CN102711454B - 用于提高rna干扰剂的递送、表达或活性的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本申请提出用于提高siRNA或miRNA递送到多层组织内部，或组织细胞的细胞质，或细胞核的方法和组合物。这些方法和组合物产生肿瘤选择性和细胞内递送的RNAi，并允许RNAi介导的生物活性，如抑制目标基因及相关产物。本发明进一步提供了提高核苷酸药物的细胞内生物利用度的方法和组合物。

Description

用于提高RNA干扰剂的递送、表达或活性的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年10月12日提交的序列号为No.61/250,587且名称为″Methods and Compositions for Improved Management and Treatment ofPatients with Tumors or Proliferative Disorders″的临时专利申请以及2010年3月8日提交的序列号为No.12/719,546且名称为″Methods and Compositionsfor Improved Delivery,Expression or Activity of RNA Interference Agents″的申请的权益。这些申请的整个内容通过引用并入本文。本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献的内容通过引用全部并入本文。

关于联邦政府资助研究的声明

该工作得到美国健康和公共事业局(United States Department of Healthand Human Services)的资助(资助号R43CA134047)。

技术领域

RNA干扰(RNAi)可以用来纠正细胞遗传信息的表达。RNAi技术的成功运用的一个主要障碍是无法将RNAi制剂递送到靶细胞或引起细胞中对应基因的表达。将RNAi药物递送到异常增生的组织，比如肿瘤，尤其困难,因为这些组织没有良好的血液灌流。本申请通过提高细胞内RNAi药物的生物利用度的方法和化学组成达到增强RNAi药物的基因阻断活性。

背景技术

基因治疗：DNA和RNA导向的基因治疗之间的差异

基因疗法通过纠正导致疾病的基因缺陷于几十年前已有文献报道。这种最初尝试的DNA导向的基因疗法是将基因药物及其载体递送到细胞核中发挥作用。

在过去的十年中，发现了一种更新的RNA导向基因治疗形式，RNA干扰(RNAi)。RNAi药物是一小段双链RNA。RNAi药物通过降解互补的mRNA，产生序列特异性转录后基因沉默,从而阻断致病基因的表达或致病蛋白的生成。RNAi介导的基因阻断过程发生在细胞质中。RNAi的两种类型是小分子干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)。它们使用相同的酶和功能蛋白质来产生基因沉默。siRNA是针对单一的mRNA，而miRNA则针对250-500不同的mRNA。

DNA和RNA导向的基因治疗之间有几个重大不同。首先，DNA和RNAi载体的配方是不同的。例如，直径范围大(从0.4到1.4微米)的DNA/脂质复合物比直径范围小的DNA/脂质复合物具有更有效的细胞转染能力。相反，在本申请中所表述的，RNAi载体通常比较小，例如在纳米范围内。其次，对于有效的DNA基因治疗，基因药物必须穿越细胞膜和细胞质到达细胞核，这个过程包括以下多个步骤：(一)载体结合到细胞上。(二)通过内吞作用形成内涵体使基因进入细胞。(三)进入细胞后，DNA载体复合物(DNA/脂质复合物或DNA/聚合物复合物)从内涵体被释放。(四)内涵体在细胞质内转运可能将复合物带到环细胞核区域，以致于释放出的DNA将有更大的机会进入细胞核。(五)DNA载体复合物解离，导致DNA与载体分离。(六)无法从内涵中脱离的DNA/脂质复合物或DNA/聚合物复合物可能在溶酶体降解。(七)从DNA/脂质复合物或DNA/聚合物复合物释放到细胞质DNA可通过以下几种不同的，非相互排斥的机制进入细胞核。第一，释放到细胞质中的DNA可在有丝分裂过程中核膜分解时进入细胞核。第二个机制是通过能源依赖的主动核转运将释放到细胞质中的DNA运到细胞核内。这种传输依赖于质粒中的特定序列和其相对应的核转运载体之间的相互作用。第三，有DNA载体复合物可能通过内涵体直接与核膜融合从而释放DNA进入到细胞核。(八)进入细胞核后，DNA通过整合到宿主染色体而干扰基因的表达，DNA也可能在细胞核中降解而失去活性。

与DNA药物在细胞核中发挥作用不同，RNAi药物在细胞质中发挥作用，不需要进入细胞核，不需要与染色体DNA相互作用。然而，输送并释放完整的RNAi到细胞质中的其他障碍依然存在。

由于上述差异，有效的DNA和RNA导向的基因治疗对药物的递送有不同的要求。提高DNA基因转染可以发生在上述所涉及的八个步骤中的任何一个。相反，增加RNAi转染可以通过改进递送RNAi(包括从载体和内涵体被释放)到细胞质中,以及增强其在细胞质中的表达来实现。这些差异是实质性的。例如，DNA载体复合物从内涵体的早期释放是不可取的，因为过早地释放DNA会受到细胞质核酸酶地降解。相比之下，RNAi从内涵体的早期释放是有益于增强其诱导基因沉默的活性。同样，提高DNA进入到细胞核内需要提高细胞核周围DNA/脂质体复合物的积累。相反，核周围的积累对RNAi是没有必要的。以上事实表明，用于提高DNA介导的基因治疗活性的方法和传送系统可能并不适用于RNA介导的基因治疗，反之亦然。

发明内容

尽管RNA在实验体系比如细胞培养中是有力的研究工具，一个普遍认识是，对病人或动物体内成功利用的RNAi疗法是非常困难的，其中最重要的一个障碍是难以将RNAi有效得递送到病变细胞尤其是病变细胞的细胞质中，以使siRNA或miRNA分子发挥他们的作用。这个障碍对使用RNAi治疗产生了很大的局限，以致最近，Sirna治疗公司，默克公司的全资子公司，公开向研究界征求帮助寻找克服这个限制的方法和成分(Sirna TherapeuticsINC，HTTP://WWW.siRNA.COM，2009年)。请参考最近的一篇综述对RNAi技术的障碍和载体进行的讨论(Jie Wang et al，AAPS Journal，2010)。

小结

本申请公开可提供有效递送RNAi药物，并实现在体外和体内RNA干扰的载体的方法和组合物。发明是基于申请人的发现，即某些药物，称为促成剂，可以提高RNAi载体或RNAi药物的肿瘤细胞的递送,改进RNAi药物在细胞质从载体,内涵体或溶酶体中释放，从而提高细胞内的RNAi药物的生物利用度和药物活性。有效的RNAi治疗取决于RNAi具有达到细胞的RNA干扰机制的能力。促成剂是一个或多个微管蛋白活性剂，其中包括但不限于，紫杉醇(paclitaxel)，多西紫杉醇(docetaxel)，秋水仙碱(colchicine)，噻氨酯哒唑(nocodazole)，长春新碱(vincristine)，和拓扑异构酶抑制剂，包括但不限于，阿霉素(doxorubicin)。没有微管蛋白或拓扑异构酶活性的其他药物，不能增强细胞内的RNAi药物的生物利用度。

所述的组合物包括一个或更多的促成剂和RNAi载体的组合。该组合被称为RNAi的传递和表达系统(RIDES)。RIDES由两部分组成。一部分是聚乙二醇表面修饰的阳离子脂质体的RNAi载体。载体的组成包括DOTAP，胆固醇,DOPE,和DSPE-PEG2000,摩尔比为50:30:19:1。这个载体，称为PCat脂质体，在相关领域中还未有报道。在例4-6中所表述的平行比较中，申请人表明，与50:50摩尔比的DOTAP：胆固醇组成的阳离子脂质体(DC载体)配方相比(美国专利No.5459127)，PCat载体在体外和体内的情况下，能更有效地传递和表达的RNAi，并产生较少的毒性。RIDES的第二个组成部分是一个或多个促成剂。RIDES的两个组成部分，可以通过多种方式使用。一个方式，就是分别同时制备两个组成部分，然后一起使用。另一种方式是，例如，在临床应用中先于几个小时到几天之前给以促成剂，再给予以RNAi。第三种方式是将两个组成部分于制备中放在同一PCat载体内,作为一个单一实体使用。

所提供的方法包括使用一个或多个促成剂，以提高运送RNAi到肿瘤细胞，并增强在细胞质内的RNAi细胞生物利用度,以致该组合在培养的细胞中或在体内，即人类患者或动物中,相对于没有使用促成剂,产生更大的疗效或者活性。RIDES可以有效地应用于带正电的脂质体和聚乙二醇修饰的脂质体。

另外的成分和方法是RIDES和细胞凋亡诱导剂的组合。细胞凋亡诱导剂可以制备成快速释放或缓释的制剂或临床使用的配方。

如示例中所述，申请人已成功地制备了载RNAi的PCat脂质体，并证明在培养的细胞和动物肿瘤模型中,有效递送RNAi到细胞,以及RNAi在细胞质中从载体，内涵体或溶酶体中的释放，导致有效的RNA干扰和蛋白质的合成抑制。

因为siRNA和miRNA有相似的化学结构(均为约21-27核苷酸单位长度的双链寡核苷酸),并且在细胞质中作用于相同的mRNA调节机制，因此相同的载体可用于两种类型的RNAi。

本申请提供将RNAi递送到其在细胞质内的作用靶点,使其产生RNA干扰的方法和组合物。

附图说明

为更全面的了解目前所描述的过程和成分的性质和优势，请参考下面的与所附图相关的详细描述：

图1.RIDES对体内肿瘤的有效治疗作用：腹腔肿瘤的腹腔治疗。

方法在例2中描述。图1A显示第21天的代表性动物。图1B显示染色的肿瘤切片的显微照片,包括总凋亡蛋白(存活素)，核凋亡蛋白,半胱天冬酶-3(caspase 3，细胞凋亡标记)和Ki67(增殖细胞标记)。

图2.RIDES对体内肿瘤的有效治疗作用：三种不同类型皮下肿瘤的的静脉注射治疗。

对载人类移植肿瘤的小鼠如例3中所述进行治疗。紫杉醇溶解在载体中(即50:50v/v聚氧乙烯蓖麻油乙醇)。图中所示为代表性动物的照片。一些动物的肿瘤很小或没有残余肿瘤(箭头表明植入肿瘤的部位)。A：载胰腺癌HS766T肿瘤动物，治疗开始后第10天。B：载PC3前列腺肿瘤动物，治疗开始后第21天。C：载咽喉癌FaDu肿瘤动物，治疗开始后第42天。在C中，三个组所示动物中没有接受载体的，因为所有的都已在42天前接近死亡。N/A,没有显示。

图3.促成剂预处理提高RNAi的细胞内的生物利用度。

方法在例7中描述。单层培养的MCF7人类乳腺肿瘤细胞，前列腺癌PC3细胞，和胰腺癌HS766T细胞以促成剂预处理，然后用DC-RNAi处理。对照组未用促成剂预处理。所用的RNAi是siGLO。细胞核以DRAQ5(蓝色荧光)标记。siGLO显示绿色荧光。脂质体显示红色荧光。将分散的红色和绿色信号共定位(这将产生一个从黄色到绿色不等混合的颜色)表示完整的siRNA存在于脂质体内。绿色和蓝色信号共定位(产生一个混合的颜色从青绿到绿色)表明siGLO存在于细胞核内。混合颜色的细微变化是由于实验差异造成地。在某些细胞中，绿色信号弥漫遍布细胞核表示siGLO从脂质体广泛分离和有效的转染。两者都可被促成剂增强。这表明促成剂促进RNAi从载体，内涵体或溶酶体的释放,或改善RNAi到细胞质和细胞核的递送。其他不具微管蛋白活性或拓扑异构酶抑制性的化疗药物,即，顺铂(cisplatin)，5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)，在并行实验中发现是无效的。标尺，20微米。

图4.促成剂在不同的条件下提高细胞内的RNAi的生物利用度。

共聚焦显微镜观察结果。标尺，20微米。A：促成剂紫杉醇在毒性浓度(50nM)和非细胞毒性(10nM)浓度时有效。方法在例7第二项研究中描述。B：促成剂在与PCat-RNAi(在分别的溶液中)同时给予时有效。方法在例7第三项研究中描述。不具微管蛋白活性或拓扑异构酶抑制性的化疗药物(顺铂)，在并行实验中发现，对于促进RNAi递送或脂质体,内涵体或溶酶体释放无效。这些结果表明促成剂提高RNAi的递送和从脂质体，内涵体，溶酶体释放。

图5.RIDES有效抑制靶基因。免疫印迹测定靶蛋白质水平降低表明RNAi的有效性。方法在例10中描述。

图6.不同方式结合RIDES的两种成分对RNAi细胞内的生物利用度的影响。

A：方法在例11中描述。单层培养PC3细胞。RNAi为siGLO。共聚焦荧光显微镜用于可视化siGLO的位置(绿色)，脂质(红色)，细胞核(蓝色)。RIDES的两个组成部分，即，促成剂和PCat-RNAi，三种不同的方式使用。促成剂为紫杉醇。RIDES的方式之一，是在PCat-RNAi之前使用促成剂(即PCat-RNAi+紫杉醇预处理)。第二个方式是同时给以促成剂和PCat-RNAi(即PCat-RNAi+紫杉醇分子共处理)。在这两种情况下，这两个RIDES成分分别给药。第三个方式为两种药物均装载于PCat脂质体内(即Pac-PCat-RNAi)。B：三种另外的促成剂与RNAi装载于PCat脂质体内，即多西紫杉醇，秋水仙碱和长春新碱；相应的组成是Doc-PCat-RNAi，Col-PCat-RNAi，和Vin-PCat-RNAi。实验所用细胞为PC3，MCF，HS766T细胞。在细胞核中siGLO含量提高表明促成剂促进RNAi递送和从脂质体，内涵体，溶酶体内的释放。标尺，20微米。

图7.含促成剂的PCat-RNAi有效产生RNA干扰。

研究中使用了负载促成剂和RNAi的PCat脂质体。促成剂为紫杉醇，多西紫杉醇，秋水仙碱，长春新碱，和相应的PCat-RNAi是Pac-PCat RNAi，Doc-PCat-RNAi，Col-PCat-RNAi，和Vin-PCat-RNAi。RNAi是靶向存活素的siRNA。方法在例12中描述。图中所示为免疫印迹结果。A：比较含促成剂PCat RNAi与促成剂(预处理)和PCat-RNAi分别给药。紫杉醇用于作为促成剂。B：Doc-PCat-RNAi，Col-PCat-RNAi，和Vin-PCat-RNAi的有效性。

详细说明

本申请提供用于RNAi细胞内递送，并提高体外和体内细胞内的RNAi药物的生物利用度的方法和组合物。

在2000年4月7日提交的序列号为No.09/547,825，名称为″Methods andCompositions for Enhancing Delivery of Therapeutic agents to Tissue″的美国专利申请，以及2005年4月3日提交的序列号为No.11/242,546，名称为″Tumor-Targeting Drug-Loaded Particles″的美国专利申请中，申请人已公开过使用肿瘤疏松的方法来提高治疗药物的递送。这些方法描述了使用细胞凋亡诱导剂的方法和成分以提高治疗药物的递送，但没有考虑RNAi药物的递送，也并没有描述新发现的PCat脂质体作为RNAi载体。正如本申请所讨论的，RNAi的递送是该领域的特殊挑战，不能用目前的标准和普遍可用的方法轻易解决。由于这些原因，申请人以前的公开并不能预期目前的方法或化学成分。

1.定义

为了提供一个对本申请明确一致的认识，为方便起见，这里集中了本申请中，包括规范，例子，以及权利要求所用的特定术语，。

术语“增生症”或“异常增长”是指一个细胞表型，与正常的细胞表型不同，特别是那些直接或间接与疾病，如癌症相关的。

术语“体外”，是指实验条件在受控环境中，而不是在活的有机体中。

术语“体内”，是指实验条件在一个活的有机体，例如，包括但不限于，哺乳动物，人类，动物，植物。

术语“给药”是将一种药物引入到一个细胞，即在体外，或在哺乳动物细胞，即在体内，或一个随后会放回哺乳动物的细胞(即离体)。

术语“促成剂药物”或“促成剂”可交替使用，是指一种通过提高RNAi细胞递送或促进RNAi从细胞质中的载体，内涵体，溶酶体中释放，从而增强在体外或体内的RNAi药物细胞生物利用度的药物。

术语“RNA干扰”或“RNAi”是指通过RNAi药物(例如，“短干扰RNA”，“siRNA”“shRNA”，“短干扰核酸分子”，“短干扰寡核苷酸分子“或”化学修饰的短干扰核酸分子“)。术语“短干扰核酸”，“短干涉RNA”，“RNAi”，“短干扰核酸分子”，“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”)沉默或减少基因表达。

术语“短干扰核酸”，“siRNA”，“短干扰RNA”，“RNAi”，“短干扰核酸分子”，“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”是指任何能够抑制或下调的基因表达或病毒复制的核酸分子，例如，通过介导的RNA干扰(Grimm,Adv.Drug Deliv.Rev.,61,672,2009;Gondi,J.Cell Physiol,220,285,2009;Carthew，136，642,2009;Jinek，457，405,2009;Ghildiyal，Nat.Rev.Genet.,10,94,2009)。RNA干扰是序列特异性，在动物和植物细胞中的转录后基因沉默，是由与被沉默的基因序列同源的双链区域的RNAi药物起动。该基因对有机体可能是内源性或外源性的，整合到染色体中或在转染载体中而不整合到染色体中。该基因的表达完全或部分抑制。RNAi也可能被视为抑制靶RNA的功能；靶RNA的功能可能是完全或部分抑制。

在一些实施方案子中，RNAi可以是双链核苷酸分子，具有自我互补的正义和反义地区，其中反义区域的核酸序列与目标核酸分子或其一部分互补，正义区域与目标核酸分子或其一部分相同。RNAi可以从两个不同的寡核苷酸组装，其中一个链是正义链和另一个是反义链，其中的反义和正义链自我互补(即，每一条链由的核苷酸序列与另一条链的核苷酸序列互补，如同出自同一双链结构的反义链和正义链，例如，其中双链区域约19个碱基对)；其中包括反义区域是与目标核酸分子或其一部分互补，正义区域与目标核酸分子或其一部分相同。另外，RNAi是从一个单一的寡核苷酸合成，自我互补的反义和正义区域是由一种核酸酸或基于非核酸酸基连接部分的连接。RNAi可以是一个双链的，不对称双链的，发夹或不对称的发夹二级结构的多聚核苷酸，具有自我互补的正义和反义区域，其中反义区域是与目标核酸分子或其一部分互补，正义区域与目标核酸分子或其一部分相同。RNAi可以是一个圆形的有两个或两个以上的环结构的单链多聚核苷酸，以及一个包括自我互补的正义和反义区域干的主干，其中反义区域是与目标核酸分子或其一部分互补，正义区域与目标核酸分子或其一部分相同，而其中圆形核苷酸经在体内或体外处理，产生积极的能够介导的RNAi小核酸分子。RNAi药物，也可以由与目标核酸分子或其一部分互补的单链核苷酸组成。就本申请而言，RNAi的分子不必限于天然存在的RNA，而且还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。

术语“RNAi药物”与其他用来描述可以介导序列特定RNAi的核酸分子的词汇同义，例如，短干扰RNA(siRNA)的双链RNA(dsRNA)，微RNA(miRNA)，短发夹RNA(shRNA的)，短干扰寡核苷酸，短干扰核酸，短干扰修饰寡核苷酸，化学修饰siRNA，转录后基因沉默的RNA(ptgsRNA)，及其他。此外，这里所用的“RNAi”与其他用来描述可以介导序列特定NRAi的核酸分子的词汇同义，如转录后基因沉默，转录抑制，或表观遗传学(epigenetics)。这里所用的“siRNA”经常是指用于RNAi治疗的人工核苷酸序列。通常情况下，一个siRNA是由两个核苷酸链，每个链约19至约28个核苷酸组成的双链核酸分子。

短发夹RNA(shRNA)是具有紧密发夹状弯曲的RNA序列，可以用来通过RNA干扰沉默基因的表达。通常使用载体将shRNA引入细胞，并使用一个启动子(例如，U6启动子)，以确保shRNA的表达。这个载体通常可以传递给子细胞，允许基因沉默的继承。shRNA的发夹结构被细胞机器裂解成siRNA，然后将其结合到的RNA诱导的沉默复合体(RISC)上。这种复合体结合并裂解与结合的siRNA相匹配的mRNA。

微RNA(miRNAs)是一类内源性的，单个或双链，约22个核苷酸长的RNA分子，调节多达30%的哺乳动物的基因，在调节细胞分化，增殖和凋亡中有重要作用。现已确认在人类各种肿瘤类型中存在特定的上调或下调miRNA的模式。miRNA通过阻断翻译或造成转录退化抑制蛋白的生产。

术语“缺陷基因”，是指一个因改变面而会致病的基因。

术语“基因敲减”，“敲减”，可以交替使用，是指降低一个生物体的一个或多个基因的表达的技术，无论是通过遗传修饰(生物体的染色体之一的DNA变化)，或以短链DNA或与mRNA或基因相互补的RNA寡核苷酸处理。使用RNAi药物抑制基因的表达，特别是通过mRNA的降解，阻断mRNA的翻译，或阻止mRNA前体转变成mRNA。

术语“抗(基因名称)RNAi”，“反(基因名称)的siRNA”可交替使用，是指用于沉默该基因的siRNA。

术语RNAi药物的“表达”和“转染”可以交替使用，是指递送到细胞内的RNAi的活性。高表达或转染表示目标蛋白质的有效抑制。对绿色荧光双链RNA分子siGLO而言，在递送到一个细胞的细胞质，并从载体或内涵体释放后，表达或转显示为绿色荧光的细胞核积累。

术语“RNAi的细胞内的生物利用度”，是指从载体，内涵体或溶酶体内被释放的完整的，即没有降解的RNAi，并可达到细胞内的RNAi机制，或者具有实现RNA干扰的能力。

术语“RIDES”指的是一个多组分的可用于RNAi药物的递送的RNAi载体系统。RIDES的RNAi传递和表达系统(RNAi delivery and expressionsystem)的缩写。RIDES的组成部分之一是聚乙二醇修饰的脂质体阳离子RNAi载体，PCat脂质体。RIDES的另一组成部分包括紫杉醇，阿霉素，其他微管蛋白活性剂，或其他拓扑异构酶抑制剂中的一个或多个。包含一个或多个这些药物是提高RNAi载体的递送，包括PCat-siRNA，到细胞中，并改善其从细胞质内的RNAi载体，内涵体和溶酶体的释放，以及所产生的基因沉默。

术语“PCat脂质体”和“PCat”可交替使用，是指聚乙二醇脂质体阳离子RNAi载体，包括DOTAP，胆固醇,DOPE,和DDPE-PEG2000,摩尔比为50:30:19:1。

术语“PCat-RNAi”，是指含有RNAi的Pcat脂质体。

术语“装有促成剂”和“含促成剂”可以互换使用。术语“装有促成剂的PCat-RNAi”是指含有RNAi和促成剂的PCat脂质体。促成剂可以是一个或多个微管蛋白活性剂，即包括但不限于，紫杉醇，多西紫杉醇，秋水仙碱，噻氨酯哒唑，长春新碱，卡巴他赛(cabazitaxel)或拓扑异构酶抑制剂，即阿霉素，喜树碱，伊立替康。

术语“Pac-PCat-RNAi”，“Doc-PCat-RNAi”，“Col-PCat-RNAi”，“Vin-PCat-RNAi”是指含有RNAi和促成剂PCat脂质体，相应的促成剂为紫杉醇，多西紫杉醇，秋水仙碱和长春新碱。

术语“载体”是指可以完成基因递送或核酸递送到的载体或其他机制。在某些实施方案中，基因递送或核酸递送，包括RNAi递送，可以通过一些机制来完成，例如，病毒和非病毒来源的载体，阳离子复合物，纳米粒子，脂质体，和其他类似的载体。

术语“载体”和“表达载体”，是指递送工具。例如，RNAi的载体是指RNAi的递送工具，比如举例来说，脂质体；RNAi载体脂质体或RNAi脂质体载体是指这样一种情况，把脂质体作为RNAi的载体；药学上可接受的载体是领域内认可的术语，指含有一种药物的工具或介质，默认为一种有治疗目的的产品。

术语“药物”和“试剂”，可交替使用，是指用于诊断，检测，监测肿瘤或增生性疾病的物质。“药物”，包括小分子，大分子(如肽类，蛋白质，抗体或抗体片段)，核酸(例如，基因治疗结构)，重组病毒，核酸片段(包括，例如，合成核酸片段，siRNA分子，反义分子)，纳米粒子，微粒。

术语“微管蛋白的活性剂”，“抗微管蛋白”，“抗微管”，“抗微管蛋白药物”，或“抗微管药物”是领域内认可的，是指一个通过干扰微管蛋白，微管，有丝分裂纺锤体，或有丝分裂过程阻止细胞分裂的化疗药物。

术语“拓扑异构酶抑制剂”是领域认可的，是指设计用于干扰拓扑异构酶的活性。拓扑异构酶通过正常细胞周期中催化DNA链的磷酸二酯键断裂和重建控制DNA结构的变化。

术语“亚治疗”，“亚毒性”和“非毒性”可以互换使用，是指低于通常用于治疗人类或实验中造成培养细胞杀伤的所用的剂量或浓度。例如，在人体亚治疗剂量为:紫杉醇小于120mg/m²,，多西紫杉醇是小于72mg/m²,，长春新碱是小于1mg/m²,，秋水仙碱口服是小于约3mg，阿霉素小于60mg/m²。

术语“细胞凋亡”根据领域内的标准是指任何非坏死，调节良好的细胞死亡的形式。

术语“易受内涵体-溶酶体运输或溶酶体降解”或“经受内涵体-溶酶体运输或溶酶体降解”可以交替使用，表示药物在内涵体-溶酶体运输或溶酶体内快速降解的倾向。这类溶酶体降解遥药物的例子有寡核苷酸化合物，其中包括反义寡核苷酸，基因治疗结构，以及各种多肽和蛋白质。

术语“细胞质”和“细胞浆”可以交替使用，为领域内认可。

在此申请的某些实施方案中，提供了说明本申请中的一或多个或类似物的形式和应用的药用成分和方法。RNAi或其他dsRNA可能与多肽结合，络合，或共轭，选择性与药学可接受的载体一同制备，如稀释剂，稳定剂，缓冲液，或其他。带负电荷的dsRNA分子可通过任何标准的手段给以病人，带或不带稳定剂，缓冲液，或其他，形成一个适合治疗的组成。当需要使用脂质体传递机制，可以遵循脂质体的标准制备方法。本申请的成分，也可以制成片剂，，胶囊或口服药剂，栓剂直肠给药，无菌溶液，或注射用混悬液，含或不含其他化合物。因此，本申请的dsRNA可以任何形式给药，如鼻腔，透皮，肠外，或局部注射。

术语的“DNA/聚合物复合物”和“DNA/脂质体复合物”是指为用于基因或核酸递送的载体，在荷负电的核苷酸分子和荷正电的载体分子之间形成了一个紧密的复合体。DNA/脂质体复合物中阳离子载体分子是一种脂类分子，例如阳离子磷脂,DOTAP。DNA/聚合物复合物中载体分子是一种非脂质阳离子或多聚阳离子，如环糊精，聚乙烯亚胺，多聚赖氨酸，和多聚组氨酸。有时，携带RNAi如核苷酸分子的阳离子脂质体也被称为DNA/脂质体复合物。

术语“脂质体”通常指两性分子，包括脂类化合物的球形集束或聚集体，通常具有一个或多个同心层的形式，例如单层和/或双层。他们也可能被称为脂质载体。脂质体可以用离子脂质和/或非离子型脂质制备。

术语“阳离子脂质体”指总体上在生理pH值下带正电荷的脂质成分的脂质体。

术语“中性脂质体”指总体上在生理pH值下带中性电荷的脂质成分的脂质体。

术语“脂质”，是指以合成或天然存在的，通常是两性和生物相容性化合物。脂质通常包括一个亲水部分和疏水部分。常用脂质包括，例如，脂肪酸，中性脂肪，磷脂，糖脂，表面活性物质(表面活性剂)，脂肪醇，蜡，萜类化合物和类固醇。

术语“中性脂质”是指任何在生理pH值下不带电或中性的两性离子形式的脂质。这些脂类包括例如，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，脑磷脂，胆固醇，脑苷和二酰基甘油。在一个实施方案中，某些中性脂质，包括胆固醇和其他甾醇衍生物，可以增加脂质体的稳定性和被称为“脂质体稳定脂质”。

术语“DOTAP”是指阳离子脂质分子(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵。

术语“DOPE”是指脂质分子1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺。

术语“DSPE”是指脂质分子1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺。

术语“DSPE-PEG2000”的指的DSPE与聚乙二醇的聚合物。其中聚乙二醇分子量约为2000g/mole。DSPE-PEG2000加入脂质体称为聚乙二醇化脂质体。

术语“聚乙二醇化(pegylated)”或“聚乙二醇化(PEGylated)”可以交替使用，是指以一个或多个聚乙二醇(PEG)侧链分子修饰脂质体或分子。聚乙二醇或聚乙二醇衍生物修饰脂质体有时也被称为“聚乙二醇脂质体”。制备聚乙二醇脂质体的过程中有时简称为“聚乙二醇化(PEGylation)”。

术语“DC脂质体”和“PCat脂质体”是指能够携带RNAi的阳离子脂质体。具体来说，“DC脂质体”是指标准DOTAP：胆固醇50:50的阳离子脂质体。“PCat脂质体”是指范例1描述的由DOTAP：胆固醇：DOPE：DSPE-PEG2000组成的脂质体。

术语“良性”，“癌前病变”，“恶性”是按照领域内公认的含义。

术语“癌症”，“肿瘤细胞”，“肿瘤”，“白血病”，或“白血病细胞”交替使用，是指任何肿瘤(neoplasm意为“新的增生”)，例如，上皮癌(来源于上皮细胞)，腺癌(起源于腺组织)，肉瘤(从结缔组织派生)，淋巴瘤(来源于淋巴组织)，或血液中的癌症(如白血病或红细胞白血病)。“癌症”或“肿瘤细胞”的还被用于指癌组织或肿块，应解释为癌细胞或肿瘤细胞的聚集体，也被用于可能是良性的，癌前病变或恶性的癌症或细胞。通常情况下，癌症或肿瘤细胞表现出各种为领域内认可的标志，例如，生长因子的独立性，缺乏细胞/细胞接触生长抑制和/或异常核型。相比之下，正常细胞通常只能传代培养有限次数，并/或显示各种领域内认可的属于正常细胞的标志(如生长因子的依赖性，接触抑制和/或正常核型)。基因正常的细胞，如果实质性成为异常增长的一部分，并经常在增殖过程中发挥不可或缺的作用也被称为癌细胞或肿瘤细胞。这包括但不限于，肿瘤分泌的因素的影响下的基质和内皮细胞增殖，以及刺激上皮性肿瘤细胞增殖的基质细胞。

术语“细胞”包括任何真核细胞，例如，体细胞或生殖系哺乳动物细胞，或细胞系，如HeLa细胞(人)，NIH3T3细胞(小鼠)，胚胎干细胞，以及其他细胞类型造血干细胞，成肌细胞，肝细胞，淋巴细胞，上皮细胞，如本文所述细胞系。

术语“腹膜”，“腹膜腔”，“腹膜内”，或“腹膜腔内”可以互换使用，都与腹膜或腹腔相关。

术语“腹膜腔”和“腹腔”可以互换使用。

术语“局部地”，“部位地”，“全身地”分别是指以下治疗。“局部”治疗给药比如治疗癌症肿块，或治疗组织或器官，如眼的玻璃体内治疗，关节的内滑膜内治疗等。“部位”治疗给药，比如在一般有癌症转移可能的部位做癌症治疗，或如在有目标器官或组织的一般领域做抗感染治疗。“全身”治疗给药比如例口服，静脉注射，肌肉注射，皮下注射，或意图使药物在主体内广泛分布的吸入。

术语“药学上可接受的载体”是领域内认可的，包括药学上可接受的材料，成分或载体，于本申请内适合对哺乳动物给以化合物。

术语“药物成分”包括可适合用于哺乳动物，例如人类，的制剂。本申请中化合物，作为药品给以哺乳动物例如人类时，可以直接给药或作为含有，例如0.1至99.5%(最好0.5%至90%)的活性成分(例如，治疗有效量)的医药成分与药学上可接受的载体的组合。

术语“主体”意在包括人类和非人类的动物(例如，包括但不限于，小鼠，大鼠，兔，猫，狗，家畜，动物和灵长类动物)。

术语“微粒”是指以约0.1微米到100微米的颗粒，约0.5微米到约50微米，0.5微米到约20微米，更好的情况下，约1微米到10微米，约5微米，或其混合物。微粒可能包括大分子如RNAi。通常微粒可以局部或部位给药。

术语“纳米粒”，是指以约0.1纳米到约1微米，1纳米到1约微米，约10纳米到约1微米，约50纳米到1约微米，约为100纳米到约1微米的粒子。纳米粒子可能包含大分子如RNAi。通常情况下，纳米粒子可以，通过局部，部位，或全身给药用于病人。

术语“粒子”是指纳米粒，微粒，或两者都有。

术语“分解”和“降解”可以交替使用，是指纳米粒子和微粒的分解或聚合物或脂质体的分解。同样，该术语可以指RNAi，蛋白质，治疗药物和其他化合物的通过酶或非酶的方式的分解。

术语“制剂”是领域内公认的将药物包裹到一种剂型中。

术语“肿瘤疏松方法”，是指以凋亡诱导剂“疏松”肿瘤，以减少肿瘤细胞密度从而提高药物的进入的方法。凋亡诱导剂，可用于提高与纳米粒子或微粒结合的RNAi的递送，在这种情况下，与不使用时凋亡诱导剂的预处理相比，纳米粒子或微粒的递送被加强。

术语“肿瘤穿入颗粒”或“TPM”，是指纳米粒子或微粒，其组分可以利用“肿瘤疏松”的方法，能使粒子比不含肿瘤疏松成分的粒子进入到肿瘤更深处。

术语“PLGA”，或“乳酸-羟基乙酸共聚物”是指乳酸(LA)和羟基乙酸(GA)的不同比例组成的共聚物。共聚物可以有不同的平均链长，和相应的不同粘度和聚合物性能的差异。PLGA用于微粒或纳米粒的制备。制备这些粒子的方法描述在序列号为No.11/242，546的专利申请中。

术语“局部化”和“集中”可以交替使用，以表明优先分配在一个特定的地点，例如，肿瘤组织。

术语“生物黏附”意为天然，合成或半合成的物质，粘附并最好强烈粘附到如皮肤，粘膜和肿瘤表面。适合生物胶粘剂包括例如，聚(赖氨酸)，纤维蛋白原，那些从部分酯化聚丙烯酸聚合物中制备的，包括聚丙烯酸聚合物，天然或合成多糖，如纤维素衍生物，包括甲基纤维素，醋酸纤维素，羧甲基纤维素，羟乙基纤维素，果胶，以及硫酸蔗糖和氢氧化铝的混合物。

术语“遗传性疾病”是指任何主体的基因组异常引起的疾病。异常可以从微不足道的到显著-从离散在一个单一的基因的DNA单碱基突变到涉及整个染色体或染色体组的增加或减少的染色体异常。遗传类型包括单一继承(例如，囊肿性纤维化，镰状细胞贫血，马凡氏综合征，血色病)，多因素遗传(例如，镰状细胞，血压高，阿尔茨海默氏症，癌症，关节炎，以及糖尿病)，染色体异常(例如，特纳氏综合征，克兰费尔特综合征)，线粒体遗传(例如，癫痫症和老年痴呆症)。

术语“代谢紊乱”是指一组已知的疾病，其中有新陈代谢紊乱，代谢的不平衡，或次优的代谢发生。本文所述的代谢紊乱，还包括通过调节代谢，可以治疗的疾病，虽然疾病本身可能是或可能不是由特定的代谢缺陷造成的。例如,II型糖尿病即是一种代谢紊乱。

2.方法

在第一个方面，本申请提供了一种促进肿瘤递送RNAi治疗剂的方法。这种方法涉及到肿瘤疏松，包括递送凋亡诱导剂和RNAi的制剂。凋亡诱导剂的目的是使细胞密度降低，以改善肿瘤的RNAi制剂的递送。凋亡诱导剂需要24-96小时的滞后时间，以发挥肿瘤疏松效应。凋亡诱导剂产生的细胞凋亡可以导致细胞密度减少30%，>20%，>10%，4%，或2%。

在某些实施方案中，RNAi是在诱导凋亡后与凋亡诱导剂分开给予。肿瘤疏松中的凋亡诱导剂在给以RNAi或脂质体配方之前用作预处理。与不加预处理相比，这个预处理导致增强的RNAi递送。在给以凋亡诱导剂和RNAi之间要有约几个小时到约96小时，或最好是从约24至约72小时的间隔。

在某些实施方案中，本申请使用了可以同时给以凋亡诱导剂和RNAi的穿入肿瘤的制剂粒子。凋亡诱导剂制成一个快速释放或缓慢释放制剂，而RNAi制成一个长循环或缓释制剂。给药后，迅速释放凋亡诱导剂将导致组织细胞凋亡，长期循环或缓慢释放的RNAi制剂将促进在达到显著细胞调亡后的RNAi递送。凋亡诱导剂的缓释配方，提供持续的组织细胞凋亡，促进RNAi的递送。在一个相关的实施方案中，包裹在长循环或缓慢释放剂型中的RNAi，与凋亡诱导剂在大约同一时间给药。由于循环时间长，将可能在肿瘤细胞凋亡发生后递送RNAi。

在一个实施方案中，本申请提供了一个方法，以促进RNAi的递送或进入到病人腹腔肿瘤中。在一个实施方案中，RNAi用于全身给药。

在第二个方面，本申请提供了提高细胞内的RNAi药物的生物利用度的方法。

如例7所示，可以扰乱微管蛋白-微管动态和拓扑异构酶的促成剂，导致包裹在脂质体内的寡核苷酸，例如，包括但不限于，siGLO，抗K-ras基因siRNA，抗存活素基因siRNA或抗钙紧张素基因siRNA，在细胞内的释放增强。但具有不同的作用机制的其他细胞毒性药物没有此类似作用。促成剂导致RNAi的细胞内的生物利用度增加和活性增强，是令人惊讶的发现，并提供了解决使用非病毒载体高效转染RNAi的主要障碍的一个方法。要进一步明确的是，至少有三个原因可以说明这种方法和在癌症化疗常见的合并用药不同。合并用药是使用两个或两个以上的治疗药物，以实现更大的化疗活性。首先，RNAi疗法与标准化疗相结合时，其目标是实现两种治疗的最佳活性。RNAi疗法目标的实现，是通过阻断内源性蛋白质合成而耗竭该蛋白。由于需要消耗预先存在的蛋白质，可预见这两个事件之间会有时间滞后或延迟。出于这个原因，通常先给予RNAi疗法，然后化疗。相反，本申请要求在RNAi疗法之前，或在同时，给以促成剂。这是因为促成剂的作用是提高转RNAi染效率(因此要求之前或同时给药)。目前的方法与常用的两个或两个以上的积极疗法相结合不同的第二个原因是，常见的做法是根据药物添加和协同作用，所用药物都有治疗作用。相比之下，目前的方法所用的组合中，RNAi如抗存活素基因siRNA，本身是无效的，或者使用的促成剂紫杉醇在没有细胞毒作用(参见示例9)的浓度下。因此本申请中的组合能够产生有效RNA干扰与领域内不同，并且不能预见。目前的方法与领域内两个或两个以上的活积极疗法相结合不同的第三个原因是，如例7所示，只有某些药物，如微管蛋白活性剂和拓扑异构酶抑制剂类，是能够改善RNAi药物的递送，释放和转染。但DNA活性剂如顺铂或抗代谢药物，如5-氟脲嘧啶，则无类似作用。这一发现意味着，RNAi不能常规的或者不加分辨的与化疗药物结合。

在一个实施方案中，RNAi是一个siRNA，miRNA，或shRNA。

在某些实施方案中，RNAi和促成剂按不同方案给药。在以RNAi处理细胞之前，先以促成剂处理细胞1，2，4，8，12或24小时。同时以促成剂和RNAi处理细胞，二者可能分别在两个制剂中或合并在一个制剂中，例如，包括但不限于，同一PCat脂质体制剂。

在某些实施方案中，促成剂是一个或多个任何临床使用的微管蛋白活性剂，其中包括但不限于，紫杉醇，多西紫杉醇，卡巴他赛(cabazitaxel)，长春新碱，长春碱，长春瑞滨(vinorelbine)，安非他命(amphethinile)，美登碱(maytansine)，西马多丁(cemadotin)，根霉素(rhizoxin)，甲基N-[6-(3,4,5-三甲氧苯甲氧)咪唑(1,2)-哒嗪-2-基]氨基甲酸酯，CI-980，多拉司他汀(dolastatin)，埃博霉素(desoxyepothilone)，蒂克霉素(discodermolide)，埃博霉素乙酰胺(epothilone B lactam)，21-氨基埃博霉素(21-aminoepothilone)，BMS-310705,BMS-184476,BMS-188791,RPR 109881A，帕土匹龙(patupilone)，TXD258，考布他丁(Combretastatin A-4)的磷酸盐，软海绵素B(halichondrin B)，ZD 6126，长春氟宁(Vinflunine)，LU103793，E7010，E7389E-7070，T138067，T900607，埃博霉素类似物，甲磺酸伊沙匹隆(ixabepilone discodermolide)，艾日布林(eribulin)，念珠藻素(cryptophycin)，去乙酰长春碱酰胺(desacetyl vinblastine amide)，海鞘素(ecteinascidin)，考布他丁(combretastatins)，IDN-5109，D-24851，D-64131，ZK-EPO或秋水仙碱。微管蛋白活性剂也可以是一个或更多在临床前应用的微管蛋白活性剂，其中包括但不限于，噻氨酯哒唑(nocodazole)，哈米特林(hemiasterlin)，sarcotidicytins  A和B，eleutherobin，laulimalide，isolaulimalide，海洋软珊瑚衍生的天然产物，海洋衍生的微管稳定剂，羟乙基米伏布林(mivobulinisethionate)。

在某些实施方案中，微管蛋白活性剂是紫杉醇，多烯紫杉醇，长春新碱，或卡巴他赛。以0.1-100nM，0.1-50nM,0.1-20nM,0.1-10nM，或0.1-2nM药物浓度处理细胞。以小于药物浓度-时间积1200NM-HR 600nM-hr，400nM-hr，240nM-hr，120nM-hr，60nM-hr，40nM-hr，20nM-hr，或10nM-hr处理细胞。

在某些实施方案中，微管蛋白活性剂是秋水仙碱或噻氨酯哒唑。以1-1000nM,1-500nM,1-200nM,或1-100nM药物浓度处理细胞。以小于药物浓度-时间积12000nM-hr，6000nM-hr,4000nM-hr,2400nM-hr,1200nM-hr,600nM-hr,400nM-hr,200nM-hr,或100nM-hr处理细胞

在某些实施方案中，促成剂是一个或多个拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶II抑制剂包括阿霉素，依托泊苷(etoposide)，安沙吖啶(amsacrine)，替尼泊苷(tenipo side)，ICRF 193，右雷佐生(dexrazoxane)，玫瑰树碱(ellipticine)，表阿霉素，美巴龙(merbarone)，米托蒽醌(mitoxantrone)，吡柔比星(pirarubicin)，鬼臼毒素(podophyllotoxin)，和索布佐生(sobuzoxane)。拓扑异构酶I抑制剂包括伊立替康(irinotecan)，拓扑替康(topotecan)，喜树碱(camptothecin),片螺素D(lamellarin D),2′,3′-双脱氧腺5′-三磷酸，β拉杷醌(β-lapachone)，阿糖胞苷(cytosine β-D-arabinofuranoside)，10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin)，纺锤菌素(netropsin)。

以阿霉素浓度0.1-100nM，0.1-50nM，0.1-20nM，或0.1-10nM处理细胞。以阿霉素浓度-时间积小于1200nM-hr,600nM-hr，400nM-hr，240nM-hr，120nM-hr，60nM-hr，40nM-hr，20nM-hr，或10nM-hr处理细胞。

在某些实施方案中，促成剂包裹于药学上可接受的载体中。在一个实施方案中，使用了临床上常见的制剂。在另一个实施方案中，制剂为对肿瘤有优先递送的纳米粒。在另一个实施方案中，制剂为可迅速释放微管蛋白活性剂的纳米粒。在一个相关的实施方案中，纳米粒在一天之内释放超过10%，20%，30%，40%，50%或60%的所含凋亡诱导剂，并导致在组织中抑制微管蛋白的功能。

在首选的实施方案中，给以RNAi治疗剂期间，组织中的促成剂维持在有效浓度。

本发明的方法可以有效地通过增加细胞内的RNAi药物生物利用度，从而增加RNAi治疗效果而有效治疗与该RNAi相关的基因过度表达特点的疾病。

在第三个方面，本申请提供了增强RNAi递送到肿瘤细胞，并提高细胞内的RNAi药物的生物利用度的方法。这是通过联合应用一个或多个凋亡诱导剂和一个或多个促成剂。在给以促成剂之前或同时给以细胞凋亡诱导剂。凋亡诱导剂的目的是减少细胞的密度，以增强肿瘤的RNAi制剂递送。促成剂的目的是促进RNAi从载体，内涵体和溶酶体释放。

在一个实施方案中，在给以RNAi期间，重复给以促成剂以保持微管蛋白活性或拓扑异构酶抑制的浓度。

在一个实施方案中，凋亡诱导剂与促成剂不同。凋亡诱导剂的包括药物如，紫杉醇，长春新碱，长春碱，长春地辛(vindesine)，长春瑞滨，泰索帝(多西紫杉醇)，卡巴他赛，阿霉素，喜树碱，拓扑替康，伊立替康盐酸盐(Camptosar)，依托泊苷，米托蒽醌，柔红霉素(daunorubicin)，去甲氧柔红霉素(idarubicin)，替尼泊苷，安沙吖啶，表阿霉素(epirubicin)，美巴龙，盐酸吡罗蒽醌(piroxantrone hydrochloride)，5-氟尿嘧啶，甲氨蝶呤(methotrexate)，6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)，6-硫鸟嘌呤(-thioguanine)，磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)，阿糖胞苷(ARA-C)，三甲曲沙(trimetrexate)，吉西他滨(gemcitabine)，阿西维辛(acivicin)，阿拉诺新(alanosine)，吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)，N-膦酰乙酰基-L-天门冬氨酸(PALA)，喷司他丁(pentostatin)，5-阿扎胞苷(5-azacitidine)，地西他滨(5-Aza-2′-deoxycytidine)，阿糖腺苷(ARA的-A)，克拉屈滨(cladribine)，替加氟(ftorafur)，优福(尿嘧啶和替加氟的组合)，5-氟-2′-脱氧尿苷(5-fluoro-2’-deoxyuridine)，5-氟尿苷(5-fluorouridine)，5′-脱氧-5-氟尿苷(5’-deoxy-5-fluorouridine)，羟基脲(hydroxyurea)，dihydrolenchlorambucil，噻唑呋林(tiazofurin)，顺铂，卡铂，奥沙利铂(oxaliplatin)，丝裂霉素，卡氮芥(卡莫司汀carmustine)，马法兰(melphalan)，塞替派(thiotepa)，白消安(busulfan)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，普卡霉素(plicamycin)，达卡巴嗪(dacarbazine)，异环磷酰胺磷酸盐(ifosfamide phosphate)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，氮芥(nitrogen mustard)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)，哌泊溴烷(pipobroman)，4ipomeanol，dihydrolenperone，spiromustine，格尔德霉素(geldanamycin)，细胞松弛素(cytochalasins)，缩酚酸肽(depsipeptide)，醋酸亮丙瑞林(Lupron)，酮康唑(ketoconazole)，他莫昔芬(tamoxifen)，戈舍瑞林(Zoladex)，氟他胺(flutamide)，4′-cyano-3-(4-fluorophenylsulphonyl)-2-hydroxy-2-methy-3′-(trifluoro-methyl)propionanilide，赫赛汀(Herceptin)，抗CD20(Rituxan)，α-干扰素，干扰素β，γ干扰素，白细胞介素2，白细胞介素4，白细胞介素12，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factors)和辐射。促成剂的例子是微管蛋白活性剂和拓扑异构酶抑制剂。

在某些实施方案中，凋亡诱导剂同时也是促成剂。为了达到疏松肿瘤和增强细胞内的生物利用度的综合功能，在使用的初始阶段，药物保持在诱导凋亡浓度。随后，在给以RNAi或RNAi存在时，保持促成剂浓度使其能够提高RNA从载体，内涵体或溶酶体中释放。这些双功能药物的例子有紫杉醇，多西紫杉醇，卡巴他赛，长春新碱，阿霉素。

在第四个方面，本申请提供了提高经内涵体-溶酶体运输或溶酶体降解的治疗药物的生物利用度的方法。

在某些实施方案中，方法中包括联合使用促成剂和治疗药物，相对不使用促成剂，使用促成剂提高治疗药物细胞内相对生物利用度。所说治疗药物为RNAi药物，反义寡核苷酸，基因结构，多肽和蛋白质。治疗药物和促成剂的使用如前所描述的RNAi和促成剂的使用。

在某些实施方案中，经内涵体-溶酶体运输或溶酶体降解的治疗药物，进一步和凋亡诱导剂联合使用，以提高所说的治疗药物的递送到多层组织如肿瘤的细胞中。这些药物的使用如前所描述的RNAi，促成剂和凋亡诱导剂的联合使用，或者以不同的制剂分开使用，或者以不同的制剂同时使用，或者在同一制剂中使用。以下提供一个包括所有三种药物的组合分别给药的一个例子。治疗最初是以细胞凋亡诱导剂预处理。当经过足够的时间达到诱导凋亡和细胞密度降低，即一般约24-96小时，再给以促成剂，同时或延迟后几小时给以RNAi。在一个实施方案中，凋亡诱导剂包裹在快速释放和缓释颗粒中。联合给以该粒子，促成剂和经内涵体-溶酶体运输或溶酶体降解的治疗药物的方法，与以上所述的联合给以该粒子与RNAi的方法相同。在一个实施方案中，所述治疗药物包裹于长循环脂质体或缓释制剂中，以用于治疗药物递送。在这种情况下说的治疗和细胞凋亡诱导剂可以同时使用。

在第五个方面，本申请描述的RNAi转染体外培养细胞的方法，包括以下步骤：

(一)细胞与一个或更多的促成剂接触，

(二)脂质体RNAi制剂处理细胞。

在某些实施方案中，细胞接触足够浓度的一个或多个促成剂，以增强细胞内的RNAi药物的生物利用度。细胞与促成剂的接触可在与RNAi接触之前，或在大约同一时间。

在优选的实施方案中，促成剂是一个或多个微管蛋白活性剂(例如，包括但不限于，紫杉醇，多西紫杉醇，长春新碱，秋水仙碱或噻氨酯哒唑)，或拓扑异构酶抑制剂(例如，包括但不限于，阿霉素)。紫杉醇，多西紫杉醇，卡巴他赛，长春新碱或阿霉素浓度约为10nM并保持约1，2或4个小时。秋水仙碱或噻氨酯哒唑，浓度约10nM并保持约1，2或4个小时。

3.组合物

在本申请中，RNAi药物包裹于脂质体内，或者单独给药，或者与凋亡诱导剂合并给药以增加肿瘤的摄取，或者与使促成剂合并给药以促进siRNA从载体，内涵体或溶酶体中释放增加细胞递送，或者同时与调亡诱导剂与促成剂两者联合使用。所述的凋亡诱导剂，可以用常规方式包裹到一个或更多生理上可接受的载体内。例如，可能会以这些化合物和其生理上可接受的盐和溶剂化物制成，例如，包括但不限于，静脉，腹腔或皮下注射制剂。在一个实施方案中，凋亡诱导剂或使促成剂可以在有靶细胞的局部给药。RNAi，凋亡诱导剂，使促成剂可以不同方式制备，以用于包括全身和局部等不同给药方式。如用于注射，该化合物可以制成溶液或悬浮液，最好在生理兼容缓冲液或生理盐水中。此外，该化合物可制成固体形式，在使用前再溶解或混悬。包括冻干制剂。药物可制成腹腔注射剂，如推注或连续输注。制定的化合物，可通过注射，如注射给药。注射制剂可以单位剂量供给，例如，在安瓿或有防腐剂的多剂量的容器中。其他制剂的形式和组成，在以下几个方面描述。

在第六个方面，本申请提供了用于凋亡诱导剂的组合物。

在某些实施方案中，凋亡诱导剂，是任何领域内所用的凋亡诱导剂，并以在临床上常见的配方使用。在一个优选实施方案中，凋亡诱导剂是紫杉醇，多西紫杉醇，卡巴他赛，或阿霉素，以临床上常见的配方使用，例如，包括但不限于，紫杉醇(Taxol)，Abraxane泰索帝Jevtan阿霉素，阿霉素(Doxil)。

在一个实施方案中，细胞凋亡诱导剂包裹于载药的PLGA颗粒中，随着时间的推移释放凋亡诱导剂。

在某些实施方案中，载药的PLGA颗粒包括快速释放组分，一天内释放大于10%，20%，30%，40%，50%，或60%的凋亡诱导剂，造成组织中的细胞凋亡，同时包括一个或多个缓慢释放组分，在几天，几个星期或更长的时间释放凋亡诱导剂。两个组件的结合可以更好的控制药物释放，通过一个有最初突释的制剂达到快速的早期释放和晚期缓慢释放。凋亡诱导剂可以是任何领域内所用的凋亡诱导剂，最好是紫杉醇或多西紫杉醇。PLGA颗粒是微粒或纳米粒。一个典型的制剂将包含药物不超过制剂的总重量的30%，15%，10%，5%，4%，3%，1%。有时，为了实现所需的释放率，加入释放促进剂，如吐温20，吐温80，肉豆蔻酸异丙酯，β-乳糖，或邻苯二甲酸二乙酯。代表性的粒子，例如，快速释放的50:50乳酸甘醇酸的PLGA颗粒，平均直径4至6微米，玻璃化转变温度低于体温(例如，30℃)，～4%的紫杉醇载药量，一天内～70%的药物释放率。代表性缓释是含75:25乳酸，甘醇酸的PLGA颗粒，平均直径有3至6微米，玻璃化转变温度在体温以上(如50℃)，～4%的紫杉醇载药量，并在第一天～5%的初始突发药物释放率，然后以较慢的释放率在七周内累积释放30%。玻璃化转变温度低于人体温度(Tg)的PLGA颗粒增强粒子的选择性粘附到肿瘤组织。其他方式也可以使粒子黏附到肿瘤组织，如使用交联聚(赖氨酸)以纤维蛋白原包衣，或由其他领域内认可的方法，增加其的生物黏附性能。该大小的粒子及其他的物理特性是适合部位递送，例如腹腔递送。类似较小的粒子，最好小于200纳米，150纳米，100纳米，80纳米，可以考虑静脉给药。凋亡诱导剂包裹于优先递送到肿瘤细胞的纳米粒子。

在第七个方面，本申请提供RNAi载体组成。制备有效的用于RNAi药物递送的脂质体需要同时克服多方面的困难而达到使载体同时具备多方面促进活性的功能。例如，脂质载体的这些功能包括，需要与RNAi结合或复合，保护RNAi免于清除，避免颗粒聚集，避免网状内皮系统清除，具备最小的毒性，能够达到目标组织，能够到达目标细胞，能够进入靶细胞，能够从内涵体脱离，能够避免溶酶体降解，能够在细胞质中释放完整的RNAi以发挥它的RNAi活性。如在发明综述所说，同时克服这些众多的决定因素已被证明是制备临床上适用的载体的几乎难以逾越的障碍。

为了寻找一个有用的RNAi制剂，研究者需要从多种可能性中进行选择。例如，申请者考虑过载体的各种形式，包括脂质体，微乳液，乳液，胶束，纳米粒子，纳米球，纳米囊，药质体(pharmacosomes)，聚合物组装聚集体(polymersome)。脂质体被选中后，仍有大量的选择项。例如，脂质体的主要组成部分，经常分为至少四类：阳离子脂质，中性磷脂，聚乙二醇脂质，稳定化脂质。阳离子脂质有络合和保护RNAi分子的优势。许多阳离子脂质已在领域内有所描述，包括DOTAP，(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)Propyl]-N,N,N-trimethylammonium Chloride，DOTMA)、N¹-胆固醇基-氧基羰基-3,7-二氮杂壬烷-1,9-二胺(N¹-cholesteryl-oxycarbonyl-3,7-diazanonane-1,9-diamine,CDAN)、3β[l-鸟氨酰氨-氨甲酰基]胆固醇(3β[l-ornithinamide-carbamoyl]cholesterol,O-Chol)、氨基甲酸酯类连接的多胺胆固醇衍生物、二油基-N,N-二甲基氯化铵(dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride,DODAC)、二甲基双十八烷基铵、双十八烷基二甲基溴化铵(N,N-distearyl-N,N-dimethyl-ammonium bromide，DDAB)、3β-(N-(N′,N′-二甲基氨基乙基)-氨甲酰基)胆固醇(3β-(N-(N′,N′-dimethylamino-ethane)-carbamoyl)cholesterol,DC-Chol)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(N-(1,2-dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammoniumbromide,DMRIE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N-(2-(sperminecarboxamido)ethyl)-N,N-dimethylammoniumtrifluoroacetate,DOSPA)、双十八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺(dioctadecylamidoglycyl carboxyspermine,DOGS)、二氧油丙基二甲其氯化铵(N-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N-dimethylammonium chloride，DODMA)和二油基二甲基丙胺(1，2-Dioleoyl-3-dimethylammonium-propane，DODAP)。另外，其他的阳离子分子，可以加入脂质双层以与RNAi结合。例如，阳离子聚合物和树枝状聚合物，比如，包括但不限于，聚-L-赖氨酸，聚乙烯亚胺(PEI)，聚-D，L-乳酸-CO-羟基乙酸共聚物(PLGA)，壳聚糖，明胶，聚乙酰丙烯酸，聚酰胺(PAMAM)，聚(亚胺)(PPI)和环糊精的阳离子聚合物。在这些超过16个选项中，申请人选定的DOTAP作为RNAi传递系统，PCat中的阳离子脂质。领域内认为，DOTAP的使用是有问题的。例如，含DOTAP的脂质体与炎症反应的毒性，并免疫反应启动相关。如(Wu,AAPS.J.,11，639,2009)，Landen等使用含DOTAP的脂质体也显示没有达到有发挥治疗作用靶细胞(Landn,Jr.,CancerRes.,65,6910,2005b)。因此，领域内提醒谨慎使用DOTAP。因此，本申请发现含DOTAP的脂质体提供有效安全RNAi递送是令人惊讶和意外的。

中性磷脂被领域内所知为毒性小，但可以减弱细胞摄取或减少的siRNA装载效率。中性脂质体和阳离子脂质体显示不同的药代动力学，生物分布，摄取和细胞内机制。与阳离子脂质体相比全身给药后中性脂质体不易与循环系统中负电成分相作用。阳离子脂质体在全身给药后可以结合，并被摄取进入血管内皮细胞，而阴离子和中性脂质体一般都不会。带正电的脂质体结合带负电荷的细胞表面成分并主要是通过内吞作用(例如，硫酸肝素蛋白多糖和整合素)触发细胞摄取。再次，许多中性磷脂被称为领域内所知，包括鸡蛋卵磷脂(EPC)、二月桂酰基磷酸卵磷酯(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、豆蔻-1-2-棕榈酰胆碱(MPPC)、棕榈-1-2-豆蔻酰胆碱(PMPC)、棕榈-1-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC的)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、二肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、1,2-硬脂酰-甘油-3-磷酸(DAPC)、1,2-花生酰基卵磷脂(DBPC)、1,2-双二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷酸卵磷酯(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷酸卵磷酯、1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)与1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE)、1,2-十四酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰磷脂酰基乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺。从以上22个选项中，申请者挑选了DOPE。

胆固醇往往添加到脂质体，据说提高脂质体的稳定性，增加储存寿命。这个稳定的原因了解很少。申请人在一个新的阳离子脂质体配方中添加胆固醇稳定脂质。

自从发现长而柔性的亲水聚合物链作为表面改性剂连接到脂质体，可以减少与血浆蛋白的相互作用，最大限度地减少由RES系统的脂质体的识别，并延长循环时间以来，已生产大量的这种亲水聚合物。最常用的亲水性聚合物是聚乙二醇(PEG)，其与脂质化合以锚定到脂质体的脂质双层。例如，一个应用于脂质体的聚乙二醇结合脂质的商业应用供应商在其网站上提供15个不同的聚乙二醇脂质(NOF Corporation,http://www.Phospholipid.Jp/Phospholipid_2-3.Html,2010),其中包括N(羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-双十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE-PEG 2000)和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-双十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE-PEG5000)。其他聚乙二醇脂质包括但不限于，锚定胆固醇的聚乙二醇。选择聚乙二醇脂质影响脂质体性能，如在主体内的流通时间。

其他加入到脂质体的成分，往往在一方面以改善他们的表现而在另一方面损害其表现，包括，MPG(从HIV-1gp41的蛋白质疏水性融合区域，以及SV40LT抗原的亲水性核本地化序列中获得的一种多肽)，TAT肽或TAT衍生的生聚氨基甲酸酯。

一个有效的脂质体载体的制成，要求从多于16种阳离子脂质，多于22种中性磷脂，多于15种聚乙二醇脂质中选择成分，总共有多于5280种组合。选定的成分，还有多种的浓度可以选择。例如，脂质体颗粒，含0%，1%，2%，5%和>5%聚乙二醇脂质有明显不同的特点。四个成分，每个有五个浓度的组合，保守的估计数量超过66万(5280×5³)。5³，而不是5⁴，是因为一旦其他的三个组成部分的浓度已被选中，在第四部分的浓度就是固定的。超过66万的组合表明，即使领域内的已经具有各种脂质成分的优点和缺点的一般原则，普通技能的人员没有大量的实验将不能够发现有效的RNAi载体。因此，申请人的发现，一个特定的脂质体配方可以成为一种有效的在体内应用RNAi载体是不能容易地为领域内所预期。

在某些实施方案中，RNAi包裹于脂质体载体内。在一个实施方案中，RNAi制成载有RNAi的脂质体复合物或纳米颗粒。RNAi的载体脂质体的组成，包括一个或多个阳离子脂质，一个或多个的中性磷脂，一个或多个脂质体稳定脂质，一个或多个聚乙二醇脂质。在一个实施方案中，本申请中的的RNAi载体脂质体的组成包括阳离子脂质DOTAP，中性磷脂DOPE，脂质体稳定脂质胆固醇，聚乙二醇脂质DSPE-PEG2000。在首选的实施方案中，脂质的摩尔比例，DOTAP，胆固醇，DOPE，DSPE-PEG2000是50:30:19:1。在最优实施方案中，RNAi载体脂质体的组成，是例1中所述的聚乙二醇脂质体PCat。

在一个实施方案中，RNAi和阳离子脂质之间的电荷比是1:1和1:10，1:3和1:6之间，或约为1:4。

在一个实施方案中，RNAi在脂质体载体被细胞摄取后才释放。

在一个实施方案中，脂质体的最终粒度约1000纳米，约800纳米，约600纳米，约400纳米，约为200纳米，约150-180纳米，约120-140纳米，约100-120纳米，大约100纳米，约为50纳米或约20纳米。

在一个实施方案中，RNAi的载体脂质体，与药学上可接受的辅料相结合。

在某些实施方案中，RNAi被包裹于脂质囊泡或脂质体载体中。制剂最好用带正电的脂质，中性脂肪，胆固醇或类似的甾醇，带负电荷的脂质混合物制备。带正电的脂质可以是领域内所知的阳离子脂质之一，例如DOTAP，DOTMA或类似物。中性和带负电荷的脂类可以是任何天然或人工合成的磷脂或单，双，或甘油三酯。天然磷脂通常是源于动物和植物，如卵磷脂，脑磷脂，鞘磷脂，磷脂，或磷脂。合成磷脂，通常是那些具有相同脂肪酸，包括，但不仅限于，二豆蔻酰磷酯酰乙醇胺，二油酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷酰胆碱及相应合成磷脂酰基乙醇胺和磷脂酰基甘油的。中性脂质是磷脂酰胆碱，心磷脂(cardiolipin)，磷脂酰基乙醇胺，单，双或三酰甘油，或类似物。带负电荷的脂质，包括磷脂酰基甘油，磷脂酸或类似的磷脂。其他添加剂，如胆固醇，糖脂，脂肪酸，鞘磷脂，前列腺素，神经节苷脂，neobee，囊泡，或任何其他天然或合成两性分子也可以被用于脂质体制备，如传统所知的脂质体的制备。

在阳离子脂质载体制备中，阳离子脂质浓度可以是约0.1mole%和100mole%，25到65mole%，或40至60mole%之间。中性脂质浓度可以在0和99.9mole%，0至50mole%，或15至35mole%之间。为制备带净的正电荷的脂质载体或脂质体，带正电的组分的数量必须超过带负电荷的组分。带负电荷的脂质，可以约0至49mole%或0至40mole%之间。胆固醇或类似的甾醇可在0至80mole%，20至60mole%或30至50mole%。

包括至少一个两性脂质的脂质配方，可以自发组装，形成粒度不均一的初级脂质体。因此，根据首选方法，本发明的脂质成分包括至少一个种阳离子脂质，并根据例1的程序制备脂质体。脂质溶解在溶剂，如氯仿中，蒸发干燥并在玻璃容器内表面形成薄膜。当重新悬浮在水性溶剂中，两性脂质分子组装成初级脂质体。如果在水溶剂有其他分子，例如生物活性物质，他们将被包裹进脂质体内。否则，将形成空脂质体。

以冻融手段可将脂质体粒度降底到需要的平均直径。本发明的脂质体配方在用于转染程序之前被制成大小均匀的载体，根据文献上已经发表的和领域内已知的方法，例如，由Felgner所述的将自发形成的脂质体在水溶液中超声处理(Felgner，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，84，7413，1987)。为制备适合在体内生理情况下应用的有单层结构并大小均匀，粒度在约50到200微米的脂质体，最好是用冻融和挤压过程处理初级脂质体。

包括但不限于，通过阴性RNAi分子和阳离子脂质体在水介质中的直接结合，RNAi可纳入脂质体。也可以用领域内的其他方法。

在第八个方面，本申请提供用于促成剂的组合物。

在某些实施方案中，促成剂是一个或多个的微管蛋白活性剂或领域内已知的拓扑异构酶抑制剂。在优选的实施方案中，促成剂是紫杉醇，多西紫杉醇，卡巴他赛，长春新碱，秋水仙碱，噻氨酯哒唑或阿霉素。促成剂包裹于临床应用的配方中。促成剂制成简易的，比如在体外转染实验用的溶液。促成剂被包裹于如纳米粒子中。促成剂制成如上面描述的用于那些细胞凋亡诱导剂的快速释放和缓释颗粒。

制备包含促成剂的脂质体可以用任何领域内已知的方法。例如，已经有一些制备紫杉醇脂质体的方法。传统的紫杉醇脂质体的载药量约为3mol%，采用先进的方法在脂质体配方中使用的形成口袋的脂质可进一步增加至7%(Koudelka,J.Pharm.Sci.,99,2309,2010)。聚乙二醇化脂质体可以抑制脂质体的药物释放和提高血浆中脂质体的稳定性。在室温透析下，传统和聚乙二醇脂质体24小时内释放55%和33%的紫杉醇，6小时内释放低于30%和20%的紫杉醇(Yang，Int.J.Pharm.,338,317,2007)。脂质体制剂可以增加紫杉醇消除半衰期(Cabanes,Int.J.Oncol.,12,1035,1998)。静脉注射后，通常临床配方(Taxol)，传统和聚乙二醇脂质体的紫杉醇最终半衰期分别为1.65，5.05，和17.8小时，并且传统和聚乙二醇脂质体配方在6小时内达到最大的肿瘤药物浓度(Yang，Int.J.Pharm.,338,317,2007)在另一个例子中，阿霉素脂质体配方，Doxil为领域内熟知，并应用于临床。一般而言，大多数药物可以包裹到脂质体内。例1提供了几个联合使用促成剂和RNAi的脂质体的几个例子。

在一个实施方案中，脂质体配方包含相对于脂质总重的1%，0.4%，0.2%，0.1%，0.06%，0.04%，0.02%，0.01%，或0.005%重量比的促成剂。

在一个相关的实施方案中，促成剂是紫杉醇，并且紫杉醇处理细胞的浓度是0.1-100nM，0.1-50nM 0.1-20nM，或0.1-10nM。

在第九个方面，本申请提供包括一个或更多促成剂和RNAi载体组合的组合物。组合被称为RNAi的传递和表达系统(RIDES)。RIDES由两部分组成。一个组分是RNAi。第二部分是一个或多个促成剂。两个RIDES组分的结合使用，可提高细胞内的RNAi药物的生物利用度和RNAi转染的有效性。

在某些实施方案中，两个RIDES组分制成单一的实体。例如，RNAi和促成剂共同包裹于同一脂质体，所以RNAi和促成剂将同时给以主体。例1所示的的几个例子为同时含有RNAi和促成剂单一脂质体配方，。

在某些实施方案中，两RIDES组分包裹于不同配方中并分别给药。例如，RNAi治疗剂包裹在脂质体，促成剂包裹于另一个配方，两种药物在同一时间或在不同的时间给以主体。在一个实施方案中，促成剂在RNAi之前给药。例1中的PCat脂质体是可提供有效RNAi递送的脂质体的例子。

在一个实施方案中，RNAi包裹于脂质体内，而促成剂包裹于在药学上可接受的配方中，两种配方在使用前合并后用于细胞。其中细胞可以是培养细胞，也可以是在主体内的细胞。

在另一个实施方案中，RNAi包裹于领域内认可的载体而非阳离子脂质体。例如，所说的载体可以是聚合物复合物(polyplex)，中性脂质体，病毒载体，或其他可携带RNAi并可被递送到细胞的载体。

在第十个方面，本发明提供一个用于RNAi转染试剂盒，包括RNAi转染体外培养细胞的方法说明，和需要进行转染的材料。

在某些实施方案中，试剂盒中的材料，包括RNAi，脂质体脂质或脂质体，促成剂，缓冲剂，稀释剂，移液器，或其他必要试剂。在一个实施方案中，这些材料包括预分装的RNAi药物，脂质体RNAi载体，促成剂，缓冲液和稀释剂。在一个更优选的实施方案中，这些材料将包括预分装的RNAi药物，含有促成剂，缓冲液和稀释剂的脂质体RNAi载体。

在某些实施方案中，该试剂盒是用于转染体外培养细胞或在主体内的细胞。试剂盒的组分的数量将取决于要进行的实验类型。比如，转染培养细胞所用的数量可以是参考实验范例7-12的数量。转染主体中的细胞，例如，实验用小鼠，数量可参考实验范例3-4中使用的数量。

在某些实施方案中，该试剂盒包括以上所述的说明和材料，但没有RNAi。这是因为RNAi为普遍存在的核酸降解酶所降解，通常是不稳定的。另一个原因是，用户可以定制载体脂质体中的RNAi。该试剂盒将包含如何将要测试的RNAi加入脂质体的说明，以获得最后的脂质体的RNAi产品。

在第十一个方面，本申请提供经内涵体-溶酶体运输或溶酶体降解的治疗药物组合物。

在某些实施方案中，组成包括促成剂和所述治疗药物的组合。所述的治疗药物的例子，可以是RNAi药物，反义寡核苷酸，基因结构，多肽和蛋白质。所说的治疗药物，一般最有利的是包裹于脂质体内，以避免在生物环境中迅速降解。一个例子是在例1中描述的用于RNAi药物PCat脂质体。所说的治疗药物和促成剂的使用与上面描述的RNAi和促成剂的使用相同。

在某些实施方案中，促成剂和所说的治疗药物进一步与细胞凋亡诱导剂联合。这些成分包括上述各种药物的配方。这些组合物的使用与以上所说的RNAi，促成剂和凋亡诱导剂的使用相同，或以不同配方分开使用，或以不同配方同时使用，或以同一配方使用。以下提供一个例子包括所有三种药剂但分开使用的组合。最初通过细胞凋亡诱导剂的预处理。当经过足够的时间达到诱导凋亡和细胞密度降低，即一般约24-96小时，再给以促成剂。RNAi同时或延迟后几小时使用。

在一个实施方案中，由一个凋亡诱导剂速释的配方，和一个促成剂的缓释配方的组成，并联合含有治疗剂长循环脂质体。在另一实施方案中，凋亡诱导剂的配方为速释和缓释颗粒的组合。

4.示范用途

在某些方面，本申请中的的方法和成分选用于治疗由缺陷基因或其衍生的蛋白质引起的疾病。在一方面，疾病可以是癌症，代谢，感染，炎症，荷尔蒙或遗传性疾病。在另一个方面，将要治疗的主体有与基因缺陷相关的某种疾病。

在某些实施方案中，有缺陷基因的细胞，是一个主体，包括但不限于，一个病人中的细胞。促进细胞内释放和转染的RNAi药物的方法为对病人的治疗。在一个实施方案中，病人患有一种疾病，可以通过改变在某些病人的相应细胞中的蛋白表达改善疾病的症状，病情恶化，或疾病的治疗效果。

在某些实施方案中，细胞是癌细胞，治疗是改善病人的癌症。在一个实施方案中，病人带有一个或多个以下疾病：纤维肉瘤，肌肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管肉皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，胃癌，一个或多个食管癌，结肠癌，直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，子宫癌，头部和颈部癌，皮肤癌，脑肿瘤，鳞状细胞癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管细胞癌，绒癌，精原细胞瘤，胚胎癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体，血管母细胞瘤，听神经瘤，神经胶质瘤，脑膜瘤，黑色素瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，白血病，淋巴瘤，卡波济氏肉瘤，急性早幼粒细胞白血病(APML)，急性髓细胞性白血病(白血病)，慢性粒细胞性白血病(CML)的急性淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞白血病(CLL)的，幼淋巴细胞白血病(PLL)的，多毛细胞白血病(HLL)，瓦尔登斯特的巨球蛋白血症(WM)，，非何杰金氏淋巴瘤，周边T细胞淋巴瘤，成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)，红细胞白血病，淋巴瘤，霍奇金病，胚胎癌，或胚胎畸胎瘤。

下面是这些方法和组合物的使用例子。在首选的实施方案中，接受治疗的病人细胞为高表达Hedgehog信号的胰腺癌细胞。Hedgehog信号可以致肿瘤的基质细胞的生长率增强。可能的治疗包括给以例1描述的包裹于PCat脂质体内的针对Hedgehog信号的siRNA(包括但不限于，针对sonichedgehog,Gli转录因子家族或Smoothened表达的siRNA)。同时全使用亚治疗剂量的促成剂。下面是促成剂的典型用法。一个例子是给以紫杉醇，使药物在病人的血浆中的浓度-时间积达到小于1200nM-hr，600nM-hr，400nM-hr，240nM-hr，120nM-hr，60nM-hr，或40nM-hr。要达到40nM-hr紫杉醇的剂量，在人类病人需要约20μg/m²的紫杉醇剂量。在给以紫杉醇不到四小时或最好不到一小时后，使用RNAi。RNAi的剂量在最初选用一个低剂量，例如，人类病人120nmol/m²，然后依据领域内的标准方法，并根据毒性和活性在随后的病人中增加用量。

也可使用其他的促成剂。一个例子是噻氨酯哒唑。在一个实施方案中，病人接受较小的和亚治疗剂量，使药物在病人的血浆中的浓度-时间积达到小于从12000nM-hr，6000nM-hr，4000nM-hr，2400nM-hr，1200nM-hr，600nM-hr或400nM-hr。在给以噻氨酯哒唑不到四小时或最好不到一小时后，使用RNAi。其他促成剂同样可以根据药效和药代动力学确定使用剂量。例如，多西紫杉醇，长春新碱，阿霉素可以使用与紫杉醇相近的浓度-时间积，而秋水仙碱可以使用与噻氨酯哒唑相近的浓度-时间积。

另外一个例子，所用的细胞高表达Ras癌基因(H-ras，K-ras，或N-ras)，导致肿瘤加速生长或肿瘤化疗耐药。一个可能的治疗方法是如本申请实施例1中所述，包括给以一个包裹于PCat脂质体内，针对Ras信号的siRNA(包括PI3K，AKT，MEK，或ERK)。病人将接受较小的亚治疗剂量的促成剂，例如，紫杉醇，如以上所述的针对Hedgehog信号的治疗。

在另一个例子中，所用的细胞显示增强Wnt/钙紧张素的表达信号，导致肿瘤加速生长或肿瘤化疗耐药。一个可能的治疗方法是如本申请实施例1中所述，包括给以一个包裹于PCat脂质体内，针对钙紧张素的siRNA。病人将接受较小的亚治疗剂量的促成剂，例如，紫杉醇，如以上所述的针对Hedgehog信号的治疗。

在另一种实施方案中，可以通过RNAi治疗控制的疾病的例子有，包括但不限于，遗传性疾病，代谢性疾病，传染病。在由RNA病毒引起的传染病，如，包括但不限于，HIV-1，HIV-2，A型肝炎，C型肝炎，RNAi序列与病毒RNA的一部分互补，从而通过RNA干扰切断病毒RNA。其他线虫和某些致病原虫引起的传染性疾病，依赖于RNA介导的过程以识别和入侵靶细胞。这些RNA介导的过程，可以成为RNAi疗法的靶点。更普遍的，任何类型的病原体，包括病毒，细菌，真菌，寄生原虫，线虫等引起的传染病，都可以用RNAi疗法治疗。在遗传性疾病和代谢性疾病，蛋白的表达可以用siRNA治疗逆转。可能可以用RNAi疗法治疗遗传和代谢性疾病的例子是，包括但不限于，眼睛疾病，如年龄相关性黄斑变性，糖尿病视网膜病变，糖尿病性黄斑水肿，青光眼，皮肤疾病，如先天性厚甲，或中枢神经系统疾病，如神经退行性疾病，肌萎缩性侧索硬化症，亨廷顿氏病，帕金森氏病。

在某些实施方案中，通过全身，局部或部位给以RNAi和促成剂。在一个实施方案中，这些药物是通过部位给药。在一个实施方案中，这些药物的使用是直接局部注射到一个容易达到的器官或直接注射到一个容易达到的器官的邻近区域。例如，包括但不限于，玻璃体腔注射治疗眼疾病，滑膜腔内治疗关节疾病，膀胱肌肉注射治疗膀胱疾病。另一个例子是如例2所示的腹腔给药。

在某些实施方案中，所说细胞是在哺乳动物体内。哺乳动物是，例如，包括但不限于，小鼠，大鼠，啮齿类动物，兔，狗，猫，牛，猪，马，猴。哺乳动物包括人类。

在另一个实施方案中，要治疗的病人是患有胰脏癌或卵巢癌，已扩散到腹腔。以上所述的配方，将用于治疗在腹腔的和毗邻腹腔组织中的肿瘤，腹水肿瘤或转移进入腹腔的肿瘤。

在一个实施方案中，这些制剂用于治疗易于直接给药的器官或区域内的肿瘤，例如，在一个或多个位于腹腔内或相邻的组织，膀胱组织，脑组织，前列腺组织，或肺组织。

在优选的实施方案中，细胞来自胰腺癌，乳腺癌，前列腺癌，头颈部癌，卵巢癌。

在某些实施方案中，细胞是一种组织培养细胞。本申请的方法，通过使用低浓度促成剂提高RNAi转染，是温和并且方便的方法。

下面的例子表明，本申请已经被实施过，但不应被解释为限制本申请。在本申请中，除非另有说明，所有的百分比，比例和用量，均按重量计算。

实施例

下面列出的例子描述了使用以下的一般方法所进行的研究。

使用了五种不同的RNAi。K-ras siRNA(sc-35731)和钙紧张素siRNA(sc-29209)来自Santa Cruz Biotechnology。抗野生型存活素的存活素siRNA来自麻萨诸塞州丹佛(Danvers,MA)Cell Signaling Technology。无靶点siRNA(siGENOME，无靶点siRNA＃1)和siGLO(D 001630)来自ThermoScientific Dharmacon。无靶点siRNA包含一个随机的核苷酸序列，不抑制任何已知的人类，小鼠或大鼠的基因表达。

存活素和钙紧张素为化疗耐药基因。K-ras基因是一种癌基因。抑制这些分子产生抗肿瘤活性，或增强其他细胞毒治疗的功效，如化疗等。siGLO为带荧光的22个核苷酸的RNA双链，不与功能性siRNA干扰或竞争。siGLO包含核转运肽，可使释放到细胞质中的siGLO转运到细胞核(DharmaconProducts Technical Support，Http://www.Dharmacon.Com/UploadedFiles/Home/Resources/Product_Literature/Siglo-Green-Red-Tech-Note.Pdf；2007;DharmaconProducts Technical Support,Http://www.Sorvall.Com/EThermo/CMA/PDFs/Various/File_5514.Pdf，2008)。

促成剂包括微管蛋白活性剂(包括但不限于，紫杉醇，多西紫杉醇，cabazitaxel，秋水仙碱，噻氨酯哒唑，长春新碱)和拓扑异构酶抑制剂(包括但不限于，阿霉素)。

使用了六个阳离子脂质体作为RNAi载体。其中的一个配方，包括50:50(摩尔比)的DOTAP：胆固醇，被领域内(包括但不限于，美国专利6413544)称为DC脂质体。第二配方，包括摩尔比为50:30:19:1的DOTAP：胆固醇：DOPE：DSPE-PEG2000，被称为PCat脂质体。第三到第六配方包含与PCat脂质体中相同种类和摩尔比的脂质，加上少量的促成剂，即，紫杉醇，多西紫杉醇，秋水仙碱，或长春新碱，并称为Pac-PCat，Doc-PCat，Col-PCat，和Vin-PCat。第二个到第六个配方都是新的，尚未为领域内报道。

RNAi可以是游离态(即没有纳入到脂质载体，称为游离RNAi)或包裹于脂质载体内。后者按照所用的载体即PCat或DC脂质体，称为PCat-RNAi或DC-RNAi，。

在促成剂与RNAi分别给药的情况下，无论是以预处理或联合给药形式，促成剂溶解于细胞培养液中。

转染效率最低的近融合细胞(>80%融合)用于转染实验。融合细胞更接近类似于体内细胞彼此接触的成长情况，。

体内抗肿瘤活性在荷肿瘤动物中测定。

体外抗肿瘤活性使用microtetrazolium法(MTT)在培养细胞上测定。此法测量细胞降低MTT法染色的能力，一般用于测量细胞总数。

RNAi疗法的有效性是通过用免疫印迹法监测靶基因mRNA表达的蛋白质水平。在这类实验中，RNAi是抗存活素，K-ras，或钙紧张素的siRNA。

研究RIDES提高细胞内的RNAi的生物利用度(即提高RNAi的细胞质递送和RNAi从脂质体，内涵体或溶酶体的释放)的有效性的方法是利用共聚焦荧光显微镜监测细胞内RNAi和脂质载体的转运和位置。在些类实验中，RNAi是siGLO。siGLO显示绿色荧光。为监测脂质体的位置，在制备过程中，罗丹明标记的脂质(红色荧光)被添加到脂质体中。siGLO-脂质体的摄取到细胞内产生散在的红色和绿色荧光信号。红色和绿色信号的共定位表明，siGLO保留在脂质体内，而红色和绿色荧光信号分离表明siGLO从脂质体释放。同样，在细胞核中的有绿色荧光表示siGLO已经从内涵体和脂质体载体释放，这是因为只有游离siGLO，因其核转运肽，可以进入细胞核。

例1

RNAi脂质载体的制备

阳离子脂质体的制备如下。每个脂质按所需重量混合并溶于90:10体积比的氯仿和甲醇的混合物中。制备Pac-PCat-RNAi时，在溶解脂质中加入所需量的紫杉醇。紫杉醇加入量按重量比为脂质总重的0.04%。在典型体外实验的培养液中，0.04%的紫杉醇重量比提供总共10nM当量浓度的紫杉醇，而0.2%的紫杉醇重量比可提供50nM的当量浓度。对于Doc-PCat-RNAi，Col-PCat-RNAi和Vin-PCat-RNAi，则加入适量多西紫杉醇，秋水仙碱和长春新碱，以提供培养液当量浓度为多西紫杉醇10nM，秋水仙碱100nM，长春新碱10nM。对于典型的总量为10毫克的脂质，需要5毫升氯仿/甲醇。溶解脂质置于一个圆底烧瓶中，有机相以氮气流蒸发除去后，在烧瓶内的玻璃表面上形成薄的脂质层。10毫克脂质，可用体积10毫升的圆底烧瓶。脂质层在干燥器中真空干燥12个小时。随后的水化过程为加入无RNase的缓冲液(每10毫克总脂质加1毫升)，在60℃水浴至少两个小时，并每隔20分钟轻轻摇动，以形成脂质体悬浮液。悬浮液通过装有滤膜的挤出器，以控制脂质体的粒度到合适的大小，例如，包括但不限于，使用100纳米滤膜，以获得直径约为100纳米的脂质体。

如制备包裹RNAi的阳离子脂质体，可将脂质体混悬液与RNAi的储备溶液(浓度2μM到10μM)在室温下混合。根据RNAi对DOTPA的电荷比例为1:4计算RNAi的用量。

例2

RIDES加肿瘤疏松在体内有效：腹腔给药治疗腹腔肿瘤

实验在荷腹腔HS766T胰腺癌的免疫抑制小鼠进行。肿瘤细胞注射到小鼠腹腔，导致肿瘤在整个腹腔形成。在缺乏治疗的情况下，所建肿瘤模型最终会造成100%的动物死亡。肿瘤植入后10天，或未经处理的动物预期存活时间的一半开始治疗。所有治疗为腹腔注射给药。零天是第一次治疗，存活时间是从第一次治疗起的时间。紫杉醇是以肿瘤穿入颗粒(TPM)的形式给药，按照美国专利申请11/242，546中的方法制备。动物分别给予单一TPM剂量(含总相当量为80mg/kg紫杉醇的速释和缓释颗粒)。由于TPM可快速和缓慢释放做为凋亡诱导剂和促成剂的紫杉醇，可实现肿瘤疏松和促进细胞内的RNAi的生物利用度的双项功能。两种配方的颗粒直径均约为4-6微米。RNAi为抗存活素的siRNA。RNAi载体为PCat脂质体。PCat-RNAi在给以TPM72小时和120小时后给以两个剂量，每剂量每只动物含有1nmole的RNAi，和0.12mg DOTAP。动物根据肿瘤大小随机分为四组：RIDES加上肿瘤疏松(TPM加PCat-siRNA)；TPM(TPM加空白脂质体载体)；siRNA(PCat-siRNA加不载紫杉醇空白TPM的颗粒)和对照组(空白TPM的颗粒加上空白PCat脂质体)。各治疗组由21至25只动物。表1总结了中位生存时间和无瘤治愈率(定义为自第一次治疗后>250天没有可测到的肿瘤)。无TPM治疗的两个对照组(对照组，siRNA组)的平均存活时间为27天，TPM组生存期较长为35天的，TPM+siRNA组增加至62天。在TPM+PCat siRNA组还显示了无瘤治愈率的增加。图1A为在肿瘤植入后第21天的每个治疗组动物的照片。这些结果表明，RNAi单独使用没有抗肿瘤活性，而添加促成剂和肿瘤疏松剂(即诱导凋亡剂)可以获得抗存活素RNAi的治疗效果。

平行实验中，在给以TPM后96，120，144小时从各治疗组摘取肿瘤，并以免疫组化方法估计总存活素的表达(多克隆抗体检测)，核内存活素表达(野生型存活素特异性单克隆抗体检测)，细胞凋亡(caspase 3的表达和形态检测)，增殖抑制(Ki-67表达检测)。每时间点各实验组取三个动物摘取肿瘤样本。120小时的时间点的代表性的标本的显微照片如图1B所示。免疫组化染色强度图像定量分析的结果如表2所示，这些结果表明，在所有三个时间，给以TPM和PCat-siRNA的动物(即RIDES加上肿瘤疏松)的组与仅给以TPM的组相比，总量和核存活素的表达减少，细胞凋亡增加，增殖减少。单剂量存活素siRNA没有减少肿瘤中存活素的基线表达水平,对肿瘤细胞增殖(Ki67的标记指数测量)和细胞凋亡(caspase-3的标记指数)没有影响。与文献报道一致，TPM可增强存活素在肿瘤中的表达，抑制细胞增殖和产生肿瘤细胞的凋亡。存活素siRNA下调TPM诱导的存活素的表达，显著增强TPM诱导的抗增生和凋亡，并延长动物生存期(P<0.05)。这些结果表明，当在给以RNAi之前同时给以凋亡诱导剂和促成剂，RIDES在体内是有效的。

实验的过程中测量每个治疗组的动物体重。TPM加或不加PCat-siRNA的治疗组的体重的时间曲线是相似的，TPM加PCat-siRNA的动物并未增加体重损失。所有三个治疗组(单剂的siRNA，TPM和它们的组合)造成<10%的体重损失，表示PCat-siRNA没有额外的毒性。

为确定提高的疗效是否源于在肿瘤组织中的紫杉醇浓度的变化，使用标准的高效液相色谱方法对肿瘤组织进行了药物浓度分析。结果表明在给以RIDES加上肿瘤疏松组和仅给以TPM组的动物组织中没有发现紫杉醇浓度差异。这些数据表明，提高的疗效不是因为紫杉醇浓度的增加。

总的来说，这些数据表明，与单独合用TPM或RNAi相比，RIDES，包括促成剂紫杉醇和RNAi，加肿瘤疏松一起，(一)增加总体存活率，(二)提高肿瘤的治愈率，(三)减少总存活素的表达，(四)减少核存活素的表达，(五)增加细胞凋亡，和(六)减少肿瘤细胞的增殖。这些作用不是由于紫杉醇在肿瘤组织中浓度的变化。这些数据表明，如果在给以RNAi之前给以促成剂紫杉醇，RIDES加上肿瘤疏松在体内是有效的。

例3

RIDES在体内有效：皮下肿瘤的静脉注射治疗

这个例子表明，静脉注射的RIDES可有效对抗全身肿瘤。这项研究是在携带皮下植入人类异种移植肿瘤的免疫抑制小鼠中进行。三种不同类型的肿瘤，即，胰腺癌HS766T，前列腺癌PC3，咽癌FaDu。治疗在肿瘤达到大于3毫米大小开始。紫杉醇溶解于50:50V/V的聚氧乙烯蓖麻油乙醇中。RNAi为存活素siRNA。RNAi载体为PCat脂质体，并载有1nmol的抗野生型存活素mRNA的siRNA，及每只动物0.12mg DOTAP。第零天是第一次治疗，存活时间是从第一次治疗起的时间。

荷HS766T瘤小鼠根据肿瘤大小随机分为六组。每个组由4个或5个动物。治疗在肿瘤大小达到直径约3毫米时开始。治疗时，动物接受紫杉醇静脉注射(20mg/kg)或载体(50:50V/V：聚氧乙烯蓖麻油乙醇)，三天后注射给以含存活素的siRNA和无靶点siRNA(NT siRNA)的PCat脂质体。RNAi治疗后24小时内给以第二个剂量紫杉醇(20mg/kg)载体(50:50V/V：聚氧乙烯蓖麻油乙醇)。六个治疗组分别为：RIDES(紫杉醇联合抗survivi的PCat-RNAi)，Pac+PCat-NT RNAi(紫杉醇加PCat脂质体含有无靶点siRNA)，Pac+PCat(紫杉醇加空白PCat脂质体)，载体+PCat-RNAi(载体加抗存活素的PCat-RNAi)，载体+PCat-NT-RNAi(载体加含有无靶点siRNA PCat脂质体)，载体+PCat(载体加空PCat脂质体)。图2A显示在第一次治疗后10天的肿瘤大小。载体治疗组，带或不带PCat NT-RNAi或PCat-RNAi，显示较大的肿瘤，说明在没有紫杉醇时RNAi没有治疗功效。相比较而言，以紫杉醇治疗的三组，带有或不带PCat NT-RNAi或PCat-RNAi显示肿瘤较小，表明紫杉醇产生了一些治疗功效。Pac+PCat和Pac+PCat NT-RNAi比较没有明显差异，表明添加无靶点siRNA没有功效。相比之下，RIDES组几乎看不见肿瘤，表明紫杉醇和PCat-RNAi相结合的协同作用。表3为动物的生存，肿瘤生长延迟，和治愈分析结果。无紫杉醇治疗的三组的肿瘤生长率大致相同，所有动物在7天和17天之间所达到定义为近死亡状态的肿瘤大小。只有接受paclitaxel的治疗组，肿瘤生长表现延迟，接收空白PCat脂质体或PCat-NT-RNAi组有相似的生长曲线；这两组的中位生存期为21天。只有在RIDES与治疗组，观察到肿瘤消退。这个动物组还显示延长的生存期，中位数为28天。本组中一只动物(11%)显示肿瘤完全消退，并于大于21天内无复发。

携带PC3肿瘤的动物以同样方式治疗，但没有PCat NT-RNAi组。分别在第0，4，7和11天给以4个剂量的紫杉醇(10mg/kg)，并分别在第3天，6，和10天给以3个剂量PCat-RNAi。图2B显示了首次治疗后第21天具有代表性的动物的照片。与荷HS766T肿瘤小鼠治疗结果相似，仅在接受RIDES治疗组观察到肿瘤消退。生存和肿瘤的生长的分析结果列于表3。

荷FaDu肿瘤与荷PC3肿瘤的动物同样方式治疗，但在第0，4，8，12天给以较高剂量的紫杉醇(20mg/kg)，并在第3和11天级以2剂量的siRNA。图2C显示治疗开始后第42天的代表性动物的照片。与其他类型的肿瘤相似，仅在接受RIDES小鼠体内的观察到肿瘤消退。生存和肿瘤的生长分析结果列于表3。

总之，这些数据表明时，当促成剂和抗存活素PCat-RNAi同时静脉注射时，RIDES静脉给药在体内是有效的，并具有抗多种类型肿瘤的广谱的活性。

在由荷相同类型的实验肿瘤的小鼠进行了细胞药效学实验。测定了细胞增殖的Ki-67指数和细胞凋亡caspase 3的指数。治疗组与上面所描述的体内肿瘤生长/生存研究相同。对于所有类型的肿瘤，在第0和4天给以紫杉醇(20mg/kg)或载体，在第3天给以siRNA(1nmol)或空白PCat脂质体。第7天摘取肿瘤并进行免疫组化分析处理。Ki-67和caspase 3的指数是在显微镜下，显示各自的蛋白抗体阳性染色细胞的百分数。细胞的药效学研究结果总结于表4。与生存和肿瘤的生长数据一致，只给以PCat-RNAi和PCat-NT-RNAi的动物组并没有表现出显著的细胞增殖减少或凋亡增加。相比之下，紫杉醇显着降低细胞增殖和增加细胞凋亡，加入抗存活素PCat-RNA进一步增强这种效果。

^*肿瘤生长延迟(TDG)：不包括完全消退的肿瘤(治愈)。

例4

与对照组DC-RNAi相比，PCat-RNAi在体内更为有效

以荷腹腔HS766T胰腺癌的小鼠比较两种类型的RNAi脂质体载体，即PCat和DC脂质体，提高紫杉醇抗肿瘤活性的能力。其余方法如例2所述。如表5所示，生存分析的结果，表明在体内的疗效PCat-RNAi在体内比DC-RNAi具有更强的活性。寿命增加的计算方式为(实验组的中位生存时间或MST减去对照组的中位生存时间)，再除以(对照组的中位生存时间)。

^*肿瘤植入后10天开始治疗

例5

PCat脂质体对培养细胞的毒性低于DC脂质体

含DOTAP脂质体的一个已知的限制是其具有的细胞毒性。这个例子比较，领域内标准的脂质体配方，即DC脂质体，和PCat脂质体的细胞毒作用。两种制剂的制备，如例1中所述。单层培养细胞给以含不同DOTAP浓度(浓度为0.1，1，2，5，10，15，50，100和200μg/ml的脂质体。人卵巢癌SKOV3细胞，人乳腺癌MCF7细胞，人类前列腺癌PC3细胞用于测定细胞毒性。结果表明：DC脂质体在DOTAP浓度为10μg/ml时可使细胞存活降低大于50%。在此相同的浓度，PCat脂质体没有造成细胞存活降低。比较包括所有DOTAP浓度的浓度效应曲线表明，与DC脂质体相比，PCat脂质体的毒性至少低10倍。

例6

PCat脂质体对小鼠的毒性低于DC脂质体

这个例子以两项研究比较DC和PCat脂质体的体内毒性。第一项研究评估空白脂质体(即，没有装载RNAi)的对动物体重变化的影响。体重减轻是一种广泛使用的毒性指标。动物腹腔注射不同剂量的空白的PCat或DC脂质体。脂质体剂量以DOTPA当量表示，剂量为0(生理盐水对照)，10，50和100mg/kg。每组四个或五个动物。结果表明在PCat脂质体动物组没有显著体重减轻，而给以最高剂量DC脂质体的动物观察到统计意义上显著的约3%的的体重损失。这些结果表明，与领域内标准的DC脂质体相比，PCat在体内有更高的安全性。

第二项研究评估含有RNAi的PCat或DC脂质体对小鼠的毒性。所用siRNA为抗存活素RNAi。这两种制剂静脉注射到无肿瘤CD1小鼠，并评估对肝，脾，网状内皮系统器官的毒性。动物每五只一组，每只动物给以含有1nmole存活素siRNA和0.12mg DOTAP的制剂，并于第7天麻醉处死取血液样本。以谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平测量分析肝功能。摘取脾脏并称重。与对照组相比，DC-RNAi组的ALT，AST值和脾脏重量显著增加(为对照组的220%，201%和126%，P<0.05)。相比之下，PCat-RNAi组没有显著变化(分别为对照组的113%，92%和108%，P>0.1)。这些数据表明PCat-RNAi对DC-RNAi的毒性更小。

例7

促成剂增强细胞内的RNAi的生物利用度

这个例子表明，促成剂提高RNAi分子递送或从脂质体载体，内涵体或溶酶体释放。利用siGLO RNAi进行了三项研究。脂质载体为DC脂质体。这项研究是在三种人类肿瘤细胞株，即胰腺癌HS766T，乳腺癌MCF7和前列腺癌PC3中的一个或多个上进行的。

第一项研究评估促成剂预处理的影响。MCF7和PC3和HS766T细胞以促成剂预处理，包括微管蛋白稳定剂(如紫杉醇，多西紫杉醇)，微管解聚剂(即，长春新碱，秋水仙碱，噻氨酯哒唑)和拓扑异构酶抑制剂(阿霉素)。另外包括不是通过与微管蛋白相互作用或抑制拓扑异构酶起作用的细胞毒性药物，即顺铂和5-氟脲嘧啶，进行平行比较。先以这些药物之一预处理细胞4小时，然后与脂质体siGLO共培养6小时。对照组不加药物。促成剂预处理后，细胞以冷的无FBS的培养液冲洗3次，用福尔马林固定，以DRAQ5核染料染色，使用共聚焦荧光显微镜观察。结果见图4，表明在控制组细胞中，大部分红色荧光与绿色荧光(siGLO)共同定位，表明DC-RNAi在细胞内主要以完整的DNA脂质体复合物进入细胞。红色和绿色荧光信号均分散并位于细胞质内或核周围地区，表明极少siGLO被释放到细胞质。绿色与蓝色的细胞核染料信号共同定位显示促成剂预处理致绿色荧光在核内积累。因为只有游离siGLO(不包裹于脂质体内)可以进入细胞核，核内siGLO积累表明RNAi从脂质体，内涵体或溶酶体释放。在所有3种细胞株均观察到这些结果。相比之下，以其他细胞毒性药物，如顺铂或5-氟尿嘧啶的预处理，并没有改变siGLO分散的分布形式。这些结果表明，微管蛋白活性剂和拓扑异构酶抑制剂选择性地促成RNAi，从脂质体，内涵体或溶酶体释放。

第二项研究评估了紫杉醇对RNAi转染效果的浓度依赖性。HS766T细胞经10和50nM紫杉醇浓度处理4小时。用MTT法测量细胞毒性，发现10nM紫杉醇处理4个小时，与无药物治疗对照组细胞相比无明显的毒性。相比之下，50nmM处理4小时的导致10至30%的细胞毒作用。如图4A所示，结果表明在两个浓度下，siGLO在细胞核中均增加。这一结果表明，微管蛋白活性剂，可以在无毒性和亚细胞毒性的浓度和处理时间内，提高将RNAi递送和释放到细胞质中。这一点令人意外，因为人们可能预期明显的细胞毒作用，会妨碍细胞活动，包括涉及微管蛋白/微管的功能和RNAi机制的细胞活动。

上述两项研究表明，在给以siGLO之前四个小时以促成剂预处理，提高了RNAi的效果。第三项研究表明，同时给以促成剂也产生了同样的益处。实验条件与以上所述相同，不同之处为微管蛋白活性药物紫杉醇和噻氨酯哒唑，化疗药物顺铂与siGLO同时给药。这项研究合用前列腺癌PC3细胞。细胞共聚焦显微镜分析表明，接受微管蛋白活性剂处理的细胞显示广泛的siGLO核积累，但对照组细胞和顺铂治疗细胞组无此现象(图4B)。这些平行比较研究表明，以促成剂预处理或同时处理增强RNAi从脂质体，内涵体或溶酶体释放，并提高的RNAi递送到细胞质和细胞核。

例8

所需的紫杉醇浓度在对正常细胞的非毒性浓度范围即可轻易达到加强 RNAi的细胞内的生物利用度

这个例子显示在对正常细胞不具毒性的非毒性浓度范围可促进RNAi的运送和释放到细胞质。这一结果是使用猪血管平滑肌细胞测定的；药物治疗的持续时间为36小时。紫杉醇肿瘤细胞株的细胞毒性以胰腺癌HS766T的PC3前列腺和乳腺癌MCF7细胞测定，治疗时间为48小时。细胞毒性使用MTT法测定。表6总结的数据显示，对不同细胞株的50%抑制紫杉醇浓度。浓度时间积CxT用于比较紫杉醇对以不同的时间长度处理的肿瘤和平滑肌细胞的相对影响。对平滑肌细胞，产生50%细胞毒作用的紫杉醇CxT为4068nMxhr，是对HS766T，MCF7，和PC3癌细胞产生50%的细胞毒作用浓度的6到16倍。这些数据表明，对正常细胞的非毒性浓度即可轻易达到加强RNAi的细胞内的生物利用度所需的紫杉醇浓度。

例9

抗存活素或K-ras RIDES增强紫杉醇的抗肿瘤活性

这个例子使用了5个细胞系，即人胰腺癌HS766T，人胰腺MiaPaCa-2，人乳腺癌MCF7细胞，人前列腺癌的PC3，人头颈癌细胞FaDu。单层细胞培养在达到80%融合(长满细胞培养皿表面80%)后使用。细胞先以紫杉醇处理，然后给以抗存活素(100nM)，或抗K-ras基因的PCat-siRNA(100nM)。对照组为单一紫杉醇，单一PCat-siRNA，紫杉醇联合无靶点siRNA，或不加任何药物处理。在所有5个细胞系中，与单独使用的药物组相比，抗存活素或抗K-ras基因的RIDES(紫杉醇加PCat-siRNA的)，取得了显着的较高的抗肿瘤活性。

例10

RIDES在紫杉醇存在时可有效敲减目标蛋白质

以人前列腺癌PC3，卵巢卵巢癌SKOV，头颈癌FaDu，或胰腺癌MiaPaCa-2单层培养细胞研究了抗存活素,钙紧张素,和K-ras的PCat-siRNA敲减蛋白水平的有效性。单层细胞用10nM紫杉醇处理4小时，然后以PCat-RNAi(100nM)处理4-6小时。在转染后48小时，在冰冷的TBS中刮取细胞并在-80℃保存直到免疫印迹分析。以缓冲提取系统提取细胞蛋白并使用BCA试剂测定蛋白浓度。在免疫印迹中，每个样品的等量总蛋白用SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜。印迹以小鼠存活素,钙紧张素,和K-ras和标准化基本生理功能蛋白的单克隆抗体检测。可视化是通过化学发光。治疗组如下。对照组给以紫杉醇和空白脂质体。PAC+NT-siRNA组给以紫杉醇和无靶点siRNA。RIDES组给以紫杉醇和抗存活素,钙紧张素,和K-ras的PCat-siRNA。

图5中结果显示，PCat-RNAi在紫杉醇存在的情况下，显著敲减存活素，钙紧张素，或K-ras蛋白水平。这表明了RIDES的有效性。

例11

RIDES的各种组合物，包括在同一PCat脂质体内负载促成剂和RNAi， 提高细胞内的RNAi的生物利用度

上面的例子(即例子2，3，7和10)表明，在以促成剂预处理或把促成剂与PCat-RNAi作为分别的实体同时给药时，RIDES是有效的。这个例子则显示在促成剂和RNAi都载入PCat脂质体并作为一个单一的实体使用时，RIDES在RNAi递送和释放到细胞质的有效性。四个促成剂为紫杉醇，多西紫杉醇，秋水仙碱，长春新碱，相应的各实体是Pac-PCat RNAi，Doc-PCat-RNAi，Col-PCat-RNAi，和Vin-PCat-RNAi。这项研究在以下人类肿瘤细胞，即HS766T胰腺癌，乳腺癌MCF7细胞，和前列腺的PC3中的一个或多个中进行。在细胞培养液中PCat-RNAi含50nM的siRNA。研究利用共焦荧光显微镜检测递送到细胞器中RNAi。RNAi为siGLO。共进行了两项研究。

第一项研究中比较了结合RIDES的两种成分的三种不同的方式。在并行比较中紫杉醇作为促成剂。如例7和10例所述，紫杉醇可用作预处理或与RNAi同时给药。两种药物也可作为Pac-PCat-RNAi单一实体给药。Pac-PCat-RNAi中的紫杉醇载药量当量于培养液中紫杉醇浓度为10nM。图6A中PC3细胞结果显示，siGLO存在于细胞核内，表明Pac-PCat-RNAi增加RNAi细胞内生物利用度的有效性。

第二项研究表明Doc-PCat-RNAi，Col-PCat-RNAi，和Vin-PCat-RNAi在三个人类肿瘤细胞株，即乳腺癌MCF7，前列腺癌PC3，和胰腺癌HS766T细胞中具有类似的活性。这些制剂中所含的药物当量浓度为多西紫杉醇10nM，秋水仙碱100nM，长春新碱10nM的。图6B中结果表明，在所有三个细胞系中，与无促成剂的PCat-RNAi相比，载有促成剂的PCat-RNAi处理后的细胞的细胞核内有更高强度siGLO。

总之，上述结果表明，装载促成剂的PCat-RNAi可更有效递送RNAi到细胞质，并促进RNAi从脂质体，内涵体，溶酶体的释放。

例12

RIDES的各种成分，包括在同一PCat脂质体内负载促成剂和RNAi， 提高RNA干扰的有效性

这个例子表明，各种组成的RIDES能产生有效的RNA干扰。实验使用人类胰腺癌HS766T细胞。RNAi为抗存活素的siRNA。对照组不加处理。某些实验组使用无靶点RNAi(NT-RNAi)，而不是抗存活素的siRNA。

在第一项研究中，细胞经Pac-PCat-RNAi处理，或经两种成分，即紫杉醇和PCat-RNAi作为两个独立的实体，处理6小时。siRNA治疗开始后72小时收集细胞，并用免疫印迹分析测定存活素蛋白水平。印迹以小鼠存活素和基本功能肌动蛋白(标准对照)的单克隆抗体检测。在图7A中结果表明，紫杉醇和PCat-RNAi分开给药可以部分敲减存活素，而Pac-PCat-RNAi产生近乎完全的蛋白质敲减。

第二项研究中使用Doc-PCat-RNAi,Col-PCat-RNAi,和Vin-PCat-RNAi。结果如图7B所示，表明所有三个制剂均可以达到存活素蛋白敲减。

等同性

具有本领域技术的人员应认识到，或能够确定，使用不超过常规实验手段，可能等同于本申请中所特别描述的具体实施方案。以下权利要求涵盖这些等同方案。

虽然方法和组合物在各实施方案中已经描述，具有本领域技术的人员会明白可做各种修改，以等同方案取代其中一些元素，而不偏离本申请的范围和基本。为应用于本申请所述的某一特定情况或材料，可以做许多修改而不偏离本申请中的基本范围。因此，本申请的目的并不仅限于提供特别实施方案，而是将包括所有的附加的权利要求所涵盖的范围内的所有实施方案。除非另有明确说明，在此申请中使用美国测量系统。此外，本文提及的所有引用都明确以参考文献纳入本申请。

文献：

专利文献:

WO/2006/099445

US Patent 5,459,127

非专利文献:

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Claims (21)

1.RNAi传递和表达系统组合物，包含：

(a)脂质体制剂，脂质成分包含一个或多个阳离子磷脂，一个或多个中性磷脂，一个或多个脂质体稳定脂质，一个或多个聚乙二醇修饰脂质，其中所述脂质成分带阳性电荷,并且脂质体制剂包含选自紫杉醇，多烯紫杉醇，长春新碱，秋水仙碱，噻氨酯哒唑，和阿霉素中的一个或多个促成剂，和选自具有短干扰RNA，双链RNA，单链RNA，微RNA，和短发夹RNA特征的RNAi剂，且促成剂含量为脂质总重的1％,0.4％,0.2％,0.1％,0.06％,0.04％,0.02％,0.01％或0.005％,和

(b)在药剂学上可接受的载体。

2.权利要求1的组合物，其中所述一个或多个阳离子磷脂包含1,2‐二油酰基‐3‐三甲铵丙烷，所述一个或多个脂质体的稳定脂质包含胆固醇，所述一个或多个中性磷脂包含二油酰磷脂酰乙醇胺，所述一个或多个聚乙二醇脂质包含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，其中所述1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷、胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺、和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇之间的摩尔比为50:30:19:1，其中RNAi剂和1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷之间的电荷比是1:1和1:10之间。

3.权利要求1的RNAi传递和表达系统组合物,其中所述的RNAi剂抑制能促进哺乳动物增生或癌变组织的细胞生长的基因的翻译。

4.权利要求1的RNAi传递和表达系统组合物，其中所述RNAi剂抑制非癌疾病有关的基因的翻译。

5.RNAi转染体外培养细胞的试剂盒，试剂盒包括使用方法说明；和预先分装的包含权利要求1的RNAi传递和表达系统组合物，缓冲液和稀释剂。

6.权利要求5的试剂盒，其中所述权利要求1的RNAi传递和表达系统组合物不包含RNAi剂，以便最终用户可以灵活替换所用RNAi剂。

7.RNAi转染到主体中细胞的试剂盒，试剂盒包含使用方法说明；和预先分装的包含通过权利要求1的RNAi传递和表达系统组合物，缓冲液和稀释剂。

8.权利要求7的试剂盒，其中所述权利要求1的RNAi传递和表达系统组合物不包含RNAi剂，以便最终用户可以灵活替换所用RNAi剂。

9.组合物，其包含：

(a)脂质体剂型,其中的脂质成分包含1,2‐二油酰基‐3‐三甲铵丙烷，胆固醇，二油酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，其中1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷、胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺、和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇摩尔比为50:30:19:1，以及RNAi剂并且RNAi剂和1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷之间的电荷比例是1：1和1:10；且

(b)在药学上可接受的载体。

10.权利要求9的组合物，其中脂质体剂型中的RNAi剂抑制能促进哺乳动物增生或癌变组织的细胞生长的基因的翻译。

11.权利要求9的组合物，其中脂质体剂型中的所述RNAi剂抑制非癌疾病有关的基因的翻译。

12.RNAi转染体外培养细胞的试剂盒，试剂盒包括使用方法说明；和预先分装的权利要求9的组合物，缓冲液和稀释剂。

13.权利要求12的试剂盒，其中所述权利要求9的组合物不包含RNAi，以便最终用户可以灵活替换所用RNAi剂。

14.权利要求12的试剂盒，进一步包括促成剂的应用，试剂盒包括使用方法说明；和预先分装的选自紫杉醇，多烯紫杉醇，长春新碱，秋水仙碱，噻氨酯哒唑，和阿霉素中的一个或多个促成剂，权利要求9的组合物，缓冲液和稀释剂。

15.权利要求14的试剂盒，其中所述权利要求9的组合物不包含RNAi剂，以便最终用户可以灵活替换所用RNAi剂。

16.RNAi转染主体中细胞的试剂盒，试剂盒包含使用方法说明以及预先分装的权利要求9的组合物，缓冲液和稀释剂。

17.权利要求16的试剂盒，其中所述权利要求9的组合物不包含RNAi剂，以便最终用户可以灵活替换所用RNAi剂。

18.权利要求16的试剂盒，进一步包括促成剂的应用，试剂盒包括使用方法说明；和预先分装的选自紫杉醇，多烯紫杉醇，长春新碱，秋水仙碱，噻氨酯哒唑，和阿霉素中的一个或多个促成剂，权利要求9中的组合物，缓冲液和稀释剂。

19.权利要求18的试剂盒，其中所述权利要求9的组合物不包含RNAi剂，以便最终用户可以灵活替换所用RNAi剂。

20.权利要求1的组合物，其中所述紫杉醇处理细胞的浓度为0.1-100nM、0.1-50nM、0.1-20nM或0.1-10nM。

21.权利要求1的组合物，其中所述紫杉醇的剂量是40nM-hr。