BR122021003805B1 - Pirimidinas modificadas na posição 5 - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere ao campo de química de ácido nucleico, especificamente a uridinas modificadas na posição 5, bem como derivados de fosforamidita e trifosfato das mesmas. A presente divulgação se refere também a métodos de fabricação e uso dos mesmos.

Description

[001] Dividido do BR112012025872-9, depositado em 12.04.2011.

PEDIDOS RELACIONADOS

[002] O presente pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisório US 61/323,145, depositado em 12 de abril de 2010, o qual é incorporado aqui por referência na íntegra.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção se refere ao campo de química de ácido nucleico, especificamente a uridinas modificadas na posição 5, bem como derivados de fosforamitidas e trifosfatos dos mesmos. A presente divulgação se refere também a métodos de fabricação e uso dos mesmos. A divulgação inclui o uso de nucleosídeos modificados como parte de um oligonucleotídeo ou um aptâmero.

ANTECEDENTES

[004] A descrição a seguir fornece um sumário de informação relevante para a presente divulgação e não é uma admissão de que qualquer informação fornecida ou publicações mencionadas aqui são a técnica anterior à presente divulgação.

[005] Tem havido interesse considerável no desenvolvimento de nucleosídeos modificados como agentes terapêuticos, agentes diagnósticos e para incorporação em oligonucleotídeos. Por exemplo, nu- cleosídeos modificados, tais como AZT, ddI, d4T e outros, têm sido usados para tratar AIDS. 5-trifluorometil-2'-deoxiuridina é ativa contra queratite herpética e 5-iodo-1-(2-deoxi-2-fluoro-b-D- arabinofuranosil)citosina tem atividade contra CMV, VZV, HSV-1, HSV- 2 e EBV (A Textbook of Drug Design and Development, Povl Krogs- gaard-Larsen e Hans Bundgaard, Eds., Harwood Academic Publishers, 1991, Capítulo 15).

[006] Nucleosídeos modificados têm mostrado utilidade em aplicações diagnósticas. Nestas aplicações, os nucleosídeos são incorporados em DNA em localizações determináveis e vários métodos diagnósticos são usados para determinar a localização dos nucleosídeos modificados. Estes métodos incluem rádio-rotulação, rotulação fluorescente,biotinilação e clivagem de fita. Um exemplo de clivagem de fita envolve reação do nucleosídeo com hidrazina para proporcionar nucleosídeos de ureia, então, reação do nucleosídeo de ureia com pi- peridina para causar clivagem de fita (o método de Maxam-Gilbert).

[007] Nucleosídeos modificados também têm sido incorporados em oligonucleotídeos. Há várias formas pelas quais oligonucleotídeos podem ser úteis como produtos terapêuticos. Oligonucleotídeos antis- senso podem se ligar a determinadas regiões de codificação genéticas em um organismo para prevenir a expressão de proteínas ou bloquear várias funções celulares. Ainda, um processo conhecido como o processo SELEX ou Evolução Sistemática de Ligantes para Enriquecimento Exponencial (Systematic Evolution of Ligands for EXponential Enrichment), nos permite identificar e produzir oligonucleotídeos (referidos como "aptâmeros") que se ligam seletivamente à moléculas alvo. O processo SELEX é descrito na Pat. U.S. N° 5.270.163, os conteúdos da qual são incorporados aqui por referência.

[008] O método SELEX envolve a seleção de oligonucleotídeos de uma mistura de candidatos para obter virtualmente qualquer critério desejado de afinidade e seletividade de ligação. Começando a partir de uma mistura aleatória de oligonucleotídeos, o método envolve contato da mistura com um alvo sob condições favoráveis para ligação (ou interação), divisão de oligonucleotídeos não ligados de oligonucleotí- deos os quais se ligaram a (ou interagiram com) moléculas alvo, dissociação dos pares de oligonucleotídeo-alvo, amplificação dos oligo- nucleotídeos dissociados dos pares de oligonucleotídeo-alvo para pro- porcionar uma mistura de oligonucleotídeos enriquecida em ligante, então, repetição das etapas de ligação, divisão, dissociação e amplificação através de tantos ciclos quanto desejado.

[009] Nucleosídeos modificados podem ser incorporados em oli- gonucleotídeos antissenso, ribozimas e oligonucleotídeos usados em ou identificados por meio do processo SELEX. Estes nucleosídeos podem conferir estabilidade in vivo e in vitro dos oligonucleotídeos para endo e exonucleases, alterar a carga, hidrofilicidade ou lipofilicidade da molécula e/ou conferir diferenças na estrutura tridimensional.

[0010] Modificações de nucleosídeos que foram previamente descritas incluem modificações de açúcar na posição 2', modificações de pirimidina na posição 5, modificações de purina na posição 8, modificações em aminas exocíclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodo-uracila, modificações de parte principais e metilações. Modificações também têm incluído modificações 3' e 5', tal como "capping". O documento PCT WO 91/14696, incorporado aqui por referência, descreve um método para modificação química de oli- gonucleotídeos antissenso para intensificar a entrada em uma célula.

[0011] As Patentes U.S. N°s5.428.149, 5.591.843, 5.633.361, 5.719.273 e 5.945.527, as quais são incorporadas aqui por referência na íntegra, descrevem modificação de nucleosídeos de pirimidina via reações de acoplamento de paládio. Em algumas modalidades, um nucleófilo e monóxido de carbono são acoplados a nucleosídeos de pirimidina contendo um grupo de condução sobre a posição 5 do anel de pirimidina, de preferência formação de derivados de éster e amida.

[0012] Uma variedade de métodos têm sido usada para tornar oli- gonucleotídeos resistentes à degradação por exonucleases. O documento PCT WO 90/15065 descreve um método para produção de oli- gonucleotídeos resistentes à exonuclease mediante incorporação de duas ou mais ligações de fosforamidita, fosforomonotionato e/ou fosfo- roditionato nas extremidades 5' e/ou 3' do oligonucleotídeo. O documento PCT WO 91/06629 divulga oligonucleotídeos com uma ou mais ligações de fosfodiéster entre nucleosídeos adjacentes substituídos mediante formação de uma ligação do tipo acetal/cetal a qual é capaz de ligação a RNA ou DNA.

[0013] Seria vantajoso proporcionar novos nucleosídeos para aplicações terapêuticas e diagnósticas e para inclusão em oligonucleotí- deos. Quando incorporados em oligonucleotídeos, seria vantajoso proporcionar novos oligonucleotídeos que exibem alta afinidade de ligação diferente por moléculas alvo e/ou mostram resistência aumentadaà exonucleases e endonucleases do que oligonucleotídeos preparados a partir de nucleosídeos que ocorrem naturalmente. Seria também útil proporcionar nucleotídeos com modificações que conferem uma outra atividade biológica que não, ou além de, resistência à endonuclease e exonuclease.

SUMÁRIO

[0014] A presente divulgação proporciona uridinas modificações na posição 5 da fórmula geral a seguir:

[0015] em que:

[0016] R é selecionado do grupo que consiste em -(CH2)n-RX1;

[0017] RX1é selecionado do grupo que consiste em:

*denota ponto de fixação do grupo RX1ao grupo de conexão (CH2)n

[0018] em que

[0019] RX4é selecionado do grupo que consiste em uma (C1-C20)alquila inferior linear ou ramificada; halogênio (F, Cl, Br, I); nitrila (CN); ácido borônico (BO2H2); ácido carboxílico (COOH); éster de ácido car- boxílico (COORX2); amida primária (CONH2); amida secundária (CO- NHRX2); amida terciária (CONRX2RX3); sulfonamida (SO2NH2); N-alquil- sulfonamida (SONHRX2);

[0020] em que

[0021] RX2, RX3são, independentemente, selecionados do grupoque consiste em uma (C1-C20) alquila inferior linear ou ramificada; fe- nila (C6H5); um anel de fenila RX4substituído (RX4C6H4), em que RX4é definido acima; um ácido carboxílico (COOH); um éster de ácido car- boxílico (COORX5), em que RX5é uma (C1-C20) alquila inferior linear ou ramificada; e cicloalquila, em que RX2= RX3= (CH2)n;

[0022] em que n = 0-10;

[0023] em que

[0024] X é selecionado do grupo incluindo, porém sem limitação, - H, -OH, -OMe, -O-alila, -F, -OEt, -OPr, -OCH2CH2OCH3 e -azido;

[0025] em que

[0026] R'é selecionado do grupo incluindo, porém sem limitação, - OAc; -OBz; e -OSiMe2tBu;

[0027] em que

[0028] R''é selecionado do grupo incluindo, porém sem limitação,H, DMT e trifosfato (-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2) ou um sal dos mesmos; e

[0029] em que

pode ser substituído por análogos de açúcar carbocíclico, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedo-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos, tal como metil ribosídeo.

[0030] Incluídos são derivados de 3'-fosforamidita e 5'-trifosfato dos referidos compostos tendo as fórmulas gerais a seguir, respectivamente ou sais dos mesmos:

[0031] em que todas as porções são conforme definido acima.

[0032] Os compostos da presente divulgação podem ser incorporados em oligonucleotídeos ou aptâmeros usando métodos sintéticos ou enzimáticos padrões de preparo de tais compostos.

[0033] Também proporcionados na presente divulgação são métodos para produção dos compostos da presente divulgação e os compostos produzidos por meio dos referidos métodos.

[0034] Em uma modalidade, é proporcionado um método para preparo de uma aminocarbonilpirimidina C-5 modificada, o referido método compreendendo: reação de uma pirimidina modificada na posição 5 com uma trifluoroetoxicarbonila com uma amina na presença de uma base; e isolamento da referida aminocarbonilpirimidina C-5 modificada.

[0035] Em outra modalidade, é proporcionado um método para preparo de a 3'-fosforamidita de uma aminocarbonilpirimidina C-5 modificada, o referido método compreendendo: reação da referida amino- carbonilpirimidina C-5 modificada com cianoetildi-isopropil- clorofosforamidita na presença de uma base; e isolamento da referida 3'-fosforamidita.

[0036] Em ainda outra modalidade, é proporcionado um método para preparo de um 5'-trifosfato de uma aminocarbonilpirimidina C-5 modificada, o referido método compreendendo:a) reação de uma aminocarbonilpirimidina C-5 modificada tendo a fórmula:

[0037] em que R e X são conforme definidos acima, com anidrido acético na presença de uma base, seguido por clivagem do grupo 5'- DMT com um ácido para formar um 3'-acetato da estrutura a seguir:

b) realização de uma reação de Ludwig-Eckstein, seguido por cromatografia de troca de ânions sobre o 3'-acetato da etapa a); e c) isolamento de um 5'-trifosfato de uma aminocarbonilpiri- midina C-5 modificada tendo a estrutura a seguir ou um sal da mesma:

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0038] Referência será feita agora em detalhes à modalidades re-presentativas da invenção. Embora a invenção seja descrita em conjunto com as modalidades enumeradas, deve ser entendido que a invenção não se destina a estar limitada a estas modalidades. Pelo contrário, a invenção se destina a abranger todas as alternativas, modificações e equivalentes que possam ser incluídos dentro do escopo da presente invenção, conforme definido pelas reivindicações.

[0039] Aqueles versados no campo reconhecerão muitos métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui, os quais poderiam ser usados em e estão dentro do escopo da prática da presente divulgação. A presente divulgação não está, de forma alguma, limitada aos métodos e materiais descritos.

[0040] A menos que de outro modo definido, termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles versados no campo ao qual a presente invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos.

[0041] Todas as publicações, documentos de patente publicados e pedidos de patente citados na presente divulgação são indicativos do nível de capacidade na técnica à qual a divulgação pertence. Todas as publicações, documentos de patente publicados e pedidos de patente citados aqui são aqui incorporados por referência até o mesmo ponto como se cada publicação, documento de patente publicado ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.

[0042] Conforme usado na presente divulgação, incluindo nas rei-vindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências no plural, a menos que o contexto oriente cla-ramente de outro modo e são usados permutavelmente com "pelo menos um(a)" e "um(a) ou mais". Assim, referência a "um aptâmero"inclui misturas de aptâmeros e similares.

[0043] Conforme usado aqui, o termo "cerca de" representa uma modificação ou variação insignificante do valor numérico, de modo que a função básica do item ao qual o valor numérico se refere não seja alterada.

[0044] O termo "cada", quando usado aqui para referir-se a uma pluralidade de itens, se destina a referir-se a pelo menos dois dos itens. Não é necessário que todos os itens que formam a pluralidade satisfaça uma limitação adicional associada.

[0045] Conforme usado aqui, os termos "compreende", "compre-endendo","inclui", "incluindo", "contém", "contendo" e quaisquer variações dos mesmos se destinam a abranger uma inclusão não exclusiva, de modo que um processo, método, produto-por-processo ou composição de matéria compreende, inclui ou contém um elemento ou lista de elementos inclui não apenas estes elementos, mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal proces-so,método, produto-por-processo ou composição de matéria.

[0046] Conforme usado aqui, o termo "nucleotídeo"se refere a um ribonucleotídeo ou um desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada dos mesmos, bem como um análogo dos mesmos. Nucleotídeos incluem espécies que incluem purinas (por exemplo, adenina, hipoxan- tina, guanina e seus derivados e análogos), bem como pirimidinas (por exemplo, citosina, uracila, timina e seus derivados e análogos).

Compostos

[0047] Em uma modalidade, a presente divulgação proporciona compostos da fórmula a seguir:

[0048] em que:

[0049] R é selecionado do grupo que consiste em -(CH2)n-RX1;

[0050] RX1é selecionado do grupo que consiste em:

*Denota ponto de fixação do grupo RX1ao grupo de conexão (CH2)n

[0051] em que

[0052] RX4é selecionado do grupo que consiste em uma (C1-C20)alquila inferior linear ou ramificada; halogênio (F, Cl, Br, I); nitrila (CN); ácido borônico (BO2H2); ácido carboxílico (COOH); éster de ácido car- boxílico (COORX2); amida primária (CONH2); amida secundária (CO- NHRX2); amida terciária (CONRX2RX3); sulfonamida (SO2NH2); N-alquil- sulfonamida (SONHRX2);

[0053] em que

[0054] RX2, RX3são, independentemente, selecionados do grupoque consiste em uma (C1-C20) alquila inferior linear ou ramificada; fe- nila (C6H5); um anel de fenila RX4substituído (RX4C6H4), em que RX4é definido acima; um ácido carboxílico (COOH); um éster de ácido car- boxílico (COORX5), em que RX5é uma (C1-C20) alquila inferior linear ou ramificada; e cicloalquila, em que RX2= RX3= (CH2)n;

[0055] em que n = 0-10;

[0056] em que

[0057] X é selecionado do grupo incluindo, porém sem limitação, - H, -OH, -OMe, -O-alila, -F, -OEt, -OPr, -OCH2CH2OCH3 e -azido;

[0058] em que

[0059] R'é selecionado do grupo incluindo, porém sem limitação, -OAc; -OBz; e -OSiMe2tBu;

[0060] em que

[0061] R''é selecionado do grupo incluindo, porém sem limitação, H, DMT e trifosfato (-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2) ou um sal dos mesmos; e

[0062] em que

pode ser substituído por análogos de açúcar carbocíclico, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedo-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos, tal como metil ribosídeo.

[0063] Em outra modalidade, a presente divulgação proporciona compostos da fórmula a seguir ou sais dos mesmos:

[0064] em que R, R'' e X são conforme definido acima. Compostos desta fórmula geral são úteis para incorporação do nucleosídeo modi- ficado em um oligonucleotídeo por meio de síntese química.

[0065] Em ainda outras modalidades, a presente divulgação proporciona compostos da fórmula ou sais dos mesmos:

[0066] em que R, R' e X são conforme definido acima. Compostos desta fórmula geral são úteis para incorporação do nucleosídeo modificado em um oligonucleotídeo por meio de síntese enzimática.

[0067] Conforme usado aqui, o termo "carboxiamidauridina C-5 modificada" ou "aminocarboniluridina C-5 modificada" se refere a uma uridina com uma modificação carboxicamida (-C(O)NH-) na posição C5 da uridina incluindo, porém sem limitações, aquelas porções (R) ilus-tradas acima. Exemplos de carboxicamidauridinas C-5 modificadas incluem aquelas descritas nas Patentes U.S. N°s 5.719.273 e 5.945.527, bem como, Pedido Provisório U.S. N° de Série 61/422.957 (o pedido '957), depositado em 14 de Dezembro 2010, intitulado "Nuclease Resistant Oligonucleotides". Pirimidinas C-5 modificadas representativas incluem: 5-(N-benzilcarboxicamida)-2'-deoxiuridina (BndU), 5-(N-benzilcarboxicamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N- benzilcarboxicamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-isobutilcarboxicamida)-2'- deoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxicamida)-2'-O-metiluridina, 5- (N-isobutilcarboxicamida)-2'-fluorouridina, 5-(N- triptaminocarboxicamida)-2'-deoxiuridina (TrpdU), 5-(N- triptaminocarboxicamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N- triptaminocarboxicamida)-2'-fluorouridina, cloreto de 5-(N-[1-(3- trimetilamônio) de propil]carboxicamida)-2'-deoxiuridina, 5-(N- naftilmetilcarboxicamida)-2'-deoxiuridina (NapdU), 5-(N- naftilmetilcarboxicamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N- naftilmetilcarboxicamida)-2'-fluorouridina ou 5-(N-[1-(2,3-di- hidroxipropil)]carboxicamida)-2'-deoxiuridina).

[0068] Exemplos específicos de aminocarboniluridinas C-5 modificadas, descritos aqui para fins de ilustração apenas, incluem os compostos a seguir, bem como os 5'-trifosfatos e 3'-fosforamiditas e sais dos mesmos dos referidos compostos, as sínteses dos quais são descritas nos Exemplos 1-5.

[0069] 5-(4-Fluorobenzilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina,

[0070] 5-((R)-2-Furfurilmetilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina,

[0071] 5-((S)-2-Furfurilmetilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina,

[0072] 5-(2-(4-Morfolino)etilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina; e

[0073] 5-(2-(1-(3-Acetil-benzimidazolonil))etilaminocarbonil)-2'- deoxiuridina.

[0074] Modificações químicas das uridinas C-5 modificadas descritas aqui podem também ser combinadas com, unicamente ou em qualquer combinação, modificações de açúcar na posição 2', modificações em aminas exocíclicas e substituição de 4-tiouridina e similares.

Sais

[0075] Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar e/ou manipular um sal correspondente do composto, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são discutidos em Berge et al."Pharmaceutically Acceptable Salts"(1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19.

[0076] Por exemplo, se o composto é aniônico ou tem um grupo funcional o qual pode ser aniônico (por exemplo, -COOH pode ser - COO-), então, um sal pode ser formado com um cátion adequado. Exemplos de cátions inorgânicos adequados incluem, porém sem limitações, íons de metal alcalino, tais como Na+e K+, cátions alcalinos terrosos, tais como Ca2+e Mg2+e outros cátions, tal como Al+3. Exemplos de cátions orgânicos adequados incluem, porém sem limi-tações, íon de amônio (isto é, NH4+) e íons de amônio substituído (por x+ x + x + x +exemplo, NH3R , NH2R 2 , NHR 3 , NR 4 ). Exemplos de alguns íons de amônio substituídos adequados são aqueles derivados de: etila- mina, dietilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodi- amina, etanolamina, dietanolamina, piperizina, benzilamina, fenilben- zilamina, colina, meglumina e trometamina, bem como aminoácidos, tais como lisina e arginina. Um exemplo de um íon de amônio quaternário comum é N(CH3)4+.

[0077] Se o composto é catiônico ou tem um grupo funcional o qual pode ser catiônico (por exemplo, -NH2 pode ser -NH3+), então, um sal pode ser formado com um ânion adequado. Exemplos de ânions inorgânicos adequados incluem, porém sem limitações, aqueles derivados dos seguintes ácidos inorgânicos: clorídrico, bromídrico, iodídri- co, sulfúrico, sulfuroso, nítrico, nitroso, fosfórico e fosforoso.

[0078] Exemplos de ânions orgânicos adequados incluem, porém sem limitações, aqueles derivados dos seguintes ácidos orgânicos: 2- acetoxic-benzoico, acético, ascórbico, aspártico, benzoico, cânfor- sulfônico, cinâmico, cítrico, edético, etanodi-sulfônico, etano-sulfônico, fumárico, gluco-heptônico, glucônico, glutâmico, glicólico, hidróxi- maleico, hidroxic-naftaleno carboxílico, isetiônico, láctico, lactobiônico, láurico, maleico, málico, metano-sulfônico, múcico, oleico, oxálico, palmítico, pamoico, pantotênico, fenilacético, fenil-sulfônico, propiôni- co, pirúvico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, tartárico, tolue- no-sulfônico e valérico. Exemplos de ânions orgânicos poliméricos adequados incluem, porém sem limitações, aqueles derivados dos se-guintesácidos poliméricos: ácido tânico, carboxicmetil celulose.

[0079] A menos que de outro modo especificado, uma referência a um composto em particular também inclui formas de sal do mesmo. Preparo de Oligonucleotídeos

[0080] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona métodos para uso dos nucleosídeos modificados descritos aqui, quer isoladamente ou em combinação com outros nucleosídeos modificados e/ou nucleosídeos que ocorrem naturalmente, para preparar oligonu- cleotídeos modificados. A síntese automatizada de oligodeoxinucleo- sídeos é prática de rotina em muitos laboratórios (vide, por exemplo, Matteucci, M. D. e Caruthers, M. H., (1990) J. Am. Chem. Soc., 103: 3185-3191, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência).Síntese de oligoribonucleosídeos é também bem conhecida (vide, por exemplo, Scaringe, S. A., et al., Nucleic Acids Res. 18: 5433-5441 (1990), aqui incorporado por referência). Conforme mencionado acima, as fosforamiditas são úteis para incorporação do nucleosídeo modificado em um oligonucleotídeo por meio de síntese química e os trifos- fatos são úteis para incorporação do nucleosídeo modificado em um oligonucleotídeo por meio de síntese enzimática (vide, por exemplo, Vaught, J. V. et al. (2010) J. Am. Chem. Soc., 132, 4141-4151; Gait, M. J. "Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach" (1984) IRL Press (Oxford, Reino Unido); Herdewijn, P. "Oligonucleotide Synthesis" (2005) (Humana Press, Totowa, NJ (cada um dos quais é incorporado aqui por referência na íntegra).

[0081] Conforme usado aqui, os termos "modificar", "modificada", "modificação"e quaisquer variações dos mesmos, quando usados em referência a um oligonucleotídeo, significam que pelo menos uma das quatro bases de nucleotídeo constituintes (isto é, A, G, T/U e C) do oligonucleotídeo é um análogo ou éster de um nucleotídeo que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, o nucleotídeo modificado se refere à resistência à nuclease do oligonucleotídeo. Modificações adi-cionais podem incluir modificações da cadeia principal, metilações, combinações de emparelhamento de base incomuns, tais como as isobases isocitidina e isoguanidina e similares. Modificações podem também incluir modificações 3' e 5', tal como "capping". Outras modifi-cações podem incluir substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente por um análogo, modificações internucleotídeo tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e aquelas com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acri- dina, psoraleno, etc.), aquelas contendo queladores (por exemplo, me-tais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendo alquiladores e aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). Ainda, qualquer um dos grupos hidroxila comumente presentes sobre o açúcar de um nucleotídeo pode ser substituído por um grupo fosfonato ou um grupo fosfato; protegido por grupos de proteção padrões; ou ativado para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais ou a um suporte sólido. Os grupos OH 5‘ e 3‘ terminais podem ser fosforilados ou substituídos por aminas, porções de grupo de "capping" orgânicas de cerca de 1 a cerca de 20 átomos de carbono, polímeros de polietileno glicol (PEG) oscilando, em uma modalidade, de cerca de 10 a cerca de 80 kDa, polímeros de PEG oscilando, em outra modalidade, de cerca de 20 a cerca de 60 kDa ou outros polímeros biológicos ou sintéticos hidrofílicos ou hidrofóbicos.

[0082] Polinucleotídeos podem também conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidas na técnica, incluindo 2'-O-metila, 2'-O-alila, 2'-O-etila, 2'-O-propila, 2'-O- CH2CH2OCH3, 2'-fluoro- ou 2'-azido, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xi- loses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos, tal como metil ribosídeo. Conforme mencionado acima, uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação al-ternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem modalidades em que fosfato é substituído por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NRx2 ("amidato"), P(O) Rx, P(O)ORx', CO ou CH2 ("formacetal"), nos quais cada Rxou Rx'são, independentemente, H ou (C1-C20) alquila não substituída ou substituída opcionalmente contendo uma ligação de éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. Substituição de formas análogas de açúcares, purinas e pirimidinas pode ser vantajosa no design de um produto final, assim como estruturas de cadeia principal alternativas, tal como uma cadeia principal de poliami- da, por exemplo.

[0083] Se presente, uma modificação na estrutura do nucleotídeo pode ser conferida antes ou após montagem de um polímero. Uma sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser ainda modificado após polimerização, tal como por meio de conjugação com um componente de rotulação.

[0084] Conforme usado aqui, "ácido nucleico", "oligonucleotídeo"e "polinucleotídeo" são usados permutavelmente para referir-se a um polímero de nucleotídeos e incluem DNA, RNA, híbridos de DNA/RNA e modificações destes tipos de ácidos nucleicos, oligonucleotídeos e polinucleotídeos, em que a fixação das várias entidades ou porções às unidades de nucleotídeo em qualquer posição está incluída. Os termos "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo"e "ácido nucleico" incluem moléculas fita dupla ou simples, bem como moléculas helicoidais triplas. Ácido nucleico, oligonucleotídeo e polinucleotídeo são termos mais amplos do que o termo aptâmero e, assim, os termos ácido nucleico, oligonucleotídeo e polinucleotídeo incluem polímeros de nucleotídeos que são aptâmeros, mas os termos ácido nucleico, oligonucleotídeo e polinucleotídeo não estão limitados a aptâmeros.

[0085] Conforme usado aqui, o termo "pelo menos um nucleotí- deo", quando de referência a modificações de um ácido nucleico, se refere a um, vários ou todos os nucleotídeos no ácido nucleico, indicando que qualquer ou todas as ocorrências de qualquer um ou todos de A, C, T, G ou U em um ácido nucleico podem ser modificadas ou não.

[0086] Em outros aspectos, os métodos da presente divulgação usam os nucleosídeos modificados descritos aqui, quer isoladamente ou em combinação com outros nucleosídeos modificados e/ou nucleo- sídeos que ocorrem naturalmente, para preparar aptâmeros e SOMA- mers (descritos abaixo). Em modalidades específicas, os aptâmeros e SOMAmers são preparados usando o processo geral SELEX ou SE- LEX aprimorado, conforme descrito abaixo.

[0087] Conforme usado aqui, "ligante de ácido nucleico", "aptâme- ro", "SOMAmer" e "clone"são usados permutavelmente para referir-se a um ácido nucleico que não ocorre naturalmente que tem uma ação desejável sobre uma molécula alvo. Uma ação desejável inclui, porém sem limitações, ligação do alvo, alteração catalítica do alvo, reação com o alvo de uma forma que modifica ou altera o alvo ou a atividade funcional do alvo, fixação covalente ao alvo (conforme em um inibidor suicida) e facilitação da reação entre o alvo e outra molécula. Em uma modalidade, a ação é afinidade de ligação específica através de um mecanismo o qual é independente de emparelhamento de base de Watson/Crick ou formação de hélice tripla, em que o aptâmero não é um ácido nucleico tendo a função fisiológica conhecida de estar ligado pela molécula alvo. Aptâmeros a um determinado alvo incluem ácidos nucleicos que são identificados a partir de uma mistura candidata de ácidos nucleicos, onde o aptâmero é um ligante do alvo, por meio de um método compreendendo: (a) contato da mistura candidata com o alvo, em que ácidos nucleicos tendo uma afinidade aumentada pelo alvo com relação a outros ácidos nucleicos na mistura candidata podem ser separados do restante da mistura candidata; (b) separação dos ácidos nucleicos com afinidade aumentada do restante da mistura candidata; e (c) amplificação dos ácidos nucleicos com afinidade aumentada para proporcionar uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em ligantes, pelo que aptâmeros da molécula alvo são identificados.É reconhecido que interações de afinidade são uma questão de grau; contudo, no presente contexto, a "afinidade de ligação específica" de um aptâmero por seu alvo significa que o aptâmero se liga a seu alvo geralmente com um grau muito maior de afinidade do que ele se liga a outros componentes não alvo em uma mistura ou amostra. Um "aptâmero", "SOMAmer" ou "ligante de ácido nucleico"é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula de ácido nu- cleico que tem uma sequência de nucleotídeo em particular. Um ap- tâmero pode incluir qualquer número adequado de nucleotídeos. "Ap- tâmeros"se refere a mais de um de tais conjuntos de moléculas. Diferentesaptâmeros podem ter os mesmos ou diferentes números de nucleotídeos. Aptâmeros podem ser DNA ou RNA e podem ser fita simples, fita dupla ou conter regiões com fita dupla e fita tripla.

[0088] Conforme usado aqui, um "SOMAmer" ou Aptâmero Modificado com Taxa de Dissociação Lenta se refere a um aptâmero tendo características de taxa de dissociação aprimoradas. SOMAmers podem ser gerados usando os métodos SELEX aprimorados descritos na Publicação U.S. N° 20090004667, intitulada "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates.".

[0089] Conforme usado aqui, "proteína" é usado como sinônimo para "peptídeo", "polipeptídeo"ou "fragmento peptídico". Um polipeptí- deo, proteína, peptídeo ou fragmento peptídico "purificado"é substancialmente isento de material celular ou outras proteínas contaminantes da célula, tecido ou fonte sem célula da qual a sequência de aminoá- cido é obtida ou substancialmente isento de precursores químicos ou outras substâncias químicas quando quimicamente sintetizado.

O Método SELEX

[0090] Os termos "SELEX" e "processo SELEX" são usados per- mutavelmente aqui para referir-se a uma combinação de (1) a seleção de ácidos nucleicos que interagem com uma molécula alvo de uma maneira desejável, por exemplo, ligação com alta afinidade a uma proteína, com (2) a amplificação daqueles ácidos nucleicos selecionados. O processo SELEX pode ser usado para identificar aptâmeros com alta afinidade por uma molécula alvo ou biomarcador específico.

[0091] O SELEX inclui, em geral, preparo de uma mistura candidata de ácidos nucleicos, ligação da mistura candidata à molécula alvo desejada para formar um complexo de afinidade, separação dos complexos de afinidade dos ácidos nucleicos candidatos não ligados, separação e isolamento do ácido nucleico do complexo de afinidade, purificação do ácido nucleico e identificação de uma sequência de aptâ- mero específica. O processo pode incluir múltiplos ciclos para refinar adicionalmente a afinidade do aptâmero selecionado. O processo pode incluir etapas de amplificação em um ou mais pontos no processo. Vide, por exemplo, Patente U.S. N° 5.475.096, intitulada "Nucleic Acid Ligands". O processo SELEX pode ser usado para gerar um aptâmero que se liga covalentemente a seu alvo, bem como um aptâmero que se liga não covalentemente a seu alvo. Vide, por exemplo, Patente U.S. N° 5.705.337 intitulada "Sistematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX".

[0092] O processo SELEX pode ser usado para identificar aptâme- ros de alta afinidade contendo nucleotídeos modificados que conferem características aprimoradas ao aptâmero tais como, por exemplo, es-tabilidade aprimorada in vivo ou características de distribuição aprimo- radas. Exemplos de tais modificações incluem substituições químicas nas posições de ribose e/ou fosfato e/ou base. Aptâmeros identificados pelo processo SELEX contendo nucleotídeos modificados são descritos na Patente U.S. N° 5.660.985, intitulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", a qual descreve oligo- nucleotídeos contendo derivados de nucleotídeo quimicamente modifi-cados nas posições 5' e 2' de pirimidinas. A Patente U.S. N° 5.580.737, vide supra, descreve aptâmeros altamente específicos contendo um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-amino (2'-NH2), 2'- fluoro (2'-F) e/ou 2'-O-metila (2'-OMe). Vide também Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 20090098549, intitulada "SELEX and PHOTOSELEX", a qual descreve bibliotecas de ácido nucleico tendo propriedades físicas e químicas expandidas e seu uso em SELEX e PhotoSELEX.

[0093] SELEX pode também ser usado para identificar aptâmeros que têm características de taxa de dissociação desejáveis. Vide Publicação de Patente U.S. N° 20090004667, intitulada "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates", a qual é incorporada aqui por referência na íntegra, descreve métodos SELEX aprimorados para a geração de aptâmeros que podem se ligar à moléculas alvo. Métodos para produção de aptâmeros e fotoaptâmeros tendo menores taxas de dissociação com suas respectivas moléculas alvo são descritos. Os métodos envolvem contato da mistura candidata com a molécula alvo, permitir que a formação de complexos de ácido nucleico- alvo ocorra e realização de um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta em que os complexos de ácido nucleico-alvo com taxas de dissociação rápida dissociação e não se formam novamente, enquanto que complexos com taxas de dissociação lentas permanecem intactos. Adicionalmente, os métodos incluem o uso de nucleotí- deos modificados na produção de misturas de ácido nucleico candida- tas para gerar aptâmeros com desempenho de taxa de dissociação aprimorada (vide Publicação de Patente U.S. N° 20090098549, intitulada "SELEX and PhotoSELEX"). (Vide também Patente U.S. N° 7.855.054 e Publicação de Patente U.S. N° 20070166740). Cada um destes pedidos é incorporado aqui por referência na íntegra.

[0094] "Alvo" ou "molécula alvo" se refere aqui a qualquer composto sobre o qual um ácido nucleico pode atuar de uma maneira desejável. Uma molécula alvo pode ser uma proteína, peptídeo, ácido nuclei- co, carboidrato, lipídio, polissacarídeo, glicoproteína, hormônio, receptor, antígeno, anticorpo, vírus, patógeno, substância tóxica, substrato, metabólito, análogo de estado de transição, cofator, inibidor, fármaco, matriz, nutriente, fator de crescimento, célula, tecido, qualquer porção ou fragmento de qualquer um dos precedentes, etc., sem limitação. Virtualmente qualquer efetuador químico ou biológico pode ser um alvo adequado. Moléculas de qualquer tamanho podem servir como alvos. Um alvo pode também ser modificado de determinadas formas para intensificar a probabilidade ou intensidade de uma interação entre o alvo e o ácido nucleico. Um alvo pode também incluir qualquer variação mínima de um composto ou molécula em particular tal como, no caso de uma proteína, por exemplo, variações mínimas na sequência de aminoácido, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipida- ção, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de rotulação, a qual não altera substancialmente a identidade da molécula. Uma "molécula alvo" ou "alvo" é uma série de cópias de um tipo ou espécie de molécula ou estrutura multimolecular que é capaz de ligação a um aptâme- ro. "Moléculas alvo" ou "alvos" se refere a mais de um de tais conjuntos de moléculas. Modalidades do processo SELEX nas quais o alvo é um peptídeo são descritas na Patente U.S. N° 6.376.190, intitulada "Modified SELEX Processes Without Purified Protein".

Síntese Química

[0095] Métodos para a síntese química de compostos fornecidos na presente divulgação são descritos aqui. Estes e/ou outros métodos bem conhecidos podem ser modificados e/ou adaptados de várias formas de modo a facilitar a síntese de compostos adicionais fornecidos na presente divulgação.

[0096] Com referência ao Esquema 1, em uma abordagem, as aminocarbonilpirimidinas modificadas na posição C-5 da presente di-vulgação são preparadas por meio de reação de uma pirimidina modi-ficada na posição 5 com uma trifluoroetoxicarbonila com uma amina na presença de uma base; e isolamento da referida aminocarbonilpirimi- dina C-5 modificada.

[0097] Em algumas modalidades, a trifluoroetoxicarbonilpirimidina é selecionada do grupo de compostos incluindo, porém sem limitação, compostos tendo a estrutura a seguir:

[0098] em que

[0099] X é selecionado do grupo incluindo, porém sem limitação,

[00100] em que

pode ser substituído por análogos de açúcar carbocíclico, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedo-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos, tal como metil ribosídeo. Em algumas modalidades, a amina é selecionada do grupo incluindo, porém sem limitação, compostos da fórmula RNH2, em que

[00101] R é selecionado do grupo que consiste em -(CH2)n-RX1;

[00102] RX1é selecionado do grupo que consiste em:

*denota ponto de fixação do grupo RX1ao grupo de conexão (CH2)n

[00103] em que

[00104] RX4é selecionado do grupo que consiste em uma (C1-C20) alquila inferior linear ou ramificada; halogênio (F, Cl, Br, I); nitrila (CN); ácido borônico (BO2H2); ácido carboxílico (COOH); éster de ácido car- boxílico (COORX2); amida primária (CONH2); amida secundária (CO- NHRX2); amida terciária (CONRX2RX3); sulfonamida (SO2NH2); N-alquil- sulfonamida (SONHRX2);

[00105] em que

[00106] RX2, RX3são, independentemente, selecionados do grupo que consiste em uma (C1-C20) alquila inferior linear ou ramificada; fe- nila (C6H5); um anel de fenila RX4substituído (RX4C6H4), em que RX4é definido acima; um ácido carboxílico (COOH); um éster de ácido car- boxílico (COORX5), em que RX5é uma (C1-C20) alquila inferior linear ou ramificada; e cicloalquila, em que RX2= RX3= (CH2)n;

[00107] em que n = 0-10.

[00108] Em modalidades específicas, a amina é selecionada do grupo que consiste em:

[00109] Em algumas modalidades, a base é uma amina terciária selecionada do grupo que consiste em trietilamina, di-isopropilamina e similares.

[00110] Com referência ao Esquema 1, a presente divulgação também proporciona um método para a síntese da 3'-fosforamidita de uma aminocarbonilpirimidina C-5 modificada compreendendo: reação da referida aminocarbonilpirimidina C-5 modificada com cianoetildi- isopropil-clorofosforamidita na presença de uma base; e isolamento da referida 3'-fosforamidita. Em algumas modalidades, a aminocarbonilpi- rimidina C-5 modificada tem a estrutura a seguir:

[00111] em que R e X são conforme definidos acima. Em algumas modalidades, a base é uma amina terciária selecionada do grupo que consiste em que consiste em trietilamina, di-isopropilamina e similares.

[00112] Novamente com referência ao Esquema 1, a presente divulgação também proporciona um método para a síntese de um 5'- trifosfato de uma aminocarbonilpirimidina C-5 modificada compreendendo:a) reação de uma aminocarbonilpirimidina C-5 modificada tendo a fórmula:

[00113] em que R e X são conforme definido acima, com anidrido acético na presença de uma base, seguido por clivagem do grupo 5'- DMT com um ácido para formar um 3'-acetato da estrutura a seguir:

b) realização de uma reação de Ludwig-Eckstein, seguidopor cromatografia de troca de ânions sobre o 3'-acetato da etapa a); ec) isolamento de um 5'-trifosfato de uma aminocarbonilpiri-midina C-5 modificada tendo a estrutura a seguir ou um sal da mesma:

[00114] A base usada é selecionada do grupo incluindo, porém sem limitação, uma amina terciária. Em algumas modalidades, a base é piridina. O ácido usado na etapa a é selecionado do grupo incluindo, porém sem limitação, ácido dicloroacético, ácido tricloroacético e 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.

[00115] Em uma abordagem alternativa, a trifluoroetoxicarbonilpiri- midina tem a estrutura a seguir:

[00116] Com referência ao Esquema 2, este composto é formado por meio da reação do composto (7) do Esquema 2 com monóxido de carbono e trifluoroetanol na presença de um catalisador de paládio e uma base. A base é selecionada do grupo incluindo, porém sem limitação, uma amina terciária selecionada de trietilamina e similares.

[00117] A presente divulgação inclui compostos preparados por meio de cada um dos métodos descritos acima.

EXEMPLOS

[00118] Os exemplos a seguir são fornecidos para fins de ilustração apenas e não se destinam a limitar o escopo da invenção conforme definido pelas reivindicações em anexo. Todos os exemplos descritos aqui foram realizados usando técnicas padrões, as quais são bem co-nhecidas e rotina para aqueles versados no campo. Técnicas de biologia molecular de rotina descritas nos exemplos a seguir podem ser re-alizadas conforme descrito em manuais de laboratório padrões, tal como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3aed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I., (2001).

[00119] Os procedimentos gerais a seguir foram empregados para produzir os nucleosídeos modificados descritos nos Exemplos 1-3 e 5. A nomenclatura usada aqui é baseada no sistema descrito por Matsudaet al. Nucleic Acids Research 1997, 25: 2784-2791.Esquema 1

Exemplo 1. Síntese de 5'-O-DMT-dU-5-Carboxamidas (3a-e)

[00120] 5'-O -Dimetoxitritil-5-(4-fluorobenzilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina (3a). O material de iniciação, 5'-O-dimetoxitritil-5- trifluoroetoxicarbonil-2'-deoxiuridina (1) foi preparado por meio do pro-cedimento de Matsuda et al (Nomura, I.; Ueno, I.; Matsuda, A. Nucleic Acids Research 1997, 25: 2784-2791; Ito, T., Ueno, I.; Matsuda, A. Nucleic Acids Research 2003, 31: 2514-2523). Uma solução de (1) (9,85 g, 15 mmol), 4-fluorobenzilamina (2a) (2,25 g, 18 mmol,1,3 eq), trietilamina (4,2 mL, 30 mmol) e acetonitrila anidro (30 mL) foi aquecida sob uma atmosfera inerte a 60-70°C durante 2-24 horas. Conversão quantitativa de (1) à amida (3a) foi confirmada por meio de cromato- grafia em camada fina (sílica-gel 60, metanol a 5%/diclorometano) ou HPLC. A mistura de reação foi concentrada in vacuo e o resíduo purifi-cado por meio de cromatografia rápida em sílica-gel (Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43: 2923) usando um eluente de me-tanol a 0-3% em 1% de trietilamina/99% de acetato de etila. Frações contendo produto puro foram combinadas e evaporadas. Traços de solventes residuais foram removidos por meio de co-evaporação com acetonitrila anidro, seguido por secagem sob alto vácuo, para propor-cionar (3a) como um sólido branco (6,57 g, rendimento de 64%). 1H- RMN (300 MHz, CD3CN) δ 2,20-2,40 (2H, m), 3,28 (2H, d, J = 4,3 Hz), 3,76 (6H, s), 4,01 (1 H, dd, J = 3,8, 4,2 Hz), 4,26-4,30 (1 H, m), 4,48 (2H, bd, J = 6,1 Hz), 6,11 (1H, t, J = 6,5 Hz), 6,85-7,46 (13H, m), 7,037,36 (4 H, m), 8,58 (1 H, s), 9,01 (1H, t, J = 6,1 Hz). MS (m/z) calc. para C38H36FN3O8, 681,25; encontrado 680,4 [M-H]-.

[00121] 5'-O -Dimetoxitritil-5-(( R )-2-furfurilmetilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina (3b). O composto (3b) foi preparado conforme descrito para (3a) usando (R)-2-furfurilmetilamina (2b) e isolado como um sólido branco (9,3 g, rendimento de 94%). O eluente para cromatografia foi 1% de trietilamina/4% de metanol/95% de acetato de etila. 1H-RMN (CD3CN) δ 1,51-1,57 (1H, m), 1,84-1,94 (3H, m), 2,18-2,38 (2H, m), 3,25-3,52 (4H, m sobreposto), 3,66-3,93 (3H, m sobreposto), 3,78 (6H, s), 3,97-4,02 (1H, m), 4,24-4,29 (1H, m), 6,12 (1 H, t, J = 6,5), 6,867,47 (13H, m), 8,54 (1H, s), 8,83 (1H, bs). MS (m/z) calc. para C36H39N3O9, 657,27; encontrado 656,5 [M-H]-.

[00122] 5'-O -Dimetoxitritil-5-(( S )-2-furfurilmetilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina (3c). O composto (3c) foi preparado conforme descrito para (3b) usando (S)-2-furfurilmetilamina (2c) e isolado como um sólidobranco (9,9 g, rendimento de 99%). 1H-RMN (CD3CN) δ 1,50-1,59 (1H, m), 1,84-1,95 (3H, m), 2,18-2,40 (2H, m), 3,24-3,50 (4H, m sobreposto), 3,69-3,97 (3H, m sobreposto), 3,78 (6H, s), 3,98-4,02 (1H, m), 4,25-4,30 (1H, m), 6,14 (1 H, t, J = 6,5), 6,87-7,47 (13H, m), 8,54 (1H, s), 8,84 (1H, bs). MS (m/z) calc. para C36H39N3O9, 657,27; encontrado 656,5 [M-H]-.

[00123] 5'-O -Dimetoxitritil-5-(2-(4-morfolino)etilaminocarbonil)-2'-deoxiuridinaJ3d). O composto (3d) foi preparado conforme descrito para (3a), usando 2-(4-morfolino)-etilamina (2d) e isolado como um sólido branco (8,2 g, rendimento de 80%). O eluente para cromatogra- fia foi metanol a 5%/2% trietilamina/93% diclorometano. 1H-RMN (CD3CN) δ 2,21-2,39 (2H, m), 2,39-2,41 (4H, m), 2,48 (2H, t, J = 6,2 Hz), 3,27-3,29 (2H, m), 3,41 (2H, dt, J = 5,8, 6,2 Hz), 3,61-3,64 (4H, m), 3,78 (6H, s), 3,98-4,02 (1H, m), 4,25-4,30 (1H, m), 6,10 (1H, t, J = 6,4), 6,86-7,47 (13H, m), 8,55 (1H, s), 8,79 (1H, bt, J ~ 6 Hz). MS (m/z) calc. para C37H42N4O9, 686,30; encontrado 685,7 [M-H]-.

[00124] 5'-O -Dimetoxitritil-5-(2-(N-benzimidazolonil)etilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina (3e). O composto (3e) foi preparado conforme descrito para (3a) usando N- benzimidazolonil-2-etilamina (2e) (CAS RN64928-88-7). O eluente para cromatografia foi 2% de metanol/1% de trietilamina/97% de dicloro- metano. O produto puro foi isolado como um sólido castanho (8,2 g, rendimento de 74,5%). 1H-RMN (CD3CN) δ 2,20-2,36 (2H, m), 3,273,29 (2H, m), 3,60 (2H, q, J = 6,5 Hz), 3,758 (3H, s), 3,762 (3H, s), 3,97 (2H, t, J = 6,5 Hz),3,98-4,02 (1H, m), 4,27-4,30 (1H, m), 6,09 (1H, t, J = 6,5 Hz), 6,86-7,48 (13H, m), 6,91-7,10 (4H, m), 8,52 (1H, s), 8,76 (1H, t, J = 6,1 Hz). MS (m/z) calc. para C40H39N5O9, 733,27; encontra- do 732,0 [M-H]-.

Exemplo 2. Síntese de 5'-O -DMT-Nucleosídeo CE-Fosforamiditas (4a- 4e)

[00125] 5'-O -Dimetoxitritil-5-(4-fluorobenzilaminocarbonil)-3'-O -[(2-cianoetil)(N,N-di-isopropilamino)fosfinil]-2'-deoxiuridina (4a). Uma solu-ção de nucleosídeo DMT-protegido (3a) (4,00 g, 5,9 mmol) em diclo- rometano anidro (40 mL) foi esfriada para aproximadamente -10°C sob uma atmosfera de argônio seco. Di-isopropiletilamina (3,1 mL, 17,6 mmoles, 3 eq) foi adicionada, seguido pela adição gota a gota de 2- cianoetildi-isopropilclorofosforamidita (1,7 mL, 7,7 mmoles, 1,3 eq). A solução foi agitada durante uma hora e reação completa foi confirmada por meio de cromatografia em camada fina (sílica-gel 60, acetato de etila/hexano). A mistura de reação foi dividida entre solução gelada de bicarbonato de sódio a 2% (200 mL) e acetato de etila (200 mL). A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia rápida em sílica-gel usando uma fase móvel de 1% de trietilamina/99% de acetato de etila. Frações contendo produto puro foram combinadas e evaporadas in vacuo(<30°C). Traços de solvente de cromatografia residual foram removidos por meio de co-evaporação com acetonitrila anidro e secagem em alto vácuo para proporcionar (4a) como uma espuma sólida branca (4,10 g, rendimento de 80%). 1H-RMN (CD3CN, dois isômeros) δ 1,02-1,16 (12H, m), 2,27-2,57 (2H, m), 2,51/2,62 (2H, 2t, J = 6,0/6,0 Hz), 3,25-3,37 (2H, m), 3,50-3,79 (4H, m sobreposto), 3,738 (3H, s), 3,742 (3H, s), 4,13/4,16 (1H, 2q, J = 3,5/3,7 Hz), 4,37-4,43 (1H, m), 4,44-4,47 (2H, m), 6,09/6,10 (1H, 2t, J = 6,4/7,1 Hz), 6,83-7,44 (13H, m), 7,01-7,30 (4H, m), 8,58/8,60 (1H, 2s), 8,98 (1H, b, J~5,5 Hz), 9,24 (1H, bs). 31P-RMN (CD3CN) δ 148,01 (s), 148,06 (s). 19F-RMN (CD3CN) δ -117,65 (m). MS (m/z) calc. para C47H53FN5O9P, 881,36; encontrado 880,3 [M-H]-.

[00126] 5'-O -Dimetoxitritil-5-(( R )-2-furfurilmetilaminocarbonil)-3‘-O -[(2-cianoetil)(N,N-di-isopropilamino)fosfinil]-2'-deoxiuridina (4b). Ocomposto (4b) foi preparado conforme descrito para (4a). Uma mistura a 1:1 de fosforamiditas diastereoméricas foi isolada como uma espuma sólida branca (3,15 g, rendimento de 62%). O eluente para cromato- grafia foi 1% de tritetilamina/20% de hexanos/79% de acetato de etila. 1H-RMN (CD3CN, dois isômeros) δ 1,14-1,27 (12H, m), 1,51-1,59 (1H, m), 1,86-1,94 (3H, m), 2,27-2,59 (2H, m), 2,54/2,65 (2H, 2t, J = 6,0/5,7 Hz), 3,27-3,38 (2H, m), 3,44-3,97 (9H, m sobreposto), 3,782 (3H, s), 3,786 (3H, s), 4,11-4,18 (1H, m), 4,39-4,48 (1H, m), 6,11/6,13 (1H, 2t, J = 5,6/6,1 Hz), 6,96-7,47 (13H, m), 8,58/8,60 (1H, 2s), 8,75 (1 H, bt, J~5,4 Hz), 9,36 (1H, bs). 31P-RMN (CD3CN) δ 148,09 (s), 148,13 (s). MS (m/z) calc. para C45H56N5O10P, 857,38; encontrado 856,6 [M-H]-.

[00127] 5'-O -Dimetoxitritil-5-(( S )-2-furfurilmetilaminocarbonil)-3'-O -[(2-cianoetil)(N,N-di-isopropilamino)fosfinil]-2'-deoxiuridina (4c). O composto (4c) foi preparado conforme descrito para (4b). Uma mistura a 1:1 de fosforamiditas diastereoméricas foi isolada como uma espuma sólida branca (3,74 g, rendimento de 74%). 1H-RMN (CD3CN, dois isômeros) δ 1,14-1,27 (12H, m), 1,51-1,59 (1H, m), 1,86-1,94 (3H, m), 2,28-2,51 (2H, m), 2,53/2,65 (2H, 2t, J = 6,0/6,0 Hz), 3,25-3,41 (2H, m), 3,44-4,14 (9H, m sobreposto), 3,783 (3H, s), 3,786 (3H, s), 4,12-4,19 (1H, m), 4,40-4,49 (1H, m), 6,11/6,13 (1H, 2t, J = 6,3/6,3 Hz), 6,86-7,48 (13H, m), 8,58/8,60 (1H, 2s), 8,75 (1 H, bt, J~5,4 Hz), 9,36 (1H, bs). 31P-RMN (CD3CN) δ 148,09 (s), 148,13 (s). MS (m/z) calc. para C45H56N5O10P, 857,38; encontrado 856,5 [M-H]-.

[00128] 5'-O -Dimetoxitritil-5-(2-(4-morfolino)etilaminocarbonil)-3'-O -[(2-cianoetil)(N,N-di-isopropilamino)fosfinil]-2'-deoxiuridina(4d). O composto (4d) foi preparado conforme descrito para (4a), exceto que a purificação usou um eluente de cromatografia de 1% de trietilami- na/5% de etanol anidro/94% de acetato de etila. A mistura a 1:1 de fosforamiditas diastereoisoméricas foi isolada como uma espuma sólida branca (3,9 g, rendimento de 75%). 1H-RMN (CD3CN, dois isôme- ros) δ 1,04-1,19 (12H, m), 2,28-2,59 (2H, m), 2,43-2,47 (6H, m sobreposto), 2,53/2,64 (2H, 2t, J = 6,2/6,2 Hz), 3,27-3,76 (8H, m sobreposto), 3,61-3,65 (4H, m), 3,781 (3H, s), 3,789 (3H, s), 4,12-4,19 (1H, m), 4,39-4,49 (1H, m), 6,11/6,13 (1H, 2t, J = 5,2//5,2), 6,86-7,48 (13H, m), 8,58/8,60 (1H, 2s), 8,78 (1H, bt, J~5,3 Hz), 9,78 (1H, bs). 31P-RMN (CD3CN) δ 148,08 (s), 148,11 (s). MS (m/z) calc. para C46H59N6O10P, 886,4; encontrado 885,7 [M-H]-.

[00129] 5'-O -Dimetoxitritil-5-(2-(N-benzimidazolonil)etilaminocarbonil)-3'-O -[(2-cianoetil)(N,N-di-isopropilamino)fosfinil]-2'-deoxiuridina(4e). O composto (4e) foi preparado conforme descrito para (4a), exceto que a purificação usou um eluente de cromatografia de 1% de trietilamina/10% de metanol ani- dro/89% de acetato de etila. A mistura a 1:1 de fosforamiditas diaste- reoméricas foi isolado como uma espuma sólida branca (1,6 g, rendimento de 31%). 1H-RMN (CD3CN, dois isômeros) δ 1,03-1,18 (12H, m), 2,27-2,57 (2H, m), 2,52/2,63 (2H, 2t, J = 6,0/6,0), 3,27-3,37 (2H, m), 3,49-3,80 (6H, m sobreposto), 3,732 (3H, s), 3,735/3,738 (3H, 2s), 4,00 (2H, bt, J~6,0 Hz), 4,12-4,18 (1H, m), 4,30-4,47 (1H, m), 6,08/6,10 (1H, 2t, J = 6,3/6,3 Hz), 6,85-7,48 (13H, m), 6,93-7,09 (4H, m), 8,57/8,60 (1H, 2s), 8,82/8,83 (1H, 2bt, J~4,3/4,3 Hz), 9,48 (1H, bs). 31P-RMN (CD3CN) δ 148,07 (s), 148,10 (s).

Exemplo 3. Síntese de 3'-O -Acetil-Nucleosídeos (5a-5e)

[00130] 5-(4-Fluorobenzilaminocarbonil)-3'-O-acetil-2'-deoxiuridina (5a).

[00131] O nucleosídeo (3a) (3,00 g, 4,4 mmoles) foi dissolvido em uma solução de piridina anidra (30 mL) e anidrido acético (3 mL). A solução foi agitada durante a noite e concentrada in vacuo para proporcionar o 3'-O-acetil-nucleosídeo. Solvente residual foi removido por meio de co-evaporação com tolueno anidro (10 mL). O resíduo foi dissolvido em diclorometano anidro (10 mL) e tratado com ácido tricloroa- cético a 3% em diclorometano (58 mL). A solução vermelha foi agitada durante a noite, tempo durante o qual o produto cristalizou. A pasta foi esfriada para -20°C, filtrada e lavada com dietil éter. O resíduo foi seco in vacuo para proporcionar (5a) como um sólido acinzentado (1,10 g, rendimento de 59%). 1H-RMN (CD3CN) δ 2,07 (3H, s), 2,33-2,38 (1H, m), 2,50-2,52 (1H, m), 3,63-3,64 (2H, m), 4,10 (1H, bdd, J = 3,1, 5,1 Hz), 4,46 (2H, d, J = 6,0 Hz), 5,19-5,26 (2 H, m sobreposto), 6,15 (1H, t, J = 7,0 Hz), 7,15 (2H, tt, J = 2,2, 9,0 Hz), 7,31-7,38 (2H, m), 8,79 (1H, s), 9,14 (1H, bt, J = 6,1 Hz), 11,95 (1H, bs). 19F-RMN (CD3CN) δ - 116,02 (tt, J = 5,5, 9,0 Hz)). MS (m/z) calc. para C19H20FN3O7, 421,13; encontrado 419,8 [M-H]-.

[00132] 5-(( R )-2-Furfurilmetilaminocarbonil)-3'-O-acetil-2'-deoxiuridina(5 b).

[00133] O composto (5b) foi preparado a partir de (4b), por meio do procedimento descrito para (5a) e isolado por meio de precipitação a partir de uma mistura de diclorometano e acetato de etila como um sólido branco (1,27 g, rendimento de 73%). 1H-RMN (CDCI3) δ 1,57-2,02 (4H, m), 2,12 (3H, s), 2,46-2,50 (2H, m), 3,03 (1H, bs), 3,43-3,64 (2H, m), 3,75-3,97 (2H, m), 3,78-4,10 (3H. m), 4,20-4,21 (1H, m), 5,40-5,42 (1H, m), 6,35 (1H, dd, J = 6,5, 7,7 Hz), 8,91 (1H, t, J = 5,5 Hz), 9,17 (1H, s), 9,44 (1H, bs). MS (m/z) calc. para C17H23N3O8, 397,15; encontrado 396,1 [M-H]-.

[00134] 5-(( S )-2-Furfurilmetilaminocarbonil)-3'-O-acetil-2'-deoxiuridina(5c).

[00135] O composto (5c) foi preparado a partir de (4c), por meio do procedimento descrito para (5a) e isolado por meio de precipitação a partir de uma mistura de diclorometano e dietil éter como um sólido laranja claro (1,35 g, rendimento de 77%). 1H-RMN (CDCl3) δ 1,572,03 (4H, m), 2,12 (3H, s), 2,47-2,51 (2H, m), 2,98 (1H, bs), 3,40-3,68 (2H, m), 3,78-3,95 (2H, m), 3,90-4,12 (3H. m), 4,20-4,21 (1H, m), 5,39- 5,42 (1H, m), 6,33 (1H, dd, J = 6,7, 7,4 Hz), 8,90 (1H, t, J = 5,5 Hz), 9,15 (1H, s), 9,37 (1H, bs). MS (m/z) calc. para C17H23N3O8, 397,15; encontrado 395,9 [M-H]-.

[00136] 5-(2-(4-Morfolino)etilaminocarbonil)-3‘-O-acetil-2'-deoxiuridina(5d).

[00137] O nucleosídeo (3d) (1,00 g, 1,37 mmol) foi dissolvido em uma solução de piridina anidra (10 mL) e anidrido acético (1 mL). A solução foi agitada durante a noite e concentrada in vacuo para proporcionar o 3'-O-acetil-nucleosídeo. Solvente residual foi removido por meio de co-evaporação com tolueno anidro (10 mL). O resíduo foi dissolvido em 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (20 mL) (Leonard, N. J. Tetrahedron Letters, 1995, 36: 7833) e aquecido a aproximadamente 50°C durante 3 horas. Clivagem completa do grupo DMT foi confirmada por meio de TLC. A solução vermelha misturada foi dissipada entornando em metanol bem agitado (200 mL). A solução amarela resultante foi concentrada in vacuo e o resíduo foi dissolvido iem acetato de etila quente (20 mL). O produto cristalizou quando de resfriamento e a pasta resultante foi envelhecida a -20°C, seguido por filtração e lavagem com acetato de etila. O 3'-O-acetil-nucleosídeo (5d) foi isolado como um sólido branco (0,46 g, rendimento de 79%). 1H-RMN (DMSO- d6) δ 2,07 (3H, s), 2,32-2,45 (7H, m sobreposto), 2,49-2,52 (1H, m), 3,33-3,40 (2H, m), 3,57 (4H, t, J = 4,5 Hz), 3,60-3,63 (2H, m), 4,09 (1H, bdd, J = 3,2, 5,2 Hz), 5,17-5,25 (2H, m), 6,14 (1H, t, J = 7,0 Hz), 8,74 (1H, s), 8,89 (1H, bt, J = 5,4 Hz), 11,90 (1H, bs). MS (m/z) calc. para C18H26N4O8, 426,18; encontrado 425,0 [M-H]-.

[00138] 5-(2-( 1 -(3-Acetil-benzimidazolonil))etilaminocarbonil)-3‘-O -acetil-2'-deoxiuπdina(5e).

[00139] O composto (5e) foi preparado conforme descrito para (5d), exceto que o produto cristalizou diretamente quando a reação de cli-vagem de DMT foi entornada em metanol. O diacetil nucleosídeo (5e) foi isolado por meio de filtração como um sólido branco (0,55 g, rendimento de 78%). 1H-RMN (DMSO-d6) δ 2,07 (3H, s), 2,30-2,37 (1H, m), 2,49-2,52 (1H, m), 2,63 (3H, s) 3,33 (1H, bs), 3,55-3,64 (4H, m sobreposto), 3,99 (2H, t, J = 6,4 Hz), 4,09 (1H, bdd, J = 2,3, 5,2 Hz), 5,155,25 (2H, m), 6,13 (1H, dd, J = 6,3, 7,6 Hz), 7,11 (1H, ddd, J = 1,2, 7,6, 7,9 Hz), 7,22 (1H, ddd, J = 1,2, 7,6, 7,9 Hz), 7,33 (1H, dd, J = 0,8, 7,9 Hz), 8,02 (1H, dd, J = 0,8, 8,0 Hz), 8,05 (1H, bs), 8,83 (1H, bt), 8,71 (1H, s), 11,87 (1H, bs). MS (m/z) calc. para C23H25N5O9, 515,17; encontrado 513,9 [M-H]-.

Exemplo 4. Síntese alternativa de 3'-O -Acetil-Nucleosídeos (5a-5d)

[00140] Os 3'-O-acetil-nucleosídeos (5a-d) foram também sintetiza-dosatravés de uma via alternativa (Esquema 2) a partir do material de iniciação, 3'-O-acetil-5'-O-dimetoxitritil-5-iodo-2'-deoxiuridina (7) (Vaught, J. D., Bock, C., Carter, J., Fitzwater, T., Otis, M., Schneider, D., Rolando, J., Waugh, S., Wilcox, S. K., Eaton, B. E. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 4141-4151). Resumidamente, com referência ao Esquema 2, trifluoroetoxic-carbonilação catalisada por paládio (III) do iodeto pro-porcionou o intermediário de éster ativado (8). Condensação de (8) com as aminas (2a-d) (1,3 eq., trietilamina (3 eq), acetonitrila, 60-70°C, 2-24 horas), seguido por clivagem do grupo de proteção 5'-O-DMT (ácido tricloroacético a 3%/diclorometano ou 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2- propanol, temperatura ambiente), proporcionou (5a-d), idêntico aos produtos produzidos via os intermediários (3a-d) (Esquema 1). Esquema 2

[00141] 3'-O -Acetil-5'-O-dimetoxitritil-5-(2,2,2-trifluoroetoxicarbonil)- 2-deoxiurídina(8). Um reator de pressão de vidro com parede pesada de 500 mL foi enchido com argônio e carregado com 3'-O-acetil-5'-O- dimetoxitritil-5-iodo-2'-deoxiuridina (7) (15,9 g, 22,8 mmoles), acetoni- trila anidro (200 mL), trietilamina (7,6 mL, 54,7 mmol) e 2,2,2- trifluoroetanol (16,4 mL, 228 mmol). A solução resultante foi vigorosa- mente agitada e desgaseificada por meio de evacuação para <100 mmHg durante 2 minutos. O frasco foi enchido com argônio e bis(benzonitrila)dicloropaládio(II) (175 mg, 0,46 mmol) foi adicionada. A solução amarela resultante foi novamente desgaseificada e, então, enchida com monóxido de carbono (99,9%) (Cuidado: Gás Venenoso!) a partir de uma derivação de gás. Uma pressão de 1-10 psi de CO foi mantida enquanto a mistura de reação era vigorosamente agitada e aquecida a 60-65°C durante 12 horas. A mistura de reação resfriada foi filtrada (Cuidado: Gás Venenoso) para remover o precipitado preto e concentrada in vacuo. O resíduo laranja foi dividido com diclorome- tano (120 mL) e bicarbonato de sódio a 10% (80 mL). A camada orgânica foi lavada com água (40 mL) e seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada para deixar uma espuma laranja (17 g). Este produto bruto pôde ser usado como estava ou ser ainda purificado por meio de cromatografia rápida em sílica-gel com um eluente de 30% de hexano/1% de trietilamina/69% de acetato de etila para proporcionar (8) como uma espuma sólida incolor (12,7 g, rendimento de 80%). 1H-RMN (CD3CN)) δ 2,03 (3H, s), 2,37-2,56 (2H, m), 3,36-3,38 (2H, m), 3,78 (6H, s), 4,15-4,19 (1H, m), 4,37-4,55 (2H, m), 5,21-5,26 (1H, m), 6,09 (1H, t, J = 6,1 Hz), 6,84-7,46 (13H, m), 8,53 (1H, s). 19F- RMN (CD3CN) δ -74,07 (t, J = 8,8 Hz). MS (m/z) calc. para C35H33F3N2O10, 698,21; encontrado 697,4 [M-H]-.

Exemplo 5. Síntese de 5'-O-Trifosfatos de Nucleosídeo

[00142] 5-(4-Fluorobenzilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina-5'-O -trifosfato (sal de tris-trietilamônio)(6a). O trifosfato (6a) foi sintetizado a partir do 3'-O-acetil-nucleosídeo (5a) por meio do procedimento de Ludwig e Eckstein (Ludwig, J. e Eckstein, F. J. Org. Chem. 1989, 54: 631) em uma escala de 500 μmol (5x). O produto de trifosfato bruto, após amonólise e evaporação, foi purificado por meio de cromatografia de troca de ânions, conforme descrito no Procedimento Geral (abaixo).

[00143] Procedimento Geral para Purificação por HPLC de Troca de Ânions de Trifosfatos de Nucleosídeo. Trifosfatos de nucleosídeo foram purificados via cromatografia de troca de ânions usando uma coluna de HPLC empacotada com resina Source Q (GE Healthcare), instalada sobre um sistema de HPLC preparativa, com detecção a 278 nm. O gradiente de eluição linear empregou dois tampões (tampão A: bicarbonato de trietilamônio a 10 mM/acetonitrila a 10% e tampão B: bicarbonato de trietilamônio a 1 M/acetonitrila a 10%), com o gradiente correndo em temperatura ambiente de baixo teor de tampão B para alto teor de tampão B durante o curso da eluição. O produto desejado era, tipicamente, o material final a eluir da coluna e foi observado como um pico amplo abrangendo um tempo de retenção de aproximadamente dez a doze minutos (produtos que eluem precocemente incluíam uma variedade de subprodutos de reação, o mais significativo sendo o nucleosídeo difosfato). Várias frações foram coletadas durante eluição de produto. A fração foi analisada por meio de HPLC de fase reversa sobre uma HPLC Waters 2795 com uma coluna Waters Sim- metry (PN: WAT054215). Frações contendo produto puro (tipicamente >90%) foram evaporados em um evaporador Genevac VC 3000D para proporcionar resinas castanhas claras a incolores. As frações foram reconstituídas em água desionizada e empoçadas para análise final. Quantificação de produto foi realizada por meio de análise usando um Espectrofotômetro Hewlett Packard 8452A Diode Array a 278 nm. Os rendimentos de produto foram calculados via a equação A = εCL, onde A é a absorbância de UV, ε é o coeficiente de extinção estimado e L é o comprimento de trajeto (1 cm).

[00144] O produto bruto (6a) foi dissolvido em aproximadamente 5 mL de tampão A (Tabela 1: Condições de prep-HPLC 1). Cada injeção de purificação consistia de uma alíquota filtrada de aproximadamente 1 mL desta solução injetada em uma HPLC Waters 625 com um detec- tor 486 adaptado com uma coluna Resource Q de 6 mL (Código de Produto da GE Healthcare: 17-1179-01) com um gradiente de fase móvel de 0%-100% de tampão B em uma eluição de 50 minutos a 12 mL/minuto. Para (6a) [ε est. 13,700 cm-1M-1], o produto isolado purificado foi 130 μmol (rendimento de 26%). 1H-RMN (D2O) δαl,15 (27H, t, J = 7,3 Hz), 2,32-2,37 (2H, m), 3,07 (18H, q, J = 7,3 Hz), 4,06-4,17 (3H, m sobreposto), 4,42 (2H, bd, J~0,7 Hz), 4,49-4,53 (1H, m), 4,70 (>7H, bs, HOD), 6,12 (1H, t, J = 6,8 Hz), 6,96-7,26 (4H, m), 8,45 (1H, s). 19F- RMN (D2O) δ -116,18 (m). 31P-RMN (D2O) δ -10,58 (d, J = 20 Hz), - 11,45 (d, J = 20 Hz), -23,29 (t, J = 20 Hz). MS (m/z) calc. para C17H21FN3O15P3, 619,02; encontrado 618,0 [M-H]-.Tabela 1.

[00145] Condições de Prep-HPLC 1

[00146] 5-(( R )-2-Furfurilmetilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina-5'-O -trifosfato (sal de tris-trietilamônio)(6b). O trifosfato (6b) foi sintetizado a partir do 3'-O-acetil-nucleosídeo (5b) conforme descrito para (6a). O produto bruto (6b) foi purificado em uma única injeção sobre um sistema preparatório Waters 2767 com um detector Waters 2489 usando uma coluna Waters AP-5 (Waters PN: WAT023331, 50 mm x 100 mm) empacotada com 196 mL de resina Source 15Q (Código de Produto da GE Healthcare: 17-0947-05). Os mesmos tampões conforme acima foram usados, mas o gradiente de eluição foi modificado para 25% a 80% de tampão B em uma eluição de 90 minutos a 50 mL/minuto (Tabela 2: Condições de prep-HPLC 2). Uma segunda purificação foi realizada sobre uma coluna de HPLC C18 para remover impurezas residuais (Tabela 4: Condições de prep-HPLC 4). Para (6b) [ε est. 10,200 cm-1M-1], o produto isolado purificado foi 325 μmol (rendimento de 65%). 1H-RMN (D2O) δDl,17 (27H, t, J= 7,3 Hz), 1,49-1,63 (1H, m), 1,77-2,02 (3H, m), 2,34-2,39 (2H, m), 2,85-3,83 (5H, m sobreposto), 3,08 (18H, q, J = 7,3 Hz), 4,01-4,19 (3H, m sobreposto), 4,52-4,56 (1H, m), 4,70 (>7H, bs, HOD), 6,15 (1H, t, J = 6,8 Hz), 8,48 (1H, s). 31P- RMN (D2O) δ -10,50 (d, J = 20 Hz), -11,51 (d, J = 20 Hz), -23,25 (t, J = 20 Hz). MS (m/z) calc. para C15H24FN3O16P3, 595,04; encontrado 594,1 [M-H]-.Tabela 2.

[00147] Condições de Prep-HPLC 2

[00148] 5-(( S )-2-Furfurilmetilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina-5'-O -trifosfato (sal de tris-trietilamônio)(6c). O trifosfato (6c) foi sintetizado a partir do 3'-O-acetil-nucleosídeo (5c) conforme descrito para (6a). O produto bruto (6c) foi purificado em uma única injeção sobre um siste-mapreparatório Waters 2767 com um detector Waters 2489 usando uma coluna Waters AP-5 (Waters PN: WAT023331, 50 mm x 100 mm) empacotada com 196 mL de resina Source 15Q (Código de Produto da GE Healthcare: 17-0947-05). Os mesmos tampões conforme acima foram usados, mas o gradiente de eluição foi modificado para 25% a 80% de tampão B em uma eluição de 90 minutos a 50 mL/minuto (Tabela 2: Condições de prep-HPLC 2). Uma segunda purificação foi realizada sobre uma coluna de HPLC C18 para remover as impurezas residuais (Tabela 4: Condições de prep-HPLC 4). Para (6c) [ε est. 10,200 cm-1M-1], o produto isolado purificado foi 255 μmol (rendimento de 51%). 1H-RMN (D2O) δαl,17 (27H, t, J= 7,3 Hz), 1,49-1,63 (1H, m), 1,78-2,01 (3H, m), 2,34-2,39 (2H, m), 2,85-3,82 (5H, m sobreposto), 3,09 (18H, q, J = 7,3 Hz), 4,01-4,19 (3H, m sobreposto), 4,52-4,56 (1H, m), 4,70 (>7H, bs, HOD), 6,15 (1H, t, J = 6,7 Hz), 8,48 (1H, s). 31P-RMN (D2O) δ -10,60 (d, J = 20 Hz), -11,42 (d, J = 20 Hz), -23,25 (t, J = 20 Hz). MS (m/z) calc. para C15H24FN3O16P3, 595,04; encontrado 594,1 [M-H]-.

[00149] 5-(2-(4-Morfolino)etilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina-5‘-O - trifosfato (sal de bis-trietilamônio)(6d). O trifosfato (6d) foi sintetizado a partir do 3'-O-acetil-nucleosídeo (5d) conforme descrito para (6a). O produto bruto (6d) foi purificado com o mesmo equipamento e tampões conforme usado para (6a), mas o gradiente foi modificado para passar tampão B de 15% a 60% durante a eluição de 50 minutos para aprimorar a decomposição de produtos (Tabela 3: Condições de prep-HPLC 3). Para (6d) [ε est. 10,200 cm-1M-1], o produto isolado purificado foi 54 μmol (rendimento de 11%). 1H-RMN (D2O) δD1,17 (18H, t, J = 7,3 Hz), 2,37-2,41 (2H, m), 2,91-2,98 (2H, m), 3,09 (12H, q, J = 7,3 Hz), 3,203,27 (4H, m), 3,87-3,90 (4H, m), 3,63-3,68 (2H, m), 4,10-4,18 (3H, m sobreposto), 4,56-4,60 (1H, m), 4,70 (>7H, bs, HOD), 6,15 (1H, bt, J = 6,3 Hz), 8,48 (1H, s). 31P-RMN (D2O) δ -9,99 (d, J = 21 Hz), -11,90 (d, J = 20 Hz), -23,19 (t, J = 20 Hz). MS (m/z) calc. para C16H27N4O16P3, 624,06; encontrado 623,1 [M-H]-. Tabela 3.

[00150] Condições de Prep-HPLC 3

Tabela 4.

[00151] Condições de Prep-HPLC 4

[00152] 5-(2-(N-Benzimidazolonil)etilaminocarbonil)-2'-deoxiuridina- 5'-O-trifosfato (sal de bis-trietilamônio)(6e). O trifosfato (6e) foi sintetizado a partir do 3'-O-acetil-nucleosídeo (5e) conforme descrito para (6a). O produto bruto (6e) foi purificado com o mesmo equipamento e tampões conforme usado para (6a), mas o gradiente foi modificado para passar tampão B de 15% a 60% durante a eluição de 50 minutos para aprimorar a decomposição de produtos (Tabela 3: Condições de prep-HPLC 3). Para (6e) [ε est. 13,700 cm-1M-1], o produto isolado purificado foi 101 μmol (rendimento de 20%). 1H-RMN (D2O) δD1,17 (18H, t, J = 7,3 Hz), 2,17-2,36 (2H, m), 3,09 (12H, q, J = 7,3 Hz), 3,60-3,73 (2H, m), 4,01 (2H, t, J = 5,4 Hz), 4,03-4,15 (3H, m), 4,45-4,50 (1H, m), 4,70 (>7H, bs, HOD), 6,04 (1H, t, J = 6,6 Hz), 6,95-7,12 (4H, m), 8,02 (1H, s). 31P-RMN (D2O) δ -10,35 (d, J = 20 Hz), -11,40 (d, J = 20 Hz), - 23,23 (t, J = 20 Hz). MS (m/z) calc. para C19H24N5O16P3, 671,04; en- contrado 670,1 [M-H]-.

[00153] As modalidades e os exemplos precedentes se destinam a ser exemplificativos apenas. Nenhuma modalidade, exemplo ou elemento particular de uma modalidade ou exemplo em particular deve ser construída como um elemento ou característica crítica, requerida ou essencial de qualquer uma das reivindicações. Ainda, nenhum elemento descrito aqui é requerido para a prática das reivindicações em anexo, a menos que expressamente descrito como "essencial" ou "crítico".Várias alterações, modificações, substituições e outras variações podem ser feitas nas modalidades divulgadas sem se desviar do escopo da presente invenção, o qual é definido pelas reivindicações em anexo. O relatório descritivo, incluindo os exemplos, deve ser considerado de uma maneira ilustrativa, em vez de restritiva e pretende-se que todas de tais modificações e substituições sejam incluídas dentro do escopo da invenção. Consequentemente, o escopo da invenção será determinado pelas reivindicações em anexo e seus equivalentes legais, em vez de pelos exemplos fornecidos acima. Por exemplo, etapas mencionadas em qualquer uma das reivindicações de método ou processo podem ser executadas em qualquer ordem viável e não estão limitadas a uma ordem apresentada em qualquer uma das modalidades, exemplos ou reivindicações.

Claims (3)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte estrutura:

na qual R é -(CH2)n-RX1; RX1é:

* significa ponto de ligação do grupo RX1ao grupo de ligação (CH2)n RX4é um halogênio selecionado dentre F, Cl, Br, I; n = 0-10; X é selecionado a partir do grupo que consiste em -H, -OH, -OMe, -O-alila, -F, -OEt, -OPr, -OCH2CH2OCH3 e azida; R'é selecionado a partir do grupo que consiste em -Ac; -P (N (iPr)2(O (CH2)2) CN; -Bz e -SiMe2tBu; R''é selecionado a partir do grupo que consiste em H, DMT e trifosfato (-P (O) (OH) -OP (O) (OH) -OP (O) (OH)2) ou um sal deste.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte estrutura ou um sal do mesmo:

3. Composto, de acordo coma reivindicação 1 ou 2, carac-terizado pelo fato de que RX4é Cl.