CN108350504A

CN108350504A - 膀胱癌的诊断方法

Info

Publication number: CN108350504A
Application number: CN201680048957.0A
Authority: CN
Inventors: A·费博; J·凯莉
Original assignee: UCL Biomedica PLC
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2036-06-24
Also published as: CN108350504B; AU2016283063B2; MA42238A; US11473148B2; JP7002334B2; AU2016283063A1; JP2022025090A; EP3314016B1; EP3314016A1; GB201511152D0; JP2018520672A; US20180305765A1; WO2016207656A1

Abstract

本发明涉及诊断患者的膀胱癌的方法，其包括确定来自患者的DNA中的甲基化可变位置(MVP)的甲基化状态，并基于甲基化状态数据提供诊断。本发明还涉及治疗膀胱癌的方法，其包括通过本文限定的诊断方法提供膀胱癌的诊断，然后给予患者一种或多种抗癌试剂。本发明还涉及包含针对本文限定的MVP的探针的甲基化识别性阵列和包括所述阵列的试剂盒。

Description

膀胱癌的诊断方法

技术领域

本发明涉及诊断患者中的膀胱癌的方法，其包括确定来自患者的DNA中的甲基化可变位置(MVP)的甲基化状态，并基于甲基化状态数据提供诊断。本发明还涉及治疗膀胱癌的方法，其包括通过本文限定的诊断方法提供膀胱癌的诊断，然后给予患者一种或多种抗癌剂。本发明还涉及包含针对本文限定的MVP的探针的甲基化识别性阵列和包括所述阵列的试剂盒。

背景技术

膀胱癌是西方世界最常见的恶性肿瘤之一，在美国排名第五位的最常见的癌症并导致所有癌症相关死亡的约3％[1，2]。出现的最主要的临床症状是血尿，在所调查的所有这样的病例的约10％中检出膀胱癌[3]。膀胱癌更可能发生于老年男性患者、现在或过去的吸烟者和接触工业致癌物的患者[4]。患有不可见血尿的年轻女性较不可能携带膀胱癌，对于这些患者而言，在误诊血尿后膀胱癌检测延误是一件常见的事[5]。膀胱镜检查是目前检测膀胱癌的黄金标准，是需要诊所或医院出诊并且具有较小但显著的感染风险的一种侵入性、不舒服的手术[6-9]。

在英国每年大约有10300人被诊断为膀胱癌并且5000人死于膀胱癌。然而，每年有超过100000个病例被从初级保健转诊到泌尿外科血尿诊所进行膀胱镜检查和影像检查。所转诊的患者中仅10％被检出膀胱癌。

在那些确诊病例中，三分之二是非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)，其中70％会复发，15％会进展为肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。通过膀胱镜检查进行监督是检测复发所必需的，并且对于处于高复发风险的病例，实施频率为每3个月复查一次持续2年，然后每6个月复查一次，之后每年复查一次。血尿的研究及随后针对复发的监督造成估计为￡5539万的高额的健康经济费用，使得膀胱名列治疗起来的最昂贵的癌症之一[10，11]。因此，非常需要可以更好地鉴定患有疾病的患者并减少对不必要的膀胱镜检查的需求的改进的测定法。

还没有基于尿的生物标记物被FDA批准作为膀胱癌检测的独立测试，因此，指导方针向所有患有可见血尿和持续性不可见血尿的患者推荐膀胱镜检查[10，11]。尿液细胞学常被用作膀胱镜检查的诊断辅助手段，但对高等级疾病和原位癌以外的其他癌症检测敏感性较低，不能代替膀胱镜检查[12，13]。同样，商业上可得的基于单个靶标或小的靶标组的测定法不能以足够的敏感性检测膀胱癌，并且只被批准与膀胱镜检查结合使用[14]。

目前，一些研究已经表明，体液中的DNA甲基化生物标记物用于癌症的非侵入性检测的潜在效用，所述体液包括尿液[15-23]、血浆/血清[24-26]以及唾液[27，28]。DNA甲基化的变化在恶性转化中起关键作用，导致肿瘤抑制基因的沉默和癌基因的过表达[29]。DNA甲基化的个体发育可塑性和相对稳定性使得外遗传改变成为用于诊断的理想生物标记物。

涉及在排泄的尿液中特定蛋白质的存在的检测测定法已被开发并商业化。在这些情况下，每次测定中检测的蛋白质的数量低，特异性和敏感性仍令人不满意[14]。所检测的蛋白质生物标记物包括人补体因子H相关蛋白、癌胚抗原(CEA)、膀胱肿瘤细胞相关的粘蛋白和核有丝分裂器蛋白22(NMP22)。

就评价某些蛋白质的表达的测定而言，WO2014042763描述了用于检测尿液样品中的蛋白、由IL-8、MMP-9、SDC1、CCL18、SERPINE1、CD44、VEGF-A、CA9和ANG组成的九-生物标记物组；由CA9、CCL18、MMP12、TMEM45A、MMP9、SEMA3D、ERBB2、CRH和MXRA8组成的另一个9-生物标记物组；以及由CCL18、CD44和VEGF-A组成的三-生物标记物组。

迄今为止，用于检测膀胱癌的DNA甲基化生物标记物检测已经集中在仅对少量基因座的分析，部分是由于技术限制和具有癌症特异性的靶标的衍生[11-19]。一般而言，所报道的敏感性和特异性相对于已建立的测定来说是高的，但仍不能获得通过膀胱镜检查所达到的性能特征。先前研究的针对膀胱癌的甲基化标记物包括DAPK、BCL2、TERT、TWIST1、NID2、RARβ、E-钙粘蛋白和p16。国际专利申请公开WO2013/144362描述了一种用于膀胱癌的诊断测定法，其涉及检测ECRG4和/或ITIH5基因的启动子的甲基化。美国专利申请公开US2013224738描述了一种用于膀胱癌的诊断测定法，其涉及评估由BCL2、CDKN2A和NID2组成的基因的甲基化状态。

寻求用于准确诊断膀胱癌的改进的测定法，这样的测定法将具有重要的临床和经济益处，特别是非侵入性的测定法。

发明概述

提供了具有可靠且高的敏感性和特异性的诊断方法，其可以从生物样品(特别是排泄的尿液样品)中检测膀胱癌，并且其有潜能减少在血尿患者中和进行疾病复发监测的患者中对膀胱镜检查的需求。避免膀胱镜检查将降低膀胱癌治疗的成本，并对患者的健康产生积极的影响，减少就诊次数和侵入性检查的不便。因此，本发明提供了以下内容：

本发明提供了一种在个体中诊断膀胱癌的方法，其包括：

(a)提供来自所述个体的样品的DNA；

(b)确定选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP；和

(c)当(b)组的至少25个MVP是甲基化的时，在所述个体中诊断为膀胱癌。

在任一种这样的方法中，MVP组可包括至少40个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP，其中当至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP是甲基化的时，诊断为膀胱癌。

MVP组可包括至少50个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP，或可包括至少100个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP。

MVP组可包括全部150个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP。

在上述方法中，当选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少40个MVP是甲基化的时，或当选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少50个MVP是甲基化的时，或当至少100个MVP是甲基化的时，或当全部150个MVP是甲基化的时，可以在个体中诊断为癌症。

在上述方法中，其中确定为是甲基化的MVP可包括以SEQ ID NO 1至3标识并由[CG]指示的MVP，或者可包括以SEQ ID NO 1至5标识并由[CG]指示的MVP，或者可包括以SEQID NO 1至10标识并由[CG]指示的MVP，或者可包括以SEQ ID NO 1至40标识并由[CG]指示的MVP。

在上述方法中个，MVP组可包括全部150个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP，其中当选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少40个MVP是甲基化的时，在个体中诊断为膀胱癌，且其中确定是甲基化的MVP包括以SEQ ID NO 1至10标识并由[CG]指示的MVP。

在任一种上述方法中，其中确定每一个MVP是否均是甲基化的步骤可包括亚硫酸氢盐转化DNA。

在任一种上述方法中，确定每一个MVP是否均是甲基化的步骤可包括：

1)进行测序步骤以确定MVP的序列；

2)将DNA与包含探针的阵列杂交，所述探针能够区分MVP的甲基化和非甲基化形式，将检测系统应用于所述阵列以区分MVP的甲基化和非甲基化形式；或

3)使用甲基化特异性引物进行扩增步骤，其中通过存在或不存在扩增产物来确定MVP的状态为甲基化的或非甲基化的。

在测序或杂交步骤之前可进行扩增步骤，其中扩增包含每个MVP的基因座。扩增可通过PCR进行。

在测序或杂交步骤之前，可进行捕获步骤。捕获步骤可包括将包含MVP基因座的多核苷酸与对MVP基因座具有特异性的结合分子结合，以及收集包含MVP基因座和结合分子的复合物；且其中：

i.捕获步骤发生在亚硫酸氢盐转化DNA的步骤之前；

ii.捕获步骤发生在亚硫酸氢盐转化DNA的步骤之后但在扩增或杂交步骤之前；或

iii.捕获步骤发生在亚硫酸氢盐转化DNA的步骤之后且在扩增步骤之后。

结合分子可以是对每个MVP具有特异性的寡核苷酸，优选每一个均包含与相应的MVP互补的序列的DNA或RNA分子。

结合分子可与纯化部分偶联。

纯化部分可包含第一纯化部分，所述收集包含MVP基因座和结合分子的复合物的步骤可包括将第一纯化部分与包含第二纯化部分的物质结合，其中第一纯化部分和第二纯化部分形成相互作用复合物。

第一纯化部分可以是生物素，第二纯化部分可以是链亲和素；或第一纯化部分可以是链亲和素，第二纯化部分可以是生物素。

扩增包含MVP的基因座的步骤可包括使用独立于MVP的甲基化状态的引物。

扩增包含MVP的基因座的步骤可通过微滴PCR扩增进行。

在任一种上述方法中，获自个体的生物样品可以为尿液、血液、血清、血浆或无细胞DNA的样品。

在任一种上述方法中，所述方法可达到95％或更高的ROC敏感性和90％或更高的ROC特异性；优选ROC敏感性为96％，ROC特异性为97％，优选95％或更高的ROC AUC，优选98％。

在任一种上述方法中，所述方法可达到95％或更高的阴性预测值(NPV)，优选97％。

在任一种上述方法中，在个体中诊断膀胱癌的步骤还可包括：

i.对肿瘤的等级进行分级；和/或

ii.确定肿瘤复发的风险；和/或

iii.确定非肌层浸润性疾病的进展的风险；和/或

确定对治疗疗法的可能的反应。

本发明还提供了一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括：

(a)从来自所述个体的样品获得DNA并确定选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQ IDNO 1至150标识并由[CG]指示的MVP；

(b)当(a)组的至少25个MVP是甲基化的时，在所述个体中诊断为膀胱癌；和

(c)给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗。

本发明还提供了一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括：

(a)提供来自所述个体的样品的DNA并确定选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQ IDNO 1至150标识并由[CG]指示的MVP；

(c)给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗。

本发明还提供了一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括：

(a)在来自所述个体的样品的DNA中确定选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQ ID NO1至150标识并由[CG]指示的MVP；

(c)给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗。

本发明还提供了一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗，其中所述个体已经通过以下步骤被诊断为患有膀胱癌：

(a)提供来自所述个体的样品的DNA并确定选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQ IDNO 1至150标识并由[CG]指示的MVP；和

(b)当(a)组的至少25个MVP是甲基化的时，在所述个体中诊断为膀胱癌。

本发明还提供了一种在个体中诊断膀胱癌的方法，其包括：

(a)获得识别选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的数据，其中该组包括至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP；和

(b)当(a)组的至少25个MVP是甲基化的时，在所述个体中诊断为膀胱癌；

其中所述数据是通过包括以下步骤的方法获得：

i.从样品中获得DNA；和

ii.确定DNA中的MVP是否是甲基化的。

在任一种上述方法中，癌症可以是非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)。癌症可以是肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。

本发明还提供了一种能够区分MVP的甲基化和非甲基化形式的阵列；所述阵列包括对MVP组中的每一个MVP的甲基化形式具有特异性的寡核苷酸探针和对所述组中的每一个MVP的非甲基化形式具有特异性的寡核苷酸探针；其中所述组由至少25个选自以SEQ IDNO 1至150标识的MVP的MVP组成。

在某些实施方案中，阵列不是Infinium HumanMethylation450BeadChip阵列。在某些实施方案中，所述阵列的MVP特异性寡核苷酸探针的数量少于482421，优选482000或更少、480000或更少、450000或更少、440000或更少、430000或更少、420000或更少、410000或更少，或400000或更少。

在上述阵列中，所述组可由选自以SEQ ID NO 1至150标识的至少40个MVP组成；优选以SEQ ID NO 1至150标识的至少50个MVP、至少60个MVP、至少70个MVP、至少80个MVP、至少90个MVP、至少100个MVP、至少110个MVP、至少120个MVP、至少130个MVP、至少140个MVP、至少145个MVP或全部150个MVP。

在上述阵列中，所述组可包括由SEQ ID NO 1至3限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至5限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至10限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至20限定的MVP，或由SEQID NO 1至30限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至40限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至50限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至60限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至70限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至80限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至90限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至100限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至100限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至120限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至130限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至140限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至150限定的MVP。

所述可阵列包括由SEQ ID NO 1至150限定的所有MVP。

在上述阵列中，所述阵列还可包括一个或多个包含MVP的寡核苷酸，所述MVP选自SEQ ID NO 1至150中限定的任一个MVP，其中所述一种或多种寡核苷酸与所述阵列的相应的寡核苷酸探针杂交。

所述一个或多个寡核苷酸可包括选自以SEQ ID NO 1至150标识的MVP的至少20个MVP；优选以SEQ ID NO 1至150标识的至少50个MVP、至少60个MVP、至少70个MVP、至少80个MVP、至少90个MVP、至少100个MVP、至少110个MVP、至少120个MVP、至少130个MVP、至少140个MVP、至少145个MVP、或全部150个MVP。

所述一种或多种寡核苷酸可包含由SEQ ID NO 1至10限定的MVP，或由SEQ ID NO1至20限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至30限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至40限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至50限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至60限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至70限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至80限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至90限定的MVP，或由SEQ ID NO1至100限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至110限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至120限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至130限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至140限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至150限定的MVP。

所述一种或多种寡核苷酸可包含由SEQ ID NO 1至150限定的所有MVP。

如上所述的阵列可通过将如上所述的阵列与一组寡核苷酸杂交而获得，所述寡核苷酸每一个均包含不同的MVP，所述MVP选自SEQ ID NO 1至150中限定的任一个MVP，且其中所述组包括至少40个寡核苷酸。

在这样的杂交阵列中，所述组可包括至少50个寡核苷酸。所述组可包括至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少145或至少150个寡核苷酸。

在杂交阵列中，所述组可包括至少40个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至20限定的MVP，或其中所述组可包括至少50个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至50限定的MVP，或其中所述组可包括至少60个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至60限定的MVP，或其中所述组可包括至少70个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至70限定的MVP，或其中所述组可包括至少80个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至80限定的MVP，或其中所述组可包括至少90个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至90限定的MVP，或其中所述组可包括至少100个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至100限定的MVP，或其中所述组可包括至少110个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至110限定的MVP，或其中所述组可包括至少120个寡核苷酸，其包含由SEQID NO 1至120限定的MVP，或其中所述组可包括至少130个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至130限定的MVP，或其中所述组可包括至少140个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至140限定的MVP，或其中所述组可包括至少145个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至145限定的MVP，或其中所述组可包括至少150个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至150限定的MVP。所述组可包括至少150个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至150限定的MVP。

本发明还提供了一种用于制造如上所限定的杂交阵列的方法，其包括将如上所限定的阵列与一组寡核苷酸接触，所述寡核苷酸每一个均包含不同的MVP，其中所述MVP选自SEQ ID NO 1至150中限定的MVP的任一个，且其中所述组包括至少25个寡核苷酸。

本发明还提供了一种用于制造如上所限定的杂交阵列的方法，其包括将如上限定的阵列与如上限定的一组寡核苷酸接触。

本发明还提供了一种试剂盒，其包括任一种如上所述的阵列。

所述试剂盒还可包括能够修饰MVP二核苷酸中的非甲基化胞嘧啶，但是不能修饰MVP二核苷酸中的甲基化胞嘧啶的DNA修饰试剂，任选地其中二核苷酸是CpG。DNA修饰试剂可以是亚硫酸氢盐试剂。

附图说明

图1.在膀胱癌(红色)与30个正常尿路上皮(蓝色)之间的9786个MVP(1746个高甲基化MVP、8040个低甲基化MVP)的热图。

图2.非癌症尿液(n＝10)、正常尿路上皮(n＝30)、膀胱癌(n＝81)和血液(n＝489)的150个UroMark基因座的热图。

图3.与膀胱癌的预测状态(淡蓝色/淡红色)和实际状态(蓝/红)，相比，正常尿路上皮(蓝色)和膀胱癌(红色)的UroMark测定涉及的150个基因座的热图。

图4.基于在来自UCL和TCGA膀胱癌的膀胱癌样品中150个基因座的甲基化状态，膀胱肿瘤和正常尿路上皮的MDS图。所述MDS(多维尺度法)图代表基于150个基因座的甲基化状态的表型与该组(panel)的不同性，并清楚地表明150个标记物能准确地将肿瘤与正常膀胱分开。坐标轴表示样品之间的欧氏距离(Euclidean distance)。

图5.用于在尿液中检测膀胱癌的UroMark模型的ROC图。

图6.表现最佳的(A)3、(B)5和(C)10标记组的ROC图。前3个MVP列为SEQ ID NO：1至3，前5个MVP列为SEQ ID NO：1至5，前10个MVP列为SEQ ID NO：1至10，全部为等级次序(参见表1)。

图7.由176个唯一尿液样品(98个非癌症尿液和78个癌症尿液)检测膀胱癌的UroMark模型的ROC图。

图8.来自患者尿液的DNA品质(浓度、纯度和完整性)的比较。A)与在家收集的样品(n＝41)相比，临床中收集的样品(n＝123)的浓度和纯度，其中红色表示低产率或纯度，琥珀色表示中等产率以及中级纯度，并且绿色表示高产率和纯度。B)示出低、中等或高产率和纯度的样品百分比。C)代表性的生物分析仪电泳图谱，其表示在具有通过分光光度法定量的浓度的样品中高分子量的DNA的回收。D)与制造者的56℃进行1小时的标准方案相比，在21℃下使用延长的消化步骤，尿液DNA的增加的中值产率和改善的纯度。E)两种尿液保存方法的比较：UCL建立的标准操作程序对比Norgen尿液保存管。细菌的数量是通过rpoB基因的qPCR来定量，并表示为rpoB拷贝数/每个人类YWHAZ拷贝。数据是平均值+/-标准差。

图9.检测来自验证同龄组2-96个唯一的尿液样品(64个非癌症尿液和32个癌症尿液)的膀胱癌的UroMark模型的ROC图。

图10.检测来自验证同龄组3-92个唯一的尿液样品(65个非癌症尿液和27个癌症尿液)的膀胱癌的UroMark模型的ROC图。

具体实施方式

膀胱癌

如上所述，膀胱癌是在西方世界中最流行的癌症类型之一。移行细胞癌为最常见的类型，并占膀胱癌的约90％。移行细胞癌起源于移行上皮，所述移行上皮为衬在膀胱内表面的组织。剩余10％的膀胱癌主要由以下组成：鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤和小细胞癌。鳞状细胞癌也起源于上皮组织，起源于鳞状细胞。这些为存在于最表面的上皮层中的薄的扁平细胞。腺癌形成于具有腺性特征和/或来源的上皮细胞。肉瘤来源于间充质来源的细胞，例如膀胱的脂肪和肌肉层的细胞。小细胞癌具有快速的倍增时间且能够更早的转移，使得它们特别具有攻击性。

膀胱癌还可分为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。

本文中所描述的诊断和治疗方法能够明确地所有类型的膀胱癌识别的恶性细胞。因此，本文中所描述的方法的任一种可用于诊断膀胱的移行细胞癌、膀胱的鳞状细胞癌、膀胱的腺癌、膀胱的肉瘤、膀胱的小细胞癌、转移膀胱癌、平滑肌肉瘤(在平滑肌中形成的肿瘤)、淋巴瘤(通常在淋巴结中形成的肿瘤)、恶性黑素瘤(通常在皮肤中形成的肿瘤)和大细胞神经内分泌癌。包括膀胱癌的原发形式和复发形式。如本文所述待被诊断或治疗的癌症可为尿路上皮细胞癌。因此，癌症可为输尿管癌、尿道癌或肾盂癌。

本文中所述的诊断测定所适用的最优选的患者类型为人类。本文中所述的诊断测定还可用于识别非人类动物中的膀胱癌。例如，非人类动物可包含衍生自人类的组织，例如异种移植物。因此，诊断测定可在人类膀胱癌的动物模型中用于诊断人类膀胱癌。本文中所述的诊断测定所适用的典型的非人类动物为啮齿类动物，例如大鼠或小鼠。

甲基化可变位点(MVP)

DNA的甲基化为后天修饰的可识别形式，其具有改变基因和其他元件(例如微小RNA)的表达的能力[51]。在癌症的发生和进展中，甲基化可具有例如沉默肿瘤抑制基因和/或增加癌基因的表达的作用。作为甲基化的后果，可出现其他形式的失调。DNA的甲基化出现在其主要为由CPG基序组成的二核苷酸的分散的基因座处，但还可出现在CHH基序(其中H为A、C或T)处。在甲基化过程中，将甲基基团添加至胞嘧啶碱基的第五个碳上以形成甲基胞嘧啶。

甲基化可在整个基因组中发生并且不限于与表达序列(如基因)相关的区域。甲基化通常但不总是在表达序列的启动子或其他调节区中发生。

本文中所定义的甲基化可变位点(MVP)为任何二核苷酸基因座，其可在表型之间(即肿瘤与正常组织之间)显示出甲基化状态的变化。MVP优选地为CpG或CHH二核苷酸基序。本文中所定义的MPV不限于与相应的表达序列相关的基因座的位点。

典型地，评估DNA甲基化状态包括分析DNA中甲基基团的存在或缺失，例如一种或多种胞嘧啶核苷酸的第5位上的甲基基团。优选地，评估作为CpG二核苷酸(其中C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤以及p代表连接两者的磷酸基团)存在的一种或多种胞嘧啶核苷酸的甲基化状态。

评估MVP的甲基化状态或测定MVP是否甲基化是指在后续处理之前确定在由个体获得的DNA的起始样品中MVP是否甲基化或未甲基化。

在本文中，如果在来自患者的基因组DNA的样品中MVP的一种或多种等位基因被测定具有一个或多个甲基化的CpG二核苷酸基因座，则所述MVP被定义为甲基化的。

在本文中所述的方法的任意一种中，测定为甲基化的MVP相对于正常的尿路上皮对照和/或全血对照为甲基化的。

用于诊断目的的具体的MVP列于表1中，并通过SEQ ID号以及Illumina ID号(IlmnID)识别。用于扩增所限定的MVP的示例性引物列于表2中，并通过SEQ ID号识别。

甲基化可变位点(MVP)状态的鉴定和评估

多种技术可用于甲基化可变位点(MVP)的鉴定和评估，下面将简要概述。本文所述的诊断方法涵盖用于确定MVP状态的任何合适的技术。

在常规的体外处理步骤如PCR中，甲基基团从起始DNA分子中丢失。为避免这种情况，检测甲基基团的技术通常包括在后续处理之前对DNA进行预处理，以便保存原始DNA分子的甲基化状态信息。这些预处理技术涉及三个主要类别的处理，即亚硫酸氢盐修饰、限制性酶消化和基于亲和力的分析。然后将这些技术的产品与基于测序或阵列的平台偶联，以便进行随后的鉴定或定性评估MVP甲基化状态。

涉及DNA的亚硫酸氢盐修饰的技术已经成为最常见的检测和评估CpG二核苷酸的甲基化状态的方法。用亚硫酸氢盐(例如亚硫酸氢钠)处理DNA将胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基，但对5-甲基胞嘧啶不起作用。因此，经亚硫酸氢盐处理的DNA中胞嘧啶的存在表明存在先前在起始DNA分子中被甲基化的胞嘧啶碱基。这类胞嘧啶碱基可通过多种技术检测。例如，可产生对未甲基化的DNA与甲基化的DNA具有特异性的引物，并将所述引物用于甲基化的CpG二核苷酸的基于PCR的鉴定。可进行分离/俘获步骤，例如，使用结合分子如互补寡核苷酸序列。也可使用标准和下一代DNA测序方案。

在其他方法中，可使用甲基化敏感性酶，其仅在甲基化的DNA的存在下进行消化或切割。对所得的片段的分析通常使用微阵列进行。

为了富集，基于亲和力的技术利用结合相互作用力以俘获甲基化的DNA的片段。通常使用结合分子(例如抗-5-甲基胞嘧啶的抗体)，然后进行后续处理步骤(例如PCR和测序)。

Olkhov-Mitsel和Bapat(2012)[51]提供了一篇可用于鉴定和评估基于MVP的生物标记物(包括甲基胞嘧啶)的技术的全面综述。

为了评估本文表征和描述的基于MVP的生物标记物的甲基化状态，可使用任何合适的方法。

优选的方法包括亚硫酸氢盐处理DNA，包括扩增所鉴定的MVP基因座以用于甲基化特异性PCR和/或测序，和/或使用甲基化鉴别微阵列对目标基因座的甲基化状态进行评估。

MVP基因座的扩增可通过多种方法实现。优选地，MVP基因座使用PCR扩增。MVP还可通过其他技术(如多重连接依赖性探针扩增(MLPA))扩增。可使用各种基于PCR的方法。例如，甲基化特异性引物可杂交至含有目的MVP序列的DNA中。这类引物可被设计为与衍生自甲基化或非甲基化MVP基因座的序列退火。退火后，进行PCR反应，随后的PCR产物的存在表明存在具有可鉴定序列的退火MVP。在这种方法中，DNA在扩增前被亚硫酸氢盐转化。这类技术通常意指甲基化特异性PCR(MSP)[53]。

在其他技术中，PCR引物可目的MVP序列退火，而不依赖于甲基化状态，并且进一步的处理步骤可用于测定MVP的状态。测定可被设计为使得MVP位点位于引物退火位点之间。该方法方案可用于诸如亚硫酸氢盐基因组测序[54]、COBRA[55]、Ms-SNuPE[56]的技术中。在这类方法中，DNA可在扩增之前或之后被亚硫酸氢盐转化。

优选地，使用小规模PCR方法。这类方法通常涉及样品的质量分配(例如数字PCR)。这些技术在高度微型化系统(皮升尺寸的液滴)的情况下提供了强大的准确性和敏感性，其对于随后处理可从生物样品(特别是尿液样品)中存在的潜在少量细胞材料中获得的少量DNA是理想的。各种小规模PCR技术是广泛可用的。例如，基于微滴的PCR仪器可购自多家供应商，包括RainDance Technologies，Inc.(Billerica，MA；http：//raindancetech.com/)和Bio-Rad，Inc.(http：//www.bio-rad.com/)。微阵列平台还可用于进行小规模PCR。这类平台可包括基于微流体网络的阵列，例如可购自Fluidigm Corp.(www.fluidigm.com)。

在MVP基因座扩增之后，扩增的PCR产物可偶联至后续分析平台上，以便测定目的MVP的甲基化状态。例如，可直接测序PCR产物以确定在目标MVP处甲基胞嘧啶的存在或缺失，或通过基于阵列技术分析PCR产物。

任何合适的测序技术可用于测定目标DNA的序列。在本发明的方法中，优选使用高处理量的、所谓的“第二代”、“第三代”和“下一代”技术对经亚硫酸氢盐处理的DNA测序。

在第二代技术中，并行测序大量的DNA分子。典型地，成千上万的分子以高密度锚定到指定的位置，并且以依赖于DNA合成的方法确定序列。反应通常由以下步骤组成：连续试剂递送和洗涤步骤，例如以便能够掺入可逆的标记的终止碱基；以及扫描步骤，以确定碱基掺入的顺序。这类基于阵列的系统为市售的，例如购自Illumina，Inc.(San Diego，CA；http：//www.illumina.com/)。

第三代技术通常定义为检测步骤之间不需要停止测序方法，因此可被视为实时系统。例如，发生在掺入过程中的氢离子的碱基特异性释放可在微孔系统的环境内检测(例如参见购自Life Technologies的Ion Torrent系统；http：//www.lifetechnologies.com/)。同样地，在焦磷酸测序中，焦磷酸盐(PPi)的碱基特异性释放被检测和分析。在纳米孔技术中，DNA分子通过或定位在纳米孔旁边，并且DNA分子相对于纳米孔移动后确定单个碱基的种类。这类系统为市售的，例如购自Oxford Nanopore(https：//www.nanoporetech.com/)。在另一种方法中，DNA聚合酶被限制在“零模式波导”中，并且掺入的碱基的种类是通过γ-标记的磷酸核苷酸的荧光检测来确定(参见例如Pacific Biosciences；http：//www.pacificbiosciences.com/)。

在本发明的其他方法中，可省略测序步骤。例如，基于两条互补的核酸链的退火以形成双链分子的原理，将扩增的PCR产物直接施用于杂交阵列。可以将杂交阵列设计成包括能够与MVP的扩增产物杂交并允许区分甲基化和非甲基化基因座的探针。例如，将探针设计为能够与含有胸腺嘧啶的MVP基因座选择性杂交，这表明在起始模板DNA中在未甲基化的胞嘧啶亚硫酸氢盐转化后产生尿嘧啶。相反地，将探针设计为能够与含有胞嘧啶的MVP基因座选择性杂交，这表明在亚硫酸氢盐处理后不存在尿嘧啶转化。这对应于起始模板DNA中的甲基化的MVP基因座。

将合适的检测系统施用于所述阵列之后，可使用基于计算机的分析技术来测定MVP的甲基化状态。检测系统可包括，例如在甲基化状态特异性探针延伸反应之后加入荧光分子。这类技术使得可以进行MVP状态确定，而不用特别的需要测序MVP扩增产物。这种基于阵列的鉴别探针可被称为甲基化特异性探针。

任何合适的甲基化鉴别微阵列可用于评估本文中所述的MVP的甲基化状态。优选的甲基化鉴别微阵列系统由Illumina，Inc.(San Diego，CA；http：//www.illumina.com/)提供。特别地，Infinium HumanMethylation450BeadChip阵列系统可用于评估本文中所述的用于膀胱癌的诊断MVP的甲基化状态。在亚硫酸氢盐处理起始DNA分子之后，这类系统利用对DNA的化学修饰。简而言之，所述阵列包含与特异性针对对应于未甲基化形式的MVP的DNA序列的寡核苷酸探针偶联的小珠，以及与特异性针对对应于甲基化形式的MVP的DNA序列的寡核苷酸探针偶联的单独的小珠。将候选的DNA分子施用于所述阵列，并在适当的条件下与对应于相关的表观遗传形式的寡核苷酸探针进行选择性杂交。因此，衍生自在相应的基因组DNA中甲基化的MVP的DNA分子将选择性连接至含有甲基化特异性寡核苷酸探针的小珠上，但是不会连接至含有非甲基化特异性寡核苷酸探针的小珠上。仅杂交探针的单碱基延伸掺入标记的ddNTP，随后用荧光试剂染色并成像。MVP的甲基化状态可通过计算源自甲基化和未甲基化位点的荧光信号的比例来确定。

因为本文中所限定的膀胱癌特异性诊断MVP生物标记物最初是使用IlluminaInfinium HumanMethylation450BeadChip阵列系统来鉴别，所以相同的芯片系统可用于在本文所述的诊断测定中审查(interrogate)那些相同的MVP。然而，替代或定制的阵列可用于审查本文限定的膀胱癌特异性诊断MVP生物标记物，条件是它们包括审查用于给定方法的所有MVP的工具，如本文所限定。

还可使用包括上述方法的组合的技术。例如，含有目的MVP序列的DNA可与微阵列杂交，然后进行DNA测序以确定上述MVP的状态。

在上述方法中，对应于MVP基因座的序列还可进行富集过程。可通过结合与目的MVP靶向序列互补的结合分子(如寡核苷酸探针)来俘获含有目的MVP序列的DNA。可在亚硫酸氢盐转化之前或之后或者在扩增之前或之后俘获对应于MVP基因座的序列。探针可以被设计为与亚硫酸氢盐转化的DNA互补。然后可将俘获的DNA进行进一步的处理步骤以确定MVP的状态，例如DNA测序步骤。

俘获/分离步骤可为定制设计的。或者，各种这类技术可为市售的，例如，购自Agilent Technologies(http：//www.agilent.com/home)的SureSelect靶标富集系统。在该系统中，与含有目的MVP序列的DNA互补的生物素化的“诱饵”或“探针”序列(例如DNA)可与样品核酸杂交。然后，使用涂覆链亲和素的磁性小珠来俘获与诱饵序列杂交的目的序列。抛弃未结合的级分。然后(例如通过消化RNA)除去诱饵序列，从而提供从非MVP序列分离的MVP靶向序列的富集库。在本发明的一个优选的方法中，将模板DNA进行亚硫酸氢盐转化，然后通过使用独立于MVP甲基化状态的引物的小规模PCR(例如微滴PCR)扩增目标基因座。扩增之后，将样品进行俘获步骤，以便富集含有目标MVP的PCR产物，例如，如上所述，使用磁性小珠来俘获和纯化。俘获之后，进行标准PCR反应以将DNA测序条形码掺入含有MVP的扩增子中。将PCR产物再次纯化，然后进行DNA测序和分析以确定在目标基因组MVP处甲基胞嘧啶的存在或缺失[31]。

本文中所限定的MVP生物标记基因座是例如通过标识符(identifier)(IlmnID)来鉴别。这些MVP基因座标识符是指市售InfiniumHuman Methylation450BeadChip试剂盒中使用的各个MVP位点。由每个MVP基因座标识符代表的每个MVP位点的种类可从Illumina，Inc.网站参照Infinium HumanMethylation450BeadChip试剂盒中使用的MVP位点公开获得。

关于在Illumina，Inc产品中使用的MVP基因座识别的其他信息见于2010年出版的标题为“Technical Note：Epigenetics.CpG Loci Identification.A guide toIllumina’s method for unambiguous CpG loci identification and tracking for the GoldenandAssay for Methylation”的技术说明书中并见于：

http：//www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_cpg_loci_identification.pdf.

关于Illumina Infinium Human Methylation450BeadChip系统的其他信息可见于：

http：//www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/datasheets/datasheet_humanmethylation450.pdf；

以及见于：

http：//www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/technote_hm450_data_analysis_optimization.pdf.

为了补充不断发展的公共数据库以提供准确的MVP/CpG基因座标识符和链取向，已经开发了一种方法，所述方法可根据每个单个MVP/CpG基因座的实际序列或上下文序列一致地命名MVP/CpG基因座。为了可以毫无疑义地提及任何种类的MVP/CpG基因座，已经开发了一致的和确定的MVP基因座数据库，以确保在甲基化数据的记录中的统一性。方法利用MVP基因座侧翼的序列来生成唯一的MVP基因座簇ID。该数字仅基于序列信息，不受基因组版本的影响。Illumina的标准化命名法也与通常用于单核苷酸多态性(SNP)命名的TOP/BOT链命名法(其表示链取向)并列。

用于Infinium Human Methylation450BeadChip系统的标识符还可来自公共存储库如Gene Expression Omnibus(GEO)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。

因此，本文中所定义的MVP是指相对于表1中列出的每个SEQ ID号和Illumina标识符(Ilmn ID)所鉴定的CG二核苷酸基序，其中可对二核苷酸的胞嘧啶碱基(在表1中列出的序列中用粗体和方括号表示)修饰或不修饰。因此，测定以指定的SEQ ID NO限定或识别的CpG的甲基化状态，或通过测定这类CpG是否甲基化，是指测定在个体的DNA的样品中的一个或多个基因座处，在表1中所示的序列中以粗体和方括号标识的CG二核苷酸基序的胞嘧啶是否被甲基化，应当认识到，由于测序错误或个体之间的差异，都可能存在任何给定的CpG的上游和下游序列中都可能存在变化。

本发明提供在个体中诊断膀胱癌的方法，其包括：

(a)提供所述个体的样品DNA；

(b)确定选自以SEQ ID NO 1至150标识且由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否被甲基化，其中所述组包含至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP；以及

(c)当至少25个(b)的组的MVP被甲基化时，在所述个体中诊断为膀胱癌。

在任何本文中所述的这类方法中，这组MVP(即这些其甲基化状态待被确定的MVP)可包含26个或更多以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP；或该组可包含27个或更多、28个或更多、29个或更多、30个或更多、31个或更多、32个或更多、33个或更多、34个或更多、35个或更多、36个或更多、37个或更多、38个或更多、39个或更多、40个或更多、41个或更多、42个或更多、43个或更多、44个或更多、45个或更多、46个或更多、47个或更多、48个或更多、49个或更多、50个或更多、51个或更多、52个或更多、53个或更多、54个或更多、55个或更多、56个或更多、57个或更多、58个或更多、59个或更多、60个或更多、61个或更多、62个或更多、63个或更多、64个或更多、65个或更多、66个或更多、67个或更多、68个或更多、69个或更多、70个或更多、71个或更多、72个或更多、73个或更多、74个或更多、75个或更多、76个或更多、77个或更多、78个或更多、79个或更多、80个或更多、81个或更多、82个或更多、83个或更多、84个或更多、85个或更多、86个或更多、87个或更多、88个或更多、89个或更多、90个或更多、91个或更多、92个或更多、93个或更多、94个或更多、95个或更多、96个或更多、97个或更多、98个或更多、99个或更多、100个或更多、101个或更多、102个或更多、103个或更多、104个或更多、105个或更多、106个或更多、107个或更多、108个或更多、109个或更多、110个或更多、111个或更多、112个或更多、113个或更多、114个或更多、115个或更多、116个或更多、117个或更多、118个或更多、119个或更多、120个或更多、121个或更多、122个或更多、123个或更多、124个或更多、125个或更多、126个或更多、127个或更多、128个或更多、129个或更多、130个或更多、131个或更多、132个或更多、133个或更多、134个或更多、135个或更多、136个或更多、137个或更多、138个或更多、139个或更多、140个或更多、141个或更多、142个或更多、143个或更多、144个或更多、145个或更多、146个或更多、147个或更多或148个或更多的以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP。该组可包含149或150个以SEQID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP。

在任何本文中所述的方法中，当至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP被甲基化时，诊断为膀胱癌。在以下情况下可诊断为膀胱癌：当26个或更多以SEQID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP被甲基化时；或当27个或更多、28个或更多、29个或更多、30个或更多、31个或更多、32个或更多、33个或更多、34个或更多、35个或更多、36个或更多、37个或更多、38个或更多、39个或更多、40个或更多、41个或更多、42个或更多、43个或更多、44个或更多、45个或更多、46个或更多、47个或更多、48个或更多、49个或更多、50个或更多、51个或更多、52个或更多、53个或更多、54个或更多、55个或更多、56个或更多、57个或更多、58个或更多、59个或更多、60个或更多、61个或更多、62个或更多、63个或更多、64个或更多、65个或更多、66个或更多、67个或更多、68个或更多、69个或更多、70个或更多、71个或更多、72个或更多、73个或更多、74个或更多、75个或更多、76个或更多、77个或更多、78个或更多、79个或更多、80个或更多、81个或更多、82个或更多、83个或更多、84个或更多、85个或更多、86个或更多、87个或更多、88个或更多、89个或更多、90个或更多、91个或更多、92个或更多、93个或更多、94个或更多、95个或更多、96个或更多、97个或更多、98个或更多、99个或更多、100个或更多、101个或更多、102个或更多、103个或更多、104个或更多、105个或更多、106个或更多、107个或更多、108个或更多、109个或更多、110个或更多、111个或更多、112个或更多、113个或更多、114个或更多、115个或更多、116个或更多、117个或更多、118个或更多、119个或更多、120个或更多、121个或更多、122个或更多、123个或更多、124个或更多、125个或更多、126个或更多、127个或更多、128个或更多、129个或更多、130个或更多、131个或更多、132个或更多、133个或更多、134个或更多、135个或更多、136个或更多、137个或更多、138个或更多、139个或更多、140个或更多、141个或更多、142个或更多、143个或更多、144个或更多、145个或更多、146个或更多、147个或更多或148个或更多的以SEQ ID NO1至150标识并且由[CG]指示的MVP被甲基化时。当149或150个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP被甲基化时，可诊断为膀胱癌。

优选地，当40个或更多的以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP被甲基化时，可诊断为膀胱癌。

当50个或更多、60个或更多、70个或更多或80个或更多、90个或更多或100个或更多的以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP被甲基化时，可诊断为膀胱癌。

在任何上述方法中，确定被甲基化的MVP可包含以SEQ ID NO 1至3标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQ ID NO 1至5标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQID NO 1至10标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQ ID NO 1至20标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQ ID NO 1至30标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQ ID NO1至40标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQ ID NO 1至50标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQ ID NO 1至60标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQ ID NO 1至70标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQ ID NO 1至80标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQ ID NO 1至90标识并且由[CG]指示的MVP，或可包含以SEQ ID NO 1至100标识并且由[CG]指示的MVP。

在一个实施方案中，这组MVP(即这些其甲基化状态待被确定的MVP)可包含全部150个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP，并且在该方法中，当至少40个选自以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP的MVP被甲基化时，在所述个体中可诊断为膀胱癌，并在该方法中，确定被甲基化的MVP包括以SEQ ID NO 1至10标识并且由[CG]指示的MVP。

生物信息学工具和统计学度量

帮助进行对亚硫酸氢盐转化的DNA序列的计算机分析和用于甲基化特异性分析目的的引物设计的软件程序通常是可用的并且已经在前面描述过[57、58、59]。

用于基于本文中所述的MVP甲基化状态测定的膀胱癌诊断的敏感性和特异性度量可使用标准接收器工作特性(ROC)统计分析来定义[52]。在ROC分析中，100％的敏感性对应于没有假阴性的结果，和100％的特异性对应于没有假阳性的结果。

基于使用一组150个MVP生物标记物进行的分析，本文中所述的根据本发明的膀胱癌诊断测定可实现的ROC敏感性为90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％。所述ROC敏感性可为100％。

根据本发明的诊断测定可实现的ROC特异性为90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％。所述ROC特异性可为100％。

根据本发明的诊断测定可具有ROC敏感性和ROC特异性值的相关组合，其中所述组合为任意一个上述所列的敏感性值与任意一个上述所列的特异性值，条件是所述敏感性值等于或小于所述特异性值。

因此，ROC特异性可为100％并且ROC敏感性可为90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或100％。

ROC特异性可为99％并且ROC敏感性可为90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或99％。

ROC特异性可为98％并且ROC敏感性可为90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或98％。

ROC特异性可为97％并且ROC敏感性可为90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或97％。

ROC特异性可为96％并且ROC敏感性可为90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或96％。

ROC特异性可为95％并且ROC敏感性可为90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或95％。

ROC特异性可为94％并且ROC敏感性可为90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或94％。

ROC特异性可为93％并且ROC敏感性可为90％或更高、91％或更高、92％或93％。

ROC特异性可为92％并且ROC敏感性可为90％或更高、91％或92％。

ROC特异性可为91％并且ROC敏感性可为90％或91％。

ROC特异性可为90％并且ROC敏感性可为90％。优选地，所述测定可实现的ROC敏感性为95％或更高并且ROC特异性为90％或更高；优选地，ROC敏感性为96％以及ROC特异性为97％。

与代表本文中所限定的诊断方法的实施例方法相对应的ROC图示于图5和7，其表明基于MVP的测定的高度敏感性和选择性。这与用更小的生物标志物组进行的测定形成对比，这已在前面描述过。因此，比较数据证明了本文限定的试验的优良的预测能力。

可被用于分类基于MVP的测定的准确度的另一个指标为ROCAUC。在ROC分析中，ROC图的曲线下的面积(AUC)是二元分类的度量。在随机二元分类中，真阳性和假阳性的数量将近似相等。在这种情况下，ROC图的AUC分数将为0.5。在一个优选的二元分级中，真阳性的数量为100％以及假阳性的数量为0％。在这种情况下，ROC图的AUC分数为1。

基于使用本文中所述的生物标记物进行的分析，本发明的膀胱癌诊断测定可实现的ROC AUC为0.90或更高、0.91或更高、0.92或更高、0.93或更高、0.94或更高、0.95或更高、0.96或更高、0.97或更高、0.98或更高、0.99或1。优选地，所述诊断测定可实现的ROC AUC为0.98或更高。

基于本文所述的MVP甲基化状态测定的膀胱癌诊断测试也可以使用阴性预测值(NPV)度量来表征。NPV为一种其为真阴性结果的阴性结果的比例的度量。

，基于使用一组150个MVP生物标记物进行的分析，本文中所述的根据本发明的膀胱癌诊断测试可实现的NPV为90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或100％。

生物样品

本文中所述的膀胱癌诊断测定可在获得来自患者的的任何合适的生物材料上进行。优选的生物材料为尿液。然而，可使用膀胱组织的样品，例如其通过活检或抽吸获得，或从保存的样品中获得(例如冷藏材料、组织切片等)。生物材料的样品还可包括固体组织样品、吸出物、生物液体的样品、血液、血清、血浆、腹水、淋巴、外周血、脑脊髓液、细针吸出物、唾液、痰、骨髓、皮肤、上皮样品(包括口腔上皮、宫颈上皮或阴道上皮)或其他来源于外胚层、阴道液、精液等的组织。组织刮片(scrape)可以包括来自例如口腔、食管、膀胱、阴道、尿道或宫颈刮片的生物材料。样品的细胞可包含炎性细胞，如淋巴细胞。

任何本文中所述的测定和方法可包括提供来自患者的生物样品作为用于甲基化分析的患者DNA的来源。

任何本文中所述的测定和方法可包括从预先已获自患者的生物样品中获得患者DNA。

任何本文中所述的测定和方法可包括获得来自患者的生物样品作为用于甲基化分析的患者DNA的来源。用于获得来自患者的生物材料的方法可为非侵入性的，例如从尿液中收集细胞。或者，可使用侵入性方法例如活检。

在本文中所述的方法中，检测水平为使得可在包含150000个细胞或更多的样品中检测到2个肿瘤细胞。在这类方法中，所述样品可包含160,000个细胞或更多、170,000个细胞或更多、180,000个细胞或更多、190,000个细胞或更多、200,000个细胞或更多、210,000个细胞或更多、220,000个细胞或更多、230,000个细胞或更多、240,000个细胞或更多、250,000个细胞或更多、260,000个细胞或更多、270,000个细胞或更多、280,000个细胞或更多、280,000个细胞或更多或者300,000个细胞或更多。

在任何这类方法中，可被检测的肿瘤细胞的数量为10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多、80个或更多、90个或更多、100个或更多、200个或更多、300个或更多、400个或更多、500个或更多、600个或更多、700个或更多、800个或更多、900个或更多、1000个或更多、2000个或更多、3000个或更多、4000个或更多、5000个或更多、6000个或更多、7000个或更多、8000个或更多、9000个或更多、10000个或更多、20000个或更多、30000个或更多、40000个或更多、50000个或更多、60000个或更多、70000个或更多、80000个或更多、90000个或更多或者100000个或更多。

治疗方法

本发明还包括在通过本文所述的诊断方法对膀胱癌进行阳性诊断之后进行一个或多个治疗步骤。

因此，本发明还包括治疗个体中的膀胱癌的方法，其包括：

(a)从来自所述个体的样品获得DNA，并确定选自以SEQ ID NO 1至150标识且由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否被甲基化，其中所述组包含至少25个以SEQ IDNO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP；

(b)当至少25个(a)组的MVP被甲基化时，在所述个体中诊断为膀胱癌，以及

(c)向所述个体施用一种或多种膀胱癌治疗方法。

本发明还包括治疗个体中的膀胱癌的方法，其包括：

(a)提供来自所述个体的样品的DNA，并确定选自以SEQ ID NO 1至150标识且由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否被甲基化，其中所述组包含至少25个以SEQ IDNO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP；

(c)向所述个体施用一种或多种膀胱癌治疗方法。

本发明还包括治疗个体中的膀胱癌的方法，其包括：

(a)在来自所述个体的样品的DNA中确定选自以SEQ ID NO 1至150标识且由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否被甲基化，其中所述组包含至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP；

(c)向所述个体施用一种或多种膀胱癌治疗方法。

本发明还包括治疗个体中的膀胱癌的的方法，所述方法包括向所述个体施用一种或多种膀胱癌治疗方法，其中所述个体已通过以下的步骤被诊断为膀胱癌，所述步骤包括：

(a)提供来自个体的样品的DNA，并确定选自以SEQ ID NO 1至150标识且由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否被甲基化，其中所述组包含至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP；

(b)当至少25个(a)组的MVP被甲基化时，在所述个体中诊断为膀胱癌。

在任何上述治疗膀胱癌的方法中，所述选自以SEQ ID NO 1至150标识且由[CG]指示的MVP的MVP组(即其甲基化状态待被确定的MVP的组)可包含任何数量的本文中所述和定义的MVP，条件是该组包含至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP。在这些方法中的任一种中，当被确定为甲基化的组中MVP的数量为任何数量的本文所述和定义的MVP时，在所述个体诊断为膀胱癌，条件是至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP被确定为甲基化的。

因此，本发明包括在阳性诊断为膀胱癌之后，施用一种或多种外科方法、一种或多种化学治疗剂、一种或多种免疫治疗剂、一种或多种放射治疗剂、一种或多种激素治疗剂，或任何上述的组合。

外科方法包括膀胱肿瘤的经尿道切除术(TURBT)、膀胱切除术、开放式根治性膀胱切除术(ORC)、腹腔镜根治性膀胱切除术(LRC)和机器人辅助根治性膀胱切除术(RARC)。

化学治疗剂包括以下物质。烷化剂包括氮芥、亚硝基脲、四嗪、氮丙啶、顺铂和铂基衍生物以及非经典的烷化剂。抗代谢物包括抗叶酸剂、氟嘧啶、脱氧核苷类似物和硫代嘌呤。微管破坏剂，包括长春花生物碱和紫杉烷以及多拉司他汀10及其衍生物。拓扑异构酶抑制剂，包括喜树碱(camptothecin)、伊立替康(irinotecan)和托泊替康(topotecan)。拓扑异构酶II毒素，包括依托泊苷(etoposide)、阿霉素(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)和替尼泊甙(teniposide)。拓扑异构酶II催化抑制剂，其包括新生霉素(novobiocin)、美巴龙(merbarone)和阿柔比星(aclarubicin)。细胞毒性抗生素，包括蒽环类抗生素(anthracyclines)、放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)和丝裂霉素(mitomycin)。

试剂的组合包括但不限于MVAC(甲氨蝶呤(Methotrexate)、长春花碱(Vinblastine)、长春花碱和长春化碱)、Gem-Cis(GC)(吉西他滨(Gemcitabine)和顺铂)、拉帕替尼(Lapatinib)和吉西他滨。

免疫治疗包括卡介苗(BCG)免疫疗法以及单克隆抗体和抗体-药物缀合物。抗体-药物缀合物包括与如上所述的微管破坏剂和DNA修饰试剂缀合的抗体。

组合疗法包括膀胱内连续BCG，然后电动施用(EMDA)MMC(EMDA-MMC)以及微波诱导膀胱壁体温过高(HT)和膀胱内MMC。

将癌症治疗剂以足以治愈的量给药至已经患有障碍或病症的受试者，减轻或部分停止所述病症或一种或多种其症状。这种治疗处理可使得降低疾病症状的严重性或提高无症状时期的频率或持续时间。将足够达到该效果的量定义为“治疗有效量”。用于给定目的的有效量将取决于疾病的严重性以及受试者的体重和常规状态。如本文中所用，术语“受试者”包括任何人。

阵列

本发明还包括能够鉴别本文中所定义的MVP的甲基化和非甲基化形式的阵列；所述阵列可包含对本文中所定义的MVP的甲基化形式具有特异性的寡核苷酸探针以及对本文中所定义的MVP的非甲基化形式具有特异性的寡核苷酸探针。

“特异性”意味着所述探针包含与含有MVP的寡核苷酸的序列互补的序列，使得它们可以杂交，特别是在严格条件下杂交。

在一些实施方案中，所述阵列不是Illumina InfiniumHumanMethylation450BeadChip阵列(Infinium HumanMethylation450BeadChip阵列)。

单独地或额外地，在一些实施方案中，所述阵列的MVP-特异性寡核苷酸探针的数量为小于482421个，优选482000个或更少、480000个或更少、450000个或更少、440000个或更少、430000个或更少、420000个或更少、410000个或更少或400000个或更少、375000个或更少、350000个或更少、325000个或更少、300000个或更少、275000个或更少、250000个或更少、225000个或更少、200000个或更少、175000个或更少、150000个或更少、125000个或更少、100000个或更少、75000个或更少、50000个或更少、45000个或更少、40000个或更少、35000个或更少、30000个或更少、25000个或更少、20000个或更少、15000个或更少、10000个或更少、5000个或更少、4000个或更少、3000个或更少或2000个或更少。

本发明还包括本文中所限定的任何阵列在任何方法中的用途，其需要在个体中确定MVP的甲基化状态以便诊断膀胱癌细胞。

试剂盒

本文中所限定的任何阵列可被包含在试剂盒中。

所述试剂盒可包含本文中所限定的任何阵列。

所述试剂盒可包含本文限定的任何阵列以及使用说明书。

所述试剂盒可额外地包含DNA修饰试剂，例如亚硫酸氢盐试剂。

所述试剂盒可额外地包含用于扩增DNA的试剂，例如本文中所限定的以SEQ ID NO1至150标识的任何MVP的引物(参见表2)。

确定样品甲基化情况的方法

本发明还包括确定来自个体的样品的甲基化情况的方法，所述方法包括：

i.提供来自个体的样品的DNA；

ii.确定选自以SEQ ID NO 1至150标识且由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否被甲基化，其中所述组包含至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP；以及

iii.基于该组MVP的甲基化状态，确定所述样品的甲基化情况。

在任何上述确定样品的甲基化情况的方法中，所述选自以SEQ ID NO 1至150标识且由[CG]指示的MVP的MVP组(即其甲基化状态待确定的MVP的组)可包含任何数量的本文中所述和定义的MVP，条件是该组包含至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP。

另外，在任何这类方法中，MVP的甲基化状态可使用本文中所述的任何阵列来确定。

其他方法

在本文中所述的任何诊断方法中，在个体中诊断膀胱癌的步骤可还包括：

I.对肿瘤等级进行分级；和/或

II.确定肿瘤复发的风险；和/或

III.确定非肌层侵入性疾病的进展风险；和/或

IV.确定对治疗疗法可能的反应。

本发明还包括确定个体中发生膀胱癌的风险的方法，所述方法包括：

(a)提供来自所述个体的样品的DNA，

(c)基于该组MVP的甲基化状态，确定所述个体中发生膀胱癌的风险。

在任何这类确定个体中发生膀胱癌的风险的方法中，所述选自以SEQ ID NO 1至150标识且由[CG]指示的MVP的MVP组(即其甲基化状态待确定的MVP的组)可包含任何数量的本文中所述和定义的MVP，条件是该组包含至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP。

其他用途

本发明还包括一组MVP在个体中诊断膀胱癌的用途或在个体中确定发生膀胱癌的风险的用途。

在任何这类用途中，该组MVP选自以SEQ ID NO 1至150标识且由[CG]指示的MVP。

在任何这类用途中，该组MVP可包含任何数量的本文中所述和定义的MVP，条件是该组包含至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并且由[CG]指示的MVP。

在任何上述用途中，在个体中诊断膀胱癌或在个体中确定发生膀胱癌的风险可通过本文中所述和限定的相应方法中的任何一种进行。另外，在任何这类方法中，MVP的甲基化状态可使用本文中所述的任何阵列来确定。

本发明通过以下实施例来举例说明：

实施例

材料和方法

介绍

利用新一代DNA测序平台的新兴技术特别有希望开发出对于高敏感度的外遗传生物标记物组。例如，亚硫酸氢盐转化的DNA的基于微滴的PCR扩增，及随后的通过RainDanceTechnologies开发的扩增的靶基因座[30]的新一代测序，使得能够进行对高达20000个亚硫酸氢盐转化的靶基因座的灵敏的、特异的且同时的扩增。亚硫酸氢盐转化的DNA的高度并行的基于微滴的PCR扩增已经证明可用于证实一系列组织中的外遗传改变[31-33]。然而，它还没有被应用于开发用于检测膀胱癌的非侵入性诊断生物标记物。

为了获得用于检测膀胱癌的灵敏测定法，本发明人进行了迄今为止最大的膀胱癌中全基因组甲基化的独立研究之一。由此看来，已经限定了一组膀胱特异性外遗传生物标记物，并且已经验证了使用RainDrop-BS[31]的150个基因座组对尿DNA的敏感性和特异性以用于以高度的诊断精确度检测膀胱癌。

研究人群

全基因组DNA甲基化分析针对来自81例膀胱癌的DNA和从UCLH(London)Department of Urology and CIEMAT(Madrid)收集的匹配30岁的正常尿路上皮样品的DNA进行。该同龄组包括35个低等级的非肌层浸润性癌症。进行代表性H&E切片的病理审查以包括肿瘤细胞性质>80％的样品。从MARMAL辅助数据库下载血液甲基化组数据(http：/marmal-aid.org，[34])。

独立的验证数据是从癌症基因组图谱计划(Cancer Genome Atlas Project)获得的(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaCancerDetails.jsp？diseaseType＝BLCA&diseaseName＝Bladder％20Urothelial％20Carcinoma)，其由MIBC膀胱癌和20例正常的尿路上皮样品组成。

对于验证研究，从就诊UCLH一站式血尿和监测膀胱镜检查诊所的患者采集连续尿液样品(n＝86例膀胱癌，n＝96例非癌症对照)。

尿液采集

从就诊血尿诊所或在University College Hospital为了复发的膀胱癌进行膀胱镜检查的患者获得尿液样品。为了比较诊所尿液样品与家庭尿液样品，患者被要求提供三个样品：一个诊所样品和两个家庭样品，其中一个应该是首段(first void)尿液。每个样品得到40-100ml。针对一个样品的家庭尿液试剂盒包含至多四个25ml无菌管、带有可吸收衬垫的邮寄管和预先填好回邮地址的带衬垫信封，设计以适合通过皇家邮政信箱。

DNA提取和定量

根据制造商的说明书使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen，UK)提取尿液DNA。通过分光光度法(Nanodrop 1000)和荧光测定法(Qubit ds DNA HS测定，Invitrogen，UK)定量DNA。

RainDance微滴PCR

对于微滴PCR，将7.20μl亚硫酸氢盐处理的(以及任选地，全基因组扩增的)DNA加入到4.70μl 10×高保真度缓冲液(Invitrogen)、1.80μl 50mM MgSO₄(Invitrogen)、1.62μl 10mM dNTP溶液混合物(NEB)、3.60μl 4M甜菜碱溶液(Sigma-Aldrich)、3.60μl液滴稳定剂(RainDance Technologies)、1.80μl 100％二甲基亚砜(Sigma-Aldrich)和0.72μl 5U/μl铂Taq聚合酶高保真度(Invitrogen)，至总体积为25μl。样品板使用ALPS 50V微孔板热封机(Thermo Scientific)密封。

然后将经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA模板混合物按照制造商的说明书施加于全自动ThunderStorm系统(RainDance Technologies)。简言之，将引物板液滴(MethylSeqSolution，RainDance Technologies)涂布到微流体芯片。DNA模板混合物在微流体芯片内转化成液滴。然后将引物对液滴和模板液滴以1∶1的比率配对在一起。成对的液滴穿过电场，其诱导离散的液滴聚结成单个PCR液滴(26μl)；每个样品收集约1百万个PCR液滴。

将PCR微滴在PTC-225热循环仪(MJ Research)中进行如下处理：94℃2min；55个循环：94℃30s，54℃45s，68℃80s；接着68℃10min；4℃下直到进一步处理。缓变率设定为每秒1℃。PCR扩增后，将70μl液滴去稳定剂(RainDance Technologies)加入到每个样品中以破坏PCR微滴乳液并释放包含在液滴内的扩增子。将溶液充分混合并在室温下孵育15min。使用Agencourt AMPure XP磁性小珠(Beckman Coulter)按照制造商的方案纯化样品。对于每个样品，使用234μl小珠。样品从40μl缓冲液中的磁性小珠洗脱。纯化的扩增子DNA的完整性和浓度(片段范围：120-300bp)是使用高敏感性DNA试剂盒(Agilent Technologies)在2100生物分析仪(Agilent Technologies)上进行评估。

甲基化阵列

将500ng DNA进行亚硫酸氢盐转化，与Infinium 450K人甲基化阵列杂交并根据制造商的建议进行处理。DNA亚硫酸氢盐转化是使用EZDNA甲基化试剂盒(Zymo Res earch)根据制造商的说明书进行。样品在单个批次中进行处理。R统计软件(版本2.14.0[35])用于随后的数据分析。ChAMP流水线用于从iDat文件中提取并分析数据，使用BMIQ将样品标准化[36，37]。对原始β值(甲基化值)进行如下严格的质量控制分析：去除表现出降低的覆盖度的样品，并且仅保留所有样品中具有高于背景的检测水平的探针(检测P＜0.01)。DMR(差异甲基化区)是使用Lasso测定[38，39]。

高通量DNA测序

根据制造商的方案，将合并的测序文库(12pM)和定制的测序引物(0.5μM)施加到MiSeq循环PE消耗筒(Illumina)。定制的测序引物的DNA序列在下表2中提供。测序在MiSeqDNA测序仪(Illumina)上使用75-bp双端读段来进行。

RainDance系统也用于核酸的测序(http：//raindancetech.com/targeted-dna-sequencing/thunderstorm/)。

数据和统计分析

测序接头是使用ea-utils v1.1.2-537的fastq-mcf工具从原始测序读段中进行剪切[60]。经剪切的测序数据使用Bismark v0.7.12被映射基于计算机的亚硫酸氢盐转化的人类参考基因组(GRCh37)[40，61]。使用Bismark v0.7.12的甲基化提取器工具提取甲基化信息[61]。靶向的DNA测序分析是使用R程序包TEQC v3.2.0.25进行。

实施例1：低等级和高等级膀胱癌的甲基化分析

与膀胱癌相关的外遗传改变最初是通过对来自81个高等级尿路上皮和30个正常尿路上皮的DNA进行全基因组DNA甲基化分析来限定的。

使用Wilcoxon秩和检验来指定方向性的监督分析被用于识别膀胱癌组织和正常组织之间的MVP(甲基化可变位置)。根据统计学显著性选择MVP(Wilcoxon P值＞0.001)。使用Δβ＞0.30(+/-)的额外滤器以补偿未考虑组之间甲基化的绝对差异。截断值根据经验限定为导致假发现率(FDR)＜2％，将候选基因座减少至甲基化差异最大并因此具有最大的区分效果潜力的那些基因座。总共9786个MVP符合这些要求(1746个超甲基化MVP、8040个低甲基化MVP)(图1)。

实施例2：膀胱癌特异性尿液生物标记物

为了限定DNA甲基化生物标记物组，识别在至少50％的癌症中确定是甲基化的(β＞50％)且在正常尿路上皮中确定是非甲基化的(β＜10％)的那些基因座。如本文中所讨论的，涉及该初始DNA甲基化生物标记物组的开发的“甲基化的(β＞50％)”，是指对于任何给定的基因座，对于该MVP而言，患者样品中>50％的细胞被确定是甲基化的。为了去除潜在的假阳性生物标记物并更好地限定膀胱癌特异性的改变，还对来自10名就诊血尿诊所并且具有确诊的非癌症诊断的患者的全血和尿液进行了分析。随后，从这些非癌症对照的尿液和血液中除去在DNA中显示任何甲基化(β＞10％)的基因座。最多识别432个基因座，其在非癌症中为非甲基化的且在大多数癌症组织中是甲基化的(β＞50％)。

为了获得用于检测的膀胱癌DNA甲基化标记(signature)，本发明人使用RandomForest框架，这得到由150个CpG基因座组成的分类标记(图2，见下表1)。使用这150个标记物的核心集合，本发明人对预测的可能值进行了分类器(classifier)的内部交叉验证，即对每个样品而言，在独立于其与样品组的关系的情况下，样品是否为癌症的可能性。这获得用于检测癌症的交叉验证的敏感性为100％、特异性为100％，表明150个外遗传基因座可以清楚地区分正常尿路上皮与膀胱癌(图3，图4)。

为了确定使用分类算法检测膀胱癌的150CpG(MVP)标记物组的敏感性，本发明人评估了另外179个膀胱癌(144个肌层浸润性和35个非肌层浸润性)和20个正常病例的甲基化谱。该组正确分类了所有膀胱癌，其敏感性和特异性均为1。

实施例3：检测组的验证

为了测试用于在尿液样品中检测膀胱癌的150个基因座组(外遗传标记(epi-signature))，从包括52位膀胱癌患者(低等级＝27，中等级/高等级＝25)和34名非癌症患者对照的同龄组(n＝86)中获得来自尿沉淀细胞的DNA。在这个独立的验证同龄组中，将外遗传标记应用于该验证同龄组中，检测膀胱癌的敏感性为95％、特异性为96％、AUC为97％(图5)。

大型标记物组也与来自训练同龄组的表现最好的单一标记物相比较，这包括来自在包括OTX1、COD1和MEIS1的基因中在先公布作为潜在的尿液生物标记物的区域的CpG基因座。对于每个CpG，基于从训练同龄组中的非膀胱癌对照中获得的最高β值，限定了甲基化阈值。然后该值用于预测验证同龄组中可能存在的膀胱癌。将性能最好的单一标记物结合起来，并开发出一种预测分类器，以探索基于3、5或10个标记物的“寡组”的潜力。虽然敏感性比单个标记物更好(最佳单个标记物72％，最佳组合标记物70％)，但他们仍未达到替代膀胱镜检查所需的水平。

这些数据表明，虽然单个标记物单独或组合地的性能相当好(图4-6，表1)，但使用单个基因座或寡组方法检测癌症的敏感性是有限的，低于临床实用所需的检测水平。使用大的标记物组的性能优于使用单个标记物组，表3示出了前10个最佳标记物和组合的150个基因座标记的敏感性、特异性、AUC、PPV和NPV。

实施例4：使用高通量技术验证检测组

RainDrop BS-seq[31]允许并行地对大量区域(最高达2000个独特的扩增子)进行大规模的靶向亚硫酸氢盐测序。这项技术先前已经得到验证，并且证明与450K甲基化阵列高度相关，并且其低模板输入的应用也已得到验证[31，32]。设计亚硫酸氢盐转化的测序引物组以测量150个所选择的基因组基因座的甲基化状态(参见下表2)。设计引物用于在可能的情况下独立审查Watson和Crick链。使用RainDrop BS-seq在96个病例的第二个独立同龄组中进行尿液的外遗传标记的验证。从26名膀胱癌患者和64名非癌症患者对照中获得来自尿沉淀细胞的DNA。使用Bismark算法产生150个基因座中的每一个的甲基化评分，使用这个数据，尿液的外遗传标记预测可能存在的膀胱癌，敏感性为96％、特异性为97％且AUC为0.96。

组合来自所有验证样品的甲基化数据可以增加所测试的样品的数量。组合样品允许评估176个独特的尿液样品：98个非癌症尿液和78个癌症尿液。外遗传标记预测膀胱癌的存在，AUC＝0.98的尿液，与分析技术无关(图7)。

结论

生物标记物驱动的膀胱癌早期非侵入性检测有可能从根本上改善这种疾病的治疗。高度敏感和特异性的测定法在检测到血尿诊所就诊的患者的新发疾病以及筛查现有膀胱癌患者的复发方面具有潜在效用。

几种非侵入性检测可商购，并是基于细胞学、FISH311分析和突变检测。尽管被FDA批准，所述测试报告的敏感性为54％至86％，特异性为61％至90％[12，13，41]。性能特征不足以代替膀胱镜检查，因此尚未被纳入临床实践。因此，新型生物标记物的改进和开发具有很大的空间，生物标记物组的组合和新技术的使用可能对此目的最有帮助。

DNA甲基化模式是高度细胞特异性的，这些外遗传事件的个体发育稳定性使得DNA甲基化成为检测和诊断疾病的理想生物标记物。整体DNA甲基化模式中的变化是致瘤性转化的共同特征，并且是膀胱癌中的常见事件。以前的研究已表明，膀胱癌(非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC))和正常尿路上皮之间的甲基化改变反映在来自膀胱癌患者的尿沉淀细胞中，并且因此可能是有用的诊断标记物。现在有几项研究已表明尿液的外遗传标记物在膀胱癌诊断中的效用。然而，尽管这些研究已经显示出良好的敏感性和特异性，但它们在临床实践中仍未被采纳，主要是因为它们仍不能拥有代替膀胱镜检查的性能特征。DNA甲基化生物标记物测定(连同其他基于DNA的标记物，例如突变)受限于识别推定的生物标记物的主要分析的低分辨率(使用候选方法或基于低分辨率微阵列的平台)，以及受限于可用于分析尿液中的候选标记物的技术中的限制。这导致在最终的生物标记物组中审查单个/小的生物标记物组[15-23]。然而，小的生物标记物组为了显示出与膀胱镜检查相匹配的敏感性和特异性，它们在很大程度上依赖于广泛疾病状态下低的肿瘤内和肿瘤间异质性[42]。

新的技术，如下一代亚硫酸氢盐测序和大规模多重PCR，目前允许使用更大的外遗传生物标记物组[31，32]。为了确定涉及膀胱癌发生的外遗传改变以及为了限定生物标记物组，进行了迄今为止最大的无偏的膀胱癌全基因组DNA甲基化筛选之一。除了可以深入了解促进膀胱癌发生的外遗传改变外，还从这些数据中鉴别了一组外遗传生物标记物，它们对膀胱癌的检测具有高度的敏感性和特异性。

限定了150个单个CpG基因座的生物标记物组，其可预测膀胱癌。虽然只有相对小的同龄组，但这些数据证明了与单个标记物和小的组生物标记物组相比，使用大的外遗传标记物组的效用。敏感性为96％，特异性为97％，该测试的阴性预测值(NPV)为97％。这比PSA(前列腺特异性抗原)测试(PPV＝30％-43％)、乳房X线照相术(PPV＝9％-19％)或大便潜血筛查(PPV＝6％-11％；[43-48])所能达到的要好1.2至8.7倍，并且与膀胱镜检查相似(PPV＝66.7％-98％)[49]。

本发明人已经证明了，通过应用高度敏感的和定量的大规模高度多路复用下一代测定，能够以比先前公开的甲基化测定更高的敏感性和特异性检测尿液中膀胱癌的存在，并且具有相当于膀胱镜检查的PPV。

本发明证明了允许审查更大组的新技术与膀胱癌特异性外遗传生物标记物的组合可以用于检测膀胱癌，使得膀胱镜检查的次数减少，并且因此改善患者的生活质量以及减少医疗保健支出。此外，大组测定的效用允许从相同数据内评估多个临床参数的潜力。例如，肿瘤等级的分级、非肌层浸润性疾病的复发或进展、对肌肉浸润性疾病治疗的可能反应或多种疾病的差异诊断。

实施例5：DNA样品处理和加工的优化

进行优化研究以使来自患者尿液样品的DNA产率最大化。DNA与蛋白酶K在56℃下孵育1小时或在21℃下孵育48小时。孵育是在100mg/mL的RNA酶A的存在下进行。采用延长的孵育方案观察到DNA的量和纯度的增加(图8D)。

将UCL家庭尿液采集试剂盒与可商购试剂盒(Norgen，Cat#18124，https：//norgenbiotek.com/display-product.php？ID＝424)进行比较。标准UCL尿液采集管含有70mg/ml Stabilur^TM尿液防腐剂。这项研究是针对来自健康志愿者的尿液进行的；每个样品的一半用UCL标准方法处理，另一半用Norgen防腐剂处理。

观察到用这两种方法保存的尿液的DNA的完整性几乎没有差异。没有观察到在首段样品和在其他时间排泄的样品之间的DNA纯度或产率的差异(浓度对比时间，c¹(1)＝0.255，p＝0.614；纯度对比时间，c¹(1)＝1.046，p＝0.306)。

然而，注意到在用Norgen防腐剂处理的尿液中超过8天时的DNA产率明显增加，而用UCL标准方案处理的尿液的DNA无论任何时间均具有相似的量。

发现使用Norgen系统尿液时DNA产量的明显增加的原因是细菌随时间的增长，而使用UCL建立的方案有效抑制了细菌的生长(图8E)。

实施例6：使用高通量技术对检测组进行额外的验证

如上所述分析来自32个确诊的膀胱癌病例和64个非癌症病例(验证同龄组2)的96个尿液样品。亚硫酸氢盐转化后，使用RainDance系统进行对上述150个UroMark基因座的测序。如上所述进行统计分析，得到的ROC图如图9所示(AUC＝0.96，敏感性＝0.97，特异性＝0.97，NVP＝0.98)。

在进一步的研究中，如上所述分析来自血尿和已知癌症样品的同龄组(验证同龄组2)的92个尿液样品。该同龄组包括27例确诊的癌症病例和65例非癌症病例。同样，在亚硫酸氢盐转化之后，使用RainDance系统进行对上述150个UroMark基因座的测序。如上所述进行统计分析，得到的ROC图如图10所示(AUC＝0.955，敏感性＝0.98，特异性＝0.97，NPV＝0.97)。

表3

下表3提供了包括如上表1中限定的全部150个MVP、排名前三位的MVP(SEQ ID NO：1-3)、排名前五位的MVP(SEQ ID NO：1-5)和排名前10位的MVP(SEQ ID NO：1-10)的示例性测定法的统计信息。

	全部150个	前3名	前5名	前10名
					敏感性	0.93	0.61	0.66	0.70
特异性	0.97	0.71	0.74	0.80
					PPV	0.98	0.79	0.82	0.86
NPV	0.89	0.51	0.55	0.61
					AUC	0.95	0.66	0.70	0.75

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Claims

1.一种在个体中诊断膀胱癌的方法，其包括：

(a)提供来自所述个体的样品的DNA；

(c)当(b)组的至少25个MVP均是甲基化的时，在所述个体中诊断为膀胱癌。

2.权利要求1的方法，其中所述MVP组包括至少40个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP，并且其中当至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP均是甲基化的时，诊断为膀胱癌。

3.权利要求2的方法，其中所述MVP组包括至少50个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP，或包括至少100个以SEQ ID NO1至150标识并由[CG]指示的MVP。

4.权利要求3的方法，其中所述MVP组包括全部150个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP。

5.权利要求2至4中任一项的方法，其中当选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少40个MVP均是甲基化的时，或当选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少50个MVP均是甲基化的时，或当选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少100个MVP均是甲基化的时，或当全部150个MVP均是甲基化的时，在个体中诊断为膀胱癌。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述确定为是甲基化的MVP包括以SEQ ID NO 1至3标识并由[CG]指示的MVP，或者包括以SEQ ID NO 1至5标识并由[CG]指示的MVP，或者包括以SEQ ID NO 1至10标识并由[CG]指示的MVP，或者包括以SEQ ID NO 1至40标识并由[CG]指示的MVP。

7.权利要求1的方法，其中所述MVP组包括全部150个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP，其中当选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少40个MVP是甲基化的时，在个体中诊断为膀胱癌，且其中所述确定是甲基化的MVP包括以SEQ ID NO1至10标识并由[CG]指示的MVP。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述确定每一个MVP是否均是甲基化的步骤包括亚硫酸氢盐转化所述DNA。

9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述确定每一个MVP是否均是甲基化的步骤包括：

1)进行测序步骤以确定MVP的序列；

10.权利要求9(a)或9(b)的方法，其中在测序或杂交步骤之前进行扩增步骤，其中扩增包含每个MVP的基因座。

11.权利要求9(c)或权利要求10的方法，其中所述扩增步骤是通过PCR进行的。

12.权利要求10或权利要求11的方法，其中在测序或杂交步骤之前，进行捕获步骤，其中所述捕获步骤包括将包含MVP基因座的多核苷酸与对MVP基因座具有特异性的结合分子结合，以及收集包含MVP基因座和结合分子的复合物；且其中：

i.所述捕获步骤发生在亚硫酸氢盐转化DNA的步骤之前；

ii.所述捕获步骤发生在亚硫酸氢盐转化DNA的步骤之后但在扩增或杂交步骤之前；或

iii.所述捕获步骤发生在亚硫酸氢盐转化DNA的步骤之后且在扩增步骤之后。

13.权利要求12的方法，其中所述结合分子是对每个MVP具有特异性的寡核苷酸，优选每一个均具有与相应的MVP互补的序列的DNA或RNA分子。

14.权利要求11至13中任一项的方法，其中所述结合分子与纯化部分偶联。

15.权利要求14的方法，其中所述纯化部分包含第一纯化部分，所述收集包含MVP基因座和结合分子的复合物的步骤包括将所述第一纯化部分与包含第二纯化部分的物质结合，其中第一纯化部分和第二纯化部分形成相互作用复合物。

16.权利要求15的方法，其中所述第一纯化部分是生物素，所述第二纯化部分是链亲和素；或其中第一纯化部分是链亲和素，所述第二纯化部分是生物素。

17.权利要求10至16中任一项的方法，其中所述扩增包含MVP的基因座的步骤包括使用独立于MVP甲基化状态的引物。

18.权利要求3至17中任一项的方法，其中所述扩增包含MVP的基因座的步骤通过微滴PCR扩增进行。

19.前述权利要求中任一项的方法，其中获自个体的生物样品为尿液、血液、血清、血浆或无细胞DNA的样品。

20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法达到95％或更高的ROC敏感性和90％或更高的ROC特异性；优选ROC地敏感性为96％，ROC特异性为97％。

21.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述方法达到95％或更高的ROC AUC，优选98％。

22.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述方法达到95％或更高的阴性预测值(NPV)，优选97％。

23.前述权利要求中任一项的方法，其中所述在个体中诊断膀胱癌的步骤还包括：

i.对肿瘤等级进行分级；和/或

ii.确定肿瘤复发的风险；和/或

iii.确定非肌层浸润性疾病的进展的风险；和/或

确定对治疗疗法的可能的反应。

24.一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括：

(a)从来自个体的样品获得DNA，并确定选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP；

(b)当(a)组的至少25个MVP是甲基化的时，在个体中诊断为膀胱癌；和

(c)给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗。

25.一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括：

(a)提供来自所述个体的样品的DNA，并确定选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP；

(c)给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗。

26.一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括：

(a)在来自所述个体的样品的DNA中确定选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP；

(c)给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗。

27.一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗，其中所述个体已经通过以下步骤被诊断为患有膀胱癌：

(a)提供来自所述个体的样品的DNA，并确定选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP；和

28.一种在个体中诊断膀胱癌的方法，其包括：

其中所述数据是通过包括以下步骤的方法获得：

i.从所述样品中获得DNA；和

ii.确定所述DNA中的MVP是否是甲基化的。

29.前述权利要求中任一项的方法，其中癌症是非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)。

30.权利要求1至29中任一项的方法，其中癌症是肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。

31.一种能够区分MVP的甲基化和非甲基化形式的阵列；所述阵列包括对MVP组中的每一个MVP的甲基化形式具有特异性的寡核苷酸探针和对所述组中的每一个MVP的非甲基化形式具有特异性的寡核苷酸探针；其中所述组由至少25个选自以SEQ ID NO 1至150标识的MVP组成。

32.权利要求31的阵列，条件是所述阵列不是Infinium HumanMethylation450BeadChip阵列，和/或条件是所述阵列的MVP特异性寡核苷酸探针的数量少于482421，优选482000或更少、480000或更少、450000或更少、440000或更少、430000或更少、420000或更少、410000或更少，或400000或更少。

33.权利要求31或权利要求32的阵列，其中所述组由选自以SEQ ID NO 1至150标识的至少40个MVP组成；优选以SEQ ID NO 1至150标识的至少50个MVP、至少60个MVP、至少70个MVP、至少80个MVP、至少90个MVP、至少100个MVP、至少110个MVP、至少120个MVP、至少130个MVP、至少140个MVP、至少145个MVP或全部150个MVP。

34.权利要求31至33中任一项的阵列，其中所述组包括由SEQ ID NO 1至3限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至5限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至10限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至20限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至30限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至40限定的MVP，或由SEQID NO 1至50限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至60限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至70限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至80限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至90限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至100限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至100限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至120限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至130限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至140限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至150限定的MVP。

35.权利要求34的阵列，其中所述阵列包括由SEQ ID NO 1至150限定的所有MVP。

36.权利要求31至35中任一项的阵列，其还包括一个或多个包含MVP的寡核苷酸，所述MVP选自SEQ ID NO 1至150中限定的任一个MVP，其中所述一种或多种寡核苷酸与所述阵列的相应的寡核苷酸探针杂交。

37.权利要求36的阵列，其中所述一个或多个寡核苷酸包括选自以SEQ ID NO 1至150标识的MVP的至少25个MVP；优选以SEQ ID NO1至150标识的至少50个MVP、至少60个MVP、至少70个MVP、至少80个MVP、至少90个MVP、至少100个MVP、至少110个MVP、至少120个MVP、至少130个MVP、至少140个MVP、至少145个MVP、或全部150个MVP。

38.权利要求36或37的阵列，其中所述一种或多种寡核苷酸包含由SEQ ID NO 1至10限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至20限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至30限定的MVP，或由SEQ IDNO 1至40限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至50限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至60限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至70限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至80限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至90限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至100限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至110限定的MVP，或由SEQID NO 1至120限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至130限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至140限定的MVP，或由SEQ ID NO 1至150限定的MVP。

39.权利要求38的阵列，其中所述一种或多种寡核苷酸包含由SEQ ID NO 1至150限定的所有MVP。

40.一种杂交阵列，其中所述阵列是可通过将权利要求31至35中任一项的阵列与一组寡核苷酸杂交而获得，所述寡核苷酸每一个均包含不同的MVP，所述MVP选自SEQ ID NO 1至150中限定的任一个MVP，且其中所述组包括至少25个寡核苷酸。

41.权利要求40的杂交阵列，其中所述组包括至少40个寡核苷酸；任选地其中所述组包括至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少145或至少150个寡核苷酸。

42.权利要求40或权利要求41的杂交阵列，其中所述组包括至少25个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至25限定的MVP，或其中所述组包括至少40个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO1至40限定的MVP，或其中所述组包括至少50个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至50限定的MVP，或其中所述组包括至少60个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至60限定的MVP，或其中所述组包括至少70个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至70限定的MVP，或其中所述组包括至少80个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至80限定的MVP，或其中所述组包括至少90个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至90限定的MVP，或其中所述组包括至少100个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至100限定的MVP，或其中所述组包括至少110个寡核苷酸，其包含由SEQID NO 1至110限定的MVP，或其中所述组包括至少120个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至120限定的MVP，或其中所述组包括至少130个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至130限定的MVP，或其中所述组包括至少140个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至140限定的MVP，或其中所述组包括至少145个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至145限定的MVP，或其中所述组包括至少150个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO 1至150限定的MVP。

43.权利要求42的杂交序列，其中所述组包括至少150个寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO1至150限定的MVP。

44.一种用于制造权利要求40的杂交阵列的方法，其包括将权利要求31至35中任一项的阵列与一组寡核苷酸接触，所述寡核苷酸每一个均包含不同的MVP，其中所述MVP选自SEQID NO 1至150中限定的MVP的任一个，且其中所述组包括至少25个寡核苷酸。

45.一种用于制造权利要求41的杂交阵列的方法，其包括将权利要求31至35中任一项的阵列与如根据权利要求41所限定的一组寡核苷酸接触；或一种用于制造权利要求42或43的杂交阵列的方法，其包括将权利要求31至35中任一项的阵列与如根据权利要求42或权利要求43所限定的一组寡核苷酸接触。

46.一种试剂盒，其包括权利要求31至35中任一项的阵列。

47.权利要求46的试剂盒，其还包括能够修饰MVP二核苷酸中的非甲基化胞嘧啶，但是不能修饰MVP二核苷酸中的甲基化胞嘧啶的DNA修饰试剂，任选地其中二核苷酸是CpG。

48.权利要求46或47的试剂盒，其中DNA修饰试剂是亚硫酸氢盐试剂。