JP2022537540A - Ｓｄｃ２遺伝子のメチル化検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化を検出する方法、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出のための組成物及びこれを含むキットに関し、より詳細には、メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマー及びプライマーによって特異的に増幅されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子に相補的にハイブリダイゼーション可能なプローブを用いて、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化を検出する方法、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出のための組成物及びこれを含むキットに関する。
Description
本発明は、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化を検出する方法、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出のための組成物及びこれを含むキットに関し、より詳細には、メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマー及びプライマーによって特異的に増幅されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子に相補的にハイブリダイゼーション可能なプローブを用いて、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化を検出する方法、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出のための組成物及びこれを含むキットに関する。
哺乳類細胞のゲノムＤＮＡには、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの他に５番目の塩基が存在し、これはシトシン環の５番目の炭素にメチル基が付いた５－メチルシトシン（５－ｍＣ）である。５－ｍＣは、常に、ＣＧジヌクレオチドのＣにのみ付き（５’－ｍＣＧ－３’）、このようなＣＧを通常、ＣｐＧと表示する。ＣｐＧのＣは、殆どがメチル基が付いてメチル化されている。このようなＣｐＧのメチル化は、Ａｌｕや転移因子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）のようにゲノム内に反復される塩基配列（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が発現しないように抑制し、哺乳類細胞において遺伝子外変化が最も頻繁に現れる部位である。このようなＣｐＧの５－ｍＣは自ずから脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）してＴに変わり、これによって、哺乳類ゲノム内のＣｐＧは正常に現れるべき頻度（１／４×１／４＝６．２５％）よりも遥かに低い１％の頻度しか示さない。
ＣｐＧ中に例外的に密集して現れるものがあり、これをＣｐＧ部位（ＣｐＧ島）という。ＣｐＧ部位は、長さが０．２～３ｋｂであり、Ｃ及びＧ塩基の分布百分率が５０％を超え、ＣｐＧの分布百分率が３．７５％以上と高く集中して現れる部位のことを指す。ＣｐＧ部位は、全体の人体遺伝体に約４５，０００個が現れ、特に、遺伝子の発現を調節するプロモーター部位に集中して現れる。実際に人体遺伝子の約半分を占める重要遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ）のプロモーターにはＣｐＧ部位が現れる（Ｃｒｏｓｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，５：３０９，１９９５）。非正常のＤＮＡメチル化は、主に該当の遺伝子の５’発現調節部位（５’ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ）で起き、該当の遺伝子の発現を減少させることが知られている。
一方、正常人の体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ）では、それらの重要遺伝子プロモーター部位のＣｐＧ島がメチル化されていないが、発生中に発現しないように刻印された（ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ）遺伝子と非活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）されたＸ染色体上の遺伝子はメチル化されている。
発癌過程中ではプロモーターＣｐＧ島にメチル化が現れ、その該当の遺伝子の発現に障害が起きる。特に、細胞周期やアポトーシスを調節し、ＤＮＡを復旧し、細胞の付着と細胞間相互協力作用に関与し、浸潤と転移を抑制する腫瘍抑制遺伝子のプロモーターＣｐＧ島にメチル化が発生する場合、これは、コーディング配列の突然変異と同様に、それらの遺伝子の発現と機能を遮断し、結果として癌の発生と進行が促進される。その他にも、老化によってＣｐＧ島に部分的にメチル化が現れることもある。
腫瘍関連遺伝子のプロモーターメチル化が癌の重要な指標であり、したがって、これは癌の診断と早期診断、発癌危険の予測、癌の予後予測、治療後追跡調査、抗癌療法に対する反応予測など、多方面に利用可能である。実際に、近年、血液や客談、唾液、大便、小便などで腫瘍関連遺伝子のプロモーターメチル化を調べて、各種の癌診療に使用しようとする試みが活発に行われている（Ａｈｌｑｕｉｓｔ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１１９：１２１９，２０００）。
このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマー及びプライマーによって特異的に増幅されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子に相補的にハイブリダイゼーション可能なプローブを用いて、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化を高い検出限度と正確度で検出できることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、プライマー及びプローブを用いてＳＤＣ２遺伝子のメチル化を検出する方法を提供することにある。
本発明の目的は、プライマー及びプローブを含むＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、上記組成物を含むＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出用キットを提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、次の段階を含む、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化を検出する方法を提供する：（ａ）メチル化されたＳＤＣ２遺伝子と非メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を互いに異なるように修飾させる一つ以上の試薬でサンプルを処理する段階；（ｂ）メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマーを処理する段階；及び、（ｃ）前記（ｂ）段階でプライマーによって特異的に増幅されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子に相補的にハイブリダイゼーション可能なプローブを処理する段階。
本発明は、また、メチル化されたＳＤＣ２遺伝子と非メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を互いに異なるように修飾させる一つ以上の試薬；前記メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマー；及び、前記プライマーによって特異的に増幅されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子に相補的にハイブリダイゼーション可能なプローブを含む、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出用組成物を提供する。
本発明は、また、前記組成物を含むＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出用キットを提供する。
特に断りのない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
本出願の発明者らは、ＳＤＣ２遺伝子のＣｐＧ島全体を代弁できるメチル化特異的検出プライマー及びプローブを設計し、メチル化特異的増幅により、メチル化ＤＮＡでのみメチル化が特異的に検出され得ることを確認した。また、メチル化特異的検出プライマー及びプローブを用いて大腸癌組織、大便、血液においてＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価した。その結果、大腸癌診断に対する敏感度及び特異度が非常に高く、大腸癌診断に有用性が高いことを確認した。
したがって、本発明は、一観点において、次の段階を含む、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化を検出する方法に関する：（ａ）メチル化されたＳＤＣ２遺伝子と非メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を互いに異なるように修飾させる一つ以上の試薬でサンプルを処理する段階；（ｂ）メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマーを処理する段階；及び、（ｃ）前記（ｂ）段階でプライマーによって特異的に増幅されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子に相補的にハイブリダイゼーション可能なプローブを処理する段階。
本発明において、段階（ａ）は、メチル化されたＤＮＡ部位と非メチル化されたＤＮＡ部位を互いに異なるように修飾させる一つ以上の試薬で、ターゲットＤＮＡが含まれているサンプルを処理する段階である。
本発明における“メチル化”とは、シトシン（ｃｙｔｏｃｉｎｅ）塩基環の５番目の炭素にメチル基が付いて５－メチルシトシン（５－ｍＣ）に修飾されたことを意味し、５－メチルシトシンは、常に、ＣＧジヌクレオチドのＣにのみ付き（５’－ｍＣＧ－３’）、このようなＣＧを通常、ＣｐＧと表示する。このようなＣｐＧのメチル化は、Ａｌｕや転移因子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）のようにゲノム内に反復される塩基配列（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が発現しないように抑制し、哺乳類細胞において遺伝子外変化が最も頻繁に現れる部位である。このようなＣｐＧの５－ｍＣは自ずから脱アミノ化してＴに変わり、これによって、哺乳類ゲノム内のＣｐＧは、正常に現れるべき頻度（１／４×１／４＝６．２５％）よりも遥かに低い１％の頻度しか示さない。
ＣｐＧ中に例外的に密集して現れるものがあり、これをＣｐＧ島という。ＣｐＧ島は、長さが０．２～３ｋｂであり、Ｃ及びＧ塩基の分布百分率が５０％を超え、ＣｐＧの分布百分率が３．７５％以上と高く集中して現れる部位のことを指す。ＣｐＧ島は、全体の人体遺伝体に約４５，０００個が現れ、特に、遺伝子の発現を調節するプロモーター部位に集中して現れる。実際に人体遺伝子の約半分を占める重要遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ）のプロモーターにはＣｐＧ島が現れる。
検体から分離された核酸は、検体の生物学的試料によって得られる。腸癌や腸癌の進行段階を診断したい場合は、スクレイピングや生検により腸組職から核酸を分離しなければならない。このような試料は、当該分野で知られた種々の医学的過程によって得ることができる。
前記検体から得られたサンプルの核酸のメチル化程度は、腸組職の細胞成長性異常がない検体の同じ核酸部分と比較して測定する。ハイパーメチル化は、一つ以上の核酸でメチル化された対立遺伝子が存在することを意味する。腸組職の細胞成長性異常がない検体は、同じ核酸を検査した時、メチル化対立遺伝子が現れない。
“正常”細胞は、異常な細胞形態又は細胞学的性質の変化を示さない細胞を意味する。“腫瘍”細胞は、癌細胞を意味し、“非腫瘍”細胞は、病症組織の一部であるが、腫瘍部位ではないと判断される細胞を意味する。
本発明によれば、検体から分離された一つ以上の核酸のメチル化段階を決定して、検体の腸組織の細胞成長性異常を早期診断することができる。前記一つ以上の核酸のメチル化段階は、腸組職の細胞成長性異常を持たない検体から分離された一つ以上の核酸のメチル化状態と比較することを特徴とし得る。核酸は、ＣｐＧ島のようなＣｐＧ含有核酸であることが好ましい。
本発明によれば、検体から分離された一つ以上の核酸のメチル化を決定することを含む検体の腸組織の細胞成長性異常素質を診断できる。前記一つ以上の核酸のメチル化段階は、腸組職の細胞成長性異常に対する素質を持っていない検体から分離された一つ以上の核酸のメチル化状態と比較することを特徴とし得る。
“素質”は、前記細胞成長性異常にかかりやすい性質を意味する。素質を持つ検体は、まだ細胞成長性異常を持っていないが、細胞成長性異常が存在したり或いは存在する傾向が増加している検体のことを指す。
前記ターゲットＤＮＡのうちＣｐＧメチル化の存在が疾病の指標であり得、例えば、ターゲットＤＮＡのプロモーター、５’非番駅領域及びイントロンのいずれか一部位のＣｐＧメチル化が測定できる。
ＣｐＧ含有遺伝子は、通常、ＤＮＡである。しかし、本発明の方法は、例えば、ＤＮＡ、又はＤＮＡとｍＲＮＡを含むＲＮＡを含有する試料を適用することができ、ここで、ＤＮＡ又はＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であり得、又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含有した試料であることを特徴とし得る。
核酸混合物も使用することができる。本発明で使われる“多重”は、一種の遺伝子内に検出される特異的な核酸配列部位が複数個である場合も、一つのチューブ（単一反応器）内に複数のターゲットＤＮＡを含む場合をも含む。検出される特異的な核酸配列は、大きい分子の分画であり得、最初から特異配列が全体核酸配列を構成する分離された分子形態で存在し得る。前記核酸配列は、純粋な形態で存在する核酸である必要はなく、核酸は、全体ヒトＤＮＡが含まれているもののように、複雑な混合物内の少ない分画であってもよい。
具体的に、本発明は、単一反応器内のサンプルのうち、複数のターゲットＤＮＡのメチル化を検出するためのものであり、前記サンプルは、複数の多重ターゲットＤＮＡを含むことができ、ターゲットＤＮＡは、対照群遺伝子の他に、非正常にメチル化されて発現が抑制される場合、癌の発生又は進行に影響を与える遺伝子であればいずれも利用可能である。
本発明において、前記サンプルは、人体から由来したものであることを特徴とし、例えば、前記サンプルは、大腸癌組織、細胞、大便、小便、血液、血清又はプラズマを使用することができる。
前記メチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを互いに異なるように修飾させる一つ以上の試薬は、非メチル化されたシトシン塩基とメチル化されたシトシン塩基とを区別できるものであれば、いずれも使用可能であり、例えば、ビスルファイト、ヒドロゲンスルファイト、ジスルファイト、及びこれらの組合せであり得、これに限定されるものではない。具体的に、前記試薬によって、メチル化されたシトシン塩基は変換されなく、非メチル化されたシトシン塩基はウラシル又はシトシン以外の塩基に変換されてよい。
本発明において、段階（ｂ）は、メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマーを処理する段階である。
前記プライマーは、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むことができる。例えば、ＰＣＲのために正方向及び逆方向プライマーを対にして同時に使用することができる。前記正方向プライマーは、例えば、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４～１１４０からなる群から選ばれる配列を含むことができる。前記逆方向プライマーは、例えば、配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、１１４１～１１５９からなる群から選ばれる配列を含むことができる。メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマーに対するプライマー対は、実施例１の表１及び実施例４の表５に具体的に記載されている。
本発明において、段階（ｃ）は、プライマーによって特異的に増幅されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子に相補的にハイブリダイゼーション可能なプローブを処理する段階である。
ハイブリダイゼーション反応において、厳格な特定レベルを達成するために用いられる条件は、ハイブリダイゼーションされる核酸の性質によって様々である。例えば、ハイブリダイゼーションされる核酸部位の長さ、相同性程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、ＧＣ／ＡＴ組成比）及び核酸タイプ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）などがハイブリダイゼーション条件を選択する上で考慮される。更なる考慮条件は、核酸が、例えばフィルターなどに固定化されているか否かである。
非常に厳格に進行される条件の例を挙げると、次の通りである：室温の２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；室温の０．２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（厳格性の低い条件）；４２℃での０．２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（普通の厳格性を有する条件）；６８℃で０．１Ｘ ＳＳＣ（高い厳格性を有する条件）。洗浄過程は、これら条件のいずれか一条件を用いて行うことができ、例えば、高い厳格性を有する条件、又は前記条件をそれぞれ使用することができ、前記記載の順にそれぞれ１０～１５分ずつ、前記記載の条件を全部又は一部反復して行うことができる。しかし、上述したように、最適条件は、含まれた特別なハイブリダイゼーション反応によって様々であり、実験から決定できる。一般に、重要なプローブのハイブリダイゼーションには、高い厳格性を有する条件が用いられる。
前記プローブは、例えば、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むことができる。具体的に、前記プローブは、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、１１６０～１１７８からなる群から選ばれる配列を含むことができる。
場合によって、プローブは検出可能に標識され、例えば、放射線同位元素、蛍光化合物、バイオ発光化合物、化学発光化合物、金属キレート又は酵素で標識されてよい。前記のようなプローブを適切に標識することは、当該分野で広く知られた技術であり、通常の方法で行うことができる。
前記増幅産物の量は、蛍光信号によって検出できる。プローブの結合した増幅産物の二重螺旋ＤＮＡに結合して蛍光を示す試薬（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）を使用するインターカレーティング（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）法、５’末端は蛍光物質、３’末端は消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）で標識されたオリゴヌクレオチドを使用する方法などがある。
本願発明に係る増幅は、リアルタイム定量増幅、例えば、リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）によって行われてよく、リアルタイム重合酵素連鎖反応においてＰＣＲ増幅産物の量は蛍光信号によって検出されてよい。リアルタイム重合酵素連鎖反応が進みながら増加するポリヌクレオチド量によって蛍光信号の強度が増加し、増幅サイクル回数による蛍光信号強度を示す増幅プロファイル（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ）曲線が得られる。
増幅プロファイル曲線は、一般に、実質的なポリヌクレオチド量が反映されていない背景の蛍光信号が現れるベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）領域、ポリヌクレオチド生成物量の増加による蛍光信号増加が現れる指数的領域（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｉｏｎ）、及びＰＣＲ反応が飽和状態となって蛍光信号強度の増加が現れない停滞状態領域（ｐｌａｔｅａｕ ｒｅｇｉｏｎ）に分けられる。
通常、ベースライン領域から指数的領域に移る地点、すなわち、ＰＣＲ増幅産物量が蛍光で検出可能な量に到達した時の蛍光信号強度を臨界値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）といい、増幅プロファイル曲線で臨界値に対応する増幅サイクル回数を、臨界サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ：Ｃｔ）値という。
前記Ｃｔ値を測定し、標準物質に対するＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値に基づいて濃度が決定された標準曲線を分析し、増幅された遺伝子の濃度を確認することによって、メチル化特異的敏感度及び／又は特異度が決定できる。
一実施例において、前記メチル化検出はＰＣＲ、メチル化特異ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）、リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合抗体を用いたＰＣＲ、定量ＰＣＲ、遺伝子チップ、シーケンシング、シーケンシングバイシンセシス（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）及びシーケンシングバイライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）からなる群から選ばれる方法によって行われてよい。
（１）メチル化特異ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）：前記メチル化特異ＰＣＲで検出する場合、ビスルフェートを処理すれば、５’－ＣｐＧ’－３部位のシトシンがメチル化された場合にはそのままシトシンが残っており、非メチル化された場合には、ウラシルに変わる。したがって、ビスルファイト処理後に変換された塩基配列を対象に、５’－ＣｐＧ－３’塩基配列が存在する部位に該当するプライマーを作製することができる。プライマーを用いてＰＣＲをすれば、メチル化された場合には、メチル化された塩基配列に該当するプライマーを使用したものからＰＣＲ産物が作られ、アガロースゲル電気泳動方法でメチル化の有無が確認できる。ここで、前記メチル化検出プローブは、ＴａｑＭａｎ、分子標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）、自己報告（ｓｅｌｆ－ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）機能を有するか或いはエネルギー転移標識機能を有するプローブであり得、これに制限されるものではない。
（２）リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）：前記リアルタイムメチル化特異ＰＣＲは、メチル化特異ＰＣＲ方法をリアルタイム測定方法に転換したものであって、ゲノムＤＮＡにビスルファイトを処理した後、メチル化された場合に該当するＰＣＲプライマーをデザインし、これらのプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行う。このとき、増幅された塩基配列と相補的なＴａｑＭａｎプローブを用いて検出する方法とサイバーグリーン（Ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ）を用いて検出する２つの方法がある。したがって、リアルタイムメチル化特異ＰＣＲは、メチル化されたＤＮＡだけを選択的に定量分析できる。このとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化ＤＮＡサンプルを用いて標準曲線を作成し、標準化のために、塩基配列内に５’－ＣｐＧ－３’配列のない遺伝子を陰性対照群として共に増幅してメチル化程度を定量分析することができる。
（３）メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ又は定量ＰＣＲ及びＤＮＡチップ：前記メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ又はＤＮＡチップ方法は、メチル化ＤＮＡにのみ特異的に結合するタンパク質をＤＮＡと混合すると、メチル化ＤＮＡにのみ特異的にタンパク質が結合するので、メチル化ＤＮＡのみを選択的に分離することができる。
また、定量ＰＣＲ方法でもメチル化の有無が測定でき、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質で分離したメチル化ＤＮＡは、蛍光染料で標識し、相補的なプローブが集積されたＤＮＡチップにハイブリダイゼーションさせることによって、メチル化の有無が測定できる。
（４）差別的メチル化の検出－ビスルファイトシーケンシング方法：メチル化ＣｐＧを含有した核酸を検出する他の方法は、核酸を含有した試料を、非メチル化シトシンを修飾させる製剤と接触させる段階、及びＣｐＧ－特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、試料のＣｐＧ含有核酸を増幅させる段階を含む。ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾されたメチル化及び非メチル化核酸とを区別してメチル化核酸を検出することを特徴とし得る。前記増幅段階は選択的であり、好ましいものではあるが、必須のものではない。前記方法は、修飾された（例えば、化学的に修飾された）メチル化及び非メチル化ＤＮＡを区別するＰＣＲ反応に依存する。
（５）ビスルファイトシーケンシング方法：メチル化ＣｐＧを含有した核酸を検出する他の方法は、核酸を含有した試料を、非メチル化シトシンを修飾させる製剤と接触させる段階、及びメチル化非依存的（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）オリゴヌクレオチドプライマーを使用して試料のＣｐＧ含有核酸を増幅させる段階を含む。ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾されたメチル化及び非メチル化核酸を区別せずに核酸を増幅することを特徴とし得る。前記増幅された産物をシーケンシングプライマーを用いてサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）方法でシーケンシングするか、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法として、メチル化核酸の検出のためのビスルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）シーケンシングと関連付いて記載されている。
（６）ここで、次世代シーケンシング方法は、シーケンシングバイシンセシスとシーケンシングバイライゲーション方法とすることを特徴とし得る。この方法の特徴は、細菌のクローン（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｌｏｎｅ）を作る代わりに、単一ＤＮＡ断片を空間的に分離してｉｎ ｓｉｔｕで増幅し（ｃｌｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、シーケンシングをするということにある。このとき、数十万個の断片を同時に読み出すことから、マッシブパラレルシーケンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法と呼ばれることもある。
基本的には、シーケンシングバイシンセシス（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）方法であり、モノ或いはジヌクレオチドを順次に付けながらシグナルを得る方法を使用するが、パイロシーケンシング、イオントレント（ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ）、Ｓｏｌｅｘａ方法がそれに該当する。
シーケンシングバイシンセシスに基づくＮＧＳ装備としては、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社の４５４プラットホーム、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）社のＨｉＳｅｑプラットホーム、ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社のＩｏｎ ＰＧＭプラットホーム、最後にパシフィックバイオサイエンス（Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）社のＰａｃＢｉｏプラットホームがある。４５４とＩｏｎ ＰＧＭは、クローナル増幅（ｃｌｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法としてｅｍｅｒｓｉｏｎ ＰＣＲを使用し、ＨｉＳｅｑは、ブリッジ増幅（Ｂｒｉｄｇｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用する。シーケンシングバイシンセシス方法は、１個のヌクレオチドを順次に付けながらＤＮＡを合成させて行く時に発生するリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、水素イオン、或いはあらかじめ付けておいた蛍光を検出して配列を読んで行く。配列を検出する方法において、４５４は、リン酸を用いるパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｅｕｎｃｉｎｇ）方法を使用し、Ｉｏｎ ＰＧＭは水素イオン検出を利用する。ＨｉＳｅｑとＰａｃＢｉｏは、蛍光を検出して配列を読み取る。
シーケンシングバイライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、ＤＮＡリガーゼを利用するシーケンシング技術であり、ＤＮＡ塩基配列に存在する特定位置のヌクレオチドを確認する技術である。大部分のシーケンシング技術が重合酵素を使用するのと違い、重合酵素を使用しなく、ＤＮＡリガーゼがミスマッチ配列をライゲーションしない特徴を利用する。ＳＯＬｉＤシステムがそれに該当する。この技法では、間隔を置いて２個ずつ塩基を読むが、プライマーリセット（ｐｒｉｍｅｒ ｒｅｓｅｔ）を用いて独立して５回を反復するので、最終的には各塩基を２回ずつ重複して読み、正確度を高める。
シーケンシングバイライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ）の場合、１６個の組合せからなるジヌクレオチドプライマーセットのうち、該当の塩基配列に対応するジヌクレオチドプライマーが順次にライゲーションされ、このライゲーションの組合せを最終的に分析することで、当該ＤＮＡの塩基配列が完成する。
ここで、次世代シーケンシング方法は、シーケンシングバイシンセシス（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）又はシーケンシングバイライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ）方法とすることを特徴とし得る。ここで、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質はＭＢＤ２ｂｔに制限されなく、抗体は５’－メチル－シトシン（５’－ｍｅｔｈｙｌ－ｃｙｔｏｓｉｎｅ）抗体であり、これに制限されない。
本発明で用いられるプライマーと関連して、前記段階（ａ）によって試薬、例えば、ビスルファイトを処理すれば、５’－ＣｐＧ’－３部位のシトシンがメチル化された場合にはそのままシトシンとして残っており、非メチル化された場合にはウラシルに変わる。したがって、試薬、例えば、ビスルファイト処理後に変換された塩基配列を対象に、５’－ＣｐＧ－３’塩基配列が存在する部位に該当するプライマーを作製することができる。
前記プライマーは、ＳＤＣ２遺伝子のうち、増幅されるローカスの各鎖と“概略的に”相補性を有するように作製されてよい。これは、重合反応を行う条件でプライマーが対応する核酸鎖とハイブリダイゼーションされるのに十分な相補性を有することを意味する。
本発明は、他の観点において、メチル化されたＳＤＣ２遺伝子と非メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を互いに異なるように修飾させる一つ以上の試薬；前記メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマー；及び、前記プライマーによって特異的に増幅されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子に相補的にハイブリダイゼーション可能なプローブを含むＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出用組成物に関する。
本発明に係る組成物に含まれる構成は、前述した構成と重なるので、これについては同様の説明が適用される。
本発明は、さらに他の観点において、前記組成物を含むターゲットＤＮＡのメチル化検出用キットに関する。
一実施例において、前記キットは、サンプルを入れる区切られたキャリア手段、試薬を含む容器、ＳＤＣ２遺伝子５’－ＣｐＧ－３’を増幅できるプライマーを含む容器、及び前記増幅産物を検出するためのプローブを含む容器を含むことができる。
前記キャリア手段は、瓶、チューブのような一つ以上の容器を収容するに適し、各容器は、本発明の方法に用いられる独立した構成要素を含有する。本発明の明細書において、当該分野における通常の知識を有する者は、容器中の必要な製剤を容易に分配できる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１：大腸癌組織でＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力評価
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、ＳＤＣ２遺伝子のＣｐＧ島全体を代弁できる１１セットのメチル化特異的検出プライマー及びプローブを設計し（表１）、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行った。そのために、２０人の大腸癌患者手術組織からの癌組織とこれに連接する正常組織を使用し、これらからゲノムＤＮＡを分離（ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）し、ゲノムＤＮＡ（２．０ｕｇ）にＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を用いてビスルフェートを処理した後、滅菌蒸留水１０μｌで溶出してメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に用いた。ビスルファイトで処理されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１で設計したメチル化特異的プライマー及びプローブを使用してｑＭＳＰを行った。ｑＭＳＰは、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ ＰＣＲ装備（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。合計２０μｌＰＣＲ反応溶液（鋳型ＤＮＡ、２０ｎｇ；５Ｘ ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、４μｌ；ＰＣＲプライマー、２μｌ（２ｐｍｏｌｅ／μｌ）、ＴａｑＭａｎプローブ、２μｌ（２ｐｍｏｌｅ／μｌ）；Ｄ．Ｗ．１０μｌ）を準備し、ＰＣＲ条件は９５℃、５分処理した後、９５℃で１５秒、適切なアニーリング温度（５８℃～６１℃）で１分として合計４０回行った。ＰＣＲ産物の増幅の有無は、ＣＴ（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を測定して確認した。メチル化及び非メチル化対照ＤＮＡは、ＥｐｉＴｅｃｔ ＰＣＲ対照ＤＮＡセット（Ｑｉａｇｅｎ，ｃａｔ．ｎｏ．５９６９５）を使用し、サンプルＤＮＡと共に試験した。内部対照遺伝子としてはＣＯＬ２Ａ１遺伝子（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）を使用した。各サンプルのメチル化程度は、ＣＴ（Ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値で測定した。
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、ＳＤＣ２遺伝子のＣｐＧ島全体を代弁できる１１セットのメチル化特異的検出プライマー及びプローブを設計し（表１）、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行った。そのために、２０人の大腸癌患者手術組織からの癌組織とこれに連接する正常組織を使用し、これらからゲノムＤＮＡを分離（ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）し、ゲノムＤＮＡ（２．０ｕｇ）にＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を用いてビスルフェートを処理した後、滅菌蒸留水１０μｌで溶出してメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に用いた。ビスルファイトで処理されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１で設計したメチル化特異的プライマー及びプローブを使用してｑＭＳＰを行った。ｑＭＳＰは、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ ＰＣＲ装備（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。合計２０μｌＰＣＲ反応溶液（鋳型ＤＮＡ、２０ｎｇ；５Ｘ ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、４μｌ；ＰＣＲプライマー、２μｌ（２ｐｍｏｌｅ／μｌ）、ＴａｑＭａｎプローブ、２μｌ（２ｐｍｏｌｅ／μｌ）；Ｄ．Ｗ．１０μｌ）を準備し、ＰＣＲ条件は９５℃、５分処理した後、９５℃で１５秒、適切なアニーリング温度（５８℃～６１℃）で１分として合計４０回行った。ＰＣＲ産物の増幅の有無は、ＣＴ（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を測定して確認した。メチル化及び非メチル化対照ＤＮＡは、ＥｐｉＴｅｃｔ ＰＣＲ対照ＤＮＡセット（Ｑｉａｇｅｎ，ｃａｔ．ｎｏ．５９６９５）を使用し、サンプルＤＮＡと共に試験した。内部対照遺伝子としてはＣＯＬ２Ａ１遺伝子（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）を使用した。各サンプルのメチル化程度は、ＣＴ（Ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値で測定した。
大腸癌組織とこれに連接した正常組織のＣＴ値を用いてＲＯＣ曲線分析（ＭｅｄＣａｌｃプログラム、ベルギー）から、各プライマー及びプローブセットの大腸癌診断に対する敏感度及び特異度を計算した（表２）。
大腸癌組織及びこれに連接した正常組織ＤＮＡを用いたＳＤＣ２遺伝子メチル化検証の結果、腸癌診断に対する敏感度は、８０％（１６／２０）～９５．０％（１９／２０）、そして特異度は８５．０％（３／２０）～９５．０％（１／２０）と優れていることを確認した。したがって、ＳＤＣ２遺伝子メチル化を用いて大腸癌診断の有用性が高いことを確認した。
実施例２：大便（Ｓｔｏｏｌ）ＤＮＡを用いたＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力評価
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、実施例１で記載されたＳＤＣ２遺伝子のメチル化特異的検出プライマー及びプローブ（表１）を用いてメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行った。そのために、２０人の大腸癌患者（ヨンセ医療院セブランス病院）及び２０人の正常人（ヨンセ医療院セブランス病院チェックアップ）の大便（ｓｔｏｏｌ）ＤＮＡを使用し、これらからゲノムＤＮＡを分離（Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）し、前記ゲノムＤＮＡ（２．０ｕｇ）にＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を用いてビスルフェートを処理した後、滅菌蒸留水１０μｌで溶出してメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に用いた。ｑＭＳＰは、実施例１に記載の方法で行った。
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、実施例１で記載されたＳＤＣ２遺伝子のメチル化特異的検出プライマー及びプローブ（表１）を用いてメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行った。そのために、２０人の大腸癌患者（ヨンセ医療院セブランス病院）及び２０人の正常人（ヨンセ医療院セブランス病院チェックアップ）の大便（ｓｔｏｏｌ）ＤＮＡを使用し、これらからゲノムＤＮＡを分離（Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）し、前記ゲノムＤＮＡ（２．０ｕｇ）にＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を用いてビスルフェートを処理した後、滅菌蒸留水１０μｌで溶出してメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に用いた。ｑＭＳＰは、実施例１に記載の方法で行った。
大腸癌患者と正常人の大便ＤＮＡからＣＴ値を用いてＲＯＣ曲線分析（ＭｅｄＣａｌｃプログラム、ベルギー）から各プライマー及びプローブセットの大腸癌診断に対する敏感度及び特異度を計算した（表３）。
大腸癌患者（２０人）及び正常人（２０人）の大便ＤＮＡを用いたＳＤＣ２遺伝子メチル化検証の結果、大腸癌診断に対する敏感度は８０％（１６／２０）～９０．０％（１８／２０）そして特異度は８５．０％（３／２０）～９０．０％（２／２０）と優れていることを確認した。したがって、ＳＤＣ２遺伝子メチル化を用いて大便ＤＮＡで大腸癌診断の有用性が高いことを確認した。
実施例３：血液でＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力評価
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、実施例１に記載されたＳＤＣ２遺伝子のメチル化特異的検出プライマー及びプローブ（表１）を用いてメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行った。そのために、１０人の大腸癌患者（チュンナム大学校病院）及び１０人の正常人（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）の血清各１ｍＬからＤＮＡを分離（Ｄｙｎａｂｅａｄ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）し、前記ＤＮＡにＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を用いてビスルファイトを処理した後、滅菌蒸留水１０μｌで溶出してメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に用いた。ｑＭＳＰは、実施例１に記載の方法で行った。
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、実施例１に記載されたＳＤＣ２遺伝子のメチル化特異的検出プライマー及びプローブ（表１）を用いてメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行った。そのために、１０人の大腸癌患者（チュンナム大学校病院）及び１０人の正常人（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）の血清各１ｍＬからＤＮＡを分離（Ｄｙｎａｂｅａｄ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）し、前記ＤＮＡにＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を用いてビスルファイトを処理した後、滅菌蒸留水１０μｌで溶出してメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に用いた。ｑＭＳＰは、実施例１に記載の方法で行った。
大腸癌患者と正常人血清ＤＮＡを使用してｑＭＭＳＰ結果から得たＣＴ値を用いてＲＯＣ曲線分析（ＭｅｄＣａｌｃプログラム、ベルギー）から、各プライマー及びプローブセットの大腸癌診断に対する敏感度及び特異度を計算した（表４）。
大腸癌患者（１０人）及び正常人（１０人）の血液ＤＮＡを用いたＳＤＣ２遺伝子メチル化検証の結果、大腸癌診断に対する敏感度は７０％（１４／２０）～９０．０％（１８／２０）そして特異度は８５．０％（３／２０）～９０．０％（２／２０）と優れていることを確認した。したがって、ＳＤＣ２遺伝子メチル化を用いて血液ＤＮＡで大腸癌診断の有用性が高いことを確認した。
実施例４：大便（Ｓｔｏｏｌ）ＤＮＡを用いたＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力評価
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、実施例１で記載されたＳＤＣ２遺伝子のメチル化特異的検出プライマー及びプローブ（表１）を用いてメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行った。そのために、２０人の大腸癌患者（ヨンセ医療院セブランス病院）及び２０人の正常人（ヨンセ医療院セブランス病院チェックアップ）の大便（ｓｔｏｏｌ）ＤＮＡを使用し、これらからゲノムＤＮＡを分離（Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）し、前記ゲノムＤＮＡ（２．０ｕｇ）にＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を用いてビスルファイトを処理した後、滅菌蒸留水１０μｌで溶出してメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に用いた。ｑＭＳＰは、実施例１に記載の方法で行った。
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、実施例１で記載されたＳＤＣ２遺伝子のメチル化特異的検出プライマー及びプローブ（表１）を用いてメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行った。そのために、２０人の大腸癌患者（ヨンセ医療院セブランス病院）及び２０人の正常人（ヨンセ医療院セブランス病院チェックアップ）の大便（ｓｔｏｏｌ）ＤＮＡを使用し、これらからゲノムＤＮＡを分離（Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）し、前記ゲノムＤＮＡ（２．０ｕｇ）にＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を用いてビスルファイトを処理した後、滅菌蒸留水１０μｌで溶出してメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に用いた。ｑＭＳＰは、実施例１に記載の方法で行った。
大腸癌患者と正常人の大便ＤＮＡからＣＴ値を用いて各プライマー及びプローブセットの大腸癌診断に対する陽性頻度を計算した（図１）。
図１に見られるように、全てのプライマーセットに対して大腸内視鏡正常人ではメチル化陰性を示した（特異度：１００％）。大腸癌患者では、韓国登録特許第１１４２１３１号に記載された配列番号２７（ＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴ）及び配列番号２８（ＧＡＣＴＣＡＡＡＣＴＣＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＡ）ＳＤＣ２プライマーセットに比べて、新規設計したプライマーのメチル化陽性頻度が高く現れた（図１で、ＳＤＣ２項目が韓国登録特許第１１４２１３１号のプライマーに対するメチル化陽性頻度）。
各プライマー及びプローブセットの大腸癌患者におけるメチル化陽性頻度は、表５に示した。
その結果、新規設計された全てのプライマー及びプローブセットに対して大腸癌患者において高いメチル化陽性頻度を示すことを確認した。
実施例５：多重メチル化特異的プライマー及びプローブ設計を用いたＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出評価
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、ＳＤＣ２遺伝子のＣｐＧ島全体を代弁できる１，１０７セットのメチル化特異的検出プライマー及びプローブを設計し（表６）、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行った。そのために、ビスルファイトで変換させたヒトメチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡ（ＥｐｉＴｅｃｔ ＰＣＲ ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ セット，Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．ｎｏ．５９６９５）を用いて各プライマー及びプローブのＳＤＣ２遺伝子メチル化検出能力を評価した。前記ＤＮＡ ２０ｎｇを滅菌蒸留水１０μｌに溶かした後、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に用いた。ｑＭＳＰは、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ ＰＣＲ装備（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。合計２０μｌのＰＣＲ反応溶液（鋳型ＤＮＡ、２０ｎｇ；５Ｘ ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、４μｌ；ＰＣＲプライマー、２μｌ（２ｐｍｏｌｅ／μｌ）、ＴａｑＭａｎプローブ、２μｌ（２ｐｍｏｌｅ／μｌ）；Ｄ．Ｗ．１０μｌ）を準備し、ＰＣＲ条件は９５℃、５分処理した後、９５℃で１５秒、適切なアニーリング温度（５８℃～６１℃）で１分として合計４０回行った。ＰＣＲ産物の増幅の有無は、ＣＴ（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を測定して確認した。内部対照遺伝子としてはＣＯＬ２Ａ１遺伝子（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）を使用した。各サンプルのメチル化程度は、ＣＴ（Ｃｙｃｌｅ ｔ）値を用いてＲＯＣ曲線分析（ＭｅｄＣａｌｃプログラム、ベルギー）から各プライマー及びプローブセットの大腸癌診断に対する敏感度及び特異度を計算した。
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、ＳＤＣ２遺伝子のＣｐＧ島全体を代弁できる１，１０７セットのメチル化特異的検出プライマー及びプローブを設計し（表６）、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を行った。そのために、ビスルファイトで変換させたヒトメチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡ（ＥｐｉＴｅｃｔ ＰＣＲ ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ セット，Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．ｎｏ．５９６９５）を用いて各プライマー及びプローブのＳＤＣ２遺伝子メチル化検出能力を評価した。前記ＤＮＡ ２０ｎｇを滅菌蒸留水１０μｌに溶かした後、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に用いた。ｑＭＳＰは、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ ＰＣＲ装備（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。合計２０μｌのＰＣＲ反応溶液（鋳型ＤＮＡ、２０ｎｇ；５Ｘ ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、４μｌ；ＰＣＲプライマー、２μｌ（２ｐｍｏｌｅ／μｌ）、ＴａｑＭａｎプローブ、２μｌ（２ｐｍｏｌｅ／μｌ）；Ｄ．Ｗ．１０μｌ）を準備し、ＰＣＲ条件は９５℃、５分処理した後、９５℃で１５秒、適切なアニーリング温度（５８℃～６１℃）で１分として合計４０回行った。ＰＣＲ産物の増幅の有無は、ＣＴ（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を測定して確認した。内部対照遺伝子としてはＣＯＬ２Ａ１遺伝子（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）を使用した。各サンプルのメチル化程度は、ＣＴ（Ｃｙｃｌｅ ｔ）値を用いてＲＯＣ曲線分析（ＭｅｄＣａｌｃプログラム、ベルギー）から各プライマー及びプローブセットの大腸癌診断に対する敏感度及び特異度を計算した。
各プライマー及びプローブのＳＤＣ２遺伝子のメチル化を測定した結果、非メチル化ＤＮＡではメチル化が一切検出されななく、メチル化ＤＮＡでのみメチル化が検出されることを確認し（表６）、これらのプライマー及びプローブがＳＤＣ２メチル化検出に適していることを確認した。
本発明は、腸癌特異的マーカー遺伝子であるＳＤＣ２遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を高い検出敏感度で検出することにより、腸癌診断のための情報を与える方法を提供する効果がある。腸癌を初期形質転換段階で診断できるので、早期診断が可能であり、通常の方法に比べて正確で早期に腸癌が診断でき、有用である。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
Claims (17)
- 次の段階を含むＳＤＣ２遺伝子のメチル化を検出する方法：
（ａ）メチル化されたＳＤＣ２遺伝子と非メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を互いに異なるように修飾させる一つ以上の試薬でサンプルを処理する段階；
（ｂ）メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマーを処理する段階；及び
（ｃ）前記（ｂ）段階でプライマーによって特異的に増幅されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子に相補的にハイブリダイゼーション可能なプローブを処理する段階。 - 前記試薬は、ビスルファイト、ヒドロゲンスルファイト、ジスルファイト、又はこれらの組合せであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記試薬処理によって少なくとも一つのシトシン塩基がウラシル又はシトシンと異なる塩基に変換されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記（ｂ）段階のプライマーは、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記（ｂ）段階のプライマーは、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、及び３４～１１４０からなる群から選ばれる配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記（ｂ）段階のプライマーは、配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、及び１１４１～１１５９からなる群から選ばれる配列をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- 前記（ｃ）段階のプローブは、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、及び１１６０～１１７８からなる群から選ばれる配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記メチル化検出は、ＰＣＲ、メチル化特異ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）、リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合抗体を用いたＰＣＲ、定量ＰＣＲ、遺伝子チップ、シーケンシング、シーケンシングバイシンセシス及びシーケンシングバイライゲーションからなる群から選ばれる方法によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記プローブに結合して蛍光を示す物質を検出して、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化を検出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- メチル化されたＳＤＣ２遺伝子と非メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を互いに異なるように修飾させる一つ以上の試薬；
前記メチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅するプライマー；及び
前記プライマーによって特異的に増幅されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子に相補的にハイブリダイゼーション可能なプローブを含む、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出用組成物。 - 前記試薬は、ビスルファイト、ヒドロゲンスルファイト、ジスルファイト、又はこれらの組合せであることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
- 前記試薬処理によって少なくとも一つのシトシン塩基がウラシル又はシトシンと異なる塩基に変換されることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
- 前記プライマーは、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
- 前記プライマーは、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、３１、３４、及び３７～１１４３からなる群から選ばれる配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
- 前記プライマーは、配列番号１１４４～１１６２からなる群から選ばれる配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
- 前記プローブは、配列番号１１６３～１１８１からなる群から選ばれる配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
- 請求項１０～１６のいずれか一項に記載の組成物を含む、メチル化ＤＮＡ検出用キット。
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