JP2007505605A6 - 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を使用したＲＮＡ干渉により媒介される血管内皮増殖因子遺伝子発現および血管内皮増殖因子遺伝子受容体遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性抑制 - Google Patents

低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を使用したＲＮＡ干渉により媒介される血管内皮増殖因子遺伝子発現および血管内皮増殖因子遺伝子受容体遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性抑制 Download PDF

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Abstract

本発明は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を使用した、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現の調節に有効な化合物、組成物、および方法に関する。本発明はまた、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現経路および／または小核酸分子を使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による活性に含まれる、その他の遺伝子の発現または活性の調節に有効な化合物、組成物、および方法にも関する。特に、本発明は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の小核酸およびＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現の調節に使用される方法を特徴とする。

Description

本出願は、２００２年７月３日付米国仮出願６０／３９３，７９６および２００２年７月２９日付米国仮出願６０／３９９，３４８の利益を主張する２００３年２月２０付ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２２の一部継続出願である２００３年９月１６日付米国特許出願１０／６６５，２５５および米国特許出願１０／６６４，７６７の一部継続出願である２００３年９月２３日付米国特許出願１０／６７０，０１１の一部継続出願である２００４年１月２６日付米国特許出願１０／７６４，９５７の一部継続出願である２００４年４月２３日付米国特許出願１０／８３１，６２０の一部継続出願である２００４年５月１１日付米国特許出願１０／８４４，０７６の一部継続出願である。また本出願は、ともに２００２年２月２０日付米国仮出願６０／３５８，５８０、２００２年３月１１日付米国仮出願６０／３６３，１２４、２００２年６月６日付米国仮出願、２００２年４月２９日付米国仮出願６０／４０６，７８４、２００２年９月５日付米国仮出願６０／４０８，３７８、２００２年９月９日付米国仮出願６０／４０９，２９３、および２００３年１月１５日付米国仮出願６０／４４０，１２９の利益を主張する２００３年２月２０日付国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５３４６および２００３年２月２０日付国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８の一部継続出願である２００３年５月２３日付米国特許出願１０／４４４，８５３の一部継続出願である２００３年１０月２３日付米国特許出願１０／６９３，０５９の一部継続出願である２００３年１１月２４日付米国特許出願１０／７２０，４４８の一部継続出願である２００４年１月１４日付米国特許出願１０／７５７，８０３の一部継続出願である２００４年４月１６日付米国特許出願１０／８２６，９６６の一部継続出願である２００４年５月２４日付国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／１６３９０の一部継続出願である。また本出願は、２００１年５月１８日付米国特許出願６０／２９２，２１７、２００２年３月６日付米国仮出願６０／３６２，０１６、２００１年７月２０日付米国仮出願６０／３０６，８８３、および２００１年８月１３日付米国仮出願６０／３１１，８６５の利益を主張する２００２年５月１７日付国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１５８７６の一部継続出願である２００３年４月３０日付米国特許出願１０／４２７，１６０の一部継続出願である２００４年２月１３日付米国特許出願１０／７８０，４４７の一部継続出願である２００４年４月３０日付国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／１３４５６の一部継続出願である。また本出願は、２００３年１２月３日付米国特許出願１０／７２７，７８０の一部継続出願である。また本出願は、２００４年２月１０日付米国仮出願６０／５４３，４８０の利益を主張する。本出願は、上記の全出願の利益を主張し、これら全出願は、参照することにより、図も含めてその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および／または血管内皮増殖因子受容体（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３）遺伝子発現および／または作用の調節に対応する形質、疾患、および状態の研究、診断、および治療用の化合物、組成物、および方法に関する。また本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および／または血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の遺伝子発現経路またはそのような形質、疾患および状態の維持または進行を媒介する他の細胞過程に関与する遺伝子の発現および／または作用の調節に対応する形質、疾患および状態に関する化合物、組成物、および方法を対象とする。特に本発明は、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、等の小核酸分子に関する。
以下はＲＮＡｉに関する関連技術の考察である。この考察は、以下に続く本発明の理解を唯一の目的として提供する。要約は下記のいずれの研究をも請求の範囲に記載の発明に対する先行技術であると認めるものではない。
ＲＮＡ干渉は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される動物における配列特定転写後遺伝子サイレンシングの過程を示す（ザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ）ら，２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２５−３３；ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら，１９９８年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６；ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら，１９９９年，サイエンス誌（Ｓｃｅｉｎｃｅ），２８６，９５０−９５１；リン（Ｌｉｎ）ら，１９９９年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０２，１２８−１２９；シャープ（Ｓｈａｒｐ），１９９９年，遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．），１３：１３９−１４１；およびストラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ），１９９９年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８６，８８６）。植物においてこれに相当するプロセス（ハイフェッツ（Ｈｅｒｆｅｔｚ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／６１６３１）は、一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、菌類ではクエリングと呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防ぐために使用され、様々な植物相や門が一般に共有する進化的に保存された細胞防御機構であると考えられている（ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら，１９９９年，トレンド遺伝学誌（Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．），１５，３５８）。外来遺伝子発現からのそのような保護は、ウイルス感染または同種の一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介したホストゲノムへのトランスポゾン要素のランダムな統合から派生した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して進化したのかもしれない。細胞にｄｓＲＮＡが存在すると、まだ完全には解明されていない機序を通じてＲＮＡｉ応答を誘発する。この機序は、リボヌクレアーゼＬの非特定切断を生じるタンパク質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素のｄｓＲＮＡ媒介性活性に起因するインターフェロン応答性といった二本鎖ＲＮＡ特定のリボヌクレアーゼを含む他の周知の機構とは異なると考えられる（例として、米国特許６，１０７，０９４；５，８９８，０３１；クレメンス（Ｃｌｅｍｅｎｓ）ら，１９９７年，ジャーナル・オブ・インターフェロン・アンド・サイトカイン・リサーチ誌（Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ＆Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．），１７，５０３−５２４；アダ（Ａｄａｈ）ら，２００１年，カレント・メディカル・ケミストリー誌（Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．），８，１１８９を参照）。
細胞に長鎖ｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が誘発される（バス（Ｂａｓｓ），２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２３５；ザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ）ら，２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２５−３３；ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）ら，２０００年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０４，２９３）。ダイサーは、ｄｓＲＮＡを低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる短鎖ｄｓＲＮＡへの処理に関与する（ザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ）ら，２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２５−３３；バス（Ｂａｓｓ），２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２３５；バースタイン（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ）ら，２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０９，３６３）。ダイサー作用から派生する低分子干渉ＲＮＡは、一般的に約２１から約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二重鎖で構成される（ザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ）ら，２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２５−３３；エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１年，遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．），１５，１８８）。またダイサーは、２１および２２ヌクレオチドの低分子一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を翻訳調整に関わる保護構造の前駆ＲＮＡから切除する場合にも関与している（ハトヴァーグナー（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ）ら，２００１年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体も特徴とする。これはｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を持つ一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、前記ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中間で行われる（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１年，遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．），１５，１８８）。
ＲＮＡｉは様々な類系で研究されている。ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら（１９９８年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６）は、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において初めてＲＮＡｉを観察した。バフラミアン（Ｂａｈｒａｍｉａｎ）とザーブル（Ｚａｒｂｌ）（１９９９年，分子細胞生物学誌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１９，２７４−２８３およびウィアニー（Ｗｉａｎｎｙ）とゲッツ（Ｇｏｅｔｚ），１９９９年，ネイチャー細胞生物学誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），２，７０）は、哺乳類系においてｄｓＲＮＡが媒介するＲＮＡｉについて記述している。ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）ら（２０００年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０４，２９３）は、ｄｓＲＮＡとともに導入されるショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉについて記述している。エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら（２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４１１，４９４）およびトゥッシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４）は、ヒト胚腎臓細胞およびＨｅＬａ細胞を含む培養哺乳類細胞内の合成２１−ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖導入によって誘導されるＲＮＡｉについて記述している。ショウジョウバエ胚の溶解物における最近の研究（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１年，欧州分子生物学協会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．），２０，６８７７およびトゥッシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４）によって、効率的なＲＮＡｉ活性の媒介に必須のｓｉＲＮＡ長、構造、化学組成、および配列に対する特定の要件が明らかになった。これらの研究は、３’端ジヌクレオチド突出部を含む場合に、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖が最も活性であることを示している。さらに、一方または両方のｓｉＮＡ鎖を２’−デオキシ（２’−Ｈ）または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドと完全に置換した場合はＲＮＡｉを不活性化したのに対し、３’端ｓｉＲＮＡ突出ヌクレオチドを２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）で置換した場合は耐性を示した。またｓｉＲＮＡ二重鎖の中心にある単一のミスマッチ配列も、ＲＮＡｉを不活性化することを示した。加えて、これらの研究は標的ＲＮＡにおける切断部位がガイド配列の３’端ではなくｓｉＲＮＡガイド配列の５’端によって定義されることを示している（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１年，欧州分子生物学協会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．），２０，６８７７）。他の研究によって、ｓｉＲＮＡ二重鎖の標的相補鎖上にある５’−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であること、およびｓｉＲＮＡ上に５’−リン酸部を維持するためにＡＴＰが利用されることが明らかになっている（二カネン（Ｎｙｋａｎｅｎ）ら，２００１年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０７，３０９）。
研究では、２つのヌクレオチド３’突出部を持つ２１量体ｓｉＲＮＡ二重鎖の３’端ヌクレオチド突出部をデオキシリボヌクレオチドと置換してもＲＮＡｉ活性に悪影響を与えないことが証明されている。前記ｓｉＲＮＡの各末端にある４つまでのヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドと置換する場合は優れた耐性を持つが、デオキシリボヌクレオチドを完全に置換する場合はＲＮＡｉが不活性化されることが報告されている（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１年，欧州分子生物学協会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．），２０，６８７７およびトゥッシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４）。さらに、エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら（前述）は、ｓｉＲＮＡを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドと置換することで完全にＲＮＡｉが不活性化されることも報告している。リー（Ｌｉ）らの国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４９１４およびビーチ（Ｂｅａｃｈ）らの国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／６８８３６は、少なくとも１つの窒素または硫黄へテロ原子を包むためにｓｉＲＮＡがリン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかを修飾することがあると仮定しているが、そのような修飾がｓｉＲＮＡ分子においてどの程度耐性を持つかということは想定しておらず、そのような修飾ｓｉＲＮＡに関する詳細な説明も例証も提供されていない。またクロイツァー（Ｋｒｅｕｔｚｅｒ）らのカナダ特許出願２，３５９，１８０も、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、特に２’−アミノまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、および２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン橋を含むヌクレオチドの活性に対抗するためのｄｓＲＮＡ構造に使用する特定の化学修飾について記述している。しかし、クロイツァー（Ｋｒｅｕｔｚｅｒ）らも同様に、それらの修飾がどの程度ｄｓＲＮＡ分子において耐性を持つかについての例証または説明を提供していない。
パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）ら（２０００年，分子細胞誌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ），６，１０７７−１０８７）は、長い（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写を使用して、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）におけるｕｎｃ−２２遺伝子を標的とする特定の化学修飾について試験した。その著者らは、チオリン酸ヌクレオチド類似体をＴ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼに組み込むことによってチオリン酸残基をそれらｓｉＲＮＡ転写物に導入することについて記述しており、また２つのホスホロチオエート修飾塩基を持つＲＮＡのＲＮＡｉとしての有効性は著しく減少したことを観察した。さらに、パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）らは、２つ以上の残基のホスホロチオエート修飾がインビトロでＲＮＡを著しく不安定化したため、干渉作用を分析できなかったとを報告した。（前記１０８１ページ）またこの著者らは、長いｓｉＲＮＡ転写物におけるヌクレオチド糖の２’位での特定の修飾を試験し、特にウリジンからチミジンおよび／またはシチジンからデオキシシチジンへの置換の場合に、デオキシヌクレオチドをリボヌクレオチドと置換することで干渉作用が大幅に減少することを発見した（同様）。さらに、彼らはｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖において、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、ウラシルの３−（アミノアリル）ウラシル、およびグアニンのイノシンにおいて、置換を含む特定の塩基修飾を試験した。４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシルの置換は、耐性を持つように思われたが、パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）はイノシンがいずれかの鎖に組み込まれた場合に干渉作用を著しく減少させると報告した。またパリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）は、アンチセンス鎖に５−ヨードウラシルおよび３−（アミノアリル）ウラシルを組み込むことで、ＲＮＡｉ活性も大幅に減少することを報告した。
長鎖ｄｓＲＮＡの使用について記載されている。例えば、ビーチ（Ｂｅａｃｈ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／６８８３６）は、内因性のｄｓＲＮＡを使用して遺伝子の発現を減衰させる特定の方法について説明している。トゥッシェル（Ｔｕｓｃｈｌ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４）は、ショウジョウバエのインビトロＲＮＡｉシステムについて、また特定の機能的ゲノムアプリケーションおよびに特定の治療用アプリケーションに対する特定のｓｉＲＮＡ分子の使用について説明している。しかし、トゥッシェル（Ｔｕｓｃｈｌ）（２００１年，化学と生物化学誌（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），２，２３９−２４５は、インタフェロン応答性を活性化する危険性があるため、ＲＮＡｉを遺伝的疾患またはウイルス感染の治療に使用することについて疑問視している。リー（Ｌｉ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４９１４）は、特定の標的遺伝子の発現を減衰するために、特定の長い（１４１−４８８塩基対）酵素合成したｄｓＲＮＡまたはベクター発現したｄｓＲＮＡの使用について説明している。ツェルニッカ−ゲッツ（Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３６６４６）は、特定の長さ（５５０−７１４塩基対）の酵素合成したｄｓＲＮＡ分子またはベクター発現したｄｓＲＮＡ分子を使用して、哺乳類細胞における特定遺伝子の発現を抑制する方法について説明している。ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３２６１９）は、線虫類における遺伝子発現の抑制に使用するため、特定の長鎖ｄｓＲＮＡ分子を細胞に導入する特定の方法について説明している。プラティンク（Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／０１８４６）は、特定の長鎖ｄｓＲＮＡ分子を使用して、細胞内の特定表現型を付与する特定の遺伝子を識別する方法について説明している。メロー（Ｍｅｌｌｏ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／２９０５８）は、ｄｓＲＮＡ媒介性ＲＮＡｉに関与する特定遺伝子の識別について説明している。パチャック（Ｐａｃｈｕｃｋ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／６３３６４）は、特定の長い（少なくとも２００ヌクレオチド）のｄｓＲＮＡ構造について記述している。デュシャン・デュパイエット（Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／０７４０９）は、特定の抗ウイルス剤と結合する特定のｄｓＲＮＡ分子で構成された特定の組成物について説明している。ウォーターハウス（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ）ら（国際ＰＣＴ公開９９／５３０５０および１９９８年米国サイエンスアカデミー会報（ＰＮＡＳ），９５，１３９５９−１３９６４）は、特定のｄｓＲＮＡを使用して、植物細胞における核酸の表現型発現を減少させる特定の方法について説明している。ドリスコール（Ｄｒｉｓｃｏｌｌ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／４９８４４）は、標的生物体において遺伝子のサイレンシングを促進するために使用する特定のＤＮＡ発現構造について触れている。
様々なＲＮＡｉおよび遺伝子サイレンシングシステムに関する他の報告もある。例えば、パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）ら（２０００年，分子細胞（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ），６，１０７７−１０８７）は、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のｕｎｃ−２２遺伝子を標的とする特定の化学修飾ｄｓＲＮＡ構造について説明している。グロスニクラウス（Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ）（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３８５５１）は、ポリコーム遺伝子発現を規制する特定の方法について説明している。チュリコフ（Ｃｈｕｒｉｋｏｖ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／４２４４３は、特定のｄｓＲＮＡを使用して、生物体の遺伝的特徴を修飾する特定の方法について説明している。コゴニ（Ｃｏｇｏｎｉ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／５３４７５）は、アカパンカビサイレンシング遺伝子を分離する方法およびその使用について説明している。リード（Ｒｅｅｄ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／６８８３６）は、植物における遺伝子サイレンシングの特定の方法について説明している。ホーネル（Ｈｏｎｅｒ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７０９４４）は、特定のｄｓＲＮＡを使用して、パーキンソン病モデルとして遺伝子組み換え線虫類を用いた薬物スクリーニングの特定方法について説明している。ディーク（Ｄｅａｋ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７２７７４）は、ショウジョウバエのＲＮＡｉに関連する特定のショウジョウバエ由来の遺伝子産物について説明している。アルンド（Ａｒｎｄｔ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９２５１３）は、ＲＮＡｉを強化する要素を使用することによって遺伝子発現を媒介する特定の方法について説明している。トゥシェル（Ｔｕｓｃｈｌ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４４３２１）は、特定の合成ｓｉＲＮＡ構造について説明している。パチャック（Ｐａｃｈｕｋ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／６３３６４）およびサティシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／０４３１３）は、特定の長さ（２５０塩基対以上）のｄｓＲＮＡ、ベクター発現したｄｓＲＮＡを使用して、特定のポリヌクレオチド配列の機能を抑制する特定の方法および組成物について説明している。エチェベリ（Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０２／３８８０５）は、ＲＮＡｉを介して識別される特定のシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）遺伝子について説明している。クロイツァー（Ｋｒｅｕｔｚｅｒ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０５５６９２、ＷＯ０２／０５５６９３、およびＥＰ１１４４６２３）は、ｄｓＲＮＡを使用して遺伝子発現を抑制する方法について説明している。グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４９０２９およびＷＯ０１／７０９４９、およびＡＵ４０３７５０１）は、特定のベクター発現したｓｉＲＮＡ分子について説明している。ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら（米国特許６，５０６，５５９）は、ＲＮＡｉを媒介する特定の長いｄｓＲＮＡ（２９９−１０３３塩基対）構造を使用したインビトロ遺伝子発現の抑制方法について説明している。マルティネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）ら（２００２年），セル誌（Ｃｅｌｌ），１１０，５６３−５７４はＨｅｌａ細胞におけるＲＮＡ干渉を媒介する特定の５’−リン酸化一本鎖ｓｉＲＮＡを含む特定の一本鎖ｓｉＲＮＡ構造について説明している。ハーボース（Ｈａｒｂｏｒｔｈ）ら（２００３年，アンチセンス核酸薬剤開発（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ），１３，８３−１０５は、化学的および構造的に修飾したｓｉＲＮＡ分子について説明している。チウ（Ｃｈｉｕ）およびラナ（Ｒａｎａ）（２００３年，ＲＮＡ，９，１０３４−１０４８）は、化学的および構造的に修飾した特定のｓｉＮＡ分子について説明している。ウルフ（Ｗｏｏｌｆ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４６２６およびＷＯ０３／０６４６２５）は化学修飾した特定のｄｓＲＮＡ構造について説明している。
本発明は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を使用して、血管形成および増殖に関連する遺伝子等の遺伝子発現を調節するのに有効な化合物、組成物、および方法に関する。さらに本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および血管内皮増殖因子受容体（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３）遺伝子、または小核酸分子を使用してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子発現および／またはＶＥＧＦ作用のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ経路に関与する遺伝子の発現および作用を調節するのに有効な化合物、組成物、および方法に関する。特に、本発明は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の小核酸分子、および対象または生物におけるＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ遺伝子および／またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ媒介性血管形成に関与する他の遺伝子の発現の調節に使用される方法を特徴とする。
本発明のｓｉＮＡは、非修飾であっても、化学修飾されたものであってもよい。本発明のｓｉＮＡは、化学的に合成するか、ベクターから発現するか、または酵素合成することがでできる。また本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、細胞中のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現または活性を調節できる様々な化学修飾合成低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。化学修飾したｓｉＮＡの使用は、抵抗の増加からヌクレアーゼ分解までおよび／または細胞摂取の改善等天然ｓｉＮＡ分子の様々な特性を改善する。さらに、先に公開されている研究とは逆に、複数の化学修飾を持つｓｉＮＡはそのＲＮＡｉ活性を保持する。本発明の前記ｓｉＮＡ分子は、様々な治療、動物、診断、標的検証、ゲノム検出、遺伝子工学、および薬理ゲノム学的アプリケーションに有効な試薬および方法を提供する。
１つの態様においては、本発明は１つ以上のｓｉＮＡ分子、および本明細書では概してそれぞれＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲと呼ばれ、表１に示すジンバンクアクセッション番号により参照される配列を含む遺伝子コード配列等の癌および他の増殖疾患の維持および進行に関連して、独立でまたは併用して、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および／または血管内皮増殖因子受容体（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３）等の遺伝子をコードするタンパク質の発現を調節する方法を特徴とする。ここでそれぞれＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲと呼ばれる典型的なＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３）遺伝子を参照して、本発明の様々な側面および態様に関する説明を以下に記す。しかし、この様々な側面および態様は、突然変異ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のスプライス変異体、他のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲリガンドおよび受容体等の他のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子も対象とする。またこの様々な側面および態様は、疾患（例、癌）の発育、進行および／または維持に関与するシグナル変換または遺伝子発現のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ媒介性経路に関与する他の遺伝子も対象とする。これらの追加遺伝子は、本明細書に記載のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子に対する方法を使用して、標的部位を分析することができる。従って、他の遺伝子の調節およびそのような調節の効果は、本明細書に記載のように実施、判定、および計測することができる。
１つの態様においては、本発明は、血管内皮増殖因子（例、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ）遺伝子の発現を下方制御する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記ｓｉＮＡ分子は約１５から約２８の塩基対を含む。
１つの態様においては、本発明は、血管内皮増殖因子（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３）遺伝子の発現を下方制御する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記ｓｉＮＡ分子は約１５から約２８の塩基対を含む。
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ）ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子は第一鎖および第二鎖からなり、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８から約２８ヌクレオチド長である。ｓｉＮＡ分子の第一鎖は、ｓｉＮＡ分子のＶＥＧＦ ＲＮＡに対して十分な相補性を持つヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ干渉を介してＶＥＧＦ ＲＮＡの切断を指示する。また前記ｓｉＮＡ分子の第二鎖は、第一鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ、例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３）ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子は第一鎖および第二鎖からなり、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８から約２８ヌクレオチド長である。ｓｉＮＡ分子の第一鎖は、ｓｉＮＡ分子のＶＥＧＦＲ ＲＮＡに対して十分な相補性を持つヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ干渉を介してＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する。また前記ｓｉＮＡ分子の第二鎖は、第一鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子は第一鎖および第二鎖からなり、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８から約２８ヌクレオチド長である。ｓｉＮＡ分子の第一鎖は、ｓｉＮＡ分子のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡに対して十分な相補性を持つヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ干渉を介してＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する。また前記ｓｉＮＡ分子の第二鎖は、第一鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子は第一鎖および第二鎖からなり、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８から約２３ヌクレオチド長である。ｓｉＮＡ分子の第一鎖は、ｓｉＮＡ分子のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡに対して十分な相補性を持つヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ干渉を介してＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する。また前記ｓｉＮＡ分子の第二鎖は、第一鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する化学合成した二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８から約２８ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の一鎖は、ｓｉＮＡ分子のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡに対して十分な相補性を持つヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ干渉を介してＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する。
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する化学合成した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８から約２３ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の一鎖は、ｓｉＮＡ分子のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡに対して十分な相補性を持つヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ干渉を介してＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示するＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するｓｉＮＡ分子を特徴とする。例えば、ここでＲＮＡのＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲコード配列を含む。１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するｓｉＮＡ分子、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示するｓｉＮＡ分子を特徴とする。例えば、ここでＲＮＡのＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ非コード配列、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現に関与する調節要素を含む。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子あるいはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子系（例、１つ以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲアイソフォーム）の発現を抑制するのに使用される。ここで、遺伝子または遺伝子系の配列は、配列相同性を共有する。そのような相同配列は、当該技術分野において周知のように、例えば配列アラインメントを使用して識別できる。ｓｉＮＡ分子は、例えば完全に相補的な配列を使用して、またはミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対等の、追加の標的配列を提供できる非正準塩基対を統合することにより、そのような相同配列を標的とするように設計できる。ミスマッチが識別される場合、非正準塩基対（例えば、ミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基）を使用して、２以上の遺伝子配列を標的とするｓｉＮＡ分子を生成できる。限定を目的としない例において、ＵＵおよびＣＣ塩基対等の非正準塩基対を使用して、配列相同性を共有する異なるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的の配列を標的とすることができる。このように、本発明のｓｉＮＡを使用する利点の１つは、単一ｓｉＮＡを、相同遺伝子間に保護されるヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含むように設計することができることである。このアプローチにおいて、単一ｓｉＮＡを使用して、複数のｓｉＮＡを使用して異なる遺伝子を標的とする代わりに、単一のｓｉＮＡを使用して、複数の遺伝子発現を抑制することができる。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、前記ｓｉＮＡ分子は表Ｉに示すジンバンクアクセッション番号を持つ配列等のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲコード配列を持つ任意のＲＮＡに相補的な配列を含む。別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、前記ｓｉＮＡ分子は、例えば、血管形成、癌、増殖性疾患、眼疾患、および／または腎疾患等の維持および／または進行に関連し、表Ｉに示されていないが、当該技術分野において周知の他の変異ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子等の変形ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲコード配列を持つＲＮＡに相補的な配列を含む。表ＩＩＩおよびＩＶに示す化学修飾または本明細書に記載の化学修飾は、本発明の任意のｓｉＮＡ構造に適用することができる。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用することでＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現のサイレンシングを媒介できるヌクレオチド配列を含む。例えばここで、前記ｓｉＮＡは、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の転写または翻訳を調節し、前記ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を回避する細胞過程によって、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現の制御を媒介する。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、前記ｓｉＮＡ分子は表Ｉに示すＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲジンバンクアクセッション番号を持つ任意のＲＮＡに相補的な配列を含む。別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は、例えば、変異ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のスプライス変異体、同類置換を持つＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ変異体、および相同ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲリガンドおよび受容体等の他のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲコード配列を持つＲＮＡに相補的な配列を含む。表ＩＩＩおよびＩＶに示される化学修飾、そうでなければ本明細書に記載の化学修飾は、本発明の任意のｓｉＮＡ構造に適用できる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、形質、疾患または状態に関連するＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲハプロタイプ多型から生じるタンパク質の発現を下方制御または抑制に使用される。遺伝子、またはタンパク質あるいはＲＮＡレベルの分析は、そのような多型を持つ対象、または本明細書に記載の形質、状態、または疾患を進行させる危険性のある患者の識別に使用することができる（例えば、シルベストリ（Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ）ら，２００３，国際癌学会誌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ），１０４，３１０−７を参照）。これらの対象は、本発明のｓｉＮＡ分子およびＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現に関連する疾患の治療に有効な任意の他の組成物を用いて治療することができる。このように、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲタンパク質、あるいはＲＮＡレベルを分析することによって、対象の治療する際の治療タイプおよび治療の経過を判断することができる。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲタンパク質、あるいはＲＮＡレベルをモニタリングすることによって、治療の成果を予測し、また形質、状態、または疾患に関連する特定のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲタンパク質のレベルおよび／または作用を調節する化合物および組成物の有効性を判断することができる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、水溶性ＶＥＧＦ受容体（例、ｓＶＥＧＦＲ１またはｓＶＥＧＦＲ２）発現の下方制御または抑制に使用される。水溶性ＶＥＧＦ受容体レベルを分析することによって、特定の癌タイプを持つ対象を識別することができる。それらの癌は、例えば本発明のｓｉＮＡ分子および任意の他の化学療法薬の組成物を用いて治療することができる。このように、水溶性ＶＥＧＦ受容体レベルの分析によって、対象を治療する際の治療タイプおよび治療の経過を判断することができる。水溶性ＶＥＧＦ受容体レベルをモニタリングすることによって、治療の成果を予測し、ＶＥＧＦ受容体のレベルおよび／または作用を調節する化合物および組成物の有効性を判断することができる（例えば、パヴコ（Ｐａｖｃｏ）米国特許出願１０／４３８，４９３を参照。これは参照することで図面も含めてその全体が本明細書に組み込まれる）。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖で構造される。ｓｉＮＡフィルターは、センス鎖を含む。ここで、前記センス鎖はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部を含む。
別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は、ＶＥＦＧおよび／またはＶＥＧＦＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列で構成されるアンチセンス領域を含む。さらにｓｉＮＡ分子は、センス領域を含む。ここでセンス領域は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部を含む。さらにｓｉＮＡ分子は、センス領域を含む。ここで、前記センス領域は、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部を含む。
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子配列のヌクレオチド配列またはその一部に相補的な前記ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域にヌクレオチド配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては、本発明は、例えば、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子配列またはその一部を含む配列に相補的な前記ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域等の領域を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。
別の態様においては、本発明は、例えばＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子配列のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域にあるヌクレオチド配列等のヌクレオチド配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては、本発明は、例えばＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子配列またはその一部を含む配列に相補的な前記ｓｉＮＡ構造のアンチセンス領域等の領域を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。
１つの態様においては、ｓｉＮＡ構造のアンチセンス領域は、表ＩＩおよびＩＩＩに示す標的配列識別番号のいずれかを持つ配列に相補的な配列を含む。１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ構造のアンチセンス領域は、表ＩＩおよびＩＩＩ、また図４および５に示すアンチセンス配列番号のいずれかを持つ配列を含む。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ構造のセンス領域は、表ＩＩおよびＩＩＩ、また図４および５に示すセンス配列番号のいずれかを持つ配列を含む。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、配列識別番号１−４２４８のいずれかを含む。配列識別番号１−４２４８に示される配列は限定されない。本発明のｓｉＮＡ分子は、連続するＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ配列を含むことができる（例、約１５から約２５以上、あるいは約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５以上の連続するＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲヌクレオチド）。
さらに別の態様においては、本発明は、例えば表Ｉに示すジンバンクアクセッション番号で示される配列を含む配列またはその一部に相補的な前記ｓｉＮＡ構造のアンチセンス配列等の配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。表ＩＩおよびＩＶの化学修飾、および本明細書に記載の化学修飾は、本発明の任意のｓｉＮＡ構造に適用することができる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを持つアンチセンス鎖を含む。ここで、アンチセンス鎖はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲをコードするＲＮＡ配列またはその一部に相補的であり、またここで、前記ｓｉＮＡはさらに約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを持つセンス鎖を含み、また前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、各鎖にある少なくとも約１５ヌクレオチドがもう一方の鎖に相補的である個別のヌクレオチド配列である。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを持つアンチセンス領域を含む。ここで、アンチセンス領域はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲをコードするＲＮＡ配列に相補的であり、また前記ｓｉＮＡはさらに約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを持つセンス領域を含む。ここで、前記センス領域および前記アンチセンス領域は、センス領域がアンチセンス領域に相補的な少なくとも約１５ヌクレオチドを含む直鎖分子において構成される。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を持つ。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲは互いにある程度の配列相同性を共有するため、異なるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的間で共有される配列または、代わりに特定のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的に固有の配列のいずれかを選択することによって、ｓｉＮＡ分子は、一群のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子または代わりに特定のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子（例、多型変異体）を標的とするように設計することができる。そのため、１つの態様においては、前記ｓｉＮＡ分子は、いくつかのＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子変異体の間で相同性を持つＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列の保護領域を標的とするように１つのｓｉＮＡ分子を持つ一群のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子を標的とするように設計することができる。従って、１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、対象におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ対立遺伝子の一方または両方の発現を調節する。別の態様においては、前記ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉ活性を媒介する必要があるという高度な特異性のため、特定のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列（例、単一のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ対立遺伝子またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））に固有の配列を標的とするようにデザインすることができる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＶＥＧＦＲ遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を持つ。ＶＥＧＦＲ遺伝子は互いにある程度の配列相同性を共有できるため、ｓｉＮＡ分子は、異なるＶＥＧＦＲ標的間で共有される配列または特定のＶＥＧＦＲ標的に固有の配列のいずれかを選択することによって、一群のＶＥＧＦＲ遺伝子（および関連する受容体またはリガンド遺伝子）または代わりに特定のＶＥＧＦＲ遺伝子を標的とするように設計することができる。そのため、１つの態様においては、前記ｓｉＮＡ分子は、１つのｓｉＮＡ分子を持ついくつかのＶＥＧＲ遺伝子（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３、異なるＶＥＧＦＲアイソフォーム、スプライス変異体、突然変異遺伝子等）を標的とするようにいくつかのＶＥＧＦＲ遺伝子間に相同性を持つＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列の保護領域を標的とするように設計することができる。１つの態様においては、前記ｓｉＮＡ分子は、共有配列相同性を持つＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡ配列を保護領域を標的とするように設計することができる（例は表ＩＩＩを参照）。従って、１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は２以上のＶＥＧＦＲ遺伝子、例えばＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３またはその任意の組み合わせの発現を調節する。別の態様においては、前記ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉ活性を媒介する必要があるという高度な特異性のため、特定のＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列に固有の配列を標的とするようにデザインすることができる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＶＥＧＦ遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を持つ。ＶＥＧＦ遺伝子は互いにある程度の配列相同性を共有できるため、ｓｉＮＡ分子は、異なるＶＥＧＦ標的間で共有される配列または、代わりに特定のＶＥＧＦ標的に固有の配列のいずれかを選択することによって、一群のＶＥＧＦ遺伝子（および関連する受容体またはリガンド遺伝子）または代わりに特定のＶＥＧＦ遺伝子を標的とするように設計することができる。そのため、１つの態様においては、前記ｓｉＮＡ分子は、１つのｓｉＮＡ分子を持ついくつかのＶＥＧＦ遺伝子（例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄ、異なるＶＥＧＦアイソフォーム、スプライス変異体、突然変異遺伝子等）を標的とするようにいくつかのＶＥＧＦ遺伝子間に相同性を持つＶＥＧＦ ＲＮＡ配列の保護領域を標的とするように設計することができる。従って、１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、２以上のＧＦ遺伝子、例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄまたはその任意の組み合わせの発現を調節する。別の態様においては、前記ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉ活性を調節する必要があるという高度の特異性のため、特定のＶＥＧＦ ＲＮＡ配列に固有の配列を標的とするようにデザインすることができる。
１つの態様においては、１つ以上のＶＥＧＦ受容体遺伝子（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３）を標的とする本発明のｓｉＮＡ分子は、乳がん、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、前立腺癌、結腸直腸癌、脳腫瘍、食道癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、神経膠腫、子宮内膜腫、多剤耐性癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管新生緑内障、近視性変性、関節炎、乾癬、子宮内膜症、雌の生殖器、尋常性疣贅、結節硬化症の血管線維種、ポートワイン母斑、スタージ・ウェーバー症候群、クリッペル・トレノネイ・ェーバ症候群、オスラー・ウェーバー・レンデュ症候群、常染色体優性多発性嚢胞腎等の腎疾患、および細胞または組織内のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２のレベルに関連するか、または応答する任意の他の疾患または状態を含むがそれらに限定されない腫瘍血管形成および癌等の疾患に関連した血管形成または新血管形成を持つ対象の治療等、単独または他の治療と組み合わせて、本明細書に記載の使用に基づいて、ＶＥＧＦ遺伝子（例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄ）を標的とする本発明のｓｉＮＡ分子と組み合わせて使用される。
別の態様においては、相同ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２配列を標的とする本発明のｓｉＮＡ分子は、乳癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、前立腺癌、結腸直腸癌、脳腫瘍、食道癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、頭頸部癌、皮膚癌、鼻咽腔癌、脂肪肉種、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、神経膠腫、子宮内膜腫、多剤耐性癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管新生緑内障、近視性変性、関節炎、乾癬、子宮内膜症、雌の生殖器、尋常性疣贅、結節硬化症の血管線維種、ポートワイン母斑、スタージ・ウェーバー症候群、クリッペル・トレノネイ・ェーバ症候群、オスラー・ウェーバー・レンデュ症候群、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）等の腎疾患、および細胞または組織内のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２のレベルに関連するか、または応答する任意の他の疾患または状態を含むがそれらに限定されない、腫瘍血管形成および癌等の血管形成または新血管形成に関連する疾患を持つ対象の治療等、本明細書に記載の使用に基づいて、ＶＥＧＦ−Ａを標的とするｓｉＮＡ分子と組み合わせて使用される。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡは、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３遺伝子の発現抑制に使用される。ここで、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３配列は、配列相同性を共有する。そのような相同配列は、当該技術分野において周知のように、例えば、配列アラインメントを使用して識別できる。ｓｉＮＡ分子は、例えば、完全に相補的な配列を使用するか、または追加の標的配列を提供できるミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対等の非正準塩基対を組み込むことによって、そのような相同配列を標的とするように設計することができる。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２間の配列アラインメントに関する限定を目的としない例を表ＩＩＩに示す。ミスマッチが示される場合、例えばミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基等の非正準塩基対を使用して、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡ配列の両方を標的とするｓｉＮＡ分子を生成することができる。限定を目的としない例において、ＵＵおよびＣＣ塩基対等の非正準塩基対は、異なるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ配列（例、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２）を標的とできるｓｉＮＡ分子の生成に使用される。このように、本発明のｓｉＮＡを使用する利点の１つは、単一のｓｉＮＡを、ＶＥＧＦ受容体（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３）間に保護されるヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含み、前記ｓｉＮＡが前記受容体のＲＮＡと相互さようし、ＲＮＡｉを媒介して前記ＶＥＧＦ受容体の発現を抑制するように設計できることである。このアプローチにおいて、複数のｓｉＮＡ分子を使用して異なる受容体を標的とする代わりに、単一のｓｉＮＡを使用して複数のＶＥＧＦ受容体の発現を抑制することができる。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２遺伝子の両方またはその一部によりコードされるか、またはそこに存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を持つｓｉＮＡを設計することを含む、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２遺伝子両方の発現を抑制するように単一のｓｉＮＡを設計する方法を特徴とする。例えば、単一のｓｉＮＡは、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２遺伝子またはその一部によりコードされるＲＮＡに存在する保護配列または相同配列に結合することによって、２つの遺伝子の発現を抑制することができる。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ３遺伝子またはその一部によりコードされるか、またはそこに存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を持つｓｉＮＡを設計することを含む、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ３遺伝子両方の発現を抑制するように単一のｓｉＮＡを設計する方法を特徴とする。ここで、前記ｓｉＮＡはＲＮＡｉを媒介して、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ３遺伝子両方の発現を抑制する。例えば、単一のｓｉＮＡは、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ３遺伝子またはその一部によりコードされるＲＮＡに存在する保護配列または相同配列に結合することにより、２つの遺伝子の発現を抑制することができる。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３遺伝子またはその一部によりコードされるか、またはそこに存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を持つｓｉＮＡを設計することを含む、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３遺伝子両方の発現を抑制するように単一のｓｉＮＡを設計する方法を特徴とする。ここで、前記ｓｉＮＡはＲＮＡｉを媒介して、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３遺伝子両方の発現を抑制する。例えば、単一のｓｉＮＡは、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３遺伝子またはその一部によりコードされるＲＮＡに存在する保護配列または相同配列に結合することにより、２つの遺伝子の発現を抑制することができる。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３遺伝子またはその一部によりコードされるか、またはそこに存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を持つｓｉＮＡを設計することを含む、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３遺伝子の発現を抑制するように単一のｓｉＮＡを設計する方法を特徴とする。例えば、単一のｓｉＮＡは、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３遺伝子またはその一部によりコードされるＲＮＡに存在する保護配列または相同配列に結合することにより、２つの遺伝子の発現を抑制することができる。
１つの態様においては、ＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング応答の媒介役として作用する本発明の核酸分子は、二本鎖核酸分子である。別の実子例において、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド間に約１５から約３０塩基対を含む二重鎖核酸分子で構成される。さらに別の実子例において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、約１９塩基対および３’末端モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド突出部を持つ約２１ヌクレオチド二重鎖等の約１から約３（例、約１、２、または３）ヌクレオチドの突出部末端を持つ二重鎖核酸分子で構成される。さらに別の実子例において、本発明のｓｉＮＡ分子は、平滑末端を持つ二重鎖核酸分子を含む。ここで、両端が平滑であるか、または一端が平滑である。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲタンパク質またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現に関連する非コードＲＮＡをコードするＲＮＡ等のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ発現核酸分子に対して特異性を持つ１つ以上の化学修飾したｓｉＮＡ構造を特徴とする。１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含むＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ発現核酸分子に対して特異性を持つＲＮＡベースのｓｉＮＡ分子（例、２’−ＯＨヌクレオチドを含むｓｉＮＡ）を特徴とする。そのような化学修飾に関する限定を目的としない例は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、およびターミナルグリセリルおよび／または逆位デオキシ脱塩基残基の結合を含む。様々なｓｉＮＡ構造（例、ＲＮＡベースのｓｉＮＡ構造）に使用する場合、これらの化学修飾は細胞内のＲＮＡｉ活性を保存すると同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に増加することが示される。さらに、上記パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）らにより公開されたデータに反して、出願人は、複数（１つ以上）のホスホロチオエート置換は優れた耐性を持ち、また修飾したｓｉＮＡ構造に対する血清安定性を大幅に増加することを説明する。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドを使用して、安定性、作用、および／または生体利用能等のインビトロまたはインビボ特性を改善することができる。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、前記ｓｉＮＡ分子にあるヌクレオチドの総数に占める割合の修飾ヌクレオチドを含むことができる。このため、本発明のｓｉＮＡ分子は、一般的に約５％から約１００％の修飾ヌクレオチド（例、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％修飾ヌクレオチド）を含むことができる。特定のｓｉＮＡ分子に存在する修飾ヌクレオチドの実際の比率は、ｓｉＮＡに存在するヌクレオチドの総数に依存する。ｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合、修飾率は、一本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するヌクレオチドの総数に基づく。同様に、ｓｉＮＡ分子が二本鎖である場合、修飾率はセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方に存在するヌクレオチドの総数に基づく。
本発明の一側面は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するか、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、１つ以上の化学修飾を含み、二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は、約２１ヌクレオチド長である。１つの態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。別の態様においては二本鎖ｓｉＮＡ分子は１つ以上のリボヌクレオチドを含む。１つの態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、独立に約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。ここで、各鎖はもう一方の鎖のヌクレオチドに相補的な約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９，２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。１つの態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の一鎖は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の第二鎖は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部とほぼ同様のヌクレオチド配列を含む。
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するか、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する、アンチセンス領域を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部、およびセンス領域を含む。ここで、センス領域は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部ににほぼ同様のヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては、アンチセンス領域およびセンス領域は、独立に約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。ここで、アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドに相補的な約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するか、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示し、センス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含み、センス領域は、アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、突出部ヌクレオチドを含まない末端等の平滑末端を含む。例えば、本明細書に記載の修飾を含む（例、化学式ＩからＶＩＩを持つヌクレオチド、または「Ｓｔａｂ００」−「Ｓｔａｂ３３」を含むｓｉＮＡ構造（表ＩＶ）あるいは、その任意の組み合わせ（表ＩＶ参照））ｓｉＮＡ分子および／または本明細書に記載の任意の長さは、平滑末端または突出ヌクレオチドを持たない末端を含むことができる。
１つの態様においては、本発明の任意のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の平滑末端を含む。例えばここで、平滑末端は突出ヌクレオチドを持たない。１つの態様においては、平滑末端ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の各鎖に存在するヌクレオチドの数に等しい多くの塩基対を持つ。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は１つの平滑末端を含む。例えばここで、アンチセンス鎖の５’端および前記センス鎖の３’端は、突出ヌクレオチドを持たない。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は１つの平滑末端を含む。例えばここで、アンチセンス鎖の３’端および前記センス鎖の５’端は、突出ヌクレオチドを持たない。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は２つの平滑末端を持つ。例えばここで、アンチセンス鎖の３’端およびセンス鎖の５’端、またアンチセンス鎖の５’端およびセンス鎖の３’端は突出ヌクレオチドを持たない。平滑末端ｓｉＮＡ分子は、例えば約１５から約３０ヌクレオチド（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）を含むことができる。平滑末端ｓｉＮＡ分子に存在する他のヌクレオチドは、例えばミスマッチ、バルジ、ループまたはゆらぎ塩基対を含み、ＲＮＡ干渉を媒介するｓｉＮＡ分子の活性を調節する。
「平滑末端」とは、対称的な末端または突出ヌクレオチドを持たない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を意味する。二本鎖ｓｉＮＡ分子の二本鎖は、末端に突出ヌクレオチドを持たず、互いに協調する。例えば、平滑末端ｓｉＮＡ構造は、ｓｉＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス領域間で相補的な末端ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するか、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は２つの個別のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられる。ここで、１つの断片はセンス領域を含み、もう１つの断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。センス領域は、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介して前記アンチセンス領域に結合することができる。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するか、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）塩基対を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は１つ以上の化学修飾を含む。別の態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の一鎖はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の第二鎖は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部とほぼ同様のヌクレオチド配列を含む。別の態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の一鎖は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の第二鎖は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部とほぼ同様のヌクレオチド配列を含む。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含み、各鎖はそのもう一方の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子は、例えば表Ｉに参照される配列を含むことができる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含む。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み、ｓｉＮＡはさらに、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部とほぼ同様のヌクレオチド配列を含む。別の態様においては、アンチセンス領域およびセンス領域はそれぞれ、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含み、アンチセンス領域はセンス領域のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子は、例えば表Ｉに参照される配列を含むことができる。別の態様においては、ｓｉＮＡは二本鎖核酸分子であり、ここでｓｉＮＡ分子の二本鎖は、独立に約１５から約４０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０）ヌクレオチドを含み、ｓｉＮＡ分子の一鎖は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列またはその一部に相補的な少なくとも約１５（例、約１５、１６，１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５あるいはそれ以上）ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む。ここでアンチセンス領域はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチドまたはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。およびセンス領域は、アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子は２つの個別のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられる。ここで、１つの断片はセンス領域を含み、もう１つの断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。別の態様においては、センス領域は、リンカー分子を介して前記アンチセンス領域に結合される。別の態様においては、センス領域はヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介して前記アンチセンス領域に結合される。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子は、例えば表Ｉに参照される配列を含むことができる。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するか、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示し、センス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド核酸またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域はアンチセンス領域に相補的ニアヌクレオチド配列を含む。またここで、ｓｉＮＡ分子は１つ以上の修飾ピリミジンおよび／またはプリンヌクレオチドを持つ。１つの態様においては、センス領域にあるピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、またセンス領域にあるプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の態様においては、センス領域のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域にあるプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。別の態様においては、センス領域にあるピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである、センス領域にあるプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。１つの態様においては、アンチセンス領域にあるピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス領域にあるプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。上述のｓｉＮＡ分子のいずれかに関する別の態様においては、センス鎖（例、突出領域）の非相補領域にある任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するか、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は２つの個別のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられる。ここで、１つの断片はセンス領域を含み、もう１つの断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。ここでセンス領域を含む断片は、その５’端、３’端、またはその両方に末端キャップ部を含む。１つの態様においては、末端キャップ部は逆位のデオキシ脱塩基部分またはグリセリル部分である。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の２つの断片はそれぞれ、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子の２つの断片はそれぞれ、約１５から約４０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０）ヌクレオチドを含む。限定を目的としない例において、ｓｉＮＡ分子の２つの断片はそれぞれ約２１ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては、本発明は少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、修飾ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチドである。ｓｉＮＡは、例えば約１５から約４０ヌクレオチド長である。１つの態様においては、ｓｉＮＡにあるすべてのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、ピリミジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡにある修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンまたは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の態様においては、ｓｉＮＡにある修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−フルオロシチジンおよび少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの態様においては、ｓｉＮＡにあるすべてのウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡにあるすべてのシチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡにあるすべてのアデノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡにあるすべてのグアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡはさらに、ホスホロチオエート結合等の少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。１つの態様においては、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを持つ位置等の、リボヌクレアーゼによる切断に敏感で、ｓｉＮＡにおいて特異的に選択された位置に存在する。
１つの態様においては、本発明は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを前記ｓｉＮＡ分子に導入することを含む、リボヌクレアーゼによる切断に対するｓｉＮＡ分子の安定性を増加する方法を特徴とする。ここで、修飾ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡにあるすべてのいりミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡにある修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンまたは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の態様においては、ｓｉＮＡにある修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−フルオロシチジンおよび少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの態様においては、ｓｉＮＡにあるすべてのウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡにあるすべてのシチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡにあるすべてのアデノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡにあるすべてのグアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡはさらに、ホスホロチオエート結合等の少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含むことができる。１つの態様においては、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを持つ位置等の、リボヌクレアーゼによる切断に敏感で、ｓｉＮＡにおいて特定の選択された位置に存在する。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するか、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示し、センス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。またここで、アンチセンス領域にあるプリンヌクレオチドは、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む。別の態様においては、アンチセンス領域にあるプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。上記態様のいずれかにおいて、前記アンチセンス領域は、アンチセンス領域の３’端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。あるいは、上記態様のいずれかにおいて、アンチセンス領域は、その３’端にグリセリル修飾を含むことができる。上述のｓｉＮＡ分子のいずれかに関する別の態様においては、アンチセンス鎖の非相補領域（例、突出領域）にある任意のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、疾患特異的な対立遺伝子に関連する単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む配列等、対象または生物における特定のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ疾患関連対立遺伝子に固有の配列を持つ内因性転写の一部に相補的な配列を含む。このため、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、疾患、状態または形質関連対立遺伝子に対して選択的なＲＮＡｉを媒介する際に特異性を提供する特定の対立遺伝子に固有の配列に対して相補的な配列を含むことができる。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方制御するか、またはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は２つの個別のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられる。ここで、１つの断片はセンス領域を含み、もう１つの断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。別の態様においては、前記ｓｉＮＡ分子は、二本鎖核酸分子である。ここで、各鎖は約２１ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の約１９ヌクレオチド各断片は、ｓｉＮＡ分子の他の断片の相補ヌクレオチドに対する塩基対である。ここで、ｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも２つの３’端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の断片のヌクレオチドに対する塩基対ではない。別の態様においては、ｓｉＮＡは二本鎖核酸分子である。ここで各鎖は約１９ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の断片の相補ヌクレオチドに対する塩基対であり、少なくとも約１５（例、１５、１６、１７、１８、または１９）塩基対を形成する。ここで、ｓｉＮＡ分子の一端または両端は平滑末端である。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の２つの３’端ヌクレオチドはそれぞれ、２’−デオキシ−チミジン等の２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドはすべて、ｓｉＮＡ分子の他の断片の相補ヌクレオチドに対する塩基対である。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は、センス領域およびアンチセンス領域を持つ約１９から約２５塩基対の二本鎖核酸分子である。ここで、アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドは、前記ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に対する塩基対である。別の態様においては、アンチセンス領域の約２１ヌクレオチドは、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に対する塩基対である。上記態様のいずれにおいても、前記アンチセンス領域を含む断片の５’端は、任意でリン酸基を含むことができる。
１つの態様においては、本発明はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列の発現を抑制する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする（例、ここで前記標的ＲＮＡ配列は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ経路に関与するＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子によりコードされる）。ここで、ｓｉＮＡ分子は任意のリボヌクレオチドを含まず、また二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５から約３０ヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子は約２１ヌクレオチド長である。ｓｉＮＡ構造を含む非リボヌクレオチドの例は、Ｓｔａｂ７／８、Ｓｔａｂ７／１１、Ｓｔａｂ８／８、Ｓｔａｂ１８／８、Ｓｔａｂ１８／１１、Ｓｔａｂ１２／１３、Ｓｔａｂ７／１３、Ｓｔａｂ１８／１３、Ｓｔａｂ７／１９、Ｓｔａｂ８／１９、Ｓｔａｂ１８／１９、Ｓｔａｂ７／２０、Ｓｔａｂ８／２０、Ｓｔａｂ１８／２０、Ｓｔａｂ７／３２、Ｓｔａｂ８／３２、またはＳｔａｂ１８／３２（例、Ｓｔａｂ７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、または３２センスまたはアンチセンス鎖あるいはその任意の組み合わせを持つ任意のｓｉＮＡ）等のセンス／アンチセンス化学反応の任意の組み合わせで表ＩＶに示される安定化学反応の組み合わせである。
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉を介してＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する化学合成した二本鎖ＲＮＡ分子を特徴とする。ここで、前記ＲＮＡ分子の各鎖は、約１５から約３０ヌクレオチド長である。ＲＮＡ分子の一鎖は、ＲＮＡ分子のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡに対して十分な相補性を持つヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ干渉を介してＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの切断を指示する。ここで、ＲＮＡ分子の少なくとも一鎖は任意で、限定を目的としないが、デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド等の本明細書に記載する１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む薬物を特徴とする。
１つの態様においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む有効成分を特徴とする。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を抑制、下方制御、または低減する二本鎖低分子干渉（ｓｉＮＡ）分子の使用を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子は１つ以上の化学修飾を含み、二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は、独立に約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチド長である。１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子である。ここで、ｓｉＮＡ分子の２つの断片はそれぞれ、約１５から約４０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０）ヌクレオチドを含み、鎖の１つはＲＮＡをコードするＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲのヌクレオチド配列またはその一部に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含む。限定を目的としない例において、ｓｉＮＡ分子の２つの断片はそれぞれ約２１ヌクレオチドを含む。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は１つ以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子である。ここで各鎖は、約２１ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片の約１９のヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他の断片の相補ヌクレオチドに対する塩基対である。ここで、ｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも２つの３’端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の断片のヌクレオチドに対する塩基対ではない。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は１つ以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子である。ここで、各鎖は約１９ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドは、前記ｓｉＮＡ分子の他の断片の相補ヌクレオチドに対する塩基対であり、少なくとも約１５（例、１５、１６、１７、１８、または１９）塩基対を形成する。ここでｓｉＮＡ分子の一端または両端は平滑末端である。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の２つの３’端ヌクレオチドはそれぞれ、２’−デオキシ−チミジン等の２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。別の態様においては、前記ｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドはすべて、前記ｓｉＮＡ分子の他の断片の相補ヌクレオチドに対する塩基対である。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は、センス領域およびアンチセンス領域を持ち、１つ以上の化学修飾を含む約１９から約２５塩基対の二本鎖核酸分子である。ここで、記アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドは、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に対する塩基対である。別の態様においては、約２１ヌクレオチドのアンチセンス領域は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に対する塩基対である。上記態様のいずれにおいても、前記アンチセンス領域を含む断片の５’端は、任意でリン酸基を含むことができる。
１つの態様においては、本発明はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を抑制、下方制御、または低減する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう一方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子にあるピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含む。
１つの態様においては、本発明はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を抑制、下方制御、または低減する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう一方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。またここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子にあるピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含む。
１つの態様においては、本発明はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を抑制、下方制御、または低減する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つは、タンパク質またはその一部をコードするＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう一方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。またここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子にあるピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含む。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上）のヌクレオチドを含む。ここで、各鎖はもう一方の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５ヌクレオチドを含む。１つの態様においては、前記ｓｉＮＡ分子は２つのオリゴヌクレオチド断片から組み立てられる。ここで、１つの断片は前記ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のヌクレオチドを含み、もう１つの断片は前記ｓｉＮＡ分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては、前記センス領域は、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介してアンチセンス鎖に結合される。別の態様においては、センス鎖にあるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域にあるプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の態様においては、センス鎖にあるピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域にあるプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。さらに別の態様においては、アンチセンス鎖にあるピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖にある任意のプリンヌクレオチドは２’−デオキシ−プリンヌクレオチドである。別の態様においては、アンチセンス鎖は１つ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド、および１つ以上の２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。別の態様においては、アンチセンス鎖にあるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖にある任意のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。別の態様においては、センス鎖は３’端および５’端を含み、ここで末端キャップ部（例、逆位デオキシ脱塩基部分または逆位チミジン等の逆位デオキシヌクレオチド部分）は、センス鎖の５’端、３’端、またはその両方に存在する。別の態様においては、アンチセンス鎖はその３’端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の態様においては、アンチセンス鎖は３’端にグリセリル修飾を含む。別の態様においては、アンチセンス鎖の５’端は任意でリン酸基を含む。
ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を抑制する二本鎖低分子核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する上記態様のいずれにおいても、二本鎖ｓｉＮＡ分子にあるピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含み、ｓｉＮＡ分子の二本鎖はそれぞれ約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０あるいはそれ以上）のヌクレオチドを含むことができる。１つの態様においては、約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０あるいはそれ以上）のヌクレオチドのｓｉＮＡ分子の各鎖は、ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖の相補ヌクレオチドに対する塩基対である。別の態様においては、約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０あるいはそれ以上）のヌクレオチドのｓｉＮＡ分子の各鎖は、ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖の相補ヌクレオチドに対する塩基対である。ここで、ｓｉＮＡ分子の各鎖の少なくとも２つの３’端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖のヌクレオチドに対する塩基対ではない。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の２つの３’端ヌクレオチドはそれぞれ、２’−デオキシ−チミジン等の２’−デオキシ−ピリミジンである。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖はもう一方の区割りの相補ヌクレオチドに対する塩基対である。１つの態様においては、アンチセンス鎖の約１５から３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に対する塩基対である。１つの態様においては、アンチセンス鎖の約１８から約２５（例、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチドはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に対する塩基対である。
１つの態様においては、本発明はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を抑制する二本鎖低分子干渉（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つは、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう１つの鎖はアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。またここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子にあるピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含み、アンチセンス鎖の５’端は任意でリン酸基を含む。
１つの態様においては、本発明はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を抑制する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう１つはアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。またここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子にあるピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列またはその一部は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの未翻訳領域のヌクレオチド配列またはその一部に相補的である。
１つの態様においては、本発明はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を抑制する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つは、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう１つは、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖である。ここで、二本鎖ｓｉＮＡ分子にあるピリミジンヌクレオチドの大部分は糖修飾を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡにあるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的である。
１つの態様においては、本発明は、医薬的に許容できる担体または希釈剤中の本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。
限定を目的としない例において、化学修飾したヌクレオチドを核酸分子に導入することで、体外から送達された天然ＲＮＡ分子に固有のインビボの安定性および生物学的利用能に関する潜在的な限界を克服する強力なツールが提供される。例えば、化学修飾した核酸分子は血清中でより長い半減期を持つため、化学修飾した核酸分子を使用することで、低用量の特定核酸分子で指定の治療効果を挙げることが可能になる。さらに、特定の化学修飾は、特定の細胞または組織のターゲティングまたは核酸分子の細胞摂取を向上させることによって、核酸分子の生物学的利用能を改善できる。そのため、例えばすべてのＲＮＡ核酸分子と比較する場合等、化学修飾した核酸分子の活性が天然核酸分子に比べて低い場合でも、修飾した核酸分子の安定性および／または送達が向上したことによって、その分子の全体活性は天然分子と比べて優れている。天然の未修飾ｓｉＮＡとは異なり、化学修飾したｓｉＮＡは、ヒトにおいてインターフェロン作用を活性化する可能性を最小限に抑えることもできる。
本明細書に記載するｓｉＮＡ分子のいずれの態様においても、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、前記アンチセンス領域の３’端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。ここに記載するｓｉＮＡ分子の任意の態様において、アンチセンス領域は約１つから約５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を前記アンチセンス領域の５’端に含むことができる。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の任意の態様において、本発明のｓｉＮＡ分子の３’端ヌクレオチド突出部は、核酸糖、塩基、または骨格で化学修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の任意の態様において、３’端ヌクレオチド突出部は１つ以上のユニバーサル塩基リボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載するｓｉＮＡ分子の任意の態様のいずれにおいても、３’端ヌクレオチド突出部は１つ以上の非環状ヌクレオチドを含むことができる。
本発明の１つの態様は、核酸分子の発現を許可する方法で、少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。本発明の別の態様は、そのような発現ベクターを含む哺乳類細胞を提供する。哺乳類細胞はヒトの細胞であってもよい。ｓｉＮＡ分子の発現ベクターはセンス領域およびアンチセンス領域を含むことができる。アンチセンス領域は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲをコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列に相補的な配列を含むことができ、またセンス領域は、アンチセンス領域に相補的な配列を含むことができる。ｓｉＮＡ分子は相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を持つ２つの個別の鎖を含むことができる。ｓｉＮＡ分子は、相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を持つ単一の鎖を含むことができる。
１つの態様においては、本発明は、細胞または再構築インビトロシステムにおいてＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、化学修飾は化学式Ｉ
Figure 2007505605
 を持つ骨格修飾ヌクレオチド間結合を含む１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のヌクレオチドを含み、
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、自然発生するまたは化学修飾した任意のヌクレオチド、非ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドであり、ＸおよびＹはそれぞれＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、または置換アルキルであり、ＺおよびＷはそれぞれＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリル、アラルキル、またはアセチルであり、またここでＷ、Ｘ、Ｙ、およびＺは任意ですべてがＯではない。別の態様においては、本発明の骨格修飾はホスホノ酢酸および／またはチオホスホノ酢酸ヌクレオチド間結合を含む（例えばシーハン（Ｓｈｅｅｈａｎ）ら，２００３，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３１，４１０９−４１１８を参照）。
化学式Ｉを持つ化学修飾ヌクレオチド間結合は、例えば、任意のＺ、Ｗ、Ｘ、および／またはＹはそれぞれ硫黄原子を含む場合、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方にあるｓｉＮＡ二重鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖またはその両方の３’端、５’端、またはその両方に１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の化学式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の５’端に化学式Ｉを持つ約１つから約５つ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学修飾ヌクレオチド間結合を含むことができる。別の限定を目的としない例において、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方に、約１つ、またはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の化学式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を持つピリミジンヌクレオチドを含むことができる。さらに別の限定を目的としない例において、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方に、約１つ、またはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の化学式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を含むプリンヌクレオチドを含むことができる。別の態様においては、化学式Ｉのヌクレオチド間結合を持つ本発明のｓｉＮＡ分子は、化学式ＩからＶＩＩのいずれかを持つ化学修飾したヌクレオチドまたは非ヌクレオチドも含む。
１つの態様においては、本発明は、細胞または再構築インビトロシステムにおいてＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで化学修飾は化学式ＩＩ
Figure 2007505605
 を持つ１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含み、
式中、Ｒ３、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７、Ｒ８，Ｒ１０、Ｒ１１，およびＲ１２はそれぞれＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ，Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、ｂ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、あるいは化学式ＩまたはＩＩのグループであり、Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ−Ｏ、ＣＨＦまたはＣＦ２であり、またＢはアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、または標的ＲＮＡに相補的または非相補的な任意の他の非自然発生塩基、等のヌクレオシド塩基、あるいはフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノンあるいは標的ＲＮＡに相補的または非相補的な任意の他の非自然発生ユニバーサル塩基、等の非ヌクレオシド塩基である。
化学式ＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドは、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方等、ｓｉＮＡ二重鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３’端、５’端、またはその両方に１つ以上の化学式ＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができる。例えば、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、約１つから約５つ、またはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学式ＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドをセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の５’端に含むことができる。別の限定を目的としない例において、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、約１つから約５つ、またはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学式ＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドをセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３’端に含むことができる。
１つの態様においては、本発明は細胞または再構築インビトロシステムにおいてＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、化学修飾は、化学式ＩＩＩ
Figure 2007505605
 を持つ１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含み、
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２はそれぞれＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、あるいは化学式ＩまたはＩＩのグループであり、Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ−Ｏ、ＣＨＦまたはＣＦ２であり、Ｂはアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、または標的ＲＮＡに相補的または非相補的となるように使用される任意の他の非自然発生塩基、等のヌクレオシド塩基、またはフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノンまたは標的ＲＮＡに相補的または非相補的な任意の他の非自然発生ユニバーサル塩基、等の非ヌクレオシド塩基である。
化学式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドは、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方等、ｓｉＮＡ二重鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の化学式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドをセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３’端、５’端、またはその両方に含むことができる。例えば、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、約１つから約５つ、またはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドをセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の５’端に含むことができる。別の限定を目的としない例において、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、約１つから約５つ、またはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドをセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３’端に含むことができる。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、化学式ＩＩまたはＩＩＩを持つヌクレオチドを含む。ここで、化学式ＩＩまたはＩＩＩを持つヌクレオチドは逆位構造にある。例えば、化学式ＩＩまたはＩＩＩを持つヌクレオチドは、一方または両方のｓｉＮＡ鎖の３’端、５’端、またはその両方といった、３’−３’、３’−２’、２’−３’、または５’−５’構造にあるｓｉＮＡ構造と結合される。
１つの態様においては、本発明は細胞または再構築インビトロシステムにおいてＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、化学修飾は化学式ＩＶ
Figure 2007505605
 を持つ５’端リン酸基を含み、
式中、ＸおよびＹはそれぞれＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、またはアルキルハロであり、ＺおよびＷはそれぞれＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリル、アラルキル、アルキルハロ、またはアセチルであり、またＷ、Ｘ、Ｙ、およびＺがすべてＯであることはない。
１つの態様においては、本発明は例えば、標的ＲＮＡに相補的な鎖等の標的相補鎖上に化学式ＩＶの５’端リン酸基を持つｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここでｓｉＮＡ分子はすべてのＲＮＡｓｉＮＡ分子を含む。別の態様においては、本発明は標的相補鎖上に化学式ＩＶの５’端リン酸基を持つｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここでｓｉＮＡ分子は、一方または両方の鎖の３’端に約１つから約４つ（例、約１、２、３、または４）のデオキシリボヌクレオチドを持つ約１つから約３つ（例、約１、２、または３）のヌクレオチドの３’端ヌクレオチド突出部も含む。別の態様においては、化学式ＩＶの５’端リン酸基は、例えば化学式ＩからＶＩＩのいずれかの化学修飾を持つｓｉＮＡ分子といった本発明のｓｉＮＡ分子の標的相補鎖上に存在する。
１つの態様においては、本発明は、細胞または再構築インビトロシステムにおいてＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、化学修飾は１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。例えば、限定を目的としない例において、本発明は、一方のｓｉＮＡ鎖に約１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を持つ化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。さらに別の態様においては、本発明は、両方のｓｉＮＡ鎖にそれぞれ約１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を持つ化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。前記ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方にあるｓｉＮＡ二重鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合をセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３’端、５’端、またはその両方に含むことができる。例えば、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の５’端に約１つから約５つ、またはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。別の態様においては、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方に１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。さらに別の態様においては、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方に１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。
１つの態様においては、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、センス鎖は１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または約１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチドを含み、また任意でセンス鎖の３’端、５’端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。ここで、アンチセンス鎖は約１つから約１０またはそれ以上、具体的には約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチドを含み、また任意でアンチセンス鎖の３’端、５’端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。別の態様においては、１つ以上、例えばセンスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または同一あるいは異なる鎖の３’端、５’端、またはその両方にある末端キャップ分子を持つか否かに関わらず、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
別の態様においては、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、センス鎖は約１つから約５つ、具体的には約１、２、３、４、または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または約１つ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチドを含み、また任意でセンス鎖の３’端、５’端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。またここで、アンチセンス鎖は、約１つから約５つまたはそれ以上、具体的には約１、２、３、４、５、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチドを含み、また任意で前記アンチセンス鎖の３’端、５’端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。別の態様においては、センスおよび／アンチセンスｓｉＮＡ鎖の１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、約１つから約５つ以上、例えば約１、２、３、４、５、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または同一あるいは異なる鎖の３’端、５’端、またはその両方にある末端キャップ分子を持つか否かに関わらず、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
１つの態様においては、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、アンチセンス鎖は、１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチドを含み、また任意でセンス鎖の３’端、５’端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。またここで、アンチセンス鎖は、約１つから約１０またはそれ以上、特に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチドを含み、また任意でアンチセンス鎖の３’端、５’端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。別の態様においては、センスおよび／アンチセンスｓｉＮＡ鎖の１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のピリミジンヌクレオチドは、約１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または同一あるいは異なる鎖の３’端、５’端、またはその両方にある末端キャップ分子を持つか否かに関わらず、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
別の態様においては、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とする。ここで、アンチセンス鎖は、約１つから約５つ以上、例えば約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチドを含み、また任意でセンス鎖の３’端、５’端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。またここで、アンチセンス鎖は、約１つから約５つ以上、特に約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチドを含み、また任意でアンチセンス鎖の３’端、５’端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。別の態様においては、センスおよび／アンチセンスｓｉＮＡ鎖の１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のピリミジンヌクレオチドは、約１つから約５つ、例えば約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または同一あるいは異なる鎖の３’端、５’端、またはその両方にある末端キャップ分子を持つか否かに関わらず、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
１つの態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子の各鎖に約１つから約５つまたはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を持つ化学修飾低分子核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
別の態様においては、本発明は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。２’−５’ヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ配列鎖の一方または両方の３’端、５’端、またはその両方に存在し得る。さらに、２’−５’ヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ配列鎖の一方または両方の様々な他の位置に存在し得る。例えば、すべてのヌクレオチド間結合を含む約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のｓｉＮＡ分子の一方または両方にあるピリミジンヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合を含むことができる。またはすべてのヌクレオチド間結合を含む約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のｓｉＮＡ配列鎖の一方または両方にあるプリンヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合を含むことができる。
別の態様においては、本発明の化学修飾ｓｉＮＡ分子は２つの鎖を持つ二重鎖を含み、その一方または両方の鎖は化学修飾することができる。ここで、各鎖はそれぞれ約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長である。二重鎖は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）の塩基対を持つ。また化学修飾は、化学式ＩからＶＩＩのいずれかを持つ構造を含む。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、２つの鎖を持つ二重鎖を含み、その一方または両方の鎖は化学式ＩからＶＩＩのいずれか、あるいはその任意の組み合わせを持つ化学修飾で化学修飾することができる。ここで、各鎖はそれぞれ２−ヌクレオチド３’端ヌクレオチド突出を持つ約２１のヌクレオチドで構成され、ここで二重鎖は約１９塩基対を持つ。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖ヘアピン構造を含み、ｓｉＮＡは約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）塩基対を持つ約３６から約７０（例、約３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０）ヌクレオチド長である。またここで、ｓｉＮＡは、化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ構造を含む化学修飾を含むことができる。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、化学式ＩからＶＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ化学修飾で化学修飾される約４２から約５０（例、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチドを持つ直鎖オリゴヌクレオチドを含む。ここで、直鎖オリゴヌクレオチドは、約１９から約２１（例、１９、２０、または２１）塩基対および２−ヌクレオチド３’端ヌクレオチド突出部を持つヘアピン構造を形成する。別の態様においては、本発明の直鎖ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフを含み、ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解が可能である。例えば、本発明の直鎖ヘアピンｓｉＮＡは、インビボのｓｉＮＡ分子のループ部分の分解によって約２ヌクレオチドを含む３’端ヌクレオチド突出部等の３’端突出部を持つ二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成できるようにデザインされる。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はヘアピン構造を含む。ここで、ｓｉＮＡは、約３から２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対を持つ約２５から約５０（例、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド長である。またここで、ｓｉＮＡは、化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ構造を含む１つ以上の化学修飾を含むことができる。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、化学式ＩからＶＩＩのいずれかまたはその任意の組み合わせを持つ１つ以上の化学修飾で化学修飾される約２５から約３５（例、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５）ヌクレオチドを持つ直鎖オリゴヌクレオチドを含む。ここで、直鎖オリゴヌクレオチドは、約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対および本明細書に記載のように化学修飾できる５’端リン酸基（例えば、化学式ＩＶを持つ５’端リン酸基）を持つヘアピン構造を形成する。別の態様においては、本発明の直鎖ヘアピンｓｉＮＡは、ステムループモチーフを含む。ここで、ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解が可能である。１つの態様においては、本発明の直鎖ヘアピンｓｉＮＡ分子は、非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分で構成される。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は非対称のヘアピン構造を含む。ここで、ｓｉＮＡは約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対を持つ約２５から約５０（例、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド長である。またここで、ｓｉＮＡは、化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ構造で構成される１つ以上の化学修飾を含むことができる。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ１つ以上の化学修飾で化学修飾される約２５から約３５（例、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５）ヌクレオチドを持つ直鎖オリゴヌクレオチドを含む。ここで、前記直鎖オリゴヌクレオチドは、約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対および本明細書に記載のように化学修飾できる５’端リン酸基（例えば、化学式ＩＶを持つ５’端リン酸基）を持つ非対称のヘアピン構造を形成する。１つの態様においては、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフを含む。ここで、ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解が可能である。別の態様においては、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分で構成される。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む個別のポリヌクレオチド鎖を持つ非対称の二本鎖構造を含む。ここで、アンチセンス領域は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレチド長であり、センス領域は約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチド長である。センス領域およびアンチセンス領域は少なくとも３つの相補ヌクレオチドを持ち、ｓｉＮＡは化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ構造を含む１つ以上の化学修飾を含むことができる。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、センス領域およびアンチセンス領域を含む個別のプリヌクレオチド鎖を持つ非対称の二本鎖構造を含む。ここで、アンチセンス領域は約１８から約２３（例、約１８、１９、２０、２１、２２、または２３）ヌクレオチド長であり、センス領域は約３から約１５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５）ヌクレオチド長である。センス領域およびアンチセンス領域は、少なくとも３つの相補ヌクレオチドを持ち、ｓｉＮＡは化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ構造を含む１つ以上の化学修飾を含むことができる。別の態様においては、非対称の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載のように化学修飾できる５’端リン酸基（例えば、化学式ＩＶを持つ５’端リン酸基）を持つこともできる。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は環状核酸分子を含む。ここでｓｉＮＡは、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）塩基対を持つ約３８から約７０（例、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０）ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡは化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ構造を含む化学修飾を含むことができる。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ化学修飾で化学修飾される約４２から約５０（例、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチドを持つ環状オリゴヌクレオチドを含む。ここで、環状オリゴヌクレオチドは、約１９の塩基対と２つのループを持つダンベル型構造を形成する。
別の態様においては、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は２つのループモチーフを含む。ここで、ｓｉＮＡ分子の１つまたは両方のループ部分は生分解が可能である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、インビボのｓｉＮＡ分子のループ部分を分解することにより、約２ヌクレオチドを含む３’端ヌクレオチド突出部等の３’端突出部を持つ二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成できるようにデザインされる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば化学式Ｖ
Figure 2007505605
 を持つ化合物等の少なくとも１つ（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の脱塩基部分を含み、
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５，Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、または化学式ＩまたはＩＩを持つグループであり、Ｒ９はＯ、Ｓ，ＣＨ２、Ｓ−Ｏ、ＣＨＦ、またはＣＦ２である。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば化学式ＶＩ
Figure 2007505605
 の化合物といった少なくとも１つ（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の逆位脱塩基部分を含み、
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１３はそれぞれＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、または化学式ＩあるいはＩＩを持つグループであり、Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ−Ｏ、ＣＨＦ、またはＣＦ２であり、またＲ２、Ｒ３、Ｒ８またはＲ１３は本発明のｓｉＮＡ分子との結合点となる。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば化学式ＶＩＩ
Figure 2007505605
 を持つ化合物等の少なくとも１つ（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の置換ポリアルキル部分を含み、
式中、ｎはそれぞれ１から１２の整数であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、または化学式Ｉを持つグループであり、またＲ１、Ｒ２、またはＲ３は本発明のｓｉＮＡ分子との結合点となる。
別の態様においては、本発明は化学式ＶＩＩを持つ化合物を特徴とする。ここでＲ１およびＲ２はヒドロキシル（ＯＨ）グループであり、ｎ＝１であり、Ｒ３はＯを含み、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖の３’端、５’端、またはその両方との結合点、または本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子との結合点である。本明細書において、当該修飾は「グリセリル」と呼ばれる（例えば図１０の修飾６）。
別の態様においては、本発明の化学修飾ヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例、化学式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩのいずれかを持つ部分）は、本発明のｓｉＮＡ分子の３’端、５’端、またはその両方に存在する。例えば、化学修飾ヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例、化学式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを持つ部分）は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３’端、５’端、またはその両方に存在し得る。１つの態様においては、化学修飾したヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例、化学式Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩを持つ部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’端および３’端、およびアンチセンス鎖の３’端に存在する。１つの態様においては、化学修飾したヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例、化学式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを持つ部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’端および３’端、およびアンチセンス鎖の３’端の末端位置に存在する。１つの態様においては、化学修飾したヌクレオシドまたは非ヌクレオシド（例、化学式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを持つ部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’端および３’端、およびアンチセンス鎖の３’端の最後から２番目の位置に存在する。さらに、化学式ＶＩＩを持つ部分は、本明細書に記載のようにヘアピンｓｉＮＡ分子の３’端または５’端に存在し得る。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は化学式ＶまたはＶＩを持つ脱塩基残基を含む。ここで、化学式ＶまたはＶＩを持つ脱塩基残基は、ｓｉＮＡ鎖の一方または両方の３’端、５’端、またはその両方にある３’−３’、３’−２’、２’−３’、または５’−５’構造のｓｉＮＡ構造と結合する。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えばその５’端、３’端、その両方、またはその任意の組み合わせに１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えばｓｉＮＡ分子の５’端、３’端、その両方、またはその任意の組み合わせに１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の非環式ヌクレオチドを含む。
１つの態様においては、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、前記センス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記センス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである）、センス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。またここで、前記センス領域に存在する３’端ヌクレオチド突出部を含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記センス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである）、前記センス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては、本発明はセンス領域を含む本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである）、前記センス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである）。またここで、前記センス領域に存在する３’端ヌクレオチド突出部を含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては、本発明はアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては、本発明はアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである）。またここで、前記アンチセンス領域に存在する３’端ヌクレオチド突出部を含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの態様においては、本発明はアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては、本発明はアンチセンス領域を含む本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、アンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである）。
１つの態様においては、本発明はセンス領域を含む細胞または再構築インビトロシステム内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、センス領域に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである）、前記センス領域に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。またここで、１つ以上のアンチセンス領域に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである）。センス領域および／またはアンチセンス領域は、本明細書に記載または図１０に示すように、前記センス領域および／またはアンチセンス領域の３’端、５’端、またはその両方に任意で存在する任意の修飾等の末端キャップ修飾を持つことができる。さらにセンス領域および／またはアンチセンス領域は、約１つから約４つ（例、約１、２、３、または４）のホスホロチオエート、ホスホノアセテート、および／またはチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合を含むことができる。これらの化学修飾ｓｉＮＡに関する限定を目的としない例は、本明細書の図４および５、ならびに表ＩＩＩおよびＩＶに示す。上記態様のいずれかにおいて、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、代替として２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドであり（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである）。また、これらの態様のいずれかにおいて、センス領域に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドは、代替としてプリンリボヌクレオチドであり（例、ここですべてのプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシプリンヌクレオチドである）。さらにこれらの態様のいずれかにおいて、前記センス領域および／またはアンチセンス領域に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドは、代替として２’−デオキシヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成されるグループから選択される（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成されるグループから選択されるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成されるグループから選択される）。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子に存在する、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス、また任意でセンス鎖および／またはその両方に存在する任意の修飾ヌクレオチドは自然発生するリボヌクレオチドと同様の特性または特徴を持つ修飾ヌクレオチドを含む。例えば、ノーザン構造を持つ修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする（例、ノーザン擬似回転サイクル、ゼンガー（Ｓａｅｎｇｅｒ），核酸構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ），スプリンガー・ヴァーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）ら，１９８４年を参照）。そのように、本発明のｓｉＮＡ分子に存在する、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス、また任意でセンス鎖および／またはその両方に存在する化学修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持すると同時に、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を示す。ノーザン構造を持つヌクレオチドに関する限定を目的としない例は、ロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド：２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。
１つの態様においては、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、その３’端、５’端、またはその両方に逆位デオキシ脱塩基部分等の末端キャップ部（図１０を参照）を含む。
１つの態様においては、本発明は細胞または再構築インビトロシステム内でＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾低分子核酸分子（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ここで、化学修飾は化学修飾ｓｉＮＡ分子に共有結合しているコンジュゲートを含む。本発明で意図するコンジュゲートの限定を目的としない例は、ヴァルギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）ら，２００３年４月３０日付米国特許出願１０／４２７，１６０に記載のコンジュゲートおよびリガンドを含む。この特許は、参照することにより図も含めてその全体が本明細書に組み込まれる。別の態様においては、コンジュゲートは生分解が可能なリンカーを介して化学修飾ｓｉＮＡ分子と共有結合している。１つの態様においては、コンジュゲート分子は化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖またはその両方の３’端で結合する。別の態様においては、コンジュゲート分子は化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖またはその両方の５’端で結合する。さらに別の態様においては、コンジュゲート分子は化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖またはその両方の３’端および５’端で結合する。１つの態様においては、本発明のコンジュゲート分子は細胞等の生物系への化学修飾ｓｉＮＡ分子の送達を促進する分子を含む。別の態様においては、化学修飾ｓｉＮＡ分子に結合するコンジュゲート分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、または細胞摂取を媒介できる細胞受容体のリガンドである。化学修飾ｓｉＮＡ分子に結合でき、本発明で意図する特定のコンジュゲート分子の例は、ヴァルギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）ら，２００２年７月２２日付米国特許出願１０／２０１，３９４に記載されており、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。使用されるコンジュゲートのタイプおよび本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲートの範囲は、ｓｉＮＡ構造の薬物動態プロファイル、生物学的利用能、および／または安定性の改善のために評価できる一方、ＲＮＡｉ作用を媒介するｓｉＮＡの能力を維持することができる。当然、当該技術分野における技術を有する者であれば、様々なコンジュゲートで修飾したｓｉＮＡ構造を検定して、前記ｓｉＮＡコンジュゲート複合体が改善された特性を待ちながらＲＮＡｉを媒介する能力を維持しているかを判断することができる。例えば、当該技術分野では動物モデルにおける例が一般的に知られている。
１つの態様においては、本発明は本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここでｓｉＮＡは、さらにヌクレオチド、非ヌクレオチド、またはｓｉＮＡのセンス領域をｓｉＮＡのアンチセンス領域に結合する混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含む。１つの態様においては、本発明のヌクレオチドリンカーは、２より多いヌクレオチド長、例えば約３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長のリンカーであってもよい。別の態様においては、前記ヌクレオチドリンカーは核酸アプタマーであってもよい。本明細書で使用する「アプタマー」または「核酸アプタマー」は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味する。ここで核酸分子は、その自然環境において標的分子によって認識される配列を含む配列を持つ。代わりにアプタマーは、核酸に自然結合しない標的分子に結合する核酸分子であってもよい。標的分子は、関連の任意の分子であってよい。例えば、アプタマーを使用して、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合することができ、それによって自然発生するリガンドとタンパク質の相互作用を回避することができる。これは限定を目的としない例であり、当業者であれば、当該技術分野において一般に知られている技術を使用して、他の例を容易に実施できる（例として、ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら，１９９５年，生化学アニュアルレビュー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ），６４，７６３；ブロディ（Ｂｒｏｄｙ）とゴールド（Ｇｏｌｄ），２０００年，生物工学会誌（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），７４，５；サン（Ｓｕｎ），２０００年，分子治療学カレントオピニオン（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．），２，１００；クッサー（Ｋｕｓｓｅｒ），２０００年，生物工学会誌（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），７４，２７；ハーマン（Ｈｅｒｍａｎｎ）とパテル（Ｐａｔｅｌ），２０００年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８７，８２０；およびジャヤセナ（Ｊａｙａｓｅｎａ），１９９９年，臨床化学誌（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），４５，１６２８を参照）。
さらに別の態様においては、本発明の非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、または他のポリマー化合物（例、２から１００エチレングリコール単位を持つポリエチレングリコール等）を含む。特定の例は、シーラ（Ｓｅｅｌａ）とカイザー（Ｋａｉｓｅｒ），核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１９９０年，１８：６３５３および核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１９８７年，１５：３１１３；クロード（Ｃｌｏａｄ）とシェパーツ（Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ），米国化学学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１９９１年，１１３：６３２４；リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）とシェパーツ（Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ），米国化学学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１９９１年，１１３：５１０９；マ（Ｍａ）ら，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），１９９３年，２１：２５８５および生物化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９９３年，３２：１７５１；デュラン（Ｄｕｒａｎｄ）ら，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），１９９０年，１８：６３５３；マカーディ（ＭｃＣｕｒｄｙ）ら，ヌクレオシドとヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）１９９１年，１０：２８７；イシュク（Ｊｓｃｈｋｅ）ら，テトラヒドロン通信（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ），１９９３年，３４：３０１；オノ（Ｏｎｏ）ら，生物化学（Ｂｉｏｃｅｍｉｓｔｒｙ）１９９１年，３０：９９１４；アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ）ら，国際公開ＷＯ８９／０２４３９；ウスマン（Ｕｓｍａｎ）ら，国際公開ＷＯ９５／０６７３１；ドゥーディッチ（Ｄｕｄｙｃｚ）ら，国際公開ＷＯ９５／１１９１０およびフェレンツ（Ｆｅｒｅｎｔｚ）とヴェルディン（Ｖｅｒｄｉｎｅ），米国化学学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９１年，１１３：４０００に記載の例を含み、これらはすべて参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに「非ヌクレオチド」は１つ以上のヌクレオチド単位として核酸鎖に組み込むことができ、糖および／またはリン酸塩置換を含む任意のグループまたは化合物を意味し、残基はその酵素活性を示すことができる。前記グループまたは化合物は、例えば糖のＣ１位にアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミン等の一般に認識されているヌクレオチド塩基を含まない場合は、脱塩基であってよい。
１つの態様においては、本発明は、細胞または再構築インビトロシステム内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖は、リボヌクレオチドを含まない２つの個別のオリゴヌクレオチドから組み立てられる。例えば、ｓｉＮＡ分子は単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ここで、ｓｉＮＡのセンスおよびアンチセンス領域は、オリゴヌクレオチドに存在するリボヌクレオチドを含まない個別のオリゴヌクレオチド（例、２’−ＯＨグループを持つヌクレオチド）を含む。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ここで、ｓｉＮＡのセンスおよびアンチセンス領域は、本明細書に記載のようにヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーにより結合されるか、または環状になる。ここで、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに存在するリボヌクレオチド（例、２’−ＯＨグループを持つヌクレオチド）を含まない。驚くべきことに、出願人はｓｉＮＡ分子内のリボヌクレオチド（例、２’−ヒドロキシルグループを持つヌクレオチド）の存在はＲＮＡｉ活性のサポートに必要不可欠ではないことを発見した。そのように、１つの態様においては、ｓｉＮＡ内のすべての位置は化学式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩまたはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド等の化学修飾したヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドを含むことができ、細胞におけるＲＮＡｉ活性をサポートするｓｉＮＡ分子の能力をある程度維持することができる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞または再構築インビトロシステム内でＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子である。ここで、前記ｓｉＮＡ分子は標的核酸配列に対して相補性を持つ一本鎖ポリヌクレオチドを含む。別の態様においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は５’端リン酸基を含む。別の態様においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は５’端リン酸基および３’端リン酸基（例、２’，３’−環状リン酸）を含む。別の態様においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。さらに別の態様においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の１つ以上の化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。例えば、前記ｓｉＮＡ分子内のすべての位置は、化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチド等の化学修飾ヌクレオチドを含むことができ、細胞におけるＲＮＡｉ活性をサポートするｓｉＮＡ分子の能力をある程度維持することができる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列に対して相補性を持つ一本鎖ポリヌクレオチドを含む細胞または再構築インビトロシステム内でＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子である。ここで、ｓｉＮＡに存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドである）アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、または２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。また、本明細書または図１０に示す任意の修飾等の末端キャップ修飾は、任意でアンチセンス配列の３’端、５’端、またはその両方に存在する。ｓｉＮＡは、さらに任意で約１つから約４つまたはそれ以上（例、約１、２、３、４、またはそれ以上）の末端２’−デオキシヌクレオチドをｓｉＮＡ分子の３’端に含む。ここで末端ヌクレオチドはさらに、１つ以上（例、１、２、３、４、またはそれ以上）のホスホロチオエート、ホスホロアセテート、および／またはチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合を含むことができ、またｓｉＮＡはさらに任意で、５’端リン酸基等の末端リン酸基を含む。これらの態様のいずれかにおいて、アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは、代わりに２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。また、これらの態様のいずれかにおいて、ｓｉＮＡに存在する任意のプリンヌクレオチド（例、センスおよび／またはアンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチド）は、代わりにロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであってよい（例、ここですべてのプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドであるか、代わりに複数のプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドである）。また、これらの態様のいずれかにおいて、ｓｉＮＡに存在する任意のプリンヌクレオチドは、代わりに２−メトキシエチルプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドであるか、または代わりに複数のプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである）。別の態様においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子に存在する任意の修飾ヌクレオチドは、自然発生するリボヌクレオチドと同様の特性または特徴を持つ修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明はノーザン構造を持つ修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする（例、ノーザン擬似回転サイクル、ゼンガー（Ｓａｅｎｇｅｒ），核酸構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ），スプリンガー・ヴァーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）ら，１９８４を参照）。このように、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子に存在する化学修飾ヌクレオチドは、好ましくはＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら、同時にヌクレアーゼ分解に対する耐性を持つ。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、化学修飾したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド（例、化学式ＩからＶＩＩのいずれかを持つ、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド等）を、前記ｓｉＮＡ分子の１つ以上の鎖または領域内の代替位置に含む。例えば、そのような化学修飾は、ｓｉＮＡの３’端または５’端から第一または第二ヌクレオチドのいずれかで開始して、ＲＮＡベースのｓｉＮＡ分子の他の各位置に導入することができる。限定を目的としない例において、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、各鎖の１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１位が化学修飾されるという特徴を持つ（例、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド等、化学式ＩからＶＩＩのいずれかを持つ化合物を用いて）。限定を目的としない別の例において、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、各鎖の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０位が化学修飾されるという特徴を持つ（例、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド等、化学式ＩからＶＩＩのいずれかを持つ化合物を用いて）。そのようなｓｉＮＡ分子はさらに、本明細書に記載のような末端キャップ部および／または骨格修飾を含むことができる。
１つの態様においては、本発明は細胞内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１つがＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子に相補的な配列を含む）、および（ｂ）細胞内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、前記ｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
１つの態様においては、本発明は細胞内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１つがＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一かまたはほぼ同様の配列を含む）、および（ｂ）細胞内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
別の態様においては、本発明は細胞内の２以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１つがＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む）、および（ｂ）細胞内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、前記ｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
別の態様においては、本発明は細胞内の２つ以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明の１つ以上のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖がＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一かまたはほぼ同様の配列を含む）、および（ｂ）細胞内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
別の態様においては、本発明は細胞内の２以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１つがＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一かまたはほぼ同様の配列を含む）、および（ｂ）細胞内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は体外アプリケーションにおける試薬として使用される。例えば、ｓｉＮＡ試薬は、治療効果を挙げるため対象に移植される組織または細胞に導入される。細胞および／または組織は、後に外移植を受ける生物体または対象から採取するか、または移植前に別の生物体または対象から採取することができる。ｓｉＮＡ分子を使用して、細胞または組織内の１つ以上の遺伝子発現を調節することができる。そのため、細胞または組織は、望ましい表現型を取得するか、またはインビボで移植された場合に機能を発揮することができる。１つの態様においては、特定の標的細胞を患者から抽出する。これらの抽出細胞は、それらの細胞によるｓｉＮＡの摂取に適した条件下で（例、カチオン脂質、リポソーム等の送達試薬を使用するか、または細胞へのｓｉＮＡ送達を促進するエレクトロポレーション等の技術を使用して）、細胞内で特定のヌクレオチド配列を標的とするｓｉＮＡに接触される。その後、細胞は同一の患者または他の患者に再導入される。１つの態様においては、本発明は組織外植片におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１つがＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む）、および（ｂ）組織外植片におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を特定の生物から摂取した組織外植片の細胞に導入することを含む。別の態様においては、さらに前記方法は、その生物におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、組織を採取した生物または別の生物に組織外植片を再導入することを含む。
１つの態様においては、本発明は組織外植片におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１つがＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一かまたはほぼ同様の配列を含む）、および（ｂ）組織外植片におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、特定の生物から採取した組織外植片の細胞にｓｉＮＡ分子を導入することを含む。別の態様においては、さらに前記方法は、その生物体内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、組織を採取した生物体または別の生物体に組織外植片を再導入することを含む。
別の態様においては、本発明は組織外植片における１つ以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１つはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む）、および（ｂ）組織外植片におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を特定の生物から摂取した組織外植片の細胞に導入することを含む。別の態様においては、前記方法はさらに、その生物体内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、組織を摂取した生物体または別の生物体に組織外植片を再導入することを含む。
１つの態様においては、本発明は対象または生物体内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１つはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子に相補的な配列を含む）、および（ｂ）対象または生物におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象または生物に導入することを含む。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲタンパク質あるいはＲＮＡのレベルは、当該技術分野においてよく知られている様々な方法を使用して判定できる。
別の態様においては、本発明は対象または生物体における２以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖の１つはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む）、および（ｂ）対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象または生物体に導入することを含む。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲタンパク質あるいはＲＮＡのレベルは、当該技術分野においてよく知られている様々な方法を使用して判別できる。
１つの態様においては、本発明は細胞内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子に相補的な一本鎖配列を含む）、および（ｂ）細胞におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
別の態様においては、本発明は細胞内の２以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに対して相補性を持つ一本鎖配列を含む）、および（ｂ）細胞内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、細胞をインビトロまたはインビボでｓｉＮＡ分子に接触させることを含む。
１つの態様においては、本発明は組織外植片（例、肝臓移植）におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに対して相補性を持つ一本鎖配列を含む）、および（ｂ）組織外植片におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、特定の対象または生物体から採取した組織外植片の細胞をｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。別の態様においては、さらに前記方法は、その生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、組織を摂取した生物体または別の生物体に組織外植片を再導入することを含む。
別の態様においては、本発明は組織外植片（例、肝臓移植）における２以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに対して相補性を持つ一本鎖配列を含む）、および（ｂ）組織外植片におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を特定の対象または生物体から採取した組織外植片の細胞に導入することを含む。別の態様においては、さらに前記方法は、その対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、組織を摂取した対象または生物体に組織外植片を再導入することを含む。
１つの態様においては、本発明は対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに対して相補性を持つ一本鎖配列を含む）、および（ｂ）対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象または生物体に導入することを含む。
別の態様においては、本発明は対象または生物体における２以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾できる本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、ｓｉＮＡ鎖はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子のＲＮＡに対して相補性を持つ一本鎖配列を含む）、および（ｂ）対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象または生物体に導入することを含む。
１つの態様においては、本発明は、対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。
１つの態様においては、本発明は、対象または生物体における眼疾患を治療または予防する方法を特徴とし、対象または生物におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現の抑制因子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。１つの態様においては、眼疾患は加齢性黄斑変性症（例、湿性または乾性ＡＭＤ）である。１つの態様においては、眼疾患は糖尿病性網膜症である。
１つの態様においては、本発明は、対象または生物における癌を治療または予防する方法を特徴とし、対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現の抑制因子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。１つの態様においては、癌は、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または腫瘍の血管新生で構成されるグループから選択される。
１つの態様においては、本発明は、対象または生物体における増殖性疾患を治療または予防する方法を特徴とし、対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現の抑制因子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。
１つの態様においては、本発明は、対象または生物体における腎疾患を治療または予防する方法を特徴とし、対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現の抑制因子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。１つの態様においては、腎疾患は多発性嚢胞腎である。
１つの態様においては、本発明は、対象または生物体における血管形成を治療または予防する方法を特徴とし、対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現の抑制因子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。
別の態様においては、本発明は、対象または生物体における２以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、対象または生物体におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節する（例、抑制する）のに適した条件下で、対象または生物体を本発明の１つ以上のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。
本発明のｓｉＮＡ分子は、様々なＲＮＡ分子のＲＮＡｉターゲティングを通じて、標的（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ）遺伝子の発現を下方制御または抑制するようにデザインすることができる。１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子を使用して、標的遺伝子に対応する様々なＲＮＡを標的とする。そのようなＲＮＡの限定を目的としない例は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、標的遺伝子の代替ＲＮＡスプライス変異体、標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ、標的遺伝子のプレｍＲＮＡ、および／またはＲＮＡテンプレートを含む。代替スプライシングによって、適切なエクソンの使用によって区別される一群の転写物が生成される場合、本発明を使用すると、適切なエクソンを通して遺伝子発現を抑制し、特異的な抑制、または遺伝子群メンバーの機能の識別が可能になる。例えば、代替スプライス膜貫通ドメインを含むタンパク質は、膜結合型および分泌型の両方で発現することができる。本発明を使用して膜貫通ドメインを含むエクソンを標的とすることで、タンパク質の分泌型に対向する膜結合型の製薬ターゲティングの機能的結果を判別することができる。これらのＲＮＡ分子のターゲティングに関連する本発明のアプリケーションの限定を目的としない例は、治療医薬アプリケーション、医薬品発見アプリケーション、分子診断および遺伝子機能アプリケーション、および例えば本発明のｓｉＮＡ分子を用いた単一のヌクレオチド多型マッピングを使用した遺伝子マッピングを含む。そのようなアプリケーションは、周知の遺伝子配列または発現配列標識（ＥＳＴ）から取得可能な部分配列を使用して実施できる。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子を使用して、１つ以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲファミリー遺伝子等の遺伝子ファミリーに対応する保存配列を標的とする。そのようにして、複数のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的をターゲットとするｓｉＮＡ分子は治療効果を高めることができる。さらに、ｓｉＮＡを使用して、様々なアプリケーションにおける遺伝子機能の経路を特徴付けることができる。例えば、本発明を使用して、経路における標的遺伝子の活性を抑制し、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析、または翻訳分析において未同定の遺伝子の機能を判別することができる。本発明を使用して、医薬品開発に向けた様々な疾患および状態に関与する潜在的な標的遺伝子経路を判別することができる。本発明を使用して、例えば癌の進行および／または維持等に関与する遺伝子発現の経路を理解することができる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子および／または方法を使用して、ジンバンクアクセッション番号によって本明細書に参照されるＲＮＡをコードする遺伝子、例えば表Ｉに示すジンバンクアクセッション番号によって本明細書で参照されるＲＮＡ配列をコードするＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子を下方制御する。
１つの態様においては、本発明は（ａ）事前設定された複雑性を持つｓｉＮＡ構造のライブラリを生成すること、および（ｂ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的部位を判別するのに適した条件下で、前記（ａ）のｓｉＮＡ構造を試験することを含む方法を特徴とする。１つの態様においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は例えば約２３ヌクレオチド長といった固定長の鎖を持つ。別の態様においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は例えば約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長の異なる長さの鎖を持つ。１つの態様においては、アッセイには本明細書に記載の再構築インビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。別の態様においては、アッセイには標的ＲＮＡが発現する細胞培養システムを含むことができる。別の態様においては、標的ＲＮＡの断片は、例えばゲル電気泳動、ノーザンブロット解析、またはＲＮＡｓｅ保護アッセイによって、検出可能なレベルの切断を分析し、標的ＲＮＡ配列内の最適標的部位を判断する。前記標的ＲＮＡ配列は、当該技術分野において周知のように、例えばクローニングおよび／またはインビトロシステムの転写、およびインビボシステムにおける細胞発現によって取得することができる。
１つの態様においては、本発明は（ａ）４N等の事前設定された複雑性を持つｓｉＮＡ構造のランダムなライブラリ生成すること（ここでＮは各ｓｉＮＡ構造鎖における塩基対ヌクレオチドの数を示す（例、１９塩基対とともに２１ヌクレオチドセンスおよびアンチセンス鎖を含むｓｉＮＡ構造の場合、複雑性は４19となる））、および（ｂ）標的ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的部位を判別するのに適した条件下で、前記（ａ）のｓｉＮＡ構造を試験することを含む方法を特徴とする。別の態様においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は例えば約２３ヌクレオチド長といった固定長の鎖を持つ。さらに別の態様においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は例えば約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長の異なる長さの鎖を持つ。１つの態様においては、アッセイには本明細書の実施例６に記載のような再構築インビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。別の態様においては、前記アッセイには標的ＲＮＡが発現する細胞培養システムを含むことができる。別の態様においては、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの断片について、例えばゲル電気泳動、ノーザンブロット解析、またはＲＮＡｓｅ保護アッセイによって、検出可能なレベルの切断を分析し、標的ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列内の最適標的部位を判断する。前記標的ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列は、当該技術分野において周知のように、例えばクローニングおよび／またはインビトロシステムの転写、およびインビボシステムにおける細胞発現によって取得することができる。
別の態様においては、本発明は（ａ）標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ標的の配列を分析すること、（ｂ）ＲＮＡの１つ以上の領域に相補的な配列を持つ１組以上のｓｉＮＡ分子を合成すること、および（ｃ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的を判別するのに適した条件下で、（ｂ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む方法を特徴とする。１つの態様においては、（ｂ）のｓｉＮＡ分子は例えば約２３ヌクレオチド長の固定長の鎖を持つ。別の態様においては、（ｂ）のｓｉＮＡ分子は例えば約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長の異なる長さの鎖を持つ。１つの態様においては、前記アッセイは本明細書に記載のような再構築インビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。別の態様においては、アッセイは標的ＲＮＡが発現する細胞培養システムを含むことができる。標的ＲＮＡの断片は、例えばゲル電気泳動、ノーザンブロット解析、またはＲＮＡｓｅ保護アッセイによって、検出可能なレベルの切断について分析され、前記標的ＲＮＡ配列内の最適標的部位が判別される。前記標的ＲＮＡ配列は、例えばインビトロシステムの場合のクローニングおよび／または転写、およびインビボシステムにおける発現によって、当該技術分野において周知のように取得することができる。
「標的部位」とは、標的配列に相補的なアンチセンス領域に配列を含むｓｉＮＡ構造により媒介される切断の「標的」とされる標的ＲＮＡ内の配列を意味する。
「検出可能なレベルの切断」とは、標的ＲＮＡのランダム分解によって生成されるＲＮＡのバックグラウンドから切断産物を識別するのに十分な標的ＲＮＡの切断（および切断産物ＲＮＡの形成）を意味する。標的ＲＮＡの１−５％の切断産物の生成は、検出の大部分の方法でバックグラウンドからの検出に十分である。
１つの態様においては、本発明は、医薬的に許容できる担体または希釈剤に化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。別の態様においては、本発明は、医薬的に許容できる担体または希釈剤中の１つ以上の遺伝子を標的とする化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。別の態様においては、本発明は、対象における疾患または状態の診断に適した条件下で、本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患または状態の診断方法を特徴とする。別の態様においては、本発明は、対象における疾患または状態の治療または予防に適した条件下で、本発明の組成物を前記対象に投与することを含む、対象における疾患または状態の治療または予防方法を特徴とする。さらに別の態様においては、本発明は、対象または生物体における眼疾患、癌、増殖性疾患、血管形成、および／または腎疾患の抑制、低減、または予防に適した条件下で、本発明の組成物を前記対象に投与することを含む、対象または生物体における眼疾患、癌、増殖性疾患、血管形成、および／または腎疾患の抑制、低減、または予防方法を特徴とする。
別の態様においては、本発明はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子標的を確認する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、前記ｓｉＮＡ鎖の１つはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む）、（ｂ）ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、前記ｓｉＮＡ分子を細胞、組織、対象、または生物体に導入すること、および（ｃ）前記細胞、組織、対象、または生物体における任意の表現型の変化を分析することによって前記遺伝子の機能を判別することを含む。
別の態様においては、本発明はＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的を確認する方法を特徴とし、（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここで、前記ｓｉＮＡ鎖の１つはＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む）、（ｂ）生体系における前記ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、前記ｓｉＮＡ分子を前記生体系に導入すること、および（ｃ）生体系における任意の表現型の変化を分析することによって遺伝子の機能を判別することを含む。
「生体系」とは、ヒトまたは動物を含むがそれに限定されない生物源から精製されたまたは精製されていない材料を意味し、ここで前記生体系はＲＮＡｉ活性に必要な構成要素を含む。「生体系」という語は、例えば細胞、組織、対象または生物体あるいはその抽出物を含む。また生体系という語は、インビトロ環境で使用できる再構築ＲＮＡｉ系も含む。
「表現型の変化」とは、本発明の核酸分子（例、ｓｉＮＡ）との結合またはそれを用いた処理に応答して生じる細胞への任意の検出可能な変化を意味する。そのような検出可能な変化は、当該技術分野において知られる方法によって試験できる形状、サイズ、増殖、運動性、タンパク質発現またはＲＮＡ発現、あるいはような他の物理的または化学的変化を含むが、それらに限定されない。また検出可能な変化は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のレポーター遺伝子／分子の発現、発現したタンパク質の識別に使用される様々なタグ、あるいは試験できる任意の他の細胞要素を含む。
１つの態様においては、本発明は、例えば細胞、組織、対象または生物体等を含む生体系において、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的遺伝子の発現の調節に使用できる化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を含むキットを特徴とする。別の態様においては、本発明は、例えば細胞、組織、対象または生物体等を含む生体系における２以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的遺伝子の発現の調節に使用できる化学修飾可能な本発明の２以上のｓｉＮＡ分子を含むキットを特徴とする。
１つの態様においては、本発明は、化学修飾可能な本発明の１つ以上のｓｉＮＡ分子を含む細胞を特徴とする。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子を含む前記細胞は哺乳類細胞である。さらに別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子を含む前記細胞はヒト細胞である。
１つの態様においては、化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子の合成は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖を合成すること、および（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子の取得に適した条件下で、２つの相補鎖をアニールすることを含む。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成による。さらに別の態様においては、ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖の合成は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成による。
１つの態様においては、本発明はｓｉＮＡ二重鎖分子を合成する方法を特徴とし、（ａ）ｓｉＮＡ分子の第一オリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること（ここで前記第一オリゴヌクレオチド配列鎖は、ｓｉＮＡの第二オリゴヌクレオチド配列鎖の合成に足場として使用できる切断可能なリンカー分子を含む）、（ｂ）ｓｉＮＡの第二オリゴヌクレオチド配列鎖を第一オリゴヌクレオチド配列鎖の足場上に合成すること（ここで第二オリゴヌクレオチド配列鎖はさらに、前記ｓｉＮＡ二重鎖の精製に使用できる化学部分を含む）、（ｃ）２つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイズして安定した二重鎖を形成するのに適した条件下で、（ａ）のリンカー分子を切断すること、および（ｄ）前記第二オリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用して、ｓｉＮＡ二重鎖を精製することを含む。１つの態様においては、（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、メチルアミン等のアルキラミン塩基を使用して、例えば加水分解条件下で、オリゴヌクレオチドの脱保護中に生じる。１つの態様においては、合成方法は、制御核ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン等の固定支持体上での固相合成を含む。ここで、（ａ）の第一配列は、前記固定支持体を足場として使用して、スクシニルリンカー等の切断可能なリンカー上で合成される。第二鎖の合成に足場として使用される（ａ）の切断可能なリンカーは、固定支持体被覆リンカーと同様の反応度を含むことができるため、固定支持体被覆リンカーおよび（ａ）の切断可能なリンカーの切断は同時に発生する。別の態様においては、結合したオリゴヌクレオチド配列の分離に使用できる（ｂ）の化学部分は、ジメトキシトリチル基等の、本明細書に記載のトリチル−オン合成方法で使用できるトリチル基を含む。さらに別の態様においては、ジメトキシトリチル基等の前記化学部分は、例えば酸性状況を使用して精製中に除去される。
別の態様においては、ｓｉＮＡ合成の方法は、固相合成またはハイブリッド相合成である。ここでｓｉＮＡ二重鎖の両鎖は、第二配列の合成に足場として機能する第一配列に結合する切断可能なリンカーを使用して、並行して合成される。個別のｓｉＮＡ配列鎖のハイブリダイゼーションに適した条件下でリンカーを切断すると、二本鎖ｓｉＮＡ分子が形成される。
別の態様においては、本発明はｓｉＮＡ二重鎖分子を合成する方法を特徴とし、（ａ）前記ｓｉＮＡ分子の第一オリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること（ここで前記配列は、別のオリゴヌクレオチド配列の合成に足場として使用できる切断可能なリンカー分子を含む）、（ｂ）（ａ）の足場上にある第一配列鎖に対して相補性を持つ第二オリゴヌクレオチド配列を合成すること（ここで前記第二配列は前記二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖を含み、さらに結合したオリゴヌクレオチド配列の分離に使用できる化学部分を含む）、および（ｃ）前記切断可能なリンカーにより結合されるｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖を両方含む全長配列を分離するのに適した条件下、またその２つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイズして安定した二重鎖を形成するのに適した条件下で、第二オリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用して、（ｂ）の産物を精製することを含む。１つの態様においては、（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、例えば加水分解条件下で、オリゴヌクレオチドの脱保護中に生じる。別の態様においては、（ｃ）のリンカー分子の切断は、オリゴヌクレオチドの脱保護後に生じる。別の態様においては、合成方法は、制御核ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン等の固定支持体上での固相合成を含む。ここで、（ａ）の第一配列は、前記固定支持体を足場として使用し、スクシニルリンカー等の切断可能なリンカー上で合成される。第二鎖の合成に足場として使用される（ａ）の切断可能なリンカーは、固定支持体被覆リンカーと同様の反応度または異なる反応度を含むことができるため、固定支持体被覆リンカーおよび（ａ）の切断可能なリンカーの切断は、同時または連続的に発生する。１つの態様においては、結合したオリゴヌクレオチド配列の分離に使用できる（ｂ）の化学部分は、例えばジメトキシトリチル基等のトリチル基を含む。
別の態様においては、本発明は、単一の合成プロセスにおいて二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）第一および第二配列を持つオリゴヌクレオチドを合成すること（ここで第一配列は第二配列に相補であり、第一オリゴヌクレオチド配列は切断可能なリンカーを介して第二配列と結合する。また例えば５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基（５’−Ｏ−ＤＭＴ）等の末端５’保護基は第二配列を持つオリゴヌクレオチド上に残る）、（ｂ）オリゴヌクレオチドを脱保護することによって、２つのオリゴヌクレオチド配列を結合するリンカーを切断すること、および（ｃ）例えば、本明細書に記載のトリチル−オン合成方法を使用して、二本鎖ｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、（ｂ）の産物を精製することを含む。
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子の合成方法は、スカリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ）らの米国特許５，８８９，１３６、６，００８，４００、および６，１１６，０８６に記載の方法を含み、それら全体は参照することにより本明細書に組み込まれる。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とする。ここでｓｉＮＡ構造は、例えばそのヌクレアーゼ抵抗を高める化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ１つ以上の化学修飾等の、１つ以上の化学修飾を含む。
別の態様においては、高いヌクレアーゼ抵抗を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）高いヌクレアーゼ抵抗を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
別の態様においては、本発明は、改良された毒性プロファイルを持つ（例、弱毒化特性を持つ、または免疫活性化特性を持たない）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか（例、表ＩＶに参照されるｓｉＮＡモチーフ）、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入する、および（ｂ）改良された毒性プロファイルを持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
別の態様においては、本発明は、細胞、対象、または生物においてインターフェロン応答を刺激しない（例、インターフェロン応答なし、または減衰したインターフェロン応答）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか（例、表ＩＶに参照されるｓｉＮＡモチーフ）、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
「改良された毒性プロファイル」とは、未修飾のｓｉＮＡまたは改良された毒性を付与するのに効果的でない修飾の少ないｓｉＮＡ分子と比較して、化学修飾したｓｉＮＡ構造が、細胞、対象、または生物体において弱い毒性を示すことを意味する。限定を目的としない例において、改良された毒性プロファイルを持つｓｉＮＡ分子は、未修飾のｓｉＮＡまたは改良された毒性を付与するのに効果的でない修飾の少ないｓｉＮＡ分子と比較して、細胞、対象、または生物体における低いまたは減衰した免疫活性化応答に関連する。１つの態様においては、改良された毒性プロファイルを持つｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。１つの態様においては、改良された毒性プロファイルを持つｓｉＮＡ分子は５より少ないリボヌクレオチド（例、約１、２、３、または４リボヌクレオチド）を含む。１つの態様においては、改良された毒性プロファイルを持つｓｉＮＡ分子は、Ｓｔａｂ７、Ｓｔａｂ８、Ｓｔａｂ１１、Ｓｔａｂ１２、Ｓｔａｂ１３、Ｓｔａｂ１６、Ｓｔａｂ１７、Ｓｔａｂ１８、Ｓｔａｂ１９、Ｓｔａｂ２０、Ｓｔａｂ２３、Ｓｔａｂ２４、Ｓｔａｂ２５、Ｓｔａｂ２６、Ｓｔａｂ２７、Ｓｔａｂ２８、Ｓｔａｂ２９、Ｓｔａｂ３０、Ｓｔａｂ３１、Ｓｔａｂ３２、Ｓｔａｂ３３またはその任意の組み合わせを含む（表ＩＶを参照）。１つの態様においては、特定のｓｉＮＡ分子に関連する免疫活性化応答のレベルは、当該技術において周知のように、例えば試験においてＰＫＲ／インターフェロン応答、増殖、Ｂ−細胞活性、および／またはサイトカイン産生のレベルを判断して、特定のｓｉＮＡ分子の免疫活性化応答を定量することにより計測することができる。（例として、ライファー（Ｌｅｉｆｅｒ）ら，２００３，免疫療法雑誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），２６，３１３−９、および米国特許５，９６８，９０９を参照。これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とする。ここでｓｉＮＡ構造は、ｓｉＮＡ構造のセンスおよびアンチセンス鎖の間の結合親和力を調節する本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。
別の態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖の間に高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）ｓｉＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖の間に高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とする。ここでｓｉＮＡ構造は、ｓｉＮＡ構造のアンチセンス鎖と細胞内の相補標的ＲＮＡ配列の間の結合親和力を調節する本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とする。ここでｓｉＮＡ構造は、ｓｉＮＡ構造のアンチセンス鎖と細胞内の相補標的ＤＮＡ配列の間の結合親和力を調節する本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。
別の態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補標的ＲＮＡ配列の間に高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補標的ＲＮＡ配列の間に高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
別の態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補標的ＤＮＡ配列の間に高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補標的ＤＮＡ配列の間に高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とする。ここでｓｉＮＡ構造は、化学修飾したｓｉＮＡ構造に対して配列相同性を持つ追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成できる細胞ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を調節する本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。
別の態様においては、本発明は、化学修飾ｓｉＮＡ分子に対して配列相同性を持つ追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成できる細胞ポリメラーゼの高いポリメラーゼ活性を媒介できるｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）化学修飾ｓｉＮＡ分子に対して配列相同性を持つ追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成できる細胞ポリメラーゼの高いポリメラーゼ活性を媒介できるｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
１つの態様においては、本発明は、細胞におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡｉを媒介する化学修飾ｓｉＮＡ構造を特徴とする。ここで化学修飾は、そのようなｓｉＮＡ構造が媒介するＲＮＡｉの有効性を低減するという意味では、ｓｉＮＡと標的ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子および／またはタンパク質、あるいはＲＮＡｉに重要な他の要素との相互作用にほとんど影響しない。
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対して高いＲＮＡｉ作用を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）高いＲＮＡｉ作用を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的ＲＮＡに対して高いＲＮＡｉ作用を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）標的ＲＮＡに対して高いＲＮＡｉ作用を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的ＤＮＡに対して高いＲＮＡｉ作用を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）標的ＤＮＡに対して高いＲＮＡｉ作用を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とする。ここでｓｉＮＡ構造は、ｓｉＮＡ構造の細胞摂取を媒介する本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対して高い細胞摂取を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）高い細胞摂取を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。
１つの態様においては、本発明は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とする。ここで、ｓｉＮＡ構造は、例えばポリエチレングリコール等のポリマーコンジュゲート、またはｓｉＮＡ構造の薬物動態を改善する同等のコンジュゲートを結合することによって、あるいはインビボで特定の組織タイプまたは細胞タイプを標的とするコンジュゲートを結合することによってその生物学的利用能を高める本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。そのようなコンジュゲートに関する限定を目的としない例は、ヴァルギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）らの米国特許出願１０／２０１，３９４に記載されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。
１つの態様においては、本発明は、高い生物学的利用能を持つ本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）コンジュゲートをｓｉＮＡ分子の構造に導入すること、および（ｂ）高い生物学的利用能を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。そのようなコンジュゲートは、自然発生するタンパク質リガンド；細胞ＺＩＰコード配列を含むタンパク質局在配列；抗体、核酸アプタマー、ビタミンおよび葉酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン等共同因子；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマー；リン脂質；コレステロール；スペルミンまたはスペリミジン等のポリアミン等に由来するペプチド等の細胞受容体のリガンドを含むことができる。
１つの態様においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第二配列はＲＮＡ干渉を効果的に媒介するためのガイド配列として作用できなくなり、および／またはＲＮＡｉを促進する細胞タンパク質により認識できるように化学修飾される。
１つの態様においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、第二配列はガイド配列として、または標的核酸（例、ＲＮＡ）配列に相補的な配列としてＲＮＡｉ経路に入るのを回避する方法でデザインまたは修飾される。そのようなデザインまたは修飾は、ｓｉＮＡの活性を強化し、および／または本発明のｓｉＮＡ分子の特異性を向上させることが期待される。またそれらの修飾は、任意のオフ−ターゲット効果および／または付随する毒性を最小限にすることも期待される。
１つの態様においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第二配列はＲＮＡ干渉を媒介するためのガイド配列として作用することができない。
１つの態様においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第二配列は末端５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）または５’−リン酸基を持たない。
１つの態様においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで前記第二配列は、その５’端に末端キャップ部を含む。１つの態様においては、前記末端キャップ部は、逆位脱塩基、逆位デオキシ脱塩基、逆位ヌクレオチド部分、図１０に示す基、アルキルまたはシクロアルキル基、複素環、または第二配列がガイド配列またはＲＮＡｉのテンプレートとして作用するＲＮＡｉ活性を回避する任意の他の基を含む。
１つの態様においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。ここで、前記第二配列はその５端および３’端に末端キャップ部を含む。１つの態様においては、各末端キャップ部は、個別に逆位脱塩基、逆位デオキシ脱塩基、逆位ヌクレオチド部分、図１０に示す基、アルキルまたはシクロアルキル基、複素環、または第二配列がガイド配列またはＲＮＡｉのテンプレートとして作用するＲＮＡｉ活性を回避する任意の他の基を含む。
１つの態様においては、本発明は、標的核酸（例、遺伝子等のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはそれに対応するＲＮＡ）の発現を下方制御または抑制する高い特異性を持つ本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、（ａ）１つ以上の化学修飾をｓｉＮＡ分子の構造に導入すること、および（ｂ）高い特異性を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む。別の態様においては、特異性の向上に使用される化学修飾は、ｓｉＮＡ分子の５’端、３’端、またはその両方に末端キャップ修飾を含む。末端キャップ修飾は、例えば図１０に示す構造（例、逆位デオキシ脱塩基部分）またはｓｉＮＡ分子（例、センス鎖）の一部をオフターゲット核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介不能にする任意の他の化学修飾を含むことができる。限定を目的としない例において、ｓｉＮＡ分子はそのアンチセンス配列のみが対応する標的ＲＮＡ配列の分解が媒介されるＲＩＳＣ媒介のガイド配列として機能できるようにデザインされる。これは、ＲＮＡｉ機構によるガイド配列としてのセンス鎖認識を回避する化学修飾をセンス鎖に導入し、ｓｉＮＡのセンス配列を不活性にすることで実現できる。１つの態様においては、そのような化学修飾は、前記ｓｉＮＡのセンス鎖の５’端に任意の化学基を含むか、またはセンス鎖をＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列としての機能を不活性化する任意の他の基を含む。これらの修飾は、例えばセンス鎖の５’端がフリーの５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）またはフリーの５’−リン酸基（例、リン酸、二リン酸、三リン酸、環状リン酸等）を持たない分子にする。そのようなｓｉＮＡ構造に関する限定を目的としない例は、本明細書において「Ｓｔａｂ９／１０」、「Ｓｔａｂ７／８」、「Ｓｔａｂ７／１９」、「Ｓｔａｂ１７／２２」、「Ｓｔａｂ２３／２４」、「Ｓｔａｂ２４／２５」、および「Ｓｔａｂ２４／２６」（例、Ｓｔａｂ７、９、１７、２３、または２４センス鎖を持つ任意のｓｉＮＡ）化学反応（表ＩＶ）およびその変異体として記載されている。ここでｓｉＮＡのセンス鎖の５’端および３’端は、ヒドロキシル基またはリン酸基を含まない。
１つの態様においては、本発明は、標的核酸（例、遺伝子等のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはそれに対応するＲＮＡ）の発現を下方制御または抑制する高い特異性を持つ本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、１つ以上の化学修飾をｓｉＮＡ分子の鎖または一部がＲＮＡｉ作用のテンプレートまたはガイド配列として機能することを防ぐｓｉＮＡ分子の構造に導入することを含む。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の不活性な鎖またはセンス領域は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域、例えば標的核酸配列に対して相補性を持たないｓｉＮＡの鎖または領域である。１つの態様においては、そのような化学修飾は、５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）または５’−リン酸基、あるいは前記センス鎖またはセンス領域をＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列としての機能を不活性化する任意の他の基を含まないｓｉＮＡのセンス鎖または領域の５端に任意の化学基を含む。そのようなｓｉＮＡ構造に関する限定を目的としない例は、本明細書において「Ｓｔａｂ９／１０」、「Ｓｔａｂ７／８」、「Ｓｔａｂ７／１９」、「Ｓｔａｂ１７／２２」、「Ｓｔａｂ２３／２４」、「Ｓｔａｂ２４／２５」、および「Ｓｔａｂ２４／２６」（例、Ｓｔａｂ７、９、１７、２３、または２４センス鎖を持つ任意のｓｉＮＡ）化学反応（表ＩＶ）およびその変異体として記載されている。ここでｓｉＮＡのセンス鎖の５端および３’端は、ヒドロキシル基またはリン酸基を含まない。
１つの態様においては、本発明は、標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介する際に活性であるｓｉＮＡ分子を審査する方法を特徴とし、（ａ）複数の未修飾ｓｉＮＡ分子を生成すること、（ｂ）前記標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性なｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングすること、および（ｃ）化学修飾（例、本明細書に記載の化学修飾または当該技術分野において周知の化学修飾）を（ｂ）の活性ｓｉＮＡ分子に導入することを含む。１つの態様においては、方法はさらに、標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介する際に活性である化学修飾ｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ｃ）の化学修飾ｓｉＮＡ分子を再スクリーニングすることを含む。
１つの態様においては、本発明は、標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性な化学修飾ｓｉＮＡ分子をスクリーニングする方法を特徴とし、（ａ）複数の化学修飾ｓｉＮＡ分子（例、本明細書に記載のｓｉＮＡ分子または当該技術分野において周知のｓｉＮＡ分子）を生成すること、および（ｂ）前記標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性な化学修飾ｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングすることを含む。
「リガンド」という語は、受容体等の別の化合物と直接または間接的に相互作用できる薬剤、ペプチド、ホルモン、または神経伝達物質といった任意の化合物または分子を意味する。リガンドと相互作用する受容体は、細胞の表面に存在することができ、あるいは代替として細胞間受容体であってよい。前記リガンドと前記受容体の相互作用によって生化学反応が生じるか、あるいは単なる物理的相互作用または関連となる。
別の態様においては、本発明は（ａ）賦形剤形をｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）高い生物学的利用能を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、高い生物学的利用能を持つ本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。そのような賦形剤は、シクロデキストリン、脂質、カチオン脂質、ポリアミン、リン脂質、ナノ粒子、レセプター、リガンド等のポリマーを含む。
別の態様においては、本発明は（ａ）化学式ＩからＶＩＩのいずれかを持つヌクレオチドまたはその任意の組み合わせをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ）高い生物学的利用能を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、高い生物学的利用能を持つ本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
別の態様においては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本発明のｓｉＮＡ化合物と共有結合的に結合することができる。結合されたＰＥＧは好ましくは約１００から約５０，０００ダルトン（Ｄａ）の任意の分子量を持つ。
本発明を単独または試薬の少なくとも１つを持つキットの構成要素として使用し、ＲＮＡのインビトロまたはインビボ導入を実施して、サンプルおよび／または対象を試験することができる。例えば、キットの好ましい構成要素は、本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載のように細胞へのｓｉＮＡの導入を促進する担体を含む（例、脂質および当該技術分野において周知の他のトランスフェクション方法を使用する。例としてベージェルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ）らの米国特許６，３９５，７１３）を参照）。例えば、遺伝子機能および／または作用の判定、または薬物最適化、および薬物発見において前記キットを標的の確認に使用することができる（例としてウスマン（Ｕｓｍａｎ）らの米国特許出願６０／４０２，９９６を参照）。そのようなキットには、ユーザーが本発明を実施できるよう指示も含まれている。
本請求で使用する「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」または「化学修飾低分子干渉核酸分子」という語は、例えばＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを配列特異的な方法で媒介することで、遺伝子の発現またはウイルスの増殖を抑制または下方制御できる任意の核酸分子を意味する。例として、ザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ）ら，２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２５−３３；バス（Ｂａｓｓ），２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４１１，４２８−４２９；エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４１１，４９４−４９８；およびクラウツァー（Ｋｒｅｕｔｚｅｒ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４８９５；ツェルニッカ−ゲッツ（Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３６６４６；ファイヤー（Ｆｉｒｅ），国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３２６１９；プラティンク（Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／０１８４６：メロ（Ｍｅｌｌｏ）とファイヤー（Ｆｉｒｅ），国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／２９０５８；デュシャン−デュパイエット（Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ），国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／０７４０９；およびリー（Ｌｉ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４９１４；オールシャー（Ａｌｌｓｈｉｒｅ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８１８−１８１９；ヴォルペ（Ｖｏｌｐｅ）ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８３３−１８３７；ジニュウェイン（Ｊｅｎｕｗｅｉｎ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２１５−２２１８；およびホール（Ｈａｌｌ）ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２３２−２２３７；ハトヴァグナー（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ）とザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２０５６−６０；マクマヌス（ＭｃＭａｎｕｓ）ら，２００２年，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；ラインハルト（Ｒｅｉｎｈａｒｔ）ら，２００２年，遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．），１６，１６１６−１６２６；およびラインハルト（Ｒｅｉｎｈａｒｔ）とバーテル（Ｂａｒｔｅｌ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８３１を参照）。本発明のｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を本明細書の図４−６および表ＩＩおよびＩＩＩに示す。例えば、ｓｉＮＡは自己相補センス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖のポリヌクレオチド分子であってよい。ここで、アンチセンス領域は標的核酸分子ヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は前記標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を持つ。ｓｉＮＡは２つの個別のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ここで、一方の鎖はセンス鎖であり、もう一方はアンチセンス鎖である。ここでアンチセンスおよびセンス鎖は自己相補である（例、各鎖は他の鎖にあるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むため、アンチセンス鎖およびセンス鎖は二重鎖または二本鎖構造を形成する。例えばここで、二本鎖領域は約１５から約３０塩基対（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または３０塩基対である））。アンチセンス鎖は標的核酸分子にあるヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む（例、ｓｉＮＡの約１５から約２５以上のヌクレオチドが標的核酸配列またはその一部に相補的である）。代替として、ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられる。ここでｓｉＮＡの自己相補センス領域およびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって結合される。ｓｉＮＡは自己相補センス領域およびアンチセンス領域を持つ二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造のポリヌクレオチドであってよい。ここで、アンチセンス領域は、個別の標的核酸分子にあるヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を持つ。ｓｉＮＡは２つ以上のループ構造および自己相補センス領域およびアンチセンス領域を含むステムを持つ環状一本鎖ポリヌクレオチドであってよい。ここで、アンチセンス領域は標的核酸分子にあるヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は前記標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を持つ。またここで、環状ポリヌクレオチドはインビボまたはインビトロのいずれかで処理してＲＮＡｉを媒介できる活性ｓｉＮＡ分子を生成することができる。またｓｉＮＡは、標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を持つ一本鎖ポリヌクレオチドを含むこともできる（例えば、ここでそのようなｓｉＮＡ分子は標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部のｓｉＮＡ分子内に存在する必要がない）。ここで、一本鎖ポリヌクレオチドはさらに、５’−リン酸等の末端リン酸基を含むことができる（例として、マルティネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）ら，２００２年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１１０，５６３−５７４およびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ら，２００２年，分子細胞（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ），１０，５３７−５６８を参照）、または５’，３’−二リン酸塩であってよい。特定の態様において、本発明のｓｉＮＡ分子は、個別のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含む。ここで、センス領域およびアンチセンス領域は当該技術分野において周知のヌクレオチドリンカー分子または非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合的に結合されるか、あるいは代替として、イオン相互作用、水素結合、フォン−デル−ワールス相互作用、疎水性相互作用および／またはスタッキング相互作用によって非共有結合的に結合される。特定の態様において、本発明のｓｉＮＡ分子は標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は標的遺伝子の発現を抑制する方法で、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書で使用する場合、ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含む分子に必ずしも限定される必要はなく、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを包含する。特定の態様において、本発明の低分子干渉核酸分子はヌクレオチドを含む２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）が欠如している。出願人は、ＲＮＡｉを媒介するために２’−ヒドロキシグループを持つヌクレオチドの存在を必要としない特定の態様における低分子干渉核酸について、また任意でリボヌクレオチド（例、２’−ＯＨグループを持つヌクレオチド）を含まない本発明の低分子干渉核酸分子について記載している。しかし、ＲＮＡｉをサポートするためにｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなｓｉＮＡ分子は、１つ以上の結合リンカー、あるいは２’−ＯＨグループを持つ１つ以上のヌクレオチドを含む他の結合されたまたは関連するグループ、部分、または鎖を持つ。任意で、ｓｉＮＡ分子はヌクレオチド位に約５、１０、２０、３０、４０、または５０％のリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の修飾低分子干渉核酸分子は、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」とも呼ばれる。本明細書で使用する場合、ｓｉＮＡという語は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）等、の配列特異的なＲＮＡｉを媒介できる核酸分子を説明するのに使用される他の語に等しいことを意味する。さらに、本明細書で使用されるＲＮＡｉという語は、例えば、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳抑制、または後成等、の配列特異的なＲＮＡｉを媒介できる核酸分子を説明するのに使用される他の語に等しいことを意味する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子を後成的に抑制された遺伝子に転写後レベルまたは転写前レベルで使用することができる。限定を目的としない例において、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的規制は、遺伝子発現を変質するクロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＮＡ媒介性修飾の結果生じる（例として、ヴァーデル（Ｖｅｒｄｅｌ）ら，２００４年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３０３，６７２−６７６；パル−バードラ（Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ）ら，２００４年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３０３，６６９−６７２；オールシャー（Ａｌｌｓｈｉｒｅ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８１８−１８１９；ヴォルペ（Ｖｏｌｐｅ）ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８３３−１８３７；ジニュウェイン（Ｊｅｎｕｗｅｉｎ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２１５−２２１８；およびホール（Ｈａｌｌ）ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２３２−２２３７を参照）。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は二重鎖形成オリゴヌクレオチド「ＤＦＯ」である（例として、図１４−１５および２００３年１２月３日出願のヴァイシュ（Ｖａｉｓｈ）らの米国特許出願１０／７２７，７８０および２００４年５月２４日出願の国際ＰＣＴ出願ＵＳ０４／１６３９０を参照）。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は多機能ｓｉＮＡである（例として、図１６−２１および２００４年２月１０日出願のジャドハティ（Ｊａｄｈａｔｉ）らの米国特許出願６０／５４３，４８０および２００４年５月２４日出願の国際ＰＣＴ出願ＵＳ０４／１６３９０を参照）。本発明の多機能ｓｉＮＡは、例えば、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡの２つ以上の領域を標的とする配列を含むことができる（例として表ＩＩおよびＩＩＩの標的配列を参照）。１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡは、１つ以上のＶＥＧＦアイソフォーム（例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、および／またはＶＥＧＦ−Ｄ）を標的とする配列を含むことができる。１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡは、１つ以上のＶＥＧＦ受容体（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３）を標的とする配列を含むことができる。１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡは、１つ以上のＶＥＧＦアイソフォーム（例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、および／またはＶＥＧＦ−Ｄ）および１つ以上のＶＥＧＦ受容体（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３）を標的とする配列を含むことができる。
本明細書で使用する「非対称ヘアピン」は、アンチセンス領域、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができるループ部分、およびアンチセンス領域より少なく、センス領域がアンチセンス領域を持つ塩基対に対して相補的なヌクレオチドを十分に持ち、ループを持つ二重鎖を形成するに足るヌクレオチドを含むセンス領域を含む直鎖ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は細胞またはインビトロシステム内でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例、約１５から約３０、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）を持つアンチセンス領域、および約４から約１２（例、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）ヌクレオチドを持つループ領域、およびアンチセンス領域に相補的な約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）のヌクレオチドを持つセンス領域を含むことができる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、化学修飾可能な５’端リン酸基を含むこともできる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載のヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、または共有結合分子を含むことができる。
本明細書で使用する「非対称二重鎖」は、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの個別の鎖を持つｓｉＮＡ分子を意味する。ここでセンス領域はアンチセンス領域より少なく、センス領域がアンチセンス領域を持つ塩基対に対して相補的なヌクレオチドを十分に持ち、二重鎖を形成するに足るヌクレオチドを含む。例えば、本発明の非対称二重鎖ｓｉＮＡ分子は細胞またはインビトロシステム内でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例、約１５から約３０、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）を持つアンチセンス領域、およびアンチセンス領域に相補的な約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）のヌクレオチドを持つセンス領域を含むことができる。
「調節」とは、遺伝子の発現またはＲＮＡ分子のレベル、あるいは１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする同等のＲＮＡ分子、または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が上方制御または下方制御されることを意味する。そのため、発現、レベル、または活性はモジュレーターが不在の場合に観察される場合より高いかまたは低くなる。例えば、「調節」は「抑制」を意味する場合もあるが、「調節」という語の使用はこの定義に限定されない。
「抑制」、「下方制御」、または「低減」とは、遺伝子の発現、またはＲＮＡ分子のレベル、あるいは１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする同等のＲＮＡ分子、または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例、ｓｉＮＡ）が不在の場合に観測されるレベルより低くなることを意味する。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子を用いた抑制、下方制御、または低減は、不活性または弱力化した分子が存在する場合に観察されるレベルより低い。別の態様においては、本発明の核酸分子を用いた抑制、下方制御、または低減は、核酸分子が不在の場合より存在する場合のほうが大きい。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子を用いた抑制、下方制御、または低減は、例えば、スクランブル配列またはミスマッチを持つｓｉＮＡ分子が存在する場合に観察されるレベルより低い。別の態様においては、本発明の核酸分子を用いた抑制、下方制御、または低減は、核酸分子が不在の場合より存在する場合のほうが大きい。１つの態様においては、遺伝子発現の抑制、下方制御、または低減は、標的核酸分子（例、ＲＮＡ）のＲＮＡｉ媒介性切断等の転写後サイレンシングまたは翻訳抑制に関連する。１つの態様においては、遺伝子発現の抑制、下方制御、または低減は転写前サイレンシングに関連する。
「遺伝子」または「標的遺伝子」は、例えば、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含むがそれに限定されない核酸配列等、ＲＮＡをコードする核酸を意味する。遺伝子または標的遺伝子は、機能的ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）または低分子一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびその前駆ＲＮＡ等の非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）をコードすることもできる。そのような非コードＲＮＡは、機能的または規制的細胞過程に関与するｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性の調節におけるｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡ干渉の場合に標的核酸分子として機能することができる。そのため、疾患につながる異常なｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ活性を本発明のｓｉＮＡ分子で調節することができる。ｆＲＮＡおよびｎｃＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子を使用して、遺伝子刷り込み、転写、翻訳、または核酸処理（例、アミノ基転移、メチル化等）といった細胞過程に介在することで、生物体または細胞の遺伝子型または表現型を操作あるいは変質させることもできる。前記標的遺伝子は、細胞、内在性遺伝子、トランス遺伝子、または例えば、感染後細胞内に存在するウイルス等の病原体の遺伝子といった外来遺伝子から採取した遺伝子であってよい。標的遺伝子を含む細胞は、例えば、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌、または菌類等の任意の生物体から採取できるか、またはこれらに含まれる。植物の限定を目的としない例は、単子葉植物、双子葉植物、または裸子植物を含む。動物の限定を目的としない例は、脊椎動物または無脊椎動物を含む。菌類の限定を目的としない例は、カビまたはイースト菌を含む。例として、スナイダー（Ｓｎｙｄｅｒ）とガースタイン（Ｇｅｒｓｔｅｉｎ），２００３年サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３００，２５８−２６０を参照のこと）。
「非正準塩基対」は、反ミスマッチ、単一水素結合ミスマッチ、トランス型ミスマッチ、三重塩基相互作用、および四重塩基相互作用を含むミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対といった任意の非ワトソン−クリック塩基対を意味する。そのような非正準塩基対の限定を目的としない例は、ＡＣ逆転フーグスティーン、ＡＣゆらぎ、ＡＵ逆転フーグスティーン、ＧＵゆらぎ、ＡＡＮ７アミノ、ＣＣ２−カルボニル−アミノ（Ｈ１）−Ｎ３−アミノ（Ｈ２）、ＧＡ剪断、ＵＣ４−カルボニル−アミノ、ＵＵイミノ−カルボニル、ＡＣ逆転ゆらぎ、ＡＵフーグスティーン、ＡＵ逆転ワトソン−クリック、ＣＧ逆転ワトソン−クリック、ＧＣＮ３−アミノ−アミノＮ３、ＡＡＮ１−アミノ対称、ＡＡＮ７−アミノ対称、ＧＡＮ７−Ｎ１アミノ−カルボニル、ＧＡ＋カルボニル−アミノＮ７−Ｎ１、ＧＧＮ１−カルボニル対称、ＧＧＮ３−アミノ対称、ＣＣカルボニル−アミノ対称、ＣＣＮ３−アミノ対称、ＵＵ２−カルボニル−イミノ対称、ＵＵ４−カルボニル−イミノ対称、ＡＡアミノ−Ｎ３、ＡＡＮ１−アミノ、ＡＣアミノ２−カルボニル、ＡＣＮ３−アミノ、ＡＣＮ７−アミノ、ＡＵアミノ−４−カルボニル、ＡＵＮ１−イミノ、ＡＵＮ３−イミノ、ＡＵＮ７−イミノ、ＣＣカルボニル−アミノ、ＧＡアミノ−Ｎ１、ＧＡアミノ−Ｎ１、ＧＡアミノ−Ｎ７、ＧＡカルボニル−アミノ、ＧＡＮ３−アミノ、ＧＣアミノ−Ｎ３、ＧＣカルボニル−アミノ、ＧＣＮ３−アミノ、ＧＣＮ７−アミノ、ＧＧアミノ−Ｎ７、ＧＧカルボニル−イミノ、ＧＧＮ７−アミノ、ＧＵアミノ−２−カルボニル、ＧＵカルボニル−イミノ、ＧＵイミノ−２−カルボニル、ＧＵＮ７−イミノ、ｐｓｉＵイミノ−２−カルボニル、ＵＣ４−カルボニル−アミノ、ＵＣイミノ−カルボニル、ＵＵイミノ−４−カルボニル、ＡＣＣ２−Ｈ−Ｎ３、ＧＡカルボニル−Ｃ２−Ｈ、ＵＵイミノ−４−カルボニル２カルボニル−Ｃ５−Ｈ、ＡＣアミノ（Ａ）Ｎ３（Ｃ）−カルボニル、ＧＣイミノアミノ−カルボニル、Ｇｐｓｉイミノ−２−カルボニルアミノ−２−カルボニル、およびＧＵイミノアミノ−２−カルボニル塩基対を含む。
本明細書で使用する「ＶＥＧＦ」とは、例えば、表ＩのＶＥＧＦ ジンバンクアクセッション番号によりコードされる任意の血管内皮成長因子（例、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ）タンパク質、ペプチド、または血管内皮成長因子活性を持つポリペプチドを意味する。またＶＥＧＦという語は、任意の血管内皮成長因子プロテイン、ペプチド、または血管内皮成長因子活性を持つポリペプチドを示す。
「ＶＥＧＦ−Ｂ」とは、例えばジンバンクアクセッション番号ＮＭ−００３３７７でコードされ、血管内皮成長因子タイプＢ活性を持つタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド受容体あるいはその派生物を意味する。またＶＥＧＦ−Ｂという語は、ＶＥＧＦ−Ｂ活性を持つ任意のＶＥＧＦ−Ｂタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを包含する核酸配列も含む。
「ＶＥＧＦ−Ｃ」とは、例えばジンバンクアクセッション番号ＮＭ−００５４２９でコードされ、血管内皮成長因子タイプＣ活性を持つタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド受容体あるいはその派生物を意味する。またＶＥＧＦ−Ｃという語は、ＶＥＧＦ−Ｃ活性を持つ任意のＶＥＧＦ−Ｃタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを包含する核酸配列も含む。
「ＶＥＧＦ−Ｄ」とは、例えばジンバンクアクセッション番号ＮＭ−００４４６９でコードされ、血管内皮成長因子タイプＤ活性を持つタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド受容体あるいはその派生物を意味する。またＶＥＧＦ−Ｄという語は、ＶＥＧＦ−Ｄ活性を持つ任意のＶＥＧＦ−Ｄタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを包含する核酸配列も含む。
本明細書で使用する「ＶＥＧＦＲ」とは、表Ｉに示すＶＥＧＦＲジンバンクアクセッション番号でコードされるような血管内皮成長因子受容体活性を持つ任意の血管内皮成長因子受容体タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド（例、その膜結合型および可溶型を含むＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、またはＶＥＧＦＲ３）を意味する。また、ＶＥＧＦＲというごは、血管内皮成長因子受容体活性を持つ任意の血管内皮成長因子受容体タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを包含する核酸配列を示す。
「ＶＥＧＦＲ１」とは、血管内皮成長因子受容体タイプ１（ｆｌｔ）活性を持つ、例えば血管内皮成長因子を結合する能力を持つ、ジンバンクアクセッション番号ＮＭ−００２０１９によりコードされるようなタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド受容体またはその派生物を意味する。またＶＥＧＦＲ１という語は、ＶＥＧＦＲ１活性を持つ任意のＶＥＧＦＲ１タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを包含する核酸を示す。
「ＶＥＧＦＲ２」とは、血管内皮成長因子受容体タイプ２（ｋｄｒ）活性を持つ、例えば血管内皮成長因子を結合する能力を持つ、ジンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００２２５３によりコードされるようなタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド受容体またはその派生物を意味する。またＶＥＧＦＲ２という語は、ＶＥＧＦＲ２活性を持つ任意のＶＥＧＦＲ２タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを包含する核酸を示す。
「ＶＥＧＦＲ３」とは、血管内皮成長因子受容体タイプ３（ｋｄｒ）活性を持つ、例えば血管内皮成長因子を結合する能力を持つ、ジンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００２０２０によりコードされるようなタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド受容体またはその派生物を意味する。またＶＥＧＦＲ３という語は、ＶＥＧＦＲ３活性を持つ任意のＶＥＧＦＲ３タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを包含する核酸を示す。
「相同配列」とは、例えば遺伝子、遺伝子転写および／または非コードポリヌクレオチド等の１つ以上のポリヌクレオチド配列で共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォームあるいはサイトカインおよびその対応する受容体といった完全に異なる遺伝子等、関連するが異なるタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子で共有されるヌクレオチド配列であってよい。相同配列は非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、規制配列、イントロン、および転写制御または規制部位といった２つ以上の非コードポリヌクレオチドで共有されるヌクレオチド配列であってよい。また相同配列は、２以上のポリヌクレオチド配列で共有される保存配列領域を含むこともできる。前記相同配列は、部分的に相同な配列も本発明によって検討されるため（例、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％等）、完全に相同（例、１００％）である必要はない。
「保存配列領域」は、世代間またはある生体系、対象、または生物体から別の生体系、対象、または生物体で大幅に変化しないポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列の１つ以上の領域を意味する。ポリヌクレオチドはコードおよび非コードＤＮＡおよびＲＮＡを含むことができる。
「センス領域」とは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を持つｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は標的核酸配列と相同性を持つ核酸配列を含むことができる。
「アンチセンス領域」は、標的核酸配列に対して相補性を持つｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、任意でｓｉＮＡ分子のセンス領域に対して相補性を持つ核酸配列を含むことができる。
「標的核酸」とは、発現または活性が調節される任意の核酸配列を意味する。前記標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。１つの態様においては、本発明の前記標的核酸は、ＶＥＧＦ ＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。別の態様においては、本発明の標的核酸はＶＥＧＦＲ ＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。
「相補性」とは、従来のワトソン−クリックまたは他の非従来的なタイプによって、核酸が別の核酸配列との水素結合を形成できることを意味する。本発明の核分子を参照して、相補配列を持つ核酸分子の結合自由エネルギーは、例えば核酸の関連機能にＲＮＡｉ活性を促進させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの判定は、当該技術分野においてよく知られている（例、ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）ら，１９８７年、量子生物学シンポジウム（ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ）ｐｐ．１２３−１３３；フライヤー（Ｆｒｉｅｒ）ら，１９８６年，米国科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８３：９３７３−９３７７；ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）ら，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照）。相補率は、第二核酸配列とともに水素結合（例、ワトソン−クリック塩基対）を形成できる核酸分子における隣接残基の割合を示す（例、１０ヌクレオチドを持つ第二核酸配列に対する塩基対となる第一オリゴヌクレオチドにある全１０ヌクレオチド中５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補であることを示す）。「完全に相補」とは、核酸配列のすべての隣接残基が第二核酸配列における同数の隣接残基と水素結合することを意味する。１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の標的核酸分子に相補的な約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドまたはその一部を含む。
１つの態様においては、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現を下方制御または低減する本発明のｓｉＮＡ分子は、対象または生物体における眼疾患、癌、増殖性疾患、腎疾患、または血管形成の治療、予防または低減に使用される。
本明細書で使用する「増殖性疾患」または「癌」は、当該技術分野において知られる制御不能な細胞成長または増殖で特徴付けられる任意の疾患、状態、形質、遺伝子型または表現型を意味し、カポジ肉腫等のＡＩＤＳ関連癌；乳癌；骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、巨細胞腫、アダマンチノーム、および脊索腫等の骨癌；髄膜腫、グリア芽腫、低悪性度星細胞腫、オリゴデンドロ細胞腫、下垂体部腫瘍、神経鞘腫、および転移性脳癌等の脳癌；マントル細胞リンパ腫、非ホジキンズリンパ腫、腺腫、扁平上皮癌、喉頭癌等様々なリンパ腫を含む頭頸部癌、胆嚢および胆管癌、網膜芽腫等の網膜癌、食道癌、胃癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、睾丸癌、子宮内膜癌、黒色腫、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌（非小細胞肺腫瘍を含む）、膵臓癌、肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸部癌、頭頸部癌、皮膚癌、鼻咽頭癌、脂肪肉腫、上皮性癌、腎細胞癌、腺筋腫、耳下腺癌、子宮内膜肉腫、多剤耐性癌、および腫瘍血管形成に関連する新血管形成等の増殖性疾患および状態、黄斑変性（例、湿／乾ＡＭＤ）、角膜新血管形成、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、近視性変性、および再狭窄および多発性嚢胞腎といった他の増殖性疾患および状態、および単独または他の治療との組み合わせで細胞または組織内の疾患関連遺伝子発現の調節に対応する任意の他の癌または増殖疾患、状態、形質、遺伝子型または表現型を含む。
本明細書で使用する「眼疾患」は、類嚢胞黄斑浮腫、星芒状硝子体症、病的近視および後部ブドウ腫、トクソカリアシス（眼幼虫移行症）、網膜静脈閉塞症、後部硝子体剥離、けん引網膜裂傷、網膜上膜、糖尿病性網膜症、格子様変性、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、黄斑変性（例、湿性ＡＭＤまたは乾性ＡＭＤ等の加齢性黄斑変性）、トキソプラズマ症、脈絡膜メラノーマ、後天性網膜分離症、ホーレンホルスト伝染病、特発性中心性漿液性網脈絡膜症、黄斑円孔、推定眼ヒストプラスマ症、網膜動脈瘤、網膜色素変性、網膜剥離、高血圧性網膜症、網膜色素上皮（ＲＰＥ）剥離、パピロ静脈炎、眼性虚血症候群、コーツ病、レーバー粟粒動脈瘤、結膜新生物、アレルギー性結膜炎、春季結膜炎、急性細菌性結膜炎、アレルギー性結膜炎および春季角結膜炎、ウイルス性結膜炎、細菌性結膜炎、クラミジア結膜炎および淋菌性結膜炎、結膜裂傷、上強膜炎、強膜炎、瞼裂斑炎、翼状片、上方輪部角結膜炎（セオドアのＳＬＫ）、中毒性結膜炎、偽膜を伴う膜炎、巨乳頭結膜炎、テリエン角膜周辺変性症、アカントアメーバ角膜炎、真菌性角膜炎、糸状角膜炎、細菌性角膜炎、乾燥角膜炎／ドライアイ症候群、細菌性角膜炎、単純ヘルペス角膜炎、無菌角膜浸潤、角膜フリクテン炎、角膜擦過傷および再発性角膜びらん、角膜異物、角膜腐食、上皮基底膜ジストロフィー（ＥＢＭＤ）、サイジェソン点状表層角膜炎、角膜裂傷、サルツマン結節性変性、フーチ角膜内皮ジストロフィー、水晶体亜脱臼、様体ブロック緑内障、原発性開放隅角緑内障、色素分散症候群および色素性緑内障、偽落屑症候群および偽落屑性緑内障、前部ブドウ膜炎、原発性開放隅角緑内障、ブドウ膜緑内障および緑内障毛様体炎発症、色素分散症候群および色素性緑内障、急性閉塞隅角緑内障、前部眼内炎、前房出血、隅角後退緑内障、水晶体過敏性緑内障、偽落屑症候群および偽落屑性緑内障、アクセンフェルド−リーガー症候群、血管新生緑内障、扁平部炎、脈絡膜破裂、デュアン後退症候群、中毒性／栄養性視神経症、脳神経ＩＩＩの異所性再生、頭蓋内大損傷、頸動脈−海綿静脈洞瘻、前部虚血性視神経症、視神経浮腫および視神経乳頭水腫、脳神経ＩＩＩ麻痺、脳神経ＩＶ麻痺、脳神経ＶＩ麻痺、脳神経ＶＩＩ（顔面神経）麻痺、ホルネル症候群、核間性眼筋麻痺、視神経頭部形成不全、視窩、緊張性瞳孔、視神経頭部ドルーセン、脱髄性視神経症（視神経炎、球後視神経炎）、一過性黒内障および一過性脳虚血発作、偽脳腫瘍、下垂体腺腫、伝染性軟属腫、涙管炎、疣贅および乳頭腫、眼瞼シラミおよびシラミ、眼瞼炎、麦粒腫、前中隔蜂巣炎、霰粒腫、基底細胞癌、眼部帯状疱疹、眼瞼シラミおよびシラミ、眼窩下壁骨折、慢性流涙症、涙嚢炎、単純ヘルペス、眼瞼炎、眼窩蜂巣炎、老人性内反、および扁平細胞腫等、の任意の眼疾患、状態、形質、遺伝子型または表現型および関連する構造を意味する。
本発明の１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子の各鎖は、独立に約１５から約３０ヌクレオチド長であり、特定の態様においては約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ二重鎖は、独立に約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）の塩基対を含む。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子の１つ以上の鎖は、独立に標的核酸分子に相補的な約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドを含む。さらに別の態様においては、ヘアピンまたは環状構造を含む本発明のｓｉＮＡ分子は、約３５から約５５（例、約３５、４０、４５、５０、または５５）ヌクレオチド長、あるいは約３８から約４４（例、約３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４）ヌクレオチド長であり、また約１５から約２５（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対を含む。本発明の典型的なｓｉＮＡ分子を表ＩＩに示す。本発明の典型的な合成ｓｉＮＡ分子を表ＩＩおよび／または図４−５に示す。
本明細書で使用する「細胞」は、通常の生物学的意味において使用され、多細胞生物体全体、特にヒトを示すものではない。細胞は、例えば鳥類、植物およびヒト、ウシ、羊、猿、ブタ、犬、および猫といった哺乳類等の生物体に存在し得る。前記細胞は原核（例、細菌細胞）または真核（例、ヒトまたは植物細胞）であってよい。細胞は体細胞または生殖細胞系起源、全能性または多能性、分割または非分割であってよい。また細胞は配偶子または胚、幹細胞、または完全に分化した細胞から派生するかまたはそれらを含んでもよい。
本発明のｓｉＮＡ分子は直接追加されるか、またはカチオン脂質と複合、リポソーム内に包含、あるいは標的細胞または組織に送達することができる。核酸または核酸複合体は、生体高分子に組み込まれるか否かに関係なく、注射、輸液ポンプまたはステントを通じて生体外または生体内の関連組織に局所的に投与することができる。特定の態様において、本発明の核酸分子は表ＩＩ−ＩＩＩおよび／または図４−５に示す配列を含む。そのような核酸分子の例は、基本的にそれらの表および図において定義される配列を含む。さらに、表ＩＶに記載される化学修飾構造は本発明のｓｉＮＡ配列に適用することができる。
別の側面において、本発明は本発明の１つ以上のｓｉＮＡ分子を含む哺乳類細胞を提供する。１つ以上のｓｉＮＡ分子は同一または異なる部位を独立して標的とすることができる。
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とはβ−Ｄ−リボフラノーゼ部分の２’位にヒドロキシル基を持つヌクレオチドを意味する。この語は、１つ以上のヌクレオチドの追加、削除、置換および／または変質によって、自然発生するＲＮＡとは異なる変質ＲＮＡとともに、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡ等の分離されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えによって生成されたＲＮＡを含む。そのような変質は、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおけるｓｉＮＡの末端への非ヌクレオチド材の追加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子にあるヌクレオチドは、自然発生でないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド等の非標準ヌクレオチドを含むこともできる。これらの変質ＲＮＡは、類似体または自然発生ＲＮＡの類似体と呼ばれる。
「対象」とは外植細胞の提供者または被提供者、あるいはその細胞自体である生物体を意味する。また「対象」とは本発明の核酸分子を投与できる生物体も意味する。対象はヒトまたはヒト細胞を含む哺乳類または哺乳類細胞であってよい。
本明細書で使用する「ホスホロチオエート」という語は、化学式Ｉを持つヌクレオチド間結合を示す。ここでＺおよび／またはＷは硫黄原子を含む。このため、ホスホロチオエートという語はホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を意味する。
本明細書で使用する「ホスホノ酢酸」という語は、化学式Ｉを持つヌクレオチド間結合を示す。ここでＺおよび／またはＷはアセチルまたは保存アセチル基を含む。
本明細書で使用する「チオホスホノ酢酸」という語は、化学式Ｉを持つヌクレオチド間結合を示す。ここでＺはアセチルまたは保存アセチル基を含み、Ｗは硫黄原子を含むか、あるいは代替としてアセチルまたは保存アセチル基を含み、Ｚは硫黄原子を含む。
本明細書で使用する「ユニバーサル塩基」という語は、ほとんど違いのない天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基をそれぞれ用いて塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を示す。ユニバーサル塩基の限定を目的としない例は、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、および当該技術分野において周知の３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールといったニトロアゾール誘導体を含む（例として、ロークス（Ｌｏａｋｅｓ），核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２９，２４３７−２４４７を参照）。
本明細書で使用する「非環状ヌクレオチド」という語は、非環状リボース糖を持つ任意のヌクレオチドを意味する。例えばリボースカーボン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４またはＣ５）のいずれかがヌクレオチドから離れて単独で存在するか、または組み合わされて存在している。
本発明の核酸分子を単独で、または他の薬剤と組み合わせてあるいは結合して使用することで、対象または生物体における眼疾患、癌、増殖性疾患、腎疾患または血管形成を治療、抑制、低減、または予防することができる。例えば、治療に適した条件下で、前記ｓｉＮＡ分子を単独で、または１つ以上の薬剤と併用して当業者に明示の他の適切な細胞に投与することができる。
別の態様においては、前記ｓｉＮＡ分子を他の周知の治療と併用して、対象または生物体における眼疾患、癌、増殖性疾患、腎疾患、または血管形成を治療、抑制、低減、または予防することができる。例えば、前記分子を１つ以上の周知の化合物、治療、または手順と併用して、当該技術分野において知られるように、対象または生物体における眼疾患、癌、増殖性疾患、腎疾患、または血管形成を治療、抑制、低減、または予防することができる。
１つの態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子を発現できるように本発明の少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。例えば、ベクターは、二重鎖を含むｓｉＮＡ分子の両鎖をコードする配列を含むことができる。またベクターは、自己相補的であるためｓｉＮＡ分子を形成する単一の核酸分子をコードする配列も含むことができる。そのような発現ベクターの限定を目的としない例は、ポール（Ｐａｕｌ）ら，２００２年，ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１９，５０５：ミヤギシ（Ｍｉｙａｇｉｓｉ）とタイラ（Ｔａｉｒａ），２００２年，ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１９，５０５、リー（Ｌｅｅ）ら，２００２年，ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１９，５００、およびノヴィーナ（Ｎｏｖｉｎａ）ら，２００２年，自然医薬（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），アドバンスオンライン公開 ｄｏｉ１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。
別の態様においては、本発明は本発明の発現ベクターを含む、例えばヒト細胞等の哺乳類細胞を特徴とする。
さらに別の態様においては、本発明の発現ベクターは、例えば表Ｉに示すジンバンクアクセッション番号等で参照されるＲＮＡ分子に対して相補性を持つｓｉＮＡ分子の配列を含む。
１つの態様においては、本発明の発現ベクターは、同一または異なる２つ以上のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。
別の態様においては、標的ＲＮＡ分子と相互作用し、標的ＲＮＡ分子（例、本明細書においてジンバンクアクセッション番号で参照される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子を下方制御するｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入される転写ユニットから発現する。組み換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであってよい。ウイルスベクターを発現するｓｉＮＡは、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに基づいて構築できるが、それらに限定されない。ｓｉＮＡ分子を発現できる組み換えベクターは、本明細書に記載のように送達することができ、標的細胞内に維持できる。代替として、ウイルスベクターを使用してｓｉＮＡ分子の一時的発現を提供することができる。そのようなベクターは、必要に応じて繰返し投与することができる。一旦発現すると、ｓｉＮＡ分子は結合し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して遺伝子の機能または発現を下方制御する。ベクターを発現するｓｉＮＡは、静脈または筋肉内投与等により全身に送達されるか、対象から外植された標的細胞に投与した後、対象に再導入することにより送達できるか、または望ましい標的細胞への導入を可能にする任意の他の方法によって送達できる。
「ベクター」とは、望ましい核酸の送達に使用される任意の核酸および／または細菌ベースの技術を意味する。
本発明の他の機能および利点は、その好ましい態様に関する以下の記述および特許請求の範囲から明白となる。
図面の簡単な説明
図１は、ｓｉＮＡ分子の合成スキームの限定を目的としない例を示す。相補ｓｉＮＡ配列鎖、鎖１および鎖２は、タンデム内で合成され、ヌクレオチドコハク酸塩または脱塩基コハク酸塩等の切断可能なリンカーにより結合される。この切断可能なリンカーは、固定支持体上での固相合成に使用される切断可能なリンカーと同じであるかまたは異なってよい。合成は、固相または液相のいずれかであってよく、表示の例において、合成は固相合成である。合成は、ジメトキシトリチル基等の保護基がタンデムオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチド上で維持されるように実施する。オリゴヌクレオチドの切断および脱保護の際に、２つのｓｉＮＡ鎖は、同時にハイブリダイズしてｓｉＮＡ二重鎖を形成する。これによって、末端脱保護基の特性を利用すること、例えばトリチルを精製方法に適用することにより二重鎖の精製を行うことができる。ここで、末端保護基を持つ二重鎖／オリゴヌクレオチドのみが分離される。
図２は、本発明の方法で合成された精製ｓｉＮＡ二重鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。表示された２つのピークは、個別のｓｉＮＡ配列鎖の予測質量に対応する。この結果は、単純なトリチル−オン精製方法を使用して、タンデム合成から生成されたｓｉＮＡ二重鎖を単一体として精製できることを示す。
図３は、ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の限定を目的としない機構図案を示す。例えばウイルス、トランスポゾン、または他の外来ＲＮＡ等外来単一鎖ＲＮＡからＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ｓｉＮＡ二重鎖を順に生成するダイサー（ＤＩＣＥＲ）酵素を活性化する。代わりに、合成ｓｉＮＡまたは発現ｓｉＮＡを適切な手段で細胞に直接導入することができる。活性なｓｉＮＡ複合体は標的ＲＮＡを認識し、その結果標的ＲＮＡがＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体により分解されるか、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により追加のＲＮＡが合成される。これがダイサー（ＤＩＣＥＲ）を活性化して追加のｓｉＮＡ分子を生じることによりＲＮＡｉ応答を増幅する。
図４Ａ−Ｆは、本発明の化学修飾したｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例を示す。図中Ｎは、任意のヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウリジン、または任意でチミジンを示し、例えばチミジン丸括弧で指定された突出領域（Ｎ Ｎ）において置換できる。ｓｉＮＡ構造のセンス鎖およびアンチセンス鎖に対する様々な修飾が示される。
図４Ａ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのヌクレオチドは、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、リボヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、任意で３’端グリセリル部を有し、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で標的ＲＮＡ配列に相補的であり、すべてのヌクレオチドは、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、リボヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載の他の化学修飾で構成されてよい。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、アンチセンス鎖の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドと任意で結合する。
図４Ｂ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは２’デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである可能性があり、すべてのプリンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み、任意で３’端グリセリル部を有し、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである可能性があり、すべてのプリンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、センス鎖およびアンチセンス鎖における（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドと任意で結合する。
図４Ｃ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、５’端および３’端キャップ部を有し、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み、任意で３’端グリセリル部を有し、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、アンチセンス鎖の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドと任意で結合する。
図４Ｄ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、５’端および３’端キャップ部を有し、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。またここで、すべてのプリンヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである可能性がある。前記アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み、任意で３’端グリセリル部を有し、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである可能性があり、すべてのプリンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、アンチセンス鎖の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドと任意で結合する。
図４Ｅ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、５’端および３’端キャップ部を有し、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み、任意で３’端グリセリル部を有し、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである可能性があり、すべてのプリンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである可能性があり、Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、アンチセンス鎖の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドと任意で結合する。
図４Ｆ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、５’端および３’端キャップ部を有し、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。またここで、すべてのプリンヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである可能性がある。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み、任意で３’端グリセリル部を有し、ここで２つの末端３’−ヌクレオチドは任意で標的ＲＮＡ配列に対して相補的であり、１つの３’端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。ここで、すべてのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである可能性があり、すべてのプリンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除き、２’−デオキシヌクレオチドである可能性があり、（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載されている他の化学修飾で構成されてよい。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、アンチセンス鎖の（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドと任意で結合する。アンチセンス鎖の構造Ａ−Ｆは、本発明の任意の標的核酸配列に対して相補的な配列を含む。さらに、グリセリル部（Ｌ）が図４Ａ−Ｆに示す任意の構造のアンチセンス鎖の３’端に存在する場合は、修飾ヌクレオチド結合は任意である。
図５Ａ−Ｆは、本発明の特定の化学修飾したｓｉＮＡ配列の限定を目的としない例を示す。Ａ−Ｆは、図４Ａ−Ｆに示す化学修飾をＶＥＧＦＲ１ｓｉＮＡ配列に適用する。そのような化学修飾は、任意のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ配列および／または細胞標的配列に適用することができる。
図６は、本発明の異なるｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例を示す。表示の例（構造１、２、および３）は１９の代表的な塩基対を持つが、本発明の異なる態様は本明細書に記載する任意の数の塩基対を含む。括弧付きの領域は、例えば約１、２、３、または４ヌクレオチド長、好ましくは約２ヌクレオチドを含むヌクレオチド突出部を示す。構造１および２は独立してＲＮＡｉ作用に使用することができる。構造２は、任意で生分解が可能なリンカーとして設計できるポリヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを含むことができる。１つの態様においては、構造２に示すループ構造は、生分解が可能なリンカーを含むことができるため、インビボおよび／またはインビトロで構造１を形成する。別の態様においては、構造３を使用して同一の原理で構造２を生成することができる。ここでリンカーを使用して、活性なｓｉＮＡ構造２をインビボおよび／インビトロで生成することができる。また任意で別の生分解が可能なリンカーを利用して活性なｓｉＮＡ構造１をインビボ／インビトロで生成することができる。そのようにして、ｓｉＮＡ構造の安定性および／または活性をその設計に基づいて調節して、インビボまたはインビトロおよび／またはインビトロで使用することができる。
図７Ａ−Ｃは、ｓｉＮＡヘアピン構造を生成する発現カセットの生成に利用されるスキームの図表示である。
図７Ａ：ＤＮＡオリゴマーは、事前設定されたＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的配列と同一の配列を有する領域（ｓｉＮＡのセンス領域）が後に続く５’−制限部位（Ｒ１）配列で合成される。ここでセンス領域は、例えば約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド（Ｎ）の長さを含み、その後に例えば約３から約１０ヌクレオチドを含む定義配列（Ｘ）のループ配列が続く。
図７Ａ：前記合成構造は、次にＤＮＡポリメラーゼにより拡張されて自己相補型配列を有するヘアピン構造を生成する。その結果、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的配列に対する特異性を有し、自己相補型センスおよびアンチセンス領域を持つｓｉＮＡ転写物が生じる。
図７Ｃ：構造を（例えば約９５℃まで）加熱して配列を線形化することによって、プライマーを第一鎖の３’制限配列に使用して、相補第二ＤＮＡ鎖を拡張することができる。二本鎖ＤＮＡは、次に細胞内発現のための適切なベクターに挿入される。構造は、例えばポール（Ｐａｕｌ）ら（２００２年，ネイチャー生化学誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），２９，５０５−５０８）に記載のように制限部位を設けることおよび／またはポリ−Ｕ末端領域を利用することにより、３’端ヌクレオチド突出部が前記転写物から生じるようにデザインすることができる。
図８Ａ−Ｃは、二本鎖ｓｉＮＡヘアピン構造を生成する発現カセットの生成に利用されるスキームの図表示である。
図８Ａ：ＤＮＡオリゴマーは、事前設定されたＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的配列と同一の配列を有する領域（ｓｉＮＡのセンス領域）が後に続く５’−制限部位（Ｒ１）配列で合成される。ここでセンス領域は、例えば約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド（Ｎ）の長さを含み、その後に定義配列（Ｘ）のループ配列に隣接する３’−制限部位（Ｒ２）が続く。
図８Ｂ：合成構造は、次にＤＮＡポリメラーゼにより拡張され、自己相補型配列を有するヘアピン構造を生成する。
図８Ｃ：構造は、Ｒ１およびＲ２に特定の制限酵素により処理され、後で細胞内発現のための適切なベクターに挿入される二本鎖ＤＮＡを生成する。転写カセットは、Ｕ６プロモータ領域がｓｉＮＡの個別のセンス鎖およびアンチセンス鎖を生成するｄｓＤＮＡの各側面に位置するように設計される。ポリＴ終止配列を構造に追加して、その結果生じる転写物にＵ突出部を生成することができる。
図９Ａ−Ｅは、メッセンジャーＲＮＡ等、の特定の標的核酸配列内でｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉの標的部位を判別するために使用される方法の図表示である。
図９Ａ：ｓｉＮＡオリゴヌクレオチドのプールが合成される。ここで前記ｓｉＮＡ構造のアンチセンス領域は、標的核酸配列全体の標的部位に対して相補性を持ち、センス領域はｓｉＮＡのアンチセンス領域に相補的な配列を含む。
図９ＢおよびＣ：（図９Ｃ）細胞へのベクター導入によってｓｉＮＡの発現を生じるように、（図９Ｂ）配列がプールされ、ベクターに挿入される。
図９Ｄ：標的核酸配列の調節に関連する表現型の変化に基づいて細胞を分類する。
図９Ｅ：ｓｉＮＡは分類された細胞から分離され、配列が決定されて標的核酸配列内で有効な標的部位を識別する。
図１０は、例えば本発明のｓｉＮＡ配列の３’端を安定化させるために使用できる異なる安定化化学反応（１−１０）（（１）［３−３’］−逆位デオキシリボース；（２）デオキシリボヌクレオチド；（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド；（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；（６）３’−グリセリル；（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド；（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド；および（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチドを含む）の限定を目的としない例を示す。図に示す修飾および未修飾骨格化学反応に加えて、これらの化学反応を本発明に記載の異なる骨格修飾、例えば化学式Ｉの骨格修飾と組み合わせることができる。さらに、表示の２’−デオキシヌクレオチド５’から末端修飾は、例えば化学式ＩからＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ修飾等、の本明細書に記載の別の修飾または未修飾のヌクレオチドあるいは非ヌクレオチドであってよい。
図１１は、ＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保持しながらヌクレアーゼ耐性を示す、本発明の化学修飾したｓｉＮＡ構造の識別に使用される方法の限定を目的としない例を示す。知識に裏付けられた設計パラメータに基づいて化学修飾をｓｉＮＡ構造に導入する（例、２’−修飾、塩基修飾、骨格修飾、末端キャップ修飾等を導入する）。修飾した構造を適切なシステムにおいて試験する（例、ヌクレアーゼ耐性についてはヒト血清、あるいはＰＫ／送達パラメータについては動物モデル）。平行して、ＲＮＡｉ作用について、例えばルシフェラーゼレポーターアッセイ等の細胞培養システムにおいて、ｓｉＮＡ構造を試験する。次に、ＲＮＡｉ作用を維持しながら特定の特性を有するリードｓｉＮＡ構造を識別し、さらにもう一度修飾および試験することができる。これと同じアプローチを使用して、高い薬物動態プロファイル、送達、およびＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡコンジュゲート分子を識別することができる。
図１２は、直鎖および二重鎖構造ならびにその非対称派生物を含む、本発明のリン酸化ｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を示す。
図１３は、本発明の化学修飾した末端リン酸基の限定を目的としない例を示す。
図１４Ａは、標的核酸配列内で識別されるパリンドロームおよび／または反復核酸配列を利用した、自己相補型ＤＦＯ構造の設計に使用される方法の限定を目的としない例を示す。（ｉ）パリンドロームまたは反復配列が核酸標的配列内で識別される。（ｉｉ）標的核酸配列およびパリンドローム配列に対して相補的な配列がデザインされる。（ｉｉｉ）相補配列の非パリンドローム／反復部分の逆位反復配列が前記相補配列の３’端に付加され、核酸標的に相補的な配列を含む自己相補型ＤＦＯ分子を生成する。（ｉｖ）ＤＦＯ分子は自己組織化して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成することができる。図１４Ｂは、二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の限定を目的としない代表的な例を示す。図１４Ｃは、代表的な二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の自己組織化の概略について限定を目的としない例を示す。図１４Ｄは、遺伝子発現の調節につながる標的核酸配列との相互作用が後に続く、代表的な二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の自己組織化の概略について限定を目的としない例を示す。
図１５は、関連の任意の標的核酸配列に対して相補的な配列を有し、前記ＤＦＯ構造に組み込まれるパリンドロームおよび／または反復核酸配列を利用した、自己相補型ＤＦＯ構造のデザインの限定を目的としない例を示す。これらのパリンドローム／反復配列の組み込みによって、各鎖が例えばＲＮＡｉにより標的遺伝子発現の調節を媒介できる、二重鎖を形成するＤＦＯ構造の設計が可能になる。最初に、標的配列を識別する。次に相補配列を生成する。ここで、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド修飾（ＸまたはＹで示す）が人工パリンドローム（図中ＸＹＸＹＸＹで示す）を生成する相補配列に導入される。非パリンドローム／反復相補配列の逆位反復配列が相補配列の３’端に付加され、核酸標的に相補的な配列を含む自己相補型ＤＦＯ分子を生成する。ＤＦＯは自己組織化して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成することができる。
図１６は、ＲＮＡｉにより指示された異なる標的核酸配列の切断を媒介できる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。図１６Ａは、第一標的核酸配列に対して相補的な第一の領域（相補領域１）および第二標的核酸配列に対して相補的な第二の領域（相補領域２）を有する多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。ここで、第一および第二の相補領域は、多機能ｓｉＮＡにおいて各ポリヌクレオチド配列の３’端に配置される。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列のダッシュ付部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に対して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有しない。図１６Ｂは、第一標的核酸配列に対して相補的な第一の領域（相補領域１）および第二標的核酸配列に対して相補的な第二の領域（相補領域２）を有する多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。ここで、第一および第二の相補領域は、多機能ｓｉＮＡにおいて各ポリヌクレオチド配列の５’端に配置される多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列のダッシュ付部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に対して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有しない。
図１７は、ＲＮＡｉにより指示された異なる標的核酸配列の切断を媒介できる単一のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。図１７Ａは、第一標的核酸配列に対して相補的な第一の領域（相補領域１）および第二標的核酸配列に対して相補的な第二の領域（相補領域２）を有する多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。ここで、第二の相補領域は多機能ｓｉＮＡにおいてポリヌクレオチド配列の３’端に配置される。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列のダッシュ付部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に対して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有しない。図１７Ｂは、第一標的核酸配列に対して相補的な第一の領域（相補領域１）および第二標的核酸配列に対して相補的な第二の領域（相補領域２）を有する多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。ここで、第一相補領域は多機能ｓｉＮＡにおいてポリヌクレオチド配列の５’端に配置される。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列のダッシュ付部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に対して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有しない。１つの態様においては、これらの多機能ｓｉＮＡ構造をインビボまたはインビトロで処理し、図１６に示す多機能ｓｉＮＡ構造を生成する。
図１８は、ＲＮＡｉにより指示された異なる標的核酸配列の切断を媒介できる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。ここで、多機能ｓｉＮＡ構造は自己相補型パリンドロームまたは反復部分をさらに含むため、異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介できる多機能ｓｉＮＡ構造を短縮することができる。図１８Ａは、第一標的核酸配列に対して相補的な第一の領域（相補領域１）および第二標的核酸配列に対して相補的な第二の領域（相補領域２）を有する多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。ここで、第一および第二相補領域は多機能ｓｉＮＡにおいて各ポリヌクレオチド配列の３’端に配置され、さらに自己相補型パリンドロームまたは反復領域を含む前記多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列のダッシュ付部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に対して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有しない。図１８Ｂは、第一標的核酸配列に対して相補的な第一の領域（相補領域１）および第二標的核酸配列に対して相補的な第二の領域（相補領域２）を有する多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。ここで、第一および第二相補領域は、前記多機能ｓｉＮＡにおいて各ポリヌクレオチド配列の５端に配置され、さらに自己相補的なパリンドロームまたは反復領域を含む。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列のダッシュ付部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に対して相補性を有するが、前記標的核酸配列に対する相補性は有しない。
図１９は、ＲＮＡｉにより指示された異なる標的核酸配列の切断を媒介できる単一のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。ここで、多機能ｓｉＮＡ構造はさらに自己相補型パリンドロームまたは反復部分を含むため、異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介できる多機能ｓｉＮＡ構造を短縮することができる。図１９Ａは、第一標的核酸配列に対して相補的な第一の領域（相補領域１）および第二標的核酸配列に対して相補的な第二の領域（相補領域２）を有する多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。ここで、第二相補領域は多機能ｓｉＮＡにおいてポリヌクレオチド配列の３’端に配置され、第一および第二相補領域はさらに自己相補型パリンドロームまたは反復領域を含む。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列のダッシュ付部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に対して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有しない。図１９Ｂは、第一標的核酸配列に対して相補的な第一の領域（相補領域１）および第二標的核酸配列に対して相補的な第二の領域（相補領域２）を有する多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの限定を目的としない例を示す。ここで、第相補領域は、多機能ｓｉＮＡにおいてポリヌクレオチド配列の５’端に配置され、第一および第二相補領域はさらに自己相補的なパリンドロームまたは反復領域を含む。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列のダッシュ付部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に対して相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性は有しない。１つの態様においては、これらの多機能ｓｉＮＡ構造をインビボまたはインビトロで処理し、図１８に示す多機能ｓｉＮＡ構造を生成する。
図２０は、異なるタンパク質、例えばサイトカインおよびその対応する受容体、異なるウイルス株、ウイルス感染または増殖に関与するウイルスおよび細胞タンパク質、または疾患の維持または進行に関わる共通または異なる生物学的経路に関与する異なるタンパク質等、をコードする個別のＲＮＡ分子等、本発明の多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡがどのように２つの個別の標的核酸分ｓｉＮＡを標的とするかに関する限定を目的としない例を示す。多機能ｓｉＮＡ構造の各鎖は相補性を有する領域を含み、標的核酸配列分子を分離する。多機能ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ複合体に利用されてその対応する標的のＲＮＡ干渉媒介性切断を開始するようにデザインされる。これらのデザインパラメータは、ｓｉＮＡ構造の各末端の不安定化を含むことができる（例として、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ら，２００３年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１１５，１９９−２０８を参照）。そのような不安定化は、例えばグアノシン−シチジン塩基対、代替塩基対（例、ゆらぎ）を使用する、または当該技術分野において知られているように、末端ヌクレオチド位の化学修飾ヌクレオチドを不安定化させることによって得られる。
図２１は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子が２つの個別の標的核酸配列を、ＲＮＡの代替コード領域、ＲＮＡのコードおよび非コード領域、またはＲＮＡの代替スプライス変異体領域等、同一の標的核酸分子内でどのように標的とするかに関する限定を目的としない例を示す。多機能ｓｉＮＡ構造の各鎖は標的核酸分子の個別の領域に対する相補性を有する領域を含む。多機能ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ複合体に利用されてその対応する標的領域のＲＮＡ干渉媒介性切断を開始するようにデザインされる。これらのデザインパラメータは、ｓｉＮＡ構造の各末端の不安定化を含むことができる（例として、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ら，２００３年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１１５，１９９−２０８を参照）。そのような不安定化は、例えばグアノシン−シチジン塩基対、代替塩基対（例、ゆらぎ）を使用する、または当該技術分野において知られているように、末端ヌクレオチド位の化学修飾ヌクレオチドを不安定化させることによって得られる。
図２２は、ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡを標的とする化学修飾ｓｉＮＡにより媒介されるＡ３７５細胞内のＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡの減少に関する限定を目的としない例を示す。Ａ５４９細胞は、２５ｎＭ ｓｉＮＡと混合された０．２５μｇ／ウェルの脂質とともにトランスフェクトした。Ｓｔａｂ４／５化学反応（化合物番号３１１９０／３１１９３）、Ｓｔａｂ１／２化学反応（化合物番号３１１８３／３１１８６および化合物番号３１１８４／３１１８７）、および未修飾のＲＮＡ（化合物番号３００７５／３００７６）を含むｓｉＮＡ構造の審査（安定化「Ｓｔａｂ」化学反応を表ＩＶに示す。構造は化合物番号により参照される。表ＩＩＩを参照のこと）において、未処理の細胞、対応する化学反応の逆位コントロールｓｉＮＡ構造、（化合物番号３１２０８／３１２１１、化合物番号３１２０１／３１２０４、化合物番号３１２０２／３１２０５、および化合物番号３００７７／３００７８）スクランブルｓｉＮＡコントロール構造（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２）、および脂質のみをトランスフェクトした細胞（トランスフェクトコントロール）と比較した。ｓｉＮＡ構造はすべて、ＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡ発現の著しい減少を示した。
図２３は、対応する化学反応の逆位コントロールｓｉＮＡ構造と比較して、ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡにおける８つの位置に対して指示されたＳｔａｂ９／１０を使用したＨＡＥＣ細胞培養におけるＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡレベルの減少に関する限定を目的としない例を示す。コントロールＵＮＴおよびＬＦ２Ｋは、それぞれ未処理の細胞およびＬＦ２Ｋトランスフェクション試薬のみで処理した細胞を示す。
図２４は、ＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡを標的とする化学修飾ｓｉＮＡにより媒介されるＨＡＥＣ細胞内のＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡの減少に関する限定を目的としない例を示す。ＨＡＥＣ細胞は、２５ｎＭ ｓｉＮＡと混合された０．２５μｇ／ウェルの脂質とともにトランスフェクトした。Ｓｔａｂ４／５化学反応（化合物番号３０７８６／３０７９０）、Ｓｔａｂ７／８化学反応（化合物番号３１８５８／３１８６０）、およびＳｔａｂ９／１０化学反応（化合物番号３１８６２／３１８６４）およびＳｔａｂ４／５化学反応（化合物番号３１８５６／３１８５７）を含む３９４８位、Ｓｔａｂ７／８化学反応（化合物番号３１８５９／３１８６１）、およびＳｔａｂ９／１０化学反応（化合物番号３１８６３／３１８６５）を含むｓｉＮＡ構造の審査（安定化「Ｓｔａｂ」化学反応を表ＩＶに示す。構造は化合物番号により参照される。表ＩＩＩを参照のこと）において、未処理の細胞、３８５４位にある対応する化学反応の逆位コントロールｓｉＮＡ構造（化合物番号３１８７８／３１８８０、化合物番号３１８８２／３１８８４、および化合物番号３１８８６／３１８８８）および３９４８にある対応する化学反応の逆位コントロールｓｉＮＡ構造（化合物番号３１８７９／３１８８１、化合物番号３１８８３／３１８８５、および化合物番号３１８８７／３１８８９）、ＬＦ２Ｋ（トランスフェクション試薬）で処理した細胞、およびすべてのＲＮＡコントロール（３８５４位における化合物番号３１４３５／３１４３９および３９４８位における化合物番号３１４３７／３１４４１）と比較した。ｓｉＮＡ構造はすべて、ＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡ発現の著しい減少を示した。
図２５は、無関連のコントロールｓｉＮＡ構造（ＩＣ１、ＩＣ２）と比較して、ＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡにおける４つの位置に対して指示されたＳｔａｂ０／０を使用したＨＡＥＣ細胞培養におけるＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡレベルの減少に関する限定を目的としない例を示す。コントロールＵＮＴおよびＬＦ２Ｋは、それぞれ未処理の細胞およびＬＦ２Ｋトランスフェクション試薬のみで処理した細胞を示す。
図２６は、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）相同性を有する配列を標的とするｓｉＮＡ分子を用いた処理から２４時間後の、ＨＡＥＣ細胞（１５，０００細胞／ウェル）におけるＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）ｍＲＮＡレベルの減少に関する限定を目的としない例を示す。ＨＡＥＣ細胞は、２５ｎＭ ｓｉＮＡと混合された１．５μｇ／ウェルの脂質とともにトランスフェクトした。ｓｉＮＡ分子の活性は、対応する化学反応の逆位ｓｉＮＡコントロール、未処理の細胞、および脂質のみで処理した細胞（トランスフェクションコントロール）と比較して表示される。ｓｉＮＡ分子およびコントロールは化合物番号（センス／アンチセンス）により参照される。配列については表ＩＩＩを参照のこと。図２６Ａは、Ｓｔａｂ９／１０ｓｉＮＡ構造の場合のデータを示す。図２６ＢはＳｔａｂ７／８ｓｉＮＡ構造の場合のデータを示す。図２６Ｂの研究は、追加コントロールとしてＶＥＧＦＲ１（３２７４８／３２７５５）およびその対応する化学反応の逆位コントロール（３２７７２／３２７７９）のみを標的とする構造を含む。図に示すように、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２配列の両方を標的とするｓｉＮＡ構造は、細胞培養実験においてＶＥＧＦＲ１発現の抑制に関して潜在的な有効性を示している。
図２７は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２相同配列を標的とするｓｉＮＡ分子を用いた処理後２４時間のＨＡＥＣ細胞（１５，０００細胞／ウェル）におけるＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）ｍＲＮＡレベルの低減に関する限定を目的としない例を示す。ＨＡＥＣ細胞は、２５ｎＭ ｓｉＮＡと混合された１．５μｇ／ウェルの脂質とともにトランスフェクトした。ｓｉＮＡ分子活性は、合致する化学的な逆位ｓｉＮＡコントロール、未処理の細胞、および脂質のみで処理した細胞（トランスフェクションコントロール）と比較して表示される。ｓｉＮＡ分子およびコントロールは化合物番号（センス／アンチセンス）により参照される。配列については表ＩＩＩを参照のこと。図２７Ａは、Ｓｔａｂ９／１０ｓｉＮＡ構造の場合のデータを示す。図２７ＢはＳｔａｂ７／８ｓｉＮＡ構造の場合のデータを示す。図２７Ｂの試験は、追加コントロールとしてＶＥＧＦＲ１（３２７４８／３２７５５）およびその対応する化学反応の逆位コントロール（３２７７２／３２７７９）のみを標的とする構造を含む。図に示すように、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２配列の両方を標的とするｓｉＮＡ構造は、細胞培養実験においてＶＥＧＦＲ２発現の抑制に関して潜在的な有効性を示している。
図２８は、ラット角膜モデルの血管形成を使用した、ＶＥＧＦ誘発性血管形成のｓｉＮＡ媒介性抑制の限定を目的としない例を示す。ＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡの２３４０位を標的とするｓｉＮＡ（化合物番号２９６９５／２９６９９ センス鎖／アンチセンス鎖で表示される）を、逆位のコントロールｓｉＮＡ（化合物番号２９９８３／２９９８４ センス鎖／アンチセンス鎖）と３つの異なる濃度（１μｇ、３μｇ、および１０μｇ）で比較し、またｓｉＮＡを投与していないＶＥＧＦコントロールとも比較した。図に示すように、ＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ構造は、ラット角膜モデルにおいて血管形成を著しく抑制した。
図２９は、ラット角膜モデルにおけるＶＥＧＦ誘発性新血管形成の抑制に関する限定を目的としない例を示す。ＶＥＧＦＲ１の３４９位にある「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応を有するｓｉＮＡ（化合物番号３１２７０／３１２７３）を、ＶＥＧＦ誘発性新血管形成の抑制について３つの異なる濃度（２．０μｇ、１．０μｇ、および０．１μｇ用量反応）で試験し、各濃度での合致した化学的な逆位のコントロールｓｉＮＡ構造（化合物番号３１２７６／３１２７９）およびｓｉＮＡを投与していないＶＥＧＦコントロールと比較した。図に示すように、「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応を有する活性ｓｉＮＡ構造（化合物番号３１２７０／３１２７３）は、０．１μｇから２．０μｇ濃度での合致した化学的な逆位コントロールｓｉＮＡと比較して、ラット角膜モデルにおけるＶＥＧＦ誘発性血管形成の抑制に極めて有効である。
図３０は、２つの異なるｓｉＮＡ安定化化学反応を使用して、ＶＥＧＦＲ１の３４９位に隣接する部位の有効性を評価した試験の限定を目的としない例を示す。化学反応ＣはＳｔａｂ９／１０であるが、化学反応ＤはＳｔａｂ７／８である。
図３１は、ＶＥＧＦディスク移植後のｓｉＮＡ結膜下投与を介してＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２により共有される相同配列を標的とするｓｉＮＡ構造を使用した、ＶＥＧＦ誘発性眼血管形成の抑制に関する限定を目的としない例を示す。脈略膜をレーザーで損傷させた後、１日目および７日目にｓｉＮＡ構造を眼内投与し、１４日目に脈略膜の新血管形成を判定した。
図３２は、ｓｉＮＡの眼内投与を介したマウスモデルの脈略膜新血管形成におけるＶＥＧＦ誘発性新血管形成の抑制に関する限定を目的としない例を示す。ＶＥＧＦＲ１の３４９位にある「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応を有する活性ｓｉＮＡ（化合物番号３１２７０／３１２７３）を、新血管形成の抑制について２つの異なる濃度（１．５μｇおよび０．５μｇ）で試験し、合致した化学的な逆位コントロールｓｉＮＡ構造（化合物番号３１２７６／３１２７９）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と比較した。脈略膜をレーザーで損傷させた後、１日目および７日目にｓｉＮＡ構造を眼内投与し、１４日目に脈略膜の新血管形成を判定した。図に示すように、「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応（化合物番号３１２７０／３１２７３）を有する活性ｓｉＮＡ構造は、このモデルにおいて眼内投与を介した新血管形成の抑制に極めて有効である。
図３３は、ｓｉＮＡの眼周囲投与を介したマウスモデルの脈略膜新血管形成におけるＶＥＧＦ誘発性新血管形成の抑制に関する限定を目的としない例を示す。ＶＥＧＦＲ１の３４９位にある「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応を有する活性ｓｉＮＡ（化合物番号３１２７０／３１２７３）を、新血管形成の抑制について２つの異なる濃度（生理食塩水コントロールの場合１．５μｇ、逆位のｓｉＮＡコントロールの場合０．５μｇ、化合物番号３１２７６／３１２７９）で試験した。片方の目に活性ｓｉＮＡ、もう一方の目に生理食塩水または逆位コントロールを投与した８匹のマウスを本試験の各郡に使用した。図に示すように、「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応を有する活性ｓｉＮＡ構造（化合物番号３１２７０／３１２７３）は、このモデルにおける眼周囲投与を介した新血管形成の抑制に極めて有効である。
図３４は、ｓｉＮＡの眼周囲投与を介したマウスモデルの脈略膜新血管形成におけるＶＥＧＦ誘発性新血管形成の抑制に関する限定を目的としない例を示す。ＶＥＧＦＲ１の３４９位にある「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応を有する活性ｓｉＮＡ（化合物番号３１２７０／３１２７３）を、新血管形成の抑制について２つの異なる濃度（逆位ｓｉＮＡコントロールの場合１．５μｇ、化合物番号３１２７６／３１２７９および生理食塩水コントロールの場合０．５μｇ）で試験した。片方の目に活性ｓｉＮＡ、もう一方の目に逆位コントロールを投与した９匹のマウスを本試験の活性群対逆位群に使用した。片方の目に活性ｓｉＮＡ、もう一方の目に生理食塩水または逆位コントロールを投与した８匹のマウスを本試験の各郡に使用した。レーザーで脈略膜を損傷させた後、ｓｉＮＡ構造およびコントロールを最長１４日間毎日投与し、１７日目に新血管形成を判定した。図に示すように、「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応を有する活性ｓｉＮＡ構造（化合物番号３１２７０／３１２７３）は、このモデルにおける眼周囲投与を介した新血管形成の抑制に極めて有効である。
図３５は、眼新血管形成のマウスモデルにおいて、合致した化学的な逆位コントロールｓｉＮＡ構造（３１２７６／３１２７９）を注射したマウスと比較して、ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡの３４９位を標的とする活性ｓｉＮＡ（３１２７０／３１２７３）を注射したマウスにおける脈略膜新血管形成（ＣＮＶ）のｓｉＮＡ媒介性抑制の限定を目的としない例を示す。ブルッフ（Ｂｒｕｃｈ）膜の破裂後、３日ごとに眼周囲注射を実施した。活性ｓｉＮＡで治療した眼は、逆位コントロールｓｉＮＡ構成（ｎ＝１３，ｐ＝０．０００２）で治療した眼よりもＣＮＶの領域が著しく小さかった。
図３６は、酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルにおいて、合致した化学的な逆位コントロールｓｉＮＡ構造（３１２７６／３１２７９）を注射したマウスと比較して、ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡの３４９位を標的とする活性ｓｉＮＡ（３１２７０／３１２７３）を注射したマウスにおけるＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡレベルのｓｉＮＡ媒介性抑制に関する限定を目的としない例を示す。ＶＥＧＦＲ１ｓｉＮＡ（３１２７０／３１２７３）をＰ１２、Ｐ１４、およびＰ１６上に眼周囲注射（５μｌ；１．５μｇ／μｌ）することで、合致した化学的な逆位コントロールｓｉＮＡ構造（３１２７６／３１２７９）を注射した場合と比較して、ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ発現が著しく減少した（４０％抑制；ｎ＝９、ｐ＝０．０１２１）。
図３７は、酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルにおいて、合致した化学的な逆位コントロールｓｉＮＡ構造（３１２７６／３１２７９）を注射したマウスと比較して、ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡの３４９位を標的とする活性ｓｉＮＡ（３１２７０／３１２７３）を注射したマウスにおけるＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡレベルのｓｉＮＡ媒介性抑制に関する限定を目的としない例を示す。ＶＥＧＦＲ１ｓｉＮＡ（３１２７０／３１２７３）（５μｇ）の眼内注射も著しく減少させた。ＶＥＧＦＲ１タンパク質レベルを合致した化学的な逆位コントロールｓｉＮＡ構成（３１２７６／３１２７９）を注射した場合と比較した（３０％抑制；ｎ＝７，ｐ＝０．０１０３）。
図３８は、合致した化学的な不活性逆位コントロールｓｉＮＡ（化合物番号３１２７６／３１２７９）および生理食塩水と比較して、ＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡの３４９位を標的とする活性Ｓｔａｂ９／１０ｓｉＮＡ（化合物番号３１２７０／３１２７３）を使用した、マウス４Ｔ１ルシフェラーゼ乳癌同系腫瘍モデルにおける初期腫瘍量の低減に関する限定を目的としない例を示す。図に示すように、このモデルにおいて活性ｓｉＮＡ構成は腫瘍量の低減に有効である。
図３９は、合致した化学的な不活性逆位コントロールｓｉＮＡ（化合物番号３１２７６／３１２７９）と比較して、ＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡの３４９位を標的とする活性Ｓｔａｂ９／１０ｓｉＮＡ（化合物番号３１２７０／３１２７３）を使用した、マウス４Ｔ１ルシフェラーゼ乳癌同系腫瘍モデルにおける可溶ＶＥＧＦＲ１血清レベルの低減に関する限定を目的としない例を示す。図に示すように、このモデルにおいて活性ｓｉＮＡ構造は可溶ＶＥＧＦＲ１血清レベルの低減に有効である。
図４０は、ＶＥＧＦの１４２０位およびＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２の保存された３６４６／３７１８位（ＭＦ３４７０６／３４７０７）、ＶＥＧＦの１４２１位およびＶＥＧＲ１／ＶＥＧＦＲ２の保存された３６４６／３７１８位（ＭＦ３４７０８／３４７０９）、およびＶＥＧＦの１５６２位およびＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２の保存された３６４６／３７１８位（ＭＦ３４６９５／３４７００）を標的とする多機能ｓｉＮＡを、２５ｎＭで異なる多機能長（ＩＣ−１、ＩＣ−２、ＩＣ−３、およびＩＣ−４）に対応して異なる長さを有する無関連の多機能ｓｉＮＡコントロール、および未処理の細胞にとともにＶＥＧＦの１４２０位（３２５３０／３２５４８）、１４２１（３２５３１／３２５４９）、および１５６２（３４６８２／３４６９０）を標的とする個別のｓｉＮＡ構造を用いて評価した試験結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号を表ＩＩＩに示す。（Ａ）ＶＥＧＦ発現に対するウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）／ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルミネセンスの比率としてデータを示す。（Ｂ）ＶＥＧＦＲ１発現に対するウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）／ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルミネセンスの比率としてデータを示す。（Ｃ）ＶＥＧＦＲ２発現に対するウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）／ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルミネセンスの比率としてデータを示す。図に示すように、多機能ｓｉＮＡ構成は、未処理の細胞および無関連の合致した化学的なコントロール、合致した長さのコントロールと比較して、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２を選択的に抑制する。
図４１は、ＶＥＧＦの１５６２位およびＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２の保存された３６４６／３７１８（ＭＦ３７５３８／３７５７９）を標的とする安定化した多機能ｓｉＮＡを、０．０２から１０ｎＭで、ＶＥＧＦの１５６２位（３７５７５／３７５７７）およびＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２の保存された３６４６／３７１８位（３３７２６／３７５７６）を標的とする個別のｓｉＮＡ構造、およびＶＥＧＦの１５６２位（３７５７５／３７５７７）およびＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２の保存された３６４６／３７１８（３３７２６／３７５７６）を標的とするプールされた個別のｓｉＮＡ構造と比較して評価した容量反応試験の結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号を表ＩＩＩに示す。（Ａ）ＶＥＧＦ発現に対するウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）／ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルミネセンスの比率としてデータを示す。（Ｂ）ＶＥＧＦＲ１発現に対するウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）／ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルミネセンスの比率としてデータを示す。（Ｃ）ＶＥＧＦＲ２発現に対するウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）／ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルミネセンスの比率としてデータを示す。図に示すように、安定化した多機能ｓｉＮＡ構造は、対応する個別のｓｉＮＡ構造およびプールされたｓｉＮＡ構造と同様のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２を選択的に抑制する。
図４２は、ＶＥＧＦの１４２１位およびＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２の保存された３６４６／３７１８位を標的とする様々な非ヌクレオチド連結多機能ｓｉＮＡを、２５ｎＭで、未処理の細胞（ｓｉＲＮＡなし）、ＨＣＶ ＲＮＡの３２７位（ＨＣＶ３２７，３４５８５／３６４４７）標的とする無関連のｓｉＮＡコントロール、ＶＥＧＦの１４２１位（３２５３１／３２５４９）およびＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２の保存された３６４６／３７１８（３２２３６／３２５５１）を標的とする個別の活性ｓｉＮＡ構造、無関連の合致した長さの多機能ｓｉＮＡ構造（３５４１４／３６４４７／３６４４６）と比較して評価した試験結果を示す。ウミシイタケ／ホタルルシフェラーゼシグナルの比率によって、本明細書に記載のようにＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ）、またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）発現レベルに関して各構造を評価した。ヘキサエチレングリコール係留紐（３６４２５／３２２５１／３２５４９）、Ｃ１２係留紐（３６４２６／３２２５１／３２５４９）、テトラエチレングリコール係留紐（３６４２７／３２２５１／３２５４９）、Ｃ３係留紐（３６４２８／３２２５１／３２５４９）および二重ヘキサエチレングリコール係留紐（３６４２９／３２２５１／３２５４９）を有する活性連結多機能ｓｉＮＡに関するデータを示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号を表ＩＩＩに示す。図に示すように、非ヌクレオチド連結多機能ｓｉＮＡ構造は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２を標的とする対応する個別のｓｉＮＡ構造に対する同様の活性を示す。
図４３（Ａ−Ｈ）は、本発明の連結された多機能ｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例を示す。表示の例において、リンカー（例、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）は２つのｓｉＮＡ領域（例、２つのセンス、２つのアンチセンス、または代替として１つのセンス領域および１つのアンチセンス領域）を結合する。第一標的配列および第二標的配列に対応する個別のセンス（またはセンスおよびアンチセンス）配列は、多機能ｓｉＮＡにおいてそれらに対応するセンスおよび／またはアンチセンス配列に対してハイブリダイズする。さらに、選択的または高い送達および／または薬物動態特性を目的として、様々なコンジュゲート、リガンド、アプタマー、ポリマーまたはレポーター分子をリンカー領域に接続することができる。
図４４は、様々なデンドリマーベースの多機能ｓｉＮＡデザインの限定を目的としない例を示す。
図４５は、様々な超分子の多機能ｓｉＮＡデザインの限定を目的としない例を示す。
図４６は、３０ヌクレオチドの前駆ｓｉＮＡ構造を使用して多機能ｓｉＮＡデザインを可能にするダイサーの限定を目的としない例を示す。３０塩基対の二重鎖は、ダイサーによっていずれかの末端から２２および８塩基対生成物に切断される（８塩基対部分は表示せず）。表示を簡略化するため、ダイサーにより生成される突出部は表示しないが、補うことができる。３つの標的配列を示す。必要な配列の重複単位はグレーのボックスで表示する。安定した化学的性質において試験する場合、親３０塩基対ｓｉＮＡのＮ’は、ダイサー切断が可能な２’−ＯＨ位の部位を提示している。ダイサーＲＮａｓｅＩＩＩによる３０量体二重鎖の処理では精密に２２＋８に切断されるのではなく、一連の近似する生成物（初期位として２２＋８を持つ）が生成される。そのため、ダイサーによる処理で一連の活性ｓｉＮＡが産出される。
図４７は、４０ヌクレオチドの前駆ｓｉＮＡ構造を使用して多機能ｓｉＮＡデザインを可能にするダイサーの限定を目的としない例を示す。４０塩基対の二重鎖は、ダイサーによっていずれかの末端から２０塩基対生成物に切断される。表示を簡略化するため、ダイサーにより生成される突出部は表示しないが、補うことができる。４つの標的配列を示す。必要な配列の重複単位はグレーのボックスで表示する。このデザイン形式はより大きなＲＮＡに拡大することができる。化学的に安定したｓｉＮＡがダイサーにより結合される場合、次に戦略的に配置されたリボヌクレオチド結合によってデザイナー切断生成物が可能になり、我々の多機能デザインのレパートリーをさらに拡大することができる。例えば、約２２ヌクレオチドのダイサー標準に限定されない切断生成物によって、例えば約３から約１５ヌクレオチドの範囲で重複する標的配列単位を持つ多機能ｓｉＮＡ構造を実現することができる。
図４８は、ＨＢＶの２６３位を標的とする多機能ｓｉＮＡ構造を可能にするダイサーによるＨＢＶ ＲＮＡの抑制の限定を目的としない例を示す。ｓｉＮＡアンチセンス鎖（例、３’−ＴＴ突出部を持つ二重鎖における２１ヌクレオチド鎖）の最初の１７ヌクレオチドが標的ＲＮＡに対して相補的である場合、２５ｎＭで強固なサイレンシングが観察された。同一形式で１６ヌクレオチドのみが相補性を持つ場合、８０％のサイレンシングが認められた。
図４９は、本発明の追加多機能ｓｉＮＡ構造のデザインの限定を目的としない例を示す。１つの態様においては、コンジュゲート、リガンド、アプタマー、ラベル、または他の部分を多機能ｓｉＮＡの一領域に結合することで高い送達または薬物動態プロファイリングが実現する。
図５０は、本発明の追加多機能ｓｉＮＡ構造のデザインの限定を目的としない例を示す。１つの態様においては、コンジュゲート、リガンド、アプタマー、ラベル、または他の部分を多機能ｓｉＮＡの一領域に結合することで高い送達または薬物動態プロファイリングが実現する。
本発明の核酸分子の作用機序
以下の考察は、現在知られている低分子干渉ＲＮＡを介したＲＮＡ干渉の機構を論じるものであり、従来技術に限定する意図はなく、従来技術を承認するものではない。出願人は、本明細書にて化学的に修飾された低分子干渉核酸がｓｉＲＮＡ分子同様に類似の、または改善されたＲＮＡｉを媒介する能力を有すること、また、改良された安定性とインビボ活性を有すると期待されることを示し、従って、本考察はｓｉＲＮＡのみに限定されず、ｓｉＮＡ全体に応用され得る。「ＲＮＡｉを媒介する改良された能力」または「改良されたＲＮＡｉアクティビティー」という用語は、インビトロまた／もしくはインビボでＲＮＡｉアクティビティーを測定したものを含んで意味し、ＲＮＡｉアクティビティーはＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡの活性と本発明のｓｉＮＡの安定性、双方の反映である。本発明では、全てのＲＮＡ、複数のリボヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡもしくはｓｉＮＡと比較して、これらの活性による結果はインビトロまた／もしくはインビボで上昇し得る。ある場合においては、ｓｉＮＡ分子の活性または安定性は低下し得るが（すなわち１０倍未満）、ｓｉＮＡ分子の全体的な活性はインビトロまた／もしくはインビボで改良された。
ＲＮＡ干渉は、動物における低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す（ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら，１９９８年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６）。植物においてこれに相当する過程は、一般的に転写後遺伝子サイレンシング、またはＲＮＡサイレンシング、菌類ではクエリングとも呼ばれる。転写後の遺伝子サイレンシング過程は、外来遺伝子の発現を阻止するために使用される進化的に保存された細胞防御機構であると考えられ、一般に多様な植物相および門に共通である（ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら，１９９９年，トレンド遺伝学誌Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ），１５，３５８）。外来遺伝子からのそのような保護は、ウイルス感染から、または特に同種の一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを破壊する細胞応答による、転位因子の宿主ゲノムへの任意の融合から生じた、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応じて進化してきた可能性がある。細胞内におけるｄｓＲＮＡの存在は、未だ特性が完全には明らかにされていない機序によってＲＮＡｉ応答を誘発する。この機序は、ｄｓＲＮＡに媒介されるプロテインキナーゼＰＫＲの活性化の結果起こる反応と、リボヌクレアーゼＬによる非特異的なｍＲＮＡ切断の結果起こる２’、５’−オリゴアデニル生成とで異なるようである。
長鎖ｄｓＲＮＡが細胞内に存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは、ｄｓＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い断片になる過程に関わっている（バースタイン（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ）ら，２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０９，３６３）。ダイサー活性によって生じる低分子干渉ＲＮＡは、一般的に約２１から約２３ヌクレオチドの長さで、約１９塩基対の二重鎖を含む。ダイサーは、２１および２２ヌクレオチドの低分子一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を、翻訳調整に関わる保存構造の前駆ＲＮＡから切除する場合にも関与している（ハットヴァーグナー（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ）ら，２００１年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９３，８３４）。ＲＮＡｉ反応はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般的に呼ばれる、ｓｉＲＮＡとの相同配列を持つ一本鎖ＲＮＡの切断を媒介するｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体としての役割がある。標的ＲＮＡの切断はｓｉＲＮＡ二重鎖であるガイド配列に相補的な中央の領域で行われる（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）等、２００１年，遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．），１５，１８８）。加えて、ＲＮＡ干渉は、おそらくクロマチン構造を制御し、それによって標的遺伝子配列の転写を防ぐという細胞機構を通じた、短いＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）によって媒介される遺伝子サイレンシングにも関わっている可能性がある（例えば以下の文献を参照：オールシャー（Ａｌｌｓｈｉｒｅ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８１８−１８１９；ヴォープ（Ｖｏｌｐｅ）ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８３３−１８３７；ジニュウェイン（Ｊｅｎｕｗｅｉｎ）２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２１５−２２１８；ホール（Ｈａｌｌ）ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２３２−２２３７）。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、転写物であるＲＮＡとの相互作用を介して、または特定の遺伝子配列との相互作用の代わりとして遺伝子サイレンシングの媒介に使われる可能性があり、そのような相互作用は転写レベルまたは転写後レベルで遺伝子サイレンシングを引き起こす。
ＲＮＡｉは様々なシステムで研究されてきた。ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら，１９９８年、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６，は、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｃｅ）で初めてＲＮＡｉを観察した。ウィアニー（Ｗｉａｎｎｙ）とゲッツ（Ｇｏｅｔｚ），１９９９年，ネイチャー細胞生物学誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）２，７０，は、マウスの胚においてＲＮＡｉはｄｓＲＮＡによって媒介されていると述べた。ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）ら，２０００年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０４，２９３）は、ｄｓＲＮＡとともに導入されるショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉについて記述している。エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４１１，４９４，は、ヒトの胚の腎臓およびＨｅＬａ細胞を含むほ乳類の細胞における２１ヌクレオチドの二重鎖の合成ＲＮＡの導入によるＲＮＡｉ誘導について述べた。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の胚ライセートにおける最近の研究では、ｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成、配列といった効率的なＲＮＡｉ活性の媒介に最も重要な特定の必要条件が明らかになった。これらの研究は、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖は３’端の２ヌクレオチドの突出を含んでいる場合に最も活性が高いという事を示した。さらに、片方または双方のｓｉＲＮＡ鎖を２’デオキシ、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換した場合ＲＮＡｉアクティビティーは消滅し、一方でｓｉＲＮＡヌクレオチド３’端のデオキシヌクレオチドによる置換は耐用性を示した。ｓｉＲＮＡ二重鎖の中央のミスマッチ配列も、同様にＲＮＡｉ活性を消滅させる事が示された。加えて、これらの研究は標的ＲＮＡの切断部位の位置はｓｉＲＮＡの３’端ではなく５’端によって規定されるという事も示された（エルバシール（Ｅｌｂｅｒｓｈｉｒ）ら，２００１年，欧州分子生物学協会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．），２０，６８７７）。ｓｉＲＮＡ二重鎖の標的相補鎖の５’リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり、ｓｉＲＮＡの５’リン酸部分の維持にＡＴＰが用いられると別の研究が示したが（ニカネン（Ｎｙｋａｎｅｎ）ら，２００１年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０７，３０９）、一方で、外因的に導入された場合には５’リン酸が欠けているｓｉＲＮＡ分子は活性であり、ｓｉＲＮＡ構造の５’リン酸化がインビボで起こるのかもしれないと示唆されている。
本発明の二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）
１つの態様として、本発明は、二重鎖オリゴヌクレオチドへと自己集合することができる二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。本発明の二重鎖形成オリゴヌクレオチドは、化学的に合成するか、転写単位および／またはベクターから発現することができる。本発明のＤＦＯ分子は、様々な治療、診断、農業、畜産、標的の確認、ゲノム上の発見、遺伝子工学、薬理ゲノミクス上の応用に、有用な試薬と方法を提供する。
本明細書においては便宜上、二重鎖形成オリゴヌクレオチドまたはＤＦＯ分子と呼ぶが、これらに限定されない特定のオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の配列特異的な調節の有力なメディエーターであることを、出願人は本明細書で示す。二重鎖オリゴヌクレオチドになるよう自己集合するようデザインされた、二重鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれの鎖が、標的核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む線状のポリヌクレオチド配列群である点において、本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で知られている他の核酸配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）とは異なる。従って本発明の核酸分子は、二重鎖のそれぞれの鎖に同じポリヌクレオチド配列を含み、それぞれの鎖が標的核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、機能的な二重鎖へと自己集合することができる。
概して、二重鎖のオリゴヌクレオチドは、一つの鎖のオリゴヌクレオチド配列が二つ目の鎖のオリゴヌクレオチド配列と相補的である、二つの異なるオリゴヌクレオチド配列の集合によって形成され、そのような二重鎖オリゴヌクレオチドは二つの分離したオリゴヌクレオチドが集合するか、または、当該分野ではしばしばヘアピン様ステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ、または短鎖ヘアピンＲＮＡ）と呼ばれる、二重鎖構造を形成するように折り畳まった一つの分子から形成される。当該分野で知られる二重鎖のそれぞれの鎖に全て共通の特徴があるこれらの二重鎖オリゴヌクレオチドには、特徴的なヌクレオチド配列がある。
当該分野で知られる二重鎖核酸分子とは異なり、出願人は、新規の、潜在的な費用効率が高い、一本鎖または線状のオリゴヌクレオチドから二重鎖核酸分子を形成する簡便な方法を開発した。二重鎖オリゴヌクレオチドの二つの鎖は、同じヌクレオチド配列を持ち、非共有結合で互いに結合された本発明に従って形成された。前述の二重鎖オリゴヌクレオチド分子は、合成後に当該分野で既知の手法と試薬によって容易に結合することができ、本発明の範囲内である。１つの態様においては、二重鎖を形成する本発明（二重鎖形成オリゴヌクレオチド）の一本鎖オリゴヌクレオチドは、第一の領域と第二の領域を含み、第二の領域は第一の領域のヌクレオチド配列の逆方向反復のヌクレオチド配列を含むか、もしくは、二重鎖の片方の鎖のヌクレオチド配列が二本目の鎖のヌクレオチド配列と同一である二重鎖オリゴヌクレオチドを、自己集合して形成するような部分を含む。上述の二重鎖形成オリゴヌクレオチドの限定を目的としない例が図１４および１５に描かれている。これらの二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）は状況に応じて特定のパリンドロームまたは反復配列を含んでいてもよく、そのようなパリンドロームまたは反復配列は、ＤＦＯの第一の領域と第二の領域の間に存在する。
１つの態様においては、本発明は、二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）中に標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列である二重鎖を形成する自己相補的な核酸配列を含むＤＦＯ分子であることを特徴とする。ＤＦＯ分子は自己相補配列を単独で、またはそのような自己相補配列による集合の結果生じた二重鎖を含む可能性がある。
１つの態様においては、本発明の二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）は第一の領域と第二の領域を含み、第二の領域はＤＦＯ分子が二重鎖ヌクレオチドに自己集合できるように第一の領域のヌクレオチド配列の逆方向反復のヌクレオチド配列を含む。そのような二重鎖オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を調節する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）として作用することができる。本発明のＤＦＯ分子によって二重鎖形成された二重鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれの鎖は、標的核酸分子（例えば、標的ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）の同じヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列領域を含む可能性がある。
１つの態様においては、本発明は、二重鎖オリゴヌクレオチドへと自己集合できる一本鎖のＤＦＯであることを特徴とする。出願人は意外にも、自己相補性のヌクレオチド領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドが容易に二重鎖オリゴヌクレオチド構造に自己集合できるということを見いだした。このようなＤＦＯは、配列特異的に遺伝子発現を抑制することができる二重鎖へと自己集合することができる。本発明のＤＦＯ分子は、第二領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を持つ第一領域を含み、その第一領域の配列は標的核酸（例えばＲＮＡ）に相補的である。ＤＦＯは、二重鎖オリゴヌクレオチドそれぞれの鎖の一部分が標的核酸配列に相補的な配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチドを形成することができる。
１つの態様においては、本発明の二重鎖オリゴヌクレオチドは、二重鎖オリゴヌクレオチドの二本の鎖は互いに共有結合で結合されていない、また、二重鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれの鎖は標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列と同一の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでいるという点を特徴とする（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）。別の態様においては、二重鎖オリゴヌクレオチドの二本の鎖は少なくとも約１５、望ましくは約１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドの同一のヌクレオチド配列を共有している。
１つの態様においては、本発明のＤＦＯ分子は化学式ＤＦＯ−Ｉ：
Figure 2007505605
 の構造を有し、式中、Ｚは場合により１か所以上の修飾されたヌクレオチド（例、２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリン、またはユニバーサル塩基といった修飾された塩基を含むヌクレオチド）を含んでいてもよい、例えば約２から２４ヌクレオチドの偶数の長さ（例えば、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２２または２４ヌクレオチド）のパリンドロームまたは反復核酸配列を含み、Ｘは、例えば約１から２１ヌクレオチドの間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を示し、Ｘ’は、Ｘかその一部に相補的なヌクレオチド配列を持つ約１から２１ヌクレオチドの間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、ｐは、末端リン酸基を含むがこれは存在していても存在しなくてもよく、式中の配列ＸおよびＺは、標的核酸配列またはその一部に相補的な核酸配列を単独または同時に含み、その長さは標的核酸配列またはその一部（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）と相互作用するのに十分な長さ（例えば、塩基対）であり、例えば、Ｘは配列Ｘやその一部に相補的な、約１２から約２１以上（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上）の長さのヌクレオチドを単独で標的ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡやその一部に含むことができる。限定を目的としない他の例では、ＸおよびＺのヌクレオチド配列の長さは共に、標的ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡやその一部に相補的なＸが存在している場合には、約１２から２１、もしくはそれ以上（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上）のヌクレオチドである。さらに、限定を目的としない他の例では、Ｘが存在しない場合、標的ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡやその一部に相補的なＺのヌクレオチド配列の長さは約１２から約２４、もしくはそれ以上（例えば、約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、またはそれ以上）のヌクレオチドである。さらに別の限定を目的としない例では、Ｘが存在している場合、標的ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡまたはその一部と相補的なＺのヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２４もしくはそれ以上のヌクレオチド（例、約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、またはそれ以上）である。１つの態様においては、Ｘ、Ｚ、およびＸ’は、Ｘおよび／またはＺは、標的ＲＮＡやその一部のヌクレオチド配列と相互作用するのに十分な長さ（例えば、塩基対）のヌクレオチド配列を含んでいるオリゴヌクレオチドである（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸの長さは同一ではない。別の態様では、オリゴヌクレオチドＸおよびＺ、またはＺおよびＸ’、またはＸ、ＺおよびＸ’の長さは同一あるいは相違のいずれかである。
１つの態様においては、本発明は、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）：
Figure 2007505605
 を有する二重鎖ヌクレオチド構造を特徴をとし、
式中、Ｚは１か所以上の修飾されたヌクレオチド（２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリン、またはユニバーサル塩基といった修飾された塩基を含むヌクレオチド）を含んだ、例えば約２から２４ヌクレオチドの偶数の長さ（例えば、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２２または２４ヌクレオチド）のパリンドロームまたは反復配列様の核酸配列を含み、Ｘは、例えば約１から２１ヌクレオチドの間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を示し、Ｘ’は、Ｘかその一部に相補的なヌクレオチド配列を持つ約１から２１ヌクレオチドの間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、ｐは、末端リン酸基を含むがこれは存在していても存在しなくてもよく、式中の配列ＸおよびＺは、標的核酸配列またはその一部に相補的な核酸配列をそれぞれ単独で含み（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）、その長さは標的核酸配列またはその一部と相互作用するのに十分な長さである例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）。例えば、配列Ｘは標的ＲＮＡやその一部に相補的な、約１２から約２１以上（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上）の長さのヌクレオチドを単独で含むことができる（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）。限定を目的としない他の例では、ＸおよびＺのヌクレオチド配列の長さは共に、（Ｘが存在している場合）標的ＲＮＡやその一部に相補的な、約１２から２１、もしくはそれ以上（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上）のヌクレオチドである（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）。さらに、限定を目的としない他の例では、Ｘが存在しない場合、標的ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡやその一部に相補的なＺのヌクレオチド配列の長さは約１２から約２４、もしくはそれ以上（例えば、約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、またはそれ以上）のヌクレオチドである。１つの態様においては、Ｘ、Ｚ、およびＸ’は、Ｘおよび／またはＺは、標的ＲＮＡやその一部のヌクレオチド配列と相互作用するのに十分な長さ（例えば、塩基対）のヌクレオチド配列を含んでいるオリゴヌクレオチドである（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。別の態様では、オリゴヌクレオチド、ＸおよびＺ、またはＺおよびＸ’、またはＸ、ＺおよびＸ’の長さは同一か相違のどちらかである。１つの態様においては、化学式Ｉ（ａ）の二重鎖オリゴヌクレオチドの構造は、１つ以上、具体的には１、２、３、もしくは４のミスマッチを含み、このようなミスマッチの範囲が標的遺伝子の発現を抑制する二重鎖オリゴヌクレオチドの効力を減少させることはない。
１つの態様においては、本発明のＤＦＯ分子は化学式ＤＦＯ−ＩＩ：
Figure 2007505605
 の構造を有し、
式中、ＸおよびＸ’は約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドをそれぞれ独立に含み、式中のＸは例えば約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さ（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを含み、Ｘ’は配列Ｘまたはその一部に相補的なヌクレオチド配列を有する例えば約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さ（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを含み、ｐは、末端リン酸基を含むがこれは存在していても存在していなくてもよく、式中のＸは標的核酸配列（例えば、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）もしくはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、その長さは標的核酸配列またはその一部と相互作用（例えば塩基対）するのに十分な長さである。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の態様では、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。１つの態様では、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは、比較的安定な二重鎖オリゴヌクレオチドを形成するのに十分な長さである。
１つの態様においては、本発明は化学式ＤＦＯ−ＩＩ（ａ）：
Figure 2007505605
 を有する二重鎖オリゴヌクレオチド構造を特徴とし、
式中、ＸおよびＸ’は約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドをそれぞれ独立に含み、式中のＸは例えば約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さ（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを含み、Ｘ’は配列Ｘまたはその一部に相補的なヌクレオチド配列を有する例えば約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さ（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを含み、ｐは、末端リン酸基を含むがこれは存在していても存在していなくてもよく、式中のＸは標的核酸配列もしくはその一部（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）に相補的なヌクレオチド配列を含み、その長さは標的核酸配列またはその一部（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）と相互作用するのに十分な長さ（例えば塩基対）である。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の態様では、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。１つの態様では、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは、比較的安定な二重鎖オリゴヌクレオチドを形成するのに十分な長さである。１つの態様においては、化学式ＩＩ（ａ）の二重鎖オリゴヌクレオチドの構造は、１つ以上、具体的には１、２、３、もしくは４のミスマッチを含み、このようなミスマッチの範囲が標的遺伝子の発現を抑制する二重鎖オリゴヌクレオチドの効力を減少させることはない。
１つの態様においては、本発明は化学式ＤＦＯ−Ｉ（ｂ）：
Figure 2007505605
 を有するのＤＦＯ分子を特徴とし、
式中、Ｚは、１か所かそれ以上の他のヌクレオチドと塩基対形成を容易にすることができる非標準の、もしくは修飾されたヌクレオチド（例、２−アミノプリンまたはユニバーサル塩基といった修飾された塩基を含むヌクレオチド）を含んでいてもよい、パリンドロームもしくは反復核酸配列を含む。Ｚは、標的核酸（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）分子のヌクレオチド配列と相互作用（例えば塩基対）するのに十分な長さ、望ましくは少なくとも１２ヌクレオチドの長さで、具体的には約１２から約２４ヌクレオチド（例えば約１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４ヌクレオチド）であることができる。ｐは末端リン酸基を表し、これは存在していても存在していなくてもよい。
１つの態様においては、化学式ＤＦＯ−Ｉ、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）、ＤＦＯ−Ｉ（ｂ）、ＤＦＯ−ＩＩ（ａ）またはＤＦＯ−ＩＩのいずれかを含むＤＦＯ分子は、本明細書で述べられた、しかしこれに限定されない、例えば化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを含むヌクレオチドや、表ＩＶに述べられた安定化反応、もしくは本明細書で述べられた様々な態様のような他の修飾ヌクレオチドや非ヌクレオチドとのいずれかの組み合わせの化学修飾を含む。
１つの態様では、化学式ＤＦＯ−Ｉ、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）およびＤＦＯ−Ｉ（ｂ）を有するＤＦＯ構造のＺのパリンドロームまたは反復配列または修飾されたヌクレオチド（２−アミノプリンまたはユニバーサル塩基といった修飾された塩基を含むヌクレオチド）は、標的核酸配列の一部分と相互作用できる化学修飾されたヌクレオチド（例えば、ワトソン−クリック塩基対または非ワトソン−クリック塩基を形成することができる、修飾された塩基アナログ）を含む。
１つの態様においては、例えば化学式ＤＦＯ−ＩまたはＤＦＯ−ＩＩを有するＤＦＯといった本発明のＤＦＯ分子は、約１５から約４０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド）を含む。１つの態様においては、本発明のＤＦＯ分子は１つ以上の化学修飾を含む。限定を目的としない例において、化学修飾されたヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドの本発明の核酸への導入は、外因的に供給された修飾されていないＲＮＡ分子特有のインビボでの安定性と生物学的利用能の潜在的な限界を乗り越える強力なツールを提供する。例えば、化学修飾された核酸は血清中または細胞内または組織内でより長い半減期を持つ傾向にあるため、化学修飾された核酸分子の利用は特定の核酸分子の用量をより少なくすることができる。さらに、特定の化学修飾は、半減期を改善するだけでなく核酸分子の特定の器官や細胞、組織へのターゲティングを容易にし、および／または核酸分子の細胞への取込みを改善することによって、生物学的利用能および／または核酸分子の作用強度を向上させる。従って、化学修飾された核酸分子の活性が、インビトロで野生型の／修飾されていない核酸分子との比較で、例えば修飾されていないＲＮＡと比較した場合に活性が減少したとしても、安定性と作用強度、効果持続期間、生物学的利用能、および／または分子の供給が改善されるために、修飾された核酸分子の全体的な活性は野生型または修飾されていない核酸分子より高い可能性がある。
本発明の多機能または多標的のｓｉＮＡ分子
１つの態様では、本発明は、細胞や組織、または生物体といった生体系のなかで、１つかそれ以上の遺伝子の発現を調節する多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子を含むことを特徴とする。本発明の多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的核酸配列の２以上の領域を標的とすることができ、もしくは２以上の別々の標的核酸分子の配列を標的とすることができる（例えば、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的）。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、化学的に合成するか、転写単位および／またはベクターから発現することができる。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、治療、診断、農業、畜産、標的の確認、ゲノム上の発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクス上の応用へとヒトへの様々な応用のための有用な試薬や方法を提供する。
本明細書においては便宜上、多機能低分子干渉核酸分子または多機能ｓｉＮＡ分子と呼ぶが、これに限定されない特定のオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の配列特異的な調節の有力なメディエーターであることを、出願人は本明細書で示す。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ構造のそれぞれの鎖が、１つ以上の標的核酸分子の異なる核酸配列に相補的な核酸配列を含むようにデザインされている点で、当該分野で知られている他の核酸配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）とは異なる。本発明の単一の多機能ｓｉＮＡ分子（概して二重鎖分子）は、従って２以上（例えば２、３、４、５、もしくはそれ以上）の異なる標的核酸、標的分子を標的とすることができる。本発明の核酸分子は、同じ標的核酸配列の２以上（例えば、２、３、４、５、もしくはそれ以上）の領域を標的とすることもできる。このような本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、１つ以上の標的核酸分子発現の下方制御や抑制に有用である。例えば、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、サイトカインおよびその対応する受容体（例、本明細書に記載のＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体）をコード化する核酸分子を標的とすることができる。１つの多機能ｓｉＮＡ構造で２以上の標的核酸分子の発現を低減または抑制することによって、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、ある疾患に関連した経路のうちの複数の標的の同時抑制を提供することができる一群の有効な治療薬となる。このような同時抑制は、個々の前臨床および臨床開発努力もしくは複雑な規制認可手続きの必要なしに、相乗的な治療上の処置戦略を提供することができる。
標的核酸分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）の１つ以上の領域を標的とする多機能ｓｉＮＡ分子の利用は、遺伝子発現の有効な抑制を提供すると期待される。例えば、本発明の単一の多機能ｓｉＮＡ構造は、標的核酸分子（例、ＶＥＧＦおよび／またはＥＧＦＲ ＲＮＡ）の保存された領域と可変領域の双方を標的とすることができ、それによって単一遺伝子によってコード化された異種スプライスバリアントの下方制御や抑制を可能にし、もしくは標的核酸分子のコード領域および非コード領域双方のターゲティングを可能にする。
概して、二重鎖のオリゴヌクレオチドは、１つの鎖のオリゴヌクレオチド配列が２つ目の鎖のオリゴヌクレオチド配列と相補的である２つの異なるオリゴヌクレオチド配列の集合によって形成され、そのような二重鎖オリゴヌクレオチドは概して２つの分離したオリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）が集合することによって形成される。代わりに、二重鎖はそれ自身が折り畳まる単一分子（例えば、ｓｈＲＮＡ、または短鎖ヘアピンＲＮＡ）から形成されることもできる。これらの二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を媒介し、二重鎖オリゴヌクレオチドのたった１か所のヌクレオチド配列領域（ガイド配列、もしくはアンチセンス配列）が標的核酸配列（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）に相補的であり、もう一方の鎖（センス配列）は標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいるという、いずれにも共通の特徴を持つということが当該分野で知られている。概して、アンチセンス配列は活性型のＲＩＳＣ複合体に保持され、配列特異的ＲＮＡ干渉の媒介のためにアンチセンス配列と標的配列の相補的な塩基対形成を用いて、ＲＩＳＣを標的ヌクレオチド配列へ導く。ある培養細胞系では、ある種の非修飾ｓｉＲＮＡは「オフターゲット」効果を示すということが当該分野で知られている。このオフターゲット効果は、ＲＩＳＣ複合体中のｓｉＲＮＡのアンチセンス配列の代わりのセンス配列の関与に関係しているとの仮説が設けられている（例えば、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）等、２００３年、セル誌（Ｃｅｌｌ）、１１５、１９９−２０８を参照）。この例では、センス配列はＲＩＳＣ複合体を、本来の標的配列とは異なる配列（オフターゲット配列）へと導き、その結果オフターゲット配列の抑制が起ると考えられている。これらの二重鎖核酸分子では、それぞれの鎖は異なる標的核酸配列に相補的である。但し、これらのｄｓＲＮＡによって影響されるオフターゲットは完全には予測することができず、非特異的である。
当該分野で知られる二重鎖核酸分子とは異なり、出願人は、単一の多機能ｓｉＮＡ構造を用いて２以上の標的核酸配列の発現を下方制御もしくは抑制する新規の、潜在的な費用効率が高い、簡便な方法を開発した。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、二重鎖または部分的に二重鎖になるようデザインされ、そのようなそれぞれの鎖の一部分、もしくは多機能ｓｉＮＡの領域は、選んだ標的核酸配列に相補的である。このように本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は互いに相補的な標的配列に限定されず、むしろあらゆる２つの異なる標的核酸配列である。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、それぞれの鎖もしくは多機能ｓｉＮＡ分子の領域が標的核酸配列に相補的であり、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに適切な長さ（例えば、約１６から約２８ヌクレオチドの長さで、約１８から約２８ヌクレオチドの長さであると望ましい）であるようにデザインされている。標的核酸配列と、多機能ｓｉＮＡの鎖もしくは領域の間の相補性は、ＲＡＮ干渉による標的核酸配列の切断に十分（少なくとも約８塩基対）でなければならない。本発明の多機能ｓｉＮＡは、前述のシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）等が述べたような、あるｓｉＲＮＡ配列に見られるオフターゲット効果を最低限にすると期待される。
２９塩基対と３６塩基対の間の長さのｄｓＲＮＡ（トゥーシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許０２／４４３２１）はＲＮＡｉを媒介しないということが報告されてきた。これらｄｓＲＮＡは非活性型である１つの理由は、ＲＩＳＣ複合体が効果的多コピーの標的ＲＮＡと相互作用できないように標的ＲＮＡ配列と相互作用し、その結果、効力とＲＮＡｉ過程の効率の著しい低下を招いている、鎖の代謝回転もしくは解離の欠如かもしれない。出願人は意外にも、本発明の多機能ｓｉＮＡはこの障害を乗り越え、ＲＮＡｉ過程の効率と効力を向上させることができる点を見いだした。上述のような本発明の態様においては、約２９から約３６塩基対の間の長さの多機能ｓｉＮＡは、多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖の一部がＲＮＡｉを効果的に媒介するに十分な長さ（例えば約１５から約２３塩基）の標的核酸に相補的であるヌクレオチド配列領域と、標的核酸に相補的でないヌクレオチド配列領域を含むようにデザインすることができる。相補的な部分と非相補的な部分両方を多機能ｓｉＮＡのそれぞれの鎖に持つことによって、多機能ｓｉＮＡは、阻害的な代謝回転もしくは解離（それぞれの鎖の長さがそれぞれの標的核酸配列に対するＲＮＡｉを媒介するには長すぎる場合）なしに標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介することができる。更に、本発明の内部重複配列を有する多機能ｓｉＮＡ分子のデザインは、多機能ｓｉＮＡ分子を、ＲＮＡ干渉のために好ましい（少ない）サイズにすることや、治療薬（例えば、それぞれの鎖が独立的に約１８から約２８ヌクレオチドの長さの場合）として利用するのに適切なサイズにすることができる。限定を目的としない例を、添付の図１６−２１、および４２にて説明する。
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は第一の領域と第二の領域を含み、多機能ｓｉＮＡの第一の領域は第一の標的核酸分子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、多機能ｓｉＮＡの第二の領域は第二の標的核酸分子の核酸配列に相補的な核酸配列を含む。１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は第一の領域と第二の領域を含み、多機能ｓｉＮＡの第一の領域は第一の標的核酸分子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、多機能ｓｉＮＡの第二の領域は第二の標的核酸分子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては、多機能ｓｉＮＡの第一の領域と第二の領域は、相補性をある程度共有する別々の核酸配列を含む場合がある（例えば、約１から１０の相補ヌクレオチド）。ある態様においては、多機能ｓｉＮＡ構造は、当該分野で知られている方法と試薬によって容易に合成後に結合される、別々の核酸配列を含む場合がある。代わりに、多機能ｓｉＮＡの第一の領域と第二の領域は、ヘアピンもしくはステムループ構造にあるような、ある程度の自己相補性をもつ単一の核酸配列を含む場合がある。そのような二重鎖およびヘアピン様の多機能低分子干渉核酸の、限定を目的としない例を図１６および１７にてそれぞれ説明する。これらの多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は、特定の重複ヌクレオチド配列を含む場合があり、そのような重複ヌクレオチド配列は多機能ｓｉＮＡの第一の領域と第二の領域の間に存在する（図１８および１９の例を参照）。
１つの態様においては、本発明は多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、多機能ｓｉＮＡ分子においては多機能ｓｉＮＡのそれぞれの鎖は独立に、異なる標的核酸配列に相補的な核酸配列の第一の領域と、標的配列に相補的でない第二のヌクレオチド配列を含む。それぞれの鎖の標的核酸配列は、同一の標的核酸分子、または異なる標的核酸分子にある。
１つの態様においては、多機能ｓｉＮＡは２つの鎖を含み、ここで（ａ）第一の鎖は標的核酸配列に相補的な配列を持つ領域（相補領域１）と標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を持たない領域（非相補領域１）を含み、（ｂ）第一の鎖のヌクレオチド配列に相補的な標的ヌクレオチド配列とは異なる標的核酸配列に相補的な配列を持つ領域（相補領域２）と、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を持たない領域（非相補領域２）を含み、（ｃ）第一の鎖の相補領域１は、２本目の鎖の非相補領域２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列と、１本目の鎖の非相補領域１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む２本目の鎖の相補領域２を含む。相補領域１および相補領域２の標的核酸配列は、同一の標的核酸分子、または異なる標的核酸分子の中にある。
別の態様においては、多機能ｓｉＮＡは２つの鎖を含み、ここで（ａ）第一の鎖は、遺伝子（例えば、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子）に由来する標的核酸配列に相補的な配列を持つ領域（相補領域１）と標的ヌクレオチド配列に相補配列を持たない領域（非相補領域１）を含み、（ｂ）多機能ｓｉＮＡの２本目の鎖は、相補領域１の遺伝子とは異なる遺伝子由来の標的核酸配列に相補的な配列を有する領域（相補領域２）と、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を持たない領域（非相補領域２）を含み、（ｃ）第一の鎖の相補領域１は、２本目の鎖の非相補領域２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列と、１本目の鎖の非相補領域１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む２本目の鎖の相補領域２を含む。
別の１つの態様においては、多機能ｓｉＮＡは２つの鎖を含み、ここで（ａ）第一の鎖は、遺伝子（例えば、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子）に由来する標的核酸配列に相補的な配列を持つ領域（相補領域１）と相補領域１の標的ヌクレオチド配列に相補配列を持たない領域（非相補領域１）を含み、（ｂ）多機能ｓｉＮＡの２本目の鎖は、相補領域１の核酸配列とは異なる遺伝子由来の標的核酸配列に相補的な配列を有する領域（相補領域２）を含むが、もし相補領域１の標的核酸配列および相補領域２の標的核酸配列の双方が同じ遺伝子に由来する場合には、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を持たない領域（非相補領域２）を含み、（ｃ）第一の鎖の相補領域１は、２本目の鎖の非相補領域２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列と、１本目の鎖の非相補領域１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む２本目の鎖の相補領域２を含む。
１つの態様においては、本発明は、多機能ｓｉＮＡが、第一の配列が標的核酸分子中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一の領域を含んだ配列と、第二の配列が同一標的核酸分子中の別々のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一領域を含んだ配列の、２つの相補核酸配列を含む、多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子であることを特徴とする。第一の配列の第一領域は、第二配列の第二領域のヌクレオチド配列に相補的でもあり、第二の配列の第一領域は第一の配列の第二領域のヌクレオチド配列に相補的であることが望ましい
１つの態様においては、本発明は、多機能ｓｉＮＡが、第一の配列が第一の標的核酸分子中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一の領域を含んだ配列と、第二の配列が第二の標的核酸分子中の別々のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一領域を含んだ配列の、２つの相補核酸配列を含む、多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子であることを特徴とする。第一の配列の第一領域は、第二配列の第二領域のヌクレオチド配列に相補的でもあり、第二の配列の第一領域は第一の配列の第二領域のヌクレオチド配列に相補的であることが望ましい。
１つの態様では、本発明は、第一領域および第二領域を含み、その第一領域は第一の標的核酸分子中の核酸配列に相補的な約１８から約２８ヌクレオチドの間の核酸配列を含み、第二領域は別の第二の標的核酸分子中の核酸配列に相補的な約１８から約２８ヌクレオチドの間の核酸配列を含む、多機能ｓｉＮＡ分子であることを特徴とする。
１つの態様では、本発明は、第一領域および第二領域を含み、その第一領域は標的核酸分子中の核酸配列に相補的な約１８から約２８ヌクレオチドの間の核酸配列を含み、第二領域は別の同一標的核酸分子中の核酸配列に相補的な約１８から約２８ヌクレオチドの間の核酸配列を含む、多機能ｓｉＮＡ分子であることを特徴とする。
１つの態様においては、本発明は、多機能ｓｉＮＡの１本の鎖が第一の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一領域を含み、２本目の鎖が第二の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一領域を含む、二重鎖の多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子であることを特徴とする。第一および第二の標的核酸配列は同一標的核酸分子に存在してもよく、もしくは同一の標的核酸分子中の異なる領域であってもよい。上述のような本発明のｓｉＮＡ分子は異なる遺伝子の発現、同一遺伝子のスプライスバリアント、１つ以上の遺伝子転写物の変異領域と保存領域の両方、または同一遺伝子あるいは異なる遺伝子もしくは遺伝子転写物のコード配列と非コード配列の両方を標的として利用することができる。
１つの態様においては、本発明の標的核酸分子は、単一のタンパク質をコード化する。別の態様においては、標的核酸分子は１つ以上のタンパク質（例えば１、２、３、４、５もしくはそれ以上のタンパク質）をコード化する。上述のような本発明の多機能ｓｉＮＡ構造はいくつかのタンパク質の発現を下方制御もしくは抑制するのに利用することができる。例えば、多機能ｓｉＮＡ分子は、一本の鎖に１つのタンパク質をコード化する遺伝子（例えば、血管内皮成長因子またはＶＥＧＦといったサイトカイン）に由来する第一の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、第二の鎖は二つのタンパク質をコード化する遺伝子（ＶＥＧＦといった単一サイトカインに対するＶＥＧＦ受容体１およびＶＥＧＦ受容体２等の２つの異なる受容体）に由来する標的核酸分子中に存在する第二の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する領域を含み、特定の生物学的経路を、例えばサイトカインおよびその受容体、またはリガンドおよびその受容体を標的にすることによって、下方制御、抑制もしくは遮断するのに利用することができる。
１つの態様においては、本発明は、サイトカインまたはリガンドの異なるアイソフォームおよび前記サイトカインまたはリガンドの受容体に存在する、保存されたヌクレオチド配列を活用している。一方の鎖がサイトカインの様々なアイソフォームの間で保存されている標的核酸配列に相補的な配列を含み、もう一方の鎖が前記サイトカインの受容体の間で保存されている標的核酸配列に相補的な配列を含むという具合に多機能ｓｉＮＡをデザインすることによって、単一の多機能ｓｉＮＡを用いて、選択的また効果的に生物学的経路もしくはその経路にある複数の遺伝子を調節または抑制することができる。
別の限定を目的としない例において、２つのタンパク質（例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、および／またはＶＥＧＦ−Ｄ）のいずれかを含むＶＥＧＦといったサイトカインの２つのアイソフォーム）コード化する標的核酸分子に存在する第一の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一方の鎖、および２つの追加タンパク質（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３といったサイトカインの２つの異なる受容体）をコード化する標的ヌクレオチド分子に存在する第二の標的核酸配列に相補的な相補的なヌクレオチド配列を持つ領域を含む第二の鎖に領域を含む多機能ｓｉＮＡ分子を使用して、サイトカインの異なるアイソフォームおよびそのようなサイトカインの受容体を標的とすることにより、特定の生物学的経路を下方制御、抑制、または遮断することができる。
１つの態様においては、本発明の多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は各鎖に領域を含み、第一の鎖にある領域はサイトカインに相補的なヌクレオチド配列を含み、第二の鎖にある領域は前記サイトカインの対応する受容体に相補的なヌクレオチド配列を含む。サイトカインの限定を目的としない例は、血管内皮成長因子（例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ）を含み、サイトカイン受容体の限定を目的としない例は、ＶＥＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３を含む。
１つの態様においては、本発明の二重鎖多機能ｓｉＮＡ分子は化学式ＭＦ−Ｉ：
Figure 2007505605
 の構造を含み、式中、５’−ｐ−ＸＺＸ’−３’および５’−ｐ−ＹＺＹ’−３’はそれぞれ、独立に約２０ヌクレオチドと約３００ヌクレオチド、望ましくは約２０と約２００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチドと約１００ヌクレオチド、約２０と約４０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチドと約４０ヌクレオチド、約２４と約３８ヌクレオチド、もしくは約２６と約３８ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドであり、ＸＺは第一の標的核酸配列に相補的な核酸配列を含み、ＹＺは第二の標的核酸配列に相補的な核酸配列を含み、Ｚは自己相補的な約１から２４ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、ＸはＹ’内に存在するヌクレオチド配列に相補的な約１から約１００ヌクレオチド、望ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、ＹはＸ’内に存在するヌクレオチド配列に相補的な約１から約１００ヌクレオチド、望ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、それぞれのｐは、独立に存在しているか欠損しているそれぞれ末端リン酸基を含み、ＸＺおよびＹＺはそれぞれ、独立に第一および第二の標的核酸配列もしくはその一部と安定に相互作用（すなわち塩基対）するのにそれぞれ十分な長さがある。例えば、ＸおよびＹはそれぞれ、標的ＲＮＡもしくはその一部のような、異なる標的核酸分子中の標的ヌクレオチド配列に相補的な、約１２から２１もしくはそれ以上の長さのヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくはそれ以上）の配列を独立に含む。限定を目的としない別の態様においては、第一の標的核酸配列もしくはその一部に相補的なＸおよびＺを合わせたヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１ヌクレオチドもしくはそれ以上（約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくはそれ以上）である。限定を目的としない別の態様においては、第二の標的核酸配列もしくはその一部に相補的なＹおよびＺを合わせたのヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１ヌクレオチドもしくはそれ以上（約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくはそれ以上）である。１つの態様においては、第一の標的核酸配列および第二の標的核酸配列は、同一標的核酸分子中に存在する（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）。別の態様においては、第一の標的核酸配列および第二の標的核酸配列は、別の標的核酸分子中に存在する（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）。１つの態様においては、Ｚはパリンドロームもしくは反復配列を含む。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ’の長さは同一である。別の態様においては、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ’の長さは同一ではない。１つの態様においては、化学式Ｉ（ａ）の二重鎖オリゴヌクレオチド構造は、標的遺伝子の発現を抑制する二重鎖オリゴヌクレオチドの効力を著しく損なわない程度で、１つ以上の、具体的には１、２、３、もしくは４つのミスマッチを含む。
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は化学式ＭＦ−ＩＩ：
Figure 2007505605
 の構造を含み、式中、５’−ｐ−ＸＸ’−３’および５’−ｐ−ＹＹ’−３’はそれぞれ、独立に約２０ヌクレオチドと約３００ヌクレオチド、望ましくは約２０と約２００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチドと約１００ヌクレオチド、約２０と約４０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチドと約４０ヌクレオチド、約２４と約３８ヌクレオチド、もしくは約２６と約３８ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドであり、Ｘは第一の標的核酸配列に相補的な核酸配列を含み、Ｙは第二の標的核酸配列に相補的な核酸配列を含み、ＸはＹ’内に存在するヌクレオチド配列に相補的な約１から約１００ヌクレオチド、望ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、ＹはＸ’内に存在するヌクレオチド配列に相補的な約１から約１００ヌクレオチド、望ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、それぞれのｐは、独立に存在していたり欠損しているそれぞれ末端リン酸基を含み、ＸおよびＹはそれぞれ、独立に第一および第二の標的核酸配列もしくはその一部と安定に相互作用（すなわち塩基対）するのにそれぞれ十分な長さがある。例えば、ＸおよびＹはそれぞれ、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的ＲＮＡもしくはその一部のような、異なる標的核酸分子中の標的ヌクレオチド配列に相補的な、約１２から２１もしくはそれ以上の長さのヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくはそれ以上）の配列を独立に含む。別の態様においては、第一の標的核酸配列および第二の標的核酸配列は、同一標的核酸分子中に存在する（例、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）。別の態様においては、第一の標的核酸配列および第二の標的核酸配列は、別の標的核酸分子中に存在する（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）。１つの態様においては、Ｚはパリンドロームもしくは反復配列を含む。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一である。別の態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ’の長さは同一ではない。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ’の長さは同一である。別の態様においては、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ’の長さは同一ではない。１つの態様においては、化学式Ｉ（ａ）の二重鎖オリゴヌクレオチド構造は、標的遺伝子の発現を抑制する二重鎖オリゴヌクレオチドの効力を著しく損なわない程度で、１つ以上の、具体的には１、２、３、もしくは４つのミスマッチを含む。
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は化学式ＭＦ−ＩＩＩ：
Figure 2007505605
 の構造を含み、式中、Ｘ、Ｘ’、ＹおよびＹ’は、独立に、約１５ヌクレオチドと約５０ヌクレオチド、望ましくは約１８から約４０ヌクレオチド、もしくは約１９および約２３ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、ＸはＹ’領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｘ’はＹ領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、ＸとＸ’はそれぞれ、独立にそれぞれ第一および第二の標的核酸配列、もしくはその一部と安定な相互作用（すなわち塩基対）するのに十分な長さであり、Ｗは、Ｙ’配列とＹ配列を結合するヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーを指し、多機能ｓｉＮＡはＲＮＡ干渉による第一と第二の標的配列の切断を指示する。１つの態様においては、第一標的核酸配列および第二標的核酸配列は、同一標的核酸分子中に存在する（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）。別の態様においては、第一標的核酸配列および第二標的核酸配列は、別の標的核酸分子中に存在する（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の３’端をＹ配列の３’端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の３’端をＹ配列の５’端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の５’端をＹ配列の５’端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の５’端をＹ配列の３’端と結合する。１つの態様においては、末端リン酸基はＸ配列の５’端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ配列の５’端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ’配列の５’端に存在する。１つの態様においては、ＷはＹ配列とＹ’配列を、生分解性リンカーを介して結合する。１つの態様においては、Ｗはコンジュゲート、ラベル、アプタマー、リガンド、脂質、もしくはポリマーをさらに含む。
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は化学式ＭＦ−ＩＶ：
Figure 2007505605
 の構造を含み、式中、Ｘ、Ｘ’、ＹおよびＹ’は、独立に、約１５ヌクレオチドと約５０ヌクレオチド、望ましくは約１８から約４０ヌクレオチド、もしくは約１９および約２３ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、ＸはＹ’領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｘ’はＹ領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、ＹとＹ’はそれぞれ、独立にそれぞれ第一および第二の標的核酸配列、もしくはその一部と安定な相互作用（すなわち塩基対）するのに十分な長さであり、Ｗは、Ｙ’配列とＹ配列を結合するヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーを指し、多機能ｓｉＮＡはＲＮＡ干渉による第一と第二の標的配列の切断を指示する。１つの態様においては、第一標的核酸配列および第二標的核酸配列は、同一標的核酸分子中に存在する（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）。別の態様においては、第一標的核酸配列および第二標的核酸配列は、別の標的核酸分子中に存在する（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の３’端をＹ配列の３’端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の３’端をＹ配列の５’端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の５’端をＹ配列の５’端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の５’端をＹ配列の３’端と結合する。１つの態様においては、末端リン酸基はＸ配列の５’端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＸ’配列の５’端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ配列の５’端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ’配列の５’端に存在する。１つの態様においては、ＷはＹ配列とＹ’配列を、生分解性リンカーを介して結合する。１つの態様においては、Ｗはコンジュゲート、ラベル、アプタマー、リガンド、脂質、もしくはポリマーをさらに含む。
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は化学式ＭＦ−Ｖ：
Figure 2007505605
 の構造を含み、式中、Ｘ、Ｘ’、ＹおよびＹ’は、独立に、約１５ヌクレオチドと約５０ヌクレオチド、のぞましくは約１８から約４０ヌクレオチド、もしくは約１９および約２３ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、ＸはＹ’領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｘ’はＹ領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｘ、Ｘ’、ＹまたはＹ’はそれぞれ、独立にそれぞれ第一、第二、第三、または第四の標的核酸配列、もしくはその一部と安定な相互作用（すなわち塩基対）するのに十分な長さであり、Ｗは、Ｙ’配列とＹ配列を結合するヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーを指し、多機能ｓｉＮＡはＲＮＡ干渉による第一、第二、第三および／または第四の標的配列の切断を指示する。１つの態様においては、第一、第二、第三および第四の標的核酸配列はすべて、同一標的核酸分子中に存在する（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）。別の態様においては、第一、第二、第三および第四の標的核酸配列はそれぞれ、別の標的核酸分子中に存在する（例、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ）。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の３’端をＹ配列の３’端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の３’端をＹ配列の５’端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の５’端をＹ配列の５’端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ’配列の５’端をＹ配列の３’端と結合する。１つの態様においては、末端リン酸基はＸ配列の５’端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＸ’配列の５’端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ配列の５’端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ’配列の５’端に存在する。１つの態様においては、ＷはＹ配列とＹ’配列を、生分解性リンカーを介して結合する。１つの態様においては、Ｗはコンジュゲート、ラベル、アプタマー、リガンド、脂質、もしくはポリマーをさらに含む。
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の（例えば、化学式ＭＦ−Ｉ〜ＭＦ−Ｖを有する）Ｘ領域とＹ領域は、同一標的核酸分子の一部分である別の標的核酸配列に相補的である。１つの態様においては、前述の標的核酸配列は、ＲＮＡ転写物のコード領域内の異なる位置にある。１つの態様においては、前述の標的核酸配列は同一ＲＮＡ転写物のコード領域と非コード領域を含む。１つの態様においては、前述の標的核酸配列は選択的スプライシングを受けた転写物の領域、もしくはそのような選択的スプライシングを受けた転写物の前駆体の領域を含む。
１つの態様においては、化学式ＭＦ−Ｉ〜ＭＦ−Ｖのいずれかを有する多機能ｓｉＮＡ分子は、本明細書で限定を目的とせずに述べられるように、例えば、本明細書で述べられたような化学式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド、表ＩＶで述べられるような安定化反応、もしくは本明細書の様々な態様で述べられたような修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドのその他の組み合わせのような化学修飾を含むことができる。
１つの態様においては、多機能ｓｉＮＡ構造のＺ中のパリンドロームもしくは反復配列もしくは修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリンやユニバーサル塩基のような修飾塩基をもつヌクレオチド）は、標的核酸配列（例えば、ワトソンクリック塩基対もしくは非ワトソンクリック塩基対を形成することができる修飾塩基アナログ）の一部と相互作用することができる化学修飾ヌクレオチドを含む化学式ＭＦ−ＩまたはＭＦ−ＩＩを有する。
１つの態様においては、例えば多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖に化学式ＭＦ−Ｉ〜ＭＦ−Ｖを有する本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、単独で約１５から約４０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド）を含む。１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は１つ以上の化学修飾を含む。限定を目的としない例において、化学修飾されたヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドの本発明の核酸への導入は、外因的に供給された修飾されていないＲＮＡ分子特有のインビボでの安定性と生物学的利用能の潜在的な限界を乗り越える強力なツールを提供する。例えば、化学修飾された核酸は血清中または細胞内または組織内でより長い半減期を持つ傾向にあるため、化学修飾された核酸分子の利用は特定の核酸分子の用量をより少なくすることができる。更に、特定の化学修飾は、半減期を改善するだけでなく核酸分子の特定の器官や細胞、組織へのターゲティングを容易にし、および／または核酸分子の細胞への取込みを改善することによって、生物学的利用能および／または核酸分子の作用強度を向上させる。従って、化学修飾された核酸分子の活性が、インビトロで野生型の／修飾されていない核酸分子との比較で、例えば修飾されていないＲＮＡと比較した場合に活性が減少したとしても、安定性と作用強度、効果持続期間、生物学的利用能、および／または分子の供給が改善されるために、修飾された核酸分子の全体的な活性は野生型または修飾されていない核酸分子より高い可能性がある。
また別の態様においては、本発明は、２つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖が、互いに一方の端でつなぎ止められた対応するセンス鎖にアニールされるように、それぞれのセンス鎖の一方の端がもう一方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖端とつなぎ止められている、２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする（図４３参照）。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
１つの態様においては、本発明は、２つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５’端が互いに逆を指して（反対方向で）互いに一方の端でつなぎ止められた（図４３（Ａ）参照）対応するセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のセンス鎖の５’端に他のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’端がつなぎ止められている２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
１つの態様においては、本発明は、２つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５’端が互いに向き合って互いに一方の端でつなぎ止められた（図４３（Ｂ）参照）対応するセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のセンス鎖の３’端に他のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’端がつなぎ止められている２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
１つの態様においては、本発明は、一方のアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５’端が他方のアンチセンス鎖の３’端に向き合うよう互いに一方の端でつなぎ止められた（図４３（Ｃ−Ｄ）参照）対応するセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のセンス鎖の３’端に他のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’端がつなぎ止められている２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
１つの態様においては、本発明は、一方のセンスｓｉＮＡ鎖の５’端が他方のアンチセンス鎖の３’端に向き合うよう互いに一方の端でつなぎ止められた（図４３（Ｇ−Ｈ）参照）対応するアンチセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖の３’端に他のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’端がつなぎ止められている２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。１つの態様においては、第一のアンチセンス鎖の５’端と第二のアンチセンス鎖の３’端の間の結合は、多機能ｓｉＮＡのそれぞれのアンチセンス鎖の５’端が標的ＲＮＡのＲＮＡ干渉による切断を媒介するのに適した遊離の５’端を持つよう、容易に切断されるような方法（例えば、生分解性リンカー）でデザインされている。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
１つの態様においては、本発明は、一方のセンスｓｉＮＡ鎖の３’端が他方のアンチセンス鎖の３’端に向き合うよう互いに一方の端でつなぎ止められた（図４３（Ｅ）参照）対応するアンチセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖の５’端に他のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’端がつなぎ止められている２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。１つの態様においては、第一のアンチセンス鎖の５’端と第二のアンチセンス鎖の５’端の間の結合は、多機能ｓｉＮＡのそれぞれのアンチセンス鎖の５端が標的ＲＮＡのＲＮＡ干渉による切断を媒介するのに適した遊離の５’端を持つよう、容易に切断されるような方法（例えば、生分解性リンカー）でデザインされている。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
１つの態様においては、本発明は、一方のセンスｓｉＮＡ鎖の５’端が他方のアンチセンス鎖の３’端に向き合うよう互いに一方の端でつなぎ止められた（図４３（Ｆ）参照）対応するアンチセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖の３’端に他のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’端がつなぎ止められている二つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。１つの態様においては、第一のアンチセンス鎖の５’端と第二のアンチセンス鎖の５’端の間の結合は、多機能ｓｉＮＡのそれぞれのアンチセンス鎖の５’端が標的ＲＮＡのＲＮＡ干渉による切断を媒介するのに適した遊離の５’端を持つよう、容易に切断されるような方法（例えば、生分解性リンカー）でデザインされている。本明細書で述べられたように、テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
上記態様のいずれにおいても、第一標的核酸配列または第二核酸配列はそれぞれ、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡまたはその一部を含むことができる。１つの態様においては、第一標的核酸配列はＶＥＧＦ（例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、および／またはＶＥＧＦ−Ｄのいずれか）ＲＮＡまたはその一部であり、第二標的核酸配列はＶＥＧＦＲ（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３のいずれか）ＲＮＡもしくはその一部である。１つの態様においては、第一標的核酸配列はＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３のいずれか）ＲＮＡまたはその一部であり、第二標的核酸配列はＶＥＧＦ（例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、および／またはＶＥＧＦ−Ｄのいずれか）ＲＮＡもしくはその一部である。１つの態様においては、第一標的核酸配列はＶＥＧＦ（例、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、および／またはＶＥＧＦ−Ｄのいずれか）ＲＮＡまたはその一部であり、第二標的核酸配列はＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、および／またはＶＥＧＦ−Ｄのいずれか）ＲＮＡもしくはその一部である。１つの態様においては、第一標的核酸配列はＶＥＧＦＲ（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３のいずれか）ＲＮＡまたはその一部であり、第二標的核酸配列はＶＥＧＦＲ（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３）ＲＮＡもしくはその一部である。
核酸分子の合成
１００ヌクレオチド以上の長さの核酸の合成は、自動化された方法では困難であり、そのような分子による治療コストは非常に高額である。本発明では低分子核酸モチーフ（「低分子」とは、１００ヌクレオチド長を越えない核酸モチーフを指し、望ましくは８０ヌクレオチドを越えない長さであり、最も望ましくは５０ヌクレオチドを越えない長さである。例えば、個別のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列もしくはタンデムに合成されたｓｉＮＡ配列）は、外因的な供給として用いられるのが望ましい。これらの分子の単純な構造は、標的のタンパク質領域および／またＲＮＡ構造に核酸が侵入する能力を上昇させる。典型的な本発明の分子は化学的に合成され、その他は同様にして合成される。
オリゴヌクレオチド（例、特定の修飾を受けたオリゴヌクレオチド、またはリボヌクレオチドが欠けているオリゴヌクレオチドの部分）は、例えばカラザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）等、１９９２、酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、２１１、３−１９、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９９／５４４５９、ウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）等、１９９５、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２３、２６７７−２６８４、ウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔ）等、１９９７、分子生物学手法誌（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ）、７４、５９、ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）等、１９９８、バイオテクノロジーとバイオ工学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．）６１、３３−４５、およびブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）、米国特許番号６，００１，３１１に述べられているような当該分野で知られているプロトコールを用いて合成された。これら全ての参考文献は、参照することで本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドの合成は、５’端のジメトキシトリチルや３’端のホスホラミダイトのような、一般的な核酸保護基とカップリング基を利用する。限定を目的としない例において、小規模合成は３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）核酸合成装置で、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドのカップリングステップは２．５分、２’−デオキシヌクレオチドもしくは２’−デオキシ−２−フルオロヌクレオチドのカップリングステップは４５秒の０．２μｍｏｌスケールのプロトコールを用いて行われた。表Ｖは、合成サイクルで用いられた試薬の量と接触回数をまとめている。また、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、プロトジーン社（Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ））製造の装置のような９６ウェルプレート核酸合成装置でサイクルへの最低限の修正で行うことができる。３３倍過剰（６０μＬ中に０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト、および１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬ中に０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）は、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに関連した２’−Ｏ−メチル残基のそれぞれのカップリングサイクルに使用することができる。２２倍過剰（４０μＬ中に０．１１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホラミダイト、および７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（４０μＬ中に０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）は、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに関連したデオキシ残基のそれぞれのカップリングサイクルに使用することができる。３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）核酸合成装置の比色定量法で測定したトリチル分画のカップリングの平均収量は、通常９７．５−９９％である。その他の３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）核酸合成装置のオリゴヌクレオチド合成試薬は、塩化メチレン中に３％ＴＣＡのデトリチル化溶液（ＡＢＩ）、キャップ形成はＴＨＦ中に１６％のＮ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中に１０％無水酢酸／１０％の２、６−ルチジンで行い、酸化溶液はＴＨＦ中に１６．９ｍＭＩ2、４９ｍＭピリジン、９％の水（パーセプティブバイオシステムズ社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．））、を含む。バーディック＆ジャクソン（Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ）の合成グレードのアセトニトリルは、試薬瓶から直接使用した。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中に０．２５Ｍ）は、アメリカ・インターナショナル・ケミカル社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｉｎｃ）より入手した個体から調製した。また、ホスホロチオエート結合の導入には、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬（アセトニトリル中に０．０５Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド）が用いられた。
ＤＮＡオリゴヌクレオチドの脱保護は、以下の通り行われた。ポリマー結合のトリチル付きオリゴリボヌクレオチドは４ｍＬのガラスねじ蓋キャップ付きのバイアルに移され、６５℃で１０分間、４０％メチルアミン水（１ｍＬ）に懸濁された。−２０℃に冷却後、ポリマー担体から上澄が除かれた。担体は１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄され、激しく撹拌され、その後上澄は最初の上澄みに加えられた。オリゴリボヌクレオチドを含む、合わせた上澄は、白色粉末になるまで乾燥された。
本発明の特定のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡの合成に用いられた方法は、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、１９８７、米国化学学会誌（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．）１０９、７８４５、スケアリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ）等、１９９０、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１８、５４３３、およびウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）等、１９９５、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２３−２６７７−２６８４、ウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）等、１９９７、分子生物学手法誌（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．）７４、５９で述べられた方法に従っており、また、５’端ではジメトキシトリチル、また３’端ではホスホラミダイトといった、一般的な核酸の保護基およびカップリング基を用いた。限定を目的としない例において、小規模合成は３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）核酸合成装置で、アルキルシリル保護されたヌクレオチドのカップリングステップは７．５分、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドのカップリングステップは２．５分で０．２μｍｏｌスケールのプロトコールを用いて行われた。表Ｖは、合成サイクルで用いられた試薬の量と接触回数をまとめている。また、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、プロトジーン社（Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ））製造の装置のような９６ウェルプレート核酸合成装置でサイクルへの最低限の修正で行うことができる。３３倍過剰（６０μＬ中に０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト、および７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬ中に０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）は、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに関連した２’−Ｏ−メチル残基のそれぞれのカップリングサイクルに使用することができる。６６倍過剰（１２０μＬ中に０．１１Ｍ＝１３．２μｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護されたホスホラミダイト、および１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬ中に０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ）は、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに関連したリボ残基のそれぞれのカップリングサイクルに使用することができる。３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）核酸合成装置の比色定量法で測定したトリチル分画のカップリングの平均収量は、通常９７．５−９９％である。その他の３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）核酸合成装置のオリゴヌクレオチド合成試薬は、塩化メチレン中に３％ＴＣＡのデトリチル化溶液（ＡＢＩ）、キャップ形成はＴＨＦ中に１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中に１０％無水酢酸／１０％２、６−ルチジンで行い、酸化溶液はＴＨＦ中に１６．９ｍＭ Ｉ2、４９ｍＭピリジン、９％の水（パーセプティブバイオシステムズ社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．））を含む。バーディック＆ジャクソン（Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ）の合成グレードのアセトニトリルは、試薬瓶から直接使用した。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中に０．２５Ｍ）は、アメリカ・インターナショナル・ケミカル社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｉｎｃ．）より入手した個体から調製した。また、ホスホロチオエート結合の導入には、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬（アセトニトリル中に０．０５Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド）が用いられた。
ＲＮＡの脱保護は、ツーポットまたはワンポットプロトコールのいずれかを用いて行われた。ツーポットプロトコールでは、ポリマー結合のトリチル付きオリゴリボヌクレオチドが４ｍＬのガラスねじ蓋付きのバイアルに移され、６５℃で１０分間、４０％メチルアミン水（１ｍＬ）に懸濁された。−２０℃に冷却後、ポリマー担体から上澄が除かれた。担体は１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄され、激しく撹拌され、その後上澄は最初の上澄みに加えられた。オリゴリボヌクレオチドを含む、合わせた上澄は、白色粉末になるまで乾燥された。塩基が脱保護されたオリゴリボヌクレオチドは、無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（ＨＦが１．４Ｍの濃度になるように、Ｎ−メチルピロリジノン溶液を１．５ｍＬ、ＴＥＡを７５０μＬ、ＴＥＡ・３ＨＦを１ｍＬを混合した溶液を３００μＬ）に再度懸濁され、６５℃に加熱された。１．５時間後、オリゴマーは１．５Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3でクェンチされた。
または、ワンポットプロトコールでは、ポリマー結合のトリチル付きオリゴリボヌクレオチドは４ｍＬのガラスねじ蓋付きのバイアルに移され、６５℃で１５分間、３３％のエタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）溶液に懸濁される。バイアルを室温にし、ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）が加えられ、バイアルは６５℃で１５分間加熱された。試料は−２０℃に冷却され、その後１．５Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3でクェンチされた。
トリチル付きオリゴマーの精製には、クェンチされたＮＨ4ＨＣＯ3溶液がアセトニトリルで予備洗浄されたＣ−１８を含むカートリッジにロードされ、その後５０ｍＭ ＴＥＡＡが加えられた。ロードされたカートリッジを水で洗浄した後、ＲＮＡは０．５％ＴＦＡで１３分間、脱トリチル化された。カートリッジは次いで水で再び洗浄され、１Ｍ ＮａＣｌで塩が交換され、再び水で洗浄された。オリゴヌクレオチドは次に３０％アセトニトリルで溶出された。
段階的なカップリングの平均収量は、一般的に＞９８％である（ウィコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）等、１９９５、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２３、２６７７−２６８４）。当該分野で通常の技術を有する者は、合成の規模を、上述の例より大規模もしくは小規模、例えば、限定されないが９６ウェルフォーマットに適応させることが可能であることを認識する。
あるいは、本発明の核酸分子は別々に合成し、例えば、ライゲーション（ムーア（Ｍｏｏｒｅ）等、１９９２、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５６、９９２３、ドレーパー（Ｄｒａｐｅｒ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９３／２３５６９、シャバロヴァ（Ｓｈａｂａｒｏｖａ）等、１９９１、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１９、４２４７、ベロン（Ｂｅｌｌｏｎ）等、１９９７、ヌクレオシドとヌクレオチド誌（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、１６、９５１、ベロン（Ｂｅｌｌｏｎ）等、１９９７、バイオコンジュゲート化学（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）８、２０４）、もしくは合成および／また脱保護の後に、ハイブリダイゼーションによって、合成後に互いに結合することも可能である。
本発明のｓｉＮＡ分子は、本明細書の実施例１に記載のように、タンデム合成法によって合成することも可能であり、ここで両方のｓｉＮＡ鎖が、単一な連続したオリゴヌクレオチド断片、あるいは切断可能なリンカーによって隔てられた鎖として合成され、後にハイブリダイズし、ｓｉＮＡ二重鎖の精製を可能にする別々のｓｉＮＡ断片または鎖を供給するために、続いて切断されるリンカーはポリヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。本明細書で記載の通り、ｓｉＮＡのタンデム合成は、９６ウェルもしくは類似のより大きいマルチウェルプラットフォームのようなマルチウェル／マルチプレート双方の合成に容易に適応することができる。本明細書で記載の通り、ｓｉＮＡのタンデム合成は、バッチリアクター、合成カラムなどを採用した大規模合成プラットフォームに容易に適応することができる。
ｓｉＮＡ分子は、二本の別々の核酸鎖、または断片から組み立てられ、ここで一方の断片がセンス領域を含み、もう一方の断片がＲＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。
本発明の核酸分子は、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈのようなヌクレアーゼ耐性基で修飾することによって（総説には、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）およびシダーグレン（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、１９９２、生化学サイエンスの傾向（ＴＩＢＳ）１７、３４、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、１９９４、核酸シンポジウムシリーズ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．）３１、１６３を参照）、安定性を向上させるために広範囲に修飾することができる。ｓｉＮＡ構造は、通常の方法を用いてゲル電気泳動によって精製するか、もしくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、前述のウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）等を参照、当該文献は参照することによりその全体が本申請に組み込まれる）で精製することができ、水に再懸濁される。
本発明の別の側面では、本発明のｓｉＮＡ分子はＤＮＡもしくはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される。組み替えベクターは、ＤＮＡプラスミド、もしくはウイルスベクターであることができる。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、これに限定はしないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはアルファウイルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現可能な組み替えベクターは、本明細書で述べられるように供給され、標的細胞内で存続する可能性がある。または、ｓｉＮＡ分子の一時的な発現を提供するウイルスベクターが使用できる。
本発明の核酸分子活性の最適化
修飾（塩基、糖および／またリン酸）の化学合成された核酸分子は、血清リボヌクレアーゼによる分解が妨げられ、その効力が増大する可能性がある（例、エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９２／０７０６５、ペロート（Ｐｅｒｒａｕｌｔ）等、１９９０、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）、３４４、５６５、ピーケン（Ｐｉｅｋｅｎ）等、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５３、３１４、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）およびシダーグレン（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、１９９２、生化学サイエンスの傾向（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．）１７、３３４、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９３／１５１８７、ロッシー（Ｒｏｓｓｉ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９１／０３１６２、スプロート（Ｓｐｒｏａｔ）米国特許番号５，３３４，７１１、ゴールド（Ｇｏｌｄ）等、米国特許番号６，３００，０７４、前述のバーギン（Ｂｕｒｇｉｎ）等を参照のこと。これら全ては、参照することで本明細書に組み込まれる）。上述の全ての文献は、本明細書で述べた核酸分子の塩基、リン酸および／また糖部分に対する様々な化学修飾について述べている。細胞内での効果を高める、また核酸分子から塩基を取り除くような、オリゴヌクレオチド合成の時間を短縮し必要な試薬を減らすような修飾が望ましい。
核酸分子にヌクレアーゼの安定性と効力の著しい向上をもたらすことのできる、糖、塩基、リン酸修飾について述べている当該分野の例がいくつかある。例を挙げると、オリゴヌクレオチドは、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−
Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾（総説として、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）およびシダーグレン（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、１９９２、生化学サイエンスの傾向（ＴＩＢＳ）、１７、３４、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、１９９４、核酸シンポジウムシリーズ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．）３１、１６３、バーギン（Ｂｕｒｇｉｎ）等、１９９６、生化学誌（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３５、１４０９０を参照）といったヌクレアーゼ耐性基での修飾によって、安定性を向上させ、および／また生物学的活性を向上させるために修飾される。核酸分子の糖修飾は当該分野において広範囲に述べられてきた（エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９２／０７０６５、ペロート（Ｐｅｒｒａｕｌｔ）等、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９０、３４４、５６５−５６８、ピーケン（Ｐｉｅｋｅｎ）等、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１、２５３、３１４−３１７、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）およびシダーグレン（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、生化学サイエンスの傾向（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．）、１９９２、１７、３３４−３３９、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９３／１５１８７、スプロート（Ｓｐｒｏａｔ）米国特許番号５，３３４，７１１、および、べーゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ）等、１９９５、生化学雑誌（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、２７０、２５７０２、べーゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９７／２６２７０、べーゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ）等、米国特許番号５，７１６，８２４、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、米国特許番号５，６２７，０５３、ウールフ（Ｗｏｏｌｆ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９８／１３５２６、１９９８年４月２０出願のトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）等、米国特許出願６０／０８２、４０４、カーペイスキー（Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ）等、１９９８、テトラヒドロン通信（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、３９、１１３１、アーンショー（Ｅａｒｎｓｈａｗ）およびゲイト（Ｇａｉｔ）、１９９８、バイオポリマー（核酸科学）（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ））、４８、３９−５５、ヴァーマ（Ｖｅｒｍａ）およびエックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、１９９８、生化学アニュアルレビュー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、６７、９９−１３４、およびバーリナ（Ｂｕｒｌｉｎａ）等、１９９７、生体無機医薬品化学（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）、５、１９９９−２０１０を参照のこと。これら全ての参考文献は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）。上述の文献は、糖、塩基、および／またはリン酸やそのような修飾を、触媒作用を調節せずに核酸分子に組み込む位置を決定するための一般的な方法と戦略を述べており、参照することで本明細書に組み込まれる。このような内容の観点では、本明細書に記載の通り、本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾するために、ｓｉＮＡの、細胞内のＲＮＡｉを促進する能力が著しく抑制されない限りは、類似の修飾を用いることができる。
ホスホロチオエート、ホスオロジチオエート、および／または５’−メチルホスホン酸結合を伴うオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を向上させる一方、過剰な修飾はある毒性や活性の低下を引き起こす可能性がある。従って、核酸分子をデザインする際にはヌクレオチド間結合の含量は最低限にするべきである。これらの結合の密度減少は、毒性を低下させ、その結果これらの分子の増大した効力と高い特異性をもたらすはずである。
活性を維持し、または向上させる化学修飾を有する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子が提供される。このような核酸はまた一般的に、未修飾核酸よりもヌクレアーゼにより耐久性がある。従って、インビトロおよび／またインビボ活性は著しく低下しないはずである。調節が目的である場合、標的ＲＮＡの翻訳が、望ましくないタンパク質のレベルが低下するに十分長く調節されるまで、外因的に供給される治療用の核酸分子は、好ましくは細胞中で安定しているべきである。この期間は、病状によって数時間から数日の間で様々である。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成（ウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）等、１９９５、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２３、２６７７、カラザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）等、１９９２、酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、２１１、３−１９（参照することで本明細書に組み込まれる））の改良によって、上述のように、ヌクレオチド修飾でヌクレアーゼの安定性を向上させることによって核酸分子を修飾する能力が拡大した。
１つの態様においては、本発明の核酸分子は１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のＧ−クランプヌクレオチドを含む。Ｇ−クランプヌクレオチドは、修飾シトシンアナログであり、ここでその修飾によってワトソン−クリック型とフーグスティーン型双方に二重鎖中の相補的なグアニン面となる水素結合を可能にする、例えば、リン（Ｌｉｎ）およびマテウッチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）、１９９８、アメリカ化学学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１２０、８５３１−８５３２を参照のこと。オリゴヌクレオチド中の１つのＧ−クランプアナログ置換は、相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした際の、らせんの熱安定性とミスマッチ識別が大幅に向上する結果になる可能性がある。本発明の核酸分子へのこのようなヌクレオチドの含有は、核酸標的、相補配列、もしくはテンプレート鎖への親和性と特異性の双方を向上する結果になる。別の態様においては、本発明の核酸分子は、１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の、２’，４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドのような「ロックト核酸」（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む（例として、ウェンゲル（Ｗｅｎｇｅｌ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許００／６６６０４、および国際公開特許９９／１４２２６を参照）。
別の態様においては、本発明は本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲートおよび／または複合体を含む。そのようなコンジュゲートおよび／または複合体は、ｓｉＮＡ分子の細胞のような生体系への送達を容易にするために使用することができる。本発明によって提供されるコンジュゲートおよび／また複合体は、治療のための化合物を、細胞膜を越えて輸送することによって、薬物動態を変化させることによって、および／また本発明の核酸分子の局在を調節することによって、治療活性を与えることができる。本発明は、小分子、脂質、コレステロール、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、マイナスに帯電したポリマー、および、例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、またはポリアミンといったその他のポリマーを含むがこれに限定しない、細胞膜を越える分子の送達のための新規のコンジュゲートおよび／また複合体のデザインと合成を含む。一般的に、述べられた輸送体は、個別に、または多成分系の一部として分解性リンカーと共に、または無しで利用されるようデザインされている。これらの化合物は、異なる組織由来の数多くの細胞タイプへの血清存在下、または非存在化での本発明の核酸分子の送達と局在化を改善すると期待される（スレンガー（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ）およびセック（Ｃｅｃｈ），米国特許５，８５４，０３８参照）。本明細書で述べられる分子のコンジュゲートは、生分解性核酸リンカー分子のような、生分解性のリンカーを介して生物学的に活性がある分子に結合される。
本明細書で使用される「生分解性リンカー」という語は、例えば、本発明のｓｉＮＡ分子に対して生物学的活性分子、あるいは本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖のような、ある分子を他の分子に結合するように生分解性リンカーとしてデザインされた、核酸、または非核酸リンカー分子を指す。生分解性リンカーは、特定の組織や細胞タイプへの送達といった、特定の目的のためにその安定性を調節できるようにデザインされている。核酸に基づく生分解性リンカー分子の安定性は、様々な化学反応を用いることによって調節でき、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、およびその他の２’−修飾のような、化学的に修飾されたヌクレオチド、もしくは塩基を修飾したヌクレオチドの組み合わせである。生分解性核酸リンカー分子は、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのような、二量体、三量体、四量体、もしくはより長い核酸分子であることができ、もしくは、例えば、ホスホラミデートまたはホスホジエステル結合のような、リンに基づく結合を有する単一ヌクレオチドを含むことができる。また、生分解性核酸リンカー分子は、核酸骨格、核酸糖、もしくは核酸塩基の修飾を含むことができる。
本明細書で使用される「生分解性」という用語は、例えば酵素的な分解、もしくは化学的な分解といった生体系での分解を指す。
本明細書で使用される「生物学的活性分子」という語は、系の生物学的反応を誘発または修飾する能力をもつ化合物または分子を指す。本発明によって単独または他の分子との組み合わせで検討された生物学的に活性なｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例は、抗生物質、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、低分子、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイ、およびそのアナログといった治療上の活性分子を含む。本発明の生物学的活性分子は、例えば、脂質、およびポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコールおよびその他のポリエステルのようなポリマーといった、薬物動態を調節できる、および／また他の生物学的活性分子の薬物動態を調節できる分子も含む。
本明細書で使用される「リン脂質」という語は、少なくとも１つのリン基を含む疎水性分子を指す。例えば、リン脂質は、リン含有基および飽和もしくは不飽和アルキル基、場合によってはＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン、もしくは置換アリールまたは非置換アリール基を含むことができる。
外因的に送達された治療核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、最適には、ＲＮＡの逆転写がＲＮＡ転写物のレベルを減少させるのに十分長い間調節されるまで細胞内で安定である。核酸分子は、有効な細胞内の治療剤として機能するよう、ヌクレアーゼに耐性である。本発明また当該分野で述べられた、核酸分子の化学合成における改良点は、上述のようにそのヌクレアーゼの安定性を向上させるためのヌクレオチド修飾の導入によって、核酸分子の修飾の可能性を拡大した。
さらに別の態様においては、ＲＮＡｉに関わるタンパク質の酵素活性を維持または向上させるような化学修飾を有するｓｉＮＡ分子が提供される。そのような核酸は、未修飾核酸よりも一般的にヌクレアーゼにより耐性がある。従って、インビトロおよび／またインビボで活性は著しく低下しないはずである。
核酸に基づく本発明の分子の利用は、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的とした複数のｓｉＮＡ分子、既知の低分子モジュレーターとカップリングされた核酸分子、もしくは異なるモチーフ、および／また化学薬品また生物学的分子といった分子の併用による断続的な治療）の可能性を提供することによって、より良い治療を導き出すだろう。ｓｉＮＡ分子による対象の治療は、酵素的な核酸分子（リボザイム）、アロザイム、アンチセンス、２，５−Ａオリゴアデニレート、デコイ、およびアプタマーのような異なるタイプの核酸分子の併用も含むｋどえる。
別の側面では、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖のみ、もしくはｓｉＮＡ鎖両方に、１つ以上の５’および／または３’キャップ構造を含む。
「キャップ構造」は、オリゴヌクレオチドのどちらかの末端に組み込まれている化学修飾を指す（例として、アダミック（Ａｄａｍｉｃ）ら，米国特許５，９９８，２０３を参照のこと。これは参照することで本明細書に組み込まれる）。これらの末端修飾は、核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内への送達および／または局在化を助ける。キャップは５’末端（５’キャップ）または３’末端（３’キャップ）もしくは両末端に存在することができる。限定を目的としない例において、５’キャップは、グリセリル、逆位のデオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（ベ
ータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌク
レオチド、１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’−セコヌクレオチド、非環状３，４−ジヒドロキシブ
チルヌクレオチド、非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆
位ヌクレオチド部分、３’−３’−逆位脱塩基部分、３’−２’−逆位ヌクレオチド部分
、３’−２’−逆位脱塩基部分、１，４−ブタンジオールリン酸、３’−ホスホラミデー
ト、ヘキシルリン酸、アミノヘキシルリン酸、３’−リン酸、３’−ホスホロチオエート
、ホスホロジチオエート、または架橋もしくは非架橋メチルホスホン酸部分を含むが、これらに限定はしない。キャップ部分の限定を目的としない例を、図１０に示す。
３’キャップの限定を目的としない例は、グリセリル、逆位のデオキシ塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌク
レオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノアルキルリン
酸、１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸、３−アミノプロピルリン酸、６−アミノヘキシルリン酸、１，２−アミノドデシルリン酸、ヒドロキシプロピルリン酸、１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’−セコヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒ
ドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分、５’−５’−逆位
脱塩基部分、５’−ホスホラミデート、５’−ホスホロチオエート、１，４−ブタンジオ
ールリン酸、５’−アミノ、架橋および／または非架橋５’−ホスホラミデート、ホスホ
ロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋および／または非架橋メチルホスホン酸、および５’−メルカプト部分を含むが、これらに限定されない（さらに詳細は
、参照することで本明細書に組み込まれる、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびアイヤー（Ｉｙｅｒ），１９９３，テトラヒドロン誌（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）４９，１９２５を参照のこと）。
「非ヌクレオチド」は、糖および／またはリン酸置換基のいずれかを含む、核酸鎖の１つ以上のヌクレオチド単位の位置に組み込まれることができる、任意の基または化合物を意味し、それにより残りの塩基が酵素活性を示すことができる。基または化合物は、一般的に認められるアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンのようなヌクレオチド塩基を含まないという点において脱塩基であり、よって１’位の塩基が欠けている。
「アルキル」基は、直鎖、分岐鎖、および環状アルキル基を含む、脂肪族飽和炭化水素を指す。好ましくは、アルキル基は１から１２の炭素を有する。より好ましくは、１から７の炭素、さらに好ましくは、１から４の炭素を持つ低アルキルである。アルキル基は、置換される場合もあり、未置換の場合もある。置換される場合には、望ましい単数または複数の置換基は、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ2、またはＮ（ＣＨ3）2、アミノ、またはＳＨである。この用語は、直鎖、分岐鎖、および環状基を含む、少なくとも１つの炭素炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基も含む。好ましくは、アルケニル基は１から１２の炭素を有する。より好ましくは、１から７の炭素、さらに好ましくは、１から４の炭素を持つ低アルケニルである。アルケニル基は、置換されてもよく、未置換でもよい。置換される場合には、望ましい単数または複数の置換基は、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ2、ハロゲン、またはＮ（ＣＨ3）2、アミノ、またはＳＨである。「アルキル」という用語は、直鎖、分岐鎖、および環状基を含む、少なくとも１つの炭素炭素三重結合を含む不飽和炭化水素基を持つアルキニル基も含む。好ましくは、アルキニル基は１から１２の炭素を有する。より好ましくは、１から７の炭素、さらに好ましくは、１から４の炭素を持つ低アルキニルである。アルキニル基は、置換されてもよく、未置換でもよい。置換される場合、置換基は好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコシキ、−Ｏ、−Ｓ、ＮＯ2、またはＮ（ＣＨ3）2、アミノ、またはＳＨである。
そのようなアルキル基は、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、ヘテロ環式アリール、アミドおよびエステル基を含むことができる。「アリール」基は、共役π電子系を持つ少なくとも１つの環を有し、炭素環式アリール、ヘテロ環式アリール、ビアリール基を含む芳香族基を指し、それらの全ては置換されていてもよい。アリール基の単数または複数の置換基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアミノ基が望ましい。「アルキルアリール」基は、アリール基（上述）に共有的に結合したアルキル基（上述）を指す。炭素環アリール基は、芳香環の環原子が全て炭素原子である基である。炭素原子は置換されていてもよい。ヘテロ環アリール基は、芳香環の環原子として、１から３のヘテロ原子を有し、残りの環原子が炭素原子である基である。適切なヘテロ原子は酸素、硫黄、および窒素を含み、またフラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリル、および同様の基を含み、いずれも任意で置換される。「アミド」は、Ｒがアルキル、アリール、アルキルアリール、もしくは水素のいずれかである場合の、Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒを指す。「エステル」は、Ｒがアルキル、アリール、アルキルアリール、もしくは水素のいずれかである場合の、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’を
指す。
本明細書で使用する「ヌクレオチド」という語は、当該分野で認められているような天然の塩基（標準）、および当該分野でよく知られている修飾塩基を指す。そのような塩基は、一般的にヌクレオチド糖部分の１’位に位置している。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、非修飾、もしくは糖、リン酸および／または塩基部分で修飾されていてもよく、（また、ヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド、などと互換的に呼ばれる。例として、前述のウスマン（Ｕｓｍａｎ）およびマックスウィッゲン（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）；エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０７０６５；ウスマン（Ｕｓｍａｎ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１５１８７；前述のウールマン（Ｕｈｌｍａｎ）およびパイマン（Ｐｅｙｍａｎ）を参照のこと。これらは全て参照することで本明細書に組み込まれる）。リンバック（Ｌｉｍｂａｃｈ）ら，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），１９９４，２２，２１８３に要約されているように、当該分野で知られている修飾核酸塩基の例がいくつかある。限定を目的としない核酸分子に導入可能な塩基修飾一部の例は、イノシン、プリン、ピジリン−４−オン、ピジリン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、５−リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、もしくは６−アザピリミジン、もしくは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、およびその他を含む（バーグン（Ｂｕｒｇｉｎ）ら，１９９６，生化学誌（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３５，１４０９０；前述のウールマン（Ｕｈｌｍａｎ）およびパイマン（Ｐｅｙｍａｎ））。この側面で「修飾塩基」は、１’位の、またはそれに同等に位置する、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル以外のヌクレオチド塩基を指す。
１つの態様においては、本発明は、１つ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、モルフォリノ、アミデートカルバミン酸、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホン酸、スルホンアミド、スルファミン酸、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、および／またアルキルシリル、置換基を含む、リン酸骨格修飾された修飾ｓｉＮＡ分子を特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説としては、ハンジカー（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ）およびリューマン（Ｌｅｕｍａｎｎ），１９９５，「最新合成方法における、核酸アナログ：合成と特性（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」，ＶＣＨ，３３１−４１７；およびメスメーカー（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ）ら，１９９４，「アンチセンス研究の炭水化物修飾における、オリゴヌクレオチドのための新規の骨格交換（Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｆｎｅｎｔｓ ｆｏｒ ＯｌｉｇｏＴａｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，ＡＣＳ，２４−３９を参照のこと。
「脱塩基」は、塩基が欠けた、またはその他の化学基を１’の塩基の位置に有する糖部分を意味する。例として、アダミック（Ａｄａｍｉｃ）ら，米国特許５，９９８，２０３を参照のこと。
「非修飾ヌクレオシド」は、ベータ−Ｄ−リボ−フラノースの１’位の炭素に結合したアデニン、シトシン、グアニン、チミン、もしくはウラシル塩基の一つを指す。
「修飾ヌクレオシド」は、非修飾ヌクレオチド塩基、糖および／またはリン酸の化学構造に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を指す。限定を目的としない修飾核酸の例は、化学式Ｉ−ＶＩＩおよび／また本明細書で述べられたその他の修飾として示されている。
本発明で述べられたような２’−修飾ヌクレオチドと結合している場合、「アミノ」は、修飾され得る、または未修飾の２’−ＮＨ2または２’−Ｏ−ＮＨ2を指す。このよう
な修飾基は、例えば、エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）ら，米国特許５，６７２，６９５、およびマチューリック−アダミック（Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ）ら，米国特許６，２４８，８７８で述べられており、双方とも参照することでその全体が本明細書に組み込まれる。
核酸のｓｉＮＡ構造への様々な修飾は、これらの分子の利用を向上させるために行い得る。このような修飾は、有効期限、インビトロでの半減期、安定性、例えば、細胞膜の透過性を向上させ、また標的細胞の認識能や結合能を与えることによって、標的部位へのそのようなオリゴヌクレオチドの導入の簡便さを向上させることになる。
核酸分子の投与
本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞または組織内のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲのレベルに関連する、あるいは反応する癌、眼疾患、増殖性疾患、または血管形成関連疾患、状態、または障害、および／または任意の他の形質、疾病または状態の治療、予防、抑制、または低減に使用するために、単独で、もしくは他の療法と組み合わせて適応させることができる。
例えば、ｓｉＮＡ分子は、リポソームを対象へ投与するための担体、希釈剤、およびその塩を含む送達手段を含むことが可能であり、および／また医薬的に許容できる製剤として存在することが可能である。核酸分子の送達の方法はアクタール（Ａｋｈｔａｒ）ら，１９９２，細胞生物学の傾向（ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌ Ｂｉｏ．），２，１３９；アンチセンスオリゴヌクレオチド治療学のための送達戦略（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）アクタール（Ａｋｈｔａｒ）編，１９９５；モウラー（Ｍａｕｒｅｒ）ら，１９９９，分子膜生物学誌（Ｍｏｌ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ．），１６，１２９−１４０；ホフランド（Ｈｏｆｌａｎｄ）およびフアン（Ｈｕａｎｇ），１９９９，実験薬理学ハンドブック（Ｈａｎｄｂ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．），１３７，１６５−１９２；およびリー（Ｌｅｅ）ら，２０００，米国癌学会シンポジウムシリーズ（ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．），７５２，１８４−１９２で述べられており、これらは全て参照することで本明細書に組み込まれる。べーゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ）ら，米国特許６，３９５，７１３；およびサリヴァン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２５９５は更に核酸分子の送達のための一般的な方法を述べている。これらのプロトコールは、事実上、任意の核酸分子の送達に利用できる。核酸分子は、当該分野の技術者に知られている様々な方法で細胞に投与することができ、その方法には、リポソームへの封入、イオン導入による方法、もしくは生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例として、ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら，１９９９，バイオ結合化学誌（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．），１０，１０６８−１０７４；ワン（Ｗａｎｇ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ０３／４７５１８および国際ＰＣＴ公開ＷＯ０３／４６１８５を参照）、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）およびＰＬＧＡミクロスフェア（例として、米国特許６，４４７，７９６および米国特許２００２１３０４３０を参照）、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェア、またはタンパク質性ベクター（オヘア（Ｏ’Ｈａｒｅ）およびノーマンド（Ｎｏｒｍａｎｄ），国際ＰＣＴ公開特許ＷＯ００／５３７２２）といった他の担体への組み込みによる方法が含まれるが、これらに限定しない。別の態様においては、本発明の核酸分子は、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）もしくはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）の誘導体のようなポリエチレンイミンとその誘導体との調剤もしくは複合体とすることも可能である。１つの態様においては、本発明の核酸分子は、参照することでその全体が本明細書に組み込まれる米国特許２００３００７７８２９に記載の通り調剤される。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、参照することにより図を含めた全体が本明細書に組み込まれる米国特許２００１０００７６６６で述べられたような膜破壊剤との複合体とされる。別の態様においては、膜破壊剤、または媒介物およびｓｉＮＡ分子は、本申請の参考文献により図を含めた全体が組み込まれる米国特許６，２３５，３１０で述べられたような、脂質である陽イオン性脂質またはヘルパー脂質分子と共に複合体とされる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、参照することにより図を含めた全体が本明細書に組み込まれる米国特許２００３０７７８２９および国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／０３６８３および国際ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０８７５４１で述べられたような送達系との複合体とされる。
別の態様においては、眼症状（例、黄斑変性症、糖尿病性網膜症等）の治療のための化合物、分子、または組成物は、眼内に、または眼内の方法によって対象に投与される。別の態様においては、眼症状（例、黄斑変性症、糖尿病性網膜症等）の治療のための化合物、分子、または組成物は、眼周囲に、または眼周囲の方法によって対象に投与される（例えば、アルハイム（Ａｈｌｈｅｉｍ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ０３／２４４２０を参照のこと）。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子および／または製剤もしくはその組成物は、眼内に、または眼内の方法によって投与される。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子および／または製剤もしくはその組成物は、眼周囲に、または眼周囲の方法によって投与される。眼周囲投与は、概してｓｉＮＡ分子および製剤またはその組成物を対象に投与するための低侵襲性アプローチを提供する（例えば、アルハイム（Ａｈｌｈｅｉｍ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ ０３／２４４２０を参照のこと）。眼周囲投与の使用はまた、網膜剥離の危険性を最小限に抑え、投薬または投与の回数増加を可能にし、黄斑変性症およびその他の目の状態のための臨床上適切な投与経路を提供し、リザーバ（例、埋め込み物、ポンプまたはその他の装置）使用の可能性も提供する。１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ化合物および組成物は、例えば注射、イオン導入（例えば、ＷＯ０３／０４３６８９およびＷＯ０３／０３０９８９を参照のこと）、または埋め込み物等、眼内もしくは眼周囲経由の方法で、約１−５０週間毎（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０週毎）に、単独で、もしくは本明細書に記載の他の化合物および／または療法と組み合わせて、局所的に投与される。１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ化合物および組成物は約１−５０週間毎（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０週毎）に、単独で、もしくは本明細書に記載の、および／または当該技術分野において周知の他の化合物および／または療法と組み合わせて、全身的に（例、静脈内、皮下、筋肉内、輸液、ポンプ、埋め込み物等を経由して）投与される。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば特定の器官または区画（例、眼、眼底、心臓、肝臓、腎臓、膀胱、前立腺、腫瘍、ＣＮＳ等）にイオン導入的に投与される。イオン導入による送達の限定を目的としない例は、例えばＷＯ０３／０４３６８９およびＷＯ０３／０３０９８９に記載されており、これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子、およびその製剤または組成物は、当該技術分野において一般的に知られているように、肝臓に投与される（例として、ウェン（Ｗｅｎ）ら，２００４，胃腸病学世界誌（Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．），１０，２４４−９；ムラオ（Ｍｕｒａｏ）ら，２００２，薬学研究（Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．），１９，１８０８−１４；リョウ（Ｌｉｕ）ら，２００３，遺伝子療法（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．），１０、１８０−７；ホン（Ｈｏｎｇ）ら，２００３，薬学および薬学ジャーナル（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．），５４，５１−８；ヘルマン（Ｈｅｒｒｍａｎｎ）ら，２００４，ウイルス学アーカイブ（Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．），１４９，１６１１−７およびマツノ（Ｍａｔｓｕｎｏ）ら，２００３，遺伝子療法（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．），１０，１５５９−６６．を参照のこと）。
１つの態様においては、本発明は、本発明の核酸分子を単球およびリンパ球を含む造血細胞へ送達するための方法の使用を特徴とする。これらの方法は、ハートマン（Ｈａｒｔｍａｎｎ）ら，１９９８，薬理学実験療法誌（Ｊ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．），２８５（２），９２０−９２８；クロネンウェット（Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ）ら，１９９８，ブラッド誌（Ｂｌｏｏｄ），９１（３），８５２−８６２；フィリオン（Ｆｉｌｉｏｎ）およびフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ），１９９７，生化学と生物物理学会報（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．），１３２９（２），３４５−３５６；マ（Ｍａ）およびウェイ（Ｗｅｉ），１９９６，白血病リサーチ（Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．），２０（１１／１２），９２５−９３０；およびボンガルツ（Ｂｏｎｇａｒｔｚ）ら，１９９４，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２２（２２），４６８１−８．に詳しく記載されている。そのような方法は、上述したように、オリゴヌクレオチドを持つ造血細胞のトランスフェクションのため、遊離オリゴヌクレオチド、陽イオン性脂質製剤、ｐＨ感受性リポソームおよび免疫リポソームを含むリポソーム製剤、および融合活性ペプチドにコンジュゲートさせたオリゴヌクレオチドを含むバイオコンジュゲートの使用を含む。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子、およびその製剤または組成物は、中枢神経系および／または末梢神経系に投与される。実験により、ニューロンによるインビボでの効率的な核酸摂取が実証されている。神経細胞への核酸の局所投与の例として、ソマー（Ｓｏｍｍｅｒ）ら，１９９８，アンチセンス核酸薬剤開発（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．），８，７５が、シー・フォス（ｃ−ｆｏｓ）に対して１５量体ホスホロチエートアンチセンス核酸分子を脳内への微量注入によりラットに投与する研究について記載している。テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識化されたアンチセンス分子は、注入後３０分、ニューロンにより排他的に取り込まれた。拡散細胞質染色および核染色がこれらの細胞内で観察された。神経細胞への核酸の全身投与の例として、エパ（Ｅｐａ）ら，２０００，アンチセンス核酸薬剤開発（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．），１０，４６９が、神経系に分化したＰＣ１２細胞内のｐ７５神経栄養因子受容体を標的にするためにベータ−シクロデキストリン−アダマンタン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用したインビボでのマウスの研究について記載している。２週間のＩＰ投与に続き、ｐ７５神経栄養因子受容体アンチセンスの明白な摂取が後根神経節（ＤＲＧ）細胞内で観察された。加えて、著しく連続したｐ７５の下方制御がＤＲＧニューロン内で観察された。ニューロンに対する核酸のターゲティングのための追加アプローチは、ブローダス（Ｂｒｏａｄｄｕｓ）ら，１９９８，神経外科学誌（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．），８８（４），７３４；カール（Ｋａｒｌｅ）ら，１９９７，ヨーロッパ臨床薬理学誌（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ），３４０（２／３），１５３；バンナイ（Ｂａｎｎａｉ）ら，１９９８，脳研究誌（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）７８４（１，２），３０４；ラジャクマール（Ｒａｊａｋｕｍａｒ）ら，１９９７，シナプス（Ｓｙｎａｐｓｅ），２６（３），１９９；ウーポン（Ｗｕ−ｐｏｎｇ）ら，１９９９，生物薬剤学誌（ＢｉｏＰｈａｒｍ），１２（１），３２；バンナイ（Ｂａｎｎａｉ）ら，１９９８，脳研究議定書（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．），３（１），８３；シマントブ（Ｓｉｍａｎｔｏｖ）ら，１９９６，神経科学誌（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ），７４（１），３９に記載されている。本発明の核酸分子は従って、遺伝子発現の調節のための反復拡大対立遺伝子多型を発現する細胞への送達および細胞からの摂取に対して影響を受けやすい。ＲＥを標的とする本発明の核酸分子送達は、様々な異なる戦略により提供される。使用可能なＣＮＳ送達への従来のアプローチは、くも膜下投与および脳室内投与、カテーテルおよびポンプの埋め込み、損傷部位または病巣への直接注射、脳動脈系への注射、もしくは血液脳関門の化学的または浸透性開口部の経由を含むがこれらに限定されない。その他のアプローチには、例えばコンジュゲートおよび生分解性のポリマーの使用を介する等の、様々な輸送および搬送システムの使用が含まれ得る。さらに、例えばカプリット（Ｋａｐｌｉｔｔ）ら，米国特許６，１８０，６１３およびデビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ），ＷＯ０４／０１３２８０に記載されているような遺伝子療法アプローチを使用して、ＣＮＳ内に核酸分子を発現させることができる。
１つの態様においては、本発明の核酸分子は、適切な肺組織への核酸分子の迅速な局所的摂取を提供するエアロゾルの吸引もしくは吸入装置またはネブライザーにより投与される乾燥製剤のスプレー等の肺送達を介して投与される。微粉化拡散組成物の呼吸用乾燥粒子を含む固体粒子組成物は、乾燥または凍結核酸組成物を粉末にし、次いで、例えば４００メッシュスクリーンにかけて微粉化組成物を分散させる、または大きな塊を析出することによって調製できる。本発明の核酸分子組成物を含む固体粒子組成物は、治療のためのその他の化合物と同様、任意でエアロゾルの製剤を容易にするのに役立つ分散剤を含むことができる。適切な分散剤は、重量で１対１の割合等、任意の適切な割合で核酸化合物と混和することができるラクトースである。
本発明の核酸組成物を含む液体粒子のエアロゾルは、ネブライザーを使用する方法等、任意の適切な方法によって生成できる。（例えば米国特許４，５０１，７２９を参照のこと）。ネブライザーは、圧縮ガス、一般的には空気または酸素を、細いベンチュリを経由して加速する方法、もしくは超音波撹拌の方法により活性成分の溶媒または懸濁液を治療用エアロゾルミストに変換する市販の装置である。ネブライザーで使用する適切な製剤は、製剤中最大量４０％ｗ／ｗまで、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満の液体担体中の活性成分を含む。担体は一般的に水または希釈アルコール水溶液であり、好ましくは、例えば塩化ナトリウムまたはその他の適切な塩の追加により、体液と等張にできている。任意選択の添加物は、製剤が滅菌調製されていない場合、例えばヒドロキシ安息香酸メチル、酸化防止剤、香料、精油、緩衝剤および乳化剤等の保存料、ならびにその他の製剤界面活性剤を含む。活性組成物および界面活性剤を含む固体粒子のエアロゾルは、同様に、任意の固体粒子エアロゾル発生器を使用して生成できる。対象に治療用の固体粒子を投与するためのエアロゾル発生器は、上記で説明したように、呼吸用の粒子を産出し、所定量の治療用組成物をヒトへの投与に適した割合で含む一定量のエアロゾルを生成する。固体粒子エアロゾル発生器の１つの具体的タイプは、吸入器である。吸入器による投与に適切な製剤は、吸入器により送達できる、細かく粉砕した粉末を含む。吸入器内において、例えば本明細書に記載の治療を実行するのに効果的な定量の粉末は、一般的にはゼラチンまたはプラスチックでできた、原位置で孔が開けてあるか開口しているカプセルまたはカートリッジ内に入れられており、粉末は吸入器または手動ポンプを用いる装置を通した気体により送達される。吸入器内で使用される粉末は、活性成分または活性成分、ラクトース等の適切な粉末賦形剤を含む粉末混合物、および任意選択の界面活性剤のいずれか１つだけを含む。活性成分は一般的に０．１から１００ｗ／ｗの製剤を含む。具体的なエアロゾル発生器の第二のタイプは、定量吸入器を含む。定量吸入器は加圧型エアロゾルディスペンサーであり、一般的に、液化推進剤中に活性成分の懸濁液または製剤溶液を含む。使用中にこれらの装置は取り付けられたバルブを通して製剤を放出し、活性成分を含む微粒子スプレーを産出するために定められた量を送達する。適切な推進剤は、一定のクロロフルオロカーボン化合物、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびそれらの混合物を含む。製剤は、例えばエタノール、乳化剤、およびオレイン酸または三オレイン酸ソルビタン等のその他の製剤界面活性剤のような１つ以上の共溶媒、酸化防止剤、および適切な香料添加剤をさらに含むことができる。肺送達のその他の方法は、例えば米国特許出願２００４００３７７８０および米国特許６，５９２，９０４；６，５８２，７２８；６，５６５，８８５に記載されている。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、当該技術分野において一般的に知られているように、真皮または濾胞に、直接または局所に（例、局在的に）投与される（例えばブランド（Ｂｒａｎｄ），２００１，分子治療学カレントオピニオン（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．），３，２４４−８；レグニア（Ｒｅｇｎｉｅｒ）ら，１９９８，薬剤標的雑誌（Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ），５，２７５−８９；カニッカナン（Ｋａｎｉｋｋａｎｎａｎ），２００２，バイオドラッグ（ＢｉｏＤｒｕｇｓ），１６，３３９−４７；ライト（Ｗｒａｉｇｈｔ）ら，２００１，薬理学と治療誌（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．），９０，８９−１０４；プリート（Ｐｒｅａｔ）およびドゥジャーディン（Ｄｕｊａｒｄｉｎ），２００１，科学技術と実践：薬理科学誌（ＳＴＰ ＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅｓ），１１，５７−６８；およびヴォート（Ｖｏｇｔ）ら，２００３，デルハウターツ（Ｈａｕｔａｒｚｔ），５４，６９２−８を参照のこと）。
１つの態様においては、本発明の送達系は、例えば水性および非水性のゲル、クリーム、複合的な乳剤、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性の溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素基剤および粉末を含み、また溶解剤、浸透促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、およびアミノ酸）、親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含むことができる。１つの態様においては、医薬的に許容できる担体は、リポソームあるいは経皮的エンハンサーである。本発明で利用可能なリポソームの例は、以下を含む：（１）セルフェクチン（ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ）、１：１．５（Ｍ／Ｍ）陽イオン性脂質のリポソーム製剤、Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミット−ｙ−スペルミンとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（ギブコＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、（２）サイトフェクチンＧＳＶ（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ ＧＳＶ）、２：１（Ｍ／Ｍ）陽イオン性脂質のリポソーム製剤およびＤＯＰＥ（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））、（３）ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−メチル硫酸アンモニウム］（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ））、および（４）リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、３：１（Ｍ／Ｍ）多価陽イオン性脂質のリポソーム製剤ＤＯＳＰＡおよび天然脂質のＤＯＰＥ（ギブコＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）。
１つの態様においては、本発明の送達系は、パッチ、錠剤、座薬、膣座薬、ゲルおよびクリームを含み、溶解剤やエンハンサー（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩、アミノ酸）、またその他の溶媒（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルとその誘導体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやヒアルロン酸のような親水性ポリマー）のような賦形剤を含むことができる。
１つの態様においては、本発明の経粘膜の送達系は、パッチ、錠剤、座薬、膣座薬、ゲルおよびクリームを含み、溶解剤やエンハンサー（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩、アミノ酸）、またその他の溶媒（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルとその誘導体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやヒアルロン酸のような親水性ポリマー）のような賦形剤を含むことができる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ポリエチレンイミン（例えば線状または分岐したＰＥＩ）および／または、ガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体誘導体ＰＥＩ、およびポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体のような、例えばグラフトされたＰＥＩ（例として、参照することで本明細書に組み込まれる、オグリス（Ｏｇｒｉｓ）ら，２００１，米国製薬科学者協会薬理科学誌（ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ），３，１−１１；ファーグソン（Ｆｕｒｇｅｓｏｎ）ら，２００３，バイオコンジュゲート化学誌（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．），１４，８４０−８４７，クナース（Ｋｕｎａｔｈ）ら，２００２；医薬研究誌（Ｐｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１９，８１０−８１７，チョイ（Ｃｈｏｉ）ら，２００１；韓国化学学会紀要（Ｂｕｌｌ． Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．），２２，４６−５２；ベッティンガー（Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ）ら，１９９９，バイオコンジュゲート化学誌（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．），１０，５５８−５６１；ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）ら，２００２，バイオコンジュゲート化学誌（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．），１３，８４５−８５４；アーバッカー（Ｅｒｂａｃｈｅｒ）ら，１９９９，遺伝子医薬誌プレプリント（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐｒｅｐｒｉｎｔ），１，１−１８；ゴッドビー（Ｇｏｄｂｅｙ）ら，１９９９，米国科学アカデミー会報（ＰＮＡＳ ＵＳＡ），９６，５１７７−５１８１，ゴッドビー（Ｇｏｄｂｅｙ）ら，１９９９，放出制御誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ），６０，１４９−１６０；ディーボルド（Ｄｉｅｂｏｌｄ）ら，１９９９，生物学化学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２７４，１９０８７−１９０９４；トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）およびクリバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ），２００２，米国科学アカデミー会報（ＰＮＡＳ ＵＳＡ），９９，１４６４０−１４６４５；サガラ（Ｓａｇａｒａ）、米国特許６，５８６，５２４を参照）を含むポリエチレンイミン誘導体と共に調剤または複合体とされる。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、バイオコンジュゲートを含み、例えば参照することにより本明細書に組み込まれるヴァーギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）ら，米国特許出願１０／４２７，１６０，２００３年４月３０日申請；米国特許６，５２８，６３１；米国特許６，３３５，４３４；米国特許６，２３５，８８６；米国特許６，１５３，７３７；米国特許番号５，２１４，１３６；米国特許番号５，１３８，０４５で述べられる核酸結合体がある。
従って、本発明は、安定剤、緩衝剤および同等の許容できる担体を用いた、１つ以上の本発明の核酸を含む医薬組成物であることを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、医薬組成物を形成するための安定剤、緩衝剤やそういったようなものを含む、または含まない標準的な方法で対象に投与（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはタンパク質）、および導入される可能性がある。リポソーム送達機序が望まれる場合には、リポソーム形成のための標準的なプロトコールに従うことができる。本発明の組成物は、調剤され、クリーム、ゲル、オイル、およびその他の当該分野で知られている局所的、真皮、または経皮的な投与に適した組成物として使用される可能性もある。
本発明は、述べられている化合物の医薬的に許容できる剤形も含む。これらの剤形は、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸といった、例えば酸添加塩のような上述化合物の塩を含む。
薬理成分もしくは製剤とは、例えば、全身投与、細胞または例えばヒトを含む対象へといった投与に適切な形の成分または製剤をさす。適切な形は、一つは用途、または例えば経口、経皮、もしくは注入による、といった摂取経路によって決まる。そのような形は成分または製剤が標的細胞（すなわち細胞への送達には、マイナスに荷電した核酸が望ましい）への到達を妨げないようにしなければならない。例えば、血流へ注入される薬理成分は可溶性でなければならない。その他の要素は、毒性および成分または製剤が効果を発揮するのを妨げるような剤形というような考察を含めて、当該技術分野で知られている。
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は全身投与により医薬的に許容可能な組成物または製剤で対象に投与される。「全身投与」とは、インビボの体内吸収もしくは薬剤の血流への蓄積の後、全身くまなく分配されることを意味する。全身吸収にいたる投与経路は、静脈内、皮下、腹腔内、吸引、経口、肺内、および筋肉内を含むが、これに限定しない。これらそれぞれの投与経路は、本発明のｓｉＮＡ分子を到達可能な病変組織に曝す。循環に対する薬剤全体の比率は、分子量またはサイズの関数として示されている。本発明の化合物を含んでいるリポソーム、またはその他の薬剤担体の利用は、例えば網膜内皮系（ＲＥＳ）の組織といった特定の組織タイプへ薬剤が局在する可能性が潜在的にある。リンパ球やマクロファージのような細胞の表面との薬剤の会合を可能にすることができるリポソーム製剤は、また有用である。このアプローチは、異常細胞に対するマクロファージやリンパ球の免疫認識の特異性の利点を活かして、標的細胞への薬剤の送達を向上させることができる。
「医薬的に許容できる製剤」または「医薬的に許容できる組成物」とは、望ましい活性のために最も適切な肉体的な部位で、本発明の核酸分子の効果的な分配を可能にする組成物または製剤を意味する。本発明の核酸分子を含む製剤のための適切な物質の限定を目的としない例は、（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｐ８５のような）Ｐ−糖タンパク質阻害剤、持続放出送達するポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコイド）マイクロスフェアのような生分解性のポリマー（エマーリックＤ．Ｆ．（Ｅｍｅｒｉｃｈ， ＤＦ）ら，１９９９，細胞移植誌（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ），８，４７−５８）、ポリシアノアクリル酸ブチルでできたような薬剤が入ったナノ粒子を含む。本発明の核酸分子のための送達戦略のその他の限定を目的としない例は、ボアード（Ｂｏａｄｏ）ら，１９９８，薬理科学誌（Ｊ．Ｐｌｉａｒｍ． Ｓｃｉ．），８７，１３０８−１３１５；タイラー（Ｔｙｌｅｒ）ら，１９９９，欧州生化学学会連合通信（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．），４２１，２８０−２８４；パードリッジ（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）ら，１９９５，米国科学アカデミー会報（ＰＮＡＳ ＵＳＡ），９２，５５９２−５５９６；ボアード（Ｂｏａｄｏ），１９９５，応用薬剤送達総説誌（Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．），１５，７３−１０７；アードリアン−ヘラーダ（Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ）ら，１９９８，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．），２６，４９１０−４９１６；およびタイラー（Ｔｙｌｅｒ）ら，１９９９，米国科学アカデミー会報（ＰＮＡＳ ＵＳＡ），９６，７０５３−７０５８で述べられた素材を含む。
本発明は、ポリ（エチレングリコール）油脂（ＰＥＧ修飾された、または長期循環リポソーム、またはステルスリポソーム）および本発明の核酸分子を含む表面修飾されたリポソームを含む成分の利用も特徴とする。これらの剤形は、標的組織における薬剤（例、ｓｉＮＡ）の蓄積を増加させる手段を提供する。この種類の薬剤担体は、オプソニン作用や単核食作用形（ＭＰＳまたはＲＥＳ）による排除に耐性であり、そのために血液循環時間が長くなり、封入された薬剤への組織暴露が向上する（レーシック（Ｌａｓｉｃ）ら，化学総説誌（Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．），１９９５，９５，２６０１−２６２７；イシワタ（Ｉｓｈｉｗａｔａ），化学薬理学紀要（Ｃｈｅｒｒａ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．），１９９５，４３，１００５−１０１１）。このようなリポソームが、腫瘍に選択的に、おそらく血管外遊出し血管新生された標的組織での捕捉によって、蓄積するのが示されている（レーシック（Ｌａｓｉｃ）ら，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９５，２６７，１２７５−１２７６；オク（Ｏｋｕ），１９９５，生化学と生物物理学会報（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ），１２３８，８６−９０）。長期循環リポソームは、特に、ＭＰＳ組織に蓄積することで知られている旧来の陽イオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態と薬力学を向上させる（リュー（Ｌｉｕ）ら，生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；チョイ（Ｃｈｏｉ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１０３９１；アンセル（Ａｎｓｅｌｌ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１０３９０；ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１０３９２）。長期循環リポソームはまた、代謝上活動的である肝臓や脾臓のようなＭＰＳ組織に蓄積するのを防ぐ能力に基づいて、陽イオン性のリポソームと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解から大いに保護すると思われる。
本発明はまた、医薬的に許容できる担体または希釈剤中の目的とする化合物の医薬的に効果的な量を含む、保存または投与のために調製された組成物も含む。治療上の使用で許容できる担体または希釈剤は薬学分野でよく知られており、例えば、レミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），マ
ック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．），（Ａ．Ｒ．ジェナーロ（Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ）編，１９８５）に記載されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。例えば、保存料、安定剤、色素と香料剤が提供される。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。加えて、抗酸化剤と懸濁化剤を使用してもよい。
医薬的に効果的な用量は、病状の防止、発生の抑制、もしくは治療（ある程度の症状、好ましくは全ての症状の緩和）に必要な用量である。医薬的に効果的な用量は、疾患のタイプ、用いられる組成物、投与の経路、治療される哺乳類のタイプ、考慮すべき特定の哺乳類の肉体的な特徴、併用薬剤、および当該技術分野の熟練者に認知されるであろうその他の要因によって決まる。概して、陰性に帯電したポリマーの効能次第で、体重当たり、一日当たり、０．１ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇの間の量の活性成分が投与される。
本発明の核酸分子およびその製剤は、経口的に、局所的に、非経口的に、吸引やスプレーで、もしくは経直腸的に、従来の非毒性の医薬的に許容できる担体、アジュバント、および／また溶剤を含む、用量単位の製剤が投与され得る。本明細書で使用される場合の、非経口的という用語は、経皮的、皮下、血管内（例、静脈内）、筋肉内、またはくも膜下注射または輸液技術および同等のものを含む。加えて、本発明の核酸分子と医薬的に許容できる担体を含む医薬製剤が提供される。１つ以上の本発明の核酸分子は、１つ以上の非毒性の医薬的に許容できる担体、および／また希釈剤、および／またアジュバント、および必要に応じて他の活性成分と共同して存在することができる。本発明の核酸分子を含む医薬組成物は、例えば錠剤、トローチ、薬用キャンディー、水性または油性の懸濁液、分散可能な粉末か顆粒、乳液、ハードまたはソフトカプセル、またはシロップまたはエリキシル剤といった、経口での使用に適切な形であり得る。
経口で使用する意図の配合は、医薬組成物の製造のために当該分野で知られている任意の方法に従って調製することができ、そのような配合は医薬品として洗練された口当たりの良い調合になるように、１つ以上の甘味料、香料、着色料、または保存料を含むことができる。錠剤は、非毒性の医薬的に許容される、錠剤の製造に適切な賦形剤との混合として活性成分を含む。それらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウムや炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性の希釈剤や、例えばコーンスターチやアルギニン酸のような整粒および崩壊剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアカシアのような結合剤、および例えばステアリン酸マグネシウムやステアリン酸、もしくはタルクのような潤滑剤であり得る。錠剤はコーティングなし、または従来法によってコーティングされることができる。ある場合には、そのようなコーティングは消化管での分散と吸収を遅らせ、長い期間に渡って作用を持続させるための、従来技術で調製されることができる。例えば、モノステアリン酸グリセリンやジステアリン酸グリセリンのような時間遅延剤が用いられる。
経口で使用する製剤は、活性成分が、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリンといった不活性の固形希釈剤と混合されて入っている、硬質ゼラチンカプセルである場合や、もしくは活性成分が水または例えばピーナッツオイル、流動パラフィン、またはオリーブオイルといったオイル溶剤に混合された、ソフトゼラチンカプセルであることができる。
水性懸濁液は、水性懸濁液を製造するのに適切な賦形剤との混合物として活性物質を含む。そのような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウムやメチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギニン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アカシアガムのような懸濁剤であり、分散剤や湿潤剤は、例えば、レシチンのような天然リン脂質、または例えばステアリン酸ポリオキシエチレンのような酸化アルキレンと脂肪酸の天然の縮合生成物、または例えばヘプタデカチレンオキシセタノールのような酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのようなエチレンオキサイドと脂肪酸とヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、またはポリエチレンソルビタンモノオレエートのようなエチレンオキサイドと脂肪酸とヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物であることができる。水性懸濁液は、例えばエチル、またはｎ−プロピル−ｐ−パラオキシ安息香酸といった１つ以上の保存料、もしくは１つ以上の着色料、１つ以上の香料、および１つ以上のサッカロースやサッカリンのような甘味料を含むことができる。
油性懸濁液は、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはココナッツオイルのような植物性オイル、もしくは流動パラフィンのような鉱物油中に活性成分を懸濁することによって調剤することができる。油性懸濁液は、例えば蜜ろう、固形パラフィン、もしくはセチルアルコールのような増粘剤を含むことができる。甘味料と香料が、口当たりの良い経口製剤になるよう加えることができる。これらの組成物はアスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって保存することができる。
水の添加による水性懸濁液の調製に適切な分散可能な粉末および顆粒は、分散剤、もしくは湿潤剤、懸濁剤、および１つ以上の保存料との混合剤として活性成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤、または懸濁剤は、既に上で例示されたものである。例えば甘味料、香料、着色料といった付加的な賦形剤が与えられることができる。
本発明の医薬組成物は、水中油型乳剤の剤形もあり得る。油層は植物油または鉱物油、またはその混合物であり得る。適切な乳化剤は、例えばアカシアガム、トラガカントガムといった天然のガムや、例えばダイズレシチン、および、例えばソルビタンモノオレエートといった脂肪酸とヘキシトール、無水物由来のエステルまたは部分エステルといった天然のリン脂質や、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのような部分エステルとのエチレンオキサイドとの縮合生成物であり得る。また乳液は、甘味料と香料を含むことができる。
シロップやエリキシル剤は、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース、またはサッカロースといった甘味料とともに調剤され得る。そのような製剤は、粘滑剤、保存料、および香料と着色料を含むことができる。医薬組成物は注射可能な滅菌水性懸濁液、または油性懸濁液の形に含まれることができる。この懸濁液は、上述の当該分野で知られている適切な分散剤もしくは湿潤剤、および懸濁剤を用いて調製され得る。滅菌注射製剤は、例えば１，３−ブタンジオール溶液のような、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶剤の滅菌注射溶液、または懸濁液であることができる。許容できる賦形剤および溶媒のなかで使用できるものは、水、リンガー溶液、等張の塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌された不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として通常用いられる。この目的のために、合成モノグリセリド、もしくはジグリセリドを含めて、任意の平凡な不揮発性油が用いられ得る。加えて、オレイン酸のような脂肪酸が注射製剤に用いられる。
本発明の核酸分子は、例えば、経直腸投与のための薬剤として、座薬の形でも投与することができる。これらの配合は、通常の温度では固体だが、直腸の温度では液体で、従って直腸で融けて薬剤が放出されるような、適切な刺激性のない賦形剤と混合して薬剤を調製することができる。そのような素材には、ココアバターおよびポリエチレングリコールが含まれる。
本発明の核酸分子は、滅菌溶媒で非経口的に投与することができる。薬剤は、溶媒と用いられる濃度によるが、溶媒に懸濁もしくは溶解することができる。局部麻酔、保存料、緩衝剤のような都合の良い補助剤を溶媒に溶解することができる。
体重キログラム当たり、一日当たり約０．１ｍｇから約１４０ｍｇのオーダーの投与量レベルが上述の病状の治療に有用である（対象につき、一日当たり、約０．５ｍｇから約７ｇ）。一回の投薬形態にするために担体物質と混合される活性成分の量は、治療されるホストと特定の投与方法によって様々である。投薬量単位の様式は通常約１ｍｇから約５００ｍｇの間の活性成分を含む。
任意の特定対象への特定の投与量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食習慣、投与の時間、投与経路、および排出率、薬剤の組み合わせと治療中の特定の疾患の重症度を含む様々な要因によって決まることが分かっている。
ヒト以外の動物への投与には、組成物は動物飼料や飲み水に加えることができる。動物が医薬的に適切な量の組成物をその食餌と共に摂取するように、動物飼料や飲み水の組成物として調剤すると便利であろう。飼料もしくは飲み水に添加するプレミックスとして組成物を提示するのも便利であろう。
本発明の核酸分子は、全体的な治療効果を増大させるために、その他の治療化合物との組み合わせで対象に投与されることができる。ある徴候を治療するための多数の化合物の使用は、薬効を増大させる一方で副作用を軽減することができる。
１つの態様においては、本発明は特定の細胞タイプへの本発明の核酸分子の投与に適した組成物を含む。例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）（ウー（Ｗｕ）およびウー（Ｗｕ）、１９８７、生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、４４２９−４４３２）は肝細胞に独特であり、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）のような分岐したガラクトース末端をもつ糖タンパク質に結合する。別の態様においては、葉酸受容体は多くのガン細胞で過剰発現されている。そのような糖タンパク質、合成糖結合体、または葉酸の受容体への結合は、オリゴ糖鎖の分岐の度合いに強く依存した親和性によって行われ、例えば、三分岐構造（ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）、二分岐鎖（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）、単鎖（ｍｏｎｏａｎｔｅｎｎａｒｙ）より強い親和性で結合する（バエンツィガー（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ）およびフィート（Ｆｉｅｔｅ），１９８０，セル誌（Ｃｅｌｌ），２２，６１１−６２０；コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）ら，１９８２，生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５７，９３９−９４５）。リー（Ｌｅｅ）およびリー（Ｌｅｅ）、１９８７、糖結合体雑誌（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．）、４、３１７−３２８、は、ガラクトースと比較して受容体に対してより高い親和性を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを炭水化物部位として用いてこの高特異性を得た。「クラスター形成効果」は、マンノシル末端糖タンパク質または糖結合体の結合および取り込みについて述べられている（ポンピポム（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ）ら，１９８１，医化学雑誌（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ），２４，１３８８−１３９５）。外因化合物を、細胞膜を越えて輸送するためのガラクトース、ガラクトサミン、または葉酸の結合体の利用は、例えば肝臓疾患の治療、肝臓癌、またはその他の癌を標的とした送達アプローチを提供することができる。バイオコンジュゲートの利用は、治療に必要な治療化合物の必要用量の低減をも提供することができる。さらに、治療上の生物利用能、薬力学上、薬物動態上のパラメーターは本発明の核酸バイオコンジュゲートの利用を通じて調節することができる。限定を目的としないそのようなバイオコンジュゲートの例が、ヴァーギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）ら，米国特許出願１０／２０１，３９４、２００１年８月１３日申請、およびマトゥリック−アダミック（Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ）ら，米国特許出願６０／３６２，０１６、２００２年３月６日申請、で述べられている。
代替として、本発明の特定のｓｉＮＡ分子は真核生物プロモーターの細胞内で発現することができる（例、アイザン（Ｉｚａｎｔ）およびワイントローブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ），１９８５，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２９，３４５；マクギャリー（ＭｃＧａｒｒｙ）およびリンドキスト（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ），１９８６，米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ）８３、３９９，スキャンロン（Ｓｃａｎｌｏｎ）ら，１９９１，米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ），８８、１０５９１−５，カシャニ−サベット（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ）ら，１９９２，アンチセンス研究開発（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．），２，３−１５，ドロパリック（Ｄｒｏｐｕｌｉｃ）ら，１９９２，ウイルス学雑誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．），６６，１４３２−４１，ウィラシンゲ（Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ）ら，１９９１，ウイルス学雑誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．），６５、５５３１−４オジュワン（Ｏｊｗａｎｇ）ら，１９９２，米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ），８９，１０８０２−６；チェン（Ｃｈｅｎ）ら，１９９２，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ）２０，４５８１−９；サーバー（Ｓａｒｖｅｒ）ら，１９９０，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２４７，１２２２−１２２５；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら，１９９５，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），２３，２２５９；グッド（Ｇｏｏｄ）ら，１９９７，遺伝子療法（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），４，４５）。それらの当該技術分野の熟練者は、任意の核酸が適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから真核細胞中に発現できることを認識している。そのような核酸の活性は、酵素核酸による一次転写産物からの放出により増大できる（ドレイパー（Ｄｒａｐｅｒ）ら，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９，およびサリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５；オーカワ（Ｏｈｋａｗａ）ら，１９９２，核酸シンポジウムシリーズ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．），２７，１５−６；タイラ（Ｔａｉｒａ）ら，１９９１，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），１９，５１２５−３０；ベンチュラ（Ｖｅｎｔｕｒａ）ら，１９９３，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），２１，３２４９−５５；チョウリラ（Ｃｈｏｗｒｉｒａ）ら，１９９４，生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６９，２５８５６。
本発明の別の側面において、本発明のＲＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位（例えばクチュール（Ｃｏｕｔｕｒｅ）ら，１９９６，ティーアイジー（ＴＩＧ．），１２，５１０を参照）から発現させることができる。組み替えベクターは、ＤＮＡプラスミド、もしくはウイルスベクターであることができる。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは、これに限定はしないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはアルファウイルスに基づいて構築することができる。別の態様においては、ポリメラーゼＩＩＩベースの構造は本発明の核酸分子発現に使用される（例えばトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、米国特許５，９０２，８８０および６，１４６，８８６を参照）。ｓｉＮＡ分子発現が可能な組み替えベクターは上述のように送達され、標的細胞内にとどまることができる。代替として、ウイルスベクターを使用して核酸分子の一時的発現を提供することができる。そのようなベクターは必要に応じて繰り返し投与されることができる。一度発現すると、ｓｉＮＡ分子は標的ｍＲＮＡと相互作用しＲＮＡｉ応答を生成する。ｓｉＮＡ分子発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与、または対象から外植された標的細胞への投与、続いてその対象への再導入、または望ましい標的細胞への導入を可能にするその他の任意の方法等による全身性であることができる（クチュール（Ｃｏｕｔｕｒｅ）ら，１９９６，ティーアイジー（ＴＩＧ．），１２，５１０を参照）。
一側面において本発明は少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコード化する核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは、ｓｉＮＡ二重鎖の一方または両方の鎖、もしくはｓｉＮＡ二重鎖に自家交雑する単一の自己相補的な鎖をコード化することができる。本発明のｓｉＮＡ分子をコード化する核酸配列は、ｓｉＮＡ分子の発現を可能にする方法で使用可能なように結合することができる（例えばポール（Ｐａｕｌ）ら，２００２，ネイチャーバイオテクノロジー誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１９，５０５；ミヤギシ（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ）およびタイラ（Ｔａｉｒａ），２００２、ネイチャーバイオテクノロジー誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１９，４９７，リー（Ｌｅｅ）ら，２００２，ネイチャーバイオテクノロジー誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１９，５００；およびノビナ（Ｎｏｖｉｎａ）ら，２００２，ネイチャーメディシン誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），電子版デジタルオブジェクト識別子：１０．１０３８／ｎｍ７２５を参照）。
別の側面では、本発明は、ａ）転写開始領域（例、真核性ポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩ開始領域）、ｂ）転写終結領域（例、真核性ポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩ終結領域）、および、ｃ）少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコード化する核酸配列を含み、ここで前記配列は前記開始領域および前記終結領域にｓｉＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする方法で使用可能なように結合している、発現ベクターを特徴とする。ベクターは任意で本発明のｓｉＮＡをコード化する配列の５’側または３’側に結
合するタンパク質の読み取り枠（ＯＲＦ）、および／またはイントロン（介在配列）を含むことができる。
ｓｉＮＡ分子配列の転写は、真核性ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターから開始されることがある。ｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写は細胞内において高いレベルで発現され、所定の細胞タイプにおける所定のｐｏｌＩＩレベルは周辺に存在する遺伝子調節配列の性質による（エンハンサー、サイレンサー等）。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は適切な細胞内で発現されることを条件として、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモータ−も使用される（エルロイ−ステイン（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ）およびモス（Ｍｏｓｓ），１９９０，米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８７，６７４３−７，ガオ（Ｇａｏ）およびファング（Ｈｕａｎｇ）１９９３，核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），２１，２８６８−７２，リーバー（Ｌｉｅｖｅｒ）ら，１９９３，酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），２１７，４７−６６，チョウ（Ｚｈｏｕ）ら，１９９０，分子細胞生物学（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），１０，４５２９−３７）。複数の調査者によって、そのようなプロモーターから発現する核酸分子が哺乳類細胞において機能し得ることが実証された（例、カシャニ−サベット（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ）ら，１９９２，アンチセンス研究開発（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．），２，３−１５；オジュワング（Ｏｊｗａｎｇ）ら，１９９２，米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８９，１０８０２−６；チェン（Ｃｈｅｎ）ら，１９９２，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），２０，４５８１−９；ユー（Ｙｕ）ら，１９９３，米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９０，６３４０−４；リュイリエール（Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ）ら，１９９２，欧州分子生物学協会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．），１１，４４１１−８；リジューイック（Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ）ら，１９９３，米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），９０，８０００−４；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら，１９９５，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），２３，２２５９；スレンガ−（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ）およびセック（Ｃｅｃｈ），１９９３，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２６２，１５６６）。さらに詳しくは、Ｕ６低分子核（ｓｎＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ＴＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコード化する遺伝子から派生したような転写単位は、細胞中のｓｉＮＡのような高濃度の望ましいＲＮＡ分子を生成するのに有効である（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら（前述）；クチュール（Ｃｏｕｔｕｒｅ）およびスティンチコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ），１９９６（前述）；ヌーンバーグ（Ｎｏｏｎｂｅｒｇ）ら，１９９４，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．），２２、２８３０；ヌーンバーグ（Ｎｏｏｎｂｅｒｇ）ら，米国特許５，６２４，８０３，グッド（Ｇｏｏｄ）ら，１９９７，遺伝子療法（Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒ．），４，４５，ベーゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１８７３６）。上述のｓｉＮＡ転写単位は、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター等）またはウイルスＲＮＡベクター（レトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）を含むがこれに限定されない、哺乳類細胞に導入する様々なベクターに組み込むことができる（クチュール（Ｃｏｕｔｕｒｅ）およびスティンチコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ），１９９６（前述）を参照）。
一側面において本発明は、ｓｉＮＡ分子の発現を可能にする方法で本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコード化する核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは、１つの実施形態において、ａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、およびｃ）少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子の鎖をコード化する核酸配列を含み、ここで前記配列は前記開始領域および前記終結領域にｓｉＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする方法で使用可能なように結合している。
別の態様においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、ｃ）読み取り枠、およびｄ）少なくとも１つのｓｉＮＡ分子の鎖をコード化する核酸配列を含み、ここで配列は読み取り枠の３’端に使用可能なように結合しており、またここで配列は開始領域、読み取り枠および終結領域にｓｉＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする方法で使用可能なように結合している。さらに別の態様においては、発現ベクターはａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、ｃ）イントロン、ｄ）少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコード化する核酸配列を含み、ここで配列は開始領域、イントロンおよび終結領域にｓｉＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする方法で使用可能なように結合している。
別の態様においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、ｃ）イントロン、ｄ）読み取り枠、およびｅ）少なくとも１つのｓｉＮＡ分子の鎖をコード化する核酸配列を含み、ここで配列は読み取り枠の３’端に使用可能なように結合しており、
またここで配列は開始領域、イントロン、読み取り枠および終結領域にｓｉＮＡ分子の発現および／または送達を可能にする方法で使用可能なように結合している。
ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ生物学および生物化学
以下の考察は、Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社から翻案した、サイトカインミニレビュー（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｉｎｉ Ｒｅｖｉｅｗｓ），血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（ＶＥＧＦ），著作権c２００２ Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。血管形成とは、新しい血管を既存の血管系から開発する過程である。それは多くの疾患における多数の役割同様、胚発生、組織の正常な成長、創傷治癒、女性の生殖周期（例、排卵、月経、および胎盤発育）において不可欠な役割を果たす。腫瘍は新しく血液供給を開発しないと、数ミリメートルを越えるサイズには成長できないため、特に癌に関心が向けられている。血管形成はまた、癌細胞の転移の拡大および成長に必要とされる。
内皮細胞が成長し生存するための重要な要素のうちの１つに、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）がある。ＶＥＧＦは、血管形成および内皮細胞増殖を含み、脈管形成を調整する上で重要な役割を果たす。ＶＥＧＦは、４５ｋＤａのホモ二量体として分泌されるヘパリン結合糖タンパク質である。多くの種類の細胞は、通常は内皮細胞自身ではないが、ＶＥＧＦを分泌する。初期に発見されたＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ａは、血管透過性を高めたので、それは血管透過性因子として知られるようになった。加えてＶＥＧＦは、一部では内皮細胞の中の一酸化窒素シンターゼの刺激を介して、血管拡張を起こす。ＶＥＧＦはまた細胞移動を刺激し、アポトーシスを抑制する。
いくつかのＶＥＧＦ−Ａのスプライスバリアントが存在する。主なものには、１２１、１６５、１８９および２０６アミノ酸（ａａ）が含まれ、それぞれ特定のエクソンの付加を含む。ＶＥＧＦ１６５が最も優勢なタンパク質であるが、ＶＥＧＦ１２１の転写物がより豊富な場合がある。ＶＥＧＦ２０６は稀にしか発現しないが、胎児肝臓内でのみ検出されている。最近では、１４５および１８３ａａのその他のスプライスバリアントもまた詳述されている。１６５、１８９、および２０６ａａスプライスバリアントは、ヘパリン結合ドメインを持ち、それが細胞外マトリックスへの固定を助け、ヘパリン硫酸への結合およびＶＥＧＦ 受容体へａの提示に関与する。そのような提示は、ＶＥＧＦの有効性にとって重要な要素である（例、ヘパリン結合形はより活性である）。その他のいくつかのＶＥＧＦ群のメンバーが、ＶＥＧＦ−Ｂ、−Ｃ、および−Ｄを含めてクローン化されてきた。胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）はまた、ＶＥＧＦ−Ａと密接に関連している。ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−ＤおよびＰｌＧＦは、すべて血小板由来成長因子−Ａおよび−Ｂと遠い親戚関係にある。ＶＥＧＦ−Ｂ、−Ｃ、および−Ｄの機能や調節に関してはあまり知られていないが、それらはＶＥＧＦ−Ａを調節する主要な経路によっては調節されないようである。
ＶＥＧＦ−Ａ転写は、低酸素状態に反応して、また活性化された腫瘍遺伝子によって可能となる。転写因子、低酸素誘導因子−１ａ（ｈｉｆ−１ａ）および−２ａは、正常酸素圧下でプロテオソームにより分解され、低酸素状態で安定化される。この経路は、フォン・ヒッペル・リンドウ遺伝子産物に依存する。Ｈｉｆ−１ａおよびｈｉｆ−２ａは、細胞核内で、アリール炭化水素核輸送体でヘテロ二量体化し、ＶＥＧＦプロモーター／エンハンサーを結合する。これは、ほとんどの種類の細胞で発現される主要な経路である。低酸素状態の誘発性が、その他のＶＥＧＦ群のメンバーや血管新生因子に対して、ＶＥＧＦ−Ａを特に特徴づける。正常酸素圧下でのＶＥＧＦ転写は上皮増殖成長因子受容体やｅｒｂＢ２のような、Ｈ−ｒａｓやいくつかの膜貫通型チロシンキナーゼを含めて、多くのに腫瘍遺伝子よって活性化される。これらの経路がともに、正常な組織と比べて腫瘍内での著しいＶＥＧＦ−Ａの上方調節の主な原因となり、しばしば予後に重要である。
ＶＥＧＦには３つの受容体がある。それらは共通の特性として、複数のＩｇＧに似た細胞外ドメインおよびチロシンキナーゼ活性を有する。ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１、またＦｌｔ−１としても知られている）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲあるいはＦｌｋ−１としても知られている）、およびＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４としても知られている）の酵素ドメインは、挿入配列によって分割される。内皮細胞はまた、さらにＶＥＧＦ受容体、ニューロピリン−１およびニューロピリン−２を発現する。ＶＥＧＦ−ＡはＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に、そしてニューロピリン−１およびニューロピリン−２に結合する。ＰｌＧＦとＶＥＧＦ−ＢがＶＥＧＦＲ１とニューロピリン−１を結合する。ＶＥＧＦ−Ｃと−ＤがＶＥＧＦＲ３とＶＥＧＦＲ２を結合する。
ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦＲ３経路がリンパの増殖には重要である。ＶＥＧＦＲ３は特にリンパ管内皮上に発現する。可溶形のＦｌｔ−１は末梢血で検出でき、ＶＥＧＦにとって高い親和性を持つリガンドである。水溶性のＦｌｔ−１はＶＥＧＦの機能を中和させるために使用できる。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、腫瘍および増殖する内皮細胞内で、部分的には低酸素状態により、またＶＥＧＦ−Ａ自体に反応して、上方調節される。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、ＰＬＣ−ｇ、Ｒａｓ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、ＰＫＣおよびＰＩ３−キナーゼのようなタンパク質を介して、複数の下流シグナル伝達経路と相互作用できる。ＶＥＧＦＲ１はＶＥＧＦＲ２より高い親和性を持ち、運動性と血管透過性を媒介する。ＶＥＧＦＲ２が増殖には必要である。
ＶＥＧＦは患者の血漿および患者の血清試料の療法で検出され、血清中にはより多く含まれる。血小板は凝集する際にＶＥＧＦを放出し、腫瘍へのＶＥＧＦ送達の主要な原因となりうる。いくつかの研究が、ＶＥＧＦの高い血中濃度と癌患者の予後の悪さとの関連が、高められた血小板数と相関関係にある可能性を示している。多くの腫瘍は、骨髄中で巨核球の生成を刺激できるサイトカインを放出し、血小板数を高める。これにより、ＶＥＧＦの腫瘍への送達を間接的に増大する結果となる。
ＶＥＧＦは機能強化された血管形成と関連するその他のいくつかの病態に関係があるとされている。例えば、ＶＥＧＦは乾癬および関節リウマチの両方で役割を果たす。糖尿病性網膜症は、ＶＥＧＦの高い眼球内レベルと関連する。ＶＥＧＦ機能の抑制により、黄体機能の遮断により不妊症となることがある。腫瘍の成長におけるＶＥＧＦの重要性の直接的な実証が、ＶＥＧＦ３９あるいはＶＥＧＦＲ２への抗体の遮断と同様、インビボの増殖を遮断するために、優性抑制ＶＥＧＦ受容体を用いて達成されている。
ＶＥＧＦを標的とする低分子干渉核酸分子、および相当する受容体およびリガンドの使用は、従って癌、増殖性疾患、あるいはその他のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子の調節に反応する任意の疾患あるいは状態の診断および治療に使用可能な新規治療薬を提供する。
以下は、本発明の核酸の選択、単離、合成および活性を示す、限定を目的としない例である。
実施例１：ｓｉＮＡ構造のタンデム合成
典型的な本発明のｓｉＮＡ分子を、例えばスクシニルに基づくリンカーのような切断可能なリンカーを用いて、タンデムに合成する。本明細書で述べたように、タンデム合成の後、高収量でＲＮＡｉ分子を供給するワンステップ精製過程が行われた。このアプローチは、高処理能力のＲＮＡｉスクリーニングの一助としてｓｉＮＡ合成に適しており、マルチカラムもしくはマルチウェルシステムプラットホームに容易に適応することができる。
ｓｉＮＡオリゴと５端のジメトキシトリチル（５’−Ｏ−ＤＭＴ）基がそのまま残った（トリチルオン合成）相補オリゴのタンデム合成の完了後、オリゴヌクレオチドは上述のように脱保護される。脱保護後、ｓｉＮＡ配列鎖は自然にハイブリダイズされる。このハイブリダイゼーションは、一方の鎖が５’−Ｏ−ＤＭＴ基を保持し、一方で相補鎖が末端５’−ヒドロキシルを含む二重鎖を生じる。一方の分子のみがジメトキシトリチル基を持つにも関わらず、新規に形成された二重鎖は、ルーチンの固相抽出精製（トリチルオン精製）の間、単一分子のように振舞う。この鎖は安定な二重鎖を形成するため、このジメトキシトリチル基（またはその他のトリチル基、またはその他の疎水性部分のような同等の基）だけで、例えばＣ１８カートリッジを用いることによって、一対のオリゴを精製することができる。
逆位のデオキシ脱塩基コハク酸、またはグリセリルコハク酸リンカー（図１参照）、または同等の切断可能なリンカーのようなタンデムリンカーを導入する目的で、標準的なホスホラミダイト合成化学反応を用いる。限定を目的としないリンカーカップリング条件で利用可能な例は、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）のような活性化試薬の存在下で、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＡ）および／またＤＭＡＰのような障害塩基を含む。リンカーをカップリングした後、標準的な合成化学反応を利用して、末端の５’−Ｏ−ＤＭＴをそのまま残したままの第二配列の合成を完了させる。合成後、この結果合成されたオリゴヌクレオチドを、本明細書に記載した手順に従って脱保護し、例えば５０ｍＭ ＮａＯＡｃまたは１．５Ｍ ＮＨ４Ｈ２ＣＯ３のような適切なバッファーでクェンチする。
ｓｉＮＡ二重鎖の精製は、例えば、ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ）のＣ１８ ＳｅｐＰａｋ ｌｇカートリッジを用いて、１カラム容量（ＣＶ）のアセトニトリル、２ＣＶのＨ２Ｏ、および２ＣＶの５０ｍＭ ＮａＯＡｃで、固相抽出精製を用いて容易に達成される。試料をロードした後、１ＣＶのＨ２Ｏまたは５０ｍＭ ＮａＯＡｃで洗浄する。故障配列をＩ ＣＶ １４％ ＡＣＮ（５０ｍＭ ＮａＯＡｃと５０ｍＭ ＮａＣＩの水溶液）で溶出する。カラムをその後、例えば１ＣＶのＨ２Ｏで洗浄し、次いで、例えば１ＣＶの１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液をカラムに通した後、２回目の、１ＣＶの１％のＴＦＡ酢酸水溶液をカラムに加え約１０分間放置することによって、カラム上、脱トリチル化を行う。残留ＴＦＡ溶液を除き、カラムをＨ２Ｏ、次いで１ＣＶの１Ｍ ＮａＣＩ、さらにＨ２Ｏで洗浄する。ｓｉＮＡ二重鎖産物をその後、例えば、１ＣＶの２０％ＣＡＮ水溶液を用いて溶出する。
図２は、精製されたｓｉＮＡ構造のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の例であり、それぞれのピークは、ｓｉＮＡ二重鎖のそれぞれのｓｉＮＡ鎖の計算上の質量に一致する。同一の精製ｓｉＮＡは、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）による解析では三つのピークを与え、一つのピークはおそらく二重鎖ｓｉＮＡに相当し、二つのピークはおそらく分離したｓｉＮＡ配列鎖に相当する。同一のｓｉＮＡ構造のイオン交換ＨＰＬＣ分析では、単一ピークのみを示す。精製ｓｉＮＡ構造の、後述のルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたテストでは、別々に合成されたオリゴヌクレオチド配列鎖から生成されたｓｉＮＡ構造と比較して、同等のＲＮＡｉ活性が示された。
実施例２：任意のＲＮＡ配列中の潜在的ｓｉＮＡ標的部位の特定
ウイルスやヒトｍＲＮＡ転写物のような、関連のＲＮＡ標的の配列は、例えば、コンピューターの折り畳みアルゴリズムを用いることによって標的部位を選別する。限定を目的としない例において、ジンバンクのようなデータベース由来の遺伝子配列またはＲＮＡ遺伝子転写物を用いて、その標的に相補性を持つｓｉＮＡ標的を生成する。このような配列はデータベースから得ることができ、もしくは当該分野で知られているように、実験的に決定することができる。例えば変異や欠失を含んでいるリボザイム、またはアンチセンス、または疾患や病状、形質、遺伝子型もしくは表現型に関連していることが知られているそれらの部位といった、例えばその他の核酸分子の研究に基づく効果的な標的部位であると決定された既知の標的部位は、その部位を標的とするｓｉＮＡ分子のデザインに用いることができる。標的ＲＮＡ中のどの部位が最も適切な標的部位かを決定するために、様々なパラメーターが用いられる。これらのパラメーターは、ＲＮＡの２次、３次構造、標的配列のヌクレオチド塩基組成、標的配列の様々な領域間の相同性の程度、またはＲＮＡ転写物中の標的配列の相対位置を含むが、これらに限定はされない。これらの決定に基づいて、ｓｉＮＡ分子の効率の選別のためにＲＮＡ転写物中に任意の数の標的部位を、例えば、インビトロＲＮＡ切断アッセイ、細胞培養、または動物モデルを用いて選ぶことができる。限定を目的としない例において、用いられるｓｉＮＡ構造のサイズに応じ、転写産物内に１から１０００の任意の標的部位が選ばれる。当該分野で知られているマルチウェルまたはマルチプレートアッセイ、またはｓｉＮＡの組み合わせライブラリーのスクリーニングアッセイ方法を用いることによって、ｓｉＮＡ分子のスクリーニングのための標的遺伝子の発現の効果的な減少を測定する高処理能力のスクリーニングアッセイが開発可能である。
実施例３：ＲＮＡ中のｓｉＮＡ分子標的部位の選択
以下の限定を目的としない方法を用いて、遺伝子配列または転写物を標的とするｓｉＮＡを選択することができる。
１．標的配列は、標的配列中に含まれる全ての断片のリスト、または特定の長さの部分配列、例えば２３ヌクレオチドの断片のリストとしてコンピューター上で解析される。この手法は、一般的には特注のパールスクリプトを用いて行われるが、オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）、マックベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）、またはＧＣＧウィスコンシンパッケージ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）でも同様に使用することができる。
２．ある例ではｓｉＮＡは１つより多い標的配列に対応し、それは例えば同じ遺伝子の異なる転写物を標的としたり、１つより多い遺伝子の異なる転写物を標的としたり、またはヒト遺伝子と動物の相同遺伝子両方を標的とする事例である。この場合、特定の長さの部分配列のリストがそれぞれの標的に対して作成され、次にそれぞれのリストで一致する配列を見つけるために比較が行われる。ほとんどの、または全ての標的配列に存在している部分配列を見つけるのを目的として、部分配列は任意の配列を含む標的配列の数によって順位付けされる。あるいは、この順位付けは変異標的配列のような、標的配列に固有の部分配列を特定することができる。このようなアプローチは、正常配列の発現には影響せずに変異配列を特異的に標的とするためのｓｉＮＡ使用を可能にするであろう。
３．ある例では、ｓｉＮＡ部分配列が望ましい標的配列には存在するが、１つ以上の配列では欠失しており、このようなパラログファミリー遺伝子が存在する遺伝子をｓｉＮＡが標的とする場合には、パラログは標的から外れることになる。上述の事例２として、特定の長さの部分配列のリストがそれぞれの標的に対して作成され、次にそれぞれのリストで標的遺伝子に存在するが、標的としないパラログには存在しない配列を見つけるために比較が行われる。
４．順位付けされたｓｉＮＡ部分配列はさらに解析され、ＧＣ含有量によって順位付けすることができる。ＧＣを３０−７０％含んでいる部位に優先順位が与えられ、ＧＣを４０−６０％含んでいる部位にさらに優先順位が与えられる。
５．順位付けされたｓｉＮＡ部分配列はさらに解析され、自己折り畳みと内部ヘアピンによって順位付けすることができる。弱い内部折り畳みが優先で、強いヘアピン構造は避けられるべきである。
６．順位付けされたｓｉＮＡ部分配列はさらに解析され、配列中にＧＧＧまたはＣＣＣの連続があるかどうかによって順位付けすることができる。いずれかの鎖のＧＧＧ（もしくは更に多くのＧ）は、オリゴヌクレオチド合成に問題を生じる場合があり、またＲＮＡｉ活性を妨げる恐れがあり得るので、ほかにふさわしい配列があれば避ける。ＣＣＣは、アンチセンス鎖にＧＧＧを配置するので、標的鎖中で検索される。
７．順位付けされたｓｉＮＡ部分配列は更に解析され、配列の３’端にＵＵのジヌクレオチド（ウリジンジヌクレオチド）を有するかどうか、および／または配列の５’端にＡＡ（アンチセンス配列に３’ＵＵをもたらす）があるかどうかによって順位付けすることができる。これらの配列は、末端ＴＴチミジンジヌクレオチドのｓｉＮＡ分子をデザインできる。
８．上述したような順位付けされた部分配列のリストから、４つか５つの標的部位を選ぶ。例えば、２３ヌクレオチドを有する部分配列においては、それぞれ選ばれた２３塩基長の配列の右２１ヌクレオチドがデザインされ、ｓｉＮＡ二重鎖の上側の（センス）鎖として合成され、一方、それぞれ選ばれた２３塩基長の配列の左２１ヌクレオチドの逆方向の相補ヌクレオチドがデザインされ、ｓｉＮＡ二重鎖の下側の（アンチセンス）鎖として合成される（表ＩＩおよびＩＩＩ参照）。末端ＴＴ残基が（第７段落で述べたように）配列に望まれる場合、センスおよびアンチセンス双方の鎖の二つの３’末端ヌクレオチドはオリゴの合成前にＴＴに置き換えられる。
９．最も活性が高いｓｉＮＡ分子を特定するため、または標的ＲＮＡ配列中の最も望ましい標的部位を特定するために、インビトロ、細胞培養、または動物モデル系でスクリーニングする。
１０．標的核酸配列を選択する際にはその他のデザイン考察を使用することができ、例えばレナルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ら，２００４，ネイチャーバイオテクノロジー電子出版（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ），２００４年２月１日，電子版デジタルオブジェクト識別子：１０．１０３８／ｎｂｔ９３６およびウイテイ（Ｕｉ−Ｔｅｉ）ら，２００４，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３２，電子版デジタルオブジェクト識別子：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ２４７を参照のこと。
代替のアプローチにおいて、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲに特異的なｓｉＮＡ構造のプールは、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、またはＡ３７５細胞のような、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡを発現する細胞内の標的部位のスクリーニングに使用される。このアプローチに用いられる一般的な戦略を図９に示す。限定を目的としないこのようなプールの例は、配列識別番号１−４２４８のいずれかを含むものもある。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ（例、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、またはＡ３７５細胞）を発現している細胞は、ｓｉＮＡ構造のプールで形質移入されＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ抑制に関連した表現型を示す細胞が分類される。ｓｉＮＡ構造のプールは、適切なベクターに挿入された転写カセットから発現されることができる（例えば図７および図８を参照）。表現型の変化（例、増殖の低下、ＶＥＧＦおよびまたはＶＥＧＦＲ ｍＲＮＡレベルの低下、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲタンパク質発現の低下）で陽性を示している細胞由来のｓｉＮＡは、標的ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列内の最も適切な単数または複数の標的部位を決定するために配列される。
実施例４：ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲを標的としたｓｉＮＡデザイン
ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的の配列解析によって、また折り畳み基盤（ｓｉＮＡの標的への接近可能性を決定するために解析された任意の配列の構造）上の標的部位の優先順位付けを行い、任意で実施例３で述べたようなｓｉＮＡ分子のライブラリーを用いて、あるいは本明細書の実施例６で述べられるようなインビトロｓｉＮＡシステムを用いて、ｓｉＮＡ標的部位を選んだ。ｓｉＮＡ分子はそれぞれの標的に結合できるようデザインされ、任意でｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用できるかどうか評価するために、個別にコンピューターで折り畳みが解析された。様々なｓｉＮＡ分子の長さが、活性を最適化するために選ばれる可能性がある。概して、標的ＲＮＡと結合または相互作用するのに十分な数の相補的ヌクレオチド塩基が選ばれるが、相補性の度合いはｓｉＮＡ二重鎖に適応するように調節することができ、または長さや塩基組成は様々である。このような方法を用いることにより、例えば任意の遺伝子転写物に相当するＲＮＡ配列のように、任意の既知のＲＮＡ配列中の部位を標的とするようにｓｉＮＡ分子をデザインすることができる。
化学的に修飾されたｓｉＮＡ構造は、ＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保ちつつ、インビボでの全身投与のためのヌクレアーゼ安定性、および／また薬物動態、局在性、および送達特性を提供するようにデザインされる。本明細書で述べられるような、または当該分野で一般的に知られている合成方法を用いて、本明細書で述べるような化学的修飾を合成的に導入する。次に、合成ｓｉＮＡ構造の、血清中、および／また細胞／組織抽出物（例えば肝臓抽出物）中のヌクレアーゼ安定性を試験する。本明細書で述べられたルシフェラーゼレポーターアッセイのような適切なアッセイ、またはその他のＲＮＡｉ活性を定量できるその他の適切なアッセイを用いて、合成ｓｉＮＡ構造のＲＮＡｉ活性も並行して試験する。ヌクレアーゼ安定性とＲＮＡｉ活性の両方を有する合成ｓｉＮＡ構造は、更に修飾され、安定性と活性アッセイで再評価されることができる。安定化された活性なｓｉＮＡ構造の化学修飾を、任意の選ばれたＲＮＡを標的とする任意のｓｉＮＡ配列に適合し、例えば治療成果をもたらす主要なｓｉＮＡ組成物（例、図１１を参照）を選ぶための標的スクリーニングアッセイで使用することができる。
実施例５：ｓｉＮＡの化学合成と精製
ｓｉＮＡ分子は、例えば、本明細書で述べられるＲＮＡ配列中の標的配列のような、ＲＮＡメッセージ中の様々な部位と相互作用するようデザインすることができる。ｓｉＮＡ分子の一方の鎖の配列は、上述の標的部位配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は本明細書で述べられる方法を用いて化学的に合成することができる。コントロール配列として用いられる不活性ｓｉＮＡ分子は、標的配列と相補的にならないようにｓｉＮＡ分子の配列を混ぜ合わせることによって合成することができる。概して、ｓｉＮＡ構造は本明細書で述べられたような固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成することができる（例えば、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、米国特許番号５，８０４，６８３；５，８３１，０７１；５，９９８，２０３；６，１１７，６５７；６，３５３，０９８；６，３６２，３２３；６，４３７，１１７；６，４６９，１５８；スケアリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ）等、米国特許番号６，１１１，０８６；６，００８，４００；６，１１１，０８６を参照。これらはすべて参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
限定を目的としない例において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られているようなホスホラミダイト化学反応を用いる段階的な方法で合成される。標準的なホスホラミダイト化学反応は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル、２’−Ｏ−タートブチルジミチルシリル、３’−Ｏ−２−シアノエチルｌＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基、および環外アミノ保護基（例、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４アセチルシチジン、およびＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオチドの利用を伴う。あるいは、上述のスケアリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ）によって述べられるように、ＲＮＡ合成において、酸に不安定な２’−Ｏ−オルトエステル保護基との結合に２’−Ｏ−シリルエステルを用いることができる。異なる２’化学反応は、例えば、参照することによ
りその全体が本明細書に組み込まれる、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、米国特許番号５，６３１，３６０で述べられている、Ｎ−フタロイル保護に利用できる２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオチドのように、異なる保護基を要求することができる。
固相合成の間、それぞれのヌクレオチドは連続的に（３’−から５’−方向に）固相支持体結合オリゴヌクレオチドに加えられる。鎖の３’端の最初のヌクレオチドは、様々なリンカーを用いて、固相（例、調節された微細孔ガラスまたはポリスチレン）に共有的に結合されている。ヌクレオチド前駆体であるリボヌクレオチドホスホラミダイト、および活性化剤が混合すると、最初のヌクレオチドの５’端に第二のヌクレオチドホスホラミダイトのカップリングが生じる。支持体を洗浄し、未反応の５’−ヒドロキシル基を無水酢酸のようなキャップ試薬でキャップして、不活性な５’−アセチル部分を生成する。三価のリン結合をより安定なリン酸結合にするために酸化する。ヌクレオチド添加サイクルの終わりに、適切な条件下（例、トリチルに基づく基では酸性条件、シリルに基づく基にはフッ素）で５’−Ｏ−保護基を切断する。各部分配列ヌクレオチドごとにこのサイクルを繰り返す。
カップリング効率を最適化するために、例えば、合成されるｓｉＮＡの特定の化学組成によって、異なるカップリング時間、異なる試薬／ホスホラミダイト濃度、異なる接触回数、異なる固相支持体、および固相支持体リンカー化学反応を用いることによって、合成条件を変更することができる。ｓｉＮＡの脱保護および精製は、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）ら、米国特許番号５，８３１，０７１、米国特許番号６，３５３，０９８、米国特許番号６，４３７，１１７、およびベロン（Ｂｅｌｌｏｎ）米国特許番号６，０５４，５７６、米国特許番号６，１６２，９０９、米国特許番号６，３０３，７７３、あるいは、上述のスケアリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ）に概して述べられているように実行されることができ、これらの文献は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、脱保護の条件は可能な限り最高の収量とｓｉＮＡ構造の純度が得られるように変更することができる。例えば、出願人は、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが、不適切な脱保護条件下で分解する場合があることを観察した。このようなオリゴヌクレオチドを、メチルアミン水を用いて約３５℃で、３０分間脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロを含むヌクレオチドがリボヌクレオチドも含む場合には、メチルアミン水を用いて約３５℃で、３０分間脱保護した後、ＴＥＡ−ＨＦを加え、約６５℃でさらに１５分間反応を維持する。
実施例６：ｓｉＮＡ活性評価のためのインビトロＲＮＡｉアッセイ
無細胞系でＲＮＡｉを再現するインビトロアッセイを用いて、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的をターゲティングするｓｉＮＡ構造の評価を行う。このアッセイは、トゥッシェル（Ｔｕｓｃｈｌ）等、１９９９、遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）１３，３１９１−３１９７およびザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ）等、２０００、セル誌（Ｃｅｌｌ）、１０１、２５−３３によって述べられる、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的ＲＮＡとともに使用する目的に適合したシステムを含む。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のシンチウム胚盤葉由来の抽出液を用いて、インビトロのＲＮＡｉ活性を再構成する。標的ＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて適切なＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ発現プラスミドからインビトロ転写することによって、または本明細書で述べるような化学合成によって生成される。センスおよびアンチセンスｓｉＮＡ鎖（例えば、それぞれ２０ｕＭ）を、緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中、９０℃で１分間、次いで３７℃で１時間のインキュベートによってアニールし、溶解緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈する。アニーリングはＴＢＥ緩衝液中のエチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルでゲル電気泳動し、モニターすることができる。オレゴンＲ（Ｏｒｅｇｏｎ Ｒ）系のハエの、酵母を塗ったモラセス寒天上で回収したゼロから２時間の胚を用いて、ショウジョウバエ溶解液を調製する。溶解液を遠心分離機にかけ、上澄を分離する。アッセイは、５０％溶解液［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（終濃度１０−５０ｐＭ）、および１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］のｓｉＮＡを含む（終濃度１０ｎＭ）溶解緩衝液を含んでいる反応混合液を含む。反応混合液は、１０ｍＭクレアチンリン酸、１０ｕｇ．ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕＭ ＧＴＰ、１００ｕＭ ＵＴＰ、１００ｕＭ ＣＴＰ、５００ｕＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／ｕＬ ＲＮａｓｉｎ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、およびそれぞれ１００ｕＭのアミノ酸も含む。酢酸カリウムの終濃度は１００ｍＭに調節する。反応液を氷上で予め混合し、ＲＮＡを加える前に２５℃で１０分間プレインキュベートし、その後２５℃でさらに６０分間インキュベートする。反応液を４倍量の１．２５ｘ受動的溶解緩衝液（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））でクェンチする。標的ＲＮＡの切断を、ＲＴ−ＰＣＲ解析、または当該技術分野で知られているその他の方法でアッセイし、反応液からｓｉＮＡが除外されたコントロール反応と比較する。
あるいは、アッセイのために内部標識された標的ＲＮＡを、［ａｌｐｈａ−32Ｐ］ＣＴＰ存在下でのインビトロ転写で調製し、スピンクロマトグラフィーによってＧ５０セファデックスカラムに通し、更なる精製なしに標的ＲＮＡとして用いる。任意で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて標的ＲＮＡを５’−32Ｐ−末端標識する。アッセイを上述のように実行し、ＲＮＡｉによって生じた標的ＲＮＡと特異的ＲＮＡ切断産物を、ゲルのオートラジオグラフで視覚化する。切断の割合を、無傷のコントロールＲＮＡ、またはｓｉＮＡなしのコントロール反応からのＲＮＡとアッセイによって生じた切断産物を表すバンドの、ホスホイメージャー（登録商標）（Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ）による定量によって測定する。
一実施形態において、このアッセイは、ｓｉＮＡに媒介されるＲＮＡｉ切断のためのＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的の標的部位を決定するために用いられ、ここで複数のｓｉＮＡ構造は、ＲＮＡｉに媒介されたＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的の切断のために、例えば標識された標的ＲＮＡの電気泳動によって、またはノーザンブロット、同様に当該分野でよく知られているその他の方法によって、アッセイ反応液が解析されることにより選択される。
実施例７：ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的ＲＮＡのインビボ核酸抑制
ヒトＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡを標的としたｓｉＮＡ分子は、上述のようにデザインされ合成される。これらの核酸分子は、例えば以下のような方法を用いて、インビボでの切断活性を試験することができる。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ内における標的配列およびヌクレオチド位置を表ＩＩおよびＩＩＩに示す。
ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲを標的とするｓｉＮＡの効率を試験するために、二つの形式が用いられる。第一は、ＲＮＡおよびタンパク質抑制の程度を測定するため、試薬を細胞培養で、例えばＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣまたはＡ３７５細胞を使用して試験する。ｓｉＮＡ試薬（例、表ＩＩおよびＩＩＩ参照）は、本明細書に記載のようにＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ標的に対して選択される。ＲＮＡ抑制は、例えば上皮角化細胞への適切なトランスフェクション媒介物によるこれらの試薬の送達後に測定される。アクチンに対する標的ＲＮＡの相対量は、増幅のモニターであるリアルタイムＰＣＲ（例えば、アプライドバイオシステムズ社７７００タックマン（登録商標）（ＡＢＩ ７７００ ＴＡＱＭＡＮ））を用いて測定される。無関係の標的にとなったオリゴヌクレオチド配列の混合物、または同一の全長と化学組成であるが各位置のヌクレオチドがランダムに置換された、ランダムに選ばれたｓｉＮＡコントロールに対して、比較を行う。標的への第一および第二の主要試薬を選び、最適化を行う。最適なトランスフェクション媒体の濃度を選択した後、主要ｓｉＮＡ分子でＲＮＡ抑制の経時的解析を実行する。加えて、ＲＮＡ抑制を測定するために、細胞プレーティングフォーマットを用いることもできる。
細胞へのｓｉＮＡの送達
トランスフェクションの前日に、細胞（例えばＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣまたはＡ３７５ 細胞）を、例としてウェルあたり１ｘ１０3細胞でＥＧＭ−２（バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））の６ウェルディッシュに播種する。ｓｉＮＡ（終濃度は例えば２５ｎＭ）およびカチオン脂質（例、終濃度２ｕｌ／ｍｌ）を、ＥＧＭ基本培地（バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））中、３７℃で３０分間、ポリプロピレンマイクロチューブで混合する。渦形成後、複合ｓｉＮＡを各ウェルに加え、表示時間インキュベートする。第一の最適化実験のため、細胞を、例として９６ウェルプレートに１ｘ１０3で播種し、記述のように複合ｓｉＮＡを加える。脂質と混合された蛍光ｓｉＮＡを使用して、ｓｉＮＡの送達効率を判定する。６ウェルディッシュの細胞をｓｉＮＡと２４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで室温にて５分間固定する。ｓｉＮＡの取込みは、蛍光顕微鏡を用いて視覚化する。
タックマン（登録商標）（ＴＡＱＭＡＮ）（リアルタイムＰＣＲ増幅モニタリング）およびライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）によるｍＲＮＡの定量
総ＲＮＡは、例えばキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）の６ウェル用ＲＮＡ精製キット、９６ウェル用またはアールエヌイージ（Ｒｎｅａｓｙ）抽出キットを使用し、ｓｉＮＡ送達に続いて細胞から調製される。タックマン（登録商標）（ＴＡＱＭＡＮ）解析（リアルタイムＰＣＲ増幅モニタリング）には、二色素標識されたプローブがレポーター色素、ＦＡＭまたはＪＯＥで合成され、５’端に共有結合され、クエンチャー色素のＴＡＭＲＡは３’端に結合される。ワンステップＲＴ−ＰＣＲ増幅は、例えば、アプライドシステムズ社プリズム７７００（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００）配列検出機で、１０μｌのトータルＲＮＡ、１００ｎＭのフォワードプライマー、９００ｎＭのリバースプライマー、１００ｎＭのプローブ、１Ｘタックマン（Ｔａｑｍａｎ）ＰＣＲ反応緩衝液（パーキンエルマー・アプライドシステムズ社（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰをそれぞれ３００μＭ、１０Ｕリボヌクレアーゼ阻害剤（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））、１．２５Ｕアンプリタックゴールド（登録商標）（ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ）（ＤＮＡポリメラーゼ）（パーキンエルマー・アプライドシステムズ社（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））および１０Ｕ Ｍ−ＭＬＶ逆転酵素（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））、で構成される５０μｌの反応液を用いて行われる。温度サイクリング条件は、４８℃で３０分、９５℃で１０分、次いで４０サイクルの９５℃で１５秒、６０℃で１分、で構成されることができる。ｍＲＮＡレベルの定量は、全細胞ＲＮＡの希釈系列（３００、１００、３３、１１ｎｇ／反応）から生成された標準に対する相対値として測定され、同時に実行されたβ−アクチンまたはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのタックマン（登録商標）（ＴＡＱＭＡＮ）反応（リアルタイムＰＣＲ増幅モニタリング）に対して標準化される。関連の各遺伝子の上流および下流プライマー、および蛍光で標識されたプローブがデザインされる。サイバーグリーンＩ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）色素の特定のＰＣＲ産物へのリアルタイムの取込みは、ライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）を用いてガラス毛細管で測定することができる。コントロールのｃＲＮＡを用いて、それぞれのプライマー対の標準曲線が作成される。数値は、それぞれの試料のＧＡＰＤＨに対する相対発現量として表現される。
ウェスタンブロッティング
核抽出物は、標準的な微量調製技術を用いて調製することができる（例として、アンドリュー（Ａｎｄｒｅｗｓ）およびフォーラー（Ｆａｌｌｅｒ）、１９９１、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９、２４９９参照）。例えば、ＴＣＡ沈澱を用いて、上澄からタンパク質抽出物が調製される。等量の２０％ＴＣＡを細胞上澄に加え、氷上で１時間インキュベートし、５分間の遠心でぺレットにする。ぺレットをアセトンで洗浄し、乾燥し、水に再懸濁する。細胞のタンパク質抽出物を、１０％ビス−トリスのニューペイジ（ＮｕＰａｇｅ）（核抽出物）または４−１２％トリス−グリシン（上澄抽出物）のポリアクリルアミドゲルで泳動させ、ニトロセルロース膜上にトランスファーする。非特異的な結合は、例えば５％の脱脂粉乳で１時間、次いで一次抗体で、４°Ｃで１６時間インキュベートすることによってブロックすることができる。次いで、洗浄、二次抗体を（１：１０，０００希釈）例えば室温で１時間塗布し、スーパーシグナル試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ｒｅａｇｅｎｔ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））でシグナルを検出する。
実施例８：ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ遺伝子発現の下方制御評価に有効な動物モデル
ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３に対して指示されたｓｉＲＮＡ等本発明の核酸の抗血管形成効果が試験できるいくつかの動物モデルがある。一般的に、角膜のモデルは、通常は無血管である組織において容易に血管の形成が観察できるため、ラットよびウサギにおける血管形成の研究に使用されている（パンドリー（Ｐａｎｄｅｙ）ら，１９９５年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８）５６７−５６９）。これらのモデルの場合、血管形成因子（例、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦ）と前処理を施した小型テフロンまたはヒドロンディスクが角膜内に外科的に作られたポケットに挿入される。血管形成は、３から５日後にモニターされる。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３ ｍＲＮＡ等に対して指示されたｓｉＲＮＡもまた、前記ディスクに送達されるか、または実験の時間経過にともなって点眼され送達される。別の眼のモデルにおいて、低酸素状態によりＶＥＧＦの発現の増加と網膜内の新血管形成を引き起こすと示してきた（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）ら，１９９５年，米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９２：９０５−９０９：シュウェキ（Ｓｈｗｅｉｋｉ）ら，１９９２年，ジェー．クリニ．インベスト（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ）．９１：２２３５−２２４３）。
ヒトグリア芽腫の場合、ＶＥＧＦは少なくとも部分的に腫瘍の血管新生に関与していると示されてきた（プレート（Ｐｌａｔｅ）ら，１９９２年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），３５９，８５４）。グリア芽腫細胞がヌードマウスの皮下に移植され、腫瘍増殖および血管新生の経過が研究されるための動物モデルが開発されてきた（キム（Ｋｉｍ）ら，１９９３年上述；ミローラ（Ｍｉｌｌｕｅｒ）ら，１９９４年上述）。
新血管形成に取り組むための別の動物モデルには、皮下に注入時に固形ゲルになる基底膜の抽出物マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）が含まれる（パッサ二ティ（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ）ら，１９９２年 ラブ．インベスト（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．）６７：５１９−５２８）。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）にＶＥＧＦ等血管形成因子が補充されると、３から５日間で血管はマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）に成長し、血管形成が評価できる。再度、ＶＥＧＦＲ ｍＲＮＡに対して指示された核酸がマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）に送達される。
血管新生阻害剤のスクリーニング用の動物モデルがいくつか存在する。これらには、角膜の損傷に伴う角膜の血管形成が含まれる（バーガー（Ｂｕｒｇｅｒ）ら，１９８５年 角膜（Ｃｏｒｎｅａ）４：３５４１；ルプリ（Ｌｅｐｒｉ）ら，１９９４年 眼学および薬理学ジャーナル（Ｊ Ｏｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）１０： ２７３−２８０；オーメロッド（Ｏｒｍｅｒｏｄ），１９９０年，米国病理学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｐａｔｈｏｌ．）１３７：１２４３−１２５２）または角膜内増殖因子埋め込み物（グラント（Ｇｒａｎｔ）ら，１９９３年糖尿病学（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）３６：２８２−２９１：パンドリー（Ｐａｎｄｅｙ）ら，１９９５年上述；ジッヒ（Ｚｉｅｃｈｅ）ら，１９９２年，ラブ．インベスト（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．）６７：７１１−７１５），増殖因子を含むマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）基質への血管成長（パッサ二ティ（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ）ら，１９９２年上述），ホルモン処置を伴う女性生殖器の新血管形成（シュウェキ（Ｓｈｗｅｉｋｉ）ら，１９９３年，臨床試験（Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ）．９１：２２３５−２２４３），高い血管新生化固形腫瘍における腫瘍増殖の抑制等幾つかのモデル（オールリ（Ｏ‘Ｒｅｉｌｙ）ら，１９９４年，セル誌（Ｃｅｌｌ）７９：３１５−３２８：サンジェ（Ｓｅｎｇｅｒ）ら，１９９３年，がん及び転移の検討（Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓ． Ｒｅｖ．）１２：３０３−３２４：タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｉ）ら，１９９４年，がん研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）５４：４２３３−４２３７：キム（Ｋｉｍ）ら，１９９３年，上述；およびマウスの網膜内における一時的低酸素誘導新血管形成（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）ら，１９９５年，米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９２：９０５−９０９）。９０５−９０９）． 腫瘍の血管新生を研究するその他のモデルシステムがフォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ），１９８５年，がん研究の進歩（Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．）４３，１７５によって検討される。
血管形成の眼モデル
角膜モデルは、パンドリー（Ｐａｎｄｅｙ）ら，上述で記載の通り、血管新生阻害剤の有効性のスクリーニング用として最も一般的で、非常に特徴のあるモデルである。このモデルは、血管が刺激剤により強化された無血管組織を含む（増殖因子、熱傷またはアルカリによる火傷、内毒素）。角膜のモデルは、ペレットに向けて血管を強化するため、ＶＥＧＦ−ヒドロン溶液に浸したテフロン製ペレットによる基質内の角膜移植を利用し、標準の顕微鏡的および像解析法を使用して量を測ることができる。血管新生阻害剤の有効性を評価するため、核酸は眼に局所的に適用されるか、またはテフロン製ペレット自体の上にあるヒドロン内に結合される。この無血管角膜もマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（以下参照）も低バックグラウンドアッセイを提供する。角膜のモデルがウサギにおいて幅広く行われてきた一方で、ラットにおける研究もまた実施されてきた。
マウスモデル（パッサ二ティ（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ）ら，上述）は、基底膜の抽出物（クラインマン（Ｋｌｅｉｎｍａｎ）ら，１９８６年）マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）または、注入前に液体中に増殖因子および血管新生阻害剤を含浸できるミリポア（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターディスクを利用する無組織モデルである。体温で皮下投与すると、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）またはミリポア（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターディスクが固形埋め込み物を形成する。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）またはミリポア（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターディスクに組み込まれているＶＥＧＦは、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）またはミリポア（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターディスクの基質内の血管を強化するのに利用され、内皮細胞特異的なｖＷＦ（因子ＶＩＩＩ抗原）免疫組織化学、トリクロム−マソン（Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ−Ｍａｓｓｏｎ）染色、またはヘモグロビン含有量へと組織学的に処理されることができる。角膜と同様に、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）またはミリポア（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターディスクは；しかしながら、組織ではない。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）またはミリポア（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターディスクにおいて、血管新生阻害剤の有効性を試験するため、核酸はマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）またはミリポア（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターディスクの基質内に投与される。従って、このモデルの送達組織は、ラットの角膜のモデルにおけるヒドロン加工テフロン製ペレットによる核酸の送達に伴い、各基質内核酸の同質の存在により問題が生じる可能性が低いかもしれない。
更に、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ（例、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、および／またはＶＥＧＦＲ３）を標的とする本発明のｓｉＮＡ分子を、活性トランスジェニックマウスで評価し、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲの調節により眼の新血管形成を抑制できるかどうかを判断できる。脈絡膜の新血管形成の動物モデルは、例えば、モリ（Ｍｏｒｉ）ら，２００１年，細胞生理学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ），１８８，２５３；モリ（Ｍｏｒｉ）ら，２００１年，米国病理学誌（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ），１５９，３１３；オオノ−マツイ（Ｏｈｎｏ−Ｍａｔｓｕｉ）ら，２００２年，米国病理学誌（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ），１６０，７１１；およびクワック（Ｋｗａｋ）ら，２０００年，研究眼科学および視覚科学（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ），４１，３１５８）で説明する。ＶＥＧＦは、網膜の新血管形成を引き起こす中心的な役割を果たす。トランスジェニックマウスの網膜の光受容器におけるＶＥＧＦＲ２の発現の増加により、網膜内の新血管形成を刺激し、ＶＥＧＦＲ２シグナルの遮断は、網膜の脈絡膜の新血管形成（ＣＮＶ）を抑制すると示されてきた（モリ（Ｍｏｒｉ）ら，２００１年，細胞生理学ジャーナル（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．），１８８．２５３）。
ＣＮＶは、例えば、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスにレーザーで誘起される。前記マウスは、また各眼におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ（例、ＶＥＧＦＲ２）ｓｉＮＡの硝子体、眼周囲または網膜下注入される。硝子体内注入は、ハーバード（Ｈａｒｂａｒｄ）ポンプマイクロインジェクション装置を利用して行われ、ガラス製マイクロピペットに引き出される。従って、マイクロピペットは角膜輪部のちょうど後ろにあり、硝子体腔へ続く強膜へ挿入される。網膜下注入は、解剖顕微鏡の集光レンズシステムを利用して行われる。前記ピペットチップは、従って角膜輪部の後方にある強膜へ挿入され、網膜上に置かれる。ベクターの注入５日後に、マウスは塩酸ケタミン（１００ｍｇ／体重ｋｇ）で麻酔をかけられ、１％のトロピカミドもまた瞳孔を希釈するのに利用され、さらに各眼における３つの場所でダイオードレーザー光凝固術がブルッフ（Ｂｒｕｃｈ）の膜を破壊するのに利用される。細隙灯送達システムおよび手動カバースライドがレーザー光凝固術用に利用される。視神経から２から３のディスク直径の９、１２、３時の位置に火傷させる。
マウスでは通常、胎児期７日目の初めに、光受容器におけるＶＥＧＦの発現により網膜下新血管形成が起こる。胎児期２１日目に、マウスは麻酔をかけられ、５０ｍｇ／ｍｌのフルオレセイン標識デキストランを含有する１ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水にてかん流される。その後、眼は除去され、そして１０％のリン酸塩緩衝ホルマリンに１時間置かれる。網膜が除去され、蛍光顕微鏡検査法で試験される（モリ（Ｍｏｒｉ）ら，上述）。
ブルッフ（Ｂｒｕｃｈ）の膜のレーザーで誘起による破壊の１４日後には、対照眼がＣＮＶの広範囲領域で評価される一方で、ｓｉＮＡの硝子体および網膜下注入を受けた眼はＣＮＶのより狭い発症領域で評価される。硝子体注入またはｓｉＮＡの網膜下注入を受ける眼はまた、網膜の外表上の新血管形成のより狭い領域で評価され、深い網膜毛細血管からの潜在的な不全芽は、ｓｉＮＡの注入を受けていない眼と比較して網膜の表面に到達しない。
血管形成の腫瘍モデル
マウスモデルの使用
各投与群を１０匹のマウス（各２０ｇ）で構成する典型的な全身性研究では、５用量（１４日間連続投与中に毎日１、３、１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇ）、約４００ｍｇの食塩水調剤されたｓｉＲＮＡが使用される。若年成体ラット（２００ｇ）における同種の研究には４ｇ以上を必要とする。平行する薬物動態研究には、同類の量の利用を含む。
ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌およびＢ−１６メラノーママウスモデル
核酸の全身有効性テスト用一般的な動物モデルを識別することは、ｓｉＲＮＡの全身有効性をスクリーニングする効率的な方法である。
ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌およびＢ−１６マウスメラノーマモデルは、原発性および転移性癌の広く認められたモデルであり、抗癌剤の初期スクリーニングとして利用される。これらマウスモデルは、免疫不全マウスの利用に依存せず、比較的安価であり、さらに飼育施設に関する懸念を最小化する。ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺およびＢ−１６メラノーマモデルは共に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに転移進行性癌細胞ライン（ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺ライン３ＬＬまたはＤ１２２、ＬＬｃ−ＬＮ７；Ｂ−１６−ＢＬ６メラノーマ）から約１０6の癌細胞の皮下埋め込みを含む。代替として、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺モデルは、腫瘍の球体を外科的埋め込むことにより生成できる（直径約０．８ｍｍ）。転移はまた、癌細胞を直接静脈内へ注入することにより作ることが出来る。ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺モデルの場合、２１から２５日以内に定量化可能な巨視的転移性腫瘍が発症し、顕微鏡的転移が埋め込み後約１４日で観察できる。Ｂ−１６メラノーマは、腫瘍の新血管形成と類似した時間経過を埋め込み後４日の初めに示す。両原発性および転移性癌は、同一動物内の２１から２５日後にこれらモデルが存在するため、指標の有用性として複数の測定が可能である。原発性癌量および増殖潜伏および微視的−巨視的転移性肺焦点の数または転移を示す動物の数が定量できる。寿命における割合の増加もまた測定できる。従って、これらモデルは、全身に投与されたｓｉＲＮＡ核酸およびｓｉＲＮＡ核酸製剤のスクリーニング用に適切な主要有用性アッセイを提供する。
ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺およびＢ−１６メラノーマモデルの場合、多種の薬剤を使用した全身薬物療法が通常は腫瘍埋め込み／植菌から１から７日で、連続または複数の投与治療により始まる。併用薬物動態学的研究により充分なｓｉＲＮＡの組織レベルが予測される薬力学的効果を達成することができるか判断することができる。更に、原発腫瘍および第二肺転移は除去され、多様なインビトロ研究に従うことができる（例、標的ＲＮＡ減少）。
加えて、動物モデルは、化合物、例えばｓｉＲＮＡ分子、のスクリーニングの際に有用であり、腎不全、その結果引き起こる常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）等の治療に有効である。Ｈａｎ：ＳＰＲＤラットモデル、Ｐｋｄ２遺伝子に標的変異を伴うマウス、および先天性多嚢胞腎（ｃｐｋ）のマウスは、ヒトＡＤＰＫＤに非常に類似し、血管形成等ＡＤＰＫＤ媒介腎不全の１つ以上の病原性要素を妨げる潜在能力を有するｓｉＲＮＡ構造の治療効果を評価する動物モデルを提供する。血管形成は、嚢胞細胞の増殖および嚢胞に体液分泌を促進する増加した血管透過性のためＡＤＰＫＤの進行に必要でありうる。培養中に嚢胞細胞は可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を生成するため、嚢胞性上皮の増殖もまた、ＡＤＰＫＤの特徴の１つである。ＶＥＧＦＲ１はまた、嚢胞性細管の上皮細胞で検出されてきたが、嚢胞性腎または正常な腎の脈管構造における上皮細胞では検出されなかった。ＶＥＧＦＲ２発現は、嚢胞性血管の上皮細胞および腎臓虚血再かん流の間の上皮細胞で増加する。抗−ＶＥＧＦＲ１および抗−ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ分子とＶＥＧＦ受容体の抑制により嚢胞形成、腎不全およびＡＤＰＫＤにおける死亡率を減衰するだろうと提案されている。抗−ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ分子は、従って嚢胞形成に伴う血管形成を抑制するようデザインされる。ＶＥＧＦＲ１が嚢胞の血管内皮ではなく嚢胞性上皮中に存在するため、抗−ＶＥＧＦＲ１ ｓｉＲＮＡ分子が、嚢胞性上皮細胞の増殖および順々により少ない嚢胞形成を導くアポトーシスを減衰するだろうと提案されている。更に、嚢胞性上皮細胞により生成されたＶＥＧＦが、血管形成ならびに上皮細胞の増殖およびアポトーシスの刺激物の１つであると提案されている。Ｈａｎ：ＳＰＲＤラット（例、カスパレイト−リッテングハウセン（Ｋａｓｐａｒｅｉｔ−Ｒｉｔｔｉｎｇｈａｕｓｅｎ）ら，１９９１年、米国病理学会誌（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）１３９，６９６を参照）Ｐｋｄ２遺伝子に標的変異を伴うマウス（Ｐｋｄ２−／−マウス、例、ウー（Ｗｕ）ら，２０００年，ネイチャー遺伝学誌（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．）２４，７５−７８を参照）およびｃｐｋマウス（例、ウー（Ｗｏｏ）ら，１９９４年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），３６８，７５０−７５３を参照）の利用により、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２媒介腎不全に対する本発明のｓｉＲＮＡ分子の有効性を研究する動物モデルをすべて提供する。
ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１ ＶＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３タンパク質レベルが、臨床上または実験上ＦＡＣＳ分析により測定できる。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１ ＶＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３コード化されたｍＲＮＡレベルは、ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）分析、ＲＮＡｓｅタンパク質、プライマー伸長解析および／または軽量ＲＴ−ＰＣＲにより評価される。ｍＲＮＡをコード化するＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１ ＶＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３タンパク質を遮断し、従って結果としてＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１ ＶＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３活性のレベルをインビトロの２０％以上で減少させるｓｉＲＮＡ核酸は識別できる。
実施例９：細胞培養におけるＶＥＧＦＲ発現のＲＡＮｉ媒介性抑制
ＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡを標的とするｓｉＮＡを利用したＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡ発現の抑制
ｓｉＮＡ構造（表ＩＩＩ）が、例えば、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣまたはＡ３７５細胞におけるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ発現の減少時の有効性に関して試験される。細胞がトランスフェクション前に約２４時間ウェルプレートにおいて、５，０００から７，５００細胞／ウェルで１００μ／ウェルでプレートされるので、トランスフェクション細胞の時間は７０から９０％の融合性である。トランスフェクションの場合、アニールされたｓｉＮＡがトランスフェクション試薬（リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００年，インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と５０μｌ／ウェルの量で混合され、室温で２０分間インキュベートする。ｓｉＮＡトランスフェクション混合液を、２５ｎＭの最終ｓｉＮＡ濃度になるように１５０μｌの量で細胞に加える。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合液をｓｉＮＡ処理が３倍になるよう３ウェル加える。連続するｓｉＮＡトランスフェクション混合液下で、細胞を３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間、ＲＮＡは処理された細胞の各ウェルから調製される。トランスフェクション混合液との上澄が、初めに除去され破棄されてから、細胞が溶解されＲＮＡが各ウェルから調製される。処理に従って標的遺伝子発現が、正常化向けＲＴ−ＰＣＲにより標的遺伝子および対照遺伝子用（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）に評価される。３部構成のデータが平均化されおよび各処理用に標準偏差が決定される。正常化されたデータが図示され、各逆位コントロールｓｉＮＡと比較した活性ｓｉＮＡによる標的ｍＲｎＡの割合の減少が決定される。
図２２は、ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡを標的とする化学修飾ｓｉＮＡにより媒介されるＡ３７５細胞内のＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡの減少に関する限定を目的としない例を示す。Ａ５４９細胞は、２５ｎＭ ｓｉＮＡと混合された０．２５μｇ／ウェルの脂質とともにトランスフェクトした。Ｓｔａｂ４／５化学反応（化合物番号３１１９０／３１１９３）、Ｓｔａｂ１／２化学反応（化合物番号３１１８３／３１１８６および化合物番号３１１８４／３１１８７）、および未修飾のＲＮＡ（化合物番号３００７５／３００７６）を含むｓｉＮＡ構造のスクリーニング（安定化「Ｓｔａｂ」化学反応を表ＩＶに示す。構造は化合物番号により参照される。表ＩＩＩを参照のこと）において、未処理の細胞、対応する化学反応の逆位コントロールｓｉＮＡ構造、（化合物番号３１２０８／３１２１１、化合物番号３１２０１／３１２０４、化合物番号３１２０２／３１２０５、および化合物番号３００７７／３００７８）、スクランブルｓｉＮＡコントロール構造（Ｓｃｒａｍ１およびＳｃｒａｍ２）、および脂質のみをトランスフェクトした細胞（トランスフェクションコントロール）と比較した。図に示した通り、全てのｓｉＮＡ構造が大幅にＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡ発現を減少させた。表ＩＶに示した通り、さらに安定化化学反応の活性を同様に試験した。これらのｓｉＮＡ構造を、適切な、対応する化学反応の逆位コントロールと比較した。さらにまた、ｓｉＮＡ構造を、未処理細胞、脂質およびスクランブルｓｉＮＡ構造をトランスフェクトした細胞、および脂質のみをトランスフェクトした細胞（トランスフェクションコントロール）と比較した。
図２３は、対応する化学反応の逆位コントロールｓｉＮＡ構造と比較して、ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡにおける８つの部位に対して指示されたＳｔａｂ９／１０を使用したＨＡＥＣ細胞培養におけるＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡレベルの減少に関する限定を目的としない例を示す。コントロールＵＮＴおよびＬＦ２Ｋは、それぞれ未処理の細胞およびＬＦ２Ｋトランスフェクション試薬のみで処理した細胞を示す。
ＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡを標的とするｓｉＮＡを用いた、ＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡ発現の抑制
ｓｉＮＡ構造（表ＩＩＩ）の、例えばＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、あるいはＡ３７５細胞内でＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ発現の減少における有効性を試験した。細胞は、トランスフェクションの前に、９６ウェルプレートで、５，０００−７，５００細胞／ウェル、１００μｌ／ウェルで、トランスフェクション時に細胞が７０−９０％の融合となるように、約２４時間プレートした。トランスフェクションには、アニ−ルしたｓｉＮＡを、トランスフェクション試薬（リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と、ウェルあたり５０μｌの容量に混合し、室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＮＡトランスフェクション混合液を、細胞に加え、２５ｎＭの最終ｓｉＮＡ濃度が１５０μｌの容量で得られる。各ｓｉＮＡトランスフェクション混合液を、３部構成のｓｉＮＡ処理のため、３ウェルに加える。細胞を、ｓｉＮＡトランスフェクション混合液の存在下で、連続して２４時間３７℃でインキュベートする。２４時間の時点で、処理ずみの細胞の各ウェルからＲＮＡを調製する。トランスフェクション混合液の上澄をまず除き、廃棄した後、細胞を溶解し、各ウェルからＲＮＡを調製する。処理後の標的遺伝子の発現を、標的遺伝子および対照遺伝子（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）の正常化をＲＴ−ＰＣＲによって評価する。三部構成データの平均をとり、各処理の標準偏差を決定した。正常化したデータをグラフ化し、活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの、それぞれの逆位コントロールｓｉＮＡと比較して、活性なｓｉＡによる標的ｍＲＮＡの減少割合を決定した。
図２４は、ＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡを標的とする化学修飾ｓｉＮＡにより媒介されるＨＡＥＣ細胞内のＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡの減少に関する限定を目的としない例を示す。ＨＡＥＣ細胞は、２５ｎＭ ｓｉＮＡと混合された０．２５μｇ／ウェルの脂質とともにトランスフェクトした。Ｓｔａｂ４／５化学反応（化合物番号３０７８６／３０７９０）、Ｓｔａｂ７／８化学反応（化合物番号３１８５８／３１８６０）、およびＳｔａｂ９／１０化学反応（化合物番号３１８６２／３１８６４）を含む部位３８５４、およびＳｔａｂ４／５化学反応（化合物番号３１８５６／３１８５７）、Ｓｔａｂ７／８化学反応（化合物番号３１８５９／３１８６１）、およびＳｔａｂ９／１０化学反応（化合物番号３１８６３／３１８６５）を含む部位３９４８中のｓｉＮＡ構造のスクリーニング（安定化「Ｓｔａｂ」化学反応を表ＩＶに示す。構造は化合物番号により参照される。表ＩＩＩを参照のこと）を、未処理の細胞、部位３８５４（化合物番号３１８７８／３１８８０、化合物番号３１８８２／３１８８４、および化合物番号３１８８６／３１８８８）中、および部位３９４８（化合物番号３１８７９／３１８８１、化合物番号３１８８３／３１８８５、および化合物番号３１８８７／３１８８９）中の対応する化学反応の逆位コントロールｓｉＮＡ構造、およびＬＦ２Ｋ（トランスフェクション試薬）でトランスフェクトした細胞、およびすべてのＲＮＡコントロール（部位３８５４中の化合物番号３１４３５／３１４３９および部位３９４８中の化合物番号３１４３７／３１４４１）と比較した。図に示した通り、全てのｓｉＮＡ構造が大幅にＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡ発現を減少させた。表ＩＶに示した通り、さらに安定化化学反応の活性を同様に試験した。これらのｓｉＮＡ構造を、適切な、対応する化学反応の逆位コントロールと比較した。さらにまた、ｓｉＮＡ構造を、未処理細胞、脂質およびスクランブルｓｉＮＡ構造をトランスフェクトした細胞、および脂質のみをトランスフェクトした細胞（トランスフェクションコントロール）と比較した。
図２５は、無関連の対照ｓｉＮＡ構造（ＩＣ１、ＩＣ２）と比較して、ＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡにおける４つの部位に対して指示されたＳｔａｂ０／０を使用したＨＡＥＣ細胞培養におけるＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡレベルの減少に関する限定を目的としない例を示す。コントロールＵＮＴおよびＬＦ２Ｋは、それぞれ未処理の細胞およびＬＦ２Ｋトランスフェクション試薬のみで処理した細胞を示す。
ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２相同ＲＮＡ配列を標的としたｓｉＮＡを使用した、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡ発現の抑制
ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２相同性を持つ配列を標的とするｓｉＮＡ分子での処理から２４時間後、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡレベルをＨＡＥＣ細胞内で判定した。ＨＡＥＣ細胞は、２５ｎＭ ｓｉＮＡと混合された１．５μｇ／ウェルの脂質とともにトランスフェクトした。ｓｉＮＡ分子の活性を、対応する化学反応の逆位ｓｉＮＡコントロール、未処理の細胞、および脂質のみで処理した細胞（トランスフェクションコントロール）と比較して表示する。ｓｉＮＡ分子およびコントロールは化合物番号（センス／アンチセンス）により参照する。配列については表ＩＩＩを参照のこと。図２６ＡおよびＢに示すように、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２配列の両方を標的とするｓｉＮＡ構造は、細胞培養実験においてＶＥＧＦＲ１発現の抑制に関して有意な有効性を示している。図２７ＡおよびＢに示すように、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２配列の両方を標的とするｓｉＮＡ構造は、細胞培養実験においてＶＥＧＦＲ２発現の抑制に関して有意な有効性を示している。
実施例１０：インビボ血管形成のｓｉＮＡ媒介性抑制
ＶＥＧＦ誘発血管形成のラットの角膜モデルにおけるｓｉＮＡ分子の評価
この研究は、ＶＥＧＦ誘発血管形成のラットの角膜モデルを使用してＶＥＧＦＲ１に対して標的とされるｓｉＮＡの抗血管形成活性を評価することを目的とする。図２８で参照されるｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡ標的と相互作用することができないために不活性である合致した逆位コントロールを有する。ｓｉＮＡ分子およびＶＥＧＦは、フィルターディスク法を使用して相互に送達された。直径０．０５７のニトロセルロースのフィルターディスク（ミリポア社（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））は、パンデー（Ｐａｎｄｅｙ）ら（上述）によって記述されているように、適切な溶液に浸されラットの角膜に外科的に埋め込められた。
この研究での血管形成に対する刺激は、角膜の基質内に埋め込まれた３０μＭのＶＥＧＦを有するフィルターディスクの処理であった。埋め込んでから５日後の用量反応試験において、この用量はディスクの方向へ成長する角膜周囲の脈管叢から生じる再生産可能な新血管形成をもたらす。ＶＥＧＦの担体のみで処理されたフィルターディスクは、血管形成反応を示さない。ｓｉＮＡは３つの異なるｓｉＮＡ濃度においてディスク上でＶＥＧＦとともに投与された。ＶＥＧＦ受容体は刺激されないためｓｉＮＡは血管形成を抑制することができないということが、同時投与に関する問題の１つである。しかし、出願人は、低用量のＶＥＧＦで新生血管反応は、血管形成反応を維持するためにはＶＥＧＦ刺激が不可欠であるという通常示唆されていることに戻ることを認めた。抗ＶＥＧＦ−Ｒ ｍＲＮＡ ｓｉＮＡを同時投与することによるＶＥＧＦ受容体の生成阻止は、ＶＥＧＦ処理されたフィルターディスクによって誘発した正常な新血管形成を弱める可能性がある。
材料および方法
テスト化合物および制御
Ｒ＆Ｄシステム社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ＶＥＧＦ、８２ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ７５μＭで無担体、ｐＨ６．９
活性ｓｉＮＡ構造および逆位コントロール（表ＩＩＩ）
動物
ハーランスプラーグ−ドーリー系ラット、約２２５−２５０ｇ
雄４５、１群につき５匹
飼育
動物は２匹ずつの群で収容される。試料、水、温度、湿度は、１９９６年の実験動物の管理と使用に関する指針（ＮＲＣ）に従う薬理試験施設実施基準（ＳＯＰｓ）によって決定される。動物は、実験の少なくとも７日前から設備に馴化させられる。この間、動物の健康状態を全般的に観察し、歩哨動物の基本血清をとった。
実験群
各溶液（ＶＥＧＦおよびｓｉＮＡｓ）は、表ＩＩＩで記述される実験群で示される最終濃度の１Ｘ溶液として調製される。
ｓｉＮＡのアニーリング条件
ｓｉＮＡセンス鎖およびアンチセンス鎖は、１．６７ｍｇ／ｍＬ／鎖のＨ２Ｏで１分間アニールした後、３７℃で１時間インキュベートし、二重ｓｉＮＡ３．３４ｍｇ／ｍＬを生成する。２０μｇ／眼の処理において、３．３４ｍｇ／ｍｌ二本鎖６μＬが眼に注入される（下記参照）。それから３．３４ｍｇ／ｍｌ二本鎖ｓｉＮＡは、用量反応アッセイ用に連続的に希釈される。
ＶＥＧＦフィルダーディスクの調製
角膜の埋め込みに対して、孔径０．４５μｍのニトロセルロースのフィルター膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））で調製された直径０．５７ｍｍのニトロセルロースディスクは、氷上にある覆われたペトリ皿内で８２ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．９）中の７５μＭ ＶＥＧＦ１μＬに３０分間浸された。ＶＥＧＦ（８３ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ６．９）の担体のみに浸されたフィルダーディスクは、血管形成反応を誘発させない。
角膜手術
この研究で使用したラットの角膜モデルは、コッホ（Ｋｏｃｈ）ら（上述）およびパンデー（Ｐａｎｄｅｙ）ら（上述）からの改変である。つまり、角膜は０．５％ポビドンヨード液、次に生理食塩水および２滴の２％リドカインで洗浄した。解剖顕微鏡（ライカ（Ｌｅｉｃａ） ＭＺ−６）の下、基質ポケットが形成され、予浸されたフィルターディスク（上記参照）はその端が角膜輪部から１ｍｍとなるようにポケットへ挿入された。
テスト溶液の結膜内注入
ディスクを挿入した直後、４０〜５０μｍのＯＤ注射器（当方の研究所で作成）の先端をＶＥＧＦで浸したフィルターディスクのすぐ隣にある角膜輪部の端から１ｍｍ離れた結膜組織の中に挿入した。テスト溶液６００ナノリットル（ｓｉＮＡ、逆位コントロールまたは滅菌水の担体）をシリンジポンプ（ＫＤ サイエンティフィック社（Ｋｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用して、１．２μＬ／分の速度で投与した。注射器は除かれ、７０％エタノールおよび滅菌水で連続的にすすぎ、注入ごとに滅菌水につけた。テスト溶液が注入されたら、動物の総自発運動量が回復されるまで、微小動脈瘤クリップを使用してまぶたを閉じ、それを維持した。処理の後、動物を３７度の加温パッドの上で温めた。
血管形成反応の定量
ディスク埋め込みの５日後、動物はアトロピン０．４ｍｇ／ｋｇを投与して安楽死させ、角膜をデジタルで撮像した。新生血管の表面積（ＮＳＡ、ピクセル表示）を死後に電子化された形態計測（イメージプロプラス（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ）、メディアサイバーネティックス社（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）、ｖ２．０）を使用して血液が充満した角膜の血管で測定した。個体の平均ＮＳＡは、フィルターディスと角膜輪部の間にある最大新血管形成の面積が同一である３つの領域からの３枚綴りの複写用紙で決定された。これらの領域にある血液が充満した角膜の血管に対応するピクセル数が合計され、ＮＳＡ指数が作成された。そして群の平均ＮＳＡを計算した。各処理群のデータはＶＥＧＦ／ｓｉＮＡの担体処理されたコントロールＮＳＡに標準化し、最終的にＶＥＧＦ誘発血管形成の抑制度として表された。
統計
処理群の平均の規定度を決定した後、ＶＥＧＦ誘発血管形成の郡平均抑制度は一元配置分散分析にしたがった。この後有意性のために、ダネット検定（ＶＥＧＦコントロールとの比較）およびアルファ＝０．０５でテューキー−クレーマー検定（その他すべての郡平均比較）を含む２つの多重比較を行った。統計分析はＪＭＰ ｖ．３．１．６（ＳＡＳインスティテュートジャパン（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して行われた。
試験結果は、図２８および２９において図で表示される。図２８で示されるように、３段階の濃度でのＶＥＧＦＲ１部位４２２９活性ｓｉＮＡ（Ｓｉｒｎａ／ＲＰＩ２９６９５／２９６９９）は、逆位ｓｉＮＡコントロール（Ｓｉｒｎａ／ＲＰＩ２９９８３／２９９８４）およびＶＥＧＦコントロールに比べて、血管形成の抑制に効果があった。２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンと５’および３’末端逆位デオキシ脱塩基残基を持つリボプリンを有するセンス鎖、および２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンと末端３’−ホスホロチオエートインターヌクレオチド連鎖（Ｓｉｒｎａ／ＲＰＩ３０１９６／３０４１６）を持つリボプリンを有するアンチセンス鎖で構成する化学的に変性した種類のＶＥＧＦＲ１部位４２２９活性ｓｉＮＡは、同様の抑制を示した。さらに、各濃度での合致する化学的な逆位コントロールｓｉＮＡ構造（化合物番号３１２７６／３１２７９）とｓｉＮＡが投与されないＶＥＧＦコントロールとを比べて、「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応（化合物番号３１２７０／３１２７３）を有するＶＥＧＦＲ１部位３４９活性ｓｉＮＡは、３つの異なる濃度（用量反応２．０ｕｇ、１．０ｕｇ、０．１ｕｇ）でＶＥＧＦ誘発血管形成の抑制に関してテストした。図２９で示されるように、「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応（化合物番号３１２７０／３１２７３）を有する活性ｓｉＮＡ構造は、０．１ｕｇから２．０ｕｇの濃度での合致する化学的な逆位コントロールｓｉＮＡに比べて、ラットの角膜モデルにおけるＶＥＧＦ誘発血管形成の抑制効果が高かった。これらの結果によって、本発明で記述される変性など異なる化学的に変性した組成を有するｓｉＮＡ分子はインビボの血管形成を有意に抑制する能力があることが証明される。２つの異なるｓｉＮＡ安定化化学反応によってＶＥＧＦＲ１部位３４９に隣接する部位が効果に関して評価された次の試験の結果は、図３０に示される。
ＶＥＧＦ誘発血管形成のラット角膜モデルにおけるｓｉＮＡ分子標的相同ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２配列の評価
上記のモデルは、ＶＥＧＦ誘発の眼球血管形成の抑制におけるｓｉＮＡ分子標的相同ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２配列の効果を評価するために使用された。テスト化合物およびコントロールは、表ＶＩＩに参照され、配列は表ＩＩに示される。ｓｉＮＡｓまたはその他の被験物質は、ＶＥＧＦディスク埋め込みの後、結膜下注射によって投与された。ｓｉＮＡは投与前に前もってアニールした。結膜下注射は、ポリイミドでコーティングし溶融したシリカゲルカテーテル管（ＯＤ＝１４８μｍ、ＩＤ＝７４μｍ）を使用して行われた。この管は、火炎殺菌／茶色の微量ピペットプラー（モデルＰ−８７、サッターインストゥルメント社（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．））を使用してＯＤ約４０〜５０ミクロンの細かい点へ引かれたホウケイ酸ガラス製微量ピペットへ挿入された。微量ピペットは、埋め込まれたフィルターディスクの周辺にある角膜周囲の結膜へ挿入され、１．２μＬの量がハミルトンミ気密シリンジ（２５μＬ）およびシリンジポンプを使用して１５秒以上送達された。ラットの眼球は、眼球の周りのひげを切り取り、プロビドン−ヨードで洗浄した後、局所にリドカイン麻酔をして調整した。硝酸銀の棒で角膜の表面を触り、傷の治癒反応および同時に起こる新血管形成を誘発した。５日目に動物はケタミン／キシラジン／アセプロマジンを使用して麻酔し、血管の増殖の採点を行った。動物は、ＣＯ２の吸入によって安楽死させ、イメージプロプラス（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ）を使用して血管の増殖を計量するために各眼球のデジタル画像を得た。計量された新生血管の表面積は、アノバ（ＡＮＯＶＡ）によって分析した後、ダネット検定およびテューキー−クレーマー検定を含む９５％の信頼水準で有意性のために２つの多重比較を行った。結果はＶＥＧＦ誘発血管形成の抑制度として、ＶＥＧＦコントロールと比較して図３１に示される。図で示されるように、相同配列によるＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方（例えば、化合物番号３３７２５／３３７３１、３３７３７／３３７４３、３３７４２／３３７４８、３３７２９／３３７３５）を標的とするいくつかのｓｉＮＡ構造は、このモデルにおいてＶＥＧＦ誘発血管形成の抑制をもたらす。これらの化合物は、ＶＥＧＦＲ１のみを標的とするｓｉＮＡ構造（化合物番号３１２７０／３１２７３）と同様またはそれ以上の抑制を与えるために現れる。
マウス脈略膜新血管形成モデルにおけるｓｉＮＡ分子の評価
ｓｉＮＡの眼内投与
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（４〜５週齢）は、ケタミン／キシラジンの混合液（８：１）０．２ｍＬで麻酔をし、１％トロピカミド１滴で瞳孔を膨張させた。そして、５３２ｎｍのダイオードレーザー光凝固術（７５μｍスポットサイズ、持続時間０．１秒、１２０ｍＷ）で、手で握れるカバースリップをコンタクトレンズとして使用して、視神経を囲う各眼球に３つのレーザースポットを作成した。レーザースポットで形成された泡はブルッフ膜の破裂を示す。次に、レーザー処理の後１７日目に、レーザースポットをＣＮＶの存在に関して評価した。
マウスに複数のＣＮＶ損傷をレーザー誘導した後、ｓｉＮＡを解剖顕微鏡の下、眼内注入によって投与した。ハーバードポンプ微量注入器具および引き外しガラス製微量ピペットを使用して、眼内注入が行われた。各微量ピペットは、ｓｉＮＡ０．５ｕｇまたは１．５ｕｇ、逆位コントロールｓｉＮＡあるいは生理食塩水を含む担体１μＬを送達するために較正した。マウスに麻酔をかけて瞳孔を膨張させ、微量ピペットの鋭い先端を角膜輪部のすぐ後ろから硝子体腔にある強膜を通し、足踏みスイッチを押した。レーザー光凝固術の後７日目に注入が繰り返された。
死亡時に、マウスは麻酔され（ケタミン／キシラジン混合液、８：１）、フルオレセイン標識デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン、２００万平均分子量、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））５０ｍｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ１ｍｌを心臓にかん流させた。眼球は取り除かれ、１％リン酸緩衝の４％ホルマリンに一晩漬けた。角膜およびレンズは取り除かれ、感覚神経の網膜は慎重に洗眼用コップから解剖した。５つの切り込みが洗眼用コップの端から赤道へとつけられ、強膜・脈絡膜・網膜色素上皮（ＲＰＥ）の錯体は、強膜面を下にしてアクアマウント（Ａｑｕａｍｏｕｎｔ）のスライドグラス上に平らに載せた。平らに載せたものは、ニコン（Ｎｉｋｏｎ）の蛍光顕微鏡で検査した。緑色の血管があるレーザースポットはＣＮＶ陽性となり、緑色の血管が欠乏したレーザースポットはＣＮＶ陰性をなった。平らに載せたものは蛍光顕微鏡検査法（アキシオスコップ（ＡＸＩＯＳＫＯＰ）；カールツアイス株式会社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）、ソーンウッド（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ）、ＮＹ）で検査し、画像は３色電荷結合素子（ＣＣＤ）ビデオカメラおよびフレーム取込み器でデジタル化した。画像分析ソフトウェア（イメージプロプラス（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ）；メディアサイバーネティックス社（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）、シルバースプリング（Ｓｙｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ）、ＭＤ）を使用して、維管束の傷の合計に対応する、各熱傷に関連する超蛍光発光の合計面積を測定した。各眼球内の面積は平均化され、面積をプロットするために眼球ごとに１つの実験値を得た。
ＶＥＧＦＲ１発現の測定も、ＰＴ−ＰＣＲおよび／または即時応答のＰＣＲを使用して決定した。網膜ＲＮＡは、Ｒｎａイージー（Ｒｎａｅａｓｙ）キットで単離し、逆転写は総ＲＮＡ約０．５μｇ、逆転写酵素（スーパースクリプトＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ））および５．０μＭオリゴ−Ｄ（Ｔ）プライマーで行われた。ＰＣＲ増幅はＶＥＧＦＲ−１（５’−ＡＡＧＡＴＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡ−３’、配列識別番号：４２５３）および（５’−ＧＧＣＴＣＧＧＣＡＣＣＴＡＴＡＧＡＣＡ−３’、配列識別番号：４２５４）専用のプライマーを使用して行われた。滴定はＰＣＲ反応が増幅の線上の範囲で行われることを確実にするために決定された。マウスＳ１６リボソームタンパク質プライマー（５’−ＣＡＣＴＧＣＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＧ−３’、配列識別番号：４２５５および５’−ＴＧＡＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＣＧＧＡＴＧＧ−３’、配列識別番号：４２５６）は、ＰＣＲ反応の鋳型の量に内部コントロールを与えるために使用された。
「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応（化合物番号３１２７０／３１２７３、表ＩＩＩ）を有するＶＥＧＦＲ１部位３４９活性ｓｉＮＡは、合致する化学的な１．５ｕｇ逆位コントロールｓｉＮＡ構造（化合物番号３１２７６／３１２７９、表ＩＩＩ）および生理食塩水コントロールと比べて、２つの異なる濃度（用量反応１．５ｕｇおよび０．５ｕｇ）でＶＥＧＦ誘発新血管形成の抑制のためのテストを行った。図３２で示されるように、「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応を有する活性ｓｉＮＡ構造は、合致する化学的な逆位コントロールｓｉＮＡと比べて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼内送達モデルにおけるＶＥＧＦＲ１誘発新血管形成（５７％抑制）の抑制における効果が高かった。活性ｓｉＮＡ構造もまた、生理食塩水コントロールに比べて、ＶＥＧＦＲ１誘発新血管形成（６６％抑制）の抑制における効果が高かった。さらに、「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応（化合物番号３１２７０／３１２７３、表ＩＩＩ）を有するＶＥＧＦＲ１部位３４９ｓｉＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析は、逆位ｓｉＮＡ構造（化合物番号３１２７６／３１２７９、表ＩＩＩ）および生理食塩水と比べて、ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡのレベルで有意な減少を示した。さらに、上記の活性ｓｉＮＡおよび逆位コントロールｓｉＮＡを使用したＶＥＧＦＲ１タンパク質のＥＬＩＳＡ分析は、不活性ｓｉＮＡ構造と比べて、活性ｓｉＮＡを使用したＶＥＧＦＲ１タンパク質発現のレベルで有意な減少を示した。これらの結果は、本明細書に記載の修飾等、異なる化学的に修飾された組成を有するｓｉＮＡ分子が、眼内投与のこのモデルで示されるように、新血管形成を有意に抑制する能力を有することを証明するものである。
ｓｉＮＡの眼周囲投与
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（４〜５週齢）は、ケタミン／キシラジンの混合液（８：１）０．２ｍＬで麻酔をし、１％トロピカミド１滴で瞳孔を膨張させた。そして、５３２ｎｍのダイオードレーザー光凝固術（７５μｍスポットサイズ、持続時間０．１秒、１２０ｍＷ）で、ハンドヘルド型のカバースリップをコンタクトレンズとして使用し、視神経を囲う各眼球に３つのレーザースポットを作成した。レーザースポットで形成された泡はブルッフ膜の破裂を示す。次に、レーザー処理の後１７日目に、レーザースポットはＣＮＶの存在に関して評価された。
マウスに複数のＣＮＶ損傷をレーザー誘導した後、ｓｉＮＡを解剖顕微鏡の下、眼周囲注入によって投与した。ハーバードポンプ微量注入器具および引き外しガラス製微量ピペットを使用して眼周囲注入が行われた。各微量ピペットは、ｓｉＮＡ０．５ｕｇまたは１．５ｕｇの濃度でテストｓｉＮＡを含有する担体５μＬを送達するために較正された。マウスに麻酔をかけて瞳孔を膨張させ、微量ピペットの鋭い先端を通し、足踏みスイッチを押した。眼周囲注入は、１日目から１４日までレーザー光凝固術後に毎日行われた。代替として、眼周囲注入はブルッフ膜の破裂後３日おきに行われた。
死亡時に、マウスは麻酔され（ケタミン／キシラジン混合液、８：１）、フルオレセイン標識デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン、２００万平均分子量、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））５０ｍｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ１ｍｌを心臓にかん流させた。眼球は取り除かれ、１％リン酸緩衝の４％ホルマリンに一晩漬けた。角膜およびレンズは取り除かれ、感覚神経の網膜は慎重に洗眼用コップから解剖した。５つの切り込みが洗眼用コップの端から赤道へとつけられ、強膜・脈絡膜・網膜色素上皮（ＲＰＥ）の錯体は、強膜面を下にして、アクアマウント（Ａｑｕａｍｏｕｎｔ）のスライドグラス上に平らに載せた。平らに載せたものは、ニコン（Ｎｉｋｏｎ）の蛍光顕微鏡で検査した。緑色の血管があるレーザースポットはＣＮＶ陽性となり、緑色の血管が欠乏したレーザースポットはＣＮＶ陰性をなった。平らに載せたものは蛍光顕微鏡検査法（アキシオスコップ（ＡＸＩＯＳＫＯＰ）；カールツアイス株式会社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）、ソーンウッド（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ）、ＮＹ）で検査し、画像は３色電荷結合素子（ＣＣＤ）ビデオカメラおよびフレーム取込み器でデジタル化した。画像分析ソフトウェア（イメージプロプラス（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ）；メディアサイバーネティックス社（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）、シルバースプリング（Ｓｙｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ）、ＭＤ）を使用して、維管束の傷の合計に対応する、各熱傷に関連する超蛍光発光の合計面積を測定した。各眼球内の面積は平均化され、眼球ごとに１つの実験値を得た。
「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応（化合物番号３１２７０／３１２７３、表ＩＩＩ）を有するＶＥＧＦＲ１部位３４９活性ｓｉＮＡは、合致する化学的な生理食塩水コントロールおよび０．５ｕｇ逆位コントロールｓｉＮＡ構造（化合物番号３１２７６／３１２７９、表ＩＩＩ）と比べて、２つの異なる濃度（用量反応１．５ｕｇおよび０．５ｕｇ）でＶＥＧＦ誘発新血管形成の抑制のためのテストを行った。図３３で示されるように、「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応（化合物番号３１２７０／３１２７３）を有する活性ｓｉＮＡ構造は、合致する化学的な逆位コントロールｓｉＮＡと比べて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼周囲の送達モデルにおけるＶＥＧＦＲ１誘発新血管形成（２０％抑制）の抑制において効果があった。活性ｓｉＮＡ構造は、生理食塩水コントロールと比べて、ＶＥＧＦＲ１誘発新血管形成（５４％抑制）の抑制においても効果が高かった。図３４で示される追加分析において、２つの濃度で「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応（化合物番号３１２７０／３１２７３）を有するＶＥＧＦＲ１部位３４９活性化ｓｉＮＡは、逆位ｓｉＮＡコントロールおよび生理食塩水コントロールと比べて、ＣＮＶ病変において新血管形成の抑制において効果があった。図３４で示されるように、「Ｓｔａｂ９／１０」化学反応（化合物番号３１２７０／３１２７３）を有する活性ｓｉＮＡ構造は、合致する化学的な逆位コントロールｓｉＮＡと比べて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼周囲の送達モデルにおけるＶＥＧＦＲ１誘発新血管形成（４３％抑制）の抑制において効果がある。活性ｓｉＮＡ構造は、ブルッフ膜の破裂後３日おきに行われた眼周囲注入での生理食塩水コントロールと比べて、ＶＥＧＦＲ１誘発新血管形成（４５％抑制）の抑制においても効果があった（図３５参照）。これらの結果は、本明細書に記載の修飾等、異なる化学的に修飾された組成を有するｓｉＮＡ分子が、眼周囲投与のこのモデルで示されるように、新血管形成を有意に抑制する能力を有することを証明するものである。
早熟モデルのマウス網膜症におけるｓｉＮＡ分子の評価
以下の手順は、早熟モデルの酸素誘発虚血性網膜症／網膜症におけるｓｉＮＡ分子標的ＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡを評価するために使用された。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの子供を、Ｐ７（生後７日）に７５％酸素（ＲＯＰ）雰囲気へ置いた。母親はＰ１０で敏速に変更した。マウスはＰ１２で７５％酸素部屋から移された。子供は、７５％酸素雰囲気から移された３時間後、Ｐ１２で投与された。ｓｉＮＡは解剖顕微鏡の下、硝子体内または眼周囲注入によって送達された。ハーバードポンプ微量注入器具および引き外しガラス製微量ピペットを注入に使用した。各微量ピペットはテストｓｉＮＡを含む担体１μＬを送達するために較正された。マウスに麻酔をかけて瞳孔を膨張させ、微量ピペットの鋭い先端を角膜輪部に通し、微量注入器具の足踏みスイッチを押した。マウスは、高酸素濃度環境から移されてから３日後に、Ｐ１５でＲＮＡ用に頸椎脱臼およびタンパク質抽出によって死亡させた。網膜は取り除かれ、適切なリーシス緩衝液に入れられた（タンパク質およびＲＮＡ分析方法に関して下記を参照）。
タンパク質解析：タンパク質溶解緩衝液に５０μＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０μＬの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、５０μＬの１００ｎＭ ＰＨＳＦ（フェニルメタンスルホニル）および５ｍＬの滅菌脱イオン化水を含ませた。２００μＬの溶解緩衝液を新鮮組織に加え、ピペットを用いてホモジナイズした。組織を４℃で２５分間、超音波分解し、４℃、１３Ｋで５分間回転させた。ペレットを廃棄し、上澄みを新しい試験管に移した。バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）アッセイを使用し、ＢＳＡを標準として用い、タンパク質濃度を測定した。試料を−８０℃で保存した。血液内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）１およびＲ＆Ｄシステム社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＲ２キットを使用して酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を実行した（クオンティカイン（登録商標）（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）免疫学的検定）。本マニュアルのプロトコルに厳密に従った。
ＲＮＡ解析：キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）ＲＮイージーミニキットおよび動物細胞からの抽出に関する以下のプロトコルを使用して、ＲＮＡを抽出した。アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）が企業プロトコルに従いＲＮＡ試料をＤＮＡ−ｆｒｅｅ（ＴＭ）で処理した。次いで、ＲＴ−ＰＣＲ用のインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）スーパースクリプトファーストストランドシステム（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を用い、以下のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲのためにファーストストランド（Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ）ｃＤＮＡを合成した。次に、ファストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーン（Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）Ｉを使用してロッシュライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）でリアルタイムＰＣＲを実行した。サイクロフィリンＡを対照として使用し、精製したＰＣＲ産物を標準として使用した。
新血管形成の解析：マウスを頚椎脱臼によりＰ１７で死亡させた。眼球を除去してＯＣＴで新鮮凍結し、−８０℃で保存した。次に眼球を切断し、レクチンを用いた免疫組織化学的染色を行った。１０μｍの凍結した眼球切断部分を、選択的に内皮細胞へ結合するビオチン化グリフォニアシンプリキフォリアレクチンＢ４（ＧＳＡ；ベクターラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリンゲーム、カリフォルニア）を用いて組織学的に染色した。スライドを乾燥し、４％ＰＦＡに２０分間固定し、次いでメタノール／Ｈ２Ｏ２中、室温で１０分間インキュベートした。０．０５Ｍトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．６（ＴＢＳ）で洗浄後、１０％ブタ血清を用いてスライドを３０分間遮断した。まずビオチン化ＧＳＡを用いてスライドを室温で２時間染色し、続いて０．０５Ｍ ＴＢＳで完全に洗浄した。スライドをアルカリホスファターゼ（ベクターラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））とカップリングしたアビジンで、室温で４５分間さらに染色した。スライドを赤色染色（ヒストマークレッド（Ｈｉｓｔｏｍａｒｋ Ｒｅｄ）、キルケゴール アンド ペリー社（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）、ゲーサーズバーグ、メリーランド）でインキュベートすると、赤色の反応産物が得られる。コンピュータおよびイメージ解析ソフトウェア（イメージプロプラスソフトウェア（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）、メディアサイバーネティクス社（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）、シルバースプリング、メリーランド）を使用して網膜上のＧＳＡ染色細胞を定量化し、その領域を測定した。各眼球につき１５回の測定の平均を一実験値として使用した。
代表的な研究結果を図３６および３７に示す。図３６に示すように、酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）のマウスにおいて、ＶＥＧＦＲ１ｓｉＮＡ（３１２７０／３１２７３）をＰ１２、Ｐ１４、およびＰ１６上に眼周囲注射（５μｌ；１．５μｇ／μｌ）することで、合致した化学的な逆位コントロールｓｉＮＡ構造（３１２７６／３１２７９）を注射した場合と比較して、ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ発現が著しく減少した（４０％抑制；ｎ＝９、ｐ＝０．０１２１）。図３７に示すように、酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）のマウスにおいて、ＶＥＧＦＲ１ｓｉＮＡ（３１２７０／３１２７３）を眼内注射（５μｌ）することで、合致した化学的な逆位コントロールｓｉＮＡ構造（３１２７６／３１２７９）を注射した場合と比較して、ＶＥＧＦＲ１タンパク質レベルが著しく減少した（３０％抑制；ｎ＝７、ｐ＝０．０１０３）。
マウス４Ｔ１ルシフェラーゼ乳癌同系腫瘍モデルの評価
本研究は、ＶＥＧＦＲ−１に向けられた全身投与されるｓｉＲＮＡが皮下腫瘍の成長を抑制するか否かを判断するようにデザインされた。試験化合物は、ＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡの３４９位を標的とする活性Ｓｔａｂ９／１０ｓｉＮＡ（化合物番号３１２７０／３１２７３）、合致した化学的な不活性逆位コントロールｓｉＮＡ（化合物番号３１２７６／３１２７９）、および生理食塩水を含むものであった。対象動物は、約２０−２５ｇ（生後５−７週間）の雌のバルブ／Ｃ（Ｂａｌｂ／ｃ）マウスとした。試験した対象は４０匹のマウスであったが、その治療群を表ＶＩに示す。マウスは４匹ずつの群に分けて飼育した。餌、水、温度および湿度の条件は１９９６年実験動物に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ） （ＮＲＣ）を踏まえた薬理学試験機関（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）実施基準（ＳＯＰ’ｓ）に従った。動物を実験前少なくとも３日間、施設に順応させた。この間、動物の健康状態を全般的に観察し、歩哨動物の基本血清をとった。４Ｔ１−ルシフェラーゼ乳癌腫瘍細胞を、この研究で動物への注射を使用するまで細胞培養しつづけた。研究０日目、ケタミン／キシラジンで動物に麻酔をかけ、１００μｌの注射量中１．０×１０６細胞を右側に皮下接種した。マイクロキャリパーを使用して初期腫瘍量を測定した。全長および全幅の測定は、接種３日後から始め接種２１日後まで各腫瘍３ｘ／週（Ｍ，Ｗ，Ｆ）から得られた。以下の等式に従い、全長／全幅から腫瘍量を計算した。腫瘍量＝（ａ）（ｂ）２／２ここでａ＝腫瘍の長軸であり、ｂ＝腫瘍の短軸である。投薬前３日間、腫瘍を成長させておいた。投薬は、１８日間毎日行う実験化合物の静脈内尾静脈注射からなる。２１日目、動物は、試験化合物の最終投薬後２４時間、または動物が瀕死の兆候（体重減少、嗜眠、身づくろい行動の欠如等）を見せ始めた際に、ＣＯ２吸入を使用して安楽死させ、続いて肺を除去した。２５Ｘ倍率のライツ（Ｌｅｉｔｚ）解剖顕微鏡で肺転移が確認された。免疫組織化学的エンドポイントまたはｍＲＮＡレベルの解析のため、腫瘍を除去しＬＮ２で急速冷凍した。結果を図３８に示す。図に示されるように、活性ｓｉＮＡ構造は腫瘍の成長を不活性コントロールｓｉＮＡ構造と比較して５０％抑制した。
加えて、活性および逆位コントロールｓｉＮＡ構造で処理したマウスにおける血漿中の可溶ＶＥＧＦＲ１レベルの評価を行った。図３９は、合致した化学的な不活性逆位コントロールｓｉＮＡ（化合物番号３１２７６／３１２７９）と比較して、ＶＥＧＦＲ１ ＲＮＡの３４９位を標的とする活性Ｓｔａｂ９／１０ｓｉＮＡ（化合物番号３１２７０／３１２７３）を使用したマウス４Ｔ１ルシフェラーゼ乳癌同系腫瘍モデルにおける可溶ＶＥＧＦＲ１血清レベルの減少を示す。図３９に示すように、このモデルにおいて活性ｓｉＮＡ構造は可溶ＶＥＧＦＲ１血清レベルの低減に有効である。
ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ発現の多機能ｓｉＮＡ抑制
多機能ｓｉＮＡのデザイン
一度、多機能ｓｉＮＡ構造のための標的部位が特定されると、ｓｉＮＡのそれぞれの鎖は、例えば、約１８と約２８ヌクレオチドの間で異なる標的核酸配列に相補的である、相補領域の範囲がデザインされる。それぞれの相補領域は、約４から約２２ヌクレオチドの標的配列に相補的でないが、その他の配列の相補領域に相補を含む、直近の隣接領域と共にデザインされる（例として、図１６を参照）。ヘアピン構造も同様にデザインすることができる（例として、図１７を参照）。異なる標的核酸配列と共通の相補、パリンドローム、または反復配列は、多機能ｓｉＮＡ構造全体の長さの短縮に用いることができる（例として、図１８と１９を参照）。
限定を目的としない例において、多機能ｓｉＮＡは２つの個別の核酸配列を標的とするようデザインされた。目標は、２つの異なるｓｉＮＡを一緒にして、２つの異なる標的に対して活性の１つのｓｉＮＡにすることである。ｓｉＮＡは、それぞれの鎖の５’が、下に斜体で示されたような２つのｓｉＲＮＡの１つの「アンチセンス」配列で始まるように結合された。
３’ＴＴＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＣＧＵＡＡＧＵＧＵ ＧＧＵＡＣＧＡＣＣＵＧＡＣＧＡＣＣＧＵ５’ 配列識別番号４２５７
５’ＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＣ ＣＡＵＧＣＵＧＧＡＣＵＧＣＵＧＧＣＡＴＴ３’配列識別番号４２５８
ＲＩＳＣは、２つの鎖をいずれも５’端から取り込むと予想される。つまり、それぞれの鎖を運ぶ二種類の活性ＲＩＳＣの集団があることになる。それぞれの鎖の５’の１９ｎｔは、個別の標的配列の分解におけるガイド配列として作用する。
別の態様においては、多機能ｓｉＮＡ分子のサイズは、重複を見つける、または個別のｓｉＮＡの長さを切り詰める、のいずれかによって短縮される。以下に述べられる例は、任意の第一の標的配列に対して、第二の標的配列中の共通の相補配列が見つかり得るということを示している。
一方とは独立に生成された、二つの長い配列の間に生じると期待される、数多くの短いポリヌクレオチド配列（例えば、１４ヌクレオチド未満）の自然発生的な一致が検証された。均一なランダム発生プログラムＳＡＳ Ｖ８．１を用いたシミュレーションが、｛ＡＣＧＵ｝の文字の繰り返しで生成される４，０００文字の文字列に利用された。この配列は、次にＳ１を位置（１，２．．．ｎ）から、Ｓ２を位置（２，３．．．，ｎ＋ｌ）から、Ｓ４０００−ｎ＋ｌを位置（４０００−ｎ＋１，．．．，４０００）から、配列を完全に最後のセットまでとることによって作られた、ほぼ４０００の重複した組に切断された。この過程は第二の４０００文字の文字列で繰り返された。（サイズｎの）同一のセットの存在が、二つの文字列の間の配列の同一性が、分類および一致−結合ルーチンによって照合された。この過程は９−１１文字のセットで繰り返された。結果は、長さｎ＝９文字で平均５５の一致配列（３９から７２の範囲）、サイズｎ＝１０で１３の共通セット（６から１８の範囲）、および１１文字の平均で４つ（０から６の範囲）の一致、であった。４０００の選択の最初の文字列の長さは、両方のＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２のコード領域のおよその長さである。この単純なシミュレーションは、他方とは独立に生成された任意の二つの長いコード領域が、多機能ｓｉＮＡ構造の長さを短縮するのに用いることができる、短い共通配列を持つということを示唆している。この例において、サイズが９の共通配列は、偶然だけで＞１％の確率で生じた。
以下は、各鎖が１４ｎｔの自己相補領域（下線）を含む２４ｎｔの合計長を有するＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２を標的とする多機能ｓｉＮＡ構造の例である。ＶＥＧＦＲ１を標的とするｓｉＮＡ‘１’およびＶＥＧＦＲ２を標的とするｓｉＮＡ‘２’の各アンチセンス領域（相補領域は斜体で表示）を使用する。
ｓｉＮＡ‘１’
５’ＣＡＡＵＵＡＧＡＧＵＧＧＣＡＧＵＧＡＧ（配列識別番号４２５９）
３’ＧＵＵＡＡＵＣＵＣＡＣＣＧＵＣＡＣＵＣ（配列識別番号４２６０）
ｓｉＮＡ‘２’
ＡＧＡＧＵＧＧＣＡＧＵＧＡＧＣＡＡＡＧ５’（配列識別番号４２６１）
ＵＣＵＣＡＣＣＧＵＣＡＣＵＣＧＵＵＵＣ３’（配列識別番号４２６２）
多機能ｓｉＮＡ
ＣＡＡＵＵＡＧＡＧＵＧＧＣＡＧＵＧＡＧＣＡＡＡＧ（配列識別番号４２６３）
ＧＵＵＡＡＵＣＵＣＡＣＣＧＵＣＡＣＵＣＧＵＵＵＣ（配列識別番号４２６４）
別の態様においては、多機能ｓｉＮＡの長さは、各標的配列に対する配列相同性のより少ない塩基対が効果的なＲＮＡｉ作用に対する耐性を持ち得るか否かを判断することにより短縮される。耐性を持ち得る場合、多機能ｓｉＮＡの全体の長さを以下に示すように短縮することができる。以下の仮説的実施例において、４つのヌクレオチド（太字）は、それぞれ１９ヌクレオチドのｓｉＮＡ‘１’およびｓｉＮＡ‘２’構造から短縮される。その結果として生じる多機能ｓｉＮＡは、３０塩基対の長さである。
ｓｉＮＡ‘１’
５’ＣＡＡＵＵＡＧＡＧＵＧＧＣＡＧＵＧＡＧ（配列識別番号４２５９）
３’ＧＵＵＡＡＵＣＵＣＡＣＣＧＵＣＡＣＵＣ（配列識別番号４２６０）
ｓｉＮＡ‘２’
ＡＧＡＧＵＧＧＣＡＧＵＧＡＧＣＡＡＡＧ５’（配列識別番号４２６１）
ＵＣＵＣＡＣＣＧＵＣＡＣＵＣＧＵＵＵＣ３’（配列識別番号４２６２）
多機能ｓｉＮＡ
ＣＡＡＵＵＡＧＡＧＵＧＧＣＡＧＵＧＧＧＡＧＵＧＡＧＣＡＡＡＧ（配列識別番号４２６５）
ＧＵＵＡＡＵＣＵＣＡＣＣＧＵＣＡＣＣＧＵＣＡＣＵＣＧＵＵＵＣ（配列識別番号４２６６）
二重レポータープラスミドシステムにおけるＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ ＲＮＡを標的とする多機能ｓｉＮＡ構造
ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ ＲＮＡ標的をターゲティングする多機能ｓｉＮＡ構造の評価に使用される二重レポーターアッセイは、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含む二重レポータープラスミド（ｐｓｉＣＨＥＣＫ−ＩＩ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）を使用する。興味のある配列（ｓｉＮＡの標的ＲＮＡ）をウミシイタケルシフェラーゼ終止コドンの下流でクローニングする。ウミシイタケルシフェラーゼ活性の欠如は、多機能ｓｉＮＡによるメッセージ分解に直接関連する。ホタルルシフェラーゼ活性はトランスフェクションコントロールとして使用される。
多機能ｓｉＮＡ作用の細胞培養解析
９６ウェルプレート、３７℃、５％ＣＯ２にて、７０−８０％密集度に対して１０％の胎孔血清を含む７５μｌのイスコヴ（Ｉｓｃｏｖｅ）溶液中で成長したＨｅＬａ細胞におけるＲＮＡｉ作用を評価した。１７５．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ（ギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、２μｌのリポフェクタミン２０００（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））および５０ｎｇ／μｌで適切な標的ＲＮＡ配列を含む１０μｌのｓｉＣＨＥＣＫ（ＴＭ）−２プラスミド（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））で構成されるトランスフェクション混合物をマイクロタイタープレートにおいて調整した。１２．５μｌのｓｉＲＮＡ（１μＭ）溶液を前記混合物に加えて、ｓｉＲＮＡ濃度を６２．５ｎＭにする。前記トランスフェクション混合物を２０−３０分間２５℃で培養した。次に５０μｌの前記トランスフェクション混合物をＨｅＬａ細胞を含む７５μｌの媒体に加えて、最終ｓｉＲＮＡ濃度を２５ｎＭにする。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２０時間培養した。
遺伝子ノックダウンの定量
９６ウェルプレート様式で行われた実験に対する製造者の指示に従って、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼルミネセンスを計測した。典型的な手順では、２０時間のトランスフェクション後、５０μｌの媒体を培養物から取り除き、７５μｌのデュアル・グロー・ルシフェラーゼ（Ｄｕａｌ Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）試薬を加えて、室温で１０分間やさしく揺らす。ホタルルミネセンスを９６ウェルプレートリーダーで測定した。次に、７５μｌの新たに調整したデュアル・グロー・ストップ・アンド・グロー（Ｄｕａｌ Ｇｌｏ Ｓｔｏｐ ａｎｄ Ｇｌｏｗ）試薬を加えて、プレートをさらに１０分間室温でやさしく揺らした。ウミシイタケルミネセンスを９６ウェルプレートリーダーで測定した。ホタルルミネセンスとウミシイタケルミンセンスの比率は、サイレンシング作用の標準化した値を提供する。結果を図４０−４２に示す。図４０は、ＲＮＡベースの多機能ｓｉＮＡが媒介する（Ａ）ＶＥＧＦ、（Ｂ）ＶＥＧＦＲ１、および（Ｃ）ＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡの抑制を示す。図４１は、安定した多機能ｓｉＮＡが媒介する（Ａ）ＶＥＧＦ、（Ｂ）ＶＥＧＦＲ１、および（Ｃ）ＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡの抑制を示す。図４２は、非ヌクレオチド連結多機能ｓｉＮＡが媒介するＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２ ＲＮＡの抑制を示す。これらのデータは、各部位を標的とする個別のｓｉＮＡ構造として複数部位を標的とすることにより、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ ＲＮＡ発現の抑制において、多機能ｓｉＮＡ構造が同様に効果的であることを示す。
その他の多機能ｓｉＮＡデザイン
単一ｓｉＮＡ分子が複数の標的をサイレンシングできるような３種類の更なる多機能ｓｉＮＡデザインが提示される。第一の方法は、ｓｉＮＡ（または多機能ｓｉＮＡ）を直接結合するためのリンカーを利用する。この方法で、干渉反応を誘因する見込みのある長い連続したＲＮＡを作ること無しに、多くの強力なｓｉＮＡを結合できるようになる。第二の方法は、重複している、または結合された多機能デザインのデンドリマー状の伸長であるか、あるいは、それに代わる超分子形式でのｓｉＮＡの編成である。第三の方法は、長さが３０塩基対以上のらせんを用いる。これらのｓｉＮＡのダイサーによる作用で、新しい、活性型の５’アンチセンス端を露呈する。従って、長いｓｉＮＡは、本来の５’端で規定される部位と、ダイサー作用によって作られた新しい末端によって規定される部位とを標的にすることができる。従来型の多機能ｓｉＮＡ（センスおよびアンチセンス鎖がそれぞれ標的を規定する）との併用で用いた場合、このアプローチは例えば４つかそれ以上の部位を標的とするように用いることができる。
Ｉ．テザー二機能ｓｉＮＡ
基本的なアイディアは、二つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖が単一のセンス鎖にアニールされた、多機能ｓｉＮＡのデザインへの新しいアプローチである。センス鎖オリゴヌクレオチドは、リンカー（例えば、本申請で述べられた非ヌクレオチドリンカー）と、アンチセンスｓｉＮＡ鎖にアニールする二つの断片を含む（図４３参照）。リンカーは、ヌクレオチドに基づくリンカーを含むことができる。いくつかの見込みのある利点と、このアプローチのバリエーションは以下を含むが、それに限定しない
１．前記の二つのアンチセンスｓｉＮＡは独立している。従って、標的部位の選択は、二つの部位の間の保存配列のための要求によって制約されない。任意の二つの高度に活性なｓｉＮＡは、多機能ｓｉＮＡを形成するために組み合わされることができる。
２．相同性、二つの遺伝子（例えば、異なるＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ株）に存在する配列を標的とするｓｉＮＡを有する標的部位の組み合わせが用いられた場合、そのデザインは二つ以上の部位を標的とするように利用することができる。例えば単一の多機能ｓｉＮＡは、２つの異なるＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ ＲＮＡ（二つのＲＮＡの間の保存配列を標的とする多機能ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖を用いる）および宿主ＲＮＡ（宿主ＲＮＡを標的とする多機能ｓｉＮＡの第ニアンチセンス鎖を用いる（例、Ｌａ抗原またはＦＡＳ）のＲＮＡを標的にするために利用できる。このアプローチによって、２以上のＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ株、および１つ以上の宿主ＲＮＡを、単一の多機能ｓｉＮＡを用いて標的とすることができるようになる。
３．遺伝子を標的とするために、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を用いる多機能ｓｉＮＡは、テザー多機能デザインに組込むこともできる。このことは、単一の複合体で６４以上の部位を標的とする可能性を残している。
４．２つ以上のアンチセンス鎖ｓｉＮＡを、単一のテザーセンス鎖にアニールすることができ得る。
５．このデザインは、長く続くｄｓＲＮＡを回避する。従って、インターフェロン反応を起こしにくい。
６．リンカー（または、本申請で述べられたコンジュゲートのように、それに結合した修飾）は、複合体の薬物動態学特性を向上させる、またはリポソームへの組み込みを向上させることができる。リンカーに導入された修飾は、直接ｓｉＮＡに結合された場合と同一程度には、ｓｉＮＡ活性に影響を与えないはずである（例として、図４９および５０を参照）。
７．センス鎖は、コンジュゲートの結合部位をさらに提供するために、アニールされたアンチセンス鎖を越えて延長できる。
８．複合体の極性は、両方のアンチセンスの３端がリンカーと近隣するように、および、５鋳端がリンカーと離れているように、またはその組み合わせになるように、切り替えることができる。
デンドリマーおよび超分子ｓｉＮＡ
デンドリマーｓｉＮＡアプローチにおいて、ｓｉＮＡの合成は、最初にデンドリマーの鋳型を合成することから始め、次いで様々な機能的ｓｉＮＡが結合される。様々な構造が図４４に描かれている。結合できる機能的ｓｉＮＡの数は、用いられるデンドリマーのサイズによってのみ限定される。
多機能ｓｉＮＡへの超分子アプローチ
超分子形式は、デンドリマー合成の難問を単純化する。この形式において、ｓｉＮＡ鎖は標準的なＲＮＡ化学反応によって合成され、次いで様々な相補鎖がアニーリングされる。個々の鎖の合成は、１つのｓｉＮＡの５’端にアンチセンス、センス配列を含み、ヘクサエチレングリコールのような、核酸または合成リンカーが続き、今度はほかのｓｉＮＡのセンス鎖が５’から３’方向に他のｓｉＮＡのセンス鎖が続く。従って、ｓｉＮＡ鎖の合成は、標準的な３’から５’の方向で行える。代表的な三機能、または四機能のｓｉＮＡの例は、図４５に描かれている。類似の原理に基づいて、様々な鎖のアニーリング効率が達成される限り、より多機能なｓｉＮＡ構造をデザインすることができる。
ダイサー作用可能な多機能ｓｉＮＡ
多標的の生物情報学的解析を用いて、異なる標的配列の間で共有される同一配列が、約２から約１４ヌクレオチド長の範囲で同定されることができる。これらの同一領域は、ダイサーによる作用が二次機能的な５’−アンチセンス部位を露呈するように、延長されたｓｉＮＡらせん（例えば、＞３０塩基対）の中にデザインされることができる（例えば図４６参照）。例えば、最初のｓｉＮＡアンチセンス鎖の１７ヌクレオチド（例、３ＴＴ突出を有する二重鎖中の２１ヌクレオチド鎖）が標的ＲＮＡに相補的である場合、強いサイレンシングが２５ｎＭで観察された。’８０％サイレンシングが、同一形式での僅か１６ヌクレオチド相補で観察された（図４８参照）。
約３０から４０以上の塩基対のｓｉＮＡデザインへのこの特性の組み込みの結果、更なる多機能ｓｉＮＡ構造が生じる。図４６の例は、ダイサー−リボヌクレアーゼＩＩＩによる処理の後、いかにして３０塩基対の二重鎖が３つの異なる配列を標的にできるかを図解している。つまりこれらの配列は、ウイルスと宿主因子のメッセージのような、同一ｍＲＮＡ上、または別のＲＮＡ上、あるいは所定の経路に沿った複数のポイント（例えば、炎症カスケード）に、存在できる。更に、４０塩基対の二重鎖は、４つの標的配列を標的とする単一の二重鎖を提供するために、二機能デザインを直列に組み合わせることができる。更により広範なアプローチは、５つまたは６つの標的を一つの多機能二重鎖でサイレンスするための相同性配列（例えば、ＶＥＧＦＲ−１／ＶＥＧＦＲ−２）を含むことができる。図４６の例は、この達成方法を示している。３０塩基対二重鎖は、ダイサーによってどちらかの端から２２および８塩基対産物に切断される（８塩基対断片は示されていない）。提示を容易にするため、ダイサーによって作られた突出は示されないが、補うことができる。３つの標的配列が示される。重複した必要な配列の同一性は、灰色の四角で示される。親の３０塩基対のｓｉＮＡのＮは、２’−ＯＨ位置の推奨部位であり、もしこの化学反応の安定性がテストされたのであれば、ダイサー切断を可能にする。なお、ダイサー−リボヌクレアーゼＩＩＩによる３０塩基長二重鎖の作用は、正確な２２＋８には切断しないが、むしろ一連の非常に関連した産物（原発部位では２２＋８）を産生する。従って、ダイサーによる作用は一連の活性ｓｉＮＡを生じる。別の限定を目的としない例を、図４７に示す。４０塩基対の二重鎖は、ダイサーによってどちらかの端から２０塩基対の産物に切断される。提示を容易にするため、ダイサーによって作られた突出は示されないが、補うことができる。４つの標的配列は、青、水色、赤、オレンジの４色で示されている。重複した必要な配列の同一性は、灰色の四角で示される。このデザイン形式は、より大きなＲＮＡに拡大できる。化学的に安定したｓｉＮＡがダイサーによって結合した場合、計画的に配置されたリボヌクレオチド結合は、我々の、さらに広範囲な多機能的デザインのレパートリーをもたらす、意図的に作られた切断産物を可能にすることができる。例えば、約２２ヌクレオチドのダイサー標準に限定されない切断産物により、標的配列が同一の多機能ｓｉＮＡ構造が、例えば、約３から約１５ヌクレオチドの範囲で重複できるようになる。
このアプローチの別の重要な側面は、そのエスケープ変異を制限する能力である。内部標的部位を露出する過程によって、アンチセンス５’端の８ヌクレオチドに相補的なエスケープ変異が、確実にｓｉＮＡの効果を減少させないようにできる。約１７ヌクレオチドの相補がＲＩＳＣに媒介される標的切断に必要な場合、これによって例えば、８／１７または４７％で起こり得るエスケープ変異が制限されるだろう。
実施例１２
適応症
ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲリサーチにおける現在の一連の知識は、リサーチや、診断、および治療に使用するために、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ活性を試験する方法、およびＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ発現を制御することのできる化合物の必要を示唆している。本請求で述べた通り、本発明の核酸分子は、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲのレベルに関連した病状を診断するアッセイに使用できる。加えて、前記核酸分子は、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲのレベルに関連した病状の治療に使用できる。
ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ発現の調節に関連付けられる特定の変性および病状には以下が含まれるが、それらに限定はされない。
１）腫瘍血管新生：血管新生は、腫瘍が病的サイズに成長するのに必要であることを示している（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ），１９７１年，米国サイエンスアカデミー会報（ＰＮＡＳ）７６，５２１７−５２２１；ウェルスタイン（Ｗｅｌｌｓｔｅｉｎ）とツバイコ（Ｃｚｕｂａｙｋｏ），１９９６年，乳癌リサーチと治療（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）３８，１０９−１１９）。さらに、血管新生によって腫瘍細胞が転移中に循環器系を移動する。血管および浮腫関連脳腫瘍において、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）といった多くの血管新生因子の高レベルの遺伝子発現が報告されている（バールマン（Ｂｅｒｌｍａｎ）ら，１９９３年，臨床試験誌（Ｊ．Ｃｌｉｎｉ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１，１５３）。ジム・キム（Ｊｉｍ Ｋｉｍ）ら（１９９３年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）３６２，８４１）は、腫瘍血管新生におけるＶＥＧＦの役割をさらに直接的に示している。ここでは、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体をうまく利用して、裸マウスにおける横紋筋肉腫、膠芽腫多型細胞の成長を抑制した。同様に、ｆｌｔ−１ＶＥＧＦ受容体の優性ネガティブ突然変異型は、裸マウスにおいてヒト膠芽腫細胞による誘発された血管新生を抑制する（ミラウアー（Ｍｉｌｌａｕｅｒ）ら，１９９４年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）３６７，５７６）。本発明の核酸分子を使用して標的とすることができる特定の腫瘍／癌タイプは、本明細書に記載の腫瘍／癌タイプが含まれるが、それらに限定されない。
２）眼疾患：新血管形成は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、乾性ＡＭＳ、湿性ＡＭＤ、ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｃｌａｓｓｉｃ型ＡＭＤ（ＰＤ ＡＭＤ）、ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｃｌａｓｓｉｃ型ＡＭＤ（ＭＣ ＡＭＤ）、およびｏｃｃｕｌｔ型ＡＭＤを含む黄斑変性；血管新生緑内障、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）および増殖性糖尿病網膜症を含む糖尿病性網膜症；近視性変性、ブドウ膜炎、およびトラコーマを含むがそれらに限定されない眼疾患を誘発する、または悪化させることが示されている（ノルビ（Ｎｏｒｒｂｙ），１９９７年。ＡＰＭＩＳ１０５，４１７−４３７）。アイエロ（Ａｉｅｌｌｏ）ら（１９９４年，ニューイングランド医薬誌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）３３１，１４８０）は、糖尿病性網膜症および他の網膜疾患の患者の大部分で眼液に高濃度のＶＥＧＦが含まれることを示した。ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら（１９９４年，アメリカ病理学誌（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）１４５，５７４）は、網膜虚血患者のＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルが高いことを報告した。これらの発見は、眼疾患におけるＶＥＧＦの直接的な役割を支持している。ＶＥＧＦ合成を刺激する因子を含む他の因子もまた、これらの報告に貢献することがある。
３）皮膚疾患：乾癬、尋常性疣贅、結節硬化症の血管線維腫、ポートワイン母斑、スタージ・ウェーバー症候群、クリッペル−トレノネイ−ウェーバー症候群、およびオスラー−ウェーバー−レンデュ症候群（前述のノルビ（Ｎｏｒｒｂｙ）を含むがそれらに限定されない、血管新生依存性の多くの兆候が識別されている。血管新生因子ｂ−ＦＧＦの皮内注射は、裸マウスにおける血管新生を示した（ウェックベッカー（Ｗｅｃｋｂｅｃｋｅｒ）ら，１９９２年，血管新生（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）：基本原理−サイエンス−テクノロジー−医薬，アール．シュタイナー（Ｒ．Ｓｔｅｉｎｅｒ）編）。デトマー（Ｄｅｔｍａｒ）ら（１９９４年，実験医学誌（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１８０，１１４１）は、乾癬皮膚および乾癬皮膚毛細血管においてＶＥＧＦおよびその受容体が過剰発現したことを報告し、ＶＥＧＦが乾癬において重要な役割を果たすことを示唆している。
４）関節リウマチ：関節リウマチ患者の関節から採取した組織に関する免疫組織化学およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成試験は、高いＶＥＧＦおよびその受容体レベルを示している（ファヴァ（Ｆａｖａ）ら，１９９４年，実験医学誌（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１８０，３４１）。さらにコッホ（Ｋｏｃｈ）ら（１９９４年，免疫学誌（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５２，３１３９）は、関節リウマチ患者から採取した滑膜組織の分裂促進作用を著しく低減できることを発見した。これらの発見は、関節リウマチにおけるＶＥＧＦの直接的な役割を支持している。本発明の血管新生因子を含む他の血管新生因子もまた、関節炎に関与することがある。
５）子宮内膜症：様々な研究が、ＶＥＧＦが子宮内膜症において直接的に実装されることを示している。ある研究では、ＥＬＩＳＡにより測定した腹水中のＶＥＧＦ濃度が、子宮内膜症でない女性よりも子宮内膜症の女性で著しく高いことが分かった（正常な場合において２４．１＋−１５ｎｇ／ｍｌ対１３．３＋−７．２ｎｇ／ｍｌ）。子宮内膜症の患者において、月経周期の分泌期（１０．７＋−５ｎｇ／ｍｌ）に比べて、増殖期（３３＋−１３ｎｇ／ｍｌ）に高いＶＥＧＦ濃度が検出された。通常患者から採取した腹水中における周期変動については言及されていない（マクラーレン（ＭｃＬａｒｅｎ）ら，１９９６年，ヒトの生殖（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）１１，２２０−２２３）。別の研究では、中度から重度の子宮内膜症を患う女性の腹水ＶＥＧＦ濃度が、子宮内膜症でない女性に比べて著しく高かった。子宮内膜症と腹水中のＶＥＧＦ濃度には正相関があった。ヒト子宮内膜検査において、初期増殖期と比べ、中期増殖期、後期増殖期、および分泌期の子宮内膜においてＶＥＧＦ発現が約１．６倍、２倍、および３．６倍増加した（シフレン（Ｓｈｉｆｒｅｎ）ら，１９９６年，臨床内分泌学と代謝誌（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．）８１，３１１２−３１１８）。第三の研究では、ヒト異所性子宮内膜のＶＥＧＦ陽性染色法によってマクロファージに限局されることが示された（ＣＤ１４マーカーを用いた二重免疫蛍光染色法）。腹水マクロファージは、子宮内膜症の女性および子宮内膜症でない女性においてＶＥＧＦ染色を示した。しかし対照と比較して、子宮内膜症の女性から採取した腹水において、高いマクロファージ活性（酸ホスファターゼ活性）が示された。子宮内膜症の患者から採取した腹水マクロファージ馴化培地は、対照と比較して、ＨＵＶＥＣ細胞において著しい細胞増殖を生じた（［3Ｈ］チミジンの取り込み）。ＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡを持つ腹水マクロファージの比率は、分泌期のほうが高く、対照（３２＋−２０％）と比較して、子宮内膜症の女性から採取した腹水（８０＋−１５％）において著しく高かった。Ｆｌｔ−ｍＲＮＡは、子宮内膜症の女性および子宮内膜症でない女性から採取した腹水マクロファージにおいて検出されたが、グループ間に相違はなく、または周期依存の証拠も見られなかった（マクラーレン（ＭｃＬａｒｅｎ）ら，１９９６年，臨床試験誌（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）９８，４８２−４８９）。月経周期の初期増殖期において、雌のマウスの卵管および子宮の内側を覆う分泌円柱上皮（エストロゲン反応性）においてＶＥＧＦが発現したことがわかった。分泌期において、ＶＥＧＦ発現が機能的子宮内胃膜を構成する基礎的な支質に変えたことを示した。子宮内膜の審査に加えて、血管新生と同様に、胚着床部位における卵胞の新血管形成および黄体も解析した。これらの過程で、形成中の血管に近い場所および時期においてＶＥＧＦが発現した（シュウェイキ（Ｓｈｗｅｉｋｉ）ら，１９９３年，臨床実験誌（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）９１，２２３５−２２４３）。
６）腎疾患：常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）は、米国において最も一般的な生命に関わる遺伝性疾患である。約４００人から１０００人に１人、またＡＤＰＫＤを持つ人の５０％が腎不全を発症する。ＡＤＰＫＤは、米国において末期腎不全の５−１０％を閉め、透析および腎移植を必要とする。血管新生は、ＡＤＰＫＤの進行中に実装されて嚢胞細胞を成長させ、嚢胞へ体液分泌を促進する血管透過性を増加する。培養下の嚢胞細胞が可溶性の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を産生するため、嚢胞上皮の増殖はＡＤＰＫＤの特徴の１つである。ＶＥＧＦＲ１は、嚢胞腎または正常な腎臓の血管系における内皮細胞ではなく、嚢胞細管の内皮細胞において検出されている。ＶＥＧＦＲ２の発現は、嚢胞血管の内皮細胞および腎虚血再かん流中の内皮細胞において増加する。
ゲムシタビンおよびシクロホスファミドといった放射線治療および化学療法の利用は、本発明の核酸分子（例、ｓｉＮＡ分子）と結合できる、または併用できる化学療法薬の限定を目的としない例である。当業者であれば、他の抗癌化合物および治療も同様に、本発明の核酸分子（例、ｓｉＮＡ分子）と容易に組み合わせることができ、故に本発明の範囲に含まれることを認識するであろう。そのような化合物および治療は、当該技術分野においてよく知られており（例として、癌：腫瘍学の原理と実践（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ），Ｖｏｌｕｍｅ１および２，デヴィータ，ヴィー．ティー．（Ｄｅｖｉｔａ，Ｖ．Ｔ．）、ヘルマン，エス．（Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．）、およびローゼンバーグ，エス．エー（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．）編，ジェイ・ビー・リッピンコット・カンパニー（Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ），フィラデルフィア，アメリカを参照。これは参照することにより本明細書に組み込まれる）、葉酸、抗葉酸、ピリミジンアナログ、フルオロピリミジン、プリンアナログ、アデノシンアナログ、トポアイソメラーゼＩ抑制因子、アントラピラゾール、レチノイド、抗生物質、アントラサイクリン、プラチナアナログ、アルキル化薬、ニトロソウレア、ビンカ・アルカロイドなどの植物由来の化合物、エピポドフィロトキシン、チロシンキナーゼ抑制因子、タキソール、放射線治療、外科手術、栄養補給、遺伝子治療、３Ｄ−ＣＲＴなどの放射線治療、リシンなどの抗毒素治療、およびモノクローナル抗体を含むがそれらに限定されない。本発明の核酸分子と結合できる、または併用される化学療法薬の特定の例は、パクリタキセル、ドセタキセル、メトトレキサート、ドキソルビン、エダトレキサート、ビノレルビン、トマキシフェン、ロイコボリン、５−フルオロウリジン（５−ＦＵ）、イオノテカン、シスプラチン、カルボプラチン、アムサクリン、シタラビン、ブレオマイシン、ミトマイシンＣ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、ヘキサメチルメラミン、ダカルバジン、Ｌ−アスペリギナーゼ、ニトロゲンマスタード、メルファラン、クロラムブチル、ブスルファン、アイフォスファミド、４−ヒドロペロキシシクロホスファミド、チオテパ、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（Ｒ）、ＣＰＴ−１１、カンプトテシン−１１、カンプト）タモキシフェン、ヘルセプチン、ＩＭＣ Ｃ２２５、ＡＢＸ−ＥＧＦ、およびその組み合わせを含むがそれらに限定されない。眼性疾患および状態の本発明のｓｉＮＡ分子と組み合わせて使用できる治療および化合物の限定を目的としない例は、黄斑下手術、焦点レーザー網膜光凝固、限局的な黄斑転移手術、網膜および網膜色素上皮移植、網膜マイクロチッププロテーゼ、フィーダー血管ＣＮＶＭレーザー光凝固、インターフェロンアルファ治療、硝子体内ステロイド治療、経瞳孔温熱療法、膜分離濾過治療、ＶＥＧＦ（例、マクゲン（Ｍａｃｕｇｅｎ）（商標））および／またはＶＥＧＦ受容体を標的とするアプタマー、ＶＥＧＦ（例、ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）（商標）および／またはＶＥＧＦ受容体、ヴィスダイン（Ｖｉｓｕｄｙｎｅ）（商標）（例、光治療（ＰＤＴ）で使用）を標的とする抗体、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（商標）またはアネコルターブ酢酸（例、レターヌ（Ｒｅｔａａｎｅ）（商標））といった抗炎症化合物、グルココルチコイドといったアンギオスタチンステロイド、ポスルデックス（Ｐｏｓｕｒｄｅｘ）（商標）といった硝子体内移植、ＦＧＦ２モジュレータ、スクアラミンといった抗血管新生化合物、および／またはＶＥＧＦとラップおよび他のサイトカインとラップを含む（例として、エコノマイド（Ｅｏｎｏｍｉｄｅｓ）ら，２００３年，天然医薬誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），９，４７−５２を参照）。前記化合物は、本発明の核酸分子（例、ｓｉＮＡ）と組み合わせることができる、または併用される化合物および／または方法の限定を目的としない例を示す。当業者であれば、他の薬剤化合物および治療も同様に、本発明の核酸分子（例、ｓｉＮＡ分子）と容易に組み合わせることができ、故に本発明の範囲に含まれることを認識するであろう。
実施例１３
診断上の利用
発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、治療、工業、環境、農業、および／また研究のような様々な応用における標的分子（例えば、ＲＮＡ）の特定のような、様々な診断上の応用に利用することができる。そのようなｓｉＮＡ分子の診断上の利用は、例えば、細胞溶解液または部分精製された細胞溶解液を用いる、ＲＮＡｉ再構成システムの利用を伴う。本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、疾患細胞中の遺伝的浮動や変異を検査するための、または、細胞中のウイルスＲＮＡのような内因性または外因性の存在を検出するための診断手段として用いることができる。ｓｉＮＡ活性と標的ＲＮＡの構造間の密接な関係故に、塩基対と標的ＲＮＡの３次元構造が変わり、分子の任意の領域の変異を検出することができる。本発明で述べられた複数のｓｉＮＡ分子を用いることにより、ＲＮＡの構造、また細胞と組織内同様にインビトロでの機能に重要なヌクレオチドの変化をマップすることができる。ｓｉＮＡ分子と標的ＲＮＡの切断は、遺伝子発現の抑制や特定の遺伝子産物の疾患または感染の進行における役割を明らかにするのに用いることができる。この方法で、その他の遺伝子標的が疾患の重要な調節因子として明らかにされる可能性がある。これらの実験は、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のｓｉＮＡ分子、既知の低分子阻害剤と結合したｓｉＮＡ分子、またはｓｉＮＡ分子および／またその他の化学的または生物学的分子との断続的な併用治療）の可能性を提供することによって、疾患進行へのより良い治療を導き出すだろう。本発明のｓｉＮＡ分子のその他のインビトロ利用は、当該分野でよく知られており、疾患、感染症、または関連の病体に関連するｍＲＮＡの存在の検出を含む。このようなＲＮＡは、例えば、蛍光共鳴放射転移（ＦＲＥＴ）のような標準的手法を用いて、ｓｉＮＡによる治療後、切断産物の存在の測定によって検出される。
特定の例において、標的ＲＮＡの野生型のみ、または変異型のみを切断するｓｉＮＡ分子がアッセイに用いられる。第一のｓｉＮＡ分子（すなわち、標的ＲＮＡの野生型のみを切断するもの）は、試料中の野生型ＲＮＡの存在を確認するのに用いられ、第二のｓｉＮＡ分子（すなわち、標的ＲＮＡの変異型のみを切断するもの）は試料中の変異型ＲＮＡを確認するのに用いられる。反応コントロールとして、反応中のｓｉＮＡの相対的効率、また「標的でない」ＲＮＡ種は切断されていないことを示すために、野生型および変異ＲＮＡ双方の合成基質が双方のｓｉＮＡ分子によって切断される。合成基質からの切断産物は、試料群中の野生系と変異ＲＮＡの解析のためのサイズマーカーを作るのに役立つ。すなわち、それぞれの解析には、二つのｓｉＮＡ分子、二つの基質、および一つの未知の試料で、合計６つの反応が必要である。切断産物の存在は、それぞれのＲＮＡの全長および切断断片がポリアクリルアミドゲルの１レーンで解析できる、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて検出される。変異ＲＮＡの発現と標的細胞における望ましい表現系が変化するという想定される危険性の洞察を得るために、結果の定量が絶対に必要というわけではない。表現系の発展にタンパク質産物が関わっている（すなわち、疾患に関係した、または感染に関係した）ｍＲＮＡの発現は、危険を証明するに十分である。もし比較可能な特定の活性のプローブが双方の転写物に用いられるなら、ＲＮＡレベルの定性的な比較で十分であり、初期診断の費用を低減する。ＲＮＡレベルが定性的に、または定量的に比較されるかどうかに関わらず、野生型に対する変異型のより高い比率は、より高い危険性と相関している。
本明細書の中で述べられた全ての特許と出版物は、本発明が属する技術分野の熟練者のレベルを表すものである。本開示に引用された全ての参考文献は、各文献を参照することでその全体が個別に本申請に組み込まれるのと同様に、本申請に組み込まれる。
当業者は、目的を遂行するために本発明はよく適合されていること、また、述べられた目的と利点を達成していることを容易に理解することであろう。好ましい例の目下の代表例として本明細書で述べられた方法と組成物は例示的なものであり、本発明の範囲の限定を目的としない。当業者に見いだされるであろう変更やその他の用途は、請求の範囲によって定義される、本発明の精神に含まれるものである。
当業者には、様々な置換と修飾は本明細書で開示される本発明が、本発明の範囲と精神から離れることなく行われ得るということが容易に理解できるだろう。従って、このような付加的な態様は本発明および請求項の範囲に含まれる。本発明は当業者に、本申請で述べられた、ＲＮＡｉ活性を媒介するための活性が向上した核酸構造を作成するための、様々な化学修飾の組み合わせおよび／または置換を試験することを悟らせる。このように向上された活性には、向上された安定性、向上された生物学的利用能、および／またＲＮＡｉを媒介する細胞反応の向上された活性化を含む可能性がある。従って、本明細書で述べられた個別の態様は限定を目的とせず、当業者は、容易に本明細書で述べられた修飾の個別の組み合わせを、ＲＮＡｉ活性が向上したｓｉＮＡ分子特定のための無駄な実験を行うことなく試験できることが容易に理解できる。本申請で適切に述べられた本発明は、本明細書で具体的に開示されなかった、任意の要素や要素群、制限項目または制限項目群が欠落していても実践することができる。従って、例えば、本明細書のそれぞれの態様において、「含む」「原則的に構成される」および「構成される」のいずれの語も、他の二つのいずれかと置き換えてられてよい。使用された用語や表現は、説明の用語として用いられるのであって、限定のためではなく、このような用語や表現で示され述べられた特徴、またはその一部分である任意の同等のものを排除する意図はなく、請求された本発明の範囲で、様々な修飾が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい態様によって具体的に開示されているが、本明細書で開示されたコンセプトの任意の特性、変形、およびバリエーションは当業者によって行われることができること、そして説明と添付特許請求の範囲によって明確にされたように、変形およびバリエーションは、本発明の範囲であると考えられるということが理解されるべきである。
加えて、当業者であれば、本発明の特性や側面がマークーシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）グループまたは、他の代替グループの観点で述べられている場合には、本発明が、マークーシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）グループまたはその他のグループにおける任意の個々メンバーまたはサブグループのメンバーの観点でも述べられていることを認識するであろう。
表 I: VEGF および/またはVEGFR アクセッション番号

NM_005429
Homo sapiens vascular endothelial growth factor C (VEGFC), mRNA
gi|19924300|ref|NM_005429.2|[19924300]
NM_003376
Homo sapiens vascular endothelial growth factor (VEGF), mRNA
gi|19923239|ref|NM_003376.2|[19923239]
AF095785
Homo sapiens vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, promoter region and
partial cds
gi|4154290|gb|AF095785.1|[4154290]
NM_003377
Homo sapiens vascular endothelial growth factor B (VEGFB), mRNA
gi|20070172|ref|NM_003377.2|[20070172]
AF486837
Homo sapiens vascular endothelial growth factor isoform VEGF165 (VEGF) mRNA,
complete cds
gi|19909064|gb|AF486837.1|[19909064]
AF468110
Homo sapiens vascular endothelial growth factor B isoform (VEGFB) gene, complete
cds, alternatively spliced
gi|18766397|gb|AF468110.1|[18766397]
AF437895
Homo sapiens vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, partial cds
gi|16660685|gb|AF437895.1|AF437895[16660685]
AY047581
Homo sapiens vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA, complete cds
gi|15422108|gb|AY047581.1|[15422108]
AF063657
Homo sapiens vascular endothelial growth factor receptor (FLT1) mRNA, complete
cds
gi|3132830|gb|AF063657.1|AF063657[3132830]
AF092127
Homo sapiens vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, partial sequence
gi|4139168|gb|AF092127.1|AF092127[4139168]
AF092126
Homo sapiens vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, 5' UTR
gi|4139167|gb|AF092126.1|AF092126[4139167]
AF092125
Homo sapiens vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, partial cds
gi|4139165|gb|AF092125.1|AF092125[4139165]
E15157
Human VEGF mRNA
gi|5709840|dbj|E15157.1||pat|JP|1998052285|2[5709840]
E15156
Human VEGF mRNA
gi|5709839|dbj|E15156.1||pat|JP|1998052285|1[5709839]
E14233
Human mRNA for vascular endothelial growth factor (VEGF), complete cds
gi|5708916|dbj|E14233.1||pat|JP|1997286795|1[5708916]
AF024710
Homo sapiens vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA, 3'UTR
gi|2565322|gb|AF024710.1|AF024710[2565322]
AJ010438
Homo sapiens mRNA for vascular endothelial growth factor, splicing variant
VEGF183
gi|3647280|emb|AJ010438.1|HSA010438[3647280]
AF098331
Homo sapiens vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, promoter, partial
sequence
gi|4235431|gb|AF098331.1|AF098331[4235431]
AF022375
Homo sapiens vascular endothelial growth factor mRNA, complete cds
gi|3719220|gb|AF022375.1|AF022375[3719220]
AH006909
vascular endothelial growth factor [alternative splicing] [human, Genomic, 414
nt 5 segments]
gi|1680143|gb|AH006909.1||bbm|191843[1680143]
U01134
Human soluble vascular endothelial cell growth factor receptor (sflt) mRNA,
complete cds
gi|451321|gb|U01134.1|U01134[451321]
E14000
Human mRNA for FLT
gi|3252767|dbj|E14000.1||pat|JP|1997255700|1[3252767]
E13332
cDNA encoding vascular endodermal cell growth factor VEGF
gi|3252137|dbj|E13332.1||pat|JP|1997173075|1[3252137]
E13256
Human mRNA for FLT,complete cds
gi|3252061|dbj|E13256.1||pat|JP|1997154588|1[3252061]
AF063658
Homo sapiens vascular endothelial growth factor receptor 2 (KDR) mRNA, complete
cds
gi|3132832|gb|AF063658.1|AF063658[3132832]
AJ000185
Homo Sapiens mRNA for vascular endothelial growth factor-D
gi|2879833|emb|AJ000185.1|HSAJ185[2879833]
D89630
Homo sapiens mRNA for VEGF-D, complete cds
gi|2780339|dbj|D89630.1|[2780339]
AF035121
Homo sapiens KDR/flk-1 protein mRNA, complete cds
gi|2655411|gb|AF035121.1|AF035121[2655411]
AF020393
Homo sapiens vascular endothelial growth factor C gene, partial cds and 5'
upstream region
gi|2582366|gb|AF020393.1|AF020393[2582366]
Y08736
H.sapiens vegf gene, 3'UTR
gi|1619596|emb|Y08736.1|HSVEGF3UT[1619596]
X62568
H.sapiens vegf gene for vascular endothelial growth factor
gi|37658|emb|X62568.1|HSVEGF[37658]
X94216
H.sapiens mRNA for VEGF-C protein
gi|1177488|emb|X94216.1|HSVEGFC[1177488]
NM_002020
Homo sapiens fms-related tyrosine kinase 4 (FLT4), mRNA
gi|4503752|ref|NM_002020.1|[4503752]
NM_002253
Homo sapiens kinase insert domain receptor (a type III receptor tyrosine kinase)
(KDR), mRNA
gi|11321596|ref|NM_002253.1|[11321596]
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図１は、ｓｉＮＡ分子の合成スキームの例を示す。 図２は、本発明の方法で合成された精製ｓｉＮＡ二重鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。 図３は、ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の限定を目的としない機構図案を示す。 図４は、本発明の化学修飾したｓｉＮＡ構造の例を示す。 図５は、本発明の特定の化学修飾したｓｉＮＡ配列の例を示す。 図６は、本発明の異なるｓｉＮＡ構造の例を示す。 図７は、ｓｉＮＡヘアピン構造を生成する発現カセットの生成に利用されるスキームの図表示である。 図８は、二本鎖ｓｉＮＡヘアピン構造を生成する発現カセットの生成に利用されるスキームの図表示である。 図９は、メッセンジャーＲＮＡ等、の特定の標的核酸配列内でｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉの標的部位を判別するために使用される方法の図表示である。 図１０は、例えば本発明のｓｉＮＡ配列の３’端を安定化させるために使用できる異なる安定化化学反応の例を示す。 図１１は、ＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保持しながらヌクレアーゼ耐性を示す、本発明の化学修飾したｓｉＮＡ構造の識別に使用される方法の例を示す。 図１２は、直鎖および二重鎖構造ならびにその非対称派生物を含む、本発明のリン酸化ｓｉＮＡ分子の例を示す。 図１３は、本発明の化学修飾した末端リン酸基の例を示す。 図１４Ａは、自己相補型ＤＦＯ構造の設計に使用される方法の例を示す。 図１４Ｂは、二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の限定を目的としない代表的な例を示す。 図１４Ｃは、代表的な二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の自己組織化の概略について例を示す。 図１４Ｄは、代表的な二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の自己組織化の概略について例を示す。 図１５は、自己相補型ＤＦＯ構造のデザインの例を示す。 図１６は、ＲＮＡｉにより指示された異なる標的核酸配列の切断を媒介できる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの例を示す。 図１７は、ＲＮＡｉにより指示された異なる標的核酸配列の切断を媒介できる単一のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの例を示す。 図１８は、ＲＮＡｉにより指示された異なる標的核酸配列の切断を媒介できる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの例を示す。 図１９は、ＲＮＡｉにより指示された異なる標的核酸配列の切断を媒介できる単一のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡの例を示す。 図２０は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分ｓｉＮＡがどのように２つの個別の標的核酸分ｓｉＮＡを標的とするかに関する例を示す。 図２１は、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子が２つの個別の標的核酸配列を、同一の標的核酸分子内でどのように標的とするかに関する例を示す。 図２２は、Ａ３７５細胞内のＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡの減少に関する例を示す。 図２３は、ＨＡＥＣ細胞培養におけるＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡレベルの減少に関する例を示す。 図２４は、ＨＡＥＣ細胞内のＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡの減少に関する例を示す。 図２５は、ＨＡＥＣ細胞培養におけるＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡレベルの減少に関する例を示す。 図２６Ａは、ＨＡＥＣ細胞におけるＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）ｍＲＮＡレベルの減少に関する例を示す。 図２６Ｂは、追加コントロールとしてＶＥＧＦＲ１およびその対応する化学反応の逆位コントロールのみを標的とする構造を含む例を示す。 図２７Ａは、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）ｍＲＮＡレベルの低減に関する例を示す。 図２７ＢはＳｔａｂ７／８ｓｉＮＡ構造の場合のデータを示す。 図２８は、ラット角膜モデルの血管形成を使用した、ＶＥＧＦ誘発性血管形成のｓｉＮＡ媒介性抑制の例を示す。 図２９は、ラット角膜モデルにおけるＶＥＧＦ誘発性新血管形成の抑制に関する例を示す。 図３０は、２つの異なるｓｉＮＡ安定化化学反応を使用して、ＶＥＧＦＲ１の３４９位に隣接する部位の有効性を評価した試験の例を示す。 図３１は、ＶＥＧＦ誘発性眼血管形成の抑制に関する例を示す。 図３２は、ｓｉＮＡの眼内投与を介したマウスモデルの脈略膜新血管形成におけるＶＥＧＦ誘発性新血管形成の抑制に関する例を示す。 図３３は、ｓｉＮＡの眼周囲投与を介したマウスモデルの脈略膜新血管形成におけるＶＥＧＦ誘発性新血管形成の抑制に関する例を示す。 図３４は、ｓｉＮＡの眼周囲投与を介したマウスモデルの脈略膜新血管形成におけるＶＥＧＦ誘発性新血管形成の抑制に関する例を示す。 図３５は、活性ｓｉＮＡを注射したマウスにおける脈略膜新血管形成（ＣＮＶ）のｓｉＮＡ媒介性抑制の例を示す。 図３６は、活性ｓｉＮＡを注射したマウスにおけるＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡレベルのｓｉＮＡ媒介性抑制に関する例を示す。 図３７は、活性ｓｉＮＡを注射したマウスにおけるＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡレベルのｓｉＮＡ媒介性抑制に関する例を示す。 図３８は、活性Ｓｔａｂ９／１０ｓｉＮＡを使用した、マウス４Ｔ１ルシフェラーゼ乳癌同系腫瘍モデルにおける初期腫瘍量の低減に関する例を示す。 図３９は、活性Ｓｔａｂ９／１０ｓｉＮＡを使用した、マウス４Ｔ１ルシフェラーゼ乳癌同系腫瘍モデルにおける可溶ＶＥＧＦＲ１血清レベルの低減に関する例を示す。 図４０Ａは、多機能ｓｉＮＡを評価した試験結果を示す。 図４０Ｂは、多機能ｓｉＮＡを評価した試験結果を示す。 図４０Ｃは、多機能ｓｉＮＡを評価した試験結果を示す。 図４１Ａは、多機能ｓｉＮＡを評価した容量反応試験の結果を示す。 図４１Ｂは、多機能ｓｉＮＡを評価した容量反応試験の結果を示す。 図４１Ｃは、多機能ｓｉＮＡを評価した容量反応試験の結果を示す。 図４２は、非ヌクレオチド連結多機能ｓｉＮＡを評価した試験結果を示す。 図４３Ａは、本発明の連結された多機能ｓｉＮＡ構造の例を示す。 図４３Ｂは、本発明の連結された多機能ｓｉＮＡ構造の例を示す。 図４４は、様々なデンドリマーベースの多機能ｓｉＮＡデザインの例を示す。 図４５は、様々な超分子の多機能ｓｉＮＡデザインの例を示す。 図４６は、３０ヌクレオチドの前駆ｓｉＮＡ構造を使用して多機能ｓｉＮＡデザインを可能にするダイサーの例を示す。 図４７は、４０ヌクレオチドの前駆ｓｉＮＡ構造を使用して多機能ｓｉＮＡデザインを可能にするダイサーの例を示す。 図４８は、ＨＢＶの２６３位を標的とする多機能ｓｉＮＡ構造を可能にするダイサーによるＨＢＶ ＲＮＡの抑制の例を示す。 図４９は、本発明の追加多機能ｓｉＮＡ構造のデザインの例を示す。 図５０は、本発明の追加多機能ｓｉＮＡ構造のデザインの例を示す。

Claims (27)

  1. 化学式ＭＦ−ＩＩＩ
    Figure 2007505605
     を持つ構造を含む多機能ｓｉＮＡ分子であって、
    式中、
    （ａ）Ｘ、Ｘ’、Ｙ、およびＹ’は、それぞれ独立して、約１５から約５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、
    （ｂ）Ｘは領域Ｙ’に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、
    （ｃ）Ｘ’は領域Ｙに存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、
    （ｄ）ＸおよびＸ’はそれぞれ独立して、第一ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲおよび第二ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ標的核酸配列、あるいはその一部と安定して相互作用するに足る長さであり、
    （ｅ）Ｗは配列Ｙ’とＹとを結合するヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを示し、および
    （ｆ）前記多機能ｓｉＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して第一ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲおよび第二ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲの切断を指示する、
    ことを特徴とする多機能ｓｉＮＡ。
  2. Ｗが配列Ｙ’の３’端と配列Ｙの３’端を結合する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  3. Ｗが配列Ｙ’の３’端と配列Ｙの５’端を結合する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  4. Ｗが配列Ｙ’の５’端と配列Ｙの５’端を結合する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  5. Ｗが配列Ｙ’の５’端と配列Ｙの３’端を結合する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  6. 末端リン酸基が配列Ｘ、Ｘ’、Ｙ、またはＹ’のいずれかの５’端に存在する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  7. Ｗが生分解性リンカーを介して配列ＹとＹ’を結合する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  8. Ｗがコンジュゲート、ラベル、アプタマー、リガンド、脂質、またはポリマーをさらに含む、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  9. 配列Ｘ、Ｘ’、Ｙ、またはＹ’のいずれかが３’端キャップ部を含む、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  10. 前記末端キャップ部が逆位デオキシ脱塩基部分である、請求項９に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  11. 前記末端キャップ部が逆位デオキシヌクレオチド部分である、請求項１０に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  12. 前記末端キャップ部がジヌクレオチド部分である、請求項１０に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  13. 前記ジヌクレオチドがジチミジン（ＴＴ）である、請求項１２に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  14. 前記ｓｉＮＡ分子がリボヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  15. 前記ｓｉＮＡ分子が１つ以上のリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  16. 前記ｓｉＮＡにある任意のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  17. 前記ｓｉＮＡにある任意のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  18. 前記ｓｉＮＡにある任意のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  19. Ｘ、Ｘ’、Ｙ、およびＹ’が、それぞれ独立して、約１９から約２３ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  20. 前記第一および第二標的配列がそれぞれＶＥＧＦ ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  21. 前記第一標的配列がＶＥＧＦ ＲＮＡ配列であり、前記第二標的配列がＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  22. 前記第一標的配列がＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列であり、前記第二標的配列がＶＥＧＦ ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  23. 前記第一標的配列がＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列であり、前記第二標的配列がＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  24. 前記ＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列がＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３ ＲＮＡ配列で構成されるグループから選択される、請求項２１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  25. 前記ＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列がＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３ ＲＮＡ配列で構成されるグループから選択される、請求項２２に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  26. 前記ＶＥＧＦＲ ＲＮＡ配列がＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３ ＲＮＡ配列で構成されるグループから選択される、請求項２３に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
  27. 請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子および許容できる担体または希釈剤を含む医薬組成物。

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