TW201730198A - ５-位置經修飾之嘧啶類及彼等之用途 - Google Patents

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Abstract

本文關於核酸化學領域，特別是關於5-位置經修飾之脲嘧啶核苷以及彼等之亞磷胺及三磷酸衍生物。本文亦關於製造及使用彼之方法。

Description

5-位置經修飾之嘧啶類及彼等之用途 相關申請案
本申請案主張2010年4月12日申請之美國臨時申請案第61/323,145號之優先權，藉由引用方式將其全文納入本文。
本發明關於核酸化學領域，特別是關於5-位置經修飾之脲嘧啶核苷以及彼等之亞磷胺及三磷酸衍生物。本發明亦關於製造及使用彼之方法。本發明包括經修飾之核苷作為部分寡核苷酸或適體(aptamer)之用途。
以下敘述提供關於本案內容之總論資訊，然而其中所提及之資訊或引用之公開刊物並非本案之先前技術。
到目前為止，相當關注發展經修飾之核苷作為治療劑、診斷劑，及將彼併入寡核苷酸。例如，已使用經修飾之核苷，諸如AZT、ddI、d4T及其他，來治療AIDS。5-三氟甲基-2'-去氧脲嘧啶核苷於抗皰疹性角膜炎具活性， 及5-碘-1-(2-去氧-2-氟-b-D-阿拉伯糖呋喃)胞嘧啶於抗CMV、VZV、HSV-1、HSV-2以及EBV(藥物設計與發展的教科書，Povl Krogsgaard-Larsen and Hans Bundgaard,Eds.,Harwood Academic Publishers,1991,Ch.15)具活性。
經修飾之核苷於診斷應用上有用。於這些應用中，核苷係併入DNA中之決定的位置，並可使用各種診斷方法來決定經修飾之核苷的位置。這些方法包括同位素標幟、螢光標幟、生物素化以及股斷裂。股斷裂的實施例關於，令核苷與肼反應以產生脲核苷，接著令脲核苷與哌啶反應以造成股斷裂(Maxam-Gilbert法)。
經修飾之核苷亦被併入寡核苷酸。於許多方法中，寡核苷酸可有用於治療。於生物體內，反義寡核苷酸可結合至特定遺傳編碼區以防止蛋白質表現或是阻止許多細胞功能。另外，如系統性配位子指數增益演繹(SELEX)程序或用於指數富集之配位子的系統演化之方法，使得選擇性結合至標靶分子之寡核苷酸(稱為"適體")能被辨識或製造。SELEX程序係描述於美國專利第5,270,163號，藉由引用方式將其內容併入本文。
SELEX法包括自候選混合物中選擇寡核苷酸以實際獲得所欲之結合親合性及選擇性。從隨機寡核苷酸混合物開始，此方法包括於有利於結合(或交互作用)的情況下令混合物與標靶接觸、自已與標靶結合(或交互作用)的寡核苷酸分隔未經結合的寡核苷酸、分離寡核苷酸-標靶對、 增殖自寡核苷酸-標靶對分離的寡核苷酸以產生配位子-富集的寡核苷酸混合物，接著重複結合、分隔、方離及增殖歷經所欲的循環數。
經修飾之核苷係可併入至SELEX程序所使用或所識別的反義寡核苷酸、核糖核酸酵素以及寡核苷酸。此等核苷可提供活體內及活體外的寡核苷酸對於內及外核酸酶之穩定性、改變分子之電荷、親水性或親油性，及/或提供不同的三維結構。
先前已知的核苷修飾包括2'-位置糖修飾、5-位置嘧啶修飾、8-位置嘌呤修飾、環外胺修飾、4-硫脲嘧啶核苷之取代、5-溴或5-碘-脲嘧啶之取代、骨架修飾及甲基化。修飾亦包括3'及5'修飾，諸如加帽(capping)。藉引用方式併入本文之PCT WO 91/14696描述一種化學性修飾反義寡核苷酸以增進進入細胞之方法。
藉由引用方式將其全文併入本文之美國專利第5,428,149號、第5,591,843號、第5,633,361號、第5,719,273號及第5,945,527號描述經由鈀偶合反應來修飾嘧啶核苷。於一些具體實施例中，親核劑及一氧化碳係偶合至嘧啶核苷，該嘧啶核苷於嘧啶環之5-位置上含有脫離基，較佳地形成酯及醯胺衍生物。
已使用數種方法來使寡核苷酸抵抗因外核酸酶之分解。PCT WO 90/15065描述一種藉由併入二或更多連結於寡核苷酸之5'及/或3'端的亞磷胺、偶磷基單磺酸鹽及/或偶磷基二磺酸鹽而使寡核苷酸抗外核酸酶之方法。PCT WO 91/06629揭露由形成能夠結合RNA或DNA之縮醛/縮酮類連結而置換之相鄰核苷間的具有一或更多磷酸二酯連結的寡核苷酸。
提供新的核苷於治療及診斷與併入其於寡核苷酸中將是有益的。當併入寡核苷酸中時，提供新的寡核苷酸將是有益的，其顯現結合至標靶分子之不同的高親合性，及/或相較於由天然產生的核苷所製備者，其顯示增進之對外核酸酶及內核酸酶的抗性寡核苷酸。提供經修飾的核苷酸修飾亦為有用的，除了內核酸酶及外核酸酶抗性外，其提供其他的生物活性。
發明簡述
本文提供一種下列通式之5-位置經修飾之脲嘧啶核苷： 其中R係選自由-(CH2)n-RX1所組成的群組；RX1係選自由以下所組成的群組 *表示RX1基團附接至(CH2)n連接基團之位置 其中RX4係選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX2)；一級醯胺(CONH2)；二級醯胺(CONHRX2)；三級醯胺(CONRX2RX3)；磺醯胺(SO2NH2)；N-烷基磺醯胺(SONHRX2)所組成的群組；其中RX2、RX3係獨立地選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C6H5)；RX4取代的苯環(RX4C6H4)，其中RX4係如上所定義；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX5)，其中RX5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；以及環烷基，其中RX2=RX3=(CH2)n所組成的群組；其中n=0-10；其中X係選自由，但不限於，-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3以及-疊氮基所組成的群組；其中R'係選自由，但不限於，-OAc；-OBz；以及-OSiMe2tBu所組成的群組；其中R"係選自由，但不限於，H、DMT以及三磷酸(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)所組成的群組或彼之鹽；以及 其中可被置換為碳環糖類似物、α-變旋異構糖、表異構糖，諸如阿拉伯膠糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物以及無核鹼基之核苷類似物，諸如甲基核糖苷。
所包含者為分別具有以下通式之該化合物的3'-亞磷胺及5'-三磷酸衍生物或彼之鹽類： 其中所有部分皆如上所定義。
使用標準合成或酵素法進行製備，本文中之化合物可併入至寡核苷酸或適體中。
本文亦提供用於製造本文所揭露之化合物的方法以及由該方法所製造的化合物。
於一個具體實施例中，提供一種用於製備C-5經修飾之胺羰嘧啶之方法，該方法包含：於鹼存在下，令5-位置經修飾之嘧啶與三氟乙氧基羰基及胺反應；以及單離該C-5經修飾之胺羰嘧啶。
於另一具體實施例中，提供一種用於製備C-5經修飾之胺羰嘧啶的3'-亞磷胺之方法，該方法包含：於鹼存在 下，令C-5經修飾之胺羰嘧啶與氰乙基二異丙基-氯亞磷胺反應；以及單離該3'-亞磷胺。
於又一具體實施例中，提供一種製備C-5經修飾之胺羰嘧啶的5'-三磷酸之方法，該方法包含：a)令具有下式之C-5經修飾之胺羰嘧啶： 其中R及X係如上所定義，於鹼存在下與酸酐反應，接著利用酸來斷裂5'-DMT基團以形成具有以下結構之3'-乙酸鹽： b)對步驟a)之3'-乙酸鹽實施Ludwig-Eckstein反應接著進行陰離子交換層析；以及c)單離具有以下結構之C-5經修飾之胺羰嘧啶的5'-三磷酸或彼之鹽：
發明詳細說明
現將參照本發明之代表性具體實施例來詳細說明。當以列舉的具體實施例說明本發明時，要瞭解的是本發明不受限於此等具體實施例。相反的，本發明欲包含由申請專利範圍所界定之範圍內的所有變化、修飾，以及等效物。
熟此技藝者將明瞭近似或等同於本文所揭露者的許多方法及材料可被用於此並落於本發明實作範圍內。本揭露並不受限於所描述的方法及材料。
除非另行定義，本文所使用之技術及科學用語與本發明所屬領域之熟此技藝者之一般理解相同。雖然可使用近似或等同本文所揭露者之任何方法、裝置及材料來操作或試驗本發明，以下將描述較佳的方法、裝置及材料。
本文中引用的所有出版品、公開專利文獻以及專利申請案為申請本案時所屬領域之熟此技藝者之技術水平。藉引用方式將文中引用的所有出版品、公開專利文獻以及專利申請案併入本文，如同藉引用方式將特定且個別指出之各出版品、公開專利文獻或專利申請案併入本文。
於本文中，包括後附申請專利範圍，單數型"一"以及"該"具複數含意，除非文意另行清楚指明，且與"至少一"以及"一或更多"為可互換者。因此，"一適體"包括適體的混合物等。
於本文中，"約"字指不重要的修飾或是數值變化，因此與該數值相關之物的基本功能沒有改變。
於本文中針對複數個物所使用之"各"一詞係指複數個 物中之至少兩個物。並非所有的複數個物均需滿足相關的額外限制。
本文中所使用之詞"包含"、"包括"、"含有"及其任何變化係非封閉性用法，因此製程、方法、製程限定物或物質組成包含、包括或含有之元件並不僅限於提出之元件，而可能包括未被明示列舉的元件或製程、方法、製程限定物或物質組成所暗示者。
本文中所使用之"核苷酸"一詞意指核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸，或彼之經修飾型，以及彼之類似物。核苷酸的種類有嘌呤類(如，腺嘌呤、次黃嘌呤，以及其衍生物及類似物)，以及嘧啶類(如，胞嘧啶、脲嘧啶、胸腺嘧啶，以及其衍生物及類似物)。
化合物
於一具體實施例中，本揭露提供下式之化合物： 其中R係選自由-(CH2)n-RX1所組成的群組；RX1係選自由以下所組成的群組 *表示RX1基團附接至(CH2)n連接基團之位置其中RX4係選自由，但不限於，支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX2)；一級醯胺(CONH2)；二級醯胺(CONHRX2)；三級醯胺(CONRX2RX3)；磺醯胺(SO2NH2)；N-烷基磺醯胺(SONHRX2)所組成的群組；其中RX2、RX3係獨立地選自由，但不限於，支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C6H5)；RX4取代的苯環(RX4C6H4)，其中RX4係如上所定義；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX5)， 其中RX5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；以及環烷基，其中RX2=RX3=(CH2)n所組成的群組；其中n=0-10；其中X係選自由，但不限於，-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3以及-疊氮基所組成的群組；其中R'係選自由，但不限於，-OH；-OAc；-OBz；-C(O)CH2OCH3以及-OSiMe2tBu所組成的群組；其中R"係選自由，但不限於，H、4,4'-二甲氧基三苯甲基、(DMT)以及三磷酸(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)所組成的群組或彼之鹽；以及其中可被置換為碳環糖類似物、α-變旋異構糖、表異構糖，諸如阿拉伯膠糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物以及無核鹼基之核苷類似物，諸如甲基核糖苷。
於另一具體實施例中，本揭露提供一種下式之化合物或彼之鹽類： 其中R、R"及X係如上所定義者。此通式之化合物通式係有用於藉由化學合成而將經修飾之核苷併入至寡核苷酸。
於又一具體實施例中，本揭露提供一種下式之化合物或彼之鹽類： 其中R、R'及X係如上所定義者。此通式之化合物通式係有用於藉由酵素合成而將經修飾之核苷併入至寡核苷酸。
於本文中，"C-5經修飾之羧醯胺脲嘧啶核苷"或"C-5經修飾之胺羰脲嘧啶核苷"一詞意指於脲嘧啶核苷的C-5位置具有羧醯胺(-C(O)NH-)修飾之脲嘧啶核苷，其包括，但不限於，上述之部分(R)。C-5經修飾之羧醯胺脲嘧啶核苷實施例包括美國專利第5,719,273號及第5,945,527號，以及2010年12月14日申請之名為"抗核酸酶之寡核苷酸"的美國臨時申請案第61/422,957號('957申請案)。代表性的C-5經修飾之嘧啶類包括：5-(N-苯甲基羧醯胺)- 2'-去氧脲嘧啶核苷(BndU)、5-(N-苯甲基羧醯胺)-2'-O-甲基脲嘧啶核苷、5-(N-苯甲基羧醯胺)-2'-氟脲嘧啶核苷、5-(N-異丁基羧醯胺)-2'-去氧脲嘧啶核苷(iBudU)、5-(N-異丁基羧醯胺)-2'-O-甲基脲嘧啶核苷、5-(N-異丁基羧醯胺)-2'-氟脲嘧啶核苷、5-(N-色胺基羧醯胺)-2'-去氧脲嘧啶核苷(TrpdU)、5-(N-色胺基羧醯胺)-2'-O-甲基脲嘧啶核苷、5-(N-色胺基羧醯胺)-2'-氟脲嘧啶核苷、5-(N-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧醯胺)-2'-去氧脲嘧啶核苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧醯胺)-2'-去氧脲嘧啶核苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧醯胺)-2'-O-甲基脲嘧啶核苷、5-(N-萘基甲基羧醯胺)-2'-氟脲嘧啶核苷或是5-(N-[1-(2,3-二羥基丙基)]羧醯胺)-2'-去氧脲嘧啶核苷)。
於此描述之僅用於說明之C-5經修飾之胺羰脲嘧啶核苷之特定實施例包括以下化合物，以及該化合物之5'-三磷酸及3'-亞磷胺及彼之鹽類，於實施例1-5描述彼等之合成。
5-(4-氟苯甲基胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷， 5-((R)-2-呋喃甲基甲胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷， 5-((S)-2-呋喃甲基甲胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷， 5-(2-(4-嗎啉基)乙胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷；以及 5-(2-(1-(3-乙醯基-苯并咪唑基))乙胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷。
於此說明之C-5經修飾之脲嘧啶核苷的化學修飾亦可與單獨地或任何組合的2'-位置糖修飾、環外胺修飾及4-硫脲嘧啶核苷的取代等組合。
鹽類
製備、純化，及/或處理化合物之對應的鹽，例如，藥學上可接受的鹽，可為方便或所欲者。藥學上可接受的鹽之實施例係如Berge等人之"藥學上可接受的鹽類"(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19中所述者。
例如，若化合物為陰離子性，或具有可能為陰離子性之官能基團(如，-COOH可為-COO-)，則可與適合的陽離子形成鹽。適合的無機陽離子之實施例包括，但不限於，鹼金屬離子，諸如Na+及K+、鹼土金屬陽離子，諸如Ca2+及Mg2+，以及其他陽離子，諸如Al+3。適合的有機陽離子之實施例包括，但不限於，銨離子(即，NH4 +)以及取代的銨離子(如，NH3Rx+、NH2Rx 2 +、NHRx 3 +、NRx 4 +)。一些適合的經取代之銨離子係得自：乙胺、二乙胺、二環己基胺、三乙基胺、丁基胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苯甲基胺、苯基苯甲基胺、膽鹼、美洛明以及三羥甲基甲胺，以及胺基酸，諸如離胺酸及精胺酸。常見四級銨離子的實例為N(CH3)4 +。
若化合物為陽離子性，或具有可能為陽離子性之官能基團(如，-NH2可為-NH3 +)，則可與適合的陰離子形成鹽。適合的無機陰離子之實例包括，但不限於，衍生自下列無機酸者：氫氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、亞硝酸、磷酸以及亞磷酸。
適合的有機陰離子之實例包括，但不限於，衍生自下列有機酸者：2-乙醯氧基苯甲酸、醋酸、抗壞血酸、天冬 胺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、桂皮酸、檸檬酸、乙二胺四乙酸、乙烷二磺酸、反丁烯二酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、麩胺酸、羥乙酸、羥基順丁烯二酸、羥基萘甲酸、羥乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、順丁烯二酸、蘋果酸、甲烷磺酸、半乳糖二酸、油酸、草酸、棕櫚酸、帕莫(pamoic)酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、柳酸、硬脂酸、琥珀酸、對胺苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸，以及戊酸。適合的多元有機陰離子之實例包括，但不限於，衍生自下列多元有機酸者：單寧酸、羧甲基纖維素。
除非另行指明，提及之特殊化合物亦包括彼之鹽形式。
寡核苷酸之製備
於一面向中，本揭露提供一種使用本文所述的經修飾之核苷，單獨或與其他經修飾之核苷及/或天然產生的核苷組合，以製備經修飾之寡核苷酸的方法。寡去氧核苷的自動合成為許多實驗室的例行規程(見如，Matteucci,M.D.and Caruthers,M.H.,(1990)J.Am.Chem.Soc.,103：3185-3191，藉引用方式將其併入本文)。寡核糖核苷的合成亦為習知者(見如，Scaringe,S.A.,et al.,Nucleic Acids Res.18：5433-5441(1990)，藉引用方式將其併入本文)。如上指出，亞磷胺係有用於藉由化學合成而將經修飾之核苷併入至寡核苷酸，以及三磷酸係有用於藉由酵素合成而將經修飾之核苷併入至寡核苷酸。(見如，Vaught,J.V., et al.(2010)J.Am.Chem.Soc.,132,4141-4151；Gait,M.J."實用寡核苷酸合成方法"(1984)IRL Press(Oxford,UK)；Herdewijn,P."寡核苷酸合成"(2005)(Humana Press,Totowa,NJ(各者係藉引用方式將其全文併入本文)。
當用於寡核苷酸時，本文中所使用之術語"修飾"、"經修飾"及其任何變化表示：寡核苷酸之四種組成核苷酸鹼基(即，A、G、T/U，及C)中至少一者為天然產生之核苷酸之類似物或酯。於一些具體實施例中，經修飾之核苷酸表現寡核苷酸之核酸酶抗性。其他的修飾可包括骨架修飾、甲基化、非典型鹼基配對組合，諸如異鹼基(isobase)異胞苷(isocytidine)及異胍(isoguanidine)等。修飾亦可包括3'及5'修飾，諸如加帽。其他修飾可包括以類似物來取代一或更多天然產生的核苷酸、內核苷酸修飾諸如，例如，具未帶電連結者(如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸醯胺酯、胺甲酸酯等)以及具帶電連結者(如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、具嵌入劑者(如，吖啶、補骨脂素等)、含有螯合劑者(如，金屬、放射性金屬、硼、氧化的金屬等)、含有烷基化劑者，以及具經修飾之連結者(如，α變旋異構核酸等)。另外，普通存在於核苷酸之糖上的羥基團可被膦酸基團或磷酸基團置換；被標準保護基保護；或經活化以製備額外的連結至另外的核苷酸或至固體撐體。5'及3'端的OH基團可經磷酸化，或經胺、具有約1至約20個碳的有機加帽基團部分、於一具體實施例中為 約10至約80kDa之聚乙二醇(PEG)聚合物、於另一具體實施例中為約20至約60kDa之PEG取代的聚合物或其他親水性或疏水性的生物或合成聚合物取代。
聚核苷酸亦可含有習知之核糖或去氧核糖的類似形式，包括2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-O-乙基、2'-O-丙基、2'-O-CH2CH2OCH3、2'-氟-或2'-疊氮基、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、表異構糖，諸如阿拉伯膠糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物，以及無核鹼基之核苷類似物，諸如甲基核糖苷。如上說明，一或更多磷酸二酯連結可被其他選擇性的連結基團置換。這些選擇性的連結基團包括，其中磷酸鹽被P(O)S("硫代酯")、P(S)S("二硫代酯")、(O)NRx 2("醯胺酯")、P(O)Rx、P(O)ORx、CO或CH2("甲縮醛")置換之具體實施例，其中各Rx或Rx'係獨立地H或經取代或未經取代的烷基(C1-C20)，其任意地含有醚(-O-)連結、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。並非聚核苷酸中的所有連結均必須相同。以糖類、嘌呤類及嘧啶類的類似物形式進行取代可有利於設計最終產物，例如選擇性的骨架可類似聚醯胺骨架。
若修飾存在，可於聚合物組合之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列可為非-核苷酸成分中斷。於聚合作用之後可進一步藉由諸如與標記用成分接合來修飾聚核苷酸。
本文中交替地使用之"核酸"、"寡核苷酸"及"聚核苷酸 "係表示核苷酸的聚合物且包括DNA、RNA、DNA/RNA雜交體及此等核酸、寡核苷酸及聚核苷酸之修飾，其中包括附接至核苷酸單元之任何位置之各種實體或部分。術語"聚核苷酸"、"寡核苷酸"以及"核酸"包括雙-或單-股分子以及三螺旋分子。相較於適體一詞，核酸、寡核苷酸以及聚核苷酸為含意較廣的術語，因此，核酸、寡核苷酸以及聚核苷酸包括為適體之核苷酸聚合物，然而核酸、寡核苷酸以及聚核苷酸並不限於適體。
如本文中所使用者，當表示核酸之修飾時，"至少一核苷酸"意指核酸中之一個、數個或所有核苷酸，其表示核酸中之任何或所有出現的任何或所有的A、C、T、G或U可經修飾或未經修飾。
於其他面向中，本揭露提供一種使用本文所述的經修飾之核苷，單獨或與其他經修飾之核苷及/或天然產生的核苷組合，以製備適體以及酶聯免疫適體(SOMAmer)(描述於下)之方法。於特定具體實施例中，使用下述之普通SELEX或改良的SELEX程序來製備適體以及酶聯免疫適體。
本文中交替地使用之"核酸配位子"、"適體"、"酶聯免疫適體"及"殖株"係指非天然存在的核酸，其對於標靶分子具有所欲的作用。所欲的作用包括，但不限於，結合標靶、催化性改變標靶、與標靶反應而修飾或改變標靶或標靶的官能活性、共價性地附接至標靶(如自殺式抑制劑)，以及促進標靶及其他分子之間的反應。於一具體實施例 中，針對標靶分子，反應係特異結合親合性，此標靶分子為三維化學結構而非透過不同於華森/克里克鹼基配對或三螺旋構型之機制而結合至核酸配位子之聚核苷酸，其中適體並非具有已知之藉由標把分子結合之生理功能的核酸。針對特定標靶之適體包括由候選核酸混合物中辨識出的核酸，其中適體為標靶的配位子，辨識的分法包含：(a)令候選混合物與標靶接觸，其中，相較於候選混合物中之其他可自候選混合物之剩餘物分離之核酸，核酸對於標靶具有增強的親和性；(b)將具有增強的親和性之核酸自候選混合物之剩餘物分離；以及(c)擴增具有增強的親和性之核酸以產生配位子-富集的核酸混合物，藉此來辨識標靶分子之適體。所瞭解的是親合性作用為程度上的不同；然而，於本文中，針對其標靶之適體的"特異結合親合性"代表，相較於與混合物或樣本中之其他非-標靶成分之結合，適體通常以較高程度的親和性與其標靶結合。"適體"、"酶聯免疫適體"或"核酸配位子"為具有特定核苷酸序列之一種或一系列核酸分子之拷貝的集合。適體可包括任何適合的數目之核苷酸。"複數適體"指多於一個的該分子之集合。不同的適體可具有相同或不同數目的核苷酸。適體可為DNA或RNA且可為單股、雙股，或含有雙股或三股區域。
如本文所使用者，"酶聯免疫適體"或低解離率的經修飾之適體表示適體具有改進的解離率之特徵。可使用名為"利用改進之解離率來產生適體之方法"之美國專利公開第 20090004667號中所述之SELEX法來產生酶聯免疫適體。
如本文所使用者，"蛋白質"與"胜肽"、"多胜肽"或"胜肽片段"為同義字。"純化的"多胜肽、蛋白質、胜肽或胜肽片段實質上不含細胞物質或來自細胞、組織、或獲取胺基酸序列之無細胞源之其他蛋白質汙染，或實質上不含化學合成用之化學前驅物或其他化學品。
SELEX法
本文中交替使用之術語"SELEX"及"SELEX程序"通常指(1)以所欲方式，如以高親和性與蛋白質結合，來選擇與標靶分子交互作用的核酸與(2)擴增所選擇的核酸之組合。SELEX程序可用來辨識對特異標靶分子或生物標記具高親和性之適體。
SELEX通常包括製備候選核酸混合物、結合候選混合物至所欲的標靶分子以形成親和性複合體、自未結合的候選核酸分離親和性複合體、自親和性複合體分離及單離核酸、純化核酸，及辨識特異適體序列。此程序可包括複數回合以進一步提高所選擇的適體之親和性。此程序中可在一或多時間點包括擴增步驟。見如，名為"核酸配位子"之美國專利第5,475,096號。SELEX程序可用來產生共價地結合其標靶的適體以及非共價地結合其標靶的適體。見如，名為"藉由指數型富集：化學SELEX之核酸配位子的系統性演化"之美國專利第5,705,337號。
SELEX程序可用來辨識含有經修飾之核苷酸之高親合性適體，其賦予適體改進的特徵，諸如，舉例來說，改進的活體內穩定性或改進的輸送特徵。此修飾的實施例包括核糖及/或磷酸鹽及/或鹼基位置的化學取代。於名為"高親合性核酸配位子含有經修飾之核苷酸"之美國專利第5,660,985號中描述SELEX程序所辨識的適體含有經修飾之核苷酸，其描述寡核苷酸含有於嘧啶類之5'-及2'-位置經化學修飾之。美國專利第5,580,737號，如上述，描述高度特異性適體，其含有一或多個以2'-胺基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)，及/或2'-O-甲基(2'-OMe)進行修飾之核苷酸。亦參見名為"SELEX及PHOTOSELEX"之美國專利申請公開案第20090098549號，其描述核酸庫具有擴充的物理及化學特性及彼於SELEX及PHOTOSELEX之應用。
SELEX亦可用於辨識具有所欲解離率特徵的適體。見名為"用於產生具有改進的解離率之適體的方法"之美國專利公開案第20090004667號，藉引用方式將其全文併入本文，其描述用於產生可與標靶分子結合之適體之改進的SELEX法。其描述用於產生以較低解離率自其各別的標靶分子解離之適體及光適體之方法。該方法包括令候選混合物與標靶分子接觸、使核酸-標靶複合體之行成得以發生，以及低解離率富集程序，其中帶高解離率的核酸-標靶複合體解離且不會再形成，而帶低解離率之複合體維持完整。此外，此方法包括於製造候選核酸混合物時使用經修飾之核苷酸以產生具有改進的解離率表現性之適體(見 名為"SELEX and photo SELEX"之美國專利申請案第20090098549號)。(亦見美國專利第7,855,054號及美國專利申請案第20070166740號)。此等申請案的每一者係藉引用方式將其全文併入本文。
於本文中，"標靶"或"標靶分子"或"標靶"係指於其上之核酸可依所欲方式作動之任何化合物。標靶分子可為蛋白質、胜肽、核酸、碳水化合物、脂質、聚醣、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、病原體、毒性物質、代謝物、過渡狀態類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營養物、生長因子、細胞、組織、任何前述者之任何部分或片段等，而無限制。實際上任何化學性或生物性致效劑可為適合的標靶。任何尺寸的分子可作為標靶。標靶亦可以特定方式來修飾以增進標靶及核酸間交互作用的可能性及強度。標靶亦可包括特定化合物或分子之任何小的變化，諸如，於蛋白質的情況中，例如胺基酸序列中小的改變、雙硫鍵形成、糖化、脂化、乙醯化、磷酸化，或任何其他調控或修飾，諸如與標記用成分接合，其並不會實質上改變分子的辨識性。"標靶分子"或"標靶"為能與適體結合之一種類或一系列分子或多分子結構之拷貝的集合。複數"標靶分子"或"標靶"意指多於一個的分子集合。名為"不需經純化蛋白質之經修飾的SELEX程序"之美國專利第6,376,190號之SELEX程序的具體實施例中的標靶為胜肽。
化學合成
於此描述本文所提供之化學性合成化合物之方法。這些及/或其他習知方法可利用經修飾及/或適應已知方法以促進本文所提供之另外的化合物之合成。
參照流程1，於一方法中，本文之C-5位置經修飾之胺羰嘧啶類係藉由，於鹼存在下，令5-位置經修飾之嘧啶與三氟乙氧基羰基及胺反應；且單離該C-5經修飾之胺羰嘧啶而製備。
於一些具體實施例中，三氟乙氧基羰基嘧啶係選自由，但不限於，具有以下結構之化合物所組成的群組： 其中X係選自由，但不限於，-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3及-疊氮基所組成的群組，以及其中可被置換為碳環糖類似物、α-變旋異構糖、表異構糖，諸如阿拉伯膠糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物及無核鹼基之核苷類似物，諸如甲基核糖苷。於一些具體實施例中，胺係選自，但不 限於，具有式RNH2之化合物所組成的群組，其中R係選自由-(CH2)n-RX1所組成的群組；RX1係選自由下列者所組成的群組： *表示RX1基團附接至(CH2)n連接基團之位置其中RX4係選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX2)；一級醯胺(CONH2)；二級醯胺(CONHRX2)；三級醯胺(CONRX2RX3)；磺醯胺(SO2NH2)；N-烷基磺醯胺(SONHRX2)所組成的群組；其中RX2及RX3係獨立地選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C6H5)；RX4取代的苯環(RX4C6H4)，其中RX4係如上所定義；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX5)，其中 RX5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；以及環烷基，其中RX2=RX3=(CH2)n所組成的群組；以及其中n=0-10。
於特定具體實施例中，胺係選自下列所組成的群組：
於一些具體實施例，鹼係選自由三乙基胺、二異丙基胺等所組成群組中的三級胺。
參照流程1，本文亦提供一種用於合成C-5經修飾之胺羰嘧啶的3'-亞磷胺之方法，包含：於鹼存在下，令該C-5經修飾之胺羰嘧啶與氰乙基二異丙基-氯亞磷胺反應；以及單離該3'-亞磷胺。於一些具體實施例中，C-5經修飾之胺羰嘧啶具有以下結構： 其中R及X係如上所定義。於一些具體實施例中，鹼係選自由三乙基胺、二異丙基胺等所組成群組之三級胺。
再次參照流程1，本文亦提供一種用於合成C-5經修飾之胺羰嘧啶之5'-三磷酸之方法，包括： a)於鹼存在下，令具有下式之C-5經修飾之胺羰嘧啶與酸酐反應： 其中R及X係如上所定義，接著利用酸來斷裂5'-DMT基團以形成具有以下結構之3'-乙酸鹽： b)對步驟a)之3'-乙酸鹽實施Ludwig-Eckstein反應接著進行陰離子交換層析；以及c)單離具有以下結構之C-5經修飾之胺羰嘧啶的5'-三磷酸或彼之鹽：
所使用的鹼係選自由，但不限於，由三級胺所組成的群組。於一些具體實施例中，鹼為吡啶。步驟a中之酸係 選自由，但不限於，二氯乙酸、三氯乙酸及1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇所組成的群組。
於選擇性的方法中，三氟乙氧基羰基嘧啶具有以下結構：
參考流程2，此化合物係，於鈀觸媒及鹼存在下，藉由令流程2之化合物(7)與一氧化碳及三氟乙醇反應所形成。鹼係選自由，但不限於，選自三乙基胺等三級胺所組成的群組。
本文包括由上述各方法製備之化合物。
以下實施例僅用於闡述目的而非試圖限制由後附申請專利範圍所定義之發明的範圍。本文所述的所有實施例皆利用標準技術實施，標準技術為熟此技藝者所知悉且常用者。於以下實施例中述及之常見分子生物技術可依標準實驗室手冊，諸如Sambrook等人之分子選殖(Molecular Cloning)：實驗室手冊(A Laboratory Manual),3rd.ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2001)來進行。
採用以下普通方式來製造實施例1-3及5中所述之經修飾之核苷。於此所用的命名法係根據Matsuda等人於 Nucleic Acids Research 1997,25：2784-2791中所描述之系統。
實施例1 5'-O-DMT-dU-5-羧醯胺(3a-e)之合成
5'-O-二甲氧三苯甲基-5-(4-氟苯甲基胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷(3a)。藉由Matsuda等人(Nomura,Y.；Ueno,Y.；Matsuda,A.Nucleic Acids Research 1997,25：2784-2791；Ito,T.,Ueno,Y.；Matsuda,A.Nucleic Acids Research 2003,31：2514-2523)之方法來製備起始材料，5'-O-二甲氧三苯甲基-5-三氟乙氧基羰基-2'-去氧脲嘧啶核苷(1)。於惰性氣體環境下於60-70℃之溫度加熱(1)(9.85g,15mmol)、4-氟苯甲基胺(2a)(2.25g,18mmol,1.3當量)、三乙基胺(4.2mL,30mmol)以及無水乙腈(30mL)之溶液持續2-24小時。由薄層管柱層析法(矽膠60，5%甲醇/二氯甲烷)或HPLC來確認(1)成為醯胺(3a)之定量轉換。在真空中濃縮反應混合物並藉由矽膠快速管柱層析法(Still,W.C.；Kahn,M.；Mitra,A.J.Org.Chem. 1978,43：2923)，使用0-3%甲醇於1%三乙基胺/99%乙酸乙酯中之洗提液來純化殘餘物。合併及蒸發含有純產物的部分。藉由與無水乙腈共蒸發而移除微量的殘餘溶劑，接著於高真空下進行乾燥以得到為白色固體的(3a)(6.57g,64%產率)。1H-NMR(300MHz,CD3CN)δ 2.20-2.40(2H,m),3.28(2H,d,J=4.3Hz),3.76(6H,s),4.01(1 H,dd,J=3.8,4.2Hz),4.26-4.30(1 H,m),4.48(2H,bd,J=6.1Hz),6.11(1H,t,J=6.5Hz),6.85-7.46(13H,m),7.03-7.36(4 H,m),8.58(1 H,s),9.01(1H,t,J=6.1Hz).MS(m/z)針對C38H36FN3O8，計算值681.25；實驗值680.4 [M-H]-.
5'-O-二甲氧三苯甲基-5-((R)-2-呋喃甲基甲胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷(3b)。使用(R)-2-呋喃甲基甲胺(2b)，如製備(3a)般製備化合物(3b)並進行單離而得到白色固體(9.3g,94%產率)。供管柱層析法之洗提液為1%三乙基胺/4%甲醇/95%乙酸乙酯。1H-NMR(CD3CN)δ 1.51-1.57(1H,m),1.84-1.94(3H,m),2.18-2.38(2H,m),3.25-3.52(4H,m重疊),3.66-3.93(3H,m重疊),3.78(6H,s),3.97-4.02(1H,m),4.24-4.29(1H,m),6.12(1 H,t,J=6.5),6.86-7.47(13H,m),8.54(1H,s),8.83(1H,bs).MS(m/z)針對C36H39N3O9，計算值657.27；實驗值656.5[M-H]-.
5'-O-二甲氧三苯甲基-5-((S)-2-呋喃甲基甲胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷(3c)。使用(S)-2-呋喃甲基甲胺(2c)，如製備(3b)般製備化合物(3c)並進行單離而得到白色固體(9.9g,99%產率)。1H-NMR(CD3CN)δ 1.50-1.59(1H,m),1.84-1.95(3H,m),2.18-2.40(2H,m),3.24-3.50(4H,m重疊),3.69-3.97(3H,m重疊),3.78(6H,s),3.98-4.02(1H,m),4.25-4.30(1H,m),6.14(1 H,t,J=6.5),6.87-7.47(13H,m),8.54(1H,s),8.84(1H,bs).MS(m/z)針對C36H39N3O9，計算值657.27；實驗值656.5[M-H]-.
5'-O-二甲氧三苯甲基-5-(2-(4-嗎啉基)乙胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷(3d)。使用2-(4-嗎啉基)-乙胺(2d)，如製備(3a)般製備化合物(3d)並進行單離而得到白色固體(8.2g,80%產率)。供管柱層析法之洗提液為5%甲醇/2%三乙 基胺/93%二氯甲烷。1H-NMR(CD3CN)δ 2.21-2.39(2H,m),2.39-2.41(4H,m),2.48(2H,t,J=6.2Hz),3.27-3.29(2H,m),3.41(2H,dt,J=5.8,6.2Hz),3.61-3.64(4H,m),3.78(6H,s),3.98-4.02(1H,m),4.25-4.30(1H,m),6.10(1H,t,J=6.4),6.86-7.47(13H,m),8.55(1H,s),8.79(1H,bt,J~6Hz).MS(m/z)針對C37H42N4O9，計算值686.30；實驗值685.7[M-H]-.
5'-O-二甲氧三苯甲基-5-(2-(N-苯并咪唑基)乙胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷(3e)。使用N-苯并咪唑基-2-乙胺(2e)(CAS RN64928-88-7)，如製備(3a)般製備化合物(3e)。供管柱層析法之洗提液為2%甲醇/1%三乙基胺/97%二氯甲烷。經單離之純產物為棕褐色固體(8.2g,74.5%產率)。1H-NMR(CD3CN)δ 2.20-2.36(2H,m),3.27-3.29(2H,m),3.60(2H,q,J=6.5Hz),3.758(3H,s),3.762(3H,s),3.97(2H,t,J=6.5Hz),3.98-4.02(1H,m),4.27-4.30(1H,m),6.09(1H,t,J=6.5Hz),6.86-7.48(13H,m),6.91-7.10(4H,m),8.52(1H,s),8.76(1H,t,J=6.1Hz).MS(m/z)針對C40H39N5O9，計算值733.27；實驗值732.0[M-H]-.
實施例2 5'-O-DMT-核苷CE-亞磷胺(4a-4e)之合成
5'-O-二甲氧三苯甲基-5-(4-氟苯甲基胺羰)-3'-O-[(2-氰乙基)(N,N-二異丙基胺基)膦基]-2'-去氧脲嘧啶核苷(4a)。於乾氬氣環境下，冷卻DMT-保護的核苷(3a)(4.00g,5.9mmol)於無水二氯甲烷(40mL)中之溶液至大約- 10℃。加入二異丙基乙基胺(3.1mL,17.6mmol,3當量)，接著逐滴加入2-氰乙基二異丙基氯亞磷胺(1.7mL,7.7mmol,1.3當量)。攪拌溶液一小時，藉由薄層管柱層析法(矽膠60，乙酸乙酯/己烷)來確認反應完成。使反應混合物被分隔於冰冷的2%重碳酸鈉溶液(200mL)與乙酸乙酯(200mL)之間。以鹵水清洗有機層、利用無水硫酸鈉進行乾燥、過濾及濃縮。藉由使用1%三乙基胺/99%乙酸乙酯的移動相之矽膠快速管柱層析法來純化殘留物。在真空中(<30℃)合併及蒸發含有純產物的部分。藉由與無水乙腈共蒸發而移除微量的殘餘溶劑，接著於高真空下進行乾燥以得到為白色固體泡沫的(4a)(4.10g,80%產率)。1H-NMR(CD3CN，兩種異構物)δ 1.02-1.16(12H,m),2.27-2.57(2H,m),2.51/2.62(2H,2t,J=6.0/6.0Hz),3.25-3.37(2H,m),3.50-3.79(4H,m重疊),3.738(3H,s),3.742(3H,s),4.13/4.16(1H,2q,J=3.5/3.7Hz),4.37-4.43(1H,m),4.44-4.47(2H,m),6.09/6.10(1H,2t,J=6.4/7.1Hz),6.83-7.44(13H,m),7.01-7.30(4H,m),8.58/8.60(1H,2s),8.98(1H,b,J~5.5Hz),9.24(1H,bs).31P-NMR(CD3CN)δ 148.01(s),148.06(s).19F-NMR(CD3CN)δ -117.65(m).MS(m/z)針對C47H53FN5O9P，計算值881.36；實驗值880.3[M-H]-.
5'-O-二甲氧三苯甲基-5-((R)-2-呋喃甲基甲胺羰)-3'-O-[(2-氰乙基)(N,N-二異丙基胺基)膦基]-2'-去氧脲嘧啶核苷(4b)。如製備(4a)般製備化合物(4b)。非鏡像異構亞磷 胺之1：1混合物係經單離為白色固體泡沫(3.15g,62%產率)。供管柱層析法之洗提液為1%三乙胺/20%己烷/79%乙酸乙酯。1H-NMR(CD3CN，兩種異構物)δ 1.14-1.27(12H,m),1.51-1.59(1H,m),1.86-1.94(3H,m),2.27-2.59(2H,m),2.54/2.65(2H,2t,J=6.0/5.7Hz),3.27-3.38(2H,m),3.44-3.97(9H,m重疊),3.782(3H,s),3.786(3H,s),4.11-4.18(1H,m),4.39-4.48(1H,m),6.11/6.13(1H,2t,J=5.6/6.1Hz),6.96-7.47(13H,m),8.58/8.60(1H,2s),8.75(1H,bt,J~5.4Hz),9.36(1H,bs).31P-NMR(CD3CN)δ 148.09(s),148.13(s).MS(m/z)針對C45H56N5O10P,計算值857.38；實驗值856.6[M-H]-.
5'-O-二甲氧三苯甲基-5-((S)-2-呋喃甲基甲胺羰)-3'-O-[(2-氰乙基)(N,N-二異丙基胺基)膦基]-2'-去氧脲嘧啶核苷(4c)。如製備(4b)般製備化合物(4c)。非鏡像異構亞磷胺之1：1混合物係經單離為白色固體泡沫(3.74g,74%產率)。1H-NMR(CD3CN，兩種異構物)δ 1.14-1.27(12H,m),1.51-1.59(1H,m),1.86-1.94(3H,m),2.28-2.51(2H,m),2.53/2.65(2H,2t,J=6.0/6.0Hz),3.25-3.41(2H,m),3.44-4.14(9H,m重疊),3.783(3H,s),3.786(3H,s),4.12-4.19(1H,m),4.40-4.49(1H,m),6.11/6.13(1H,2t,J=6.3/6.3Hz),6.86-7.48(13H,m),8.58/8.60(1H,2s),8.75(1H,bt,J~5.4Hz),9.36(1H,bs).31P-NMR(CD3CN)δ 148.09(s),148.13(s).MS(m/z)針對C45H56N5O10P,計算值857.38；實驗值856.5[M-H]-.
5'-O-二甲氧三苯甲基-5-(2-(4-嗎啉基)乙胺羰)-3'-O-[(2-氰乙基)(N,N-二異丙基胺基)膦基]-2'-去氧脲嘧啶核苷(4d)。如製備(4a)般製備化合物(4d)，除了於純化時使用之管柱層析法的洗提液為1%三乙基胺/5%無水乙醇/94%乙酸乙酯。非鏡像異構亞磷胺之1：1混合物係經單離為白色固體泡沫(3.9g,75%產率)。1H-NMR(CD3CN，兩種異構物)δ 1.04-1.19(12H,m),2.28-2.59(2H,m),2.43-2.47(6H,m重疊),2.53/2.64(2H,2t,J=6.2/6.2Hz),3.27-3.76(8H,m重疊),3.61-3.65(4H,m),3.781(3H,s),3.789(3H,s),4.12-4.19(1H,m),4.39-4.49(1H,m),6.11/6.13(1H,2t,J=5.2//5.2),6.86-7.48(13H,m),8.58/8.60(1H,2s),8.78(1H,bt,J~5.3Hz),9.78(1H,bs).31P-NMR(CD3CN)δ 148.08(s),148.11(s).MS(m/z)針對C46H59N6O10P，計算值886.4；實驗值885.7[M-H]-.
5'-O-二甲氧三苯甲基-5-(2-(N-苯并咪唑基)乙胺羰)-3'-O-[(2-氰乙基)(N,N-二異丙基胺基)膦基]-2'-去氧脲嘧啶核苷(4e)。如製備(4a)般製備化合物(4e)，除了於純化時使用之管柱層析法的洗提液為1%三乙基胺/10%無水乙醇/89%乙酸乙酯。鏡像異構亞磷胺之1：1混合物係經單離為白色固體泡沫(1.6g,31%產率)。1H-NMR(CD3CN，兩種異構物)δ 1.03-1.18(12H,m),2.27-2.57(2H,m),2.52/2.63(2H,2t,J=6.0/6.0),3.27-3.37(2H,m),3.49-3.80(6H,m重疊),3.732(3H,s),3.735/3.738(3H,2s),4.00(2H,bt,J~6.0Hz),4.12-4.18(1H,m),4.30-4.47(1H, m),6.08/6.10(1H,2t,J=6.3/6.3Hz),6.85-7.48(13H,m),6.93-7.09(4H,m),8.57/8.60(1H,2s),8.82/8.83(1H,2bt,J~4.3/4.3Hz),9.48(1H,bs).31P-NMR(CD3CN)δ 148.07(s),148.10(s).
實施例3 3'-O-乙醯基-核苷(5a-5e)之合成
5-(4-氟苯甲基胺羰)-3'-O-乙醯基-2'-去氧脲嘧啶核苷(5a)。
令核苷(3a)(3.00g,4.4mmol)溶解於無水吡啶(30mL)及酸酐(3mL)之溶液中。攪拌溶液過夜及於真空中進行濃縮以得到3'-O-乙醯基-核苷。藉由與無水甲苯(10mL)共蒸發而移除殘餘的溶劑。令殘留物溶解於無水二氯甲烷(10mL)中並以於二氯甲烷(58mL)中之3%三氯乙酸進行處理。攪拌紅色溶液過夜，於攪拌期間產物結晶化。令漿液冷卻至-20℃、進行過濾，以及利用二乙醚來清洗。在真空中乾燥殘留物以得到灰白色的固體(5a)(1.10g,59%產率)。1H-NMR(CD3CN)δ 2.07(3H,s),2.33-2.38(1H,m),2.50-2.52(1H,m),3.63-3.64(2H,m),4.10(1H,bdd,J=3.1,5.1Hz),4.46(2H,d,J=6.0Hz),5.19-5.26(2H,m重疊),6.15(1H,t,J=7.0Hz),7.15(2H,tt,J=2.2,9.0 Hz),7.31-7.38(2H,m),8.79(1H,s),9.14(1H,bt,J=6.1Hz),11.95(1H,bs).19F-NMR(CD3CN)δ -116.02(tt,J=5.5,9.0Hz)).MS(m/z)針對C19H20FN3O7，計算值421.13；實驗值419.8[M-H]-.
5-((R)-2-呋喃甲基甲胺羰)-3'-O-乙醯基-2'-去氧脲嘧啶核苷(5b)。
由(4b)製備化合物(5b)，其係藉如製備(5a)之方法及藉由沉澱二氯甲烷及乙酸乙酯的混合物進行單離而得到白色固體(1.27g,73%產率)。1H-NMR(CDC13)δ 1.57-2.02(4H,m),2.12(3H,s),2.46-2.50(2H,m),3.03(1H,bs),3.43-3.64(2H,m),3.75-3.97(2H,m),3.78-4.10(3H.m),4.20-4.21(1H,m),5.40-5.42(1H,m),6.35(1H,dd,J=6.5,7.7Hz),8.91(1H,t,J=5.5Hz),9.17(1H,s),9.44(1H,bs).MS(m/z)針對C17H23N3O8，計算值397.15；實驗值396.1[M-H]-.
5-((S)-2-呋喃甲基甲胺羰)-3'-O-乙醯基-2’-去氧脲嘧啶核苷(5c)。
由(4c)製備化合物(5c)，其係藉如製備(5a)之方法及藉由沉澱二氯甲烷及二乙醚的混合物進行單離而得到略呈橙色固體(1.35g,77%產率)。1H-NMR(CDCl3)δ 1.57-2.03(4H,m),2.12(3H,s),2.47-2.51(2H,m),2.98(1H,bs),3.40-3.68(2H,m),3.78-3.95(2H,m),3.90-4.12(3H.m),4.20-4.21(1H,m),5.39-5.42(1H,m),6.33(1H,dd,J=6.7,7.4Hz),8.90(1H,t,J=5.5Hz),9.15(1H,s),9.37(1H,bs).MS(m/z)針對C17H23N3O8，計算值397.15；實驗值395.9[M-H]-.
5-(2-(4-嗎啉基)乙胺羰)-3'-O-乙醯基-2'-去氧脲嘧啶核苷(5d)。
令核苷(3d)(1.00g,1.37mmol)溶解於無水吡啶(10mL)及酸酐(1mL)之溶液中。攪拌溶液過夜及於真空中進行濃縮以得到3'-O-乙醯基-核苷。藉由與無水甲苯(10mL)共蒸發而移除殘餘的溶劑。令殘留物溶解於1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(20mL)中(Leonard,N.J.Tetrahedron Letters, 1995,36：7833)及於大約50℃加熱持續3小時。藉由tlc確認DMT基團的斷裂完成。藉倒入攪拌好的甲醇(200mL)而驟冷紅色溶液混合物。在真空中濃縮所得的黃色溶液以及令殘留物溶解於熱乙酸乙酯(20mL)中。於冷卻時產物結晶化及所得的漿液於-20℃老化，接著進行過濾並用乙酸乙酯清洗。3'-O-乙醯基-核苷(5d)經單離為白色固體(0.46g,79%產率)。1H-NMR(DMSO-d6)δ 2.07(3H,s),2.32-2.45(7H,m重疊),2.49-2.52(1H,m),3.33-3.40(2H,m),3.57(4H,t,J=4.5Hz),3.60-3.63(2H,m),4.09(1H,bdd,J=3.2,5.2Hz),5.17-5.25(2H,m),6.14(1H,t,J=7.0Hz),8.74(1H,s),8.89(1H,bt,J=5.4Hz),11.90(1H,bs).MS(m/z)針對C18H26N4O8，計算值426.18；實驗值425.0[M-H]-.
5-(2-(1-(3-乙醯基-苯并咪唑基))乙胺羰)-3'-O-乙醯基-2'-去氧脲嘧啶核苷(5e)。
如製備(5d)般製備化合物(5e)，除了於DMT-斷裂反應倒入甲醇時產物直接結晶化以外。藉由過濾而單離之二乙醯基核苷(5e)為白色固體(0.55g,78%產率)。1H-NMR(DMSO-d6)δ 2.07(3H,s),2.30-2.37(1H,m),2.49-2.52(1H,m),2.63(3H,s)3.33(1H,bs),3.55-3.64(4H,m重 疊),3.99(2H,t,J=6.4Hz),4.09(1H,bdd,J=2.3,5.2Hz),5.15-5.25(2H,m),6.13(1H,dd,J=6.3,7.6Hz),7.11(1H,ddd,J=1.2,7.6,7.9Hz),7.22(1H,ddd,J=1.2,7.6,7.9Hz),7.33(1H,dd,J=0.8,7.9Hz),8.02(1H,dd,J=0.8,8.0Hz),8.05(1H,bs),8.83(1H,bt),8.71(1H,s),11.87(1H,bs).MS(m/z)針對C23H25N5O9，計算值515.17；實驗值513.9[M-H]-.
實施例4 3'-O-乙醯基-核苷(5a-5d)之選擇性的合成
3'-O-乙醯基-核苷(5a-d)亦可由起始材料3'-O-乙醯基-5'-O-二甲氧三苯甲基-5-碘-2'-去氧脲嘧啶核苷(7)藉選擇性地途徑(流程2)而合成(Vaught,J.D.,Bock,C.,Carter,J.,Fitzwater,T.,Otis,M.,Schneider,D.,Rolando,J.,Waugh,S.,Wilcox,S.K.,Eatom,B.E.J.Am.Chem.Soc. 2010,132,4141-4151)。簡言之，參照流程2，鈀(II)-催化的碘化物之三氟乙氧羰化反應產生經活化的酯中間產物(8)。冷凝(8)與胺類(2a-d)(1.3當量、三乙基胺(3當量)、乙腈、60-70℃、2-24小時)，接著斷裂5'-O-DMT-保護機團(3%三氯乙酸/二氯甲烷或1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇、室溫)來產生(5a-d)，其與經由中間產物(3a-d)(流程1)所得到之產物相同。
3'-O-乙醯基-5'-O-二甲氧三苯甲基-5-(2,2,2-三氟乙氧基羰基)-2'-去氧脲嘧啶核苷(8)。以氬氣填充500mL之厚壁玻璃壓力反應器，及填入3'-O-乙醯基-5'-O-二甲氧三苯甲基-5-碘-2'-去氧脲嘧啶核苷(7)(15.9g,22.8mmol)、無水乙腈(200mL)、三乙基胺(7.6mL,54.7mmol)，以及2,2,2-三氟乙醇(16.4mL,228mmol)。劇烈攪拌所得的溶液並藉由抽真空至<100mmHg持續2分鐘來進行除氣。燒瓶填充有氬及加入雙(苯并腈)二氯鈀(II)(175mg,0.46 mmol)。再次除氣所得的黃色溶液，接著自氣體歧管填充一氧化碳(99.9%)(注意！此為有毒氣體)。當劇烈攪拌反應混合物時，維持壓力為1-10psi之CO，且於60-65℃加熱12小時。過濾冷卻的反應混合物(注意！此為有毒氣體)以移除黑色沉澱且在真空中進行濃縮。以二氯甲烷(120mL)及10%重碳酸鈉(80mL)分隔橙色的殘留物。以水(40mL)清洗有機層及以硫酸鈉來乾燥、進行過濾及濃縮以得到橙色泡沫(17g)。此粗製產物可被使用或進一步藉矽膠快速管柱層析法以30%己烷/1%三乙基胺/69%乙酸乙酯之洗提液來純化而得到為無色固體泡沫的(8)(12.7g,80%產率)。1H-NMR(CD3CN))δ 2.03(3H,s),2.37-2.56(2H,m),3.36-3.38(2H,m),3.78(6H,s),4.15-4.19(1H,m),4.37-4.55(2H,m),5.21-5.26(1H,m),6.09(1H,t,J=6.1Hz),6.84-7.46(13H,m),8.53(1H,s).19F-NMR(CD3CN)δ -74.07(t,J=8.8Hz).MS(m/z)針對C35H33F3N2O10，計算值698.21；實驗值697.4[M-H]-.
實施例5 核苷5'-O-三磷酸之合成
5-(4-氟苯甲基胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷-5'-O-三磷酸(參-三乙銨鹽)(6a)。藉由(500μmol-級(5x))Ludwig及Eckstein(Ludwig,J.and Eckstein,F.J.Org.Chem.1989,54：631)而由3'-O-乙醯基-核苷(5a)來合成三磷酸(6a)。於氨解及蒸發後，藉由陰離子交換管柱層析法將粗製三磷酸產物純化，如(以下)普通程序所說明者。
供三磷酸核苷之陰離子交換HPLC純化之普通程序。經由使用安裝在製備型HPLC系統上、於278nm進行偵測、填充有Source Q樹脂(GE Healthcare)之HPLC管柱的陰離子交換管柱層析法來純化三磷酸核苷。線性洗提梯度使用兩種緩衝液(緩衝液A：10mM三乙胺重碳酸鹽/10%乙腈，及緩衝液B：1M三乙胺重碳酸鹽/10%乙腈)，於洗提過程中，在室溫下，梯度由低緩衝液B含量移向高緩衝液B。所欲的產物普通為自管柱洗提出之最終物質，且為跨越約十至十二分鐘之停留時間的最寬峰值(較早的洗提產物包括各種反應副產物，最重要的為核苷二磷酸)。於產物洗提過程中收集數個分液。藉由(具有Waters對稱管柱(PN：WAT054215)之Waters 2795 HPLC)反相HPLC來分析各分液。含有純產物的分液(普通>90%)係於Genevac VC 3000D蒸發器中進行蒸發以產生淺棕褐色樹脂。於去離子水中重組分液共同用於最終分析。使用於278nm進行偵測之Hewlett Packard 8452A二極體陣列質譜儀之分析而實施產物定量。由等式A=εCL，其中A為UV吸光值、ε為估計的消光係數及L為光程(1cm)，來計算產率。
令粗製產物(6a)溶解於約5mL之緩衝液A中(表1：製備型-高效液相層析法，條件1)。各含有1mL此溶液之經過濾的等分之純化射入係注入至Waters 625 HPLC，其具有配合Resource Q 6mL管柱(GE Healthcare產品碼：17-1179-01)的486偵測器(移動相梯度為0%-100%緩衝液 B，以12mL/分鐘於50分鐘內進行洗提)。針對(6a)[ε估計13,700cm-1 M-1]，單離的經純化產物為130μmol(26%產率)。1H-NMR(D2O) 1.15(27H,t,J=7.3Hz),2.32-2.37(2H,m),3.07(18H,q,J=7.3Hz),4.06-4.17(3H,m重疊),4.42(2H,bd,J~0.7Hz),4.49-4.53(1H,m),4.70(>7H,bs,HOD),6.12(1H,t,J=6.8Hz),6.96-7.26(4H,m),8.45(1H,s).19F-NMR(D2O)δ -116.18(m).31P-NMR(D2O)δ -10.58(d,J=20Hz),-11.45(d,J=20Hz),-23.29(t,J=20Hz).MS(m/z)針對C17H21FN3O15P3，計算值619.02；實驗值618.0[M-H]-.
5-((R)-2-呋喃甲基甲胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷-5'-O-三磷酸(參-三乙銨鹽)(6b)。如製造(6a)般自3'-O-乙醯基-核苷(5b)來合成三磷酸(6b)。粗製產物(6b)係於Waters 2767製備系統之單一注入中以Waters 2489偵測器使用填 有196mL之Source 15Q樹脂(GE Healthcare產品碼：17-0947-05)之Waters AP-5(Waters PN：WAT023331,50mm x 100mm)管柱來進行純化。使用與上述相同的緩衝液，但洗提梯度係經修飾為25%至80%緩衝液B，以50mL/分鐘於90分鐘內進行洗提(表2：製備型-高效液相層析法，條件2)。於C18 HPLC管柱中實施第二純化以移除殘留的雜質(表4：製備型-高效液相層析法，條件4)。針對(6b)[ε估計10,200cm-1 M-1]，單離之經純化的產物為325μmol(65%產率)。1H-NMR(D2O) 1.17(27H,t,J=7.3Hz),1.49-1.63(1H,m),1.77-2.02(3H,m),2.34-2.39(2H,m),2.85-3.83(5H,m重疊),3.08(18H,q,J=7.3Hz),4.01-4.19(3H,m重疊),4.52-4.56(1H,m),4.70(>7H,bs,HOD),6.15(1H,t,J=6.8Hz),8.48(1H,s).31P-NMR(D2O)δ -10.50(d,J=20Hz),-11.51(d,J=20Hz),-23.25(t,J=20Hz).MS(m/z)針對C15H24FN3O16P3，計算值595.04；實驗值594.1[M-H]-.
5-((S)-2-呋喃甲基甲胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷-5'-O-三磷酸(參-三乙銨鹽)(6c)。如製造(6a)般自3'-O-乙醯基-核苷(5c)來合成三磷酸(6c)。粗製產物(6c)係於Waters 2767製備系統之單一注入中以Waters 2489偵測器使用填有196mL之Source 15Q樹脂(GE Healthcare產品碼：17-0947-05)之Waters AP-5(Waters PN：WAT023331,50mm x 100mm)管柱來進行純化。使用與上述相同的緩衝液，但洗提梯度係經修飾為25%至80%緩衝液B，以50mL/分鐘於90分鐘內進行洗提(表2：製備型-高效液相層析法，條件2)。於C18 HPLC管柱中實施第二純化以移除殘留的雜質(表4：製備型-高效液相層析法，條件4)。針對(6c)[ε估計10,200cm-1 M-1]，單離之經純化的產物為255μmol(51%產率)。1H-NMR(D2O) 1.17(27H,t,J=7.3Hz), 1.49-1.63(1H,m),1.78-2.01(3H,m),2.34-2.39(2H,m),2.85-3.82(5H,m重疊),3.09(18H,q,J=7.3Hz),4.01-4.19(3H,m重疊),4.52-4.56(1H,m),4.70(>7H,bs,HOD),6.15(1H,t,J=6.7Hz),8.48(1H,s).31P-NMR(D2O)δ -10.60(d,J=20Hz),-11.42(d,J=20Hz),-23.25(t,J=20Hz).MS(m/z)針對C15H24FN3O16P3，計算值595.04；實驗值594.1[M-H]-.
5-(2-(4-嗎啉基)乙胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷-5'-O-三磷酸(雙-三乙銨鹽)(6d)。如製造(6a)般自3'-O-乙醯基-核苷(5d)來合成三磷酸(6d)。利用與供(6a)所使用者相同的設備及緩衝液來純化粗製產物(6d)，但梯度經修飾為於50分鐘洗提期間內流過15%至60%的緩衝液B，以增進產物的分辨度(表3：製備型-高效液相層析法，條件3)。針對(6d)[ε估計10,200cm-1 M-1]，單離之經純化的產物為54μmol(11%產率)。1H-NMR(D2O) 1.17(18H,t,J=7.3Hz),2.37-2.41(2H,m),2.91-2.98(2H,m),3.09(12H,q,J=7.3Hz),3.20-3.27(4H,m),3.87-3.90(4H,m),3.63-3.68(2H,m),4.10-4.18(3H,m重疊),4.56-4.60(1H,m),4.70(>7H,bs,HOD),6.15(1H,bt,J=6.3Hz),8.48(1H,s).31P-NMR(D2O)δ -9.99(d,J=21Hz),-11.90(d,J=20Hz),-23.19(t,J=20Hz).MS(m/z)針對C16H27N4O16P3，計算值624.06；實驗值623.1[M-H]-.
5-(2-(N-苯并咪唑基)乙胺羰)-2'-去氧脲嘧啶核苷-5'-O-三磷酸(雙-三乙銨鹽)(6e)。如製造(6a)般自3'-O-乙醯基-核苷(5e)來合成三磷酸(6e)。利用與供(6a)所使用者相同的設備及緩衝液來純化粗製產物(6e)，但梯度經修飾為 於50分鐘洗提期間內流過15%至60%的緩衝液B，以增進產物的分辨度(表3.製備型-高效液相層析法，條件3)。針對(6e)[ε估計13,700cm-1 M-1]，單離之經純化的產物為101μmol(20%產率)。1H-NMR(D2O) 1.17(18H,t,J=7.3Hz),2.17-2.36(2H,m),3.09(12H,q,J=7.3Hz),3.60-3.73(2H,m),4.01(2H,t,J=5.4Hz),4.03-4.15(3H,m),4.45-4.50(1H,m),4.70(>7H,bs,HOD),6.04(1H,t,J=6.6Hz),6.95-7.12(4H,m),8.02(1H,s).31P-NMR(D2O)δ -10.35(d,J=20Hz),-11.40(d,J=20Hz),-23.23(t,J=20Hz).MS(m/z)針對C19H24N5O16P3，計算值671.04；實驗值670.1[M-H]-.
前述具體實施例及實施例係僅為實施例。無特定的具體實施例、實施例，或特定具體實施例或實施例的元素被視為申請專利範圍之關鍵的、需要的或必要的元件或特徵。此外，沒有本文所述的元件必須用於後附申請專利範圍的實施，除非表示元件為"必要的"或"關鍵的"。在不悖離本發明之範圍下(由後附申請專利範圍所定義)，可對揭露的具體實施例進行各種變化、修飾、取代及其他改變。本說明書，包括實施例，被視為闡述目的而非限制性目的，且所有此等修飾及取代被視為包括於本發明之範圍內。因此，本發明應由後附申請專利及其等效物，而非以上提供的實施例，來決定範圍。例如，方法或程序請求項所記載的任何步驟可依任何可行的順序執行，而不受限於具體實施例、實施例或請求項所提出之順序。

Claims (4)

  1. 一種C-5經修飾之胺基羰基嘧啶，其具有下式結構： 其中R'係選自-H、-Ac、-Bz、-CH2CH2OCH3、-C(O)CH2OCH3、-P[N(iPr)2)](OCH2CH2CN)或-SiMe2tBu；R"係選自H、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)或三磷酸(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)或彼之鹽；X係選自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3或-疊氮基；R係選自-(CH2)n-RX1；RX1係選自 RX4係腈(CN)；且n=0至10。
  2. 如請求項1之C-5經修飾之胺基羰基嘧啶，其中n係1、2或3。
  3. 如請求項1之C-5經修飾之胺基羰基嘧啶，其中R'係-P[N(iPr)2)](OCH2CH2CN)。
  4. 如請求項1之C-5經修飾之胺基羰基嘧啶，其中 R"係三磷酸(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)。
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