JP6920683B2 - ピロールイミダゾール含有ポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の濃縮方法およびキット - Google Patents
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Description
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、
を混合して混合溶液とする工程と、
(2)前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1の該第1PIポリアミドにさらに前記担持体aを結合させた複合体Aを形成する工程と、
(3)前記混合溶液から、前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドが結合した複合体a1を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体a1の前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体Aを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
(1)前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、
溶液または溶媒と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中で、前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体a2を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記試料を混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体a2の前記第1PIポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Aを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
(1)前記試料と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bと、
を混合して混合溶液とする工程と、
(2)前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとを結合させた複合体b1の該第2PIポリアミドにさらに前記担持体bを結合させた複合体Bを形成する工程と、
(3)前記混合溶液から、前記複合体Bを分離して除去して除去する工程と、
を含むことを特徴とする。
(1)前記試料と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドが結合した複合体b1を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体b1の前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体Bを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする。
(1)前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液1とする工程と、
溶液または溶媒と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中で、前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体b2を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記試料を混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体b2の前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Bを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする。
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1を形成するとともに、
前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとが結合した複合体b1を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体a1の前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体Aを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1を形成するとともに、
前記混合溶液1中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとが結合した複合体b1を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体b1の前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体Bを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
(6)前記複合体Bを分離した前記混合溶液2に第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合させて混合溶液3とする工程と、
(7)前記複合体a1と前記担持体aが結合させて複合体Aを形成する工程と、
(8)前記混合溶液3から複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bと、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1の該第1PIポリアミドにさらに前記担持体aを結合させた複合体Aを形成し、さらに、
前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとを結合させた複合体b1の該第2PIポリアミドにさらに前記担持体bを結合させた複合体Bを形成する工程と、
(3)前記混合溶液1から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
(4)前記混合溶液1から前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドが結合した複合体a1を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合して混合溶液2とする工程と、および、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体a1の前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体Aを形成する工程と、
を含む複合体Aを形成する工程、
または、
(1’)前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、
溶液または溶媒と、
を混合して混合溶液1’とする工程と、
(2’)前記混合溶液1’中で、前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体a2を形成する工程と、
(3’)前記混合溶液1’に、前記試料を混合して混合溶液2’とする工程と、
(4’)前記混合溶液2’中で、前記複合体a2の前記第1PIポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Aを形成する工程と、
を含む複合体Aを形成する工程、
から選択される複合体Aを形成する工程、ならびに、
(5)前記(4)の後の混合溶液2または(4’)の後の混合溶液2’に、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液3とする工程と、
(6)前記混合溶液3中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドが結合した複合体b1を形成する工程と、
(7)前記混合溶液3に、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液4とする工程と、
(8)前記混合溶液4中で、前記複合体b1の前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体Bを形成する工程と、および、
(9)前記混合溶液4から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する工程、
または、
(5’)前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着するリガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液3’とする工程と、
(6’)前記混合溶液3’中で、前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体b2を形成する工程と、
(7’)前記混合溶液3’に、前記(4)の後の混合溶液2または(4’)の後の混合溶液2’を混合して混合溶液4’とする工程と、
(8’)前記混合溶液4’中で、前記複合体b2と前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Bを形成する工程と、および、
(9’)前記混合溶液4’から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する工程、
から選択される非標的核酸を分離して除去する工程、ならびに、
(10)前記混合溶液4または4’から前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする。
前記非標的二本鎖核酸分子が、野生型のK−RAS、N−RAS,H−RAS、RHO、RAB、ARF、RAN、CYP、GSTT、NAT、TS、UGT、ERCC、MDR、CRHR、BRCA、MSH、CDA、DPD、OPRT、5−HTT、Factor V、VKORC1、APEX1、DCK、DPYD、TYMP、MLH1、UMPS、PCNA、POLA、RRM1、SLC29A1、TK1、UNG、ACTB、AKT1、ALK、APC、BRAF、CHD1、CTNNB1、EGFR、ERBB2、FBXW7、FGFR2、FOXL2、GNAQ、GNAS、KIT、MAP2K1、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、SMAD4、SRC、STK11、TP53、MLH1、MSH2、MSH6、APC、MEN1、RET、TP53、EGFR、BRAF、c−kit、PDGFRα、PDGFR、およびTP53からなる遺伝子群から選択される遺伝子上の特定の塩基配列の領域であって、
前記標的二本鎖核酸分子が、前記野生型の遺伝子群から選択される遺伝子上の前記特定の塩基配列の領域に一塩基以上の変異を有する。
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドが、以下の式1で示される構造であって、
T−A1−H−A2−L (式1)
[式中、Tは末端領域を、A1およびA2は識別領域を、Hは連結領域を、Lは第1リンカー分子または第2リンカー分子を意味する。]
前記識別領域と、連結領域と、第1リンカー分子または第2リンカー分子の間はアミド結合により連結され、
前記末端領域は、N、N−ジメチルアミノプロピルアミンであり、
前記識別領域は、ピロール(Py)、イミダゾール(Im)、およびβ−アラニン(β−Ala)から選択的に連結された識別領域である、
ことを特徴とする。
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドが、以下の式2で示される環状構造であって、
前記識別領域と、連結領域と、第1リンカー分子または第2リンカー分子の間はアミド結合により連結され、
前記識別領域は、ピロール(Py)、イミダゾール(Im)、およびβ−アラニン(β−Ala)から選択的に連結された識別領域である、
ことを特徴とする。
前記非標的二本鎖核酸分子が、野生型のK−RAS遺伝子上のコドン12、コドン13の塩基配列の領域であって、
前記標的二本鎖核酸分子が、前記K−RAS遺伝子上のコドン12、コドン13の塩基配列の領域に一塩基以上の変異を有し、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドのリンカー分子Lがビオチンで構成され、前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域Hがγ−アミノブタン酸で構成され、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域H−識別領域A2−リンカー分子L中の識別領域A2のイミダゾール(Im)、ピロール(Py)及びβ−アラニン(β―Ala)の配列が、
H−(Py)(Py)(Py)(β―Ala)(Py)(Im)(β―Ala)−L の順番であり、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域H−識別領域A1−末端領域T中の識別領域A1のイミダゾール(Im)、ピロール(Py)及びβ−アラニン(β―Ala)の配列が、
H−(Im)(Py)(β―Ala)(Im)(Im)(Py)(β―Ala)−T;
H−(Im)(Im)(β―Ala)(Im)(Im)(Py)(β―Ala)−T;
H−(Im)(Im)(β―Ala)(Im)(Py)(Py)(β―Ala)−T;
又は
H−(Py)(Im)(β―Ala)(Im)(Im)(Py)(β―Ala)―T;
であり、
前記配列におけるイミダゾール(Im)、ピロール(Py)及びβ−アラニン(β―Ala)それぞれの分子間がアミド結合により連結されている。
[16][1]〜[15]のいずれか一つに記載の方法は、前記試料が、核酸分子を含む血清、血漿、尿、胸水、腹水、抹消血、およびリンパ液からなる群から選択されるひとつ以上の液体生検試料であって、前記試料中に含まれる標的二本鎖核酸分子を濃縮することができる。
標的二本鎖核酸分子および非標的二本鎖核酸分子の配列の間の1塩基の違いを識別し結合することができる配列を識別することができる識別領域を含むリンカー分子で修飾されたPIポリアミドと、
リンカー分子に特異的に結合することができるリガンド分子で修飾された担持体と、
pH緩衝剤、界面活性剤、2価の陽イオンを含む塩、および、1価の陽イオンを含む塩、およびこれらの組み合わせからなる群から少なくとも1つ以上選択される試薬と、
を含み、
前記界面活性剤が、混合溶液に対して0.05v/v%以下であり、
前記2価の陽イオンを含む塩および/または1価の陽イオンを含む塩が1モル/L以下であり、
前記PIポリアミドが、
前記識別領域が、標的二本鎖核酸分子または非標的二本鎖核酸分子の塩基配列に基づいて分子設計が可能であり、
前記PIポリアミドがさらに以下の(1)〜(4)の少なくとも1つ以上の特徴を有することを特徴とする。
(1)標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(T−AあるいはA−T)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を少なくとも一つ含む。
(2)標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(T−AあるいはA−T)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を二つ以上含むことで環状構造を形成することができる。
(3)配列内の2あるいは3残基毎にβ−アラニン残基を少なくとも1残基以上を含む。
(4)標的二本鎖核酸分子の塩基配列と非標的二本鎖核酸分子の塩基配列を十分に認識することができる長さを有するPy、Im、およびβ−Alaを含む配列である。
本発明において用語「濃縮」とは、標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子の混合溶液から、非標的核酸分子を除去し標的二本鎖核酸分子を選択的に回収して濃度を高めることをいう。
核酸の塩基配列を識別する技術は、前記遺伝子診断システムにとどまらず創薬の分野での応用も期待されている。特に近年、癌治療において注目をあつめている分子標的薬が標的とする標的分子は多岐にわたる。実際に、タンパク質や抗体あるいは核酸を標的とした分子標的薬の開発が進み、標的分子を識別する技術は臨床試験へと段階を進めている。臨床試験においては、特にサンプル中に存在する1以上の塩基配列の変異を有する微量の核酸分子を識別する技術が望まれており、本願発明の濃縮方法はそのような標的二本鎖核酸分子の濃縮に適した方法である。
(工程1)前記試料と、前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、を混合して混合溶液とする工程と(図4 S402)、
(工程2)前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1の該第1PIポリアミドにさらに前記担持体aを結合させた複合体Aを形成する工程と(図4 S404)、
(工程3)前記混合溶液から、前記複合体Aを分離して回収する工程と(図4 S406)、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
試料と、第1PIポリアミドと、担持体aとを混合する工程1は、標的二本鎖核酸分子等が吸着することのない反応容器内で行うことを必要とする。核酸等が反応容器内に吸着すると、標的二本鎖核酸分子を回収することが困難になるからである。
工程2の複合体Aの形成に要する時間は、24時間以内であり、好ましくは1時間以上12時間以内であり、より好ましくは1時間以上6時間以内であり、さらに好ましくは1時間以上3時間以内とすることもできる。
工程3において、担持体aは磁性体であるので、磁石により反応容器の壁面に複合体Aを引寄せ、上澄みを反応容器内からデカンテーションやピペッティング等により除去することができる。
(工程1)前記試料と、前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、を混合して混合溶液1とする工程と(図5 S502)、
(工程2)前記混合溶液1中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドが結合した複合体a1を形成する工程と(図5 S504)、
(工程3)前記混合溶液1に、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合して混合溶液2とする工程と(図5 S506)、
(工程4)前記混合溶液2中で、前記複合体a1の前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体Aを形成する工程と(図5 S508)、
(工程5)前記混合溶液2から前記複合体Aを分離して回収する工程と(図5 S510)、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
試料と、第1PIポリアミドとを混合する工程1は、標的二本鎖核酸分子等が吸着することのない反応容器内で行うことを必要とする。核酸等が反応容器ないに吸着すると、標的二本鎖核酸分子を回収することが困難になるからである。
工程2の複合体a1の形成に要する時間は、60分以内であり、好ましくは40分以内であり、より好ましくは30分以内であり、さらに好ましくは10分以内とすることもできる。
工程3で混合する担持体の量は、混合溶液内で形成された複合体a1を十分に回収可能な量を混合することが好ましい。例えば、標的二本鎖核酸分子と担持体上のリガンド分子との量比を1:1以上とすることもできる。
第二の発明の工程4は、上述した第一の発明の工程2の方法と同じ条件を適用できる。
第二の発明の工程5は、上述した第一の発明の工程3の方法と同じ条件を適用できる。
(工程1)前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、溶液または溶媒と、を混合して混合溶液1とする工程と(図6 S602)、
(工程2)前記混合溶液1中で、前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体a2を形成する工程と(図6 S604)、
(工程3)前記混合溶液1に、前記試料を混合して混合溶液2とする工程と(図6 S06)、
(工程4)前記混合溶液2中で、前記複合体a2の前記第1PIポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Aを形成する工程と(図6 S608)、
(工程5)前記混合溶液2から前記複合体Aを分離して回収する工程と(図6 S610)、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
第三の発明は、標的二本鎖核酸分子等が吸着することのない反応容器内で行うことを必要とする。核酸等が反応容器内に吸着すると、標的二本鎖核酸分子を回収することが困難になるからである。
工程1の複合体a2の形成に要する時間は、24時間以内であり、好ましくは1時間以上12時間以内であり、より好ましくは1時間以上6時間以内であり、さらに好ましくは1時間以上3時間以内とすることもできる。
工程3で混合する試料中の全二本鎖核酸分子に対する第1PIポリアミドの量比(分子数)は、1:102〜1:108であり、好ましくは1:104〜1:108、より好ましくは1:106〜1:108、さらに好ましくは1:107〜1:108とすることもできる。
工程4の複合体Aの形成は、60分以内であり、好ましくは40分以内であり、より好ましくは30分以内であり、さらに好ましくは10分以内とすることもできる。
第三の発明の工程5は、上述した第一の発明の工程3の方法と同じ条件を適用できる。
(工程1)前記試料と、前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bと、を混合して混合溶液とする工程と(図7 S702)、
(工程2)前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとを結合させた複合体b1の該第2PIポリアミドにさらに前記担持体bを結合させた複合体Bを形成する工程と(図7 S704)、
(工程3)前記混合溶液から、前記複合体Bを分離して除去して除去する工程と(図7 S706)、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法の発明である。
第四の発明の工程1は、上述した第一の発明の工程1の方法のうち、第1PIポリアミドの代わりに、第2PIポリアミドを用いる他は、同じ条件を適用できる。
第四の発明の工程2は、上述した第一の発明の工程2の方法のうち、第1PIポリアミドの代わりに、第2PIポリアミドを用いる他は、同じ条件を適用できる。
第四の発明の工程3では、担持体bが磁性体であるので、磁石により反応容器の壁面に複合体Bを引寄せ、上澄みを反応容器内からデカンテーションやピペッティング等により回収して複合体Bを除去することができる。
(工程1)前記試料と、前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、を混合して混合溶液1とする工程と(図8 S802)、
(工程2)前記混合溶液1中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドが結合した複合体b1を形成する工程と(図8 S804)、
(工程3)前記混合溶液1に、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液2とする工程と(図8 S806)、
(工程4)前記混合溶液2中で、前記複合体b1の前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体Bを形成する工程と(図8 S808)、
(工程5)前記混合溶液2から前記複合体Bを分離して除去する工程と(図8 S810)、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法の発明である。
第五の発明の工程1は、上述した第二の発明の工程1の方法のうち、第1PIポリアミドの代わりに、第2PIポリアミドを用いる他は、同じ条件を適用できる。
第五の発明の工程2は、上述した第二の発明の工程2の方法のうち、第1PIポリアミドの代わりに、第2PIポリアミドを用いる他は、同じ条件を適用できる。
第五の発明の工程3は、上述した第二の発明の工程3の方法のうち、第1PIポリアミドの代わりに、第2PIポリアミドを用い、担持体aの代わりに担持体bを用いる他は、同じ条件を適用できる。
第五の発明の工程4は、上述した第二の発明の工程4の方法のうち、第1PIポリアミドの代わりに、第2PIポリアミドを用い、担持体aの代わりに担持体bを用いる他は、同じ条件を適用できる。
第五の発明の工程5は、上述した第四の発明の工程5と同じ条件を適用できる。
(工程1)前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液1とする工程と(図9 S902)、
(工程2)前記混合溶液1中で、前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体b2を形成する工程と(図9 S904)、
(工程3)前記混合溶液1に、前記試料を混合して混合溶液2とする工程と(図9 S906)、
(工程4)前記混合溶液2中で、前記複合体b2の前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Bを形成する工程と(図9 S908)、
(工程5)前記混合溶液2から前記複合体Bを分離して除去する工程と(図9 S910)、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法の発明である。
(工程1)
第六の発明の工程1は、上述した第三の発明の工程1の方法のうち、第1PIポリアミドを、第2PIポリアミドを用い、担持体aの代わりに担持体bを用いる他は、同じ条件を適用できる。
第六の発明の工程2は、上述した第三の発明の工程2の方法のうち、第1PIポリアミドを、第2PIポリアミドを用い、担持体aの代わりに担持体bを用いる他は、同じ条件を適用できる。
第六の発明の工程3は、上述した第三の発明の工程3の方法のうち、第1PIポリアミドを、第2PIポリアミドを用い、担持体aの代わりに担持体bを用いる他は、同じ条件を適用できる。
第六の発明の工程4は、上述した第三の発明の工程4の方法のうち、第1PIポリアミドを、第2PIポリアミドを用い、担持体aの代わりに担持体bを用いる他は、同じ条件を適用できる。
第六の発明の工程5は、上述した第三の発明の工程5の方法のうち、第1PIポリアミドを、第2PIポリアミドを用い、担持体aの代わりに担持体bを用いる他は、同じ条件を適用できる。
(工程2)前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1を形成するとともに、前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとが結合した複合体b1を形成する工程と(図10 S1004)、
(工程3)前記混合溶液1に、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合して混合溶液2とする工程と(図10 S1006)、
(工程4)前記混合溶液2中で、前記複合体a1の前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体Aを形成する工程と(図10 S1008)、
(工程5)前記混合溶液2から前記複合体Aを分離して回収する工程と(図10 S1010)、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
第七の発明の工程1は、第1PIポリアミドと第2PIポリアミドの双方を混合する他は、第一の発明の工程1と同じ条件を適用できる。
第七の発明の工程2は、第二の発明の工程2と同じ条件を適用できる。
第七の発明の工程3は、第二の発明の工程3と同じ条件を適用できる。
第七の発明の工程4は、第二の発明の工程4と同じ条件を適用できる。
第7の発明の工程5は第二の発明の工程5と同じ条件を適用できる。
(工程1)前記試料と、前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、を混合して混合溶液1とする工程と(図11 S1102)、
(工程2)前記混合溶液1中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1を形成するとともに、
前記混合溶液1中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとが結合した複合体b1を形成する工程と(図11 S1104)、
(工程3)前記混合溶液1に、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液2とする工程と(図11 S1106)、
(工程4)前記混合溶液2中で、前記複合体b1の前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体Bを形成する工程と(図11 S1108)、
(工程5)前記混合溶液2から前記複合体Bを分離して除去する工程と(図11 S1110)、
(工程6)前記複合体Bを分離した前記混合溶液2に前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合させて混合溶液3とする工程と(図11 S1112)、
(工程7)前記複合体a1と前記担持体aが結合した複合体Aを形成する工程と(図11 S1114)、
(工程8)前記混合溶液3から複合体Aを分離して回収する工程と(図11 S1116)、
を含むことを特徴とする非標的二本鎖核酸分子を分離して濃縮する方法の発明である。
(工程1)
第八の発明の工程1は、第1PIポリアミドと第2PIポリアミドの双方を混合する他は、第五の発明の工程1と同じ条件を適用できる。
第八の発明の工程2は、第五の発明の工程2と同じ条件を適用できる。
第八の発明の工程3は、第五の発明の工程3と同じ条件を適用できる。
第八の発明の工程4は、第五の発明の工程4と同じ条件を適用できる。
第八の発明の工程5は、第五の発明の工程5と同じ条件を適用できる。
第八の発明の工程6は、第二の発明の工程3と同じ条件を適用できる。
第八の発明の工程7は、第二の発明の工程4と同じ条件を適用できる。
第八の発明の工程8は、第二の発明の工程5と同じ条件を適用できる。
(工程1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bと、
を混合して混合溶液1とする工程と(図12 S1202)、
(工程2)前記混合溶液1中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1の該第1PIポリアミドにさらに前記担持体aを結合させた複合体Aを形成し、さらに、
前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとを結合させた複合体b1の該第2PIポリアミドにさらに前記担持体bを結合させた複合体Bを形成する工程と(図12 S1204)、
(工程3)前記混合溶液1から前記複合体Bを分離して除去する工程と(図12 S1206)、
(工程4)前記混合溶液1から前記複合体Aを分離して回収する工程と(図12 S1208)、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
(工程1)
試料と、第1PIポリアミドと、第2PIポリアミドと、担持体aと、担持体bとを混合する工程1は、標的二本鎖核酸分子等が吸着することのない反応容器内で行うことを必要とする。核酸等が反応容器内に吸着すると、標的二本鎖核酸分子を回収することが困難になるからである。
工程2の複合体AおよびBの形成に要する時間は、24時間以内であり、好ましくは1時間以上12時間以内であり、より好ましくは1時間以上6時間以内であり、さらに好ましくは1時間以上3時間以内とすることもできる。
第十の発明の工程3は、第二の発明の工程3と同じ条件を適用できるが、担持体bの素材として磁性体以外の素材を用いたときは、その担持体の素材に特性に適合した方法で複合体Bを分離して除去する。
第十の発明の工程4は、第二の発明の工程4と同じ条件を適用できが、担持体aの素材として磁性体以外の素材を用いたときは、その担持体の素材に特性に適合した方法で複合体Aを分離して回収する。
(工程1)前記試料と、前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、を混合して混合溶液1とする工程と(図13 S1302)、
(工程2)前記混合溶液1中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドが結合した複合体a1を形成する工程と(図13 S1304)、
(工程3)前記混合溶液1に、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合して混合溶液2とする工程と(図13 S1306)、
(工程4)前記混合溶液2中で、前記複合体a1の前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体Aを形成する工程と(図13 S1308)、または、
(工程1’)前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、溶液または溶媒と、を混合して混合溶液1’とする工程と(図13 S1322)、
(工程2’)前記混合溶液1’中で、前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体a2を形成する工程と(図13 S1324)、
(工程3’)前記混合溶液1’に、前記試料を混合して混合溶液2’とする工程と(図13 S1326)、および、
(工程4’)前記混合溶液2’中で、前記複合体a2の前記第1PIポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Aを形成する工程と(図13 S1328)、ならびに、
(工程5)前記(工程4)後の混合溶液2または(工程4’)の後の混合溶液2’に、前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、を混合して混合溶液3とする工程と(図13 S1308)、
(工程6)前記混合溶液3中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドが結合した複合体b1を形成する工程と(図13 S1310)、
(工程7)前記混合溶液3に、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液4とする工程と(図13 S1312)、
(工程8)前記混合溶液4中で、前記複合体b1の前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体Bを形成する工程と(図13 S1314)、
(工程9)前記混合溶液4から前記複合体Bを分離して除去する工程と(図13 S1340)、または、
(工程5’)前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合する第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液3’とする工程と(図13 S1330)、
(工程6’)前記混合溶液3’中で、前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体b2を形成する工程と(図13 S1332)、
(工程7’)前記混合溶液3’(複合体b2を含むもの)に、前記(工程4)後の混合溶液2(複合体Aを含むもの)または(工程4’)の後の混合溶液2’(複合体Aを含むもの)を混合して混合溶液4’とする工程と(図13 S1334)、
(工程8’)前記混合溶液4’中で、前記複合体b2と前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Bを形成する工程と(図13 S1336)、および、
(工程9’)前記混合溶液4’から前記複合体Bを分離して除去する工程と(図13 S1340)、ならびに、
(工程10)前記(工程9)の後の混合溶液4または前記(工程9’)の後の混合溶液4’から、前記複合体Aを分離して回収する工程と(図13 S1342)、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法の発明である。
(工程1)
第十の発明の工程1は、第二の発明の工程1と同じ条件を適用できる。
(工程2)
第十の発明の工程2は、第二の発明の工程2と同じ条件を適用できる。
(工程3)
第十の発明の工程3は、第二の発明の工程3と同じ条件を適用できる。
(工程4)
第十の発明の工程4は、第二の発明の工程4と同じ条件を適用できる。
(工程1’)
第十の発明の工程1’は、第三の発明の工程1と同じ条件を適用できる。
(工程2’)
第十の発明の工程2’は、第三の発明の工程2と同じ条件を適用できる。
(工程3’)
第十の発明の工程3’は、第三の発明の工程3と同じ条件を適用できる。
(工程4’)
第十の発明の工程4’は、第三の発明の工程4と同じ条件を適用できる。
(工程5)
第十の発明の工程5は、第五の発明の工程1と同じ条件を適用できる。
(工程6)
第十の発明の工程6は、第五の発明の工程2と同じ条件を適用できる。
(工程7)
第十の発明の工程7は、第五の発明の工程3と同じ条件を適用できる。
(工程8)
第十の発明の工程8は、第五の発明の工程4と同じ条件を適用できる。
(工程9)
第十の発明の工程9は、第九の発明の工程3と同じ条件を適用できる。
第十の発明の工程5’は、第六の発明の工程1と同じ条件を適用できる。
(工程6’)
第十の発明の工程6’は、第六の発明の工程2と同じ条件を適用できる。
(工程7’)
第十の発明の工程7’は、第六の発明の工程3と同じ条件を適用できる。
(工程8’)
第十の発明の工程8’は、第六の発明の工程4と同じ条件を適用できる。
(工程9’)
第十の発明の工程9’は、第九の発明の工程3と同じ条件を適用できる。
第十の発明の工程10は、第九の発明の工程4と同じ条件を適用できる。
3.標的二本鎖核酸分子の収率の向上の方法について
本発明に係るPIポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の回収、濃縮方法は、一般的に用いられるメジャーグルーブバインダとは異なり、変性、ハイブリダイズの工程の為の厳密な温度制御及び制御装置を必要としない為、前記ステップ全てにおいて室温下で実施することができる。識別性、濃縮効果を挙げる目的で必要に応じて温度制御しても良い。
(1)試料
本発明に係るPIポリアミドは、二本鎖特異的に結合する分子である為、標的、非標的核酸分子は二本鎖核酸分子であることが好ましい、より好ましくは標的、非標的核酸分子は二本鎖DNAである方が良い。
ピロールイミダゾール含有ポリアミドとは、ヒトゲノム中の任意の予め決定された塩基配列にナノモル以下の親和性で特異的に結合する芳香族アミノ酸であるピロール(Py)アミノ酸(好ましくはN−メチルピロールアミノ酸)、イミダゾール(Im)アミノ酸(好ましくはN−メチルイミダゾールアミノ酸);あるいは、ベータアラニン(β−Ala)で構成された小分子である。ここで、芳香族アミノ酸とは、芳香環上にアミノ置換基及びカルボキシル置換基を有する芳香族化合物を意味する。
本明細書ではピロールイミダゾール含有ポリアミド中のピロールアミノ酸単位及びイミダゾールアミノ酸単位を、それぞれ単にピロール(Py)及びイミダゾール(Im)と呼ぶことがある。
T−A1−H−A2−L (式1)
式中、Tは末端領域を、A1およびA2は識別領域を、Hは連結領域を、Lはリンカー分子を意味する。
ここで、リンカー分子(L)が環を貫く結合で示されているのは、リンカー分子(L)が環の任意の位置に結合可能であることを意味する。
図14(a)に示されるように式1におけるTに相当する末端領域(11)と、式1および式2におけるA1およびA2に相当する2つの識別領域(12、13)と、前記2つの識別領域を連結する式1および式2におけるTに相当する連結領域(14)と、前記末端部位とは反対側の末端に結合する式1および式2におけるLに相当するリンカー分子(15)とからなる(図14(a))。末端領域11は、例えば、N、N−ジメチルアミノプロピルアミンからなる。
(1)標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(T−AあるいはA−T)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を少なくとも一つ含む。
(2)標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(T−AあるいはA−T)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を二つ以上含むことで環状構造を形成することができる。
(3)配列内のピロールイミダゾール含有ポリアミドを構成している分子(PyまたはIm)の2あるいは3残基毎にβ−アラニン残基を少なくとも1残基以上を含む。
(4)配列末端にリンカー分子を少なくとも一つ含む。
(5)標的二本鎖核酸分子の塩基配列と非標的二本鎖核酸分子の塩基配列を十分に認識することができる長さを有するPy、Im、およびβ−Alaを含む配列である。
本発明で用いられるPIポリアミドは、特許文献5(特許第3231045号明細書)、特許文献6(特許第4012145号明細書)、非特許文献1〜4等に記載されている数多くの方法を用いることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において用いられる担持体としては、二本鎖核酸分子が前記リンカー分子とリガンド分子が結合可能であれば特に限定されるものではなく、固形または液形あるいはゲル等のあらゆる相状態であってもよい。また、素材は、無機物、あるいは、有機物、あるいはこれらを組み合わせたものであっても良い。前記担持体は、ピロールイミダゾール含有ポリアミド末端リンカー分子と特異的な相互作用で結合するリガンド分子を有する。
本発明において用語「リンカー分子」および「リガンド分子」とは、例えば、ストレプトアビジンとビオチンのように、互いに特異的に結合をすることができる分子のことをいう。本発明の実施例では、ピロールイミダゾール含有ポリアミドのリンカーとしてビオチンを用いており、担持体に固定されているリンカー分子と特異的な結合をするリガンド分子としてストレプトイアビジンを用いている。同様の結合様式を示す物質であれば、ストレプトアビジンとビオチンに限られず本発明に利用することができる。
(i)バッファー
本発明に係るPIポリアミドを用いた標的二本鎖核酸分子の回収、濃縮方法において用いることができるバッファーは、水、および、pH緩衝剤、界面活性剤、2価、および/または1価の陽イオンを少なくとも一つ以上含有する。含有されている界面活性剤、あるいは、塩は1種類のみであってもよく、2種類以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明のバッファーには界面活性剤を添加することができる。当該界面活性剤としては、当該技術分野で一般的に使用されている界面活性剤から適宜選択して用いることができる。バッファーに含有する界面活性剤としては、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)等のイオン性界面活性剤であってもよいが、非イオン性界面活性剤が好ましく、Triton(登録商標)X(Polyoxyethylene(10)Octylphenyl Ether)、Tween(登録商標)20(Polyoxyethylene(20)Sorbitan Monolaurate)、Tween(登録商標)40(Polyoxyethylene(20)Sorbitan Monopalmitate)、Tween(登録商標)60(Polyoxyethylene(20)Sorbitan Monostearate)、Tween(登録商標)80(Polyoxyethylene(20)Sorbitan Monooleate)、Nonidet(登録商標)P−40(Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether)、Brij(登録商標)35(Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether)、Brij(登録商標)58(Polyoxyethylene(20)Cethyl Ether)、ジギトニン、又はサポニン等がより好ましく、Triton X、Tween 20、又はNonidet P−40がさらに好ましい。
本発明において用いられるバッファーは、さらに、陽イオンを含有していることが好ましい。当該陽イオンとしては、1価の陽イオンであってもよく、2価の陽イオンであってもよい。陽イオンとしては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、アンモニウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオンが挙げられる。とりわけ、リチウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、又はカルシウムイオンが好ましい。これらの陽イオンと対をなす陰イオンとしては、塩化物イオン、臭化物イオン、又はヨウ化イオンが好ましく、塩化物イオン又は臭化物イオンがより好ましく、塩化物イオンがさらに好ましい。
遺伝子解析をはじめとする核酸解析は、一般的に、解析対象の核酸を分析し、分析の結果得られた情報を解析する。核酸分析は、主に、核酸の塩基配列をシークエンサー等で直接読む方法、特定の塩基配列からなる領域と特異的にハイブリダイズするプライマーを起点としたポリメラーゼ反応を利用する方法、又は特定の塩基配列からなる領域と特異的にハイブリダイズするプローブを用いる方法により行われる。本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法によって得られた標的二本鎖核酸分子は、通常は多種多様な遺伝子の核酸又はその断片を含むため、解析対象遺伝子は、プライマーとプローブの少なくとも一方を用いる方法によって分析することが好ましい。少なくともプライマーを用いる方法としては、例えば、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法、リアルタイムPCR法、TaqMan(登録商標)−PCR法、LAMP(Loop−Mediated Isothermal Amplification)法、SMAP(SMart Amplification Process)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence−Based Amplification)法、RCA(rolling circle amplification)法、及びこれらの改変方法等が挙げられる。また、プローブを用いる方法としては、例えば、Invader(登録商標)法、DNAマイクロアレイ等が挙げられる。これらの方法は、適宜組み合わせて用いてもよい。
<標的二本鎖核酸分子濃縮用キット>
本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法に用いる材料、および試薬はキット化することで簡便に行うことができる。
本願発明において、標的とすることができる遺伝子は、これに限られるものでないが、ゲノム薬理学(PGx:Pharmacogenomics)の分野において一塩基多型(SNP)の解析で標的とされる遺伝子であれば、適用することができる。
なお、本明細書において遺伝子の「ファミリー」とは、特定の遺伝子のスーパーファミリーおよびサブファミリーの双方を含む用語である。
その他、本発明において、標的とすることができる遺伝子群として、出生前診断において検査対象となる遺伝子群、遺伝病として公知の遺伝子、アルツハイマー病などタンパク質の変異・変性が関係する疾患に関連する遺伝子群が含まれる。
表1に示す塩基配列の違いを有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を5000分子:5×105分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率1%)とした試料A、500分子:5×105分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率0.1%)とした試料B、50分子:5×105分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率0.01%)とした試料Cの3つの試料と図17に示す標的二本鎖核酸分子と結合することができる配列を有する本発明に係る第1PIポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ(MagnosphereTM MS300/Streptavidin、JSR Life Sciences社)を本発明に係る担持体として用い、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第二の発明の方法により標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドDNAを用いて実施した。
なお、表1に記載の塩基配列のうち配列番号1の塩基配列は、本発明に係る第1PIポリアミドが結合する標的二本鎖核酸分子のセンス側の部位の塩基配列(結合に関係する部分のみ)を示している。また、表1に記載の塩基配列のうち配列番号2の塩基配列は、本発明に係る第2PIポリアミドが結合する非標的二本鎖核酸分子のセンス側の部位の塩基配列(結合に関係する部分のみ)を示している(以下、同じ)。もっともいずれの二本鎖核酸分子を標的とするかは、目的により変動しうるのであり、目的によっては、表1の標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子とし、表1の非標的二本鎖核酸分子を標的二本鎖核酸分子とすることもありうる。
また、表1のアンチセンス側の塩基配列の記載は省略している(以下同じ)。
尚、本実施例における標的二本鎖核酸分子は、K−RASコドン12G12V変異型の塩基配列に相当し、非標的二本鎖核酸分子は、K−RASコドン12野生型の塩基配列に相当する。まず、各試料中に第1PIポリアミドを1×107分子相当を添加し、十分に混和し、60分インキュベートする。その後、混合物にストレプトアビジン標識磁性ビーズを100μg添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、60分インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離した。
前記分析用試料を市販dropletdigitalPCR用試薬キット(PrimePCR for ddPCR、BIO−RAD社製)とdropletdigitalPCRシステム(QX100TM dropletdigitalPCR、BIO−RAD社製)を用いて分析試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)を測定し、濃縮効果(倍)(濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)/各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%))を算出した。
表1に示す標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を100分子:1×104分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率1%)とした試料Dと図17に示す非標的二本鎖核酸分子と結合することができる配列を有する本発明に係る第2PIポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ(MagnosphereTM MS300/Streptavidin、JSR Life Sciences社)を本発明に係る担持体として用い、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第六の発明の工程1〜5で標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドDNAを用いて実施した。まず、第2PIポリアミドを1×107分子相当と、ストレプトアビジン標識磁性ビーズを100μg添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、60分インキュベートする。次に、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離する。その後、第2PIポリアミドが結合したストレプトアビジン標識磁性ビーズに試料Dを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、60分間インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離した。
表4に示す塩基配列の違いを有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を500分子:5×105分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率0.1%)とした試料(試料E)と図17、18に示す本発明に係る第1PIポリアミドと第2PIポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ(MagnosphereTM MS300/Streptavidin、JSR Life Sciences社)を本発明に係る担持体として用い、本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第五の発明の工程1〜3および第三の発明の工程1〜5を組み合わせることにより標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドDNAを用いて実施した。尚、本実施例における標的二本鎖核酸分子は、K−RASコドン13G13D変異型の塩基配列に相当し、非標的二本鎖核酸分子は、K−RASコドン12野生型の塩基配列に相当する。まず、図17に示す第2PIポリアミド1×107分子相当を、試料Eに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、30分間インキュベートする。ここまでの手順が本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第五の発明に相当する。
表4に示す塩基配列の違いを有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子100分子:1×104分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率1%)とした試料F、10分子:1×104分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率0.1%)とした試料G、5分子:5×104分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率0.01%)とした試料Hの3つの試料と図18、19に示す本発明に係る第1PIポリアミドと第2PIポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ(MagnosphereTM MS300/Streptavidin、JSR Life Sciences社)を本発明に係る担持体として用いて本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第五の発明の工程1〜5と第三の発明の工程1〜5の手順を組み合わせて標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドDNAを用いて実施した。まず、図18に示す第2PIポリアミド1×107分子相当を、試料に添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、60分間インキュベートする。その後、ストレプトアビジン標識磁性ビーズ100μgを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、60分間インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離する。当該液性成分を次工程では処理済試料とする。本手順が本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第五の発明の工程1〜5に相当する。
表1に示す塩基配列の違いを有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を500分子:5×105分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率0.1%) で健常人ヒト血清に添加した試料Iと、500分子:5×105分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率0.1%) で健常人ヒト血漿に添加した試料Jと図17に示す標的二本鎖核酸分子と結合することができる配列を有する本発明に係る第1PIポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ(MagnosphereTM MS300/Streptavidin、JSR Life Sciences社)を本発明に係る担持体として用いて本発明に係る標的二本鎖核酸分子の濃縮方法における第二の発明の方法により標的二本鎖核酸分子の濃縮を実施した。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドDNAを用いて実施した。 まず、各試料中に第1PIポリアミドを1×107分子相当を添加し、十分に混和し、60分間インキューベーとする。その後、混合物にストレプトアビジン標識磁性ビーズを100μg添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、60分間インキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドを用いてストレプトアビジン標識磁性ビーズと液性成分とに分離した。
表8に示される異なる塩基配列を有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を50分子:5×105分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率0.01%)とした試料Kと、図17に示す本発明に係る第1PIポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ(MagnosphereTM MS300/Streptavidin、JSR Life Sciences社)を担持体として用いた。二本鎖核酸分子は、制限酵素処理済のプラスミドDNAを用いた。尚、本実施例における標的二本鎖核酸分子は、K−RASコドン12G12V変異型の塩基配列に相当し、非標的二本鎖核酸分子は、K−RASコドン12野生型の塩基配列に相当する。
[複合体a1の形成を経た複合体Aの形成]
1.複合体a1の形成
第1PIポリアミド1×107分子相当を試料Kが入ったマイクロチューブに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で10分間インキュベートし、第1PIポリアミドとストレプトアビジン標識磁性ビーズの複合体(複合体a1)を形成した。
複合体a1が入ったマイクロチューブにストレプトアビジン標識磁性ビーズ100μgを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で60分間インキュベートし、複合体a1とストレプトアビジン標識磁性ビーズを結合させ複合体Aを形成した。インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体A−1に分離した。分離した液性成分に、新たにストレプトアビジン標識磁性ビーズ100μgを添加し、上記と同様の操作を行い、複合体Aと液性成分を分離した。この操作を繰り返し3回行い、複合体Aを3セット(順に複合体A−1、複合体A−2、複合体A−3)それぞれ分離した。
分離した複合体Aを全て一つのチューブに移し、分散液として20μLのTEバッファーを添加し、これを分析用サンプルとした。前記分析用サンプルを市販のdropletdigitalPCR用試薬キット(PrimePCR for ddPCR、BIO−RAD社製)とdropletdigitalPCRシステム(QX100TM dropletdigitalPCR、BIO−RAD社製)を用いて分析サンプル中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)を測定し、濃縮効果(倍)(濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)/各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%))を算出した。尚、複合体A−1のみを分析用サンプルとした場合の結果を比較対象とした。
[複合体a2の形成を経た複合体Aの形成]
1.複合体a2の形成
第1PIポリアミド1×107分子相当とストレプトアビジン標識磁性ビーズ100μgをマイクロチューブ中で混合し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で30分間インキュベートし、第1PIポリアミドとストレプトアビジン標識磁性ビーズの複合体(複合体a2)を形成し、インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体a2に分離した。分離した液性成分に新たに第1PIポリアミド1×107分子相当とストレプトアビジン標識磁性ビーズ100μgを添加し、上記と同様の操作を行い、複合体a2を分離した。この操作を繰り返し3回行い、複合体a2を3セット(順に複合体a2−1、複合体a2−2、複合体a2−3)準備した。
(2−1)複合体a2−1を試料Kが入ったマイクロチューブに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、60分間インキュベートし、複合体A−1を形成する。インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体A−1に分離した。
(2−2)液性成分中に上記で作成した複合体a2−2、複合体a2−3を用いて、(2−1)と同様の手順で2回繰り返し、複合体A−2、複合体A−3を形成、分離した。
分離した複合体A全てに分散液として20μLのTEバッファーを添加し、分散液としてこれを分析用サンプルとした。前記分析用サンプルを市販dropletdigitalPCR用試薬キット(PrimePCR for ddPCR、BIO−RAD社製)とdropletdigitalPCRシステム(QX100TM dropletdigitalPCR、BIO−RAD社製)を用いて分析サンプル中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)を測定し、濃縮効果(倍)(濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)/各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%))を算出した。尚、複合体A−1のみを分析用サンプルとした場合の結果を比較対象とした。
表8に示される異なる塩基配列を有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を100子:1×104分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率1%)とした試料Lと、図18に示される本発明に係る第2PIポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ(MagnosphereTM MS300/Streptavidin、JSR Life Sciences社)を本発明に係る担持体として用いて実施する。二本鎖核酸分子としては、制限酵素処理済のプラスミドDNAを用いて実施した。
[複合体b1の形成を経た複合体Bの形成]
1.複合体b1の形成
第2PIポリアミド1×107分子相当を試料Lが入ったマイクロチューブに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で60分間インキュベートし、第2PIポリアミドとストレプトアビジン標識磁性ビーズの複合体(複合体b1)を形成した。
複合体b1が入ったマイクロチューブにストレプトアビジン標識磁性ビーズ100μgを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で60分間インキュベートし、複合体b1とストレプトアビジン標識磁性ビーズを結合させ複合体Bを形成する。インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体B−1に分離した。分離した液性成分に、新たにストレプトアビジン標識磁性ビーズ100μgを添加し、上記と同様の操作を行い、複合体Bを分離した。この操作を繰り返し3回行い、複合体Bを3セット(順に複合体B−1、複合体B−2、複合体B−3)それぞれ分離した。
分離した液性成分を分析用サンプルとした。前記分析用サンプルを市販dropletdigitalPCR用試薬キット(PrimePCR for ddPCR、BIO−RAD社製)とdropletdigitalPCRシステム(QX100TM dropletdigitalPCR、BIO−RAD社製)を用いて分析サンプル中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)を測定し、濃縮効果(倍)(濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)/各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%))を算出した。尚、複合体B−1を分離後の液性成分を分析用サンプルとした場合の結果を比較対象とした。
[複合体b2の形成を経た複合体Bの形成]
1.複合体b2の形成
第2PIポリアミド1×107分子相当とストレプトアビジン標識磁性ビーズ100μgをマイクロチューブ中で混合し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で60分間インキュベートし、第2PIポリアミドとストレプトアビジン標識磁性ビーズの複合体(複合体b2)を形成し、インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体b2に分離した。
分離した液性成分に、新たに第2PIポリアミド1×107分子相当とストレプトアビジン標識磁性ビーズ100μgを添加し、上記と同様の操作を行い、複合体b2を分離した。この操作を繰り返し3回行い、複合体b2を3セット(順に複合体b2−1、複合体b2−2、複合体b2−3)準備した。
(2−1)複合体b2−1を試料Lが入ったマイクロチューブに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、60分インキュベートし、複合体B−1を形成する。インキュベート後、磁気スタンドを用いてと液性成分と複合体B−1に分離した。
(2−2)液性成分中に、上記で作成した複合体b2−2、複合体b2−3を用いて(2−1)と同様の手順で2回繰り返し、複合体B−2、複合体B−3を形成して分離した。
分離した液性成分を分析用サンプルとした。前記分析用サンプルを市販dropletdigitalPCR用試薬キット(PrimePCR for ddPCR、BIO−RAD社製)とdropletdigitalPCRシステム(QX100TMdropletdigitalPCR、BIO−RAD社製)を用いて分析サンプル中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)を測定し、濃縮効果(倍)(濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)/各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%))を算出した。尚、複合体b2−1分離後の液性成分を分析用サンプルとした場合の結果を比較対象とした。
表13に示される異なる塩基配列を有する標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を500分子:5×105分子(試料中の標的二本鎖核酸分子含有率0.1%)とした試料Mと、図18に示される本発明に係る第1PIポリアミド及びストレプトアビジン標識磁性ビーズ(MagnosphereTM MS300/Streptavidin、JSR Life Sciences社)を本発明に係る担持体として用いた。二本鎖核酸分子は、制限酵素処理済のプラスミドDNAを用いた。尚、本実施例における標的二本鎖核酸分子は、K−RASコドン12G12C変異型の塩基配列に相当し、非標的二本鎖核酸分子は、K−RASコドン12野生型の塩基配列に相当する。又、複合体a1および複合体Aを形成する条件について表14の3つの条件でそれぞれ実施し、塩と界面活性剤の効果を確認した。
第1PIポリアミド1×107分子相当を試料Mが入ったマイクロチューブに添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で60分インキュベートし、第1PIポリアミドとストレプトアビジン標識磁性ビーズの複合体(複合体a1)を形成した。
複合体a1が入ったマイクロチューブにストレプトアビジン標識磁性ビーズ100μgを添加し、チューブ ローテーターで混和しながら、室温下で60分インキュベートし、複合体a1とストレプトアビジン標識磁性ビーズを結合させ複合体Aを形成した。インキュベート後、磁気スタンドを用いて液性成分と複合体Aに分離した。
分離した複合体Aに分散液として20μLのTEバッファーを添加し、これを分析用サンプルとした。前記分析用サンプルを市販のdropletdigitalPCR用試薬キット(PrimePCR for ddPCR、BIO−RAD社製)とdropletdigitalPCRシステム(QX100TM dropletdigitalPCR、BIO−RAD社製)を用いて分析サンプル中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)を測定し、濃縮効果(倍)(濃縮後の標的二本鎖核酸分子の含有率(%)/各試料中の標的二本鎖核酸分子の含有率(%))を算出した。
2 第1PIポリアミド
3 第1リンカー分子(例えばビオチン)
4 第1リンカー分子に特異的に結合するリガンド分子(例えばストレプトアビジン)
8 第2リンカー分子(例えばビオチン)
9 第2リンカー分子に特異的に結合するリガンド分子(例えばストレプトアビジン)
5 担持体a
6 非標的二本鎖DNA
7 第2PIポリアミド
10 担持体b
11 末端領域
12 識別領域1
13 識別領域2
14 連結領域
15 リンカー分子
100 複合体A
200 複合体B
Claims (18)
- 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾された第1PIポリアミドと、
前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、
を混合して混合溶液とする工程と、
(2)前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1の該第1PIポリアミドにさらに前記担持体aを結合させた複合体Aを形成する工程と、
(3)前記混合溶液から、前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。 - 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドが結合した複合体a1を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体a1の前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体Aを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。 - 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
(1)前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、
溶液または溶媒と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中で、前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体a2を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記試料を混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体a2の前記第1PIポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Aを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。 - 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって、
(1)前記試料と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bと、
を混合して混合溶液とする工程と、
(2)前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとを結合させた複合体b1の該第2PIポリアミドにさらに前記担持体bを結合させた複合体Bを形成する工程と、
(3)前記混合溶液から、前記複合体Bを分離して除去して除去する工程と、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法。 - 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって、
(1)前記試料と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドが結合した複合体b1を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体b1の前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体Bを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法。 - 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記非標的二本鎖核酸分子を分離して除去する方法であって、
(1)前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
前記第2PIポリアミドに修飾された第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液1とする工程と、
溶液または溶媒と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中で、前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体b2を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記試料を混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体b2の前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Bを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する方法。 - 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1を形成するとともに、
前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとが結合した複合体b1を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体a1の前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体Aを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。 - 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1を形成するとともに、
前記混合溶液1中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとが結合した複合体b1を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液2とする工程と、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体b1の前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体Bを形成する工程と、
(5)前記混合溶液2から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
(6)前記複合体Bを分離した前記混合溶液2に前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合させて混合溶液3とする工程と、
(7)前記複合体a1と前記担持体aが結合させて複合体Aを形成する工程と、
(8)前記混合溶液3から複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。 - 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bと、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中の前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドとが結合した複合体a1の該第1PIポリアミドにさらに前記担持体aを結合させた複合体Aを形成し、さらに、
前記混合溶液中の前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドとを結合させた複合体b1の該第2PIポリアミドにさらに前記担持体bを結合させた複合体Bを形成する工程と、
(3)前記混合溶液1から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
(4)前記混合溶液1から前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。 - 標的二本鎖核酸分子と非標的二本鎖核酸分子を含む試料から、前記標的二本鎖核酸分子を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法であって、
(1)前記試料と、
前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液1とする工程と、
(2)前記混合溶液1中で、前記標的二本鎖核酸分子と前記第1PIポリアミドが結合した複合体a1を形成する工程と、
(3)前記混合溶液1に、前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aを混合して混合溶液2とする工程と、および、
(4)前記混合溶液2中で、前記複合体a1の前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体Aを形成する工程と、
を含む複合体Aを形成する工程、
または、
(1’)前記標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)であって、第1リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第1PIポリアミド)と、
前記第1リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第1リガンド分子で修飾された担持体aと、
溶液または溶媒と、
を混合して混合溶液1’とする工程と、
(2’)前記混合溶液1’中で、前記第1PIポリアミドと前記担持体aが結合した複合体a2を形成する工程と、
(3’)前記混合溶液1’に、前記試料を混合して混合溶液2’とする工程と、
(4’)前記混合溶液2’中で、前記複合体a2の前記第1PIポリアミドと前記標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Aを形成する工程と、
を含む複合体Aを形成する工程、
から選択される複合体Aを形成する工程、ならびに、
(5)前記(4)の後の混合溶液2または(4’)のの後の混合溶液2’に、
前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
を混合して混合溶液3とする工程と、
(6)前記混合溶液3中で、前記非標的二本鎖核酸分子と前記第2PIポリアミドが結合した複合体b1を形成する工程と、
(7)前記混合溶液3に、前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液4とする工程と、
(8)前記混合溶液4中で、前記複合体b1の前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体Bを形成する工程と、および、
(9)前記混合溶液4から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する工程、
または、
(5’)前記非標的二本鎖核酸分子の特定の配列に特異的に結合するピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)であって、第2リンカー分子で修飾されたピロールイミダゾール含有ポリアミド(第2PIポリアミド)と、
前記第2リンカー分子と特異的に結合および/または吸着する第2リガンド分子で修飾された担持体bを混合して混合溶液3’とする工程と、
(6’)前記混合溶液3’中で、前記第2PIポリアミドと前記担持体bが結合した複合体b2を形成する工程と、
(7’)前記混合溶液3’に、前記(4)の後の混合溶液2または(4’)の後の混合溶液2’を混合して混合溶液4’とする工程と、
(8’)前記混合溶液4’中で、前記複合体b2と前記非標的二本鎖核酸分子が結合した複合体Bを形成する工程と、および、
(9’)前記混合溶液4’から前記複合体Bを分離して除去する工程と、
を含むことを特徴とする非標的核酸を分離して除去する工程、
から選択される非標的核酸を分離して除去する工程、ならびに、
(10)前記混合溶液4または4’から前記複合体Aを分離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸を非標的二本鎖核酸分子から分離して濃縮する方法。 - 請求項1〜請求項10から選択されるひとつ以上の方法を複数回繰り返すことにより標的塩基配列有する核酸分子を濃縮することを特徴とする方法。
- 前記非標的二本鎖核酸分子が、野生型のK−RAS、N−RAS,H−RAS、RHO、RAB、ARF、RAN、CYP、GSTT、NAT、TS、UGT、ERCC、MDR、CRHR、BRCA、MSH、CDA、DPD、OPRT、5−HTT、Factor V、VKORC1、APEX1、DCK、DPYD、TYMP、MLH1、UMPS、PCNA、POLA、RRM1、SLC29A1、TK1、UNG、ACTB、AKT1、ALK、APC、BRAF、CHD1、CTNNB1、EGFR、ERBB2、FBXW7、FGFR2、FOXL2、GNAQ、GNAS、KIT、MAP2K1、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、SMAD4、SRC、STK11、TP53、MLH1、MSH2、MSH6、APC、MEN1、RET、TP53、EGFR、BRAF、c−kit、PDGFRα、PDGFR、およびTP53からなる遺伝子群から選択される遺伝子上の特定の塩基配列の領域であって、
前記標的二本鎖核酸分子が、前記野生型の遺伝子群から選択される遺伝子上の前記特定の塩基配列の領域に一塩基以上の変異を有する、
ことを特徴とする請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1から12のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドが、以下の式1で示される構造であって、
T−A1−H−A2−L (式1)
[式中、Tは末端領域を、A1およびA2は識別領域を、Hは連結領域を、Lは第1リンカー分子または第2リンカー分子を意味する。]
前記識別領域と、連結領域と、第1リンカー分子または第2リンカー分子の間はアミド結合により連結され、
前記末端領域は、N、N−ジメチルアミノプロピルアミンであり、
前記識別領域は、ピロール(Py)、イミダゾール(Im)、およびβ−アラニン(β−Ala)から選択的に連結された識別領域であり、
前記連結領域は、炭素数が3以上で炭素−炭素が単結合である連結領域である、
ことを特徴とする方法。 - 前記非標的二本鎖核酸分子が、野生型のK−RAS遺伝子上のコドン12、コドン13の塩基配列の領域であって、
前記標的二本鎖核酸分子が、前記K−RAS遺伝子上のコドン12、コドン13の塩基配列の領域に一塩基以上の変異を有し、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドのリンカー分子Lがビオチンで構成され、前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域Hがγ−アミノブタン酸で構成され、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域H−識別領域A2−リンカー分子L中の識別領域A2のイミダゾール(Im)、ピロール(Py)及びβ−アラニン(β―Ala)の配列が、
H−(Py)(Py)(Py)(β―Ala)(Py)(Im)(β―Ala)−L の順番であり、
前記ピロールイミダゾール含有ポリアミドの連結領域H−識別領域A1−末端領域T中の識別領域A1のイミダゾール(Im)、ピロール(Py)及びβ−アラニン(β―Ala)の配列が、
H−(Im)(Py)(β―Ala)(Im)(Im)(Py)(β―Ala)−T;
H−(Im)(Im)(β―Ala)(Im)(Im)(Py)(β―Ala)−T;
H−(Im)(Im)(β―Ala)(Im)(Py)(Py)(β―Ala)−T;
又は
H−(Py)(Im)(β―Ala)(Im)(Im)(Py)(β―Ala)―T;
であり、
前記配列におけるイミダゾール(Im)、ピロール(Py)及びβ−アラニン(β―Ala)それぞれの分子間がアミド結合により連結されている、ことを特徴とする請求項13に記載の方法。 - 前記試料が、核酸分子を含む血清、血漿、尿、胸水、腹水、抹消血、およびリンパ液からなる群から選択されるひとつ以上の液体生検試料であって、前記試料中に含まれる標的二本鎖核酸分子を濃縮することができることを特徴とする請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、生検から抽出あるいは精製工程を経た核酸分子を含む試料であることを特徴とする請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法に用いるキットであって、
標的二本鎖核酸分子および非標的二本鎖核酸分子の配列の間の1塩基の違いを識別し結合することができる、配列を識別することができる識別領域を含むPIポリアミドであって、リンカー分子で修飾されたPIポリアミドと、
リンカー分子に特異的に結合することができるリガンド分子で修飾された担持体と、
pH緩衝剤、界面活性剤、2価の陽イオンを含む塩、および、1価の陽イオンを含む塩、およびこれらの組み合わせからなる群から少なくとも1つ以上選択される試薬と、
を含み、
前記界面活性剤が、混合溶液に対して0.05v/v%以下であり、
前記2価の陽イオンを含む塩および/または1価の陽イオンを含む塩が1モル/L以下であり、
前記PIポリアミドが、
前記識別領域が、標的二本鎖核酸分子または非標的二本鎖核酸分子の塩基配列に基づいて分子設計が可能であり、
前記PIポリアミドがさらに以下の(1)〜(4)の少なくとも1つ以上の特徴を有することを特徴とするキット。
(1)標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(T−AあるいはA−T)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を少なくとも一つ含む。
(2)標的塩基配列内あるいはその近傍の塩基対(T−AあるいはA−T)と結合し、かつ、ピロールイミダゾール含有ポリアミドにヘアピン様構造を形成することができるスペーサー分子を二つ以上含むことで環状構造を形成することができる。
(3)配列内の2あるいは3残基毎にβ−アラニン残基を少なくとも1残基以上を含む。
(4)標的二本鎖核酸分子の塩基配列と非標的二本鎖核酸分子の塩基配列を十分に認識することができる長さを有するPy、Im、およびβ−Alaを含む配列である。
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