ここで，遺伝子は，ｓｉＮＡの発現またはデリバリーまたはその両方を可能とする様式で開始領域，イントロンおよび終止領域に動作可能なように連結されている，請求項１１記載の方法。
発現ベクターが，
ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；
ｃ）イントロン；
ｄ）オープンリーディングフレーム；および
ｅ）少なくとも１つのｓｉＮＡをコードする遺伝子，
を含み，ここで，遺伝子はオープンリーディングフレームの３’末端に動作可能なように連結されており，遺伝子はｓｉＮＡの発現またはデリバリーまたはその両方を可能とする様式で，開始領域，イントロン，オープンリーディングフレームおよび終止領域に動作可能なように連結されている，請求項１１記載の方法。
発現ベクターがレトロウイルスに由来する，請求項１１記載の方法。
発現ベクターがアデノウイルスに由来する，請求項１１記載の方法。
発現ベクターがアデノ随伴ウイルスに由来する，請求項１１記載の方法。
発現ベクターがアルファウイルスに由来する，請求項１１記載の方法。
発現ベクターが細菌プラスミドに由来する，請求項１１記載の方法。
発現ベクターがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター要素に動作可能なように連結されている，請求項１１記載の方法。
発現ベクターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター要素に動作可能なように連結されている，請求項１１記載の方法。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターがトランスファーＲＮＡ遺伝子に由来する，請求項２１記載の方法。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターがＵ６小核ＲＮＡ遺伝子に由来する，請求項２１記載の方法。
ｓｉＮＡ転写産物がその５’末端にＵ６小核ＲＮＡ遺伝子によりコードされる末端２７ヌクレオチドと相同的な配列を含む，請求項２１記載の方法。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターがＴＲＺＲＮＡ遺伝子に由来する，請求項２４記載の方法。
生物学的システムが真核生物起源のものである，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
ｓｉＮＡがＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さのものである，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
ｓｉＮＡが，それぞれ約１９−約２３ヌクレオチドの長さを有するセンス領域およびアンチセンス領域を含む，請求項２７記載の方法。
ｓｉＮＡが，ｓｉＮＡのセンス領域，アンチセンス領域，またはセンス領域およびアンチセンス領域の両方に約１−約３ヌクレオチドの３’−ヌクレオチドオーバーハングを含む，請求項２７記載の方法。
３’−ヌクレオチドオーバーハングが２ヌクレオチドを含む，請求項２９記載の方法。
ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリがランダムライブラリである，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
ｓｉＮＡコンストラクトのランダムライブラリがマルチマーランダムライブラリである，請求項３１記載の方法。
マルチマーランダムライブラリが少なくとも１つのｓｉＮＡを含む，請求項３２記載の方法。
生物学的システムにおいてプロセスを調節しうるｓｉＮＡコンストラクトのファミリーを同定する方法であって，
ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを調節するのに適した条件下で該生物学的システムに導入し；そして
ｂ）プロセスが調節された生物学的システムからｓｉＮＡコンストラクトのファミリーを同定する，
の各工程を含む方法。
生物学的システムにおいてプロセスを調節しうる核酸分子のファミリーを同定する方法であって，
（ａ）ｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生物学的システムにおいてプロセスを調節するのに適した条件下で該生物学的システムに導入し；そして
（ｂ）プロセスが変化した生物学的システム中に存在するｓｉＮＡコンストラクトのファミリーを同定し；そして
（ｃ）（ｂ）において同定されたｓｉＮＡコンストラクトのファミリーの少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定して，生物学的システムにおいてプロセスに関与する核酸分子のファミリーを同定する，
の各工程を含む方法。
ｓｉＮＡが化学的に修飾されている，請求項１−３のいずれかに記載の方法。