JP5529732B2 - 前立腺癌における再発性遺伝子融合 - Google Patents

前立腺癌における再発性遺伝子融合 Download PDF

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Description

本出願は、２００５年９月１２日申請の米国特許仮出願第６０／７１６，４３６号、２００６年３月３日申請の特許仮出願第６０／７７９，０４１号、２００５年１０月２７日申請の特許仮出願第６０／７３０，３５８号、および２００６年４月２８日申請の特許仮出願第６０／７９５，５９０号に基づく優先権を主張する、２００６年９月１２日申請の出願第１１／５１９，３９７号の一部継続出願である、２００７年７月６日申請の年米国特許出願第１１／８２５，５５２号に基づき、その優先権を主張する。ここで、これらの特許出願の全容を参照により援用する。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＣＡ０６９５６８およびＣＡｌ１１１２７５に基づく米国政府の支援のもとに実施されたものであり、本政府は本発明に何らかの権利を有する。
発明の属する分野
本発明は、癌の診断、研究、および治療に関する組成物および方法に関するものであり、これらには限定されないが、癌マーカー等を含む。特に本発明は、診断用マーカーとしての再発性遺伝子融合および前立腺癌に対する臨床標的に関する。
発明の背景
癌研究における主なる目的は、発癌において必然的に発癌に結びつく異常な遺伝子を同定することである。これまで同定された体細胞変異の数種として、塩基置換、挿入、欠失、転位、そして染色体増加および消失があり、これらのいずれもが、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の異常活性を生じる。１９００年代初期に仮説が立てられ、癌における染色体再編成についての原因となる役割に関する有力な証拠が現在ある（Ｒｏｗｌｅｙ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １：２４５（２００１）（非特許文献１））。再発性染色体異常は、主として、白血病、リンパ腫、および肉腫の特徴であると考えられた。より一層一般的で、ヒトの癌に伴う罹患率および死亡率の比較的大部分に寄与する上皮腫瘍（癌腫）は、既知のもの１％未満であり、疾患特異性染色体再編成である（Ｍｉｔｅｌｍａｎ，Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４６２：２４７（２０００）（非特許文献２））。血液悪性腫瘍が平衡のとれた疾患特異性染色体再編で特徴付けられることが多いのに対し、多くの固形腫瘍は非特異性染色体異常の過多を有する。固形腫瘍の核型の複雑性は、癌の進化または進行を通じて取得した第２の変化によるものであると考えられている。
染色体再編成に関して２つの主要機構が述べられてきた。一機構では、１つの遺伝子のプロモーター／エンハンサーエレメントは、原癌遺伝子に隣接して再配列され、これにより発癌性タンパク質の異常発現を引き起こす。この種の転位は、免疫グロブリン（ＩＧ）とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の、ＢおよびＴ細胞悪性腫瘍それぞれにおけるこの癌遺伝子の活性化をもたらすＭＹＣへの並置で例示される（Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：１４３（１９９４）（非特許文献３））。第２の機構においては、再配列は２つの遺伝子の融合を生じ、これにより新しい機能または異常活性を有する可能性のある融合タンパク質を生成する。この転位の原型の例は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）におけるＢＣＲ-ＡＢＬ遺伝子融合である（Ｒｏｗｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ ４３：２９０（１９７３）（非特許文献４）；ｄｅ Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３００：７６５（１９８２）（非特許文献５））。重要なことに、この知見は、ＢＣＲ-ＡＢＬキナーゼ（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０５：２６４０（２００５）（非特許文献６））をうまく標的にするメチル酸イマチニブの合理的開発へと導いた（Ｇｌｅｅｖｅｃ）。従って通常の上皮腫瘍における再発性遺伝子の再配列の同定は、患者の治療はもちろん癌治療薬の発見努力に対する深い意味がある可能性がある。
Ｒｏｗｌｅｙ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １：２４５（２００１） Ｍｉｔｅｌｍａｎ，Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４６２：２４７（２０００） Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：１４３（１９９４） Ｒｏｗｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ ４３：２９０（１９７３） ｄｅ Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３００：７６５（１９８２） Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０５：２６４０（２００５）
いくつかの実施形態において、本発明は、患者から試料を採取する工程と、アンドロゲン制御遺伝子（ＡＲＧ）（例えば、ＳＬＣ４５Ａ３、ＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑｌ １．２３またはＣ１５ＯＲＦ２１）またはハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）（例えば、ＨＮＲＰ Ａ２Ｂ１）の転写制御領域由来の５´部分と、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子（例えば、ＥＴＶ１）由来の３´部分とを有する遺伝子融合の、試料中での存在または非存在を検出する工程であって、該工程において試料中の遺伝子融合の存在が患者の前立腺癌を示すものである工程とを含む、患者の前立腺癌を診断する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域由来の５´部分は、ＡＲＧまたはＨＧのプロモーター領域を有する。いくつかの実施形態において、前記の検出工程は、ＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域由来の５´部分とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とを有するゲノムＤＮＡの染色体再編成の検出を含む。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡの染色体再編成の検出は、核酸配列決定法、核酸ハイブリッド形成法（例えば、インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイまたはサザンブロット）、または核酸増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ））を用いることを含む。いくつかの実施形態において、前記検出工程は、ＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域由来の５´部分と、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とを有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む。いくつかの実施形態において、キメラｍＲＮＡ転写物の検出は、核酸配列決定法、核酸ハイブリッド形成法（例えば、インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイまたはノーザンブロット法）、または核酸増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ））を用いることを含む。いくつかの実施形態において、試料は、組織、血液、血漿、血清、尿、尿の上澄み、尿細胞ペレット、精液、前立腺液、または前立腺細胞である。
また別の実施形態において、本発明は、患者から試料を採取する工程と、試料中の、アンドロゲン制御遺伝子（例えば、ＴＭＰＲＳＳ２またはＳＬＣ４５Ａ３）由来の５´部分と、ＥＴＶ５由来の３´部分とを有する遺伝子融合の存在または非存在を検出する工程とを含み、試料中の遺伝子融合の存在がその患者の前立腺癌を示すものである、患者の前立腺癌を診断する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＲＧの転写制御領域由来の５´部分は、ＡＲＧプロモーター領域を有する。いくつかの実施形態において、前記検出工程は、ＡＲＧの転写制御領域由来の５´部分と、ＥＴＶ５由来の３´部分とを有するゲノムＤＮＡの染色体再編成の検出を含む。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡの染色体再編成の検出は、核酸配列決定法、核酸ハイブリッド形成法（例えば、インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイまたはサザンブロット）、または核酸増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ））を用いることを含む。いくつかの実施形態において、前記検出工程は、ＡＲＧの転写制御領域由来の５´部分と、ＥＴＶ５由来の３´部分とを有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む。いくつかの実施形態において、キメラｍＲＮＡ転写物の検出は、核酸配列決定法、核酸ハイブリッド形成法（例えば、インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイまたはノーザンブロット法）、あるいは核酸増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ））を用いることを含む。いくつかの実施形態において、試料は、組織、血液、血漿、血清、尿、尿の上澄み、尿細胞ペレット、精液、前立腺液、または前立腺細胞である。
本発明のさらなる実施形態は、以下の記述および例に示している。
[請求項101]
(a)患者から試料を採取する工程と、
(b)SLC45A3、HERV-K_22qll.23、およびC15ORF21からなる群より選ばれるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の5´部分と、ETSファミリーメンバー遺伝子由来の3´部分とを有する遺伝子融合の、前記試料中での存在または非存在を検出する工程と
を含み、試料中の遺伝子融合の存在がその患者の前立腺癌を示す、患者の前立腺癌を診断する方法。
[請求項102]
前記アンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域が、アンドロゲン制御遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項101記載の方法。
[請求項103]
ETSファミリーメンバー遺伝子がETV1である請求項101記載の方法。
[請求項104]
前記工程(b)が、アンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来5´部分と、ETSファミリーメンバー遺伝子由来の3´部分とを有するゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項101記載の方法。
[請求項105]
前記工程(b)が、核酸配列決定法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項104記載の方法。
[請求項106]
前記工程(b)が、核酸ハイブリッド形成法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項104記載の方法。
[請求項107]
前記工程(b)が、インサイツハイブリダイゼーション(ISH)、マイクロアレイ、およびサザンブロットからなる群から選ばれる核酸ハイブリッド形成法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項106記載の方法。
[請求項108]
前記工程(b)が、核酸増幅法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項104記載の方法。
[請求項109]
前記工程(b)が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT‐PCR)、転写介在増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列ベース増幅(NASBA)からなる群より選ばれる核酸増幅法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項108記載の方法。
[請求項110]
前記工程(b)が、アンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の5´部分とETSファミリーメンバー遺伝子由来の3´部分とを有するキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項101記載の方法。
[請求項111]
前記工程(b)が、核酸配列決定法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項110記載の方法。
[請求項112]
前記工程(b)が、核酸ハイブリッド形成法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項110記載の方法。
[請求項113]
前記工程(b)が、インサイツハイブリダイゼーション(ISH)、マイクロアレイおよびノーザンブロット法からなる群より選ばれる核酸ハイブリッド形成法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項112記載の方法。
[請求項114]
前記工程(b)が、核酸増幅法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項110記載の方法。
[請求項115]
前記工程(b)が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT‐PCR)、転写介在増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列ベース増幅(NASBA)からなる群より選ばれる核酸増幅法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項114記載の方法。
[請求項116]
前記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿の上澄み、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物、および前立腺細胞からなる群より選ばれる、請求項101記載の方法。
[請求項117]
(a)患者から試料を採取する工程と、
(b)ハウスキーピング遺伝子の転写制御領域由来5´部分と、ETSファミリーメンバー遺伝子由来の3´部分とを有する遺伝子融合の、前記試料中での存在または非存在を検出する工程と
を含み、試料中の遺伝子融合の存在が患者の前立腺癌を示す、患者の前立腺癌を診断する方法。
[請求項118]
前記ハウスキーピング遺伝子がHNRP A2 B1である請求項117記載の方法。
[請求項119]
前記ETSファミリーメンバー遺伝子がETV1である請求項117記載の方法。
[請求項120]
前記ハウスキーピング遺伝子の転写制御領域が、ハウスキーピング遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項117記載の方法。
[請求項121]
前記工程(b)が、ハウスキーピング遺伝子の転写制御領域由来の5´部分と、ETSファミリーメンバー遺伝子由来の3´部分とを有するゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項117記載の方法。
[請求項122]
前記工程(b)が、核酸配列決定法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項121記載の方法。
[請求項123]
前記工程(b)が、核酸ハイブリッド形成法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項121記載の方法。
[請求項124]
前記工程(b)が、インサイツハイブリダイゼーション(ISH)、マイクロアレイ、およびサザンブロット法からなる群より選ばれる核酸ハイブリッド形成法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項123記載の方法。
[請求項125]
前期工程(b)が、核酸増幅法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項121記載の方法。
[請求項126]
前記工程(b)が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT‐PCR)、転写介在増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列ベース増幅(NASBA)からなる群より選ばれる核酸増幅法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項125記載の方法。
[請求項127]
前記工程(b)が、ハウスキーピング遺伝子の転写制御領域由来の5´部分と、ETSファミリーメンバー遺伝子由来の3´部分とを有するキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項117記載の方法。
[請求項128]
前記工程(b)が、核酸配列決定法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項127記載の方法。
[請求項129]
前記工程(b)が、核酸ハイブリッド形成法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項127記載の方法。
[請求項130]
前記工程(b)が、インサイツハイブリダイゼーション(ISH)、マイクロアレイおよびノーザンブロット法からなる群から選ばれる核酸ハイブリッド形成法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項129記載の方法。
[請求項131]
前記工程(b)が、核酸増幅法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項127記載の方法。
[請求項132]
前記工程(b)が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT‐PCR)、転写介在増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列ベース増幅(NASBA)からなる群より選ばれる核酸増幅法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項131記載の方法。
[請求項133]
前記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿の上澄み、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物、および前立腺細胞からなる群より選ばれる、請求項117記載の方法。
[請求項134]
(a)患者から試料を採取する工程と、
(b)アンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来5´部分と、ETV5由来の3´部分とを有する遺伝子融合の、前記試料中での存在または非存在を検出する工程と
を含み、試料中の遺伝子融合の存在が患者の前立腺癌を示す、患者の前立腺癌を診断する方法。
[請求項135]
前記アンドロゲン制御遺伝子が、TMPRSS2とSLC45A3とからなる群より選ばれる、請求項134記載の方法。
[請求項136]
前記アンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域が、アンドロゲン制御遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項134記載の方法。
[請求項137]
前記工程(b)が、アンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来5´部分と、ETV5由来の3´部分とを有するゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項134記載の方法。
[請求項138]
前記工程(b)が、核酸配列決定法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項137記載の方法。
[請求項139]
前記工程(b)が、核酸ハイブリッド形成法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項137記載の方法。
[請求項140]
前記工程(b)が、インサイツハイブリダイゼーション(ISH)、マイクロアレイ、およびサザンブロットからなる群より選ばれる核酸ハイブリッド形成法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項139記載の方法。
[請求項141]
前記工程(b)が、核酸増幅法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項137記載の方法。
[請求項142]
前記工程(b)が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT‐PCR)、転写介在増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列ベース増幅(NASBA)からなる群より選ばれる核酸増幅法を利用してゲノムDNAの染色体再編成を検出することを含む、請求項141記載の方法。
[請求項143]
前記工程(b)が、アンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来5´部分と、ETV5由来の3´部分とを有するキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項134記載の方法。
[請求項144]
前記工程(b)が、核酸配列決定法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項143記載の方法。
[請求項145]
前記工程(b)が、核酸ハイブリッド形成法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項143記載の方法。
[請求項146]
前記工程(b)が、インサイツハイブリダイゼーション(ISH)、マイクロアレイおよびノーザンブロット法からなる群より選ばれる核酸ハイブリッド形成法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項145記載の方法。
[請求項147]
前記工程(b)が、核酸増幅法を利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項143記載の方法。
[請求項148]
前記工程(b)が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT‐PCR)、転写介在増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列ベース増幅(NASBA)からなる群より選ばれる核酸増幅法利用してキメラmRNA転写物を検出することを含む、請求項147記載の方法。
[請求項149]
前記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿の上澄み、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物、および前立腺細胞からなる群より選ばれる、請求項134記載の方法。
マイクロアレイデータの癌の例外事象の解析（ＣＯＰＡ）を示す。（Ａ）２つの大量遺伝子発現研究におけるすべての解析試料から得られたＥＴＶ１（図中左）およびＥＲＧ（図中、中央）発現（正規化発現ユニット）を示す。（Ｂ）（Ａ）に示すように、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションからのデータ以外の試料を使用した。（Ｃ）（Ａ）に示すように、複数の骨髄腫における免疫グロブリン重鎖プロモーター（ＩｇＨ）への既知の転位を有する癌遺伝子（ＦＧＦＲ３およびＣＣＮＤｌ）を試験した。 前立腺癌（ＰＣＡ）におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合の同定および特性決定を示す。（Ａ）前立腺癌細胞株（ＤｕＣａＰ、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ）およびホルモン抵抗性転移性（ＭＥＴ）前立腺癌組織を、ＥＲＧ（■）およびＥＴＶ１（□）ｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により解析したものである。（Ｂ）ＬＮＣａＰ細胞と比較した、ＭＥＴ２６におけるＥＴＶ１エクソン２および３の過剰発現の消失。（Ｃ）ＴＭＰＲＳＳ２への遺伝子融合を明らかにする、ＭＥＴ２６-ＬＮにおけるＥＴＶ１およびＭＥＴ２８-ＬＮにおけるＥＲＧに対する、ｃＤＮＡ末端（ＲＬＭ-ＲＡＣＥ）の５´ＲＮＡリガーゼ介在性急速増幅の概略的結果。（Ｄ）ＭＥＴ２６-ＬＮおよびＭＥＴ２６-ＲＰにおいて転位特異性ＱＰＣＲを用いたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１発現の検証。（Ｅ）細胞株およびＰＣＡ試料において転位特異性ＱＰＣＲを用いたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ発現の検証。 ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１遺伝子融合およびＥＲＧ遺伝子再配列を確認する、ホルマリン固定 パラフィン包埋組織切片での間期蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、ＴＭＰＲＳＳ２（緑シグナル）とＥＴＶ１（赤シグナル）の融合を検出するための２色、融合シグナルアプローチを示す。（Ｃ）および（Ｄ）は、ＥＲＧの５´（緑シグナル）および３´（赤シグナル）領域に及ぶ２つのプローブを２色分断シグナルアプローチに用いたＥＲＧ遺伝子再配列の検出を示す。（Ｅ）は、臨床的に局在化した前立腺癌（ＰＣＡ）の１３症例と転移性前立腺癌（ＭＥＴ）の１６症例由来のコアを含む独立組織マイクロアレイに（Ａ-Ｄ）と同じプローブを用いたＦＩＳＨ結果のマトリックス表示を示す。 ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転位を保有する前立腺癌細胞におけるＥＲＧのアンドロゲン制御を示す。 癌の例外事象の解析（ＣＯＰＡ）を示す。図５Ａは、ＣＯＰＡ解析の概略を示す。図５Ｂは、ＲＵＮＸｌＴｌ（ＥＴＯ）がＶａｌｋらの急性骨髄性白血病データセット（ｎ=２９３）における９０パーセンタイルでの最も高いスコアの例外事象を有したことを示す。 ＴＭＰＲＳＳ２（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂ融合）との遺伝子融合を明らかにする、ＭＥＴ２６-ＬＮにおけるＥＴＶ１およびＰＣＡ４におけるＥＲＧについてのｃＤＮＡ末端（ＲＬＭ-ＲＡＣＥ）のＲＮＡリガーゼ介在性急速増幅結果の概略を示す。 前立腺癌におけるＥＴＳファミリーメンバーの過剰発現を示す。全体解剖組織（Ａ）、またはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより摘出した組織（Ｂ）由来のプロファイルした良性前立腺、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、臨床的に局在化した前立腺癌、および転移性前立腺癌におけるモニターしたＥＴＳファミリーメンバーのすべての発現をＯｎｃｏｍｉｎｅを利用して描出したものである。 ＥＴＶ４を過剰発現している、前立腺癌の症例におけるＴＭＰＲＳＳ２およびＥＴＶ４座位の過剰発現を示す。（Ａ）は、プール良性前立腺組織（ＣＰＰ）におけるＥＴＶ４の図示のエクソンまたは領域、ＥＴＶ４を過剰発現せず、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ陽性（ＰＣＡ１-２）または陰性（ＰＣＡ３―４）であった前立腺癌、およびＥＴＶ４超過剰発現を有する我々のＬＣＭコホート由来の前立腺癌の症例（ＰＣＡ５）の発現を示す。（Ｂ）は、ＲＬＭ-ＲＡＣＥが、ＰＣＡ５におけるＴＭＰＲＳＳ２の上流の配列のＥＴＶ４との融合を明らかにしている。（Ｃ）は、ＰＣＡ５における、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ａおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ｂのＱＰＣＲによる発現を示す。（Ｄ）は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織での間期蛍光インサイツハイブリダイゼーションが、ＰＣＡ５における、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＴＶ４座位の融合を確認していることを示す。 例となるＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。 ＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ配列を示す。 ＦＩＳＨによるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合解析を示す。図Ａは、イデオグラム、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合の間接的検出に関する分離分析を描いている。図Ｂは、間質細胞（左）および前立腺癌の腺（右）の間期核を示す。図Ｃは、テロメアプローブの損失により示される分離および同時欠失を示す前立腺癌の腺の間期核（１００ｘ、油浸対物レンズ倍率）である。図Ｄは、テロメアプローブの分離および損失のある２つの核を示す図Ｃの囲み部分の拡大図である（６０ｘ、油浸対物レンズ倍率）。 ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２間での２１番染色体におけるゲノム欠失を示す。図Ａは、６つの細胞株、１３個の異種移植、および１１の転移性ＰＣＡ試料等の試料を、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１状態（陰性をグレーの棒状部分、陽性状態を青の棒状部分で示す）について、ｑＰＣＲおよび／またはＦＩＳＨにより特性決定した結果を示す。図Ｂは、図Ａ中の緑の囲み部分の拡大図である。図Ｃは、図Ａ中の黒の囲み部分の拡大図である。 臨床的に局在化した前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列を病理学的変数と関連させて示している。図Ａは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列が主要ＰＣＡ試料の４９．２％およびホルモン無処置の転移性ＬＮ試料の４１．２％で確認されたことを示す。図Ｂは、ＴＭＰＲＳＳ２：欠失で再配列した腫瘍が、進行した腫瘍段階（ｐ＝０．０３）のＰＣＡ症例の高い割合で観測される傾向にあったことを示す。 ＥＲＧ（セントロメア）とＴＭＰＲＳＳ２（テロメア）との間の２１ｑ２２-２３に位置する既知の遺伝子を示す。黒線上側の遺伝子は、５´セントロメアから３´テロメアに指向しており、黒線下側の遺伝子は、５´テロメアから３´セントロメアに指向している。図の下半分には、ＥＲＧ座位の拡大図をＦＩＳＨプローブで描出している。 欠失（右側の核）のあるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列および欠失のない（左側の核）ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列を示す小領域のみを主に示す「異質性」前立腺癌の症例を示す。 ８つの公開発現アレイデータセットにわたる、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧ間に位置する遺伝子のメタ分析を示す。 ＦＩＳＨ分析が、疾病の進行に伴う、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合に伴う特性欠失を検出していることを示す。図ＡおよびＢは、２１番染色体ｑ２２．２上でのＥＲＧ再配列を分析するため、ビオチン-１４-ｄＣＴＰ標識ＢＡＣクローンＲＰ１１-２４Ａ１１（最終的には赤のシグナル生成するように結合）およびジゴキシゲニン-ｄＵＴＰ標識ＢＡＣクローンＲＰ１１-１３７Ｊ１３（最終的には緑のシグナルを生成するように結合）を有し、ＥＲＧ座位の隣接するセントロメアおよびテロメア領域にそれぞれわたる、分離プローブシステムが使用されている。この分離プローブシステムを用いて、ＥＲＧ再配列のない核は、２対の並置した赤および緑シグナルを示す。並置した赤-緑のシグナルは、黄色の融合シグナルを生成する（図Ｂ矢印）。図Ｃは、累積罹患率回帰モデルにおいて、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧを累積罹患率または転移または前立腺癌特異的な死亡に関する決定因子とした評価を示す。 融合転写物のないＦＬ１１過剰発現を示す。 ＴＭＰＲＳＳ２-ＥＲＧ＋細胞におけるアンドロゲンによるＥＲＧタンパク質発現の誘発を示す。 内在性および融合ＥＲＧポリペプチドの模式図である。 ＥＲＧ２に対する核相互作用因子を示す。 ペプチド抗体についての配列およびＥＲＧｌに対するＡｑｕａＰｒｏｂｅプローブ発生を示す。 ペプチド抗体に対する配列およびＥＴＶ１に対するＡｑｕａＰｒｏｂｅプローブ発生を示す。 ペプチド抗体に対する配列およびＦＬ１１に対するＡｑｕａＰｒｏｂｅプローブ発生を示す。 ペプチド抗体に対する配列およびＥＴＶ４に対するＡｑｕａＰｒｏｂｅプローブ発生を示す。 ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるＥＴＶ１の過剰発現およびアンドロゲン制御を示す。図２６Ａは、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるアンドロゲン制御遺伝子の発現シグネチャーを示す。図２６Ｂは、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞の両者におけるアンドロゲンによるＰＳＡ誘発の定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）による確認を示す。図２６Ｃは、ＬＮＣａＰ細胞におけるアンドロゲンによるＥＴＶ１誘発を示す。図２６Ｄは、ＬＮＣａＰ細胞において顕著に過剰発現されていることを示す。 ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１の再配列を示す。図２７Ａは、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）についてプローブとして使用したＢＡＣの模式図である。図２７Ｂは、ＲＰ１１-１２４Ｌ２２およびＲＰ１１-１１４９Ｊｌ３の、正常な末梢リンパ球（ＮＰＬｓ）における７番染色体への共存を示す。図２７Ｃは、分裂中期スプレッド上（同図上）でのＢＡＣ＃１およびＢＡＣ＃４の局在化を示し、間期細胞（同図下）が、近接４倍体ＬＮＣａＰ細胞株において決定されている。図２７Ｄは、ＲＰ１１-１２４Ｌ２２からのシグナルが、ＬＮＣａＰ細胞内の１４番染色体に局在化されていることを示す。 ＥＴＶ１座位全体がＬＮＣａＰ細胞内の１４番染色体に挿入されていることを示す。図２８Ａは、本実験で使用したＢＡＣの模式図である。図２８Ｂは、分裂中期スプレッド（同図上）と間期細胞（同図下）におけるＲＰ１１-１２４Ｌ２２（ＢＡＣ＃１）およびＲＰ１１-３１３Ｃ２０（ＢＡＣ＃２）の局在化をＬＮＣａＰ細胞内でのＦＩＳＨで決定したことを示す。 ＬＮＣａＰ内でのＥＴＶ１のｓｉＲＮＡノックダウンを示す。 ＶＣａＰにおけるＥＲＧのｓｉＲＮＡノックダウンを示す。 ウイルス過剰発現システムを示す。 遺伝子導入マウスの模式図である。 尿中のＥＲＧとＥＴＶ１転写物の検出を示す。図３３Ａは、ＬＮＣａＰ（高ＥＴＶ１発現）またはＶＣａＰ（高ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ発現）前立腺癌細胞におけるＥＲＧとＥＴＶ１の検出を示す。図３３Ｂは、前立腺癌を有する疑いのある患者の尿中のＥＲＧとＥＴＶ１の検出を示す。 前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ遺伝子融合を検出するのに用いられるアッセイを示す。図３４Ａは、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧについての分離アッセイを示す。１対の分断した５´および３´シグナルにより示されるように、ＥＲＧ再配列陽性の症例（欠失なし）を同図左に示す。１つの３´シグナルの消失に示されるように、ＴＭＰＲＳＳ２再配列陽性の症例（欠失あり）を同図右に示す。図３４Ｂは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１遺伝子融合についての融合アッセイを示す。図３４Ｃは、ＥＴＶ４についての分離アッセイを示す。 ＦＩＳＨにより検出された、ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４再配列を示す。図３５Ａは、図３４に示すアッセイにより検出された、ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４内の再配列についての結果の表を示す。図３４Ｂは、Ａに記載のように４つすべてのアッセイが評価できる３８の症例からのＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４状態のヒートマップ表示である。図３４Ｃは、不調和なＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳ再配列状態を有する症例のヒートマップ表示である。 本発明の遺伝子融合の配列を示す。 ＦＬＩ-Ｉ発現分析についてのプライマーおよびプローブを示す。 前立腺特異的、またはアウトライアー腫瘍試料においてＥＴＶ１に融合した偏在的に活性な制御エレメントの同定を示し、同図ａはＥＴＶ１アウトライアー例の同定、同図ｂは、アウトライアー例におけるＥＴＶ１に融合した新規５´パートナーの構造、同図ｃは、プローブ５´を図示のパートナーへ、３´をＥＴＶ１に用いたＥＴＶ１融合のＦＩＳＨによる確認である。同図ｄは、５´融合パートナーの組織特異性、同図ｅは、５´融合パートナーのアンドロゲン制御の評価を示す。 ｑＰＣＲによる新規ＥＴＶ１遺伝子融合の確認を示す。 ＦＩＳＨによる新規ＥＴＶ１遺伝子融合の確認を示す。同図ａは、間期ＦＩＳＨに対するプローブとして使用したＥＴＶ１、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１、ＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑｌ１.２３、Ｃ１５ＯＲＦ２１およびＳＬＣ４５Ａ３への５´および３´に位置するＢＡＣの模式図である。同図ｂ-ｄは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に対応する蛍光標識で示すようにＢＡＣを用いてＦＩＳＨを実施したものであり、ｂ）は、５´融合パートナーの分断シグナルアッセイ、ｃ）は、５´パートナーとＥＴＶ１の融合、そしてｄ）は、ＥＴＶ１の分断シグナルアッセイである。 前立腺細胞でのＥＴＶ１過剰発現が侵襲性を付与することを示す。同図ａは、ＥＴＶ１遺伝子融合産物（エクソン４-から既報の停止コドン）を発現しているアデノウイルスおよびレンチウイルスを示す。同図ｂは、良性不死化前立腺細胞株ＲＷＰＥを図示のようにＥＴＶ１または対照（ＧＵＳ）レンチウイルスに感染させ、安定なクローンを作製し、改変基底膜を通した侵襲について分析した。同図ｃは、初代培養前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を図示のようにＥＴＶ１またはＬＡＣＺアデノウイルスに感染させ、侵襲について分析した。平均（ｎ=３）＋Ｓ．Ｅ．を示す。感染細胞の顕微鏡写真を差し込み図に示す。同図ｄ〜ｅは、ＬＮＣａＰ細胞内のＥＴＶ１のｓｉＲＮＡノックダウンが侵襲を阻害していることを示す。ＬＮＣａＰ細胞をトランスフェクト試薬のみ（未処理）で処理、または図示のように、非標的またはＥＴＶ１ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたものを示す。同図ｄは、ＥＴＶ１ノックダウンをｑＰＣＲで確認したものである（平均（ｎ=４）＋Ｓ．Ｅ．）。同図ｅは、細胞をｂおよびｃのように侵襲について分析したものである（平均（ｎ=３）＋Ｓ．Ｅ．）。同図ｆは、ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１およびＲＷＰＥ-ＧＵＳ細胞のアジレント社の全ゲノムマイクロアレイ上での分析結果である。ＲＷＰＥ-ＧＵＳ細胞に比べてＲＷＰＥ-ＥＴＶ１内で過剰発現した遺伝子の分子概念解析のネットワーク図を示す。各ノードは、分子概念または生物学的に関連した遺伝子の組を表す。ノードの大きさは、前記概念の遺伝子数（例として、「ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１」および「細胞外基質」概念は、それぞれ５２７および１８６遺伝子を包含する）に比例する。概念の色は、その説明文に応じた概念の種類を示す。各端は、顕著なエンリッチメント（Ｐ＜０．００５）を表す。同図ｇは、ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１細胞内で過剰発現した侵襲に関与する選択した遺伝子のｑＰＣＲによる確認を示す。 前立腺内でＥＴＶ１遺伝子融合産物を発現している遺伝子導入マウスは、マウス前立腺上皮内腫瘍（ｍＰＩＮ）を生じていることを示す。同図ａ-ｆは、形態学的評価のための、ＡＲＲ２ＰＢ-ＥＴＶ１前立腺のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。同図ｃは、ｂ図の高倍率図であり、挿入図にｍＰＩＮ病変内の顕著な核小体を示している。同図ｄは、ＡＲＲ２ＰＢ-ＥＴＶ１マウス＃３（３３週）の腹側前立腺（ＶＰ）内に観測されるｍＰＩＮの正常な腺および病巣を示す。同図ｅは、ｄ図の高倍率図である。同図ｆは、単一の腺がｍＰＩＮとともに、正常な上皮構造を示している。図の挿入部分は、矢印で示すｍＰＩＮの病巣を示す。同図ｇ-１は、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）を用いた免疫組織化学的検査が、良性腺（ｇ）およびすべてのｍＰＩＮ病変（ｈ）の周囲の連続した繊維筋層を実証するのに対し、基底細胞マーカーサイトケラチン５（ＣＫ５）（ｉ-ｊ）およびｐ６３（ｋ-１）が、ＡＲＲ２ＰＢ-ＥＴＶ１マウス＃３の背外側前立腺（ＤＬＰ）における正常な腺（ｉおよびｋ）と比較して、ｍＰＩＮ病巣（ｊおよびｌ）内の周囲基底細胞が消失していることを実証している。ａ、ｂ、およびｄのもともとの拡大倍率は１００倍であり、ｅ-１の倍率は４００倍である。 染色体再編成の特徴的なクラスが、前立腺癌におけるＥＴＳ癌遺伝子を活性化していることを示す。 ＥＴＶ１の過剰発現が増殖をもたらすまたは良性前立腺上皮細胞を形質転換しないことを示す。同図ａでは、良性不死化前立腺細胞株ＲＷＰＥが図示のようにＥＴＶ１または対照（ＧＵＳ）レンチウイルスに感染させ、安定なクローンを作製して増殖を評価した。同図ｂでは、初代培養前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を図示のようにＥＴＶ１またはＬＡＣＺアデノウイルスに感染させ、増殖を評価した。平均（ｎ=３）＋Ｓ．Ｅ．を示す。結果は、３つの独立した実験の典型的なものである。同図ｃでは、ＥＴＶ１過剰発現はＳ期におけるＲＷＰＥ細胞の割合を増加させていない。同図ｄでは、ＥＴＶ１過剰発現はＲＷＰＥ細胞の足場非依存性増殖を増強していない。 ＥＴＶ１のｓｈＲＮＡノックダウンがＬＮＣａＰ細胞における侵襲を阻害することを示す。同図ａは、図示のように、対照ＬＮＣａＰ細胞、あるいは非標的またはＥＴＶ１ｓｈＲＮＡｍｉｒを発現しているレンチウイルスに感染したＬＮＣａＰ細胞を、図４１ｅに示すように、侵襲について評価したものである。平均（ｎ=３）＋Ｓ．Ｅ．を示す。同図ｂは、ａからの得た感染細胞の顕微鏡写真である。 ＥＴＶ１の過剰発現により増殖に係る概念の増殖低下を生じることを示す。 ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１細胞に過剰発現した侵襲関連の遺伝子の同定を示す。同図ａは、ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１およびＲＷＰＥ-ＧＵＳ細胞のアジレント社の全ゲノムマイクロアレイ上での分析結果である。同図ｂは、ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１概念およびエンリッチメントネットワーク（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｎｅｔｗｏｒｋ）（数で示す）中のその他の１４概念のうち少なくとも５つにある遺伝子を同定するオーバーレイマップである。 ＡＲＲ２ＰＢ-ＥＴＶ１マウスの前立腺のｍＰＩＮの領域におけるＡＲＲ２ＰＢ-ＥＴＶ１-ＦＬＡＧ発現の確認を示す。同図ａは、ＡＲＲ２ＰＢ-ＥＴＶ１ マウス＃４の腹側前立腺（ＶＰ）の低倍率拡大図であり、良性領域およびｍＰＩＮ病巣を黄色および黒の矢印でそれぞれ示している。同図ｂは、ａ図の良性腺の高倍率拡大図であり、ＥＴＶ１-ＦＬＡＧ発現の欠如を示す。同図ｃは、ａ図のｍＰＩＮ腺の高倍率拡大図であり、ＥＴＶ１-ＦＬＡＧ発現を実証している。 アンドロゲン制御遺伝子の発現を調節するＬＮＣａＰ細胞のアンドロゲン欠乏を示す。 Ｒ１８８１がアンドロゲン応答性ＶＣａＰ細胞株におけるＥＴＶ１発現を誘導しないことを示す。 本発明のさらなる遺伝子融合の配列を示す。 本発明のまたさらなる遺伝子融合の配列を示す。 前立腺癌（ＰＣＡ）の症例２つの同定であり、ＱＰＣＲによるＥＴＶ５アウトライアー発現を示す。図Ｂは、前記２症例についてのＲＡＣＥで決定した融合転写物の構造を示す。
定義
本発明をより理解しやすくするため、いくつかの用語および表現を以下のように定義する。
本願明細書において使用されるように、「遺伝子融合」とは、第１の遺伝子の少なくとも一部が第２の遺伝子の少なくとも一部に融合することから生じるキメラゲノムＤＮＡ、キメラメッセンジャーＲＮＡ、切断されたタンパク質またはキメラタンパクを意味する。この遺伝子融合は、全遺伝子または遺伝子のエクソンを含んでいる必要はない。
本願明細書において使用されるように、「癌において上方制御された遺伝子」とは、その他の組織におけるレベルと比較して、癌（例えば、前立腺癌）において高レベルで発現される（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現）遺伝子を意味する。いくつかの実施形態において、癌において上方制御された遺伝子は、その他の組織での発現レベルに比べて、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、またより好ましくは少なくとも１００％、さらにまたより好ましくは少なくとも２００％、および最も好ましくは少なくとも３００％高いレベルで発現される。いくつかの実施形態において、前立腺癌で上方制御された遺伝子は、「アンドロゲン制御遺伝子」である。
本願明細書において使用されるように、「前立腺組織で上方制御された遺伝子」とは、その他の組織におけるレベルに比べて、前立腺組織で高レベルで発現される遺伝子（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現）を意味する。いくつかの実施形態において、前立腺組織で上方制御された遺伝子は、その他の組織での発現レベルに比べて、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、またより好ましくは少なくとも１００％、さらにまたより好ましくは少なくとも２００％、および最も好ましくは少なくとも３００％高いレベルで発現される。いくつかの実施形態において、前立腺組織で上方制御された遺伝子は、前立腺組織で排他的に発現される。
本願明細書において使用されるように、「高発現プロモーター」とは、遺伝子に融合した場合に、高発現プロモーターに融合していない場合の遺伝子の発現レベルに比べて、特定の組織（例えば、前立腺）内で高いレベル（例えば、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、またより好ましくは少なくとも１００％、さらにまたより好ましくは少なくとも２００％、および最も好ましくは少なくとも３００％を超えるレベル）でその遺伝子を発現させるプロモーターを意味する。いくつかの実施形態において、高発現プロモーターは、アンドロゲン制御遺伝子またはハウスキーピング遺伝子（例えば、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１）由来のプロモーターである。
本願明細書において使用されるように、「転写制御領域」とは遺伝子の発現を調節する（例えば、上方制御または下方制御）配列を有する遺伝子の領域を意味する。いくつかの実施形態において、遺伝子の転写制御領域は、５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）とも呼ばれる遺伝子の非コード上流配列を有する。その他の実施形態において、この転写制御領域は、遺伝子のコード領域内またはイントロン（例えば、エンハンサー）内に位置する配列を有する。
本願明細書において使用されるように、「アンドロゲン制御遺伝子」とは、その発現がアンドロゲン（例えば、テストステロン）により誘導または抑制される遺伝子または遺伝子の一部を意味する。アンドロゲン制御遺伝子のプロモーター領域として、アンドロゲンまたはアンドロゲンシグナル分子（例えば、下流シグナル分子）と相互作用する「アンドロゲン応答エレメント」も含むこともある。
本願明細書において使用されるように、「検出する」、「検出用」または「検出」とは、発見または識別という一般的な行為、または検出可能に標識された組成物に関する特定の観察を意味する。
本願明細書において使用されるように、「遺伝子融合の少なくとも１つの生物学的活性を阻害する」とは、本発明（例えば、これらには限られないが、本外明細書中に記載の活性を含む）の遺伝子融合のどのような活性をも、直接的に遺伝子融合タンパク質に接触させ、遺伝子融合ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに接触させ、遺伝子融合ポリペプチドの立体構造変化を生じさせ、遺伝子融合タンパク質レベルを低下させ、あるいはシグナルパートナーとの遺伝子融合相互作用に干渉し、そして遺伝子融合標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことにより低下させる各種薬剤を意味する。阻害剤としてまた、遺伝子融合生物学的活性を上流シグナル分子を妨害することで間接的に制御する分子も含む。
本願明細書において使用されるように、「ｓｉＲＮＡ」とは低分子干渉ＲＮＡを意味する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、約１８〜２５ヌクレオチド長の２本鎖または２本鎖領域を有し、ｓｉＲＮＡは、およそ２つから４つの不対ヌクレオチド各鎖の３´末端に有することが多い。ｓｉＲＮＡの２本鎖または２本鎖領域の少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡ分子に対し実質的相同あるいは実質的相補である。標的ＲＮＡ分子に相補的な分子鎖は「アンチセンス鎖」であり、標的ＲＮＡ分子に相同な分子鎖は、「センス」鎖であり、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に対しても相補的である。ｓｉＲＮＡは、さらなる配列を有していてもよく、このような配列の非限定的な例として、ステムおよびその他の折り畳み構造はもちろん、連結配列またはループが挙げられる。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物および脊椎動物におけるＲＮＡ干渉を引き起こす際、および植物における転写後の遺伝子発現抑制時の配列特異性ＲＮＡの分解を引き起こす際の重要な中間体として機能しているように思われる。
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」とは、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現の発現抑制または減少を意味する。これは、発現抑制された遺伝子の配列に対しその２本鎖領域において相同なｓｉＲＮＡによって惹起された、動物や植物における配列特異性の転写後遺伝子発現抑制の過程である。この遺伝子は、その生命体に対して内在性または外来性であり、染色体に組込まれて存在していたり、あるいはゲノムに組込まれていないトランスフェクトベクターに存在してもよい。この遺伝子の発現は、完全または部分的に阻害されている。ＲＮＡｉはまた、標的ＲＮＡの機能を阻害するとも考えられており、この標的ＲＮＡの機能は完全または部分的なものである。
本願明細書において使用されるように、「癌の段階」とは、癌の進行のレベルの定性的または定量的評価を意味する。癌の段階を決定するのに用いる基準としては、これらには限らないが、腫瘍の大きさおよび転移範囲（例えば、局在または遠隔転移）が挙げられる。
本願明細書において使用されるように、「遺伝子導入システム」とは、細胞または組織に核酸配列を有する組成物を送達する種々の手段を意味する。例えば、遺伝子導入システムとして、これらには限らないが、ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびその他の核酸ベースの送達システム）、裸の核酸の微量注入、ポリマーベースの送達システム（例えば、リポソームベースのおよび金属粒子ベースのシステム）、バイオリスティック注入等がある。本願明細書において使用されるように、「ウイルス遺伝子導入システム」とは、試料の所望の細胞または組織への送達を促進するためのウイルス成分（例えば、無傷ウイルス、改変ウイルス、および核酸またはタンパク質等のウイルス成分）を有する遺伝子導入システムを意味する。本願名細書において使用されるように、「アデノウイルス遺伝子導入システム」とは、アデノウイルス科に属する無傷のまたは変質ウイルスを有する遺伝子導入システムを意味する。
本願明細書において使用されるように、「部位特異的組換え標的配列」とは、組換え因子および組換えの起こる位置について認識配列を与える核酸配列を意味する。
本願明細書において使用されるように、「核酸分子」とは、これらには限られないが、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の、各種核酸含有分子を意味する。この用語は、これらには限られないが、４-アセチルシトシン、８-ヒドロキシ-Ｎ６-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５-（カルボキシヒドロキシlメチル）ウラシル、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウラシル、５ -カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルアデニン、１-メチルシュードウラシル、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、２，２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチルシトシン、Ｎ６-メチルアデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシ-アミノメチル-２-チオウラシル、β-Ｄ-マンノシルキューオシン、５´-メトキシカルボニルメチルウラシル、５-メトキシウラシル、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸 メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２-チオシトシン、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、Ｎ-ウラシル-５-オキシ 酢酸 メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２-チオシトシン、および２，６-ジアミノプリン等の、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のすべてを網羅する。
「遺伝子」とは、ポリペプチド、ＰｒＥ前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の生成に必要なコード配列を有する核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を意味する。このポリペプチドは、その全長または断片の所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が維持される限り、全長コード配列またはそのコード配列どの部分によってもコード化される。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域、およびその遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、いずれかの末端で約１ｋｂまたはそれ以上の距離で５´および３´両末端においうてコード領域に隣接して位置する配列も、網羅する。そのコード領域の５´位置にあってｍＲＮＡ上に存在する配列は、５´非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３´または下流に位置しおよびｍＲＮＡ上に存在する配列は、３´非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」とは、ｃＤＮＡおよび遺伝子のゲノム型の双方を包含する。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」、または「介在配列」と呼ばれる非コード配列により分断されるコード領域を有する。イントロンは、核のＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写された遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサー等の制御エレメントを有していてもよい。イントロンは、核または一次転写物から除去あるいは「スプライシングで切り出されて」おり、それゆえイントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳時に、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。
本願明細書において使用されるように、「異種遺伝子」とは、天然の環境には存在しない遺伝子を意味する。例えば異種遺伝子として、ある種から別の種に導入された遺伝子が挙げられる。異種遺伝子としてまた、なんらかの方法（例えば、変異、複数の複製への付加、非未変性制御配列への結合等）により変容した生命体にネイティブな遺伝子も含む。異種遺伝子は、異種遺伝子配列は、染色体の遺伝子配列と自然に関連して、あるいは天然には存在しない染色体の部分に関連して（例えば、遺伝子が通常発現されない座位に発現する遺伝子）みられないＤＮＡ配列に通常結合している点で、内在性遺伝子とは区別される。
本願明細書において使用されるように、「オリゴヌクレオチド，」とは、１本鎖ポリヌクレオチド鎖の長さの短いものを意味する。オリゴヌクレオチドは、通常２００残基長（例えば、１５〜１００の間）未満であるが、本願明細書において使用されるように、この用語は、より大きなポリヌクレオチド鎖も包含するように意図している。オリゴヌクレオチドは、これらの長さにより称されることが多い。例えば、２４残基オリゴヌクレオチドは「２４量体」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリッド形成またはその他のポリヌクレオチドに対してハイブリッド形成することで２次および３次構造を形成することができる。このような構造として、これらには限らないが、２本鎖、ヘアピン、十字型、屈曲、および３本鎖が挙げられる。
本願明細書において使用されるように、「相補」または「相補性」の語は、塩基対則に関連してポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を参照するのに用いられる。例えば、配列「５´-Ａ-Ｇ-Ｔ‐３´」は、配列「３´-Ｔ‐Ｃ‐Ａ-５´」に対し相補である。相補性は、核酸の塩基のいくつかが塩基対則に従って対応している、「部分的」なものであってもよい。あるいは、核酸間で「完全」または「総」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリッド形成の効率や強度に顕著な効果を有する。このことは、核酸間の結合に依存する検出方法はもとより、増幅反応にも特定の重要性を有する。
「相同性」とは、相補性の度合いを意味する。部分相同性や完全相同性（すなわち同一性）がある。部分的相補配列とは、完全相補核酸分子の標的核酸へのハイブリッド形成を少なくとも部分的に阻害する核酸分子であり、「実質的相同」である。標的配列に対し完全相補の配列のハイブリッド形成の阻害は、低厳密条件下でのハイブリッド形成分析（サザンまたはノーザンブロット法、溶液ハイブリッド形成等）を用いて調べることができる。実質的相同配列またはプローブは、低厳密条件下で標的に対し完全相同核酸分子結合（すなわち、ハイブリッド形成）に対し競合または阻害する。このことは低厳密条件が非特異性結合が許容されるようなものであることを意味するのではなく、低厳密条件が、２つの配列が互いに結合することが所定の（すなわち選択的）相互作用であることを必要とするのである。非特異性結合の非存在は、実質的非相補（例えば、同一性が約３０％未満）である第２の標的を用いることで試験でき、非特異性結合が存在しない場合、プローブの結合は第２の非相補標的に対してハイブリッド形成しない。
ｃＤＮＡまたはゲノムクローン等の２本鎖核酸配列に関して使用する場合、「実質的相同」とは、上述のような低厳密条件下で本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリッド形成できる各種プローブを意味する。
遺伝子は、一次ＲＮＡ転写物の差次的スプライシングにより生成される複数のＲＮＡ種を産生することができる。同じ遺伝子のスプライス変異体であるｃＤＮＡは、配列同一性または完全相同性を有する（同じエクソンまたは両ｃＤＮＡ上の同一エクソンの部分の存在を示す）領域および完全非同一性を有する領域（例えば、ｃＤＮＡ１上にエクソン「Ａ」の存在を示し、ｃＤＮＡ２はエクソン「Ｂ」を代わりに有する）を有することになる。２つのｃＤＮＡは配列同一性を有する領域を有するので、これらは共に全遺伝子または両ｃＤＮＡにみられる配列を有する遺伝子の部分から誘導されるプローブにハイブリッド形成することになり、従ってこれら２つのスプライス変異体は、このようなプローブおよび互いに実質的相同である。
１本鎖核酸配列に関して使用される場合、「実質的相同」とは、上述のような低厳密性条件下で、１本鎖核酸配列とハイブリッド形成できる（すなわち、その補体である）各種プローブを意味する。
本願明細書において使用されるように、「ハイブリッド形成」は相補核酸の対形成に関して用いられる。ハイブリッド形成およびハイブリッド形成の強度（すなわち核酸間の会合強度）は、核酸間の相補の度合い、係る条件の厳密性、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比等の因子により影響される。構造内に相補核酸の対形成を有する単一分子は、「自己ハイブリッド形成」しているといえる。
本願明細書において使用されるように、「厳密」の語は、核酸ハイブリッド形成を実施する際の温度、イオン強度、および有機溶媒等のその他の化合物の存在の条件について用いられる。「低厳密条件」下においては、対象とする核酸配列は、その完全補体、単一の塩基ミスマッチを有する配列、密接に関連した配列（例えば、９０％またはそれ以上の相同性を有する配列）、および部分相同性のみを有する配列（例えば、５０-９０％の相同性を有する配列）とハイブリッド形成することになる。「中度の厳密条件」下においては、対象とする核酸配列は、その完全補体、単一の塩基ミスマッチを有する配列、および密接に関連した配列（例えば、９０％またはそれ以上の相同性）とのみハイブリッド形成することになる。「高厳密条件」下においては、対象とする核酸配列は、その完全補体、および（温度等の条件によって）単一の塩基ミスマッチを有する配列とのみハイブリッド形成することになる。すなわち高厳密条件下では、単一の塩基ミスマッチを有する配列とのハイブリッド形成を排除するように、温度を上げることができる。
核酸ハイブリッド形成に関して適用される「高厳密条件」は、５倍濃度ＳＳＰＥ（４３.８ｇ／ＬのＮａＣｌ、６.９ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１.８５ｇ／ＬのＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５倍濃度デンハート試薬、および１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中４２℃で結合またはハイブリッド形成させるのと同等の条件を含み、続いて０．１倍濃度ＳＳＰＥ、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合には４２℃で１．０％ＳＤＳを含む溶液中で洗浄する。
核酸ハイブリッド形成に関して適用される「中度厳密条件」は、５倍濃度ＳＳＰＥ（４３.８ｇ／ＬのＮａＣｌ、６.９ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１.８５ｇ／ＬのＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５倍濃度デンハート試薬、および１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中４２℃で結合またはハイブリッド形成させるのと同等の条件を含み、続いて１．０倍濃度ＳＳＰＥ、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合は４２℃で１．０％ＳＤＳを含む溶液中で洗浄する。
「低厳密条件」は、５倍濃度ＳＳＰＥ（４３.８ｇ／ＬのＮａＣｌ、６.９ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１.８５ｇ／１ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５倍濃度デンハート試薬［５０倍濃度デンハート液は、５００ｍＬあたり、５ｇのフィコール（＃４００；ファルマシア社）、５ｇのＢＳＡ（フラクションＶ；シグマ社）を含有］、および１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中４２℃で結合またはハイブリッド形成させるのと同等の条件を含み、続いて５倍濃度ＳＳＰＥ、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合４２℃で０．１％ＳＤＳを含む溶液中で洗浄する。
当該技術分野では、数多くの同等の条件が低厳密条件を含むように適用できることがよく知られており、プローブの長さや性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、および（溶液中に存在または固定化されたＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成等）標的の性質、および塩およびその他の成分の濃度（例えば、ホルムアルデヒド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在または非存在）等の因子を考慮し、そのハイブリッド形成溶液は、上述の条件とは異なるが同等の低厳密ハイブリッド形成の条件をつくるのに異なる可能性がある。さらにまた、当該技術分野では、高厳密条件（例えば、ハイブリッド形成および／または洗浄工程の昇温や、ハイブリッド形成溶液中でのホルムアルデヒドの使用等）（「厳密」については上記定義を参照のこと）下でハイブリッド形成を促進する条件が知られている。
本願明細書において使用されるように、「増幅オリゴヌクレオチド」とは、標的核酸またはその補体とハイブリッド形成し、核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドをヌクレオチドを意味する。増幅オリゴヌクレオチドの例として、鋳型核酸とハイブリッド形成し、かつ増幅過程でポリメラーゼにより伸長される３´ＯＨ末端を有する「プライマー」がある。増幅オリゴヌクレオチドの別の例として、（例えば、３´封止末端を有するため）ポリメラーゼによって伸長されないが、増幅に関与または促進するオリゴヌクレオチドがある。増幅オリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチドまたは類似体、または増幅反応に関与するが標的核酸に対して相補的でないまたはこれに含まれていないさらなるヌクレオチドを適宜含んでいてもよい。増幅オリゴヌクレオチドは、その標的または鋳型配列に対して相補的でない配列を有していてもよい。例えば、プライマーの５´領域は、標的核酸に対して非相補的なプロモーター配列を有していてもよい（「プロモーター-プライマー」と呼ばれる）。当業者ならば、プライマーとして機能する増幅オリゴヌクレオチドは、５´プロモーター配列を有するように改変でき、これによりプロモーター-プライマーとして機能することが理解できよう。同様に、プロモーター-プライマーは、プロモーター配列の除去あるいは同配列なしの合成により改変でき、プライマーとして依然機能する。３´封止増幅オリゴヌクレオチドは、プロモーター配列を与えることができ、重合の鋳型として使用できる（「プロモーター-プロバイダー」と称する）。
本願明細書において使用されるように、「プライマー」とは、オリゴヌクレオチドを意味し、精製された制限酵素消化物のように天然に存在してもよく、あるいは合成により生成され、核酸鎖に対し相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼ等の誘導物質、ならびに好適な温度およびｐＨの存在下）におかれた際に、合成開始点として作用できる。このプライマーは、増幅時の最大効率のために１本鎖であることが好ましいが、代わりに２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、プライマーはまず伸長生成物の調製に使用する前に、その鎖を分離させるように処理する。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導物質の存在下で伸長生成物の合成を刺激するのに十分な長さを有する必要がある。このプライマーの正確な長さは、温度、プライマー源および方法の用途等、多くの因子に依存する。
本願明細書において使用されるように、「プローブ」とは、オリゴヌクレオチド（すなわち、１連のヌクレオチド）を意味し、精製された制限酵素消化物のように天然に存在してもよく、あるいは合成、組換え、またはＰＣＲ増幅により生成され、対象とする別のオリゴヌクレオチドの少なくとも１部とハイブリッド形成できる。プローブは１本鎖または２本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、分離に有用である。本発明において使用される各種プローブは、各種の「レポーター分子」で標識され、その結果、これらには限られないが酵素（例えば、酵素ベースの組織化学的アッセイはもちろん、ＥＬＩＳＡ）、蛍光、放射性、および発光システム等の各種検出システムで検出可能となると考えられる。本発明を特定の検出システムまたは標識に限定することは意図していない。
「単離オリゴヌクレオチド」または「単離ポリヌクレオチド」のように、核酸に関連して用いられる「単離」という語は、同定され、少なくとも１つの成分またはその天然源に通常伴う混入物から分離されている核酸配列を意味する。単離核酸は、天然物とは異なる形態または設定で存在するようなものである。これに対し、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸といった非単離核酸は、天然に存在する形態で存在する。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は隣接する遺伝子に近接する宿主細胞染色体上に見られ、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列は、タンパク質の多くをコードする数多くのその他のｍＲＮＡとの混合物として、細胞内に見られる。しかしながら、所定のタンパク質をコードする単離核酸の例として、核酸が天然の細胞の染色体位置とは異なる場合に所定のタンパク質を通常発現する細胞内の核酸、あるいは天然に存在するものとは異なる核酸配列の横に位置するものがある。単離核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖の形態で存在している。単離核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質を発現するのに利用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、少なくともセンスまたはコード鎖を有するが（すなわち、そのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが１本鎖）、センスおよびアンチセンス鎖の両者を有していてもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、２本鎖であってもよい）。
本願明細書において使用されるように、「精製（された）」または「精製する」とは、試料から成分（例えば、不純物）を除去することを意味する。例えば、抗体は、混入している非免疫グロブリンタンパク質の除去により精製され、あるいは標的分子に結合していない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合していない免疫グロブリンの除去により、試料中の標的反応性免疫グロブリンの増加を生じる。別の例において、組換えポリペプチドは細菌宿主細胞に発現され、そのポリペプチドは宿主細胞タンパク質の除去により精製される。このため、組換えポリペプチドの割合は試料中で増加する。
発明の詳細な説明
本発明は、前立腺癌における再発性遺伝子融合の発見に基づく。本発明は、遺伝子融合を直接的または間接的に検出または標的する診断、研究、および治療法を提供する。本発明はまた、診断、研究、および治療目的のための組成物も提供する。
Ｉ．遺伝子融合
本発明は、前立腺癌の指標となる再発性遺伝子融合を同定する。遺伝子融合は、アンドロゲン制御遺伝子（ＡＲＧ）またはハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子の染色体再編の結果によるものである。これらの再発にもかかわらず、ＡＲＧまたはＨＧがＥＴＳファミリーメンバー遺伝子に融合する接合部は多様である。この遺伝子融合は、通常ＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域由来の５´部分とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とを有する。再発性遺伝子融合は、前立腺癌の診断マーカーおよび臨床用標的としての用途を有する。
Ａ．アンドロゲン制御遺伝子
アンドロゲンにより制御される遺伝子は、ヒト前立腺腺の正常な生理機能に大変重要である。これらは、前立腺癌腫の発生および進行にも寄与している。認識されているＡＲＧとして、これらには限らないが、ＴＭＰＲＳＳ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑｌ１．２３、Ｃ１５ＯＲＦ２１、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＫＬＫ２、ＳＮＲＫ、Ｓｅｌａｄｉｎ-１、およびＦＫＢＰ５１（Ｐａｏｌｏｎｉ―Ｇｉａｃｏｂｉｎｏ ｅｔ ａｌ，ゲノムｓ ４４：３０９（１９９７）；Ｖｅｌａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４５（８）：３９１３（２００４））がある。
ＴＭＰＲＳＳ２（ＮＭ００５６５６）は、その他の正常なヒト組織に比べて、前立腺上皮に高度に発現されていることが実証されてきた（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ＲｅｓｅａｒＣＨ ５９：４１８０（１９９９））。このＴＭＰＲＳＳ２遺伝子は、２１番染色体上に位置している。この遺伝子は、４１，７５０，７９７〜４１，８０１，９４８ｂｐに位置している（５１，１５１全ｂｐ；マイナス鎖配向）。このヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＣ５１７８４（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースアクセッション番号：０１５３９３）やその対応するｃＤＮＡ at ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ７５３２９（Ｐａｏｌｏｎｉ-Ｇｉａｃｏｂｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅｓ ４４：３０９（１９９７）も参照のこと）にも見られる。
プロステインまたはＰ５０１Ｓとも知られるＳＬＣ４５Ａ３はまた、正常な前立腺および前立腺癌において、転写物およびタンパク質の両レベルで排他的に発現されることが示されてきた（Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６０、２４６-５６（２００４）；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１、１５６３-８（２００１））。
ＥＳＴ分析および超並列配列決定によるＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑｌ１．２３は、ヒト内在性レトロウイルス要素のＨＥＲＶ-Ｋファミリーで２番目に最も強く発現されたメンバーであり、その他の正常な組織に比べて前立腺に最も高い発現されることが示されている（Ｓｔａｕｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ ４、２（２００４））。ＨＥＲＶ-Ｋ要素のアンドロゲン制御についての記載はないが、内在性レトロウイルス要素は、マウス伴性タンパク質遺伝子Ｃ４Ａにアンドロゲン応答性を付与することが示されてきた（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５５、２４７-５４（１９８８））。その他のＨＥＲＶ-Ｋファミリーメンバーは、乳癌および乳癌細胞株において高発現かつエストロゲン制御されていることが示されており（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６１、２０５９-６２（１９８７）；Ｐａｔｉｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０、２６５４-７（１９９６）；Ｗａｎｇ-Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２、１５２８-３５（２００３））、１９番染色体上のＨＥＲＶ-Ｋ３要素由来の配列は、ｔ（８；１９）（ｐｌ２；ｑｌ３.３）を有する幹細胞骨髄増殖性疾患の症例においてＦＧＦＲｌに融合した（Ｇｕａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１、２８６-８（２００３））。
Ｄ-ＰＣＡ-２としても知られるＣ１５ＯＲＦ２１はまた、正常な前立腺および前立腺癌での排他的過剰発現に基づいて、もともと単離されたものである（Ｗｅｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ１０９、８８２-９２（２００４））。
本発明の遺伝子融合は、ＡＲＧの転写制御領域を有していてもよい。このＡＲＧの転写制御領域は、プロモーター領域等のＡＲＧのコードまたは非コード領域を有していてもよい。ＡＲＧのプロモーター領域は、ＡＲＧのアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）さらに有していてもよい。ＴＭＰＲＳＳ２のプロモーター領域は特に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ２７６４０４で与えられる。
Ｂ．ハウスキーピング遺伝子
ハウスキーピング遺伝子は、構成的に発現され、一般に全組織で広範に発現する。これらの遺伝子は、すべての細胞が生存するのに必要な基本的必須機能を与えるタンパク質をコードする。ハウスキーピング遺伝子は、通常すべての細胞および組織内で同じレベルで発現するが、特に細胞増殖および生命体の発達時にいくぶんかの差異を伴う。ヒト細胞が有するハウスキーピング遺伝子の正確な数はわかっていないが、推定の多くのは３００〜５００の範囲にある。
数百のハウスキーピング遺伝子の多くは同定されている。最も典型的な既知の遺伝子であるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素）は、解糖経路に重要な酵素をコードする。別の重要なハウスキーピング遺伝子はアルブミンであり、これは全身への化合物の輸送を補助する。いくつかのハウスキーピング遺伝子は、β-アクチンやチューブリンなどの細胞骨格を作り上げる構造タンパク質をコードする。その他は、リボソームの１８Ｓまたは２８ＳｒＲＮＡサブユニットをコードする。ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、広範に発現されるヘテロ核リボ核タンパク質の１つである。そのプロモーターは、メチル化されておらず、導入遺伝子内のＣＭＶプロモーターの転写サイレンシングを阻止することが示されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ ＢｉｏｔｅＣＨｎｏｌ ５、１７（２００５））。ハウスキーピング遺伝子の一覧例として、例えば、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９、３６２-３６５（２００３）がある。
Ｃ.ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子
転写因子のＥＴＳファミリーは、遺伝子発現をコントロールする細胞内シグナル経路を制御する。下流エフェクターとして、これらは所定の標的遺伝子を活性化または抑制する。上流エフェクターとして、これらは数々の増殖因子受容体の空間的および時間的発現に関与している。このファミリーのほぼ３０のメンバーが、同定されており、生理学的および病理学的過程の広い範囲に関与している。このようなものとして、これらには限らないが、ＥＲＧ、ＥＴＶ１（ＥＲ８１）、ＦＬ１１、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＬＫ１、ＥＴＶ６（ＴＥＬｌ）、ＥＴＶ７（ＴＥＬ２）、ＧＡＢＰα、ＥＬＦｌ、ＥＴＶ４（ＥｌＡＦ；ＰＥＡ３）、ＥＴＶ５（ＥＲＭ）、ＥＲＦ、ＰＥＡ３／Ｅ１ＡＦ、ＰＵ．１、ＥＳＥ１／ＥＳＸ、ＳＡＰｌ（ＥＬＫ４）、ＥＴＶ３（ＭＥＴＳ）、ＥＷＳ／ＦＬＩ１、ＥＳＥ１、ＥＳＥ２（ＥＬＦ５）、ＥＳＥ３、ＰＤＥＦ、ＮＥＴ（ＥＬＫ３；ＳＡＰ２）、ＮＥＲＦ（ＥＬＦ２）、およびＦＥＶが挙げられる。ＥＴＳファミリーメンバー配列の例を図９に示す。
ＥＲＧ（ＮＭ００４４４９）は、その他の正常なヒト組織に比べて前立腺上皮により高く発現することが実証されてきた。ＥＲＧ遺伝子は、２１番染色体上に位置する。この遺伝子は、ｐｔｅｒから３８，６７５，６７１-３８，９５５，４８８塩基対に位置する。このＥＲＧ遺伝子は、２７９，８１７全ｂｐマイナス鎖配向である。対応するＥＲＧ ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１７２５４およびＮＰ０４４４０（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースアクセッション番号：Ｐｌ１３０８）で与えられる。
ＥＴＶ１遺伝子は、７番染色体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ０００００７ｉ ｌ、ＮＣ_０８６７０３．１１、およびＮＴ_００７８１９．１５）上に位置している。この遺伝子は、ｐｔｅｒから１３，７０８３３０〜１３，８０３，５５５塩基対に位置する。このＥＴＶ１遺伝子は、全長９５，２２５ｂｐ、マイナス鎖配向である。対応するＥＴＶ１ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００４９５６およびＮＰ００４９４７（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースアクセッション番号Ｐ５０５４９）で与えられる。
このヒトＥＴＶ４遺伝子は１４番染色体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ_００００１７．９；ＮＴ_０１０７８３．１４；およびＮＴ_０８６８８０．１）上に位置している。この遺伝子は、ｐｔｅｒから３８，９６０，７４０〜３８，９７９，２２８塩基対である。このＥＴＶ４遺伝子は、全長１８，４８８ｂｐ、マイナス鎖配向である。対応するＥＴＶ４ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ_００１９８６およびＮＰ_０１９７７（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースアクセッション番号：Ｐ４３２６８）で与えられる。
ヒトＥＴＶ５遺伝子は、３番染色体上の３ｑ２８（ＮＣ０００００３.１０（１８７３０９５７０．.１８７２４６８０３）に位置する。対応するＥＴＶ５ｍＲＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ_００４４５４およびＣＡＧ３３０４８で与えられる。
Ｄ．ＥＴＳ遺伝子融合
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ遺伝子融合の最初の同定を含み、前立腺癌のＥＴＳ再配列の５つのクラスが同定されている（図４３）。本発明は、特定の機構に限定されるものではない。実際、機構の理解は本発明を実施するのに必要ではない。にもかかわらず、ＡＲＧまたはＨＧとの融合または癌内で増加した発現を伴う座位への挿入を介したＥＴＳファミリーメンバーの上方制御された発現は、前立腺癌に関する機構を与えると考えられている。特定の個体に存在する再配列のクラスに関する知見は、オーダーメイド型の癌治療を可能にする。
１．遺伝子再配列のクラス
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ遺伝子融合（クラスＩ）は、前立腺癌におけるＥＴＳ再配列の優勢なクラスを表す。ＳＬＣ４５Ａ３およびＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑｌ１．２３等の、非翻訳領域との融合が関与するその他の前立腺特異性アンドロゲン誘導遺伝子（クラスＨａ）および内在性レトロウイルス要素（クラス１１ｂ）からの再配列は、ＥＴＳ再配列内の５´パートナーとＴＭＲＰＳＳ２と同様に機能する。クラスＩおよびＩＩ再配列の５´パートナーと同様に、Ｃ１５ＯＲＦ２１は前立腺癌内で顕著に過剰発現される。しかしながら、クラスＩおよびＩＩ再配列の融合パートナーとは異なり、Ｃ１５ＯＲＦ２１はアンドロゲンにより抑制され、前立腺特異性アンドロゲン抑制された５´融合パートナーを含むＥＴＳ再配列の新規クラス（クラスＩＩＩ）を表す。一方、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、前立腺特異性発現またはアンドロゲン応答性を提示しなかった。従って、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１は、非組織特異性プロモーターエレメントを含む融合ＥＴＳ発現を誘発するＥＴＳ再配列の新規クラス（クラスＩＶ）を表す。クラスＶ再配列においては、その全ＥＴＳ遺伝子は、前立腺特異性領域に再配列されている。
進行型の前立腺癌を有する男性は、通常はアンドロゲン欠乏療法で治療され、腫瘍退行を生じる。しかしながら癌は、ホルモン-抵抗性表現型によりほぼ一定に進行する。クラスＩＶ再配列（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１等）はアンドロゲン非感受性プロモーターエレメントにより誘発されるので、その結果は、これらの遺伝子融合はアンドロゲン欠乏に対する応答ではないことから、これらの患者が抗アンドロゲン治療に応答しないことを示している。クラスＩＩＩ再配列を有する患者の抗アンドロゲン治療は、ＥＴＳ融合発現を増加する可能性がある。例えば、Ｃ１５ＯＲＦ２１：ＥＴＶ１は、抗アンドロゲン治療がＣ１５ＯＲＦ２１：ＥＴＶ１発現を増加させたホルモン-抵抗性転移性前立腺癌を有する患者から単離された。この仮説を支持して、ＬＮＣａＰのアンドロゲン飢餓は顕著に内在性 ＰＳＡおよびＴＭＰＲＳＳ２の発現を低減し、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１に何の影響もなく、Ｃ１５ＯＲＦ２１の発現を増加させた（図４９）。このことは、現在の融合クラスに基づいた、前立腺癌の男性のオーダーメイド型治療（例えば、アンドロゲン遮断療法またはその他の代替療法の選択）を可能にする。
前立腺癌における遺伝子再配列の複数のクラスは、通常の上皮癌における染色体再編成に関してより一般化された役割を示す。例えば、乳癌の癌遺伝子に融合したエストロゲン応答エレメントのように、組織特異性プロモーターエレメントは、その他のホルモンに誘発された癌内の癌遺伝子に融合する可能性がある。さらにまた、前立腺所定の融合（クラスＩ〜ＩＩＩおよびＶ）は増殖優位性を与えず、その他の上皮癌内で選択されるのに対し、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１等の広範に発現した遺伝子の強いプロモーターを含む融合は、腫瘍の様々なタイプにおいて癌遺伝子の以上発現を引き起こす。要約すると、本研究は、血液悪性腫瘍と同様に、種々の機構による通常の上皮腫瘍発達における染色体再編成に関する役割を支持する。
２．ＡＲＧ／ＥＴＳ遺伝子融合
上述のように、本発明は、ＡＲＧのＥＴＳファミリーメンバー遺伝子への融合を提供する。遺伝子融合配列の例を図３６、５１、および５２に示す。ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、およびＥＴＶ４については、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列番号を示し、それらのエクソンは、ＵＣＳＣヒトゲノムの２００４年５月のアセンブリを用いて配列比較している。すべての同定された融合について、図３６は、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の最初から融合までの完全配列およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子の停止コドンを示している。公表されている変異体の各々について供託されたＧｅｎＢａｎｋ配列も示してある。いくつかのＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合は、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子のブレークポイントエクソンにより記載してある。例えば、ＴＭＰＲＳＳ２のエクソン１をエクソン４にＥＲＧの１１を通して融合するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ（１，４）として同定される。
ある種の遺伝子融合は、通常の前立腺癌においてその他のものに比べてより一般的である。本発明は、前立腺癌の５０〜８０％がＴＭＰＲＳＳ２のＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４またはＦＬ１１との再発性遺伝子融合を有することを確認している。もちろん、５０〜７０％はＴＭＰＲＳＳ２-ＥＲＧであり、そのうちの５０％〜６０％は２１番染色体上のＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧ座位との間の遺伝子情報の欠失（さらなる詳細は以下に記載）から生じ、５〜１０％はＴＭＰＲＳＳ２-ＥＴＶ１であり、１〜２％はＴＭＰＲＳＳ２-ＥＴＶ４であり、１〜２％はＴＭＰＲＳＳ２-ＦＬＩ１である。
本発明の開発過程において実施した実験によれば、その他は機能性転写物を発現しない（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０：６４４-６４８（２００５）；Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ＲｅｓｅａｒＣＨ ６６：３３９６-３４００（２００６））のに対し、ある種の融合遺伝子融合転写物を発現することが示された。
ａ．ＥＲＧ遺伝子融合
上述のように、ＥＲＧを有する遺伝子融合は、前立腺癌において最も一般的な遺伝子融合であることがわかっている。本発明の開発過程において実施した実験により、２１番染色体ｑ２２．２-３上のＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する顕著なゲノム欠失を同定した。欠失は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合陽性ＰＣＡ試料に見られた。この欠失は、共通領域に見られるが、この領域内での変異性を示している。Ｐａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：１３０３-１３（２００４））による過去の報告によれば、ＣＧＨ分析は、ＴＭＰＲＳＳ２由来の６ｋｂセントロメアであるＣＴＤ-２１０３Ｏ７ＢＡＣ中の欠失を検出した。これらの欠失は、臨床的に局在化したＰＣＡ試料の１２．５％（９／７２）および転移性ＰＣＡ試料の３３％（５／１５）で観察された。これらの結果は、本検討で得られたＳＮＰアレイデータを支持し、ＰＣＡの欠失が癌の進行と共により一般的となるか、あるいは、より迅速に進行する傾向のあるＰＣＡにおいて欠失がより頻繁に確認されることを示している。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列の著しい腫瘍内均一性を考えると、これらの分子サブタイプは、異なる疾患進行特徴に関連している可能性が高い。
ＥＲＧの再配列を４９．２％内部に有する臨床的に局在化したＰＣＡの１１８の症例を評価した。イントロン欠失は、これらのＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合陽性の症例の６０．３％に見られた。ＥＲＧの顕著な過剰発現を有するほぼすべてのＰＣＡ試料は再配列を有し、その過剰発現は、再配列とほぼ同じ数の症例で起こった。遺伝子発現データの公共利用可能な一覧であるＯｎｃｏｍｉｎｅを利用して、通常の欠失部位の領域に位置する、４つの顕著な下流制御された遺伝子を同定した（図１６）。
本発明は、特定の機構に限定されるものではない。実際、機構の理解は本発明の実施に必要ではない。しかしながら、この結果は全ＰＣＡの半分近くがＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列により定義できることを示唆している。これらの腫瘍の多くが、オリゴヌクレオチドＳＮＰアレイゲノム解析によればサイズの異なるイントロン欠失であることを実証している。しかしながら、およそ３０〜４０％は欠失を実証しておらず、従ってＴＭＲＰＳＳ２とＥＲＧの均衡のとれた転位を内部に有するに違いない。欠失の範囲におけるばらつきは、ＣＭＬで見られたように、疾病の進行に関連してる可能性がある。現行の研究により、腫瘍段階およびリンパ節の状態との顕著な臨床的な関連が確認された。欠失を有するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列腫瘍はまた、高いＰＳＡ生化学的不全率の傾向を示した。
本発明を開発する過程において実施したさらなる実験により、長期の経過観察を伴う初期前立腺がんの待機療法コホートにおけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合の存在に基づく、転移の進行または前立腺癌特異的死亡のリスクを検討した。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合の頻度を、９２の症例を用いて評価した。この個体群ベースのコホートにおけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合の頻度は１５．２％（１４／９２）であり、２つ病院ベースのコホートで見られる頻度５０％よりも低かった。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際、機構の理解は、本発明の実施に必要ではない。にもかかわらず、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合前立腺癌におけるこの差異は、民族および人種の遺伝子の違いによる可能性がある。これらの違いは、その他の非個体群ベースの研究に比べ、本待機療法コホートにおいて高グレードの症例の割合が低いことによっても説明できる。
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合と遠隔転移の進行との顕著な関連および前立腺癌に特有の死亡を累積罹患率比３．６（Ｐ＝．００４、９５％信頼区間=１．５〜８．９）で観測した。これらのデータは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合前立腺癌がより侵襲的な表現型を有することを示唆している。さらなる実験は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合におけるゲノム欠失が、進行型および／または転移性前立腺癌（例えば、実施例５を参照）と相互に関連していることを示した。
本発明はまた、アンドロゲンがＥＲＧの過剰発現を、おそらくＡＲＥを介して、ＴＭＰＲＳＳ２-ＥＲＧ陽性細胞株内で誘導できることを実証した。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際、機構の理解は、本発明の実施に必要ではない。にもかかわらず、まとめると、この結果は、ＴＭＰＲＳＳ２の上流のＡＲＥを介したＥＴＳファミリー活性の調節不全は、前立腺癌発達を誘発する可能性があることを示唆している。
ｂ. ＥＴＶ１遺伝子融合
本発明のいくつかの実施形態の展開の過程で実施したさらなる検討により、ＥＴＶ１アウトライアー発現およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１陽性前立腺癌の頻度間の不一致を調べた。この結果、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合を前立腺癌におけるＥＲＧ過剰発現を誘発する優勢機構として同定する過去の研究を確認した。しかしながら、ＥＴＶ１を過剰発現している前立腺癌においては、新規５´融合パートナーが同定された。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際、機構の理解は、本発明の実施に必要ではない。にもかかわらず、ＥＲＧとＥＴＶ１の関与する融合についての５´パートナーの不一致に関する理由は明らかではないが、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧがおよそ３ＭＢ離れて２１番染色体上に位置するので、これらの近接性は、ＥＲＧに対する５´パートナーとしてＴＭＰＲＳＳ２に有利であるかもしれない。
遺伝子導入マウスにおけるアンドロゲン制御下でのＥＴＶ１の過剰発現は、マウス前立腺で高浸透ｍＰＩＮ（１２のうちの９、７５％）を生じた。癌腫の発達は観察されていない。これらの結果は、ＥＴＶ１過剰発現が良性前立腺上皮細胞における侵襲を増加させたが形質転換には不十分であるという生体外研究を支持するものであり、過去の研究では、ヒトにおいてＥＴＳ融合が、ＰＩＮから癌腫への転移期間あるいは前立腺癌進行の初期におそらく起こることを示している（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３９、４１-５１（２００７））。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際、機構の理解は、本発明の実施に必要ではない。にもかかわらず、ヒト前立腺癌発生においては、ＥＴＳ遺伝子融合は単一のＮＫＸ３-１および／またはＰＴＥＮ対立遺伝子の損失等の早期の病変との関連で起こると考えられた（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ １，２４３-２７１（２００６））。さらにまた、癌腫への初期進行のないＥＴＶ１遺伝子導入マウスにおけるｍＰＩＮの発達は、ＮＫＸ３-１＋／−およびＰＴＥＮ＋／−マウス等の、ヒト前立腺癌におけるこれらのその他の初期の現象のマウスモデルと同様である（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９、２８８４-９（２００２）；Ａｂｄｕｌｋａｄｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２、１４９５-５０３（２００２）；Ｄｉ Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７、２２２-４（２００１））。従って、ＡＲＲ２ＰＢ-ＥＴＶ１マウスおよびこれらのマウス間での交配は、ヒト前立腺癌発生における初期の現象を模倣する癌遺伝子／腫瘍抑制因子モデルを作ると考えられる。
ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１においてＥＴＶ１により制御される転写プログラムを同定するため、発現シグネチャーを増大中の分子概念のコレクション、または生物学的関連遺伝子セット間の相互関係のネットワークを探索する解析フレームワークである分子概念マップに取り込んだ。関連解析のための遺伝子セットの最大コレクションであることに加えて、ＭＣＭは、データベース中のすべての遺伝子セット間の対的な関連を計算する点が特有であり、繋がった概念の「エンリッチメントネットワーク」の同定および描出を可能にする。
この解析は、ＥＴＳ遺伝子のアウトライアー発現なしの癌と比較した、ＥＴＶ１アウトライアー発現を有する前立腺癌内で過剰発現した遺伝子のインビボシグネチャーが、ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１細胞内で過剰発現された遺伝子のインビトロシグネチャーに富んでいた（Ｐ＝０．００３）ことを示し（図４１ｆ）、インビトロモデルの生物学的関連性を支持している。より一般的には、ＭＣＭ分析は、本報告に記載の表現型効果に一致する、ＥＴＶ１過剰発現されたシグネチャーに富む細胞侵襲に関連した分子概念のネットワークを明らかにした。例えば、このシグネチャーにおいてエンリッチメントは、表在性移行細胞膀胱癌と対比された侵襲性癌で過剰発現された遺伝子を表す概念（ＭｏｄｌｉｃｈらのＰ＝２．９Ｅ-１４、ＤｙｒｓｋｊｏｔらのＰ＝１．２Ｅ-８）２９、３０と、インサイツでの腺管癌腫と対比された侵襲性乳管癌腫で過剰発現された遺伝子を表す概念（Ｓｃｈｕｅｔｚら、Ｐ＝３.８Ｅ-１３）とに分配された。より直接的には、このシグネチャーにおいてエンリッチメントは、マトリックスメタロプロテイアーゼ（ＭＭＰ）ならびにディスインテグリンおよびメタロプロテイアーゼ領域（ＡＤＡＭ）を含む、「ペプチダーゼＭｌ０ＡおよびＭ１２Ｂ、マトリキシンまたはアダマリシン領域」（Ｐ＝８．５Ｅ-５）を含有するタンパク質のＩｎｔｅｒＰｒｏコンセプトに分配された。
侵襲を媒介することが知られＥＴＳ転写因子の直接的標的であることが報告されている、いくつかのＭＭＰおよびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子経路のメンバーの両者は、ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１細胞内で過剰発現された（図４Ｉｇ）。さらにまた、この「ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１内で過剰発現した」シグネチャーは、ＳＴＡＴ３-Ｃ癌遺伝子を過剰発現しているＭＣＦ-１０Ａ細胞内で過剰発現された遺伝子のシグネチャーと重複を共有した（Ｐ＝８.９Ｅ-１４）。このモデルにおいて、ＳＴＡＴ３-Ｃ過剰発現は増殖に影響を与えなかったが、ＭＭＰ９に依存した形で侵襲を増加させた。この結果はまたＥＷＳ：ＦＬＩ１のノックダウンまたは過剰発現が侵襲に影響を与えるが、増殖に影響を与えないことを実証したユーイング肉腫におけるＥＷＳＲｌ：ＥＴＳ遺伝子融合の並行研究でもある（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ９，４０５-１６（２００６））。ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１シグネチャーにおいて低発現したものに関するＭＣＭ分析は、増殖関連概念（図５０）のエンリッチメントを明らかにし、細胞増殖に対するわずかな効果はＦＡＣＳまたは増殖圧制において明白ではないことを示す。
本研究はまた、細胞遺伝学的研究を導くためにアウトライアー遺伝子発現を利用する用途を実証している。例えば、数多くの核型分析、ＳＫＹ、および高解像度アレイＣＧＨ研究にも拘わらず、潜在性ＥＴＶ１再配列は、最も一般的に用いられる前立腺癌のインビトロモデルである、ＬＮＣａＰ内での報告がない（Ｂｅｈｅｓｈｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ５、２３-３２（２０００）；Ｂｅｈｅｓｈｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３，６２-９（２００１）；Ｇｉｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ １１，３９９-４０４（１９８４）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １２０，７９５-８０５（２００７）；Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６６，１５７-７２（２００６）；Ｍｕｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ４５，７０２-１６（２００６）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６０，２５７-７１（２００４）；Ｔａｋａｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２，６４７-５１（２００２）；Ｓｔｒｅｆｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ ＣｙｔｏＧｅｎｅｔ １２４，１１２-２１（２００１）；Ｔｈａｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４、２５７７-８１（１９９４））。同様に、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合は、核型分析では検出できない２１ｑ上でのＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間の染色体内欠失により生じることが多い。同様に、本願明細書で同定されたＨＮＲＰＡ２Ｂ１ ：ＥＴＶ１融合はまた、およそ１５ＭＢにわたる染色体内欠失をとおしても起こる。これらの結果は、癌遺伝子を活性化する潜在性再配列および染色体内欠失がその他の通常の上皮癌腫において起こる可能性を示している。
ｃ．ＥＴＶ４遺伝子融合
Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースからの前立腺癌プロファイル研究でモニターした全てのＥＴＳファミリーメンバーの発現を調べるため、いくつかの実験を行った（上記Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．）。ＥＴＳファミリーメンバーＥＴＶ４の顕著な過剰発現が、全体解剖組織をプロファイルしたもの（上記Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．）（図７Ａ）およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）組織１をプロファイルしたもの（図７Ｂ）の２つの研究の各々から単一の前立腺癌の症例で同定された。ＥＴＶ４は、癌性組織内のＴＭＰＲＳＳ２に融合することがわかった。
ｄ．ＥＴＶ５遺伝子融合
さらなる実験実験により、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ５およびＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ５遺伝子融合（例２０）を確認した。ＥＴＶ５は、前立腺癌試料内でアウトライアー発現を有することがわかり、その後、遺伝子融合内に存在することがわかった。
３．ＨＧ／ＥＴＳ遺伝子融合
さらなる実験により、前立腺癌内でのＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１遺伝子融合を確認した。ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、前立腺特異性発現またはアンドロゲン制御を示さず、その代わり、全ての腫瘍のタイプにわたり強く発現されている。ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、広範に発現されたヘテロ核リボ核タンパク質のメンバーをコードし、そのプロモーターは、その他のハウスキーピング遺伝子に対して構造的類似性を共有している（Ａｎｔｏｎｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８２，２６９-７９（２００３））。さらにまた、このＨＮＲＰＡ２Ｂ１プロモーターは、非メチル化されて導入遺伝子内でのＣＭＶプロモーターの転写抑制を防ぐことが示されてきた（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５、１７（２００５））。従って、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１は、非組織特異的プロモーターエレメントが癌遺伝子の発現を誘発する通常の上皮癌腫における遺伝子融合の新規クラスを示している。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ融合がＢ細胞悪性腫瘍内のＩＧＨ-ＭＹＣ再配列に機能的に類似しているのに対し、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１ ：ＥＴＶ１は、構成的に発現されたＲＰＮｌ遺伝子のエンハンサーエレメントの制御下でＥＶＩの配置を生じると考えられている、急性骨髄性白血病におけるｉｎｖ（３）（ｑ２１ｑ２６）およびｔ（３；３）（ｑ２１；ｑ２６）に、より類似している（Ｓｕｚｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４、２６８１-８（１９９４）；Ｗｉｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ４３，５９-６５（２００２））。
その他の通常の上皮癌は、乳癌において癌遺伝子に融合したエストロゲン応答エレメントのような組織特異的プロモーターエレメントにより誘発されていると考えられる。さらにまた、本願明細書中で同定されている前立腺に特異的な融合（ＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ１等）が、その他の上皮癌において増殖優位性を与えないのに対し、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１等の広範囲に発現した遺伝子の強力なプロモーターを含む融合は、種々の腫瘍のタイプにわたって癌遺伝子の異常発現を生じることができると考えられる。本願明細書において同定されたＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１融合は、およそ１５ＭＢにわたる染色体内欠失を通して起こる。これらの結果は、癌遺伝子を活性化する潜在性再配列および染色体内欠失がその他の通常の上皮癌腫内で起こる可能性があることを示している。
ＩＩ．抗体
その断片、誘導体、および類似体を含む本発明の遺伝子融合タンパク質は、下記の診断、研究、および治療法における用途を有する抗体を生成する免疫原として使用できる。この抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖、またはＦａｂ断片であってもよい。当業者に既知の様々な手順は、このような抗体および断片の生成や標識に用いることができる。例えば、Ｂｕｒｎｓ，ｅｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）を参照のこと。切断されたＥＴＳファミリーメンバータンパク質またはキメラタンパク質およびこれらそれぞれの未変性タンパク質との違いを活用する抗体または断片が特に好ましい。
ＩＩＩ．診断的な応用
ＡＲＧまたはＨＧのＥＴＳファミリーメンバー遺伝子への融合は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質として検出できる。最初に、この遺伝子融合は、ＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域由来の５´部分と、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とを有するゲノムＤＮＡの染色体再編として検出できる。転写されると、この遺伝子融合は、ＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域由来の５´部分とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とを有するキメラｍＲＮＡとして検出できる。翻訳されると、この遺伝子融合は、ＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域のＥＴＳファミリーメンバー遺伝子への融合により生じたアミノ末端で切断されたＥＴＳファミリーメンバータンパク質、ＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域由来のアミノ末端部分とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来のカルボキシ末端部分とを有するキメラタンパク質、あるいは上方制御されているが、それ以外は区別のできない、未変性ＥＴＳファミリーメンバータンパク質として検出できる。この切断ＥＴＳファミリーメンバータンパク質およびキメラタンパク質は、アミノ酸配列、翻訳後処理および／または２次、３次または４次構造において、それぞれの未変性タンパク質とは異なる可能性がある。このような違いは、遺伝子融合が存在する場合、その存在を同定するのに使用することができる。検出に関する具体的な方法は、以下により詳しく記載する。
本発明は、直接的または間接的に遺伝子融合を検出するＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質に基づく診断法を提供する。本発明はまた、診断目的の組成物およびキットも提供する。
本発明の診断法は、定性的または定量的である。定量的な診断方法は、例えば、カットオフまたは閾値を介して緩徐進行性と侵襲性癌を区別するのに利用できる。適用可能な場合、定性的または定量診断法として標的、シグナルまたは中間物（例えば、ユニバーサルプライマー）の増幅も包含する。
最初のアッセイにより、遺伝子融合の存在が確認できるが、特定の融合を同定できない。所望の場合、続いて２次的アッセイを行い、特定の融合を同定する。この２次的なアッセイは、最初のアッセイと異なる検出方法を用いることができる。
本発明の遺伝子融合は、多重またはパネル形式でその他のマーカーと共に検出できる。マーカーは、これらの予測値のみ、あるいは遺伝子融合との組み合わせに関して選択される。例示的な前立腺癌マーカーには、これらには限らないが、ＡＭＡＣＲ／Ｐ５０４Ｓ（米国特許第６，２６２，２４５号）；ＰＣＡ３（米国特許第７，００８，７６５号）；ＰＣＧＥＭｌ（米国特許第６，８２８，４２９号）；プロステイン／Ｐ５０１Ｓ、Ｐ５０３Ｓ、Ｐ５０４Ｓ、Ｐ５０９Ｓ、Ｐ５１０Ｓ、プロスターゼ／Ｐ７０３Ｐ、Ｐ７１０Ｐ（米国公開第２００３０１８５８３０号）、および米国特許第５，８５４，２０６号および同６，０３４，２１８号、および米国公開番号第２００３０１７５７３６に開示のものが挙げられ、これら各々はその全体を参照により援用する。その他の癌、疾患、感染症、および代謝条件についてのマーカーもまた、多重またはパネル形式への包含について考慮される。
本発明の診断法は、データを参照して、特定の遺伝子融合を疾患の病期、攻撃性または進行あるいは転移の存在またはリスクと相関させて、変更することもできる。最終的に、本発明の方法により提供される情報は、医師による特定の患者に対する治療の最良の治療針路の選択に役立つ。
Ａ．試料
遺伝子融合を有する疑いのある任意の患者試料を本発明の方法に従って試験できる。非限定例として、該試料は、組織（例えば、前立腺生検試料または前立腺切除術により得た組織試料）、血液、尿、精液、前立腺液、またはこれらの画分（例えば、血漿、血清、尿の上澄み、尿細胞ペレットまたは前立腺細胞）であってもよい。尿試料は、好ましくは、前立腺腺から前立腺細胞を尿路に流す、注意深い直腸診（ＤＲＥ）の直後に採取される。
患者試料は、遺伝子融合または遺伝子融合を含む細胞について、試料を単離または濃縮するように設計された予備的な処理を通常必要とする。本目的に使用される、当業者に既知の種々の手法として、これらには限られないが、遠心分離、免疫捕捉、細胞溶解、および核酸標的捕捉（例えば、欧州特許第１，４０９，７２７号参照のこと。ここで該文献の全内容を参照により援用する）が挙げられる。
Ｂ．ＤＮＡおよびＲＮＡの検出
本発明の遺伝子融合は、これらには限られないが、核酸配列決定、核酸ハイブリッド形成、および核酸増幅等の当業者に既知の様々な核酸手法を利用してゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの染色体再編成として検出することができる。
１．配列決定
核酸配列決定法の説明的な非限定例として、これらには限らないが、鎖終結（Ｓａｎｇｅｒ）による配列決定およびダイターミネーターによる配列決定が挙げられる。当業者ならば、ＲＮＡは細胞内で安定が損なわれており実験的にヌクレアーゼの攻撃をより受けやすいので、ＲＮＡは通常、配列決定の前にＤＮＡに逆転写されることがわかるであろう。
鎖終結配列決定は、改変ヌクレオチド基質を用いたＤＮＡ合成反応の配列特異性終結を利用する。伸長は、短い放射性の、あるいはその他の標識された、その領域で鋳型に対して相補であるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、鋳型ＤＮＡ上の特定の部位で開始される。このオリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、標準的な４つのデオキシヌクレオチド塩基、および低濃度の１つの鎖終結ヌクレオチド、最も一般的にはジデオキシヌクレオチドを用いて伸長される。この反応は、ジデオキシヌクレオチドとして交互になっている４つの別々の管で繰り返される。ＤＮＡポリメラーゼによる鎖終結ヌクレオチドの限定的な組込みは、特定のジデオキシヌクレオチドが用いられた位置でのみ終結されている一連の関連ＤＮＡ断片を生じる。各反応管について、これらの断片は、平板ポリアクリルアミドゲルまたは粘性ポリマーを充填した毛細管内での電気泳動により、それらの大きさに従って分離される。この配列は、ゲルの最上部から最下部をスキャンして、標識されたプライマーから描出されたマークを生成するレーンを読み取ることで決定される。
ダイターミネーター配列決定は、代わりに、これらのターミネーターを標識する。完全配列決定は、ジデオキシヌクレオチド鎖-ターミネーターの各々を、異なる波長で蛍光を発する別個の蛍光色素で標識することで単一の反応で実施できる。
２．ハイブリッド形成
核酸ハイブリッド形成法の説明的な非限定例として、これらには限らないが、インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイ、およびサザンまたはノーザンブロット法がある。
インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、組織（インサイツ）の部分または切片の所定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列、あるいは組織が十分小さい場合は全組織（ホールマウントＩＳＨ）を局在化させるプローブとして、標識した相補ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を用いるハイブリッド形成 の１種である。ＤＮＡ ＩＳＨは、染色体の構造を決定するのに用いることができる。ＲＮＡ ＩＳＨは、組織切片またはホールマウント内のｍＲＮＡおよびその他の転写物の測定や局在化に使用される。試料細胞および組織は、通常、標的転写物をその場に固定したり、プローブのアクセスを増やすために処理される。このプローブは、高温で標的配列にハイブリッド形成し、その後過剰のプローブを洗浄除去する。放射性、蛍光、または抗原標識された塩基で標識されたプローブは、放射線写真法、蛍光顕微鏡観察、または免疫組織化学的検査のいずれかの方法により、それぞれ組織内で局在化され定量化される。ＩＳＨはまた、２つまたはそれ以上の転写物を同時に検出するために、放射能活性またはその他の非放射性標識で標識された２つまたはそれ以上のプローブを使用できる。
ａ．ＦＩＳＨ
いくつかの実施形態において、融合配列は、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により検出される。本発明に好ましいＦＩＳＨアッセイでは、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）を利用する。これらはヒトゲノム配列決定プロジェクト（Ｎａｔｕｒｅ ４０９：９５３-９５８（２００１）を参照）で広く使用されており、特定のＢＡＣを有するクローンは、例えば、ＮＣＢＩ等の多くの源にわたって存在する販売業者から入手できる。ヒトゲノム由来の各ＢＡＣクローンには、それを明確に同定する参照名が与えられている。これらの名称は、対応するＧｅｎＢａｎｋ配列を見つけたり、販売業者にクローンの複製物を購入するのに使用できる。
いくつかの実施形態において、この検出アッセイは、ＥＴＶ１に対するプローブ（例えば、ｂａｃＲＰ１１-６９２Ｌ４）、ｃ‐ＥＲＧに対する１組のプローブ、ｔ‐ＥＲＧ分断（ｂｒｅａｋ-ａｐａｒｔ）（例えば、ｂａｃＲＰ１１-２４Ａ１１やｔ‐ＥＲＧ ＲＰ１１-３７２０１７またはＲＰ１１-１３７Ｊ１３に対するプローブとして）を用いたＦＩＳＨ分析である。その他の実施形態において、このＦＩＳＨ分析は、一組のプローブを用いたＥＴＶ１欠失または増幅について試験することで実施され、１つのプローブはＥＴＶ１座位（例えば、ｂａｃＲＰ１１-６９２Ｌ４）にまたがり、その他のプローブは７番染色体にハイブリッド形成している（例えば、染色体のセントロメア上のプローブ）。また別の実施形態においては、この方法は一組のプローブを用いたＥＲＧ欠失または増幅について試験することで実施され、１つのプローブはＥＲＧ座位（例えば、ｂａｃＲＰ１１-４７６Ｄ１７）にまたがり、１つの基準プローブは２１番染色体上にある（例えば、ＰＲ１１-３２Ｌ６、ＲＰ１１-７５２Ｍ２３、ＲＰ１１-１１０７Ｈ２１、ＲＰ１１-６３９Ａ７またはＲＰ１１-１０７７Ｍ２１）。さらにまた別の実施形態において、この方法は一組のプローブを用いたＴＭＰＲＳＳ２欠失／増幅について試験することで実施され、１つはＴＭＰＲＳＳ２（例えば、ＲＰ１１-１２１Ａ５、ＲＰ１１-１２０Ｃ１７、ＰＲ１１-８１４Ｆ１３、あるいはＲＲ１１-５３５Ｈ１１）座位にまたがり、１つの基準プローブは２１番染色体上にある（例えば、ＰＲ１１-３２Ｌ６、ＲＰ１１-７５２Ｍ２３、ＲＰ１１-１１０７Ｈ２１、ＲＰ１１-６３９Ａ７、あるいはＲＰ１１-１０７７Ｍ２１）。いくつかの実施形態において、この方法は、これらには限られないが、ＲＰ１１１２１Ａ５、ＲＰ１１１２０Ｃ１７、ＰＲ１１-８１４Ｆ１３、およびＲ１１-５３５Ｈ１１等を含む群から選ばれるプローブを用いたハイブリッド形成の工程をさらに有する。
本発明はさらに、ヒト前立腺細胞、ヒト前立腺組織、または前記ヒト前立腺細胞またはヒト前立腺組織を取り囲む液体に対してＦＩＳＨ分析を行う方法を提供する。いくつかの実施形態において、このアッセイは、これらには限られないが、ＲＰ１１-３７２０１７、ＲＰ１１-１３７Ｊ１３、ＲＰ１１-６９２Ｌ４、ＲＰ１１-４７６Ｄ１７、ＰＲ１１-３２Ｌ６、ＲＰ１１-７５２Ｍ２３、ＲＰ１１-１１０７Ｈ２１、ＲＰ１１-６３９Ａ７、ＲＰ１１-１０７７Ｍ２１、ＲＰ１１-１２１Ａ５、ＲＰ１１-１２０Ｃ１７、ＰＲ１１-８１４Ｆ１３、およびＲＲ１１-５３５Ｈ１１を含む群から選ばれたプローブを用いる、ハイブリッド形成の工程を含む。
本発明に関連する再配列を検出するためにＦＩＳＨプロトコル内に用いることのできる特定のＢＡＣクローンは以下のとおりである。
・ＥＴＶ１-ＴＭＰＲＳＳ２融合に関する試験については、以下の、ＥＴＶ１にまたがる１つのプローブと、ＴＭＰＲＳＳ２座位にまたがるものが使用できる：
ＥＴＶ１：ＲＰ１１-６９２Ｌ４用のＢＡＣ
ＴＭＰＲＳＳ２：ＲＰ１１-１２１Ａ５、（ＲＰ１１-１２０Ｃ１７、ＰＲ１１-８１４Ｆ１３、ＲＲ１１-５３５Ｈ１１）用のＢＡＣ。
・ｃ‐ＥＲＧ：ｔ‐ＥＲＧ分解物に関して１組のプローブを用いてＥＲＧ転移を試験する場合、
ｃ‐ＥＲＧ：ＲＰ１１-２４Ａ１１用のＢＡＣ、
ｔ‐ＥＲＧ：ＲＰ１１-３７２０１７、ＲＰ１１-１３７Ｊ１３用のＢＡＣ
が使用できる。
・１つがＥＴＶ１座位にまたがり、１つの基準プローブが７番染色体上にある１組のプローブを用いてＥＴＶ１欠失／増幅の試験する場合、
ＥＴＶ１：ＲＰ１１-６９２Ｌ４に対するＢＡＣ
が使用できる。
ＥＲＧ欠失／増幅を試験する場合、以下の、１つがＥＲＧ座位にまたがり、１つの基準プローブが２１番染色体上にある１組のプローブを用いる：
ＥＲＧ：ＲＰ１１-４７６Ｄ１７用のＢＡＣ、
２１番染色体上の基準プローブ用のＢＡＣ。*
・ＴＭＰＲＳＳ２欠失／増幅を試験する場合、以下の、１つがＴＭＰＲＳＳ２座位にまたがり、１つの基準プローブが２１番染色体上にある１組のプローブを用いる：
ＴＭＰＲＳＳ２：ＲＰ１１-１２１Ａ５用のＢＡＣ、（ＲＰ１１-１２０Ｃ１７、ＰＲ１１-８１４Ｆ１３、ＲＲ１１-５３５Ｈ１１）、
２１番染色体上の基準プローブ用のＢＡＣ：ＰＲ１１-３２Ｌ６、ＲＰ１１-７５２Ｍ２３、ＲＰ１１-１１０７Ｈ２１、ＲＰ１１-６３９Ａ７、（ＲＰ１１-１０７７Ｍ２１）。
ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間の融合を生じている欠失変異を検出するのに最も好ましいプローブは、ＲＰ１１-２４Ａ１１およびＲＰ１１-１３７Ｊ１３である。これらのプローブまたは上記のものは、適切な蛍光またはその他のマーカーで標識され、その後ハイブリッド形成に用いられる。本願明細書中の実施例に関する部分は、欠失を測定するのに効果的な１つの特定のプロトコルを述べており、当業者であれば、このアッセイの様々な変形が同等によく用いることができることがわかるであろう。特定のプロトコルは当該技術分野でよく知られており、本発明に容易に適応させることができる。方法論に関する手引きは、Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ｅｄｓ．Ｇ．Ｒ．Ｃｏｕｌｔｏｎ ａｎｄ Ｊ．ｄｅ Ｂｅｌｌｅ Ｒｏｃｈｅ）、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９２）；Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｊ．Ｈ．Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，Ｋ．Ｌ．Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．ＢａｒＣＨａｓ），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）；Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９２））；Ｋｕｏ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９：Ｕ２-Ｕ９（１９９１）；Ｋｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５１：５５-６５（１９９２）；およびＷａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：８５４-８６５（１９９３））等の多くの参考文献から入手できる。市販のものでＦＩＳＨアッセイを実施するためのプロトコルを提供するキットもある（例えば、米国メリーランド州ゲイザースバーグのＯｎｃｏｒ社から市販されている方法論についての指針を与える特許として、米国特許第５，２２５，３２６号、５，５４５，５２４号、６，１２１，４８９号、および６，５７３，０４３号がある。これら全ての文献は、参照によりその全内容が本明細書に援用され、当該技術分野における文献および特定の研究室で簡便な手順上の工程を構築するのに本願明細著中で記載の情報とともに使用される。
下記の表１３は、ＦＩＳＨプローブとしての用途を有するＢＡＣクローンをさらに示す。
（表１３）
Figure 0005529732
本発明の方法において有用なＦＩＳＨプローブをさらに表１６に示す（図４６）。
ｂ．マイクロアレイ
異なる種類の生物学的アッセイは、これらには限られないが、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ）、タンパク質マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、トランスフェクトまたは細胞マイクロアレイ、化学化合物マイクロアレイ、および抗体マイクロアレイ等、マイクロアレイと称する。遺伝子チップ、ＤＮＡチップ、またはバイオチップとして通常知られるＤＮＡマイクロアレイは、発現のプロファイリングの目的、または数千もの遺伝子について発現レベルを同時にモニターするためにアレイを形成する固体表面（例えば、ガラス、プラスチックまたはシリコンチップ）に付着させた微視的なＤＮＡの斑点の集合である。これらのＤＮＡセグメントは、プローブとして知られており、このうちの数千は単一のＤＮＡマイクロアレイ内で使用できる。マイクロアレイは、疾患および正常細胞における遺伝子発現を比較することで疾患遺伝子を同定するのに使用できる。マイクロアレイは、これらには限らないが、細い先端を有するピンでスライドガラス上に印刷したり、あらかじめ作製したマスクを用いたフォトリソグラフィ、動的マイクロミラーを用いたフォトリソグラフィ、インクジェット印刷、あるいは微小電極アレイ上の電気化学等の種々の技術によって加工できる。
サザンおよびノーザンブロット法は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列をそれぞれ検出するのに使用される。試料から抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡは、断片化し、電気泳動によりマトリックスゲル上で分離し、膜フィルターに移す。このフィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡは、対象とする配列に相補である標識されたプローブを用いたハイブリッド形成を受ける。フィルターに結合した、ハイブリッド形成したプローブを検出する。この手順を変形したものが逆ノーザンブロット法であり、この方法では膜に付着した基質核酸が単離ＤＮＡ断片の集合であり、プローブが組織から抽出され標識されたＲＮＡである。
３．増幅
ゲノムＤＮＡとキメラｍＲＮＡの染色体再編成は、検出の前あるいは検出と同時の増幅であってもよい。核酸増幅手法の説明的な非限定例として、これらには限らないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）がある。当業者ならば、その他の増幅手法は直接的にＲＮＡを増幅する（例えば、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）のに対し、ある種の増幅手法（例えば、ＰＣＲ）は、ＤＮＡが増幅前にＤＮＡ（例えば、ＲＴ‐ＰＣＲ）に対して逆転写されることが必要であることがわかるであろう。
通常ＰＣＲと称するこのポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、および第４，９６５，１８８号、ここでこれら各文献の全内容を参照により援用する）は、変性、プライマー対の逆ストランドへのアニーリング、および標的核酸配列の複製個数を指数的に増やすプライマー伸長のサイクルを複数用いる。ＲＴ‐ＰＣＲとよばれる変形法では、逆転写酵素（ＲＴ）がｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製するのに利用され、続いてｃＤＮＡがＰＣＲにより増幅されてＤＮＡの複数の複製物を生成する。ＰＣＲのその他の様々な並べ替えについては、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５（１９８７）、およびＭｕｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ７：２８７（１９８８）を参照されたい。ここでこれら各文献の全内容を参照により援用する。
通常ＴＭＡとよばれる転写介在性増幅（米国特許第５，４８０，７８４号および第５，３９９，４９１号、ここで各文献の全内容を参照により援用する）は、標的配列の複数のＲＮＡ複製物が自己触媒的にさらなる複製物を生成する、実質的に一定の温度、イオン強度、およびｐＨの条件下で、自己触媒的に標的核酸配列の複数の複製物を合成する。例えば、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，８２４，５１８号を参照されたい。ここでこれら各文献の全内容を参照により援用する。米国公開番号第２００６００４６２６５号（ここで該文献の全内容を参照により援用する）に記載の変形法においては、ＴＭＡは、阻止部分、終結部分、およびＴＭＡ工程の感度および精度を改善するためのその他の改質部分の利用を適宜取り入れている。
通常ＬＣＲとよばれるリガーゼ連鎖反応（Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２９２（１９９１）、ここで該文献の全内容を参照により援用する）では、標的核酸の隣接領域にハイブリッド形成する２組の相補ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる。これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドは、熱的変性、ハイブリッド形成、および検出可能な２本鎖連結オリゴヌクレオチド産物を生成する連結の繰り返しサイクルにおいて、ＤＮＡリガーゼによって共有結合によって結合している。
通常ＳＤＡとよばれる鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８９：３９２-３９６（１９９２）、米国特許第５，２７０，１８４号、および第５，４５５，１６６号、ここで各文献の全内容を参照により援用する）は、標的配列の逆ストランドへのプライマー配列のアニーリング、２本鎖ヘミホスホチオエート化プライマー伸長生成物を生成するためのｄＮＴＰαＳ存在下でのプライマー伸長、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ介在性ニッキング、および該ニックの３´末端からポリメラーゼ介在性プライマー伸長し、現存する鎖を置き換えて次サイクルのプライマーアニーリング、ニッキングおよび鎖の置き換えのための鎖を生成し、生成物の幾何学的増幅を生じる。好熱性のＳＤＡ（ｔＳＤＡ）では、好熱性のエンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼをより高い温度で本質的に同じ方法に用いる（欧州特許第０６８４３１５号）。
その他の増幅方法として、例えば、通常ＮＡＳＢＡとよばれる核酸配列ベース増幅（米国特許第５，１３０，２３８、ここで該文献の全内容を参照により援用）、プローブ分子自身を増幅するために通常Ｑβ複製酵素とよばれるＲＮＡ複製酵素を用いる方法（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：１１９７（１９８８）、ここで該文献の全内容を参照により援用）、転写ベースの増幅方法（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３（１９８９））、および自家持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４（１９９０）、ここで各文献の全内容を参照により援用）がある。既知の増幅方法についてのさらなる議論については、Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．の「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」 ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．）、ｐｐ．５１-８７（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９３））を参照。
４．検出方法
非増幅または増幅遺伝子融合核酸は、各種の従来手段により検出できる。例えば、遺伝子融合は、検出可能に標識されたプローブを用いたハイブリッド形成およびその結果得られるハイブリッドの測定により検出できる。例示的な検出法の非限定例を以下に示す。
例示的な検出方法の１つである、ハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイ（ＨＰＡ）は、化学発光オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、アクリジニウムエステル標識（ＡＥ）プローブ）を標的配列とハイブリッド形成させる工程と、非ハイブリッド形成プローブ上に存在する化学発光標識を選択的にハイブリッド形成させる工程と、ルミノメーターに残存するプローブから生じる化学発光を測定する工程とを含む。例えば、米国特許第５，２８３，１７４号およびＮｏｒｍａｎ Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｃｈ．１７（Ｌａｒｒｙ Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９９５、ここで各文献の全内容を参照により援用する）を参照。
その他の説明的な検出方法は、増幅過程のリアルタイムでの定量的評価を提供する。増幅過程の「リアルタイム」での評価は、増幅反応中持続的または一定期間ごとに反応混合物中の増幅産物の量を決定する工程と、決定値を用いて試料中に最初に存在した標的配列の量を計算する工程とを含む。リアルタイム増幅に基づく試料中の初期の標的配列の量を決定する種々の方法は、当該技術分野でよく知られている。このような方法として、米国特許第６，３０３，３０５号および第６，５４１，２０５号に開示の方法が挙げられ、ここでこれら各文献の全内容を参照により援用する。リアルタイム増幅に基づかない、試料中に最初に存在下標的配列の量を決定するその他の方法は、米国特許第５，７１０，０２９号に開示されており、ここで該文献の全内容を参照により援用する。
増幅産物は、ほとんどがステムループ構造を有する様々な自己ハイブリッド形成プローブを用いてリアルタイムに検出できる。このような自己ハイブリッド形成プローブは、プローブが自己ハイブリッド形成状態にあるか標的配列とハイブリッド形成する変容状態にあるかによって、検出可能なシグナルを異なって発するように標識されている。非限定例として、「分子トーチ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｒｃｈ）」は、結合領域（例えば、非ヌクレオチドリンカー）で結合し、所定のハイブリッド形成アッセイ条件下で互いにハイブリッド形成しあう、自己相補性を有する別々の領域（「標的結合領域」および「標的閉鎖領域」と称する）を有する、自己ハイブリッド形成プローブの１種である。好ましい実施形態において、分子トーチは、標的結合領域中に、１〜約２０塩基の長さの、鎖置換条件下での増幅反応において存在する標的配列とのハイブリッド形成に利用可能な、１本鎖塩基領域を有する。鎖置換条件下では、標的結合領域に存在する１本鎖領域に結合し標的閉鎖領域の全てまたは一部を置換する標的配列の存在下を除き、分子トーチの、完全または部分的に相補の可能性のある、２つの相補領域のハイブリッド形成が好まれる。分子トーチの標的結合領域および標的閉鎖領域は、分子トーチが標的配列とハイブリッド形成するときと分子トーチが自己ハイブリッド形成するときとで異なるシグナルが生成されるように配置した、検出可能な標識または相互作用する標識の対（例えば、発光／消光剤）を有し、これにより非ハイブリッド形成分子トーチ存在下で試験試料中のプローブ：標的の２本鎖の検出を可能にする。分子トーチおよび様々な種類の相互作用する標識対は米国特許第６，５３４，２７４号に開示されており、ここで該文献の全内容を参照により援用する。
自己相補性を有する検出プローブの別の例は「分子ビーコン」である。「分子ビーコン」として、標的相補配列、増幅反応に存在する標的配列の非存在下の閉構造におけるプローブを保持するアフィニティ対（あるいは核酸アーム）、およびプローブが閉構造にあるときに相互作用する標識対を有する核酸分子がある。標的配列および標的相補配列のハイブリッド形成は、アフィニティ対のメンバーを分離し、これによりプローブを開構造にシフトする。この開構造へのシフトは標識対の低下した相互作用のため、例えば、フルオロフォアおよび消光剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）で、検出可能である。分子ビーコンは、米国特許第５，９２５，５１７号および第６，１５０，０９７号に開示されており、ここで該文献の全内容を参照により援用する。
その他の自己ハイブリッド形成プローブは、当業者によく知られている。非限定例として、米国特許第５，９２８，８６２号（ここで該文献の全内容を参照により援用する）に開示されているもののような、相互作用する標識を有するプローブ結合対は、本発明における使用に適しているはずである。一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）を検出するのに用いられるプローブシステムは、本発明においても利用できるはずである。さらなる検出システムとして、米国公開番号第２００５００４２６３８号に開示される「分子スイッチ」があり、ここで該文献の全内容を参照により援用する。インターカレーティング色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅ）および／または蛍光色素を含むもの等のその他のプローブもまた、本発明における増幅産物の検出に有用である。例えば、米国特許第５，８１４，４４７号（ここで該文献の全内容を参照により援用）を参照。
C.タンパク質検出
本発明の遺伝子融合は、これらには限られないが、タンパク質配列決定やイムノアッセイ等の当業者には既知の様々なタンパク質手法を用いて、切断されたＥＴＳファミリーメンバータンパク質またはキメラタンパク質として検出できる。
１．配列決定
タンパク質配列決定法の説明的な非限定例として、これらには限らないが、質量分析およびエドマン分解がある。
質量分析は、原則として、どのような大きさのタンパク質でも配列決定できるが、大きさが増すにつれ計算的に困難になる。タンパク質をエンドプロテアーゼにより消化し、得られた溶液を高圧液体クロマトグラフィー用のカラムに通す。このカラムの終端で、溶液は、高い陽電位に荷電された狭いノズルから質量分析計に噴射される。液滴上の電荷は、単一のイオンのみが残るまで細分化する。これらのペプチドは、その後細分化され、それらの断片の質量-電荷比を測定する。この質量スペクトルはコンピュータで解析され、多くの場合、それらの断片の配列を決定するため、過去に配列決定されたタンパク質のデータベースと比較される。その後、このプロセスを異なる消化酵素を用いて繰り返し、配列中の重複部分をそのタンパク質についての配列を構築するのに用いる。
エドマン分解反応においては、配列決定されるペプチドを固体表面（例えば、ポリブレン塗装したガラス繊維）上に吸着させる。エドマン試薬であるフェニルイソチオシアネート（ＰＴＣ）を、吸着されたペプチドに、１２％トリメチルアミンの弱塩基性緩衝液溶液とともに添加し、Ｎ末端アミノ酸のアミン基と反応させる。続いて、末端アミノ酸誘導体を、酸無水物の添加により選択的に脱離させる。この誘導体を異性化することにより、洗浄除去できかつクロマトグラフィで同定できる置換フェニルチオヒダントインを得、このサイクルは繰り返すことができる。各工程の効率は約９８％であり、およそ５０のアミノ酸を確実に決定できる。
２．イムノアッセイ
イムノアッセイの説明的な非限定例として、これらには限らないが、免疫沈降、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、免疫細胞化学、フローサイトメトリ、および免疫ＰＣＲがある。当業者に既知の様々な手法（例えば、比色、蛍光、化学発光または放射性）を用いて検出可能に標識したポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、イムノアッセイにおける使用に好適である。
免疫沈降とは、抗原に特異的な抗体を用いて溶液から抗原を沈降させる手法である。このプロセスは、複合体中にあると考えられるタンパク質を標的とすることで、細胞抽出物中に存在するタンパク質複合体を同定するのにしようできる。これらの複合体は、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇのように細菌から最初に単離された不溶性の抗体-結合タンパク質により、溶液から取り出される。この抗体はまた、溶液から容易に単離できるセファロースビーズにも結合させることができる。洗浄後、この沈殿を質量分析、ウェスタンブロット、または複合体中の成分を同定するためのあらゆるその他の方法により分析することができる。
ウェスタンブロット法、または免疫ブロット法とは、組織破砕物または抽出物の所定の試料中のタンパク質を検出するための方法である。変性したタンパク質を質量ごとにゲル電気泳動で分離する。これらのタンパク質は、その後、関心対象のタンパク質に特異的な抗体を用いて調べる場合、通常ポリ２フッ化ビニルまたはニトロセルロースの膜上にゲルから移す。結果として、研究者は所与の試料中のタンパク質の量を調べ、いくつかのグループ間でそのレベルを比較できる。
酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ-Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）の省略形であるＥＬＩＳＡは、試料中の抗体または抗原の存在を検出する生化学的手法である。一方が抗原に対して特異的であり他方が酵素に結合する、少なくとも２つの抗体を使用する。第２の抗体は、シグナルを生成するための発色性または蛍光発生的な基質を生じる。ＥＬＩＳＡの変形法として、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、およびＥＬＩＳＰＯＴがある。ＥＬＩＳＡは、資料中の抗原の存在または抗体の存在を評価するために実施できるので、血清抗体濃度の決定であると同時に、抗原の存在の検出にも有用なツールである。
免疫組織化学的検査および免疫細胞化学とは、これらのそれぞれの抗体に結合している組織または細胞中の抗原の原理により、組織切片または細胞中でそれぞれタンパク質を局在化するプロセスを意味する。発色または蛍光タグで標識することで可視化できる。色タグの典型例として、これらには限らないが、西洋わさびペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼがある。フルオロフォアタグの典型例として、これらには限らないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）がある。
フローサイトメトリは、流れる液体中に懸濁した微視的な粒子の計数、検査、および選別するための手法である。この手法は、光学的／電子的検出装置を流れる単一の細胞の物理的および／または化学特徴についての同時多様性解析を可能にする。単一周波数または色の光線（例えば、レーザー）を流体力学的に収束した流体束に向ける。いくつかの検出器は、その流れが光線を通過する点に向けられ、１つは光線と一致しており（前方散乱またはＦＳＣ）、いくつかはそれに（側方散乱（ＳＳＣ）および１またはそれ以上の蛍光検出器）対して垂直である。光線を通過する各懸濁粒子は、何らかの方法でその光を散乱し、粒子中の蛍光化学物質は光源よりも低い周波数で発光に励起される。散乱光と蛍光の組み合わせは、検出器により捕捉され、各発光ピーク用の各検出器における輝度の変動を分析することにより、各々の粒子の物理的および化学構造に関する様々な事実を推定することができる。ＦＳＣは細胞体積と相関し、ＳＳＣは密度または粒子の内部複雑性（例えば、核の形状、細胞質顆粒の量や種類、または膜の粗さ）と相関している。
免疫ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＰＣＲ）は、抗体ベースのイムノアッセイにおけるシグナル発生を増加させる核酸増幅手法を利用する。ＰＣＲのタンパク質等価物が存在しない、つまり、ＰＣＲ中に複製されるのと同じ様式では核酸は複製できないので、検出感度を上げる唯一の方法は、シグナル増幅によるものである。これらの標的タンパク質は、オリゴヌクレオチドに直接的または間接的に抱合している抗体に結合している。非結合抗体を洗浄除去し、残留する結合抗体はこれらのオリゴヌクレオチドを増幅する。タンパク質検出は、リアルタイム法等の標準的な核酸検出方法を用いることで増幅オリゴヌクレオチドを介して起こる。
Ｄ．データ解析
いくつかの実施形態において、コンピュータベースの解析プログラムは、検出アッセイにより作製された生データ（例えば、所定の遺伝子融合またはその他のマーカーの存在、非存在、または量）を、臨床医のための予測値データに翻訳するのに使用される。臨床医は、任意の好適な手段を用いて予測データを利用できる。従って、いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、遺伝学または分子生物学についておそらく学んでいないような臨床医が生データを理解する必要がないという、さらなる長所を提供する。本データは、最も有用な形態で臨床医に直接提示される。そうすると、臨床医は、患者のケアを最適化するための情報を即座に利用できる。
本発明は、情報を受け取り、処理し、そのアッセイを行っている実験室から／実験室へ送信することのできる各種方法を意図しており、これらの情報は、医療関係者や患者に提供できる。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、試料（例えば、生検または血清または尿試料）は、患者から採取され、世界のどこか（例えば、患者が居住する国や情報が究極的に使用される場所とは異なる国）に位置するプロファイリングサービス（例えば、医療施設、ゲノムプロファイリング業者の臨床検査室等）に提出され、生データを作製する。この試料が組織またはその他の生物試料からなる場合、患者は、試料を採取しプロファイリングセンターに送付する医療センターに行くか、あるいは患者は自分で試料を採取し（例えば、尿試料）直接プロファイリングセンターに送付してもよい。試料が過去に決定された生物学的情報を含む場合、このような情報は、患者によって直接プロファイリングセンターに送付できる（例えば、コンピュータによりスキャンできる情報や電子通信システムを利用してプロファイリングセンターに送信するデータを有する）。プロファイリングサービスが試料を受取ると、試料は処理され、その患者が望む診断または予後の情報に特有のプロファイル（すなわち、発現データ）が作製される。
続いてこのプロファイルデータは、治療担当の臨床医による理解に好適なフォーマットで作製される。例えば、生の発現データを提供するのではなく、その作製フォーマットは、診断あるいはリスク評価（例えば、存在する癌の可能性）を、特定の治療の選択肢に関する推奨とともに示すことができる。このようなデータは、各種の好適な方法で臨床医に対して表示できる。例えば、いくつかの実施形態において、プロファイリングサービスは、遺伝子臨床医に対して印刷可能な報告書を作製したり（例えば、治療を行う場所で）、あるいはコンピュータのモニター上に臨床医に対して表示したりする。
いくつかの実施形態においては、このような情報はまず治療を行う場所または現地施設で解析する。その後、生データをさらに分析かつ／または臨床医または患者に有用な情報に生データを変換するのに、中央処理施設に送信する。この中央処理施設は、プライバシー（全データは統一されたセキュリティプロトコルを有する中央施設に保存されている）、速度、およびデータ解析の統一性について利点を提供する。続いて、この中央処理施設は、患者のデータに従った治療の末路を制御する。例えば、電子通信システムを利用して、この中央施設はデータを臨床医、患者、または研究者に提供できる。
いくつかの実施形態において、患者は、電子通信システムを利用して直接データにアクセスできる。患者は、この結果に基づいた、さらなる治療介入やカウンセリングを選択できる。いくつかの実施形態において、このデータは研究用途に使用される。例えば、データは、疾患の特定の状態または段階の有用な指標として、マーカーの包含や除去をさらに最適化するのに使用できる。
Ｅ．インビボイメージング
本発明の遺伝子融合は、インビボイメージング手法により検出することもでき、これらには限られないが、放射性核種イメージング、陽電子放射断層撮像（ＰＥＴ）、コンピュータ体軸断層撮像、Ｘ線または磁気共鳴イメージング法、蛍光検出、および化学発光検出が挙げられる。いくつかの実施形態において、インビボイメージング手法は、動物（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）における癌マーカーの存在または発現を描出するのに使用される。例えば、いくつかの実施形態において、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質は、癌マーカーに特異的な標識抗体を用いて標識される。特異的に結合し標識された抗体は、これらには限られないが、放射性核種イメージング、陽電子放射断層撮像、コンピュータ体軸断層撮像、Ｘ線または磁気共鳴イメージング法、蛍光検出、および化学発光検出等のインビボイメージング法を用いることで、個体中で検出できる。本発明の癌マーカーに対する抗体の生成法を以下に述べる。
本発明のインビボイメージング法は、本発明の癌マーカー（例えば、前立腺癌）を発現する癌の診断に有用である。インビボイメージングは、癌の指標となるマーカーの存在を描出するのに用いられる。このような手法は、不快な生検を用いることなく、診断を可能にする。この本発明のインビボイメージング法は、癌患者に対する予後を提供するのにも有用である。例えば、癌の指標となるマーカーの存在は、おそらく検出できるであろう。本発明のインビボイメージング法は、体のその他の部分にある転移性癌を検出するのにさらに使用できる。
いくつかの実施形態において、本発明の癌マーカーに特異的な試薬（たとえば抗体）は、蛍光で標識される。これらの標識抗体は、（例えば、経口または非経口的に）患者に導入される。蛍光で標識した抗体は、各種の好適な方法（例えば、米国特許第６，１９８，１０７号に記載の装置を用いて。ここで参照により援用する）を利用して検出される。
別の実施形態において、抗体は放射性活性物質で標識される。インビボ診断のための抗体の使用は、当該技術分野でよく知られている。Ｓｕｍｅｒｄｏｎらは（Ｎｕｃｌ.Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ １７：２４７-２５４［１９９０］）インジウム-１１１を標識として用いた放射免疫シンチグラフイによる腫瘍のイメージングのための最適化抗体-キレート剤を記載している。Ｇｒｉｆｆｉｎらは（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ ９：６３１-６４０［１９９１］）再発性結腸直腸癌を有する疑いのある患者内の腫瘍を検出する際の、この試薬の使用について記載している。常磁性イオンを磁気共鳴イメージングのための標識として有する同様の試薬の使用は当該技術分野で既知である（Ｌａｕｆｆｅｒ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２：３３９-３４２［１９９１］）。使用する標識は、選択するイメージング様式による。インジウム-１１１、テクネチウム-９９ｍ、またはヨウ素-１３１等の放射性標識が、平面スキャンまたは単一光子放射型コンピュータ断層撮像（ＳＰＥＣＴ）に使用できる。フッ素-１９のようなポジトロン放出標識は、陽電子放射断層撮像（ＰＥＴ）にも使用できる。ＭＲＩに対しては、ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）等の常磁性イオンが使用できる。
スカンジウム-４７（３．５日間）ガリウム-６７（２．８日間）、ガリウム-６８（６８分間）、テクネチウム-９９ｍ（６時間）、およびインジウム-１１１（３．２日間）等の１時間〜３．５日間の範囲の半減期を有する放射性金属が、抗体への結合に使用でき、そのうちガリウム-６７、テクネチウム-９９ｍおよびインジウム-１１１は、ガンマカメライメージングに好ましく、ガリウム-６８は、陽電子放射断層撮像に好ましい。
このような放射性金属で抗体を標識する有用な方法は、例えば、Ｉｎ-１１１およびＴｃ‐９９ｍについてＫｈａｗら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：２９５［１９８０］）、およびＳｃｈｅｉｎｂｅｒｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１５１１［１９８２］）により記載されているようにジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）等の二官能性キレート化剤によるものである。その他のキレート化剤も使用できるが、抗体の免疫活性に対して実質的に影響を及ぼすことなく結合を可能にするので、１-（ｐ-カルボキシメトキシベンジル）ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡのカルボキシ酸炭酸無水物（ｃａｒｂｏｘｙｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）は有用である。
ＤＰＴＡをタンパク質に結合させる別の方法として、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｒａｄｉａｔ．Ｉｓｏｔ．３３：３２７［１９８２］）に記載されるように、アルブミンをＩｎ-１１１で標識するためにＤＴＰＡの環状無水物を使用する方法があるが、この方法は抗体の標識に適用できる。キレート化を利用しないで抗体をＴｃ‐９９ｍで標識する好適な方法として、Ｃｒｏｃｋｆｏｒｄらの錫めっき前処理（ｐｒｅｔｉｎｎｉｎｇ）がある（米国特許第４，３２３，５４６号、ここで参照により援用する）。
免疫グロブリンをＴｃ‐９９ｍで標識する好ましい方法は、Ｗｏｎｇらによって（Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｒａｄｉａｔ．Ｉｓｏｔ．，２９：２５１［１９７８］）血漿タンパク質について記載されており、最近ではＷｏｎｇらが（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２３：２２９［１９８１］）抗体標識への応用に成功した。
特定の抗体に結合した放射性金属の場合、その免疫特異性を損なうことなく抗体分子中にできるだけ高い比率の放射性標識を導入することが同様に望ましい。さらなる改良は、抗体上の抗原結合部位が確実に保護されるように、本発明の特定の癌マーカーの存在下で放射性標識をもたらすことにより達成できる。この抗原は、標識後に分離される。
また別の実施形態においては、インビボバイオフォトニックイメージング（Ｘｅｎｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州アルメダ）をインビボイメージングに利用する。このリアルタイムインビボイメージングではルシフェラーゼを用いる。ルシフェラーゼ遺伝子は細胞、微生物、および動物（例えば、本発明の癌マーカーを有する融合タンパク質）に組込まれる。活性時は、光を発する反応に至る。ＣＣＤカメラおよびソフトウェアを画像を捕捉し解析するのに用いる。
Ｆ．組成物およびキット
本発明の診断法において用いるための組成物として、これらには限らないが、プローブ、増幅オリゴヌクレオチド、および抗体がある。特に好ましい組成物は、ＡＲＧまたはＨＧがＥＴＳファミリーメンバー遺伝子と融合するときのみに産物を検出する。これらの組成物は、ＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域由来の５´部分がＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分に融合している接合部とハイブリッド形成する配列（すなわち、遺伝子融合接合部に広がる）；第１の増幅オリゴヌクレオチドがＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域とハイブリッド形成する配列を含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドがＥＴＳファミリーメンバー遺伝子とハイブリッド形成する配列を含む、１対の増幅オリゴヌクレオチド；ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子へのＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域の融合から生じた、アミノ末端で切断されたＥＴＳファミリーメンバータンパク質に対する抗体；あるいはＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域由来のアミノ末端部分とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来のカルボキシ末端部分とを有するキメラタンパク質に対する抗体を含む、単一の標識されたプローブを含む。しかしながらその他の有用な組成物は、第１の標識されたプローブがＡＲＧまたはＨＧの転写制御領域とハイブリッド形成する配列を含み、第２の標識されたプローブがＥＴＳファミリーメンバー遺伝子とハイブリッド形成する配列を含む、１対の標識されたプローブを含む。
これらの組成物のいずれもが、それ自身あるい本発明のその他の組成物との組み合わせで、キットの形態で提供できる。例えば、単一の標識されたプローブおよび１対の増幅オリゴヌクレオチドを本発明の遺伝子融合の増幅および検出のためにキットとして提供できる。キットは、適切な対照物および／または検出試薬をさらに含んでいてもよい。本発明のプローブおよび抗体組成物はまた、アレイの形で提供してもよい。
ＩＶ．予後への応用
本発明の開発の過程で実施した実験は、本発明の遺伝子融合と前立腺癌を有する患者の予後との間の緊密な相関関係を実証した（例えば、以下の実施例５を参照）。ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間にあるゲノムＤＮＡの欠失から融合が起こっている症例においては特に、癌細胞がより侵襲性表現型をとることがわかってきた。従って、いくつかの実施形態において、介在ＤＮＡの欠失のある、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間の遺伝子融合を検出できるアッセイは、予後を提供し、医師が適切な治療法を決定する手助けとして用いられる。例えば、いくつかの実施形態において、この特定の再配列有する腫瘍をもつ患者はこれらの予後が再配列のない患者に比べて著しく悪いので、より集中的に治療される。
任意のアッセイが、細胞が先に考察された種類の再配列を有して存在しているかどうかを決定するのに使用できる（例えば、上述のもの）。
最も好ましくは、本発明は前立腺癌患者の予後を得ることと関連しても用いられるが、その他の上皮細胞腫瘍もまた検討され、本願明細書に記載のアッセイおよびプローブは、腫瘍由来の癌性細胞がこれらを特に高悪性度、すなわちおそらく侵襲性および転移性にする再配列を有するかどうかを決定するのに使用されうる。この方法を用いることを特徴とする腫瘍の例として、胸部、肺、結腸、卵巣、子宮、食道、胃、肝臓、腎臓、脳、皮膚、および筋肉の腫瘍がある。これらのアッセイは、細胞株や動物モデルでこれらの癌を研究する研究者にとっても価値のあるものであろう。
本発明の過程で実施したさらなる実験は、欠失領域に位置する１またはそれ以上の遺伝子の発現が失われているかどうかを決定するために試料を分析することで染色体欠失が検出できることを実証した。例えば、およそ２．８メガベースのゲノムＤＮＡは、通常、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの融合を形成する際に欠失し、この欠失時この領域に位置する少なくとも４つの遺伝子が失われる。これらは、ＥＴＳ２遺伝子、ＷＲＢ遺伝子、ＰＣＰ４遺伝子、およびＭＸｌ遺伝子である。癌性前立腺細胞に存在する１またはそれ以上の減少は、予後不良を示唆している。
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、癌関連の再配列の指標となる、上皮細胞における染色体ＤＮＡの欠失を分析する方法を提供するものであり、この方法は、第１のプローブが少なくとも１５ヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１５、２０、３５等）であり、第１の蛍光標識に結合し、かつ厳密条件下でヒトゲノム内の第１の配列とハイブリッド形成し、この第１の配列はアンドロゲン応答性遺伝子（例えば、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子）またはＥＴＳファミリー遺伝子（例えば、ＥＲＧ遺伝子、ＥＴＶ１遺伝子、またはＥＴＶ４遺伝子）の少なくとも一部を含み、第２のプローブが少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、第１の蛍光標識とは異なる第２の蛍光標識に結合し、かつアンドロゲン応答性遺伝子（例えば、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子）またはＥＴＳファミリー遺伝子（例えば、ＥＲＧ遺伝子、ＥＴＶ１遺伝子、またはＥＴＶ４遺伝子）の少なくとも一部を含む、前記第１の配列とは異なるヒトゲノム中の第２の配列と厳密条件下でハイブリッド形成する、少なくとも第１および第２のプローブを用いてＦＩＳＨ分析を行う工程を含む。
別の実施形態においては、本発明は、癌関連の再配列の指標となる上皮細胞（例えば、前立腺細胞）におけるゲノムＤＮＡの欠失を分析する方法を提供し、この方法は、上皮細胞の試験試料を得る工程と、これらには限られないが、ＥＴＳ２、ＷＲＢ、ＰＣＰ４、およびＭＸｌを含む群より選ばれる１つまたはそれ以上の遺伝子の発現レベルを決定するために、上皮細胞の試料を分析する工程と、工程（ｂ）で決定した発現レベルを対照試料中のレベルと比較する工程と、試験試料中のその遺伝子について決定した発現レベルが対照試料のものより低ければ、欠失が起こったと結論する工程とを含む。
Ｖ．薬剤スクリーニングへの応用
いくつかの実施形態において、本発明は、薬剤スクリーニングアッセイ（例えば、抗癌剤のスクリーニング）を提供する。本発明のこのスクリーニング法は、本発明の方法、例えばこれらには限られないが、本発明の遺伝子融合）により同定したがんマーカーを利用するものである。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子融合の発現を変化させる（例えば減少させる）化合物のスクリーニング法を提供する。これらの化合物または作用物質は、例えばプロモーター領域との、相互作用によって転写を妨げる可能性がある。このような化合物または作用物質は、融合により生成されたｍＲＮＡを阻害する可能性がある（例えば、ＲＮＡ干渉、アンチセンス技術等）。これらの化合物または作用物質は、融合に関する生物学的活性の上流または下流である経路を妨げる可能性がある。いくつかの実施形態において、候補化合物は、癌マーカーに対するアンチセンスまたは干渉ＲＮＡ剤（例えば、オリゴヌクレオチド）である。その他の実施形態において、候補化合物は、癌マーカー制御因子または本発明の発現産物に特異的に結合し、その生物学的機能を阻害する抗体または小分子である。
あるスクリーニング法においては、候補化合物は、化合物を癌マーカーを発現する細胞に接触させた後、候補化合物の発現に対する効果について分析することで、癌マーカー発現を変質させる能力について評価される。いくつかの実施形態において、候補化合物の癌マーカー遺伝子の発現に対する効果は、細胞により発現された癌マーカーｍＲＮＡのレベルを検出することで評価できる。ｍＲＮＡ発現は、各種の好適な方法により検出できる。その他の実施形態において、候補化合物の癌マーカー遺伝子の発現に対する効果は、癌マーカーによりコードされたポリペプチドのレベルを測定することにより評価できる。発現されたポリペプチドのレベルは、これらには限られないが、本願明細書中で開示されたもの等の各種の好適な方法によって測定できる。
具体的には、本発明は、修飾物質、すなわち、本発明の癌マーカーに結合し、例えば、癌マーカー発現または癌マーカー活性に対して阻害（または促進）効果、あるいは、例えば、癌マーカー基質の発現または活性に対して促進または阻害効果を有する候補または試験化合物または作用物質（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、小分子またはその他の作用物質）を同定するためのスクリーニング法を提供する。従って、同定された化合物は、標的遺伝子産物の生物学的機能を構成、あるいは正常な標的遺伝子相互作用を妨害する化合物を同定するために、標的遺伝子産物（例えば、癌マーカー遺伝子）の活性を直接的または間接的に治療プロトコルにおいて調節するのに用いることができる。癌マーカーの活性または発現を阻害する化合物は、増殖性疾患、例えば癌、特に前立腺癌の治療において有用である。
一実施形態において、本発明は、癌マーカータンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的活性部分の基質である候補化合物または試験化合物を選定するアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、癌マーカータンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的活性部分に結合またはそれらの活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリ、ペプトイドライブラリ（ペプチドの機能性を有するが、酵素分解に耐性を示すが生物活性を維持する新規の非ペプチド主鎖を有する分子のライブラリ、例えば、Ｚｕｃｋｅｎｎａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８-８５［１９９４］を参照）、空間的位置指定可能な並行固相または溶液相ライブラリ、逆重畳を要する合成ライブラリ方法、「１-ビーズ１-化合物」ライブラリ方法、およびアフィニティクロマトグラフィ選別を用いた合成ライブラリ方法等の当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ方法における数多くの各種アプローチを用いることで得ることができる。その他の４つのアプローチが化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子ライブラリに適用できるのに対し、生物学的ライブラリおよびペプトイドライブラリのアプローチは、ペプチドライブラリで用いるのが好ましい（Ｌａｍ（１９９７）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
分子ライブラリの合成法の例は、当該技術分野で見つけることができ、例えば、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９［１９９３］；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２［１９９４］、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８［１９４］、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３［１９９３］；Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３．２０５９［１９９４］、Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１［１９９４］、およびＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３［１９９４］がある。
化合物のライブラリは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２-４２１［１９９２］）、またはビーズ（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２-８４［１９９１］）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５-５５６［１９９３］）、細菌または胞子（米国特許第５，２２３，４０９号、ここで参照により援用）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５１８６９［１９９２］）、またはファージ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６-３９０［１９９０］；Ｄｅｖｌｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４-４０６［１９９０］；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８-６３８２［１９９０］；Ｆｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１［１９９１］）上に示してもよい。
一実施形態において、アッセイは、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質またはその生物学的活性部分を発現する細胞を試験化合物と接触させて、試験化合物の癌マーカーの活性を調節する能力を決定する細胞ベースのアッセイである。試験化合物の癌マーカー活性を調節する能力は、例えば、酵素活性、破壊、またはｍＲＮＡ等の変化をモニターすることで決定できる。
化合物に結合している癌マーカー、例えば、癌マーカー基質または修飾物質を調節する試験化合物の能力も、評価できる。このことは、例えば、化合物、例えば基質の、癌マーカーに対する結合が複合体中の標識された化合物、例えば基質を検出することで決定できるように、化合物、例えば基質を放射性同位元素または酵素標識に結合させることで、達成できる。
あるいは、癌マーカーは、試験化合物の、複合体中で癌マーカー基質と結合している癌マーカーを調節する能力をモニターするため、放射性同位元素または酵素標識に結合する。例えば、化合物（例えば、基質）を１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで、直接的または間接的に標識でき、このような放射性同位元素は電波放射の直接計数またはシンチレーション測定により検出できる。あるいは、化合物は、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを用いて酵素的に標識でき、このような酵素標識は適当な基質の産物への転換の決定により検出できる。
化合物（例えば、癌マーカー 基質）の、各種の相互作用物の標識あり／無しでの癌マーカーとの相互作用能力が評価できる。例えば、ミクロフィジオメーターは、化合物または癌マーカーの標識なしで、化合物の癌マーカーとの相互作用を検出するのに用いることができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６-１９１２［１９９２］）。本願明細書において使用されるように、「ミクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサー）は、ＬＡＰＳ（ｌｉｇｈｔ‐ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｓｅｎｓｏｒ）を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析装置である。この酸性化速度の変化は化合物と癌マーカーとの間の相互作用の指標として用いることができる。
またその他の実施形態では、癌マーカータンパク質またはその生物学的活性部分を試験化合物に接触し、試験化合物の、癌マーカータンパク質、ｍＲＮＡ、またはその生物学的活性部分に対する結合能を評価する無細胞アッセイが提供される。本発明のアッセイにおいて使用される癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡの好ましい生物学的活性部分は、基質またはその他のタンパク質との相互作用に関与する断片、例えば、高表面確率スコアを有する断片を含む。
無細胞アッセイは、２成分を相互作用および結合させるに十分な条件下および時間で標的遺伝子タンパク質および試験化合物の反応混合物を調製する工程を含むので、除去および／または検出可能な複合体を形成する。
２分子間の相互作用は、例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚらの米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓらの米国特許第４，９６８，１０３号を参照、ここで各文献を参照により援用する）を利用しても検出できる。フルオロフォア標識は、第１のドナー分子の発する蛍光エネルギーが、今度は吸収したエネルギーにより蛍光を発することのできる第２の「アクセプター」分子上で蛍光標識により吸収されるように選択される。
あるいは、「ドナー」タンパク質分子として、トリプトファン残基の自然蛍光エネルギーを単に利用してもよい。「アクセプター」分子標識が「ドナー」のものとは区別できるように、異なる波長の光を発する標識が選ばれる。標識間のエネルギー移動の効率は分子を分離する距離と関連しているので、分子間の空間的関係を評価できる。分子間で結合が起こる状況においては、「アクセプター」分子標識の蛍光発光が最大となるはずである。ＦＲＥＴ結合現象は、当該技術分野でよく知られる標準的な蛍光定量検出手段（例えば、蛍光光度計）で簡便に測定できる。
別の実施形態において、癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡの標的分子に対する結合能の決定は、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）を利用して達成できる（例えば、ＳｊｏｌａｎｄｅｒおよびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８-２３４５［１９９１］およびＳｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９-７０５［１９９５］を参照）。「表面プラズモン共鳴」または「ＢＩＡ」は、いずれの相互作用物（例えば、ＢｌＡｃｏｒｅ）も標識することなく、リアルタイムで生物特異性相互作用を検出する。結合表面での質量変化（結合現象の指標）は、表面近くでの屈折率の変化を生じ（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）、生物学的分子間でのリアルタイムの反応の指標として利用できる検出可能なシグナルを生じる。
一実施形態において、標的遺伝子産物または試験物質は、固相上に固着される。固相に固着した標的遺伝子産物／試験化合物複合体は、反応終了時に検出できる。好ましくは、この標的遺伝子産物は、固体表面上に固着できるものであり、（固着していない）試験化合物は、本願明細書で述べている検出可能な標識で直接または間接的に標識できる。
タンパク質の一方または両者の非複合化された型から複合化されたもの分離を促進するため、アッセイの自動化に対応することはもちろん、癌マーカー、抗癌マーカー抗体またはその標的分子を固定化することも好ましい場合がある。試験化合物の癌マーカータンパク質との結合、候補化合物の存在および非存在下での癌マーカータンパク質の標的分子との相互作用は、反応物をいれるのに好適などのような容器においても達成できる。このような容器の例として、マイクロタイタープレート、試験管、およびミクロ遠心管がある。一実施形態において、これらタンパク質の一方または両者をマトリックスに結合させることのできる領域を加える融合タンパク質が提供できる。例えば、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ-癌マーカー融合タンパク質またはグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（シグマケミカル社、米国ミズーリ州セントルイス）またはグルタチオン-誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着でき、その後、試験化合物または試験化合物および非吸着標的タンパク質または癌マーカータンパク質と混合し、その混合物を複合体形成をもたらす条件下で（例えば、塩およびｐＨに関する生理学的条件で）恒温放置する。恒温放置の後、例えば上述のように、これらのビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄してすべての非結合成分、ビーズの場合は固定化されたマトリックスを除去し、複合体を直接的または間接的に決定する。
あるいは、これらの複合体をマトリックスから分離し、標準的な手法を利用して癌マーカーの結合または活性のレベルを決定することができる。癌マーカータンパク質または標的分子のいずれかをマトリックス上に固定化するためのその他の手法は、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用することを含む。ビオチン化癌マーカータンパク質または標的分子は、ビオチン-ＮＨＳ（Ｎ-ヒドロキシ-サクシンイミド）から当該技術分野で知られる手法（例えば、ビオチン化キット、ピアスケミカル社、米国イリノイ州ロックフォード）を用いて調製でき、ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート（ピアスケミカル社）のウェル中に固定化される。
このアッセイを実施するために、非固定化成分を、固着成分を含有する被覆表面に添加する。反応が完了すると、未反応成分は、形成されたすべての複合体が固体表面上に固定化されたままとなるような条件下で、（例えば、洗浄により）除去する。固体表面に固着した複合体は、いくつかの方法により検出できる。前もって非固定化された成分が予め標識されている場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。予め非固定化された成分が予め標識されている場合、間接標識を、例えば、固定化成分に特異的な標識抗体を用いて、表面に固着した複合体を検出するのに用いることができる（今度はこの抗体が、例えば、標識抗ＩｇＧ抗体で直接的に標識または間接的に標識できる）。
このアッセイは、癌マーカータンパク質または標的分子と反応性を示すが、癌マーカータンパク質のその標的分子との結合を妨げない抗体を用いて実施される。このような抗体は、プレートのウェル、および非結合標的またはウェル中に捕捉されたに癌マーカータンパク質に対し、抗体結合により誘導体化される。これらの複合体の検出法は、ＧＳＴ‐固定化複合体についての上記のものに加え、癌マーカータンパク質または標的分子に関わる酵素活性の検出による酵素結合アッセイはもちろん、癌マーカータンパク質または標的分子と反応性のある抗体を用いた複合体の免疫検出を含む。
あるいは、無細胞アッセイを、液相中で行うことができる。このようなアッセイにおいて、これらの反応産物は、これらには限られないが、分画遠心分離（例えば、Ｒｉｖａｓ ａｎｄ Ｍｉｎｔｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １８：２８４-７［１９９３］）、クロマトグラフィ（ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ aｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９９，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）、および免疫沈降（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９９，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）等のいくつかの標準的な手法によって、未反応成分から分離される。このような樹脂およびクロマトグラフ的手法は、当業者に既知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ Ｊ．Ｍｏｉ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ １１ ：１４１-８［１９９８］、Ｈａｇｅａｎｄ Ｔｗｅｅｄ Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ ６９９：４９９-５２５［１９９７］を参照）。さらに、蛍光エネルギー移動は、本願明細書に記載されるように、溶液から複合体をさらに精製することなく結合を検出するのにも簡便に利用できる。
本アッセイは、癌マーカー、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはその生物学的活性部分をアッセイ混合物を形成するように癌マーカーを結合させる既知の化合物に接触させること、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させること、および試験化合物の、癌マーカータンパク質、またはｍＲＮＡと相互作用する能力を決定することを含むことができ、試験化合物の、癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡとの相互作用能力の決定は、既知の化合物と比較して、試験化合物の、癌マーカーまたはその生物学的活性部分に優先的に結合、あるいは標的分子の活性を調節する能力を決定することを含む。
癌マーカーがインビボで１またはそれ以上の細胞内または細胞外の、タンパク質等の巨大分子と相互作用できる限りは、このような相互作用の阻害剤は有用である。均一系アッセイは、阻害剤を同定するのに利用できる。
例えば、標的遺伝子産物と相互作用的な細胞内または細胞外結合パートナー産物との予め形成された複合体は、標的遺伝子産物またはこれらの結合パートナーは標識されるが、標識により生成されたシグナルは複合体形成により停止されるように調製される（例えば、イムノアッセイに対するアプローチをとっている米国特許第４，１０９，４９６号を参照し、ここで参照により援用する）。予め形成された複合体と競合し、プリフォーム複合体から１つの種を置き換える試験物質の添加は、バックグラウンドを超えるシグナルの発生を引き起こすことになる。このようにして、標的遺伝子産物-結合パートナー相互作用を乱す試験物質を同定できる。あるいは、癌マーカータンパク質は、癌マーカー（「癌マーカー-結合タンパク質」または「癌マーカー-ｂｐ」）と結合または相互作用し、癌マーカー活性に関与するその他のタンパク質を同定するために、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質」として使用できる（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号、Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７２：２２３-２３２［１９９３］；Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８．１２０４６-１２０５４［１９９３］；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０-９２４［１９９３］；Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３-１６９６［１９９３］；およびＢｒｅｎｔのＷＯ９４／１０３００、ここで各文献を参照により援用）。これらのような癌マーカー-ｂｐは、例えば、癌マーカー介在性シグナル経路の下流要素として、癌マーカータンパク質または標的により、シグナルの活性化剤または阻害剤となりうる。
癌マーカー発現の促進物質を同定することができる。例えば、細胞または無細胞混合物を候補化合物と接触させ、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を、候補化合物の非存在下での癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較して評価できる。癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、 候補化合物の非存在下よりも存在下で高い場合、この候補化合物は、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤であると同定される。あるいは、癌マーカー、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下に比べて存在下で少ない（すなわち、統計的に顕著に少ない）場合、この候補化合物は、癌マーカー、ｍＲＮＡ、またはタンパク質発現の阻害剤であると同定される。癌マーカー、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の発現レベルは、癌マーカー、ｍＲＮＡ、またはタンパク質を検出するための本願明細書に記載の方法により決定できる。
調節剤は、細胞ベースのまたは無細胞アッセイを利用して同定でき、この調節剤が癌マーカータンパク質の活性を調節する能力は、例えば、疾患について、動物モデルのような動物において、（例えば、前立腺癌または転移性前立腺癌を有する動物、または動物由来の前立腺癌の異種移植をもつ動物モデルのような動物（例えば、ヒト）または前立腺癌の転移から生じた癌由来の細胞（例えば、リンパ節、骨、または肝臓への転移）、あるいは前立腺癌細胞株由来の細胞において、インビボで確認することができる。
本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイ（例えば、癌治療の以下の記載を参照）により同定された新規薬剤に関する。従って、本願明細書に記載のように同定された作用物質（例えば、癌マーカー調節剤、アンチセンス癌マーカー核酸分子、ｓｉＲＮＡ分子、癌マーカー特異性抗体、または癌マーカー-結合パートナー）を、このような薬剤を用いた治療の効力、毒性、副作用、または作用機序を決定するために、適切な動物モデル（例えば、本願明細書に記載のもの）においてさらに使用することは、本発明の範囲内である。さらにまた、上記スクリーニングアッセイによって同定された新規作用物質は、例えば、本願明細書に記載のように、治療に用いることが可能である。
ＶＩ．治療への応用
いくつかの実施形態において、本発明は、癌（例えば、前立腺癌）の治療法を提供する。いくつかの実施形態において、治療法は、本発明の遺伝子融合を直接的または間接的に標的とする。
Ａ．ＲＮＡ干渉およびアンチセンス療法
いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子融合の発現を標的とする。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、オリゴマーアンチセンスまたはＲＮＡｉ化合物、特にオリゴヌクレオチド（例えば、上述の薬物スクリーニング法で同定されたもの）を含有する組成物を、本発明の癌マーカーをコードする核酸分子の機能を調節し、究極的には発現される癌マーカーの量を調節する際の使用に用いる。
１．ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、融合タンパク質機能を阻害するのに用いられる。ＲＮＡｉは、ヒトを含む多くの真核生物における外来遺伝子の発現を制御するために、進化の過程で保存された細胞性生体防御を表す。ＲＮＡｉは典型的に２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により誘発されて、ｄｓＲＮＡに応答して相同な１本鎖標的ＲＮＡの配列特異的なｍＲＮＡ分解を引き起こす。ｍＲＮＡ分解の介在物質は、通常、長鎖ｄｓＲＮＡから細胞中の酵素切断により産生される、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）２本鎖である。ｓｉＲＮＡは一般的に、およそ２１ヌクレオチドの長さ（例えば２１〜２３ヌクレオチドの長さ）であり、２つのヌクレオチド３´-オーバーハングで特徴づけられる塩基対構造を有する。小分子ＲＮＡまたはＲＮＡｉの細胞中への導入後、この配列は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）とよばれる酵素複合体に送達されると考えられている。ＲＩＳＣは標的を認識し、エンドヌクレアーゼで切断する。より大きなＲＮＡ配列が細胞に送達された場合、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素（Ｄｉｃｅｒ）は、より長いｄｓＲＮＡを２１〜２３ｎｔのｄｓ-ｓｉＲＮＡ断片に変換することがよく知られている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは融合タンパク質の接合部領域を標的するように設計される。
化学的に合成されたｓｉＲＮＡは、培養体細胞細胞における哺乳類の遺伝子機能の全ゲノム的解析に対し強力な試薬となってきた。遺伝子機能を確認するこのような価値以外に、ｓｉＲＮＡは、遺伝子特異性治療薬として大変な可能性も有している（Ｔｕｓｃｈｌ ａｎｄ Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．２００２；２（３）：１５８-６７、ここで参照により援用する）。
動物細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクトは、所定の遺伝子の強力で持続的な転写後抑制をもたらす（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１；９８：９７４２-７、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１１ ：４９４-８、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１；１５：１８８-２００、およびＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ．２００１；２０：６８７７-８８、これら全ての文献をここで参照により援用する）。ｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡｉを実施するための方法および組成物は、例えば米国特許第６，５０６，５５９号に記載されており、ここで参照により援用する。
ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡの量を減らすのに極めて効果的であり、伸長タンパク質により、多くの場合には検出不能なレベルまで低下させる。この発現抑制効果は、数ヶ月持続し、標的ＲＮＡとｓｉＲＮＡの中心領域との間の１つのヌクレオチドミスマッチが多くの場合に発現抑制を防ぐのに十分であることから、極めて特異的である（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０-３、およびＨｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２；３０：１７５７-６６、これら両文献をここで参照により援用する）。
ｓｉＲＮＡの設計において重要な因子は、ｓｉＲＮＡ結合に対して到達可能な部位の存在である。Ｂａｈｏｉａらは（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３；２７８：１５９９１-１５９９７；ここで参照により援用する）走査アレイとよばれるＤＮＡアレイの１種の、効果的なｓｉＲＮＡを設計するためにｍＲＮＡ中の到達可能な部位を見つけるための使用について記載している。これらのアレイは、物理的バリア（マスク）を用いて各塩基を配列中に段階的に加えて合成される、通常Ｃｏｍｅｒｓのような、モノマーからある最大の大きさにわたるオリゴヌクレオチドを含む。従って、これらのアレイは、標的遺伝子の領域の完全オリゴヌクレオチド補体を表す。標的ｍＲＮＡのこれらのアレイとのハイブリッド形成は、標的ｍＲＮＡのこの領域の徹底的な到達性プロファイルを提供する。このようなデータは、有効性および標的特異性を保持するためにオリゴヌクレオチド長と結合親和性との間の折り合いを達成することが重要な場合の、アンチセンスオリゴヌクレオチド（７塩基長から２５塩基長の範囲）の設計に有用である（Ｓｏｈａｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１；２９（１０）：２０４１-２０４５）。ｓｉＲＮＡの選択に関するさらなる方法および関連事項は、例えば、ＷＯ ０５０５４２７０、ＷＯ ０５０３８０５４Ａ１、ＷＯ ０３０７０９６６Ａ２、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ １３；３４８（４）：８８３-９３、J Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ １３；３４８（４）：８７１-８１、およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ａｕｇ １；３１（１５）：４４１７-２４に記載されており、ここで各文献の全内容を参照により援用する。さらにまた、ｓｉＲＮＡの選択の際の使用のために、ソフトウェア（例えば、ＭＷＧオンラインｓｉＭＡＸ ｓｉＲＮＡデザインツール）が市販または一般に公開されている。
２．アンチセンス
その他の実施形態において、融合タンパク質発現は、本発明の癌マーカーをコードする１またはそれ以上の核酸と特異的にハイブリッド形成する、アンチセンス化合物を用いて調節される。オリゴマー化合物の標的核酸との特異的ハイブリッド形成は、核酸の正常機能に影響を及ぼす。標的核酸の機能をそれと特異的にハイブリッド形成する化合物により調整することを、一般的に「アンチセンス」という。影響を受けるＤＮＡの機能として、複製および転写がある。影響を受けるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳の部位への転位、タンパク質のＲＮＡからの翻訳、１またはそれ以上のｍＲＮＡ種を与えるようなＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与するまたはＲＮＡに促進される触媒活性等のすべての重要な機能を含む。標的核酸機能に対するこのような阻害の総合的な効果は、本発明の癌マーカーの発現の調整である。本発明において、「調整」とは、遺伝子の発現における増大（促進）または減少（阻害）を意味する。例えば、発現は、腫瘍増殖を強力に防ぐために阻害されるかもしれない。
アンチセンスに対して特異的な核酸を標的とすることが好ましい。本発明において、アンチセンス化合物を特定の核酸に対して「標的する」ことは、多段階プロセスである。このプロセスは、通常、機能を調節する核酸配列の同定で始まる。これは、例えば、特定の疾患または病状に関わる細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または感染病原体由来の核酸分子である。本発明において、標的は、本発明の遺伝子融合をコードする核酸分子である。標的プロセスは、所望の効果、例えば、タンパク質の発現の検出または調整が起こるように、アンチセンス相互作用が起こるための遺伝子内の１部位または複数の部位の決定も含む。本発明の範囲において、好ましい遺伝子内の部位は、遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止コドンを含む領域である。翻訳開始コドンは通常５´-ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５´-ＡＴＧ）であるので、この翻訳開始コドンは「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」ともよばれる。遺伝子の少数は、ＲＮＡ配列５´-ＧＵＧ、５´-ＵＵＧまたは５´-ＣＵＧ、および５´-ＡＵＡを含む翻訳開始コドンを有しており、５´-ＡＣＧおよび５´-ＣＵＧはインビボで機能することが示されている。従って、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、各例における開始アミノ酸が通常メチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）であるにもかかわらず、多くのコドン配列を包含する可能性がある。真核生物および原核生物遺伝子は、２またはそれ以上の別の開始コドン有している可能性もあり、これらのいずれもが特定の細胞型または組織中または特定の条件下で、翻訳開始に優先的に用いられる可能性がある。本発明において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、このようなコドン配列に関わらず、本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳をインビボで開始するのに用いられる１つまたは複数のコドンを意味する。
遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）は、３つの配列（すなわち、５´-ＵＡＡ、５´-ＵＡＧ、および５´-ＵＧＡであり、対応するＤＮＡ配列はそれぞれ５´-ＴＡＡ、５´-ＴＡＧ、および５´-ＴＧＡ）のうちの１つを有する可能性がある。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」とは、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５´または３´）で約２５から約５０の近接するヌクレオチドを含むこのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を意味する。同様に、「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」とは、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５´または３´）で約２５から約５０の近接するヌクレオチドを含むこのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を意味する。
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味する翻訳領域（ＯＲＦ）または「コード領域」は、効果的に標的化される領域でもある。その他の標的領域として、翻訳開始コドンから５´方向にあるｍＲＮＡの部分を意味し、従って５´キャップ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンの間のヌクレオチドまたは遺伝子上で対応するヌクレオチドを含む５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）と、翻訳終止コドンから３´方向におけるｍＲＮＡの部分を意味し、従って翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３´末端との間のヌクレオチドまたはその遺伝子上で対応するヌクレオチドを含む３´非翻訳領域（３´ＵＴＲ）とを含む。ｍＲＮＡの５´キャップは、ｍＲＮＡの最も５´側の残基に５´-５´トリホスフェート結合を介して結合しているＮ７-メチル化グアノシン残基を有する。このｍＲＮＡの５´キャップ領域は、そのキャップに隣接する第１の５０ヌクレオチドはもとより、５´キャップ構造自身も含むと考えられている。このキャップ領域も好ましい標的領域である可能性がある。
真核生物ｍＲＮＡ転写物には直接的に翻訳されるものがあるにもかかわらず、多くは１またはそれ以上の領域を有し、翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として知られる。残る（従って翻訳）領域は、「エクソン」として知られており、ともにスプライスされて連続したｍＲＮＡ配列を生成する。ｍＲＮＡスプライス部位は（すなわち、イントロン-エクソン接合部）好ましい標的領域でもある可能性があり、異常スプライシングが疾患に結びついている場合、あるいは特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰生成が疾患に結びついている場合に特に有用である。再配列または欠失による異常融合接合部も好ましい標的である。イントロンが効果的であることが分かっており、それゆえ好ましく、アンチセンス化合物に対する標的領域は、例えば、ＤＮＡまたはｐｒｅ-ｍＲＮＡを標的とする。
いくつかの実施形態において、アンチセンス阻害に対する標的部位を市販のソフトウェア プログラム（例えば、バイオグノスティック社、独国ゲッティンゲン；ＳｙｓＡＲＲはソフトウェア、印国バンガロー、アンチセンス研究グループ、リバプール大学、英国リバプール；Ｇｅｎｅ Ｔｒｏｖｅ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いて同定する。その他の実施形態において、アンチセンス阻害に対する標的部位は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１９８５３７Ａ２に記載の到達可能部位法を用いて同定され、ここで該文献を参照により援用する。
１またはそれ以上の標的部位が同定されると、オリゴヌクレオチドは、所望の効果を与えるように、標的に十分相補となるように選ばれる（すなわち、十分にかつおよび十分な特異性を持ってハイブリッド形成）。例えば、本発明の好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、開始コドンまたその近傍を標的とする。
この発明において、アンチセンス組成物および方法に関した「ハイブリッド形成」とは、相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間でのワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合のような水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対となる相補性核酸塩基である。特異的にハイブリッド形成可能な核酸となるためにアンチセンス化合物の配列がその標的核酸の配列に対して１００％相補である必要はないことが理解されている。アンチセンス化合物は、化合物の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への結合が、有用性の消失を引き起こすように、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常機能を妨害し、かつアンチセンス化合物の非標的配列に対する非特異的結合を避けるのに十分な度合いの相補性がある場合、特異的な結合が望まれる条件下で（すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合およびインビトロアッセイの場合の、アッセイを実施する生理学的条件下で）、特異的にハイブリッド形成可能である。
アンチセンス化合物は、研究試薬および診断薬として一般に使用されている。例えば、特異性を有する遺伝子発現を阻害することのできるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するのに用いることができる。アンチセンス化合物も、例えば、様々な生物学的経路の機能を区別するのに使用できる。
アンチセンスの特異性および感度は、治療用途にも応用できる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物やヒトにおける病状の治療における治療部分として使用されてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに対し安全かつ効果的に投与されており、数多くの臨床試験が現在行われている最中である。従って、オリゴヌクレオチドが細胞、組織、および動物、特にヒトの治療のための治療措置において有用であるように構成できる有用な治療用様式であることが実証されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンス化合物の好ましい形態であるのに対し、本発明は、これらには限られないが、以下に述べるようなオリゴヌクレオチド類似物等のその他のオリゴマーのアンチセンス化合物を包含する。この発明に従うアンチセンス化合物は、これより長い配列および短い配列も本発明で使用できるかもしれないが、好ましくは約８〜約３０の核酸塩基（すなわち、約８〜約３０の結合した塩基）を有する。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは約１２〜約２５の核酸塩基を含む化合物である。
本発明で有用な好ましいアンチセンス化合物の具体例として、改変主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドがある。本願明細書で定義されるように、改変主鎖を有するオリゴヌクレオチドとして、主鎖中にリン原子を保持するものと、主鎖中にリン原子を持たないものがある。本願明細書の目的に関しては、これらのヌクレオシド主鎖中にリン原子を持たない改変オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドとして考えることができる。
好ましい改変オリゴヌクレオチド主鎖として、例えば、ホスホロチオエート、キラル ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３´-アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネート等のメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３´-アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート等のホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３´-５´結合を有するボラノホスフェート、これらの２´-５´結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が結合５´-３´に対しては３´-５´あるいは５´-２´に対しては２´-５´である反転極性を有するものがある。様々な塩、混合塩類および遊離酸型も含まれる。
リン原子を含まない好ましい改変オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間の混合結合、または１またはそれ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合により形成された主鎖を有する。これらのようなものとして、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成）、シロキサン主鎖、硫化物、スルホキシドおよびスルホン主鎖、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネートおよびスルホンアミド主鎖、アミド主鎖、およびＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を混合して有するその他のものを有するものがある。
その他の好ましいオリゴヌクレオチド類似物において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合（すなわち、その主鎖）の両者は、新しい基で置換されている。これらの塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリッド形成のために維持される。このようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリッド形成性を有することが示されてきたオリゴヌクレオチド類似物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とよばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。これらの核酸塩基は、保持されており、主鎖のアミド部分のアザ窒素に直接的または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許として、これらには限らないが、米国特許第５，５３９，０８２号、同５，７１４，３３１号、および同５，７１９，２６２号があり、ここでこれらの各文献を参照により援用する。さらなるＰＮＡ化合物の教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７（１９９１）にある。
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシドであり、特に、--ＣＨ２、--ＮＨ--Ｏ--ＣＨ２--、--ＣＨ２--Ｎ（ＣＨ３）--Ｏ--ＣＨ２--［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られる］、--ＣＨ２--Ｏ--Ｎ（ＣＨ３）--ＣＨ２--、--ＣＨ２--Ｎ（ＣＨ３）--Ｎ（ＣＨ３）--ＣＨ２--、上述の米国特許第５，４８９，６７７号記載の--Ｏ--Ｎ（ＣＨ３）--ＣＨ２--ＣＨ２--［ここで、未変性ホスホジエステル主鎖とは--Ｏ--Ｐ--Ｏ--ＣＨ２--で表されるものである］、および上述の米国特許第５，６０２，２４０号記載のアミド主鎖を有するものである。上述の米国特許第５，０３４，５０６号記載のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
改変オリゴヌクレオチドは、１またはそれ以上の置換糖部分を有していてもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のものの１つを２´位置に有する。すなわち、ＯＨ、Ｆ、Ｏ-、Ｓ-、またはＮ-アルキル、Ｏ-、Ｓ-、またはＮ-アルケニル、Ｏ-、Ｓ-、またはＮ-アルキニル、あるいはＯ-アルキル-Ｏ-アルキルであり、ここでアルキル、アルケニル、およびアルキニルは置換または未置換のＣ１―１０アルキルまたはＣ２-１０アルケニルおよびアルキニルである。特に好ましいものは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ここでｎおよびｍは１〜約１０である。その他の好ましいオリゴヌクレオチドとして、以下のもの１つを２´位置に有する。すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ-アルカリルまたはＯ-アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善する基、およびその他の同様の性質を有する置換基。好ましい改変として、２´-メトキシエトキシ（２´-Ｏ--ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、２´-Ｏ-（２-メトキシエチル）または２´-ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｉｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７８：４８６［１９９５］）すなわち、アルコキシアルコキシ基がある。さらに好ましい改変として、２´-ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基）、２´-ＤＭＡＯＥ、および２´-ジメチルアミノエトキシエトキシとして知られる（当該技術分野において２´-Ｏ-ジメチルアミノエトキシエチルまたは２´-ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２´-Ｏ--ＣＨ２--Ｏ--ＣＨ２--Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の好ましい改変として２´-メトキシ（２´-Ｏ--ＣＨ３）、２´-アミノプロポキシ（２´-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２´-フルオロ（２´-Ｆ）がある。同様の改変は、オリゴヌクレオチド上のその他の位置、特に３´末端ヌクレオチド上の糖または２´-５´結合オリゴヌクレオチドの３´位置および５´末端ヌクレオチドの５´位置にも形成される可能性がある。オリゴヌクレオチドは、フラノース型五炭糖（ペントフラノシル糖）の代わりにシクロブチル部分等の糖類似物を有していてもよい。
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当該技術分野において「塩基」と簡略的によばれることが多い）改変または置換も含む。本願明細書において使用されるように、「未改変」または「天然の」核酸塩基として、プリン塩基アデニン（ａ）、およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。改変核酸塩基としてその他の合成および天然の核酸塩基には、例えば、５-メチルシトシン（５-ｍｅ-Ｃ）、５-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６-メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２-プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２-チオウラシル、２-チオチミンおよび２-チオシトシン、５-ハロウラシルおよびシトシン、５-プロピニルウラシルおよびシトシン、６-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５-ウラシル（シュードウラシル）、４-チオウラシル、８-ハロ、８-アミノ、８-チオール、８-チオアルキル、８-ヒドロキシルおよびその他の８-置換アデニンおよびグアニン、５-ハロ、特に５-ブロモ、５-トリフルオロメチルおよびその他の５-置換ウラシルおよびシトシン、７-メチルグアニンおよび７-メチルアデニン、８-アザグアニンおよび８-アザアデニン、７-デアザグアニンおよび７-デアザアデニンおよび３-デアザグアニンおよび３-デアザアデニンが含まれる。核酸塩基として、さらに米国特許第３，６８７，８０８号に開示のものがある。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。このようなものとして、２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシルおよび５-プロピニルシトシンを含む、５-置換ピリミジン、６-アザピリミジンおよびＮ-２、Ｎ-６およびＯ-６置換プリンがある。５-メチルシトシン置換は、特に２´-Ｏ-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に一層さらに、０．６〜１．２℃で安定的に核酸２本鎖を増加することを示しており、現在好ましい塩基置換である。
本発明のオリゴヌクレオチドのその他の改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、または細胞内取り込みを増強する、１つまたはそれ以上の成分またはコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに対する化学的結合を含む。このような成分として、これらには限らないが脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、（例えば、ヘキシル-Ｓ-トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖、（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質、（例えば、ジヘキサデシル-ｒａｃ‐グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-ｒａｃ‐グリセロ-Ｓ-Ｈ-ホスホネート）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖あるいはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分がある。
関連分野の当業者であれば、上記の改変を含むオリゴヌクレオチドをどのように生成するかを十分知っている。本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドに限定されるものではない。どのような好適な改変または置換でも利用できる。
所与の化合物におけるすべての位置が均一に改変される必要はなく、実際１つ以上の上記改変をオリゴヌクレオチド内の単一化合物または単一ヌクレオシドにでも組込むことができる。本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も包含する。本発明において「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」とは、アンチセンス化合物であり、各々が少なくとも１つのモノマー単位からなる化学的に異なる２つまたはそれ以上の領域を有する、化学的に異なる領域を特にオリゴヌクレオチド、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合のヌクレオチド２つまたはそれ以上有する。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対し増強された耐性、増大した細胞内取り込み、および／または標的核酸に対して増大した結合親和性をヌクレオチドに付与するように、通常オリゴヌクレオチドが改変する少なくとも１つの領域を有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することのできる酵素の基質として使用できる可能性がある。例えば、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内エンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を生じ、これにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率をかなり高める。結果として、多くの場合において、匹敵する結果がキメラオリゴヌクレオチドを用いた場合に、同じ標的領域とハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比べて、短い鎖のオリゴヌクレオチドで得られる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動で日常的に検出でき、必要に応じて、当該技術分野で既知の核酸ハイブリッド形成法と組み合わせて検出できる。
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上述のように、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド類似物の複合構造として形成できる。
本発明はまた、以下に述べる本発明のアンチセンス化合物を含有する薬学的組成物および製剤も含む。
Ｂ．遺伝子療法
本発明は、本発明の遺伝子融合の発現を調節する際に利用するための各種の遺伝子操作の利用を意図している。遺伝子操作の例として、これらには限らないが、遺伝子ノックアウト（例えば、例えば、組換えを利用して、染色体から融合遺伝子を除去）、誘導性プロモーター有り／無しのアンチセンスコンストラクトの発現等が挙げられる。インビトロまたはインビボにおける核酸コンストラクトの細胞への送達は、各種の好適な方法を利用して実施できる。好適な方法とは、所望の事象が起こるように核酸コンストラクトを細胞に導入するものである（例えば、アンチセンスコンストラクトの発現）。遺伝子療法は、インビボで発現されるｓｉＲＮＡまたはその他の妨害分子を送達するのにも（例えば、誘導性プロモーター（例えば、アンドロゲン応答性プロモーター）による促進の際に）用いることができる。
遺伝子情報を保有する分子の細胞への導入は、これらには限られないが、ネイキッドＤＮＡコンストラクトの直接注入、該コンストラクトを添加した金粒子を用いた打ち込み、および例えば、リポソーム、生体高分子等を用いた巨大分子介在遺伝子導入等の各種様々な方法により達成される。好ましい方法は、これらには限られないが、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス等のウイルス由来の遺伝子送達媒体を用いる。レトロウイルスと比較すると効率がより高いので、アデノウイルス由来のベクターは、核酸分子をインビボで宿主細胞に移すのに好ましい遺伝子送達媒体である。アデノウイルスベクターは、動物モデルにおける種々の固形腫瘍および免疫欠乏マウスにおけるヒト固形腫瘍異種移植へのインビボでの大変効率的な遺伝子導入を与えることが示されている。遺伝子導入に関するアデノウイルスベクターおよび方法の例は、ＰＣＴ公開ＷＯ第００／１２７３８号およびＷＯ第００／０９６７５号および米国特許出願第６，０３３，９０８号、同６，０１９，９７８号、同６，００１，５５７号、同５，９９４，１３２号、同５，９９４，１２８号、同５，９９４，１０６号、同５，９８１，２２５号、同５，８８５，８０８号、同５，８７２，１５４号、同５，８３０，７３０号、および同５，８２４，５４４号に記載されており、ここでこれら各文献の全内容を参照により援用する。
ベクターは、種々の方法により患者に投与できる。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、ベクターは、直接注射により、腫瘍または腫瘍を伴う組織に投与される。その他の実施形態において、投与は、血液またはリンパ循環を介するものである（例えば、ＰＣＴ公開第９９／０２６８５号を参照、ここで該文献の全内容を参照により援用する）。アデノウイルスベクターの例示的投与レベルは、好ましくは１０８〜１０１１のベクター粒子を灌流液に対して添加した。
Ｃ．抗体療法
いくつかの実施形態において、本発明は本発明の遺伝子融合を発現する抗体を提供する。好適な抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、または合成）のいずれもが、本願明細書において開示の治療法に使用できる。好ましい実施形態において、癌治療に用いられる抗体はヒト化抗体である。抗体をヒト化する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同５，５８５，０８９号、同６，０５４，２９７号、および同５，５６５，３３２号を参照し、ここで各文献を参照により援用する）。
いくつかの実施形態において、治療抗体は、本発明の遺伝子融合に対して生成された抗体を含み、この抗体は細胞毒性薬物に結合している。このような実施形態においては、標的正常細胞を標的とする腫瘍特異性治療薬は作られておらず、それゆえ従来の化学療法の有害な副作用の多くを減らす。ある応用に関しては、治療薬は、抗体への付加に有用な薬理学的薬剤であること、特に内皮細胞の増殖または細胞分割を死滅または抑制する能力を有する細胞毒性またはそうでなければ抗細胞（ａｎｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ）剤であることが構想されている。本発明は、抗体に結合し、活性型で送達できる各種の薬剤に使用を意図する。例示的な抗細胞剤として、化学療法薬、放射性同位元素、および細胞毒がある。本発明の治療抗体は、種々の細胞毒性部分を含み、これらには限られないが、例えば放射性同位元素（例えば、ヨウ素-１３１、ヨウ素-１２３、テクニシウム-９９ｍ、インジウム-１１１、レニウム-１８８、レニウム-１８６、ガリウム-６７、銅-６７、イットリウム-９０、ヨウ素-１２５またはアスタチン-２１１）、ステロイド等のホルモン、シトシン等の代謝拮抗剤（例えば、アラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサートまたはアミノプテリン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ）、ビンカアルカロイド（例えば、デモコルチン、エトポシド、ミトラマイシン）、およびクロラムシルまたはメルファラン等の抗腫瘍アルキル化剤を含む。その他の実施形態では、血液凝固剤、サイトカイン、増殖因子、細菌性内毒素または細菌性内毒素の脂質Ａ部分等の薬剤を包含できる。例えば、いくつかの実施形態において、治療薬として、いくつかの例を挙げると、Ａ鎖毒素（Ａ ｃｈａｉｎ ｔｏｘｉｎ）、リボソーム失活性タンパク質、αサルシナ菌、コウジカビ、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素またはシュードモナス外毒素等の植物、真菌、または細菌由来の毒素が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態において、脱グリコシルしたリシンＡ鎖が用いられる。
いずれの場合においても、これらのような薬剤は、所望の場合、必要に応じて既知の抱合技術を用いて、標的化腫瘍細胞の部位で血液成分に対する標的化、内部移行、遊離または提示を可能にする方法で抗体とうまく結合させることができることが提言されている（例えば、Ｇｈｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，９３：２８０［１９８３］を参照）。
例えば、いくつかの実施形態において本発明は、本発明の癌マーカー（例えば、ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合）を標的とした免疫毒素を提供する。このような免疫毒素は、通常、腫瘍指向性抗体または断片である、特異性標的薬剤の毒素成分等の細胞毒性薬物とのコンジュゲートである。この標的薬剤は、標的抗原を保持する細胞に向けられ、これにより選択的に該細胞を殺す。いくつかの実施形態において、治療抗体は高い生体内安定性を与える架橋剤を使用する（Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４８：６３９６［１９８８］）。
特に固形腫瘍の治療に関わるその他の実施形態において、抗体は、血管内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制することで、腫瘍脈管構造に対して細胞毒性またはそうでなければ抗細胞効果を有するように設計されている。この攻撃は、腫瘍細胞、特に脈管構造の遠位の腫瘍細胞から酸素および栄養分を奪い、最終的に細胞死および腫瘍壊死をもたらす、腫瘍に局在化した血管崩壊をもたらすことを意図する。
好ましい実施形態において、抗体ベースの治療薬は、以下に記載するように、薬学的組成物として製剤される。好ましい実施形態において、本発明の抗体組成物の投与は、癌において測定可能な減少（例えば、腫瘍の低減または除去）をもたらす。
Ｄ．薬学的組成物
本発明は、（例えば、本発明の遺伝子融合の発現または活性を調節する薬剤を含有する）薬学的組成物をさらに提供する。本発明の薬学的組成物は、局所または全身治療が望ましいかどうか、および治療する領域によって、いくつかの方法により投与できる。投与としては、局所（点眼および、膣内や直腸送達等を含む粘膜）、肺（例えば、 粉末またはエアロゾルの吸入またはガス注入や噴霧吸入器により、気管内、鼻腔内、上皮、および経皮へ投与）、経口または非経口投与がある。非経口投与として、静脈、動脈、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴、あるいは頭蓋内、例えば、くも膜下腔内または脳室内への投与がある。
局所的投与用の薬学的組成物および製剤として、パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー剤、液体および粉末がある。水性、粉末または油状基剤、増粘剤等の慣用的薬学的担体が、必要または望ましい場合がある。
経口投与用の組成物および製剤として、粉末または顆粒、水または非水性媒体の懸濁液または溶液、カプセル剤、サシェまたは錠剤がある。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましい場合がある。
非経口、くも膜下腔内または脳室内投与用の組成物および製剤として、緩衝液、希釈剤、およびその他の好適な添加物、例えばこれらには限られないが、浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担体、または賦形剤等を含有する滅菌水性溶液を含んでいてもよい。
本発明の薬学的組成物として、これらには限らないが、溶液、乳濁液、およびリポソーム含有製剤が挙げられる。これらの組成物はこれらには限らないが、予め作製された液、自己-乳化固体および自己-乳化半固体等の種々の成分から生成できる。
使用しやすいように単位剤形として提供できる本発明の薬学的製剤は、薬学分野でよく知られる従来の方法により調製できる。このような手法は、薬学的担体（１種または複数種）または賦形剤（１種または複数種）と結合させる工程を含む。一般に、これらの製剤は、均一かつ十分に有効成分を液体担体または微紛化した固形担体またはこれら両者とに結合させ、その後必要に応じて生成物を成形することで調製される。
本発明の組成物は、これらには限られないが、錠剤、カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐薬、および浣腸剤等のありとあらゆる可能な剤型に製剤できる。本発明の組成物は、水性、非水性、または混合媒体の懸濁液として製剤してもよい。水性懸濁液は、懸濁液の粘度を上昇させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストラン等をさらに含有していてもよい。この懸濁液は、安定化剤を含有していてもよい。
本発明の一実施形態において、当該薬学的組成物は、泡沫として製剤または使用できる。薬学的泡沫として、これらには限られないが、乳濁液、ミクロ乳濁液、クリーム、ゼリー、およびリポソーム等の製剤が含まれる。基本的には同様の性質であるが、これらの製剤は、その成分および最終産物の粘稠性において異なる。
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを高める薬剤は、本発明の薬学的およびその他の組成物に添加できる。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）等のカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジン（ＷＯ９７／３０７３１）等のポリカチオン分子もまた、オリゴヌクレオチドの細胞内取り込みを増強する。
本発明の組成物は、薬学的組成物に従来みられるようなその他の補助的成分をさらに含んでいてもよい。従って、例えば、当該組成物は、例えば、かゆみ止め剤、収斂剤、局所麻酔剤または抗炎症剤等の追加的、相溶性のある、薬学的に活性な材料を含有していてもよく、あるいは本発明の組成物、染料、香味剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定化剤等の本発明の様々な剤形を物理的に製剤するのに有用なさらなる材料を含有していてもよい。しかしながら、これらの材料は、添加された場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に阻害すべきではない。これらの製剤は、殺菌して、所望の場合、製剤の核酸（１種または複数種）と悪影響を与えるように相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、緩衝液、着色料、香味料および／または芳香性物質等の助剤と混合できる。
本発明のある実施形態は、（ａ）１またはそれ以上のアンチセンス化合物と、（ｂ）非アンチセンス機構により機能する１またはそれ以上のその他の化学療法薬とを含有する薬学的組成物を提供する。このような化学療法薬の例として、これらには限らないが、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムシル、メルファラン、シクロホスファミド、６-メルカプトプリン，６-チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５-フルオロウラシル（５-ＦＵ）、フロクスウリジン（５-ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）等の抗癌剤がある。これらには限られないが非ステロイド系抗炎症剤および副腎皮質ステロイド等の抗炎症剤、およびこれらには限られないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビル抗ウイルス剤も、本発明の組成物に混合できる。その他の非アンチセンス化学療法薬も本発明の範囲である。２つまたはそれ以上を組み合わせて用いた化合物を同時あるいは経時的に用いてもよい。
投与量は、治療する病状の重篤度および応答性に依存し、数日間から数ヶ月にわたる、あるいは治癒がもたらされるまたは病状の減少するまで継続する治療過程を伴う。最適な投与スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定から計算できる。投与医は、最適投与量、投与方法論、および繰り返し率を容易に決定することができる。最適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力により異なっており、一般に、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的なことがわかっているＥＣ５０Ｓに基づいて、または本願明細書に記載の実施例に基づいて見積もることができる。一般に、投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日、１週間、１ヶ月、または１年に１回またはそれ以上の頻度で投与できる。治療医は、体液または組織中の薬物の滞留時間および濃度の測定値に基づいて、投与量についての繰り返し率を見積もることができる。治療成功後、オリゴヌクレオチドが、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇ、１日に１回またはそれ以上から２０年ごとに１回の範囲の維持量で投与される、病状の再発を防ぐための維持療法を対象に受けさせるのが望ましいかもしれない。
ＶＩＩ．遺伝子導入動物
本発明は、本発明の外来性癌マーカー遺伝子（例えば、遺伝子融合）または変異体およびその異種（例えば、切断または一塩基遺伝子多型）を有する遺伝子導入動物の作製を意図している。好ましい実施形態において、この遺伝子導入動物は、野生型の動物と比較して、変化した表現型（例えば、マーカーの存在の増大または減少）を示す。このような表現型の存在または非存在を分析する方法として これらには限らないが、本願明細書に開示のものがある。いくつかの好ましい実施形態において、遺伝子導入動物は、腫瘍の増殖の増大または減少、または癌の証拠をさらに提示する。
本発明の遺伝子導入動物は、薬物（例えば、癌治療）スクリーニングに使用できる。いくつかの実施形態において、試験化合物（例えば、癌の治療に有用な可能性のある薬物）、および対照化合物（例えば、プラセボ）を遺伝子導入動物および対照動物に投与して、その効果を評価する。
これらの遺伝子導入動物は、種々の方法で作製できる。いくつかの実施形態において、様々な発達段階にある胚性細胞を、遺伝子導入動物作製のために、導入遺伝子を導入するのに用いた。胚性細胞の発達の段階に応じて異なる方法が用いられる。接合体は、ミクロ注入に最良の標的である。マウスにおいて、雄の前核は直径およそ２０μｍのサイズに達し、１〜２ピコリットル（ｐｌ）のＤＮＡ溶液の注入を再現可能にする。接合体を遺伝子導入の標的として用いることは、ほとんどの場合に、注入されたＤＮＡが第１の卵割の前に宿主ゲノムに取り込まれるという大きな利点がある（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８-４４４２［１９８５］）。結果として、遺伝子導入非ヒト動物の全細胞が、この組み入れた導入遺伝子を保持することになる。このことは、生殖細胞の５０％が導入遺伝子を有するので、初代から子孫への導入遺伝子の効率的な伝達にも一般に反映されている。米国特許第４，８７３，１９１号は、接合体のミクロ注入の方法について記載しており、本特許の開示内容をここでその全内容について参照により援用する。
その他の実施形態において、レトロウイルス感染症は、非ヒト動物に導入遺伝子を導入するのに用いられる。いくつかの実施形態において、このレトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを卵母細胞の囲卵腔に注入して卵母細胞をトランスフェクトするのに用いられる（米国特許第６，０８０，９１２号、ここで該文献を参照により援用する）。その他の実施形態において、発達中の非ヒト胚は、胚盤胞段階にインビトロで培養できる。この間、これらの卵割球は、レトロウイルス感染症の標的とすることができる（Ｊａｎｅｎｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：１２６０［１９７６］）。卵割球の効率的な感染は、透明帯を除去するための酵素治療により得られる（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｎｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー。［１９８６］）。導入遺伝子を導入するのに用いられるウイルスベクターシステムは、通常、導入遺伝子を有する複製欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６９２７［１９８５］）。トランスフェクトは、ウイルス産生細胞の単層上で卵割球を培養することで容易にかつ効率的に得られる（Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，６：３８３［１９８７］）。あるいは、感染は、後の段階で行うこともできる。ウイルスまたはウイルス産生細胞は、胞胚腔に注入できる（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３［１９８２］）。取り込みが遺伝子導入動物を形成する細胞のサブセットのみにおいて起こるので、ほとんどの初代は導入遺伝子のモザイクとなる。さらにまた、初代は、導入遺伝子の様々なレトロウイルス挿入断片を、一般的に子孫に分離される、ゲノム中の異なる位置に有する可能性がある。さらにまた、低効率ではあるが、妊娠中期の胚の子宮内レトロウイルス感染により、生殖細胞系に導入遺伝子を導入することも可能である（上記既出のＪａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，［１９８２］）。当該技術分野で既知の、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを用いた、遺伝子導入動物作製のためのさらなる手段は、受精卵の囲卵腔または初期の胚にレトロウイルス粒子またはマイトマイシンＣ処理細胞産生レトロウイルスをミクロ注入することを含む（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９０／０８８３２［１９９０］、およびＨａｓｋｅｌｌ ａｎｄ Ｂｏｗｅｎ，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，４０：３８６［１９９５］）。
その他の実施形態において、導入遺伝子は胚性幹細胞に導入され、そのトランスフェクトされた幹細胞は、胚を形成するのに用いられる。ＥＳ細胞は、インビトロで適当な条件下で着床前胚を培養することで得られる（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４［１９８１］；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５［１９８４］；Ｇｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９０６５［１９８６］；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５［１９８６］）。導入遺伝子は、リン酸カルシウム共沈、プロトプラストまたはスフェロプラスト融合、リポフェクションおよびＤＥＡＥ-デキストラン介在性トランスフェクト等の当該技術分野で既知のさまざまな方法によるＤＮＡトランスフェクトによりＥＳ細胞に効率的に導入される。導入遺伝子を、レトロウイルス介在性伝達またはミクロ注入によりＥＳ細胞にも導入してもよい。このようなトランスフェクトされたＥＳ細胞はその後、胚盤胞段階胚の胞胚腔への導入後に胚に定着し、結果として生じるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する（概説については、Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８［１９８８］を参照）。トランスフェクトしたＥＳ細胞を胞胚腔に導入する前に、トランスフェクトしたＥＳ細胞に対して、導入遺伝子が選択のための手段を提供すると仮定して、導入遺伝子を組込んだＥＳ細胞を濃縮するための様々な選択プロトコルを行ってもよい。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応を導入遺伝子を組込んだＥＳ細胞をスクリーニングするのに用いてもよい。この手法は、胞胚腔に移す前に適切な選択条件下でトランスフェクトしたＥＳ細胞を増殖する必要性を除去する。
また別の実施形態において、相同組換えは、遺伝子機能をノックアウトまたは欠失変異体（例えば、トランケーション変異体）を作製するのに用いられる。相同組換えのための方法は、米国特許第５，６１４，３９６号に記載されており、ここで該文献を参照により援用する。
実験
以下の実施例は、ある好ましい実施形態および本発明の態様を実証しさらに概説するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
実施例１：ＥＲＧとＥＴＶ１遺伝子融合
Ａ．材料および方法
癌の例外事象の解析（Ｃａｎｃｅｒ Ｏｕｔｌｉｅｒ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＣＯＰＡ）
ＣＯＰＡ解析を１０，４８６のマイクロアレイ実験を含むＯｎｃｏｍｉｎｅ３．０の１３２の遺伝子発現データセット上で行った。さらにまた、９９個の増幅された、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで採取した前立腺組織試料からのデータを、ＣＯＰＡ解析に含めた。ＣＯＰＡは３つの工程を有する。まず第１工程として、遺伝子発現値は中央値を中心にし、各遺伝子の中央値発現をゼロに設定する。第２工程で、中央値絶対偏差（ＭＡＤ）を計算し、各遺伝子発現値をそのＭＡＤで割ることで、１に縮尺調整する。中央値およびＭＡＤを、平均および標準的な偏差とは対照的に、アウトライアー発現値が分布推定値に対して過度に影響を与えず、したがって正規化後もこれらが保たれるように、変換に用いた。第３工程で、変換された発現値の７５、９０、および９５パーセンタイルを各遺伝子について一覧にまとめて、遺伝子をこれらのパーセンタイル値スコアでランク付けし、例外プロファイルについて優先順位付けされた一覧を得る。
試料
使用した組織は、共に米国ミシガン大学の前立腺癌専門優良研究プログラム（Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ：ＳＰＯＲＥ）組織コアの一部である、米国ミシガン大学の根治的前立腺切除系列由来および迅速剖検プログラム由来（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４，９２０９（２００４年１２月１５日））のものである。
組織は、ウルム大学病院（独国ウルム）での根治的前立腺切除術系列からも得た。すべての試料は、各それぞれの研究施設での事前の研究所審査委員の承認を得て、同意した患者から収集したものである。すべての試料からの全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従って、トリゾール（インビトロジェン社）を用いて単離した。全ＲＮＡを、ＲＷＰＥ、ＰＣ３、ＰＣ３＋ＡＲ（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ６１、５３１（１９９６））、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰおよびＤｕＣａＰ細胞株のからも単離した。ＲＮＡの完全性を、ホルムアルデヒドゲル変性 電気泳動またはアジレント社のバイオアナライザー２１００により検証した。良性前立腺組織の全ＲＮＡ（ＣＰＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の市販のプールも用いた。
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、基本的に記載されているように、ＳＹＢＲ緑色素を用いて、アプライドバイオシステム社の７３００リアルタイムＰＣＲシステム上で行った（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５、３３２８（２００５）；Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４、３８１４（２００４））。要約すると、１〜５μｇの全ＲＮＡを、ランダムプライマーまたはランダムプライマーおよびオリゴｄＴプライマーの存在下で、スーパースクリプトＩＩＩ（インビトロジェン社）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。すべての反応は、ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（アプライドバイオシステム社）および２５ｎｇの順方向および逆方向プライマーの両者を製造業者の推奨する熱サイクル条件を用いて、実施した。すべての反応を融解曲線分析し、および選択した実験から得た産物を１.５％アガロースゲル上で電気泳動させることで分離した。各実験について、閾値を、配列検出ソフト、バージョン１．２．２（アプライドバイオシステム社）を用いて、ＱＰＣＲ反応の指数期において設定した。各試料について、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）と比較した各標的遺伝子の量を、ｃＤＮＡ試料を図説の各実験について検量用試料として用いて、比較閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ：Ｃｔ）法（アプライドバイオシステム社ユーザーブリテン＃２）により決定した。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社により合成されたものであった。
ＧＡＰＤＨプライマーは、（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ３，ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４（２００２））に記載されており、その他すべてのプライマーは表４に列挙している。
およそ等しい効率のプライマーを、比較Ｃｔ法を利用するため、前立腺癌ｃＤＮＡまたはプラスミド鋳型の段階希釈により確認した。
ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅（ＲＬＭ-ＲＡＣＥ）
ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅をジーン・レーサーＲＬＭ-ＲＡＣＥキット（インビトロジェン社）を製造業者の使用説明書に従って用いて実施した。最初に、試料をＥＲＧまたはＥＴＶ１の発現に基づき、ＱＰＣＲにより選択した。全ＲＮＡの５μｇを仔ウシ腸由来ホスファターゼで処理し、切断されたｍＲＮＡおよび非ｍＲＮＡから５´ホスフェートを除去し、タバコ酸性フィロホスファターゼでキャップ構造を除去する。ジーン・レーサーＲＮＡオリゴを全長転写物に連結し、スーパースクリプトＩＩＩを用いて逆転写した。５´末端を得るため、第１の鎖のｃＤＮＡを、ＥＴＶ１に対してジーンレーサー５´プライマーおよびＥＴＶ１エクソン４-５_ｒ、あるいはＥＲＧに対してジーンレーサー５´プライマーおよびＥＲＧエクソン４ａ_ｒまたはＥＲＧエクソン４ｂ_ｒを用いて、プラチナＴａｑハイフィデリティ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）（インビトロジェン社）で増幅した。プライマー配列を表Ｓ２に示す。産物を１.５％アガロースゲル上で電気泳動により分離し、バンドを切除、精製し、ＴＯＰＯ ＴＡをｐＣＲ４-ＴＯＰＯにクローン化した。少なくとも４つの結腸からの精製プラスミドＤＮＡを、米国ミシガン大学ＤＮＡ配列決定コアのＡＢＩモデル３７３０自動配列決定装置で、Ｍ１３逆方向およびＭ１３順方向（-２０）プライマーまたはＴ３およびＴ７プライマーを双方向で用いて、配列決定した。ＲＬＭ-ＲＡＣＥｄ ｃＤＮＡは、その他のアッセイに使用しなかった。
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合についての逆転写ＰＣＲ
上述のようにＱＰＣＲを用いた場合のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ陽性を同定後、同一のｃＤＮＡ試料を、プラチナＴａｑハイフィデリティおよびＴＰＲＳＳ２：ＥＲＧプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。産物を電気泳動で分離し、ｐＣＲ４-ＴＯＰＯクローン化し、上述のように配列決定した。
インビトロアンドロゲン応答性
ヒトアンドロゲン受容体で安定的にトランスフェクトしたＲＷＰＥ、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ ＤｕＣａＰ、ＰＣ３およびＰＣ３細胞（ＰＣ３+ＡＲ）（３）を、１％エタノール対照または１ｎＭの合成アンドロゲンＲ１８８１で２４時間処理した。全ＲＮＡを単離し、ＥＲＧエクソン５-６_ｆおよび_ｒプライマーを用いて逆転写とＱＰＣＲを行った。各試料についてＥＲＧ／ＧＡＰＤＨの相対量をＲＷＰＥ対照試料に対して較正した。
正常な末梢リンパ球由来の蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ホルマリン固定パラフィン包理（ＦＦＰＥ）組織切片と転移性前立腺癌試料ＭＥＴ‐２６およびＭＥＴ‐２８を、間期蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析に用いた。さらにまた、間期ＦＩＳＨを、１３の臨床的に局在化した前立腺癌と１６の転移性前立腺癌試料のＦＦＰＥ部分由来のコアを含む組織マイクロアレイ上で実施した。２色、２シグナルアプローチをＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＶ１の融合を評価するのに用い、プローブはそれぞれの遺伝子座位のほとんどにまたがっていた。ビオチン-１４-ｄＣＴＰ ＢＡＣクローンＲＰ１１-１２４Ｌ２２をＥＴＶ１座位に対して用い、ジゴキシン-ｄＵＴＰ標識ＢＡＣクローンＲＰＰ１１-３５ＣＤをＴＭＰＲＳＳ２座位に対して用いた。ＥＲＧを含む遺伝子再配列を解析するには、２つのプローブがＥＲＧ座位（ビオチン-１４-ｄＣＴＰ標識ＢＡＣクローンＲＰ１１-４７６Ｄ１７およびジゴキシン-ｄＵＴＰ標識ＢＡＣクローンＲＰ１１-９５Ｉ２１）にまたがる、分断シグナルプローブ手法を利用した。すべてのＢＡＣクローンは、オークランド研究所小児科病院（ＣＨＯＲＩ）より入手したものである。組織分析の前に、すべてのプローブの完全性と純度を、正常な末梢リンパ球の分裂中期スプレッドのハイブリッド形成により確認した。組織ハイブリッド形成、洗浄および色検出を、（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４、３８１４（２００４）；Ｇａｒｒａｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３６、１１７（２００５））に記載のように実施した。
Ｂ．結果
癌の例外事象解析
近年において、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現のプロファイリングは、癌トランスクリトームを研究するための通常的な方法となってきている。マイクロアレイ研究は、癌の分子多様性に対する膨大な知見を与えており、多くの場合に、腫瘍組織像、患者予後、および治療応答に対応する疾患の新規分子サブタイプを同定してきた（Ｖａｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０、１６１７（２００４））。しかしながら、一般に、トランスクリトーム解析は、新規の癌の原因となる遺伝子の発見にはつながらなかった。癌遺伝子の著しい過剰発現を生じる再配列および高レベルの複製数変化は、トランスクリトームデータで顕著だが、必ずしも従来の解析アプローチで顕著であるわけではなかったと仮定される。
癌の種類の大多数は、癌遺伝子活性化の不均一パターンが観測されており、それゆえ癌試料の１つのクラスにわたって遺伝子の通常の活性化を探すような、従来の解析方法（例えば、ｔ検定またはシグナル・ノイズ比）では、このような癌遺伝子発現プロファイルをみつけることはできない。かわりに、症例のサブセットにおける著しい過剰発現を探す方法が必要である。本発明の過程において実施した実験は、癌の例外事象の解析（ＣＯＰＡ）を発展させた。ＣＯＰＡは、遺伝子発現プロファイルの中央値および中央値絶対偏差に基づいて簡単な数値的変換を応用することで、例外プロファイルを増強および同定しようとするものである（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０２、２９５１（２００３））。このアプローチを図５Ａに示す。ＣＯＰＡを１０，４８６のマイクロアレイ実験を示す１３２遺伝子発現データセットの概要を含むＯｎｃｏｍｉｎｅデータベース（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０６、５３６（２０００））に応用した。ＣＯＰＡは、再発性再配列または高レベル増幅が起こると知られている特定の癌型における遺伝子について、いくつかの例外プロファイルを正確に同定した。この解析では、癌遺伝子調査（Ｖａｓｓｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００、６９５８（２００３））により定義されるような、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータセットにおいて上位１０の例外プロファイルに位置する（表１および表３）既知の癌原因遺伝子の例外プロファイルに着目した。例えば、Ｖａｌｋらの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）データセットにおいては、ＲＵＮＸｌＴｌ（ＥＴＯ）は、９５パーセンタイルで最強度の例外プロファイルを示し、ＡＭＬのサブセットにおけるこの遺伝子の既知の転位および発癌活性と一致している（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００、６０５１（２００３））（表１）。この例外プロファイルは、ＲＵＮＸｌ（ＡＭＬ１）、およびＲＵＮＸｌＴｌ（ＥＴＯ）（図５Ｂ）を融合させる、既に確認済みのｔ（８；２１）転位を有する症例に正確に関連している。同様に、Ｒｏｓｓらの急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）データセットにおいては、ＰＢＸ１は９０パーセンタイルで最強度の例外プロファイルを示し、ＡＬＬのサブセットで起こることが知られるＥ２Ａ-ＰＢＸ１と一致している（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２１、１７７５（２００３））（表１）。ここで、このアウトライアー発現プロファイルは、ＡＬＬに関するこの図中の特性決定されたｔ（ｌ；１９）Ｅ２Ａ-ＰＢＸ１転位と完全に相関している（図Ｓ１Ｃ）。
前立腺癌におけるＥＴＳファミリーメンバーＥＲＧとＥＴＶ１に関する例外プロファイルの同定
次に、新規ＣＯＰＡ予測を検討した。いくつかの独立したデータセットにおいて、ＣＯＰＡは、ユーイング肉腫および骨髄性白血病における発癌転位に関与していることが知られる２つのＥＴＳファミリー転写因子、ＥＲＧとＥＴＶ１、について前立腺癌における強い例外プロファイルを同定した（Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１、８１１（２００４）；Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４９、２４８３（２００３））。Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎら（Ｋｅａｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０５、４０６０（２００５））、Ｗｅｌｓｈら（Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆａｓｅｂ Ｊ １９、２４３（２００５））、およびＬａｐｏｉｎｔｅら（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３６５、６７１（２００５））の前立腺癌遺伝子発現データセットにおいては、ＥＲＧは、７５パーセンタイルで最高スコアの例外プロファイルを示し（表１）、Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．およびＴｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１、５９７４（２００１））データセットでは、ＥＴＶ１が９０パーセンタイルで最高スコアの例外プロファイルを示した（表１）。これらのことから、ＣＯＰＡは、７つの独立した前立腺癌プロファイリング研究において、ＥＲＧまたはＥＴＶ１をアウトライアー遺伝子の上位１０番以内に９回ランク付けした。ＥＲＧとＥＴＶ１の両者は、ユーイング肉腫における発癌転位に関与している。ＥＷＳ遺伝子の５´活性化領域の、ＥＲＧ（ｔ（２１；２２）（ｑ２２；ｑｌ２））またはＥＴＶ１（ｔ（７；２２）（ｐ２１；ｑｌ２））等のＥＴＳファミリーメンバーの高保存３´ＤＮＡ結合領域への融合は、ユーイング肉腫の特徴である（上述のＬａｐｏｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９９、１７４５（２００２）；Ｆｏｎｓｅｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４、１５４６（２００４））。ＥＴＳファミリーメンバーの関与する転移は発癌形質転換において機能的に重複するので、転移の１種のみが、ユーイング肉腫の各症例において通常観測される。
ＥＲＧとＥＴＶ１が前立腺癌の発達に同様に関与しているならば、これらの例外プロファイルは、相互排他的、すなわち、各症例は、２つ遺伝子のうち１つのみを過剰発現するはずであると考えられる。機能的重複遺伝子または同じ発癌経路にある遺伝子における変異は、腫瘍進行において共に選択される可能性は低い。ＥＲＧとＥＴＶ１の共発現プロファイルをいくつかの前立腺癌データセットにわたって調べたところ、これらが相互排他的な例外プロファイルを示すことがわかった。異なるマイクロアレイプラットフォームを用いて全体的に切除された前立腺組織をプロファイルした、２つラージスケールでのトランスクリトーム研究からのＥＲＧとＥＴＶ１の発現プロファイル（上記既出のＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３４、８５（２００３））を同定した（図１Ａ左および中央）。Ｇｌｉｎｓｋｙらの研究が臨床的に局在化した前立腺癌試料のみについてプロファイリングを行ったのに対し、Ｌａｐｏｉｎｔｅらによる研究は、ＥＲＧとＥＴＶ１アウトライアー発現を前立腺癌および転移性前立腺癌に限定して、良性前立腺組織、臨床的に局在化した前立腺癌、および転移性前立腺癌をプロファイリングしている。これら両研究においては、前立腺癌は、もっぱらＥＲＧまたはＥＴＶ１を発現している（図１Ａ右）。同様の結果は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）によって得られた９９の前立腺組織試料に関するプロファイリング研究においてもみられる（Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，上記）。ＥＲＧまたはＥＴＶ１の排他的なアウトライアー発現（図１Ｂ右）に加え、ＬＣＭ研究の結果は、ＥＴＶ１およびＥＲＧが、推定前駆病変前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）あるいは隣接する良性上皮内にではなく、前立腺癌または転移性前立腺癌由来の上皮細胞内のみに過剰発現されることを実証した。観察されたこの排他的なアウトライアーパターンが活性化遺伝子が複数のパートナーと融合できるその他の転移と一致しているかを直接的に決定するため、Ｚｈａｎらは、複数の骨髄腫データセット（Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１２、８２２（２００１））について検討した。免疫グロブリン重鎖プロモーターの、ＣＣＮＤｌまたはＦＧＦＲ３、それぞれｔ（１１，１４）またはｔ（４，１４）、への再発性融合は、複数の骨髄腫の特定のサブセットを特徴付ける（Ｗｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２、３００５（２００２））。ＣＣＮＤｌが７５パーセンタイルで最高スコアのアウトライアーを示し、ＦＧＦＲ３が９５パーセンタイルで３番目に高いスコアのアウトライアーを示したので（表１）、これらの転位は例外プロファイル分析（図１Ｃ）に反映されている。２つの症例を除き、骨髄腫試料は、ＣＣＮＤｌまたはＦＧＦＲ３の排他的な過剰発現を示した（図１Ｃの右）。これらを総合すると、複数の前立腺癌データセットにわたるＥＲＧとＥＴＶ１の例外プロファイルは、様々なヒト悪性腫瘍におけるその他の原因変異と一致している。ＥＲＧまたはＥＴＶ１の個々の前立腺癌試料における排他的な過剰発現は、多発性骨髄腫等の活性化遺伝子が生物学的重複パートナー遺伝子と融合できるその他の腫瘍と一致している。
前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２のＥＲＧまたはＥＴＶ１への再発性遺伝子融合の発見
次に、個々の前立腺癌試料におけるＥＲＧとＥＴＶ１過剰発現の機構を決定した。ＥＲＧまたはＥＴＶ１を過剰発現した前立腺癌細胞株および臨床試料を、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を実施して、同定した（図２Ａ）。ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株およびホルモン抵抗性転移性前立腺癌で死亡した患者から入手した２試料（前立腺における残存原発癌腫であるＭＥＴ‐２６ＲＰおよび、リンパ節転移であるＭＥＴ‐２６ＬＮ）は、ＱＰＣＲにより、ＥＴＶ１を顕著に過剰発現した（図２Ａ）。異なる解剖学的位置由来の５つの独立した転移性病巣のほかに、同患者の前立腺における残存癌腫も、ＤＮＡマイクロアレイ解析でＥＴＶ１を過剰発現し（上記既出のＷｅｌｓｈらの文献を参照）、ＥＴＶ１活性化が広範な転移の前に原発性腫瘍で起こったことを示唆している。リンパ節転移はホルモン抵抗性転移性前立腺癌（ＭＥＴ‐２８ＬＮ）で死亡した第２の患者、および、過剰発現されたＥＲＧを過剰発現した、ＶＣａＰおよびＤｕＣａＰの２つの前立腺癌細胞株からも同定された（図２Ａ）。これらの細胞株は、椎骨転移（ＶＣａＰ）、およびホルモン抵抗性前立腺癌を有する第３の患者由来の硬膜転移（ＤｕＣａＰ）から独立に単離された（Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６、５３１（１９９９）；Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３，１８５（２００３））。繰り返しとなるが、これらの２つの細胞株におけるＥＲＧの通常の過剰発現は、ＥＲＧ活性化が広範な転移の前に起こったことを示唆する。これらを総合すると、これらの結果は、特定の遺伝現象が、前立腺腫瘍形成の前に個々の試料においてＥＲＧまたはＥＴＶ１を活性化しているかもしれないことを示唆していることになる。
これらの遺伝現象の特性を決定する上で、高ＥＲＧまたはＥＴＶ１発現を有する試料について、これらのそれぞれの座位（７ｐ２１．２および２１ｑ２２．３）での染色体増幅を試験した。ゲノムＤＮＡ上でのＱＰＣＲによると、試料中のＥＲＧまたはＥＴＶ１の、それぞれの転写物過剰発現（Ｓｏｔｉｒｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００，１０３９３（２００３））による増幅は見られなかった。続いて、ＤＮＡ再配列の発生を分析した。上述のＱＰＣＲに用いたプライマーは、ユーイング肉腫においてはＥＲＧとＥＴＶ１の既知のブレイクポイントに対して５´に位置するため、同じ転位が前立腺癌において起こりそうになかった。従って、ＥＴＶ１エクソンの発現レベルは、ＥＴＶ１過剰発現を示した、上記の同定した試料中のエクソンウォーキングＱＰＣＲにより測定した。ＥＴＶ１エクソン２〜７におよぶ５つのプライマー対を用い、ＬＮＣａＰ細胞はすべての測定ＥＴＶ１エクソンの実質的に均一な過剰発現を示し、およびＭＥＴ２６の両試料ではエクソン４〜７に比べて、ＥＴＶ１エクソン２および３の発現が＞９０％の減少していることを示した（図２Ｂ）。本結果の可能性のある説明として、別のスプライシング、新規の癌特異性アイソフォームまたは未報告の再配列が考えられる。
全長ＥＴＶ１転写物の特性を決定するため、ｃＤＮＡ末端の５´ＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅（ＲＬＭ-ＲＡＣＥ）をＬＮＣａＰ細胞およびＭＥＴ２６-ＬＮ上で行った。さらにまた、ＭＥＴ２８-ＬＮにおけるＥＲＧの全長転写物を得るため、ＲＬＭ−ＲＡＣＥを行った。ＲＬＭ-ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ由来のＥＴＶ１のＰＣＲ増幅のため、完全転写物の５´末端に連結したＲＮＡ-オリゴヌクレオチドに相補な順方向プライマーと、ＬＮＣａＰ細胞およびＭＥＴ２６-ＬＮの両者で過剰発現された最も５´側のエクソンである、エクソン４の逆方向プライマーを用いた。上述と同様の手法により、ＥＲＧのエクソン４がＭＥＴ２８-ＬＮ内に過剰発現されたことを決定した。このエクソン中の逆方向プライマーをＲＬＭ-ＲＡＣＥ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に用いた。クローン化産物の配列決定により、前立腺特異性遺伝子ＴＭＰＲＳＳ２（２８）（２１ｑ２２．２）の、ＭＥＴ２６-ＬＮにおけるＥＴＶ１との融合およびＭＥＴ２８-ＬＮにおけるＥＲＧとの融合が明らかになった（図２Ｃ）。ＭＥＴ２６-ＬＮでは、２つのＲＬＭ-ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物を同定した。
第１の産物であるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ａは、ＴＭＰＲＳＳ２の完全エクソン１の、ＥＴＶ１のエクソン４の始めとの融合を生じた（図２Ｃ）。第２の産物であるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ｂは、ＴＭＰＲＳＳ２のエクソン１および２の、ＥＴＶ１のエクソン４の始めとの融合を生じた（図６）。これらの両産物は、ＭＥＴ２６-ＬＮがエクソン２および３における過剰発現の消失を示した、上述のエクソン-ウォーキングＱＰＣＲと矛盾がない。ＭＥＴ２８-ＬＮにおいては、単一のＲＬＭ-ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物を同定し、配列決定により、ＴＭＰＲＳＳ２の完全エクソン１が、ＥＲＧのエクソン４の初めに融合していることが明らかになった（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧa）（図２Ｃ）。
前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１遺伝子融合の検証
これらの結果に基づき、ＱＰＣＲプライマー対は、ＴＭＰＲＳＳ２においては順方向プライマーで、ＥＲＧとＥＴＶ１のエクソン４においては逆方向プライマーで設計された。ＳＹＢＲグリーンＱＰＣＲを、両プライマー対を臨床的に局在化した前立腺癌および転移性前立腺癌の４２の症例より得た試料のパネルにわたって用いて行い、代表的な結果を描出した（図２ＤおよびＥ）。これらの結果は、高レベルのＥＴＶ１またはＥＲＧを有する試料のみがＴＭＰＲＳＳ２を有するそれぞれの融合産物を発現することを実証している。ＱＰＣＲがいくつかの陰性試料において３５サイクル後に測定可能な産物を生じたにもかかわらず、融解曲線分析は、陽性および陰性試料中の個別の産物を明らかにし、４０サイクルのＱＰＣＲ解析後の産物のゲル電気泳動は陰性融合試料のプライマーダイマーのみを明らかにした（図２、ＤおよびＥ）。プライマーダイマーの形成は、高ＧＣ含有量（８０．３％）に起因するＴＭＰＲＳＳ２のエクソン１全体でプライマーを設計する困難さで部分的に説明できる。しかしながら、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ａ、およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ｂ融合の特異的発現をタックマン（Ｔａｑｍａｎ）ＱＰＣＲでそれぞれの融合にまたがる順方向プライマーを用いて確認し、各症例において産物はＳＹＢＲグリーンＱＰＣＲと同じ症例でのみ検出された（上記Ｓｏｔｉｒｉｏｕ ｅｔ ａｌ．）。ＳＹＢＲグリーンＱＰＣＲと増幅産物に対して用いたプライマーの特異性をさらに確認するため、標準的な逆転写ＰＣＲを、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａを発現した試料のパネル上でＳＹＢＲグリーンＱＰＣＲと同じプライマーでおこなった。同様の大きさの産物が得られ、クローン化産物の配列決定はＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａの存在を確認した。高レベルのＥＴＶ１またはＥＲＧをそれぞれ発現したが、ＱＰＣＲによる転位の証拠を示さなかったＰＣＡ１６およびＰＣＡ１７の２症例（図２ＤおよびＥ）を同定した。ＰＣＡ１６においてＥＴＶ１プライマーで産生された産物の配列決定が融合転写物の証拠を示さず、ＰＣＡ１７においてはＥＲＧプライマーで産物は得られなかったので、ＲＬＭ-ＲＡＣＥはこれらの結果を裏付けた。同様の結果はＬＮＣａＰ細胞についても得られ、ＲＬＭＲＡＣＥまたはＱＰＣＲによる融合の証拠はなく、上記のエクソンウォーキングＱＰＣＲと矛盾しなかった。
前立腺癌試料におけるＥＴＳファミリーメンバーとのＴＭＰＲＳＳ２融合転写物の証拠の概要
ＲＬＭ-ＲＡＣＥ産物の配列決定、ＲＴ‐ＰＣＲ産物のＱＰＣＲおよび配列決定を含む、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合転写物についての３つの異なるアッセイから得られた結果を表２にまとめる。すべての試料におこなったＴＭＰＲＳＳ２融合に対するＱＰＣＲに加え、これらの融合の存在を、選択した試料についていくつかの手法を用いて確認した。例えば、ＰＣＡ１（前立腺癌試料１）において、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａを、ＲＬＭＲＡＣＥ産物の配列決定、ＲＴ‐ＰＣＲ産物のＱＰＣＲおよび配列決定により同定した。ＱＰＣＲ産物のＱＰＣＲ融解曲線分析およびゲル電気泳動により、ＰＣＡ４は予想より大きな増幅産物を産生した。続くＲＬＭ-ＲＡＣＥ解析で、ＴＭＰＲＳＳ２の完全エクソン１の、ＥＲＧのエクソン２の初めとの融合（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂ）を確認した（図６）。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂ接合部にまたがる順方向プライマーを用いたタックマンＱＰＣＲはＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂがＰＣＡ４のみに存在することを確認し、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ接合部にまたがる順方向プライマー を用いたタックマンＱＰＣＲは、この試料中で産物を産生しなかった（２７）。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合の証拠は、過剰発現したＥＲＧまたはＥＴＶ１をそれぞれ発現した症例のみに、ＱＰＣＲまたはＤＮＡマイクロアレイにより見られた。これらの結果は、アウトライアー解析で観察された排他的な発現と一致している。
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるＴＭＰＲＳＳ２ ：ＥＴＶ１転位およびＥＲＧ再配列の確認
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合転写物の存在確認後、染色体レベルでのこれらの再配列の証拠を、間期蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をホルマリン固定パラフィン包理（ＦＦＰＥ）試料上で用いて得た。２つの異なるプローブ手法を用いた。すなわち、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１転位を検出するのに２色、融合-シグナルアプローチ、およびＥＲＧ座の再配列を検出するのに２色、分断シグナルアプローチを用いた。これらのプローブ手法は、ＲＬＭ-ＲＡＣＥ、ＭＥＴ２６およびＭＥＴ２８に当初使用した２症例で検証した（図３）。ＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＶ１に対するプローブを用いて、正常な末梢リンパ球（ＮＰＬｓ）は１対の赤と１対の緑のシグナルを示した（図３Ａ）。ＭＥＴ２６は、プローブの重複の指標である一対のシグナルの融合を示し（図３Ｂ、黄色矢印）、本試料中におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１転写物の発現と一致していた。さらにまた、ＥＴＶ１に対する残りの２つのシグナルにより示されるように（図３Ｂ、赤矢印）、ＥＴＶ１座位の一貫した低レベル増幅を確認した。同様に、ＥＲＧ座位の５´および３´領域にわたるプローブを用いて、ＮＰＬにおける一対の黄色のシグナルを観測した（図３Ｃ）。ＭＥＴ２８においては、一対のプローブは緑と赤の別々のシグナルに分かれ、ＥＲＧ座位での再配列を示している（図３Ｄ、緑および赤の矢印）。この結果は、本症例におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写物の発現と一致している。これらの結果に基づき、上述の個々のＦＩＳＨ解析を、局在化した前立腺癌の１３症例および転移性前立腺癌の１６症例（図３Ｅ）由来のコアを含む連続組織マイクロアレイでおこなった。マトリックスで示すように、２９の症例中２３症例（７９.３％）が、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合（７症例）またはＥＲＧ再配列（１６症例）の証拠を示した。さらにまた、２９症例のうちの１２症例で（４１.４％）ＥＴＶ１座位での低レベル増幅の証拠を示した。過去の報告では、ＥＴＶ１、７ｐのゲノム位置を、局在化したおよび転移性前立腺癌において最もよく増幅された領域の１つとして同定した（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５、１７７（１９８７））。しかしながら、ＥＴＶ１増幅がＥＲＧ再配列を有する６症例で起こり、本発明者らの転写物データが、高いＥＲＧ発現およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合を有する試料のうち高いＥＴＶ１発現も有するものは１９試料のうち０試料であることを実証しているので、７ｐ増幅はＥＴＶ１発現を誘発していないようである。さらにまた、ＥＴＶ１増幅およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合の両者がＦＩＳＨにより存在した場合、融合シグナルではなく、個々のＥＴＶ１シグナルのみが増幅された。にもかかわらず、このＦＩＳＨ解析結果は、 上述の転写物データと一致した、ゲノムレベルでのＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１およびＥＲＧ再配列の存在を実証している。
ＴＭＰＲＳＳ２はアンドロゲン調節遺伝子であり、ＥＲＧとの融合でＥＲＧのアンドロゲン制御を生じている。ＴＭＰＲＳＳ２は、初期にＬＮＣａＰ細胞中でアンドロゲンにより発現が増大された前立腺特異的遺伝子として同定されたものであり、アンドロゲン応答性エレメント（ＡＲＥ）もそのプロモーター中に含む（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３６１、１５９０（２００３）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２、４７２２（２００２））。続く研究により、正常および腫瘍性前立腺組織における高い発現が確認され、ＴＭＰＲＳＳ２がアンドロゲン感受性前立腺細胞株においてアンドロゲン制御されていることが実証された（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２、４７２２（２００２）；Ｆｅｒｒａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １，７５（２００２）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １４，３２０８（２００３）；ＬａＴｕｌｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２，４４９９（２００２））。さらにまた、アンドロゲンがアンドロゲン非感受性前立腺癌細胞株ＰＣ３におけるＴＭＰＲＳＳ２の発現を増大しないのに対し、ＰＣ３細胞におけるアンドロゲン受容体の安定な発現は、アンドロゲン応答性となるＴＭＰＲＳＳ２を生じた（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｆｅｒｒａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．上記；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．上記；ＬａＴｕｌｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．上記）。これに対し、アンドロゲンで処理したＬＮＣａＰ前立腺細胞株のマイクロアレイ研究では、アンドロゲン応答性であるためＥＲＧまたはＥＴＶ１を同定しておらず（Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４、３９０７（２００４））、これらのプロモーター配列を調べることでは共通ＡＲＥを明らかにしなかった（上記Ｓｏｔｉｒｉｏｕ ｅｔ ａｌ．）。各細胞株において３つの独立したアッセイにより確認された（表２）ＤｕＣａＰおよびＶＣａＰ細胞株におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ融合が、ＥＲＧのアンドロゲン制御を生じていると考えられた。ＥＲＧ発現のアッセイにＱＰＣＲを用いて、ＥＲＧがＶＣａＰおよびＤｕＣａＰ細胞の両者で高発現されたにもかかわらず、合成アンドロゲンＲ１８８１による処理が、ＥＲＧの発現を、未処理対照と比較して、ＤｕＣａＰ細胞では２．５７倍に、およびＶＣａＰ細胞では５．０２倍に増大したことが確認された（図４）。ＥＲＧの発現は最小であり、Ｒ１８８１治療後では未処理対照試料に比べて、ＲＷＰＥ（１.３７倍）、ＬｎＣａＰ（０．８６倍）、ＰＣ３（１．２８倍）、およびアンドロゲン受容体を発現するＰＣ３細胞（０．７３倍）では実質的に変化しなかった。
同一試料のマイクロアレイ解析は、ＥＲＧは、ＤｕＣａＰおよびＶＣａＰ細胞おけるアンドロゲンに対する応答で、上方制御されるだけであることを確認した（Ｓｏｔｉｒｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，上記）。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際、機構の理解は、本発明の実施に必要ではない。にもかかわらず、これらの結果は、ＴＭＰＲＳＳ２とのそれぞれの融合が存在する場合に前立腺癌におけるＥＲＧまたはＥＴＶ１の異常発現についての可能な機構を示唆していると考えられる。
（表１）癌の例外事象の解析（ＣＯＰＡ）
強度の例外プロファイルを有する癌において原因となる変異が起こることが知られている遺伝子。「Ｘ」は、後天性病原ゲノム（ｐａｔｈｏｇｅｎｏｍｉｃ）転位についての文献証拠を示す。「ＸＸ」は、転位について特性決定した具体的な研究における例と、具体的な転位についての文献証拠を示す。「Ｙ」は、既知の増幅との一致を示す。「＊＊」は、前立腺癌におけるＥＲＧとＥＴＶ１の例外プロファイルを示す。
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表２は、前立腺癌試料および細胞株におけるＥＴＳファミリーメンバー状態に対するＴＭＰＲＳＳ２融合をまとめたものである。すべてのアッセイについて、陽性結果を「＋」で示し、陰性結果を「−」で示している。空欄になっている細胞は、所定のアッセイがその試料について行われなかったことを示す。定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によるＥＲＧまたはＥＴＶ１の過剰発現が示されており、アステリスク（＊）で示す試料は、その試料がｃＤＮＡマイクロアレイでも評価され過剰発現が確認されたことを示す。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧまたはＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１遺伝子融合を検出するために、選択した試料について過剰発現したＥＴＳファミリーメンバーについてのＲＬＭ-ＲＡＣＥを行い、配列決定後にＴＭＰＲＳＳ２融合を有する試料を示す。すべての試料について、ＱＰＣＲによるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ発現を分析した。選択した症例はまた、ＱＰＣＲで用いたものと同じＴＭＰＲＳＳ２融合プライマーを用いて標準的な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ‐ＰＣＲ）により増幅し、増幅産物を配列決定した。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１またはＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合の証拠を示す試料を表中の１番最後の列に示す。
（表２）
Figure 0005529732
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（表３）癌の例外事象の解析（ＣＯＰＡ）
Ｏｎｃｏｍｉｎｅでの検討で上位１０位に入る例外プロファイルを有する癌における原因となる変異が起こることが知られている遺伝子を示す。「Ｘ」は、後天性病原ゲノム転位に関する文献証拠を示す。「ＸＸ」は転位について特性決定した具体的な研究における例と、具体的な転位についての文献証拠を示す。「Ｙ」は、既知の増幅との一致を示す。「＊＊」は、前立腺癌におけるＥＲＧとＥＴＶ１の例外プロファイルを示す。
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（表４）本研究で用いたオリゴヌクレオチドプライマー
すべてのプライマーについて、遺伝子、塩基、およびエクソン（ＵＣＳＣゲノムブラウザーを用いた、２００４年５月のヒトゲノムのアセンブリと本文中に記載の参照配列のアラインメントに従う）を列挙する。順方向プライマーを「ｆ」でおよび逆方向プライマーを「ｒ」で示す。
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実施例２：ＥＴＶ４遺伝子融合
Ａ．材料および方法
プロファイリング研究におけるＥＴＳファミリーの発現
前立腺癌におけるＥＴＳファミリーメンバーの発現を調べるため、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベース（Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ２００４；６：１-６）にある、２つの前立腺癌プロファイリング研究を利用した（Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００４；１０１ ：８１１-６およびＴｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５；３１０：６４４-８）。ＥＴＳ領域を有する遺伝子をインタープロフィルター「Ｅｔｓ」（インタープロＩＤ：ＩＰＲ０００４１８）により同定した。ヒートマップ表示を「遺伝子ごとに中央値を中心」のオプションを用いてＯｎｃｏｍｉｎｅ中に作製し、その色の対比を、ＥＲＧとＥＴＶ１の発現差異を強調するように設定した。
試料
前立腺癌組織（ＰＣＡｌ-５）は、米国ミシガン大学前立腺癌専門優良研究プログラム（ＳＰＯＲＥ）組織コアの一部である、米国ミシガン大学の根治的前立腺切除術系列から得た。すべての試料は、患者らのインフォームドコンセントおよび事前の研究所審査委員の承認を得て収集した。全ＲＮＡをトリゾール（インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールスバッド）を製造業者の使用説明に従って用いて単離した。良性前立腺組織全ＲＮＡの市販のプール（ＣＰＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）も用いた。
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
ＱＰＣＲを、既述のように（上記Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）、ＳＹＢＲグリーン色素をアプライドバイオシステム社７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム社、米国カリフォルニア州フォスターシティ）上で用いて実施した。各試料についての、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対する各標的遺伝子の量を報告した。これらの標的遺伝子の相対量を、良性前立腺組織（ＣＰＰ）のプール由来量に対する値に対して較正した。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ（米国アイオワ州コーラルビル）により合成されたものである。ＧＡＰＤＨプライマーについては、文献（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２００２；３：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４）に記載のとおりである。ＥＴＶ４のエクソンに対するプライマーは以下のとおりである（５´→３´方向に列挙）。すなわち、
Figure 0005529732
である。エクソンを、ＵＣＳＣゲノムブラウザーを用いて２００４年５月凍結のヒトゲノムで、ＥＴＶ４（ＮＭ００１９８６.１）に関するＲｅｆＳｅｑのアラインメントにより番号付けした。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合転写物のＱＰＣＲ確認のため、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ａおよびＴＭＰＲＳＳ２；ＥＴＶ４ｂ転写物の両者を検出する
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を、ＥＴＶ４_エクソン４-ｒと共に用いた。
ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅（ＲＬＭ-ＲＡＣＥ）
ＲＬＭ-ＲＡＣＥを、ジーンレーサーＲＬＭ-ＲＡＣＥキット（インビトロジェン社）を用いて、記載の製造業者の使用説明書に従い（上記Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）実施した。ＥＴＶ４の５´末端を得るために、ＰＣＡ５由来の第１の鎖ｃＤＮＡを、ジーンレーサー５´プライマーおよびＥＴＶ４_エクソン４-ｒまたはＥＴＶ４_エクソン７-ｒ
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を用いて増幅した。産物をクローン化し、記載のように配列決定した（上記Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４転写物の等価物５´末端を両プライマー対から得た。
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ホルマリン固定したパラフィン包理（ＦＦＰＥ）組織切片を間期ＦＩＳＨに用いた。パラフィンを除去した組織を、０．２ＭのＨＣｌで１０分間、２倍濃度のＳＳＣで８０℃で１０分間処理し、プロテアーゼＫ（インビトロジェン社）で１０分間消化した。これらの組織とＢＡＣプローブを５分間９４℃で共に変性し、一晩３７℃でハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成後洗浄を０．１％ツイーン２０を含む２倍濃度のＳＳＣで５分間行い、蛍光検出を、フルオレセインに結合した抗ジゴキシゲニン（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、米国インディアナ州インディアナポリス）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４に結合したストレプトアビジン（インビトロジェン社）を用いて実施した。スライドを対比染色し、ＤＡＰＩ含有のＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（インビトロジェン社）中においた。スライドをＬｅｉｃａ ＤＭＲＡ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社、米国イリノイ州ディアフィールド）を用いて観察し、サイトビジョンソフトウェアシステム（アプライドイメージング社、米国カリフォルニア州サンタクララ）を用いてＣＣＤカメラで撮像した。
いずれのＢＡＣも、ＢＡＣＰＡＣリソースセンター（米国カリフォルニア州オークランド）から入手したものであり、プローブ位置を正常な末梢リンパ球の分裂中期スプレッドとのハイブリッド形成により確認した。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合の検出については、ＲＰ１１-３５Ｃ４（ＴＭＰＲＳＳ２に対して５´側）をＥＴＶ４に対して３´側に位置する複数のＢＡＣ（ＥＴＶ４に対して遠位側から近位側へ、順にＲＰ１１-２６６Ｉ２４、ＲＰ１１-２４２Ｄ８、およびＲＰ１１-１００Ｅ５）と共に用いた。ＥＴＶ４再配列の検出については、ＲＰ１１-４３６Ｊ４（ＥＴＶ４に対して５´側）をＥＴＶ４に対して３´側に位置する複数のＢＡＣと共に用いた。各ハイブリッド形成について、癌性細胞の領域が病理学者により同定され、一試料につき１００細胞をカウントした。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合についての報告された細胞数は、ＲＰ１１-２４２Ｄ８を用い、同様の結果がすべての３´ＥＴＶ４ ＢＡＣで得られた。ＰＣＡ５におけるさらなる再配列を排除するため、ＦＩＳＨを、ＥＴＶ４に対して３´側（ＲＰ１１-２６６Ｉ２４およびＲＰ１１-２４２Ｄ８）、ＥＲＧ分断シグナルプローブ（ＲＰ１１-９５Ｉ２１およびＲＰ１１-４７６Ｄ１７）、およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合プローブ（ＲＰ１１-３５Ｃ４およびＲＰ１１-１２４Ｌ２２）の２つのプローブを用いて実施した。ＢＡＣ ＤＮＡをＱＩＡフィルター・マキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、米国カリフォルニア州ヴァレンシア）を用いて単離し、プローブをジゴキシゲニンまたはビオチン・ニックトランスレーションミックス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて合成した。
Ｂ．結果
最初のＣＯＰＡスクリーニングは、ＥＲＧまたはＥＴＶ１とのＴＭＰＲＳＳ２融合の特性決定に至った（実施例１）。これらの遺伝子融合に対して陰性な前立腺癌は、その他のＥＴＳファミリーメンバーを含む再配列を有しているとさらに考えられる。Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベース（上記既出のＲｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．）からの前立腺癌プロファイリング研究においてモニターされたすべてのＥＴＳファミリーメンバーの発現を調べることで、ＥＴＳファミリーメンバーＥＴＶ４の著しい過剰発現を、１つは全体解剖組織のプロファイリング（Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，上記）（図７Ａ）であり、もう１つがレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）組織のプロファイリング（図７Ｂ）である、２つの研究の各々から単一の前立腺癌の症例で同定した。これらの症例はＥＲＧまたはＥＴＶ１を過剰発現せず、いずれの良性前立腺組織も過剰発現を示さなかったので、ＴＭＰＲＳＳ２との融合がこれらの症例におけるＥＴＶ４の過剰発現に関与したと考えられた。ＥＬＦ３が前立腺癌の症例のうちのわずかでも過剰発現されたにも拘わらず、これらの両研究で、正常な前立腺組織試料も著しいＥＬＦ３過剰発現を示しており、良性および癌性組織の両者での発現を引き起こす遺伝子融合の可能性が低いことを示している。従って、このＥＴＶ４過剰発現の事例（ＰＣＡ５として表す）をさらに分析した。
全ＲＮＡをＰＣＡ５から単離し、エクソン-ウォーキング定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いてＥＴＶ４の過剰発現を確認した。この場合、ＱＰＣＲは、プールされた良性前立腺組織（ＣＰＰ）（約９００倍）、およびＥＴＶ４を過剰発現せずかつＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ陽性（ＰＣＡｌ-２）であるかまたは陰性（ＰＣＡ３-４）であった前立腺癌に比べて、ＥＴＶ４の３´からエクソン２までのエクソンが著しく発現されたことを実証した（図８Ａ）。しかしながら、ＰＣＡ５における遠位領域に対する、ＥＴＶ４のエクソン２の発現の顕著な減少（＞９９％）が観測されており、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１陽性の例（上記既出のＴｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）ですでに観察されているように、可能性のあるＴＭＰＲＳＳ２との融合を示している。
ＰＣＡ５におけるＥＴＶ４転写物の５´末端を同定するため、ｃＤＮＡ末端のＲＮＡ-リガーゼ介在性迅速増幅（ＲＬＭ-ＲＡＣＥ）を、エクソン７において逆方向プライマーを用いて行った。ＲＬＭ-ＲＡＣＥは２つの転写物を明らかにし、これらは各々、ＥＴＶ４由来の配列に融合したＴＭＰＲＳＳ２のおよそ８ｋｂ上流に位置する配列からなる５´末端を有していた（図８Ｂ）。具体的には、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ａの５´末端は、ＴＭＰＲＳＳ２の該領域上流から４７塩基対を有しているが、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ｂの５´末端は、同じ末端１３塩基対を有している。これら両転写物の５´末端は、ＥＴＶ４のエクソン７の逆方向プライマーを通じて、ＥＴＶ４のエクソン３の直前の５´側に位置するイントロンの９塩基対と、エクソン３の既報の基準配列とからなる、同一の隣接配列に融合した。
ＰＣＡ５における両転写物の存在およびＣＰＰおよびＰＣＡ１〜４におけるこれらの非存在を、ＱＰＣＲを用いて確認した。既知のエクソンを含む融合物の存在をＴＭＰＲＳＳ２からさらに排除するため、ＱＰＣＲを、ＴＭＰＲＳＳ２のエクソン１の順方向プライマー、およびＥＴＶ４エクソン４逆方向プライマーを用いて実施し、予測どおり、ＣＰＰまたはＰＣＡ１〜５で産物は検出されなかった。
ＥＴＶ４調節不全を有するその他の前立腺癌が、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１転写物（ＴＭＰＲＳＳ２由来の既知のエクソン含む）に構造的により類似したＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合転写物を含み得るかどうかは不明である。本願明細書で報告されているＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合は、ＴＭＰＲＳＳ２のすぐ上流の十分特性決定されたＡＲＥを含んでいない。しかしながら、本願明細書に記載のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４転写物（Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ １９９４；３７２：１４３-９）に存在するＴＭＰＲＳＳ２配列の上流に位置するアンドロゲン応答性エンハンサーについての証拠はある。にもかかわらず、融合転写物に関わるＥＴＶ４エクソンのみの著しい過剰発現は、遺伝子融合が、ＥＴＶ４の調節不全に関与していることを強く示唆している。これらをあわせると、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合転写物の構造は、転写されたＴＭＰＲＳＳ２配列よりむしろ、ＴＭＰＲＳＳ２上流の制御エレメントが、ＥＴＳファミリーメンバーの調節不全を引き起こしているという結論を支持する。
ＲＬＭ-ＲＡＣＥおよびＱＰＣＲで実証されている、ＴＭＰＲＳＳ２（２１ｑ２２）とＥＴＶ４（１７ｑ２１）を取り囲むゲノム座位の融合を確認するため、間期蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を利用した。ＴＭＰＲＳＳ２に対して５´側、ＥＴＶ４に対して３´側のプローブを用いることで、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＶ４座位の融合が、ＰＣＡ５由来の癌性細胞の６５％で観測された（図８Ｄ）。ＥＴＶ４の再配列のさらなる確認として、５´および３´側のプローブをＥＴＶ４に用いると、ＰＣＡ５由来の癌性細胞の６４％が分断シグナルを示した。ＦＩＳＨも、さらなる再配列を排除するため、ＥＴＶ４に対して３´側の２つプローブ、ＥＲＧ分断シグナルプローブ、およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合プローブを用いてＰＣＡ５上で実施し、各ハイブリッド形成について陰性の結果が得られた。
これらを総合すると、この結果は、多くの分析方法は一貫した調節解除を示さないプロファイルを考慮にいれず（Ｅｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８；９５：１４８６３-８；Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８６：５３１-７；Ｔｕｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００１；９８：５１１６-２１）、それゆえ希少にみえる（９８症例中２症例）前立腺癌におけるＥＴＶ４を同定できないので、腫瘍遺伝子発現データの例外プロファイルを注意深く調べて用いることを強調している。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合の同定と組み合わせると、ここに示す結果は、ＡＲＥまたはＴＭＰＲＳＳ２上流のエンハンサーの破壊によってもたらされるＥＴＳファミリーメンバーの調節不全は、前立腺腫瘍形成の顕著な特徴である。
実施例３：遺伝子融合ＲＮＡの検出
本実施例では、４つの異なる定性的アッセイにおける、４つの遺伝子融合配列を有するＲＮＡ（ＩＶＴ）を標的とした捕捉、増幅および定性的検出（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ａ、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ｂ、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ、およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂ、ＡＰＴＩＭＡ製剤試薬を使用）、ならびに各々を適当な標的特異的なオリゴヌクレオチド、プライマー、およびプローブを加えたＨＰＡ検出について説明する。表５は、アッセイに用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
（表５）
Figure 0005529732
Ａ．材料および方法
ＲＮＡ標的捕捉
溶解緩衝液は、１５ｍＭのリン酸１ナトリウム（１水塩）、１５ｍＭのリン酸２ナトリウム（無水）、１．０ｍＭのＥＤＴＡ２ナトリウム２水和物、１．０ｍＭのＥＧＴＡ遊離酸、および１１０ｍＭのラウリル硫酸リチウムをｐＨ６．７を含有した。標的捕捉試薬は、２５０ｍＭのヘペス（ＨＥＰＥＳ）、３１０ｍＭの水酸化リチウム、１．８８Ｍの塩化リチウム、１００ｍＭのＥＤＴＡ遊離酸（ｐＨ６．４）、および２５０μｇ／ｍＬの１ミクロンの、共有結合したオリゴマー（ｄＴ）１４を有するカルボキシレート改変磁性粒子であるＳＥＲＡ-ＭＡＧ ＭＧ-ＣＭ（Ｓｅｒａｄｙｎ社、米国インディアナ州インディアナポリス）を含んだ。洗浄液は、１０ｍＭのヘペス、６．５ｍＭの水酸化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をｐＨ７．５で含有する。
ＲＮＡ増幅および検出
増幅試薬は、２６．７ｍＭのｒＡＴＰ、５．０ｍＭのｒＣＴＰ、３３.３ｍＭのｒＧＴＰおよび５．０ｍＭのｒＵＴＰ、１２５ｍＭのヘペス、８％（ｗ／ｖ）トレハロース２水和物、１．３３ｍＭのｄＡＴＰ、１．３３ｍＭのｄＣＴＰ、１．３３ｍＭのｄＧＴＰ、および１．３３ｍＭのｄＴＴＰを、ｐＨ７．５で含有する３．６ｍＬの溶液の凍結乾燥させた形態である。この増幅試薬は、９．７ｍＬの増幅試薬再構成溶液（下記参照）中で再構成した。使用前に、各１５ｐｍｏｌのプライマーオリゴマーを加えた。増幅試薬再構成溶液は、０．４％（ｖ／ｖ）エタノール、０．１０％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０２％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、３３ｍＭのＫＣｌ、３０．６ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００３％フェノールレッドを含んでいた。酵素試薬は、２０ｍＭのヘペス、１２５ｍＭのＮ-アセチル-Ｌ-システイン、０．１ｍＭのＥＤＴＡ２ナトリウム２水和物、０．２％（ｖ／ｖ）トリトン７Ｘ１００洗浄液、０．２Ｍのトレハロース２水和物、０．９０ ＲＴＵ／ｍＬのモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、および０．２０Ｕ／ｍＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをｐＨ７．０で含有する１.４５ｍＬの溶液の凍結乾燥された形態のものである。１単位（ＲＴＵ）の活性を、５.７５ｆｍｏｌのｃＤＮＡの、３７℃１５分間におけるＭＭＬＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対する合成および遊離と定義し、１単位（Ｕ）の活性を、３７℃２０分間での５.０ｆｍｏｌのＲＮＡ転写物の産生と定義する。酵素試薬を、３.６ｍＬの酵素試薬再構成溶液（下記参照）中で再構成した。酵素試薬再構成溶液は、５０ｍＭのヘペス、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）トリトン７Ｘ１００、１２０ｍＭの塩化カリウム、２０％（ｖ／ｖ）無水グリセリンをｐＨ７．０で含有する。ハイブリッド形成試薬は、１００ｍＭのコハク酸遊離酸、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１００ｍＭの水酸化リチウム、１５ｍＭのアルドリチオール-２、１.２Ｍの塩化リチウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ遊離酸、３．０％（ｖ／ｖ）エタノールを、ｐＨ４．７で含有した。
選択試薬は、６００ｍＭのホウ酸、１８２.５ｍＭの水酸化ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）トリトン７Ｘ１００を、ｐＨ８．５で含有した。この検出試薬は、１ｍＭの硝酸および３２ｍＭの過酸化水素を含有する検出試薬Ｉと、１．５Ｍの水酸化ナトリウムを含有する検出試薬ＩＩとを含んだ。
Ｂ．アッセイプロトコル
標的捕捉
１．反応管１本につき４００μＬの試料に対して示される複製レベルで、ＩＶＴストック溶液をＳＴＭに希釈することで試料を調製する。
２．連続分注器を用いて、ＴＣＯを有するＴＣＲ１００μＬを適切な反応管に添加する。
３．マイクロピペットを用いて各試料４００μＬを加えて、適切に標識する。
４．反応管をシーリングカードでカバーして、ラックを緩やかに手で振とうする。ボルテックスしない。ラックを６２±１℃ウォーターバス中で３０±５分間インキュベートする。
５．ウォーターバスからラックを取り出し、反応管の底を吸収性材料で拭いて乾かす。
６．シーリングカードがしっかりと固定されていることを確認する。必要に応じて、シーリングカードを新しいものと取替え、しっかりと密封する。
７．シーリングカードを取り外さずに、ラックを室温で３０±５分間インキュベートする。
８．ラックを５〜１０分間ＴＣＳマグネチックベース上に置く。
９．ＡＰＴＩＭＡ洗浄液を分注マニフォールドを通してポンプでくみあげて、分注装置のポンプラインを準備する。ライン中の気泡がなくすべての１０個のノズルが安定な流れの液体を送液するように、ポンプで十分に液体をシステム内に通す。
１０．真空ポンプを始動し、吸引マニフォールドとトラップ瓶の間の第一のコネクターで吸引マニフォールドの接続を切る。真空計の読みが、２５ｉｎ．Ｈｇを超えないようにする。真空計の読みには１５秒かかる可能性がある。マニフォールドを再び接続して、および真空計の読みが７〜１２ｉｎ．Ｈｇの範囲になるようにする。すべての標的捕捉工程が完了するまで真空ポンプを運転させておく。
１１．吸引マニフォールドを第１セットの先端部にしっかりと取り付ける。先端部が軽く反応管の底に接触するまで、先端部を第１のＴＴＵに下げて、すべての液体を吸引する。先端部を反応管の底に触れたままにしない。
１２．吸引終了後、先端部をもとの先端カセットに外し入れる。各試料専用の先端部用いて、吸引工程を残りのＴＴＵについて繰り返す。
１３．分注マニフォールドを各ＴＴＵに配置し、分注装置ポンプを用いて、１．０ｍＬのＡＰＴＩＭＡ洗浄液をＴＴＵの各反応管に送液する。
１４．反応管をシーリングカードで封をし、ラックをＴＣＳから取り除く。マルチチューブボルテックスミキサーで１度ボルテックスする
１５．ラックをＴＣＳマグネチックベース上に５〜１０分間置く。
１６．すべての液体を工程１３および１４のように吸引する。
１７．最終吸引の後、ラックをＴＣＳベースから取り出し、目視で反応管を検査してすべての液体が吸引されたかを確認する。液体がまだ見られる場合、ラックをＴＣＳベースに２分間戻して、各試料について先に用いたものと同じ先端部を用いてＴＴＵに対して吸引を繰り返す。
プライマーアニーリングおよび増幅
１．連続分注器を用いて、分析物特異性プライマーを含有する再構成増幅試薬７５μＬを各反応管に加える。この時点ですべての反応混合物は赤色となるはずである。
２．連続分注器を用いて、２００μＬの油試薬を加える。
３．シーリングカードで反応管に封をし、マルチチューブボルテックスミキサー上でボルテックスする。
４．ラックをウォーターバス中６２±１℃で１０±５分間インキュベートする。
５．ラックをウォーターバスに移し、４２±１℃で５±２分間放置する。
６．ラックをウォーターバスにつけたまま、シーリングカードを注意深く取り外し、連続分注器を用いて、２５μＬの再構成酵素試薬を反応混合物の各々に添加する。この段階で、すべての反応は、オレンジ色となっているはずである。
７．直ちに新しいシーリングカードで反応管に封をしてウォーターバスから取り出し、ラックを手で緩やかに振とうさせて反応物を混合する。
８．ラックを４２±１℃で６０±１５分間インキュベートする。
ハイブリッド形成
１．増幅前ウォーターバスからラックを取り出し、増幅後領域に移す。分析物特異性プローブを有する再構成したプローブ試薬１００μＬを、連続分注器を用いて加える。すべての反応混合物はこの時点で黄色となっているはずである
２．反応管をシーリングカードで封をし、マルチチューブボルテックスミキサー上で１０秒間ボルテックスする。
２．ラックを６２±１℃のウォーターバス中で２０±５分間インキュベートする。
３．ラックをウォーターバスから取り出し、室温で５±１分間インキュベートする。
選別
１．連続分注器を用いて、２５０μＬの選択試薬を各反応管に加える。すべての反応は、この段階で赤色を呈するはずである。
２．反応管をシーリングカードで封をして１０秒間あるいは色が均一になるまでボルテックスし、ラックを６２±１℃のウォーターバス中で１０±１分間インキュベートする。
３．ラックをウォーターバスから取り出す。ラックを室温で１５±３分間インキュベートする。
ＴＴＵの読み取り
１．試験完了に十分な量の自動検出試薬ＩおよびＩＩがあることを確認する。
２．カセット位置番号１に空のＴＴＵを１つ入れてＬＥＡＤＥＲルミノメーターを準備し、ＷＡＳＨプロトコルをおこなう。
３．ＴＴＵをルミノメーターにロードし、ＨＣ＋ＲｅｖＢプロトコルを実行する。
Ｃ．結果
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１遺伝子融合ＩＶＴの各々をＴＣＲに添加した４つのアッセイに対する結果を表６〜９に示す。
（表６）
Figure 0005529732
（表７）
Figure 0005529732
（表８）
Figure 0005529732
（表９）
Figure 0005529732
実施例４：遺伝子融合に関するＦＩＳＨ分析
本実施例では、前立腺癌試料２９試料中２３試料がＥＲＧまたはＥＴＶ１に再配列を保持することを実証するための、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の使用について説明する。細胞株実験は、ＴＭＰＲＳＳ２のアンドロゲン応答性プロモーターエレメントが、前立腺癌においてＥＴＳファミリーメンバーの過剰発現を介在していることを示唆する。これらの結果は、癌腫の発症および前立腺癌の分子的診断および治療に意味をもつ。
ＦＩＳＨアッセイに用いた具体的なＢＡＣプローブの一覧を以下に示す。
ＥＴＳファミリーメンバーにおける異常をＦＩＳＨにより検査するための臨床的ＦＩＳＨ解析
・１つがＥＴＶ１にまたがり１つがＴＭＰＲＳＳ２座位にまたがるプローブを用いたＥＴＶ１-ＴＭＰＲＳＳ２融合の評価
ＥＴＶ１に対するＢＡＣ：ＲＰ１１-６９２Ｌ４
ＴＭＰＲＳＳ２に対するＢＡＣ：ＲＰ１１-１２１Ａ５、（ＲＰ１１-１２０Ｃ１７、ＰＲ１１-８１４Ｆ１３、ＲＲ１１-５３５Ｈ１１）
・ｃ‐ＥＲＧ：ｔ‐ＥＲＧ分断に関する１組のプローブを用いたＥＲＧ転位の評価：
ｃ‐ＥＲＧに対するＢＡＣ：ＲＰ１１-２４Ａ１１
ｔ‐ＥＲＧに対するＢＡＣ：ＲＰ１１-３７２Ｏ１７、ＲＰ１１-１３７Ｊ１３
・１つはＥＴＶ１座位にまたがり１つの基準プローブは７番染色体上にある１組のプローブを用いたＥＴＶ１欠失／増幅試験：
ＥＴＶ１に対するＢＡＣ：ＲＰ１１-６９２Ｌ４
７番染色体上の標準プローブに対するＢＡＣ：ｃｈrのセントロメア上の市販プローブ
・１つがＥＲＧ座位にまたがり１つの基準プローブが２１番染色体上にある１組のプローブを用いたＥＲＧ欠失／増幅試験：
ＥＲＧに対するＢＡＣ：ＲＰ１１-４７６Ｄ１７
２１番染色体上の標準プローブに対するＢＡＣ：＊
・１つがＴＭＰＲＳＳ２座位にまたがり１つの基準プローブが２１番染色体上にある１組のプローブを用いたＴＭＰＲＳＳ２欠失／増幅試験：
ＴＭＰＲＳＳ２に対するＢＡＣ：ＲＰ１１-１２１Ａ５、（ＲＰ１１-１２０Ｃ１７、ＰＲ１１-８１４Ｆ１３、ＲＲ１１-５３５Ｈ１１）
２１番染色体上の基準プローブに対するＢＡＣ：＊
＊２１番染色体上の基準プローブに対するＢＡＣ：ＰＲ１１-３２Ｌ６、ＲＰ１１-７５２Ｍ２３、ＲＰ１１-１１０７Ｈ２１、ＲＰ１１-６３９Ａ７、（ＲＰ１１-１０７７Ｍ２１）
実施例５：欠失を伴うＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合
本実施例では、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合に伴う、２１番染色体ｑ２２．２-３上のＥＲＧとＴＭＰＲＳＳ２との間に位置する共通の欠失（ｃｏｍｍｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）の存在について説明する。疾患進行と臨床成績との関連を、広い範囲にわたるヒトＰＣＡ試料、６つの細胞株、および１３の異種移植を用いて調べた。
Ａ．材料および方法
臨床試料
本検討で用いた前立腺試料は、ＩＲＢ認定プロトコルのもとで収集されたものである。すべての臨床的に局在化したＰＣＡ試料を、１名の病理学者により特性決定し、病理報告の際の観察者間の差異を排除するため、グリーソンスコアをつけた。臨床的に局在化したＰＣＡ試料を、ウルム大学での現在進行中の研究プロトコルの一部として収集した。これらのホルモン抵抗性試料は、米国ミシガン大学の迅速剖検プログラムから採取されたものである。
ＦＩＳＨ実験を、２１４名の患者由来の８９７の組織コア（ヒストスポット）からなる、２つのＰＣＡ予後評価アレイについておこなった。患者の個体群統計の要約を表１０に示す。すべての患者が、１９８９年から２００１年の間にウルム大学（独国ウルム）にて、骨盤リンパ節切除術を伴う根治的前立腺切除術を受けた。術前ＰＳＡは、１から３１４ｎｇ/ｍＬ（平均３６ｎｇ/ｍＬ）の範囲であった。平均および最大追跡期間は、それぞれ３．４および８．４年である。
細胞株および異種移植片
アンドロゲン非依存性（ＰＣ‐３、ＤＵ-１４５、ＨＰＶ１０、および２２Ｒｖ１）、およびアンドロゲン感受性（ＬＮＣａＰ）ＰＣＡ細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国バージニア州マナサス）から購入したものであり、限定培地中で維持した。ＨＰＶ１０は、ＨＰＶ１８ＤＮＡ（１８）によるトランスフェクションで形質転換した、高悪性度ＰＣＡ（グリーソンスコア：４＋４=８）由来の細胞に由来した。２２Ｒｖ１は、性腺摘除誘発性退縮および親のアンドロゲン依存性ＣＷＲ２２異種移植の再発後にマウスにおいて連続的に増殖させた、異種移植に由来するヒトＰＣＡ上皮細胞株である。ＶＣＡＰ細胞株は、米国ミシガン大学での迅速剖検プログラムの一部として、椎骨転移性病変から得られたものである。
ＬｕＣａＰ２３.１、３５、７３、７７、８１、８６．２、９２．１、および１０５は、アンドロゲン非依存性ホルモン-抵抗性疾患ＰＣＡの患者由来のものである。ＬｕＣａＰ４９および１１５は、アンドロゲン依存ＰＣＡの患者由来のものである。ＬｕＣａＰ５８は、臨床的に進行した転移性疾患を有する未治療の患者由来のものであり、ＬｕＣａＰ９６は、ホルモン抵抗性ＰＣＡを有する患者で増殖する前立腺由来腫瘍から樹立したものである。ＬｕＣａＰ４９（大網腫瘤より樹立）、およびＬｕＣａＰ９３は、ホルモン非感受性（アンドロゲン受容体［ＡＲ］-陰性）小細胞ＰＣＡである。これらの２つの異種移植は、神経内分泌表現型を実証した。ＬｕＣａＰ２３．１はＳＣＩＤマウス内で維持され、およびその他の異種移植は、オスのＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕマウスに腫瘍を移植することで維持される。
間期ＦＩＳＨを利用したＴＭＰＲＳＳ２ ：ＥＲＧ融合の決定
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧの転位に関するＦＩＳＨ解析は、本願明細書中や過去にも記載がある（Ｔｏｍｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４-８（２００５））。この分離アッセイを図１１および１４に示す。２１番染色体ｑ２２．２上におけるＥＲＧ再配列を解析するために、それぞれがＥＲＧ座位の隣接するセントロメアおよびテロメア領域に広がる、ビオチン-１４-ｄＣＴＰ標識ＢＡＣクローンＲＰ１１-２４Ａ１１（最終的に結合して赤のシグナルを生成）、およびジゴキシゲニン-ｄＵＴＰ標識ＢＡＣクローンＲＰ１１-１３７Ｊ１３（最終的に結合して緑のシグナルを生成）からなる分離プローブシステムを応用した。すべてのＢＡＣクローンは、ＢＡＣＰＡＣリサーチセンター、オークランド研究所小児科病院（ＣＨＯＲＩ）、米国カリフォルニア州オークランドより入手したものである。
この分離プローブシステムを利用して、ＥＲＧ再配列を有さない核は、赤と緑の並列した２対のシグナルを示した。赤-緑の並列シグナルは、黄色の融合シグナルを形成する。ＥＲＧ再配列を有する核は、１つの並んだ赤-緑シグナル対の分離が各細胞において、転位置された対立遺伝子に対する単一の赤および緑シグナルと非転位置対立遺伝子に対する複合した黄色のシグナルを生じることを示している。組織解析の前に、すべてのプローブの完全性と純度を正常な末梢リンパ球の分裂中期スプレッドとのハイブリッド形成により確認した。組織ハイブリッド形成、洗浄、および蛍光検出は、過去の記載に基づいておこなった（Ｇａｒｒａｗａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３６：１１７-２２（２００５）；Ｒｕｂｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：３８１４-２２（２００４））。少なくとも１つのＴＭＡコアを、２つＴＭＡ由来の５９％のＰＣＡの症例で評価できた。このアッセイの技術的な難点として、評価する診断材料がないこと、弱いプローブシグナル、および正確な診断を妨げる重複細胞が挙げられた。残りの本解析では、評価可能な臨床的に局在化したＰＣＡの１１８の症例に絞った。１５の症例では、同じく評価可能な、対応するホルモン未処理転移性リンパ節試料を有した。
これらの試料を、適切なフィルターを装備したオリンパスＢＸ−５１蛍光顕微鏡、ＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）カメラおよびサイトビジョン ＦＩＳＨ撮像および画像取り込み用ソフト（アプライドイメージング社、米国カリフォルニア州サンノゼ）を用いて、１００ｘ油浸対物レンズで観察した。これらの試験の評価は、ともに間期ＦＩＳＨ実験の解析の経験のある病理学者２名により独立におこなった。各症例について、１症例につき少なくとも１００個の核を評定するようにした。両病理学者による結果において顕著な差が見られ場合、その症例は、第３の病理学者が審査した。
オリゴヌクレオチドＳＮＰアレイ解析
ＳＮＰアレイは対立遺伝子の遺伝子型解析を対象としているにもかかわらず、このＳＮＰアレイデータは、異型接合性の損失（Ｌｉｅｂｅｒｆａｒｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：４７８１-５（２００３）；Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：１２３３-４０（２００４））および複製数変化の検出（Ｚｈａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：４８３-９５（２００３））に関する情報を提供できる。ＳＮＰアレイ解析を利用すると、黒色腫（ＭＩＴＦ）等の様々な癌における増幅遺伝子を確認および検証することが可能である（Ｇａｒｒａｗａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３６：１１７-２２（２００５））、およびＰＣＡ（ＴＰＤ５２）（Ｒｕｂｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：３８１４-２２（２００４））。
１００Ｋアレイ上でのＳＮＰ検出は、ゲノム表現（ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の減少で始まった。ゲノムＤＮＡ２５０ｎｇの２つのアリコットを別々にＸｂａＩ ＨｉｎｄＩＩＩで消化した、これらの消化された断片を独立にオリゴヌクレオチドリンカーに連結した。この結果得られる産物を、２００〜２０００ｂｐのＰＣＲ断片を増幅する条件下で単一のＰＣＲプライマーを用いて増幅した。これらの断片は、ゲノムの細分画を示す。これらはそのＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片内にあるので、アレイ上にタイル張り状に配置したＳＮＰを予備選択し、アレイ上で強く検出されることを確認した。続いて、これらの得られたＤＮＡの増幅プールを標識して断片化し、さらに、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩオリゴヌクレオチドＳＮＰアレイを分離するためハイブリッド形成した。
アレイをジーンチップスキャナー３０００で走査した。遺伝子型決定（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｃａｌｌ）およびシグナル定量化を遺伝子操作システム１．１．１およびアフィメトリックス・ジェノタイピングツールズ２．０ソフトを用いて得た。遺伝子型決定割合が９０％を超えるアレイのみをさらに解析した。生データファイルを呼び処理し、ｄＣｈｉｐＳＮＰ（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：１２３３-４０（２００４））において描出した。具体的には、予備処理は、一組の不変プローブを用いたベースラインに対するアレイデータの正規化を含み、続く処理でモデルベースの（ＰＭ／ＭＭ）方法（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３１-６（２００１））を利用して、各試料の各ＳＮＰの単一の強度値を得る。
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合転写物の定量ＰＣＲ
ＱＰＣＲをＳＹＢＲグリーン色素（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＭＪリサーチ社のＤＮＡエンジンオプティコン２マシンで行った。全ＲＮＡを、ランダム６量体の存在下でＴＡＱＭＡＮ逆転写試薬（アプライドバイオシステム社）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。すべてのＱＰＣＲ反応をＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて行った。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーで設計されたものである。Ｔｏｍｌｉｎらが記載し（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４-８（２００５））、融合に特異的なプライマーを用いた。すなわち、
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である。
ＧＡＰＤＨプライマーについては過去に報告されている（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ３：ＲＥＳＥＡＲＣＨ ００３４（２００２））。１０μｍｏｌの順方向および逆方向プライマーを用い、製造業者の推奨する熱サイクル条件に従って手順を実施した。閾値は、ＱＰＣＲ反応の指数期の間にＯｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒ解析ソフト、バージョン２．０２を用いて設定した。各試料について、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対する各標的遺伝子の量を比較閾値サイクル（Ｃｔ）法（アプライドバイオシステム社ユーザーブルテン＃２）により決定した。すべての反応について融解曲線分析し、選択した実験から得られた生成物を２％アガロースゲル上で電気泳動させて分離した。
統計
臨床的および病理学的変数を再配列状態および欠失の存在との関連について調べた。χ２乗検定およびフィッシャーの正確確率検定を適切に用いた。カプラン‐マイヤー分析を、病態についての前立腺特異的な抗原無再発生存曲線とゲノム変化パラメーターを作製するのに用いた。対数順位検定を、関連性の統計学的有意性を評価するのに用いた。ネオアジュバントホルモンアブレーション療法の前歴のある患者は排除した。すべての統計を、ウィンドウズ用ＳＰＳＳ１３．０（ＳＰＳＳ社、米国イリノイ州シカゴ）を用いて有意水準０．０５でおこなった。
Ｂ．結果
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子再配列に伴う２１番染色体上の欠失の検出
ＰＣＡにおけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列の頻度の特性決定を行うため、Ｔｏｍｌｉｎｓらにより記載されたアッセイ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４-８（２００５））を改変したＦＩＳＨ分析を用いた。当初のＦＩＳＨ分析は、セントロメア３´およびテロメア５´末端のＥＲＧ上に位置する２つのプローブを用いた。この新しいアッセイは、５´プローブをテロメア方向に移動した（図１４）。ＰＣＡスクリーニング組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を用いて、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列（図１１Ａおよび１１Ｂ）を実証するおよそ７０％のＰＣＡが、テロメア５´ＥＲＧプローブ（図１１Ｃおよび１１Ｄ）に対応する緑のシグナルの消失も示すことが観察され、この染色体領域が消失したことを示唆している。１００ＫオリゴヌクレオチドＳＮＰアレイを、これらの欠失の範囲を特徴付けるため用いた。細胞株、異種移植およびホルモン未処理およびホルモン抵抗性転移性ＰＣＡ試料を含む３０のＰＣＡ試料を調べることで、２１番染色体ｑ２３上のＥＲＧとＴＭＰＲＳＳ２との間のゲノム消失が確認された（図１２Ａ-Ｃ）。
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１に関する再配列状態を、これらの３０個のＰＣＡについてのＦＩＳＨおよび／またはｑＰＣＲにより決定した（図１２Ａ中の灰色および薄い青色の棒状部）。個別のゲノム喪失が、ＬｕＣａＰ４９、ＬｕＣａＰ９３、ＵＬＭ ＬＮ１３、ＭＥＴ６-９、ＭＥＴ１８-２、ＭＥＴ２４-２８、およびＭＥＴ２８-２７について、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧ座位の間の領域に関わるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列陽性試料中で観測された。これらの個別の欠失の範囲は不均一であった。ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧ座位の間の領域を含む２１番染色体上での、より広範囲のゲノム喪失は、ＬｕＣａＰ３５、ＬｕＣａＰ８６.２、ＬｕＣａＰ９２.１、およびＭＥＴ３-８１において観測された。ＶＣａＰ細胞株および異種移植片ＬｕＣａＰ２３．１は、この領域での喪失を実証しなかった。試料のサブセット４５％（１１試料のうち５試料）については、欠失が、ＥＲＧイントロン３の近くで起こっている。試料の大半６４％（１１試料のうち７試料）では、欠失がＴＭＰＲＳＳ２上に位置するＳＮＰの近辺で終結している（テロメア方向で次のＳＮＰが約１００Ｋ離れている）。ＶＣａＰ細胞株は、全２１番染色体にわたり複製数増加を示した。
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列陽性腫瘍については、７１％（７試料のうち５試料）のホルモン治療不応性ＰＣＡは、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧ座位の間の欠失を実証しているの対し、欠失は２５％（４試料のうち１試料）のホルモン未処理転移性ＰＣＡ試料（ＵＬＭ ＬＮ１３）でのみ同定された。３８.７６５Ｍｂまたは３８.９１１Ｍｂの欠失の開始点で区別される２つ個別のサブクラスとの欠失境界について、顕著な均一性がある。標準的なＰＣＡ細胞株（ＰＣ‐３、ＬＮＣａＰ、ＤＵ-１４５、またはＣＷＲ２２（２２Ｒｖ１））のいずれもが、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧまたはＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合を実証しなかった。いくつかのＬｕＣａｐ異種移植片には、ともにホルモン非感受性（アンドロゲン受容体［ＡＲ］陰性）小細胞ＰＣＡである、ＬｕＣａＰ４９（大網腫瘤から確立）、およびＬｕＣａＰ９３、等の欠失を有するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合を実証するものもあった。
ＥＲＧの複製数増加は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列のある場合とない場合の両方で小サブセットで観測された。ホルモン抵抗性ＰＣＡ由来のＶＣａＰ細胞株は、顕著な複製数増加を２１番染色体上で実証し（図１２Ａ〜Ｃ）、この増加はＦＩＳＨにより確認された。
原発性前立腺癌試料におけるＴＭＰＲＳＳ２ ：ＥＲＧ再配列とホルモン未処理リンパ節転移
これらの観察についての頻度および潜在的臨床意義を特徴づけるため、１１８の臨床的に局在化したＰＣＡの症例をＦＩＳＨにより調べた。これらの臨床的および病理学的個体群統計を表１０に示す。患者のコホートは、高腫瘍悪性度（グリーソン評価）、病態の段階、および予備治療ＰＳＡレベルにより実証される疾患再発のリスクが高い。ＰＣＡの大きな領域が微視的に調べることのできる、このコホート由来の標準的な組織切片を用いると、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列は、所与の腫瘍について均一に観察された。ＴＭＡ実験により、これらの観測を確認した。３〜６つのコアが腫瘍の異なる領域から得られたＰＣＡの症例では、１００％の一致がＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列状態（すなわち、存在または非存在）について観察された。欠失を伴うＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列の場合、９７．９％（９４／９６）の症例で欠失が同じ患者由来のすべてのＴＭＡコアで観察された。
（表１０）前立腺切除術で治療された臨床的に局在化した前立腺癌を有する男性１１８名の臨床的および病理学的個体群統計＊
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＊１１８症例においてデータ点のないものもあった。
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列を、原発性ＰＣＡ試料の４９．２％およびホルモン未処理転移性ＬＮ試料の４１．２％で確認した（図１３Ａ）。テロメアプローブの欠失（緑シグナル）（図１Ｃ〜Ｄ）を、原発性ＰＣＡ試料の６０．３％（３５／５８）およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列を有するホルモン未処理リンパ節腫瘍の４２.９％（３／７）で観測した。
整合した原発性およびホルモン未処理リンパ節腫瘍のあった１５症例においては、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列状態は、再配列を示す対のうちの４７％（１５のうちの７）と１００％の一致があった。テロメア（緑シグナル）プローブの欠失は４２.９％（７症例のうち３症例）の対で一致してみられた。
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列状態および前立腺癌の進行
再配列状態と臨床的および病理学的変数との関連を観察した（図１３）。欠失を有するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列は、進行した腫瘍段階（ｐＴ）（ｐ＝０．０３）（図１３Ｂ）および局所骨盤リンパ節への転移性疾患の存在（ｐＮ０対ｐＮ１−２）（ｐ＝０．０２）を有するＰＣＡの症例でより高い割合で観察された。欠失を伴うまたは伴わないＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列と、経過観察データのある７０名の患者についての前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）生化学的欠陥により決定された臨床成績との関連性も評価した。グリーソン評価、腫瘍段階、核異型度、およびリンパ節状態は、ＰＳＡ生化学的欠陥値（全てのｐ値＜０．０００５）の良好な予測因子である。ＦＩＳＨアッセイにより決定された欠失のないＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列ＰＣＡの症例におけるＰＳＡ無再発延命効果を示唆する傾向が一変量レベルで観察された。
実施例６：致死性前立腺癌に関連するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合
過去の研究において、ＥＲＧ（２１q２２.２）、ＥＴＶ１（７ｐ２１.２）（Ｔｏｍｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４-８（２００５））、またはＥＴＶ４（Ｔｏｍｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（７）：３３９６-４００（２００６））のいずれかであるＥＴＳ転写因子ファミリーメンバーとのＴＭＰＲＳＳ２（２１ｑ２２．３）の５´非翻訳領域の遺伝子融合は、大多数の前立腺癌におけるＥＴＳ遺伝子の過剰発現に関する機構を与える。さらにまた、アンドロゲン制御遺伝子であるＴＭＰＲＳＳ２、および癌遺伝子の融合は、疾患の進行がこれらの分子のサブタイプに基づいて変動しうる可能性を示唆している。遺伝子融合に関して最もよくある機構は、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧの間の約２．８メガベースのゲノムＤＮＡの喪失である（図１７ＡおよびＢ）。この例は、通常のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合の存在に基づく転移または前立腺癌特異的な死亡のリスクについて説明する。
Ａ．方法
本治験対照母集団は、Ａｎｄｒｅｎらの文献（Ｊ．Ｕｒｏｌ．１７５（４）１３３７-４０（２００６））に記載の症候性良性前立腺肥大に対する経尿道的前立腺切除術（ＴＵＲＰ）または経膀胱腺腫核摘出により、１９７７年から１９９１年の間にスウェーデンのオレブロ大学病院で診断された初期の前立腺癌（Ｔ１ａ−ｂ、Ｎｘ、Ｍ０）を有する男性からなる。診断でのベースライン評価として、物理的検査、胸部Ｘ線、骨スキャンおよび骨格Ｘ線検査（必要に応じて）をおこなった。リンパ節転移段階評価はおこなわなかった。この評価では遠隔転移の証拠が示されなかったので、患者は診断後最初の２年間は６ヶ月ごとそしてその後１２ヶ月ごとに治験、臨床検査および骨スキャンを受けることとした。骨スキャンによる決定で転移のあった患者は、症状のあった場合、アンドロゲン欠乏療法で治療した。
このコホートにおける死亡原因を、研究調査員による医療記録を調べて決定した。スウェーデン死亡記録（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｄｅａｔｈ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ）と比較した死亡原因に関する検証研究は、９０％を超える一致を示し、いずれの死亡原因についても系統的な過小または過剰報告がなかった（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ｌ（８６４２）：７９９-８０３（１９８９））。死亡率についてのコホートの追跡調査は１００％であり、いずれの患者についても２００５年１０月まで追跡できた。本研究の終了点は、遠隔転移の進行または前立腺癌所定の死亡として定義した（追跡時間の中央値は９.１年であり、最大２７年）。
すべてのＴＵＲＰ試料について、過去に報告されたように（Ｊ．Ｕｒｏｌ．１７５（４）：１３３７-４０（２００６））、前立腺癌の診断確認、グリーソンスコアおよび核異型度の決定、および腫瘍量の評価を１人の病理学者により再調査した。組織マイクロアレイを、マニュアル式のアレイヤー（Ｒｕｂｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．１４（６）：１４２４-３２（２００５））を用いて組み立てた。前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列の頻度をＴｏｍｌｉｎｓらによりもともと報告されたアッセイ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４-８（２００５））から生まれた改変蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを利用して評価した。この新しいアッセイは５´プローブをテロメア方向におよそ６００ｋｂ動かした。少なくとも１つのＴＭＡコアを９２の前立腺癌の症例で評価することができた。
Ｂ．結果
局在化した癌を診断された男性のこの集団ベースのコホートにおいて、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合の頻度は１５.２％（１４／９２）であった（図１７ＡおよびＢ）。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合陽性腫瘍は、より高いグリーソンスコア（両側Ｐ=．０１４）を有する可能性が高い（表１１）。融合状態と致死性前立腺癌の関係を評価するために、累積罹患率回帰を用いた。累積罹患率（ＣＩＲ）が３．６（Ｐ＝．００４、９５％信頼区間［ＣＩ］=１．５〜８．９）である、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合の存在と転移または疾患特有の死亡との顕著な関連が観測された（図１７Ｃ）。グリーソンスコアを調節した場合、ＣＩＲは２．４であった（Ｐ＝．０７および９５％ＣＩ＝０．９〜６．１）。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際、機構を理解することは、本発明を実施するのに必要ではない。にもかかわらず、所与の細胞腫瘍の細胞内でのＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合の均一性および侵襲性前立腺癌のみにおけるその存在（前立腺上皮内腫瘍と比べた場合に）に基づいて、このことは、グリーソンパターンの表現型の影にひそむ生物学に一部寄与する初期の現象であると考えられていた。
（表１１）ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子により重層化した局在化前立腺癌に対し指示に従って対処した男性のコホートに関する予後因子
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＊ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合を有する対象とＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合を持たない対象の臨床用変数を、連続変数およびカテゴリー変数のそれぞれについてｔ検定またはχ２乗検定を用いることで比較した。
＊＊グリーソンスコアは、優勢型および従属型グリーソンパターンを加算することで得た。
＊＊＊１つの症例について、核異型度は評価しなかった。
＊＊＊＊２００５年の時点で少なくとも１２年間生存し、転移進行がなかったあるいは前立腺癌で死亡しなかった個人を長期生存者に分類した。１２年未満の期間生存しおよび転移進行しなかった個人を短期生存者に分類した。
実施例７：前立腺癌患者の尿中のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ融合の検出
Ａ．材料および方法
尿採取、ＲＮＡ単離および増幅
尿試料は、針生検または根治的前立腺切除術の前に、直腸診後患者から採取した。尿は、ＤＮＡ／ＲＮＡ保存料を含む尿採集用のカップ（シエラダイアグノスティック社）への排尿により採取した。ＲＮＡの単離には、少なくとも３０ｍＬの尿を４℃で１５分間４００ｒｐｍで遠心分離した。ＲＮＡｌａｔｅｒ（アンビオン）を尿沈渣に添加し、ＲＮＡが単離するまで、−２０℃で保存した。全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮイージーマイクロキットを製造業者の使用説明書に従って使用して単離した。全ＲＮＡを、オムニプレックス全トランスクリトーム増幅（ＷＴＡ）キット（ルビコンゲノムス社）を製造業者の使用説明書に従って（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ８：１５３［２００６］）用いて増幅した。２５ｎｇの全ＲＮＡをＷＴＡライブラリ合成に用い、ｃＤＮＡライブラリについてＷＴＡＰＣＲ増幅を１回行った。増幅産物をキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。概念実験の細胞株証明として、記載数のＶＣａＰまたはＬＮＣａＰ細胞を１ｍＬの滅菌尿中に添加し、これらの試料を排尿採取尿として処理した。
定量ＰＣＲ
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、基本的に記載（上記既出のＴｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ８：１５３［２００６］、Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４［２００５］、および実施例１）に基づき、ＷＴＡ増幅ｃＤＮＡ由来のＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写物を検出するのに用いた。各ＱＰＣＲ反応について、１０ｎｇのＷＴＡ増幅ｃＤＮＡを鋳型として用いた。ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＰＳＡ、およびＧＡＰＤＨの反応には、２倍濃度のパワーＳＹＢＲグリーンマスターミックス（アプライドバイオシステム社）、および２５ｎｇの順方向および逆方向プライマーを用いた。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａの反応には、２ｘタックマンユニバーサルＰＣＲマスターミックスおよび最終濃度９００ｎＭの順方向および逆方向プライマー、および２５０ｎＭのプローブを用いた。タックマンアッセイでは、３８サイクルを超えるＣｔ値を有する試料は、増幅を示さないと考えた。すべての試料について、ＥＲＧとＥＴＶ１の量は、ＧＡＰＤＨの量に基準化した。尿中の前立腺細胞の乏しい回復を示すＰＳＡの不適切な増幅の試料は、さらなる解析から排除した。ＥＲＧ（エクソン５_６順方向）とＥＴＶ１（エクソン６_７）２、ＧＡＰＤＨ３、およびＰＳＡ４プライマーは記載のとおりである。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａに対して特異的なタックマンプライマーおよびプローブ（ＭＧＢ標識）は、以下のとおりである。すなわち、
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である。
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
整合する針生検から得た、厚さ４μｍのホルマリン固定パラフィン包理（ＦＦＰＥ）切片を間期蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に用い、既述のように（実施例２およびＴｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：３３９６［２００６］）、処理およびハイブリッド形成した。ＥＲＧ再配列検出用のＢＡＣプローブである、ＲＰ１１-９５Ｉ２１（ＥＲＧに対して５´側）およびＲＰ１１-４７６Ｄ１７（ＥＲＧに対して３´側）を既述のように調製した（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：３３９６［２００６］；Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４［２００５］；上記の例１および２）。
Ｂ．結果
本実施例では、直腸診後の尿に排泄された前立腺癌細胞内のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ融合転写物の存在により前立腺癌を検出する非侵襲性方法について記載する。結果を図３３に示す。概念の証拠として、高レベルのＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ（ＶＣａＰ）または高レベルのＥＴＶ１（ＬＮＣａＰ）を発現する前立腺癌細胞株を添加した滅菌尿を用いた。図３３Ａに示すように、１，６００細胞でＶＣａＰ中に排他的に過剰発現したＥＲＧと１６，０００細胞でＬＮＣａＰ中に排他的に過剰発現したＥＴＶ１を定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により検出することができる。
添加したＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞の数をＧＡＰＤＨ Ｃｔ（閾値サイクル）値に相関させることにより、いくつかの症例では、直腸診後に患者から採取した尿は、ＥＲＧまたはＥＴＶ１過剰発現を確実に検出するには不十分な細胞数を含有していたことが観察された。従って、前立腺癌の疑いのある患者の尿から採取した全ＲＮＡを、ＱＰＣＲ解析の前にオムニプレックス全トランスクリトーム増幅（ＯｍｎｉＰｌｅｘ Ｗｈｏｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により増幅した。この手法を利用して、前立腺癌を検出するために直腸診後で針生検前に尿を採取した、１６名の患者のコホートを評価した。続いて行った針生検の評価は、このコホートでは、４名の患者が良性前立腺を有し、１名は高悪性度前立腺上皮内腫瘍（ＨＧＰＩＮ）を有し、そして１１名が前立腺癌を有していたことを実証した。さらにまた、直腸診後で根治的前立腺切除術前に尿を採取した、３名の前立腺患者のコホートを評価した。
コホートの特徴を表１２に示す。各尿試料は、固有の患者から得たものであり、認識番号を有する。試料入手源（生検前または根治的前立腺切除術（ＲＰ））を示している。針生検後の診断（良性、高悪性度前立腺上皮内腫瘍（ＨＧＰＩＮ）、および前立腺癌（ＰＣａ）等）を示している。針生検後に前立腺癌と診断された患者については、優勢型グリーソン、従属型グリーソン、およびグリーソン合計スコアを示している。すべての患者について、可能なものについては生検前ＰＳＡ（ｎｇ/ｍＬ）および年齢を報告している。
（表１２）
Figure 0005529732
前記針生検コホートから、５名の患者がＥＲＧの著しい過剰発現を有することが確認され、そのうち１名は針生検でＨＧＰＩＮを有すると診断され、その他の４名は前立腺癌を有すると診断された。前記根治的前立腺切除術コホートからは、前立腺癌を有する３名のうち１名の患者は、高ＥＲＧ発現を有することが確認された（図３３Ｂ）。ＥＴＶ１過剰発現は、いずれのコホートの患者からも検出されなかった。ＥＲＧを過剰発現した試料中のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧの発現を確認するため、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａを特異的に増幅するように設計されたタックマンプライマー／プローブアッセイを利用した。このアッセイは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａを発現するＶＣａＰ細胞からの産物を強力に増幅する（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４［２００５］）。さらにまた、ＥＲＧを過剰発現した前立腺癌を有する患者由来の尿試料の６つのうち５つがＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧa（Ｃｔ値：２９．８-３８．９）も発現したのに対し、ＥＲＧ過剰発現なしの患者の１０試料のうち、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａを発現したものは無かった。１つの試料はＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａの発現なくＥＲＧを過剰発現したので、この試料は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂまたはより最近同定された融合転写物（Ｓｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ４５：７１７［２００６］；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ８：４６５：２００６）等の融合転写物のその他のアイソフォームを発現しているようである。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合転写物の存在がＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ陽性癌性組織の存在を示すことを確認するため、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、代表的な症例より得た整合した組織切片上でＥＲＧ配列を検出するように設計されたプローブを用いて実施した。整合した組織は、検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写物を尿中に有し癌と診断された３名の患者から得たものであり、１名は検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写物を尿中に含有し、高悪性度のＰＩＮと診断され、そして２名の患者は検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写物を持たず癌と診断されている。図３３Ｂに示すように、癌と診断されたが検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写物を自身の尿に含有しない患者の両名は、ＦＩＳＨでは癌性組織中のＥＲＧ再配列を有さなかった。癌と診断されかつ検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写物を自身の尿中に含有する３名の患者はすべて、癌性組織中のＥＲＧ再配列もＦＩＳＨにより示した。最後に、高悪性度ＰＩＮと診断され、検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧを自身の尿に有する患者は、高悪性度ＰＩＮ組織中にＥＲＧ再配列を示さなかった。このことは、この患者が前立腺のどこかに未診断の癌を有しているかもしれず、このためこれらの尿中に検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写物が存在することになったことを示している。
実施例８：前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳファミリー遺伝子の融合
本検討では、臨床的に局在化した前立腺癌を手術により治療したアメリカ人男性１１１名からなるスクリーニングベースのコホートにおける、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳファミリー遺伝子の再配列の頻度に関する包括的な解析について述べる。
Ａ．材料および方法
治験対象母集団、臨床的データ、および前立腺試料の収集
臨床的に局在化した前立腺癌の源として、癌を示す組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）含有コアおよび良性組織を、米国ミシガン大学で初期単独治療（すなわち、アジュバントまたはネオアジュバントの無いホルモンまたは放射線療法）として根治的前立腺切除術を受けた１１１名の男性から構築した。根治的前立腺切除術系列は、米国ミシガン大学前立腺癌専門優良研究プログラム（ＳＰＯＲＥ）組織コアの一部である。ＴＭＡを構築するため、３つのコア（直径０．６ｍｍの）を各代表組織ブロックから取り出した。ＴＭＡ構築プロトコルについては、文献（Ｋｏｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８４４［１９９８］；Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２６：３１２［２００２］）に記載されている。詳細な臨床的、病理学的、およびＴＭＡデータは、既述の確実な関連データベースに保存されている（Ｍａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：８３７［２００１］）。
間期蛍光インサイツハイブリッド形成アッセイを利用したＴＭＰＲＳＳ２-ＥＴＳ遺伝子融合の評価
厚さ４μｍの組織マイクロアレイ切片を、間期蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に用い、既述のように処理およびハイブリッド形成した（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４［２００５］；Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：３３９６［２００６］）。スライドをＡｘｉｏｐｌａｎイメージングＺ１顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察し、Ｍｅｔａｆｅｒイメージ解析システム（メタシステム社、独国Ａｌｔｌｕｓｓｈｅｉｍ）でＩＳＩＳソフトウェアシステムを利用し、ＣＣＤカメラで撮像した。形態学的に無傷のおよび非オーバーラップ核の状態で、ＦＩＳＨシグナルを病理学者により手作業で評価し（１００ｘ油浸）、１つ症例からの３つのコアにある少なくとも３０細胞または最大数の癌細胞を記録した。３０個の評価可能な細胞のない症例は、不十分なハイブリッド形成として報告した。すべてのＢＡＣは、ＢＡＣＰＡＣリサーチセンター（米国カリフォルニア州オークランド）から入手し、プローブ位置は、正常な末梢リンパ球の分裂中期スプレッドとのハイブリッド形成により検証した。ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、およびＥＴＶ４再配列の検出については、以下のプローブを用いた。すなわち、ＲＰ１１-３５Ｃ４（ＴＭＰＲＳＳ２に対して５´側）、およびＲＰ１１-１２０Ｃ１７（ＴＭＰＲＳＳ２に対して３´側）、ＲＰ１１-９５Ｉ２１（ＥＲＧに対して５´側）、およびＲＰ１１-４７６Ｄ１７（ＥＲＧに対して３´側）、およびＲＰ１１-１００Ｅ５（ＥＴＶ４に対して５´側）、およびＲＰ１１-４３６Ｊ４（ＥＴＶ４に対して３´側）。ＴＭＰＳＳ２-ＥＴＶ１融合の検出については、ＲＰ１１-３５Ｃ４（ＴＭＰＲＳＳ２に対して５´側）をＲＰ１１-１２４Ｌ２２（ＥＴＶ１に対して３´側）と共に用いた。ＢＡＣ ＤＮＡをＱＩＡフィルターマキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、米国カリフォルニア州ヴァレンシア）を用いて単離し、プローブをジゴキシゲニン-またはビオチンニックトランスレーションミックス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、米国インディアナ州インディアナポリス）を用いて合成した。ジゴキシゲニンおよびビオチン標識されたプローブを、フルオレセイン結合ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）、およびＡｌｅｘａ５９４結合ストレプトアビジン（インビトロジェン社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）をそれぞれ用いて検出した。
分断（ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ４）または融合（ＴＭＰＲＳＳ２-ＥＴＶ１）プローブ手法を染色体レベルでの再配列を検出するために用いた。ＤＡＰＩ染色核におけるＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、およびＥＴＶ４についての正常なシグナルを、２対の共存した緑および赤のシグナルにより示した。これらのプローブについて、再配列を、この２つの共存したシグナルの１つを分離することで確認した。ＴＭＰＲＳＳ２-ＥＴＶ１融合については、２対の赤と緑の分離シグナルを正常値として記録し、１対の分離シグナルと１対の共存したシグナルを再配列として記録した。
Ｂ．結果と考察
本例では、臨床的に局在化した前立腺癌を外科的に処置したアメリカ人男性の大きなスクリーニングベースのコホートにおけるＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳ転写因子遺伝子再配列のシグネチャーの概要を描く包括的な解析について説明する。ＴＭＰＲＳＳ２スプリットプローブＦＩＳＨ分析アプローチを、図３４に示すように、既知のＥＴＳファミリーパートナーであるＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４とその他の未知のパートナーを有する前立腺癌における遺伝子再配列の全体的な頻度を検出するのに用いた。３つの既知のＥＴＳパートナー（ＥＲＧ、ＥＴＶ１、およびＥＴＶ４）に対して陰性である前立腺癌は、その他のＥＴＳファミリーメンバーに関わる再配列を有している可能性があると仮定した。これらの結果は、臨床的に局在化した前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳとＥＴＳファミリー遺伝子再配列が、複合分子シグネチャーを示した（図３５ＡおよびＢ）。全体的なＴＭＰＲＳＳ２が評価可能な症例の６５％で再配列したのに対し、ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４が評価可能な症例の５５％、２％および２％で再配列した（図３５Ａ）。ＴＭＰＲＳＳ２再配列を有する症例の４０．５％において、３´プローブの損失が観測され、これは遺伝子融合の機構としてのＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間の染色体欠失と一致している。これらの結果は、前立腺癌における高頻度のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ融合を確認し、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧが極めて共通の型であることを示す過去の研究を立証している（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４；Ｐｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：３３９６［２００６］；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ８：４６６５［２００６］；Ｓｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ４５：７１７［２００６］；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：８３４７［２００６］および上述の例）。
同様の結果は、すべての４つのプローブが評価可能であったこれらの症例のみに（図３５ＡおよびＢ）コホートが限られる場合に、観測された。いずれの症例も複数のＥＴＳファミリーメンバーの再配列を示さなかったので、本解析でＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ再配列が相互排他的であることが確認された。ＥＲＧ、ＥＴＶ１またはＥＴＶ４再配列を有する２４症例のうち２３症例がＴＭＰＲＳＳ２アッセイにより検出されたので、本解析が単一のＴＭＰＲＳＳ２アッセイがほぼすべてのＥＴＳ再配列を効果的に検出できることも実証した。５´ＥＲＧプローブが消失したすべての９つの症例において、３´ＴＭＰＲＳＳ２プローブの欠失が同定された。
さらにまた、ＴＭＰＲＳＳ２プローブの分断により２つの事例が同定され、これは、ＥＲＧ、ＥＴＶ１またはＥＴＶ４の再配列を伴わない再配列（症例３２および３６）、ならびにＴＭＰＲＳＳ２再配列を有するがＥＲＧ再配列を有さず、ＥＴＶ１および／またはＥＴＶ４が評価できなかった事例を示した。これらの事例は、前立腺において、ＴＭＰＲＳＳ２が、新規ＥＴＳファミリーメンバーまたは関係のない癌遺伝子と対を作ることを示している。これらのことから、これらの結果は、単一のＴＭＰＲＳＳ２アッセイが前立腺癌における診断および予後の情報を与えることができることを示唆している。
実施例９：ＰＳＡ遺伝子融合
ＦＩＳＨ実験を、ＰＳＡに対し５´および３´に位置するプローブについて分断シグナルを示す事例をＦＩＳＨにより同定するために用いた。ＰＳＡスプリットを検出するのに用いた５´および３´ ＢＡＣはそれぞれＲＰ１１-５１０Ｉ１６およびＲＰ１１-２６Ｐ１４である。ＰＳＡ遺伝子融合についてのパートナーはいまだ同定されていない。これらの同じプローブは、ＰＳＡのごく近傍に位置しているため、ＥＴＳファミリーメンバーＳＰＩＢ内のスプリットもとらえる。
実施例１０：ＦＬＩ１過剰発現
ＦＬＩ１発現を、ＦＬＩ１遺伝子融合を有していない異なる細胞試料で評価した。ＦＬＩ１の５´および３´エクソン発現を高ＦＬＩ１発現を有する症例から測定した。結果を図１８に示す。５´および３´転写物の存在量に差異は検出されなかった。ＲＡＣＥでも融合転写物を示さなかった。ＦＬＩ１は、対照試料と比較して前立腺癌において過剰発現された。Ｆｌｉ１増幅のためのプライマーを、タックマンプローブとともに図３７に示す。
ＦＩＳＨを、再配列を示すＦＬＩ１についての分断シグナルを有する試料を同定するのに用いたが、これらの症例は、ＦＩＳＨによるＴＭＰＲＳＳ２：ＦＬＩ１融合を有していない。ＢＡＣプローブを表１３に示す。これらの症例は、高ＦＬＩ１発現も有する。
実施例１１：組織マイクロアレイ
組織マイクロアレイを遺伝子融合の存在についての分析に使用した。用いたＴＭＡは、前立腺癌進行アレイ，前立腺癌予後評価アレイ、温式生検アレイ，前立腺癌スクリーニングアレイ、Ｅｒｇ陰性前立腺癌アレイ、および個々の前立腺癌の症例である。以下の遺伝子プローブを組織マイクロアレイ上で使用した。すなわち、ＴＭＰＲＳＳ２-ＥＴＶ１融合プローブ、Ｅｒｇスプリットプローブ、ＴＭＰＲＳＳ２スプリットプローブ、ＥＴＶ１スプリットプローブ、ＥＴＶ４スプリットプローブ、およびＦＬ１スプリットプローブを使用した。
さらにまた、Ｅｒｇスプリットプローブを予後評価アレイ上に用いた。これらの結果は以下のとおりである。すなわち、陰性の症例：３０、陽性の症例：２９、境界の症例：１。Ｅｒｇ陽性の症例の比較的高いグリーソンスコア（≧７）との関連は低かった。
タンパク質アレイおよび質量分析をＥＲＧ２についての核相互作用因子を同定するのに使用した。これらの結果を図２１に示す。
実施例１２：Ｅｒｇ発現のアンドロゲン制御
本実施例では、ＥＲＧ発現のアンドロゲン制御について述べる。ＬＮＣａｐ（ＴＭＰＲＳＳ２-ＥＲＧ-）、およびＶＣａＰ（ＴＭＰＲＳＳ２-ＥＲＧ＋）細胞株を用いた。これらの細胞を異なる量のＲ１８８１と４８時間接触させた。Ｅｒｇ、ＰＳＡ（陽性対照）、およびβ-チューブリン（陰性対照）の発現を評価した。これらの結果を図１９に示す。ＥＲＧ発現は、ＶＣａＰにおいてはアンドロゲン依存であるが、ＬＮＣａｐ細胞ではアンドロゲン依存ではないことがわかった。
実施例１３：ペプチド抗体およびアクアプローブの作製
図２２〜２５は、ペプチド抗体作製およびアクアプローブの作製における使用のためのＥＲＧ１、ＥＴＶ１、ＦＬＩ-１、およびＥＴＶ４の配列（下線部）を示す。プライマーは、すべてのＥＴＳファミリーメンバー用にアプライドバイオシステム社により設計されたものである。発現を前立腺癌の症例においてモニターし、高発現は、可能な遺伝子融合の指標およびＦＩＳＨのための指標である。
実施例１４：ＬｎＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１
本実施例では、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰにおけるアンドロゲンに対する転写応答の解析について述べる。ＰＳＡ等の両細胞株で異なって発現された転写物の数を検出することに加え、ＶＣａＰまたはＬＮＣａＰ細胞において独自に調節不全な転写物の数も同定した。本解析は、ＥＴＶ１がＬＮＣａＰ細胞内でアンドロゲンに対し排他的に応答性を示すことを立証した。ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１の過剰発現と合わせて、ＦＩＳＨをＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１座位を調べるのに用いた。
Ａ．材料および方法
細胞株
前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（リンパ節前立腺癌転移由来）、およびＶＣａＰ（Ｋｏｒｅｎｃｈｕｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ １５，１６３-８（２００１））（椎骨前立腺癌転移由来）を本検討に用いた。マイクロアレイ研究については、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞を、０．１％エタノール、またはエタノールに溶解した１ｎＭの合成アンドロゲンメチルトリエノロン（Ｒ１８８１、ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社、米国マサチューセッツ州ボストン）を用いた４８時間の処理の前に、活性炭処理済血清含有培地中で２４時間増殖させた。定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）研究に関しては、細胞の増殖を、活性炭処理済血清含有培地中で２４時間、０．１％エタノール、アセトンに溶解したカソデックス（１０μＭ、ビカルタミド、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、米国デラウェア州ウィルミングトン）またはエタノールに溶解したフルタミド（１０μＭ、シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）と共に予備インキュベートして行った。２時間後、０．１％エタノールまたは０．５ｎＭのＲ１８８１を添加し、細胞を４８時間後に回収した。全ＲＮＡを、すべての試料からトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールスバッド）製造業者の使用説明書に従って用いて単離した。ＲＮＡ完全性を、変性ホルムアルデヒドゲル電気泳動またはアジレント社のバイオアナライザー２１００（アジレントテクノロジーズ社、米国カリフォルニア州パロアルト）により確認した。
マイクロアレイ解析
本検討で用いたｃＤＮＡマイクロアレイは、アレイが３２，４４８の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）を含むこと意外は、基本的に既述のように構築した。アレイのプリントおよび後処理のためのプロトコルは、インターネット上で入手できる。ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を基本的に既述のようにおこなった。要約すると、対照およびＲ１８８１で処理したＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞株由来の全ＲＮＡを逆転写し、ｃｙ５蛍光色素で標識した。対照ＶＣａＰまたはＬＮＣａＰ試料から得たプールした全ＲＮＡを逆転写し、それぞれの細胞株由来のすべてのハイブリッド形成に対してｃｙ３蛍光色素で標識した。その後、標識産物を混合し、ｃＤＮＡアレイとハイブリッド形成した。イメージを、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェアパッケージ（アクソンインスツルメンツ社、米国カリフォルニア州ユニオンシティ）を用い、フラグ付けおよび正規化した。データをアレイ単位で中央値を中心にし、試料の少なくとも８０％に存在する発現値を有した遺伝子のみを本解析に用いた。
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
ＱＰＣＲを、文献（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６、３３９６-４００（２００６）；Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０、６４４-８（２００５））に記載のように、アプライドバイオシステム社 ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム社、米国カリフォルニア州フォスターシティ）でＳＹＢＲグリーンの色素を用いておこなった。各試料のハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対する各標的遺伝子の量を報告した。各細胞株および／または実験における標的遺伝子の相対量は、対照に対し較正した。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社（米国アイオワ州コーラルビル）により合成されたものである。ＧＡＰＤＨ（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ３，ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４（２００２））、ＰＳＡ（Ｓｐｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５８、４１９-２９（２００１））、ＥＲＧ（エクソン５-６_ｆおよびエクソン５-６_ｒ）およびＥＴＶ１（エクソン６-７_ｆおよびエクソン６-７_ｒ）、プライマー（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０、６４４-８（２００５））は、記載のとおりである。
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
分裂中期スプレッドを、標準的な手法により、正常な末梢リンパ球（ＮＰＬｓ）およびＬＮＣａＰ細胞から調製した。スライドを、２倍濃度のＳＳＣで２分間、７０％エタノールで２分間、そしてプローブの添加前に１００％エタノールで２分間処理した。スライドを、カバースリップでカバーし、７５℃で２分間インキュベートし、そして一晩３７℃でハイブリッド形成した。ハイブリッド形成後の洗浄を２倍濃度のＳＳＣで４２℃にて５分間行い、その後ＰＢＳＴ中で３回洗浄した。蛍光検出を、フルオレセインに結合した抗ジゴキシゲニン（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、米国インディアナ州インディアナポリス）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４に結合したストレプトアビジン（インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールスバド）を用いて実施した。スライドを対比染色し、ＤＡＰＩ含有ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（インビトロジェン社）中においた。スライドをツァイスＡｘｉｏ ＩｍａｇｅｒＺ１蛍光顕微鏡（ツァイス社、米国ニューヨーク州ソーンウッド）を用いて観察し、ＩＳＩＳソフトウェア（Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ社、独国Ａｌｔｌｕｓｓｈｅｉｍ）を用いてＣＣＤカメラで撮像した。
いずれのＢＡＣもＢＡＣＰＡＣリサーチセンター（米国カリフォルニア州オークランド）より入手したものであり、プローブ位置を正常な末梢リンパ球の分裂中期スプレッドとのハイブリッド形成により確認した。７番染色体ｐ上のＥＴＶ１領域とのハイブリッド形成のために、４つのＢＡＣ（テロメアからセントロメア）、すなわちＲＰ１１-１２４Ｌ２２、ＲＰ１１-３１３Ｃ２０、ＲＰ１１-７０３Ａ４、およびＲＰ１１-１１４９Ｊ１３を用いた。１４番染色体ｑに対する局在化については、ＦＩＳＨによりＢＡＣ ＲＰ１１-４８３Ｋ１３をマッピングし、またこれが１４ｑとハイブリッド形成することも、本発明者らはＮＰＬを用いて確認した。ＢＡＣ ＤＮＡをＱＩＡフィルターマキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、米国カリフォルニア州ヴァレンシア）を用いて単離し、プローブをジゴキシゲニン-またはビオチンニックトランスレーションミックス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて合成した。
Ｂ．結果
結果を図２６〜２８に示す。図２６は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるＥＴＶ１の過剰発現およびアンドロゲン制御を示す。図２６Ａは、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるアンドロゲン調節遺伝子の発現シグネチャーを示す。遺伝子のヒートマップは、媒体のみでの治療（灰色）と比較した、１ｎＭの合成アンドロゲンＲ１８８１（緑）によるいずれかの細胞株（特徴数３，４９９、ｐ＜０．０５および変化倍率>=１.５）における誘発または抑制を示す。各列は遺伝子、各列は試料を示す。黄色および青色の細胞は、カラースケールに従い、過剰または過小発現をそれぞれ示す。灰色の細胞は、欠測データを示す。各細胞株についての値は、対応する対照試料を中心に示している。ヒートマップ中でＰＳＡ、ＥＲＧ、およびＥＴＶ１の位置を示し、これらの発現を挿入図中に示している。図２６Ｂは、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）による、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞の両細胞におけるアンドロゲンによるＰＳＡ誘発を示す。ＬＮＣａＰ（赤色）、およびＶＣａＰ（青色）細胞株におけるＰＳＡ（ＧＡＰＤＨに対し正規化）の相対発現をＱＰＣＲにより決定した。細胞を、媒体または１ｎＭのＲ１８８１で４８時間、抗アンドロゲンカソデックスまたはフルタミドの存在または非存在下で記載どおりに処理した。各試料におけるＰＳＡの相対量を、各細胞株に対する対照試料中の量に対して較正した。図２６Ｃは、ＬＮＣａＰ細胞におけるアンドロゲンによるＥＴＶ１誘発を示す。Ｂと同じ試料を用いて、ＥＴＶ１の相対量をＱＰＣＲにより決定した。図２６Ｄは、ＥＴＶ１がＬＮＣａＰ細胞中で顕著に過剰発現されていることを示す。ＰＳＡ、ＥＴＶ１およびＥＲＧの相対発現を、ＱＰＣＲにより各細胞株由来の４８時間対照試料で決定した。各試料における標的遺伝子の相対量を、両細胞株由来のＰＳＡの平均量に対して較正した。ＬＮＣａＰとＶＣａＰでのＥＲＧとＥＴＶ１発現における差の倍率を示す。
図２７は、ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１の再配列を示す。図２７Ａは、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）でプローブとして使用したＢＡＣの模式図である。７ｐ２１および１４ｑ３２での位置と座標（ＥＴＶ１座位および周囲ＢＡＣを含む）を、ＵＣＳＣゲノムブラウザーを用いて２００４年５月凍結のヒトゲノムで決定した。本研究で用いたＢＡＣを番号のついた長方形で示す。ＥＴＶ１およびＤＧＫＢの位置を転写の方向を示す矢印で示す。図２７Ｂは、正常な末梢リンパ球（ＮＰＬ）における７番染色体へのＲＰ１１-１２４Ｌ２２およびＲＰ１１-１１４９Ｊ１３同時局在化を示す。分裂中期スプレッド（図中上）または間期細胞（図中下）上でのＲＰ１１-１２４Ｌ２２（ＢＡＣ＃１）およびＲＰ１１-１１４９Ｊ１３（ＢＡＣ＃４）の局在化をＮＰＬ中でＦＩＳＨにより決定した。すべての分裂中期の写真について、７番染色体上のシグナルを矢印で示し、１４番染色体上のシグナルを対応するプローブの色の矢印で示す。分裂中期スプレッドの情報領域のより高い倍率での拡大図を囲み部分に示す。図２７Ｃは、分裂中期スプレッド（図中上）上および間期細胞（図中下）でのＢＡＣ＃１およびＢＡＣ＃４の局在化が、ほぼ４倍体のＬＮＣａＰ細胞株で決定されたことを示している。７番染色体上の２つの同時に局在化したシグナル、７番染色体上の２つの赤色シグナル、および異なる染色体上の２つの緑色シグナルが観察された。図２７Ｄは、ＬＮＣａＰ細胞における、１４番染色体に局在化したＲＰ１１-１２４Ｌ２２由来のシグナルを示す。同図Ｃに示すように、ＲＰ１１-１２４Ｌ２２（ＢＡＣ＃１）以外は、ＬＮＣａＰ分裂中期スプレッド上でＲＰ１１-４８３Ｋ１３（ＢＡＣ＃５、１４番染色体ｑにＦＩＳＨマッピング）と同時にハイブリッド形成した。ＲＰ１１-４８３Ｋ１３由来の４つの赤色シグナルは１４番染色体ｑに局在し、２つの緑のシグナルは７番染色体ｐに局在し、２つの緑のシグナルは１４番染色体ｑに局在している。
図２８は、ＥＴＶ１座位全体がＬＮＣａＰ細胞内の１４番染色体に挿入されていることを示す。図２８Ａは、この実験で用いたＢＡＣの模式図である。図２８Ｂは、分裂中期スプレッド（図中上）におけるＲＰ１１-１２４Ｌ２２（ＢＡＣ＃１）および間期細胞（図中下）におけるＲＰ１１-３１３Ｃ２０（ＢＡＣ＃２）の局在化が、ＬＮＣａＰ細胞においてＦＩＳＨにより決定されたことを示している。分裂中期スプレッドでは、２対の同時局在化したシグナルは７番染色体（黄色矢印）および１４番染色体（黄色矢印）で観察された。
これらの結果は、ＥＴＶ１座位全体が７番染色体から１４番染色体に転座していることを実証している。１４番染色体上の挿入断片上流のゲノム配列が未知であっても、この領域は、ＬＮＣａＰ細胞でのみ観察される高レベルのＥＴＶ１とアンドロゲン応答性を誘発するＡＲＥをおそらく有すると思われる。これらの結果は、ＬＮＣａＰ細胞に、ヒト前立腺癌にみられるＥＴＳ遺伝子融合のインビトロモデルとしての用途があることを示唆している。
実施例１５：ＰＣＡにおけるＥＴＳファミリーメンバーのノックダウン
本実施例では、前立腺癌におけるＥＴＳファミリーメンバーのノックダウンについて述べる。ｓｉＲＮＡをＬＮＣａＰおよびＶＣＡＰにおけるＥＴＶ１およびＥＲＧの発現をノックダウンするのに用いた。定量ＰＣＲをこのノックダウンの確認に用いた。結果を図２９および３０に示す。このノックダウンは増殖に影響を与えなかった。ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを安定なノックダウンのために作製した。
ＥＲＧ発現がＶＣａＰ細胞（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合を有する）においてノックダウンされる場合にどの遺伝子が異なって発現するかを決定するために、マイクロアレイをアジレント社の４４Ｋ全ゲノムアレイ上で実施した。この実験について、３つの条件を用いた。すなわち、ＥＲＧ（ＥＲＧｓｉ）に対してＤｈａｒｍａｃｏｎ社のｓｉＲＮＡを用いたノックダウン、ルシフェラーゼ（対照）およびトランスフェクトされなかった（非形質移入）ＶＣａＰ細胞のノックダウン。ＥＲＧ／非形質移入の３つのハイブリッド形成および２つの対照／非形質移入を実施した。これらの遺伝子は、５つすべての実験に存在するとしており、標準偏差（両条件についての平均）は０．５未満であり、ＥＲＧと対照との差の倍率は＜０．７５または＞１．５を示した。ＥＲＧｄｉｆフィールドは、ＥＲＧと対照ノックダウン実験との差の倍率を示すので、１未満は遺伝子がＥＲＧノックダウンにおいて過小発現されていることを意味する（本解析においてＥＲＧ自身は８１番目に位置する）。
実施例１６：遺伝子導入マウス
本発明の遺伝子融合を過剰発現する遺伝子導入マウスのほかに、ＥＴＳとアンドロゲン応答性遺伝子も作製した。図３１は、マウス作製に用いるためのウイルス過剰発現システムである。図３２は、遺伝子導入マウスにおけるゲノム挿入断片の模式図である。このようなマウスは、研究（例えば、機構研究）および薬物スクリーニング応用における用途がある。
実施例１７：ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧaの同定
上述のように（実施例１）、ＴＭＰＲＳＳ２のＥＲＧへの融合を観察した。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ遺伝子融合からの発現タンパク質を決定するため、３ｘＦｌａｇタグを停止コドンのすぐ上流に挿入して、ＶＣａＰ前立腺癌細胞株から、エクソン４の始まりにある融合区切り点からエクソン１１内の推定の停止コドンまでのＥＲＧ（ＮＭ_００４４４９）の部分を増幅するのに、ＰＣＲを用いた。この産物をｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯＴＡ（インビトロジェン社）にＴＡクローン化し、双方向で配列決定した。配列決定は、本願明細書においてＥＲＧ１（ＥＲＧアイソフォーム１由来のエクソン６を含む
Figure 0005529732
）およびＥＲＧ２（該エクソンを含まない）と名付けている２つの異なるアイソフォームの存在を明らかにした。この産物をｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５-ＤＥＳＴデスティネーションベクターにＧａｔｅｗａｙクローン化した。このプラスミドを、ＥＲＧタンパク質産生のため、直接的にＰＨIＮＸ細胞にトランスフェクトした。
Ａ．方法
トランスフェクトアッセイ：
Ｐｈｉｎｘ細胞に、ＦｕＧｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ社）を製造業者の使用説明書に従って用いて、ＥＲＧ２または空ベクターをトランスフェクトした。直径１５０ｍｍのプレート計１０個を各コンストラクトに用いた。トランスフェクション後４８時間の時点でこれらの細胞を収集し、以下に述べる免疫沈降アッセイに用いた。
タンパク質溶解および免疫沈降：
細胞を氷冷したＰＢＳ含有プロテアーゼ阻害剤により洗浄し、１％ＮＰ４０含有ＴＢＳ中で均質化して溶解した。タンパク質を含有するこの上澄みについて、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（バイオラッドラボラトリーズ社、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を製造業者の使用説明書に従って用いて、タンパク質含有量を評価した。すべての試料からの等量のタンパク質（緩衝液１５ｍＬ中に約３０ｍｇ）を免疫沈降研究に用いた。ＥＺＶＩＥＷレッド抗ＦＬＡＧ Ｍ２親和性ゲル（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）の５０％スラリー約２００μＬを各試料に加え、４℃で一晩インキュベートした。この免疫沈降物をＴＢＳ含有０．１％ＮＰ４０およびＴＢＳのみで、３回ずつ洗浄した。結合したタンパク質を、ＦＬＡＧペプチド（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）を製造業者の使用説明に従って用い、溶出した。この溶出を３回行った。溶出物中のタンパク質を５０％ＴＣＡ（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）を用いて沈殿させた。沈降物を氷冷したアセトンで３回洗浄し、ラエミリ緩衝液に再懸濁し、４〜２０％のＢＩＳ−ＴＲＩＳゲル（インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールスバッド）上で電気泳動させた。これらのゲルを質量分析用の銀染色（シルバーケスト、インビトロジェン社、カールスバッド、米国カリフォルニア州）で染色した。ＥＲＧ２に対応するバンドおよびベクターレーン中で対応する領域を各１ｃｍの６片に切り取った。ゲル片の各一片は、ゲル上の高分子量領域から始まり移動していくバンド１〜６で標示した。それゆえバンド１は高分子量タンパク質を含む領域に対応するのに対し、バンド６は低分子量領域に対応する。ＥＲＧ２の未変性分子量（約５５ＫＤａ）に基づくと、バンド４および５を移動することになる。ＥＲＧ２配列同定を３回繰り返し、すべての実験からデータをまとめた。
タンパク質同定
ゲルバンドを採取し、製造業者の使用説明書に従い銀染色キット（インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールスバッド）に含まれる脱染溶液を用いて脱染した。ゲル中で、消化をｐＨ９の１Ｍの重炭酸アンモニウム中で、ブタ由来トリプシン（１：５０、Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ワイオミング州マジソン）を用いて行った。この消化は、３７℃で１６時間行った。２４時間後、トリプシン活性を３％ギ酸により停止した。これらのペプチドを５０％アセトニトリルを用いて抽出した。これらのペプチドを乾燥して０．１％ギ酸含有の２％アセトニトリルに懸濁し、パラダイムＨＰＬＣポンプ（Ｍｉｃｈｒｏｍｅ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社）に取り付けた０．０７５ｍｍ ｘ １５０ｍｍのＣ１８カラムを用いて、逆相クロマトグラフィにより分離した。ペプチドを、溶媒Ａを０．１％ギ酸／２％アセトニトリルとし、Ｂ（０．１％ギ酸／９５％アセトニトリル）を４５分５〜９５％の濃度勾配で用いて溶出した。フィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）ＬＴＱ質量分析計（サーモエレクトロン社）をスペクトルを得るのに用い、装置をデータ依存モードでダイナミック・エクスクルージョン（ｄｙｎａｍｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を可動状態にして操作した。フルＭＳスキャンにおける３つの最大量ペプチドイオンでのＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。これらのスペクトルを、混成の、非同一のＮＣＢＩヒト標準配列データベースに対してＭＡＳＣＯＴ検索ツールを用いて検索した。これらのデータベースの検索結果は、ペプチド帰属精度について、ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔプログラムを用いて確認した。これは混合モデルであり、検索結果スコアやトリプシン末端数等の様々なペプチドの特徴に基づいた正確なペプチド同定の確率を決める期待値最大化推定である。第２のプログラムであるＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔを、ペプチドをタンパク質によりグループ化し、これらの確率を組み合わせて正しいタンパク質帰属の確率を決めるために用いた。識別能は、これらのＮＳＰ値により、またはペプチドグループ化情報および起こりうるマルチヒットのタンパク質の状態を意味する同胞ペプチド数により、個々のペプチドの確率の２次的な再評価で増加する。
結果：
（表１４）カバレージマップ（ＥＲＧ２）
注：Ｅ＊ＢＡＮＤ＊−＊は、ＥＲＧ１実験におけるＥＲＧ２ペプチドを意味する。
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本表は、３つ異なる実験にわたって得たＥＲＧ２についてのカバレージマップを示す。下線部アミノ酸配列は、ＶＣＡＰ細胞からクローン化されたＥＲＧ１のシリコ翻訳配列に対応する。アミノ酸配列
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は、ＥＲＧ１に特異的でＥＲＧ２では欠損しているエクソンに対応している。残りのアミノ酸配列は、３つの実験の各々で同定されたＥＲＧ２配列に対応している。ＥＲＧ２をすべての実験におけるバンド１〜５で同定した。これらのバンドの各々で得たＥＲＧ２についてのペプチド配列を示す。非常に高いカバレージのＥＲＧ２タンパク質が、３つの実験にわたり観測された。このカバレージマップは、第１の５０アミノ酸残基に対応する、クローン化タンパク質のＮ末端領域におけるペプチドのカバレージが、質量分析カバレージマップにおいてほどんど観測されないことを示した。しかしながら、アミノ酸バリンで始まるペプチドＶＰＱＱＤＷＬＳＱＰ（配列番号：１９７）は極めて大量に見られ、それ故すべての実験において同定された。より詳しい評価は、４７番目の位置にあるアミノ酸がメチオニンのフレームにあることを示唆した。複数の実験における４７番目のメチオニンの上流（Ｎ終端）にあるどのようなペプチドの欠如も、それがＥＲＧ２のＮ末端アミノ酸であることを確認している。さらにまた、５０番目の位置にあるアルギニン残基の存在により、潜在的なトリプシン切断部位とした。この部位でのトリプシンによる消化は、イオン捕捉質量分析計による同定には小さすぎるより短鎖のＮ末端ペプチドＭＳＰＲや、すべての実験で同定された長鎖Ｃ末端ペプチドＶＰＱＱＤＷＬＳＱＰ（配列番号：１９８）を生じることになる。さらに、ペプチド配列ＭＩＱＴＶＰＤＰＡＡＨＩ（配列番号：１９９）も単一の実験において非常に低い確率スコアで同定された。これは、ＮＣＢＩにおいて報告されているように、ＥＲＧのＮ末端にマッピングされる。この配列は、ＶＣＡＰ細胞からクローン化された、異所的に過剰発現されたコンストラクトの一部ではなかった。これは、ＰＨＩＮＸ細胞において発現されたインビボのＥＲＧより入手できたかもしれず、したがって良性細胞に関連するＥＲＧの一部を示しているのかもしれない。
従って要約すると、この結果は、３番目のメチオニンがＴＭＰＲＳＳ２-ＥＲＧ融合産物の翻訳開始部位であることを示している。
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。第１のメチオニンは、内在性ＥＲＧの翻訳開始部位である。ＭＩＱＴＶＰＤＰＡＡＨＩ（配列番号：２０１）。図２０は、内在性および融合ポリペプチドの模式図を示す。
実施例１８：尿試料でのＦＩＳＨ解析
尿から前立腺細胞を分離および調製するため、約３０ｍＬの尿を直腸診後に採取する。この後直ちに、１５ｍＬのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔを加え、試料を５０ｍＬの遠心管中で１０分間室温で４０００ｒｐｍにて遠心分離する。上澄みを廃棄し、沈渣を１５ｍＬの０．７５ＭのＫＣｌ中に１５分間室温で再懸濁し、５０ｍＬの遠心管中で１０分間室温で４０００ｒｐｍにて遠心分離する。上澄みを廃棄し、沈渣を１０ｍＬの３：１比メタノール：氷酢酸中に再懸濁する。この後、４０００ｒｐｍで８分間遠心する。上澄みを２００μＬを除き廃棄し、ペレットを再懸濁する。続いてこの再懸濁したペレットをガラススライドに滴下し、風乾する。ハイブリッド形成およびプローブ調製を上記の実施例２のように、ＥＲＧ５´／３´およびＴＭＰＲＳＳ５´／３´プローブ対で行う。
実施例１９：さらなるＥＴＶ１遺伝子融合
Ａ．材料および方法
試料および細胞株
前立腺組織は、共に米国ミシガン大学前立腺癌専門優良研究プログラム（ＳＰＯＲＥ）組織コアの一部である、米国ミシガン大学の根治的前立腺切除術系列および迅速剖検プログラム１から得たものである。すべての試料を、患者らのインフォームドコンセントおよび事前の研究所審査委員の承認を得て採取した。
良性不死化前立腺細胞株ＲＷＰＥおよび前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、Ｄｕｌ４５ＮＣＩ−Ｈ６６０およびＰＣ３は、ＡＴＣＣから入手したものである。原発性良性前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）は、カムブレックス・バイオサイエンス社（米国メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）より入手した。前立腺癌細胞株Ｃ４-２Ｂ、ＬＡＰＣ４およびＭＤＡ-ＰＣａ２Ｂは、Ｅｖａｎ Ｋｅｌｌｅｒ（米国ミシガン大学）により提供された。前立腺癌細胞株２２-ＲＶ１は、Ｊｉｌｌ ＭｃＫｏｓｋａ（米国ミシガン大学）により提供された。ＶＣａＰは、ホルモン-抵抗性転移性前立腺癌を有する患者由来の椎骨転移から誘導した（Ｋｏｒｅｎｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｖｏ １５、１６３-８（２００１））。
アンドロゲン刺激実験のため、ＬＮＣａＰ細胞を、１％エタノール、またはエタノールに溶解した１ｎＭのメチルトリエノロン（Ｒｌ８８１、ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社、米国マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）を用いた２４時間の処置の前に、活性炭処理済血清含有培地中で２４時間増殖させた。すべての試料について、トリゾール（インビトロジェン社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を製造業者の使用説明書に従って用い、全ＲＮＡを単離した。
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、パワーＳＹＢＲグリーンのマスターミックス（アプライドバイオシステム社、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）をアプライドバイオシステム社の７３００リアルタイムＰＣＲシステム上で、文献（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６， ３３９６−４００ （２００６）； Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ＴＭＰＲＳＳ２ ａｎｄ ＥＴＳ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０， ６４４−８ （２００５））に記載のように用いて行った。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社（米国アイオワ州コーラルビル）により合成されたものであり、表１５に列挙されている。ＨＭＢＳおよびＧＡＰＤＨ５、およびＰＳＡ６プライマーは記載のとおりである。アンドロゲン刺激反応を４回行い、その他すべての反応を２回行った。
ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅（ＲＬＭ-ＲＡＣＥ）
ＲＬＭ-ＲＡＣＥを、既述のように（上記Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；上記Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）、製造業者の使用説明書に従ってジーン・レーサーＲＬＭ-ＲＡＣＥキット（インビトロジェン社）を用いて行った。ＥＴＶ１の５´末端を得るため、第１の鎖のｃＤＮＡを、ジーン・レーサー ５´プライマーおよびＥＴＶ１_エクソン４-５-ｒを用いて、プラチナＴａｑハイフィデリティ（インビトロジェン社）で増幅した。産物をクローン化し、文献（上記Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；上記Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）に記載のように双方向で配列決定した。ＲＬＭ-ＲＡＣＥｄｃＤＮＡは、その他のアッセイに使用しなかった。
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ホルマリン固定したパラフィン包理（ＦＦＰＥ）組織切片に対する間期ＦＩＳＨを、文献（上記Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）に記載のように行った。１アッセイにつき少なくとも５０の核を評価した。ＬＮＣａＰおよびＭＤＡ-ＰＣａ２Ｂの分裂中期スプレッドを、標準的な細胞遺伝学的手法により調製した。スライドを２倍濃度のＳＳＣ中で２分間、７０％エタノールで２分間、そして１００％エタノールで２分間前処理し、風乾した。スライドおよびプローブを同時に７５℃で２分間変性し、一晩３７℃でハイブリッド形成した。ハイブリッド形成後、０．５倍濃度のＳＳＣ中４２℃で５分間、続いてＰＢＳＴ中で３回洗浄した。蛍光検出を、フルオレセインについては抗ジゴキシゲニン抱合体（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、米国インディアナ州インディアナポリス）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４（インビトロジェン社）についてはストレプトアビジンコンジュゲートを用いて行った。スライドを対比染色し、ＤＡＰＩ含有ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（インビトロジェン社）中においた。スライドをツァイス社のＡｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ１蛍光顕微鏡（ツァイス、米国ニューヨーク州ソーンウッド）で観察し、ＩＳＩＳソフトウェア（メタシステム社、独国Ａｌｔｌｕｓｓｈｅｉｍ）を利用しＣＣＤカメラで撮像した。ＢＡＣ（表１６に記載）はＢＡＣＰＡＣリサーチセンター（米国カリフォルニア州オークランド）から入手したものであり、プローブは文献（上記Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）に記載のように調製した。予め標識された７番染色体セントロメアおよび７ｐテロメアプローブはＶｙｓｉｓ社（米国イリノイ州デスプレーンズ）から入手したものである。すべてのプローブについて、完全性および正確な局在化を正常な末梢リンパ球の分裂中期スプレッドとのハイブリッド形成により確認した。
組織特異的発現
１４ｑｌ３〜ｑ２１における５´融合パートナーと遺伝子の組織特異的発現を決定するため、２９の異なる種類の６３０の腫瘍から得た発現プロファイルからなる、国際ゲノムコンソーシアムのｅｘｐＯデータセットをＯｎｃｏｍｉｎｅデータベースを利用して用いた。市販のアレイプラットフォームではモニターされない、ＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑ１１．２３の発現を調べるため、Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社の正常組織ＭＰＳＳ（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）データセット（ＧＳＥ１７４７）に対するクエリーを、文献（Ｓｔａｕｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ ４、２（２００４））に記載のように、ＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑｌ１．２３を明確に同定するＭＰＳＳタグ「ＧＡＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴＡＣＴ」（配列番号：３０８）を用いて行った。ｅｘｐＯデータセットより得た腫瘍型の記述およびＭＰＳＳデータセットより得た正常な組織型を表１７に示す。
発現のプロファイリング
ＬＮＣａＰ、Ｃ４-２Ｂ、ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１およびＲＷＰＥ-ＧＵＳ細胞の発現プロファイリングをアジレント社の全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ（米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）を利用しておこなった。トリゾールを用いて単離した全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮＡｅａｓｙマイクロキット（米国カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。１μｇの全ＲＮＡをｃＲＮＡに転換し、製造業者のプロトコル（アジレント社）に従って標識した。ハイブリッド形成を６５℃で１６時間行い、およびアレイをアジレント社ＤＮＡマイクロアレイスキャナーでスキャンした。画像を解析し、線形およびＬｏｗｅｓｓ正規化を各アレイに対して実施して、データをアジレント社の特性抽出ソフト９．１．３．１を利用して抽出した。ＬＮＣａＰおよびＣ４-２Ｂハイブリッド形成については、各細胞株に対する標準をプール良性前立腺全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）とした。各細胞株についてダイフリップもおこなった。特性を色素フリップの補正後の２つＣ４-２Ｂアレイにおける平均発現で割った２つＬＮＣａＰアレイにおける平均発現（対数比）で順位付けした。ＲＷＰＥ細胞については、４つのハイブリッド形成を行った（複製ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１／ＲＷＰＥ-ＧＵＳおよびＲＷＰＥ-ＧＵＳ／ＲＷＰＥ-ＥＴＶｌハイブリッド形成）。過剰および過小発現したシグネチャーを、すべての４つのハイブリッド形成で顕著な異なる発現差異（Ｐ値対数比＜０．０１）と、ダイフリップに対する補正後に２倍平均過剰または過小発現（対数比）を有する特性のみを含むようにフィルタリングして作製した。
サザンハイブリッド法
ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、プールした正常なヒト雄ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ウィスコンシン州マディソン）、および正常な胎盤ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）由来のゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を、ＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）で一晩消化した。断片を０．８％アガロースゲル上４０Ｖで一晩分離し、ハイボンドＮＸナイロン膜に移し、予備ハイブリッド形成して、プローブとハイブリッド形成し、標準的なプロトコルに従って洗浄した。ＦＩＳＨにより関連付けられたｃｈｒ７の領域にまたがる一連の２２プローブ（ＲＰ１１-３１３Ｃ２０とＲＰ１１-７０３Ａ４との間）を、プールした正常なヒト雄ゲノムＤＮＡ（表１５）上でプラチナＴａｑハイフィデリティを用いてＰＣＲ増幅により作製した。各プローブ２５ｎｇをｄＣＴＰ-Ｐ３２で標識し、ハイブリッド形成に用いた。
逆ＰＣＲ
ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１区切り点を同定するため、サザンブロット法により同定した再配列に基づく逆ＰＣＲ法を用いた。野生型の配列由来の逆相補配列であり、プライマーＢ１、Ｂ２、Ｂ３と異なる、プライマーＡ１、Ａ２、Ａ３を、ＰｓｔＩで消化および再連結した（分子内結合を促進するため）ＬＮＣａＰゲノムＤＮＡ鋳型に対する逆ＰＣＲに用いた。ネステッドＰＣＲを、以下のプライマー組の順で実施した。すなわち、Ａ１-Ｂ１、Ａ２-Ｂ２、およびＡ３-Ｂ３。エキスパンド２０ｋｂＰＬＵＳ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ社、独国マンハイム）を、製造業者の指示にしたがい、融合産物の増幅に用いた。このネステッドＰＣＲで観測された濃縮３ＫｂバンドをｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にクローン化し、ミニプレップＤＮＡを挿入断片についてスクリーニングし、陽性クローンを配列決定した（ミシガン大学ＤＮＡ配列決定コア、米国ミシガン州アンアーバー）。その後、融合特異性プライマーを用いたプラチナＴａｑハイフィデリティにより、融合をＰＣＲにより確認した（表１５）。
ＥＴＶ１のインビトロ過剰発現
ＥＴＶ１の既報の停止コドンに対するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合（２６９-１５２１、ＮＭ_００４９５６．３）に存在する、ＥＴＶ１のｃＤＮＡをＭＥＴ２６４からＲＴ−ＰＣＲで増幅して、ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にＴＯＰＯクローン化し、ｐＣＲ８-ＥＴＶ１を得た。アデノウイルスおよびレンチウイルスのコンストラクトを作製するため、ｐＣＲ８-ＥＴＶ１および対照エントリークローン（ｐＥＮＴＲ-ＧＵＳ）をそれぞれｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５（インビトロジェン社）とｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ／Ｖ５（インビトロジェン社）と、ＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社）を用いて組み換えた。対照ｐＡＤ／ＣＭＶ／ＬＡＣＺクローンをインビトロジェン社から入手した。アデノウイルスおよびレンチウイルスは、米国ミシガン大学ベクターコアにより作製されたものである。この良性不死化前立腺細胞株ＲＷＰＥをＥＴＶ１またはＧＵＳを発現するレンチウイルスに感染させ、安定なクローンをブラストサイジン（インビトロジェン社）を用いた選択により作製した。初代ＰｒＥＣ細胞では安定な培養細胞を作製できないので、良性ＰｒＥＣをＥＴＶ１またはＬＡＣＺを発現するアデノウイルスに感染させた。細胞数を、細胞のトリプシン処理および記載の時点で３回コールターカウンターで分析することで概算した。侵襲アッセイについては、同数のＰＲＥＣ‐ＥＴＶ１および-ＬＡＣＺ（感染後４８時間）または安定なＲＰＷＥ-ＥＴＶ１および-ＧＵＳ細胞を、化学誘引物質として下側チャンバーにはウシ胎児血清を加えた、２４ウェル培養プレートのインサート内にある基底膜マトリックス（ＥＣマトリックス、ケミコン社、米国カリフォルニア州テメクラ）上に播種した。４８時間後、非侵襲性細胞およびＥＣマトリックスを綿棒で除去した。感染細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真撮像した。これらのインサートを１０％酢酸で処理し、吸収を５６０ｎｍで測定した。
ＥＴＶ１ノックダウン
ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１のｓｉＲＮＡノックダウンについて、ダーマコン社のＥＴＶ１用ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（ＭＵ-００３８０１-０１、米国イリノイ州シカゴ）を構成する個々のｓｉＲＮＡを、ｑＰＣＲによりＥＴＶ１ノックダウンについて試験し、最も効果的な１本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｄ-００３８０１-０５）をさらなる実験に用いた。ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非標的ｓｉＲＮＡ＃１（Ｄ-００１２１０-０１）またはＥＴＶ１に対するｓｉＲＮＡを、オリゴフェクタミン（インビトロジェン社）を用いてＬＮＣａＰ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、２回目の同一トランスフェクションを実行し、２４時間後に以下に記載するようなＲＮＡおよび侵襲アッセイのために細胞を回収した。ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１のｓｈＲＮＡノックダウンについては、ｐＭＳ２レトロウイルスベクター由来のＥＴＶ１に対するｓｈＲＮＡｍｉｒコンストラクト（Ｖ２ＨＳ_６１９２９、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国アラバマ州ハンツビル）を、製造業者のプロトコルに従ってｐＧＩＰＺレンチウイルス空ベクター（ＲＨＳ４３４９、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にクローン化した。ＥＴＶ１のｓｈＲＮＡｍｉｒを有するｐＧＩＰＺレンチウイルスまたは非発現抑制対照（ＲＨＳ４３４６）は、米国ミシガン大学ベクターコアにより作製されたものである。ＬＮＣａＰ細胞をレンチウイルスに感染させ、４８時間後に細胞を以下に述べるように侵襲アッセイに用いた。６つの独立した実験の代表的な結果を示す。
侵襲アッセイ
同じ数の記載の細胞を、ウシ胎児血清を化学誘引物質として下側のチャンバーに添加した２４ウェル培養プレートのインサート内にある基底膜マトリックス（ＥＣマトリックス、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国カリフォルニア州テメクラ）上に播種した。４８時間後、非侵襲細胞およびＥＣマトリックスを綿棒で除去した。感染細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真撮像した。これらのインサートを１０％酢酸で処理し、吸収を５６０ｎｍで測定した。
ＦＡＣＳ細胞周期分析
ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１およびＲＷＰＥ-ＧＵＳ細胞を、細胞周期特性決定についてＦＡＣＳで評価した。細胞を２倍濃度のＰＢＳで洗浄し、およそ２ｘ１０６細胞を７０％エタノール中に固定する前にＰＢＳ中に再懸濁した。沈渣の細胞を洗浄し、ＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍＬ最終濃度）およびヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍＬ最終濃度）で３０分間３７℃で処理した。染色細胞をＦＡＣＳＤｉｖｉａを利用してＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州サンノゼ）で分析し、および細胞周期の段階をＭｏｄＦｉｔ ＬＴ（ベリティソフトウェアハウス社、米国メーン州トプシャム）を用いて計算した。
軟寒天アッセイ
正常培地の低融点アガロースの０．６％（質量／体積）の下層を、６ウェル培養プレート中で調製した。一番上に、１ｘ１０４ＲＷＰＥ-ＧＵＳ、ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１、またはＤＵ１４５（陽性対照）細胞を含有する０．３％アガロースの層をいれた。１２日後、病巣をクリスタルバイオレットで染色しカウントした。
免疫ブロット分析
細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ＮＰ４０（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）、および完全プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ社）を含むＮＰ４０溶解緩衝液中でホモジナイズした。１５μｇのタンパク質抽出物をＳＤＳ試料緩衝液と混合し、１０％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上で還元条件下で電気泳動させた。これらの分離したタンパク質を、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）上に移した。この膜を、ブロッキング用緩衝液［０．１％ツイーン（ＴＢＳ−Ｔ）および５％脱脂乾燥乳を含有するトリス緩衝生理食塩水］中で１時間インキュベートした。一次抗体を、ブロッキング用緩衝液中一晩４℃で、記載の希釈率で適用した。ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄後、膜を、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で、１：５，０００希釈で１時間室温にてインキュベートした。これらのシグナルを、改良型化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）および放射線写真法で描出した。
マウスモノクローナル抗ＭＭＰ-３（ＩＭ３６Ｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を１：５００希釈で適用し、マウスモノクローナル抗ｕＰＡ（ＩＭ１３Ｌ、ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ社）を１：５００希釈で適用し、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）を１：３０，０００希釈で対照に添加するのに適用した。
遺伝子導入ＥＴＶ１マウス
ＥＴＶ１のインビボでの過剰発現について、Ｃ末端３ＸＦＬＡＧ-エピトープタグをつけたコンストラクトを、停止コドンの前で３ｘＦＬＡＧタグをコードする逆方向プライマーと、ｐＣＲ８-ＥＴＶ１を鋳型として用いて、ＰＣＲにより作製した。この産物をｐＣＲ８にＴＯＰＯクローン化した。前立腺特異的ＥＴＶ１遺伝子導入コンストラクトを作製するため、３倍濃度のＦＬＡＧ-ＥＴＶ１を、改変低分子複合プロバシンプロモーター（ＡＲＲ２ＰＢ）の下流およびウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡ部位（ＰＡ-ＢＧＨ）の上流で、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａ Ｇｅｎｅ社、米国カリフォルニア州ラホヤ）に挿入した。ＡＲＲ２ＰＢ配列は、本来のプロバシン配列ＰＢ（−４２６／＋２８）とさらに２つのアンドロゲン応答エレメントを有する。このコンストラクトを配列決定し、ＦＶＢマウス卵への微量注入の前の一過性トランスフェクトの際にＬＮＣａＰ細胞におけるアンドロゲンによるプロモーター誘導能を試験した。ＡＲＲ２ＰＢ-ＥＴＶ１プラスミドをＰｖｕＩ／ＫｐｎＩ／／ＳａｃＩＩで直線化し、受精ＦＶＢマウス卵に微量注入し、米国ミシガン大学遺伝子導入動物モデルコアにより、偽妊娠の雌に手術で移植した。遺伝子導入初代動物を、切り取った尾から単離したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲによりスクリーニングした。遺伝子導入ＡＲＲ２ＰＢ-ＥＴＶ１初代動物を、ＦＶＢマウスと交配し、導入遺伝子陽性雄マウス子孫を様々な時点で屠殺した。遺伝子導入マウス由来の前立腺をＮｉｋｏｎ社の切開用顕微鏡を用いて切開し、１０％緩衝ホルマリンに固定し、パラフィン中に包理した。５μｍの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、３名の病理学者により、ヒト癌コンソーシアム前立腺病理委員会のマウスモデルに関するバーハーバーミーティングのコンセンサスレポートに従って評価した（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ６（２００７））。
ＥＴＶ１-ＦＬＡＧの免疫組織化学的検出に関しては、基底細胞マーカーであるｐ６３およびサイトケラチン５（ＣＫ５）、および平滑筋アクチン、脱パラフィン化スライドについて、マイクロ波-クエン酸塩抗原検索を行い、ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（１：５０希釈、一晩恒温放置、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，＃２３６８）、マウスモノクローナル抗ｐ６３抗体（１：１００希釈、４５´ 恒温放置、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、ＭＳ１０８１Ｐ１）、マウスモノクローナル抗平滑筋アクチン抗体（１：５０希釈、３０℃恒温放置、ＤａｋｏＡｂ Ｍ０８５１）、およびウサギポリクローナル抗ＣＫ５抗体（１：５００希釈、３０℃恒温放置、ＡｂＣａｍ、ａｂ２４６４７）と共に、それぞれインキュベートした。ｐ６３およびＳＭＡの描出を、Ｍ.Ｏ.Ｍ免疫検出キット（ＰＫ２２００、ベクターラボラトリー社）を用いた標準的なビオチン-アビジン複合体手法によりおこなった。ＦＬＡＧおよびＣＫ５をＥｎｖｉｓｉｏｎ＋システム-ＨＲＰ（ＤＡＢ）キット（Ｋ４０１１、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）を用いて検出した。
（表１５）
Figure 0005529732
Figure 0005529732
Figure 0005529732
Figure 0005529732
（表１６）
Figure 0005529732
（表１７）
Figure 0005529732
Ｂ．結果
前立腺癌における新規 ５´ＥＴＳ融合パートナーの同定
ｑＰＣＲにより、前立腺組織試料の２つのコホートを、ＥＴＶ１のアウトライアー発現を有する症例を同定するために、ＥＲＧとＥＴＶ１の発現についてスクリーニングした。図３８ａに示すように、これら２つのコホートにわたり、５４の局在化した前立腺癌試料のうち２６および３試料が、それぞれＥＲＧ（４８％）およびＥＴＶ１（５.５％）アウトライアー発現を示した。さらにまた、２つのホルモン抵抗性転移性前立腺癌試料であるＭＥＴ２６およびＭＥＴ２３は、ＥＴＶ１アウトライアー発現を示した。ｑＰＣＲにより、ＥＲＧのアウトライアー発現を有する、２６の局在化した試料中２５試料（９６％）が、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合転写物を発現した。ＭＥＴ２６を除き、４つのＥＴＶ１アウトライアー（ＰＣａ_ＥＴＶ１_１〜３およびＭＥＴ２３）を含むいずれの試料も、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合転写物を発現しなかった。
これらの症例におけるＥＴＶ１転写物構造の特性決定をするため、ｃＤＮＡ末端（ＲＬＭ-ＲＡＣＥ）の５´ＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅をおこなった。ＭＥＴ２６におけるＴＭＰＲＳＳ２由来の５´エクソンよりむしろ、すべての４つの試料は、特有の５´配列を有した（図３８ｂ）。ＰＣａ_ＥＴＶ１_１においては、ＥＴＶ１のエクソン１〜４を、５´末端反復配列（ＬＴＲ）に対して相同性を有する２２ｑ１１．２３由来の２つのエクソン、およびヒト内在性レトロウイルスファミリーＫ（以下「ＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑ１１．２３」と称する）のｇａｇ配列で置換した。ＰＣａ_ＥＴＶ１_２では、ＥＴＶ１のエクソン１は、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１（７ｐｌ５）由来のエクソン１で置換されていたのに対し、ＰＣａ_ＥＴＶ１_３では、ＥＴＶ１のエクソン１〜４がさらなる上流配列およびＳＬＣ４５Ａ３（１ｑ３２）のエクソンで置換されていた。ＭＥＴ２３においては、ＥＴＶ１のエクソン１〜５が、Ｃ１５ＯＲＦ２１（１５ｑ２１）由来のエクソン１および２で置換されていた（図１ｂ）。これらの融合転写物の排他的な発現は、ｑＰＣＲおよびＦＩＳＨによるこれらの症例におけるゲノムレベルでの融合により確認された（図３８ｃ、３９、および４０）。ＰＣａＥＴＶ１_２において、ＦＩＳＨは、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１に対して５´側およびＥＴＶ１に対して３´側のプローブの対応する融合を伴った、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１に対して３´側およびＥＴＶ１に対して５´側のプローブの欠失を実証し、７ｐ上でおよそ１３ＭＢ離れてヘッドからテールの方向に配向する、ＨＮＲＰ２Ａ２Ｂ１とＥＴＶ１との間の染色体内欠失と一致した（図３８ｃおよび４０）。遺伝子融合の配列を図５１に示す。
５´融合パートナーの明確な機能分類
ＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑｌｌ．２３：ＥＴＶ１、ＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ１、およびＣ１５ＯＲＦ２１：ＥＴＶ１融合は、５´パートナー由来の予測翻訳配列を含まず、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１融合におけるＨＮＲＰＡ２Ｂ１配列は、融合タンパク質に対して２つの残基のみが寄与する。従って、５´パートナーのプロモーターエレメントは、おそらくこれらの症例における異常ＥＴＶ１発現を誘発するので、これらの遺伝子の組織特異性およびアンドロゲン制御が特徴決定された。ＳＬＣ４５Ａ３、Ｃ１５ＯＲＦ２１、およびＨＮＲＰＡ２Ｂ１の組織特異性を調べるため、２９の異なる種類の６３０の腫瘍から得た発現プロファイルからなる国際ゲノムコンソーシアムｅｘｐＯデータセットを、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースを用いて検索した（Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ９、１６６-８０（２００７））。ＴＭＰＲＳＳ２と同様に、ＳＬＣ４５Ａ３は、その他すべての腫瘍型（中央値＝０．３３、Ｐ＝２．４Ｅ-７）と比較して、前立腺癌において著しい過剰発現 （中央値=２.４５、１つのアレイ当たりの中央値を超える標準偏差）を示した。Ｃ１５ＯＲＦ２１は、前立腺癌において同様の過剰発現を示した（中央値=２．０６ｖｓ-０．１２、Ｐ＝３．４Ｅ-６）。一方、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、前立腺およびその他の腫瘍型で高発現を示した（中央値=２．３６ｖｓ２．４１、Ｐ＞０．０５）（図３８ｄ）。ＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑ１１．２３をｅｘｐＯデータセットで用いたＤＮＡマイクロアレイでモニターしていないにもかかわらず、Ｓｔａｕｆｆｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ ４、２（２００４））が記載するように、ＭＰＳＳにより明確に測定される。従って、ＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑ１１．２３の発現を、３１のその他の正常な組織（中央値=１００万あたり９個の転写物）と比較して、ＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑ１１.２３が正常な前立腺組織において最高レベルで発現（１００万あたり９４個の転写物）した、３２の正常な組織型（Ｊｏｎｇｅｎｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５、１００７-１４（２００５））からのプロファイルを含むリンクス治療法ＭＰＳＳデータセット中で検索した（図３８ｄ）。
ｑＰＣＲにより、ＳＬＣ４５Ａ３（２１.６倍、Ｐ＝６.５Ｅ-４）とＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑ１１.２３（７．８倍、Ｐ＝２.４Ｅ-４）の、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株における内在性発現は、ＴＭＰＲＳＳ２（１４．８倍、Ｐ＝９．９５Ｅ-７）と同様に、合成アンドロゲンＲ１８８１によって著しく増加する。逆に、Ｃ１５ＯＲＦ２１の発現は、Ｒ１８８１刺激により著しく減少する（１.９倍、Ｐ＝０．００１２）。最後に、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１の発現は、アンドロゲン刺激により著しくは変化しない（１．１７倍、Ｐ＝０．２９））（図３８ｅ）。
ＥＴＶ１は、良性前立腺細胞において侵襲を誘導する
５´パートナーがコード配列をＥＴＶ１転写物に与えないので、臨床的試料および前立腺癌細胞株における異なるクラスのＥＴＶ１再配列についての共通の結果は、切断されたＥＴＶ１の異常過剰発現である。従って、この現象は、前立腺癌における異常ＥＴＳファミリーメンバー発現の役割を決定するために、インビトロおよびインビボで繰り返された。アデノウイルスおよびレンチウイルスコンストラクトは、指標のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合が陽性の症例、ＭＥＴ２６（ＥＴＶ１のエクソン４から始まって報告の終始コドンまで）で表されるようにＥＴＶ１を過剰発現するようにデザインされている（図４１ａ）。良性不死化前立腺上皮細胞株ＲＷＰＥを、ＥＴＶ１を発現するレンチウイルスに感染させ、安定なＲＷＰＥ-ＥＴＶ１細胞を選択し、ＥＴＶ１を発現するアデノウイルスによる感染により、原発性良性前立腺上皮細胞株ＰｒＥＣにおいてＥＴＶ１を一時的に過剰発現した。ＲＷＰＥおよびＰｒＥＣ細胞の両者において、ＥＴＶ１の過剰発現は、増殖に対して検出可能な効果はなく（図４４ａ〜ｂ）、細胞周期解析は、Ｓ期におけるＲＷＰＥ-ＥＴＶ１とＲＷＰＥ-ＧＵＳ細胞の割合に何の差異も示さなかった（図４４c）。さらにまた、軟寒天形質転換アッセイでは、ＥＴＶ１過剰発現がＲＷＰＥ細胞を形質転換するには十分でないことが示された（図４４ｄ）。
ＥＴＶ１過剰発現は、ＲＷＰＥ（３.４倍、Ｐ＝０．０００５）およびＰｒＥＣ（６．３倍、Ｐ＝０．０００６）の両者で顕著に侵襲を増大させた（図４１ｂ〜ｃ）。さらにまた、ＬＮＣａＰにおける、ｓｉＲＮＡ、または異なる配列に対して設計されたｓｈＲＮＡを用いたＥＴＶ１ノックダウンは、侵襲を顕著に阻害し（図４１ｄ〜ｅおよび図４５）、過去の研究と一致している（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２００７））。これらの結果は、ＥＴＶ１過剰発現が重要な発癌表現型である侵襲を誘発することを実証している。安定なＥＴＶ１過剰発現により制御される転写プログラムを調べるため、ＲＷＰＥ-ＥＴＶ１細胞をプロファイリングし、発現シグネチャーを、分子概念マップ（ＭＣＭ）と呼ばれる生物学的に関連した概念の概要に対して解析した。ＭＣＭは、２０，０００以上の生物学的に関連した遺伝子セット間の関連を不均衡なオーバーラップにより探すためのものである（Ｔｏｍｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３９、４１-５１（２００７））。図４１ｆに示すように、ＭＣＭ分析は本発明者らのＥＴＶ１過剰発現されたシグネチャーにおいてエンリッチメントが起こっている細胞侵襲に関連する分子概念のネットワークを明らかにしており、上述の表現型効果と一致している。ｑＰＣＲおよび免疫ブロット法により、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子経路のメンバー（Ｌａｕｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ５、１７６０-７１（２００６）；Ｆｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １１、４７９-９１（２００６））等の、過去に侵襲に関与した複数の遺伝子のＲＷＰＥ-ＥＴＶ１細胞における過剰発現を確認した（図４１ｇおよび４７）。これらの結果は、ＥＴＶ１がマトリックスメタロプロテイナーゼを通じてＬＮＣａＰ細胞内での侵襲に影響を与えることを実証する最近の研究（上述のＣａｉ ｅｔ ａｌ．）と一致している。
ｍＰＩＮを誘発するマウス前立腺におけるＥＴＶ１発現
つぎに、インビボでのＥＴＶ１過剰発現の効果を、アンドロゲン制御下で前立腺において排他的に強力な導入遺伝子発現を誘発する、改変プロバシンプロモーター（ＡＲＲ２Ｐｂ-ＥＴＶ１）の制御下にあるＦＬＡＧタグのついた切断されたバージョンのＥＴＶ１（図４１ａ）を発現する遺伝子導入マウスを用いて調べた（Ｅｌｌｗｏｏｄ-Ｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ４，２２３-３８（２００３））。この導入遺伝子は、ヒト前立腺癌において同定されたＥＴＶ１のアンドロゲン誘導遺伝子融合に機能的に類似している（すなわち、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１、ＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ１、およびＨＥＲＶ-Ｋ_２２ｑ１１．２３：ＥＴＶ１）。複数のＡＲＲ２Ｐｂ-ＥＴＶ１初代動物を入手し、表現型解析に展開した。１２〜１４週齢の、ＡＲＲ２Ｐｂ-ＥＴＶ１遺伝子導入マウス８匹中６匹（７５％）が、マウス前立腺上皮内腫瘍（ｍＰＩＮ）を発症した（表１８および図４２）。ｍＰＩＮの定義に従い、層形成、高色素血および肥大核小体（ｍａｃｒｏｎｕｃｌｅｏｌｉ）を含む核異型を示す、ＡＲＲ２Ｐｂ-ＥＴＶ１マウスの前立腺における正常な腺内に含まれる局所性増殖病変を観察した（図４２ａ〜ｆ）。ｍＰＩＮは、ＡＲＲ２Ｐｂ-ＥＴＶ１マウスのすべての３つの前立腺葉（前側、腹側、および背外側）で観察され、腹側葉で最もよくみられた（７／１１、６３.６％）（表１８）。免疫組織化学的検査により、強度のＥＴＶ１-ＦＬＡＧ発現が、ＡＲＲ２Ｐｂ-ＥＴＶ１マウスの良性腺ではなく、排他的にｍＰＩＮ病巣で観察され（図４８）、ｑＰＣＲは、導入遺伝子発現が前立腺に限定されるものであることを確認した。
すべての病変は、近接する平滑筋アクチン染色により実証されるように、無傷の繊維筋層の存在により、インサイツであることが確認された（図４２ｇ〜ｈ）。しかしながら、基底細胞マーカーサイトケラチン５およびｐ６３を用いた免疫組織化学的検査は、良性腺と比較した、ＡＲＲ２Ｐｂ-ＥＴＶ１ｍＰＩＮにおける周囲基底上皮層の消失を実証し（図４２ｉ〜ｌ）、基底細胞層の破損を示している。これらの結果は、ＥＴＶ１がマウス前立腺における腫瘍表現型を誘導を実証し、ヒト前立腺癌におけるＥＴＳ遺伝子融合の発癌役割を支持する。
（表１８）
Figure 0005529732
実施例２０：さらなる遺伝子融合
本実施例では、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ５およびＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ５遺伝子融合の同定を説明する。ＳＹＢＲグリーンを用いたＱＰＣＲによるＥＴＶ５アウトライアー発現の検出には、以下のプライマー対、すなわち、
Figure 0005529732
を用いた。
ＰＣａ_ＥＴＶ５_１由来のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ５融合の同定には、ＲＬＭ-ＲＡＣＥに対し、以下のプライマー、すなわち、
Figure 0005529732
を用いた。
ＰＣａ_ＥＴＶ５_２由来のＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ５融合の同定には、以下のプライマー、すなわち、
Figure 0005529732
を用いた。
図５２は、上述の融合を示す。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ５については、３つのスプライスバリアントを同定した。すべてについての配列を示した。図５３は、ＥＴＶ５アウトライアー発現を示す２つの前立腺癌（ＰＣａ）の例のＱＰＣＲによる同定を示す。図Ｂは、ＲＡＣＥで決定した、両例についての融合転写物の構造を示す。
すべての刊行物、特許、特許出願、および上述の明細書において述べた配列番号を、ここでこれらの前内容を参照により援用する。本発明は特定の実施形態と関連させて記載されているが、特許請求の本発明はこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、本発明の記載の組成物および方法の様々な変形および変更は、当業者に明らかであり、以下の請求項の範囲内であると考える。

Claims (11)

  1. 以下を含む、生物学的試料を試験する方法；
    （ａ）該生物学的試料を検出試薬と接触させる工程であって、該生物学的試料が、前立腺細胞もしくは画分、前立腺分泌物もしくは画分、またはそれらの組み合わせを含むかまたはそれらに由来する、工程、および
    （ｂ）ＳＬＣ４５Ａ３であるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の５´部分と、ＥＴＶ１もしくはＥＴＶ５であるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とを有する遺伝子融合が該試料中に存在する場合、それを検出する工程、
    ここで、生物学的試料中の遺伝子融合の存在が該試料が由来する個体における前立腺癌を示す。
  2. 前記アンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域が、アンドロゲン制御遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項１記載の方法。
  3. 前記工程（ｂ）が、アンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の５´部分と、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とを有するゲノムＤＮＡの染色体再編成を検出することを含む、請求項１記載の方法。
  4. 前記工程（ｂ）が、アンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の５´部分とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とを有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む、請求項１記載の方法。
  5. 前記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿の上澄み、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物、および前立腺細胞からなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
  6. 前立腺癌に関連する、アンドロゲン制御遺伝子--ＥＴＳの遺伝子再配列を検出するための組成物の使用であって、該組成物が、ＳＬＣ４５Ａ３であるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の５´部分と特異的にハイブリッド形成する配列を含む第一の標識されたプローブと、ＥＴＶ１もしくはＥＴＶ５であるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分と特異的にハイブリッド形成する配列を含む第二の標識されたプローブとを含む、使用。
  7. 前立腺癌に関連する、アンドロゲン制御遺伝子--ＥＴＳの遺伝子再配列を検出するための組成物の使用であって、該組成物が、ＳＬＣ４５Ａ３であるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の５´部分がＥＴＶ１もしくはＥＴＶ５であるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分に融合している接合部とハイブリッド形成する配列を含むプローブを含む、使用。
  8. 前立腺癌に関連する、アンドロゲン制御遺伝子--ＥＴＳの遺伝子再配列を検出するための組成物の使用であって、該組成物が、ＳＬＣ４５Ａ３であるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の５´部分とハイブリッド形成する配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチドと、ＥＴＶ１もしくはＥＴＶ５であるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とハイブリッド形成する配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチドとを含む、使用。
  9. 前立腺癌に関連する、アンドロゲン制御遺伝子--ＥＴＳの遺伝子再配列を検出するための組成物の使用であって、該組成物が、ＳＬＣ４５Ａ３であるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域の、ＥＴＶ１もしくはＥＴＶ５であるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子への融合から生じた、アミノ末端で切断されたＥＴＳファミリーメンバータンパク質に対する抗体を含む、使用。
  10. 以下のうちの少なくとも一つを含む、患者における前立腺癌を診断するための組成物：
    （a）ＳＬＣ４５Ａ３であるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の５´部分がＥＴＶ１もしくはＥＴＶ５であるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分に融合している接合部とハイブリッド形成する配列を含む、標識されたプローブ；
    （b）ＳＬＣ４５Ａ３であるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の５´部分とハイブリッド形成する配列を含む第一の標識されたプローブ、ならびにＥＴＶ１もしくはＥＴＶ５であるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とハイブリッド形成する配列を含む第二の標識されたプローブ；
    （c）ＳＬＣ４５Ａ３であるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の５´部分とハイブリッド形成する配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、ならびにＥＴＶ１もしくはＥＴＶ５であるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分とハイブリッド形成する配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチド；
    （d）ＳＬＣ４５Ａ３であるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域の、ＥＴＶ１もしくはＥＴＶ５であるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子への融合から生じた、アミノ末端で切断されたＥＴＳファミリーメンバータンパク質に対する抗体；または
    （e）ＳＬＣ４５Ａ３であるアンドロゲン制御遺伝子の転写制御領域由来の５´部分と、ＥＴＶ１もしくはＥＴＶ５であるＥＴＳファミリーメンバー遺伝子由来の３´部分との融合に関連する再編成を検出するためのインサイツハイブリダイゼーションプローブ。
  11. 請求項１０記載の組成物のうち一つまたは複数を含むキット。
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