JP2005518451A - ホスフィチル化化合物を製造する方法 - Google Patents

Abstract

提供されるものは、ヒドロキシル含有化合物を、ホスフィチル化剤と、（１）Ｒ、Ｒ^１、及びＲ^２が、独立にＣ_１−Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０アリール、Ｃ_１−Ｃ_１０アラルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０ヘテロアルキル、又はＣ_１−Ｃ_１０ヘテロアリールである、式（Ｉ）のアミンから誘導される酸−塩基複合体；（２）Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びが、独立に水素、Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０アリール、Ｃ_１−Ｃ_１０アラルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０ヘテロアルキル、又はＣ_１−Ｃ_１０ヘテロアリールであり、そしてＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７の少なくとも一つが水素ではない、式（ＩＩ）のアミン塩基から誘導される酸−塩基複合体；（３）ジアザビシクロアミン塩基から誘導される酸−塩基複合体；（４）双性イオン性アミン複合体；及び（５）二つ又はそれより多いこれらの組合せからなる群から選択されるホスフィチル化活性化剤の存在下で反応させて、ホスフィチル化化合物を製造する工程を含んでなる、３’−Ｏホスホロアミダイトを含むホスフィチル化化合物を製造する方法である。
【化１】

Description

関連する出願との相互参照
本出願は、米国特許商標局に２００２年２月２２日に出願した米国特許仮出願番号６０／３５９，１２４及び米国特許商標局に２００２年３月７日に出願した米国特許仮出願番号６０／３６２，３２０の優先権を主張する。上記の仮出願の両方は、参照により本明細書に含まれるものとされる。

発明の分野
本発明は、ヒドロキシル含有化合物を、ホスフィチル化剤とホスフィチル化活性化剤の存在下で反応させることによってホスフィチル化化合物を製造する方法に関する。

背景
ヒドロキシル含有化合物とホスフィン試薬との反応によるホスフィチル化化合物の製造は、幅広い範囲の有用化合物の合成において用途がある反応である。例えば、本出願人は、このような反応が、一般的に以下のスキーム１に示すように、５’−Ｏ−保護−ヌクレオシドからの３’−Ｏ−ホスホロアミダイトの合成において有用であることを認識している。

［式中、例えば、Ｘは、水素、アルコキシ、−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＯＴＢＤＭＳ）、−Ｏ−メトキシメチル（ＯＭＯＭ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）等であり；Ｒ’は、ＤＭＴ、ジメトキシトリチル、オリゴヌクレオチド及びその類似体、等であり；Ｒ”は、メチル等のようなアルキル、又は２−シアノエチル等のようなアルコキシであり；Ｒ’”は、ジイソプロピルアミン等であり；そしてＢは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルから誘導された部分である］
スキーム１によって形成される種類のホスホロアミダイトは、都合よくカップリングして、オリゴヌクレオチドを調製することができる。例えば、米国特許第４，７２５，６７７及びＭｅｌｌｏｒ，Ｔｈｏｍａｓ，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｏｅｔｉｄｅ”，Ｊ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，１９９８，７４７−７５７（この両方は参照により本明細書に含まれるものとされる）を参照されたい。こういったホスホロアミダイトは、例えばアンチセンス薬物（参照により本明細書に含まるものとされる、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，（１９９８）中に記載されているような）など、治療及び診断への適用の分野において、重要性が増大している。これらのオリゴヌクレオチドに対する増大する需要を満たすために、商業的規模のヌクレオシドのホスホロアミダイト合成を改良することが期待されている（参照により本明細書に含まれるものとされる、Ｎｅｏ，Ｋａｕｆｈｏｌｄ，Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣｈ Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２０００，２６１）。

しかしながら、本出願人は、３’−Ｏ−ホスホロアミダイトのようなホスフィチル化化合物を、ヒドロキシル含有化合物から調製するための従来の方法が、いくつかの理由から不都合であることを認識するにいたった。多くの従来の方法に伴う一つの不都合は、高価な及び／又は危険な活性化剤／化合物の使用を必要とすることである。例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８１，２２，１８５９（参照により本明細書に含まれるものとされる）において、１Ｈ−テトラゾールが、最も汎用的なホスフィチル化活性化剤として推奨されている。しかしながら、このような活性化剤／試薬は、高価かつ危険である。（例えば、参照により本明細書に含まれるものとされる、Ｓｔｕｌｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｆｉｒｅ ａｎｄ Ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ，ＡＩＣｈＥ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．１０，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７７，Ｖｏｌ．７３，２２を参照されたい）。窒素に富んだ複素環が有する爆発性のために、このような組成物の取扱いに対して、特別な安全対策が必要である。より危険性の少ない化合物４，５−ジシアノイミダゾールは、ある種のヌクレオシドのホスホロアミダイトの製造において有用であることが示されている。残念なことに、この化合物は、非常に高価であり、そして事実、工業的な方法において使用するには極めて高価である傾向がある。未置換のピリジンから誘導されたホスフィチル化活性化剤が、例えばＧｒｙａｚｎｏｖ，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３，５８７６；Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２，２０，１８７９；Ｂｅｉｅｒ，Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，１９９９，８２，８７９；Ｓａｎｇｈｖｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００，４，１７５；及びＳａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第６，２７４，７２５号中に開示されており、これらの全ては、参照により本明細書に含まれるものとされる。しかしながら、これらの塩は、毒性があり、非常に水溶性となる傾向がある。従って、このような活性化剤を使用する系に、費用の高い排水処理用機器を設置しなければならない。

ホスフィチル化化合物を調製するための多くの従来の方法に伴うもう一つの不都合は、好ましい溶媒としてジクロロメタンを使用することである。ジクロロメタンは環境に優しくない傾向を有するために、ジクロロメタンを溶媒として含む方法に関する使用に対して、比較的費用のかかる排水処理用機器を必要とする。

上記の不都合の少なくともあるものを回避するための一つの可能性のある方法は、例えば、Ｚｈａｎｇ等の米国特許第６，３４０，７４９ Ｂ１に記載されているような、更なる活性化工程を含まない、得られた溶液を固相支持体合成装置において即時に使用する、ヌクレオシドのホスホロアミダイトのｉｎ ｓｉｔｕの調製である。残念なことに、このような方法は、比較的効率が悪くなりがちで、そしてこのような方法によって得られたホスホロアミダイトの溶液は、不安定で、そして保存に適していない傾向がある。

従って、本出願人は、従来の方法に伴う不都合を回避する、ホスフィチル化化合物を調製する新規な方法に対する必要性を認識した。
発明及び好ましい態様の説明
本発明は、広い多種のホスフィチル化化合物を製造する効率のよい方法を提供することによって上記の欠点を克服する。この方法は、従来の方法より危険性が少なく、そして費用がかからない傾向がある。具体的には、本出願人は、比較的立体的に妨害されたアミン塩基から誘導されたある種の酸−塩基複合体及び双性イオン性複合体を、ホスフィチル化活性化剤として、ヒドロキシル含有出発物質からのホスフィチル化化合物の調製の方法において極めて有利に使用することができることを見出した。本明細書中で使用される場合、「ホスフィチル化化合物」という用語は、一般的にヒドロキシル含有化合物のホスフィチル化剤との反応によって形成される酸素−リン結合を含有する化合物を指す。本出願人は、本発明の酸−塩基及び双性イオン性複合体が、従来の活性化剤より毒性が少なく、かつ水溶性が低い傾向があることを見出した。

更に、本発明の酸−塩基及び双性イオン性活性化剤の複合体が、慣用的に使用される活性化剤より多く立体的に妨害され、より求核性でないという傾向があるという事実にもかかわらず、本発明の方法が、多くの態様において、従来技術の方法によって達成されるものと同様に高い、そしてある場合には従来技術の方法より高い収率でホスフィチル化化合物の製造を可能にすることを、本出願人は予期せずに見出した。本出願人は、いかなる特定の作用理論によるものではなく、又、それに束縛されることを望むものではないが、ホスフィチル化化合物の製造に使用するためのホスフィチル化剤を活性化する機構が、ホスフィチル化剤の脱離基の活性化剤による求核的置換に関係すると考える。例えば、Ｂｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９，１７，８５３及びＤａｈｌ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７，１５，１７２９は、ビス−試薬２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイトの、より立体的に妨害されていないアミン活性化剤（テトラゾールのような）による活性化の推定機構を、活性化されたビス−試薬薬剤のヒドロキシル含有化合物との反応に先立つ、ジイソプロピルアミン脱離基の求核性アミンによる置換に関係するものと記載している。

これを考慮すると、テトラゾール及びピリジン活性化剤のような従来技術のアミン活性化剤と比べて、そして多くの場合有意に、立体的に妨害されたアミンを含んでなる本発明の活性化剤は、ホスフィチル化剤の脱離基を置換することにおいてより効率的でないものであり、そして従ってこのような薬剤は、ホスフィチル化化合物の製造においてこのような薬剤を活性化するためにはより非効率的であることが予想される。しかしながら、先に記述したように、本発明の有意に立体的に妨害された活性化剤によって、ホスフィチル化生成物の製造が、未置換のピリジンの塩のような従来の活性化剤と同様に良好な収率で、又はそれよりなお良好な収率で可能になることを、本出願人は驚くべきことに見出した。いかなる特定の作用理論によって又はそれに束縛されることを意図するものではないが、発見された予期しなかった結果に対するその後の研究によって、本発明の活性化剤による驚くべき高収率は、少なくとも部分的に、活性化剤のある種のヒドロキシル含有出発物質の反応性の部分（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８６，１４，７３９１によって検討されているような、グアノシン化合物のラクタム単位）との減少した副反応のためである可能性があると本出願人は考えるようになった。従って、本発明の方法により、ホスフィチル化化合物の製造が、従来の方法と同様に良好な収率、そしてしばしばそれより良好な収率で、更にこのような従来の方法に伴う多くの不都合を回避しながら可能になる。

ある態様によれば、本発明の方法は、ヒドロキシル含有化合物のホスフィチル化剤と：以下に記載される式Ｉ又は式ＩＩのアミンから誘導される酸−塩基複合体、ジアザビシクロアミン化合物から誘導される酸−塩基複合体、双性イオン性複合体、及び二つ又はそれより多いこれらの組合せからなる群から選択されるホスフィチル化活性化剤の存在下で反応させて、ホスフィチル化化合物を製造する工程を含んでなる。

ホスフィチル化活性化剤
本明細書中で使用される場合、「ホスフィチル化活性化剤」という用語は、一般的にヒドロキシル含有化合物のホスフィチル化剤との反応を促進して、本発明によるホスフィチル化化合物を製造する化合物を指す。本出願人は、幅広い範囲の酸−塩基複合体及び双性イオン複合体がホスフィチル化活性化剤として極めて有利に使用することができることを見出した。

Ａ．酸−塩基複合体
本発明の酸及び塩基の複合体は、以下の式Ｉ又は式ＩＩの少なくとも一つのアミン塩基或いはジアザビシクロアミン塩基を、少なくとも一つの酸に導入して、酸−塩基複合体を形成させることによって形成される。

［式中、Ｒ、Ｒ^１、及びＲ^２は、独立にアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、又はヘテロアリールであり、それぞれは約１ないし約１０個の炭素を有する（Ｃ_１−Ｃ_１０）］
又は以下の式ＩＩ：

［式中、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７は、独立に水素、Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０アリール、Ｃ_１−Ｃ_１０アラルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０ヘテロアルキル、又はＣ_１−Ｃ_１０ヘテロアリールであり、ここにおいて前記Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７の少なくとも一つは水素ではない］
Ｃ_１ないしＣ_１０アルキル基としてのＲ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７は、直鎖又は分枝された部分、例えば、置換された又は置換されていない：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ノニル、デシル等であることができる。これらの基はいずれも、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキル、フルオロアルキル、アリールアルキル基、等で置換することができる。

Ｃ_１ないしＣ_１０シクロアルキルとしてのＲ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７は、例えば、置換された又は置換されていない：シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、シクロヘキシル、メチルシクロヘキシル、ジメチルシクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、等であることができる。これらの基のいずれもは、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキル、フルオロアルキル、アリールアルキル基、等で置換することができる。

Ｃ_１ないしＣ_１０アリールとしてのＲ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７は、例えば、置換された又は置換されていない：フェニル、ｏ−トリル、ｍ−トリル、ｐ−トリル、ｏ−キシリル、ｍ−キシリル、ｐ−キシリル、アルファ−ナフチル、ベータナフチル、等であることができる。これらの基のいずれもは、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アリールオキシ、アルキル、フルオロアルキル、アリールアルキル基、等で置換することができる。

Ｃ_１ないしＣ_１０アラルキルとしてのＲ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７は、例えば、置換された又は置換されていない：ベンジル、４−メチルベンジル、ｏ−メチルベンジル、ｐ−メチルベンジル、ジフェニルメチル、２−フェニルエチル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピル、等であることができる。これらの基のいずれもは、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アリールオキシ、アルキル、フルオロアルキル、アリールアルキル基、等で置換することができる。

それぞれ式Ｉ並びに式ＩＩ中のいずれもの二つの隣接するＲ、Ｒ^１、及びＲ^２、又はＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７基は、接続されて、芳香族、非芳香族、又は複素環式環を形成することができる。

本発明の方法において使用するために適した式Ｉのアミン塩基の例は：ジイソプロピルエチルアミン（即ちＨｕｎｉｇ塩基）、トリプロピルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ジエチルメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）等のようなトリアルキルアミン；テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）のような第３ジアミン；ポリアミン及びポリマー結合アルキルアミン；トリフェニルアミン、等のようなトリアリールアミン；トリベンジルアミン、等のようなトリアラルキルアミン；ジメチルアニリンのような他の三置換されたアミン：等を含む。具体的な式Ｉの好ましいアミンは、Ｈｕｎｉｇ塩基、等を含む。

本発明の方法における使用のために適した式ＩＩのアミン塩基の例は：ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４−ジメチルアミノピリジン、及びメチルピリジンを含むモノアルキルピリジンのような他の置換されたピリジン、２−ピコリン、３−ピコリン、ジメチルピリジンを含むジアルキルピリジン、２，６−ルチジン、トリメチルピリジンを含むトリアルキルピリジン、２，４，６−コリジン、ｓｙｎ−コリジン、テトラメチルピリジンを含むテトラアルキルピリジン、ペンタメチルピリジンを含むペンタアルキルピリジン、等を含む。具体的な式ＩＩの好ましい塩基は、２−ピコリン、ｓｙｎ−コリジン、等を含む。

本発明における使用のために適したジアザビシクロアミン塩基の例は、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン（ＤＢＮ）；１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）；１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、等を含む。

幅広い範囲の酸のいずれもは、本発明の一つ又はそれより多い塩基と組合わせて、本発明の酸−塩基複合体を形成させることができる。適した酸は：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジクロロ酢酸、等のような酢酸誘導体；メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、４−ピリジニウムエチレンスルホン酸、等のようなスルホン酸、無水塩化水素、無水臭化水素、無水ヨウ化水素、等のような無水ハロゲン化水素；及びＨＢＦ_４を含む。ある好ましい態様において、本発明に使用される酸は、トリフルオロ酢酸である。

本発明の具体的な好ましい酸−塩基複合体は：トリフルオロ酢酸とＨｕｎｉｇ塩基との複合体；トリフルオロ酢酸と２−ピコリンとの複合体；並びにトリフルオロ酢酸とｓｙｎ−コリジンとの複合体を含む。特に好ましい酸−塩基複合体は、トリフルオロ酢酸とＨｕｎｉｇ塩基との複合体である。

酸−塩基複合体を形成させるために幅広い範囲の既知のあらゆる方法を、本発明による酸−塩基複合体の製造に使用するために適用することができる。例えば、ある態様において、本発明の酸−塩基複合体は、少なくとも一つの酸を少なくとも一つの塩基に導入して、複合体を形成させることによって製造される。

本発明の酸及び塩基を、溶媒の存在又は非存在下で導入して、本発明の複合体を形成させることができる。溶媒の存在を含む態様において、酸及び／又は塩基のいずれか又は両方は、複合体を形成させるために酸及び塩基を接触させる前に、まず溶媒中に溶解して、酸溶液及び／又は塩基溶液を形成させることができる。本発明の酸−塩基複合体の形成において使用される溶媒は、本発明のホスフィチル化反応において所望により使用されるあらゆる溶媒と同一であっても、異なっていてもよい。本発明による酸−塩基複合体の製造において使用するために適した溶媒は、非極性又は極性の非プロトン性溶媒を含む。適した非極性及び極性の非プロトン性溶媒の例は：酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、等のような酢酸エステル；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、等のようなエーテル；トルエン、クロロベンゼン、等のような芳香族溶媒；ジクロロメタン；アセトニトリル；Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びこれらの二つ又はそれより多い組合せを含む。ある態様において、酸−塩基複合体の塩基、又は複合体自体が溶媒として作用することができる。

あらゆる適した量の酸及び塩基を本発明の酸−塩基複合体の調製に使用することができる。一般的に、酸及び塩基成分が複合体中に約１：１のモル比で存在するように、十分な酸及び塩基を使用しなければならない。ある態様において、約０．９ないし約１．５当量の塩基及び約０．９ないし約１．５当量の酸が使用される。好ましくは、約０．９ないし約１．３当量の塩基及び約０．９ないし約１．１当量の酸が使用され、そしてなお更に好ましくは約１．０ないし約１．３当量の塩基及び約１．０ないし約１．０５当量の酸が使用される。ある特に好ましい態様において、約１．３当量の塩基及び約１．０５当量の酸が使用される。他に示されない限り、全ての当量は、モル当量である。

本発明の酸−塩基複合体は、本発明のホスフィチル化反応で、ｉｎ ｓｉｔｕで形成させることができるか、又はこれらとは別に形成させることができる。複合体がｉｎ ｓｉｔｕで形成される態様において、複合体は、ホスフィン及び／又はヒドロキシル含有化合物のいずれかを加える前に、反応混合物中で形成させることができる。別の方法として、複合体は、ホスフィン及び／又はヒドロキシル含有化合物の両方の反応混合物への導入後に、複合体の酸及び／又は塩基のその後の添加によって調製することができる。

本発明の複合体を形成させるために、あらゆる適した反応条件を使用することができる。例えば、ある態様において、本発明の酸及び塩基は、約０℃ないし約１００℃の温度で混合される。好ましくは、酸及び塩基は、約１０℃ないし約６０℃、そして更に好ましくは約１５℃ないし約４０℃の温度で混合される。

Ｂ．双性イオン複合体
本明細書中で使用される場合、「双性イオン複合体」という用語は、一般的に当技術分野において知られるように、同一分子（即ち内部塩）内にカチオン及びアニオンを有する複合体イオンを指す。本出願人は、このような双性イオン複合体が本発明によるホスフィチル化活性化剤として使用するために適していることを予期せずに見出した。

幅広い範囲のあらゆる双性イオン性化合物／内部塩は、本発明による使用のために適している。適した双性イオン性化合物の例は、ピリジンエタンスルホン酸、等のようなスルホン酸化合物を含む。

ホスフィチル化剤
本明細書中で使用される場合、「ホスフィチル化剤」という用語は、一般的にヒドロキシル含有化合物とホスフィチル化活性化剤に存在下で反応して、ヒドロキシル含有化合物のヒドロキシル基の酸素原子とホスフィチル化剤のリン原子との間に結合を形成して、ホスフィチル化化合物を形成させることが可能なあらゆる試薬化合物を指す。幅広い範囲のあらゆる化合物が、本発明によるホスフィチル化剤として使用するために適している。適した化合物は、例えば、ビス−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフィンのようなアルコキシ−ビス（ジアルキルアミノ）ホスフィン；ジアルコキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィン；アルコキシ−アルキル（ジアルキルアミノ）ホスフィン、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−メチルトリフルオロアセチルアミノエトキシホスフィン；ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−ジフェニル−メチルシリルエトキシホスフィン；（アリルオキシ）ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ホスフィン；等を含むビス置換されたホスフィンのようなホスフィン；並びに、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト；メトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト；メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト、等、を含むヒドロキシル−保護−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ホスホロアミダイト；並びに５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシアデノシン（Ｎ^６−ベンゾイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−（Ｎ^４−ベンゾイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシグアノシン（Ｎ^２−イソブチロイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト、等のような３’−Ｏ−ホスホロアミダイトのようなホスホロアミダイト；並びに二つ又はそれより多いこれらの混合物を含む。好ましいホスフィチル化剤は、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト、メトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトのようなヒドロキシル−保護−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシアデノシン（Ｎ^６−ベンゾイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−（Ｎ^４−ベンゾイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシグアノシン（Ｎ^２−イソブチロイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト、及び５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイトを含む。特に好ましい態様において、ホスフィチル化剤は、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトである。

ヒドロキシル含有化合物
本明細書中で使用される場合、「ヒドロキシル含有化合物」という用語は、一般的にホスフィチル化剤とホスフィチル化活性化剤の存在下で反応して、ヒドロキシル含有化合物の少なくとも一つのヒドロキシル基の酸素原子とホスフィチル化剤のリン原子との間に結合を形成して、ホスフィチル化化合物を形成させることが可能な、少なくとも一つのヒドロキシル基を含有する化合物を指す。一般的に、ホスフィチル化剤とホスフィチル化活性化剤の存在下で反応して、ヒドロキシル含有化合物の少なくとも一つのヒドロキシル基の酸素原子とホスフィチル化剤のリン原子との間に結合を形成して、ホスフィチル化化合物を形成させることが可能な、少なくとも一つのヒドロキシル基を含んでなるあらゆる化合物は、本発明によるヒドロキシル含有化合物として使用するために適している。ある好ましい態様において、本発明のヒドロキシル含有化合物は、連鎖核酸（ＬＮＡ）誘導体及び更なる基、例えば、ハロゲン置換基で置換されたヌクレオシド、ビオチン−又はフルオレセン−連結化合物を含む検出基含有ヌクレオシド；アンチセンス作用を促進するリガンドを伴うエフェクター含有化合物を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡヌクレオシドを含むあらゆる天然の及び／又は非天然のヌクレオシド；並びにこれらの二つ又はそれより多くから誘導されたオリゴマー構造を含む。適したＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドの例は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、及びデオキシグアノシンの５’−Ｏ−保護ヌクレオシドを含む、５’−Ｏ−保護ヌクレオシド（ベンゾイル、イソブチリル、ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル“ＴＡＣ”、等による保護のようなＮ−保護を伴う又は伴わない）；アデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンの５’−Ｏ−保護−２’−保護ヌクレオシド（ここにおいて好ましい２’−保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル、メトキシメチル（ＭＯＭ）、メトキシエチル（ＭＯＥ）及びメトキシ基のようなアルコキシを含む）を含む、５’−Ｏ−保護−２’−保護ヌクレオシド（更なるＮ−保護を伴う又は伴わない）、並びにアデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、及びデオキシグアノシンの３’−Ｏ−保護ヌクレオシド（更なるＮ−保護を伴う又は伴わない）のような保護されたヌクレオシド、並びにこれらから誘導されたオリゴマー構造を含む。

反応溶媒及び条件
本発明の方法は、バッチ又は連続法として使用するために適用することができる。
ある態様によれば、本発明のホスフィチル化法の反応工程は、更に溶媒を含んでなる。本発明のホスフィチル化反応において使用される溶媒は、本発明の酸−塩基複合体の形成において使用されるあらゆる所望による溶媒と同一であっても、異なっていてもよい。本発明によるホスフィチル化反応において使用するために適した溶媒は、非極性及び極性の非プロトン性溶媒を含む。適した非極性及び極性の非プロトン性溶媒の例は：酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、等のような酢酸エステル；ＴＨＦ、ＭＴＢＥ、等のようなエーテル；トルエン、クロロベンゼン、等のような芳香族溶媒；ジクロロメタン；アセトニトリル；ＮＭＰ；ＤＭＦ及びこれらの二つ又はそれより多い組合せを含む。ある態様において、酸−塩基複合体の塩基、又は複合体自体が溶媒として作用することができる。

あらゆる適した量のヒドロキシル含有化合物及びホスフィチル化剤を本発明の方法において使用することができる。ある態様において、約０．９ないし約１．５当量のヒドロキシル含有及び約０．９ないし約１．５当量のホスフィチル化剤が使用される。好ましくは、約０．９ないし約１．１当量のヒドロキシル含有化合物及び約０．９ないし約１．３当量のホスフィチル化剤が使用され、なお更に好ましくは約０．９ないし約１．１当量のヒドロキシル含有化合物及び約１．０ないし約１．３当量のホスフィチル化剤が使用される。ある特に好ましい態様において、約１．０当量のヒドロキシル含有化合物及び約１．１当量のホスフィチル化剤が使用される。他に示されない限り、全ての当量は、モル当量である。

参照により本明細書に含まれるものとされるあらゆる文書に開示されている条件を含むあらゆる適した反応条件を、本発明のホスフィチル化反応において使用することができる。ある態様において、本発明のホスフィチル化反応は、約０℃ないし約１００℃の温度で行われる。好ましくは、ホスフィチル化反応は、約０℃ないし約４０℃、そして更に好ましくは約２０℃の温度で行われる。

本発明の方法によって調製されたホスフィチル化化合物は、当技術分野において既知のあらゆる適した方法によって精製することができる。例えば、水洗浄、乾燥、減圧下の濃縮、クロマトグラフィー、蒸留、結晶化、沈殿等を使用することができる。

ある好ましい態様によれば、３’−Ｏ−ホスホロアミダイトのような比較的高純度のホスフィチル化化合物が、溶液中のホスフィチル化化合物を沈殿させることによって得ることができることを。本出願人は見出した。ある好ましい態様において、本発明の沈殿法は、沈殿させるべきホスフィチル化化合物及び溶媒を含んでなる化合物の溶液を用意し、そして前記の化合物の溶液を沈殿溶媒と接触させて、ホスフィチル化化合物を沈殿させることを含んでなる。

幅広い範囲のあらゆる適した溶媒を、本発明による化合物の溶液に使用することができる。適した化合物の溶液の溶媒の例は：トルエン、キシレン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、二つ又はそれより多いこれらの組合せ等を含む。好ましい化合物の溶液の溶媒は、トルエン等を含む。

化合物の溶液は、本発明による方法の幅広い範囲のいずれによっても得ることができる。ある好ましい態様において、化合物の溶液は、本発明のホスフィチル化反応の生成物として得られる。このような溶液は、ホスフィチル化反応から直接得ることができ、又は反応生成物を精製し、そしてこのような精製された生成物を溶解することによって得ることができる。別の方法として、本発明の反応以外の供給源から得られたホスフィチル化化合物を、化合物の溶液の溶媒に溶解して、本発明による化合物の溶液を得ることができる。

石油エーテル、ペンタン、ヘキサン、イソヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、等、及び二つ又はそれより多いこれらの混合物のようなアルカンを含む、あらゆる適した沈殿溶媒を、本発明によるホスフィチル化化合物を沈殿させるために使用することができる。好ましい沈殿溶媒は、石油エーテル、ヘキサン、二つ又はそれより多いこれらの混合物、等を含む。

ある好ましい態様において、本発明の方法の沈殿物の構造に影響を与えるために、一つ又はそれより多い添加剤を沈殿溶媒に加えることができる。適した添加剤の例は、例えば、トリエチルアミン、等を含む。あらゆる適した量の添加剤を本発明による沈殿物の溶液に加えることができる。ある好ましい態様において、沈殿溶媒及び添加剤の合計重量に基づいて約０ないし約１０重量％の添加剤が使用され、好ましくは約０ないし約５％が使用される。

化合物の溶液と沈殿溶媒／添加剤のあらゆる適した比を、本発明の方法によって使用することができる。ある好ましい態様において、化合物の溶液は、沈殿溶媒又は沈殿溶媒及び添加剤（存在する場合）の、約５ないし約２５重量当量、好ましくは約２０ないし約２５当量加えられる。

沈殿は、あらゆる適した条件下で、そしてあらゆる適した実験室の機器を使用して行うことができる。好ましくは沈殿は、窒素、アルゴン、等のような不活性ガス雰囲気下で行われる。あらゆる適した温度、例えば、約−２０℃ないし約４０℃を使用することができる。好ましくは、沈殿は、約０℃ないし約３０℃、そして更に好ましくは、約５℃ないし約２５℃の温度で行われる。あらゆる適した容器を、沈殿のために使用することができる。ある好ましい態様において、ステンレス鋼の容器が使用される。

自動化オリゴヌクレオチド合成
当業者によって認識されるように、オリゴヌクレオチドは、本発明によるヌクレオシド及び／又はそれから誘導されたオリゴマーを含んでなるヒドロキシル含有化合物から、先に記載したバッチ及び／又は連続法だけではなく、更に例えばＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｌｓ ３９２ ａｎｄ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ；Ｓｅｃｔｉｏｎ ６ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍａｒｃｈ）１９９４及びＭ．Ｊ．Ｇａｉｔ，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８４，ＩＳＢＮ ０−９０４１４７−７４−６）中に記載されているような自動化オリゴヌクレオチド合成法を使用して合成することができ、これらは参照により本明細書に含まれるものとされる。このような態様において、ヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチドのヒドロキシル含有化合物は、固相支持体上に固定化され、そして自動化ＤＮＡ合成装置内で、ヌクレオシドホスフィチル化剤と、ホスフィチル化活性化剤の存在下で反応して、オリゴヌクレオチドを形成させる。規定された数及び配列のホスフィチル化反応を、本発明による異なった長さ及び配列のヌクレオシドを含んでなるオリゴヌクレオチドを製造するために行うことができる。

あらゆる適した固相支持物質を、本発明における使用のために適用することができる。適した固相支持物質の例は、コントロールドポアグラス（“ＣＰＧ”）、ポリスチレン、シリカ、セルロース紙、及び二つ又はそれより多いこれらの組み合わせを含む。固相支持物質の好ましい群は、コントロールドポアグラス、ポリスチレン、及びこれらの組合わせを含む。

本発明の方法における使用のための固相支持体は、あらゆる適した大きさの細孔を有することができる。当業者によって認識されるように、細孔の大きさの選択は、製造されるオリゴマーの大きさ及び使用されるヌクレオチド合成の手順に少なくとも部分的に依存する。本明細書中の教示を考慮すれば、当業者は、広い多種の適用において使用するための適当な細孔の大きさの固相支持物質を容易に選択することが可能であるものである。

各種の固相支持体に固定化されたヌクレオシドが、商業的に入手可能である。例えば、ＣＰＧ上に固定化された多くのｎ−保護デオキシヌクレオシド（１０００オングストロームのＣＰＧ上の０．２マイクロモルのベンゾイル保護デオキシシトシンを含む）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）から入手可能である。

幅広い範囲の自動化ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置のいずれをも、本発明における使用のために適用することができる。適したＤＮＡ合成装置の例は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＭｏｄｅｌ Ｎｏｓ．３９００、３８０Ｂ、３９２及び３９４、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８８００、８９０５、８９０９、Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ、ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ、ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ ＩＩ、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １０、及びＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １００、並びにＢｅｃｋｍａｎｎ Ｏｌｉｇｏ １０００及び１０００Ｍ、ｔｈｅ ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｏｌｉｇｏ ２０００、ＰｏｌｙＰｌｅｘ ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｏｌｉｇｏｔｏｒ、ＭｅｒＭａｄｅ Ｉ ａｎｄ ＩＩ、Ｉｍｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ ＢｉｏＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｔａｔｉｏｎ ９６０、Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｐｏｌｙｇｅｎ、Ｓｙｎｔｏｗｅｒ、等を含む。合成装置の好ましい群は、Ｍｏｄｅｌ ３９４、等を含む。

あらゆる適した量の固体支持ヒドロキシル含有化合物及びホスフィチル化剤を、本発明の自動化された方法によって使用することができる。ある好ましい態様において、過剰の、好ましくは５０倍過剰のホスフィチル化剤が、それぞれの反応に使用される。

本発明は、以下の実施例を参照して更に説明されるが、これらは、例示を意図したものであり、いかなる方法でも限定するものではない。
実施例１−１１
本実施例は、いくつかの保護されたヌクレオシド試薬の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトによる、いくつかの活性化剤の存在下における、本発明によるホスフィチル化を例示する。

保護されたヌクレオシド試薬を、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトと、本発明による酸−塩基活性化剤の存在下で反応させることを含んでなる、１１のホスフィチル化反応（１−１１）を行い、そして以下の一般的手順中に記載されるように、生成物の収率をそれぞれ計算した。１１の反応のそれぞれに対する保護されたヌクレオシド、活性化剤の塩基、活性化剤の酸、溶媒の各種の組合わせ、及び収率を表１に列挙する。

一般的手順：活性化剤の塩基（１．１ないし１．２当量）を溶媒に加え、そしてその後０．９５ないし１．１当量の活性化剤の酸を周囲温度でそれに加えて、活性化剤の溶液を形成させる。約１当量の保護されたヌクレオシドを別個の容器中の約１０当量の溶媒中に溶解し、そして次いで約３当量の溶媒を減圧下で蒸留して除去する。約１ないし１．２当量の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトをヌクレオシド混合物に周囲温度で加え、そして次いで先に調製した活性化剤の溶液をヌクレオシド混合物に周囲温度で激しく攪拌しながら加える。１２時間後、反応混合物をトルエンで希釈し、そして水で洗浄する。有機層を分離し、必要な場合硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下で濃縮する。次いで所望するアミダイトの収率を、ＨＰＬＣ法を使用して計算する。即ち、得られた生成物の混合物を適当な溶出剤を使用したＨＰＬＣカラムにかけ、そしてＨＰＬＣのピーク下の面積を使用して、混合物中の生成物の収率％を決定する。

ＤＭＴ＝ジメトキシトリチル；Ｂｚ＝ベンゾイル；ｉＢｕ＝イソブチロイル。
実施例１２−１８
本実施例は、いくつかの保護されたヌクレオシド試薬の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトによる、本発明によるＨｕｎｉｇ塩基−ＴＦＡ活性化剤の存在下のホスフィチル化を例示する。

式ＩＩＩ（以下の）：

［式中、Ｂは、Ｎ^６−ベンゾイル−アデニン（Ａ（Ｂｚ））、Ｎ^４−ベンゾイル−シチシン（Ｃ（Ｂｚ））、Ｎ^２−イソブチロイル−グアニン（Ｇ（ｉＢｕ））、チミン（Ｔ）、又はウラシル（Ｕ）から誘導された部分であり、そしてＸは、水素、ＯＴＢＤＭＳ、又はメトキシ（ＯＭｅ）であり、それぞれのヌクレオシドに対する特定のＸ及びＢの意義及びそれぞれの反応に対する収率％を、表２に示す］
の７つのヌクレオシド試薬を、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトと、Ｈｕｎｉｇ塩基−ＴＦＡ活性化剤の存在下で、実施例１−１１のための一般的手順により反応させ、そして生成物の収率を二つの方法の一つによって計算した：（１）得られた生成物の混合物を、適当な溶出剤を使用したＨＰＬＣカラムにかけ、そしてＨＰＬＣピーク下の面積を使用して、混合物中の生成物の収率％を決定する；又は（２）得られた生成物を、酢酸メチル／トルエンの混合物を使用した短いシリカゲルカラムで精製する（濃縮は精製される特定の生成物による）。適当な生成物の画分を減圧下で、そして所望するアミダイトの約５０％溶液を得るまで溶媒を濃縮する。この溶液を約５ないし２５当量の石油エーテルに加えて、生成物を沈殿させ、これを濾過し、そして石油エーテルで洗浄する。次いで生成物を乾燥し、秤量し、そして収率％を計算する。

ＯＴＢＤＭＳ、又はメトキシ（ＯＭｅ）である。それぞれのヌクレオシドに対する特定のＸ及びＢの意義及びそれぞれの反応に対する収率％を、表２に示す。

実施例１９
この実施例は、Ｎ^６−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシン（Ｂｚ−ＤＭＴ−ｄＡ）の、本発明によるジイソプロピルエチルアンモニウムトリフルオロ酢酸塩及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロ−ジアミダイトとのホスフィチル化を例示する。

ジイソプロピルエチルアミン６．４ｇ（４９．４ミリモル）を、反応容器中の２０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中に溶解する。トリフルオロ酢酸４．９ｇ（４３．６ミリモル）を、ＴＨＦ混合物に周囲温度で加えて、以下の反応工程において使用するための活性化剤の溶液を形成させる。

Ｂｚ−ＤＭＴ−ｄＡ３０ｇ（４５ミリモル）を反応容器中の１８５ｍｌの乾燥ＴＨＦ中に溶解し、そして次いで５０ｍｌのＴＨＦを減圧下で蒸留して除去して、反応混合物を形成させる。反応混合物に、１４．７ｇ（４７．２ミリモル）の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを周囲温度で加える。次いで上記で調製した活性化剤の溶液を、周囲温度で激しく攪拌しながら反応混合物に加える。１２時間後、反応混合物を８０ｍｌのトルエンで希釈し、そして５０ｍｌの水で洗浄する。有機層を分離し、そして減圧下で濃縮する。得られた生成物を、酢酸メチル／トルエン（８０／２０）を用いて短いシリカゲルカラムで精製する。適当な生成物の画分を、減圧下で、そして５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシアデノシン−（Ｎ^６−ベンゾイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト（ＰＡｍ−Ｂｚ−ＤＭＴ−ｄＡ）の約５０％の溶液が得られるまで溶媒を濃縮する。この約５０％の溶液を、激しく攪拌しながら（約５００−６００ｒｐｍ）、５００ｍｌのヘキサンが入った機械的攪拌機付きの１Ｌのステンレス鋼の反応器に周囲温度で加える。３時間後、得られた沈殿物を濾過し、５０ｍｌのヘキサンで洗浄し、そして乾燥して、３２ｇ（８３％）のＰａｍ−Ｂｚ−ＤＭＴ−ｄＡを得る。

実施例２０
この実施例は、Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン（Ｂｚ−ＤＭＴ−ｄＣ）の、本発明によるジイソプロピルエチルアンモニウムトリフルオロ酢酸塩及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトとのホスフィチル化を例示する。

ジイソプロピルエチルアミン２２．４ｇ（１７３ミリモル）を、反応容器中の３０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中に溶解する。トリフルオロ酢酸１８．４ｇ（１６４ミリモル）を、ＴＨＦの混合物に周囲温度で加えて、以下の反応工程で使用するための活性化剤の溶液を形成させる。

Ｂｚ−ＤＭＴ−ｄＣ１０３ｇ（１５８．３ミリモル）を、反応容器中の４５０ｍｌの乾燥トルエン中に溶解し、そして次いで１００ｍｌのトルエンを減圧化で蒸留して除去して、反応混合物を形成させる。反応混合物に、５１．４ｇ（１７０．５ミリモル）の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを周囲温度で加える。次いで上記で調製した活性化剤の溶液を、反応混合物に周囲温度で激しく攪拌しながら加える。１２時間後、反応混合物を１００ｍｌの酢酸アンモニウム水溶液で２回洗浄する。有機層を分離し、そして減圧下で濃縮する。得られた生成物を、酢酸メチル／トルエン／トリエチルアミン（１００／３０／２）を用いて短いシリカゲルカラムで精製する。適当な生成物の画分を、減圧下で、そして５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’デオキシシチジン−（Ｎ４−ベンゾイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト（ＰＡｍ−Ｂｚ−ＤＭＴ−ｄＣ）のトルエン中の約５０％の溶液が得られるまで溶媒を濃縮する。機械的攪拌機付きの３Ｌのステンレス鋼の反応器を使用して、この溶液を１８８０ｍｌのヘキサン中の１９ｇのトリエチルアミンの溶液に激しく攪拌しながら（５００−６００ｒｐｍ）５℃で加えた。３時間後、得られた沈殿物を濾過し、１００ｍｌのヘキサンで洗浄し、そして乾燥して、１１２ｇ（８５％）のＰＡｍ−Ｂｚ−ＤＭＴ−ｄＣを得る。

比較実施例１−３
保護されたヌクレオシド試薬を、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトと、ピリジン−ＴＦＡ活性化剤の存在下で反応させることを含んでなる三つの比較ホスフィチル化反応（Ｃ１−Ｃ３）を行った。それぞれの生成物の収率を、実施例１２−１８に対して先に記載した一般的手順によって計算した。保護されたヌクレオシド、溶媒の各種の組合わせ、及び三つの反応のそれぞれに対する収率を、表３に列挙する。表３中の収率によって例示されるように（表１及び２のものと比較して）、本発明の方法に伴う収率は、より妨害されていない未置換のピリジンの塩を含んでなる従来の活性化剤を使用する比較反応による収率と比較して、驚くべきことに少なくとも同等、そして多くの態様において、これらより良好である傾向がある。

実施例２１
この実施例は、本発明による自動化合成法を使用した、二つのオリゴヌクレオチド配列（５’−ＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＴＴＣ−３’）及び（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’）の製造を例示する。

ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ合成装置に、ＣＰＧ（１０００オングストローム）上の０．２マイクロモルのベンゾイル保護デオキシシトシン（ＡＢＩから入手）を含んでなる四つの合成カラムを設置した。合成装置に更に、反応のヌクレオシドホスフィチル化剤の供給源として作用する四つの３’−Ｏ−ホスホロアミダイト（それぞれｄＣ、ｄＡ、ｄＧ、及びＴに基づく）の一つをそれぞれ含んでなる四つのビンを設置した。合成装置に、更に以下の溶液：
活性化剤溶液：１．０ＭのＨｕｎｉｇ塩基／ＴＦＡ複合体（８．９グラムのジイソプロピルエチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を４３．０グラムのアセトニトリル中の８．９グラムのＴＦＡ（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ）と組合わせることによって製造）；
Ｄｅｂｌｏｃｋ−Ｔ：ジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸；
Ａ Ｃａｐ：１０％無水酢酸／１０％ピリジン／８０％ＴＨＦ；
Ｂ Ｃａｐ：１０％Ｎ−メチルイミダゾール／８０％ＴＨＦ；及び
酸化Ｔ：０．０２Ｍヨウ素／２％水／２０％ピリジン／７８％ＴＨＦ；
の供給源を設置した。

カップリング当り５０倍過剰のヌクレオシドホスフィチル化剤を順番に反応させて、所望するオリゴヌクレオチド“ｆｏｓ−２１”（５’−ＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＴＴＣ−３’）及び“ＣＴ１０”（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’）を製造した。ＨＰＬＣ分析を、ＰＤＡ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣを使用して行った。Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＬＣ ３Ｄソフトウェアを使用して、データを収集及び分析した。使用したｈｐｌｃカラムは、Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｋ １００（４×２５０ｍｍ）カラムであった。１．０ｍｌ／分の流量で直線的勾配を使用した。移動相は：Ｂ、１０ｍＭのＮａＣｌＯ_４、１０ｍＭのｐＨ８．３のトリス；Ｄ、３００ｍＭのＮａＣｌＯ_４、１０ｍＭのｐＨ８．３のトリスであった。勾配のプログラムは以下のとおり：
オリゴヌクレオチドＨＰＬＣ分析勾配プログラム−４５分

であった。
オリゴヌクレオチドを、水中のｍｌ当り５０ｍｇの濃度で分析のために調製した。ＯＤ２６０のピークの未精製ＤＮＡの収率の値を濃度を計算するために使用した。３０ｍｌの試料注入を行った。それぞれのオリゴヌクレオチドに対して四つの試料を試験した。平均収率は、ｆｏｓ−２１に対して約４２．７％、そしてＣＴ−１０に対して約８５．２％と測定された。

比較実施例４
この実施例は、自動化合成においてテトラゾール及びピリジン−ＴＦＡ活性化剤を使用した、二つのオリゴヌクレオチド配列（５’−ＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＴＴＣ−３’）及び（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’）の合成を例示する。

オリゴヌクレオチド配列（５’−ＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＴＴＣ−３’）及び（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’）をそれぞれ合成し、そして慣用的な活性化剤の溶液を使用した以外は、実施例２２に記載したように試験した。一つの実験において、（５’−ＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＴＴＣ−３’）及び（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’）の両方を、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｉｎｃ．から入手したテトラゾールを活性化剤として使用して製造した。もう一つの実験において、（５’−ＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＴＴＣ−３’）及び（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’）の両方を、米国特許第６，２７４，７２５号に記載されているようなピリジン−ＴＦＡ活性化剤を使用して製造した。

テトラゾールを活性化剤として使用した（５’−ＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＴＴＣ−３’）の平均収率は、６５．６％であり、ピリジン−ＴＦＡを使用した場合５８．１％であった。テトラゾールを活性化剤として使用した（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’）の平均収率は、８７．３％であり、そしてピリジン−ＴＦＡを使用した場合８６．０％であった。

Claims (35)

1. ヒドロキシル含有化合物を、ホスフィチル化剤と：
   （１）以下の式Ｉ：
   

   

   ［式中、Ｒ、Ｒ^１、及びＲ^２は、独立にＣ_１−Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０アリール、Ｃ_１−Ｃ_１０アラルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０ヘテロアルキル、又はＣ_１−Ｃ_１０ヘテロアリールである］
   のアミン塩基から誘導される酸−塩基複合体；
   （２）以下の式ＩＩ：
   

   

   ［式中、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７は、独立に水素、Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０アリール、Ｃ_１−Ｃ_１０アラルキル、Ｃ_１−Ｃ_１０ヘテロアルキル、又はＣ_１−Ｃ_１０ヘテロアリールであり、そして前記Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７の少なくとも一つは水素ではない］
   のアミン塩基から誘導された酸−塩基複合体；
   （３）ジアザビシクロアミン塩基から誘導された酸−塩基複合体；
   （４）双性イオンアミン性複合体；及び
   （５）二つ又はそれより多いこれらの組合せ；
   からなる群から選択されるホスフィチル化活性化剤の存在下で反応させて、ホスフィチル化化合物を製造するための工程を含んでなる、ホスフィチル化化合物を製造する方法。
2. 前記ホスフィチル化活性化剤が、式Ｉのアミン塩基から誘導された酸−塩基複合体である、請求項１に記載の方法。
3. 前記式Ｉのアミン塩基が、ジイソプロピルエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ジエチルメチルアミン、ＮＭＭ、ＴＭＥＤＡ、トリベンジルアミン、及び二つ又はそれより多いこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記式Ｉのアミン塩基が、ジイソプロピルエチルアミンである、請求項３に記載の方法。
5. 前記ホスフィチル化活性化剤が、更にトリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、４−ピリジニウムエチレンスルホン酸、無水塩酸、無水臭化水素、無水ヨウ化水素、及びＨＢＦ_４からなる群から選択される酸から誘導される、請求項２に記載の方法。
6. 前記酸−塩基複合体が、更にトリフルオロ酢酸から誘導される、請求項４に記載の方法。
7. 前記ホスフィチル化活性化剤が、式ＩＩのアミン塩基から誘導された酸−塩基複合体である、請求項１に記載の方法。
8. 前記式ＩＩのアミン塩基が、ジメチルアニリン、ＤＭＡＰ、４−ジメチルアミノピリジウム、メチルピリジン、２−ピコリン、３−ピコリン、ジメチルピリジン、２，６−ルチジン、トリメチルピリジン、２，４，６−コリジン、ｓｙｎ−コリジン、テトラメチルピリジン、ペンタメチルピリジン、及び二つ又はそれより多いこれらの組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記式ＩＩのアミン塩基が、２−ピコリン又はｓｙｎ−コリジンである、請求項８に記載の方法。
10. 前記ホスフィチル化活性化剤が、更にトリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、４−ピリジニウムエチレンスルホン酸、無水塩酸、無水臭化水素、無水ヨウ化水素、及びＨＢＦ_４からなる群から選択される酸から誘導される、請求項８に記載の方法。
11. 前記酸−塩基複合体が、更にトリフルオロ酢酸から誘導される、請求項９に記載の方法。
12. 前記ホスフィチル化活性化剤が、ＤＢＵ、ＤＢＮ、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン及びこれらの組合せからなる群から選択されるジアザビシクロアミン塩基から誘導される酸−塩基複合体である、請求項１に記載の方法。
13. 前記ホスフィチル化活性化剤が、双姓イオン性アミン複合体である、請求項１に記載の方法。
14. 前記双性イオン性アミン複合体が、ピリジンエタンスルホン酸を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ヒドロキシル含有化合物が、ヌクレオシド又はそれから誘導されたオリゴマーである、請求項１に記載の方法。
16. 前記ヌクレオシドが、５’−Ｏ−保護ヌクレオシドである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ホスフィチル化剤が、ビス−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフィン；ジアルコキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィン；アルコキシ−アルキル（ジアルキルアミノ）ホスフィン、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−メチルトリフルオロアセチルアミノエトキシホスフィン；ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−ジフェニル−メチルシリルエトキシホスフィン；（アリルオキシ）ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ホスフィン；２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト；メトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト；メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト；及び二つ又はそれより多いこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
18. 前記ホスフィチル化剤が、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト及びメトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ホスフィチル化剤が、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトである、請求項１８に記載の方法。
20. 更に沈殿溶媒中でホスフィチル化化合物を沈殿させる工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
21. 前記沈殿工程が、ホスフィチル化化合物及び溶媒を含んでなる化合物の溶液を用意し、そして前記化合物の溶液を沈殿溶媒と接触させて、ホスフィチル化化合物を沈殿させることを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
22. 前記沈殿溶媒が、石油エーテルを含んでなる請求項２１に記載の方法。
23. ５’−Ｏ−保護−ヌクレオシドを、ホスフィチル化剤と、トリフルオロ酢酸−ジイソプロピルエチルアミン複合体の存在下で反応させて、３’−Ｏ−ホスホロアミダイトを形成させる工程を含んでなる、ホスフィチル化化合物を製造する方法。
24. 前記ホスフィチル化剤が、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記５’−Ｏ−保護−ヌクレオシドが、Ｎ^６−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシン、Ｎ^４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン、Ｎ^２−イソブチロイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシグアノシン、及び５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−チミジンからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記３’−Ｏ−ホスホロアミダイトが、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシアデノシン（Ｎ^６−ベンゾイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−（Ｎ^４−ベンゾイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシグアノシン（Ｎ^２−イソブチロイル）−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト、及び５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
27. 前記３’−Ｏ−ホスホロアミダイトが、前記３’−Ｏ−ホスホロアミダイトの沈殿溶媒中の沈殿によって精製される、請求項２３に記載の方法。
28. 請求項２３に記載の方法によって製造されたホスフィチル化化合物。
29. ５’−Ｏ−保護−ヌクレオシドから誘導されたオリゴマーを、３’−Ｏ−ホスホロアミダイトと、トリフルオロ酢酸−ジイソプロピルエチルアミン複合体の存在下で反応させて、ホスフィチル化オリゴマー化合物を形成させる工程を含んでなる、ホスフィチル化化合物を製造する方法。
30. 前記反応が、自動化ＤＮＡ合成装置中で行われる、請求項２９に記載の方法。
31. 請求項２９に記載の方法によって製造されたホスフィチル化オリゴマー化合物。
32. ホスフィチル化化合物及び溶媒を含んでなる化合物の溶液を用意し、そして前記化合物の溶液を沈殿溶媒と接触させて、精製されたホスフィチル化化合物を沈殿させる工程を含んでなる、ホスフィチル化化合物を精製する方法。
33. 前記沈殿溶媒が、石油エーテルを含んでなる、請求項３２に記載の方法。
34. 前記接触工程が、約５℃ないし約２５℃の温度で行われる、請求項３３に記載の方法。
35. 前記接触工程が、ステンレス鋼の容器中で行われる、請求項３４に記載の方法。