EA022429B1 - АПТАМЕРЫ К β-NGF И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ β-NGF-ОПОСРЕДОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ - Google Patents

АПТАМЕРЫ К β-NGF И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ β-NGF-ОПОСРЕДОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ Download PDF

Info

Publication number
EA022429B1
EA022429B1 EA201291034A EA201291034A EA022429B1 EA 022429 B1 EA022429 B1 EA 022429B1 EA 201291034 A EA201291034 A EA 201291034A EA 201291034 A EA201291034 A EA 201291034A EA 022429 B1 EA022429 B1 EA 022429B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
aptamer
νορ
sequence
specified
aitamer
Prior art date
Application number
EA201291034A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201291034A1 (ru
Inventor
Дэниел Дж. Шнайдер
Акихико Хисаминато
Шила Уо
Дэниел Резников
Акира Нагабукуро
Тосихиде Оно
Original Assignee
Сомалоджик, Инк.
Оцука Фармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сомалоджик, Инк., Оцука Фармасьютикал Ко., Лтд. filed Critical Сомалоджик, Инк.
Publication of EA201291034A1 publication Critical patent/EA201291034A1/ru
Publication of EA022429B1 publication Critical patent/EA022429B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/067—Pyrimidine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/073—Pyrimidine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/167—Purine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/173—Purine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Описание в общем связано с нуклеиновыми кислотами, более конкретно - с аптамерами, способными связываться с β-NGF; с фармацевтическими композициями, содержащими такие аптамеры к β-NGF; и со способами их изготовления и их применения.

Description

Область изобретения
Настоящее описание в целом связано с областью нуклеиновых кислот, более конкретно - с аптамерами, способными связываться с фактором роста нервов, более конкретно - с β-субъединицей фактора роста нервов (β-ΝΟΡ), пригодными в качестве терапевтических средств для предотвращения, лечения или улучшения состояния при зуде (почесухе), патологических состояниях, сопровождающихся зудом, и/или других заболеваниях или состояниях, в развитие которых вовлечен β-ΝΟΡ. Кроме того, описание настоящего изобретения связано с материалами и способами введения аптамеров, способных связываться с β-ΝΟΡ.
Предшествующий уровень техники
В последующем описании представлена краткая информация, относящаяся к настоящему изобретению, и в нем не предусмотрено, чтобы какая бы то ни было представленная в нем информация или указанные здесь публикации были отнесены к предшествующему по отношению к настоящему изобретению уровню техники.
Тяжелый зуд ежедневно отрицательно сказывается на качестве жизни миллионов людей. Тяжелый зуд может быть ассоциирован с разными состояниями здоровья, включая состояния кожного зуда, такие как чесотка, экзема, ксероз, псориаз и крапивница, а также с системными заболеваниями, включая хронический гепатит или почечное заболевание или лимфому. Сходным образом, боль является общим проявлением, являясь одной из основных причин визитов к врачу. Боль может быть ассоциирована с многочисленными типами повреждений или состояний, и неудача в лечении острой боли может привести к развитию хронической боли, а также к иммунным и метаболическим расстройствам. Помимо ухудшения качества жизни индивида, страдающего от зуда и/или боли, это существенно сказывается на бюджете здравоохранения, в частности, в связи с состояниями кожного зуда, а также с хроническими кожными расстройствами. В настоящее время попытки контролировать или лечить зуд и/или боль многими признаются неадекватными.
Научные исследования по нейрофизиологии подтвердили отличие метаболических путей при зуде от путей метаболизма при развитии боли. Чувствительность к зуду воспринимается и передается специализированными С-нейронами, которые отличаются от болевых рецепторов, которые обусловливают чувствительность к боли (БсЬтек, №иго8С1. ВюЪеЬау. Ксу. бо1:10.1016/).пеиЫогеу.2008.12.004, 2009). Затем специализированные С-нейроны передают стимул зуда на специализированный класс нейронов заднего рога, проецируемых на таламус (81апбег апб 8с1ипе1/. Еиг. 1. Ра1п, 10: 473, 2006). Утверждается, что на окончаниях периферических нервов нет специального рецептора зуда, и специфичность С-нейронов зуда обусловлена их спинномозговыми связями с метаболическими путями при зуде. Между проявлениями зуда и боли наблюдаются различия в характере активации мозга, такие как отсутствие заметной активации таламической и соматосенсорной коры теменной доли головного мозга при ощущении зуда (ΥοδίρονίΐΛ е! а1., Ьапсе!, 361: 690, 2003).
Обычно боль классифицируется либо как острая, либо как хроническая. Острая боль обычно является ответом на повреждение ткани, характеризующимся кратковременностью, и она рассасывается, как только заживает первоначальное повреждение. Хроническая боль является персистирующей, при этом может не наблюдаться видимой связи с травмирующим событием. Кроме того, боль, включая ноцицептивную и неноцицептивную, может быть классифицирована на основе механистической природы боли. Ноцицептивная боль опосредована специфическими рецепторами (ноцицептивные рецепторы), которые активируются специфическим стимулом (повреждением, воспалением, химическим стимулом и т.п.). Ноцицептивная боль может дополнительно быть классифицирована как соматическая или висцеральная.
Соматическая боль возникает в таких тканях, как кожа, мышцы, суставы, кости или связки. Соматическая боль обычно является острой и локализованной. Современные способы лечения включают применение опиоидов и нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (ΝδΆΙΌ). Висцеральная боль возникает во внутренних органах. Зачастую она является слаболокализованной болью, и обычно ее лечат с помощью опиоидов.
Неноцицептивная боль может быть дополнительно подразделена на невропатическую или симпатическую. Невропатическая боль может возникать в периферической или центральной нервной системе. Невропатическая боль может быть ассоциирована с дегенеративными состояниями, воспалением или с инфекционными заболеваниями. Такой тип боли приводит к гиперчувствительности (гипералгезии) и зачастую описывается как прострел или жгучая боль. Варианты лечения включают антагонисты Ν-метил-Э-аспартата (ΝΜΌΆ), противоаритмические средства, противоконвульсивные средства или ан- 1 022429 тидепрессанты. Невропатическая боль часто резистентна к действию обычно применяемых анальгетиков. Симпатическая боль возникает в симпатической нервной системе, а также в периферической и центральной нервной системах, и обычно она ассоциирована с определенным типом повреждения. На месте повреждения может проявляться повышенная гиперчувствительность и аномальная температура. Лечение обычно включает схему многократного приема нескольких лекарственных средств, включая блокаторы симпатических нервов, вазодилятаторы, противоконвульсивные средства, противоаритмические средства и антидепрессанты.
Общепринятое и пролонгированное лечение боли опиоидными анальгетиками не рекомендуется из опасений, что потенциально возможны привыкание, побочные эффекты, толерантность и зависимость от опиоидов. Побочные эффекты опиоидов могут включать тошноту, рвоту, запоры, угнетение дыхания и т.д. В сочетании со многими современными способами лечения возможны отсутствие эффективности, тяжелые побочные эффекты и несостоятельность способов доставки лекарственных средств в оказании помощи в адекватном устранении боли. Указанные проблемы подчеркивают необходимость в более совершенной терапии в отношении устранения боли.
Несмотря на то что зуд и боль представляют собой совершенно разные ощущения, между зудом и болью имеются важные взаимосвязи. Хорошо известно, что зуд можно уменьшить провоцирующим боль ощущением, вызываемым расчесыванием. Кроме того, анальгетики, такие как опиоиды, действуя путем уменьшения болевых ощущений, на самом деле могут усиливать ощущение зуда. Таким образом, некоторые терапевтические средства в отношении боли могут обострять симптомы зуда, что дополнительно свидетельствует о необходимости в улучшении терапевтических средств, способных оказывать лечебное воздействие как в отношении зуда, так и в отношении боли.
Фактор роста нервов (ΝΟΡ) относится к семейству нейротрофических цитокинов, или нейротрофинов. Нейротрофины играют ключевую роль в развитии и поддержании периферической и центральной нервной системы путем регуляции выживаемости клеток, их дифференцировки и апоптоза. Помимо указанных функций нервной системы, ΝΟΡ, как было показано, усиливает высвобождение гистамина, продуцирование тучных клеток, а также рост и дифференцировку В-лимфоцитов. Было показано также, что ΝΟΡ модулирует базофильную продукцию определенных липидных медиаторов. Апоптоз нейтрофилов может также быть подавлен воздействием ΝΟΡ. Все указанные факторы свидетельствуют о роли ΝΟΡ в иммунной системе, а также в нервной системе.
Только бета-цепь ΝΟΡ (β-ΝΟΡ) ответственна за активность
ΝΟΡ, стимулирующую рост нервов. В клетке β-ΝΟΡ существует в виде димера и связывается с двумя типами рецепторов клеточной поверхности в нервных и не нервных клетках. Третичная структура указанного белка основана на трех цистеиновых дисульфидах и двух антипараллельных β-цепях. Аминокислотная гомология между белками человека, мыши и крысы составляет приблизительно 90%. β-ΝΟΡ, как и все нейротрофины, связывается с клеточным рецептором р75 с наномолярной (нМ) аффинностью. β-ΝΟΡ связывается также с одним из тирозинкиназных рецепторов (Тгк), в частности ТгкА, с пикомолярной (пМ) аффинностью. Реакция с рецептором р75 может вызвать гибель клетки, тогда как связывание с ТгкА способствует выживанию клеток. Связывание β-ΝΟΡ с ТгкА приводит к фосфорилированию рецептора и внутриклеточных белков. β-ΝΟΡ интернализируется путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Рецепторы Тгк обнаруживаются во многих не нервных тканях.
Фактор роста нервов (ΝΟΡ), высвобождаемый из кератиноцитов в коже, является одним из основных медиаторов, которые повышают дермальную плотность нервов и действуют на морфологию, помимо прочего, стимулируя прорастание нервных волокон (5>с1ипс1/. №иго8ск ВюЪекау. Кеу. 6οί: 10.1016/_).пеиЪюгеу.2008.12.004, 2009). Было обнаружено, что у пациентов с хроническим зудом повышена интрадермальная плотность нервных волокон. Кроме того, было обнаружено, что ΝΟΡ повышает чувствительность периферических нейронов, помимо прочего, путем запуска рецептора ΝΟΡ, тирозинкиназы ТгкА (Шапбег апб §сЬтек, Еиг. 1. Раш, 10: 473, 2006).
Важная роль ΝΟΡ в опосредовании зуда, а также боли проявляется в высоких концентрациях ΝΟΡ, измеряемых в атопических условиях, которые могут служить симптомами как зуда, так и боли. Пациенты с атопическим дерматитом имеют существенно повышенные уровни ΝΟΡ в сыворотке, которые положительно коррелируют с тяжестью состояния. Пациенты с контактным дерматитом имеют более повышенные локальные концентрации ΝΟΡ, а у пациентов с узловатой почесухой также выявляются более высокие уровни ΝΟΡ и уровни активации ТгкА (§сЬтек, №иго8ск ВюЪекау. Ксу. бок
10.1016/ .пеиЪюгеу.2008.12.004, 2009).
Были исследованы эффекты анти-NΟΡ-антител, вводимых системно путем внутрибрюшинной инъекции, в отношении симптомов на мышиных моделях атопического дерматита, и результаты дают основания предполагать, что анти-NΟΡ-антитела блокируют эффекты ΝΟΡ на периферии нервной системы и подавляют эпидермальную иннервацию, дерматит и расчесывание (Такапо е1 а1. 1. Ркагтасок 8ск, 99: 277: 284, 2005). Кроме того, в указанном исследовании было обнаружено, что анти-NΟΡ-антитела не вызывают изменения сывороточных уровней ΝΟΡ, они не снижали концентрацию ΝΟΡ в тестированных участках кожи и не вызывали полное устранение расчесывания. Таким образом, остается потребность в
- 2 022429 более полном ослаблении или устранении расчесывания, ассоциированного с атопическим дерматитом.
Все больше данных указывает на то, что ΝΟΡ функционирует в качестве медиатора определенных болевых состояний. Было показано, что анти^ОР-антитела могут вызывать длительный термический и химический анальтезирующий эффект, а также блокировать гипералгезию, которая развивается при каррагенан-индуцированном воспалении (МсМайоп е! а1., Ναι. Меб. 1: 774, 1995). Исследования низкомолекулярных антагонистов рецепторов ΝΟΡ в отношении блокирования биологической активности ΝΟΡ выявили наличие анальтезирующего эффекта при невропатических состояниях и состояниях воспаления, сопровождающихся болью (О\Уо1аЫ е! а1., 1. РЬагшасоР Ехр. ТНег. 289: 1271, 1999)). В исследовании О\Уо1аЫ е! а1. показано, что анальтезирующий эффект низкомолекулярного ингибитора активности ΝΟΡ может быть слабее эффекта морфина, в зависимости от пути введения. Поскольку опиоиды, такие как морфин, оказывают много нежелательных побочных эффектов, остается потребность в обеспечении обезболивания при различных болевых состояниях, опосредованных ΝΟΡ, которое было бы более гибким в выборе пути введения.
Краткое описание изобретения
Настоящее описание связано с различными аптамерами, которые связываются с бета-субъединицей фактора роста нервов, индивидуально упоминаемыми здесь как аптамер к β-ΝΟΡ, или β-ΝΟΡ-аптамер, и со способами применения таких аптамеров, как β-ΝΟΡ, для лечения β-ΝΟΡопосредованных заболеваний и расстройств, включая лечение боли и зуда, а также состояний, ассоциированных с зудом. Включены также фармацевтические композиции или составы, содержащие β-ΝΟΡ или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
Композиции согласно настоящему описанию могут быть получены в виде любой из фармацевтически приемлемых лекарственных форм. Описанные здесь композиции и дозы подобраны с таким расчетом, чтобы максимализировать клиническую эффективность при лечении различных состояний, таких как боль и зуд, а также состояний, ассоциированных с зудом, и при этом одновременно снизить или минимизировать нежелательные побочные эффекты.
Кроме того, настоящее описание связано со способами предотвращения (профилактики), лечения или улучшения состояния при заболевании или состоянии, опосредованном β-ΝΟΡ, где указанные способы включают введение аптамера к β-ΝΟΡ или фармацевтической композиции аптамера к β-ΝΟΡ позвоночному, в частности, млекопитающему, более конкретно, человеку. В частности, настоящее описание связано со способами лечения, предотвращения или ослабления боли и зуда, а также состояний, ассоциированных с зудом. В определенных аспектах β-ΝΟΡ-опосредованное заболевание или состояние является заболеванием или состоянием, при которых активность β-ΝΟΡ может непосредственно или опосредованно вызывать зуд на определенных стадиях заболевания. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или состоянием, которое предполагается лечить, предотвратить или облегчить, является дерматит или экзема. В других вариантах осуществления заболеванием или состоянием, которое предполагается лечить, предотвратить или облегчить, является атопический дерматит.
В одном из вариантов осуществления терапевтический эффект (например, лечение, профилактика или облегчение боли и состояний, ассоциированных с зудом) может быть достигнут путем введения аптамера к β-ΝΟΡ, так, чтобы аптамер был экспонирован и мог бы связываться с β-ΝΟΡ, независимо от способа введения указанного аптамера подвергаемому лечению пациенту. В аналогичном варианте осуществления терапевтический эффект может быть достигнут путем введения аптамера к β-ΝΟΡ, так, чтобы он был экспонирован и связывался с β-ΝΟΡ, и таким образом предотвращал бы или уменьшал бы связывание β-ΝΟΡ с одним или несколькими из его различных клеточных рецепторов. В одном из вариантов осуществления указанным клеточным рецептором является р75. В другом варианте осуществления указанным клеточным рецептором является рецептор Тгк. Еще в одном из вариантов осуществления указанным клеточным рецептором является ТгкА. В другом варианте осуществления аптамер к β-ΝΟΡ предотвращает или снижает уровень фосфорилирования рецептора β-ΝΟΡ и других внутриклеточных белков.
Предлагаемые способы включают введение аптамера к β-ΝΟΡ в сочетании с одним или несколькими вторичными активными средствами. Такое введение может быть последовательным или в составе сочетанной композиции.
В другом аспекте в настоящем описании предложен способ диагностики ίη νίΐτο, включающий приведение аптамера к β-ΝΟΡ в контакт с образцом, в котором подразумевается наличие β-ΝΟΡ. В другом аспекте в настоящем описании предложен способ диагностики ίη νίνο, включающий соответствующим образом меченный аптамер к β-ΝΟΡ, инъецирование указанного аптамера индивиду, у которого подразумевается наличие β-ΝΟΡ-опосредованного заболевания или расстройства, и детектирование меченого аптамера с целью диагностики или оценки состояния здоровья указанного индивида. Используемая метка будет выбрана в соответствии с модальностью изображения, которая будет использована.
- 3 022429
Краткое описание графического материала
На фиг. 1 приведены кривые связывания аптамера 2426-66 () (8ЕО ГО N0: 1) в сравнении со случайно выбранной библиотекой (о).
На фиг. 2А и 2В изображены аптамерные консенсусные последовательности, идентифицированные с помощью секвенирования-454 для аптамера 2426-66 (8Е0 ГО N0: 1).
На фиг. 3 проиллюстрирована стратегия димеризации #1 для аптамера к β-ΝΟΡ.
На фиг. 4 проиллюстрирована стратегия димеризации #2 для аптамера к β-ΝΟΡ.
На фиг. 5 графически проиллюстрирована способность различных аптамеров ингибировать индуцированную человеческим β-ΝΟΡ дифференцировку клеток РС12, тестируемую путем анализа роста нейрита, описанного в примере 4.
На фиг. 6 графически проиллюстрировано ингибирование β-ΝΟΡ-опосредованного роста нейрита как функция от концентрации аптамера 2426-66 () (8Е0 ГО N0: 1) и усеченного варианта 2426-66-50 (о) (8Е0 ГО N0: 2), измеряемое так, как описано в примере 4.
На фиг. 7 графически проиллюстрировано ингибирование роста нейрита, опосредованного человеческим β^ΟΡ, мышиным β^ΟΡ и крысиным β^ΟΡ, под действием аптамера 2426-66 (8Е0 ГО N0: 1) и усеченных вариантов 2426-66-50 (8Е0 ГО N0: 2) и 2426-66-53 (8Е0 ГО N0: 43). Все три аптамера ингибировали мышиный β^ΟΡ приблизительно с такой же эффективностью, что и человеческий β^ΟΡ, а крысиный β^ΟΡ ингибировали в меньшей степени.
На фиг. 8 графически проиллюстрированы результаты анализа фосфорилирования ТгкА, предпринятого с помощью аптамеров 2426-66 (8Е0 ГО N0: 1) и усеченных вариантов 2426-66-50 (8Е0 ГО N0: 2) и 2426-66-3 (8ЕО ГО N0: 5).
На фиг. 9 графически проиллюстрирован анализ фосфорилирования ТгкА в случае усеченного аптамера 2426-66-50 (8Е0 ГО N0: 2) с использованием мышиного и крысиного β^ΟΡ.
На фиг. 10 изображены С-5-пиримидиновые модификации, используемые для получения описанных здесь аптамеров.
На фиг. 11 графически проиллюстрировано уменьшение частоты почесывания через четыре недели у больных мышей, обработанных аптамером 2426-66-50 (8Е0 ГО N0: 2) <·) , в отличие от необработанных мышей () или мышей, обработанных гидрофильной мазью (НО, ЬуйгорЬШс оиИтсШ) (4) , как описано в примере 5. Статистически достоверные различия (р<0,05) наблюдались между группой обработки аптамером и группой необработанных мышей (*) или между группой обработки аптамером и группой обработки НО (#) на основании ΐ-теста.
На фиг. 12 графически проиллюстрировано снижение количественных клинических показателей состояния кожи через четыре недели у больных мышей, обработанных аптамером 2426-66-50 (8Е0 ГО N0: 2), (*) , в отличие от необработанных мышей () или мышей, обработанных НО (4), как описано в примере 5. Статистически достоверные различия (р<0,05) наблюдались между группой обработки аптамером и группой необработанных мышей (*) или между группой обработки аптамером и группой обработки НО (#),на основании ΐ-теста.
Подробное описание изобретения
Далее последует подробное описание репрезентативных вариантов осуществления настоящего изобретения. Несмотря на то что изобретение будет описано в отношении приведенных здесь вариантов осуществления, очевидно, что указанные варианты осуществления не предназначены для ограничения объема, охватываемого данным изобретением. Наоборот, подразумевается, что настоящее изобретение распространяется на все альтернативные варианты, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем, охватываемый данным изобретением, что определяется формулой изобретения.
Специалистам в данной области известно много способов и веществ, сходных с описанными здесь или с их эквивалентами, которые могут быть использованы в рамках практического применения настоящего изобретения. Настоящее изобретение никоим образом не ограничено описанными здесь способами и материалами.
Если специально не указано иное, используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно под ними подразумевается специалистом (специалистами) в той области, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то что любые способы, устройства и материалы, сходные или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы при реализации или тестировании настоящего изобретения, далее будут описаны предпочтительные способы, устройства и материалы.
Все цитируемые в настоящем описании публикации, опубликованные патентные документы и патентные заявки являются путеводителем для специалистов в той области, к которой относится настоящее описание. Все цитируемые здесь публикации, опубликованные патентные документы и патентные заявки включены в настоящее описание в такой же степени, как и в случае, если бы каждая из этих указанных публикаций, опубликованных патентных документов или патентных заявок была бы индивидуально и специфически указана как включенная в полном объеме в настоящее описание в виде ссылки.
- 4 022429
В настоящем описании, включая и прилагаемую формулу изобретения, используемые формы единственного числа относятся, если контекстом конкретно не продиктовано иное, также и ко множественному числу, и их используют взаимозаменяемо с выражениями по меньшей мере один и один или более. Таким образом, указание на аптамер включает смесь аптамеров и т.п.
Здесь термин приблизительно представляет собой неопределенную модификацию или вариацию числового значения, такую, что при этом основная функция объекта, к которому относится указанное числовое значение, остается неизменной.
Подразумевается, что используемый здесь в отношении множества элементов термин каждый относится по меньшей мере к двум из указанных элементов. Необязательно требовать, чтобы все из элементов, образующих указанное множество, удовлетворяли связанному с ними дополнительному ограничению.
Здесь подразумевается, что термины содержит, содержащий, включает, включая, включает, включающий и любые их варианты охватывают неэксклюзивное включение, способ, продукт, получаемый этим способом, или композицию согласно изобретению, которая включает или содержит элемент или список элементов, включает не только указанные элементы, но может включать также и другие элементы, специально не перечисленные или присущие такому способу, продукту, полученному указанным способом, или композицией согласно изобретению.
Здесь термин нуклеотид относится к рибонуклеотиду или дезоксирибонуклеотиду, или к их модифицированной форме, а также к их аналогу. Нуклеотиды включают виды, которые содержат пурины (например, аденин, гипоксантин, гуанин, также как и их производные и их аналоги), а также пиримидины (например, цитозин, урацил, тимин, а также их производные и их аналоги).
Здесь нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид используются взаимозаменяемым образом для обозначения полимера из нуклеотидов и включают ДНК, РНК, гибриды ДНК/РНК, а также модификации указанных разновидностей нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов и полинуклеотидов, при этом сюда входит также присоединение разных элементов или фрагментов к нуклеотидному соединению в любом положении. Термины полинуклеотид, олигонуклеотид и нуклеиновая кислота включают двух- или одноцепочечные молекулы, а также молекулы, образующие тройную спираль. Нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид являются более широкими терминами, чем термин аптамер, и, таким образом, термины нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид включают полимеры нуклеотидов, которые являются аптамерами, однако термины нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид не ограничены аптамерами.
Здесь термины модифицировать, модифицированный, модификация и любые их вариации, используемые в отношении олигонуклеотида, означают, что по меньшей мере одно из четырех составляющих нуклеотидных оснований (т.е. А, О, Т/и и С) олигонуклеотида является аналогом или сложным эфиром встречающегося в природе нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеотид придает олигонуклеотиду резистентность к нуклеазе. Пиримидин с замещением в Соположении является примером модифицированного нуклеотида. Модификации могут включать модификации остова, метилирование, необычные комбинации спаривания оснований, такие как изомерные основания изоцитидина и изогуанидина и т.д. Модификации могут также включать 3'- и 5'-модификации, такие как кэппинг. Другие модификации могут включать замену одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидными модификациями, такими, например, как модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, сложные фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т.д.) и модификации с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), модификации с интеркаляторами (например, акридин, псорален и т.д.), модификации, содержащие хелатообразующие соединения (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), модификации, содержащие алкилирующие вещества, и модификации с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих на сахаре нуклеотида, может быть заменена на фосфонатную группу или фосфатную группу; защищена стандартными защитными группами или активирована с целью получения дополнительных связей с добавочными нуклеотидами или с твердой подложкой. 5'- и З'-Концевые ОН-группы могут быть фосфорилированы или замещены аминами, фрагментами органических кэппинг-групп, содержащими от приблизительно 1 до приблизительно 20 атомов углерода, полимерами полиэтиленгликоля (ПЭГ) согласно одному из вариантов осуществления, составляющими от приблизительно 10 до приблизительно 80 кДа, полимерами ПЭГ согласно другому варианту осуществления, составляющими от приблизительно 20 до приблизительно 60 кДа, или другие гидрофильные или гидрофобные полимеры. В одном из вариантов осуществления модификациями являются модификации в С-5положении пиримидинов. Указанные модификации могут быть получены путем непосредственного связывания амида в С-5-положении или посредством других типов связей.
Полинуклеотиды могут содержать также аналогичные формы сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые в общем известны в данной области, включая 2'-О-метил-, 2'-О-аллил, 2'-фторо- или 2'-азидорибозу, аналоги карбоциклических сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические
- 5 022429 аналоги и абазические нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Как было указано выше, одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связывающими группами. Указанные альтернативные связывающие группы включают варианты осуществления, при которых фосфат заменен на Р(О)8 (тиоат), Р(8)8 (дитиоат), (Θ)ΝΚ2 (амидат), Р(О)К, Р(О)ОК', СО или СН2 (формацеталь), в которых каждый К или К' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С), необязательно содержащий эфирную (-О-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Необязательно, чтобы все связи в полинуклеотиде были идентичными. Замена аналогичных форм сахаров, пуринов и пиримидинов может оказаться благотворной в создании конечного продукта, поскольку могут образоваться альтернативные структуры остова, например, наподобие полиамидного остова.
Здесь термин С-5-модифицированный пиримидин относится к пиримидину с модификацией в С-5-положении, включая, но не ограничиваясь, те фрагменты, которые проиллюстрированы на фиг. 10. Примеры С-5-модифицированного пиримидина включают таковые, описанные в патентах США № 5719273 и 5945527, а также в предварительной заявке США с серийным № 61/264,545, поданной 25 ноября 2009 г., под названием ШеКахс РейШаШ О11допис1еоййе8. Примеры С-5-модификации включают замену дезоксиуридина в положении С-5 заместителем, независимо выбранным из бензилкарбоксиамида (альтернативно, бензиламинокарбонила) (Вп), нафтилметилкарбоксиамида (альтернативно, нафтилметиламинокарбонила) (Ναρ), триптаминокарбоксиамида (альтернативно, триптаминокарбонила) (Тгр) и изобутилкарбоксиамида (альтернативно, изобутиламинокарбонила) (Ши), как проиллюстрировано непосредственно ниже.
Химические модификации С-5-модифицированного пиримидина могут также быть совмещены с сахаром, модифицированным в одном положении, или в любой комбинации с сахаром, модифицированным в 2'-положении, с модификациями в экзоциклических аминах и заменами 4-тиоуридина и т.п.
Репрезентативные С-5-модифицированные пиримидины включают
5-^-бензилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридин (ВпбИ),
5-^-бензилкарбоксиамид)-2'-О-метилуридин,
5-^-бензилкарбоксиамид)-2'-фторуридин,
5-^-изобутилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридин (Юиби),
5-(Ν-изобутилкарбоксиамид) -2' -О -метилуридин,
5-^-изобутилкарбоксиамид)-2'-фторуридин,
5-^-триптаминокарбоксиамид)-2'-дезоксиуридин (ТтрбИ),
5-^-триптаминокарбоксиамид)-2'-О-метилуридин,
5-^-триптаминокарбоксиамид)-2'-фторуридин,
5-^-[1-(3-триметиламмоний)пропил]карбоксиамид)-2'-дезоксиуридинхлорид,
5-^-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридин (Ναράυ).
5-^-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-О-метилуридин,
5-^-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-фторуридин или
5-^-[1-(2,3-дигидроксипропил)]карбоксиамид)-2'-дезоксиуридин.
Модификация нуклеотидной структуры, если таковая имеет место, может быть осуществлена до или после сборки полимера.
Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть прерван ненуклеотидными компонентами. Кроме того, полинуклеотид может быть модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с меченым компонентом.
Здесь термин по меньшей мере один пиримидин, когда он относится к модификациям нуклеиновой кислоты, относится к одному, нескольким или же всем пиримидинам в нуклеиновой кислоте, что указывает на то, что любой или все из числа С, Т или и в нуклеиновой кислоте могут быть модифицированы или не модифицированы.
Здесь нуклеиново-кислотный лиганд, аптамер и клон используются взаимозаменяемым образом для обозначения не встречающейся в природе нуклеиновой кислоты, которая оказывает требуемое воздействие на молекулу-мишень. Требуемое воздействие включает, но не ограничено связыванием с
- 6 022429 мишенью, каталитическим изменением мишени, реагированием с мишенью таким образом, чтобы модифицировалась или изменялась мишень или функциональная активность мишени, ковалентным прикреплением к мишени (как в случае суицидного ингибитора) и облегчением реакции между мишенью и другой молекулой. В одном из вариантов осуществления указанное воздействие представляет собой специфическую аффинность связывания с молекулой-мишенью, при этом такая молекула-мишень представляет собой трехмерную химическую структуру, отличную от полинуклеотида, который связывается с нуклеиново-кислотным лигандом посредством механизма, который не зависит от спаривания оснований по Уотсону/Крику или образования тройной спирали, где указанный аптамер не является нуклеиновой кислотой, имеющей известную физиологическую функцию при связывании с молекулой-мишенью. Аптамеры к данной мишени включают нуклеиновые кислоты, которые идентифицируют из смеси нуклеиновых кислот-кандидатов, где аптамер является лигандом мишени, посредством способа, включающего:
(a) приведение смеси молекул-кандидатов в контакт с мишенью, при этом нуклеиновые кислоты, имеющие повышенную аффинность в отношении мишени, по сравнению с другими нуклеиновыми кислотами в смеси молекул-кандидатов, могут быть отделены от остальных молекул-кандидатов в смеси;
(b) отделение нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью от остальной смеси молекулкандидатов и (c) амплификацию нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью с получением лигандобогащенной смеси нуклеиновых кислот, посредством чего идентифицируют аптамеры молекулымишени.
Считается, что аффинность взаимодействий является понятием, характеризующимся степенью выраженности; однако в данном контексте специфическая аффинность связывания аптамера с его мишенью означает, что указанный аптамер связывается со своей мишенью обычно со значительно более высокой степенью аффинности, чем он связывается с другими компонентами, не являющимися мишенями, в смеси или в образце. Аптамер или нуклеиново-кислотный лиганд представляет собой набор копий одного типа или вида молекулы нуклеиновой кислоты, которая имеет конкретную нуклеотидную последовательность. Аптамер может включать любое подходящее число нуклеотидов. Аптамеры относятся к более чем одному такому набору молекул. Различные аптамеры могут иметь либо одинаковое либо разное количество нуклеотидов. Аптамеры могут представлять собой ДНК или РНК и могут быть одноцепочечными, двухцепочечными или содержать двухцепочечные участки или участки тройной спирали.
Здесь протеин, или белок, используется синонимично с пептидом, полипептидом или пептидным фрагментом. Очищенный полипептид, протеин, белок, пептид или пептидный фрагмент, по существу, свободен от клеточного материала или других контаминирующих белков из клетки, ткани или бесклеточного источника, из которого получена аминокислотная последовательность, или, по существу, свободен от химических предшественников или других химикалий, в случае химического синтеза.
Здесь модулировать означает изменять либо в сторону увеличения, либо уменьшения уровня пептида или полипептида или означает изменять либо в сторону увеличения, либо уменьшения стабильности или активности пептида или полипептида.
Термин ингибировать означает понизить уровень пептида или полипептида или уменьшить стабильность или активность пептида или полипептида. Здесь подразумевается, что белок, модуляцию или ингибирование которого осуществляют, представляет собой β-ΝΟΡ.
Здесь термин биологическая активность указывает на эффект в отношении одного или нескольких клеточных или внеклеточных процессов (например, путем связывания, передачи сигнала и т.д.), который может оказывать влияние на физиологические или патофизиологические процессы.
Здесь термины фактор роста нервов, ΝΟΡ и ”[бета]^ОР относятся к бета-субъединице фактора роста нервов и его вариантов, которые хотя бы частично сохраняют активность ΝΟΡ. Здесь ΝΟΡ включает нативные последовательности ΝΟΡ всех видов млекопитающих, включая человеческие, собачьи, кошачьи, мышиные, последовательности приматов, лошадиные и бычьи последовательности.
Здесь рецептор ΝΟΡ относится к полипептиду, который связывается или активируется посредством ΝΟΡ. Рецепторы ΝΟΡ включают рецептор ТгкА и рецептор р75 любого вида млекопитающего, включая человека, собаку, кошку, мышей или крыс, лошадей, приматов и жвачных животных, но не ограничиваясь ими.
Аптамер β-ΝΟΡ представляет собой аптамер, который способен связываться с β-ΝΟΡ и модифицировать его активность. Здесь аптамер β-ΝΟΡ относится к аптамеру, который способен связываться с β-ΝΟΡ и/или ингибировать биологическую активность и/или низлежащий путь(пути) β-ΝΟΡ, опосредованный передачей сигнала ΝΟΡ.
Здесь заболевание или болезненное состояние, опосредованное β-ΝΟΡ, относится к заболеванию или болезненным состояниям, при которых активность β-ΝΟΡ может напрямую или опосредованно приводить к возникновению боли или зуда (почесухи) на определенной стадии болезненного процесса, включая любое из заболеваний или болезненных состояний, перечисленных в табл. 7. Таким образом, лечение β-ΝΟΡ-аптамером ингибирует боль или зуд, которые возникают в результате активности β-ΝΟΡ при указанных заболеваниях или болезненных состояниях. Аптамер к β-ΝΟΡ может, кроме того, блоки- 7 022429 ровать связывание β-ΝΟΡ с одним или несколькими из его рецепторов.
Здесь боль относится к острой боли, хронической боли, ноцицептивной боли, висцеральной боли, соматической боли, неноцицептивной боли, невропатической боли, симпатической боли или к боли, связанной с процессами воспаления, опосредованными β-ΝΟΡ.
Термин зуд относится к почесухе, которая может варьировать от слабых ощущений до интенсивного ощущения болезненного кожного зуда. Кожный зуд может сопровождать первичное кожное заболевание или может быть симптомом системного заболевания - иногда единственным симптомом. Кожные заболевания, при которых кожный зуд может быть наиболее тяжелым, включают, помимо прочего, чесотку, педикулез, укус насекомого, ксероз, крапивницу, атопический дерматит, контактный дерматит, красный плоский лишай, потницу и герпетиформный дерматит. Системные причины зуда включают хронический гепатит или почечное заболевание и лимфому.
Термины кожное расстройство и кожное заболевание относятся к любому заболеванию или состоянию, которое поражает кожу или в которое вовлечена кожа, включая кожные состояния, такие как атопический дерматит, ихтиоз, ксеродермия, себорейный дерматит, аллергический контактный дерматит, алопеция, пузырчатка, герпетиформный дерматит, псориаз, кандидамикоз, акне, дерматофитоз, опрелость, себорейный дерматит у новорожденного, экзема, анкилостомоз и повреждение кожи, например, от ран, ожогов, а также от непроизвольного стула и недержания мочи.
Используемый здесь термин фармацевтически приемлемый означает одобренный органами государственного регулирования федеральной власти или правительством штата или же входящий в список Фармакопеи США или других общепризнанных фармакопей для применения в отношении животных, а конкретнее, в отношении человека.
Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или эксципиенту, в сочетании с которым вводят лекарственное средство, и он включает, но не ограничен, такие стерильные жидкости, как вода и масла.
Фармацевтически приемлемая соль, или соль аптамера к β-ΝΟΡ, является продуктом обнаруженного соединения, который содержит ионную связь и обычно продуцируется в результате реакции обнаруженного соединения либо с кислотой, либо с основанием, подходящим для введения индивиду. Фармацевтически приемлемая соль может включать, не ограничиваясь перечисленным, соли присоединения кислот, включая гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты, кислые сернокислые соли, алкилсульфонаты, арилсульфонаты, арилалкилсульфонаты, ацетаты, бензоаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, лактаты и тартраты; катионы щелочных металлов, таких как Ы, Να, К, соли щелочноземельных металлов, таких как Мд или Са, или соли органических аминов.
Фармацевтическая композиция является композицией, включающей аптамер к β-ΝΟΡ в форме, подходящей для введения индивиду. Фармацевтическую композицию обычно составляют таким образом, чтобы она соответствовала предполагаемому пути введения. Примеры путей введения включают, но не ограничены, пероральный и парентеральный пути введения, например внутривенный, интрадермальный, подкожный пути введения, введение путем ингаляции, местный, трансдермальный, чресслизистый и ректальный пути введения.
Здесь термин терапевтически эффективное количество обычно означает количество, необходимое для облегчения по меньшей мере одного симптома расстройства или состояния, которое предполагается предотвратить, ослабить или подвергнуть лечению, согласно приведенному здесь описанию. Фраза терапевтически эффективное количество в отношении аптамеров к β-ΝΟΡ согласно настоящему описанию означает дозу аптамера, которая обеспечивает специфический фармакологический ответ, для получения которого указанный аптамер вводят большому количеству индивидов, нуждающихся в таком лечении. Следует подчеркнуть, что терапевтически эффективное количество аптамера, которое вводят конкретному индивиду в конкретном случае, не всегда будет эффективным при лечении описываемых здесь состояний/заболеваний, даже несмотря на то, что такая доза будет казаться терапевтически эффективной специалистам в данной области.
Способ 8ЕЬЕХ.
Термины §ЕЬЕХ и способ §ЕЬЕХ используются здесь взаимозаменяемым образом обычно для обозначения (1) отбора нуклеиновых кислот, которые взаимодействуют с молекулой-мишенью требуемым образом, например с высокой степенью аффинности связываются с белком; (2) амплификации указанных отобранных нуклеиновых кислот. Способ 8ЕЬЕХ может быть использован для идентификации аптамеров с высокой аффинностью в отношении специфической молекулы-мишени или специфического биомаркера.
Обычно способ 8ЕЬЕХ включает получение смеси нуклеиновых кислот-кандидатов, связывание смеси нуклеиновых кислот-кандидатов с требуемой молекулой-мишенью с образованием аффинного комплекса, отделение аффинного комплекса от не связанных нуклеиновых кислот-кандидатов, отделение и выделение указанной нуклеиновой кислоты из аффинного комплекса, очистку нуклеиновой кислоты и идентификацию специфической последовательности аптамера. Указанный способ может включать множественные циклы для дальнейшего усовершенствования аффинности выбранного аптамера. Указанный
- 8 022429 способ может включать стадии амплификации на одной или нескольких стадиях данного процесса. См., например, патент США № 5475096 под названием Ыис1ею Лаб Ыдаибк. Способ §ЕЬЕХ может быть использован для получения аптамера, который ковалентно связывается со своей мишенью, так же как и аптамера, который нековалентно связывается со своей мишенью. См., например, патент США № 5705337 под названием §ук1етабс Ενοίιιΐίοη оГ ШсШс Лаб Ыдаибк Ьу ЕхроиеиИа1 ЕттсЬтей: СЬет1-8ЕЬЕХ.
Способ §ЕЬЕХ может быть использован для идентификации высокоаффинных аптамеров, содержащих модифицированные нуклеотиды, которые придают улучшенные характеристики аптамеру, такие, например, как улучшенная стабильность ίη νίνο или улучшенные характеристики доставки. Примеры таких модификаций включают химические замены в положениях рибозы и/или фосфата и/или оснований. Аптамеры, идентифицируемые способом §ЕЬЕХ и содержащие модифицированные нуклеотиды, описаны в патенте США № 5660985 под названием ШдЬ АГГшЬу ЫисШс Лаб Ыдаибк Сойшшид Μοάίйеб №с1еойбек, в котором описаны олигонуклеотиды, содержащие нуклеотидные производные, химически модифицированные в 5'- и 2'-положениях пиримидинов. В патенте США № 5580737, см. выше, описаны высокоспецифичные аптамеры, содержащие один или несколько нуклеотидов, модифицированных в положениях 2'-амино (2'-ΝΗ2), 2'-фторо (2'-Р) и/или 2'-О-метил (2'-ОМе). См. также публикацию патентной заявки США № 20090098549 под названием §ЕЬЕХ апб РНОТО8ЕЬЕХ, в которой описаны библиотеки нуклеиновых кислот, имеющих расширенный диапазон физических и химических свойств, и их применение в способах §ЕЬЕХ и рЬо1о8ЕЬЕХ.
В предварительной заявке США с серийным № 61/264,545, поданной 25 ноября 200 г., под названием №.1с1еаке Кек1к1аи1 ОЬдоиис1еойбек, описаны способы получения олигонуклеотидов с улучшенной резистентностью к нуклеазе. Резистентные к нуклеазе олигонуклеотиды включают по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в С-5-положении группой, выбранной из таковых, представленных на фиг. 10. В различных вариантах осуществления указанные модификации включают замену дезоксиуридина в С-5-положении заместителем, независимо выбранным из бензилкарбоксиамида (Ви), нафтилметилкарбоксиамида (Ν;·ιρ)„ триптаминокарбоксиамида (Тгр) и изобутилкарбоксиамида, как было проиллюстрировано выше.
Способ §ЕЬЕХ может быть использован также для идентификации аптамеров, которые имеют требуемые характеристики скорости диссоциации. См. публикацию патентной заявки США № 20090004667 под названием Ме1Ьоб Гог Сеиетайид Ар!атетк \νί11ι Пнргоуеб ОГГ-Ка1ек, в которой описаны усовершенствованные способы §ЕЬЕХ для получения аптамеров, которые могут связываться с молекуламимишенями. Описаны способы получения аптамеров и фотоаптамеров, имеющих более низкие скорости диссоциации от соответствующих им молекул-мишеней. Указанные способы включают приведение смеси-кандидата в контакт с молекулой-мишенью, что дает возможность образования комплексов нуклеиновая кислота-мишень, и осуществление обогащения процесса более низкими скоростями диссоциации, где комплексы нуклеиновая кислота-мишень с высокими скоростями диссоциации диссоциируют и не восстанавливаются, тогда как комплексы с низкими скоростями диссоциации остаются интактными. Кроме того, указанные способы включают применение модифицированных нуклеотидов при продуцировании смесей-кандидатов нуклеиновых кислот для получения аптамеров с улучшенными показателями скоростей диссоциации (см. публикацию патентной заявки США № 20090098549 под названием §ЕЬЕХ аиб РЬо1о8ЕЬЕХ).
Мишень или молекула-мишень, или мишень, относится здесь к любому соединению, посредством которого нуклеиновая кислота может действовать желаемым образом. Молекула-мишень может представлять собой белок, пептид, нуклеиновую кислоту, углевод, липид, полисахарид, гликопротеин, гормон, рецептор, антиген, антитело, вирус, патоген, токсическое вещество, субстрат, метаболит, аналог переходного состояния соединения, кофактор, ингибитор, лекарственное средство, краситель, питательное вещество, фактор роста, клетку, ткань, любую часть или фрагмент указанного выше и т.д., без ограничения. В действительности любой химический или биологический эффекторный фактор может быть подходящей мишенью. Молекулы любого размера могут служить в качестве мишеней. Мишень также может быть модифицирована определенными путями с целью повышения вероятности или силы взаимодействия между указанной мишенью и указанной нуклеиновой кислотой. Мишень может также включать любую минорную вариацию конкретного соединения или молекулы, например, в случае белка, например минорные вариации в аминокислотной последовательности, в образовании дисульфидных связей, в гликозилировании, липидизации, ацетилировании, фосфорилировании или в любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгация с меченым компонентом, которая, по существу, не изменяет идентичности молекулы. Молекула-мишень, или мишень, представляет собой набор копий одного типа или вида молекул или мультимолекулярную структуру, которая способна связываться с аптамером. Молекулы-мишени, или мишени, относятся более чем к одному такому набору молекул. Варианты осуществления способа 8ЕЬЕХ, при котором мишенью является пептид, описаны в патенте США № 6376190 под названием МобШеб §ЕЬЕХ Ргосеккек ХУШюи! Рипйеб Рто1еш. В данном случае такой мишенью является З^СР.
- 9 022429
Аптамеры.
Аптамеры согласно настоящему изобретению были идентифицированы с помощью усовершенствованного способа §ЕЬЕХ с целью идентификации аптамеров, имеющих низкие скорости диссоциации, как описано в примере 1, в котором описан репрезентативный способ селекции продуцирования ДНК аптамера к β-ΝΟΡ. Форма β-ΝΟΡ, которая была использована в способе селекции, соответствовала рекомбинантному человеческому белку и была выделена в виде мономерной формы белка с молекулярной массой порядка 13,2 кДа. В растворе такой мономер образует димер. С помощью такого способа идентифицировали ДНК-аптамер к β-ΝΟΡ, обозначенный как аптамер 2426-66 (δΕΟ ГО N0: 1).
Используя аптамер 2426-66 (δΕΟ ГО N0: 1), проводили исследования по идентификации минимальной длины последовательности, необходимой для поддержания строгой аффинности в отношении β-ΝΟΡ, как описано в примере. Минимизация длины последовательности позволяет производить более воспроизводимый синтез аптамера в химическом процессе и потенциально способствует адсорбции через кожу, а также включению фармацевтической композиции. Сокращенные исследования ведут к идентификации аптамеров, имеющих число укороченных последовательностей, которые также были авидными связующими веществами в отношении β-ΝΟΡ, со значениями К, приблизительно составляющими вплоть до 30 нМ. Указанные последовательности включают δΕΟ ГО Ν0: 1, 2, 9-44 и 149 (табл. 3 и 4). В конкретном аптамере 2426-66-50 (δΕΟ ГО Ν0: 2; табл. 4) был идентифицирован 28-мер, имеющий Кб порядка 1,4 нМ в отношении β-ΝΟΡ.
Исследования дополнительного секвенирования проводили на группе последовательностей, из которых была выбрана последовательность 2426-66 (δΕΟ ГО Ν0: 1). Используемым способом секвенирования был способ секвенирования-454. Это широкомасштабный, высокопроизводительный способ, в котором используется параллельное пиросеквенирование. Указанный способ обеспечивает объективное получение образца и очень безошибочный анализ последовательностей. В указанном способе биотинилированные фрагменты ДНК захватывают на поверхности стрептавидиновых бусинок, а затем амплифицируют путем ПЦР. Небиотинилированная нить высвобождается с бусинки и используется в качестве библиотеки одноцепочечных ДНК-матриц. Затем указанную ДНК амплифицируют путем ПЦР. После чего каждая бусинка содержит амплифицированные клональные копии ДНК-фрагментов. Указанная библиотека бусинок используется затем в процессе ферментативного секвенирования. Полученные при секвенировании данные были использованы для идентификации консенсусной последовательности для β-ΝΟΡ-аптамера. Кроме того, исследования нуклеотидных замен, описанные в примере 3, привели к открытию, что семь из девяти положений ВпбИ в консенсусной последовательности являются желательными с точки зрения связывания β-ΝΟΡ, а два положения ВпбИ могут быть заменены на бТ без потери активности связывания. Указанная консенсусная последовательность представлена на фиг. 2А вместе с графическим представлением частоты нуклеотида в каждом положении по отношению к аптамеру 242666 (δΕΟ ГО Ν0: 1). Как проиллюстрировано на фиг. 2А, консенсусная последовательность представляет собой следующую последовательность:
ΒΑΖΟΚΟΟΚδΖ^ΟΟΟΟΖΖ^ΑΌΟΟΟΖΖΚΖΟ (δΕΟ ГО Ν0: 45), в которой В выбран из любого нуклеотида, отличного от А;
К независимо выбран из А или Ο;
δ выбран из С или Ο;
независимо выбран из Ζ или Т;
И выбран из любого нуклеотида, отличного от С; и
Ζ независимо выбран из модифицированного нуклеотида, в частности из модифицированного пиримидина.
В одном из аспектов В выбран из С, Ο или Ζ; И выбран из Α, Ο или Ζ и К, δ, и Ζ являются такими, как определено выше.
В другом аспекте консенсусная последовательность представляет собой следующую последовательность:
ΒΑΖΟΚΟΟΚδΖΖΟΟΟΟΖΖΖΑΌΟΟΟΖΖΚΖΟ (δΕΟ ΙΌ Ν0: 3), в которой В, К, δ, И и Ζ являются такими, как определено выше.
В некоторых вариантах осуществления Ζ является модифицированным уридином. В других вариантах осуществления Ζ является С-5-модифицированным пиримидином, как определено выше. В других воплощениях Ζ является С-5-модифицированным пиримидином, независимо выбранным из группы, состоящей из
5-^-бензилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (ВпбИ),
5-^-бензилкарбоксиамид)-2'-О-метилуридина,
5-^-бензилкарбоксиамид)-2'-фторуридина,
5-^-изобутилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина ДВибИ),
5-^-изобутилкарбоксиамид)-2'-0-метилуридина,
5-^-изобутилкарбоксиамид)-2'-фторуридина,
5-^-триптаминокарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (ТгрбИ),
- 10 022429
5-(Ы-триитаминокарбоксиамид)-2'-О-метилуридина,
5-(Ы-триитаминокарбоксиамид)-2'-фторуридина,
5-(N-[1-(3-триметиламмоний)ироиил]карбоксиамид)-2'-дезоксиуридинхлорида,
5-(Ы-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (Ыарйи),
5-(Ы-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-О-метилуридина,
5-(Ы-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-фторуридина и
5-(Ы-[1-(2,3-дигидроксиироиил)]карбоксиамид)-2'-дезоксиуридина).
В других вариантах осуществления Ζ является 5-(Ы-бензилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридином (ВийИ). Подразумевается, что любые из указанных нуклеотидных модификаций будут одинаково эффективны в иромоции высокоаффинного связывания с β-ΝΟΡ и будут обеспечивать низкие скорости диссоциации.
Здесь термин консенсусная иоследовательность, исиользуемый в отношении серии родственных нуклеиновых кислот, относится к нуклеотидной иоследовательности, которая отражает наиболее тииовую иодборку основания в каждом иоложении в иоследовательности, ири этом указанные серии родственных нуклеиновых кислот иодвергают интенсивному математическому анализу и/или анализу иоследовательностей.
В настоящем оиисании иредставлены аитамеры к β-ΝΟΡ, идентифицированные с иомощью сиособа 8ЕЬЕХ и иеречисленные в табл. 3 и 4 (8ЕО ГО N0: 1, 2, 9-44 и 149). Аитамеры к β-ΝΟΡ, которые являются, ио существу, гомологичными любому из иеречисленных аитамеров и которые обладают сиособностью связываться с β-ΝΟΡ, ио существу, сходной с таковой аитамера, выбранного из груииы аитамеров, иредставленных в табл. 3 и 4 (8Е0 ГО N0: 1, 2, 9-44 и 149), также считаются входящими в объем, охватываемый настоящим изобретением. Кроме того, аитамеры к β-ΝΟΡ, которые имеют, ио существу, такую же структурную форму, что и идентифицированные здесь аитамеры, и которые обладают сиособностью связываться с β-ΝΟΡ, ио существу, сходной с таковой аитамера, выбранного из груииы аитамеров, иредставленных в табл. 3 и 4 (8Е0 ГО Ν0: 1, 2, 9-44 и 149), также считаются входящими в объем, охватываемый настоящим изобретением.
В одном из асиектов в настоящем оиисании иредставлен аитамер, который сиецифически связывается с β-ΝΟΡ и включает иервичную иоследовательность нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления указанная иервичная иоследовательность нуклеиновой кислоты выбрана из 8Е0 ГО Ν0: 1, 2, 9-44 и 149. В других вариантах осуществления иервичная иоследовательность нуклеиновой кислоты выбрана таким образом, чтобы она была ио меньшей мере ириблизительно на 75% идентична, ио меньшей мере ириблизительно на 80% идентична, ио меньшей мере ириблизительно на 85% идентична, ио меньшей мере на ириблизительно 90% идентична или ио меньшей мере ириблизительно на 95% идентична иервичной иоследовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из 8Е0 ГО Ν0: 1, 2, 9-44 и 149.
Термины идентичность иоследовательности, ироцент (или стеиень) идентичности иоследовательности, % идентичности, %-ная идентичность, а также их вариации, ири ирименении в контексте двух или нескольких иоследовательностей нуклеиновых кислот, исиользуются взаимозаменяемым образом для обозначения двух или нескольких иоследовательностей или иодиоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют точно оиределенный ироцент нуклеотидов, которые являются одинаковыми, ири сравнении и выравнивании на иредмет максимального соответствия, которое оиределяется с иомощью алгоритма сравнения иоследовательностей или иутем визуальной ироверки. Для сравнения иоследовательностей обычно одна иоследовательность выстуиает в качестве ссылочной иоследовательности, с которой сравнивают тестируемые иоследовательности. Когда исиользуют алгоритм сравнения иоследовательностей, тестируемые и ссылочные иоследовательности вводят в комиьютер, если это необходимо, задают координаты иодиоследовательности и задают иараметры ирограммы алгоритма иоследовательностей. Затем с иомощью алгоритма сравнения иоследовательностей на основе заданных иараметров ирограммы вычисляют ироцент идентичности тестируемой иоследовательности (иоследовательностей) ио отношению к ссылочной иоследовательности. Оитимальное выравнивание иоследовательностей для сравнения может быть ироведено, наиример, с иомощью алгоритма локальной гомологии Смита и Ватермана, 8тйй аий \Уа1сгтап. Αάν. Арр1. Майк, 2: 482, 1981, с иомощью алгоритма гомологичного выравнивания Нидельмана и Вунша, №ей1етаи аий ^ииксй, 1. Мо1. Вю1., 48: 443, 1970, иутем иоиска методом иодобия Пирсона и Лиимана, Реагкои аий Ыртаи, Ргос. ΝαΙ'1. Асай. 8сй И8А, 85: 2444, 1988, иутем комиьютеризованных комилементаций указанных алгоритмов (ΟΑΡ, ΒΕ8ΤΡΙΤ, ΡΑ8ΤΑ и ΤΡΑ8ΤΑ с иомощью набора ирограммного обесиечения ио генетике, ^ксоикш СепеОск, 8оП\\аге Раскаде, Сепейск СотрШег Οιώ^, 575 8аеисе Иг., Май1кои, \νί8.), или иутем визуальной ироверки (в целом см. Αи8иЬе1, Ρ.Μ. е! а1., Сиггеи! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, риЬ. Ьу ^ееие РиЪйкЫид Α88ос. аий ^йеуЛйегкшеисе (1987)).
Одним из иримеров алгоритма, который является иодходящим для оиределения ироцента идентичности иоследовательностей, является алгоритм, исиользуемый в стандартном инструментальном средстве иоиска (здесь далее ΒΕΑ8Τ), см., наиример, Α1ΐ8Πιιι1 е! а1., I. Мо1. Вю1. 215: 403-410, 1990 и
- 11 022429
Λΐΐδαΐηιΐ с1 а1., Νυοίοίο Άοίάδ Кек., 15: 3389-3402, 1997. Программное обеспечение для осуществления анализа ВЬА8Т является общественно доступным через Национальный Центр Информации по Биотехнологии (здесь далее ΝΟΕΙ. Ναΐίοηαί Сеи1ет ίοτ В1о1есйио1о§у 1пЮгтаИоп). Подразумеваемые значения параметров по умолчанию, используемые при определении идентичности последовательностей с помощью программного обеспечения, доступного в NСВI, например, ΒΕΑ8ΤΝ (для нуклеотидных последовательностей), описаны МсОшшк е1 а1., №.1с1ею Ααάκ Кек., 32: \20-\25, 2004.
Здесь при описании процента идентичности нуклеиновой кислоты, такой как β-ΝΟΡ-аптамер, последовательность которого составляет по меньшей мере, например, приблизительно 95% идентичности ссылочной нуклеотидной последовательности, подразумевается, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты идентична ссылочной последовательности, за исключением того, что последовательность нуклеиновой кислоты может включать вплоть до пяти точковых мутаций на каждые 100 нуклеотидов ссылочной последовательности нуклеиновой кислоты. Иными словами, чтобы получить требуемую последовательность нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере приблизительно на 95% идентична ссылочной последовательности нуклеиновой кислоты, вплоть до 5% нуклеотидов в ссылочной последовательности может быть подвергнуто делеции или замене другим нуклеотидом, или же некоторое количество нуклеотидов вплоть до 5% общего количества нуклеотидов ссылочной последовательности может быть встроено в ссылочную последовательность (здесь они упоминаются как вставки или инсерции). Указанные мутации ссылочной последовательности для получения требуемой последовательности происходят в 5'- или 3'-концевых положениях ссылочной нуклеотидной последовательности или же где-либо между указанными концевыми положениями, вставленные либо индивидуально между нуклеотидами в ссылочной последовательности, либо в одну или несколько смежных групп внутри ссылочной последовательности. Ссылочная (запрашиваемая) последовательность может быть какой-нибудь любой из последовательностей полного нуклеотида, представленного в последовательностях 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 9-44 и 149, или любым фрагментом любой из указанных последовательностей.
В одном из аспектов каждая из консенсусных последовательностей 8ЕО ГО ΝΟ: 45 или 8ЕО ГО ΝΟ: 3 может быть модифицирована таким образом, чтобы включать по меньшей мере одну вставку. В одном из вариантов осуществления консенсусные последовательности либо 8ЕО ГО ΝΟ: 45, либо 8ЕО ГО ΝΟ: 3 модифицированы таким образом, чтобы один нуклеотид (Ν) был встроен в консенсусную последовательность между основаниями 9 и 10. В другом варианте осуществления консенсусная последовательность либо 8ЕО ГО ΝΟ: 45, либо 8ЕО ГО ΝΟ: 3 модифицирована таким образом, чтобы один нуклеотид (Ν) был встроен в консенсусную последовательность между основаниями 15 и 16. В другом варианте осуществления консенсусные последовательности либо 8ЕО ГО ΝΟ: 45, либо 8ЕО ГО ΝΟ: 3 модифицированы таким образом, чтобы один нуклеотид (Ν) был встроен в консенсусную последовательность между основаниями 9 и 10 и дополнительный нуклеотид (Ν) был встроен в консенсусную последовательность между основаниями 15 и 16. Указанные варианты осуществления можно проиллюстрировать следующим образом:
ΒΑ/ΌΚΌΌΚδΝ0-1 )Ζ\ΌΌΌΌΝ(0и //\\'Л1)ССС,//К/С, (8ЕС) ГО ΝΟ: 154),
ΒΑΖΌΚΌΌΚ8Ν(0-1)ΖΖΌΌΌΌΝ(0-1)ΖΖΖΑΌ^ΌΖΖΚΖΌ (8ЕС ГО ΝΟ: 155), где В, К, δ, Ό и Ζ являются такими, как определено выше, и Ν независимо выбрано из встречающегося в природе или модифицированного нуклеотида (А, С, С или Т).
В другом аспекте настоящее описание связано с аптамером к β-ΝΌΡ, который при связывании с β-ΝΌΡ модулирует функцию β-ΝΌΡ. В различных вариантах осуществления указанный аптамер модулирует функцию β-ΝΌΡ ίη у1уо. В различных вариантах осуществления указанный аптамер к β-ΝΌΡ включает последовательность смежных нуклеотидов, которая идентична последовательности смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2, 9-44 и 149. В различных вариантах осуществления указанная последовательность смежных нуклеотидов в аптамере к β-ΝΌΡ может включать любое число нуклеотидов, которые идентичны такому же числу нуклеотидов в последовательности смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2, 9-44 и 149. В различных вариантах осуществления указанная последовательность смежных нуклеотидов в аптамере к β-ΝΌΡ включает последовательность от приблизительно 4 до приблизительно 30 смежных нуклеотидов, которые идентичны последовательности от приблизительно 4 до приблизительно 30 смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2, 9-44 и 149. В иллюстративном варианте осуществления аптамер к β-ΝΌΡ включает последовательность 30 смежных нуклеотидов, которые идентичны последовательности 30 смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2, 9-44 и 149. В другом иллюстративном варианте осуществления аптамер к β-ΝΌΡ включает последовательность из 20 смежных нуклеотидов, которые идентичны последовательности 20 смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2, 9-44 и 149. Еще в одном иллюстративном варианте осуществления аптамер к β-ΝΌΡ включает последовательность 8 смежных нуклеотидов, которые идентичны последовательности 8 смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2, 9-44 и 149. Еще в одном иллюстративном варианте осуществления аптамер к β-ΝΌΡ включает последовательность 4 смежных нуклеотидов, которые идентичны
- 12 022429 последовательности 4 смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 9-44 и 149.
В одном из вариантов осуществления указанный аптамер к β-ΝΟΡ-аптамер представляет собой последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1. В другом варианте осуществления указанный β-ΝΟΡ-аптамер представляет собой последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2. Еще в одном варианте осуществления указанный β-ΝΟΡаптамер получен из консенсусной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 3. В других вариантах осуществления β-ΝΟΡ-аптамер представляет собой любую из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 9-44 и 149. В одном из вариантов осуществления указанный в-ЫОР-аптамер по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичен, по меньшей мере приблизительно на 85% идентичен, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичен или по меньшей мере приблизительно на 75% идентичен любой из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 9-44 и 149. В другом варианте осуществления указанный в-ЫОР-аптамер включает последовательность из любой из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 9-44 и 149 и фрагменты любой из них.
Указанный в-ЫОР-аптамер может содержать любое число нуклеотидов вдобавок к области, связывающейся с β-ЛОР. В различных вариантах осуществления аптамер к β-ЛОР может включать приблизительно вплоть до 100 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 95 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 90 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 85 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 80 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 75 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 70 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 65 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 60 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 55 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 50 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 45 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 40 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 35 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 30 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 25 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 20 нуклеотидов.
В другом варианте осуществления указанный аптамер к β-ЛОР выбран из аптамеров, которые имеют сходные характеристики связывания и обладают способностью лечить β-NΟΡ-ассоциированную боль или состояния зуда, в качестве аптамера, выбранного из группы, состоящей из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 9-44 и 149.
Указанный β-NΟΡ-аптамер может быть выбран таким образом, чтобы он имел любую подходящую константу диссоциации (Кз) по отношению к β-ЛОР.
В иллюстративном варианте осуществления указанный β-NΟΡ-аптамер имеет константу диссоциации (Кз) по отношению к β-ЛОР, составляющую приблизительно 10 нМ или менее.
В другом иллюстративном варианте осуществления указанный β-NΟΡ-аптамер имеет константу диссоциации (Кз) по отношению к β-ЛОР, составляющую приблизительно 15 нМ или менее.
Еще в одном иллюстративном варианте осуществления указанный β-NΟΡ-аптамер имеет константу диссоциации (Кз) по отношению к β-ЛОР, составляющую приблизительно 20 нМ или менее.
Еще в одном иллюстративном варианте осуществления указанный β-NΟΡ-аптамер имеет константу диссоциации (Кз) по отношению к β-ЛОР, составляющую приблизительно 25 нМ или менее.
Подходящая константа диссоциации может быть определена анализом связывания с использованием многоступенчатого титрования и в соответствии с уравнением у=(тах-тт)(Рго1ет)/(К<1+белок)+тт, как описано в примере 1 ниже. Следует иметь в виду, что определение констант диссоциации в большой степени зависит от условий, при которых они измеряются, и, таким образом, их значения могут значительно варьировать в зависимости от факторов, таких как время установления равновесия и т.д. В других вариантах осуществления указанный β-NΟΡ-аптамер является аптамером со значением Кз, которое меньше или равно Кз аптамера, выбранного из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 9-44 и 149.
Аптамер 2426-66 (8ЕЦ ГО N0: 1) связывается с β-ЛОР-мономером со стехиометрией 1:1. Поскольку β-ЛОР образует жесткий гомодимер, который необходим для реакции с его рецепторами-мишенями, более эффективное ингибирование активности β-ЛОР могло бы быть достигнуто при использовании димерной или другой мультимерной формы 2426-66-аптамера. Таким образом, в другом варианте осуществления β-NΟΡ-аптамер является продуктом мультимеризации любой комбинации указанных выше последовательностей. На фиг. 3 и 4 проиллюстрированы потенциальные подходы к димеризации 2426-66-аптамера. Такие же стратегии могут быть использованы в отношении любой последовательности аптамера с соответствующими характеристиками связывания с β-ЛОР. Сходные подходы могут быть использованы также для создания мультимерных аптамеров с таким количеством копий последовательности аптамера, какое потребуется. В таком случае используется последовательность 2426-66-50 (8ЕЦ ГО N0: 2) усеченного аптамера, но может быть использована также и полная длина последовательности 2426-66. На фиг. 3 проиллюстрирована конструкция голова-к-хвосту двух последовательностей 2426-66 либо с одним, либо с несколькими гексаэтиленгликолями (НЕО), либо с абазическими сахарфосфатами в качестве линкеров между указанными двумя частями новой последовательности аптамера. На фиг. 4 изображена димеризация последовательности 2426-66 путем использования разветвленного фосфорамидита, необязательно включающая либо гексаэтиленгликоль (НЕО), либо абазические сахар- 13 022429 фосфаты в качестве линкеров.
Фармацевтические композиции, включающие аптамер к β-ΝΟΡ Настоящее описание включает фармацевтические композиции, которые содержат по меньшей мере один аптамер к β-ΝΟΡ и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие носители описаны в справочнике Репипфоп: ТЬе 8с1епсе апб Ртаебее о£ РЬатшаеу, Т\усШу-Пг51 Ε6ί6οη, опубликованном Ырршсоб Аббате & ХУПкиъ. который включен в настоящее описание в виде ссылки. Фармацевтические композиции, которые включают по меньшей мере один аптамер к β-ΝΟΡ и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, могут также включать один или несколько активных компонентов, которые не являются ингибиторами β-ΝΟΡ.
Описанные здесь аптамеры могут быть использованы в любой фармацевтически приемлемой форме, включая, но не ограничиваясь, инъецируемые лекарственные формы, жидкие дисперсии, гели, аэрозоли, мази, крема, лиофилизированные композиции, сухие порошки, таблетки, капсулы, композиции с контролируемым высвобождением, быстрорастворимые композиции, композиции с отложенным высвобождением, композиции с замедленным высвобождением, композиции с пульсирующим высвобождением, композиции со смешанным моментальным высвобождением и контролируемым высвобождением и т.д. Описанные здесь аптамеры могут, в частности, быть составлены в композицию (а) для введения, выбранного из любого из таких введений, как пероральное, пульмональное, внутривенное, внутриартериальное, интратекальное, внутрисуставное, ректальное, офтальмическое, ободочное, парентеральное, интрацистернальное, внутривлагалищное, внутрибрюшинное, локальное, защечное, назальное и местное введение; (Ь) в лекарственной форме, выбранной из любой из таких форм, как жидкие дисперсии, гели, аэрозоли, мази, крема, таблетки, саше и капсулы; (с) в лекарственной форме, выбранной из любой из таких форм, как лиофилизированные композиции, сухие порошки, быстрорастворимые композиции, композиции с контролируемым высвобождением, композиции с отложенным высвобождением, композиции с замедленным высвобождением, композиции с пульсирующим высвобождением, композиции со смешанным моментальным высвобождением и контролируемым высвобождением; или (б) любую их комбинацию.
Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать один или несколько из следующих компонентов: (1) стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; (2) антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; (3) антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; (4) хелатообразующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; (5) буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; и (6) средства для доведения тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Значение рН может быть доведено с помощью кислот или оснований, таких как соляная кислота или гидроокись натрия. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, шприцы одноразового использования или пузырьки для многократного приема, изготовленные из стекла или пластика.
Фармацевтические композиции, подходящие для применения в виде инъекций, могут включать стерильные водные растворы (в случае водорастворимых средств) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильного инъецируемого раствора или дисперсии для немедленного введения. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, СгеторЬог ЕЬ (ΒΆ8Ρ, Рагаррапу, N.1.) или раствор фосфатного буфера (РВ8). Во всех случаях такая композиция должна быть стерильной и должна быть в такой степени текучей, чтобы легко набиралась в шприц. Такая фармацевтическая композиция должна быть стабильна в условиях производства и хранения и должна быть защищена от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Здесь термин стабильный означает пребывание в состоянии или в условиях, которые являются подходящими для введения пациенту.
Указанный носитель может быть растворителем или диспергирующей средой, включая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), а также соответствующие их смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем нанесения эмульсионного слоя, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ.
Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включение в такую композицию изотонических средств, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит или сорбит, и неорганических солей, таких как хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута путем включения в композицию средства, которое задерживает абсорбцию, например моностеарат алюминия и желатин.
Стерильные инъецируемые растворы могут быть получены путем включения активного реагента (например, β-ΝΟΡ-аптамера) в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним ин- 14 022429 гредиентом или с комбинацией перечисленных выше ингредиентов, при необходимости, с последующей стерилизацией путем фильтрования. Обычно дисперсии получают путем включения по меньшей мере одного аптамера к β-ΝΟΡ в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и любой другой требуемый ингредиент. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов иллюстративные способы получения включают вакуумную сушку и лиофильную сушку, обе из которых дают на выходе порошок β-ΝΟΡ-аптамера плюс любого дополнительного ингредиента из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.
Пероральные композиции обычно включают инертный разбавитель или пищевой наполнитель. Они могут быть заключены, например, в желатиновые капсулы или спрессованы в таблетки. Для целей перорального терапевтического введения аптамер к β-ΝΟΡ может быть введен в составе с эксципиентами и использован в виде таблеток, пастилок или капсул. Оральные композиции могут быть получены также с использованием жидкого наполнителя для применения в качестве жидкости для полоскания рта, где указанное соединение в жидком наполнителе наносится орально и ополаскивает и выплевывается или проглатывается.
Фармацевтически приемлемые связующие средства и/или адъювантные материалы могут быть включены как часть композиции.
Для введения путем ингаляции соединения доставляются в виде аэрозольного спрея из спрессованного контейнера или диспенсера, который содержит соответствующий пропеллент, например, газ, такой как двуокись углерода, распыленную жидкость или сухой порошок, из соответствующего устройства. Для чресслизистого или трансдермального введения в композиции используются пенетранты, подходящие для преодоления конкретного барьера. Такие пенетранты в общем известны в данной области и включают, например, в случае предназначения для чресслизистого введения, детергенты, желчные кислоты и производные фусидовой кислоты. Чресслизистое введение может быть осуществлено посредством назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные реагенты составляют в виде растирок, целебных мазей, гелей или кремов, как правило, широко известных в данной области. Указанные реагенты могут быть составлены также в виде суппозиториев (например, с соответствующими основами для суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды) или удерживающих клизм для ректальной доставки.
В одном из вариантов осуществления аптамер к β-ΝΟΡ составлен в композицию для местного введения. Здесь термин местное введение относится к доставке β-ΝΟΡ-аптамера путем приведения в контакт, напрямую или иным способом, композиции, содержащей β-ΝΟΡ-аптамер, со всей кожей (эпидермисом) животного или части кожи. Указанный термин охватывает несколько путей введения, включая, но не ограничиваясь местным и трансдермальным введениями. Общим требованием для таких способов введения является эффективность доставки к ткани- или к слою-мишени. В одном из аспектов местное введение используется в качестве средства для проникновения через эпидермис и дерму, и в конечном итоге достигается системное введение β-ΝΟΡ-аптамера. В другом аспекте местное введение используется в качестве средства для селективного проникновения β-ΝΟΡ-аптамера к эпидермису или дерме животного или же к его специфическому слою-мишени.
Для местного введения β-ΝΟΡ-аптамер может быть составлен в виде фармацевтически приемлемых целебных мазей, кремов, лосьонов, глазных мазей, глазных капель, пропитанных перевязочных материалов и аэрозолей, медикаментозных присыпок, медикаментозных адгезивов, пен и может содержать соответствующие обычно применяемые добавки или эксципиенты, включая, например, консервирующие добавки или растворители, способствующие проникновению лекарственного средства, и мягчительные средства в составе мазей, гелей и кремов. Такие местные композиции могут также содержать совместимые обычно применяемые носители, например, этанол или олеиловый спирт в случае лосьонов. Такие носители могут составлять от приблизительно 1 до приблизительно 98% от массы композиции; чаще такие носители будут составлять приблизительно 80% от массы композиции. Специфические композиции для местного введения аптамеров описаны в патенте США № 6841539 и в публикации патентной заявки США № 20050096287. Дозировка, доставляемая при нанесении местной композиции, предназначена для обеспечения режима непрерывной доставки.
В одном из вариантов осуществления β-ΝΟΡ-аптамер вводят в композицию в составе с носителем, который обеспечит защиту против быстрого его выведения из организма. Например, может быть использована композиция с контролируемым высвобождением, включая имплантирующие примеси и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимер молочной кислоты. Способы получения таких композиций должны быть знакомы специалистам в данной области. Необходимые материалы являются также коммерчески доступными от компаний Л1/а Согрогайоп и Νονα РЬагтасеийсак, 1пс.
Липосомные суспензии (включая липосомы, нацеленные на инфицированные клетки моноклональными антителами против вирусных антигенов) также могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными спе- 15 022429 циалистам в данной области, например, как описано в патенте США № 4522811.
Кроме того, суспензии β-NΟΡ-аптамера могут быть получены в виде приемлемых масляных инъекционных суспензий. Подходящие для этого липофильные растворители или наполнители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Нелипидные поликатионные аминополимеры также могут быть использованы для доставки. Необязательно, но такая суспензия может включать также и соответствующие стабилизаторы или средства для повышения растворимости соединений, которые дают возможность получать высококонцентрированные растворы.
В некоторых случаях может быть особенно предпочтительным составление оральных или парентеральных композиций в лекарственной форме для облегчения введения и стандартизации дозировки. Используемая здесь дозированная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных дозировок для субъекта, подвергаемого лечению; каждая однократная дозировка содержит предварительно определяемое количество аптамера к β^ΟΡ, рассчитанное для продуцирования требуемого терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Подробная характеристика дозированных лекарственных форм описанных здесь β^ΟΡаптамеров диктуется и напрямую зависит от особых характеристик конкретного β-NΟΡ-аптамера и конкретного терапевтического эффекта, которого желательно достичь, и характерных в данной области ограничений, возникающих при составлении композиций, содержащих такое активное лекарственное средство, для лечения индивидов.
Фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один β-NΟΡ-аптамер, могут включать один или несколько фармацевтических эксципиентов. Примеры таких эксципиентов включают, но не ограничены, связующие средства, наполнители, смазывающие вещества, суспендирующие средства, подсластители, ароматизирующие вещества, консерванты, буферы, увлажняющие средства, дезинтеграторы, шипучие агенты и другие эксципиенты. Такие эксципиенты известны в данной области. Иллюстративные эксципиенты включают следующее: (1) связующие средства, которые включают различные целлюлозы и поперечно сшитый поливинилпирролидон, микрокристаллическую целлюлозу, такую как Ау1се1® РН101 и Ауюе1® РН102, силицифицированную микрокристаллическую целлюлозу (Рго8о1у 8МСС™), трагакантовую камедь и желатин; (2) наполнители, такие как различные крахмалы, лактоза, моногидрат лактозы и безводная лактоза; (3) дезинтегрирующие спредства, такие как альгиновая кислота, примогель, кукурузный крахмал, слабо поперечно сшитый поливинилпирролидон, картофельный крахмал, маисовый крахмал и модифицированные крахмалы, кроскармеллозу натрия, кросповидон, гликоляткрахмал натрия и их смеси; (4) скользящие вещества, включая средства, которые действуют на текучесть порошка, предназначенного для компрессии, включают стеарат магния, коллоидный диоксид кремния, такой как АегокП® 200, тальк, стеариновую кислоту, стеарат кальция и силикагель; (5) вещества, способствующие скольжению, такие как коллоидный диоксид кремния; (6) консерванты, такие как сорбат калия, метилпарабен, пропилпарабен, бензойная кислота и ее соли, другие эфиры парагидроксибензойной кислоты, такие как бутилпарабен, спирты, такие как этиловый или бензиловый спирт, фенольные соединения, такие как фенол, или четвертичные соединения, такие как бензалконий хлорид; (7) разбавители, такие как фармацевтически приемлемые инертные наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, двухосновный фосфат кальция, сахариды, и/или смеси любых из перечисленных выше веществ; примеры разбавителей включают микрокристаллическую целлюлозу, такую как Ау1се1® РН101 и Ауюе1® РН102; лактозу, такую как моногидрат лактозы, безводная лактоза; и РНагтаЮке® ОСЬ21; двухосновный фосфат кальция, такой как Етсотргекк®; маннит; крахмал; сорбит; сахароза и глюкоза; (8) подсластители, включая любой природный или искусственный подсластитель, такой как сахароза, сахарин сахарозы, ксилит, сахарин натрия, цикламат, аспартам и ацесульфам; (9) вкусовые добавки, такие как мята перечная, метилсалицилат, апельсиновый ароматизатор, Мадпа5\уее1® (торговая марка ΜΆΡΟΌ). ароматизатор надувной жевательной резинки, фруктовые ароматизаторы, и т.п.; а также (10) шипучие вещества, включая шипучие соединения, такие как органическая кислота и карбонат или бикарбонат. Подходящие органические кислоты включают, например, лимонную, виннокаменную, яблочную, фумаровую, адипиновую, янтарную и альгиновую кислоты и ангидриды и кислые соли. Подходящие карбонаты и бикарбонаты включают, например, карбонат натрия, бикарбонат натрия, карбонат калия, бикарбонат калия, карбонат магния, глицин-карбонат натрия, карбонат Ь-лизина и карбонат аргинина. Альтернативно, может присутствовать только компонент бикарбоната натрия шипучего вещества.
В различных вариантах осуществления описанные здесь композиции являются, по существу, чистыми. Здесь термин по существу чистые означает, что активный ингредиент (β^ΟΡ аптамер) является количественно преобладающим (т.е. на молярной основе, его количество превосходит количество всех других компонентов в композиции). В одном из вариантов осуществления, по существу, очищенная фракция представляет собой композицию, в которой активный ингредиент составляет по меньшей мере приблизительно 50% (на молярной основе) всех присутствующих видов макромолекул. Обычно, по существу, чистая композиция будет включать более чем приблизительно 80% всех видов макромолекул,
- 16 022429 присутствующих в такой композиции. В различных вариантах осуществления, по существу, чистая композиция будет включать по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 99% всех видов макромолекул, присутствующих в такой композиции. В различных вариантах осуществления активный ингредиент очищают, по существу, до гомогенного состояния (при обычных способах детектирования в такой композиции не удается обнаружить тех или иных видов примесей), при этом указанная композиция состоит, по существу, из макромолекул одного вида.
Наборы, содержащие композиции аптамера к β-ΝΟΡ.
В настоящем описании представлены наборы, содержащие любой из описанных здесь β-ΝΟΡ-аптамеров. Такие наборы могут включать, например, (1) по меньшей мере один аптамер β-ΝΟΡ и (2) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, такой как растворитель или раствор. Дополнительные компоненты набора, необязательно, могут включать, например, (1) любой из идентифицированных здесь фармацевтически приемлемых эксципиентов, таких как стабилизаторы, буферы и т.д., (2) по меньшей мере один контейнер, флакон или подобное устройство для временного хранения и/или смешивания компонентов указанного набора и (3) аппарат для доставки.
Способы доставки.
В настоящем описании представлены способы предотвращения или лечения (например, улучшения одного или нескольких симптомов) болезненных состояний путем применения β-ΝΟΡ-аптамера. Указанные способы включают введение пациенту, в случае необходимости, терапевтически эффективного количества β-ΝΟΡ-аптамера. Описанные аптамеры могут быть использованы также и для профилактической терапии. В некоторых вариантах осуществления используется местное введение указанного β-ΝΟΡ-аптамера.
β-ΝΟΡ-аптамером, используемым в способах лечения, могут быть следующие: (1) новый β-ΝΟΡ-аптамер, полученный описанными здесь способами, или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство.
Индивидом или пациентом может быть любое животное (домашнее животное, домашний скот или дикое животное), включая, но не ограничиваясь, кошек, собак, лошадей, свиней и крупный рогатый скот, и предпочтительно человек. Здесь термины пациент, индивид и субъект могут быть использованы взаимозаменяемым образом.
Здесь термином лечение описывается оказание помощи и уход за пациентом с целью лечения заболевания, состояния или расстройства, и оно включает введение β-ΝΟΡ-аптамера для предотвращения запуска симптомов или осложнений заболевания, состояния или расстройства, для облегчения симптомов или осложнений заболевания, состояния или расстройства; или для устранения наличия заболевания, состояния или расстройства у пациента. Более конкретно, лечение включает обратное развитие, ослабление, облегчение, минимизацию, супрессию или устранение по меньшей мере одного из болезнетворных симптомов или проявления болезненного состояния (расстройства), прогрессии заболевания, этиологического фактора заболевания (например, бактерии или вирусов) или другого аномального состояния. Лечение обычно продолжается до тех пор, пока не ослабнут симптомы и/или само патологическое состояние.
В различных вариантах осуществления описанные композиции (включая местные композиции) и способы используются для лечения дерматита, который часто характеризуется поверхностным воспалением или сыпью на коже, характеризующейся покраснением, отеком, выделениями, образованием струпьев, процессом шелушения кожи и иногда образованием везикул. Прурит (зуд, чесотка) является общим симптомом при дерматите. Экзема является термином, часто взаимозаменяемым образом используемым с дерматитом. Примеры дерматита или экземы включают, например, атопический дерматит (также называемый инфантильной или флексурной экземой), контактный дерматит (включая аллергический и раздражающий), ксеротическую экзему (называемую также астеатозной экземой, потрескавшейся или сухой, Холодовым зудом, или зимней чесоткой), эксфолиативный дерматит, ладонно-подошвенный дерматит, нейродерматит (например, простой хронический лишай), себоррейный дерматит (себорейный дерматит у новорожденных, перхоть), дискоидную экзему (называемую также монетовидной простой экземой, экссудативной экземой, микробной экземой), дисгидроз, венозную экзему (гравитационная экзема, застойный дерматит, застойный дерматит при варикозной экземе, герпетиформный дерматит (болезнь Дюринга), аутоэкзематизацию (называемую также ауточувствительным дерматитом, аутосенсибилизацией), синдром пловцов (например, зуд пловцов или утиный зуд (проявление шистосомоза)), урушиолиндуцированный контактный дерматит, который называется также токсикодендроновым дерматитом и луговым дерматитом (например, сыпь от соприкосновения с сумахом ядоносным, сумахом укореняющимся, с ядовитым плющом), солнечный дерматит и экзема домашних хозяек.
В одном из вариантов осуществления описанные здесь соединения или же их фармацевтически приемлемые соли или пролекарства могут быть введены в сочетании с другими терапевтическими средствами, которые облегчают или устраняют кожный зуд. Композиции, содержащие описанные здесь
- 17 022429 β-ΝΟΡ-аптамеры, могут включать, например, более чем один аптамер, например аптамер к 1дЕ, к 1Ь-6 и/или к РЛК2, а также аптамер к β-ΝΟΡ. В некоторых примерах композицию β-ΝΟΡ-аптамера, содержащую один или несколько аптамеров, вводят в сочетании с другой эффективной противозудной композицией, такой, например, как антигистаминовое, анальгезирующее, антихолинергическое, нестероидное противовоспалительное лекарственное средство, стероид, антиоксидантное вещество, витамин, модификатор лейкотриена, антагонист интерлейкина, ингибитор тучных клеток, анти-1дЕ-антитело, селективный ингибитор обратного захвата серотонина, антагонист рецептора 5-гидрокситриптамина, антибиотик, замедлитель реакции кальцийнейрина, ингибитор деацетилаз гистонов, габапентин или налоксон, в которой активные ингредиенты представлены в свободной форме или в виде фармацевтически приемлемой соли и, необязательно, по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем для системного или местного применения или одновременного, раздельного или последовательного введения и т.п. В большинстве случаев общеприменимые доступные лекарственные формы известных терапевтических лекарственных средств для применения в таких комбинациях являются подходящими.
Комбинированная терапия (или совместная терапия) включает введение композиции β-ΝΟΡаптамера и по меньшей мере еще одного второго средства как части специфической схемы лечения, предназначенной для обеспечения благотворного эффекта от совместного воздействия указанных терапевтических лекарственных средств. Благотворный эффект такой комбинации включает, не ограничиваясь, совместное фармакокинетическое или фармадинамическое действие, обусловленное сочетанием терапевтических средств. Введение таких терапевтических средств в сочетании обычно осуществляют в течение определенного периода (обычно минут, часов, дней или недель, в зависимости от выбранной комбинации).
Под комбинированной терапией может подразумеваться, но обычно не подразумевается, возможность введения двух или нескольких из указанных терапевтических средств как части отдельных схем монотерапии, которые случайно и произвольным образом приводят к комбинациям согласно настоящему изобретению. Под комбинированной терапией подразумевается, что она включает введение указанных терапевтических средств в последовательном режиме, т.е. в таком режиме, при котором каждое терапевтическое средство вводят в разное время, так же как и введение указанных терапевтических средств или по меньшей мере двух из указанных терапевтических средств, по существу, одновременно. По существу, одновременное введение может быть осуществлено, например, путем введения субъекту однократной дозы, имеющей фиксированное соотношение каждого из терапевтических средств, или многократного введения однократных доз каждого из терапевтических средств.
Схему приема лекарственного средства, в которой используются β-ΝΟΡ-аптамеры, выбирают в соответствии с разными факторами, включая, например, тип, вид, возраст, вес, пол и состояние здоровья пациента; степень тяжести подвергаемого лечению состояния; путь введения; функцию почек и печени пациента и конкретно используемый β-ΝΟΡ-аптамер или его соль. Рядовой практикующий врач или ветеринар может с легкостью определить и предписать эффективное количество указанной композиции, необходимой для профилактики, оказания противодействия или остановки процесса прогрессирования конкретного состояния.
Обычно дозировка, т.е. терапевтически эффективное количество, варьирует от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мг/кг массы тела субъекта, подвергаемого лечению, в день.
Эффективность.
В примере 4 проиллюстрирована способность различных β-ΝΟΡ-аптамеров и их укороченных (усеченных) вариантов ингибировать β-ΝΟΡ-опосредованный рост нейрита у человека (фиг. 5-7) и ингибировать фосфорилирование ТгкА под действием β-ΝΟΡ (фиг. 8 и 9).
В примере 5 проиллюстрирована эффективность β-ΝΟΡ-аптамеров в уменьшении частоты расчесывания и улучшении клинического состояния кожи в результате введения аптамера 2426-66-50 (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2) больным мышам. Со ссылкой на фиг. 11 можно видеть, что частота расчесывания постоянно уменьшается между 14 и 28 днями у мышей, обработанных аптамером 2426-66-50 (·), в отличие от отсутствия изменении, наблюдаемых у необработанных мышей (Ч) или мышей, обработанных гидрофильной мазью (НО) (4). Сходным образом, со ссылкой на фиг. 12 можно видеть, что клиническое состояние кожи улучшалось через 4 недели у больных мышей, обработанных аптамером 2426-66-50 (δΕζ) ГО N0: 2) (·), и что отсутствие улучшения в отношении частоты расчесывания имело место у необработанных мышей (И) или мышей, обработанных НО ί*).
Примеры
Следующие примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема притязаний настоящего изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения. Все описанные здесь примеры были осуществлены с использованием стандартных технологий, которые хорошо известны и являются рутинными для специалистов в данной области. Общеизвестные технологии молекулярной биологии, описанные в следующих примерах, могут быть осуществлены так, как описано в стандартных лабораторных справочниках, таких как §атЪтоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошп§: А ЬаЪотаГОту Мапиа1, 3гй. ей., Со1й 8ртшд НагЪог ЬаЪотаГОту Рте88, Со1й 8ртшд НагЪог, Ν.Υ. (2001).
- 18 022429
Пример 1. Селекция и последовательности аптамеров.
А. Получение смесей-кандидатов.
Кандидатную смесь частично рандомизированных олигонуклеотидов одноцепочечной ДНК (оцДНК) получали путем полимеразного удлинения ДНК-праймера, отожженного на биотинилированной матрице оцДНК, как показано в табл. 1. Кандидатная смесь содержала рандомизированную кассету из 40 нуклеотидов, содержащую бАТР, 6ΟΤΡ, бСТР и ВпбИТР 5-(№бензилкарбоксиамид-2'дезоксиуридинтрифосфат).
4,8 нмоль праймера 1 (8ЕО ГО ΝΟ: 165), содержащего единственный хромофор, нитрозоазидоанилин (ΑΝΑ, обозначенный в последовательности как X), на 5'-конце, и 4 нмоль матрицы 1 (8ЕО ГО ΝΟ: 46), содержащей два биотиновых остатка (обозначенных в последовательности как В') и 40 рандомизированных положений (А, С, Ο или Т) (обозначенных в последовательности как Ν), объединяли в 100 мкл 1х ДНК-полимеразного буфера ΚΟΌ (№уадеп), нагревали до 95°С в течение 8 мин и охлаждали на льду. 100 мкл смеси праймер:матрица добавляли к 400 мкл реакции достройки, содержащей 1х ДНК-полимеразный буфер ΚΟΌ, 0,125 Ед/мкл ДНК-полимеразы ΚΟΌ ХЬ и 0,5 мМ каждого из бАТР, бСТР, бΟΤΡ и ВпбИТР, и инкубировали при 70°С в течение 30 мин. Двухцепочечный продукт собирали посредством биотинов матричной цепи с добавлением 1 мл покрытых стрептавидином магнитных бусинок (МадпаВшб 81гер1ау|б1п, Р1егсе, 5 мг/мл в 3 М №С1, содержащем 0,05% Т\УЕЕИ-20) и инкубировали при 25°С в течение 10 мин при помешивании. Бусинки трижды промывали 0,75 мл буфера 8В17Т (40 мМ НЕРЕ8, рН 7,5, 125 мМ №С1, 5 мМ КС1, 5 мМ МдС12, 0,05% Т\УЕЕИ-20). Аптамерную цепь элюировали с бусинок с помощью 1,2 мл 20 мМ ΝηΟΗ, нейтрализовывали 0,3 мл 80 мМ НС1 и забуферивали, используя 15 мкл 1 М НЕРЕ8, рН 7,5. Кандидатные смеси концентрировали с помощью С.’еп1псоп-30 приблизительно до 0,2 мл и подвергали количественному спектроскопическому анализу УФ-поглощения.
Таблица 1
Последовательности матрицы и праймеров 8ЕИЕХ 1
Обозначение олигонуклеотида Последовательность (5'—>3' ) ЗЕр Ιϋ ΝΟ:
Матрица 1 АВ'АВ'ТТТТТТТТШТСТТОТТТСТТСТСТОТО- (Шдо-САООСАОАСООТСАСТС 46
Праймер 1 хоотсттотттсттстстото 165
Праймер 2 АТАТАТАТОАОТОАССОТСТОССТО 47
Праймер 3 АВ'АВ'ТТТТТТТТСОТСТТОТТТСТТСТСТОТО 48
Праймер 4 ттттттттоотсттотттсттстстото 169
B. Получение белка-мишени.
Немеченный человеческий β-ΝΟΡ (Κ&Ό 8у51ет5) биотинилировали путем ковалентного связывания NН8-ΡЕΟ4-биотина (Р1егсе) с лизиновыми остатками. Белок (300 пмоль в 50 мкл) обменивали в 8В17Т с использованием микроспиновой колонки 8ерйабех Ο-25. NН8-ΡЕΟ4-биотин добавляли до 1,5 мМ и реакционную смесь инкубировали при 4°С в течение 16 ч. Непрореагировавший NН8-ΡЕΟ4биотин удаляли на микроспиновой колонке 8ерйабех Ο-25.
C. Иммобилизация белка-мишени.
Белок-мишень иммобилизировали на парамагнитных бусинках МуΟηе-δΑ (МуΟηе 8А, 1пуйгодеп, или, как они будут называться далее, на 8А-бусинках), в цикле 1 способа §ЕЬЕХ. β-ΝΟΡ разбавляли до 0,2 мг/мл в 0,5 мл 8В17Т и добавляли к 0,5 мл 8А-бусинок (предварительно дважды промытых в 20 мМ ΝηΟΗ и однократно - в 8В17Т). Полученную смесь перемешивали в течение 30 мин при 25°С и до использования хранили при 4°С.
Ό. Отбор целевых аптамеров способом обогащения с низкой скоростью диссоциации и путем фотохимической сшивки.
Были предприняты способы отбора из кандидатной смеси, сравнение связывания между образцами и белком-мишенью (сигнал 8) и образцами без белка-мишени (фон В). Первые три цикла были предприняты с отбором в отношении аффинности (без фотохимической сшивки); второй и третий циклы включали процесс обогащения с низкой скоростью диссоциации. Циклы с четвертого по девятый включали как процесс обогащения комплексами с низкой скоростью диссоциации, так и фотохимической сшивкой.
Для каждого образца 90 мкл смеси ДНК получали в 8В17Т с 10-20 пмоль кандидатной смеси (56 пмоль в первом цикле) и 56 пмоль обратного праймера. Образцы нагревали до 95°С в течение 3 мин и охлаждали до 37°С со скоростью 0,1°С/с. Образцы объединяли с 10 мкл конкурентной белковой смеси (0,1% Н8А, 10 мкМ казеина и 10 мкМ протромбина в 8В17Т), добавляли к 0,5 мг 8А-бусинок и инкубировали при 37°С в течение 5 мин при перемешивании. Бусинки удаляли путем магнитного разделения.
Реакции связывания предпринимали путем добавления 10 мкл белка-мишени (0,5 мкМ в 8В17Т)
- 19 022429 или 8В17Т к 40 мкл смесей ДНК и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Процесс обогащения с низкой скоростью диссоциации использовали тремя различными путями. В циклах два и три образцы 20-кратно разбавляли путем добавления 950 мкл 8В17Т (предварительно нагретого до 37°С) и инкубировали при 37°С в течение 15 мин перед началом захвата комплексов. В циклах четыре и пять образцы 20-кратно разбавляли путем добавления 950 мкл 8В17Т (предварительно нагретого до 37°С) и инкубировали при 37°С в течение 30 мин перед фотосшивкой. В циклах шесть и семь образцы 20-кратно разбавляли путем добавления 950 мкл 8В17Т (предварительно нагретого до 37°С). 50 мкл каждого разбавленного образца вновь разбавляли путем переноса в 950 мкл 8В17Т, содержащего 10 мМ декстрансульфата (5 кДа) (предварительно нагретого до 37°С), что дает общее 400-кратное разведение, и инкубировали при 37°С в течение 60 мин перед фотосшивкой. В циклах восемь и девять образцы 20-кратно разбавляли путем добавления 950 мкл 8В17Т (предварительно нагретого до 37°С) и 50 мкл каждого образца вновь разбавляли путем переноса в 950 мкл 8В17Т, давая 400-кратное разведение. Наконец, 50 мкл каждого 400кратно разведенного образца вновь разбавляли путем переноса в 950 мкл 8В17Т, содержащего 10 мМ декстрансульфата (5 кДа) (предварительно нагретого до 37°С), давая в общей сложности 8000-кратное разведение, и инкубировали при 37°С в течение 60 мин перед фотосшивкой. При осуществлении фотосшивки 1 мл реакции связывания после процесса обогащения с низкой скоростью диссоциации облучали сверху с помощью совокупности ЬЕО 470 нм в течение 60 с до захватывания комплекса.
Комплексы захватывали 8А-бусинками посредством биотинов белка с добавлением 0,25 мг МуОпе-8А-бусинок (Ιηνίίτο^βη) и инкубировали при 25°С в течение 15 мин при перемешивании. Свободную ДНК удаляли путем 5-кратного промывания бусинок буфером 8В17Т. Если специально не указано иное, все промывки осуществляли путем ресуспендирования бусинок в 100 мкл промывочного раствора, перемешивали в течение 30 с при 25°С, отделяли бусинки магнитом и удаляли промывочный раствор. Цепь аптамера элюировали с бусинок путем добавления 85 мкл 20 мМ ΝαΟΗ и инкубировали при 37°С в течение 1 мин при перемешивании. 80 мкл элюата аптамера переносили в новую пробирку после магнитного разделения, нейтрализовывали 20 мкл 80 мМ НС1 и забуферивали, используя 1 мкл 0,5 М ТЙ8-НС1, рН 7,5.
При осуществлении фотоселекции комплексы захватывались, как было указано выше, и несшитую ДНК удаляли путем однократного промывания бусинок 4 М гуанидином-НС1, содержащим 0,05% Т\УЕЕН-20 при 50°С в течение 10 мин, однократного промывания 20 №ОН при 25°С в течение 2 мин, двукратного промывания буфером 8В17Т и однократного промывания 16 мМ №С1. Поперечно сшитую ДНК не удаляли с поверхности бусинок с целью проведения стадий амплификации.
Е. Амплификация и очистка аптамера.
Отобранный аптамер ДНК амплифицировали и количественно определяли с использованием ОРСК. 48 мкл ДНК добавляли к 12 мкл смеси ОРСК (5х ДНК-полимеразный буфер ΚΟΌ, 25 мМ МдС12, 10 мкМ прямого ПЦР-праймера (праймер 2, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 47), 10 мкМ биотинилированного обратного ПЦРпраймера (праймер 3, 8ЕЦ ГО ΝΟ: 48), 5х 8УВК Сгееп I, 0,125 Ед/мкл ДНК-полимеразного буфера ΚΟΌ ХЬ и 1 мМ каждого из бАТР, бСТР, άΟ'ΓΡ и бТТР) и подвергали циклической термообработке в аппарате Вю-Каб Му1Ц ОРСК со следующим протоколом: 1 цикл при 99,9°С, 15 с, 55°С, 10 с, 68°С, 30 мин, 30 циклов при 99, 9°С, 15 с, 72°С, 1 мин. Количественное определение осуществляли с использованием программного обеспечения и отобранное число копий ДНК, без белка-мишени или с белком-мишенью, сравнивали для определения соотношений сигнал/фон.
При осуществлении фотоселекции копию кДНК отобранной ДНК получали путем достройки праймера на поверхности бусинок. Промытые бусинки ресуспендировали в 20 мкл смеси достроенной кДНК (буфер для достройки праймера, содержащий 5 мкМ небиотинилированного обратного ПЦР-праймера (праймер 4, 8ЕЦ ГО ΝΟ: 169), 0,5 мМ каждого из бАТР, бСТР, бΟТΡ и бТТР, а также 0,125 Ед/мкл ДНК-полимеразного буфера ΚΟΌ ХЬ) и инкубировали при 68°С в течение 30 мин при перемешивании. Бусинки 3 раза промывали буфером 8В17Т и цепь кДНК элюировали с бусинок путем добавления 85 мкл 20 мМ NаΟН и инкубировали при 37°С в течение 1 мин при перемешивании. 80 мкл элюата аптамера переносили в новую пробирку после магнитного разделения, нейтрализовывали 20 мкл 80 мМ НС1 и забуферивали, используя 1 мкл 0,5 М ТгС-НС’Е рН 7,5. кДНК амплифицировали и количественно определяли с использованием ОРСК, как было описано выше, с проведением 30 циклов при 99,9°С, 15 с, 72°С, 1 мин.
После амплификации продукт ПЦР улавливали на поверхности 8а-бусинок посредством биотинилированной антисмысловой цепи. 1,25 мл 8а-бусинок (10 мг/мл) дважды промывали 0,5 мл 20 мМ ΝαΟΚ однократно промывали 0,5 мл буфера 8В17Т, ресуспендировали в 1,25 мл 3 М ΝαΟ + 0,05% Т\\ееп и хранили при 4°С. 25 мкл 8а-бусинок (10 мг/мл в 3 М ШОТ) добавляли к 50 мкл двухцепочечных продуктов ОРСК и инкубировали при 25°С в течение 5 мин при перемешивании. Бусинки однократно промывали буфером 8В17Т и смысловую цепь элюировали с бусинок путем добавления 200 мкл 20 мМ NаΟН и инкубировали при 37°С в течение 1 мин при перемешивании. Элюированную цепь отбрасывали и бусинки 3 раза промывали буфером 8В17Т и однократно промывали 16 мМ №С1.
Смысловую цепь аптамера получали, используя хромофор АNА, путем достройки праймера из им- 20 022429 мобилизированной антисмысловой цепи. Бусинки ресуспендировали в 20 мкл реакционной смеси достроенного праймера (1х буфер для достройки праймера, 1,5 мМ МдС12, 5 мкМ прямого праймера с 5'-хромофором ΑΝΑ (праймер 1, 8ЕО ГО ΝΟ: 165), 0,5 мМ каждого из άΑΤΡ, ЙСТР. άΟΤΡ и άΤΤΡ, а также 0,125 Ед/мкл ДНК-полимеразного буфера ΚΟΌ ХЬ) и инкубировали при 68°С в течение 30 мин при перемешивании. Бусинки 3 раза промывали буфером 8Β17Τ и цепь аптамера элюировали с бусинок путем добавления 85 мкл 20 мМ ΝαΟΗ и инкубировали при 37°С в течение 1 мин при перемешивании. 80 мкл элюата аптамера переносили в новую пробирку после магнитного разделения, нейтрализовывали 20 мкл 80 мМ НС1 и забуферивали, используя 5 мкл 0,1 М НЕРЕ8, рН 7,5.
Ρ. Выбор обратной связи и условий строгости.
Концентрация соответствующего белка-мишени на стадии селекции при каждом цикле снижалась в соответствии с соотношением 8/Β следующим образом, где сигнал 8 и фон В определены выше в разделе Ό:
Если 5/В<10, [Ρ] (ί+ΐ)= [Ρ]ι
Если 10<5/В<100, [Ρ] ϋ+ιι=[Ρ]ί/3,2
Если 3/В>100, [Р] ц+ц= [Рк/Ю, где [Р]=концентрация белка, 1=номер текущего цикла.
После каждого цикла селекции определяли конвергентный статус обогащенной смеси ДНК. 10 мкл двухцепочечного продукта ОРСК разбавляли до 200 мкл 4 мМ МдС12, содержащим 1х 8ΥΒΚ Сгссп I. Образцы покрывали 75 мкл силиконового масла и проводили анализ на предмет сходимости с помощью С0!-анализа, в котором измеряется время гибридизации комплексных смесей двухцепочечных олигонуклеотидов. Образцы подвергали циклической термообработке в соответствии со следующим протоколом: 3 цикла при 98°С, 1 мин, 85°С, 1 мин, 1 цикл при 93°С, 1 мин, 85°С, 15 мин. В течение 15 мин при 85°С измеряли флуоресцентные изображения с 5-секундными интервалами. Интенсивность флуоресценции наносили в виде логарифмической функции 1од (от времени) и с каждым циклом 8ЕЬЕХ наблюдали повышенную скорость гибридизации, что указывает на конвергенцию последовательностей.
Ο. Способ скрининга клонов и идентификация аптамеров.
Конвергированный пул, полученный после девяти циклов 8ЕЬЕХ, клонировали и секвенировали. Отобранную ДНК подвергали ПЦР-амплификации с небиотинилированными 8ЕЬЕХ-праймерами для создания ΑΟСΤ ДНК, очищали с помощью набора ОМсццск 96 РСК РигШсайои Кй (Са! # 28181) и очищенные вставки клонировали, используя набор 8!га!адепе РСК-8спр! С1отид Кй (Са! # 211189), в соответствии с инструкциями изготовителя. Лигированные пулы 8ЕЬЕХ отсылали в компанию по секвенированию (Содеи1С8, Нои8!ои, Τеxаδ) для трансформации, расположения в 96-луночных планшетах, подготовки и секвенирования ДНК. Были получены последовательности ~42 клонов, их подвергали анализу на предмет сходимости, используя общеупотребимое для этого программное обеспечение, с помощью которого определяют значение порядкового номера последовательности/число копий и идентифицируют общий характер сходимости с помощью алгоритма локального выравнивания. Последовательности с наиболее высокой воспроизводимостью/числом копий в пуле и последовательности, которые сводились к общим мотивам связывания, отбирались для дальнейшего скрининга. Для дальнейшего анализа было отобрано шесть последовательностей и их получали ферментативным путем с использованием плазмидной ДНК, полученной от компании Содетсз, в качестве матрицы для ПЦР-амплификации.
H. Измерение константы равновесного связывания (К2).
Константы равновесного связывания 6 отобранных последовательностей измеряли путем анализа на определение аффинности. Радиоактивно меченую ДНК нагревали в течение 3 мин при 95°С в буфере 8Β17Τ-0,002 (8Β17Τ с Τ№ΗΗΝ-20 доведенный до 0,002%) и медленно остужали до 37°С. Комплексы образовывались в результате смешивания низкой концентрации радиоактивно меченой ДНК (~1 х 10-11 М) с белком-мишенью с разбросом концентраций (от 1х10-7 до 1х10-12 М) в 8Β17Τ-0,002 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Часть каждой из реакционных смесей переносили на нейлоновую мембрану и высушивали для определения общего счета в каждой реакции. Комплексы перехватывали на смоле ΖΟΚΒΑΚ (Адйеи!), пропущенной под вакуумом через планшет МиШзсгееи НУ Р1а!е (Мййроге), и промывали 200 мкл буфера 8Β17Τ-0,002 для отделения белок-связанных комплексов из несвязанной ДНК. Нейлоновую мембрану и планшет МиШзсгееи НУ фосфорометрически визуализировали и количественно определяли уровень радиоактивности в каждом образце с помощью ЕШ1 ΡΕΑ-3000. Относительное количество (фракцию) захваченной ДНК наносили как функцию концентрации белка (Р!) и определяли константы равновесного связывания (К) посредством уравнения у=(тах-т!п)(Р|)/(К,|+Р|)+т1п. Клон 2426-66 (8ЕО ГО ΝΟ: 1, перечисляемый в табл. 3), 76-мер, с К,|=5х 10-9 М, был отобран как лидирующий клон для определения дальнейших его характеристик, см. фиг. 1.
I. Полное секвенирование пула 8ЕЬЕХ.
Для более полной оценки последовательностей внутри пула семейства аптамеров 2426-66 данный обогащенный пул секвенировали с использованием технологии пиросеквенирования-454. Пул ДНК амплифицировали с помощью праймеров согласно технологии 454, как описано выше, и продукт ПЦР очищали и нормировали, используя 8едиа1 погтаП/аОоп р1а!е Диуйгодеи, Са! # Α 10510-01). Элюат нано- 21 022429 сили и пропускали через гель для подтверждения размера и чистоты каждого ампликона. Очищенный продукт ПЦР секвенировали с помощью облегченной технологии пиросеквенирования-464 в Центре Здоровья в университете штата Колорадо, ИшуегкИу о£ Со1огабо НеаЦН §аепсе СеШег ш Аигога СО.
Указанные 454 последовательности выравнивали в соответствии с 2426-66 с использованием СЬиЗТАЬ-анализа. Всего из 1165 мультикопийных последовательностей 165 последовательностей имели характеристики, сходные с таковыми 2426-66. На основе общности 5'-последовательностей в указанных последовательностях их выравнивали по трем группам. Средняя область последовательности была консервативна во всех трех группах. Для всех последовательностей для каждого положения вычисляли степень идентичности с 2426-66, как указано на фиг. 2В. В табл. 2 перечислены номера последовательностей-представителей последовательностей семейства аптамеров 2426-66, где Ζ' представляет собой Впби.
Таблица 2
Последовательности-представители семейства аптамеров* 2426-66
Обозначение аптамера Последовательность (5'—>3') 8ЕЦЮ N0:
2426-87 ΟΑΟεΟΟΟΑϋΑϋΑΖΌΑΟΟΑϋΖ'ΖΌΟΟσΖ’Ζ' ζ’οοεαοζ'ΖΌΖ'οο 49
2426-88 САСсссоАСАСАг’САССАсг'г'оооог'г' ΖΆοεοοζ’ΖΌΖ'οε 50
2426-1373 ССАССОООАСАСАг’САССАСАг’СОООг^ 'ΖΆΟΟΧΟΖ’ΖΌΖΌΟ 51
2426-1621 осАССоооАСАСАг'ОАССАСсг'ооссг'г 'ζ'Αοεεοζζ'οζΌο 52
2426-1634 осоосоооАСАСАг'ОАооАсг'г'Оооог' ζ'ΖΆοεασζ'ΖΌΖΌΟ 53
2426-1627 осАосооОАСАСАг'г'АОСгАСг'гссоог1 Ζ'ΖΆΟΟσΟΖ'Ζ’ΟΖΌΟ 54
2426-1372 ССАССООААСАСАг'ОАСОАСгг'ООООг' гг'АСССог'г'сг’со 55
2426-1387 осАССссг'АСАСАг'ОАООАсг-г'ссосг Ζ'ΖΆΟίΧΟΖ’Ζ’ΟΖΟΟ 56
2426-1527 САОСОООАСАСАгЧЗАООАСгТССОг'ГГ АОСссг’г’ог’оосА 57
2426-1753 гсАосссСАСАСАг’САССАСг’г’осоог ζ'ΖΆοαϋαΖ'Ζ'ϋΖΌϋ 58
2426-1003 осАОСОсоАСАСАг'ОАССАсг'г’оооог’ Ζ'ΖΆΟίΧΟΖ'ΖΌΖΌΟ 59
2426-1626 осАССссоАСАСАг’ОАссАсг’г'соссг· Ζ'ΖΆΟΖ'ΰΟΖ’Ζ'ΟΖΌΟ 60
2426-1380 осАСССоОАСАСАг'САооАсг’г'сссог' гглоссАгтегоо 61
2426-1625 осАосооОАСАСАгоАСОАСггооеог· гг'АОСсг’г'г'ог'ое 62
2426-1388 ссАсссг'ОАСАгАгсАСОАсгг’ссссг' Ζ'ΖΆΟΙΧΟΖ'ΖΌΖΌΟ 63
2426-1381 осАососоАСАСАг’ОАССАсг,г,оосог’ //'АОССС./'/' ΟΖΆΟ 64
- 22 022429
2426-1699 огАсссссАСАСАг'ОАСолсг'г'Ооссг ΖΖΆΑΟΟΪΖΖΟΖ'ΟΟ 65
2426-1702 ΟΖΆΟΟΟΟΟΑΟΑΟΑΖΌΟΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ' Ζ'ΖΆΑϋεΟΖ'ΖΌΖΌΟ 66
2426-1265 СААОСОООАСАСАг’ОАОСАСгг'ОССОг ΖΖΆΑΟεΟΖ’ΖΌΖΌΟ 67
2426-1374 ССАССОООАСАСА2ОАООАСгтеАООГ Ζ'Ζ-ΑΑί’ΟΟΖ'ΖΟΖΌΟ 68
2426-1377 осАОССХЮАСАСАгцАбОАсгтеооог· Ζ'Ζ’ΑΑΟεΟΖ'ΖΌΖΌΟ 69
2426-1384 ссАосоооАСАСАгоАог’Асгтеооог' ΖΆΑεοοζ'ΖΌΖΌαο 70
2426-1622 сслссоослсАСлг'Слоолсгтаоосг' ΖΆΑϋΟΟΖ'ΖΌΖΌΟΤ 71
2426-1378 ОСАССОООАСАСАГОАООАСг'ГООООг' Ζ'Χ'ΑΑίΓΟΖ'ΖΟΖΌΖ' 72
2426-1266 ОААССОООАСАСАг'САООАСг'г'ООООг Ζ'ΖΆΟίΧΟΖ'ΖΌΖ'ΖΌ 73
2426-1537 ΟΑΑΟϋΟΟΟΑΌΑΟΑΖΌΑΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ' Ζ'ΖΑΟΌΌΟΖ'ΖΌΖΌΟ 74
2426-1355 ССААСССОАСАСАг'САХ'ОАСг'г'ОСООг ζ’ΖΆοεεοζ'ΖΌΖ’οο 75
2426-1385 ССАСССССАСАСАГСАг'САСГг'г'ССОГ Ζ'ΖΑΟίΤΟΖ'ΖΆΖΟΟ 76
2426-1701 οζΆοοοοοΑΌΑϋΑΖΌΑΖΌΑϋΖ'Ζ’οοσοζ' ΖΖΆΟΟΟΟΖ’Ζ'ΟΖΟΟ 77
2426-1458 ог'АосссоАСАСАг’ОАОСАсг’г'осооо 7У;ЛССССт7'7/СССС 78
2426-1700 οζΆΟΌΟΌΟΑΟΑεΑΖΌΑΟΟΑεζ’ΖΌΟοαζ’ Ζ'ΖΆΟϋεΟΖ'ΖΌΖΌΟ 79
2426-1386 осАосоооосАСАгоАСОАсгтеооог' ΖΖΆΟ€€ΟΖ'Ζ'ΟΖΌΟ 80
2426-1623 осАОСОООАСАСАг'ОАООАсг'г'бооог' Ζ’ΖΆΟΟΑΟΖΖ'ΑΖΟΟ 81
2426-1392 ΟΌΑαΖ'ΟΟΟΑΟΑΟΑΖ'ΟΑΟΟΑΟΖ'Ζ'ΟΟΟΟΖ· ΖΖΆΟίΧΟΖ’Ζ'ΑΖΟα 82
2426-1624 есАСССССАСАСАг'ОАОСАсггсссог’ гг'Аосссг'г'Аг'сс 83
2426-1383 ссАССоссАСАСАгсАССАсг’г'ссссг' Ζ'ΖΑζΧΧΟΖΖΌΖΌΟ 84
2426-1382 ссАоссссАСАСАг’ОАосАсг'г'ОООог’ Ζ'ΖΆΟϋεΟΖ'ΖΌΖΌΑ 85
2426-1619 осАСССССАСАСАг'ОАсг’Асг’г'Оосог Ζ'ΖΆΟίΧΟΖ’ΖΌΖΌΟ 86
2426-1389 ссАОстеоАСАСАСОАООАСгтообог'г ΖΆΟϋΖΌΖ'ΖΌΖΌΟ 87
2426-1371 ССАССАССАСАСАг'ОАООАСгг'ОССОг' ΖΖΑίΧΧΟΖΖΌΖΌΟ 88
2426-1391 ссАог’АССАСАСАг'САОСАсг'г'оооог’ ΖΖΆΟΟΟΟΖ'ΖΌΖΟΟ 89
2426-1618 ССАОАССОАСАСАг'ОАССАСг’г'ССОСг ζ'ζ'ΑΟΕΤΟζ'ζΌζ'αϋ 90
- 23 022429
2426-1629 ОСАОг'ОСОАСАСАГСАССАСгТСООСг' ζ'ΖΆοεεοζ’ΖΌΖΌΟ 91
2426-1393 ΟϋΑΟΖΌΟΟΑΖΆεΑΖ'ΟΑΟΟΑΰΟΖ'ΖΌΟΟΟ ζζ'ΖΆοεσοζζοζΌ 92
2426-1457 Ог'АССОООАСАСАГОАООАССг'г'ОООО ζζζΆΟΌσσζ'ζ'οζο 93
2426-1642 ССАОСОСООСАСАг’САСОАСг’ГСССООг ΖΖΆθεΟΟΖ'ΖΟΖΏ 94
9999-1044 ОСАССССОАСАСАг'ОАОСАСгГООСООг ’Ζ'ΖΆΟίΧΟΖ’ΖΌΖΌ 95
2426-1628 СЗСАССОООАСАСг’Аг'ОАОСАСгТСООО ггг'Аооссогг'сг 96
2426-1376 осАосоооАСАСАг'ОАооАсг’г’Оооог Ζ'ΖΆΑΟϋΟΖ'Ζ' 97
2426-1379 осАОСОООАСАСАг'САОСАсг'г'оосог Ζ'Ζ'ΑΟ 98
2426-1375 ОСАОСОООАСАСАГОАООАСгТОООООг 'ζ'ζΆοσ 99
2426-1390 οόαοοζόοαοαοαζοαζόζάοοζ'ζόοο сгггАссс 100
2426-1390 οοαοοζ'ΟΟαοαοαζόαζόζάοοζζόοο ΟΖ'Ζ'Ζ'ΛΟΟΟ 101
2426-1402 οοααοζάοοοζόοαζόοοοοζ’ζόοοοζ ΖΖΆΟΟΟΟΖ'Ζ'ΑΖΌΟ 102
2426-1531 ΟΑΑΟΖ'ΑΟϋΟΖΌΟΑΖ'ΟΟΟΟΟΟΖ'ΖΟΟΟΟΖ’ ζζάοοοοζ'ζάζόο 103
2426-1401 ΟαΑΑΟΖ’ΑΟΟΟΖΌΑΖΌΟΟΟΟΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ' ζζάοοοοζ’ζάζόο 104
2426-1755 ζόοααοζάοοοζόοαζόοοοοοζ'ζόοο Ζ'Ζ'Ζ'ΛΟίΧ'Ό Ζ'Ζ’ΑΖΌ 105
2426-1404 ΟΟΑΑΟΖΆΟΟΟΖΌΟΑΖΌΟΟΟΟΟΖΖΌΟΟΟ Ζ'Ζ’Ζ'ΑΟΟΟΑΖ'ΖΆΖΟ 106
2426-1009 ΟΟΑΑΟΖΆΟΟΟΖΌΟΑΖΌΟΟΟΟΟΖ'ΖΌΟΟΟ Ζ'Ζ'Ζ'ΑΟΟΟΟΖ'Ζ'ΑΖΌ 107
2426-1403 ΟΟΑΑΟΖΆίίΟΟΖΟΟΑΖΟΟΟΟΟΟΖΖΌΟΑΟ ΖΖ'ΖΆΟΟΟΟΖ'ΖΆΖΟ 108
2426-1637 οοααοζάοοοζόοαζόοοοοοζ'ζόοοο ΖΖΖΆΑΟΟΟΖ'ΖΑΖΌ 109
2426-1529 οαααοζάοοοζόοαζόοοόοοζ^όοοο Ζ'Ζ'ΖΆΟΟΟΟΖ'Ζ'ΑΖΌ 110
2426-1638 ΟΟΑΑΟΖ'ΑΟΟΟΖΌΟΑΖΌΟΟΟΟΟΖ'ΖΌΟΟΟ ζζ'ΖΆοσεσζ'ζοζο 111
2426-1643 οοαοοζάοοοζόοαζόοοόαοζ’ζόοοό Ζ'Ζ'Ζ'ΑΟΟΟΟΖ'ΖΌΖ'Ο 112
2426-1636 οοααοζάοοαοοοαζόοοοοοζ'ζόοοο ΖΖΖ'ΑΟίΧΤΟΖΖΆΖΌ 113
2426-1405 οόααοζάοοοζόοαζόοοοοοζ'ζόοοο Ζ'Ζ’Ζ'ΑΖΌΟΟΖ'Ζ'ΑΖΆ 114
2426-1406 ΟΟΑΑΟΖΆΟΟΟΖΌΟΑΖΌΟσΟΟΟΖ’ΖΌΟΟΖ' ΖΆΟΖ' 115
2426-1364 ΟΟΑΟΑΑΖΌΟΟΟΖΆΖΆΖΌΑΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΑ ΟΖ'Ζ'Ζ'ΑΟΟΟΟΖ'ΖΌΖ' 116
- 24 022429
2426-1365 ίΧΙΑΟΑΑΖ'ΟϋΟΟΖΆΖΆΖ'ΟΑΟΟΑϋΖ'ΖΌΟΟ ΟΖ'Ζ'ΖΆΟΙΧΟΖ'ΖΌΖ' 117
2426-1366 ΟΟΑΟΑΑΖΌΌΟΟΖ'ΑΖΆΖΌΟΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟ сггтосссогг’ог 118
2426-1617 ΟΟΑΟΑΑΖΌεΟΟΖΆΖΆΖ'ΟΟΟΟΟΟΖΖΌΟΟ αζζ'Ζ'Αζταοζ· ζοζ1 119
2426-1367 ΟΕΑΟΑΑΖ'ΟΌΟΟΖΆΖΆΖΌΟΟΟΟΟΖ'ΖΌΟΟ ΟΖ'Ζ'ΖΆΟεΟΑΖ’ΖΌΖ' 120
2426-1067 <3€ΑΟΑΑΖΟΑΟΟΖ’ΑΖ'ΑΖΌΑΟΟΑεΖ'Ζ'ΟΟΟ οζζζ' Αοαζοζζ’οζ' 121
2426-1369 (^ΑΟΑΑΖΌεοαΖ’ΑΖ'ΑΖΌΟΟΟΟεΖΖΌΟΟ ΟΖ'Ζ'ΖΆΖΊΧΟΖ'ΖΆΖ' 122
2426-1368 (ΧΙΑΟΑΑΖΟεΟΟΖ'ΑΖΆΖΌΟΟΟΟεζ'ΖΌΟΟ οζ'Ζ'ΖΆααοοζ'ζ'ΑΖ' 123
2426-1370 ΟϋΑΟΑΑΖ'ΟΟΟΟΖ’ΑΖ'ΑΖ'ΟΟΟΟΟεΖ’Ζ'ΖΌΟ (ΙΖ'Ζ'ΖΆίΚΧ'.σΖ'ΖΆΖ' 124
2426-1616 ссАОААг'ссссг'Аг'Аг'сосоАсг'г'осо ΟΟΖ'Ζ'ΖΆΟΙΧΟΖ'ΖΌ 125
2426-1363 0€Α0ΑΑΖΌε00ΖΆΖΆ0ΖΌ0000εΖ·ΖΌ0 οοζ'Ζ'ΖΆσσΓΟΖΖΆ 126
2426-1519 ΖΌΓΑΟΑΑΖΌΓΟΟΖΆΖ-ΑΖ'ΟΟΟΟΟΰΖΖΌΟ οοζ'ζζ'Αζυεο 127
2426-1156 ΟΖΌΖ’σΑεΖ'Ζ'ΟΖΌΟΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ'Ζ'ΟΑ гсссгтогссссс 128
2426-1743 ΟΖΌΖΌΑΟΖ’ΖΌΖΌΟΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ'ΖΌΑ гсссгтсгтсосс 129
2426-1514 ΟΖΌΖΌΑΟΖ'Ζ'ΟΖΟΟΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ'ΖΌΑ ΖΌΟΟΖ’ΖΌΖ'Ζ'Ζ'ΟΟΖ' 130
2426-1513 сгсгсАсгссгсоссАсггссссгтсА 7’ссо7/?;ст7;/сосг 131
2426-1742 ΟΖΌΖ'ΟΑΟΖ’ΖΌΖΌΟΟΟΑΟΖ’ΖΌσαΟΖ'ΖΌΑ гссАА/сгтсссг' 132
2426-1744 ΟΖΌΖ'ΟΑΟΖ'ΖΌΖ’ΟΟΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ'ΖΌΑ гссогтогтгсос 133
2426-1157 ΟΖΌΖ'ΟΑΟΖ'ΖΌΖ’ΟΟΟΟΑΟΖ'Ζ'Ζ'ΟΟΟΖ'ΖΌΖ ΆΖΟΟΟΖ'ΖΌΟΖ'ΖΖΌ 134
2426-1094 оосоАсососАСАогчзооог'Аогтеос ΟΖ'Ζ'ΖΆΑΟΟΟΖ'ΖΌΖ' 135
2426-1417 ссссАСОСОСОСАгАсссгАогг'оооо Ζ'Ζ’ΖΆΑΟΟΟΖ'ΖΌΖ’Ο 136
2426-63 ссоАсссссссАгосссгАсггсссог Ζ'ΖΆΑΟΟΟΖ'Ζ'ΟΖΌΟ 137
2426-1038 САССААСАгсАООАСгг’ссссгг'г'АСС ссг'г'огсссАСАО 138
2426-1571 ΟΑΟΟΑΑΟΑΖ’ΟΑΟΟΑΟΖ'ΖΟΟΟΟΖ'Ζ'ΖΆΟΟ согтогтссАСАО 139
2426-1100 ΟΟΟΑΑΟΟΟΑΖΆΖΌΑΟΟΑΟΖ’ΖΌΟΟΟ ггтАСсссгтогсссА 140
2426-1419 ООСААСССАг'Аг'ОАССАС ζ'ζοοοοζτζάζόοοζ'ζόζοααο 141
2426-1089 ΟΟΑΟΖΆΟΟΟΑΑΑΑΖΌΟΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ’ Ζ'ΖΆΖΌΟΟΖ'ΖΌΖΌΑ 142
2426-1064 ΟΑΖ'ΖΌΌΖΌΟΑ ΟΟΑ ΖΌΟ ΟΟΑΟΖΌΟΟΟ Ο ζ’ζ'ζ’αζ1 ссогг οζόα 143
2426-1352 οαζ'ζόόζόοαοοαζόοοοαοζζόοοοζ· Ζ'ΖΆΖΌΟΟΖΖ'ΟΖΌΑ 144
2426-1198 ΟΑΖ'ΖΌΌΖ’ΟΟΑΟΟΑΖΌΑΟΟΑΟΖ’ΖΌΟΟΟΖ' ζζάοοοοζ'ζόζόο 145
2426-1073 оссооооссосг'Аг’ОАООАСАгоооогг ’ΖΆΟΌΟΟΖ’ΖΌΖΌΟ 146
2426-1068 ΟΌΑΟΑΑΖΌΌΟΑΖΆΖΆΖΌΟΟΟΟΟΖ'ΖΌΟΟ οζ'Ζ'ζάοοοοζ'ζάζ' 147
2426-1231 οοζόοοαοαοζόοζόοοοοοοζζόοοο Ζ'ΖΌΑΟΌΟΟΖ'Ζ'ΑΖΌ 148
*Показана только область 40Ν.
- 25 022429
На основе этого, как указано выше, была определена следующая консенсусная последовательность связывания с β-ΝΟΡ:
ΒΑΖΟΚΟΟΚδΖΖΟΟΟΟΖΖΖΑΌΟΟΟΖΖΚΖΟ (δΕΕ) ΙΌ ΝΟ: 3), в которой В, Ζ, К и δ являются такими, как определено выше.
Хотя консенсусная последовательность содержит 28 нуклеотидов в длину, ряд последовательностей, перечисленных в табл. 2, имеет в указанной консенсусной последовательности вставки из одного основания. На фиг. 2В показано, что приблизительно 91% последовательностей имеет делецию в положении 12, но приблизительно 7% последовательностей имеет в этом положении Ο или Ζ и приблизительно 95% последовательностей имеет делецию в положении 19, но приблизительно 3% последовательностей имеет в этом положении Ο. Данное наблюдение свидетельствует о том, что вставки консенсусной последовательности β-ΝΟΡ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3) в некоторых положениях являются допустимыми и что такие вставки не вызывают инактивации β-ΝΟΡ-аптамера.
Пример 2. Исследования укорочения последовательностей.
β-ΝΟΡ-аптамер 2426-66 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1) насчитывает в длину 76 нуклеотидов с Ка=5х10-9 М. Для большей части эффективных химических синтезов важно идентифицировать минимальную высокоаффинную последовательность аптамера и укорачивать такой аптамер до наименьшего возможного размера. К другим положительным качествам относятся повышение проницаемости тканей и стабильность в отношении активности нуклеазы ίη νίνο.
Чтобы идентифицировать минимальную область аптамера 2426-66 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1), которая сохраняет связывающую активность, синтезировали целую серию укороченных вариантов, представляющих собой все возможные последовательности длиной в 50 смежных нуклеотидов, представленных в 2426-66. Последовательности указанных вариантов перечислены в табл. 3, в которой Ζ' представляет собой Βηάυ, и Т представляет собой άΤ. Указанные варианты тестировали на предмет их аффинности путем анализа аффинности связывания с β-ΝΟΡ, как описано выше.
Таблица 3
Последовательности аптамеров 2426-66 и их укороченных вариантов
Обозначение аптамера Последовательность (5’-> 3') 8Е<) ГО ΝΟ:
2426-66 (76-мер) САСТОАСССТСТСССТССАСССОСАСАСАг'СА ооАсг’г'ооссгг'г'Асссог’г’ог’сосАСАСАо ААОАААСААОАСС 1
2426-66-2 (50-мер) ОАОТОАССОТСТОССТОСАОСОООАСАСАгОА ооАсггоосогтг'АОссс 4
2426-66-3 (50-мер) АОТОАССОТСТОССТОСАОСОООАСАСАг’ОАО οαοζ'ζόοοοζ'Ζ'ζάοοοοζ· 5
2426-66-4 (50-мер) ОТОАССОТСТОССТОСАОСОООАСАСАг'ОАОО ΑΟΖ'ΖΌΟΟοζ'Ζ'ζΆοσεοζ'ζ' 6
2426-66-5 (50-мер) ТОАССОТСТОССТОСАОСОООАСАСАг'ОАООА οζ'Ζ'οοσοζ'Ζ'ΖΆσοϋΟΖ'ΖΌ 7
2426-66-6 (50-мер) ОАССОТСТОССТОСАОСОООАСАСАг'ОАООАС ζ'Ζ'οαοοζ'Ζ’ΖΆαεοοζ'ζ’οτ 8
2426-66-7 (50-мер) АСССТСТСССТССАОССООАСАСАг’САООАСг' ΖΌΟΟΟΖ'Ζ'ΖΆΟΟΟΟΖ'ΖΌΖΌ 9
2426-66-8 (50-мер) ССОТСТОССТОСАОСОССАСАСАг'ОАООАСг'г’ οοοοζ'ζ'ΖΆοεεοζ'ΖΌΖΌο 10
2426-66-9 (50-мер) сотстосстосАосоооАСАСАгг'ОАаоАсг'г ΖΌΟοοζ’ζζΆσοοοζ'ζΌΖ'σαο 11
2426-66-10 (50-мер) стстссстасАОсаоаАСАСАг'ОАооАсгтоо οαζ'Ζ'ΖΑΟοοαζζοζΌοεΑ 12
2426-66-11 (50-мер) тстосстосАосаосАСАСАг'САооАсг'г'соо οζ'Ζ'ζάοοοοζ'Ζ'οζόοοαο 13
2426-66-12 (50-мер) СТОССТОСАОСОООАСАСАг'ОАООАСг'ГОООО Ζ'Ζ'ΖΆΟΟΟΟΖ'ΖΌΖ'ΟΟΟΑΟΑ 14
- 26 022429
2426-66-13 (50-мер) тссстосАоссоаАСАСАг'ОАооАсг'г'ооссг таАССсог'г'ог'оосАСАО 15
2426-66-14 (50-мер) асстссАССсооАСАСАг'САОСАсг’гоооог ГГАОСССГгОГООСАСАОА 16
2426-66-15 (50-мер) сстосАососОАСАСАг'ОАООАсг'г'оооог'г' ΖΆΟΟϋΟΖ'ΖΌΖΌΟϋΑΟΑΟΑΟ 17
2426-66-16 (50-мер) стосАОСоооАСАСАг'САООАсг'г'оооог’г’г' АОСсог’г’огсосАСАОАСА 18
2426-66-17 (50-мер) тосАососоАСАСАгоАООАсгг'оооогтг'А оссог'г'Ог'аоСАСАОАОАА 19
2426-66-18 (50-мер) осАОсоссАСАСАг'ОАсоАсг'г'сасог'г'г'АС ссог’г’ог'оссАСАОАОААо 20
2426-66-19 (50-мер) САОсосоАСАСАг'ОАСОАсг’г'соссг'г'г'Аос СОгг'Ог'ООСАСАОАОААСА 21
2426-66-20 (50-мер) АоссооАСАСАг'аАООАсг'г'ссааг'г'г'АОСс Ог'ГОг'ООСАСАОАОААОАА 22
2426-66-21 (50-мер) осоооАСАСАг'САСОАсгг'оссогг'г’АОСсо г'г’Сг'СОСАСАОАСААОААА 23
2426-66-22 (50-мер) οοσοΑΌΑΌΑΖΌΑΟΟΑσζ'Ζ'σοσαζ'Ζ'Ζ'Ασεοσζ' ГОг'ОССАСАОАСААОАААС 24
2426-66-23 (50-мер) оооАСАСАгчАООАсгтаооогтаАОССог'г· Ог'СОСАСАСАСААОАААСА 25
2426-66-24 (50-мер) осАСАСАг'ОАООАсг'г'оооог’гг’АОССог'го г'ООС АС А ОАОААОАААСАА 26
2426-66-25 (50-мер) οαοαοαζόαοοαοζ'ζόοοοζ'Ζ'ζάοοοοζ’ζόζ 'ООСАСАОАОААОАААСААО 27
2426-66-26 (50-мер) АСАСАг'ОАООАсг'г'ОООог'г'г'Аоссог'г’ог· ООСАСАОАОААОАААСААОА 28
2426-66-38 (50-мер) ΟΑΟΑΖΌΑΟΟΑΟΖ’ΖΌΟΟΟΖ'Ζ'ΖΆΟοοοζ'ΖΌΖ’α ОСАСАОАОААОАААСААОАС 29
2426-66-39 (50-мер) ΑΟΑΖΌΑΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ'Ζ'ΖΆΟΟΟΟΖ'Ζ'ΟΖΌΟ САСАОАСААОАААСААОАСС 30
Все варианты сохраняли активность связывания с β-ΝΟΡ, за исключением вариантов 2426-66-2 (НЕС) ГО ΝΟ: 4), 2426-66-3 (НЕС) ГО ΝΟ: 5), 2426-66-4 (НЕС) ГО ΝΟ: 6), 2426-66-5 (НЕС) ГО ΝΟ: 7) и 2426-66-6 8Е0 ГО ΝΟ: 8), что свидетельствует о том, что 5'-концевых 26 нуклеотидов (положения 1-26) и З'-концевых 21 нуклеотидов (положения 56-76) в 2426-66 не являются необходимыми для связывания β-ΝΟΡ, и что полностью всех или части остальных 29 нуклеотидных элементов (положения 27-55) может быть достаточно. Такая гипотеза была проверена путем синтеза и измерения аффинностей связывания второй серии вариантов 2426-66 (8ЕС ГО ΝΟ: 1). Последовательности указанных вариантов перечислены в табл. 4, в которой Ζ' представляет собой Впби и Т представляет собой бТ. Все варианты сохраняли активность связывания с β-ΝΟΡ, за исключением вариантов 2426-66-56 (8ЕС ГО ΝΟ: 150), 2426-66-57 (НЕС) ГО ΝΟ: 151), 2426-66-58 (НЕС) ГО ΝΟ: 152) и 2426-66-59 (НЕС) ГО ΝΟ: 153). Вариант 2426-66-55 (8ЕО ГО ΝΟ: 149), 25-мер, оказался самой короткой последовательностью с β-ΝΟΡ-связывающей аффинностью, равной таковой полноразмерного аптамера 2426-66 (8ЕС ГО ΝΟ: 1). Вариант 2426-66-54 (8ЕО ГО ΝΟ: 44), 26-мер, обладал аффинностью в отношении β-ΝΟΡ, слегка лучшей, чем таковая полноразмерного аптамера 2426-66 (8ЕС ГО ΝΟ: 1), и он был выбран для дальнейшей оптимизации.
- 27 022429
Таблица 4
Последовательности укороченных вариантов аптамеров 2426-66
Обозначение аптамера Последовательность (5'—>3') 8ЕЦ 11) ΝΟ:
2426-66-30 (40-мер) тосАОСоооАСАСАг'ОАООАСгг'оооог'г'г'АСС ΟΟΖ'ΖΌΖΌ 31
2426-66-40 (39-мер) осАссоооАСАСАг'ОАсоАсг'г'оооогг'г’Ассс ΟΖ'ΖΌΖΌ 32
2426-66-41 (38-мер) οαοοόοοαοαοαζόαοοαοζ'ζόοοοζ’Ζ'ζάοοοο Ζ'ΖΌΖ'Ο 33
2426-66-42 (37-мер) αοοοοοαοαοαζόαοοαοζ'ζόοοοζ'Ζ’ζάοοοοζ' ΖΌΖΌ 34
2426-66-52 (36-мер) ΟΟΟΟΟΑΟΑΟΑΖΌΑΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ’Ζ'ΖΆΟΟΟΟΖ'Ζ· ΟΖΌ 35
2426-66-43 (35-мер) οοοοαοαοαζόαοοαοζ'ζόοοοζζ’ζαοοοοζ'ΖΌ ΖΌ 36
2426-66-44 (34-мер) οοοαοαοαζόαοοαοζ'ζόοοοζ'Ζ'ζάοοοοζ'ζόζ' о 37
2426-66-45 (33-мер) οοαοαοαζόαοοαοζ'ζόοοοζ'Ζ'ζάοοοοζ'ζόζό 38
2426-66-46 (32-мер) ΟΑΟΑΟΑΖΌΑΟΟΑΟζ'ΖΌσσοζ'Ζ'ΖΆΟΟοσζ'ζΌζΌ 39
2426-66-47 (31-мер) ΑΟΑΟΑΖΌΑΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ'Ζ'Ζ'ΑΟΟΟΟΖ'ΖΌΖΌ 40
2426-66-48 (30-мер) ΟΑΕΑΖΌΑΟΟΑΕΖ'ΖΌΟΟΟΖ'Ζ'Ζ'ΑΟΕΕΟΖ'ΖΌΖΌ 41
2426-66-49 (29-мер) ΑΟΑΖΌΑΟΟΑΟΖ'Ζ'αΟΟΟΖ'Ζ'ΖΆΟΟΟΟΖ'ΖΌΖΌ 42
2426-66-50 (28-мер) ΟΑΖΌΑοοΑοζ'Ζ'σοσσζ’Ζ'ΖΆοοοσζ'ΖΌΖΌ 2
2426-66-53 (27-мер) αζόαοοαοζ'ζόοοοζ'Ζ'Ζαοοοοζ·ζόζό 43
2426-66-54 (26-мер) ζόαοοαοζ'ζόοοοζ'Ζ'ζάοοοοζ'ζόζό 44
2426-66-55 (25-мер) οαοοαοζ'ζόοοοζ'Ζ'Ζ'αοοοοζ'ζόζό 149
2426-66-56 (24-мер) ΑΟΟΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ'Ζ'Ζ'ΑΟΟΟΟΖ’ΖΌΖΌ 150
2426-66-57 (23-мер) οοαοζ'ζόοοοζ'Ζ’ζάοοοοζ'ζόζό 151
2426-66-58 (22-мер) ΟΑΟΖ’ΖΌΟΟΟΖ'Ζ'Ζ'ΑΟΟΟΟΖ'ΖΌΖΌ 152
2426-66-59 (21-мер) ΑΟΖ'ΖΌΟΟΟΖ'Ζ’ΖΆΟΟΟΟΖ'ΖΌΖΌ 153
Пример 3. Определение подходящих положений Βηάυ.
Одиночные замены Βηάυ на άΤ в 26-мерном аптамере.
Девять из 26 нуклеотидов аптамера 2426-66-54 (8ЕО ГО N0: 44) представляют собой Βηάυ. Для определения того, в каких именно положениях Βηάυ вовлечен в связывание, было синтезировано девять вариантов 2426-66-54, каждый из которых содержал единственную замену άΤ в одном из девяти положений Βηάυ, и были измерены аффинности в отношении β^ΟΡ. Последовательности всех вариантов перечислены в табл. 5, в которой Ζ' представляет собой Βηάυ и Т представляет собой άΤ.
- 28 022429
Таблица 5
Последовательности вариантов аптамеров 2426-66-54
Обозначение аптамера Положение замены Последовательность (5'->3') ЗЕОГО ΝΟ:
2426-66-54 отсутствует ζΌΑοοΑΟΖ'ΖΌοοσζ'ζζΆσσεοζ'ΖΌΖ'ο 44
2426-66-66 1 ΤΟΑΟΟΑΌΖ'ΖΌΟΟΟΖ'Ζ'ΖΆΟΟΌΟΖ’ΖΌΖΌ 156
2426-66-67 8 ζ'ΟΑασΑΟΤζΌοοοζ'Ζ’ΖΆοεεοζ'ΖΌΖΌ 157
2426-66-68 9 ΖΌΑΟΟΑΟΖΤΟΟΟΟΖ'Ζ'ΖΆΟεεΟΖ'ΖΌΖΌ 158
2426-66-69 14 ζΌΑσοΑεζ'ζ'οοαστζ'ΖΆοεεαζ'Ζ'σζΌ 159
2426-66-70 15 ΖΌΑΟΟΑΟΖ'Ζ'ΟΟΟαΖ'ΤΖ'ΑΟΟϋΟΖ'ΖΌΖΌ 160
2426-66-71 16 ΖΌΑΟσΑΌΖ'ΖΌΟΟσΖ'ΖΤΑΟσοαΖ'ΖΌΖΌ 161
2426-66-72 22 ζ'ΟΑσσΑεζ'Ζ'οοοσζ'ζζ'ΑοσοοτζΌΖ'ο 162
2426-66-73 23 ΖΌΑΰΟΑΤΖ'ΖΌΟΟΟΖ'Ζ'ΖΆΟΓΌΟΖ'ΤΟΖΌ 163
2426-66-74 25 ζΌΑοαΑαζ'Ζ'αοοαζ'ζζΆοοϋοζ'Ζ'οτο 164
Замена Виби на бТ в положении 9 (вариант 2426-66-68, δΕφ ГО NО: 158) и в положении 16 (вариант 2426-66-71, δΕφ ГО NО: 161) не привела к потере активности в отношении β-ΝΟΡ по сравнению с незамещенным (все Виби) аптамером 2426-66-54 (δΕφ ГО NО: 44). Замена Виби на бТ в положении 1 (вариант 2426-66-66, δΕφ ГО NО: 156), в положении 8 (вариант 2426-66-67, δΕφ ГО NО: 157) и в положении 14 (2426-66-69, δΕφ ГО NО: 159) привела к частичной потере аффинности, а замена в положении 15 (2426-66-70, δΕφ ГО NО: 160), в положении 22 (2426-66-72, δΕφ ГО NО: 162), в положении 23 (2426-66-73, δΕφ ГО NО: 163) и в положении 25 (2426-66-74, δΕφ ГО NО: 164) привела к полной потере аффинитета. Полученные результаты свидетельствуют о том, что модифицированные остатки уридина в положениях 1, 8, 14, 15, 22, 23 и 25 являются желательными для проявления максимальной аффинности связывания β-ΝΟΡ.
Укороченные варианты 2426-66 (δΕφ ГО NО: 1) с остатками Виби в положениях 9 и 16, замененными на бТ, синтезировали и тестировали на предмет аффинности в отношении β-ΝΟΡ. Последовательности приведены в табл. 6, в которой Ζ' представляет собой Виби и Т представляет собой бТ. Замена Виби на бТ в двух положениях любого из трех указанных вариантов не вызывала потери аффиннности по сравнению с незамещенными контрольными образцами.
Таблица 6
Укороченный и замещенный варианты аптамера 2426-66
Обозначение аптамера Положение замены Последовательность <5'~>3’) ЗЕ<) ГО ΝΟ:
2426-66-75 (28тег) 11, 18 САг’ОАООАсгтсюоогг'ТАОСсо ζ'ζσζΌ 166
2426-66-76 (27тег) 10, 17 Аг'ОАООАсг'тооссгг'ТАОСссг ΖΌΖΌ 167
2426-66-77 (26тег) 9, 16 ΖΌΑΟΟΑΟΖ'ΤΟΟΟΟΖ'ΖΎΑΟΟΟΟΖ'Ζ' ΟΖΌ 168
На основе полученных результатов, которые суммированы на фиг. 2А, консенсусную последовательность (δΕφ ГО ЫО: 3) для связывания с β-ΝΟΡ модифицировали следующим образом, чтобы отразить возможность замены Виби на бТ в двух положениях:
ιτΛζαΐ4®,Ηδζ\\Όαααζζ\\\Λ]κχτ,ζζΗζα <δΕθ ιό \О: 45), в которой ζ, ΐ, δ, ζ и \ являются такими же, как определено выше.
Пример 4. Анализ клеток.
β-ΝΟΡ-аптамер 2426-66 (δΕφ ΙΌ NО: 1) и укороченные варианты 2426-66 подвергали скринингу на предмет ингибирования активности β-ΝΟΡ в двух клеточных анализах ш уйго. Клетки РС12 (СКГ-1721 из АТСС), линия злокачественных клеток феохромоцитомы крысы и модель нейрональной дифференцировки отвечали на β-ΝΟΡ индукцией нейронального фенотипа. Двумя проявлениями указанного ответа являются фосфорилирование мембрано-связанной ТгкА и удлинение нейритов. Аптамеры тестировали на предмет их способности ингибировать β-ΝΟΡ-стимулированное фосфорилирование ТгкА и рост нейритов на клетках РС12.
Анализ роста нейритов.
Клетки РС12 редко помещали в 60-мм чашки и предоставляли им возможность прикрепиться к чашке в течение ночи. После прикрепления нормальную среду для роста клеток заменяли средой с низким содержанием сыворотки (ΤδΜ), поскольку клетки РС12 не дифференцируются в нормальной ростовой среде с высоким содержанием сыворотки. β-ΝΟΡ (100 нг/мл) и аптамер (100 нМ) предварительно
- 29 022429 смешивали в Ь8М и позволяли им уравновешиваться в течение одного часа, затем добавляли к чашкам до конечной концентрации 10 нг/мл β-ЫОР (0,38 нМ) и 10 нМ аптамера. Клетки инкубировали в течение трех дней, на третий день, как и прежде, сменяли среду, β-ЫОР и аптамер. На день 5 с помощью фазовоконтрастного микроскопа были получены изображения клеток и длину нейритов измеряли с помощью программного обеспечения №игои1 ρΐιΐβίη Гог 1таде1 (программа №Н). Длину нейрита на клетку вычисляли и нормировали к величине 100 для контрольного образца, не содержащего аптамер (по сравнению с ростом нейрита).
Способность аптамеров ингибировать дифференцировку клеток РС12, индуцированную человеческим β-ЫОР, тестировали в анализе роста нейритов. Аптамеры синтезировали с инвертированным ДТ-амидитом (3'-1ДТ) на 3'-конце для обеспечения резистентности к 3'-5'-экзонуклеазам, присутствующим в культуральной среде (см. фиг. 5).
Аптамер 2426-66 (8ЕЦ ГО N0: 1) и укороченный вариант 2426-66-50 (8ЕЦ ГО N0: 2) эффективно ингибировали рост нейритов, индуцированный β-ЫОР. Варианты 2426-66-53 (8ЕЦ ГО N0: 43), 2426-66-54 (8ЕЦ ГО N0: 44) и 2426-66-55 (8ЕЦ ГО N0: 149) оказались менее эффективными в ингибировании β-ΗΟΡ-опосредованного роста нейритов, чем 2426-66-50, что свидетельствует о том, что для максимального ингибирования требуется аптамер длиной в 28 нуклеотидов. Вариант 2426-66-75 (8ЕЦ ГО N0: 166), в котором остатки ВиДИ в положениях 11 и 18 аптамера 2426-66-50 были заменены на остатки ДТ, также оказался неэффективным в блокировании β-NΟΡ-опосредованного роста нейритов. Вариант 2426-66-3 (8ЕЦ ГО N0: 5), 50-мер, со слабой аффинностью в отношении β-ЫОР оказывал слабое ингибирование β-NΟΡ-опосредованного роста нейритов.
Эффективность ингибирования аптамером β-NΟΡ-опосредованного роста нейритов определяли путем измерения относительного роста нейритов при концентрациях аптамера, варьирующих от 0,5 до 8,0 нМ, и полумаксимальную ингибирующую концентрацию (1С50) вычисляли путем аппроксимации нелинейной кривой (сигмоидальная дозовая зависимость с различным наклоном) (см. фиг. 6). В этом анализе аптамер 2426-66 (8ЕЦ ГО N0: 1) характеризовался величиной 1С50=2х 10-9 М, а укороченный вариант 2426-66-50 (8ЕЦ ГО N0: 2) характеризовался величиной 1С50=1х10-9 М.
Аптамер 2426-66 (8ЕЦ ГО N0: 1) и укороченные варианты 2426-66-50 (8ЕЦ ГО N0: 2) и 2426-66-53 (8ЕЦ ГО N0: 43) тестировали на предмет ингибирования действия мышиного β-ЫОР и крысиного β-ЫОР в анализе роста нейритов. Все три аптамера ингибировали действие мышиного β-ЫОР с той же эффективностью, что и человеческого β-ЫОР, а действие крысиного β-ЫОР ингибировали в меньшей степени (см. фиг. 7).
Анализ фосфорилирования ТгкА β-ЫОР связывается с рецептором ТгкА на поверхности клеток РС12, индуцируя димеризацию и аутофосфорилирование данного рецептора. Путем анализа фосфорилирования ТгкА изучают статус фосфорилирования ТгкА через 10 мин после обработки β-ЫОР, который предварительно уравновешивают с аптамером. Поскольку анализ роста нейритов является терминальным анализом в изучении конечной стадии β-NΟΡ-стимуляции, анализ фосфорилирования ТгкА является мгновенным снимком явлений моментальной передачи сигналов после β-NΟΡ-стимуляции.
Клетки РС12 высевали на 100-мм планшетах и в течение ночи предоставляли им возможность прикрепиться к планшету. После прикрепления среду заменяли средой Ь8М. Клеткам предоставляли возможность уравновеситься в Ь8М в течение ночи, а затем их в течение 10 мин обрабатывали только β-ЫОР (в конечной концентрации 10 нг/мл, или 0,38 нМ), β-ЫОР с ингибитором фосфорилирования ТгкА, К252а (0,2 мкМ), и β-ЫОР, предварительно уравновешенным с аптамером в конечной концентрации 10 нМ. Клетки собирали, лизировали и осуществляли иммунопреципитацию ТгкА из осветленного лизата с использованием антитела против тотальной Тгк (ТгкА является единственным Тгк-рецептором, экспрессируемым в клетках РС12). Иммунопреципитацию прогоняли на ДСН-ПААГ, осуществляли электроблоттинг на РУЭР-мембране и исследовали с помощью фосфотирозинового антитела на предмет количественного определения фосфорилированной ТгкА. Блот разрезали на полоски и исследовали с помощью антитела против ТгкА на предмет количественного определения тотальной ТгкА. Процент фосфорилирования ТгкА (отношение фосфорилированной ТгкА к тотальной ТгкА) вычисляли для каждого образца и нормировали к значению 100 для контрольного образца, не содержащего аптамер. Результаты представлены на фиг. 8.
Аптамер 2424-66 (8ЕЦ ГО N0: 1) и укороченные варианты 2426-66-50 (8ЕЦ ГО N0: 2) и 2426-66-3 (8ЕЦ ГО N0: 5) тестировали на предмет ингибирования фосфорилирования ТгкА, вызываемого человеческим β-ЫОР. Аптамер 2426-66 и укороченный вариант 2426-66-50 эффективно ингибировали фосфорилирование рецепторов ТгкА, индуцированное β-ЫОР. Вариант 2426-66-3, 50-мер, со слабой аффинностью в отношении β-ЫОР обнаруживал слабое ингибирование фосфорилирования ТгкА, вызываемого β-ЫОР.
Вариант 2426-66-50 (8ЕЦ ГО N0: 2) тестировали на предмет ингибирования мышиного β-ЫОР и крысиного β-ЫОР в анализе фосфорилирования ТгкА. Результаты представлены на фиг. 9. Вариант
- 30 022429
2426-66-50 эффективно ингибировал фосфорилирование ТгкА, индуцированное как мышиным β-ΝΟΡ, так и крысиным β -ΝΟΡ.
Пример 5. Обработка аптамером атопического дерматита на мышиной модельной системе.
У инбредных мышей НС/НдаТпй, выросших в нестерильных (обычных) условиях, спонтанно развились кожные поражения, сходные с поражениями при атопическом дерматите у человека, и такие мыши стали достоверной моделью для исследований в области лечения атопического дерматита (Ма18ийа е! а1., 1п! 1ттипо1. 9: 461, 1997). Следующее исследование было разработано для установления способности ΝΟΡ-нейтрализующих аптамеров ослаблять или устранять клинические проявления атопического дерматита ш νί\Ό у указанной мышиной модели.
Мышей НС/НдаТпй содержали в обычных условиях в некондиционируемом помещении при 20-26°С, с 12-часовым циклом дня/ночи, и с неограниченным доступом к стандартному корму и воде. Мышей в возрасте 8-10 недель, у которых обнаруживались умеренные кожные повреждения (болезненный фенотип), использовали в настоящем исследовании. Мыши НС/НдаТпй, содержащиеся в специальных непатогенных (8ΡΡ) условиях и не проявляющие клинических признаков или симптомов атопического дерматита (отсутствие болезненного фенотипа), использовали в качестве контрольных животных.
Гидрофобную мазь (НО, НуйгорЬШс ОиИтеп1) изготовляли в соответствии с рекомендациями фармакопеи Японии (25% белого вазелинового масла, 20% стеарилового спирта, 12% пропиленгликоля, 4% полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла 60, 1% глицерилмоностеарата, 0,1% метилпарагидроксибензоата, 0,1% пропилпарагидроксибензоата). Аптамер составляли в НО путем расплавления 20 г НО в водяной бане при 85°С, добавления 20 г 2% аптамера в воде и перемешивали в водяной бане, охлажденной до температуры замерзания, пока не остынет.
Мышей разделили на четыре группы. В группу 1 входило 7 мышей с дерматитом, нелеченных. В группу 2 входило 7 мышей с дерматитом, обработанных НО. В группу 3 входило 7 мышей с дерматитом, обработанных аптамером 2426-66-50 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2) с 3'-1ЙТ (1% мас./об. в НО). В группу 4 входило 7 нормальных мышей 8ΡΡ, нелеченных. Мышей в группах 2 и 3 обрабатывали один раз в день в течение четырех недель путем наложения 100 мг образца к поврежденным дорсальным поверхностям. Один раз в неделю в течение четырех недель (в дни 0, 7, 14, 21, 28) количественно оценивали поведение, связанное с расчесыванием, и оценивали клиническое состояние кожи мышей.
Поведение, связанное со спонтанным расчесыванием, количественно оценивали с помощью системы §СЬАВА-Кеа1 хуЧет (§сга!сй Соипйпд £ог ЬаЪогаГОгу АттаЪ, Nονе1ΐес 1пс., КоЪе, 1арап) (НаНоп е! а1., 1. 1ттипо1. 184: 2729, 2010). Мышей перед измерениями на 30 мин помещали в аппарат §СЬАВА, чтобы предоставить им возможность адаптироваться к новому окружению, и количество расчесываний подсчитывали в течение 1 ч в камере для наблюдения. Серию поведенческих реакций, связанных с расчесыванием, начиная с протягивания задних лап к голове, лицу или спине и кончая выворачиванием лап, считали за один приступ (акт) расчесывания.
Оценку клинического состояния кожи определяли в соответствии с критериями, описанными Ма1ы.1Йа е! а1., 1п! 1ттипо1. 9: 461, 1997. Предметами наблюдения были 1) кожный зуд/чесотка, 2) эритема/геморрагия, 3) эдема, 4) экскориация/эрозия, а также 5) шелушение/сухость. Оценки в отношении каждого предмета наблюдения определялись как 0 (отсутствие), 1 (слабая степень), 2 (умеренная) и 3 (тяжелая степень). Оценку клинического состояния кожи определяли как сумму оценок пяти предметов наблюдения.
На фиг. 11 проиллюстрировано изменение в частоте расчесывания для каждой обрабатываемой группы, нанесенное в виде средних значений с отрезками, означающими стандартное отклонение от среднего. Частота расчесывания постоянно снижалась между 14 и 28 днями у животных в группе 3 (обработка аптамером), но никаких изменений в частоте расчесывания в течение 28 дней в группах 1 (необработанные) и 2 (обработанные НО) не наблюдалось. Частота расчесывания в группе 4 (нормальные мыши 8ΡΡ) была очень низка (данные не представлены).
На фиг. 12 проиллюстрировано изменение в оценке клинического состояния кожи для каждой группы, нанесенное в виде средних значений с отрезками, означающими стандартное отклонение от среднего. Оценка состояния кожи постоянно снижалась между 14 и 28 днями у животных в группе 3 (обработка аптамером), но никаких изменений в течение 28 дней в группах 1 (необработанные) и 2 (обработанные НО) не наблюдалось. Оценка состояния кожи в группе 4 (нормальные мыши 8ΡΡ) была очень низкой (данные не представлены).
Представленные выше варианты осуществления и примеры предусмотрены только лишь в качестве примеров. Ни одно из конкретных вариантов осуществления, ни один пример или элемент конкретного варианты осуществления или примера не должен рассматриваться как критический, необходимый или основной элемент или признак какого бы то ни было из заявленных предметов изобретения. Кроме того, ни один из описываемых здесь элементов не является необходимым для осуществления прилагаемых пунктов формулы изобретения, если специально не оговорено, что он является главным или критическим. В отношении описанных здесь вариантов осуществления могут быть осуществлены в рамках объема, охватываемого настоящим изобретением, различные изменения, модификации, замены и другие
- 31 022429 вариации, которые оиределяются ирилагаемой формулой изобретения. Оиисание изобретения, включая фигуры и иримеры, следует рассматривать исключительно как выиолняющие иллюстративную, но не ограничительную, функцию, и иодразумевается, что все указанные модификации и замены являются включенными в объем, охватываемый настоящим изобретением. Соответственно, объем настоящего изобретения должен оиределяться иунктами ирилагаемой формулы изобретения и их законными эквивалентами, а не ириведенными выше иримерами. Наиример, стадии, указанные в любом из иунктов на сиособ или ироцесс, могут быть выиолнены в любом доиустимом иорядке и не ограничены тем иорядком, который оиисан в каком бы то ни было из вариантов осуществления, иримеров или иунктов формулы изобретения.
Таблица 7
Заболевания с иотенциальной ролью β-ΝΟΡ
Комплекс СПИД-деменция Болезнь Крона Интерстициальный пневмонит Прурит
Синдром приобретенного иммунного дефицита (СПИД) Криптогенный аутоиммунный гепатит Воздействие ионизирующей радиации Псориаз
Синдром приобретенного иммунодефицита Криптогенный фиброзирующий альвеолит Иридоци кли т/увеит/неврит зрительного нерва Псориаз I типа
Приобретенная пернициозная анемия Грам-негативный сепсис Синдром раздраженного кишечника Псориаз II типа
Акроцианоз Кистозный фиброз Ишемическиреперфузионное повреждение Псориатический артрит
Острая и хроническая боль (разные формы боли) Расстройства, ассоциированные с цитокиновой терапией Ишемическое нарушение мозгового кровообращения Псориатическая артропатия
Острая и хроническая боль, ассоциированная с хроническим заболеванием (бактериальным или вирусным) Деафферентационные синдромы Ювенильный хронический артрит Легочный фиброз
Острое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа Деменция боксеров Ювенильная пернициозная анемия Вторичная легочная гипертензия вследствие заболевания соединительной ткани
Острый лейкоз Демиелинизирующее заболевание Ювенильный ревматоидный артрит Легочные проявления узелкового полиартериита
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) Геморрагическая лихорадка Денге Ювенильная спинальная мышечная атрофия Лучевой фиброз
Острый миелолейкоз (ОМЛ) Зубная боль Саркома Калоши Лучевая терапия
Острое или хроническое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа Дерматит Болезнь Кавазаки Болезнь и феномен Рейно
Острый панкреатит Дерматит Склеродермия Отторжение почечного трансплантата Реактивный артрит
Острая почечная недостаточность Дерматологические состояния Легионеллы Болезнь Рефсума
Острая ревматическая лихорадка Дерматологические заболевания Лейшманиоз Регулярная узкая 0Е5тахикардия
Острый поперечный миелит Заболевание легких, ассоциированное с дерматомиозитом/ полимиозит ом Про каза Болезнь Рейтера
Болезнь Аддисона Диабет Повреждения кортикоспинальной системы Заболевание почек без дополнительных уточнений
Аденокарциномы Сахарный диабет Линейный 1дА-зависимый буллезный дерматоз Почечные заболевания
- 32 022429
(Острый) синдром расстройства дыхания у взрослых диабе тич ес кий артериосклероз Жировой отек Реноваскулярная артериальная гипертензия
Аэроэктопическая систола Диабетическая нейропатия Отторжение печеночного трансплантата Реперфузионное повреждение
Алкогольный гепатит Болезнь диффузных телец Леви Волчанка Реперфузионное повреждение после трансплантации органа
Алкогольное повреждение печени Дилатационная кардиомиопатия Артрит Лайма Рестриктивная кардиомиопатия
Алкогольный цирроз печени Застойная дилатационная кардиомиопатия Болезнь лайма Вырождение сетчатки
Аллергические и атопические заболевания Дискоидная красная волчанка Лимфангиоктатический отек Синдром Ретта
Аллергический конъюнктивит Расстройства базального ядра Болезнь лимфоцитарной инфильтрации легких Ревматические заболевания
Аллергический контактный дерматит Диссеминированное внутрисосудистое свертывание малярия Ревматоидный артрит
Аллергические заболевания Нарушения висцеральной подвижности при дыхании Мужское бесплодие идиопатическое или без дополнительных уточнений Интерстициальная болезнь легких, ассоциированная с ревматоидным артритом
Аллергический ринит Синдром Дауна от матерей среднего возраста Злокачественные новообразования Ревматоидный спондилит
Аллергические кожные реакции Чувствительность к лекарственному средству Злокачественная лимфома Саркоидоз
Аллергия и астма Лекарственный гепатит Злокачественная гистиоцитома Саркомы
Отторжение трансплантата Лекарственное интерстициальное заболевание легких Злокачественная меланома Синдром Шмидта
Алопеция Расстройства двигательной активности, вызываемые лекарственными средствами-блокаторами допаминовых рецепторов ЦНС Расстройство памяти Склеродермия
Алопеция гнездная Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки менингит Нейропатия седалищного нерва
Дефицит альфа-1антитрипсина Дисменорея Менингококкемия Деменция с тельцами Леви
Болезнь Альцгеймера Диспепсия Психические расстройства (например, депрессия и шизофрения) Сенильная хорея
Ами отрофичес кий боков о й склероз Экзема Метаболические и идиоп а ти че с кие заболевания Септический синдром
Анемия Энцефаломиелит метаболизм/идиопатия Септический артрит
- 33 022429
Апд±па рхсЪогхз Эндокардит Микроскопический почечный васкулит Септический шок
Болезнь легких, ассоциированная с анкилоэирующим. спондилитом Эндокринопа тия Мигрень Серонегативная артропатия
Дегенерация клеток переднего рога спинного мозга Энтеропатический синовит Митохондриальные мул ь т исис т емн ые нарушения Шок
Анти-СБЗ-терапия Эпилепсия Смешанное заболевание соединительной ткани Серпо в идно-кле то чн ая анемия
Антирецепторные реакции гиперчувствитель ности Эпиглоттит Болезнь легких, ассоциированная со смешанным заболеванием соединительной ткани Болезнь легких, ассоциированная с синдромом Шегрена
Опосредованная антителами цитотоксичность Повреждение или дисфункция эпителиальной ткани Смешанные сосудистые и не со суди стые синдромы Синдром Шегрена
Антифосфолипидный синдром Инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барр Моноклональная гаммопатия Отторжение кожного трансплантата
Аневризма аорты и периферическая аневризма Эр и т роме г алия Множественная миелома Синдром кожных изменений
Расслоение аорты Экстрапирамидальные и церебральные расстройства Рассеянный склероз (все разновидности) Кожные болезни с воспалительными компонентами
Артериальная гипертензия Экстрамамиллярный дерматоз Педжета Мультисистемные нарушения (синдром Дежерина-Тома, ШаяДрейджера синдом и Мач адо-Джо зе ф-син дром) Отторжение трансплантата тонкой кишки
Артерио с клеро з Семейный гематофагоцитарный лимфогистиоцитоз Миалгический энцефалит/Синдром хронической усталости Патология солидных и так называемых «жидких» опухолей
Артериовенозный свищ Женское бесплодие Миастения гравис Солидные опухоли
Артрит отторжение имплантата фетального тимуса инфекция мусоЬас^еггит аугит Особые аритмии
Артропатия Фибромиалгия Туберкулезная бацилла Мужское аутоиммунное бесплодие
Астения Фиброз Миелодиспластический синдром Спинальная атаксия
Астма Легочный фиброз Инфаркт миокарда Спиноцеребеллярная дегенерация сетчатки
Атаксия Атаксия Фридриха Ишемические расстройства миокарда Спондилоартропатия
Атероматозная болезнь/Артериосклероз функциональные расстройства периферических артерий Миозит Спорадические явления
Атеро склероз Грибковый сепсис β-МСГ-связанная боль и гипералгезия Болезнь Стилла
Атопическая аллергия Газовая гангрена Рак носоглотки Стрептококковый миозит
- 34 022429
Атопический дерматит Язва желудка Неонатальная хроническая болезнь легких Инсульт
Фибрилляция предсердий (стойкая или пароксизмальная) Гастроэзофагеальный рефлюкс Нефрит Структурные нарушения мозжечка
Трепетание предсердий Желудочно-кишечные или сосудистые зоны Нефроз Подострый склерозирующий ланэнцефалит
Атриовентрикулярная блокада Общие желудочно-кишечные расстройства Нефротический синдром Солнечный ожог
Атрофический аутоиммунный гипотиреоидизм Общая головная боль Нейрит Операционная боль
Аутоиммунное буллезное заболевание Общее воспаление Нейродегенеративные заболевания Метастатическая офтальмия
Аутоиммунные заболевания Расстройства мочеполовой системы Неврогенные мышечные атрофии Симпатически поддерживаемая боль
Аутоиммунная гемолитическая анемия Гигантоклеточный артериит Неврологические заболевания Синкопе
Аутоиммунный гепатит Гломе руло н е фри т Невропатическая боль Сифилис сердечнососудистой системы
Аутоиммунная гипогликемия Аутоиммунный тиреоидит Хашимото Невропатическая боль и ас с оцииро ванные гипералгезия и аллодиния Системная анафилаксия
Аутоиммунная нейтропения Синдром Гудпасчера Невропатическая боль и ассоциированная гипералгезия или аллодиния Синдром системного воспалительного ответа
Аутоиммунная тромбоцитопения Подагрический артрит Нейтропеническая лихорадка Системная красная волчанка
Аутоиммунный тиреоидит Отторжение трансплантата любого органа или ткани Неал ко голь ный стеатогепатит Болезнь легких, ассоциированная с системной красной волчанкой
В-клеточная лимфома Глаукома Неходжкинская лимфома Системное начало ювенильного ревматоидного артрита
Отторжение костного трансплантата Бактериальный грамотрицательный сепсис Гинекологические заболевания и акушерские состояния Системный склероз
Отторжение трансплантата костного мозга (ВМТ) Бактериальный грамположительный сепсис Окклюзия абдоминальной аорты и ее ветвей Интерстициальная болезнь легких, ассоциированная с системным склерозом
Бронхиальные расстройства Гранулемы, вызванные внутри кл еточ ными паразитами Окклюзивные поражения артерий Острый Т-клеточный лимфолейкоз
Облитерация бронхов Болезнь Грава Ок1:3-терапия Болезнь Такаяши/артериит
Блокада ножки пучка Гиса Стрептококковая инфекция группы «В» Офтальмологические заболевания Телеангиэктазия
Лимфосаркома Беркитта ВИЧ Орхит/эпидидимит Головная боль напряжения
- 35 022429
Ожоги Нейропатия при ВИЧ Орхит/процедуры реверсивной вазэктомии Болезни, опосредованные ТЬ2-ТИПОМ и ТН1-ТИПОМ иммунных реакций
Кахексия Ассоциированная с гемосидерозом болезнь легких Отторжение органного трансплантата Синдром таламической боли
Рак Волосатоклеточный лейкоз Органоме галия Облитерирующий тромбоангиит
Сердечные аритмии Болезнь ГаллерворденаШпатца Остеоартрит Тромбоцитопения
Синдром кратковременных кардиогенных обмороков тиреоидит Хашимото Остеоартроз Тиреоидит
Опухоли сердца Сенная лихорадка Остеопороз Синдром токсического шока
Кардиомиопатия Сердечная недостаточность Воспалительные заболевания дыхательных путей Токсичность
Воспалительная реакция на искусственное кровообращение Отторжение сердечного трансплантата Нарушение овуляции Токсины
Сердечно-сосудистые поражения Гемахроматоз РОЕМЗ-синдром (полинейропатия, органомегалия, эндокринопатия, моноклональная гаммопатия и синдром кожных изменений) Токсины и химиотерапия
Кардиты Гематопоэтические злокачественные заболевания (лейкемия и лимфома)г Абеталилопротеинемия Воль Болезни отторжение трансплантата
Отторжение хрящевого трансплантата Гемодиализ Боль от ампутации или абсцесса Трансплантаты
Каузалгия Гемолитическая анемия Боль от травмы Травма/геморрагия
Вырождение коры головного мозга Гемолитический уремический синдром/тромболитическая тромбоцитопеническая пурпура, геморрагия Отторжение трансплантата поджелудочной железы Невралгия тройничного нерва
Церебральные расстройства Пурпура Шенлайна-Геноха Карцинома поджелудочной железы Инсулинореэистентность при диабете 2 типа с акантокератодермией
Хаотическая или мультифокальная предсердная тахикардия Гепатит А Панкреатит Реакции гилерчувствительности III типа
химиотерапия Гепатит В Паранеопластический синдром/гиперкальциемия при злокачественных новообразованиях Гиперчувствительность IV типа
Церебральный инфаркт Гепатит С Паразитарные заболевания Аутоиммунный гепатит 1 типа (классический аутоиммунный или волчаночный гепатит)
- 36 022429
Хламидии Герпетическая лихорадка Отторжение трансплантата паращитовидной железы Аутоиммунный гепатит 2 типа (гепатит анти-пкмантител)
Холестаз Аритмии пучка Гиса Болезнь Паркинсона Артропатия при неспецифическом язвенном колите
Хронический миелолейкоз (ХМЛ) Болезнь Ходжкина Воспалительное заболевание тазовых органов Язвенный колит
Хронический активный гепатит Хорея Гентингтона Пемфигоид Нестабильная стенокардия
Хронический алкоголизм Гиперкинетические двигательные расстройства Слоистый пемфигоид Уремия
Хроническая эозинофильная пневмония Реакции ги пе рч у в ст ви те ль но с ти Обыкновенная пуэыпчатка Уросепсис
Синдром хронической усталости Гиперчувствительный пневмонит Круглогодичный аллергический ринит Крапивница
Хроническое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа Гипертензия Болезнь перикарда Увеит
Состояния хронического воспаления Гипертироидизм Периферический атеросклероз Порок клапана сердца
Боли хронического воспаления или нейропатические боли Гипокинетические двигательные расстройства Периферические сосудистые расстройства Варикозные вены
Патологии хронического воспаления Гипогликемия Перитонит Диффузная сосудистая болезнь легких
Хроническое заболевания печени Гипопаратироидиэм Пернициозная анемия Васкулит
Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) Оценка гипоталамогипофизарнонадпочечниковой системы Белково-анафилактический увеит Вазомоторный или аллергический ринит
Хронический кандидоз кожи и слизистых Состояния ятрогенной интоксикации Пневмоцистная пневмония Венозные болезни
Хроническая обструктивная болезнь легких Идиопатическая болезнь Аддисона Пневмония Венозный тромбоз
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) Идиопатическая лейкопения Плюригландулярный дефицит I типа и плюригландулярный дефицит II типа Фибрилляция желудочков
Хроническая интоксикация с ал ицил а т ами Идиопатический фиброз легких По с ггерп е тиче скал невралгия Вирусная и грибковая инфекции
Хроническая висцеральная боль Идиопатическая тромбоцитопения Постперфузионный синдром Висцералгия илли синдром раздраженной толстой кишки
Гистаминовая головная боль Идиосинкразическая болезнь печени Постперфузионный синдром Вирусный энцефалит/асептический менингит
- 37 022429
Колит Послеоперационная боль Постинфарктный посткардиогомный синдром Вирус-ассоциированный гемофагоцитарный синдром
Коллагеноз сосудов Детский спинальный паралич Поствоспалительная интерстициальная болезнь легких Витилиго
Рак ободочной и прямой кишки Инфекционные заболевания Постинфекционная интерстициальная болезнь легких Витилиго и острое заболевание печени
Вариабельный не кл а ссифицируемый иммунодефицит (не кла с с и фицируема я вариабельная гипогаммаглобулинемия) Воспаление аорты Преэклампсия Валлеровское перерождение
Врожденные заболевания Воспалительное заболевание кишечника Синдром истощения яичников Гранулематоз Вегенера
Ишемическая болезнь сердца Воспалительные кишечные расстройства Первичный билиарный цирроз синдром Вернике-Корсакова
Конъюнктивит Воспалительные заболевания Первичная микседема Болезнь Вильсона
Интерстициальное заболевание легких, ассоциированное с болезнью соединительной ткани Воспалительные глазные болезни Первичная легочная гипертензия Ранения
Контактный дерматит воспаленный или нестабильный мочевой пузырь Первичный склерозирующий холангит отторжение ксенотрансплантата любого органа или ткани
Аутоиммунная гемолитическая анемия с неполными тепловыми агглютининами Боль при воспалении Первичный склерозирующий гепатит Артропатия, ассоциированная с иерсинией и сальмонеллой
Легочное сердце Боль при воспалении и ассоциированная гиперальгезия и аллодиния Первичный васкулит
Заболевание коронарной артерии Грипп, вызванный вирусом типа А Синдром прогрессирующего супр а ну кл е а рн ог о паралича
Болезнь Крейцфельда-Якоба Ин сулино за ви симый сахарный диабет
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (30)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Аптамер, содержащий последовательность
    ΒΆΖΟΚΟΟΚδΝ ΖΧΥΟΟΟΟΝ ΖΖΧΥΆΙΧ'ί'ΟΖΖΚΖΟ (δΙΑ) ΙΌ ΝΟ: 154) или ее фрагмент, в которой В выбран из С, Ο или Ζ;
    К независимо выбран из А или Ο; δ выбран из С или Ο;
    независимо выбран из Ζ или Т;
    И выбран из А, Ο или Ζ;
    Ν независимо выбран из любого встречающегося в природе или модифицированного нуклеотида;
    Ζ независимо выбран из модифицированного пиримидина, при этом указанная последовательность может включать неспецифические нуклеотидные вставки.
  2. 2. Аптамер по п.1, где указанный аптамер имеет следующую последовательность:
    ΙΥΛΖακααΚδΖ\ΥααααΖΖ\ΥΆυα'(.,ΖΖΚΖ(., (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 45).
  3. 3. Аптамер, содержащий последовательность ΐΕ\ΖακαακδΖΖααααΖΖΖΆυα·(.,ΖΖΚΖα (δίο ιό νο: 3) или ее фрагмент, в которой В выбран из С, Ο или Ζ;
    К независимо выбран из А или Ο; δ выбран из С или Ο;
    Ό независимо выбран из А, Ο или Ζ;
    Ζ независимо выбран из модифицированного пиримидина, при этом указанная последовательность может включать неспецифические нуклеотидные вставки.
  4. 4. Аптамер по любому из пп.1-3, где указанный аптамер связывается с β-ΝΟΡ.
  5. 5. Аптамер по п.4, где указанный аптамер ингибирует функцию β-ΝΟΡ.
  6. 6. Аптамер по п.4, где указанный аптамер обладает способностью модулировать связывание β-ΝΟΡ с одним или несколькими из его клеточных рецепторов.
    - 38 022429
  7. 7. Аитамер ио и.6, где указанный клеточный рецеитор выбран из р75 или Τι!<Α.
  8. 8. Аитамер ио и.5, где указанный аитамер характеризуется величиной Кй ио отношению к β-ΝΟΡ, составляющей 30 нМ или менее.
  9. 9. Аитамер ио любому из ии.1-3, где указанный модифицированный ииримидин иредставляет собой С-5-модифицированный ииримидин.
  10. 10. Аитамер ио и.9, где указанный С-5-модифицированный ииримидин выбран из груииы, состоящей из соединений, указанных на фиг. 10.
  11. 11. Аитамер ио и.10, где указанный С-5-модифицированный ииримидин выбран из груииы, состоящей из
    5-(№бензилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (ВийИ),
    5-(№изобутилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (1Вийи),
    5-(№триитаминокарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (Τ^υ) и
    5 -(№нафтилметилкарбоксиамид)-2 '-дезоксиуридина (№рйи).
  12. 12. Аитамер ио и.10, где указанный С-5-модифицированный ииримидин иредставляет собой 5-(Νбензилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридин (Вийи).
  13. 13. Аитамер ио и.3, где указанный модифицированный ииримидин иредставляет собой С-5модифицированный ииримидин и указанный аитамер включает ио меньшей мере одну нуклеотидную вставку (Ν) и имеет следующую иоследовательность:
    ΒΑΖΟΚΟΟΚ8N(0-1)ΖΖΟΟΟΟN(0-1)ΖΖΖΑ^ССΟΖΖΚΖΟ (8ЕО ΙΌ Ν0: 155), в которой Ν независимо выбран из любого встречающегося в ирироде или модифицированного нуклеотида.
  14. 14. Аитамер, который связывается с β-ΝΟΡ, содержащий иоследовательность, выбранную из груииы, состоящей из 8ЕО ГО Ν0: 1, 2, 9-44 и 149.
  15. 15. Аитамер ио и.14, где указанный аитамер ингибирует функцию β-ΝΟΡ.
  16. 16. Аитамер ио и.14, где указанный аитамер обладает сиособностью модулировать связывание β-ΝΟΡ с одним или несколькими из его клеточных рецеиторов.
  17. 17. Аитамер ио и.16, где указанный клеточный рецеитор выбран из р75 или Τι!<Α.
  18. 18. Аитамер ио и.17, где указанная иоследовательность выбрана из груииы, состоящей из иоследовательностей, имеющих ио меньшей мере ириблизительно 90% идентичности, ио меньшей мере ириблизительно 91% идентичности, ио меньшей мере ириблизительно 92% идентичности, ио меньшей мере ириблизительно 93% идентичности, ио меньшей мере ириблизительно 94% идентичности и ио меньшей мере ириблизительно 95% идентичности.
  19. 19. Димер, включающий два комионента, иредставляющих собой аитамеры ио и.2, соединенные между собой.
  20. 20. Димер ио и.19, где указанные два комионента соединены иосредством углеводородного линкера.
  21. 21. Фармацевтическая комиозиция, содержащая аитамер ио любому из иредшествующих и. 1-18, его фрагмент или димер ио ии.19, 20 или их соль и фармацевтически ириемлемый носитель или эксциииент.
  22. 22. Комиозиция ио и.21, доиолнительно содержащая разбавитель, иротивомикробное средство, связующее средство, наиолнитель, увлажняющее средство, сусиендирующее средство, смягчающее вещество и эмульгирующее средство.
  23. 23. Комиозиция ио и.21 или 22, где указанная комиозиция является местной комиозицией, выбранной из груииы, состоящей из крема, лосьона, мази, геля, ироиитанного материала, аэрозоля, медикаментозной ирисыики, медикаментозного адгезива и иены.
  24. 24. Применение аитамера ио любому из ии.1-18 или димера ио ии.19, 20 для лечения, ирофилактики или улучшения состояния ири заболевании, оиосредованном β-ΝΟΡ.
  25. 25. Применение ио и.24, где указанным β-ΝΟΡ-оиосредованным заболеванием или состоянием является такое, ири котором активность β-ΝΟΡ может на оиределенной стадии болезненного ироцесса наирямую или оиосредованно ириводить к возникновению зуда.
  26. 26. Применение ио и.24, где указанным заболеванием или состоянием является дерматит или экзема.
  27. 27. Применение ио и.26, где указанным дерматитом является атоиический дерматит.
  28. 28. Применение ио и.24, где лечение включает местное введение указанного аитамера субъекту, в случае необходимости такого введения, в тераиевтически эффективной дозе указанного аитамера.
  29. 29. Применение ио и.24, где лечение включает введение указанного аитамера в дозе в диаиазоне от ириблизительно 1 мкг до ириблизительно 100 мг/кг массы тела в день.
  30. 30. Применение ио и.24, где лечение включает введение указанного аитамера в сочетании с другим средством, исиользуемым ири лечении зуда.
EA201291034A 2010-04-12 2011-04-12 АПТАМЕРЫ К β-NGF И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ β-NGF-ОПОСРЕДОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ EA022429B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32314510P 2010-04-12 2010-04-12
PCT/US2011/032017 WO2011130195A1 (en) 2010-04-12 2011-04-12 APTAMERS TO β-NGF AND THEIR USE IN TREATING β-NGF MEDIATED DISEASES AND DISORDERS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201291034A1 EA201291034A1 (ru) 2013-04-30
EA022429B1 true EA022429B1 (ru) 2015-12-30

Family

ID=44798979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201291034A EA022429B1 (ru) 2010-04-12 2011-04-12 АПТАМЕРЫ К β-NGF И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ β-NGF-ОПОСРЕДОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ

Country Status (23)

Country Link
US (7) US20110275794A1 (ru)
EP (3) EP3345915B1 (ru)
JP (4) JP6012591B2 (ru)
KR (4) KR101952671B1 (ru)
CN (4) CN102858990B (ru)
AR (1) AR081452A1 (ru)
AU (2) AU2011240677B2 (ru)
BR (2) BR112012025872B8 (ru)
CA (3) CA3066785A1 (ru)
CO (1) CO6630139A2 (ru)
DK (1) DK2558478T3 (ru)
EA (1) EA022429B1 (ru)
ES (3) ES2667491T3 (ru)
HK (2) HK1201740A1 (ru)
IL (5) IL222339A (ru)
MX (3) MX2012011771A (ru)
MY (1) MY160608A (ru)
NO (1) NO2558478T3 (ru)
NZ (1) NZ602618A (ru)
SG (3) SG184497A1 (ru)
TW (6) TWI505833B (ru)
UA (1) UA105290C2 (ru)
WO (2) WO2011130289A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2686992C2 (ru) * 2014-03-24 2019-05-06 Рибомик Инк. Аптамер для fgf2 и его применение

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5993279A (ja) * 1982-11-17 1984-05-29 富士通株式会社 ロボツトによるカ−ド，レシ−ト分離取出し方法
US20110136099A1 (en) * 2007-01-16 2011-06-09 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
US8975026B2 (en) 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US7947447B2 (en) 2007-01-16 2011-05-24 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US8404830B2 (en) * 2007-07-17 2013-03-26 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US20110275794A1 (en) * 2010-04-12 2011-11-10 Somalogic, Inc. 5-position modified pyrimidines and their use
WO2012061810A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Miragen Therapeutics Base modified oligonucleotides
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9783602B2 (en) 2010-12-01 2017-10-10 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
CN104379764B (zh) 2012-03-28 2018-04-06 私募蛋白质体公司 Pdgf和vegf的适体及它们在治疗pdgf和vegf介导的病状中的用途
JP2015514227A (ja) * 2012-04-13 2015-05-18 ソマロジック・インコーポレーテッド 結核バイオマーカーおよびその使用
EP2868747B1 (en) 2012-07-02 2018-04-04 UNIST (Ulsan National Institute of Science and Technology) Aptamer for periostin and anti-cancer composition including same
EP2912182B1 (en) 2012-10-23 2021-12-08 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
US10942184B2 (en) 2012-10-23 2021-03-09 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
CA2895847C (en) 2012-12-19 2019-01-08 Caris Science, Inc. Compositions and methods for aptamer screening
AU2014244534B2 (en) * 2013-03-14 2020-04-30 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Aptamers that bind to IL-6 and their use in treating or diagnosing IL-6 mediated conditions
TWI594975B (zh) 2013-04-24 2017-08-11 第一三共股份有限公司 二羧酸化合物
WO2014177510A2 (en) * 2013-05-03 2014-11-06 Creabilis Sa Polymer conjugates of indolocarbazole compounds in the treatment of pruritus
GB201312295D0 (en) * 2013-07-09 2013-08-21 Syntaxin Ltd Suppression of itch
US9695424B2 (en) 2013-09-09 2017-07-04 Somalogic, Inc. PDGF and VEGF aptamers having improved stability and their use in treating PDGF and VEGF mediated diseases and disorders
KR102348283B1 (ko) * 2013-09-24 2022-01-10 소마로직, 인크. 멀티앱타머 표적 검출
JP2015062364A (ja) * 2013-09-25 2015-04-09 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 クレンブテロールに結合する核酸分子およびその用途
JP2015062365A (ja) * 2013-09-25 2015-04-09 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ラクトパミンに結合する核酸分子およびその用途
WO2015066001A1 (en) * 2013-10-29 2015-05-07 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Nucleic acid-scaffolded small molecule libraries
BR112016010165A2 (pt) * 2013-11-21 2017-12-05 Somalogic Inc composições de nucleotídeos modificados de citidina-5-carboxamida e métodos relacionados às mesmas
NO2718257T3 (ru) 2014-05-30 2018-04-14
KR102425265B1 (ko) 2014-08-25 2022-07-26 에이뮨 테라퓨틱스, 인코퍼레이티드 난 단백질 제형 및 이의 제조 방법
CN104561013A (zh) * 2015-01-05 2015-04-29 中国人民解放军南京军区福州总医院 基于高通量测序技术进行核酸适配体序列优化的方法
WO2017139274A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 Pharmakea, Inc. Quinolinone lysyl oxidase-like 2 inhibitors and uses thereof
KR102269009B1 (ko) * 2016-03-14 2021-06-28 소마로직, 인크. 핵산 내로의 혼입을 위한 5-(n-보호된-트립타미노카복시아미드)-2''-데옥시유리딘 포스포아미다이트의 합성을 위한 화합물 및 방법
CN107663220B (zh) * 2016-07-27 2020-10-02 上海伯豪医学检验所有限公司 修饰碱基、包含修饰碱基的核酸、适配体及其应用
US11028395B2 (en) 2016-10-24 2021-06-08 Biois Co., Ltd. TNF-alpha-binding aptamer, and therapeutic use for same
JP2020514746A (ja) 2016-12-01 2020-05-21 ノーティラス バイオテクノロジー インコーポレイテッド タンパク質をアッセイする方法
CN108299518A (zh) * 2018-02-02 2018-07-20 王成宇 一种2`-脱氧-β-尿苷的合成方法
WO2019154410A1 (zh) 2018-02-12 2019-08-15 翼高生物科技有限公司 针对骨硬化蛋白的适体及其用途
MX2020013814A (es) * 2018-06-22 2021-04-13 Somalogic Operating Co Inc Ensayo multiple proteomico mejorado.
AU2020245346A1 (en) 2019-03-22 2021-09-09 Somalogic Operating Co., Inc. Reducing intersample analyte variability in complex biological matrices
JP2022532212A (ja) 2019-05-17 2022-07-13 ソマロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド 複雑な生物学的マトリックスにおける試料間分析物変動性の制御
US11935311B2 (en) 2020-06-11 2024-03-19 Nautilus Subsidiary, Inc. Methods and systems for computational decoding of biological, chemical, and physical entities
CA3203106A1 (en) 2021-01-20 2022-07-28 Parag Mallick Systems and methods for biomolecule quantitation
WO2022159663A1 (en) 2021-01-21 2022-07-28 Nautilus Biotechnology, Inc. Systems and methods for biomolecule preparation
US11505796B2 (en) 2021-03-11 2022-11-22 Nautilus Biotechnology, Inc. Systems and methods for biomolecule retention
US20240200081A1 (en) 2021-03-25 2024-06-20 Aptacure Therapeutics Limited Nucleic acid molecule conjugate having prolonged in vivo half-life
CN113481204B (zh) * 2021-07-02 2022-08-12 湖南赛奥维生物技术有限公司 一种蛋白的核酸适配体、其衍生物及其应用
CA3227872A1 (en) 2021-09-09 2023-03-16 James Henry JOLY Characterization and localization of protein modifications
CA3227592A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Gregory KAPP Methods and systems for determining polypeptide interactions
CN117916377A (zh) 2021-09-26 2024-04-19 安沛治疗有限公司 针对dkk1的适体及其用途
US20230149883A1 (en) 2021-11-03 2023-05-18 Nautilus Biotechnology, Inc. Systems and methods for surface structuring
WO2023192917A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Nautilus Subsidiary, Inc. Integrated arrays for single-analyte processes
WO2023212490A1 (en) 2022-04-25 2023-11-02 Nautilus Subsidiary, Inc. Systems and methods for assessing and improving the quality of multiplex molecular assays
WO2023250364A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Nautilus Subsidiary, Inc. Method for detecting analytes at sites of optically non-resolvable distances
WO2024059655A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Nautilus Subsidiary, Inc. Characterizing accessibility of macromolecule structures
WO2024073599A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Nautilus Subsidiary, Inc. Preparation of array surfaces for single-analyte processes
WO2024107857A1 (en) 2022-11-15 2024-05-23 Nautilus Subsidiary, Inc. Standard polypeptides
WO2024124073A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Nautilus Subsidiary, Inc. A method comprising performing on a single-analyte array at least 50 cycles of a process
US20240201182A1 (en) 2022-12-15 2024-06-20 Nautilus Subsidiary, Inc. Inhibition of photon phenomena on single molecule arrays
WO2024151373A1 (en) 2023-01-12 2024-07-18 Nautilus Subsidiary, Inc. Characterization of glycans and glycoconjugates

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030054360A1 (en) * 1999-01-19 2003-03-20 Larry Gold Method and apparatus for the automated generation of nucleic acid ligands
US20040120891A1 (en) * 1998-12-21 2004-06-24 Craig Hill Compounds for intracellular delivery of therapeutic moieties to nerve cells
US20070286915A1 (en) * 2004-10-19 2007-12-13 Pias Corporation Nerve Growth Factor Production Inhibitor and External Preparation for the Skin, Cosmetic, Quasi Drug, Preventive and Remedy for Atopic Dermatitis Containing the Nerve Growth Factor Production Inhibitor
US20080207523A1 (en) * 2006-09-08 2008-08-28 Matthias Friebe Compounds as aptamer-dimers and their uses in diagnosis and therapy
US20090004667A1 (en) * 2007-01-16 2009-01-01 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4267171A (en) 1979-07-02 1981-05-12 The Regents Of The University Of California C-5 Substituted cytosine nucleosides
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4594339A (en) 1982-04-06 1986-06-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Anti-herpes virus compositions containing 5-substituted 1-2'(deoxy-2-'-substituted-β-d-arabinofuranosyl)pyrimedene nucleosides
US5599720A (en) 1982-08-27 1997-02-04 Multilyte Limited Measurement of analyte concentration
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4737453A (en) 1984-12-12 1988-04-12 Immunomedics, Inc. Sandwich immunoassay utilizing a separation specific binding substance
DE3590766T (ru) 1985-03-30 1987-04-23
US5093232A (en) 1985-12-11 1992-03-03 Chiron Corporation Nucleic acid probes
US4752566A (en) 1985-12-17 1988-06-21 Genetics Institute, Inc. Displacement polynucleotide method and reagent complex employing labeled probe polynucleotide
US5047519A (en) 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US4997818A (en) 1987-09-21 1991-03-05 The University Hospital Therapeutic method for selectively treating terminal deoxynucleotidyl transferase-positive neoplastic leukemias and lymphomas
SE8802173D0 (sv) 1988-06-10 1988-06-10 Astra Ab Pyrimidine derivatives
JPH05500799A (ja) * 1989-06-05 1993-02-18 ギリアド　サイエンシス，インコーポレイテッド エキソヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドおよびその調製方法
US5118672A (en) 1989-07-10 1992-06-02 University Of Georgia Research Foundation 5'-diphosphohexose nucleoside pharmaceutical compositions
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
EP0498843B1 (en) 1989-10-24 1996-06-12 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
WO1991013900A1 (en) 1990-03-13 1991-09-19 Acic (Canada) Inc. Process for producing 2,2'-o-cyclonucleosides, nucleosides, and analogs thereof
EP0537299A1 (en) 1990-03-29 1993-04-21 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide-transport agent disulfide conjugates
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5496938A (en) 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US6346611B1 (en) 1990-06-11 2002-02-12 Gilead Sciences, Inc. High affinity TGfβ nucleic acid ligands and inhibitors
US5476766A (en) 1990-06-11 1995-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Ligands of thrombin
US5861254A (en) 1997-01-31 1999-01-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Flow cell SELEX
DE69133513T2 (de) 1990-06-11 2006-09-21 Gilead Sciences, Inc., Foster City Verfahren zur Verwendung von Nukleinsäureliganden
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US6030776A (en) 1990-06-11 2000-02-29 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel SELEX
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5840867A (en) * 1991-02-21 1998-11-24 Gilead Sciences, Inc. Aptamer analogs specific for biomolecules
IE920561A1 (en) 1991-02-21 1992-08-26 Gilead Sciences Aptamer specific for thrombin and methods of use
JPH06508022A (ja) 1991-02-21 1994-09-14 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 生体分子に特異的なアプタマーおよび生産方法
US5582981A (en) 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
US5412087A (en) 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
CA2122365C (en) 1991-11-26 2010-05-11 Brian Froehler Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5580972A (en) 1993-06-14 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Purine nucleoside modifications by palladium catalyzed methods
US5428149A (en) 1993-06-14 1995-06-27 Washington State University Research Foundation Method for palladium catalyzed carbon-carbon coulping and products
US5719273A (en) 1993-06-14 1998-02-17 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Palladium catalyzed nucleoside modifications methods using nucleophiles and carbon monoxide
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5658738A (en) 1994-05-31 1997-08-19 Becton Dickinson And Company Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin
JP4899014B2 (ja) * 1995-06-02 2012-03-21 イーシー・テクノロジー・エルエルシー 求核試薬および一酸化炭素を用いるパラジウム触媒ヌクレオシド修飾方法
US5962225A (en) 1995-10-27 1999-10-05 Cygene, Inc. Methods and compositions for detection of specific nucleotide sequences
US5945527A (en) 1996-05-30 1999-08-31 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Palladium catalyzed nucleoside modification methods using nucleophiles and carbon monoxide
US6794499B2 (en) * 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US20070166741A1 (en) 1998-12-14 2007-07-19 Somalogic, Incorporated Multiplexed analyses of test samples
WO2003070984A1 (en) 2002-02-15 2003-08-28 Somalogic, Inc. Methods and reagents for detecting target binding by nucleic acid ligands
US6020483A (en) 1998-09-25 2000-02-01 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside modifications by palladium catalyzed methods
US6175001B1 (en) 1998-10-16 2001-01-16 The Scripps Research Institute Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same
US6734172B2 (en) 1998-11-18 2004-05-11 Pacific Northwest Research Institute Surface receptor antigen vaccines
JP3485023B2 (ja) * 1999-05-20 2004-01-13 東亞合成株式会社 ヌクレオシド化合物
CA2404639A1 (en) * 2000-04-13 2001-10-25 Pharmasset, Ltd. 3'-or 2'-hydroxymethyl substituted nucleoside derivatives for treatment of hepatitis virus infections
US6376190B1 (en) 2000-09-22 2002-04-23 Somalogic, Inc. Modified SELEX processes without purified protein
AU2002360272A1 (en) 2001-10-10 2003-04-22 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
WO2003078623A1 (fr) 2002-03-19 2003-09-25 Fujitsu Limited Molecule fonctionnelle et son procede de production
US7767803B2 (en) 2002-06-18 2010-08-03 Archemix Corp. Stabilized aptamers to PSMA and their use as prostate cancer therapeutics
CA2407825A1 (en) 2002-10-11 2004-04-11 Andrew J. Simmonds Trap-tagging: a novel method for the identification and purification of rna-protein complexes
US20040176282A1 (en) 2003-01-09 2004-09-09 Brian Dalby Cellular delivery and activation of polypeptide-nucleic acid complexes
JP4119976B2 (ja) * 2003-02-07 2008-07-16 国立大学法人群馬大学 ５位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法
WO2005024042A2 (en) 2003-09-04 2005-03-17 The Regents Of The University Of California Aptamers and methods for their in vitro selection and uses thereof
EP1584923A3 (en) 2004-04-07 2006-01-04 Roche Diagnostics GmbH Stabilization of biomolecules in samples
AU2005323437B2 (en) 2004-04-30 2011-10-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a C5-modified pyrimidine
EP1828217A2 (en) 2004-12-16 2007-09-05 Febit Biotech GmbH Polymerase-independent analysis of the sequence of polynucleotides
WO2007044427A2 (en) 2005-10-05 2007-04-19 Panomics, Inc. Detection of nucleic acids from whole blood
JP5256578B2 (ja) * 2005-12-20 2013-08-07 大正製薬株式会社 掻痒性皮膚疾患の予防または治療剤
KR101149688B1 (ko) 2006-01-17 2012-05-24 소마로직, 인크. 시료의 다중 분석
EP1996193A2 (en) 2006-03-13 2008-12-03 OSI Pharmaceuticals, Inc. Combined treatment with an egfr kinase inhibitor and an agent that sensitizes tumor cells to the effects of egfr kinase inhibitors
US8242258B2 (en) * 2006-12-03 2012-08-14 Agilent Technologies, Inc. Protecting groups for RNA synthesis
EP2207891B1 (en) 2006-12-22 2012-07-25 Archemix LLC Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
US8975026B2 (en) 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US20110136099A1 (en) 2007-01-16 2011-06-09 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
US7855054B2 (en) 2007-01-16 2010-12-21 Somalogic, Inc. Multiplexed analyses of test samples
EP2144921A2 (en) * 2007-02-27 2010-01-20 K.U. Leuven Research and Development Phosphate modified nucleosides useful as substrates for polymerases and as antiviral agents
US20090137506A1 (en) * 2007-05-02 2009-05-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA Interference Mediated Inhibition of Cyclic Nucleotide Type 4 Phosphodiesterase (PDE4B) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
CN104593373A (zh) * 2007-07-17 2015-05-06 私募蛋白质体公司 产生具有改良的解离速率的适配体的方法
US8404830B2 (en) 2007-07-17 2013-03-26 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US20090215050A1 (en) 2008-02-22 2009-08-27 Robert Delmar Jenison Systems and methods for point-of-care amplification and detection of polynucleotides
US8703416B2 (en) 2008-07-17 2014-04-22 Somalogic, Inc. Method for purification and identification of sperm cells
DK2354225T3 (en) 2008-09-24 2015-06-29 Ribomic Inc APPLICATIONS TO NGF AND USE THEREOF
EP2542266A4 (en) 2010-03-03 2013-10-23 Somalogic Inc 4-1BB-BINDING APTAMERS AND USE THEREOF IN THE TREATMENT OF DISEASES AND DISORDERS
CN102844436B (zh) 2010-03-24 2015-11-25 力博美科股份有限公司 针对ngf的适配体及其用途
EP2550000A4 (en) 2010-03-24 2014-03-26 Advirna Inc RNAI COMPOUNDS OF REDUCED SIZE ADMINISTERING
WO2011130065A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MET GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20110275794A1 (en) * 2010-04-12 2011-11-10 Somalogic, Inc. 5-position modified pyrimidines and their use
WO2012061810A1 (en) * 2010-11-05 2012-05-10 Miragen Therapeutics Base modified oligonucleotides
CN104379764B (zh) * 2012-03-28 2018-04-06 私募蛋白质体公司 Pdgf和vegf的适体及它们在治疗pdgf和vegf介导的病状中的用途
BR112016010165A2 (pt) 2013-11-21 2017-12-05 Somalogic Inc composições de nucleotídeos modificados de citidina-5-carboxamida e métodos relacionados às mesmas

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040120891A1 (en) * 1998-12-21 2004-06-24 Craig Hill Compounds for intracellular delivery of therapeutic moieties to nerve cells
US20030054360A1 (en) * 1999-01-19 2003-03-20 Larry Gold Method and apparatus for the automated generation of nucleic acid ligands
US20070286915A1 (en) * 2004-10-19 2007-12-13 Pias Corporation Nerve Growth Factor Production Inhibitor and External Preparation for the Skin, Cosmetic, Quasi Drug, Preventive and Remedy for Atopic Dermatitis Containing the Nerve Growth Factor Production Inhibitor
US20080207523A1 (en) * 2006-09-08 2008-08-28 Matthias Friebe Compounds as aptamer-dimers and their uses in diagnosis and therapy
US20090004667A1 (en) * 2007-01-16 2009-01-01 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2686992C2 (ru) * 2014-03-24 2019-05-06 Рибомик Инк. Аптамер для fgf2 и его применение

Also Published As

Publication number Publication date
EP2558478B1 (en) 2018-03-07
UA105290C2 (ru) 2014-04-25
JP7025818B2 (ja) 2022-02-25
MX2020003168A (es) 2022-05-31
BR112012025872B1 (pt) 2021-04-20
NO2558478T3 (ru) 2018-08-04
JP6352324B2 (ja) 2018-07-04
MY160608A (en) 2017-03-15
KR20130043099A (ko) 2013-04-29
JP2013523887A (ja) 2013-06-17
KR101842269B1 (ko) 2018-03-26
TW201134482A (en) 2011-10-16
AU2011240774A1 (en) 2012-10-18
IL222339A0 (en) 2012-12-31
TW201730198A (zh) 2017-09-01
BR112012025872B8 (pt) 2022-10-25
TW201900668A (zh) 2019-01-01
US20160355540A1 (en) 2016-12-08
US9163056B2 (en) 2015-10-20
BR112012025872A2 (pt) 2016-10-18
CA2793451A1 (en) 2011-10-20
TW201629079A (zh) 2016-08-16
AU2011240677B2 (en) 2015-05-14
CN102985435A (zh) 2013-03-20
BR122021003805B1 (pt) 2021-10-13
CN102858990B (zh) 2016-08-03
TWI671309B (zh) 2019-09-11
EP2558478A4 (en) 2013-10-23
IL256013A (en) 2018-01-31
US20150376223A1 (en) 2015-12-31
IL252703A0 (en) 2017-08-31
US20130012693A1 (en) 2013-01-10
CA3066785A1 (en) 2011-10-20
TW202019943A (zh) 2020-06-01
TWI643864B (zh) 2018-12-11
IL222339A (en) 2015-11-30
KR20190018750A (ko) 2019-02-25
IL256013B (en) 2018-05-31
HK1201740A1 (en) 2015-09-11
US20140058076A1 (en) 2014-02-27
WO2011130289A1 (en) 2011-10-20
US20180127450A1 (en) 2018-05-10
US20190233461A1 (en) 2019-08-01
IL256014A (en) 2018-01-31
SG184497A1 (en) 2012-11-29
KR101952671B1 (ko) 2019-02-27
DK2558478T3 (en) 2018-05-22
AU2011240774B2 (en) 2014-04-10
CA2797188C (en) 2020-03-31
CN107033204A (zh) 2017-08-11
KR102185779B1 (ko) 2020-12-03
HK1252803A1 (zh) 2019-06-06
KR20130103317A (ko) 2013-09-23
EP2558586A1 (en) 2013-02-20
TW201936623A (zh) 2019-09-16
MX2012011779A (es) 2012-12-17
US20110275794A1 (en) 2011-11-10
ES2905656T3 (es) 2022-04-11
IL256014B (en) 2018-05-31
IL252703A (en) 2017-12-31
IL242038A0 (en) 2015-11-30
AR081452A1 (es) 2012-09-05
JP2016145230A (ja) 2016-08-12
EP3345915A1 (en) 2018-07-11
TWI684596B (zh) 2020-02-11
BR122021003805B8 (pt) 2022-10-25
JP2013523177A (ja) 2013-06-17
SG2014006522A (en) 2014-03-28
EP2558478A1 (en) 2013-02-20
CN104069512A (zh) 2014-10-01
EA201291034A1 (ru) 2013-04-30
MX2012011771A (es) 2012-12-17
CN102858990A (zh) 2013-01-02
TWI505833B (zh) 2015-11-01
AU2011240677A1 (en) 2012-11-01
WO2011130195A1 (en) 2011-10-20
NZ602618A (en) 2013-12-20
CN102985435B (zh) 2016-10-26
ES2610159T3 (es) 2017-04-26
CO6630139A2 (es) 2013-03-01
CA2797188A1 (en) 2011-10-20
KR20180030229A (ko) 2018-03-21
US10221207B2 (en) 2019-03-05
EP2558586B1 (en) 2016-10-12
TWI593701B (zh) 2017-08-01
JP2018109050A (ja) 2018-07-12
ES2667491T3 (es) 2018-05-11
SG184089A1 (en) 2012-11-29
JP5901610B2 (ja) 2016-04-13
JP6012591B2 (ja) 2016-10-26
US8598140B2 (en) 2013-12-03
EP2558586A4 (en) 2014-10-15
IL242038A (en) 2017-07-31
EP3345915B1 (en) 2021-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA022429B1 (ru) АПТАМЕРЫ К β-NGF И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ β-NGF-ОПОСРЕДОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ
DK2158316T3 (en) Gene expression and pain
JP2022519019A (ja) オリゴヌクレオチド組成物及びその方法
US9365855B2 (en) Aptamers to 4-1BB and their use in treating diseases and disorders
US20150209332A1 (en) Use of Angiotensin II Agonists
JP2019500349A (ja) 中枢神経系疾患の処置のための組成物および方法
KR20190084351A (ko) 펩타이드 올리고뉴클레오타이드 접합체
TW201741459A (zh) 反義寡聚物及將其用於治療與酸性α－葡萄糖苷酶基因相關之疾病的方法
AU2017324860A1 (en) PD-1 specific aptamers
WO2015050957A2 (en) Treatments for systemic lupus erythematosus
US9993522B2 (en) Treatment of pain by inhibition of USP5 de-ubiquitinase
WO2023176920A1 (ja) コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンス核酸
WO2022266042A1 (en) Treatment of mst1r related diseases and disorders
AU2016266076A1 (en) Gene expression and pain

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU