Claims (6)
Zastrzeżenia patentc^wePatent Claims
1. 3gtacagtagaagatc5 1. 3 gtacagtagaagatc 5
1. Sposób wytwarzania oligonukleotydów o ogólnym wzorze 1, w którym R2 oznacza grupę OH lub grupę etoksylową, Y oznacza atom tlenu, m = 1, n oznacza liczbę 0-200, a B oznacza resztę adeniny, guaniny lub cytozyny o wzorach odpowiednio 2, 3 albo 4, w których R1 oznacza atom wodoru lub B oznacza resztę tyminy o wzorze 5 z tym, że wszystkie B nie oznaczają tyminy, przez prowadzoną w obecności czynnika sprzęgającego kondensację w pozycjach 5' i 3' kolejnych nukleozydów, takich jak pochodne adenozyny, guanozyny, cytydyny i tymidyny, z których to nukleozydów pierwszy jest związany kowalencyjnie ze stałym nośnikiem, utlenianie produktu każdej kondensacji i usuwanie grupy zabezpieczającej funckję 5' - hydroksylową oraz odszczepianie wytworzonego digonukleotydu od stałego nośnika, znamienny tym, że jako pochodne adenozyny, guanozyny i cytydyny stosuje się nukleozydy o wzorze 6 lub o wzorze 7, jeżeli pochodna ta jest pierwszym nukleozydem, w których to wzorach Z oznacza atom wodoru, a dla wzoru 6 grupę dimetoksytrifenylometylową, R2 oznacza grupę 2-cyjanoetoksylową lub etoksylową, R3 oznacza grupę diizopropyloaminową, dimetyloaminową lub grupę morfolinową, S oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem, m = 0, a B' oznacza resztę adeniny, guaniny lub cytozyny o wzorach odpowiednio 2, 3 albo 4, w których R1 oznacza grupę izopropoksyacetylową, przy czym grupę blokującą funkcję 5' - hydroksylową usuwa się z ostatniego nukleotydu przez kwaśną hydrolizę, przed odszczepieniem produktu od nośnika lub po odszczepieniu go i oczyszczeniu.A method for the production of oligonucleotides of general formula I, wherein R2 is OH or ethoxy, Y is oxygen, m = 1, n is 0-200, and B is an adenine, guanine or cytosine residue of the formulas 2, respectively, 3 or 4, in which R1 is hydrogen or B is a thymine residue of formula 5, except that all B are not thymine, by condensation carried out in the presence of a coupling agent at the 5 'and 3' positions of consecutive nucleosides such as adenosine derivatives, guanosine, cytidine and thymidine, the first of which is covalently bound to a solid support, oxidation of the product of each condensation and removal of the 5'-hydroxyl protecting group and cleavage of the produced digonucleotide from the solid support, characterized in that as derivatives of adenosine, guanosine and cytidine the nucleosides of formula 6 or formula 7 are used when this derivative is the first nucleoside, in which formulas Z is hydrogen and for formula 6 a dimethoxytriphenylmethyl, R 2 is 2-cyjanoetoksylową or ethoxy, R3 is diisopropylamino, dimethylamino or morpholino group, S is a solid support with an extended chain, m = 0, and B 'is a residue of adenine, guanine or cytosine of formulas 2 3 or 4, in which R1 is an isopropoxyacetyl group, wherein the 5'-hydroxyl blocking group is removed from the last nucleotide by acid hydrolysis, prior to cleavage of the product from the support or after it has been cleaved and purified.
2. ^TTCTACTGTACCTAG5 2. ^ TTCTACTGTACCTAG 5
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie odszczepiania oligonukleotydu od nośnika jednocześnie odblokowuje się wszystkie grupy aminowe i usuwa grupę 2-cyjanoetylową.2. The method according to p. The method of claim 1, characterized in that in the step of cleaving the oligonucleotide from the support, all amino groups are simultaneously deblocked and the 2-cyanoethyl group is removed.
3. ^TTGGGGCTCACT5 3. ^ TTGGGGCTCACT 5
3. Sposób wytwarzania oligonukleotydów o ogólnym wzorze 1, w którym R2 oznacza grupę trifluoroetoksylową, Y oznacza atom tlenu, m = 1, n oznacza liczbę 0-200, a B oznacza resztę adeniny, guaniny lub cytozyny o wzorach odpowiednio 2, 3 albo 4, w których R1 oznacza atom wodoru lub B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, z tym, że wszystkie B nie oznaczają tyminy, znamienny tym, że nukleozyd o wzorze 7, w którym Z oznacza atom wodoru, S oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem, a B' oznacza resztę adeniny, guaniny lub cytozyny o wzorach odpowiednio 2, 3 albo 4, w których R1 oznacza grupę izopropoksyacetylową, albo B' oznacza resztę tyminy o wzorze 5, kondensuje się w obecności czynnika sprzęgającego z nukleozydem o wzorze 6, w którym Z oznacza grupę zabezpieczającą funkcję 5'-hydroksylową, taką jak grupa dimetoksytrifenylometylowa, R2 oznacza grupę trifluoroetoksylową, R3 oznacza grupę diizopropyloaminową, dietyloaminową lub grupę morfolinową, m = O, a B' ma wyżej podane znaczenie, produkt kondensacji utlenia się jodem lub nadtlenkami, a po odblokowaniu przez kwaśną hydrolizę grupy 5'-hydroksylowej kondensuje się kolejny nukleozyd o wzorze 6, w którym wszystkie symbole mają wyżej podane znaczenie, otrzymany oligonukleotyd odszczepia się od nośnika i oczyszcza, przy czym grupę blokującą funkcję 5' - hydroksylową usuwa się z ostatniego nukleotydu przed odszczepieniem produktu od nośnika lub po oczyszczeniu go.Process for the production of oligonucleotides of general formula I, wherein R2 is a trifluoroethoxy group, Y is an oxygen atom, m = 1, n is 0-200, and B is an adenine, guanine or cytosine residue of the formulas 2, 3 or 4, respectively wherein R1 is hydrogen or B is a thymine residue of formula 5 with the proviso that all B are not thymine, characterized in that the nucleoside of formula 7 in which Z is hydrogen, S is a chain extended solid support, and B 'is an adenine, guanine or cytosine residue of formulas 2, 3 or 4, respectively, wherein R 1 is isopropoxyacetyl, or B' is a thymine residue of formula 5, is condensed in the presence of a coupling agent with a nucleoside of formula 6, wherein Z is a group protecting a 5'-hydroxy function, such as a dimethoxytriphenylmethyl group, R2 is a trifluoroethoxy group, R3 is a diisopropylamino, diethylamino or morpholino group, m = O, and B 'is as defined above, The condensation angle is oxidized with iodine or peroxides, and after deprotection by acid hydrolysis of the 5'-hydroxyl group, another nucleoside of formula 6 is condensed, in which all symbols have the above meaning, the obtained oligonucleotide is cleaved from the support and purified, and the function-blocking group is The 5'-hydroxyl is removed from the last nucleotide before the product is cleaved from the support or after it is purified.
4. 3GTTCGGACATCG5 4. 3GTTCGGACATCG 5
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w etapie odszczepiania oligonukleotydu od nośnika jednocześnie usuwa się grupy blokujące funkcje aminowe.4. The method according to p. The process of claim 3, wherein in the step of cleaving the oligonucleotide from the support, groups that block amino functions are simultaneously removed.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania oligonukleotydów o ogólnym wzorze 1, w którym R2 oznacza grupę OH, grupę etoksylową lub grupę trifluoroetoksylową, Y oznacza atom tlenu, m = 1, n oznacza liczbę 0-200, a B oznacza resztę adeniny, guaniny lub cytozyny o wzorach odpowiednio 2,3 albo 4, w których R1 oznacza atom wodoru lub B oznacza resztę tyminy o wzorze 5 z tym, że wszystkie B nie oznaczają tyminy.The subject of the invention is a process for the preparation of oligonucleotides of general formula I, in which R2 is an OH group, an ethoxy group or a trifluoroethoxy group, Y is an oxygen atom, m = 1, n is 0-200, and B is an adenine, guanine or cytosine residue of Formulas 2,3 or 4, respectively, wherein R 1 is hydrogen or B is a thymine residue of formula 5 with the proviso that all B are not thymine.
Oligonukleotydy o wzorze 1, w którym R2 oznacza grupę hydroksylową, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie stanowią fragmenty genów kodujących biosyntezę białek, obcych dla puli naturalnych białek komórki dokonującej biosyntezy. Oligonukleotydy o wzorze 1, w którymOligonucleotides of formula I, in which R2 represents a hydroxyl group, and the remaining symbols have the meaning given above, are fragments of genes encoding protein biosynthesis, foreign to the pool of natural proteins of the biosynthetic cell. Oligonucleotides of the formula 1, wherein
157 777 3157 777 3
R2 oznacza grupę etoksylową lub trifluoroetoksylową są stosowane w badaniach nad oddziaływaniem oligonukleotydów z białkami.R2 is ethoxy or trifluoroethoxy are used in studies of the interaction of oligonucleotides with proteins.
Spośród oligonukleotydów wytwarzanych sposobem według wynalazku nie otrzymywano dotychczas oligonukleotydów o wzorze 1, w którym R2 oznacza grupę trifluoroetoksylową.Among the oligonucleotides according to the invention, the oligonucleotides of the formula I in which R2 is a trifluoroethoxy group have not been prepared so far.
Znany sposób syntezy oligonukleotydów o wzorze 1, w którym R2 oznacza grupę hydroksylową lub etoksylową, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie, na nośniku stałym, polega na tym, że w związanym z nośnikiem nukleozydzie o wzorze 7, w którym Z oznacza grupę zabezpieczającą funkcję hydroksylową, korzystnie grupę dimetoksytrifenylometylową, S oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem, a B' oznacza resztę tyminy o wzorze 5 lub resztę adeniny, guaniny albo cytozyny o wzorach odpowiednio 2,3 albo 4, w których Ri oznacza grupę benzoilową albo izobutyrylową odblokowuje się grupę 5'-hydroksylową i poddaje się kondensacji z fosforynem nukleozydu o wzorze 6, w którym Z i B' mają wyżej podane znaczenie, m = 0, R2 oznacza grupę 2-cyjanoetoksylową, etoksylową lub trifluoroetoksylową, a R3 oznacza grupę diizopropyloaminową, dietyloaminową lub grupę morfolinową, w obecności czynnika sprzęgającego, z wytworzeniem związku o wzorze 8, w którym S, Z, B' mają wyżej podane znaczenie, R2 oznacza grupę 2-cyjanoetoksylową, etoksylową lub trifluoroetoksylową, a m = 0. W ewentualnie nieprzereagowanym związku o wzorze 7, w którym Z oznacza atom wodoru, a B', S i R mają wyżej podane znaczenie blokuje się grupę 5'-hydroksylową, aby zapobiec powstawaniu mylnych sekwencji. Otrzymany związek o wzorze 8 utlenia się do związku o wzorze 8, w którym m = 1, Y oznacza atom tlenu, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie, odblokowuje się grupę 5'-hydroksylową przez kwaśną hydrolizę i przyłącza następny fosforyn nukleozydu o wzorze 6, w obecności czynnika sprzęgającego, powtarzając pierwszy cykl reakcji aż do wytworzenia żądanego oligonukleotydu.A known method of synthesizing oligonucleotides of formula I, in which R2 represents a hydroxyl or ethoxy group, and the remaining symbols have the above meanings, on a solid support, is that in a support-bound nucleoside of formula 7, in which Z is a group protecting a function hydroxy, preferably a dimethoxytriphenylmethyl group, S is a chain extended solid support, and B 'is a thymine residue of formula 5 or an adenine, guanine or cytosine residue of the formulas 2,3 or 4, respectively, in which Ri is a benzoyl or isobutyryl group, the group is deprotected 5'-hydroxyl and condensed with a nucleoside phosphite of formula 6, where Z and B 'are as defined above, m = 0, R2 is 2-cyanoethoxy, ethoxy or trifluoroethoxy and R3 is diisopropylamino, diethylamino or morpholino in the presence of a coupling agent to give a compound of formula 8, wherein S, Z, B 'are as defined above, R2 is 2-cyanoethoxy, ethoxy or trifluoroethoxy, m = 0. Optionally unreacted compound of formula 7, where Z is hydrogen and B ', S and R are as defined above, the 5'-hydroxy group is blocked to prevent formation wrong sequences. The obtained compound of formula 8 is oxidized to the compound of formula 8, where m = 1, Y is oxygen, and the remaining symbols are as defined above, the 5'-hydroxyl group is deprotected by acidic hydrolysis and the next nucleoside phosphite of formula 6 is attached. , in the presence of a coupling agent, repeating the first cycle of reactions until the desired oligonucleotide is formed.
W przedstawionej znanej metodzie, po otrzymaniu oligonukleotydu o żądanej sekwencji odszczepia się go od stałego nośnika przez działanie stężonym wodnym roztworem amoniaku w czasie 2 godzin. W tych warunkach usunięta zostaje grupa 2-cyjanoetylowa. W następnym etapie usuwa się grupy blokujące funkcje aminowe, tzn. grupę benzoilową lub izobutyrylową na drodze ogrzewania produktu syntezy w stężonym wodnym roztworze amoniaku przez 16 godzin, w temperaturze 50-60°C, bądź utrzymywania przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Stosowanie podwyższonej temperatury stwarza konieczność użycia szczelnych naczyń spełniających wymagania stawianie w pracach z materiałami czynnymi biologicznie i jednocześnie odpornych na działanie podwyższonego ciśnienia. Ponadto różnica szybkości z jaką hydrolizowane są grupy benzoilowe i/lub izobutyrylowe w adeninie, guaninie i cytozynie powodują otrzymanie oligonukleotydów z niecałkowicie odblokowanymi grupami aminowymi, co wpływa niekorzystnie na wydajność i czystość produktu. Drastyczne warunki temperatury i czasu, w których usuwa się grupy zabezpieczające funkcję aminową uniemożliwiają wytworzenie związków o wzorze 1, w którym R2 oznacza grupę trifluoroetoksylową, natomiast związki o wzorze 1, w którymR2 oznacza grupę etoksylową otrzymuje się z małą wydajnością.In the presented known method, after obtaining the oligonucleotide of the desired sequence, it is cleaved from the solid support by treatment with a concentrated aqueous ammonia solution for 2 hours. Under these conditions, the 2-cyanoethyl group is removed. In the next step, groups which block the amine function, i.e. the benzoyl or isobutyryl group, are removed by heating the synthesis product in concentrated aqueous ammonia solution for 16 hours at 50-60 ° C or by keeping it at room temperature for 48 hours. The use of elevated temperature makes it necessary to use sealed vessels that meet the requirements for working with biologically active materials and at the same time are resistant to increased pressure. Moreover, the difference in the rate at which the benzoyl and / or isobutyryl groups in adenine, guanine and cytosine are hydrolyzed results in oligonucleotides with incompletely deblocked amino groups, which adversely affects the yield and purity of the product. The severe temperature and time conditions in which the amino function protecting groups are removed prevent the preparation of compounds of formula I in which R2 is trifluoroethoxy, while compounds of formula I in which R2 is ethoxy are obtained in a low yield.
W odróżnieniu od znanego procesu, sposób według wynalazku pozwala na odszczepienie oligonukleotydu od stałego nośnika w jednym etapie, równocześnie z całkowitym a zarazem selektywnym odblokowaniem grup funkcyjnych, w mniej drastycznych warunkach temperatury i czasu, tzn. przez działanie stężonym amoniakiem tylko w czasie 2 godzin, w temperaturze pokojowej. Sposób według wynalazku zapewnia wysoką wydajność pojedynczej reakcji wydłużenia łańcucha, wynoszącą powyżej 99,6%, przy czym otrzymane oligonukleotydy charakteryzują się wyższą niż dotychczas czystością, co pozwala na otrzymanie znanymi metodami chromatografii wysokociśnieniowej i/lub elektroforezy z wyższą wydajnością czystych fragmentów genów.Contrary to the known process, the method according to the invention allows the oligonucleotide to be cleaved from the solid support in one step, simultaneously with complete and at the same time selective deprotection of functional groups, under less drastic conditions of temperature and time, i.e. by treatment with concentrated ammonia for only 2 hours, in room temperature. The method according to the invention provides a high efficiency of a single chain extension reaction, exceeding 99.6%, and the obtained oligonucleotides are characterized by higher purity than before, which allows for obtaining pure gene fragments with the known methods of high pressure chromatography and / or electrophoresis.
Obecnie stwierdzono, że wydajność i czystość syntetyzowanego oligonukleotydu zależy od zabezpieczenia grup aminowych.It has now been found that the yield and purity of the synthesized oligonucleotide depends on the protection of the amino groups.
Sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w znanym procesie kondensacji kolejnych nukleozydów w pozycjach 5' i 3', wobec czynnika sprzęgającego, z następnym utlenianiem produktu każdej kondensacji stosuje się nowe pochodne nukleozydów, takich jak adenozyna, guanozyna i cytydyna o wzorach 6 i 7, w których B' oznacza grupę o wzorze odpowiednie 2,3 lub 4, w których R1 oznacza grupę izopropoksyacetylową, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie, przy czym dla związku o wzorze 7 Z oznacza atom wodoru.The method according to the invention is characterized in that in the known process of condensing consecutive nucleosides at the 5 'and 3' positions in the coupling agent, with subsequent oxidation of the product of each condensation, new nucleoside derivatives such as adenosine, guanosine and cytidine of the formulas 6 and 7 are used. wherein B 'is a group of the formula 2,3 or 4, in which R 1 is isopropoxyacetyl and the other symbols are as defined above, with Z representing a hydrogen atom for the compound of formula 7.
157 777157 777
Sposób według wynalazku polega na tym, że nukleozyd o wzorze 7, w którym B' oznacza resztę adeniny, guaniny lub cytozyny o wzorach 2,3 lub 4, w których Ri oznacza grupę izopropoksyacetylową lub B' oznacza resztę tyminy o wzorze 5, Z oznacza atom wodoru, a S ma wyżej podane znaczenie poddaje się kondensacji, w obecności czynnika sprzęgającego, z nukleozydem o wzorze 6, w którym B' oznacza resztę adeniny, guaniny lub cytozyny o wzorach 2, 3 lub 4, w których Ri oznacza grupę izopropoksyacetylową lub B' oznacza resztę tyminy o wzorze 5, m = 0, Z oznacza grupę zabezpieczającą funkcję hydroksylową, korzystnie grupę dimetoksytrifenylometylową, R2 oznacza grupę 2-cyjanoetokslyową, etoksylową lub trifluoroetoksylową, a R3 ma wyżej podane znaczenie, z wytworzeniem związku o wzorze 8, w którym Z oznacza grupę zabezpieczającą funkcję hydroksylową, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie, związek ten utlenia się do związku o wzorze 8, w którym m= 1, Y oznacza atom tlenu, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie, po czym odblokowuje się grupę 5'-hydroksylową przez kwaśną hydrolizę i przyłącza następny nukelozyd o wzorze 6, w obecności czynnika sprzęgającego, powtarzając pierwszy cykl reakcji aż do wytworzenia żądanego oligonukleotydu. Po otrzymaniu oligonukleotydu o żądanej sekwencji odszczepia się go od stałego nośnika i oczyszcza.The method according to the invention consists in that the nucleoside of formula 7 in which B 'is an adenine, guanine or cytosine residue of the formulas 2,3 or 4, in which Ri is an isopropoxyacetyl group or B' is a thymine residue of the formula 5, Z is a hydrogen atom, and S is as defined above, is subjected to condensation, in the presence of a coupling agent, with a nucleoside of formula 6, in which B 'is an adenine, guanine or cytosine residue of the formulas 2, 3 or 4, in which Ri is an isopropoxyacetyl group, or B 'is a thymine residue of formula 5, m = 0, Z is a group protecting a hydroxyl function, preferably a dimethoxytriphenylmethyl group, R2 is a 2-cyanoethoxyl, ethoxy or trifluoroethoxy group, and R3 is as defined above to give a compound of formula 8, where Z represents a group protecting a hydroxyl function, and the other symbols have the meaning given above, this compound is oxidized to the compound of formula 8 where m = 1, Y represents an oxygen atom, and the other symbols are as defined above, then the 5'-hydroxy group is deprotected by acid hydrolysis and the next nuceloside of formula 6 is attached in the presence of a coupling agent, repeating the first reaction cycle until the desired oligonucleotide is formed. After obtaining the oligonucleotide with the desired sequence, it is cleaved from the solid support and purified.
Grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową usuwa się z ostatniego nukleotydu albo przed odszczepieniem produktu od stałego nośnika albo po odszczepieniu go od nośnika i oczyszczeniu. Zależy to od sposobu oczyszczania. Jeżeli produkt oczyszcza się na przykład metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej, wówczas funkcję 5'-hydroksylową odblokowuje się zwykle po oczyszczeniu. Jeżeli natomiast oczyszczanie prowadzi się na drodze elektroforezy, to grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową usuwa się na ogół przed odszczepieniem oligonukleotydu od stałego nośnika.The group that blocks the 5'-hydroxy function is removed from the last nucleotide either before cleavage of the product from the solid support or after it has been cleaved from the support and purified. It depends on the method of cleaning. If the product is purified, for example, by high pressure liquid chromatography, then the 5'-hydroxy function is usually deblocked after purification. If, on the other hand, the purification is carried out by electrophoresis, the group that blocks the 5'-hydroxyl function is generally removed before cleavage of the oligonucleotide from the solid support.
W procesie prowadzonym sposobem według wynalazku, w odróżnieniu od znanego sposobu, równocześnie z uwalnianiem oligonukleotydu od stałego nośnika następuje odblokowanie wszystkich grup izopropoksyacetylowych zabezpieczających funkcje aminowe oraz usunięcie grupy 2-cyjanoetylowej z wytworzeniem związku o wzorze 1, w którym R2 oznacza grupę OH. Jeśli podstawnik R2 oznacza grupę etoksylową lub grupę trifluoroetoksylową, to grupy te zostają zachowane podczas odblokowania grup aminowych i uwalniania produktu od nośnika.In the process according to the invention, unlike the known method, simultaneously with the liberation of the oligonucleotide from the solid support, all isopropoxyacetyl groups protecting the amine functions are deblocked and the 2-cyanoethyl group is removed to give the compound of formula 1 in which R2 is OH. When R2 is ethoxy or a trifluoroethoxy group, these groups are retained during the deblocking of the amino groups and the release of the product from the carrier.
Odszczepienie oligonukleotydu z jednoczesnym usunięciem wspomnianych grup blokujących korzystnie prowadzi się przez działanie 25% roztworem amoniaku, w czasie 2 godzin, w temperaturze pokojowej.Cleavage of the oligonucleotide with simultaneous removal of said blocking groups is preferably carried out by treatment with a 25% ammonia solution for 2 hours at room temperature.
W sposobie według wynalazku tworzenie wiązania międzynukleotydowego katalizuje się czynnikiem sprzęgającym o charakterze słabego kwasu, korzystnie tetrazolem.In the method of the invention, the formation of the internucleotide bond is catalyzed by a weak acid coupling agent, preferably tetrazole.
Utlenianie międzynukleotdyowej grupy fosforynowej w związku o wzorze 8, przeprowadza się wodno-organicznym roztworem jodu lub nadtlenkami organicznymi, takimi jak np. wodoronadtlenek t-butylowy.The oxidation of the internucleotide phosphite group in the compound of formula 8 is carried out with an aqueous-organic iodine solution or with organic peroxides such as e.g. t-butyl hydroperoxide.
Odszczepienie grupy zabezpieczającej funkcję 5'-hydoksylową przeprowadza się za pomocą mocnego kwasu, korzystnie dichlorooctowego.Cleavage of the protecting group for the 5'-hydroxy function is carried out with strong acid, preferably dichloroacetic acid.
Jako nośnik stosuje się materiał nieorganiczny bądź organiczny o kontrolowanej granulacji i porowatości, korzystnie szkło o kontrolowanej granulacji i porowatości. Z nośnikiem związany jest kowalencyjnie za pomocą łańcucha organicznego składającego się z atomów węgla, azotu i tlenu odpowiednio blokowany nukleozyd.The carrier used is an inorganic or organic material with controlled granulation and porosity, preferably glass with controlled granulation and porosity. A properly blocked nucleoside is covalently bound to the carrier by an organic chain consisting of carbon, nitrogen and oxygen atoms.
Przykładowy nukleozyd związany ze stałym nośnikiem typu szkła o kontrolowanej porowatości (500 A) z przedłużonym łańcuchem aminowym przedstawia wzór 9, w którym CPG oznacza szkło o kontrolowanej porowatości, Z oznacza grupę dimetoksytrifenylometylową, a B' oznacza grupę o wzorze 2, 3, 4 lub 5 w których Ri oznacza grupę izopropoksyacetylową.An example of a nucleoside bonded to a solid controlled-porosity (500Å) glass support with an amine chain extended is shown in Formula 9, where CPG is a controlled porosity glass, Z is a dimethoxytriphenylmethyl group, and B 'is a group of formula 2, 3, 4 or Wherein Ri is isopropoxyacetyl.
Sposób wytwarzania nowych pochodnych nukleozydów, takich jak pochodne adenozyny, guanozyny i cytydyny z funkcjami aminowymi zablokowanymi grupą izopropoksyacetylową przedstawiono w zgłoszeniu patentowym nr P 273 722 opublikowanym w BUP 8/90. Jak już wspomniano, sposób według wynalazku zapewnia całkowite usunięcie grup blokujących funkcje aminowe razem z grupą 2-cyjanoetylową w trakcie odszczepiania produktu od stałego nośnika tak, że otrzymane surowe oligonukleotydy charakteryzują się wyższą niż dotychczas czystością, co pozwala na wytworzenie znanymi metodami chromatografii wysokociśnieniowej i/lub elektrofo157 777 5 rezy, z wyższą wydajnością, czystych fragmentów oligonukleotydowych stosowanych do syntezy genów.A method for the preparation of novel nucleoside derivatives such as adenosine, guanosine and cytidine derivatives with amine functions blocked with an isopropoxyacetyl group is described in patent application No. P 273 722 published in BUP 8/90. As already mentioned, the method according to the invention ensures the complete removal of the amino function blocking groups together with the 2-cyanoethyl group during the cleavage of the product from the solid support, so that the obtained crude oligonucleotides are of higher purity than before, which allows for the preparation of high pressure chromatography and / or or electrophoresis, with higher yields, of pure oligonucleotide fragments used for gene synthesis.
Oligonukleotydy wytwarzane sposobem według wynalazku wykorzystano np. do syntezy genu kodującego biosyntezę białka TNF o działaniu cytotoksycznym.The oligonucleotides according to the invention have been used, for example, for the synthesis of a gene encoding the biosynthesis of a cytotoxic TNF protein.
Sposób według wynalazku ilustrują niżej podane przykłady, z których przykłady I-VIII dotyczą wytwarzania substratów.The process of the invention is illustrated by the following Examples, of which Examples 1-8 relate to the preparation of starting materials.
Przykład I A. N6-izopropoksyacetylo-2'-dezoksyadenozyna.Example I A. N6-isopropoxyacetyl-2'-deoxyadenosine.
50 mmoli 2'-dezoksyadenozyny suszono pod wysoką próżnią na łaźni olejowej w temperaturze 50°C przez 6 godzin, następnie zawieszono w 80 ml bezwodnej pirydyny i dodano z mieszaniem 250 mmoli trimetylochlorosilanu w temperaturze pokojowej. Po 2 godzinach dodano 75 mmoli bezwodnika izopropoksyoctowego i mieszano przez 2 godziny. Odsączono osad chlorowodorku pirydyny, przemyto 20 ml benzenu, przesącze połączono i zatężono do około 40 ml, następnie dodano 50 ml dioksanu i 30 ml wody. Mieszano przez 2 godziny. Mieszaniną reakcyjną zatężono do sucha. Otrzymany olej oczyszczono na kolumnie z żelem (Merck 60) przy użyciu eluentu: chloroform/metanol 99:1 - 90:10. Frakcje właściwe zatężono do sucha. Produkt krystalizowano z chloroformu, temperatura topnienia 134-135°C, Rf - 0,52 (CH3CN:H2O 85:15), wydajność 76%, analiza elementarna zgodna z teoretyczną.50 mmoles of 2'-deoxyadenosine were dried under high vacuum in an oil bath at 50 ° C for 6 hours, then suspended in 80 ml of anhydrous pyridine and 250 mmoles of trimethylchlorosilane were added with stirring at room temperature. After 2 hours, 75 mmol of isopropoxyacetic anhydride was added and stirred for 2 hours. The precipitate of pyridine hydrochloride was filtered off, washed with 20 ml of benzene, the filtrates were combined and concentrated to about 40 ml, then 50 ml of dioxane and 30 ml of water were added. Stirred for 2 hours. The reaction mixture was concentrated to dryness. The oil obtained was purified on a gel column (Merck 60) using the eluent: chloroform / methanol 99: 1 - 90:10. The actual fractions were concentrated to dryness. The product was crystallized from chloroform, mp 134-135 ° C, Rf - 0.52 (CH 3 CN: H 2 O 85:15), 76% yield, elemental analysis consistent with theoretical.
B. 5'-dimetoksytrifenylometylo-N6-izopropoksyacetylo-2'-dezoksyadenozyna.B. 5'-dimethoxytriphenylmethyl-N6-isopropoxyacetyl-2'-deoxyadenosine.
Otrzymany w etapie A związek (2 mmole) suszono przez odparowanie bezwodnej pirydyny (5 ml) i zawieszono w 10 ml bezwodnej pirydyny. Dodano chlorku 4,4'-dimetoksytrifenylometylowego (2,2 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Dodano 2 ml metanolu i zatężono do sucha. Surowy produkt oczyszczono na kolumnie z żelem Merck 60H, stosując jako eluent mieszaninę chloroform/metanol 99:1, zawierającą 0,1% pirydyny, Rf-0,68 (CHCDCH3OH 90:10/ HPTLC. Analiza elementarna zgodna z teoretyczną. Wydajność 76%.The compound obtained in step A (2 mmol) was dried by evaporation of anhydrous pyridine (5 ml) and suspended in 10 ml of anhydrous pyridine. 4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl chloride (2.2 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 5 hours. 2 ml of methanol was added and concentrated to dryness. The crude product was purified on a Merck 60H gel column, eluting with chloroform / methanol 99: 1 containing 0.1% pyridine, Rf-0.68 (CHCDCH3OH 90: 10 / HPTLC. Elemental analysis consistent with theory. Yield 76%) .
C. N6-izopropoksyacetylo-5'-dimetoksytrifenylometylo-2'-dezoksyadenozyno-3'-0-(0-2-cyjanoetylo)-N,N-diizopropyloamidofosforyn.C. N6-isopropoxyacetyl-5'-dimethoxytriphenylmethyl-2'-deoxyadenosine-3'-O- (0-2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite.
Otrzymany w etapie B związek (1 mmol)i 1-H-tetrazol (1 mmol) osuszono przez odparowanie bezwodnej pirydyny (3 ml) i przez 2 godziny pod wysoką próżnią. Rozpuszczono w bezwodnym chlorku metylenu (3 ml) i dodano mieszając Ν,Ν,Ν', N'-tetraizopropylodiamidofosforyn 0-2cyjanoetylowy (1,1 mmol). Mieszanie kontynuowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną zatężono do sucha, oczyszczono na kolumnie z żelem Merck 60, stosując jako eluent mieszaninę: benzen/chlorek metylu/trietyloamina 8:1:1. Produkt otrzymano z wydajnością 80%. Rf = 0,75 i 0,62 (benzen/CH2Cl2) (CH3CH2/3N) (60:16:16), δ ppm ^P NMR 149,73, 149,46 (CD3CN) 85% H3PO4.The compound obtained in step B (1 mmol) and 1-H-tetrazole (1 mmol) were dried by evaporation of anhydrous pyridine (3 ml) and for 2 hours under high vacuum. Dissolved in anhydrous methylene chloride (3 mL) and 0-2 cyanoethyl N'-tetraisopropyl diamidophosphite (1.1 mmol) was added with stirring. Stirring was continued for 1 hour at room temperature. The reaction mixture was concentrated to dryness, purified on a Merck 60 gel column, eluting with benzene / methyl chloride / triethylamine 8: 1: 1. The product was obtained in a yield of 80%. Rf = 0.75 and 0.62 (benzene / CH 2 Cl 2) (CH3CH2 / 3N) (60:16:16) δ ppm ^ P NMR 149.73, 149.46 (CD 3 CN) 85% H3PO4.
Przykład II A. N2-izopropoksyacetyIo-2'-dezoksyguanozyna.Example II A. N 2 -isopropoxyacetyl-2'-deoxyguanosine.
Postępując analogicznie jak w przykładzie IA z tym, że po dodaniu dioksanu i wody mieszano przez 12 godzin, a produkt krystalizowano z mieszaniny dioksan/eter etylowy 1:1, otrzymano związek tytułowy z wydajnością 81%, temperatura topnienia >200°C (z rozkładem); Rf = 0,50 (CH3CN · H2O 85:15); analiza elementarna zgodna z teoretyczną.Proceeding analogously to Example IA, except that after adding dioxane and water, it was stirred for 12 hours, and the product was crystallized from the dioxane / ethyl ether 1: 1 mixture, the title compound was obtained with a yield of 81%, melting point> 200 ° C (with decomposition ); Rf = 0.50 (CH 3 CN · H 2 O 85:15); elemental analysis consistent with theoretical.
B. 5'-dimetoksytrifenylometylo-N2-izopropoksyacetylo-2'-dezoksyguanozyna.B. 5'-dimethoxytriphenylmethyl-N2-isopropoxyacetyl-2'-deoxyguanosine.
Postępując analogicznie jak w przykładzie I B, otrzymano produkt z wydajnością 71%,By proceeding analogously to example 1B, the product was obtained in 71% yield,
Rt = 0,53 (CHCI3· CH3OH 90:10) HPTLC. Analiza elementarna zgodna z teoretyczną.Rt = 0.53 (CHCl3 · CH3OH 90:10) HPTLC. Elemental analysis consistent with theoretical.
C. N2-izoporpoksyacetylo-5'-dimetoksytrifenylometylo-2'-dezoksyguanozyno-3'-0-(0-2-cyjanoetylo)-N,N-diizopropyloamidofosforyn.C. N2-isoporpoxyacetyl-5'-dimethoxytriphenylmethyl-2'-deoxyguanosine-3'-O- (0-2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite.
Postępując analogicznie jak w przykładzie I C, otrzymano produkt z wydajnością 82%, Rf = 0,37 (benzen/chlorek metylu/trietyloamina 60:16:16), δ ppm 31P NMR 149,86, 149,46 (CD3CN) 85% H3PO4.By proceeding analogously to example IC, the product was obtained in 82% yield, Rf = 0.37 (benzene / methyl chloride / triethylamine 60:16:16), δ ppm 31 P NMR 149.86, 149.46 (CD3CN) 85% H3PO4.
Przykład III A. N4-izopropoksyacetylo-2'-dezoksycytydyna.Example III A. N4-isopropoxyacetyl-2'-deoxycytidine.
Postępując analogicznie jak w przykładzie I z tym, że krystalizację przeprowadzono w czterochlorku węgla, otrzymano produkt z wydajnością 87%, Rf-0,59 (CH3CN:H2O 85:15); temperatura topnienia 157-158°C. Analiza elementarna zgodna z teoretyczną.By proceeding analogously to Example 1, except that the crystallization was carried out in carbon tetrachloride, the product was obtained with a yield of 87%, Rf-0.59 (CH3CN: H2O 85:15); mp 157-158 ° C. Elemental analysis consistent with theoretical.
157 777157 777
B. 5'-dimetoksytrifenylometylo-N4-izopropoksyacetylo-2'-dezoksycytydyna.B. 5'-dimethoxytriphenylmethyl-N 4 -isopropoxyacetyl-2'-deoxycytidine.
Postępując analogicznie jak w przykładzie IB otrzymano produkt z wydajnością 80%,Rf-0,75 (CHCb:CH3OH 90:10) HPTLC. Analiza elementarna zgodna z teoretyczną.The product was obtained in a yield of 80%, Rf-0.75 (CHCl2: CH3OH 90:10) by HPTLC by proceeding analogously to example 1B. Elemental analysis consistent with theoretical.
C. N4-izoporpoksyacetylo-5'-dimetoksytrifenylometylo-2'-dezoksycytydyno-3'-0-(0-2-cyjanoetylo)-N,N-diizopropyloamidofosforyn.C. N 4 -isoporpoxyacetyl-5'-dimethoxytriphenylmethyl-2'-deoxycytidine-3'-O- (0-2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite.
Postępując analogicznie jak w przykładzie I C, otrzymano produkt z wydajnością 80%, Rt — 0,62 (chlorek metylenu/trietyloamina 84:16), < ppm ^P NMR '149,66, 149,52 (CD3CN) 85% H3PO4.By proceeding analogously to Example 1 C, the product was obtained in 80% yield, Rt - 0.62 (methylene chloride / triethylamine 84:16), <ppm ^ P NMR '149.66, 149.52 (CD3CN) 85% H3PO4.
Przykład IV A. 5'-dimetoksytrifenylotymidyna.Example IV A. 5'-dimethoxytriphenylthymidine.
Postępując analogicznie jak w przykładzie IB. otrzymano produkt z wydajnością 82%, Rf-0,65 (CHC^CHaOH 90:10) HPTLC.Proceeding analogously to the example IB. the product was obtained in 82% yield, Rf-0.65 (CHCl2 CHaOH 90:10) HPTLC.
B. 5'-dimetoksytrifenylotymidyno-3'-0-(0-2-cyjanoetylo)-N,N-diizopropyloamidofosforyn.B. 5'-dimethoxytriphenylthymidine-3'-O- (0-2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite.
Postępując analogicznie jak w przykładzie IC, otrzymano produkt z wydajnością 81%, Ri-0,68 (benzen/chlorek metylenu/trietyloamina 60:16:16), < ppm 31P NMR 148,5, 148,1 (CH2CI2).By proceeding analogously to example IC, the product was obtained in 81% yield, Ri-0.68 (benzene / methylene chloride / triethylamine 60:16:16), <ppm 3 1 P NMR 148.5, 148.1 (CH2Cl2).
Przykład V. 5'-dimetoksytrifenylometylo-N6-izopropoksyacetylo-2'-dezoksyadenozyna związana ze stałym nośnikiem.Example 5 5'-dimethoxytriphenylmethyl-N6-isopropoxyacetyl-2'-deoxyadenosine bound to a solid support.
10 mmoli związku otrzymanego w przykładzie I B, 10 mmoli bezwodnika bursztynowego i 10 mmoli dimetyloaminopirydyny suszono pod wysoką próżnią przez 2 godziny, dodano 10 ml bezwodnej pirydyny i mieszano przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Zatężono do sucha, produkt oczyszczono na kolumnie z żelem (Merck 60), eluowano mieszaniną chloroform:metanol 100:5.10 mmol of the compound obtained in Example 1B, 10 mmol of succinic anhydride and 10 mmol of dimethylaminopyridine were dried under high vacuum for 2 hours, 10 ml of anhydrous pyridine were added and stirred for 12 hours at room temperature. Concentrated to dryness, the product was purified on a gel column (Merck 60), eluted with chloroform: methanol 100: 5.
26 mmoli produktu, 28 mmoli 4-nitrofenolu i 31 mmoli dicykloheksylomocznika suszono przez 2 godziny pod wysoką próżnią. W warunkach bezwodnych dodano 3 ml chlorku metylenu, mieszano przez 1 godzinę.26 mmol of product, 28 mmol of 4-nitrophenol and 31 mmol of dicyclohexylurea were dried for 2 hours under high vacuum. Under anhydrous conditions, 3 ml of methylene chloride was added, stirred for 1 hour.
Do 1 g szkła o kontrolowanej porowatości z łańcuchem składającym się z atomów węgla, azotu i tlenu dodano produkt w 1 ml trietyloaminy, mieszano przez 20 godzin, odsączono i przemyto metanolem i pirydyną. Otrzymano produkt o zawartości 35/,/moli na 1 g stałego nośnika.The product in 1 ml of triethylamine was added to 1 g of a controlled porosity glass with a chain consisting of carbon, nitrogen and oxygen, stirred for 20 hours, filtered and washed with methanol and pyridine. The product was obtained with a content of 35 µmol per 1 g of solid support.
Przykład VI. 5'-dimetoksytrifenylometylo-2'-dezoksyguanozyna związana że stałym nośnikiem.Example VI. 5'-dimethoxytriphenylmethyl-2'-deoxyguanosine bound to a solid support.
Analogicznie jak w przykładzie B otrzymano produkt o zawartości 41,3//moli na 1 g stałego nośnika.By analogy with Example B, the product was obtained with a content of 41.3 µmol per 1 g of solid support.
Przykład VII. 5'-dimetoksytrifenylometylo-2'-dezoksycytydyna związana ze stałym nośnikiem.Example VII. 5'-dimethoxytriphenylmethyl-2'-deoxycytidine bound to a solid support.
Analogicznie jak w przykładzie V otrzymano produkt o zawartości 39,8//moli na 1 g stałego nośnika.By analogy with Example 5, the product was obtained with a content of 39.8 µmol per 1 g of solid support.
Przykład VIII. 5'-dimetoksytrifenylometylotymidyna związana ze stałym nośnikiem.Example VIII. 5'-dimethoxytriphenylmethylthymidine bound to a solid support.
Analogicznie jak w przykładzie V otrzymano produkt o zawartości 33,8//moli na 1 g stałego nośnika.The product was obtained analogously to Example 5 with a content of 33.8 µmol per 1 g of solid support.
Przykład IX. Wytwarzanie fragmentu o sekwencji 3GACTACCACA5.Example IX. Generation of the fragment with the sequence 3 GACTACCACA 5 .
Fragment ten wytwarza się według schematu, gdzie zastosowano następujące skróty: A-adenozyna, G-guanozyna, T-tymidyna, C-cytydyna, IPA-grupa izopropoksyacetylowa, DMT-grupa dimetoksytrifenylometylowa, S-stały nośnik, X-grupa -CH2CH2CN, z-grupa diizopropyloaminowa.This fragment is prepared according to the scheme where the following abbreviations are used: A-adenosine, G-guanosine, T-thymidine, C-cytidine, IPA-isopropoxyacetyl group, DMT-dimethoxytriphenylmethyl group, S-solid support, X-group -CH2CH2CN, with - diisopropylamine group.
Cykl przyłączenia jednego nukleozydu przebiega następująco. Przez kolumienkę o pojemności 110//1 zabezpieczonej z dwóch stron filterkami, zawierającej 0,5 //mola nukleozydu związanego ze stałym nośnikiem przepuszczano 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w ciągu 1 minuty, przemywano acetonitrylem (5 ml) i suszono pod argonem, a następnie pod wysoką próżnią. Do tak przygotowanej kolumienki dodano 50//I 0,2 molowego roztworu odpowiedniego nukleozydu w acetonitrylu i 60,/1 0,5 molowego roztworu tetrazolu w acetonitrylu. Reakcję prowadzono przez 2,5 minuty, po czym przemywano acetonitrylem (5 ml) i suszono pod argonem. Następnie przez kolumienkę przepuszczano 0,5 ml roztworu A + B (1:1) w ciągu 1 minuty (A - 20% roztwór bezwodnika metoksyoctowego w tetrahydrofuranie, B - 9 g dimetyloaminopirydyny, 30 ml 2,6-lutydyny i 70 ml tetrahydrofuranu). Kolumienkę przemywano acetonitrylem (5 ml) i suszono pod argonem. Przez kolumienkę przepuszczano 0,5 ml roztworu jodu, wody, 2,6-lutydyny i tetra157 777 hydrofuranu (2,6g, 20 ml, 40 ml, 40 ml) w ciągu 0,5 minuty. Kolumienkę przymywano acetonitrylem (5 ml) i suszono pod argonem. Następnie przepuszczano roztwór kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu (3% objętościowych) odblokowując funkcję 5'-hydroksylową.The cycle of one nucleoside attachment is as follows. 5 ml of 2% dichloroacetic acid in methylene chloride was passed through a 110 µl column protected on both sides with filters, containing 0.5 µmol of nucleoside bound to a solid support for 1 minute, washed with acetonitrile (5 ml) and dried. under argon and then under high vacuum. 50 µl of a 0.2 molar solution of the appropriate nucleoside in acetonitrile and 60 µl of a 0.5 molar solution of tetrazole in acetonitrile were added to the column thus prepared. The reaction was allowed to proceed for 2.5 minutes then washed with acetonitrile (5 ml) and dried under argon. Then 0.5 ml of A + B (1: 1) solution was passed through the column for 1 minute (A - 20% solution of methoxyacetic anhydride in tetrahydrofuran, B - 9 g of dimethylaminopyridine, 30 ml of 2,6-lutidine and 70 ml of tetrahydrofuran) . The column was washed with acetonitrile (5 ml) and dried under argon. 0.5 ml of a solution of iodine, water, 2,6-lutidine and tetra157 777 hydrofuran (2.6 g, 20 ml, 40 ml, 40 ml) was passed through the column for 0.5 minutes. The column was washed with acetonitrile (5 ml) and dried under argon. A solution of dichloroacetic acid in methylene chloride (3% by volume) was then passed through to unlock the 5'-hydroxyl function.
Powyższy cykl powtarzano do uzyskania fragmentu o sekwencji 3GACTACCACA5.The above cycle was repeated until a fragment with the sequence 3 GACTACCACA 5 was obtained.
Po usunięciu grupy zabezpieczającej funkcję 5'-hydroksylową z ostatniego nukleotydu przez kolumienkę przepuszczano 1 ml 25% wodnego roztworu amoniaku w ciągu 2 godzin. Produkt zatężono do sucha i oczyszczano metodą elektroforezy na 20% żelu poliakrylamidowym. Elucję z żelu prowadzono stosując 0,4 ml roztworu o następującym składzie: 0,5 M CH3COONH4,10 mM MgCl2, 10 mM etylenodiaminoczterooctanu sodu, 0,02% NaN3, przez 12 godzin, a następnie oddzielano od soli na żelu preparatywnym RP C18 (55-105pm) w gradiencie woda-acetonitfyl. Frakcję z produktem zatężano do sucha.After removal of the protecting group for the 5'-hydroxyl function of the last nucleotide, 1 ml of 25% aqueous ammonia was passed through the column for 2 hours. The product was concentrated to dryness and purified by 20% polyacrylamide gel electrophoresis. Elution from the gel was carried out using 0.4 ml of a solution with the following composition: 0.5 M CH3COONH4, 10 mM MgCl2, 10 mM sodium ethylenediaminetetraacetate, 0.02% NaN3, for 12 hours, and then separated from the salt on a preparative RP C18 gel ( 55-105pm) in a water-acetonitrophyl gradient. The product fraction was concentrated to dryness.
Przykład X. Postępowano analogicznie jak w przykładzie IX, z tym, że wytworzony fragment o sekwencji podanej w przykładzie IX odszczepiano od złoża przed usunięciem z ostatniego nukleotydu grupy zabezpieczającej funkcję 5'-hydroksylową. Odszczepianie od złoża prowadzono przepuszczając 1 ml 25% wodnego roztworu amoniaku w ciągu 2 godzin.Example 10 The procedure was analogous to that in Example IX, except that the generated fragment with the sequence given in Example IX was cleaved from the resin before the 5'-hydroxyl protecting group was removed from the last nucleotide. Cleavage from the bed was carried out by passing 1 ml of 25% aqueous ammonia solution for 2 hours.
Następnie produkt zatężano do sucha i oczyszczano za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej na żelu RP, μ. Bondapak C18 w gradiencie woda-acetonitryl. Frakcję z produktem zatężano do sucha. Frakcję 5'-hydroksylową odblokowano w roztworze kwas octowy - woda (4:1 v/v) 0,5 ml przez 45 minut, w temperaturze pokojowej.Then the product was concentrated to dryness and purified by high pressure liquid chromatography on RP, μ gel. Bondapak C18 on a water-acetonitrile gradient. The product fraction was concentrated to dryness. The 5'-hydroxy fraction was deprotected in acetic acid - water (4: 1 v / v) 0.5 ml solution for 45 minutes at room temperature.
Następnie produkt zatężano do sucha i oczyszczano jeszcze raz za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej w tych samych warunkach.The product was then concentrated to dryness and purified once more by high pressure liquid chromatography under the same conditions.
Sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie IX otrzymano następujące fragmenty:The following fragments were obtained in an analogous manner to that described in Example 9:
5. 3GGTACAACATC5 5. 3GGTACAACATC 5
6. 3GTTTGGGAGTTC5 6. 3GTTTGGGAGTTC 5
7. 3gactccccgtcg5 7. 3 5 gactccccgtcg
8. 3acgtcgacggg5 8. 3 acgtcgacggg 5
9. 3gagtcgaactc39. 3 gagtcgaactc3
10. 3CCAAACGATGT310. 3 CCAAACGATGT3
11. 3TGTACCCGATGT311. 3TGTACCCGATGT3
12. 3CCGAACAGTGA312. 3CCGAACAGTGA3
13. 3GCCCCAAGATC313. 3GCCCCAAGATC3
14. 3GGTTCAGCCACTGCA314. 3GGTTCAGCCACTGCA3
15. 3GGAGGGCATTGGCCCGGC315. 3 GGAGGGCATTGGCCCGGC3
16. 3GCTCCACGCCATTGGCCA316. 3 GCTCCACGCCATTGGCCA3
17. 3CACCAGCTGGTTATCTCTCA317. 3 CACCAGCTGGTTATCTCTCA3
18. 3ACCAGCTGGTGGTAC318. 3ACCAGCTGGTGGTAC3
19. 3GCGTGGAGCTGAGATA?19. 3 GCGTGGAGCTGAGATA?
20. 3aatgccctcctggccaatg5 20. 3 aatgccctcctggccaatg 5
21. 3GTGGCTGAACCGCCGGGCC321. 3 GTGGCTGAACCGCCGGGCC3
22. 3catggtagtctcccggacatgg5 22. 3 catggtagtctcccggacatgg 5
23. 3AGTAGATGAGGGTCCAGGAGAAG323. 3AGTAGATGAGGGTCCAGGAGAAG3
24. 3TTCCCGGTTCCGACGGGCAGCT524. 3 TTCCCGGTTCCGACGGGCAGCT5
25. 3GCCCGTCGGAACCGGGAACTTCT5 25. 3 GCCCGTCGGAACCGGGAACTTCT 5
26. 3CCTGGACCCTCAT326. 3CCTGGACCCTCAT3
27. 3CTACTCCATGTCCGGGAGACTAC527. 3 CTACTCCATGTCCGGGAGACTAC5
28. 3gggtacacgaggagtgggtgtg5 28. 3 gggtacacgaggagtgggtgtg 5
29. 3GTAGTCGGCGTAGCGGCAGAGGA329. 3 GTAGTCGGCGTAGCGGCAGAGGA3
30. ^TGGTCTGGTTCC5 30. ^ TGGTCTGGTTCC 5
31. 3AGTTGGAGGAGAGACGTCAG531. 3AGTTGGAGGAGAGACGTCAG5
32. 3CGTCTCTCCTCCAACTGGAACCA332. 3 CGTCTCTCCTCCAACTGGAACCA3
33. 3GACCATCCTCTGCCGCTACGCC333. 3 GACCATCCTCTGCCGCTACGCC3
34. 3CCCACTCCTCGTGTACCCAGCT534. 3CCCACTCCTCGTGTACCCAGCT5
35. 3TTCTCGGGGACGGTCTCCCTCTG335. 3TTCTCGGGGACGGTCTCCCTCTG3
36. 3GGGTCTCCCCCGACTCCGGTTCG536. 3 GGGTCTCCCCCGACTCCGGTTCG5
37. 3GGACCATACTCGG337. 3 GGACCATACTCGG3
38. 3GTAGATAGACC'CTCCCCAGAA338. 3 GTAGATAGACC'CTCCCCAGAA3
39. 3GGTCGACCTCTTCCCACTGGCTG539. 3 GGTCGACCTCTTCCCACTGGCTG5
40. 5AGTCGCGACTIT5 40. 5AGTCGCGACTIT 5
41 3AGTTAGCCGGGCTGATAGATC5 41 3AGTTAGCCGGGCTGATAGATC 5
42. 3ATTCAGCCCGGCTAACTAAAGTC542. 3ATTCAGCCCGGCTAACTAAAGTC5
43. 3GCGACTCAGCCAGTGGGAAGA343. 3 GCGACTCAGCCAGTGGGAAGA3
44. 3GGTCGACCTTCTGG544. 3 GGTCGACCTTCTGG5
45. 3GGAGGGTCTATCTACCCGAGTA545. 3 GGAGGGTCTATCTACCCGAGTA5
46. ^TGGTCCCGAACCGGAGTCGGGG5 46. ^ TGGTCCCGAACCGGAGTCGGGG 5
47. 3GAGACCCCAGA347. 3 GAGACCCCAGA3
48. 3GGGAGACCGTCCCCGAGAACTAG348. 3 GGGAGACCGTCCCCGAGAACTAG3
49. 3TGAAAGGGCTCAGACCCG5 49. 3TGAAAGGGCTCAGACCCG 5
50. 3TCCAGATGAAACCCTAGTAACGGGACACTATCCTAC.5 50. 3 TCCAGATGAAACCCTAGTAACGGGACACTATCCTAC. 5
51. 3GATAGTGTCCCGTTACTA351. 3 GATAGTGTCCCGTTACTA3
52. 3GGGTTTCATCTGGACGGGTCTGAGCCGTATCAGATC552. 3 GGGTTTCATCTGGACGGGTCTGAGCCGTATCAGATC5
157 777 '“θ' ‘ο-ομγ ο w ο ο 'i * Λ Ρ·Ο' Ό-ΟΜΤ e* η ΛΜ £** (§ ί' ? ,** θ'-- ®0/β'0-Ρ-0' Ό-Ρ-0 Ο-ΟΜΤ ^θ' Ό-Ρ-0 ΟΗ Ο 1 χ157 777 '“θ''ο-ομγ ο w ο ο ' i * Λ Ρ · Ο 'Ό-ΟΜΤ e * η Λ Μ £ ** (§ ί'?, ** θ '- ®0 / β ' 0-Ρ-0 'Ό-Ρ-0 Ο-ΟΜΤ ^ θ' Ό-Ρ-0 ΟΗ Ο 1 χ
Ο Λ ρ-ο Ο-ΟΜΤΟ Λ ρ-ο Ο-ΟΜΤ
9 Α ? ·*~ ΐΑα Μ ϊ9 Α? · * ~ Ϊ́Αα Μ ϊ
Ο Ο-Ρ-0 Ο-Ρ-0 O-DMT ή Ó ο ο ,ι • ; χ » ν X Ο Ο-Ρ-0 Ο-Ρ-0 O-DMT ή Ó ο ο, ι •; χ »ν X
SCHEMATSCHEME
-/ΡΛ- / ΡΛ
6 ?6?
'αρ,ο'α ρ , ο
IAND
ΟΟ
IAND
XX
ΙΡΑΙΡΑ
Α 0 Α 0
ΙΡΑΙΡΑ
C οC ο
ΙΡΑΙΡΑ
Α οΑ ο
JPAJPA
JPAJPA
ΙΡΑ BPA JPA A ο C ο Α • 0'Ό·,Ο' X,ΙΡΑ BPA JPA A ο C ο Α • 0'Ό ·, Ο 'X,
ο)β'0*,0' Ό'Ο' ΌΑρ,Ο' Ό^ρ.Ο'Ό^ρ.Ο' -0Η 'χρχ'ο) β'0 *, 0 'Ό'Ο' ΌΑρ, Ο 'Ό ^ ρ.Ο'Ό ^ ρ.Ο' - 0Η 'χρχ'
ΟΟ