UA125185C2 - Покращений спосіб одержання іметелстату - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способу одержання інгібітора тіломерази іметелстату із застосуванням зв'язування на твердофазному носії з 3-ма стадіями в циклі, що включає стадії зняття захисту з 3'-аміногрупи зв'язаного з носієм олігонуклеотиду, зв'язування з 5'-фосфорамідитом і сульфуризацію з ацилдисульфідом, що характеризується відсутністю додаткової стадії кепування в кожному циклі, яку застосовують з метою уникнення введення в реакцію непрореагувавших 3'-аміноолігонуклеотидних груп протягом наступних циклів. Іметелстат має формулу, представлену нижче іметелстат .

Description

Даний винахід відноситься до способу одержання інгібітора тіломерази іметелстату із застосуванням способу зв'язування на твердофазном носії з З стадіями в циклі, який включає стадії зняття захисту з 3'-аміногрупи пов'язаного з носієм олігонуклеотиду, зв'язування з 5'- фосфорамідитом і сульфуризацію з ацилдисульфідом, що характеризується відсутністю додаткової стадії кепування в кожному циклі, яку застосовують для запобігання вступу в реакцію непрореагувавших 3'-аміноолігонуклеотидних груп під час наступних циклів.

Рівень техніки

Іметелстат (5БЕО ІЮ МО: 1) являє собою М3'-Ре' тіофосфорамідатний олігонуклеотид, що ковалентно зв'язаний з пальмітоїлліпідним фрагментом і описаний у М/0-2005/023994 як сполука (1Е). Натрієва сіль іметелстату діє як потужний та специфічний інгібітор тіломерази та може бути використана для лікування порушень, опосередкованих тіломеразою, наприклад, раку, включаючи такі захворювання, як мієлофіброз (МЕ), мієлодиспластичні синдроми (МОБ) та гострий мієлолейкоз (АМІ.).

Структура іметелстату натрію показана нижче:

І

- г Я хн ях он яку я а в и и ОК В чне ок о ЕН 5 ) я. св бота ко ЩЕ г ще КО я я що АЖ ме

Е Зв

Й ле Шин 7 яв КВ к. 7 х, Ме ня в Е І а ї нн А ІНН . пров Б кс Ж к - 8 І я х нк 5 В ше 7 оо Мона

Н ЛИ

І ОЗ КВ. в Б ви

Кв но З пай х з й Е А ще рОАХ м в ее и НН левів 7 я прю не К. Н щ ще т е ви о» де тв

Що не хи ик вно В ТЕН ки й ки да Я ще М ву

В шк еншнье М що ЖЕО ща

Й | | Й зд й жене гсяНОи р іметепстаї натрю ном

Же у Сех зи оч Н

І мМ. ОК ба їх Кк

ЧО,

І

Структура іметелстату також може бути представлена, як показано нижче іметенстат

Ве т ВюгА 8 Г | Й ВачтА Ви

Мвт в Ва 0 ВогА сон | рн | В. - Віз г А

Цій | ви 68 ! !

МО пра вве Ї з тимін ! он ! - бут А х вденін рон ВизА 0 б егуднія - їй Ва Сх цИТОЗИН

У й

ШМАТ «СНУ (ЄНУна с МОНУ (ОНОНІ-СМУ:

Група ГРТ являє собою пальмітоїлліпід, ковалентно пов'язаний з М3--РБ5 тіофосфор- амідатом олігонуклеотиду. Послідовність основ з тринадцяти нуклеотидів являє собою наступну: ТАйССТТАСАСАА і представлена основами від В: до Віз. Групи -МН-Р(-5ХОН)- і -О-

РІ-5БХОН)-вказаної структури можуть знаходитися у сольовій формі. Зрозуміло, що сольові форми сполукиза даним винаходом охоплені зображеними в даному документі структурами, навіть якщо це конкретно не зазначено.

Іметелстат натрію також можна представити наступним чином:

Мох - Ве ВечА 5. | Вог А Вухо

Баттотио но пе Вз Ван Віз А ше -- | бух Ват А рок щі і Вас Ї з тимін

Ме ше ! -- Ву т Ах аденін . й пиа Ва А (З г гувнім - «ля Ваг (3 Сх цитозиН он

МАТ сне Онана С МСНУ НОМ СНУ

Група -МН-Р/-5ХОН)- і основи тиміну, аденіну, гуаніну та цитозину можуть зустрічатися в інших таутомерних конфігураціях, які застосовуються на фігурах опису. Зрозуміло, що всі таутомерні форми досліджуваної сполуки охоплені структурою, де описана одна можлива таутомерна форма сполуки, навіть якщо конкретно не зазначено.

Попередній рівень техніки

Схема синтезу, що застосовується у М/О-2005/023994 для одержання іметелстату як сполуки (1), описана на Схемі 1 і Схемі 2. Синтез цього олігонуклеотиду досягається із застосуванням твердофазної фосфорамідитної методології в якій всі реакції відбуваються на твердофазному носії. Синтез іметелстату здійснюється на склі з контрольованим розміром пор (І САА-СРС), завантаженому З-пальмітоїламідо-1-0-(4,4"-диметокситритил)-2-0- сукциніллропандіолом. Олігонуклеотид збирається від 5' до 3 кінця шляхом додавання захищених нуклеозид-5'-фосфор-амідитів за сприяння активатора. Кожен цикл подовження складається з 4 окремих, чітко контрольованих стадій: зняття захисту, зв'язування амідиту, сульфуризації і стадії кепування.

Схема 1: іметелстат схема синтезу цикл 1

М сив о І з му пов ко ЦИ ЩІК. З як

Ея ква и зи ру з ій пет,

Се ї5 (З нку ї соте, дев у жк

Е ї У й 59

Цикл свнтезу 2-1 х в.

Я Я ї. Зняття захисту

М у І ки їх ; Ше ки чем х и н «САЛА ко ва гу в г. томи Ні ово Є Й нн і і рено ит, АХ ХК ї о он ч бен кір ОО Шок що с с ї В и - і Мои Ек 5

Непроревгувнвці 7 М | чо

МА, кеповані 4. Кепування 2. Зв'язування | Мн

ЖК. бейм / Фосфорамідні ї І 7 ен нд ел о я ФІ с і

СУ В ке є Кая сао ї у в ге шк ен еще Я п о а ве у Кк я В яоьолАВВЕ Ве «с У

Ї су ФОМИ ща "у « МНЕ й ав З МИ зе ри (оз очи зом ще МмнтЕ

З. Сульфуризація

На Схемі 1 синтез на твердофазному носії починається з видалення кислото-лабільної захисної групи 4,4-диметокси-тритилу (ОМТ) з пальмітоїламідопропандіолу, зв'язаного з твердофазним носієм. Фосфорамідит першого нуклеотиду зв'язується з носієм з подальшою сульфуризацією фосфору із застосуванням 0.1 М розчину фенілацетил дисульфіду (РАЮ5) в суміші ацетонітрилу та 2,б-лютидину (співвідношення 1:1). Потім застосовують стадію кепування для запобігання зв'язування будь-якого непрореагувавшого вихідного матеріалу на твердофазному носії з фосфорамідитом нуклеотиду в наступних циклах реакції. Кепування проводиться із застосуванням суміші 18:1:1 ТГФ / ізомасляний ангідрид / 2,6-лютидин.

Після першого циклу на твердофазному носії, подовження ланцюга досягається реакцією 3'- аміногрупи пов'язаного 3 носієм олігонуклеотиду із надлишком розчину захищеного нуклеотидного фосфорамідитного мономеру, що відповідає наступному потрібному нуклеотиду у послідовності, як зображено на Схемі 2.

Схема 2: іметелстат схема синтезу цикл 2-13

М ви що а Ї М ті г мим з ее ЗЕ

С с яе сис і 5 З з у міри Шок ним, сти о

КК т вх МК их Я з о АХ Моє дн В й У нЕтудний цикл я їв) Мн й і : їв м т і

ТК тречня ; і Кз / - Й пбтеруєтх а чад яЗмд: ; н ї / х.Кязування | пізня в і я

У Я. кепування ; ШИК

Н «восфорамідих

М ї в н ДН Ї Ге соку

КОМ за са ак Я Мена не ж

ШІ Бв ! ба ТМ, кош я Ех Може я В

М -о рах ПО Ко ї гній З; еуйьфуризація р нед ЗКУ УК УТ Уют іа 2 талі о В Сея е

Га їх Сех шк Н ж, їх «і КН МО" в Мт

На Схемі 2 зображений перший цикл способу подовження ланцюга, який досягається зняттям захисту 3'-аміногрупи олігонуклеотиду, пов'язаного з носієм, (а) з подальшою реакцією зв'язування 3'-аміногрупи пов'язаного з носієм олігонуклеотиду (Б) з надлишком розчину 5'- фосфорамідитного мономеру, що відповідає наступному потрібному нуклеотиду у послідовності іметелстату. Наступною за реакцією зв'язування відбувається сульфуризація фосфору пов'язаного з носієм олігонуклеотиду (с) і стадія кепування (див. Схему 3) для запобігання зв'язування будь-якого непрореагувавшого вихідного матеріалу на твердофазному носії (Б) з 5'- фосфорамідитом нуклеотиду в наступних циклах реакції. Цикл реакції по Схемі 2 повторюють 12 разів перед обробкою пов'язаного з твердофазним носієм олигонуклеотиду сумішшю 1: 1 етанолу і концентрованого аміаку з подальшим очищенням за допомогою ВЕРХ з одержанням іметельстата.

Схема З

І. «КНУ Я, «ни мохи ай Но ке - в се ія п !

Стадія кепування із застосуванням суміші 18:1:1 ТГФф / ізомасляний ангідрид / 2,6-лютидин проводиться для перетворення будь-якого, що залишився після стадії зв'язування пов'язаного з твердофазним носієм олігонуклеотиду (Б) з первинною 3'-аміногрупою, в олігонуклеотид (є) із захищеною (або "керованою") 3'-аміногрупою, щоб запобігти зв'язування первинної 3'- аміногрупи з фосфорамідитом нуклеотиду в наступних циклах реакції.

МУО-01/18015 розкриває у Прикладі З з 5ЕО ІО Ме 2 М3--РБ' тіофосфорамідатний олігонуклеотид і спосіб одержання цього олігонуклеотиду, який включає стадію кепування.

У Негтбреті В-5 вї аіІ. обговорюється ліпідна модифікація ЧАМ163 (Опсодепе (2005) 24, 5262- 5268).

У МакКіко Ногіє єї аі. обговорюється синтез і властивості олігонуклеотидів, що містять нуклеїнові кислоти з 2-0, 4"-С-етиленовимі містиковим зв'язком, спрямованих на субодиницю

РНКтіломерази людини (Мисівїс Асідаз Бутровішт Зегевз (2005) 49, 171-172).

Опис винаходу

Реакція зв'язування в способі, пов'язаному з твердофазним носієм, розкритому у УМО- 01/18015 ії М/О-2005/023994, включає стадію кепування для запобігання вступу в реакцію будь- яких непрореагувавших первинних 3'-аминогрупп на пов'язаному з носієм олігонуклеотиді

Зо протягом наступних циклів.

У даний час несподівано було виявлено, що застосування стадії кепування, як описано у попередньому рівні техніки, є зайвим і що іметелстат може бути одержаний із застосуванням 3-х стадійного без додаткової стадії кепування з майже однаковим виходом і чистотою у порівнянні з попереднім рівнем техніки з 4-х стадійним циклом, в якому застосовується вказана стадія кепування. Усунення стадії кепування з кожного циклу приносить користь загальному способу за рахунок скорочення кількості стадій циклів на 22 95 (з 54 до 42 стадій) і, отже, скорочення часу способу. Також витрата розчинника зменшується за рахунок скорочення стадій циклів, що робить процес більш екологічним.

У даному документі, де використовується термін "стадія кепування", він визначає додаткову стадію хімічного способу, в якій первинна вільна 3'-аминогрупа на пов'язаному з твердофазним носієм олігонуклеотиді перетворюється на заміщену вторинну або третинну 3'-аміногрупу, яка не здатна брати участь в реакції зв'язування із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М,

М-діїзопропіламіно-фосфорамідитим мономером на наступній стадії зв'язування.

В одному варіанті здійснення, даний винахід відноситься до способу синтезу М3'-»РБ' тіофосфорамідату олігонуклеотиду формули іматенстат сш о Ве т бо А й і ' Вісі | Ве А Вір це оон ад Ві ж ВизА о -6 | Веб 0 Вата вою Ва В Ш о

ПИ Важ Тетимін

ОН І жрннй а зе й су ге Ву А х аденін

Мне ВазА бе туанін

М «Ма Ви 000 С цитознн о в ер еснНученьх с -МСНУ НО ст їй спосіб включає: а) забезпечення першого 3'-амінозахищеного нуклеотиду, приєднаного до твердофазного носія формули (А), де РО являє собою кислото-лабільну захисну групу; іо ерения

Мои в пре ща

Нв

З . ще . . ще . р) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи з утворенням вільної 3'-аміногрупи;

Я. - зу ; бі В кін В

КК с ВМ М ев Хе 5 моя в. са

МОкооєеу а в ї ІЕх І щи ч

ВН. с) введення в реакцію вільної 3'-аміногрупи із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-

М, М-діїзопропіламінофосфорамідитним мономером формули (В'ї), де п-2 з утворенням 10 міжнуклеозидного М3'--Р5'-фосфорамідитного зв'язку;

В ге ще --й мономер іїю во п

Я) сульфуризацію міжнуклеозидної фосфорамідитної групи із застосуванням ацилдисульфіду з утворенням М3'-»Р5' тіофосфорамідату; е) повторення 11 разів у послідовному порядку стадії зняття захисту б), стадії зв'язування с) 15 із захищеним //3'-амінонуклеозид-5'-0-ціаноетил-М, М-діїзопропіламіно-фосфорамідитним мономером формули (В'я), де захищена нуклеозидна основа В' в мономері (В'ї) являє собою послідовно захищену нуклеооснову від Вз до Віз на відповідних 11 стадіях зв'язування, і стадії сульфуризації 4);

І) видалення кислото-лабільної захисної групи РО; і 20 9) зняття захисту та відщеплення іметелстату з твердофазного носія який характеризується тим, що на будь-якій зі стадій реакції а) -є) додаткову стадію кепування не проводять.

В одному варіанті здійснення, даний винахід відноситься до способу синтезу М3--РБ тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату формули інетевстат

Ву т Вуд А в. | Вус А Вваа песен о Ва ВХ Ще АЖ

БТ мі ев г й | Ка ав Ві А св | ; | Іо - НУ Ві - й і Ми : : Ве і я-о Ге Ве т Те тимін

Че | я-7й Ву т А х аденін (МН; Ва А (З « тувнів - щ1В Ву С в цЦИТОЗИН їх ї З В ке к хижої чат в Це «дну Єви МОНУ НОВ ОН: спосіб включає: а) забезпечення першого 3'-амінозахищеного нуклеотиду, приєднаного до твердофазного носія формули (А), де РСї являє собою кислото-лабільну захисну групу; же М и їх іі КЗ що КОКО Ще що ца й Те Й б

Мо й вен -е ЇД ях р) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи з утворенням вільної 3'-аміногрупи;

Я

Ж же Кі

ЗТНПИШШХ с Ї її " й че Во 5

МЕ й

Мен З в. (ТАЗ ее ша й чну с) введення в реакцію вільної 3'-аміногрупи із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-0-ціаноетил-

М, М-діїізопропіламінофосфорамідитним мономером формули (В'яї), де В'яї з п-2 являє собою захищений А, з утворенням міжнуклеозидного М3'-Р5-фосфорамідитного зв'язку; г. Гек ЗИ с

Кг з ой ОТ ее 15 . . Й . .

Я) сульфуризацію міжнуклеозидної фосфорамідитної групи із застосуванням ацилдисульфіду для утворення М3'- Ре тіофосфорамідату; е) повторення 11 разів у послідовному порядку стадії зняття захисту б), стадії зв'язування с) із захищеним /3'-амінонуклеозид-5'і-О-ці«аноетил-М, М-діїзопропіламіно-фосфорамідитним мономером формули (В'я), де нуклеозидна основа В' в мономері (В'я) являє собою захищений В, за виключенням випадку, коли В являє собою тимін, і де Ви являє собою наступну нуклеооснову від Вз до Візна відповідних 11 стадіях зв'язування, і стадії сульфуризації а);

І) видалення кислото-лабільної захисної групи РО; і д) зняття захисту та відщеплення відщеплення та зняття захисту іметелстату з твердофазного носія; який характеризується тим, що на будь-якій зі стадій реакції а) -є) додаткову стадію кепування не проводять

В одному варіанті здійснення, даний винахід відноситься до способу синтезу М3- Р тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату формули іКелелет ше - Ве Вуха; пе о Ві В р пАяшеН ме ет : со ці. й | Ву кі Ві й

Ше ща» | ЩО ВихА й | в. Вед

ТКУ еоленюют сж Ж ся якої

ПИШИ Раб Ве т Тен

ОВ | ; о ЗЕ ЧОН ше БУТ 00 Ас аденів

ЕВ: н :

КТ ОУН В ОВ ЧОНОН І ОНех спосіб включає: а) забезпечення першого 3'-амінозахищеного нуклеотиду, приєднаного до твердофазного носія формули (А), де РО являє собою кислото-лабільну захисну групу;

Кк Еш хи а ТВЕО ХО, щі г що ш й: й ;

Нештеци френя що В о

Ум І б і

ЯМ о

Б) зняття захисту з РО-захищеного 3'-амінонуклеотиду з утворенням вільного 3'- амінонуклеотиду формули (А); це шо

КА

М о АВ ех си й рф х х і. ка | несе

МН

15 . . . . . с) зв'язування вільного 3'-амінонуклеотиду із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-

М, М-діїізопропіламінофосфорамідитним мономером формули (В'яї), де В'яї з п-2 являє собою захищений А, з утворенням міжнуклеозидного М3'-Р5-фосфорамідитного зв'язку; -

СВ що ані уся В о шо

Ще еі затівакн В А що К 7 мономер

Ну

ЕчЗ а) сульфуризацію М3'-Р5'-фосфорамідитного зв'язку із застосуванням ацилдисульфіду для утворення міжнуклеозидного М3'--Ре' тіофосфорамідитного зв'язку; є) повторення 11 разів у послідовному порядку: стадії зняття захисту б), стадії зв'язування с) із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М, М-діїзопропіламіно- фосфорамідитним мономером формули (В'я), де нуклеозидна основа В' в мономері (В'я) являє собою захищений В, за виключенням випадку, коли В являє собою тимін, і де Вп являє собою наступну нуклеооснову від Вз до Віз на відповідних 11 стадіях зв'язування, і стадіїй етапі сулфуризації а); з одержанням захищеного М3--РБ5 тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату, приєднаного до твердофазного носія; Її) видалення 3'-кінцевої кислото-лабільної захисної групи

Ра із захищеного М3-РБ' тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату; і д) зняття захисту та відщеплення захищеного М3--»РБ тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату від твердого носія з одержанням іметелстату; який характеризується тим, що на будь-який зі стадій реакції а) -е) додаткову стадію кепування не проводять.

Згідно даному винаходу може застосовуватися широкий спектр твердофазних носіїв, включаючи, але не обмежуючись ними, такі, як мікрочастинки, виготовлені зі скла з контрольованим розміром пор (СРО), полістиролу з високим ступенем поперечної зшивки, гібридного скла з контрольованим розміром пор, завантаженого поперечно-зшитим полістирольним носієм, акрилових співполімерів, целюлози, нейлону, декстрану, латексу, поліакролеїну та тому подібного. 3'-амінозахищений нуклеотид, приєднаний до твердофазного носія формули (А) ку

Меси в ВН

ПКЕЕ 0

КН чо р В Ще т та ан в нах може бути одержаний так, як розкрито у МУО-2005/023994, де здійснювали зв'язування носія зі скла з контрольованим розміром пор, завантаженого З-пальмітоїламідо-1-0-(4,2- диметокситритил)-2-О-сукцинілпропандіолом, із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М,

М-діїзопропіламінофосфорамідитним мономером формули (В':) ! я

ОА ВУ ше. ваг па но

Ме ї- ща , мономерів р у яму я

НА ре де РО являє собою кислото-лабільну захисну групу. Придатні кислото-лабільній 3'-

Зо амінозахисні групи Рі являють собою, але не обмежуються ними, наприклад, трифенілметил (тобто тритил або Ттг), п-анізилдифенілметил (тобто моно-метокситритил або ММТ) і ді-п- анізилфенілметил (тобто диметокситритил або ДМТ).

Захищені 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М, М-діїізопропіламінофосфорамідитні мономери формули (В'я) мають 3'-амінозахисну групу РО, яка являє собою кислотно-лабільну групу.таку як трифенілметил (тобто тритил або Ті), п-анізилдифенілметил (тобто монометокситритил або

ММТ) або ді-п-анізилфенілметил (тобто диметокситритил або ЮМТ). Крім того, нуклеозидна основа В' захищена осново-лабільною захисною групою (крім тиміну).

, Ву Ве захищене А -Кки ТО. з захншена А Кі з захищена С ав нн В є захищена СЗ Ме» захищена А шов Ви Ва захищена З Й іх з захищена А жі З ш- жнонерії В'єх захищена 5 ! ПИ Ву Те тимін

НМ. во Взетї А « аденін

Ве: захищена А (5 х Туднін

Во захищена С С « цитозин

Нуклеотидні мономери В"': і В'» до В'їз застосовуються послідовно на 13 стадіях зв'язування, починаючи з забезпечення твердофазного носія, завантаженого З-пальмітоїламідо-1-О-(4,4- диметокситритил)-2-О-сукциніллропандіолом і зв'язування з нуклеотидним мономером В' і наступним циклом з 12 реакцій зняття захисту, реакції зв'язування та сульфуризації, в яких застосовуються нуклеотидні мономери від В'» до В'з.

З3З'--амінозахисну групу РО можна видалити, обробляючи кислим розчином таким як, наприклад, дихлороцтова кислота в дихлоорметані або толуені.

Нуклеозидна основа В' в захищених 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М, М-діїзопропіл- амінофосфорамідитних мономерах формули (В'ї) захищена осново-лабільною захисною групою, яка видаляється на етапі 9). Придатними осново-лабільними захисними групами для нуклеозидної основи аденіну, цитозину або гуаніну є, наприклад, ацильні групи, такі як ацетил, бензоїл, ізобутирил, диметил-формамідиніл або дибензилформамідиніл. За умов реакції, що застосовуються в олігонуклеотидному синтезі, нуклеозидна основа тиміну не потребує захисту.

Такі захищені 3'-аміно-нуїслеозид-5'-О-ціаноетил-М, М-діїзопропіламінофосфорамідитні мономери формули (В'я), що мають 3'-амінозахищену кислото-лабільну групу, захисну групу РО і нуклеозидну основу В' що захищена осново-лабільною захисною групою, є комерційно доступними або можуть бути одержані, як описано у УУМО-2006/014387.

Стадію зв'язування с) проводять додаванням розчину захищеного 3'-амінонуклеозид-5'-О- ціаноетил-М, М-дізопропіламінофосфорамідитного мономеру формули (Ви) і розчину активатора (або розчину, що містить фосфорамідитний мономер (Ви) й активатор) у реакційну посудину, що містить вільну аміногрупу (оліго)нуклеотиду, ковалентно приєднаного до твердого носія. Потім суміш змішують такими способами, як механічне вихрування, барботаж інертним газом і т.п. Як альтернатива, може бути зроблено так, щоб розчин(и) мономеру і активатора протікали через реакційну посудину (або колонку), що містить (оліго)дунуклеотид з вільною 3'- аміногрупою, нанесений на тверду фазу. Мономер й активатор можуть бути попередньо перемішані, змішані у клапанному блоці придатного синтезатора, змішані у посудині для попередньої активації та попередньо витримані, якщо потрібно, або вони можуть бути додані окремо у реакційну посудину.

Прикладами активаторів для застосування у винаході являються, але не обмежуюються ними, тетразол, 5-(етилтіо)-1ІН-тетразол, 5-(4-нітро-феніл)тетразол, 5-(2-тієніл)-1Н-тетразол, триазол, піридинію хлорид і тому подібне. Придатними розчинниками являються ацетонітрил, тетрагідрофуран, дихлорометан і тому подібне. На практиці ацетонітрил є широко застосовуваним розчинником для синтезу олігонуклеотиду.

Реагент сульфуризації для застосування на стадії 4) являє собою ацилдисульфід, розчинений в розчиннику... Ацилдисульфіди, відомі в даній області техніки, являють собою-, наприклад, дибензоїлдисульфід, біс(фенілацетил)у дисульфід (РАЮОБ), біс(4-метоксибензоїл) дисульфід, біс(4-метилбензоїл) дисульфід, біс(4-нітробензоїл) дисульфід і біс(4-хлорбензоїл) дисульфід.

Фенілацетилдисульфід (РАЮ) є загальновживаним реагентом для реакцій сульфуризації, який найкращим чином слід "витримувати»хв основному розчині для одержання оптимальної активності сульфуризації (бсоїбзоп ..Ї. еї аІ., Ог9у. Віотої. Спет., мої. 14, 10840-10847, 2016).

Придатним розчинником для РАЮ5 являється, наприклад, суміш основного розчинника, такого як, наприклад, З-піколіну або 2,6-лютидину зі співрозчинником, таким як ацетонітрил, толуен, 1- метил-піролідинон або тетрагідрофуран. Кількість основного розчинника до кількості співрозчинника може бути у будь-якому співвідношенні, включаючи співвідношення 1:1.

Залежно від фосфітного складного ефіру, який повинен бути перетворений у відповідний тіофосфат, можна застосовувати як "свіжий", так і "витриманий" РАЮОБ5, однак показано, що "витримані" РАЮ покращують швидкість й ефективність сульфуризації. "Витримані" розчини

РАО5 являють собою свіжоприготовлені розчини РАОБ, які витримувалися деякий час перед застосуванням в реакції сульфуризації. Час витримування може варьюватися від декількох годин до 48 годин, і кваліфікований фахівець може визначити оптимальний час витримування, аналізуючи реакцію сульфуризації на вихід і чистоту.

Для одержання іметелстату за даним винаходом, застосовується розчин РАЮ5 в суміші ацетонітрилу та 2,6-лютидину, переважно у співвідношенні 1:1, з часом витримки від 4 до 14 годин. Виявлено, що при застосуванні 2,6-лютидину гранична кількість 2,3,5-колідину (який зазвичай виявляють в якості домішки в 2,6-лютидині) нижче 0,195 покращує ефективність сульфуризації, та спостерігають меншу кількість небажаного окиснення фосфору.

На стадії 9) з іметелстату знімають захист і відщеплюють від твердофазного носія. Зняття захисту включає видалення В-ціаноетильних груп й осново-лабільних захисних груп на нуклеотидних основах. Це можна зробити обробкою основним розчином, таким як розчин діетиламіну (ОЕА) в ацетонітрилі, з подальшою обробкою водним аміаком, що розчинений в спирті, такому як етанол.

Стадії реакції а)-ї) даного винаходу проводяться в діапазоні температур від 10 "С до 40 "с.

Більше переважно, ці реакції проводять при контрольованій температурі в діапазоні від 15 "С до 30 "С. Зокрема, стадію реакції Б) у даному винаході проводять при контрольованій температурі в діапазоні від 15 "С до 30 "С; більше конкретно від 17 "С до 27 "С. Зокрема, стадію реакції а) у даному винаході проводять в діапазоні температур від 17 "С до 25 "С; більше конкретно від 18 С до 22 "С; ще більше конкретно при 19 "С. Стадію 9), в якій з іметелстату знімають захист і відщеплюють від твердофазного носія, проводять при температурі в діапазоні від 30 "С до 60"С. Залежно від обладнання та конкретних застосовуваних умов реакції, оптимальна температура реакції для кожної стадії а)-д) у вищезазначених діапазонах може бути визначена кваліфікованим фахівцем.

Після кожної стадії в циклі подовження, твердофазний носій промивають розчинником, наприклад, ацетонітрилом, при приготуванні до наступної реакції.

Після стадії 9), неочищений іметелсотат одержують у формі амонієвої солі, яку потім очищають препаративною зворотно-фазовою високоефективною рідинною хроматографією (3Ф-ВЕРХ), застосовуючи полімерні смоли або смоли на основі кремнезему, щоб одержати

Зо очищений іметелстат у триетиламіновій формі. Додають надлишок натрієвої солі, а потім розчин знесолюють шляхом діафільтрації, одержуючи таким чином іметелстат натрію, який потім ліофілізують для видалення води.

Експериментальна частина "Кімнатна температура" або "температура навколишнього середовища" зазвичай становить 21-2576.

Експеримент 1 (відсутня стадія кепування)

Всі реагенти та розчини вихідного матеріалу готували, включаючи З 95 дихлороцтову кислоту (ОСА) в толуені, 0.5 М розчин 5-(етилтіо)-1Н-тетразолу в ацетонітрилі, 0.15 М розчин усіх 4 нуклеотидних мономерів формули (В'ї) в ацетонітрилі, 0.2 М розчин фенілацетил дисульфіду (РАЮ5Б) в суміші ацетонітрилу та 2,б-лютидину 1:1 і 20 95 розчин ДЕА (діетиламіну) в ацетонітрилі. щ-й тр ов і: а «бе дей фун З ше: 2 сек

С Є Й р;

В, В'є, В'; й ці з У дя | А щі.

ці і ї не ше о МК Мі цк От шо, ц ' ' ' ' ' че ча ім;

В», В'в, В", В"ї2, В'їз ит

Я шин я ней

Ж щ ви р НО ме нет чн а - к ЕН Н Н НІ

П-я х ве ца а и

Й Б БУ БУ гж ї

В'з В. А В'5 В'є о Урі ту не Канн її Срна 2 п в і се ше о ки че ож

Й НМ о й

Я й сб в ще | М й ву 7 що МО ' Ял о | ше

Вч М У. п МИ мл

ОЗ | и

Уджкй Же й Ко г Ї

З

Синтез олігонуклеотиду проводили в напрямку від 5' до 3, використовуючи повторюваний цикл синтезу, що складається з детритилювання з подальшим зв'язуванням і сульфуризацією при температурі навколишнього середовища.

Колонку (діаметром: 3.5 см) заповнювали твердим носієм, завантаженим З-пальмітоїламідо- 1-0-(4,42-диметокситритил)-2-О-сукциніл пропандіолом (3.5 ммоль на основі ємності 400 цмоль/г), що зв'язувався з нуклеотидним мономером В'ї. Детритилювання здійснювали із застосуванням З 95 дихлороцтової кислоти (ОСА) в толуені (кількість становила від 6.5 до 13.4 об'ємів колонки на кожній стадії детритилювання), і зв'язаний з твердим носієм нуклеотид, промивали ацетонітрилом (кількість: 5 об'ємів колонки). Зв'язування з наступним нуклеотидним мономером формули (В'ї) було досягнуто шляхом закачування 0.5 М розчину 5-(етилтіо)-1 Н- тетразолу в ацетонітрилі та 0.15 М розчину наступного у послідовності нуклеотидного мономеру формули (В'я), розчиненого в ацетонітрилі, через колонку. Колонку промивали ацетонітрилом (кількість: 2 об'єми колонки). Потім сульфуризацію проводили закачуванням розчину 0.2 М феніл ацетил дисульфіду (РАЮ5) в суміші ацетонітрилу та 2,6-лютидину 1:1 через колонку з подальшим промиванням колонки ацетонітрилом (кількість: 5 об'ємів колонки).

У синтезі цикл детритилювання, зв'язування з наступним нуклеотидним мономером формули (В'ї) їі сульфуризацію повторювали 12 разів, з подальшим детритилюванням із застосуванням З 95 дихлороцтової кислоти (ОСА) в толуені (кількість становила від 6.5 до 13.4 об'ємів колонки).

По завершенні циклу синтезу, неочищений олігонуклеотид на твердофазному носії обробляли розчином діетиламіну (ДЕА) з подальшою обробкою розчином гідроксид амонію: етанол (об'ємне співвідношення 3:1) при температурі 55 "С. Реакційну суміш витримували протягом 4-24 годин при 55"С, охолоджували до кімнатної температури, і суспензію фільтрували для видалення полімерного носія. Розчин, який включає іметелстат в його амонієвій формі, піддавали процедурі аналізу ВЕРХ згідно Експерименту 3.

Експеримент 2 (зі стадією кепування)

Всі реагенти та розчини вихідного матеріалу готували, включаючи З 95 дихлороцтову кислоту (ОСА) в толуенії, 0.5 М розчин 5-(етилтіо)-1Н-тетразолу в ацетонітрилі, 0.15 М розчин усіх 4 нуклеотидних мономерів формули (В'ї) в ацетонітрилі, 0.2 М розчин фенілацетилдисульфіду (РАЮ) в суміші ацетонітрилу та 2,б-лютидину 1:1, 20 95 розчин М- метилімідазолу (ММІ) в ацетонітрилі як реагент кепування А, ізомасляний ангідрид в суміші ацетонітрилу та 2,6-лютидину 11 як реагент кепування В і 20 95 ДЕА в ацетонітрилі.

Синтез олігонуклеотиду проводили в напрямку від 5' до 3, використовуючи повторюваний цикл - синтезу, що складається з детритилюванняї з подальшим зв'язуванням і сульфуризацією при температурі навколишнього середовища.

Колонку (діаметром: 3.5 см) заповнювали твердим носієм, завантаженим З-пальмітоїламідо- 1-0-(4,42-диметокситритил)-2-О-сукциніл пропандіолом (3.5 ммоль на основі ємності 400 цмоль/г), що зв'язувався з нуклеотидним мономером В'ї. Детритилювання здійснювали із застосуванням З 95 дихлороцтової кислоти (ОСА) в толуені (кількість становила від 6.5 до 13.4 об'ємів колонки на кожній стадії детритилювання), і зв'язаний з твердим носієм нуклеотид, промивали ацетонітрилом (кількість: 5 об'ємів колонки). Зв'язування з наступним нуклеотидним мономером формули (В'ї) було досягнуто шляхом закачування 0.5 М розчину 5-(етилтіо)-1 Н- тетразолу в ацетонітрилі та 0.15 М розчину наступного у послідовності нуклеотидного мономеру формули (В'я), розчиненого в ацетонітрилі, через колонку. Колонку промивали ацетонітрилом (кількість: 2 об'єми колонки). Потім сульфуризацію проводили закачуванням розчину 0.2 М феніл ацетил дисульфіду (РАЮ5) в суміші ацетонітрилу та 2,6-лютидину 1:1 через колонку з подальшим промиванням колонки ацетонітрилом (кількість: 5 об'ємів колонки).

Сульфуризація була наступною після стадії кепування У кожному кепуванні в заданому циклі застосовували 37-47 еквівалентів (екв.) реагенту кепування ММІ та 9-11 еквівалентів реагенту кепування В ізомасляного ангідриду (МА) та 1.4-1.8 еквівалентів 2,6-лютидину. Реагенти кепування А і В перекачували через колонку окремими насосами в різних співвідношеннях, таких як 50:50, 35:65, 65:35.

У синтезі цикл детритилювання, зв'язування з наступним нуклеотидним мономером формули (В'ї) і сульфуризація, і стадію кепування повторювали 12 разів, з подальшим

Зо детритилюванням із застосуванням 3 95 дихлороцтової кислоти (ОСА) в толуені (кількість становила від 6.5 до 13.4 об'ємів колонки).

По завершенні циклу синтезу, неочищений олігонуклеотид на твердофазному носії обробляли розчином діетиламіну (ДЕА) з подальшою обробкою розчином гідроксид амонію: етанол (об'ємне співвідношення 3:1) при температурі 55 "С. Реакційну суміш витримували протягом 4-24 годин при 55"С, охолоджували до кімнатної температури, і суспензію фільтрували для видалення полімерного носія. Розчин, який включає іметелстат в його амонієвій формі, піддавали процедурі аналізу ВЕРХ згідно Експерименту 3.

Експеримент 3: порівняння за відсутності і наявності кепування

Іметелстат, одержаний в Експерименті 1 й Експерименті 2, аналізували за допомогою ВЕРХ.

Кількість необхідного повнорозмірного олігонуклеотиду, що має 13 нуклеотидів, визначили та навели в Таблиці нижче для Експерименту 1 й Експерименту 2. Крім того, загальна кількість короткого олігонуклеотида, зокрема з 12 нуклеотидів, була визначена та наведена в Таблиці нижче для Експерименту 1 й Експерименту 2.

Спосіб аналізу ВЕРХ: тип колонки: Ктотавії С18, розмір частинок 3.5 мкм, 4.6 х 150 мм елюент:

А: 14.4 мМ ТЕА/386 мМ НРЇР (гексафлуороізопропанол)/100 ррт (мас/об.) Маг?ЕеЕЮОТА у воді В: 95 Меон, 50 95 ЕЮН, що містить 5 95 ІПС

Градієнт: 50 нин нини шили 61142115 ни: пиши т Я ПОЛО ГПО

Таблиця експерименти за наявності кепуванням проти за відсутності кепування (Експеримент 1 проводили двічі і результати наведені як Експеримент Та і 16). тенненм СО 0 бненеяюх МИ й й 5. Короткий олігонуклеотид (12

Експеримент Мо відсутність Основний пік, 90 й нуклеотидів) кепування кепування кепування

Аналіз ВЕРХ Експерименту 1 і Експерименту 2 демонструє, що вихід і чистота є порівнянними в експерименті за відсутності кепування і в експерименті з кепуванням.

Основний пік, 96, включає повнорозмірний олігонуклеотид їж домішки РО ї депуриновані домішки.

РО домішки являють собою домішки, які включають один або більше оксофосфорамідатних міжнуклеозидних зв'язків замість тіофосфорамідатних міжнуклеозидних зв'язків.

Застосування розчинника та час реакції 0.45 л ацетонітрилу/ммоль застосовується для приготування реагенту кепування А та реагенту кепування В, що відповідає близько 25 95 загального використання ацетонітрилу під час приготування реагентів. Оскільки за кожною стадією хімічної реакції відбувалося промивання розчинником, після кожної стадії кепування також, відбувається промивання розчинником, що еквівалентно близько 40 об'ємам колонки розчинника. Враховуючи, що близько 212 об'ємів колонки промивального розчинника застосовувалося для заданого циклу синтезу, близько 19 95 промивального розчинника застосовувалося для стадій кепування. стадій кепування займала від З до б хвилин. Це відповідає близько 8 95 загального часу синтезу, включаючи 13 циклів і обробку ДЕА.

Експеримент 4 (температура детритилювання)

Температура детритилювання впливає з точки зору контролю п-1 і депуринованих домішок.

Температуру деблокуючого розчину на вході в установку для синтезування вибирали від 17,5 до 27 "С (при загрузці 3,5 ммоль), і вибрану температуру утримували такою самою протягом всіх етапів детритилювання. При промиванні ацетонітрилом також утримували таку саму температуру деблокуючого розчину. 956 депуринованих домішок збільшувався лінійно в залежності від температури, в той час як п-1 був вище при більше низьких температурах.

Експеримент 5 (температура стадії сульфуризації)

В експериментах нижче досліджували вплив температури (НТ означає кімнатну температуру) використовуваного в реакціях сульфуризації розчину РАОБ5 на 95 менше бажаних

Зо домішок РО (вони являють собою домішки, в яких окиснення фосфору відбувається замість сульфуризації). Більш низькі температури призводять до більш низького 95 РО. в1111111111111111111117111111111111681

ЗЕО ІО МО:1 - іметелстат і іметелстат натрію

5-8-ТАааСТТАСАСАДА-МН»-3! де А являє собою пальмітоїл |(СНг).4СНз| амід, кон'югований за допомогою аміногліцеринового лінкеру з 5'-тіофосфатною групою М3--РБ' тіофосфорамідату (МР) - зв'язаного олігонуклеотиду.

Claims (13)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб синтезу М3'-РБ'-тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату формули: іметелстат

В. шт Ваз хх д З й І Ве вд В. Р с ЕН Н се ; мкм ки -в В Ву: Ва - З Во д с | -2 і В. щ ЕЕ- Вуз ш д МН Вк г З Пеня м 2 Ве Ве т т т - чикін ІЩ |! они т й й он ех А х аденін Мн; ВехА 0 бе гувнін не 8 Ваз Сх ЦИТОЗИН З н Це ОН Она ма СМ ОН НОМ СН» ; який включає: а) забезпечення першого 3'-амінозахищеного нуклеотиду, приєднаного до твердофазного носія формули (А), де РО являє собою кислотолабільну захисну групу: «ТЯ и ді й -ю ОН СХ Ах А р я Кк І Мои яр

НМ. зо ве А р) зняття захисту захищеної 3'-аміногрупи з утворенням вільної 3'-аміногрупи: ДК кс СИН Ї ї С ще се « ї- що м щи я ме а. що щй вк ї МН» 1 А с) введення в реакцію вільної 3'-аміногрупи із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М, М- дізопропіламінофосфорамідитним мономером формули (В'ї), де В' з п-2 являє собою захищений А, з утворенням міжнуклеозидного М3'-Р5-фосфорамідитного зв'язку: ще до й й тт а. тя й В цей со ще у МОНОМерВ ся м пе й а з а) сульфуризацію міжнуклеозидної фосфорамідитної групи із застосуванням ацилдисульфіду з утворенням М3'--РБ'-тіофосфорамідату;

е) повторення 11 разів у послідовному порядку стадії зняття захисту Б), стадії зв'язування с) із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М,М-діззопропіламінофосфорамідитним мономером формули (В'я), де нуклеозидна основа В' в мономері (В'я) являє собою захищений В, за виключенням випадку, коли В являє собою тимін, і де Ви являє собою нуклеооснову послідовно від Вз до Віз на відповідних 11 стадіях зв'язування, і стадії сульфуризації а); І) видалення кислотолабільної захисної групи РО; і 9) зняття захисту та відщеплення іметелстату від твердофазного носія; що характеризується тим, що додаткова стадія кепування не виконується на будь-якій зі стадій а)-е) реакції.

2. Спосіб за п. 1, у якому іметелстат додатково перетворюють в його натрієву сіль.

3. Спосіб за будь-яким із пп. 1 або 2, у якому ацилдисульфід вибраний з дибензоїлдисульфіду, біс(фенілацетил)дисульфіду (РАО5Б), біс(4-метоксибензоїл)дисульфіду, біс(4- метилбензоїл)дисульфіду, біс(4-нітробензоїл)дисульфіду та біс(4-хлорбензоїл)дисульфіду.

4. Спосіб за п. 3, у якому ацилдисульфід являє собою РАЮО5.

5. Спосіб за п. 4, у якому РАЮ5 розчиняють в суміші З-піколіну або 2,6б-лутидину зі співрозчинником, вибраним з ацетонітрилу, толуену, 1-метилпіролідинону та тетрагідрофурану.

6. Спосіб за п. 5, у якому РАОЗ розчиняють в суміші 2,6-лутидину з ацетонітрилом.

7. Спосіб за п. 6, у якому розчин РАОЗ витриманий від 4 до 14 годин перед застосуванням.

8. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, у якому кислотолабільна група РО вибрана з трифенілметилу, п-анізилдифенілметилу та ді-п-анізилфенілметилу.

9. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, у якому кислотолабільну захисну групу РО видаляють шляхом обробки кислим розчином.

10. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, у якому основолабільну захисну групу на основі аденіну, цитозину та гуаніну в мономері формули (В'ї) вибирають з ацетилу, бензоїлу, ізобутирилу, диметилформамідинілу та дибензилформамідинілу.

11. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, у якому стадію зв'язування с) проводять із застосуванням активатора, вибраного з тетразолу, 5-(етилтіо)-1Н-тетразолу, 5-(4- нітрофеніл)тетразолу, 5-(2-тієніл)-1 Н-тетразолу, триазолу та піридинію хлориду.

12. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, у якому стадію 9) здійснюють шляхом обробки Зо основним розчином.

13. Спосіб за п. 12, у якому основний розчин являє собою діетиламін, розчинений в ацетонітрилі, або водний аміак, розчинений у спирті, або комбінацію обох.