JP2018520672A - 膀胱がんを診断する方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、患者における膀胱がんを診断する方法であって、患者に由来するDNAにおけるメチル化可変部位(Methylation Variable Positions:MVP)のメチル化状態を決定すること、及びメチル化状態のデータに基づく診断を提供することを含む、方法に関する。本発明はまた、本明細書において定義される診断方法によって膀胱がんの診断を提供すること、続けて患者に1以上の抗がん剤を投与することを含む、膀胱がんを治療する方法に関する。本発明はまた、本明細書において定義されるMVPを対象とするプローブを含むメチル化判別アレイ、及びアレイを含むキットに関する。
膀胱がんは、西洋世界において最もよく見られる悪性腫瘍の一つであり、米国において5番目によく見られるがんとして位置づけられており、全てのがん関連死の約3%を引き起こしている[1, 2]。診察時に最初に見られる臨床兆候は尿であり、調査した全てのそのような症例のうち約10%で、膀胱がんが検出される[3]。膀胱がんは、より高齢な男性患者、現在又は過去の喫煙者、及び工業的な発がん物質に曝された患者がよりなりやすい[4]。可視的でない血尿がみられるより若い女性は、膀胱がんが隠れている可能性はより低く、これらの患者では、血尿の誤診によって、膀胱がんの検出が遅れることが良くある出来事である[5]。膀胱鏡検査は、膀胱がんを検出するための現在の代表的な基準であり、診療所又は病院に通院する必要があり、小さいが有意な感染リスクを課す、侵襲的で不快な処置である[6‐9]。
安定し、高い感度及び特異度をもって、生体試料、特に排尿試料から膀胱がんを検出し得る、診断方法が提供される。該方法は、血尿で照会された患者、及び疾患の再発についての観察を受けている患者における膀胱鏡検査のニーズを低減する可能性がある。膀胱鏡検査を回避することで、膀胱がんの管理費用が低減され、患者の幸福においてポジティブな影響があり、通院数や侵襲的な検査の不都合の両方が低減される。それゆえ、本発明は以下を提供する:
本発明は、個体における膀胱がんを診断する方法であって、
以下:
(a) 個体由来の試料からDNAを提供すること;
(b) 配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;及び
(c) (b)のグループのMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、を含む方法を提供する。
MVPのグループは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの150全てを含み得る。
上記のいずれかの方法において、MVPの各1がメチル化されているかを決定する工程は、以下:
1)MVPの配列を決定するために、シーケンシング工程を実施すること;
2)MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるプローブを含むアレイにDNAをハイブリダイズし、及びMVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別するためのアレイに、検出システムを適用すること;又は
3)メチル化特異的プライマーを使用する増幅工程を実施することであって、メチル化されているか又はメチル化されていないかのMVPの状態が、増幅産物の存在又は非存在によって決定されること、
を含み得る。
シーケンシング又はハイブリダイゼーション工程の前に、キャプチャリング(capturing)工程を実施し得る。該キャプチャリング工程は、MVPローカスに特異的である結合分子に、MVPローカスを含むポリヌクレオチドを結合すること、及びMVPローカス及び結合分子を含む複合体を回収することを含み得;及びここで:
i 重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の前に、該キャプチャリング工程が存在する;
ii 重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の後だが、増幅若しくはハイブリダイゼーション工程の前に、該キャプチャリング工程が存在する;又は
iii 重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の後で、増幅工程の後に、該キャプチャリング工程が存在する。
該結合分子は、精製のための成分(purification moiety)に結合し得る。
該第一の精製のための成分は、ビオチンであり得、該第二の精製のための成分は、ストレプトアビジンであり得る;又は該第一の精製のための成分は、ストレプトアビジンであり得、該第二の精製のための成分は、ビオチンであり得る。
MVPを含むローカスを増幅する工程は、マイクロドロップレットPCR増幅により実施し得る。
上記のいずれかの方法において、該方法は、95%以上のROC感度及び90%以上のROC特異度;好ましくは96%のROC感度及び97%のROC特異度、好ましくは95%以上、好ましくは98%のROC AUCを達成し得る。
上記のいずれかの方法において、該方法は、95%以上、好ましくは、97%の陰性的中率(NPV)を達成し得る。
I. 腫瘍の悪性度を階層化すること;及び/又は
II. 腫瘍の再発のリスクを決定すること;及び/又は
III. 非筋肉浸潤性疾患の進行のリスクを決定すること;及び/又は
治療療法に対し予想される応答を決定することを含み得る。
(a) 個体に由来する試料からDNAを採取し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;及び
(c) 該個体に対し、1以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む、方法を提供する。
(a) 個体に由来する試料からDNAを提供し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;及び
(c) 該個体に対し、1以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む、方法を提供する。
(a) 個体に由来する試料からのDNAにおいて、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;及び
(c) 該個体に対し、1以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む、方法を提供する。
(a) 個体に由来する試料からのDNAを提供し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;及び
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、
を含む工程によって、個体が膀胱がんであると診断されている、方法を提供する。
(a) 配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを特定するデータを得ること;及び
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;を含み、
ここで、該データが以下:
i 試料に由来するDNAを採取すること;及び
ii 該DNAにおいて、MVPがメチル化されているかを決定すること、
を含む方法によって得られた、方法を提供する。
該パネルは、配列番号1〜150で定義されるMVP全てを含み得る。
1以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号1〜150で定義されるMVP全てを含み得る。
本発明はまた、上記アレイのいずれかを含むキットを提供する。
膀胱がん
上記で検討したように、膀胱がんは、西洋世界において、がんの最も一般的であるグループの一つである。移行細胞がんは、最も一般的な型であり、膀胱がんの約90%を占める。移行細胞がんは、膀胱の内側表面を裏打ちする組織である、移行上皮から生じる。膀胱がんの残りの10%は、主に、扁平上皮がん、腺がん、肉腫及び小細胞がんからなる。扁平上皮がんはまた、上皮組織、扁平上皮細胞から生じる。これらは、最も浅い上皮層に見られる薄い平らな細胞である。腺がんは、腺の特徴及び/又は起源を有する上皮細胞から生じる。肉腫は、例えば膀胱の脂肪層及び筋肉層の細胞等の間葉起源の細胞に由来する。小細胞がんは、速い倍増時間を有し、早期転移が可能であり、それによって特に攻撃的になる。
本明細書に記載された診断及び治療方法は、膀胱がんの全ての分類の悪性細胞を陽性として検出することができる。それゆえ、本明細書に記載されたいずれかの方法は、膀胱の移行細胞がん、膀胱の扁平上皮がん、膀胱の腺がん、膀胱の肉腫、膀胱の小細胞がん、転移性膀胱がん、平滑筋肉腫(平滑筋から生じる腫瘍)、リンパ腫(通常、リンパ節に生じる腫瘍)、悪性メラノーマ(通常、皮膚から生じる腫瘍)及び大細胞神経内分泌がんを診断するために使用し得る。膀胱がんの原発形態及び再発形態が含まれる。本明細書に記載されるように、診断され又は治療される該がんは、尿路上皮細胞がんであり得る。それゆえ、該がんは、尿管、尿道又は腎盂のがんであり得る。
DNAのメチル化は、例えば遺伝子及びmicroRNA等の他の要素の発現を改変することができるエピジェネティックな修飾の広く認められている形式である[51]。がんの発症及び進行において、メチル化は、例えば腫瘍サプレッー遺伝子をサイレンシングする及び/又はがん遺伝子の発現を増大させる効果を有し得る。調節異常の他の形式は、メチル化の結果として生じ得る。DNAのメチル化は、CpGモチーフからなる主にジヌクレオチドである、別々のローカスで起こるが、CHHモチーフ(ここでHは、A、C又はTである)においてもまた起こりうる。メチル化の間、メチル基が、シトシン塩基の5位の炭素に付加され、メチルシトシンとなる。
本明細書において定義されるメチル化可変部位(MVP)は、表現型間、すなわち、腫瘍と正常な組織の間での、メチル化状態における違いを示し得る、任意のジヌクレオチド部位である。MVPは、好ましくは、CpG又はCHHジヌクレオチドモチーフである。本明細書において定義されるMVPは、対応する発現される配列に関するローカスの部位に限定されない。
MVPのメチル化状態を評価すること、又はMVPがメチル化されるかを決定することによって、その後の処理の前に、個体から採取したDNAの開始試料において、MVPがメチル化されたか又はメチル化されなかったかどうかについて決定することを意味する。
本明細書に記載されたいずれかの方法において、メチル化されていると決定したMVPは、健常な尿路上皮対照及び/又は全血対照に比べてメチル化されている。
診断目的として有用である特異的なMVPは、表1に記載されており、配列番号及びIllumina ID番号(Ilmn ID)で特定される。定義されたMVPを増幅するための例示的なプライマーは、表2に記載されており、配列番号によってもまた特定される。
多様な技術が、メチル化可変部位 (MVP)の特定及び評価のために利用することができ、以下で簡易に概説される通りである。本明細書に記載された診断方法は、MVPの状態を決定するための任意の好適な技術を包含する。
例えばPCR等の従来のin vitroでの操作工程の間に、開始DNA分子からメチル基が失われる。このことを避けるために、メチル基を検出する技術は、一般的に、その後の処理に先立って、元のDNA分子のメチル化状態の情報を保存する方法での、DNAの予備的な処理を含む。そのような予備的な技術は、処理の3つの主なカテゴリー、すなわち重亜硫酸塩修飾、制限酵素分解及び親和性に基づく分析を含む。次いで、これらの技術の産物は、MVPメチル化状態のその後の特定又は定性的評価のための、シーケンシング又はアレイベースのプラットフォームと一体となり得る。
他のアプローチにおいては、メチル化DNAが存在するときのみ、消化又は切断するメチル化感受性酵素が、用いられ得る。結果として生じる断片の分析は、一般的にマイクロアレイを用いて実行される。
性状が調べられ本明細書に記載された、MVPベースのバイオマーカーのメチル化状態を評価する目的で、任意の好適な方法が利用され得る。
好ましい方法は、メチル化特異的PCRのために特定されたMVPローカスの増幅及び/又はシーケンシング及び/又はメチル化判別マイクロアレイを用いた標的ローカスのメチル化状態の評価を含む、DNAの重亜硫酸塩処理を含む。
任意の好適なシーケンシング技術は、標的DNAの配列を決定するために利用され得る。本発明の方法においては、重亜硫酸塩処理したDNAをシーケンシングするためのハイスループット、いわゆる「第二世代」、「第三世代」及び「次世代」技術の使用が好ましい。
任意の好適なメチル化判別マイクロアレイは、本明細書に記載されたMVPのメチル化状態を評価するために利用し得る。好ましいメチル化判別マイクロアレイシステムは、Illumina, Inc. (San Diego, CA;http://www.illumina.com/)によって提供される。特に、Infinium HumanMethylation450 BeadChipアレイシステムは、本明細書に記載されたように膀胱がんの診断に用いるMVPのメチル化状態を評価するために使用され得る。そのようなシステムは、開始DNA分子の重亜硫酸塩処理を経たDNAになされた化学修飾を利用する。簡易には、該アレイは、MVPの非メチル化形態に対応するDNA配列に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブと結合するビーズ、及びMVPのメチル化形態に対応するDNA配列に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブと結合する、別のビーズを含む。候補DNA分子は、アレイに適用され、関連するエピジェネティックな形態に対応するオリゴヌクレオチドプローブに、好適な条件下で、選択的にハイブリダイズする。それゆえ、対応するゲノムDNAにおけるメチル化MVPに由来するDNA分子は、メチル化特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むビーズに選択的に、付着(attach)するが、非メチル化特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むビーズに付着しない。ハイブリダイズしたプローブのみの1塩基伸長は、その後蛍光試薬で染色され、撮像される、標識ddNTPを取り込む。メチル化部位及び非メチル化部位に由来する蛍光シグナルの比を計算することによって、該MVPのメチル化状態を決定し得る。
上記方法において、MVPローカスに対応する配列はまた、濃縮工程に供し得る。目的のMVP配列を含有するDNAは、例えば目的のMVP標的配列に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブ等の結合分子によってキャプチャし得る。重亜硫酸塩による変換の前若しくは後、又は増幅の前若しくは後に、MVPローカスに対応する配列は、キャプチャし得る。プローブは、重亜硫酸塩で変換したDNAに相補的であるよう設計され得る。次いで、キャプチャされたDNAは、例えばDNAシーケンシング工程等、該MVPの状態を決定するための、更なる処理工程に供し得る。
http://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/technote_hm450_data_analysis_optimization.pdfで見ることができる。
それゆえ、本明細書において定義されるMVPは、表1に列記された各配列番号及びIllumina Identifier (Ilmn ID)に関連して特定されるCGジヌクレオチドモチーフを参照する。そこでは、ジヌクレオチドのシトシン塩基(表1に列記される配列において太字及び大括弧で強調されている)は、修飾されても良い(又はされなくても良い)。それゆえ、所定の配列番号によって定義されるか若しくは特定されるCpGのメチル化状態を決定することによって、又はそのようなCpGがメチル化されているかを決定することによって、個体に由来するDNAの試料における1以上のローカスにおいて、表1に示される配列における太字及び大括弧で特定されるCGジヌクレオチドモチーフのシトシンが、メチル化されているか又はメチル化されていないかについての決定がなされることを意味する。それにより、シーケンシングのエラー又は個体間の多様性によって、任意の所定のCpGの上流及び下流の配列における多様性が存在し得ることを許容する。
(a) 個体に由来する試料からDNAを提供すること;
(b) 配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;及び
(c) (b)のグループのMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、
を含む方法を提供する。
好ましくは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの40以上がメチル化されているとき、膀胱がんが診断され得る。
重亜硫酸塩で変換したDNA配列のin silico分析、及びメチル化特異的分析の目的のためのプライマー設計において助けとなるソフトウェアプログラムは、一般的に入手でき、以前に記載されている[57, 58, 59]。
本明細書に記載されたMVPメチル化状態アッセイに基づく膀胱がん診断のための感度及び特異度の指標は、標準的な受信者動作特性(ROC)統計分析を用いて定義し得る[52]。ROC分析においては、100%の感度は、偽陰性が見られないことに対応し、及び100%の特異度は、偽陽性が見られないことに対応する。
本発明に従った診断検査は、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%のROC特異度を達成し得る。該ROC特異度は100%であり得る。
それゆえ、該ROC特異度は、100%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%又は100%であり得る。
該ROC特異度は、99%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%又は99%であり得る。
該ROC特異度は97%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%又は97%であり得る。
該ROC特異度は96%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%又は96%であり得る。
該ROC特異度は95%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%又は95%であり得る。
該ROC特異度は93%であり得、該ROC感度は90%以上、91%以上、92%又は93%であり得る。
該ROC特異度は92%であり得、該ROC感度は90%以上、91%又は92%であり得る。
該ROC特異度は91%であり得、該ROC感度は90%又は91%であり得る。
該ROC特異度は90%であり得、該ROC感度は90%であり得る。
好ましくは、該検査は、95%以上のROC感度及び90%以上のROC特異度;好ましくは、96%のROC感度及び97%のROC特異度を達成し得る。
MVPベース検査の正確性を分類するために利用され得る更なる指標は、ROC AUCである。ROC分析においては、ROCプロットの曲線下面積(AUC)は、二項分類のための指標である。ランダムな二項分類器においては、真陽性及び偽陽性の数は、およそ等しい。この状況において、ROCプロットについてのAUCスコアは0.5である。完全な二項分類器においては、真陽性の数が100%となり、偽陽性の数は0%である。この状況において、ROCプロットについてのAUCスコアは1である。
150MVPバイオマーカーのパネルを用いて実施された分析に基づいて、本明細書に記載された、本発明に従った膀胱がん診断検査は、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%又は100%のNPVを達成し得る。
本明細書に記載された膀胱がん診断検査は、患者から採取された任意の好適な生体物質で実施し得る。好ましい生体物質は尿である。しかしながら、膀胱組織の試料、例えば生検又は吸引によって採取されたか、又は保存されていた試料(例えば、凍結保存材料、組織切片等)から採取したものを用い得る。生体物質の試料としてはまた、固形の組織試料、吸引物、体液の試料、血液、血清、血漿、腹水、リンパ、末梢血、脳脊髄液、細針による吸引物、唾液、痰、骨髄、皮膚、上皮試料(口腔、頚部又は膣上皮を含む)、又は外胚葉に由来する他の組織、膣液、精液等が挙げられ得る。組織のスクレープス(scrape)としては、例えば口腔、食道、膀胱、膣、尿道又は頚部のスクレープスに由来する生体物質が挙げられ得る。該試料の細胞は、例えばリンパ球等の炎症細胞を含み得る。
本明細書に記載された検査及び方法のいずれかは、患者から以前に採取された生体試料から、患者DNAを採取することを含み得る。
本明細書に記載された検査及び方法のいずれかは、メチル化分析のための患者DNAのソースとして、患者由来の生体試料を採取することを含み得る。患者から生体試料を採取する手順は、例えば尿から細胞を回収する等、非侵襲的であり得る。代替的には、例えば生検等の侵襲的な手順を用い得る。
本発明はまた、本明細書に記載された診断方法によって、膀胱がんが陽性である診断に続き、1以上の治療工程の実行を包含する。
それゆえ、本発明はまた、個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下:
(a) 個体に由来する試料からDNAを採取すること、及び配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること:
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;及び
(c) 該個体に対し、1以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法を包含する。
(a) 個体に由来する試料からDNAを提供すること、及び配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;及び
(c) 該個体に対し、1以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法を包含する。
(a) 個体に由来する試料からのDNAにおいて、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;及び
(c) 該個体に対し、1以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法を包含する。
(a) 個体に由来する試料からDNAを提供すること、及び配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;及び
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、
によって膀胱がんと診断されている、方法を包含する。
それゆえ、本発明は、膀胱がん陽性の診断に続き、1以上の外科処置、1以上の化学療法剤、1以上の免疫治療剤、1以上の放射線治療剤、1以上のホルモン治療剤又は上記の任意の組合せを投与することを包含する。
外科処置としては、膀胱腫瘍の経尿道切除 (TURBT)、膀胱摘除術、開放性膀胱全摘除術 (ORC)、腹腔鏡膀胱全摘除術 (LRC)及びロボット支援膀胱全摘除術 (RARC)が挙げられる。
剤の組合せとしては、MVAC(メトトレキセート、ビンブラスチン、ビンブラスチン及びビンブラスチン)(Methotrexate, Vinblastine, Vinblastine and Vinblastine)、ジェムシス(GC)(ゲムシタビン及びシスプラチン)、ラパチニブ及びゲムシタビンが挙げられるが、それらに限定されない。
併用療法としては、膀胱内、逐次BCG、続いてMMCの電動投与(EMDA)(EMDA-MMC)、並びにマイクロ波誘発性膀胱壁温熱療法(HT)及び膀胱内MMCが挙げられる。
本発明はまた、本明細書において定義した、MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるアレイを包含する;該アレイは、本明細書において定義されるMVPのメチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブ及び本明細書において定義されるMVPの非メチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。
「特異的」とは、該プローブが、特にストリンジェントな状態において、ハイブリダイズし得るようMVPを含むオリゴヌクレオチドの配列に、相補的である配列を含むことを意味する。
幾つかの実施形態においては、該アレイは、Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChipアレイ (Infinium HumanMethylation450 BeadChip array)ではない。
更に、本発明は、個体における膀胱がん細胞を診断する目的のために、MVPのメチル化状態を決定することを要求する方法のいずれかにおいて、本明細書において定義されるアレイのいずれかの使用を包含する。
本明細書において定義されるアレイのいずれかが、キットに含まれ得る。
該キットは、本明細書において定義される任意のアレイを含み得る。
該キットは、使用のための説明書と共に、本明細書において定義される任意のアレイを含み得る。
該キットは、追加的に、例えば重亜硫酸塩剤等のDNA修飾剤を含み得る。
該キットは、追加的に、例えば配列番号1〜150において特定される、本明細書において定義されるMVPのいずれかを対象とするプライマー(表2参照)等のDNAを増幅する試薬を含み得る。
更に、本発明は、個体に由来する試料のメチル化プロファイルを決定する方法であって、以下:
i 個体に由来する試料からDNAを提供すること;
ii 配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;及び
iii 該グループのMVPのメチル化状態に基づき、試料のメチル化プロファイルを決定すること、
を含む、方法を包含する。
更に、任意のそのような方法においては、本明細書に記載されたいずれかのアレイを使用して、MVPのメチル化状態が決定され得る。
本明細書に記載された診断方法のいずれかにおいて、個体における膀胱がんを診断する工程は、更に以下:
I 腫瘍の悪性度を階層化すること;及び/又は
II 腫瘍の再発リスクを決定すること;及び/又は
III 非筋肉浸潤性疾患の進行リスクを決定すること;及び/又は
IV 治療療法に対し予想される応答を決定すること、
を含み得る。
(a)個体に由来する試料からDNAを提供すること;
(b)配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;及び
(c)該グループのMVPのメチル化状態に基づき、個体における膀胱がんの発症のリスクを決定すること、
を含む方法を包含する。
更に、任意のそのような方法においては、MVPのメチル化状態は、本明細書に記載されたアレイのいずれかを用いて決定し得る。
本発明はまた、個体における膀胱がんの診断において、又は個体における膀胱がんの発症のリスクを決定することにおいて、MVPのグループの使用を包含する。
任意のそのような使用において、MVPのグループは、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択される。
任意のそのような使用において、MVPのグループは、該グループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むという条件で、本明細書において記載され、定義された任意のMVP数を含み得る。
上記使用のいずれかにおいて、個体における膀胱がんの診断又は個体における膀胱がんの発症リスクの決定は、本明細書において記載され、定義された各方法のいずれかによって実行され得る。更に、任意のそのような方法においては、MVPのメチル化状態は、本明細書に記載されたアレイのいずれかを使用することで決定され得る。
本発明は、以下の実施例によって例示される。
序論
次世代DNAシーケンシングプラットフォームを利用する新興技術は、高感度エピジェネティックバイオマーカーパネルの開発のために、特に有望である。例えば、RainDance Technologiesによって開発された、重亜硫酸塩で変換したDNAのマイクロドロップレット・ベースのPCR増幅の後の、増幅された標的ローカスの次世代シーケンシング[30]によって、20,000までの重亜硫酸塩で変換された標的ローカスを、精度良く、特異的に、同時に増幅することができる。重亜硫酸塩で変換したDNAの高度に並列なマイクロドロップレット・ベースのPCR増幅は、様々な組織におけるエピジェネティックな変化の評価において有用性を示している[31‐33]。しかしながら、膀胱がんを検出するための非侵襲的診断バイオマーカーの開発には、まだ適用されていない。
膀胱がんを検出するための精度の良い検査を得るために、本発明者はこれまで、膀胱がんにおけるゲノムワイドなメチル化の最大の独立研究の一つを実施している。これにより、膀胱特異的エピジェネティックバイオマーカーのパネルが定義されており、尿中DNAにおいて、RainDrop‐BS[31]を用いて、150ローカスパネルの感度及び特異度が、高い程度の診断精度を伴う、膀胱がんの検出に関して検証されている。
ロンドン大学病院(UCLH)(ロンドン)泌尿器科及びエネルギー・環境・技術研究センター(CIEMAT)(マドリード)から回収された、81の膀胱がん及び30の年齢をマッチさせた健常な尿路上皮の試料に由来するDNAにおいて、ゲノムワイドのDNAメチル化プロファイリングが実施された。該コホートは、35の低悪性度の非筋肉浸潤性がんを含んでいた。80%超の腫瘍細胞充実性を有する切片を含めるよう、代表的なH&E切片の病理学的レビューが行われた。血中メチロームデータは、MARMAL-aid database (http:/marmal‐aid.org, [34])からダウンロードした。
独立した検証データは、MIBC膀胱がん及び20の健常な尿路上皮試料からなる、がんゲノムアトラスプロジェクト(Cancer Genome Atlas Project)(https://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/tcgaCancerDetails.jsp?diseaseType=BLCA&diseaseName=Bladder%20Urothelial%20Carcinoma)から入手した。
検証研究のために、UCLHワンストップ血尿及びサーベイランス膀胱鏡検査クリニック (UCLH one-stop haematuria and surveillance cystoscopy clinics)に通院している患者から、逐次的な尿試料を採取した(n=86:膀胱がん、n=96:非がん対照)。
大学病院において、血尿診療所に通院しているか、又は再発した膀胱がんのために膀胱鏡検査を受けている患者から、尿試料を採取した。診療所と自宅での尿試料を比較するために、患者には3試料:診療所での1試料及び自宅での2試料(内1つは、最初の排尿でなければならない)を供給するように依頼した。試料当たり40〜100mlが採取された。1試料のための自宅尿キットは、最大で4本の25ml滅菌チューブ、吸収パッドを備えた郵送用チューブ、及びロイヤルメールの郵便ポストを何とか通り抜けるよう設計した、予めあて名書きされた、パッド入りの封筒を含んでいた。
DNA抽出及び定量
製造業者の指示に従って、DNeasy血液・組織キット (Qiagen, UK)を用いて、尿中DNAを抽出した。分光測光法 (Nanodrop 1000)及び蛍光定量法 (Qubit ds DNA HS assay, Invitrogen, UK)によってDNAを定量した。
マイクロドロップレットPCRのために、7.20μlの重亜硫酸塩で処理し(及び任意で、全ゲノムを増幅した)DNAを、4.70μlの10×High‐Fidelity Buffer (Invitrogen)、1.80μlの50 mM MgSO4 (Invitrogen)、1.62μlの10 mM dNTP solution mix (NEB)、3.60μlの4 Mベタイン溶液 (Sigma-Aldrich), 3.60μlの液滴安定剤 (RainDance Technologies)、1.80μlの100%ジメチルスルホキシド(Sigma-Aldrich)及び0.72μlの5U/μl Platinum Taq Polymerase High-Fidelity (Invitrogen)に添加し、総量を25μlにした。ALPS 50Vマイクロプレート・ヒートシーラー(Thermo Scientific)を用いて、試料プレートをシールした。
500 ngのDNAを、重亜硫酸塩で変換し、Infinium 450K Humanメチル化アレイにハイブリダイズし、製造業者の推奨に従って処理した。製造業者の指示の通りに、EZ DNA Methylationキット (Zymo Research)を用いて、重亜硫酸塩によるDNAの変換を実施した。試料は単一バッチ内で処理した。それに続くデータ分析には、R統計ソフトウェア(version 2.14.0 [35])を用いた。iDatファイルからのデータを抽出及び分析するために、ChAMPパイプラインを用い、BMIQを用いて試料を標準化した[36, 37]。未加工のβ値(メチル化値)を以下のように、ストリンジェント品質管理分析に供した:カバレッジの低下を示した試料を除き、全試料に対してバックグラウンドを超える検出レベルのプローブのみを保持した(検出P値<0.01)。Lassoを用いて、DMR (Differentially Methylated Regions:差次的メチル化領域)を決定した[38, 39]。
製造業者のプロトコールに従って、プールしたシーケンシングライブラリー(12 pM)及び特注のシーケンシングプライマー (0.5 μM)をMiSeq‐cycle PE consumable cartridge (Illumina)にアプライした。特注のシーケンシングプライマーのDNA配列は、以下の表2において提供される。MiSeq DNAシーケンサー(Illumina)において、75bpのペアエンドリードを用いて、シーケンシングを行った。
RainDance ThunderStorm(登録商標)Systemはまた、核酸のシーケンシングにも用いた (http://raindancetech.com/targeted-dna-sequencing/thunderstorm/).
ea‐utils v1.1.2‐537のfastq‐mcfツールを用いて、未加工のシーケンシングリードから、シーケンシングアダプターを切り取った[60]。Bismark v0.7.12を用いて、切り取られたシーケンシングデータを、in silico重亜硫酸塩変換ヒト・リファレンスゲノム(GRCh37)にマップした[40, 61]。Bismark v0.7.12のmethylation_extractorツールを用いて、メチル化情報を抽出した[61]。RパッケージTEQC v3.2.0.25を用いて、標的とされたDNAシーケンシング分析を実施した。
まず、81人の高悪性度及び30人の健常な尿路上皮に由来するDNAにおいて、ゲノムワイドでのDNAメチル化プロファイリングを実施することによって、膀胱がんに関連するエピジェネティックな変化を定義した。
膀胱がん及び健常な組織の間でのMVP (メチル化可変部位)を特定するために、傾向を見出すためのWilcoxon順位和検定を使用する、教師あり分析を用いた。統計的有意性(Wilcoxon P値>0.001)に基づき、MVPを選択した。グループ間でのメチル化における絶対的な相違を考慮しないことを補償するために、Δβ>0.30(+/-)の追加的なフィルターを適用した。偽検出率(FDR)<2%となるように、及び最も大きいメチル化の相違を有し、それゆえ判別効果の可能性が最も大きいところまで、候補ローカスを減らすように、カットオフは実験的に定義される。合計9786MVPが、これらの要件を満たした(1746の高メチル化MVP、8040低メチル化MVP) (図1)。
DNAメチル化バイオマーカーパネルを定義するために、がんの少なくとも50%においてメチル化されていると決定され (β>50%)、健常な尿路上皮においてメチル化されていないと決定された (β<10%)、ローカスを特定した。この最初のDNAメチル化バイオマーカーパネルの開発に関連して、本明細書において検討されるように、「メチル化されている (β>50%)」は、任意の所定のローカスについて、患者試料における細胞の50%超が、MVPに関してメチル化されていると決定されることを意味する。潜在的な偽陽性バイオマーカーを除くため、及び膀胱がん特異的である変化をより良く定義するために、血尿診療所に通院しており、診断で非がんであることが確定した10人の患者由来の全血及び尿もまた、プロファイルされた。続いて、これらの非がんの対照尿及び血液に由来するDNAにおいて、任意のメチル化を示した任意のローカス(β>10%)を除去した。非がんにおいてメチル化されておらず、がん組織の大多数においてメチル化されている (β>50%)、最大で432ローカスが特定された。
尿試料における膀胱がんの検出のための150ローカスパネル (エピ-シグネチャー)をテストするため、尿沈渣細胞由来DNAを、52人の膀胱がん患者(低悪性度:27、中/高悪性度:25)及び34人の非がん患者対照を含むコホート(n=86)から採取した。この検証コホートにエピ-シグネチャーを適用することで、この独立した検証コホートにおける膀胱がんの検出に対して、95%の感度及び96%の特異度及び97%のAUCが得られる(図5)。
RainDrop BS‐seq [31]は、並行して、多数の領域(最大20,00固有の単位複製配列)のラージスケールを標的とした重亜硫酸塩シーケンシングを可能にする。この技術は、既に検証され、450Kメチル化アレイと相関性が高いことが示されており、少ない鋳型のインプットの有用性もまた検証されている[31, 32]。重亜硫酸塩で変換したシーケンシングプライマーパネルは、150の選択されたゲノムのローカスのメチル化状態を測定するために設計された(以下の表2参照)。プライマーは、ワトソン・クリック鎖の両方を、可能であれば独立して調べるために設計された。尿エピ-シグネチャーの検証は、96症例の2番目の独立したコホートにおいて、RainDrop BS‐seqを用いて行われた。尿沈渣細胞由来のDNAを、26人の膀胱がん患者及び64人の非がん患者対照から採取した。150ローカス各々についてのメチル化スコアを、Bismarkアルゴリズムを用いて生成し、このデータを用いて、尿エピ-シグネチャーから、96%の感度、97%の特異度及び0.96のAUCで、膀胱がんが存在する可能性を予測した。
バイオマーカーによって早期に非侵襲的に膀胱がんを検出することは、この疾患の管理を劇的に改善する可能性を有する。感度及び特異度が高い検査は、血尿診療所に通院している患者における新たな疾患の検出、及びまた存在している膀胱がん集団における再発のスクリーニングの両方において、有用である可能性を有する。
患者尿の試料からのDNA収量を最大化するために、最適化研究を実施した。DNAを、プロテネースKで、56℃で1時間又は21℃で48時間のいずれかでインキュベートした。インキュベーションは、100 mg/mLのRNAse A存在下で行われた。延長したインキュベーション・プロトコールで、DNAの量及び純度の両方の増加が観察された(図8D)。
32の膀胱がんが確認された症例及び64の非がん症例に由来する96の尿試料(検証コホート2)を、上記のように分析した。RainDance ThunderStorm(登録商標)Systemを用いた重亜硫酸塩による変換に続き、上記150UroMarkローカスのシーケンシングを実施した。上記のように統計分析を実施し、得られるROCプロットを図9に示す(AUC=0.96、感度=0.97、特異度=0.97、NVP=0.98)。
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Claims (48)
- 個体における膀胱がんを診断する方法であって、以下:
(a) 個体に由来する試料からDNAを提供すること;
(b) 配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;及び
(c) (b)のグループのMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、
を含む、方法。 - MVPのグループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも40を含み、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、膀胱がんが診断される、請求項1に記載の方法。
- MVPのグループが、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも50を含む、又は配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも100を含む、請求項2に記載の方法。
- MVPのグループが、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの150全てを含む、請求項3に記載の方法。
- 配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも40がメチル化されているとき、又は配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも50がメチル化されているとき、又は該MVPの少なくとも100がメチル化されているとき、又は全150MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんが診断される、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- メチル化されていると決定した前記MVPが、配列番号1〜3において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、又は配列番号1〜5において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、又は配列番号1〜10において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、又は配列番号1〜40において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、上記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記MVPのグループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの150全てを含み、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも40がメチル化されているとき、個体における膀胱がんが診断され、メチル化されていると決定したMVPが、配列番号1〜10において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MVPの各1がメチル化されているかを決定する工程が、重亜硫酸塩でDNAを変換することを含む、上記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記MVPの各1がメチル化されているかを決定する工程が、以下:
1)MVPの配列を決定するために、シーケンシング工程を実施すること;
2)MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるプローブを含むアレイにDNAをハイブリダイズし、及びMVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別するためのアレイに検出システムを適用すること;又は
3)メチル化特異的プライマーを使用する増幅工程を実施することであって、メチル化されているか又はメチル化されていないかのMVPの状態が、増幅産物の存在又は非存在によって決定されること、
を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - シーケンシング又はハイブリダイゼーション工程の前に、増幅工程が実施され、各MVPを含むローカスが増幅される、請求項9(a)又は9(b)に記載の方法。
- 増幅工程がPCRによって実施される、請求項9(c)又は請求項10に記載の方法。
- シーケンシング又はハイブリダイゼーション工程の前に、キャプチャリング工程が実施され、該キャプチャリング工程が、MVPローカスを含むポリヌクレオチドを、MVPローカスに特異的な結合分子に結合させること、並びにMVPローカス及び結合分子を含む複合体を回収することを含み;及びここで:
i 重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の前に、前記キャプチャリング工程が存在する;
ii 重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の後であるが、増幅又はハイブリダイゼーション工程の前に、前記キャプチャリング工程が存在する;又は
iii 重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の後であって、増幅工程の後に、キャプチャリング工程が存在する;
請求項10又は請求項11に記載の方法。 - 前記結合分子が、各MVPに特異的なオリゴヌクレオチド、好ましくは対応するMVPに相補的である配列を各々有するDNA又はRNA分子である、請求項12に記載の方法。
- 前記結合分子が、精製のための成分に結合している、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記精製のための成分が、第一の精製のための成分を含み、MVPローカス及び結合分子を含む複合体を回収する前記工程が、前記第一の精製のための成分を、第二の精製のための成分を含む基質に結合することを含み、第一及び第二の精製のための成分が相互作用複合体を形成する、請求項14に記載の方法。
- 前記第一の精製のための成分がビオチンであり、前記第二の精製のための成分がストレプトアビジンである;又は前記第一の精製のための成分がストレプトアビジンであり、前記第二の精製のための成分がビオチンである、請求項15に記載の方法。
- MVPを含むローカスを増幅する前記工程が、MVPのメチル化状態に依存しないプライマーの使用を含む、請求項10〜16のいずれか1項に記載の方法。
- MVPを含むローカスを増幅する前記工程が、マイクロドロップレットPCR増幅により実施される、請求項3〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 個体から採取された前記生体試料が、尿、血液、血清、血漿又は無細胞DNAの試料である、上記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、95%以上のROC感度及び90%以上のROC特異度;好ましくは96%のROC感度及び97%のROC特異度を達成する、上記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、95%以上、好ましくは98%のROC AUCを達成する、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、95%以上、好ましくは97%の陰性的中率 (NPV)を達成する、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 個体における膀胱がんを診断する前記工程が、更に以下:
I. 腫瘍の悪性度を階層化すること;及び/又は
II. 腫瘍の再発リスクを決定すること;及び/又は
III. 非筋肉浸潤性疾患の進行リスクを決定すること;及び/又は
治療療法に対し予想される応答を決定すること、
を含む、上記請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下:
(a) 個体に由来する試料からDNAを採取し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;及び
(c) 前記個体に対し、1以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法。 - 個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下:
(a) 個体に由来する試料からDNAを提供し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;及び
(c) 前記個体に対し、1以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法。 - 個体における膀胱がんを治療する方法であって、以下:
(a) 個体に由来する試料からのDNAにおいて、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;及び
(c) 前記個体に対し、1以上の膀胱がん治療を施すこと、
を含む方法。 - 個体における膀胱がんを治療する方法であって、個体に対し、1以上の膀胱がん治療を施すことを含み、以下:
(a) 個体に由来する試料からのDNAを提供し、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること;及び
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること、
を含む工程によって、個体が膀胱がんであると診断されている、方法。 - 個体における膀胱がんを診断する方法であって、以下:
(a) 配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを特定するデータを得ること;及び
(b) (a)のグループの少なくとも25MVPがメチル化されているとき、個体における膀胱がんを診断すること;を含み、
ここで、前記データが以下:
i 試料に由来するDNAを採取すること;及び
ii 前記DNAにおいて、MVPがメチル化されているかを決定すること、
を含む方法によって得られた、方法。 - 前記がんが、非筋肉浸潤性膀胱がん (NMIBC)である、上記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記がんが、筋肉浸潤性膀胱がん (MIBC)である、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるアレイであって;MVPパネルにおける各MVPのメチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブ、及び前記パネルにおいて各MVPの非メチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブを含み;前記パネルが、配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される少なくとも25MVPからなる、アレイ。
- 請求項31に記載のアレイであって、前記アレイがInfinium Human Methylation450 BeadChipアレイでない場合、及び/又は前記アレイのMVP特異的であるオリゴヌクレオチドプローブの数が、482,421より少なく、好ましくは482,000以下、480,000以下、450,000以下、440,000以下、430,000以下、420,000以下、410,000以下又は400,000以下である、アレイ。
- 請求項31又は請求項32に記載のアレイであって、前記パネルが配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される少なくとも40MVP、好ましくは少なくとも50MVP、少なくとも60MVP、少なくとも70MVP、少なくとも80MVP、少なくとも90MVP、少なくとも100MVP、少なくとも110MVP、少なくとも120MVP、少なくとも130MVP、少なくとも140MVP、少なくとも145MVP、又は配列番号1〜150において特定される150MVP全てからなる、アレイ。
- 請求項31〜33のいずれか1項に記載のアレイであって、前記パネルが配列番号1〜3で定義されるMVP、又は配列番号1〜5で定義されるMVP、又は配列番号1〜10で定義されるMVP、又は配列番号1〜20で定義されるMVP、又は配列番号1〜30で定義されるMVP、又は配列番号1〜40で定義されるMVP、又は配列番号1〜50で定義されるMVP、又は配列番号1〜60で定義されるMVP、又は配列番号1〜70で定義されるMVP、又は配列番号1〜80で定義されるMVP、又は配列番号1〜90で定義されるMVP、又は配列番号1〜100で定義されるMVP、又は配列番号1〜100で定義されるMVP、又は配列番号1〜120で定義されるMVP、又は配列番号1〜130で定義されるMVP、又は配列番号1〜140で定義されるMVP、又は配列番号1〜150で定義されるMVPを含む、アレイ。
- 請求項34に記載のアレイであって、前記パネルが配列番号1〜150で定義されるMVP全てを含む、アレイ。
- 請求項31〜35のいずれか1項に記載のアレイであって、配列番号1〜150で定義されるMVPのいずれかから選択されるMVPを含む1以上のオリゴヌクレオチドを更に含み、前記1以上のオリゴヌクレオチドが前記アレイの対応するオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする、アレイ。
- 請求項36に記載のアレイであって、前記1以上のオリゴヌクレオチドが配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される少なくとも25MVP;好ましくは少なくとも50MVP、少なくとも60MVP、少なくとも70MVP、少なくとも80MVP、少なくとも90MVP、少なくとも100MVP、少なくとも110MVP、少なくとも120MVP、少なくとも130MVP、少なくとも140MVP、少なくとも145MVP、又は配列番号1〜150において特定される150MVP全てを含む、アレイ。
- 請求項36又は37に記載のアレイであって、前記1以上のオリゴヌクレオチドが、配列番号1〜10で定義されるMVP、又は配列番号1〜20で定義されるMVP、又は配列番号1〜30で定義されるMVP、又は配列番号1〜40で定義されるMVP、又は配列番号1〜50で定義されるMVP、又は配列番号1〜60で定義されるMVP、又は配列番号1〜70で定義されるMVP、又は配列番号1〜80で定義されるMVP、又は配列番号1〜90で定義されるMVP、又は配列番号1〜100で定義されるMVP、又は配列番号1〜110で定義されるMVP、又は配列番号1〜120で定義されるMVP、又は配列番号1〜130で定義されるMVP、又は配列番号1〜140で定義されるMVP、又は配列番号1〜150で定義されるMVPを含む、アレイ。
- 請求項38に記載のアレイであって、前記1以上のオリゴヌクレオチドが配列番号1〜150で定義されるMVP全てを含む、アレイ。
- ハイブリダイズしたアレイであって、前記アレイが、請求項31〜35のいずれか1項に記載のアレイを、配列番号1〜150で定義されるMVPのいずれかから選択される様々なMVPを各々含むオリゴヌクレオチドのグループとハイブリダイズすることによって得られ、前記グループが少なくとも25オリゴヌクレオチドを含む、アレイ。
- 請求項40に記載のハイブリダイズしたアレイであって、前記グループが、少なくとも40オリゴヌクレオチドを含み;任意で前記グループが少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも145、又は少なくとも150オリゴヌクレオチドを含む、アレイ。
- 請求項40又は請求項41に記載のハイブリダイズしたアレイであって、前記グループが配列番号1〜25で定義されるMVPを含む少なくとも25オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜40で定義されるMVPを含む少なくとも40オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜50で定義されるMVPを含む少なくとも50オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜60で定義されるMVPを含む少なくとも60オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜70で定義されるMVPを含む少なくとも70オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜80で定義されるMVPを含む少なくとも80オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜90で定義されるMVPを含む少なくとも90オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜100で定義されるMVPを含む少なくとも100オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜110で定義されるMVPを含む少なくとも110オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜120で定義されるMVPを含む少なくとも120オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜130で定義されるMVPを含む少なくとも130オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜140で定義されるMVPを含む少なくとも140オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜145で定義されるMVPを含む少なくとも145オリゴヌクレオチドを含み、又は前記グループが配列番号1〜150で定義されるMVPを含む少なくとも150オリゴヌクレオチドを含む、アレイ。
- 請求項42に記載のハイブリダイズしたアレイであって、前記グループが配列番号1〜150で定義されるMVPを含む少なくとも150オリゴヌクレオチドを含む、アレイ。
- 請求項40に記載のハイブリダイズしたアレイを作製するための方法であって、請求項31〜35のいずれか1項に記載のアレイを、配列番号1〜150で定義されるMVPのいずれかから選択される様々なMVPを各々含むオリゴヌクレオチドのグループと接触させることを含み、前記グループが少なくとも25オリゴヌクレオチドを含む、方法。
- 請求項41に記載のハイブリダイズしたアレイを作製するための方法であって、請求項31〜35のいずれか1項に記載のアレイと、請求項41により定義されるオリゴヌクレオチドのグループを接触させることを含む、方法;又は請求項42又は43に記載のハイブリダイズしたアレイを作製するための方法であって、請求項31〜35のいずれか1項に記載のアレイと、請求項42又は請求項43のいずれかにより定義されるオリゴヌクレオチドのグループを接触させることを含む、方法。
- 請求項31〜35のいずれか1項に記載のアレイを含むキット。
- MVPジヌクレオチドにおける非メチル化シトシンを修飾することができるが、MVPジヌクレオチドにおけるメチル化シトシンを修飾することができないDNA修飾剤を更に含み、任意で前記ジヌクレオチドがCpGである、請求項46に記載のキット。
- 前記DNA修飾剤が重亜硫酸塩剤である、請求項46又は47に記載のキット。
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