JP6920683B2 - ピロールイミダゾール含有ポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法およびキット - Google Patents

ピロールイミダゾール含有ポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法およびキット Download PDF

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Description

本発明は、ピロールイミダゾール含有ポリアミドを用いて標的遺伝子の配列の１塩基以上の違いを識別して標的遺伝子の二本鎖核酸分子を濃縮する方法及びキットに関する。
近年の分子生物学の顕著な発展、およびこれまでに蓄積された研究成果は、生命現象の解明に寄与するのみならず、医療に対しても多大な貢献をなしている。とりわけ、分子生物学的手法をもちいた遺伝子医療の発展はめざましく、臨床分野にまで急速に展開されている。さらには、様々な疾患に遺伝子の核酸配列のレベルでの多様性が関与していることが明らかにされてきており、それらの疾患に対しては遺伝子の核酸配列のレベルでの診断が必要不可欠なものとなっている。ここで、遺伝子の核酸配列のレベルでの多様性とは、遺伝子の核酸配列における欠失、付加又は置換などの遺伝子変異が挙げられる。
今日、先天的代謝異常として古くから知られている数多くの酵素の機能欠損症が遺伝子疾患に基づくものであることが明らかとなっている。これらの疾患を検出する方法としては、特定の代謝に関与しているタンパク質または酵素の遺伝子について、先天的に異常のない健常者の遺伝子の塩基配列と、代謝異常を起こしている患者の当該遺伝子の塩基配列とを比較して、患者の当該遺伝子上の塩基配列の変異を検出するものがあり、これらの遺伝子に基づいた疾患の遺伝子診断として極めて有効な手法となっている。
また、後天的な遺伝子異常によって引き起こされる例えば癌などの疾患の遺伝子に基づく診断を行う場合、正常細胞と癌細胞が常に共存する状態にあるので、癌病片から癌細胞のみを集めることは極めて困難である。したがって、サンプルには常に正常細胞が混入し、遺伝子変異の検出の正確性が落ちてしまう問題点がある。そこで、癌細胞中の変異遺伝子のみを選択的に検出することが必要とされている。
単に遺伝子の量を増大させるだけならば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法等の遺伝子増幅法により、標的遺伝子の増幅を簡便に行うことができる。一方で、癌細胞と正常細胞、または健常者と特定の遺伝病患者の原因となっている遺伝子の変異を識別する場合には、単に遺伝子の量を増大させるだけでなく、試料中に含有する変異遺伝子の比率を高めることが要求される。
すなわち、試料中の疾病の原因である変異遺伝子の絶対量が非常に僅かな場合、そのままでは当該変異遺伝子を確認することはほとんど不可能であるので、任意選択的な標的遺伝子を濃縮する方法の開発が望まれている。望ましくは、これらの方法で濃縮された標的遺伝子は、既存の遺伝子診断システムへ導入可能なものであることが望ましい。
近年ではＰＣＲテクノロジーを応用することで、正常遺伝子と変異遺伝子を識別し、優先的に微量な変異遺伝子を増幅するＰＣＲクランプ法が一般的な濃縮方法として知られている。例えば、人工核酸であるロックド核酸（ＬＮＡ）含有オリゴヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）含有オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）含有オリゴヌクレオチドによって、標的となる遺伝子の野生型核酸配列をクランプし、試料中のＰＣＲに関与できる変異型遺伝子の割合を増加させて、変異型遺伝子をより増幅することができる方法がある（特許文献２）。ＰＣＲクランプ法は、人工核酸の配列の設計の自由度や高い配列特異性等から広く普及している技術であるが、ＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲ増幅の際の正確性（Ｆｉｄｅｒｉｔｙ）によって、鋳型ＤＮＡの配列とは異なる塩基が挿入されてしまう。Ｔａｑポリメラーゼの不正確性に起因する鋳型ＤＮＡへの異なる塩基の挿入は、診断または検出において擬陽性などの原因に繋がる問題点が報告されている。このＰＣＲクランプ法には、ＰＣＲテクノロジーに必須となる精度の高い温調装置や厳密な反応系の制御が要求される。
これらの人工核酸等以外では、抗腫瘍活性を有する物質であるディスタマイシン、ネトロプシン、ダウノルビシン、およびデュオカルマイシン等のような低分子化合物が、二本鎖構造あるいは特定遺伝子に対して特異的な識別性を有していることが知られている(非特許文献１)。
この低分子化合物は、ＤＮＡ二本鎖構造の副溝（マイナーグルーブ；Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ）を特異的に識別し結合することからマイナーグルーブバインダと呼ばれている。また、それに対して、前記人工核酸等は主溝（メジャーグルーブ：Ｍａｊｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ）を特異的識別し結合することからメジャーグルーブバインダと呼ばれている。
その他、配列特異的なオリゴヌクレオチド等とリンカー分子を介して担持体上に変異遺伝子を回収することで、標的遺伝子核酸を濃縮する方法、あるいは、同手法で正常遺伝子を除去することで標的遺伝子核酸を濃縮する方法が報告されている。しかしながら、これらの方法を用いて、標的遺伝子中の1塩基の違いを良好に識別した報告例はまだない。
上述した低分子化合物ディスタマイシン等のマイナーグルーブバインダは、識別できる塩基配列あるいは遺伝子に制限あるため、標的に対する自由度がない。そこで近年開発され、注目を集めているのがピロールイミダゾール含有ポリアミドである。図１に例示されるような構造を有するピロールイミダゾール含有ポリアミドは、特定の標的遺伝子の塩基配列に対して特異的に結合できるような分子設計の自由度が高いものとして知られている。（特許文献１〜４）。
しかしながら、これらのピロールイミダゾール含有ポリアミドは、現段階では薬剤としての応用例は数多く報告されているが、前記人工核酸等のようにＰＣＲテクノロジーによる診断あるいはその他核酸調製プロセス（標的核酸の濃縮等）における応用例は非常に少ない。
特表２０１０−５０５４４６号公報 特表２０１１−５１８５５２号公報 特表２００９−５０７４９２号公報 特表２０１０−５３２６６３号公報 特許第３２３１０４５号明細書 特許第４０１２１４５号明細書 国際公開２０１２／１１１６８７号
Ｆ ＡＲＣＡＭＯＮＥ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０３：１０６４−１０６５，１９６４ Ｎｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｃｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２５４、ｐｐ１４９７−１５００ Ｃｈｏ Ｊ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ９２：１０３８９−１０３９２，１９９５ ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ １３０（３）３５５−３７５（２０１０）川島悦子、釜池和大著
本発明では、ピロールイミダゾール含有ポリアミドを用いることで精度の高い温調装置や厳密な反応系の制御を要することとなく、簡便な工程で非標的二本鎖核酸分子と標的二本鎖核酸分子の塩基配列の１塩基以上の違いを識別して、標的二本鎖核酸分子を特異的に捕捉または非標的二本鎖核酸分子を除去し、標的二本鎖核酸分子を濃縮する方法及びそのような標的二本鎖核酸分子を濃縮するためのキットを提供することを目的とする。
本発明に係るピロールイミダゾール含有ポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法およびキットは、下記［１］〜［１３］である。
［１］標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法は、
（１）前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、
を混合して混合溶液とする工程と、
（２）前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１の該第１ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ａを結合させた複合体Ａを形成する工程と、
（３）前記混合溶液から、前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
［２］標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法は、
（１）前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
を混合して混合溶液１とする工程と、
（２）前記混合溶液１中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドが結合した複合体ａ１を形成する工程と、
（３）前記混合溶液１に、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合して混合溶液２とする工程と、
（４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ１の前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体Ａを形成する工程と、
（５）前記混合溶液２から前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
［３］標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法は、
（１）前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、
溶液または溶媒と、
を混合して混合溶液１とする工程と、
（２）前記混合溶液１中で、前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体ａ２を形成する工程と、
（３）前記混合溶液１に、前記試料を混合して混合溶液２とする工程と、
（４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ２の前記第１ＰＩポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ａを形成する工程と、
（５）前記混合溶液２から前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
［４］標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法は、
（１）前記試料と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂと、
を混合して混合溶液とする工程と、
（２）前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとを結合させた複合体ｂ１の該第２ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ｂを結合させた複合体Ｂを形成する工程と、
（３）前記混合溶液から、前記複合体Ｂを分離して除去して除去する工程と、
を含むことを特徴とする。
［５］標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法は、
（１）前記試料と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
を混合して混合溶液１とする工程と、
（２）前記混合溶液１中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドが結合した複合体ｂ１を形成する工程と、
（３）前記混合溶液１に、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液２とする工程と、
（４）前記混合溶液２中で、前記複合体ｂ１の前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体Ｂを形成する工程と、
（５）前記混合溶液２から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする。
［６］標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって、
（１）前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液１とする工程と、
溶液または溶媒と、
を混合して混合溶液１とする工程と、
（２）前記混合溶液１中で、前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体ｂ２を形成する工程と、
（３）前記混合溶液１に、前記試料を混合して混合溶液２とする工程と、
（４）前記混合溶液２中で、前記複合体ｂ２の前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ｂを形成する工程と、
（５）前記混合溶液２から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする。
［７］標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法は、
（１）前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
を混合して混合溶液１とする工程と、
（２）前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１を形成するとともに、
前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとが結合した複合体ｂ１を形成する工程と、
（３）前記混合溶液１に、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合して混合溶液２とする工程と、
（４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ１の前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体Ａを形成する工程と、
（５）前記混合溶液２から前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
［８］標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離する方法は、
（１）前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
を混合して混合溶液１とする工程と、
（２）前記混合溶液１中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１を形成するとともに、
前記混合溶液１中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとが結合した複合体ｂ１を形成する工程と、
（３）前記混合溶液１に、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液２とする工程と、
（４）前記混合溶液２中で、前記複合体ｂ１の前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体Ｂを形成する工程と、
（５）前記混合溶液２から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
（６）前記複合体Ｂを分離した前記混合溶液２に第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合させて混合溶液３とする工程と、
（７）前記複合体ａ１と前記担持体ａが結合させて複合体Ａを形成する工程と、
（８）前記混合溶液３から複合体Ａを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
［９］標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法は、
（１）前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂと、
を混合して混合溶液１とする工程と、
（２）前記混合溶液１中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１の該第１ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ａを結合させた複合体Ａを形成し、さらに、
前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとを結合させた複合体ｂ１の該第２ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ｂを結合させた複合体Ｂを形成する工程と、
（３）前記混合溶液１から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
（４）前記混合溶液１から前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
［１０］標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法は、
（１）前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
を混合して混合溶液１とする工程と、
（２）前記混合溶液１中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドが結合した複合体ａ１を形成する工程と、
（３）前記混合溶液１に、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合して混合溶液２とする工程と、および、
（４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ１の前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体Ａを形成する工程と、
を含む複合体Ａを形成する工程、
または、
（１’）前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、
溶液または溶媒と、
を混合して混合溶液１’とする工程と、
（２’）前記混合溶液１’中で、前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体ａ２を形成する工程と、
（３’）前記混合溶液１’に、前記試料を混合して混合溶液２’とする工程と、
（４’）前記混合溶液２’中で、前記複合体ａ２の前記第１ＰＩポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ａを形成する工程と、
を含む複合体Ａを形成する工程、
から選択される複合体Ａを形成する工程、ならびに、
（５）前記（４）の後の混合溶液２または（４’）の後の混合溶液２’に、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
を混合して混合溶液３とする工程と、
（６）前記混合溶液３中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドが結合した複合体ｂ１を形成する工程と、
（７）前記混合溶液３に、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液４とする工程と、
（８）前記混合溶液４中で、前記複合体ｂ１の前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体Ｂを形成する工程と、および、
（９）前記混合溶液４から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する工程、
または、
（５’）前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着するリガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液３’とする工程と、
（６’）前記混合溶液３’中で、前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体ｂ２を形成する工程と、
（７’）前記混合溶液３’に、前記（４）の後の混合溶液２または（４’）の後の混合溶液２’を混合して混合溶液４’とする工程と、
（８’）前記混合溶液４’中で、前記複合体ｂ２と前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ｂを形成する工程と、および、
（９’）前記混合溶液４’から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する工程、
から選択される非標的核酸を分離して除去する工程、ならびに、
（１０）前記混合溶液４または４’から前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
［１１］［１］から［１０］から選択される一つ以上の方法を複数回繰り返すことにより標的塩基配列有する核酸分子を濃縮することを特徴とする方法。
［１２］［１］から［１０］のいずれか一つに記載の方法であって、
前記非標的二本鎖核酸分子が、野生型のＫ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ，Ｈ−ＲＡＳ、ＲＨＯ、ＲＡＢ、ＡＲＦ、ＲＡＮ、ＣＹＰ、ＧＳＴＴ、ＮＡＴ、ＴＳ、ＵＧＴ、ＥＲＣＣ、ＭＤＲ、ＣＲＨＲ、ＢＲＣＡ、ＭＳＨ、ＣＤＡ、ＤＰＤ、ＯＰＲＴ、５−ＨＴＴ、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ、ＶＫＯＲＣ１、ＡＰＥＸ１、ＤＣＫ、ＤＰＹＤ、ＴＹＭＰ、ＭＬＨ１、ＵＭＰＳ、ＰＣＮＡ、ＰＯＬＡ、ＲＲＭ１、ＳＬＣ２９Ａ１、ＴＫ１、ＵＮＧ、ＡＣＴＢ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＦＯＸＬ２、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＫＩＴ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＡＰＣ、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ｃ−ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲ、およびＴＰ５３からなる遺伝子群から選択される遺伝子上の特定の塩基配列の領域であって、
前記標的二本鎖核酸分子が、前記野生型の遺伝子群から選択される遺伝子上の前記特定の塩基配列の領域に一塩基以上の変異を有する。
［１３］［１］から［１２］のいずれか一つに記載の方法は、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドが、以下の式１で示される構造であって、
Ｔ−Ａ１−Ｈ−Ａ２−Ｌ （式１）
［式中、Ｔは末端領域を、Ａ１およびＡ２は識別領域を、Ｈは連結領域を、Ｌは第１リンカー分子または第２リンカー分子を意味する。］
前記識別領域と、連結領域と、第１リンカー分子または第２リンカー分子の間はアミド結合により連結され、
前記末端領域は、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンであり、
前記識別領域は、ピロール（Ｐｙ）、イミダゾール（Ｉｍ）、およびβ−アラニン（β−Ａｌａ）から選択的に連結された識別領域である、
ことを特徴とする。
［１４］［１］から［１３］のいずれか一つに記載の方法は、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドが、以下の式２で示される環状構造であって、
Figure 0006920683
［式中、Ａ１およびＡ２は識別領域を、Ｈは連結領域を、Ｌは第１リンカー分子または第２リンカー分子を意味する。］
前記識別領域と、連結領域と、第１リンカー分子または第２リンカー分子の間はアミド結合により連結され、
前記識別領域は、ピロール（Ｐｙ）、イミダゾール（Ｉｍ）、およびβ−アラニン（β−Ａｌａ）から選択的に連結された識別領域である、
ことを特徴とする。
［１５］［１］〜［１４］のいずれか一つに記載の方法は、
前記非標的二本鎖核酸分子が、野生型のＫ−ＲＡＳ遺伝子上のコドン１２、コドン１３の塩基配列の領域であって、
前記標的二本鎖核酸分子が、前記Ｋ−ＲＡＳ遺伝子上のコドン１２、コドン１３の塩基配列の領域に一塩基以上の変異を有し、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドのリンカー分子Ｌがビオチンで構成され、前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域Ｈがγ−アミノブタン酸で構成され、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域Ｈ−識別領域Ａ２−リンカー分子Ｌ中の識別領域Ａ２のイミダゾール（Ｉｍ）、ピロール（Ｐｙ）及びβ−アラニン（β―Ａｌａ）の配列が、
Ｈ−（Ｐｙ）（Ｐｙ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）（Ｐｙ）（Ｉｍ）（β―Ａｌａ）−Ｌ の順番であり、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域Ｈ−識別領域Ａ１−末端領域Ｔ中の識別領域Ａ１のイミダゾール（Ｉｍ）、ピロール（Ｐｙ）及びβ−アラニン（β―Ａｌａ）の配列が、
Ｈ−（Ｉｍ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）（Ｉｍ）（Ｉｍ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）−Ｔ；
Ｈ−（Ｉｍ）（Ｉｍ）（β―Ａｌａ）（Ｉｍ）（Ｉｍ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）−Ｔ；
Ｈ−（Ｉｍ）（Ｉｍ）（β―Ａｌａ）（Ｉｍ）（Ｐｙ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）−Ｔ；
又は
Ｈ−（Ｐｙ）（Ｉｍ）（β―Ａｌａ）（Ｉｍ）（Ｉｍ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）―Ｔ；
であり、
前記配列におけるイミダゾール（Ｉｍ）、ピロール（Ｐｙ）及びβ−アラニン（β―Ａｌａ）それぞれの分子間がアミド結合により連結されている。
［１６］［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の方法は、前記試料が、核酸分子を含む血清、血漿、尿、胸水、腹水、抹消血、およびリンパ液からなる群から選択されるひとつ以上の液体生検試料であって、前記試料中に含まれる標的二本鎖核酸分子を濃縮することができる。
［１７］［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の方法は、前記試料が、生検から抽出あるいは精製工程を経た核酸分子を含む試料であることを特徴とする。
［１８］［１］〜［１７］のいずれか一つに記載の標的塩基配列を有する二本鎖核酸分子の濃縮方法に用いるキットであって、
標的二本鎖核酸分子および非標的二本鎖核酸分子の配列の間の１塩基の違いを識別し結合することができる配列を識別することができる識別領域を含むリンカー分子で修飾されたＰＩポリアミドと、
リンカー分子に特異的に結合することができるリガンド分子で修飾された担持体と、
ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、２価の陽イオンを含む塩、および、１価の陽イオンを含む塩、およびこれらの組み合わせからなる群から少なくとも１つ以上選択される試薬と、
を含み、
前記界面活性剤が、混合溶液に対して０．０５ｖ／ｖ％以下であり、
前記２価の陽イオンを含む塩および／または１価の陽イオンを含む塩が１モル／Ｌ以下であり、
前記ＰＩポリアミドが、
前記識別領域が、標的二本鎖核酸分子または非標的二本鎖核酸分子の塩基配列に基づいて分子設計が可能であり、
前記ＰＩポリアミドがさらに以下の（１）〜（４）の少なくとも１つ以上の特徴を有することを特徴とする。
（１）標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(Ｔ−ＡあるいはＡ−Ｔ)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を少なくとも一つ含む。
（２）標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(Ｔ−ＡあるいはＡ−Ｔ)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を二つ以上含むことで環状構造を形成することができる。
（３）配列内の２あるいは３残基毎にβ−アラニン残基を少なくとも１残基以上を含む。
（４）標的二本鎖核酸分子の塩基配列と非標的二本鎖核酸分子の塩基配列を十分に認識することができる長さを有するＰｙ、Ｉｍ、およびβ−Ａｌａを含む配列である。
任意の塩基配列を有する核酸分子と結合する配列を有する機能性ピロールイミダゾール含有ポリアミドを用いる本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法により、高精度の温調装置や厳密な反応系の制御を要することなく簡便な工程で１塩基以上の違いを識別して標的二本鎖核酸分子を濃縮することができる。
従来使われていたピロールイミダゾール含有ポリアミドの一例を示す図である。 （ａ）は本発明において形成される標準二本鎖ＤＮＡと、第１ＰＩポリアミドと、担持体ａの複合体の複合体の模式図である。（ｂ）は本発明において形成される非標準二本鎖ＤＮＡと、第２ＰＩポリアミドと、担持体ｂの複合体の模式図である。 （ａ）は本発明において形成される複合体Ａの模式図である。（ｂ）は本発明において形成される複合体Ｂの模式図である。 本明細書における第一の発明のフローチャートである。 本明細書における第二の発明のフローチャートである。 本明細書における第三の発明のフローチャートである。 本明細書における第四の発明のフローチャートである。 本明細書における第五の発明のフローチャートである。 本明細書における第六の発明のフローチャートである。 本明細書における第七の発明のフローチャートである。 本明細書における第八の発明のフローチャートである。 本明細書における第九の発明のフローチャートである。 本明細書における第十の発明のフローチャートである。 （ａ）は本発明に係るヘアピン型のピロールイミダゾール含有ポリアミドの模式図である。（ｂ）は本発明に係る環状構造のピロールイミダゾール含有ポリアミドの模式図である。 リンカー分子で修飾されたＰＩポリアミドの合成方法のスキーム（その１）である。 リンカー分子で修飾されたＰＩポリアミドにタンパク質を結合させる合成方法のスキーム（その２）である。 本発明の一態様における標的二本鎖核酸分子と結合するピロールイミダゾール含有ポリアミドの配列の模式図とその構造式である。 本発明の一態様における非標的二本鎖核酸分子と結合するピロールイミダゾール含有ポリアミドの配列の模式図とその構造式である。 本願発明の一態様における標的二本鎖核酸分子と結合するピロールイミダゾール含有ポリアミドの配列の模式図とその構造式である。 本願発明の一態様における標的二本鎖核酸分子と結合するピロールイミダゾール含有ポリアミドの配列の模式図とその構造式である。
１．定義
本発明において用語「濃縮」とは、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子の混合溶液から、非標的核酸分子を除去し標的二本鎖核酸分子を選択的に回収して濃度を高めることをいう。
本発明において用語「（特定の遺伝子の）ファミリー」とは、特定の遺伝子のスーパーファミリーおよびサブファミリーの双方を含む用語である。
２．本願発明の概要
核酸の塩基配列を識別する技術は、前記遺伝子診断システムにとどまらず創薬の分野での応用も期待されている。特に近年、癌治療において注目をあつめている分子標的薬が標的とする標的分子は多岐にわたる。実際に、タンパク質や抗体あるいは核酸を標的とした分子標的薬の開発が進み、標的分子を識別する技術は臨床試験へと段階を進めている。臨床試験においては、特にサンプル中に存在する１以上の塩基配列の変異を有する微量の核酸分子を識別する技術が望まれており、本願発明の濃縮方法はそのような標的二本鎖核酸分子の濃縮に適した方法である。
一方、上述した、人工核酸を用いるＰＣＲクランプ法は、微量な変異遺伝子を増幅する濃縮方法であり、特定の塩基配列を有する核酸分子あるいは遺伝子を標的とした薬剤として役立つことが期待され開発された経緯があるが、従来技術で述べたような問題点があることが知られている。
本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法は、大別して２つの方法（第１の側面および第２の側面）に分類される。
１つ目（第１の側面）は、サンプル中の標的二本鎖核酸分子を直接的に濃縮する方法であって、図２（ａ）および図３（ａ）に示される複合体Ａ（１００）を形成して、複合体Ａ（１００）を分離および回収することにより濃縮する方法である。以下に図２（ａ）および図３（ａ）を用いて説明する。
ここで、図２（ａ）は、標的二本鎖核酸分子を回収および濃縮するために形成される複合体Ａ（１００）の模式図である。図２（ａ）に示されるように、複合体Ａ（１００）は、構成要素として、標的二本鎖核酸分子（１）と、標的二本鎖核酸分子（１）を識別する第１ＰＩポリアミド（２）と、第１リンカー分子（３）と、第１リンカー分子（３）に特異的に結合する第１リガンド分子（４）と、担持体ａ（５）を含む。
もう１つの方法（第２の側面）は、サンプル中の非標的二本鎖核酸分子を複数の工程で除去する工程を介する方法であり、図２（ｂ）および図３（ｂ）に示される複合体Ｂを形成して複合体Ｂ（２００）をサンプル中から除去し、その後回収した、標的二本鎖核酸分子（１）を分離および回収することにより濃縮する方法である。
ここで、図２（ｂ）は、非標的二本鎖核酸分子（６）を含む複合体Ｂ（２００）の模式図である。図２（ｂ）に示されるように、複合体Ｂ（２００）は、構成要素として、非標的二本鎖核酸分子（６）と、非標的二本鎖核酸分子（６）を識別する第２ＰＩポリアミド（７）と、第２リンカー分子（８）と、第２リンカー分子（８）に特異的に結合する第２リガンド分子（９）と、担持体ｂ（１０）を含む。
本発明の１つの側面は、標的となる遺伝子の二本鎖核酸分子（１）の特定の塩基配列には結合することができるが、その特定の塩基配列に一塩基の変異が入った配列に対しては結合することができない配列と構造を有するピロールイミダゾール含有ポリアミド（２）をもちいた濃縮方法である。第１リンカー分子（３）を修飾した第１ＰＩポリアミド（２）と第１リンカー分子（３）と特異的な結合をする第１リガンド分子（４）で修飾された担持体ａ（５）を利用することで標的二本鎖核酸分子（１）と非標的核酸分子（６）を分離し、標的二本鎖核酸分子（１）を濃縮することができる。また、ＰＩポリアミドに分子設計を施すことにより、結合する対象を標的二本鎖核酸分子（１）または非標的二本鎖核酸分子（６）のいずれかとすることができる。
第１の側面である標的二本鎖核酸分子（１）を回収および濃縮する方法は、以下の３つの方法（第一の発明〜第三の発明）を含む。以下に図３（ａ）を用いて説明する。
１つ目の方法は、標的二本鎖核酸分子（１）を含む試料と、第１リンカー分子（３）により修飾された第１ＰＩポリアミド（２）と、第１リガンド分子（４）で修飾された担持体ａ（５）との３つすべてを混合し、複合体Ａ（１００）を形成し、これを濃縮する方法である（第一の発明）。
２つ目の方法は、標的二本鎖核酸分子（１）を含む試料と第１リンカー分子（３）により修飾された第１ＰＩポリアミド（２）とを混合し、複合体ａ１を形成し、その後、さらに第１リガンド分子（４）で修飾された担持体ａ（５）を混合して複合体Ａ（１００）を形成し、これを濃縮する方法である（第二の発明）。
３つ目の方法は、第１リンカー分子（３）により修飾された第１ＰＩポリアミド（２）と第１リガンド分子（４）で修飾された担持体ａ（５）とを混合し、複合体ａ（２）を形成し、その後さらに、標的二本鎖核酸分子（１）を混合して複合体Ａ（１００）を形成し、これを濃縮する方法である（第三の発明）。
なお、図３（ａ）は、「複合体ａ１」、「複合体ａ２」を含む「複合体Ａ（１００）」として示した。ここで、標的二本鎖核酸分子（１）および第１リンカー分子（３）により修飾された第１ＰＩポリアミド（２）が結合した複合体を「複合体ａ１」と定義し、第１ＰＩポリアミド（２）および第１リンカー分子（３）に特異的に結合することができる第１リガンド分子（４）で修飾された担持体ａ（５）とが結合した複合体を「複合体ａ２」と定義し、複合体ａ１および複合体ａ２が第１リンカー分子（３）と第１リンカー分子に特異的に結合することができる第１リガンド分子（４）の相互作用により結合した複合体を「複合体Ａ」と定義する。
図２（ａ）および図３（ａ）に示されるように、第１ＰＩポリアミド（２）には第１リンカー分子（３）（例えばビオチン）が修飾され、担持体ａ（５）には第１リンカー分子（３）に特異的に結合することができる第１リガンド分子（４）（例えばストレプトアビジン）が修飾されている。第１ＰＩポリアミド（２）は標的二本鎖核酸分子（１）に特異的に結合することができる。
形成された複合体Ａ（１００）は、分離、回収および濃縮され、分析に供されることとなる。形成された複合体Ａ（１００）の分離および回収の方法は、用いられる担持体ａ（５）の材料にも拠るが、担持体ａ（５）が磁性体である場合には、磁石を用いて複合体Ａ（１００）を引寄せて複合体Ａ（１００）を回収することができる。また、担持体ａ（５）が粒状である場合や、ゲル状のものである場合には、遠心分離後にピペッティングやデカンテーションにより分離および回収することができる。より具体的な混合方法、各々の複合体の形成方法、および分離方法の条件等については、本明細書中で後述する。
非標的二本鎖核酸分子（６）を回収および除去する工程を介する標的二本鎖核酸分子（１）の濃縮方法（第２の側面）としては、以下の３つの方法（第四の発明〜第十の発明）で行うことができる。以下に図３（ｂ）を参照して説明する。
１つ目の方法は、非標的二本鎖核酸分子（６）を含む試料と、第２リンカー分子（８）により修飾された第２ＰＩポリアミド（７）と、第２リガンド分子（９）で修飾された担持体ｂ（１０）とを混合し、複合体Ｂ（２００）を形成し、複合体Ｂ（２００）を除去し、その後、分離および回収した標的二本鎖核酸分子（１）を濃縮する方法である（第四の発明）。
２つ目の方法は、非標的二本鎖核酸分子（６）を含む試料と第２リンカー分子（８）により修飾された第２ＰＩポリアミド（７）とを混合し、複合体ｂ１を形成し、その後、さらに第２リガンド分子（９）で修飾された担持体ｂ（１０）を混合して複合体Ｂ（２００）を形成し、複合体Ｂ（２００）を除去し、その後、分離および回収した標的二本鎖核酸分子（１）を濃縮する方法である（第五の発明）。
３つ目の方法は、第２リンカー分子（８）により修飾された第２ＰＩポリアミド（７）と第２リガンド分子（９）で修飾された担持体ｂ（１０）とを混合し、複合体ｂ２を形成し、その後さらに、非標的二本鎖核酸分子（６）を混合して複合体Ｂ（２００）を形成し、複合体Ｂ（２００）を除去し、その後、分離および回収した標的二本鎖核酸分子（１）を濃縮する方法である（第六の発明）。
なお、図３（ｂ）の複合体は、「複合体ｂ１」、「複合体ｂ２」を含む「複合体Ｂ（２００）」として示す。ここで、非標的二本鎖核酸分子（６）および第２リンカー分子（８）により修飾された第２ＰＩポリアミド（７）が結合した複合体を「複合体ｂ１」と定義し、第２ＰＩポリアミド（７）および第２リンカー分子（８）に特異的に結合することができるリガンド分子（９）で修飾された担持体ｂ（１０）とが結合した複合体を「複合体ｂ２」と定義し、複合体ｂ１および複合体ｂ２が第２リンカー分子（８）と第２リンカー分子に特異的に結合することができるリガンド分子（９）の相互作用により結合した複合体を「複合体Ｂ」と定義する。
図２（ｂ）および図３（ｂ）に示されるように、第２ＰＩポリアミド（７）にはリンカー分子（８）（例えばビオチン）が修飾され、担持体ｂ（１０）には第２リンカー分子（８）に特異的に結合することができる第２リガンド分子（９）（例えばストレプトアビジン）が修飾されている。第２ＰＩポリアミド（８）は非標的二本鎖核酸分子（９）に特異的に結合することができる。
形成された複合体Ｂ（２００）は、分離および除去され、その後、標的二本鎖核酸分子（１）は回収され分析に供されることとなる。形成された複合体Ｂ（２００）の分離および除去の方法は、用いられる担持体ｂ（１０）の材料にも拠るが、担持体ｂ（１０）が磁性体である場合には、磁石を用いて複合体Ｂを引寄せて複合体Ｂ（２００）を除去することができる。また、担持体ｂ（１０）が粒状である場合や、ゲル状のものである場合には、遠心分離後にピペッティングやデカンテーションにより複合体Ｂを除去することができる。より具体的な混合方法、各々の複合体の形成方法、および分離方法の条件等については、本明細書中で後述する。
ある実施形態では、標的二本鎖核酸分子（１）を回収および濃縮する方法として、第２リンカー分子（３）により修飾された第１ＰＩポリアミド（２）と第２リンカー分子（８）により修飾された第２ＰＩポリアミド（７）の双方をはじめから標的二本鎖核酸分子（１）と非標的二本鎖核酸分子（６）を含む試料に混合し、第２リガンド分子（４）で修飾された担持体ａ（５）を混合し、複合体Ａ（１００）を形成させ、複合体Ａ（１００）を分離および回収することで、標的二本鎖核酸分子（１）を濃縮することもできる（第七の発明）。
また、別の実施形態では、第１リンカー分子（３）により修飾された第１ＰＩポリアミド（２）と第２リンカー分子（８）により修飾された第２ＰＩポリアミド（７）の双方をはじめから標的二本鎖核酸分子（１）と非標的二本鎖核酸分子（６）を含む試料に混合し、第２リガンド分子（９）で修飾された担持体ｂ（１０）を混合し、複合体Ｂ（２００）を形成させ、その後、複合体Ｂ（２００）を除去する工程を介してから、複合体Ａ（１００）を形成し、標的二本鎖核酸分子を濃縮することもできる（第八の発明）。
また、別の実施形態では、第１リンカー分子（３）により修飾された第１ＰＩポリアミド（２）と、第２リンカー分子（８）により修飾された第２ＰＩポリアミド（７）の双方と、第１リガンド分子（４）で修飾された担持体ａ（５）と、第２リガンド分子（９）で修飾された担持体ｂ（１０）を、はじめから標的二本鎖核酸分子（１）と非標的二本鎖核酸分子（６）を含む試料に混合し、複合体Ａ（１００）および複合体Ｂ（２００）を形成させ、複合体Ｂ（２００）を除去し、その後、複合体Ａ（１００）を分離回収することで、標的二本鎖核酸分子（１）を濃縮することもできる（第九の発明）。
また、別の実施形態では、第一ステップとして、第１ＰＩポリアミド（２）と、標的二本鎖核酸分子（１）と非標的二本鎖核酸分子（６）を含む試料に混合し、複合体ａ１を形成し、その後、第１リガンド分子（４）で修飾された担持体ａ（５）を混合して複合体Ａ（１００）を形成、または、第１ＰＩポリアミド（２）と第１リガンド分子（４）で修飾された担持体ａ（５）を混合し、複合体ａ２を形成し、その後、標的二本鎖核酸分子（１）と非標的二本鎖核酸分子（６）を含む試料に混合して複合体Ａ（１００）を形成し、その後に、第二ステップとして、第２リンカー分子（８）により修飾された第２ＰＩポリアミド（７）を混合して複合体ｂ１を形成させ、第２リガンド分子（９）で修飾された担持体ｂ（１０）を混合し、複合体Ｂ（２００）を形成、または、第２リガンド分子（９）で修飾された担持体ｂ（１０）と第２リンカー分子（８）により修飾された第２ＰＩポリアミド（７）を混合し複合体ｂ２を形成し、その後に、複合体ｂ２と非標的二本鎖核酸分子（６）から複合体Ｂ（２００）を形成させ、第三ステップとして、複合体Ｂを除去する工程を介してから、複合体Ａ（１００）を分離および回収することで、標的二本鎖核酸分子（１）を濃縮することもできる（第十の発明）。
上記、第一の発明、第三の発明、および第九の発明は、より少ないステップで、簡便に標的二本鎖核酸分子を濃縮することができる。また、第八の発明〜第十の発明では、複合体Ｂを形成させて、同時またはあらかじめ試料から取り除くことにより、標的二本鎖核酸分子の濃縮の効率を向上させることができる。
さらに、上述した標的二本鎖核酸分子を回収および濃縮する３つの方法と非標的二本鎖核酸分子（１）を回収および除去する工程を介する標的二本鎖核酸分子（１）の濃縮方法等を適宜組み合わせることにより、標的二本鎖核酸分子（１）をさらに濃縮することも可能である。
上述した本願に係る１０の発明について以下にさらに説明する。以下の説明では、特に第１または第２リンカー分子（３、８）がビオチンであり、第１または第２リガンド分子（４、９）がストレプトアビジンであり、担持体ａ（５）および担持体ｂ（１０）が磁性体からなる場合を例にして説明をする。
ただし、第九の発明および第十の発明においては、標的二本鎖核酸分子および非標的核酸分子がそれぞれ独立して担持体ａおよび担持体ｂに結合できるようにリンカー分子およびリガンド分子の素材を選択し、また、担持体ａおよび担持体ｂについても、複合体Ａおよび複合体Ｂがそれぞれ独立して分離または回収できるような素材を選択する。
第一の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって（図４）、
（工程１）前記試料と、前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、を混合して混合溶液とする工程と（図４ Ｓ４０２）、
（工程２）前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１の該第１ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ａを結合させた複合体Ａを形成する工程と（図４ Ｓ４０４）、
（工程３）前記混合溶液から、前記複合体Ａを分離して回収する工程と（図４ Ｓ４０６）、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
次に、第一の発明の各工程について説明する。
（工程１）
試料と、第１ＰＩポリアミドと、担持体ａとを混合する工程１は、標的二本鎖核酸分子等が吸着することのない反応容器内で行うことを必要とする。核酸等が反応容器内に吸着すると、標的二本鎖核酸分子を回収することが困難になるからである。
工程１の混合するときの温度は、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
工程１で混合する試料中の全二本鎖核酸分子に対する第１ＰＩポリアミドの量比（分子数）は、１：１０2〜１：１０8であり、好ましくは１：１０4〜１：１０8、より好ましくは１：１０6〜１：１０8、さらに好ましくは１：１０7〜１：１０8である。
工程１で混合する担持体の量は、混合溶液内で形成される第１ＰＩポリアミドを十分に回収可能な量を混合することが好ましい。例えば、第１ＰＩポリアミドに対する担持体上のリガンド分子の量比(分子数)は、１：１〜１：１０であり、好ましくは１：１〜１：８、より好ましくは１：１：１〜１：５、さらに好ましくは１：１〜１：３である。
本発明の一実施形態では、後述するｐＨ緩衝剤、界面活性剤、１価および／または２価の塩等を工程1の混合溶液に含ませないことが特に好ましい場合がある。本発明の他の実施形態としては、後述するｐＨ緩衝剤、界面活性剤、１価および／または２価の塩等を任意選択的に含ませることもできる。
工程1の混合溶液に含ませることができる界面活性剤の量は、全混合溶液の０．０５ｖ／ｖ％以下とすることができ、好ましくは０．０３ｖ／ｖ％、より好ましくは０．０１ｖ／ｖ％とすることができる。なお、ｖ／ｖは体積比であり、ｖ／ｖ％は体積比の百分率である。
工程１の混合溶液に含ませることができるｐＨ緩衝剤の量は、１００ｍＭすることができ、好ましくは５０ｍＭ、より好ましくは、２０ｍＭさらに好ましくは１０ｍＭとすることができる。
工程１の混合溶液に含ませることができる塩は、１．０Ｍ以下とすることができ、好ましくは０．５Ｍ以下、より好ましくは０．２Ｍ以下とすることができる。
（工程２）
工程２の複合体Ａの形成に要する時間は、２４時間以内であり、好ましくは１時間以上１２時間以内であり、より好ましくは１時間以上６時間以内であり、さらに好ましくは１時間以上３時間以内とすることもできる。
工程２の複合体Ａを形成するために要する温度は、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
（工程３）
工程３において、担持体ａは磁性体であるので、磁石により反応容器の壁面に複合体Ａを引寄せ、上澄みを反応容器内からデカンテーションやピペッティング等により除去することができる。
工程３で回収した複合体Ａは、その後の分析に持ち込むために、緩衝溶液等に懸濁してもよい。複合体Ａ中の標的二本鎖核酸分子の分析方法については本明細書中で後述する。
第二の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって（図５）、
（工程１）前記試料と、前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、を混合して混合溶液１とする工程と（図５ Ｓ５０２）、
（工程２）前記混合溶液１中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドが結合した複合体ａ１を形成する工程と（図５ Ｓ５０４）、
（工程３）前記混合溶液１に、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合して混合溶液２とする工程と（図５ Ｓ５０６）、
（工程４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ１の前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体Ａを形成する工程と（図５ Ｓ５０８）、
（工程５）前記混合溶液２から前記複合体Ａを分離して回収する工程と（図５ Ｓ５１０）、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
次に、第二の発明の各工程について説明する。
（工程１）
試料と、第１ＰＩポリアミドとを混合する工程１は、標的二本鎖核酸分子等が吸着することのない反応容器内で行うことを必要とする。核酸等が反応容器ないに吸着すると、標的二本鎖核酸分子を回収することが困難になるからである。
工程１の混合するときの温度は、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
工程１で混合する試料中の全二本鎖核酸分子に対する第１ＰＩポリアミドの量比（分子数）は、１：１０2〜１：１０8であり、好ましくは１：１０4〜１：１０8、より好ましくは１：１０6〜１：１０8、さらに好ましくは１：１０7〜１：１０8である。
本発明の一実施形態では、工程1の混合溶液には、後述するｐＨ緩衝剤、界面活性剤、１価および／または２価の塩等を含ませないことが特に好ましい場合がある。本発明の他の実施形態としては、後述するｐＨ緩衝剤、界面活性剤、１価および／または２価の塩等を任意選択的に含ませることができる。
工程1の混合溶液に含ませることができる界面活性剤の量は、全混合溶液の０．０５ｖ／ｖ％以下とすることができ、好ましくは０．０３ｖ／ｖ％、より好ましくは０．０１ｖ／ｖ％とすることができる。
工程１の混合溶液に含ませることができるｐＨ緩衝剤の量は、１００ｍＭ以下とすることができ、好ましくは５０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ、さらに好ましくは１０ｍＭとすることができる。
工程１の混合溶液に含ませることができる塩は、１．０Ｍ以下とすることができ、好ましくは０．５Ｍ以下、より好ましくは０．２Ｍ以下とすることができる。
（工程２）
工程２の複合体ａ１の形成に要する時間は、６０分以内であり、好ましくは４０分以内であり、より好ましくは３０分以内であり、さらに好ましくは１０分以内とすることもできる。
工程２の複合体ａ１を形成するために要する温度は、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
（工程３）
工程３で混合する担持体の量は、混合溶液内で形成された複合体ａ１を十分に回収可能な量を混合することが好ましい。例えば、標的二本鎖核酸分子と担持体上のリガンド分子との量比を１：１以上とすることもできる。
工程３の担持体ａを混合するときの温度は、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
（工程４）
第二の発明の工程４は、上述した第一の発明の工程２の方法と同じ条件を適用できる。
（工程５）
第二の発明の工程５は、上述した第一の発明の工程３の方法と同じ条件を適用できる。
工程５で回収した複合体Ａは、その後の分析に持ち込むために、緩衝溶液等に懸濁してもよい。複合体Ａ中の標的二本鎖核酸分子の分析方法については本明細書中で後述する。
第三の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって（図６）、
（工程１）前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、溶液または溶媒と、を混合して混合溶液１とする工程と（図６ Ｓ６０２）、
（工程２）前記混合溶液１中で、前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体ａ２を形成する工程と（図６ Ｓ６０４）、
（工程３）前記混合溶液１に、前記試料を混合して混合溶液２とする工程と（図６ Ｓ０６）、
（工程４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ２の前記第１ＰＩポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ａを形成する工程と（図６ Ｓ６０８）、
（工程５）前記混合溶液２から前記複合体Ａを分離して回収する工程と（図６ Ｓ６１０）、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
次に、第三の発明の各工程について説明する。
（工程１）
第三の発明は、標的二本鎖核酸分子等が吸着することのない反応容器内で行うことを必要とする。核酸等が反応容器内に吸着すると、標的二本鎖核酸分子を回収することが困難になるからである。
工程１で混合する担持体の量は、混合溶液内で形成される第１ＰＩポリアミドを十分に回収可能な量を混合することが好ましい。例えば、標的二本鎖核酸分子と担持体上のリガンド分子との量比を１：１以上とすれることもできる。
工程１の混合するときの温度は、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
本発明の一実施形態では、工程1の混合溶液には、後述するｐＨ緩衝剤、界面活性剤、１価および／または２価の塩等を含ませないことが特に好ましい場合がある。本発明の他の実施形態としては、後述するｐＨ緩衝剤、界面活性剤、１価および／または２価の塩等を任意選択的に含ませることができる。
工程１の混合溶液に含ませることができる界面活性剤の量は、全混合溶液の０．０５ｖ／ｖ％以下とすることができ、好ましくは０．０３ｖ／ｖ％、より好ましくは０．０１ｖ／ｖ％とすることができる。
工程１の混合溶液に含ませることができるｐＨ緩衝剤の量は、１００ｍＭ以下とすることができ、好ましくは５０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ、さらに好ましくは１０ｍＭとすることができる。
工程１の混合溶液に含ませることができる塩は、１．０Ｍ以下とすることができ、好ましくは０．５Ｍ以下、より好ましくは０．２Ｍ以下とすることができる。
（工程２）
工程１の複合体ａ２の形成に要する時間は、２４時間以内であり、好ましくは１時間以上１２時間以内であり、より好ましくは１時間以上６時間以内であり、さらに好ましくは１時間以上３時間以内とすることもできる。
工程２の複合体ａ２を形成するために要する温度は、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
（工程３）
工程３で混合する試料中の全二本鎖核酸分子に対する第１ＰＩポリアミドの量比（分子数）は、１：１０2〜１：１０8であり、好ましくは１：１０4〜１：１０8、より好ましくは１：１０6〜１：１０8、さらに好ましくは１：１０7〜１：１０8とすることもできる。
（工程４）
工程４の複合体Ａの形成は、６０分以内であり、好ましくは４０分以内であり、より好ましくは３０分以内であり、さらに好ましくは１０分以内とすることもできる。
工程４の複合体Ａを形成するために要する温度は、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
（工程５）
第三の発明の工程５は、上述した第一の発明の工程３の方法と同じ条件を適用できる。
工程５で回収した複合体Ａは、その後の分析に持ち込むために、緩衝溶液等に懸濁してもよい。複合体Ａ中の標的二本鎖核酸分子の分析方法については本明細書中で後述する。
第四の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって（図７）、
（工程１）前記試料と、前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂと、を混合して混合溶液とする工程と（図７ Ｓ７０２）、
（工程２）前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとを結合させた複合体ｂ１の該第２ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ｂを結合させた複合体Ｂを形成する工程と（図７ Ｓ７０４）、
（工程３）前記混合溶液から、前記複合体Ｂを分離して除去して除去する工程と（図７ Ｓ７０６）、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法の発明である。
次に、第四の発明の各工程について説明する。
（工程１）
第四の発明の工程１は、上述した第一の発明の工程１の方法のうち、第１ＰＩポリアミドの代わりに、第２ＰＩポリアミドを用いる他は、同じ条件を適用できる。
（工程２）
第四の発明の工程２は、上述した第一の発明の工程２の方法のうち、第１ＰＩポリアミドの代わりに、第２ＰＩポリアミドを用いる他は、同じ条件を適用できる。
（工程３）
第四の発明の工程３では、担持体ｂが磁性体であるので、磁石により反応容器の壁面に複合体Ｂを引寄せ、上澄みを反応容器内からデカンテーションやピペッティング等により回収して複合体Ｂを除去することができる。
工程３で回収した標的二本鎖核酸分子を含む上澄みは、その後の分析にそのまま持ち込むこともできる。また、第一の発明と同様方法でさらに上澄み中の標的二本鎖核酸分子をさらに濃縮してもよい。
回収した標的二本鎖核酸分子の分析方法については本明細書中で後述する。
第五の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって（図８）、
（工程１）前記試料と、前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、を混合して混合溶液１とする工程と（図８ Ｓ８０２）、
（工程２）前記混合溶液１中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドが結合した複合体ｂ１を形成する工程と（図８ Ｓ８０４）、
（工程３）前記混合溶液１に、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液２とする工程と（図８ Ｓ８０６）、
（工程４）前記混合溶液２中で、前記複合体ｂ１の前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体Ｂを形成する工程と（図８ Ｓ８０８）、
（工程５）前記混合溶液２から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と（図８ Ｓ８１０）、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法の発明である。
次に、第五の発明の各工程について説明する。
（工程１）
第五の発明の工程１は、上述した第二の発明の工程１の方法のうち、第１ＰＩポリアミドの代わりに、第２ＰＩポリアミドを用いる他は、同じ条件を適用できる。
（工程２）
第五の発明の工程２は、上述した第二の発明の工程２の方法のうち、第１ＰＩポリアミドの代わりに、第２ＰＩポリアミドを用いる他は、同じ条件を適用できる。
（工程３）
第五の発明の工程３は、上述した第二の発明の工程３の方法のうち、第１ＰＩポリアミドの代わりに、第２ＰＩポリアミドを用い、担持体ａの代わりに担持体ｂを用いる他は、同じ条件を適用できる。
（工程４）
第五の発明の工程４は、上述した第二の発明の工程４の方法のうち、第１ＰＩポリアミドの代わりに、第２ＰＩポリアミドを用い、担持体ａの代わりに担持体ｂを用いる他は、同じ条件を適用できる。
（工程５）
第五の発明の工程５は、上述した第四の発明の工程５と同じ条件を適用できる。
回収した複合体Ａ中の標的二本鎖核酸分子の分析方法については本明細書中で後述する。
第六の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって（図９）、
（工程１）前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液１とする工程と（図９ Ｓ９０２）、
（工程２）前記混合溶液１中で、前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体ｂ２を形成する工程と（図９ Ｓ９０４）、
（工程３）前記混合溶液１に、前記試料を混合して混合溶液２とする工程と（図９ Ｓ９０６）、
（工程４）前記混合溶液２中で、前記複合体ｂ２の前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ｂを形成する工程と（図９ Ｓ９０８）、
（工程５）前記混合溶液２から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と（図９ Ｓ９１０）、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法の発明である。
次に、第六の発明の各工程について説明する。
第六の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって、
（工程１）
第六の発明の工程１は、上述した第三の発明の工程１の方法のうち、第１ＰＩポリアミドを、第２ＰＩポリアミドを用い、担持体ａの代わりに担持体ｂを用いる他は、同じ条件を適用できる。
（工程２）
第六の発明の工程２は、上述した第三の発明の工程２の方法のうち、第１ＰＩポリアミドを、第２ＰＩポリアミドを用い、担持体ａの代わりに担持体ｂを用いる他は、同じ条件を適用できる。
（工程３）
第六の発明の工程３は、上述した第三の発明の工程３の方法のうち、第１ＰＩポリアミドを、第２ＰＩポリアミドを用い、担持体ａの代わりに担持体ｂを用いる他は、同じ条件を適用できる。
（工程４）
第六の発明の工程４は、上述した第三の発明の工程４の方法のうち、第１ＰＩポリアミドを、第２ＰＩポリアミドを用い、担持体ａの代わりに担持体ｂを用いる他は、同じ条件を適用できる。
（工程５）
第六の発明の工程５は、上述した第三の発明の工程５の方法のうち、第１ＰＩポリアミドを、第２ＰＩポリアミドを用い、担持体ａの代わりに担持体ｂを用いる他は、同じ条件を適用できる。
回収した標的二本鎖核酸分子の分析方法については本明細書中で後述する。
第七の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって（図１０）、 （工程１）前記試料と、前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、を混合して混合溶液１とする工程と（図１０ Ｓ１００２）、
（工程２）前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１を形成するとともに、前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとが結合した複合体ｂ１を形成する工程と（図１０ Ｓ１００４）、
（工程３）前記混合溶液１に、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合して混合溶液２とする工程と（図１０ Ｓ１００６）、
（工程４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ１の前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体Ａを形成する工程と（図１０ Ｓ１００８）、
（工程５）前記混合溶液２から前記複合体Ａを分離して回収する工程と（図１０ Ｓ１０１０）、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
次に、第七の発明の各工程について説明する。
（工程１）
第七の発明の工程１は、第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドの双方を混合する他は、第一の発明の工程１と同じ条件を適用できる。
工程１で混合する試料中の全二本鎖核酸分子に対する第１ＰＩポリアミドの量比（分子数）は、１：１０2〜１：１０8であり、好ましくは１：１０4〜１：１０8、より好ましくは１：１０6〜１：１０8、さらに好ましくは１：１０7〜１：１０8とすることもできる。
工程１で混合する試料中の全二本鎖核酸分子に対する第２ＰＩポリアミドの量比（分子数）は、１：１０2〜１：１０8であり、好ましくは１：１０4〜１：１０8、より好ましくは１：１０6〜１：１０8、さらに好ましくは１：１０7〜１：１０8とすることもできる。
（工程２）
第七の発明の工程２は、第二の発明の工程２と同じ条件を適用できる。
（工程３）
第七の発明の工程３は、第二の発明の工程３と同じ条件を適用できる。
（工程４）
第七の発明の工程４は、第二の発明の工程４と同じ条件を適用できる。
（工程５）
第７の発明の工程５は第二の発明の工程５と同じ条件を適用できる。
第八の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離する方法であって（図１１）、
（工程１）前記試料と、前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、を混合して混合溶液１とする工程と（図１１ Ｓ１１０２）、
（工程２）前記混合溶液１中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１を形成するとともに、
前記混合溶液１中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとが結合した複合体ｂ１を形成する工程と（図１１ Ｓ１１０４）、
（工程３）前記混合溶液１に、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液２とする工程と（図１１ Ｓ１１０６）、
（工程４）前記混合溶液２中で、前記複合体ｂ１の前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体Ｂを形成する工程と（図１１ Ｓ１１０８）、
（工程５）前記混合溶液２から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と（図１１ Ｓ１１１０）、
（工程６）前記複合体Ｂを分離した前記混合溶液２に前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合させて混合溶液３とする工程と（図１１ Ｓ１１１２）、
（工程７）前記複合体ａ１と前記担持体ａが結合した複合体Ａを形成する工程と（図１１ Ｓ１１１４）、
（工程８）前記混合溶液３から複合体Ａを分離して回収する工程と（図１１ Ｓ１１１６）、
を含むことを特徴とする非標的二本鎖核酸分子を分離して濃縮する方法の発明である。
次に、第八の発明の各工程について説明する。
（工程１）
第八の発明の工程１は、第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドの双方を混合する他は、第五の発明の工程１と同じ条件を適用できる。
工程１で混合する試料中の全二本鎖核酸分子に対する第１ポリアミドの量比（分子数）は、１：１０2〜１：１０8であり、好ましくは１：１０4〜１：１０8、より好ましくは１：１０6〜１：１０8、さらに好ましくは１：１０7〜１：１０8とすることもできる。
工程１で混合する試料中の全二本鎖核酸分子に対する第２ポリアミドの量比（（分子数）は、１：１０2〜１：１０8であり、好ましくは１：１０4〜１：１０8、より好ましくは１：１０6〜１：１０8、さらに好ましくは１：１０7〜１：１０8とすることもできる。
（工程２）
第八の発明の工程２は、第五の発明の工程２と同じ条件を適用できる。
（工程３）
第八の発明の工程３は、第五の発明の工程３と同じ条件を適用できる。
（工程４）
第八の発明の工程４は、第五の発明の工程４と同じ条件を適用できる。
（工程５）
第八の発明の工程５は、第五の発明の工程５と同じ条件を適用できる。
（工程６）
第八の発明の工程６は、第二の発明の工程３と同じ条件を適用できる。
（工程７）
第八の発明の工程７は、第二の発明の工程４と同じ条件を適用できる。
（工程８）
第八の発明の工程８は、第二の発明の工程５と同じ条件を適用できる。
第九の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を分離した後に前記標的核酸を濃縮する方法であって（図１２）、
（工程１）前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂと、
を混合して混合溶液１とする工程と（図１２ Ｓ１２０２）、
（工程２）前記混合溶液１中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１の該第１ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ａを結合させた複合体Ａを形成し、さらに、
前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとを結合させた複合体ｂ１の該第２ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ｂを結合させた複合体Ｂを形成する工程と（図１２ Ｓ１２０４）、
（工程３）前記混合溶液１から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と（図１２ Ｓ１２０６）、
（工程４）前記混合溶液１から前記複合体Ａを分離して回収する工程と（図１２ Ｓ１２０８）、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
次に、第九の発明の各工程について説明する。
（工程１）
試料と、第１ＰＩポリアミドと、第２ＰＩポリアミドと、担持体ａと、担持体ｂとを混合する工程１は、標的二本鎖核酸分子等が吸着することのない反応容器内で行うことを必要とする。核酸等が反応容器内に吸着すると、標的二本鎖核酸分子を回収することが困難になるからである。
工程１の混合するときの温度は、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
工程１で混合する試料中の全標的二本鎖核酸分子および全非標的二本鎖核酸分子のそれぞれに対する第１ＰＩポリアミドおよび第２ＰＩポリアミドの量比（分子数）は、１：１０2〜１：１０8であり、好ましくは１：１０4〜１：１０8、より好ましくは１：１０6〜１：１０8、さらに好ましくは１：１０7〜１：１０8である。
工程１で混合する担持体ａおよびｂの量は、混合溶液内で形成される第１ＰＩポリアミドおよび第２ＰＩポリアミドをそれぞれ十分に回収可能な量を混合することが好ましい。例えば、第１ＰＩポリアミドおよび第２ＰＩポリアミドのそれぞれに対する担持体ａおよびｂ上のリガンド分子の量比(分子数)は、１：１〜１：１０であり、好ましくは１：１〜１：８、より好ましくは１：１：１〜１：５、さらに好ましくは１：１〜１：３である。
工程１で使用する担持体ａおよび担持体ｂは、後に混合溶液内で共に形成される複合体Ａおよび複合体Ｂをそれぞれ別々に分離することができるような素材を用いるべきである。
本発明の一実施形態では、後述するｐＨ緩衝剤、界面活性剤、１価および／または２価の塩等を工程１の混合溶液に含ませないことが特に好ましい場合がある。本発明の他の実施形態としては、後述するｐＨ緩衝剤、界面活性剤、１価および／または２価の塩等を任意選択的に含ませることもできる。
工程1の混合溶液に含ませることができる界面活性剤の量は、全混合溶液の０．０５ｖ／ｖ％以下とすることができ、好ましくは０．０３ｖ／ｖ％、より好ましくは０．０１ｖ／ｖ％とすることができる。
工程１の混合溶液に含ませることができるｐＨ緩衝剤の量は、１００ｍＭすることができ、好ましくは５０ｍＭ、より好ましくは、２０ｍＭさらに好ましくは１０ｍＭとすることができる。
工程１の混合溶液に含ませることができる塩は、１．０Ｍ以下とすることができ、好ましくは０．５Ｍ以下、より好ましくは０．２Ｍ以下とすることができる。
（工程２）
工程２の複合体ＡおよびＢの形成に要する時間は、２４時間以内であり、好ましくは１時間以上１２時間以内であり、より好ましくは１時間以上６時間以内であり、さらに好ましくは１時間以上３時間以内とすることもできる。
工程２の複合体ＡおよびＢを形成するために要する温度は、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
（工程３）
第十の発明の工程３は、第二の発明の工程３と同じ条件を適用できるが、担持体ｂの素材として磁性体以外の素材を用いたときは、その担持体の素材に特性に適合した方法で複合体Ｂを分離して除去する。
（工程４）
第十の発明の工程４は、第二の発明の工程４と同じ条件を適用できが、担持体ａの素材として磁性体以外の素材を用いたときは、その担持体の素材に特性に適合した方法で複合体Ａを分離して回収する。
第十の発明は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を分離した後に前記標的核酸を濃縮する方法であって（図１３）、
（工程１）前記試料と、前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、を混合して混合溶液１とする工程と（図１３ Ｓ１３０２）、
（工程２）前記混合溶液１中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドが結合した複合体ａ１を形成する工程と（図１３ Ｓ１３０４）、
（工程３）前記混合溶液１に、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合して混合溶液２とする工程と（図１３ Ｓ１３０６）、
（工程４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ１の前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体Ａを形成する工程と（図１３ Ｓ１３０８）、または、
（工程１’）前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、溶液または溶媒と、を混合して混合溶液１’とする工程と（図１３ Ｓ１３２２）、
（工程２’）前記混合溶液１’中で、前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体ａ２を形成する工程と（図１３ Ｓ１３２４）、
（工程３’）前記混合溶液１’に、前記試料を混合して混合溶液２’とする工程と（図１３ Ｓ１３２６）、および、
（工程４’）前記混合溶液２’中で、前記複合体ａ２の前記第１ＰＩポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ａを形成する工程と（図１３ Ｓ１３２８）、ならびに、
（工程５）前記（工程４）後の混合溶液２または（工程４’）の後の混合溶液２’に、前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、を混合して混合溶液３とする工程と（図１３ Ｓ１３０８）、
（工程６）前記混合溶液３中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドが結合した複合体ｂ１を形成する工程と（図１３ Ｓ１３１０）、
（工程７）前記混合溶液３に、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液４とする工程と（図１３ Ｓ１３１２）、
（工程８）前記混合溶液４中で、前記複合体ｂ１の前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体Ｂを形成する工程と（図１３ Ｓ１３１４）、
（工程９）前記混合溶液４から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と（図１３ Ｓ１３４０）、または、
（工程５’）前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液３’とする工程と（図１３ Ｓ１３３０）、
（工程６’）前記混合溶液３’中で、前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体ｂ２を形成する工程と（図１３ Ｓ１３３２）、
（工程７’）前記混合溶液３’（複合体ｂ２を含むもの）に、前記（工程４）後の混合溶液２（複合体Ａを含むもの）または（工程４’）の後の混合溶液２’（複合体Ａを含むもの）を混合して混合溶液４’とする工程と（図１３ Ｓ１３３４）、
（工程８’）前記混合溶液４’中で、前記複合体ｂ２と前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ｂを形成する工程と（図１３ Ｓ１３３６）、および、
（工程９’）前記混合溶液４’から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と（図１３ Ｓ１３４０）、ならびに、
（工程１０）前記（工程９）の後の混合溶液４または前記（工程９’）の後の混合溶液４’から、前記複合体Ａを分離して回収する工程と（図１３ Ｓ１３４２）、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
次に、第十の発明の各工程について説明する。
（工程１）
第十の発明の工程１は、第二の発明の工程１と同じ条件を適用できる。
（工程２）
第十の発明の工程２は、第二の発明の工程２と同じ条件を適用できる。
（工程３）
第十の発明の工程３は、第二の発明の工程３と同じ条件を適用できる。
（工程４）
第十の発明の工程４は、第二の発明の工程４と同じ条件を適用できる。
（工程１’）
第十の発明の工程１’は、第三の発明の工程１と同じ条件を適用できる。
（工程２’）
第十の発明の工程２’は、第三の発明の工程２と同じ条件を適用できる。
（工程３’）
第十の発明の工程３’は、第三の発明の工程３と同じ条件を適用できる。
（工程４’）
第十の発明の工程４’は、第三の発明の工程４と同じ条件を適用できる。
（工程５）
第十の発明の工程５は、第五の発明の工程１と同じ条件を適用できる。
（工程６）
第十の発明の工程６は、第五の発明の工程２と同じ条件を適用できる。
（工程７）
第十の発明の工程７は、第五の発明の工程３と同じ条件を適用できる。
（工程８）
第十の発明の工程８は、第五の発明の工程４と同じ条件を適用できる。
（工程９）
第十の発明の工程９は、第九の発明の工程３と同じ条件を適用できる。
（工程５’）
第十の発明の工程５’は、第六の発明の工程１と同じ条件を適用できる。
（工程６’）
第十の発明の工程６’は、第六の発明の工程２と同じ条件を適用できる。
（工程７’）
第十の発明の工程７’は、第六の発明の工程３と同じ条件を適用できる。
（工程８’）
第十の発明の工程８’は、第六の発明の工程４と同じ条件を適用できる。
（工程９’）
第十の発明の工程９’は、第九の発明の工程３と同じ条件を適用できる。
（工程１０）
第十の発明の工程１０は、第九の発明の工程４と同じ条件を適用できる。
３．標的二本鎖核酸分子の収率の向上の方法について
識別性、濃縮効果を挙げる目的で前記第一の発明〜第八の発明の方法を組み合わせて良い。本発明の１つの実施形態では、前記第一の発明から第三の発明のいずれかの発明のうち１つ以上を複数回、同一サンプルに対して用いることで、より回収率の高い標的二本鎖核酸分子の濃縮を達成するが、これに限定されるものではない。
本発明の他の実施形態では、前記第四の発明〜第六の発明のいずれか一つ以上で、第２ＰＩポリアミドを用いて試料中から非標的二本鎖核酸分子を取り除く工程と、次いで、前記第一の発明から第三の発明のいずれかの発明のうち一つ以上で、第１ＰＩポリアミドを用いて試料中から標的二本鎖核酸分子を捕捉する工程により、より回収率の高い標的二本鎖核酸分子の濃縮を達成することもできる。
特に、試料中において標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子の量比において圧倒的に非標的二本鎖核酸分子多く存在する場合は、第四の発明および／または第五の発明を複数回繰り返して、サンプル中の非標的二本鎖核酸分子を十分に除去した後に第一の発明から第三の発明により標的二本鎖核酸分子を回収することにより、より回収率の高い標的二本鎖核酸分子の濃縮を達成することもできる。
また、第１ＰＩポリアミドおよび第２ＰＩポリアミドの双方を同時に用いた第七の発明および／または第八の発明を複数回繰り返すことで更に濃縮効果を向上させることもできる。
４．第一の発明から第十の発明における方法の一般的手法について
本発明に係るＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の回収、濃縮方法は、一般的に用いられるメジャーグルーブバインダとは異なり、変性、ハイブリダイズの工程の為の厳密な温度制御及び制御装置を必要としない為、前記ステップ全てにおいて室温下で実施することができる。識別性、濃縮効果を挙げる目的で必要に応じて温度制御しても良い。
前記ステップ全てにおいて、複合体Ａまたは複合体Ｂを形成後、複合体Ａまたは複合体Ｂと液性成分を分離し、複合体Ａを回収または複合体Ｂを除去する方法は、汎用されている固液分離操作により行うことができる。
上述した第一の発明から第八の発明では、担持体の形状（粒状、基板表面、あるいは、容器等の内壁表面に固着）を用いた除去方法を採用することができる。
第一の発明の工程３において、例えば、担持体が粒状である場合、複合体Ａを分離する方法としては、遠心分離により複合体Ａを沈殿させ、上澄みをデカンテーションやピペッティング等で除去する方法で行うことができる。
また、担持体が基板表面、あるいは、容器等の内壁表面に固着している場合には、当該容器内へ標的二本鎖核酸分子および非標的二本鎖核酸分子の試料とＰＩポリアミドを添加することにより、第１ＰＩポリアミドが結合した当該標的二本鎖核酸分子を当該担持体に接触させることができ、デカンテーションやピペッティング等により上澄みを除去することができる。
例えば、第四の発明の工程３において、担持体が粒状である場合、複合体Ｂを分離する方法としては、遠心分離により複合体Ｂを沈殿させ、上澄みをデカンテーションやピペッティング等で回収する方法で行うことができる。
担持体が基板表面、あるいは、容器等の内壁表面に固着している場合には、当該容器内へ標的二本鎖核酸分子および非標的二本鎖核酸分子の試料とＰＩポリアミドを添加することにより、第２ＰＩポリアミドが結合した非標的二本鎖核酸分子を当該担持体に接触させることができ、デカンテーションやピペッティング等により複合体Ａを含む上澄みを回収することができる。
担持体を含む溶液を、担持体が透過できないほど小さい多孔質膜又は濾紙を通過させることにより、当該担持体と液性成分を分離することもできる。担持体がシリカ膜等の膜状の場合には、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子の試料をシリカ膜に透過させることにより、当該混合物を当該担持体に接触させて担持体と液性成分を分離することもできる。当該混合物をシリカ膜に通過させる際には、遠心分離処理を行ったり、真空を適用したり、又は圧力をかけることにより、当該シリカ膜と液性を除去、分離してもよい。
標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料とＰＩポリアミドとの混合と同時に担持体を試料に混合してもよく、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料とＰＩポリアミドとの混合をある程度の時間インキュベートして該試料中のＰＩポリアミドとの結合を十分に行った後の混合物に担持体を接触させてもよい。標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料とＰＩポリアミドとの混合物と担持体を接触させた状態で、ある程度の時間インキュベートした後に、形成された複合体Ａを回収または複合体Ｂを分離除去することで複合体Ａまたは複合体Ｂを液性成から分離してもよい。
前記ステップでＰＩポリアミドと二本鎖核酸分子を結合させる工程全ての場合において、インキュベート中の温度条件は、ＰＩポリアミドの構造、配列特性や試料、二本鎖核酸分子の長さ等を考慮して適宜調整することが好ましい。また、２５℃〜１００℃とすることができ、好ましくは２５℃〜８０℃とすることができ、より好ましくは２５℃〜５０℃とすることができ、さらに好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
前記ステップ全ての場合において、使用する担持体の量、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子の試料とＰＩポリアミドとの混合物に担持体を接触させた時点から当該担持体を分離するまでの時間の条件は、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子の試料中のＰＩポリアミドが結合する核酸分子（第１ＰＩポリアミドの場合は、標的二本鎖核酸分子であり、第２ＰＩポリアミドの場合は、非標的二本鎖核酸分子である。）のほぼ全量が担持体に吸着されるように調整することが好ましい。よって、第１ＰＩポリアミドを用いて標的二本鎖核酸分子を濃縮する方法（例えば、第一の発明〜第三の発明）では、標的二本鎖核酸分子が非標的核酸分子と比較して圧倒的に少ないため、標的二本鎖核酸分子の含有率が１０％以下であることが想定される場合は、比較的長時間（例えば６０分程度）インキュベートすることが好ましい。また、第２ＰＩポリアミドを用いた場合では、その逆で比較的短い時間（例えば１０分程度）インキュベートすることが好ましい。より好ましくは、３０分以上にインキュベートすることで、非標的二本鎖核酸分子を第２ＰＩポリアミドと結合させて、試料中からの非標的二本鎖核酸分子を分離除去することもできる。
前記ステップ全ての場合における、ＰＩポリアミドの量については、ＰＩポリアミドの構造、配列特性や試料、二本鎖核酸分子の長さ等を考慮して適宜調整することが好ましい。前記ステップ全ての場合少なくとも全二本鎖核酸分子と当量以上であることが好ましい、更には、１０2倍量〜１０8倍量であることがより好ましい。混合する試料中の全二本鎖核酸分子にＰＩポリアミドの量比（分子数）は、１０2倍量〜１０8倍量であり、好ましくは１０4倍量〜１０8倍量、より好ましくは１０6倍量〜１０8倍量、さらに好ましくは１０7倍量〜１０8である倍量。
５．本発明の方法に用いる材料について
（１）試料
本発明に係るＰＩポリアミドは、二本鎖特異的に結合する分子である為、標的、非標的核酸分子は二本鎖核酸分子であることが好ましい、より好ましくは標的、非標的核酸分子は二本鎖ＤＮＡである方が良い。
本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において回収される核酸分子は、その塩基長によらず、二本鎖ＤＮＡであればよく、線状核酸であってもよく、プラスミド等の環状核酸であってもよい。また、後成的（エピジェネティック）に修飾された核酸であってもよい。さらに、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において回収される核酸分子は、血液中に流れる細胞由来の循環遊離ＤＮＡ(ｃｃｆＤＮＡ)であってもよく、ミトコンドリア由来の核酸であってもよく、混入していた微生物由来の核酸であってもよく、人工的な又は合成の核酸であってもよい。人工的な又は合成の核酸としては、コスミド、ベクター、ｃＤＮＡ、及びこれらの断片等が挙げられる。
本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法に供される試料は、上述した核酸分子の標的核酸分子が含まれていればよく、例えば固形生検から抽出あるいは精製工程を経た核酸分子を含む試料、あるいは、核酸分子を含む血清、血漿、尿、胸水、腹水、抹消血、リンパ液などの液体生検でも良い。従来法では、前記液体生検から一般に販売されている核酸精製試薬あるいはキット、もしくはそれ以外の既知の方法で精製した核酸分子を含む純度の高い試料を用いることが必要である。しかしながら、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法は、前記の通り、血清、血漿あるいは尿等の液体生検から前記核酸精製工程を経ず、直接的に標的二本鎖核酸分子の回収を達成し得る。
本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法においては、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子の塩基配列に1塩基以上の違いがあれば標的二本鎖核酸分子を効率的に濃縮し得る方法である。例えば、標的二本鎖核酸分子がヒトゲノムであり、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子の塩基配列の違いが点変異による1塩基の違いであればよく、欠損による１塩基以上の違いであってもよい。
本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法は、例えば、試料中に微量に含まれる標的核酸分子を濃縮する方法に適している。また、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法は、試料中における標的核酸分子の含有率が１．０、０．１、０．００１％であっても有意な濃縮効果を得ることができる。また、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法、従来法に比べ、各工程の操作が比較的簡便であり、厳密な温度制御あるいは温度制御装置が必要ないため、自動化への展開も可能である。さらに、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法は、試料中における標的二本鎖核酸分子が濃縮されているため、比較的分析感度の低い方法でも高感度に標的核酸分子の分析ができるため、より様々な分析法と好適である。すなわち、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法は、様々な分析法を組み合わせることによって臨床研究・診断分野へ展開可能な方法である。
本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法によって得られた標的二本鎖核酸分子は、いずれの核酸解析に供されてもよいが、特に遺伝子多型や遺伝子変異の解析(遺伝子検査等)に供されることが好ましく、ＳＮＰ（一塩基多型）や一遺伝子変異の解析に供されることがより好ましい。特に、癌細胞由来の循環ＤＮＡ中の微量な変異遺伝子を含む核酸分子を回収、濃縮を目的とした場合には、回収された変異遺伝子を含む核酸分子は、癌腫の予後の診断のため、癌腫に侵された人の経過をモニタリングするため、又は悪性腫瘍に対する抗癌治療の効果を観察するため等の様々な目的のための核酸解析に供される。
（２）ピロールイミダゾール含有ポリアミド（ＰＩポリアミド）
ピロールイミダゾール含有ポリアミドとは、ヒトゲノム中の任意の予め決定された塩基配列にナノモル以下の親和性で特異的に結合する芳香族アミノ酸であるピロール(Ｐｙ)アミノ酸（好ましくはＮ−メチルピロールアミノ酸）、イミダゾール（Ｉｍ）アミノ酸（好ましくはＮ−メチルイミダゾールアミノ酸）；あるいは、ベータアラニン（β−Ａｌａ）で構成された小分子である。ここで、芳香族アミノ酸とは、芳香環上にアミノ置換基及びカルボキシル置換基を有する芳香族化合物を意味する。
本明細書ではピロールイミダゾール含有ポリアミド中のピロールアミノ酸単位及びイミダゾールアミノ酸単位を、それぞれ単にピロール（Ｐｙ）及びイミダゾール（Ｉｍ）と呼ぶことがある。
本出願に係る方法の発明で用いられるリンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミドの１つの態様は、以下の式１で示されるヘアピン構造を有する。
Ｔ−Ａ１−Ｈ−Ａ２−Ｌ （式１）
式中、Ｔは末端領域を、Ａ１およびＡ２は識別領域を、Ｈは連結領域を、Ｌはリンカー分子を意味する。
２つの識別領域（１２、１３）の両末端の連結領域（１１）として、例えばγ−アミノブタン酸(ガンマーターン)を導入することができる。２つの識別領域（１２、１３）を連結させる連結領域（１１）を有する構造の一例を図１７〜１９に示す。連結部位に、回転可能な単結合を有する物質を導入することにより、２つの識別領域間が化学的相互作用でペアを形成し、結果としてヘアピン構造を形成することとなる。
このように、リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミドをヘアピン構造とすることにより、識別領域（Ａ１およびＡ２）を構成するＰｙ、Ｉｍ、β−Ａｌａが両識別領域間でペアを形成し、後述するように、二本鎖ＤＮＡの塩基対（Ａ−ＴおよびＣ−Ｇ）から構成される配列を良好に識別し、二本鎖ＤＮＡの特異的な配列を有する副溝に結合することができる。
また、本出願に係る方法の発明で用いられるリンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミドの１つの態様は、以下の式２で示されるような環状構造を有する。
Figure 0006920683
式中、Ａ１およびＡ２は識別領域を、Ｈは連結領域を、Ｌはリンカー分子を意味する。
ここで、リンカー分子（Ｌ）が環を貫く結合で示されているのは、リンカー分子（Ｌ）が環の任意の位置に結合可能であることを意味する。
次に本出願に係る方法の発明で用いられる、リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミドについて、図１４（ａ）を用いてさらに詳述する。
図１４（ａ）に示されるように式１におけるＴに相当する末端領域（１１）と、式１および式２におけるＡ１およびＡ２に相当する２つの識別領域（１２、１３）と、前記２つの識別領域を連結する式１および式２におけるＴに相当する連結領域（１４）と、前記末端部位とは反対側の末端に結合する式１および式２におけるＬに相当するリンカー分子（１５）とからなる（図１４（ａ））。末端領域１１は、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンからなる。
ピロールイミダゾール含有ポリアミドの２つの識別領域（１２、１３）は、複数のイミダゾール（Ｉｍ）と、ピロール（Ｐｙ）と、β−アラニン（β−Ａｌａ）から任意選択的に選択される配列により構成される。識別領域（１２、１３）を構成するこれらのＩｍ、Ｐｙおよびβ−Ａｌａのそれぞれの分子間の連結はアミド結合により連結される。
２つの識別領域（１２、１３）を構成するこれらのＩｍ、Ｐｙおよびβ−Ａｌａは両領域間のペアの組み合わせにより二本鎖ＤＮＡのＡ−ＴペアとＧ−Ｃペアを認識することができる。２つの識別領域（１２、１３）の間で形成するＩｍ／Ｐｙペアは、ＤＮＡ二本鎖におけるＧ−Ｃペアを認識し、Ｐｙ／Ｐｙ、Ｐｙ／β−Ａｌａ、β−Ａｌａ／Ｐｙ、β−Ａｌａ／β−Ａｌａペアは、ＤＮＡ二本鎖におけるＡ−Ｔペアを認識する。その他にも様々な配列規則が明らかとなっている。例えば、ピロールイミダゾール含有ポリアミド配列中におけるβ−Ａｌａ残基あるいはβ−Ａｌａ／β−Ａｌａペアは、ピロールイミダゾール含有ポリアミドと標的二本鎖核酸分子の塩基配列との結合における立体障害を緩和する働きがあり、ピロールイミダゾール含有ポリアミド配列において２残基あるいは３残基毎に導入してやることでより親和性を高めることができると報告されている(非特許文献３)。
図１４（ｂ）に示されるように、２つの識別領域（１２、１３）の両末端に連結領域（１４）を導入して、環状構造とすることもできる。図１４（ｂ）中２つあるリンカー分子（１５）は両方有していてもよく、どちらか一方だけでもよい。環状構造を形成できるガンマーターンが形成する前記連結領域（１４）がγ−アミノブタン酸であるときは、Ａ−ＴあるいはＴ−Ａペアに高い識別性を有することが報告されている。
また、これらの識別領域（１２、１３）を構成するＰｙ、Ｉｍおよびβ−Ａｌａの配列の規則以外にも多くの配列の規則が存在する。そのため配列の組み合わせによって人工核酸等のメジャーグルーブバインダに匹敵する識別能、結合力を有する機能分子を設計できる可能性があるといわれている。例えば、識別領域（１２、１３）の構成要素としてヒドロキシピロール（Ｈｐ）を用いても良い。
ピロールイミダゾール含有ポリアミドにより形成される第１ＰＩポリアミドは標的二本鎖核酸分子と結合する配列を有し、第２ＰＩポリアミドが非標的二本鎖核酸分子と結合する配列を有しかつ以下の機能、特徴を少なくとも一つ以上有していることが好ましい。
（１）標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(Ｔ−ＡあるいはＡ−Ｔ)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を少なくとも一つ含む。
（２）標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(Ｔ−ＡあるいはＡ−Ｔ)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を二つ以上含むことで環状構造を形成することができる。
（３）配列内のピロールイミダゾール含有ポリアミドを構成している分子（ＰｙまたはＩｍ）の２あるいは３残基毎にβ−アラニン残基を少なくとも１残基以上を含む。
（４）配列末端にリンカー分子を少なくとも一つ含む。
（５）標的二本鎖核酸分子の塩基配列と非標的二本鎖核酸分子の塩基配列を十分に認識することができる長さを有するＰｙ、Ｉｍ、およびβ−Ａｌａを含む配列である。
より好ましくは、第１ＰＩポリアミドは標的二本鎖核酸分子と結合する配列を有し、第２ＰＩポリアミドが非標的二本鎖核酸分子と結合する配列を有し、かつ、前記（１）、（２）いずれか一つの構成及び（３）、（４）、（５）の構成を有することが好ましい。
タンパク質で修飾されたＰＩポリアミドの合成方法の概略
本発明で用いられるＰＩポリアミドは、特許文献５（特許第３２３１０４５号明細書）、特許文献６（特許第４０１２１４５号明細書）、非特許文献１〜４等に記載されている数多くの方法を用いることができるが、これに限定されるものではない。
本発明で用いることができるＰＩポリアミドの合成法の一実施形態について概略を説明する。以下の例は、例えば、タンパク質（例えば、ビオチン）で修飾されたＰＩポリアミド−タンパク質共役体の合成例であり、以下の５つの工程で合成することができる。合成のスキームは、図１５および図１６に示す通りである。
（工程１）この工程は、固体担体を準備する工程である。固体担体は図１５（１）に示すように、樹脂（Ｒ）上にアミノ基を有するリンカー（Ｌ）を有する。ここで、固体担体は、アミノ基が直接に樹脂に存在する場合、リンカーはなくてもよい。固体担体は、樹脂にアミノ基を有するリンカーを修飾することで調製できる。調製法は一般的に知られている方法を採用すればよい。一実施形態では、例えば、固体担体の樹脂としてポリスチレン等の樹脂を用いることができる（図１５（１））。例えば、リンカーは、上記特許文献に記載されるようなものを採用すればよい。
（工程２）次に、目的とするＰＩポリアミドの合成に必要な単量体を用意する。単量体としては、ピロール基にカルボキシル基およびアミノ基を修飾した単量体（ピロール由来の単量体）、イミダゾール基にカルボキシル基およびアミノ基を修飾した単量体（イミダゾール由来の単量体）、およびβ−アラニン等が挙げられる。より具体的には、ピロール由来の単量体としては４−［（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、イミダゾール由来の単量体としては４−［（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸が挙げられる。本工程では、アミノ基は保護されたものであることが好ましい。ピロール由来の単量体とイミダゾール由来の単量体は、既知の方法で得る事ができる。これらの単量体のアミノ基の保護基は、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）および９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等を挙げることができる。保護基の導入は、既知の方法を用いればよい。
（工程３）本工程は、上記工程１で準備した固体担体に工程２で準備した各種単量体を結合させていく工程である。まず、アミノ基が保護された単量体を、固体担体のアミノ基に結合させる。次いで、単量体のアミノ基を脱保護し、次の単量体を結合させる。このアミノ基の脱保護と、単量体の結合を繰り返すことによって、固体担体とアミノ保護基を有する目的のＰＩポリアミドを得る（図１５（３））。アミノ基の脱保護と、単量体の結合（アミド結合の形成）は、既知の方法を用いることができる。
（工程４）上記工程３で得られたＰＩポリアミドの樹脂（Ｒ）とリンカーを除去し、アミノ保護基を有するＰＩポリアミドを得る。得られたポリアミドのカルボキシル基末端側でジメチルアミノプロピルアミン（Ｂｐ）を導入する（図１６（４））。カルボキシル基へのＢｐの導入（アミド結合の形成）は、既知の方法を用いることができる。
（工程５）Ｂｐを結合したＰＩポリアミドのアミノ保護基（Ｐ）を脱保護し、ＰＩポリアミノ末端に、タンパク質（例えば、ビオチン）をアミド結合させて、目的のＰＩポリアミド−タンパク質共役体を得る（図１６（５））。アミノ基の脱保護と、タンパク質の結合（アミド結合の形成）は、既知の方法を用いることができる。
ＰＩポリアミド−タンパク質共役体の合成方法の他の実施形態は、以下に説明するものである。上記工程１および２において、固体担体のアミノ基をカルボキシル基に置き換え、単量体のカルボキシル基を保護し、単量体のアミノ基と固体担体のカルボキシル基をまず結合する。次いで、保護したカルボキシル基を脱保護して、工程３と同様に、カルボキシル基の脱保護と適切な単量体のアミノ基の結合を繰り返すことで固体担体と保護基を含むＰＩポリアミドを得ることができる。その後、上記工程４および５と同様の手順でタンパク質とＢｐを導入することができる。また、さらなる他の実施形態としては、タンパク質またはＢｐを端緒として、単量体を順次結合させていってもよい。
本発明に係るＰＩポリアミドは、二本鎖特異的に結合する分子である為、標的、非標的核酸分子は二本鎖核酸分子であることが好ましい、より好ましくは標的、非標的核酸分子は二本鎖ＤＮＡである方が良い。
前記ステップ全ての場合における、ＰＩポリアミドの量については、ＰＩポリアミドの構造、配列特性や試料、二本鎖核酸分子の長さ等を考慮して適宜調整することが好ましい。前記ステップ全ての場合少なくとも全二本鎖核酸分子と当量以上であることが好ましい、更には、１０2倍量〜１０8倍量であることがより好ましい。
（３）担持体
本発明において用いられる担持体としては、二本鎖核酸分子が前記リンカー分子とリガンド分子が結合可能であれば特に限定されるものではなく、固形または液形あるいはゲル等のあらゆる相状態であってもよい。また、素材は、無機物、あるいは、有機物、あるいはこれらを組み合わせたものであっても良い。前記担持体は、ピロールイミダゾール含有ポリアミド末端リンカー分子と特異的な相互作用で結合するリガンド分子を有する。
本発明において用いられる担持体が、無機物である場合は、担持体は、珪酸含有物質、ゼオライト、酸化アルミニウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、カオリン、磁性粒子、セラミックス、からなる群より選択される１種以上であっても良い。また、前記珪酸含有物質がシリカ、磁性シリカ、ガラス、又は二酸化珪素であっても良い。
本発明において用いられる担持体が、有機物である場合は、担持体は、テフロン（登録商標）、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート共重合体、ポリウレタン、ポリベンズイミダゾール、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニルおよびポリ弗化ビニリデンからなる群より選択される１種以上で構成された有機高分子、あるいは、正もしくは負の荷電をもったナイロン、あるいは、セルロース、セルロース混合エステル、硝酸セルロース、酢酸セルロースおよびニトロセルロースからなる群より選択される１種以上で構成された多糖構造を有する有機高分子であっても良い。
また、本発明において用いられる担持体が、有機物であり、かつ、生体高分子である場合、タンパク質、炭水化物、脂質、及び核酸からなる群より選択される１種以上で構成されていても良い。
担持体の形状は特に限定されるものではなく、例えば固形であれば、粒子状であってもよく、膜状であってもよく、基板状であってもよい。また担持体は、複合体を形成させる容器等の内壁表面に固着させてもよい。例えば、非標的二本鎖核酸分子を複合体Ｂとして除去する際に、担持体ｂを容器内に固定し、複合体Ｂを容器内壁表面に形成し、容器から標的二本鎖核酸分子を含む上澄みを回収することができる。固形以外であれば、例えば、ゲル様体であっても良い。
本発明の実施例で用いる表面にアビジンを固定した担持体（磁性粒子、ビーズ等）は、担持体に各種官能基(アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、アルデヒド基等)を修飾し、アビジン分子中の官能基、もしくはリガンド分子を介してカップリングさせてアビジンを固定化する方法で作製することもできるが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施形態では、担持体へのアビジンの固定化方法の実施例で用いている磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ：ＪＳＲ株式会社製）は、ラテックス系粒子に磁性層をコートし、更にメタアクリレート系モノマーを主成分とした共重合体のシェルを形成させるが、これに限定されるものではない。表面のカルボキシル基とアビジン分子中のアミノ基をカップリングさせて、表面にアビジンが修飾された磁性粒子を作製することもできる。
他の担持体へのアビジンの固定化方法として、特許文献７（国際公開２０１２／１１１６８７号）に記載の方法も用いることができるが、これに限定されるものではない。
（４）リンカー分子およびリガンド分子
本発明において用語「リンカー分子」および「リガンド分子」とは、例えば、ストレプトアビジンとビオチンのように、互いに特異的に結合をすることができる分子のことをいう。本発明の実施例では、ピロールイミダゾール含有ポリアミドのリンカーとしてビオチンを用いており、担持体に固定されているリンカー分子と特異的な結合をするリガンド分子としてストレプトイアビジンを用いている。同様の結合様式を示す物質であれば、ストレプトアビジンとビオチンに限られず本発明に利用することができる。
本発明に係るＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の回収、濃縮方法において用いられる担持体は、表面上にＰＩポリアミド末端リンカー分子と特異的に共有結合、イオン結合あるいはファンデルワール力によって結合する分子(以下、「リガンド分子」ということもある)を有することが望まれる。より好ましくはＰＩポリアミド末端リンカー分子と特異的に共有結合並みの結合力がある分子を有する方が良い。
前記、ＰＩポリアミド末端リンカー分子と特異的に共有結合並みの結合力があるリガンド分子間の相互作用は、たとえば抗体／抗原(ストレプトアビジンービオチン結合)、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素／阻害物質、酵素／補因子、結合性タンパク質／基質、キャリヤータンパク質／基質、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エフェクター、核酸の相補鎖、タンパク質／核酸、リプレッサー／インデューサー、リガンド／細胞表面受容体、ウイルス／リガンドなどを、本発明の結合相互作用として採用できる。また、共有結合では、エステル、アミド、チオエステル、スルホンアミド、スルホネート、ホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、またはリン酸結合等の結合であってもよい。
（５）その他の試薬
（ｉ）バッファー
本発明に係るＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の回収、濃縮方法において用いることができるバッファーは、水、および、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、２価、および／または１価の陽イオンを少なくとも一つ以上含有する。含有されている界面活性剤、あるいは、塩は１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
なお、バッファーには、本発明の効果を阻害しない限りにおいて、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、２価の陽イオンを含む塩、または１価の陽イオンを含む塩以外の物質を含有していてもよい。
（ｉｉ）界面活性剤
本発明のバッファーには界面活性剤を添加することができる。当該界面活性剤としては、当該技術分野で一般的に使用されている界面活性剤から適宜選択して用いることができる。バッファーに含有する界面活性剤としては、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）等のイオン性界面活性剤であってもよいが、非イオン性界面活性剤が好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ（Polyoxyethylene（10）Octylphenyl Ether）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monolaurate）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０（Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monopalmitate）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０（Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monostearate）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monooleate）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（Polyoxyethylene（9）Octylphenyl Ether）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５（Polyoxyethylene（23）Lauryl Ether）、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８（Polyoxyethylene（20）Cethyl Ether）、ジギトニン、又はサポニン等がより好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、Ｔｗｅｅｎ ２０、又はＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０がさらに好ましい。
バッファーが界面活性剤を含有する場合、界面活性剤の濃度は、標的あるいは非標的二本鎖核酸分子とＰＩポリアミド間の結合あるいはＰＩポリアミドと担持体間の結合において非特異的な結合・吸着を抑えるブロッキング剤として機能するのに十分な濃度であれば良く、用いるＰＩポリアミドの量、構造、配列特性や試料等を考慮して適宜調節することができる。例えば、バッファーの界面活性剤は、調製後の溶液の体積の０．０５ｖ／ｖ％以下であり、好ましくは０〜０．０１ｖ／ｖ％以下であり、より好ましくは０ｖ／ｖ％である。
（ｉｉｉ）陽イオン
本発明において用いられるバッファーは、さらに、陽イオンを含有していることが好ましい。当該陽イオンとしては、１価の陽イオンであってもよく、２価の陽イオンであってもよい。陽イオンとしては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、アンモニウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンが挙げられる。とりわけ、リチウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、又はカルシウムイオンが好ましい。これらの陽イオンと対をなす陰イオンとしては、塩化物イオン、臭化物イオン、又はヨウ化イオンが好ましく、塩化物イオン又は臭化物イオンがより好ましく、塩化物イオンがさらに好ましい。
バッファーが陽イオンを含有する場合、陽イオン濃度は、ＰＩポリアミドと二本鎖核酸分子との結合、ＰＩポリアミドと担持体の結合反応が達成可能な濃度であればよく、用いられる陽イオンの種類や用いるＰＩポリアミドの量、構造、配列特性や試料等を考慮して適宜決定される。本発明において用いられるバッファーとしては、濃縮した標的二本鎖核酸分子をＰＣＲ等の一般的に用いられる分析に供することを考慮し、陽イオンが１モル／Ｌ以下であることが好ましい。
前記バッファーは、水を含み、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、２価の陽イオンを含む塩、および／または１価の陽イオンを含む塩のうち少なくとも一つ以上を必要に応じて溶解して調製する。バッファーの場合、当該バッファーのｐＨは、用いるＰＩポリアミドの量、構造、配列特性や試料、あるいは、回収された標的二本鎖核酸分子が供される分析方法等を考慮して適宜決定される。本発明においては、前記バッファーのｐＨは、ｐＨ５．０〜９．０であることが好ましく、ｐＨ６．５〜８．５であることがより好ましく、ｐＨ７．０〜８．５であることがさらに好ましい。バッファーは、核酸の抽出や精製、分析の際に当該技術分野で一般的に使用されているバッファーから適宜選択して用いることができる。当該バッファーとしては、具体的には、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）−ＨＣｌバッファー、リン酸バッファー等が挙げられる。バッファーを調製するための溶媒とする水としては、脱イオン水又は超純水が好ましい。
６．分析方法について
遺伝子解析をはじめとする核酸解析は、一般的に、解析対象の核酸を分析し、分析の結果得られた情報を解析する。核酸分析は、主に、核酸の塩基配列をシークエンサー等で直接読む方法、特定の塩基配列からなる領域と特異的にハイブリダイズするプライマーを起点としたポリメラーゼ反応を利用する方法、又は特定の塩基配列からなる領域と特異的にハイブリダイズするプローブを用いる方法により行われる。本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法によって得られた標的二本鎖核酸分子は、通常は多種多様な遺伝子の核酸又はその断片を含むため、解析対象遺伝子は、プライマーとプローブの少なくとも一方を用いる方法によって分析することが好ましい。少なくともプライマーを用いる方法としては、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、リアルタイムＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、及びこれらの改変方法等が挙げられる。また、プローブを用いる方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）法、ＤＮＡマイクロアレイ等が挙げられる。これらの方法は、適宜組み合わせて用いてもよい。
本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法では、微量の標的二本鎖核酸分子しか得られない場合がある。このため、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法により回収された標的二本鎖核酸分子を解析する方法としては、プローブを用いた核酸増幅反応を利用した分析方法や、第１段階としてＰＣＲ等により核酸を増幅させ、第２段階として、第１段階で得られた増幅産物に対して核酸分析を行う方法が好ましい。前者としては、例えば、特定の遺伝子型に特異的なプライマーを用いて伸長反応を行うアレル特異的伸長法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法等が挙げられる。後者としては、例えば、インベーダープラス法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（１本鎖高次構造多型）法等が挙げられる。中でも、解析対象の標的二本鎖核酸分子の量が非常に微量の場合であっても、高感度かつ高精度に核酸解析を行うことが可能であるため、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法によって得られた標的二本鎖核酸分子を、まずＰＣＲによって増幅させた後、シークエンサー等で直接読む方法、あるいは、まずＰＣＲによって増幅させた後、インベーダー法を行うインベーダープラス法が好ましい。
以下に、インベーダープラス法により、特定の遺伝子（解析対象遺伝子）を検出し解析する方法の例を示すが、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法により回収された標的二本鎖核酸分子の核酸解析方法は、これに限定されるものではない。
まず、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法により回収された標的二本鎖核酸分子溶液（第１ＰＩポリアミドを用いた場合では、第一の発明〜第三の発明の方法で回収した標的核酸分子を含む溶液、第２ＰＩポリアミドを用いた場合では、第四の発明〜第六の発明の方法で、担持体を回収除去した後の溶液）に、インベーダープラス反応液であるインベーダープラスバッファーと、解析対象遺伝子を検出するためのオリゴミックスと、エンザイムミックスとを混合した後に、変性処理（９５℃、２分間加熱）することによりＤＮＡの二重螺旋を一本鎖に融解させる。なお、オリゴミックスは、ＰＣＲ用プライマー、ＤＮＡプローブ、インベイディングオリゴ、ＦＲＥＴカセットから成る。
次に、ＰＣＲを行うことにより、解析対象遺伝子に相当する部分の核酸の増幅反応を行った後、ポリメラーゼの失活処理を行い、ＰＣＲを停止させる。
最後にインベーダー（登録商標）法を実施し、解析対象遺伝子に対応する核酸配列を有する領域に特異的にハイブリダイズしたＤＮＡプローブを分解させる。次いで、当該分解反応により生成されたＤＮＡの加熱プローブの５’−オリゴヌクレオチドが蛍光色素を持つＦＲＥＴカセットと結合し、さらに当該ＦＲＥＴカセットが分解されて蛍光色素が当該ＦＲＥＴカセットから遊離して蛍光を発光するようになる。この蛍光を測定することにより、解析対象遺伝子を間接的に検出し測定できる。すなわち、蛍光シグナル強度が対応する解析対象遺伝子の検出量を示す。
インベーダー（登録商標）法により解離された蛍光色素の蛍光シグナル強度は、蛍光測定装置で測定する。例えば、蛍光色素がＦＡＭの場合には、励起波長が４８５ｎｍ、発光波長が５３５ｎｍで観測されるＦＡＭの蛍光シグナル強度を測定する。当該蛍光測定装置としては、例えば、ロシュ・アプライド・サイエンス社製の蛍光測定装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０等が挙げられる。
７．キットについて
＜標的二本鎖核酸分子濃縮用キット＞
本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法に用いる材料、および試薬はキット化することで簡便に行うことができる。
本発明に係る標的二本鎖核酸分子を濃縮する方法のためのキットとしては、リンカー分子で修飾された第１ＰＩポリアミドおよび／または第２ＰＩポリアミド、リンカー分子に特異的に結合および／または吸着することができるリガンド分子で修飾された担持体、その他、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、２価の陽イオンを含む塩、およびまたは１価の陽イオンを含む塩を少なくとも一つ以上含む。これらの材料および試薬は上述したものをキットに含めることができる。
キットに含めることができるリンカー分子で修飾された第１ＰＩポリアミドおよび／または第２ＰＩポリアミドの識別領域（図１４（ａ）および（ｂ））は、遺伝子検査で検出したい標的遺伝子の特定の塩基配列に合わせて自在に分子設計することができる。
ピロールイミダゾール含有ポリアミドの２つの識別領域１２、１３（図１４（ａ））は、複数のイミダゾール（Ｉｍ）と、ピロール（Ｐｙ）と、β−アラニン（β−Ａｌａ）から任意選択的に選択される配列により構成される。識別領域１２、１３を構成するこれらのＩｍ、Ｐｙおよびβ−Ａｌａのそれぞれの分子間の連結はアミド結合により連結される。
識別部位の分子設計をする際には、以下の識別領域の化学的性質を考慮して設計する。２つの識別領域１２、１３を構成するこれらのＩｍ、Ｐｙおよびβ−Ａｌａは両領域間のペアの組み合わせにより二本鎖ＤＮＡのＡ−ＴペアとＧ−Ｃペアを認識することができる。２つの識別領域１２、１３の間で形成するＩｍ／Ｐｙペアは、ＤＮＡ二本鎖におけるＧ−Ｃペアを認識し、Ｐｙ／Ｐｙ、Ｐｙ／β−Ａｌａ、β−Ａｌａ／Ｐｙ、β−Ａｌａ／β−Ａｌａペアは、ＤＮＡ二本鎖におけるＡ−Ｔペアを認識する。その他にも様々な配列規則が明らかとなっている。例えば、ピロールイミダゾール含有ポリアミド配列中におけるβ残基あるいはβ−Ａｌａ／β−Ａｌａペアは、ピロールイミダゾール含有ポリアミドと認識ＤＮＡ二本鎖との結合における立体障害を緩和する働きがあり、ピロールイミダゾール含有ポリアミド配列において２残基あるいは３残基毎に導入してやることでより親和性を高めることができる。
第１ＰＩポリアミドの識別領域は標的二本鎖核酸分子に結合できる配列有し、かつ、以下の機能、特徴を少なくとも一つ以上有していることが好ましい。
（１）標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(Ｔ−ＡあるいはＡ−Ｔ)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を少なくとも一つ含む。
（２）標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(Ｔ−ＡあるいはＡ−Ｔ)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を二つ以上含むことで環状構造を形成することができる。
（３）配列内の２あるいは３残基毎にβ−アラニン残基を少なくとも１残基以上を含む。
（４）配列末端に担持体と特異的結合できるリンカー分子を少なくとも一つ含む。
（５）標的二本鎖核酸分子の塩基配列と非標的二本鎖核酸分子の塩基配列を十分に認識することができる長さを有するＰｙ、Ｉｍ、およびβ−Ａｌａを含む配列である。
前記第２ＰＩポリアミドの識別領域は、非標的二本鎖核酸分子に結合できる配列有し、かつ、以下の機能、特徴を少なくとも一つ以上有していることが好ましい。
（１）非標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(Ｔ−ＡあるいはＡ−Ｔ)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を少なくとも一つ含む。
（２）非標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(Ｔ−ＡあるいはＡ−Ｔ)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を二つ以上含むことで環状構造を形成することができる。図１４（ｂ）に示されるように、２つの識別領域の両末端に連結領域を導入して、環状構造とすることもできる。環状構造の一般式を有する。図１４（ｂ）中２つあるリンカー分子は両方有していてもよく、どちらか一方だけでもよい。
（３）配列内の２あるいは３残基毎にβ−アラニン残基を少なくとも１残基以上を含む。
（４）配列末端に担持体と特異的結合できるリンカー分子を少なくとも一つ含む。
（５）標的二本鎖核酸分子の塩基配列と非標的二本鎖核酸分子の塩基配列を十分に認識することができる長さを有するＰｙ、Ｉｍ、およびβ−Ａｌａを含む配列である。
より好ましくは、第１ＰＩポリアミドは標的二本鎖核酸分子と結合する配列を有し、第２ＰＩポリアミドが非標的二本鎖核酸分子と結合する配列を有し、かつ、前記（１）、（２）いずれか一つの構成及び（３）、（４）、（５）の構成を有することが好ましい。
キットに含めることができる前記第１ＰＩポリアミドおよび第２ＰＩポリアミドは、上述した式１のヘアピン構造を有するものであってもよく、また上述した式２の環状構造を有するものであってもよい。
キットに含ませることができる修飾された担持体を修飾するリンカー分子と特異的に結合できるリガンド分子は、第１ＰＩポリアミドおよび／または第２ＰＩポリアミドに修飾されているリンカー分子と特異的に結合する分子である。
キットに含ませることができる界面活性剤は、調製後の濃度が０．０５ｖ／ｖ％以下とできるように含ませることが好ましい。１価の陽イオンおよび／または２価の陽イオンを含む塩は、調整後の濃度が１モル／Ｌ以下とできるように含ませることが好ましい。
キットの一実施形態としては、試験管の中に予めリンカー分子で修飾された第１ＰＩポリアミドおよび／または第２ＰＩポリアミドと、リガンド分子で修飾された担持体と、必要な試薬等を投入しておく形態のものでもよい。
本実施形態で用いる試験管は、試験管内部に核酸が吸着しないような加工がされているものが好ましい。別の実施形態では、試験管内部をリガンド分子で修飾しておく形態のものでもよい。別の実施形態では、試験管は採血管であってもよい。例えば、第１ＰＩポリアミドおよび／または第２ＰＩポリアミドと、リガンド分子で修飾された担持体と、必要な試薬等を投入した採血管を用いて直接患者の血液を採血することで、その後直ぐに標的二本鎖核酸分子の濃縮、および分析の作業に持ち込むことができる。
７．本発明の解析対象となる遺伝子について
本願発明において、標的とすることができる遺伝子は、これに限られるものでないが、ゲノム薬理学（ＰＧｘ：Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）の分野において一塩基多型（ＳＮＰ）の解析で標的とされる遺伝子であれば、適用することができる。
なお、本明細書において遺伝子の「ファミリー」とは、特定の遺伝子のスーパーファミリーおよびサブファミリーの双方を含む用語である。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、ＲＡＳとそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、ＲＡＳのスーパーファミリーは、ＲＨＯ、ＲＡＢ、ＡＲＦ、ＲＡＮおよびこれらのサブファミリーを含み、ＲＡＳのサブファミリーとしては、例えば、Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ，Ｈ−ＲＡＳが含まれ、ＲＨＯのサブファミリーとしては、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ、ＲＡＣ１、およびＣＤＣ４２を含み、ＲＡＢのサブファミリーとしては、ＲＡＢ１，ＲＡＢ２、ＲＡＢ３Ａ、ＲＡＢ４、ＲＡＢ２７が含まれるが、これに限定されるものではない。
好ましくは、Ｋ−ＲＡＳのエクソン２、３および４における変異の有無の解析が好ましい。Ｋ−ＲＡＳ遺伝子エクソン２においては、コドン１２、１３の変異の有無の解析が好ましい。好ましくは、Ｋ−ＲＡＳ遺伝子のエクソン３においてはコドン６１の変異の有無の解析が好ましい。好ましくは、Ｋ−ＲＡＳ遺伝子のエクソン４においてはコドン１１７および１４６の変異の有無の解析が好ましい。
Ｎ−ＲＡＳのエクソン２および３における変異の有無の解析が好ましい。Ｎ−ＲＡＳのエクソン２においては、コドン１２および１３の変異の有無の解析が好ましい。若しくは、Ｎ−ＲＡＳのエクソン３においては、コドン６１の変異の解析が好ましい。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、シトクロムＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ）とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれるが、これに限定されるものではない。ＣＹＰのサブファミリーとしては、例えば、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子（ＧＳＴＴ）とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、ＧＤＴＴのサブファミリーとしては、例えば、ＧＳＴＴ１、ＧＳＴＴＭ１、およびＧＳＴＰ１が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、Ｎ−アセチル化転移酵素遺伝子（ＮＡＴ）とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、ＮＡＴのサブファミリーとしては、例えば、ＮＡＴ１、ＮＡＴ２が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、チミジル酸合成酵素遺伝子（ＴＳ）とそのファミリー、これらの変異体およびＴＳの３’非翻訳領域、３’非翻訳領域が含まるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、ＵＤＰグルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、ＵＧＴのサブファミリーとしては、例えば、ＵＧＴ１Ａ１が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、除去修復交差相補遺伝子（ＥＲＣＣ）とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、ＥＲＣＣのサブファミリーとしては、例えば、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ２が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれが、これに限定されるものではない。ＭＤＲのサブファミリーとしては、例えば、ＭＤＲ１、ＭＤＲ２が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、遺伝子修復蛋白質遺伝子（ＸＲＣＣ）とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、ＸＲＣＣのサブファミリーとしては、例えば、ＸＲＣＣ１、ＸＲＣＣ５が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容蛋白質遺伝子（ＣＲＨＲ）とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、ＭＤＲのサブファミリーとしては、例えば、ＣＲＨＲ１、ＣＲＨＲ２が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、乳がん抑制遺伝子（ＢＲＣＡ）とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、ＢＲＣＡのサブファミリーとしては、例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、がん抑制遺伝子（ＭＳＨ）とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれが、これに限定されるものではない。ＭＳＨのファミリーとしては、例えば、ＲＢ、ｐ５３、ＡＰＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＷＴ１、ＶＨＬ、ＢＲＣＡ、ＣＨＥＫ２、ＭＡＳＰＩＮ、Ｐ７３、ＤＰＣ４（ＳＭＡＤ４）、ＭＳＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＤＣＣ、ＰＴＥＮ、ＳＤＨＤ、Ｐ１６、Ｐ５７ＫＩＰ２、ＰＴＣ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２遺伝子が含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、ゲムシタビン代謝酵素遺伝子（ＣＤＡ）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤＰＤ）、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＭＴＨＦＲ）、オロテートホスホリボシル トランスフェラーゼ遺伝子（ＯＰＲＴ）、セロトニントランスポーター遺伝子（５−ＨＴＴ）、血液凝固第Ｖ因子遺伝子（Ｆａｃｔｏｒ Ｖ）、ビタミンＫエポキシド還元酵素複合体１遺伝子（ＶＫＯＲＣ１）、ＡＰＥＸ１、ＤＣＫ、ＤＰＹＤ、ＴＹＭＰ、ＭＬＨ１、ＵＭＰＳ、ＰＣＮＡ、ＰＯＬＡ、ＲＲＭ１、ＳＬＣ２９Ａ１、ＴＫ１、ＵＮＧ、ＡＣＴＢ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＦＯＸＬ２、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＫＩＴ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、およびＴＰ５３から選択される群からなる遺伝子とこれらの遺伝子のファミリー、およびこれらの遺伝子から選択される遺伝子の変異体が含まれる。
その他、本発明において、標的とすることができる遺伝子群として、出生前診断において検査対象となる遺伝子群、遺伝病として公知の遺伝子、アルツハイマー病などタンパク質の変異・変性が関係する疾患に関連する遺伝子群が含まれる。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、ＭＬＨ１遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、これに限られるものではないが、ＭＬＨ１遺伝子の解析領域は、エクソン１−エクソン１９であることが好ましい。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、ＭＳＨ２遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、これに限られるものではないが、ＭＳＨ２遺伝子の解析領域は、エクソン１−エクソン１６であることが好ましい。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、ＭＳＨ６遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれが、これに限定されるものではない。ＭＳＨ６遺伝子の解析領域は、エクソン１−エクソン１０であることが好ましい。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、ＰＭＳ２遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、これに限られるものではないが、ＰＭＳ２遺伝子の解析領域は、エクソン１−エクソン１５であることが好ましい。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、ＡＰＣ遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、これに限られるものではないが、ＡＰＣ遺伝子の解析領域は、エクソン１−エクソン１５であることが好ましい。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、ＭＥＮ１遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、これに限られるものではないが、ＭＥＮ１遺伝子の解析領域は、エクソン２−エクソン１０であることが好ましい。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、ＲＥＴ遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれが、これに限定されるものではない。ＲＥＴ遺伝子の解析領域は、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１３−エクソン１５であることが好ましい。ＲＥＴ遺伝子のエクソン１５におけるＡ８８３Ｆの変異の有無、またはエクソン１６におけるＭ９１８Ｔ、またはＳ９９２Ｓの変異の有無を解析するのがより好ましい。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、ＴＰ５３遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれ、ＴＰ５３遺伝子の解析領域は、エクソン１−エクソン１１であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれが、これに限定されるものではない。ＥＧＦＲ遺伝子の解析領域は、エクソン１８−エクソン２１であることが好ましい。ＥＧＦＲ遺伝子のＳ４９２Ｒにおける変異の有無を解析することがより好ましい。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、ＢＲＡＦ遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれが、これに限定されるものではない。ＢＲＡＦ遺伝子の解析領域は、エクソン１５であることが好ましい。ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５におけるＶ５００ＥまたはＫの変異の有無を解析することが好ましい。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、ｃ−ｋｉｔ遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれが、これに限定されるものではない。ｃ−ｋｉｔ遺伝子の解析領域は、エクソン９、１１、１３、および１７であることが好ましい。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、ＰＤＧＦＲα遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれが、これに限定されるものではない。ＰＤＧＦＲα遺伝子の解析領域は、エクソン１２および１８であることが好ましい。
本発明において、標的とすることができる別の遺伝子は、ＰＤＧＦＲ遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれが、これに限定されるものではない。ＰＤＧＦＲ遺伝子の解析領域は、エクソン１４であることが好ましい。
本発明において、標的とすることができるさらに別の遺伝子は、ＴＰ５３遺伝子とそのファミリー、およびこれらの変異体が含まれが、これに限定されるものではない。ＴＰ５３遺伝子の解析領域は、エクソン５−８であることが好ましい。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（実施例１：第１ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮）
表１に示す塩基配列の違いを有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を５０００分子：５×１０5分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率１％)とした試料Ａ、５００分子：５×１０5分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％)とした試料Ｂ、５０分子：５×１０5分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．０１％)とした試料Ｃの３つの試料と図１７に示す標的二本鎖核酸分子と結合することができる配列を有する本発明に係る第１ＰＩポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ（ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を本発明に係る担持体として用い、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第二の発明の方法により標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドＤＮＡを用いて実施した。
なお、表１に記載の塩基配列のうち配列番号１の塩基配列は、本発明に係る第１ＰＩポリアミドが結合する標的二本鎖核酸分子のセンス側の部位の塩基配列（結合に関係する部分のみ）を示している。また、表１に記載の塩基配列のうち配列番号２の塩基配列は、本発明に係る第２ＰＩポリアミドが結合する非標的二本鎖核酸分子のセンス側の部位の塩基配列（結合に関係する部分のみ）を示している（以下、同じ）。もっともいずれの二本鎖核酸分子を標的とするかは、目的により変動しうるのであり、目的によっては、表１の標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子とし、表１の非標的二本鎖核酸分子を標的二本鎖核酸分子とすることもありうる。
また、表１のアンチセンス側の塩基配列の記載は省略している（以下同じ）。
尚、本実施例における標的二本鎖核酸分子は、Ｋ−ＲＡＳコドン１２Ｇ１２Ｖ変異型の塩基配列に相当し、非標的二本鎖核酸分子は、Ｋ−ＲＡＳコドン１２野生型の塩基配列に相当する。まず、各試料中に第１ＰＩポリアミドを１×１０7分子相当を添加し、十分に混和し、６０分インキュベートする。その後、混合物にストレプトアビジン標識磁性ビーズを１００μｇ添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離した。
Figure 0006920683
分離したストレプトアビジン標識磁性ビーズには、標的二本鎖核酸分子が結合していると想定し、２０μＬの分散液としてＴＥバッファーを添加し、これを分析用試料とした。
前記分析用試料を市販ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ用試薬キット(ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｆｏｒ ｄｄＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)とｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム(ＱＸ１００TM ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)を用いて分析試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）を測定し、濃縮効果（倍）（濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）／各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％））を算出した。
Figure 0006920683
表２の測定結果より、本発明における標的二本鎖核酸分子の濃縮方法用いることで試料Ａ(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率１％)は、１００％となり、濃縮前と比較して１００倍濃縮された。次に、試料Ｂ(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％)では、１００．０％となり、濃縮前と比較して１０００倍濃縮された。次に、試料Ｃ(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．０１％)では、１４．３％となり、濃縮前と比較して１４３０倍濃縮された。この事から、本発明における第１ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法によって、一塩基の違いを識別して、試料中より標的二本鎖核酸分子を回収することで最大で１４３０倍濃縮できたことが明らかとなった。
（実施例２：第２ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮）
表１に示す標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を１００分子：１×１０4分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率１％)とした試料Ｄと図１７に示す非標的二本鎖核酸分子と結合することができる配列を有する本発明に係る第２ＰＩポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ（ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を本発明に係る担持体として用い、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第六の発明の工程１〜５で標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドＤＮＡを用いて実施した。まず、第２ＰＩポリアミドを１×１０7分子相当と、ストレプトアビジン標識磁性ビーズを１００μｇ添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分インキュベートする。次に、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離する。その後、第２ＰＩポリアミドが結合したストレプトアビジン標識磁性ビーズに試料Ｄを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分間インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離した。
分離した液性成分に標的二本鎖核酸分子が残留していると仮定し、分析用試料とした。前記分析用試料を市販ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ用試薬キット(ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｆｏｒ ｄｄＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)とｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム(ＱＸ１００TM ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)を用いて分析試料中の標的二本鎖核酸分子と非標的核酸二本鎖核酸分子の分析試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）を測定し、濃縮効果（倍）（濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）／各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％））を算出した。
Figure 0006920683
表３の測定結果より、本発明における標的二本鎖核酸分子の濃縮方法用いることで試料Ｄ(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率１％)は、１５．０％となり、濃縮前と比較して１５倍濃縮された。この事から、本発明における第２ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法によって、一塩基の違いを識別して試料中より非標的二本鎖核酸分子を除去することで１５倍濃縮できたことが明らかとなった。
（実施例３：第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドを併用した標的二本鎖核酸分子の濃縮［１］）
表４に示す塩基配列の違いを有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を５００分子：５×１０5分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％)とした試料（試料Ｅ）と図１７、１８に示す本発明に係る第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ（ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を本発明に係る担持体として用い、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第五の発明の工程１〜３および第三の発明の工程１〜５を組み合わせることにより標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドＤＮＡを用いて実施した。尚、本実施例における標的二本鎖核酸分子は、Ｋ−ＲＡＳコドン１３Ｇ１３D変異型の塩基配列に相当し、非標的二本鎖核酸分子は、Ｋ−ＲＡＳコドン１２野生型の塩基配列に相当する。まず、図１７に示す第２ＰＩポリアミド１×１０7分子相当を、試料Ｅに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、３０分間インキュベートする。ここまでの手順が本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第五の発明に相当する。
次に、図１９に示す第１ＰＩポリアミドを１×１０7分子相当に、ストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分間インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離する。分離した第１ＰＩポリアミドが結合したストレプトアビジン標識磁性ビーズを、第２ＰＩポリアミドと試料Ｅの混合物に全量添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分間インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離した。以上の本段落における手順が本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第三の発明に相当する。
Figure 0006920683
分離したストレプトアビジン標識磁性ビーズには、標的二本鎖核酸分子が結合していると仮定し、分散液として２０μＬのＴＥバッファーを添加し、これを分析用試料とした。前記分析用試料を市販ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ用試薬キット(ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｆｏｒ ｄｄＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)とｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム(ＱＸ１００TM ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)を用いて分析試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）を測定し、濃縮効果（倍）（濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）／各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％））を算出した。また、参照データとして図１９に示す第１ＰＩポリアミドのみを用いた本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において第五の発明の工程１〜３と第三の発明の工程１〜５を組み合わせて標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した際の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）の測定結果及び算出した濃縮効果（倍）と比較した。
Figure 0006920683
表５の測定結果の実測データより、本発明における第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドを併用した標的二本鎖核酸分子の濃縮方法を用いることで試料Ｅ(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％)は、５０．０％となり、濃縮前と比較して５００倍濃縮された。この事から、本発明における第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドを併用し、第五の発明の工程１〜３と第三の発明の工程１〜５を組み合わせた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法によって、一塩基の違いを識別して試料中より非標的二本鎖核酸分子の誤捕捉を低減しつつ、標的二本鎖核酸分子を捕捉することで５００倍濃縮できたことが明らかとなった。
表５の測定結果の参照データと実測データの比較より、本発明における第１ＰＩポリアミドのみを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法に比べ、本発明における第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドを併用し、第五の発明の工程１〜３と第三の発明の工程１〜５を組み合わせた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法を用いることで標的二本鎖核酸分子の含有率（％）及び濃縮効果（倍）は、およそ１．５倍程度向上させることができることが明らかとなった。
（実施例４：第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドを併用した標的二本鎖核酸分子の濃縮［２］）
表４に示す塩基配列の違いを有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子１００分子：１×１０4分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率１％)とした試料Ｆ、１０分子：１×１０4分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％)とした試料Ｇ、５分子：５×１０4分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．０１％)とした試料Ｈの３つの試料と図１８、１９に示す本発明に係る第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ（ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を本発明に係る担持体として用いて本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第五の発明の工程１〜５と第三の発明の工程１〜５の手順を組み合わせて標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドＤＮＡを用いて実施した。まず、図１８に示す第２ＰＩポリアミド１×１０7分子相当を、試料に添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分間インキュベートする。その後、ストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分間インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離する。当該液性成分を次工程では処理済試料とする。本手順が本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第五の発明の工程１〜５に相当する。
次に図２０に示す第１ＰＩポリアミドを１×１０7分子相当に、ストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分間インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離する。分離した第１ＰＩポリアミドが結合したストレプトアビジン標識磁性ビーズを、前記処理済試料へ全量添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分間インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離した。本手順が本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第三の発明の工程１〜５に相当する。
分離したストレプトアビジン標識磁性ビーズには、標的二本鎖核酸分子が結合していると仮定し、分散液として２０μＬのＴＥバッファーを添加し、これを分析用試料とした。前記分析用試料を市販ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ用試薬キット(ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｆｏｒ ｄｄＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)とｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム（ＱＸ１００TM ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて分析試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）を測定し、濃縮効果（倍）（濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）／各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％））を算出した。また、参照データとして図２０に示す第１ＰＩポリアミドのみを用いた本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において第五の発明と第三の発明の工程を組み合わせて標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した際の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）の測定結果及び算出した濃縮効果（倍）と比較した。
Figure 0006920683
表６の測定結果より、試料Ｆ(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率１％)は、１００.０％となり、濃縮前と比較して１００倍濃縮された。次に、試料Ｇ(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％)では、１００.０％となり、濃縮前と比較して１０００倍濃縮された。次に、試料Ｈ (試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．０１％)では、５０．０％となり、濃縮前と比較して５０００倍濃縮された。この事から、本発明における第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドを併用し、第五の発明の工程１〜５と第三の発明の工程１〜５を組み合わせた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法によって、一塩基の違いを識別して試料中より非標的二本鎖核酸分子を除去し、かつ、標的二本鎖核酸分子を捕捉することで最大で５０００倍濃縮できたことが明らかとなった。
表６の測定結果の参照データと実測データの比較より、本発明における第１ＰＩポリアミドのみを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法に比べ、本発明における第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドを併用し第五の発明の工程１〜５と第三の発明の工程１〜５の手順を組み合わせた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法を用いることで標的二本鎖核酸分子の含有率（％）及び濃縮効果（倍）は、試料Ｆではおよそ４．２倍程度、試料Ｇではおよそ３倍程度、試料Ｈではおよそ５．５倍程度向上させることができることが明らかとなった。
また、実施例３における本発明における第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドを併用し、第五の発明の工程１〜３と第三の発明の工程１〜５を組み合わせた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法（実施例３の試料Ｅの実測データと、実施例４の試料Ｇの実測データの比較）と比較すると、本発明における第１ＰＩポリアミドのみを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法に比べ、本発明における第１ＰＩポリアミドと第２ＰＩポリアミドを併用し第五の発明の工程１〜５と第三の発明の工程１〜５の手順を組み合わせた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法を用いることで標的二本鎖核酸分子の含有率（％）及び濃縮効果（倍）は、およそ２．０倍程度向上させることができることが明らかとなった。
（実施例５：第１ＰＩポリアミドを用いた血清・血漿中標的二本鎖核酸分子の濃縮）
表１に示す塩基配列の違いを有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を５００分子：５×１０5分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％) で健常人ヒト血清に添加した試料Iと、５００分子：５×１０5分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％) で健常人ヒト血漿に添加した試料Ｊと図１７に示す標的二本鎖核酸分子と結合することができる配列を有する本発明に係る第１ＰＩポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ（ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を本発明に係る担持体として用いて本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第二の発明の方法により標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドＤＮＡを用いて実施した。 まず、各試料中に第１ＰＩポリアミドを１×１０7分子相当を添加し、十分に混和し、６０分間インキューベーとする。その後、混合物にストレプトアビジン標識磁性ビーズを１００μｇ添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分間インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離した。
分離したストレプトアビジン標識磁性ビーズには、標的二本鎖核酸分子が結合していると仮定し、分散液として２０μＬのＴＥバッファーを添加し、これを分析用試料とした。前記分析用試料を市販ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ用試薬キット(ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｆｏｒ ｄｄＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)とｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム(ＱＸ１００TM ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)を用いて分析試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）を測定し、濃縮効果（倍）（濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）／各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％））を算出した。
Figure 0006920683
表７の測定結果より、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法を用いることで試料Ｉ（試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％）では、６．６％となり、濃縮前と比較して６６倍濃縮された。試料Ｊ（試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％）では、９．８％となり、濃縮前と比較して９８倍濃縮された。この事から、本発明における第１ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法によって、一塩基の違いを識別して、血清あるいは血漿試料中より標的二本鎖核酸分子を回収することで６６あるいは９８倍濃縮できたことが明らかとなった。また、本結果より、本発明に係る本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法では、核酸精製工程を必要とせず液体生検（血清・血漿あるいは尿）から直接的に標的二本鎖核酸分子を回収、濃縮できることが明らかとなった。
（実施例６：第１ＰＩポリアミドを用いての繰り返し濃縮(複合体Aを形成する場合)の効果）
表８に示される異なる塩基配列を有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を５０分子：５×１０5分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．０１％)とした試料Ｋと、図１７に示す本発明に係る第１ＰＩポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ（ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を担持体として用いた。二本鎖核酸分子は、制限酵素処理済のプラスミドＤＮＡを用いた。尚、本実施例における標的二本鎖核酸分子は、Ｋ−ＲＡＳコドン１２Ｇ１２V変異型の塩基配列に相当し、非標的二本鎖核酸分子は、Ｋ−ＲＡＳコドン１２野生型の塩基配列に相当する。
（実施例６−１）
［複合体ａ１の形成を経た複合体Ａの形成］
１．複合体ａ１の形成
第１ＰＩポリアミド１×１０7分子相当を試料Ｋが入ったマイクロチューブに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で１０分間インキュベートし、第１ＰＩポリアミドとストレプトアビジン標識磁性ビーズの複合体（複合体ａ１）を形成した。
２．繰り返し複合体Ａの形成
複合体a１が入ったマイクロチューブにストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で６０分間インキュベートし、複合体ａ１とストレプトアビジン標識磁性ビーズを結合させ複合体Ａを形成した。インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体Ａ−１に分離した。分離した液性成分に、新たにストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇを添加し、上記と同様の操作を行い、複合体Ａと液性成分を分離した。この操作を繰り返し３回行い、複合体Ａを３セット（順に複合体Ａ−１、複合体Ａ−２、複合体Ａ−３）それぞれ分離した。
３．定量分析
分離した複合体Ａを全て一つのチューブに移し、分散液として２０μＬのＴＥバッファーを添加し、これを分析用サンプルとした。前記分析用サンプルを市販のｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ用試薬キット(ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｆｏｒ ｄｄＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)とｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム(ＱＸ１００TM ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)を用いて分析サンプル中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）を測定し、濃縮効果（倍）（濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）／各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％））を算出した。尚、複合体Ａ−１のみを分析用サンプルとした場合の結果を比較対象とした。
表９に測定結果を示す。本発明における第１ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において複合体ａ１とストレプトアビジン標識磁性ビーズを混合して複合体Ａを形成、分離する工程を繰り返し実施することでは、７．２％となり、濃縮前と比較して７２０倍濃縮された（試料中の標的二本鎖核酸分子含有率は１％である）。複合体Ａ形成工程を１回のみ行った場合（含有率３.３％、濃縮効果（倍）３３０倍）に比べ、約２倍濃縮効果が高くなった。
Figure 0006920683
Figure 0006920683
（実施例６−２）
［複合体ａ２の形成を経た複合体Ａの形成］
１．複合体ａ２の形成
第１ＰＩポリアミド１×１０7分子相当とストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇをマイクロチューブ中で混合し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で３０分間インキュベートし、第１ＰＩポリアミドとストレプトアビジン標識磁性ビーズの複合体(複合体ａ２)を形成し、インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体ａ２に分離した。分離した液性成分に新たに第１ＰＩポリアミド１×１０7分子相当とストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇを添加し、上記と同様の操作を行い、複合体ａ２を分離した。この操作を繰り返し３回行い、複合体a２を３セット（順に複合体a２−１、複合体ａ２−２、複合体ａ２−３）準備した。
２．繰り返し複合体Ａの形成
（２−１）複合体a２−１を試料Ｋが入ったマイクロチューブに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分間インキュベートし、複合体Ａ−１を形成する。インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体Ａ−１に分離した。
（２−２）液性成分中に上記で作成した複合体a２−２、複合体a２−３を用いて、（２−１）と同様の手順で２回繰り返し、複合体Ａ−２、複合体Ａ−３を形成、分離した。
３．定量分析
分離した複合体Ａ全てに分散液として２０μＬのＴＥバッファーを添加し、分散液としてこれを分析用サンプルとした。前記分析用サンプルを市販ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ用試薬キット（ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｆｏｒ ｄｄＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）とｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム（ＱＸ１００TM ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて分析サンプル中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）を測定し、濃縮効果（倍）（濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）／各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％））を算出した。尚、複合体Ａ−１のみを分析用サンプルとした場合の結果を比較対象とした。
表１０に測定結果を示す。本発明における第１ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において複合体ａ２と試料とを混合して複合体Ａを形成、分離する工程を繰り返し実施することでは、１５．６％となり、濃縮前と比較して１５６０倍濃縮された（試料中の標的二本鎖核酸分子含有率は１％である）。複合体Ａ形成工程を１回のみ行った場合（含有率５.４％、濃縮効果（倍）５４０倍）に比べ、約３倍濃縮効果が高くなった。
Figure 0006920683
これらの結果から、第１ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において複合体ａ２と試料を混合して複合体Ａを形成する工程、あるいは、複合体ａ１と担持体ａ（ストレプトアビジン標識磁性ビーズ）を混合して複合体Ａを形成する工程を繰り返し実施することで、より標的二本鎖核酸分子を濃縮できることが示された。
（実施例７：第２ＰＩポリアミドを用いての繰り返し濃縮(複合体Ｂを形成する場合)の効果）
表８に示される異なる塩基配列を有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を１００子：１×１０4分子（試料中の標的二本鎖核酸分子含有率１％）とした試料Ｌと、図１８に示される本発明に係る第２ＰＩポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ（ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を本発明に係る担持体として用いて実施する。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドＤＮＡを用いて実施した。
（実施例７−１）
［複合体ｂ１の形成を経た複合体Ｂの形成］
１．複合体ｂ１の形成
第２ＰＩポリアミド１×１０7分子相当を試料Ｌが入ったマイクロチューブに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で６０分間インキュベートし、第２ＰＩポリアミドとストレプトアビジン標識磁性ビーズの複合体（複合体ｂ１）を形成した。
２．繰り返し複合体Ｂの形成
複合体ｂ１が入ったマイクロチューブにストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で６０分間インキュベートし、複合体ｂ１とストレプトアビジン標識磁性ビーズを結合させ複合体Ｂを形成する。インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体Ｂ−１に分離した。分離した液性成分に、新たにストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇを添加し、上記と同様の操作を行い、複合体Ｂを分離した。この操作を繰り返し３回行い、複合体Ｂを３セット（順に複合体Ｂ−１、複合体Ｂ−２、複合体Ｂ−３）それぞれ分離した。
３．定量分析
分離した液性成分を分析用サンプルとした。前記分析用サンプルを市販ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ用試薬キット（ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｆｏｒ ｄｄＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）とｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム（ＱＸ１００TM ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて分析サンプル中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）を測定し、濃縮効果（倍）（濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）／各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％））を算出した。尚、複合体Ｂ−１を分離後の液性成分を分析用サンプルとした場合の結果を比較対象とした。
表１１に測定結果を示す。本発明における第２ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において複合体ｂ１とストレプトアビジン標識磁性ビーズを混合して複合体Ｂを形成、分離する工程を繰り返し実施することでは、１１．３％となり、濃縮前と比較して１１．３倍濃縮された（試料中の標的二本鎖核酸分子含有率は１％である）。複合体Ｂ形成工程を１回のみ行った場合（含有率５．２％、濃縮効果（倍）５．２倍）に比べ、約２倍濃縮効果が高くなった。
Figure 0006920683
（実施例７−２）
［複合体ｂ２の形成を経た複合体Ｂの形成］
１．複合体ｂ２の形成
第２ＰＩポリアミド１×１０7分子相当とストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇをマイクロチューブ中で混合し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で６０分間インキュベートし、第２ＰＩポリアミドとストレプトアビジン標識磁性ビーズの複合体（複合体ｂ２）を形成し、インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体ｂ２に分離した。
分離した液性成分に、新たに第２ＰＩポリアミド１×１０7分子相当とストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇを添加し、上記と同様の操作を行い、複合体ｂ２を分離した。この操作を繰り返し３回行い、複合体ｂ２を３セット（順に複合体ｂ２−１、複合体ｂ２−２、複合体ｂ２−３）準備した。
２．繰り返し複合体Ｂの形成
（２−１）複合体ｂ２−１を試料Ｌが入ったマイクロチューブに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、６０分インキュベートし、複合体Ｂ−１を形成する。インキュベート後、磁気スタンドを用いてと液性成分と複合体Ｂ−１に分離した。
（２−２）液性成分中に、上記で作成した複合体ｂ２−２、複合体ｂ２−３を用いて（２−１）と同様の手順で２回繰り返し、複合体Ｂ−２、複合体Ｂ−３を形成して分離した。
３．定量分析
分離した液性成分を分析用サンプルとした。前記分析用サンプルを市販ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ用試薬キット（ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｆｏｒ ｄｄＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）とｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム（ＱＸ１００TMｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて分析サンプル中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）を測定し、濃縮効果（倍）（濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）／各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％））を算出した。尚、複合体ｂ２−１分離後の液性成分を分析用サンプルとした場合の結果を比較対象とした。
表１２に測定結果を示す。本発明における第２ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において複合体ｂ２と試料を混合して複合体Ｂを形成、分離する工程を繰り返し実施することでは、２４．３％となり、濃縮前と比較して２４．３倍濃縮された（試料中の標的二本鎖核酸分子含有率は１％である）。複合体Ｂ形成工程を１回のみ行った場合（含有率１５.０％、濃縮効果（倍）１５．０倍）に比べ、約１．５倍濃縮効果が高くなった。
Figure 0006920683
これらの結果から、第２ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において複合体ｂ２と試料を混合して複合体Ｂを形成する工程、あるいは、複合体ｂ１と担持体ｂ（ストレプトアビジン標識磁性ビーズ）を混合して複合体Ｂを形成する工程を繰り返し実施することで、標的二本鎖核酸分子をより濃縮できることが示された。
（実施例８：塩と界面活性剤の効果）
表１３に示される異なる塩基配列を有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を５００分子：５×１０5分子（試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％）とした試料Ｍと、図１８に示される本発明に係る第１ＰＩポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ（ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅTM ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を本発明に係る担持体として用いた。二本鎖核酸分子は、制限酵素処理済のプラスミドＤＮＡを用いた。尚、本実施例における標的二本鎖核酸分子は、Ｋ−ＲＡＳコドン１２Ｇ１２C変異型の塩基配列に相当し、非標的二本鎖核酸分子は、Ｋ−ＲＡＳコドン１２野生型の塩基配列に相当する。又、複合体ａ１および複合体Ａを形成する条件について表１４の３つの条件でそれぞれ実施し、塩と界面活性剤の効果を確認した。
１．複合体ａ１の形成
第１ＰＩポリアミド１×１０7分子相当を試料Ｍが入ったマイクロチューブに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で６０分インキュベートし、第１ＰＩポリアミドとストレプトアビジン標識磁性ビーズの複合体（複合体ａ１）を形成した。
２．複合体Ａの形成
複合体a１が入ったマイクロチューブにストレプトアビジン標識磁性ビーズ１００μｇを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で６０分インキュベートし、複合体ａ１とストレプトアビジン標識磁性ビーズを結合させ複合体Ａを形成した。インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体Ａに分離した。
３．定量分析
分離した複合体Ａに分散液として２０μＬのＴＥバッファーを添加し、これを分析用サンプルとした。前記分析用サンプルを市販のｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ用試薬キット（ＰｒｉｍｅＰＣＲ ｆｏｒ ｄｄＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）とｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム(ＱＸ１００TM ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製)を用いて分析サンプル中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）を測定し、濃縮効果（倍）（濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率（％）／各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率（％））を算出した。
表１５に測定結果を示す。本発明における第１ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において条件１で複合体ａ１および複合体Ａを形成した場合 (試料中の標的二本鎖核酸分子含有率０．１％)は、４.２％となり、濃縮前に比べ４２倍の濃縮効果となった、条件２の場合は、４９．０％、条件３の場合は、５２．１％となり、それぞれ濃縮前に比べ４９０倍、５２１倍濃縮され、条件１と比べ約１０倍濃縮効果が高くなった。
Figure 0006920683
Figure 0006920683
Figure 0006920683
これらの結果から、第１ＰＩポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法において、複合体ａ１および複合体Ａを形成する際の界面活性剤と塩の濃度条件は、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を０．０５ｖ／ｖ％以下、塩（ＮａＣｌ）を１モル／Ｌ以下とすることで標的二本鎖核酸分子を効率的に濃縮可能であることが示された。
本発明により高精度の温調装置の設備がなく、かつ、ＰＣＲ等の分子生物学的専門知識や技能を持つ人員のいない施設においても簡便に標的二本鎖核酸分子の濃縮を達成し得る。
ピロールイミダゾール含有ポリアミドは、前記診断技術以外でも、例えば臨床検査の現場において汎用性の高いダイレクトシーケンス法等で高感度に変異遺伝子を検出、診断する為の前処理として生体試料から微量に含まれる変異遺伝子のみを回収、濃縮する方法としても用いることもできる。ロールイミダゾール含有ポリアミドを用いた変異遺伝子の検出方法を臨床の現場において運用プロセスをそのまま用いれば、診断感度を大幅に高めると共に解析効率を上げ、検査コストを低減させることも可能となる。
本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法を提供することによって精度の高い温調装置や厳密な反応系の制御を要することとなく簡便な工程で１塩基の違いを識別して標的二本鎖核酸分子を濃縮でき、通常では感度が不十分であった分析方法でも標的二本鎖核酸分子の検出、分析が可能となることで様々な分析方法と組み合わせて遺伝子解析あるいは診断、臨床への展開が可能である。
１ 標的二本鎖ＤＮＡ
２ 第１ＰＩポリアミド
３ 第１リンカー分子（例えばビオチン）
４ 第１リンカー分子に特異的に結合するリガンド分子（例えばストレプトアビジン）
８ 第２リンカー分子（例えばビオチン）
９ 第２リンカー分子に特異的に結合するリガンド分子（例えばストレプトアビジン）
５ 担持体ａ
６ 非標的二本鎖ＤＮＡ
７ 第２ＰＩポリアミド
１０ 担持体ｂ
１１ 末端領域
１２ 識別領域１
１３ 識別領域２
１４ 連結領域
１５ リンカー分子
１００ 複合体Ａ
２００ 複合体Ｂ

Claims (18)

  1. 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
    （１）前記試料と、
    前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾された第１ＰＩポリアミドと、
    前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、
    を混合して混合溶液とする工程と、
    （２）前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１の該第１ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ａを結合させた複合体Ａを形成する工程と、
    （３）前記混合溶液から、前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
    を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。
  2. 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
    （１）前記試料と、
    前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
    を混合して混合溶液１とする工程と、
    （２）前記混合溶液１中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドが結合した複合体ａ１を形成する工程と、
    （３）前記混合溶液１に、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合して混合溶液２とする工程と、
    （４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ１の前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体Ａを形成する工程と、
    （５）前記混合溶液２から前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
    を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。
  3. 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
    （１）前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
    前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、
    溶液または溶媒と、
    を混合して混合溶液１とする工程と、
    （２）前記混合溶液１中で、前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体ａ２を形成する工程と、
    （３）前記混合溶液１に、前記試料を混合して混合溶液２とする工程と、
    （４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ２の前記第１ＰＩポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ａを形成する工程と、
    （５）前記混合溶液２から前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
    を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。
  4. 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって、
    （１）前記試料と、
    前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
    前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂと、
    を混合して混合溶液とする工程と、
    （２）前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとを結合させた複合体ｂ１の該第２ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ｂを結合させた複合体Ｂを形成する工程と、
    （３）前記混合溶液から、前記複合体Ｂを分離して除去して除去する工程と、
    を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法。
  5. 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって、
    （１）前記試料と、
    前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
    を混合して混合溶液１とする工程と、
    （２）前記混合溶液１中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドが結合した複合体ｂ１を形成する工程と、
    （３）前記混合溶液１に、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液２とする工程と、
    （４）前記混合溶液２中で、前記複合体ｂ１の前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体Ｂを形成する工程と、
    （５）前記混合溶液２から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
    を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法。
  6. 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって、
    （１）前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
    前記第２ＰＩポリアミドに修飾された第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液１とする工程と、
    溶液または溶媒と、
    を混合して混合溶液１とする工程と、
    （２）前記混合溶液１中で、前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体ｂ２を形成する工程と、
    （３）前記混合溶液１に、前記試料を混合して混合溶液２とする工程と、
    （４）前記混合溶液２中で、前記複合体ｂ２の前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ｂを形成する工程と、
    （５）前記混合溶液２から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
    を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法。
  7. 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
    （１）前記試料と、
    前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
    前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
    を混合して混合溶液１とする工程と、
    （２）前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１を形成するとともに、
    前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとが結合した複合体ｂ１を形成する工程と、
    （３）前記混合溶液１に、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合して混合溶液２とする工程と、
    （４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ１の前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体Ａを形成する工程と、
    （５）前記混合溶液２から前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
    を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。
  8. 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
    （１）前記試料と、
    前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
    前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
    を混合して混合溶液１とする工程と、
    （２）前記混合溶液１中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１を形成するとともに、
    前記混合溶液１中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとが結合した複合体ｂ１を形成する工程と、
    （３）前記混合溶液１に、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液２とする工程と、
    （４）前記混合溶液２中で、前記複合体ｂ１の前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体Ｂを形成する工程と、
    （５）前記混合溶液２から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
    （６）前記複合体Ｂを分離した前記混合溶液２に前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合させて混合溶液３とする工程と、
    （７）前記複合体ａ１と前記担持体ａが結合させて複合体Ａを形成する工程と、
    （８）前記混合溶液３から複合体Ａを分離して回収する工程と、
    を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。
  9. 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
    （１）前記試料と、
    前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
    前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、
    前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
    前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂと、
    を混合して混合溶液１とする工程と、
    （２）前記混合溶液１中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドとが結合した複合体ａ１の該第１ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ａを結合させた複合体Ａを形成し、さらに、
    前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドとを結合させた複合体ｂ１の該第２ＰＩポリアミドにさらに前記担持体ｂを結合させた複合体Ｂを形成する工程と、
    （３）前記混合溶液１から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
    （４）前記混合溶液１から前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
    を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。
  10. 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
    （１）前記試料と、
    前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
    を混合して混合溶液１とする工程と、
    （２）前記混合溶液１中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第１ＰＩポリアミドが結合した複合体ａ１を形成する工程と、
    （３）前記混合溶液１に、前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａを混合して混合溶液２とする工程と、および、
    （４）前記混合溶液２中で、前記複合体ａ１の前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体Ａを形成する工程と、
    を含む複合体Ａを形成する工程、
    または、
    （１’）前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）であって、第１リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第１ＰＩポリアミド）と、
    前記第１リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第１リガンド分子で修飾された担持体ａと、
    溶液または溶媒と、
    を混合して混合溶液１’とする工程と、
    （２’）前記混合溶液１’中で、前記第１ＰＩポリアミドと前記担持体ａが結合した複合体ａ２を形成する工程と、
    （３’）前記混合溶液１’に、前記試料を混合して混合溶液２’とする工程と、
    （４’）前記混合溶液２’中で、前記複合体ａ２の前記第１ＰＩポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ａを形成する工程と、
    を含む複合体Ａを形成する工程、
    から選択される複合体Ａを形成する工程、ならびに、
    （５）前記（４）の後の混合溶液２または（４’）のの後の混合溶液２’に、
    前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
    を混合して混合溶液３とする工程と、
    （６）前記混合溶液３中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第２ＰＩポリアミドが結合した複合体ｂ１を形成する工程と、
    （７）前記混合溶液３に、前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液４とする工程と、
    （８）前記混合溶液４中で、前記複合体ｂ１の前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体Ｂを形成する工程と、および、
    （９）前記混合溶液４から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
    を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する工程、
    または、
    （５’）前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）であって、第２リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド（第２ＰＩポリアミド）と、
    前記第２リンカー分子と特異的に結合および／または吸着する第２リガンド分子で修飾された担持体ｂを混合して混合溶液３’とする工程と、
    （６’）前記混合溶液３’中で、前記第２ＰＩポリアミドと前記担持体ｂが結合した複合体ｂ２を形成する工程と、
    （７’）前記混合溶液３’に、前記（４）の後の混合溶液２または（４’）の後の混合溶液２’を混合して混合溶液４’とする工程と、
    （８’）前記混合溶液４’中で、前記複合体ｂ２と前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Ｂを形成する工程と、および、
    （９’）前記混合溶液４’から前記複合体Ｂを分離して除去する工程と、
    を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する工程、
    から選択される非標的核酸を分離して除去する工程、ならびに、
    （１０）前記混合溶液４または４’から前記複合体Ａを分離して回収する工程と、
    を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。
  11. 請求項１〜請求項１０から選択されるひとつ以上の方法を複数回繰り返すことにより標的塩基配列有する核酸分子を濃縮することを特徴とする方法。
  12. 前記非標的二本鎖核酸分子が、野生型のＫ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ，Ｈ−ＲＡＳ、ＲＨＯ、ＲＡＢ、ＡＲＦ、ＲＡＮ、ＣＹＰ、ＧＳＴＴ、ＮＡＴ、ＴＳ、ＵＧＴ、ＥＲＣＣ、ＭＤＲ、ＣＲＨＲ、ＢＲＣＡ、ＭＳＨ、ＣＤＡ、ＤＰＤ、ＯＰＲＴ、５−ＨＴＴ、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ、ＶＫＯＲＣ１、ＡＰＥＸ１、ＤＣＫ、ＤＰＹＤ、ＴＹＭＰ、ＭＬＨ１、ＵＭＰＳ、ＰＣＮＡ、ＰＯＬＡ、ＲＲＭ１、ＳＬＣ２９Ａ１、ＴＫ１、ＵＮＧ、ＡＣＴＢ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＨＤ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＦＯＸＬ２、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＫＩＴ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＡＰＣ、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ｃ−ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲ、およびＴＰ５３からなる遺伝子群から選択される遺伝子上の特定の塩基配列の領域であって、
    前記標的二本鎖核酸分子が、前記野生型の遺伝子群から選択される遺伝子上の前記特定の塩基配列の領域に一塩基以上の変異を有する、
    ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドが、以下の式１で示される構造であって、
    Ｔ−Ａ１−Ｈ−Ａ２−Ｌ （式１）
    ［式中、Ｔは末端領域を、Ａ１およびＡ２は識別領域を、Ｈは連結領域を、Ｌは第１リンカー分子または第２リンカー分子を意味する。］
    前記識別領域と、連結領域と、第１リンカー分子または第２リンカー分子の間はアミド結合により連結され、
    前記末端領域は、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンであり、
    前記識別領域は、ピロール（Ｐｙ）、イミダゾール（Ｉｍ）、およびβ−アラニン（β−Ａｌａ）から選択的に連結された識別領域であり、
    前記連結領域は、炭素数が３以上で炭素−炭素が単結合である連結領域である、
    ことを特徴とする方法。
  14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドが、以下の式２で示される環状構造であって、
    Figure 0006920683
     ［式中、Ａ１およびＡ２は識別領域を、Ｈは連結領域を、Ｌは第１リンカー分子または第２リンカー分子を意味する。］
    前記識別領域と、連結領域と、第１リンカー分子または第２リンカー分子の間はアミド結合により連結され、
    前記識別領域は、ピロール（Ｐｙ）、イミダゾール（Ｉｍ）、およびβ−アラニン（β−Ａｌａ）から選択的に連結された識別領域であり、
    前記連結領域は、炭素数が３以上で炭素−炭素が単結合である連結領域である、
    ことを特徴とする方法。
  15. 前記非標的二本鎖核酸分子が、野生型のＫ−ＲＡＳ遺伝子上のコドン１２、コドン１３の塩基配列の領域であって、
    前記標的二本鎖核酸分子が、前記Ｋ−ＲＡＳ遺伝子上のコドン１２、コドン１３の塩基配列の領域に一塩基以上の変異を有し、
    前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドのリンカー分子Ｌがビオチンで構成され、前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域Ｈがγ−アミノブタン酸で構成され、
    前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域Ｈ−識別領域Ａ２−リンカー分子Ｌ中の識別領域Ａ２のイミダゾール（Ｉｍ）、ピロール（Ｐｙ）及びβ−アラニン（β―Ａｌａ）の配列が、
    Ｈ−（Ｐｙ）（Ｐｙ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）（Ｐｙ）（Ｉｍ）（β―Ａｌａ）−Ｌ の順番であり、
    前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域Ｈ−識別領域Ａ１−末端領域Ｔ中の識別領域Ａ１のイミダゾール（Ｉｍ）、ピロール（Ｐｙ）及びβ−アラニン（β―Ａｌａ）の配列が、
    Ｈ−（Ｉｍ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）（Ｉｍ）（Ｉｍ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）−Ｔ；
    Ｈ−（Ｉｍ）（Ｉｍ）（β―Ａｌａ）（Ｉｍ）（Ｉｍ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）−Ｔ；
    Ｈ−（Ｉｍ）（Ｉｍ）（β―Ａｌａ）（Ｉｍ）（Ｐｙ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）−Ｔ；
    又は
    Ｈ−（Ｐｙ）（Ｉｍ）（β―Ａｌａ）（Ｉｍ）（Ｉｍ）（Ｐｙ）（β―Ａｌａ）―Ｔ；
    であり、
    前記配列におけるイミダゾール（Ｉｍ）、ピロール（Ｐｙ）及びβ−アラニン（β―Ａｌａ）それぞれの分子間がアミド結合により連結されている、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  16. 前記試料が、核酸分子を含む血清、血漿、尿、胸水、腹水、抹消血、およびリンパ液からなる群から選択されるひとつ以上の液体生検試料であって、前記試料中に含まれる標的二本鎖核酸分子を濃縮することができることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記試料が、生検から抽出あるいは精製工程を経た核酸分子を含む試料であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法に用いるキットであって、
    標的二本鎖核酸分子および非標的二本鎖核酸分子の配列の間の１塩基の違いを識別し結合することができる、配列を識別することができる識別領域を含むＰＩポリアミドであって、リンカー分子で修飾されたＰＩポリアミドと、
    リンカー分子に特異的に結合することができるリガンド分子で修飾された担持体と、
    ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、２価の陽イオンを含む塩、および、１価の陽イオンを含む塩、およびこれらの組み合わせからなる群から少なくとも１つ以上選択される試薬と、
    を含み、
    前記界面活性剤が、混合溶液に対して０．０５ｖ／ｖ％以下であり、
    前記２価の陽イオンを含む塩および／または１価の陽イオンを含む塩が１モル／Ｌ以下であり、
    前記ＰＩポリアミドが、
    前記識別領域が、標的二本鎖核酸分子または非標的二本鎖核酸分子の塩基配列に基づいて分子設計が可能であり、
    前記ＰＩポリアミドがさらに以下の（１）〜（４）の少なくとも１つ以上の特徴を有することを特徴とするキット。
    （１）標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(Ｔ−ＡあるいはＡ−Ｔ)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を少なくとも一つ含む。
    （２）標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(Ｔ−ＡあるいはＡ−Ｔ)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を二つ以上含むことで環状構造を形成することができる。
    （３）配列内の２あるいは３残基毎にβ−アラニン残基を少なくとも１残基以上を含む。
    （４）標的二本鎖核酸分子の塩基配列と非標的二本鎖核酸分子の塩基配列を十分に認識することができる長さを有するＰｙ、Ｉｍ、およびβ−Ａｌａを含む配列である。
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