JP2015514227A - 結核バイオマーカーおよびその使用 - Google Patents

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Abstract

本出願は、結核（ＴＢ）の検出、処置および診断のためのバイオマーカー、方法、デバイス、試薬、システム、およびキットを含む。一態様において、本出願は、表１、２、４、５、および８から１２に記載されるものを含む、単独または様々な組み合わせとしてＴＢの検出に使用され得るバイオマーカーの特定を含む。別の態様において、本出願は、単独または様々な組み合わせとして、ＴＢを診断もしくは予後診断する、または処置応答を追跡するために使用され得るバイオマーカーを提供する。別の態様において、個人におけるＴＢを診断するための方法が提供され、この方法は、個人からの生体試料において、表１、２、４、５、および８から１２に記載のバイオマーカーの群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する少なくとも１つのバイオマーカー値を検出することを含み、少なくとも１つのバイオマーカー値に基づいて、個人がＴＢを有するものとして分類される、または個人がＴＢを有している尤度が決定される。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本出願は、２０１２年４月１３日出願の米国仮特許出願第６１／６２３，７３２号の利益を主張し、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、概して、結核（ＴＢ）のバイオマーカーの特定および検出に関する。より具体的には、本発明は、ＴＢ感染および疾患の評価のための１つ以上のバイオマーカー、方法、デバイス、試薬、数学モデル、システム、およびキットに関し、評価は、個人におけるＴＢの診断、予後診断、処置、処置応答および処置効果および処置毒性、再発、再感染、ぶり返しの決定、または潜伏感染からＴＢの活動性疾患への再活性化の予測を含み得る。
以下の説明は、本開示に関連する情報の要約を提供するものであり、提供される情報、または本明細書において参照される出版物のいずれも、本開示の先行技術であることを認めるものではない。
結核（ＴＢ）は、年間１４０万人の死亡の原因であり、特に、ＨＩＶおよび他の慢性疾患に同時感染している個人において、多大な個人的、社会的、公衆衛生、および経済コストが伴う。適切、正確、および時宜を得たＴＢの診断は、疾患の蔓延を予防し薬物耐性菌の発生を最小限化するための、処置および標的化された公衆衛生介入に向けた患者の迅速な特定に必須である［ＷＨＯ（２００９）］。Ｓｔｏｐ ＴＢ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐの新たな診断ワーキンググループ［Ｍｅｈｔａ ａｎｄ Ｃｏｏｋ（２０１０）ＢＩＯ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ］。世界的に、ＴＢのほとんどの症例は喀痰塗抹標本、臨床症状、および／またはＸ線写真を使用して診断される。痰中の抗酸菌（ＡＦＢ、例えばＺｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ法）に対する微視的な染色によるマイコバクテリア症の現在の診断は、ＴＢの症例の約５０％においてマイコバクテリアを検出することができないため、診断を改善する明確な義務が存在する。この診断方法は、ＨＩＶ同時感染者においては性能が低く、個人が検体を生成することができない（例えば、痰を生成することができない幼児）または肺の外（肺外）に疾患を有する場合特に問題となる。世界保健機関（ＷＨＯ）の推定によれば、世界の症例検出率はわずか６３％であり、アフリカにおいてはＴＢ症例の半分しか検出および通知されていない（ＷＨＯ（２０１１）Ｌｉｖｉｎｇ ｗｉｔｈ ＨＩＶ，ｄｙｉｎｇ ｆｒｏｍ ＴＢ；ＭｃＮｅｒｎｅｙ ａｎｄ Ｄａｌｅｙ（２０１１）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９（３）：２０４−２１３）。ＴＢの過小診断は、ＴＢ−ＨＩＶ同時感染に伴う高い死亡率のため、ＡＩＤＳにおいて極めて重要である。接触伝染病を有するＨＩＶ陰性患者におけるＴＢの診断は、世界のＴＢ発生率の減少における進展を継続するための優先的な介入である。２００９年においては、推定４００，０００人の人々がＨＩＶ関連ＴＢで死亡しており、これによりＴＢは４つのＡＩＤＳによる死亡の１つの原因となっている（ＷＨＯ（２０１１）Ｌｉｖｉｎｇ ｗｉｔｈ ＨＩＶ，ｄｙｉｎｇ ｆｒｏｍ ＴＢ）。
診断未確定患者は、薬物耐性ＴＢを含む疾患の蔓延の主要な温床である。具体的な特定および薬剤感受性に必要な微生物技術は、数日から数週間を要し、多くの場合、リソースに乏しい地域および遠隔地域においては利用できない。診療所または地域の病院のスタッフにより使用される迅速、正確、および安価なＴＢ試験は、速やかに処置を必要とする者を特定することにより、リソースが制限された地域における公衆衛生の価値を大きく高め、したがって他者への疾患の蔓延を減少させる。ポイントオブケア（ＰＯＣ）試験がないことが、ＴＢ診断の既存のパイプラインにおける主要なギャップとして特定されている（Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｕｌｍ Ｍｅｄ １６（３）：２７１−２８４）。
結核の治療に対する臨床反応は、全身症状の改善、微生物負荷の減少、他者への蔓延のリスクの低減、および多剤療法で処置された患者における健康への極めて急速な回復により明らかとなるが、最終的にぶり返す者を予測するには、長期的な臨床経過観察が必要である。ＴＢ処置期間を大幅に短縮し得る新たな計画では、殺菌計画のためのより迅速な代理マーカーが必要である。（Ｓｐｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ １４：６６３−６６４；Ｗａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ９：１６２−１７２）。治癒（１年から２年の綿密な臨床経過観察後にぶり返しが存在しないことと定義される）の完全な代理評価項目はないが、８週間の痰培養物状態が最も広く認められている評価項目である（Ｃｈａｋｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１３１−１４８；Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３８：５０−５９；Ｗａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ９：１６２−１７２）。
処置評価においてより初期に使用することができ得る処置応答のための安定したタンパク質バイオマーカーの発見は、臨床試験に対する影響を有し、潜在的に患者の臨床ケアに有用であることが期待される。ぶり返しが稀であることから（標準的治療を使用した薬物感受性疾患の試験において、患者の５％未満がぶり返す）、臨床試験において大きな試料サイズ、典型的には治療群または比較群当たり７５〜３００の対象を含める必要がある。ＴＢ試験において、大きなダイナミックレンジを有する複数血清タンパク質等の代理マーカーの連続測定が、患者試料サイズを５０〜９０％低減し得、また切実に必要とされるヒト試験において、時間的および金銭的投資を減らすことができることが指摘されている。（Ｂｕｒｍａｎ（２００３）Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃａｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６７：１２９９−１３０１；Ｎａｈｉｄ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃａｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８４（８）：９７２−９７９ｅ）。したがって、ＴＢの診断、予後診断、処置応答マーカーおよび再発の決定または再活性化の予測を可能とするバイオマーカー、方法、デバイス、試薬、システム、およびキットが必要とされている。
特定の疾患状態のためのバイオマーカー選択は、まず、特定の医学的応用における対照集団と比較した疾患集団における測定可能で統計学的に有意な差を有するマーカーの特定を含む。バイオマーカーは、疾患の発達または進行に平行し、ＴＢ組織から、または周囲組織および循環細胞からＴＢに反応して血流または他の体液中に容易に拡散する、分泌または脱落した分子を含んでもよい。特定されたバイオマーカーまたはバイオマーカーのセットは、一般に、臨床的に検証されるか、または、それが選択された元の使用目的のための信頼性のある指標であることが示される。バイオマーカーは、小分子、ペプチド、タンパク質、および核酸を含み得る。バイオマーカーの特定に影響する主要な問題のいくつかは、利用可能なデータの過剰適合およびデータの偏りを含む。
疾患の評価、診断、予後診断、およびその再発または再活性化の決定のためのバイオマーカーを特定しようとする試みにおいて、様々な方法が使用されている。タンパク質系マーカーの場合、これらは、２次元電気泳動、質量分析、および免疫測定方法を含む。核酸マーカーの場合、これらは、ｍＲＮＡ発現プロファイル、ｍｉｃｒｏＲＮＡプロファイル、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、メチル化プロファイル、および大量遺伝子発現アレイを含む。
２次元電気泳動の実用性は、低い検出感度、タンパク質の溶解度、電荷、および疎水性に関する問題、ゲル再現性、ならびに複数タンパク質を表す単一スポットの可能性により制限される。質量分析においては、使用される形式に依存して、制限は、試料処理および分離、低存在量タンパク質に対する感度、シグナル対雑音の考慮事項、および検出されたタンパク質、脂質または小分子を速やかに特定することができないことが中心となる。バイオマーカー発見の免疫測定アプローチにおける制限は、抗体系多重アッセイが大量の分析物を測定することができないことが中心となる。抗体のアレイを単に印刷して、サンドイッチせずにそれらの抗体に結合した分析物を測定することができる。これは、正式に、ハイブリダイゼーションにより、生物または細胞内の全てのＤＮＡまたはＲＮＡ配列を測定するために核酸配列の全ゲノムを使用することと同等である。ハイブリダイゼーションは、識別のためのストリンジェントな試験となり得るため、ハイブリダイゼーション実験は役立つ。高親和性抗体であっても、血液またはさらに細胞抽出物に関連して機能する結合パートナーの選択において十分ストリンジェントではないが、これは、それらのマトリックス内のタンパク質集合体は、極めて異なる存在量を有するためである。したがって、バイオマーカー発見の免疫測定ベースアプローチと共に異なるアプローチを使用しなければならず、多くの分析物を同時に測定して、どの分析物が実際にバイオマーカーであるかを決定するために十分なストリンジェンシーを得るために、多重ＥＬＩＳＡアッセイ（すなわちサンドイッチ）を使用する必要があるだろう。サンドイッチ免疫測定法は、高含量まで拡張されず、したがってストリンジェントなサンドイッチ免疫測定法を使用したバイオマーカー発見は、標準的なアレイ形式を使用しては不可能である。最後に、抗体試薬は、実質的なロット間変動および試薬不安定性を被る。タンパク質バイオマーカー発見のための本プラットフォームは、これらの問題を克服する。
これらの方法の多くは、分析前のある種の試料分別に依存する、またはそれを必要とする。したがって、一連の十分明確に定義された試料集団において、統計学的に関連したバイオマーカーを特定および発見するように設計された十分に力のある試験を行うのに必要な試料調製は極めて困難であり、費用を要し、時間を要する。分別中、広範な変動が様々な試料に導入され得る。例えば、潜在的マーカーは、プロセスに対し不安定である可能性があり、マーカーの濃度が変化する可能性があり、不適切な凝集または分解が生じる可能性があり、また不用意な試料汚染が生じ、したがって早期疾患において予測されるわずかな変化を不明確化する可能性がある。
これらの技術を使用したバイオマーカーの発見および検出方法は、診断バイオマーカーの特定に対する深刻な制限を有することが、広く認められている。これらの制限は、低存在量バイオマーカーを検出することができないこと、プロテオームのダイナミックレンジ全体を一貫してカバーすることができないこと、試料処理および分別における非再現性、全体的な非再現性および方法の安定性の欠如を含む。さらに、これらの方法は、データに偏りを導入し、標的疾患集団内のバイオマーカーを特定し検証するのに必要な分布およびランダム化の点での適切な制御を含め、試料集団の複雑性に十分対応していない。
新たな効果的ＴＢバイオマーカーの発見を目指した取り組みが数十年間続けられているが、それらの取り組みの大部分が不成功である。様々な疾患のためのバイオマーカーは、典型的には、学術研究所において、通常はいくつかの疾患プロセスに対する基礎的研究を行っている間の偶然の発見により特定されている。発見および少量の臨床データに基づき、新たなバイオマーカーの特定を示唆する論文が発表された。しかしながら、これらの提案されたバイオマーカーのほとんどは、主に少数の臨床試料が試験されたことから、実際の、または有用なバイオマーカーとして確認されておらず、効果的なバイオマーカーが実際に発見されたことの弱い統計的証拠しか提供しなかった。すなわち、最初の特定は、統計学の基本要素の点で厳密ではなかった。１９９４年から２００３年まで毎年、科学文献を検索すると、バイオマーカーに関する数千もの参考文献が発行されたことが分かる。しかしながら、同時期に、ＦＤＡは、１年で最大３つの新たなタンパク質バイオマーカーの診断における使用を承認しており、数年は新たなタンパク質バイオマーカーは承認されていない。
失敗に終わったバイオマーカーの発見への取り組みの歴史に基づき、疾患のバイオマーカーが稀であり、発見が困難であることの一般的理解をさらに促進する数学的理論が提案されている。２Ｄゲルまたは質量分析に基づくバイオマーカー研究が、これらの考えを裏付けている。これらのアプローチにより、極めて数少ない有用なバイオマーカーが特定されている。しかしながら、２Ｄゲルおよび質量分析は、約１ｎＭ以上の濃度で血液中に存在するタンパク質を測定するものであること、およびこのタンパク質の集合体は、疾患により変化する可能性が最も低くなり得ることが通常見落とされている。本バイオマーカー発見プラットホーム以外、はるかにより低い濃度でのタンパク質発現レベルを正確に測定することができるプロテオームバイオマーカー発見プラットフォームは存在しない。
複雑なヒト生物学の生化学的経路に関してはよく知られている。多くの生化学的経路は、病変内で局所的に作用する分泌タンパク質で終わる、またはそれにより開始し、例えば、成長因子は、その病変における他の細胞の複製を刺激するために分泌され、他の因子は、免疫系を回避するために分泌される、等がある。これらの分泌タンパク質の多くは、傍分泌形式で作用し、いくつかは体内の遠位で機能する。生化学的経路の基本的理解を有する当業者には、多くの病変特異的タンパク質が、２Ｄゲルおよび質量分析の検出限界未満（さらにははるかに下回る）濃度で血液中に存在するはずであることが理解される。この比較的豊富な数の疾患バイオマーカーの特定の前に、２Ｄゲルまたは質量分析により検出可能な濃度を下回る濃度のタンパク質を分析することができるプロテオームプラットフォームが必要である。
本開示は、ＴＢおよびその後のＴＢ処置応答の評価のためのバイオマーカー、方法、試薬、デバイス、システム、数学モデルおよびキットを含む。本開示のバイオマーカーは、実施例１において説明される多重アプタマーベースアッセイを使用して特定された。本明細書に記載のアプタマーベースバイオマーカー特定法を使用することにより、本出願は、ＴＢの評価および処置に有用な驚くほど多数のＴＢバイオマーカーを説明する。これらのバイオマーカーの特定において、個々の参加者の試料からの約１０３０のタンパク質が測定され、そのいくつかは、低フェムトモル範囲の濃度であった。これは、２Ｄゲルまたは質量分析で行われたバイオマーカー発見実験よりも約４桁低い。
説明されたＴＢバイオマーカーのいくつかは、ＴＢ処置に対する宿主応答の検出およびＴＢの診断において単独で有用となり得るが、ＴＢを診断するため、無症状性または顕在性の薬物毒性を検出するため、および治療に対する成功裏の応答を予測するためのバイオマーカーのパネルとして有用であるＴＢバイオマーカーの複数のサブセットのグループ化のための方法が、本明細書に記載される。個々のバイオマーカーまたはバイオマーカーのサブセットが特定されたら、生体試料中の選択されたバイオマーカー（複数を含む）のレベルの差を測定することができる任意のアッセイプラットフォームまたは形式を使用して、ＴＢの検出または診断、ならびにＴＢ処置および治療処置への応答の追跡が達成され得る。
しかしながら、本明細書に開示されるＴＢバイオマーカーを特定することができたのは、約１０３０の別個の潜在的バイオマーカー値がＴＢと診断された個人から個々にスクリーニングされた本明細書に記載の多重アプタマーベースバイオマーカー特定法を使用し、処置により変化するバイオマーカーを監視することによってのみである。この発見アプローチは、より患者に関連したシステムにクエリし、タンパク質を測定しＲＮＡ発現を測定しないため、動物モデルまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ系を使用したバイオマーカー発見とは著しく対照的である（Ｂｅｒｒｙ（Ａｕｇ．２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４６６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９２４７）；ａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｄｒｉｖｅｎ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ。
したがって、本出現の一態様において、ＴＢを診断および処置するための、単独で、または様々な組み合わせとしての使用のための１つ以上のバイオマーカーが提供される。例示的実施形態は、表１、２、４、５および８から１２に記載のバイオマーカーを含み、これらは、上述のように、実施例１および２において記載されるように多重アプタマーベースアッセイを使用して特定された。マーカーはまた、バイオマーカーに対する処置薬剤の効果を反映し得、処置毒性または効果のマーカーであることを証明し得る。
記載されるＴＢバイオマーカーのいくつかは、ＴＢの評価において単独で有用であるが、それぞれ２つ以上のバイオマーカーのパネルとして有用であるＴＢバイオマーカーの複数のサブセットのグループ化のための方法もまた、本明細書において説明される。したがって、本出願の様々な実施形態は、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、例えば、Ｎは少なくとも２であり、Ｎは少なくとも３であり、Ｎは少なくとも４であり、Ｎは少なくとも５であり、Ｎは少なくとも６であり、Ｎは少なくとも７であり、Ｎは少なくとも８であり、Ｎは少なくとも９であり、Ｎは少なくとも１０であり、Ｎは、１個のバイオマーカーから２３９個のバイオマーカーの任意の数であってもよい。
本明細書において使用される場合、ＴＢの評価は、表１、２、４、５もしくは８から１２の１つ以上の少なくとも１つのバイオマーカーが、対照分布から差次的に発現したと検出されなかった場合、個人が疾患の証拠を有さないこと（ＮＥＤ）の第１の評価を有するかどうか、または、表１、２、４、５もしくは８から１２の１つ以上の少なくとも１つのバイオマーカーが、対照分布から差次的に発現したと検出された場合、疾患の証拠（ＥＶＤ）の第２の評価を有するかどうかを評価することを指す。
別の態様において、ＴＢに関して個人を評価するための方法が提供され、方法は、個人を、ＴＢを有する、もしくは有さないと診断すること、ＴＢおよびその処置の未来の経過を予後診断すること、活性ＴＢが明らかに治癒された、疾患の潜在的形態のみを有する個人におけるＴＢの再発を決定もしくはその再活性化を予測すること、ならびに、ＴＢの処置に対する個人の応答を特性決定すること、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
別の実施形態において、ＴＢに関して個人を評価する方法は、個人の生体試料における、表１、２、４、５または８から１２の１つ以上のバイオマーカーに対応する検出可能な値を決定することにより、個人を診断することを含み、診断は、対照集団のバイオマーカー値に比べて個人のバイオマーカー値の差次的発現が実質的にない場合、疾患の証拠を有さないこと（ＮＥＤ）およびＴＢを有さないことの第１の診断、または、対照集団のバイオマーカー値に比べて個人のバイオマーカー値の差次的発現がある場合、疾患の証拠（ＥＶＤ）およびＴＢの第２の診断を含む。上述のように、様々な実施形態は、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、例えば、Ｎは少なくとも２であり、Ｎは少なくとも３であり、Ｎは少なくとも４であり、Ｎは少なくとも５であり、Ｎは少なくとも６であり、Ｎは少なくとも７であり、Ｎは少なくとも８であり、Ｎは少なくとも９であり、Ｎは少なくとも１０であり、Ｎは、１個のバイオマーカーから２３９個のバイオマーカーの任意の数であってもよい。
一態様において、診断の方法は、個人の生体試料をアッセイして、表１、２、４、５または８から１２の１つ以上の少なくとも１つのバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定することと、個人のバイオマーカー値を対照集団のバイオマーカー値と比較して、差次的発現があるかどうかを決定することと、対照集団に比べて差次的発現がない場合、個人を、第１の診断を有するものとして分類し、または、対照集団に比べて差次的発現がある場合、第２の診断を有するものとして分類することを含む。様々な実施形態は、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、例えば、Ｎは少なくとも２であり、Ｎは少なくとも３であり、Ｎは少なくとも４であり、Ｎは少なくとも５であり、Ｎは少なくとも６であり、Ｎは少なくとも７であり、Ｎは少なくとも８であり、Ｎは少なくとも９であり、Ｎは少なくとも１０であり、Ｎは、１個のバイオマーカーから２３９個のバイオマーカーの任意の数であってもよい。
別の態様において、ＴＢを評価することは、疾患の証拠を有さないこと（ＮＥＤ）および好ましい予後の第１の予後、または、疾患の証拠（ＥＶＤ）および好ましくない予後の第２の予後を診断することを含む。
一態様において、予後診断方法は、個人の生体試料をアッセイして、表１、２、４、５または８から１２の１つ以上の少なくとも１つのバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定することと、個人のバイオマーカー値を対照集団のバイオマーカー値と比較して、差次的発現があるかどうかを決定することと、ならびに、差次的発現がない場合、個人を、陰性ＴＢ診断の第１の予後診断を有するものとして分類し、または、差次的発現がある場合、陽性ＴＢ診断の第２の予後診断を有するものとして分類することとを含む。様々な実施形態において、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせが提供され、例えば、Ｎは少なくとも２であり、Ｎは少なくとも３であり、Ｎは少なくとも４であり、Ｎは少なくとも５であり、Ｎは少なくとも６であり、Ｎは少なくとも７であり、Ｎは少なくとも８であり、Ｎは少なくとも９であり、Ｎは少なくとも１０であり、Ｎは、１個のバイオマーカーから２３９個のバイオマーカーの任意の数であってもよい。
一態様において、処置に対する応答を評価する方法であって、処置されている個人の生体試料をアッセイして、表８から１２の１つ以上からの少なくとも１つのバイオマーカーに対応する値を決定することと、個人のバイオマーカー値を対照集団のバイオマーカー値と比較して、差次的発現の程度を決定することと、前記バイオマーカー値の差次的発現の程度を、処置に対する陽性反応の増加した尤度と関連付けることとを含む方法が提供される。様々な実施形態において、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせが提供され、例えば、Ｎは少なくとも２であり、Ｎは少なくとも３であり、Ｎは少なくとも４であり、Ｎは少なくとも５であり、Ｎは少なくとも６であり、Ｎは少なくとも７であり、Ｎは少なくとも８であり、Ｎは少なくとも９であり、Ｎは少なくとも１０であり、Ｎは、１個のバイオマーカーから１２２個のバイオマーカーの任意の数であってもよい。
別の態様において、処置に対する応答を評価する方法であって、処置されている個人の生体試料をアッセイして、表８から１２の１つ以上からの少なくとも１つのバイオマーカーに対応する値を決定することと、結核菌を対象とした抗菌薬治療を含む処置を開始することと、処置前のバイオマーカー値を処置からのいくらかの期間後のバイオマーカー値と比較することとを含み、それによりバイオマーカー値の変化が処置の応答を示す方法が提供される。様々な実施形態において、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせが提供され、例えば、Ｎは少なくとも２であり、Ｎは少なくとも３であり、Ｎは少なくとも４であり、Ｎは少なくとも５であり、Ｎは少なくとも６であり、Ｎは少なくとも７であり、Ｎは少なくとも８であり、Ｎは少なくとも９であり、Ｎは少なくとも１０であり、Ｎは、１個のバイオマーカーから１２２個のバイオマーカーの任意の数であってもよい。
別の態様において、評価する方法であって、活性ＴＢが見かけ上治癒された、または感染の潜在的形態を有する個人におけるＴＢの再発または再活性化を決定することを含み、再発または再活性化を決定することは、疾患の証拠がないこと（ＮＥＤ）の第１の決定または疾患の証拠（ＥＶＤ）の第２の決定を含む方法が提供される。ＮＥＤの第１の決定は、ＴＢの再発または再活性化がないことを示し、ＥＶＤの第２の決定は、処置の失敗、ＴＢの再発または再活性化を示す。
再発または再活性化を決定する１つの方法は、個人の生体試料をアッセイして、表１、２、４、５または８から１２の１つ以上から選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する値を決定することと、個人のバイオマーカー値を対照集団のバイオマーカー値と比較して、差次的発現があるかどうかを決定することと、対照集団に比べて差次的発現がない場合、個人を、ＴＢ再発または再活性化がないことの前記第１の決定を有するものとして分類し、または、対照値に比べて差次的発現がある場合、ＴＢ再発または再活性化の前記第２の決定を有するものとして分類することとを含む。様々な実施形態において、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせが提供され、例えば、Ｎは少なくとも２であり、Ｎは少なくとも３であり、Ｎは少なくとも４であり、Ｎは少なくとも５であり、Ｎは少なくとも６であり、Ｎは少なくとも７であり、Ｎは少なくとも８であり、Ｎは少なくとも９であり、Ｎは少なくとも１０であり、Ｎは、１個のバイオマーカーから２３９個のバイオマーカーの任意の数であってもよい。
別の態様において、個人における結核感染を処置するための方法であって、個人の生体試料における表１、２、４、５または８から１２の１つ以上から選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する値を決定させることにより、結核感染を診断することであって、前記決定は、バイオマーカーの差次的発現に関して、個人のバイオマーカー値を、対照集団におけるバイオマーカー値と比較することを含み、バイオマーカーの差次的発現は、個人における結核感染の存在を示す、診断することと、そのようにして結核感染を診断された個人に結核感染に対する処置を施すこととを含む方法が提供される。様々な実施形態において、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせが提供され、例えば、Ｎは少なくとも２であり、Ｎは少なくとも３であり、Ｎは少なくとも４であり、Ｎは少なくとも５であり、Ｎは少なくとも６であり、Ｎは少なくとも７であり、Ｎは少なくとも８であり、Ｎは少なくとも９であり、Ｎは少なくとも１０であり、Ｎは、１個のバイオマーカーから２３９個のバイオマーカーの任意の数であってもよい。
さらに別の態様において、個人における結核感染を診断するためのアッセイであって、個人の生体試料における表１、２、４、５または８から１２の１つ以上から選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する値を決定させることであって、前記決定は、バイオマーカーの差次的発現に関して、個人のバイオマーカー値を、対照集団におけるバイオマーカー値と比較することを含み、バイオマーカーの差次的発現は、個人における結核感染の存在を示す、決定させることと、前記バイオマーカーの差次的発現に基づいて、個人を、結核感染を有すると診断することとを含むアッセイが提供される。様々な実施形態において、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせが提供され、例えば、Ｎは少なくとも２であり、Ｎは少なくとも３であり、Ｎは少なくとも４であり、Ｎは少なくとも５であり、Ｎは少なくとも６であり、Ｎは少なくとも７であり、Ｎは少なくとも８であり、Ｎは少なくとも９であり、Ｎは少なくとも１０であり、Ｎは、１個のバイオマーカーから２３９個のバイオマーカーの任意の数であってもよい。
別の態様において、個人が結核を有する、または有さないことを診断するための方法であって、個人からの生体試料を、少なくともＮ個のアプタマーと接触させることであって、各アプタマーは、表１、２、４、５または８から１２の１つ以上から選択されるＮ個のバイオマーカーの１つに対応するバイオマーカーに対する特定の親和性を有する、接触させることと、生体試料におけるバイオマーカーのレベルを検出することと、前記Ｎ個のバイオマーカーのそれぞれに対するバイオマーカー値を決定することとを含み、前記個人は、前記バイオマーカー値に基づいて結核を有する、または有していないと診断され、Ｎは、２から２３９の任意の整数である方法が提供される。
一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５から選択される。一実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５から選択される。一実施形態において、少なくとも３つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５から選択される。一実施形態において、少なくとも４つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５から選択される。一実施形態において、少なくとも５つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５から選択される。一実施形態において、少なくとも６つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５から選択される。一実施形態において、少なくとも７つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５から選択される。一実施形態において、少なくとも８つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５から選択される。一実施形態において、少なくとも９つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５から選択される。一実施形態において、少なくとも１０個のバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５等から選択される。
一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、およびＬＢＰからなる群から選択される。一実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、およびＬＢＰからなる群から選択される。一実施形態において、少なくとも３つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、およびＬＢＰからなる群から選択される。一実施形態において、少なくとも４つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、およびＬＢＰからなる群から選択される。さらに別の実施形態において、少なくとも５つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、およびＬＢＰ等からなる群から選択される。
一実施形態において、Ｎは、３から２３９、または４から２３９、または５から２３９、または６から２３９、または７から２３９、または８から２３９、または９から２３９、または１０から２３９、または１５から２３９、または２０から２３９等の任意の整数である。
別の態様において、結核感染に対する処置を患者に施すべきかどうかを決定するための方法であって、ａ）個人の生体試料における表１、２、４または５および表８から１２の少なくとも１つのバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定するために、アッセイを行わせることであって、前記決定は、バイオマーカーの差次的発現に関して、個人のバイオマーカー値を、対照集団におけるバイオマーカー値と比較することを含み、バイオマーカーの差次的発現は、個人における結核感染の存在を示す、アッセイを行わせることと、ｂ）バイオマーカーの前記差次的発現に基づいて、個人が結核感染を有すると診断することと、ｃ）結核感染に対する処置を施すこととを含む方法が提供される。一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５および／または表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される。
別の実施形態において、結核に対する処置を施すべきかどうかを決定するための方法であって、ａ）個人からの生体試料を、少なくともＮ個のアプタマーと接触させることであって、各アプタマーは、表１、２、４、５または表８から１２から選択されるＮ個のバイオマーカーの１つに対応するバイオマーカーに対する特定の親和性を有する、接触させることと、ｂ）生体試料におけるバイオマーカーのレベルを検出し、前記Ｎ個のバイオマーカーのそれぞれに対するバイオマーカー値を決定することと、ｃ）前記バイオマーカー値に基づいて、個人が結核感染を有すると診断し、結核感染に対する処置を施すこととを含み、Ｎは、２から２３９の任意の整数である方法が提供される。
一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５および／または表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される。
一実施形態において、Ｎは、３から２３９、または４から２３９、または５から２３９、または６から２３９、または７から２３９、または８から２３９、または９から２３９、または１０から２３９、または１５から２３９、または２０から２３９等の任意の整数である。
別の態様において、個人における結核の処置のための薬物の投与から生じる薬物毒性を評価するための方法であって、ａ）個人に結核感染に対する処置を施すことであって、個人の生体試料における表１、２、４、５または８から１２の１つ以上の少なくとも１つのバイオマーカーに対応する値が決定されている、施すことと、ｂ）処置後の前記バイオマーカー値（複数を含む）を比較することにより、処置において使用される薬物の毒性を評価することとを含む方法が提供される。
別の態様において、個人における結核に対する処置の有効性を評価するための方法であって、ａ）個人に結核感染に対する処置を施すことであって、個人の生体試料における表８から１２の少なくとも１つのバイオマーカーに対応する値が決定されている、施すことと、ｂ）処置後の前記バイオマーカー（複数を含む）を比較することにより、処置の有効性を評価することとを含む方法が提供される。別の態様において、前記バイオマーカーの少なくとも１つが、表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。別の態様において、前記バイオマーカーの少なくとも２つが、表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。別の態様において、前記バイオマーカーの少なくとも３つが、表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。別の態様において、前記バイオマーカーの少なくとも４つが、表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。別の態様において、前記バイオマーカーの少なくとも５つが、表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２等から選択される。
さらに別の態様において、少なくとも１つのバイオマーカーが、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＳＡＡ、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７からなる群から選択される。さらに別の態様において、少なくとも２つのバイオマーカーが、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＳＡＡ、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７からなる群から選択される。さらに別の態様において、少なくとも３つのバイオマーカーが、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＳＡＡ、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７からなる群から選択される。さらに別の態様において、少なくとも４つのバイオマーカーが、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＳＡＡ、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７からなる群から選択される。さらに別の態様において、少なくとも５つのバイオマーカーが、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＳＡＡ、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７等からなる群から選択される。
別の実施形態において、結核に対する処置の有効性を評価するための方法であって、ａ）個人からの生体試料を、少なくともＮ個のアプタマーと接触させることであって、各アプタマーは、表８から１２から選択されるＮ個のバイオマーカーの１つに対応するバイオマーカーに対する特定の親和性を有する、接触させることと、ｂ）生体試料におけるバイオマーカーのレベルを検出し、前記Ｎ個のバイオマーカーのそれぞれに対するバイオマーカー値を決定することと、ｃ）前記バイオマーカー値に基づいて、個人が結核感染を有すると診断することと、ｄ）結核感染に対する処置を施すことであって、Ｎは、２から２３の任意の整数である、施すことと、ｅ）処置後の前記バイオマーカー値（複数を含む）を比較することにより、処置の有効性を評価することとを含む方法が提供される。
別の態様において、前記バイオマーカーの少なくとも２つが、表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。別の態様において、前記バイオマーカーの少なくとも３つが、表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。別の態様において、前記バイオマーカーの少なくとも４つが、表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。別の態様において、前記バイオマーカーの少なくとも５つが、表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２等から選択される。
さらに別の態様において、少なくとも１つのバイオマーカーが、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＳＡＡ、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７からなる群から選択される。さらに別の態様において、少なくとも２つのバイオマーカーが、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＳＡＡ、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７からなる群から選択される。さらに別の態様において、少なくとも３つのバイオマーカーが、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＳＡＡ、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７からなる群から選択される。さらに別の態様において、少なくとも４つのバイオマーカーが、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＳＡＡ、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７からなる群から選択される。さらに別の態様において、少なくとも５つのバイオマーカーが、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＳＡＡ、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７等からなる群から選択される。
一実施形態において、Ｎは、３から２３９、または４から２３９、または５から２３９、または６から２３９、または７から２３９、または８から２３９、または９から２３９、または１０から２３９、または１５から２３９、または２０から２３９等の任意の整数である。
別の態様において、個人における結核感染の再発または再活性化を処置するための方法であって、個人の生体試料における表１、２、４、５または８から１２のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定させることにより、結核感染の再発または再活性化を診断することであって、前記決定は、バイオマーカーの差次的発現に関して、個人のバイオマーカー値を、対照集団におけるバイオマーカー値と比較することを含み、バイオマーカーの差次的発現は、個人における結核感染の再発または再活性化を示す、診断することと、そのようにして結核感染の再発または再活性化を診断された個人に、結核感染の再発または再活性化に対する処置を施すこととを含む方法が提供される。
一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５および／または表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される。
一実施形態において、Ｎは、３から２３９、または４から２３９、または５から２３９、または６から２３９、または７から２３９、または８から２３９、または９から２３９、または１０から２３９、または１５から２３９、または２０から２３９等の任意の整数である。
さらに別の態様において、個人における結核感染の処置を修正するための方法であって、個人の生体試料における表１、２、４、５または８から１２のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定させることにより、結核感染の状態を評価することであって、前記評価は、バイオマーカーの差次的発現に関して、個人のバイオマーカー値を、対照集団におけるバイオマーカー値と比較することを含み、バイオマーカーの差次的発現は、個人における結核感染の処置を強化する必要性を示す、評価することと、そのようにして結核感染の強化された処置が必要であると評価された個人への結核感染に対する処置を強化することとを含む方法が提供される。
一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５および／または表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２から選択される。一実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーが、表１および／または表４および／または表５および／または表９および／または表１０および／または表１１および／または表１２等から選択される。一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢおよびＩＬ−７からなる群から選択される。一実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７等からなる群から選択される。
別の態様において、個人がＮＥＤの第１の評価を有する、またはＥＶＤの第２の評価を有するものとして分類するためのコンピュータ実装方法が提供される。方法は、ａ）コンピュータ上で個人のバイオマーカー情報を取得することであって、バイオマーカー情報は、表１、２、４、５または８から１２の少なくとも１つのバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む、取得することと、ｂ）ステップａ）の前記バイオマーカー値を、対照集団のバイオマーカー値と比較して、差次的発現があるかどうか決定することと、ｃ）対照集団に比べて個人のバイオマーカー値の差次的発現がない場合、個人を、ＮＥＤの第１の評価を有するものとして分類し、または、対象集団に比べて個人のバイオマーカー値の差次的発現がある場合、ＥＶＤの第２の評価を有するものとして分類することとを含む。
コンピュータ実装方法において、評価はＴＢの診断、処置、予後診断、再発もしくは再活性化の決定、および／またはそれらの組み合わせを含んでもよい。ＮＥＤの評価は、ＴＢがないという診断、選択された未来の時点でＴＢがないという転帰の予後診断、ＴＢの再発もしくは再活性化がないという決定、および／またはそれらの組み合わせを示し得る。ＥＶＤの評価は、ＴＢの存在の診断、選択された未来の時点でのＴＢの転帰の予後診断、ＴＢの再発もしくは再活性化の決定、および／またはそれらの組み合わせを示し得る。
別の態様において、コンピュータプログラム製品は、コンピュータデバイスまたはシステムのプロセッサにより実行可能なプログラムコードを具現化するコンピュータ可読媒体を含み、プログラムコードは、個人からの生体試料に帰属するデータを取得するコードであって、データは、表１、２、４、５または８から１２に記載のバイオマーカーの少なくとも１つに対応するバイオマーカー値を含む、コードと、個人のバイオマーカー値を、対照集団のバイオマーカー値と比較するためのコードと、対照集団に比べて個人のバイオマーカー値の差次的発現がない場合、ＮＥＤの第１の評価を示し、または、対照集団に比べて個人のバイオマーカー値の差次的発現がある場合、ＥＶＤの第２の評価を示す分類方法を実行するコードとを備える。
別の態様において、コンピュータプログラム製品またはコンピュータ可読媒体による個人のＴＢ状態のコンピュータ実装分類は、ＴＢの診断、処置計画、予後診断、再発もしくは再活性化の決定、および／またはそれらの組み合わせを反映し得る。ＮＥＤの評価は、ＴＢがないという診断分類、選択された未来の時点でＴＢがないという転帰の予後診断分類、ＴＢの再発もしくは再活性化がないという決定分類、および／またはそれらの組み合わせを示し得る。ＥＶＤの評価は、ＴＢの診断分類、選択された未来の時点でのＴＢの転帰の予後診断分類、ＴＢの再発もしくは再活性化の決定分類、および／またはそれらの組み合わせを示し得る。
本開示のある特定の態様において、考慮されるバイオマーカーパネルまたはバイオマーカー値の数は、例えば、少なくとも２つのバイオマーカー、少なくとも３つのバイオマーカー、少なくとも４つのバイオマーカー、少なくとも５つのバイオマーカー、少なくとも６つのバイオマーカー、少なくとも７つのバイオマーカー、少なくとも８つのバイオマーカー、少なくとも９つのバイオマーカー、少なくとも１０個のバイオマーカーから選択され、Ｎは、１個のバイオマーカーから２３９個のバイオマーカーの任意の数であってもよい。
本開示の他の態様において、少なくとも１つのバイオマーカーが、表１、および／または表４、および／または表５、および／または表９、および／または表１０、および／または表１１、および／または表１２から選択される。本開示の他の態様において、少なくとも２つのバイオマーカーが、表１、および／または表４、および／または表５、および／または表９、および／または表１０、および／または表１１、および／または表１２から選択される。本開示の他の態様において、少なくとも３つのバイオマーカーが、表１、および／または表４、および／または表５、および／または表９、および／または表１０、および／または表１１、および／または表１２から選択される。本開示の他の態様において、少なくとも４つのバイオマーカーが、表１、および／または表４、および／または表５、および／または表９、および／または表１０、および／または表１１、および／または表１２から選択される。本開示の他の態様において、少なくとも５つのバイオマーカーが、表１、および／または表４、および／または表５、および／または表９、および／または表１０、および／または表１１、および／または表１２から選択される。本開示の他の態様において、少なくとも６つのバイオマーカーが、表１、および／または表４、および／または表５、および／または表９、および／または表１０、および／または表１１、および／または表１２から選択される。本開示の他の態様において、少なくとも７つのバイオマーカーが、表１、および／または表４、および／または表５、および／または表９、および／または表１０、および／または表１１、および／または表１２から選択される。本開示の他の態様において、少なくとも８つのバイオマーカーが、表１、および／または表４、および／または表５、および／または表９、および／または表１０、および／または表１１、および／または表１２から選択される。本開示の他の態様において、少なくとも９つのバイオマーカーが、表１、および／または表４、および／または表５、および／または表９、および／または表１０、および／または表１１、および／または表１２から選択される。本開示の他の態様において、少なくとも１０個のバイオマーカーが、表１、および／または表４、および／または表５、および／または表９、および／または表１０、および／または表１１、および／または表１２等から選択される。
他の態様において、少なくとも１つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される。他の態様において、少なくとも２つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される。他の態様において、少なくとも３つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される。他の態様において、少なくとも４つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される。他の態様において、少なくとも５つのバイオマーカーが、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７等からなる群から選択される。
生体試料におけるＴＢを検出するための例示的方法のフローチャートである。 単純ベイズ分類法を使用して生体試料におけるＴＢを検出するための例示的方法のフローチャートである。 生体試料における１つ以上のＴＢバイオマーカーを検出するために使用され得る例示的アプタマーアッセイを示す。 本明細書に記載の様々なコンピュータ実装方法との使用のための例示的コンピュータシステムを示す。 一実施形態による、個人がＴＢを有する尤度を示す方法のフローチャートである。 一実施形態による、個人がＴＢを有する尤度を示す方法のフローチャートである。 図６Ａ〜６Ｃは、ベースラインと治療８週目との間の、急性期反応物質ＳＡＡ（図６Ａ）およびＣＲＰ（図６Ｂ）、ならびにアルブミン（図６Ｃ）を含む活性ＴＢの非特異的マーカーの発現の変化を示す。 図７Ａ〜７Ｄは、空洞化のＸ線写真分類による、臨床パラメータ（ＢＭＩ、検出までの時間）および血清タンパク質レベル（プラスミノーゲン、トロンボスポンジン−２）の相関を示す。 図８Ａ〜８Ｉは、血清タンパク質マーカーのＴＢ疾患重症度との相関を示す。上位マーカーは、ベースラインでの中央値に基づき、重度の疾患（ｎ＝１３）と比較して、軽度の疾患において最大の差次的発現を示した（ｎ＝１３）。ベースライン（ｌｏｇ）ＲＦＵが、線形モデルにおける反応として使用され、５％偽発見率であった。図８Ａ〜８Ｄは、ベースラインにおいて疾患重症度スコアと相関したタンパク質濃度の線形回帰分析により特定された疾患重症度のマーカーを示す。図８Ｅ〜８Ｆは、８週間での疾患重症度スコアに対する、（それぞれ）α２−抗プラスミンおよびフィブリノゲンのレベルを示す。図８Ｇ〜８Ｉは、ベースラインから８週目までの発現シフトの回帰分析に基づく疾患重症度のマーカーを示す。 同上。 同上。 ｎ＝３９患者におけるＴＢ治療のベースラインと８週目との間の最大変化を伴う、マーカーの対分析を示し、中央対象内倍数変化により順位付けされている。 １，０３０個の測定タンパク質に対するＫＳ距離による特徴分離を示し、対応する有意水準は、ｑ値として示されている。 図１１Ａ〜１１Ｈは、ベースラインと８週目との間に最大ＫＳ距離を有する８つのタンパク質に対するＬｏｇ１０ ＲＦＵを示す実験的累積分布関数を示す。 同上。 ｎ＝３９ＴＢ患者からの試料における、ベースラインおよび８週目測定の非対分析からの上位５９タンパク質の実験的累積分布関数を示す。 最大ＫＳ距離を有する２つのマーカー、ＴＳＰ４およびＳＥＰＲを使用したベースラインおよび８週目試料の分離の散布図を示す。 肺ＴＢを有する３９患者からの試料の正規化された疾患重症度スコアを示す。 図１５Ａ〜１５Ｄは、四分位数、中央値、および外れ値を示す、応答者および低応答者における患者人口統計パラメータ（年齢（図１５Ａ）、ＢＭＩ（図１５Ｂ）、検出までの日数（図１５Ｃ）およびＣＸＲ範囲（図１５Ｄ））のボックスプロットを示す。 同上。 図１６Ａは、応答者対低応答者からのベースライン試料において測定された１０３０個のタンパク質のＫＳ距離プロットを示す。四角は、応答者（白四角）または低応答者（黒四角）におけるより高い上位１０個のタンパク質を示す。破線は、ボンフェローニ較正された３０％有意水準を示す。図１６Ｂは、ベースラインでの応答者（Ｒ）対低応答者（Ｓ）における、最も差次的に発現したタンパク質の累積分布関数（ＣＤＦ）プロットを示す。ＲＦＵ（ｘ軸）および各群内の全ての試料の累積割合（ｙ軸）の軸標示および目盛りは、明確性のために省略した。 処置応答に基づく８週間でのタンパク質マーカーを示す。図１７Ａは、８週間の処置後の応答者対低応答者からの試料において測定された１０３０個のタンパク質全てのＫＳ距離プロットを示す。四角は、応答者（白四角）または低応答者（黒四角）におけるより高い上位１０個のタンパク質を示す。破線は、ボンフェローニ較正された３０％有意水準を示す。図１７Ｂは、８週間のＴＢ処置での応答者（Ｒ）対低応答者（Ｓ）における、最も差次的に発現したタンパク質の累積分布関数（ＣＤＦ）プロットを示す。ＲＦＵ（ｘ軸）および各群内の全ての試料の累積割合（ｙ軸）の軸標示および目盛りは、明確性のために省略した。 応答者（Ｒ）および低応答者（Ｓ）におけるベースラインシグナルに対する８週目のｌｏｇ２比のボックスプロットを示す。 ８週目において処置応答を「予測」するための分類手段として５つのマーカー（凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、可溶性ｇｐ１３０、ＴＩＭＰ−２およびＥＣＭ１）を使用した、単純ベイズモデルを示す。図１９Ａは、ＡＵＣ＝０．８８および９５％信頼区間（０．７５、０．９８）を示すＲＯＣ曲線を示す。図１９Ｂは、訓練サンプル分類を示す。黒四角は、真の陽性分類を表し、黒丸は、真の陰性分類を示し、白四角は、偽陽性結界であり、白丸は、偽陰性結果である。２つの試料は、薬物耐性（ｄｒ）ＴＢ株を有する対象からのものであった。 図２０Ａは、低応答者（８週目）からベースライン（全て）対応答者（８週目）から低応答者（８週目）のＫＳ距離のマトリックスプロットを示す。潜在的な処置応答マーカーは、右下領域に含まれる（大きな点）。図２０Ｂは、このＫＳ距離メトリクスにより特定された代表的な候補処置応答マーカーのＣＤＦプロットを示す。この図は、８週目応答者試料（Ｒ）が、８週目低応答者試料（Ｓ）および全てのベースライン試料（Ａ）とは明確に異なる軌跡をたどることを示している。 ８週目における処置応答を「予測」するためのモデルおよびアルゴリズムを示す。図２１Ａは、応答者を非応答者から分類するための、ベースライン測定および臨床的共変量の組み合わせに適用された、ランダム化ｌａｓｓｏ（脆弱性＝０．２５、Ｗ＝０．９）を使用したＬ１正規化ロジスティック回帰の安定性経路を示す。破線は、クラスランダム化観察から演算された異なる選択確率閾値における予期される偽陽性（ＦＰ）発見の数を示す。図２１Ｂは、応答者を非応答者から分類するための、８週間の測定および臨床的共変量のＬ１正規化ロジスティック回帰の安定性経路を示す。図２１Ｃは、ベースラインで測定された５つのマーカー（ＩＬ−１１ Ｒα、α２−抗プラスミン、ＰＳＭＥ１、ＳＡＡ、および対象年齢）を使用したロジスティック回帰モデルにより生成された（ｌｏｇ）オッズ比に基づく訓練サンプル分類を示す。黒四角は、真の陽性分類（応答者）を表し、黒丸は、真の陰性分類（低応答者）であり、白四角は、偽陽性結果であり、白丸は、偽陰性結果である。薬物耐性ＴＢを有する対象からの２つの試料がマークされている（ｄｒ）。図２１Ｄは、対応するＲＯＣ曲線およびこの訓練試料の分析におけるポイントワイズ９５％ＣＩを示し、ＡＵＣ＝０．９６およびブートストラップ９５％ＣＩ（０．８８、０．９９）を示す。 同上。 血清タンパク質レベルのＴＴＣＣとの関連を示す。図２２Ａは、ＴＴＣＣに対するベースラインタンパク質データ（ｌｏｇ１０ ＲＦＵ）の回帰を示す。 図２２Ｂは、ＴＴＣＣに対する８週目タンパク質データ（ｌｏｇ ＲＦＵ）の回帰を示す。 図２２Ｃは、ベースライン（上）および８週間（下）での応答者群の中央値に基づく、タンパク質の差次的発現を示す。 図２２Ｄは、ベースライン（左）および８週間（右）でのＴＴＣＣに対するＳＡＡデータ（ｌｏｇ１０ ＲＦＵ）の回帰を示す。
ここで、本発明の代表的実施形態を詳細に参照する。列挙された実施形態と併せて本発明を説明するが、本発明は、それらの実施形態に制限されることを意図しないことが理解される。逆に、本発明は、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替、修正、および均等物を網羅することが意図される。
当業者には、本明細書に記載のものと同様または同等の多くの方法および材料が認識され、それらは、本発明の実践において使用することができ、その範囲内に含まれる。本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。
別段に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様もしくは同等の任意の方法、デバイス、および材料を本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイスおよび材料をここで説明する。
本出願において引用される全ての出版物、公開特許文献、および特許出願は、本出願が関連する分野における技術（複数を含む）のレベルを示す。本明細書において引用される全ての出版物、公開特許文献、および特許出願は、それぞれ個々の出版物、公開特許文献、または特許文書が参照により組み込まれるものとして具体的および個々に示されたのと同等に、参照により本明細書に組み込まれる。
添付の特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別様に示されない限り複数形の言及を含み、「少なくとも１つ」および「１つ以上」と同義的に使用される。したがって、例えば、「アプタマー」の言及は、アプタマーの混合物を含み、「プローブ」の言及は、プローブの混合物を含む、等である。
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、数値が関連する項目の基本的機能が変化しないような、数値のわずかな変更または変動を表す。
本明細書において使用される場合、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語およびそれらの任意の変化形は、要素または一連の要素を備える、含む、または含有するプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、または組成物が、それらの要素を含むだけでなく、明示的に列挙されていない、またはそのようなプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、もしくは組成物に固有の他の要素をも含み得るように、非限定的な包含を網羅することを意図する。
本開示は、ＴＢの評価および処置、ならびに個人における処置に対する応答のための、バイオマーカー、方法、デバイス、試薬、システム、およびキットを含む。主題の発明の特定の意図される用途および臨床的応用は、１）ＴＢの存在または非存在の診断、２）ＴＢの処置、３）選択された未来の時点での、個人におけるＴＢの処置中、およびその転帰の予後診断、ならびに４）ＴＢが明らかに治癒された個人におけるＴＢの再発または再活性化の監視を含む。
一態様において、個人におけるＴＢの診断、診断後のＴＢの処置、ＴＢの処置の転帰の予後診断、ＴＢの再発または再活性化の監視、または他の臨床的適応への対応を含む、ＴＢを評価するための単独または様々な組み合わせとしての使用のための１つ以上のバイオマーカーが提供される。以下で詳細に説明されるように、例示的実施形態は、実施例１において概説されるように、およびＧｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（１２）：ｅ１５００４ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１５００４の方法に従って多重アプタマーベースアッセイを使用して特定された、表１、２、４、５、または８から１２に記載のバイオマーカーを含む。
表１、２、４、５、または８から１２は、ＴＢを診断された３９人の個人からの血清試料の分析から得られた所見を示す。訓練群は、予後ＴＢ診断試験が大きな利益を有し得る集団に適合するように設計された。（これらの症例および対照は、Ｕ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ’ｓ ＴＢ Ｔｒｉａｌｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＣＤＣ ＴＢＴＣ）Ｓｔｕｄｙ ２９に参加した、ウガンダのカンパラからの、肺ＴＢを有する３９人の患者からの血清試料から得られた）。潜在的バイオマーカーは、疾患試料をプールするのではなく、個々の試料において測定され、これにより、ベースラインおよび８週間の試験治療後の疾患の存在に関連した表現型における個人および群の変動のより良い理解（この場合ＴＢおよびその処置）が可能であった。各試料に対して約１０３０のタンパク質測定を行い、疾患集団から全３９の試料が全ての試料において個々に測定されたため、表１、２、４、５、または８から１２は、データの比較的大きなセットの分析から得られた。測定値は、本明細書における「バイオマーカーの分類およびＴＢ予後スコアの計算」の項で説明されている方法を使用して分析された。
説明されるＴＢバイオマーカーのいくつかは、ＴＢの診断、処置、予後診断、および／または再発もしくは再活性化の決定に単独で有用であるが、バイオマーカーの複数のサブセットのグループ化のための方法もまた、本明細書において説明されており、各グループ化またはサブセット選択は、本明細書において同義的に「バイオマーカーパネル」および「パネル」と呼ばれる、２つ以上のバイオマーカーのパネルとして有用である。したがって、本出願の様々な実施形態は、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、Ｎは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０等から選択される。
一実施形態において、バイオマーカーサブセットまたはパネルに有用なバイオマーカーの数は、バイオマーカー値の特定の組み合わせに対する感度および特異性値に基づく。「感度」および「特異性」という用語は、本明細書において、生体試料において検出された１つ以上のバイオマーカー値に基づいて、個人におけるＴＢ診断、ＴＢ予後診断および明らかな治癒後のＴＢ再発を正確に分類する能力に関して使用される。「感度」は、陽性ＴＢ診断、陽性ＴＢ予後診断（ＥＶＤ）、または明らかな治癒後の陽性ＴＢ再発、すなわち疾患の証拠（ＥＶＤ）を有する個人の正確な分類に関する、バイオマーカー（複数を含む）の性能を示す。「特異性」は、陰性ＴＢ診断、陰性ＴＢ予後診断（ＮＥＤ）、またはＴＢの見かけの治癒後の陰性ＴＢ再発を有する個人の正確な分類に関する、バイオマーカー（複数を含む）の性能を示す。例えば、対照試料およびＴＢ診断試料のセットを試験するために使用されたマーカーのパネルに対する８５％の特異性および９０％の感受性は、対照試料の８５％がパネルによりＮＥＤ試料として正確に分類されたこと、および陽性試料の９０％がパネルによりＥＶＤ試料として正確に分類されたことを示す。
本明細書において特定されるＴＢバイオマーカーは、ＴＢに関して個人を効果的に評価するために使用され得るバイオマーカーのサブセットまたはパネルの多くの選択数を表す。所望の数のそのようなバイオマーカーの選択は、選択されるバイオマーカーの特定の組み合わせに依存する。個人におけるＴＢの評価のためのバイオマーカーのパネルは、表２および８から１２に見られないバイオマーカーを含み得ること、ならびに表２および８から１２に見られない追加のバイオマーカーの包含は、表２および８から１２から選択される特定のサブセットまたはパネルにおけるバイオマーカーの数を低減し得ることに留意することが重要である。サブセットまたはパネルにおいて使用される表２および８から１２からのバイオマーカーの数はまた、所与のアッセイにおいて許容される感受性および特異性値を確立するために、追加の生物医学情報がバイオマーカー値と併せて使用された場合に低減され得る。
バイオマーカーのサブセットまたはパネルにおいて使用されるバイオマーカーの数に影響し得る別の因子は、ＴＢに関して評価されている個人からの生体試料を得るために使用される手順である。慎重に制御された試料調製環境においては、所望の感度および特異性値を満足させるために必要なバイオマーカーの数は、試料採取、処理および保存においてより多くの変動性があり得る状況よりも少ない。
一実施形態において、主題の発明は、対象となる個人（複数を含む）からの生体試料を得ることを含む。次いで、生体試料は、対象となる１つ以上（Ｎ個）のバイオマーカーの存在を検出するために、および前記Ｎ個のバイオマーカーのそれぞれに対するバイオマーカー値を決定するためにアッセイされる（典型的には、マーカーＲＦＵ（相対蛍光単位）として測定される）。バイオマーカーが検出され、バイオマーカー値が割り当てられたら、各マーカーは、本明細書において詳細に説明されるようにスコア化または分類される。次いで、マーカースコアが組み合わされて全評価スコアが生成され、これは、個人が疾患の証拠、すなわち現在のＴＢ診断、将来のＴＢ転帰の予後診断、または明らかな治癒後のＴＢの再発の明らかな証拠を有するかどうかを反映する。
「生体試料」、「試料」、および「試験試料」は、本明細書において、個人から得られた、または別様に生じた任意の物質、生体液、組織、または細胞を指すように同義的に使用される。これは、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、軟膜、血漿、および血清を含む）、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、息、尿、精液、唾液、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、胸膜液、腹腔液、滑液、関節吸引液、腹水、細胞、細胞抽出物、ならびに脳脊髄液を含む。これはまた、上記の全ての実験的に分離された画分を含む。例えば、血液試料は、血清に、または赤血球細胞または白血球細胞（白血球）等の特定の型の血液細胞を含有する画分に分けることができる。所望により、試料は、組織および液体試料の組み合わせ等の、個人からの試料の組み合わせであってもよい。「生体試料」という用語はまた、例えば糞便試料、組織試料、または組織生検等からの均質化された固体材料を含有する材料を含む。「生体試料」という用語はまた、組織培養または細胞培養から得られる材料を含む。生体試料を得るための任意の好適な方法を使用することができ、例示的な方法は、例えば、静脈切開術、尿採取、痰採取、スワブ（例えば口腔スワブ）、洗浄、および微細針吸引生検手順を含む。顕微解剖（例えばレーザキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）またはレーザマイクロダイセクション（ＬＭＤ））により、例えば痰、気管支肺胞洗浄液、肺液、リンパ節または他の関連組織等の試料もまた採取され得る。個人から得られた、または生じた「生体試料」は、個人から得られた後に任意の好適な様式で処理された任意のそのような試料を含む。
さらに、複数の個人から生体試料を採取し、それらをプールする、またはそれぞれの個人の生体試料の一定量をプールすることにより、生体試料が得られてもよいことが理解されるべきである。プールされた試料は、単一の個人からの試料として扱うことができ、ＴＢ評価がプールされた試料において疾患の証拠（ＥＶＤ）を示す場合、それぞれの個々の生体試料は、どの個人がＥＶＤを有するかを決定するために再試験され得る。
本明細書の目的において、「個人からの生体試料に帰属するデータ」という語句は、個人の生体試料からある形態のデータが得られた、またはそれを使用して生成されたことを意味するように意図される。データは、生成された後、例えば１つの測定系における単位から別の測定系における単位への変換により、ある程度再フォーマット、改訂、または数学的に改変されていてもよいが、データは、生体試料から得られた、またはそれを使用して生成されたと理解される。
「標的」、「標的分子」および「分析物」は、本明細書において、生体試料中に存在し得る任意の対象分子を指すように同義的に使用される。「対象分子」は、特定の分子の任意の僅かな差異、例えば、タンパク質の場合、例えばアミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識化成分との複合化等の任意の他の操作もしくは修飾における僅かな差異を含むが、これは、分子の同一性を大きく改変しない。「標的分子」、「標的」、または「分析物」は、１つのタイプまたは種の分子または複数分子構造のコピーのセットである。「標的分子」、「標的」、および「分析物」は、そのような分子のセットの２つ以上を指す。例示的な標的分子は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、メチル化核酸、抗原、抗体、アフィボディ（ａｆｆｙｂｏｄｉｅｓ）、抗体模倣体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝産物、遷移状態アナログ、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養物、成長因子、細胞、組織、および上記のいずれかの任意の断片または一部を含む。
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように同義的に使用される。ポリマーは、線形または分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、また非アミノ酸により中断されてもよい。この用語はまた、天然または介入により修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識化成分との複合化等の任意の他の操作もしくは修飾も包含する。また、例えば、アミノ酸（例えば非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体、および当該技術分野において知られた他の修飾を含有するポリペプチドも、この定義に含まれる。ポリペプチドは、一本鎖または会合した鎖であってもよい。また、プレタンパク質および無傷成熟タンパク質；成熟タンパク質から得られたペプチドまたはポリペプチド；タンパク質の断片；スプライス変異；タンパク質の組み換え形態；アミノ酸修飾、欠失、または置換を有するタンパク質変異体；消化物；および翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等も、この定義に含まれる。
本明細書において使用される場合、「マーカー」および「バイオマーカー」は、個人における正常もしくは異常なプロセス、または個人における疾患もしくは他の状態を示す、またはその兆候である標的分子を指すように同義的に使用される。より具体的には、「マーカー」または「バイオマーカー」は、正常または異常に関わらず、また異常である場合には、慢性または急性に関わらず、特定の生理学的状態またはプロセスの存在に関連した、解剖学的、生理学的、生化学的、または分子的パラメータである。バイオマーカーは、実験室アッセイおよび医用画像化を含む様々な方法により検出可能および測定可能である。バイオマーカーがタンパク質である場合、生体試料における対応するタンパク質バイオマーカーの量または存在もしくは非存在、あるいはバイオマーカーの発現を制御するバイオマーカーまたはタンパク質をコードする遺伝子のメチル化状態の代替的測定として、対応する遺伝子の発現を使用することもできる。
本明細書において使用される場合、「バイオマーカー値」、「値」、「バイオマーカーレベル」および「レベル」は、生体試料におけるバイオマーカーを検出するための任意の分析方法を使用して行われ、生体試料におけるバイオマーカーの、そのための、またはそれに対応する、存在、非存在、絶対量または濃度、相対量または濃度、力価、レベル、発現レベル、測定レベルの比等を示す測定を指すように同義的に使用される。「値」または「レベル」の正確な性質は、バイオマーカーを検出するために使用される特定の分析方法の具体的設計および成分に依存する。
バイオマーカーが個人における異常なプロセスまたは疾患もしくは他の状態を示す、またはその兆候である場合、そのバイオマーカーは、一般に、個人における正常なプロセスまたは疾患もしくは他の状態の非存在を示す、またはその兆候であるバイオマーカーの発現レベルまたは値と比較して、過剰発現または過小発現であると説明される。「上方調整」、「上方調整された」、「過剰発現」、「過剰発現した」、およびそれらの任意の変化形は、健常もしくは正常個人からの同様の生体試料において典型的に検出されるバイオマーカーの値もしくはレベル（または値もしくはレベルの範囲）より大きい、生体試料におけるバイオマーカーの値もしくはレベルを指すように同義的に使用される。これらの用語はまた、特定の疾患の異なる段階において検出され得るバイオマーカーの値もしくはレベル（または値もしくはレベルの範囲）より大きい、生体試料におけるバイオマーカーの値もしくはレベルを指す。
「下方調整」、「下方調整された」、「過小発現」、「過小発現した」、およびそれらの任意の変化形は、健常もしくは正常個人からの同様の生体試料において典型的に検出されるバイオマーカーの値もしくはレベル（または値もしくはレベルの範囲）より小さい、生体試料におけるバイオマーカーの値もしくはレベルを指すように同義的に使用される。これらの用語はまた、特定の疾患の異なる段階において検出され得るバイオマーカーの値もしくはレベル（または値もしくはレベルの範囲）より小さい、生体試料におけるバイオマーカーの値もしくはレベルを指す。
さらに、過剰発現または過小発現したバイオマーカーは、正常もしくは対照プロセスまたは個人における疾患もしくは他の状態の非存在を示す、またはその兆候であるバイオマーカーの「正常」または「対照」発現レベルまたは値と比較して、「差次的に発現した」、または「差次的レベル」もしくは「差次的値」を有すると呼ぶこともできる。したがって、バイオマーカーの「差次的発現」はまた、バイオマーカーの「正常」または「対照」発現レベルからの変動と呼ぶこともできる。
「差次的遺伝子発現」および「差次的発現」という用語は、正常または対照対象におけるその発現に比べ、特定の疾患に罹患した対象においてその発現がより高いまたはより低いレベルまで活性化された遺伝子（またはその対応するタンパク質発現産物）を指すように同義的に使用される。これらの用語はまた、同じ疾患の異なる段階においてその発現がより高いまたはより低いレベルまで活性化された遺伝子（または対応するタンパク質発現産物）を含む。また、差次的に発現した遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルにおいて活性化または阻害されてもよいこと、または、異なるポリペプチド産物をもたらすように選択的スプライシングに供されてもよいことが理解される。そのような差は、ｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌またはポリペプチドの他の分配を含む、様々な変化により証明され得る。差次的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物の間の発現の比較；２つ以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物の間の発現の比の比較；またはさらに、正常対象と疾患に罹患した対象との間、もしくは同じ疾患の様々な段階の間で異なる同じ遺伝子の２つの別々に処理された産物の比較を含んでもよい。差次的発現は、例えば、正常および疾患細胞の中で、または異なる疾患イベントもしくは疾患段階を経験した細胞の中での、遺伝子またはその発現産物中の時間的または細胞発現パターンにおける定量的および定性的差異の両方を含む。
本明細書において使用される場合、「個人」は、試験対象または患者を指す。個人は、哺乳動物または非哺乳動物であってもよい。様々な実施形態において、個人は、哺乳動物である。哺乳動物の個人は、ヒトまたはヒト以外であってもよい。様々な実施形態において、個人は、ヒトである。健常または正常な個人は、対象となる疾患または状態が従来の診断法により検出可能ではない個人である。
「診断する」、「診断すること」、「診断」およびそれらの変化形は、１つ以上の兆候、症状、データ、または個人に関連する他の情報に基づく、その個人の健康状況または状態の検出、決定、または認識を指す。個人の健康状況は、健常／正常（すなわち、疾患もしくは状態の非存在の診断）と診断されてもよく、あるいは、病気／異常（すなわち、疾患もしくは状態の存在の診断、またはその特徴の評価）と診断されてもよい。「診断する」、「診断すること」、「診断」等の用語は、特定の疾患または状態に関して、疾患の最初の検出；疾患の特性決定または分類；疾患の進行、回復、または再発もしくは再活性化の検出；および個人への処置または治療の適用後の疾患応答の検出を包含する。ＴＢの診断は、ＴＢを有する個人を、ＴＢを有さない個人から区別することを含む。
「予後診断する」、「予後診断すること」、「予後診断」、およびそれらの変化形は、疾患または状態を有する個人における疾患または状態の将来の経過の予測（例えば、患者の生存を予測する）を指し、そのような用語は、個人への処置または治療の適用に対する疾患応答の評価を包含する。「予後診断すること」およびその変化形はまた、将来の事前選択された時点での個人における疾患の証拠（ＥＶＤ）または疾患の証拠がないこと（ＮＥＤ）を予測することを意味し得る。予後診断の日付は、時点１（ＴＰ１）と呼ぶことができ、事前選択された将来の時点は、時点２（ＴＰ２）と呼ぶことができ、特定の未来の日付または日付範囲、例えば処置後経過観察を含み得る。
「評価する」、「評価すること」、「評価」およびその変化形は、「診断すること」、「処置すること」、「予後診断すること」、および処置された個人における再発を監視することを包含する。ＴＢを「評価すること」は、１）ＴＢを診断すること、すなわち、ＴＢの存在もしくは非存在を最初に検出すること；２）時点１（ＴＰ１）において、時点２（ＴＰ２）におけるＴＢ処置の未来の転帰、すなわち、ＴＰ２がＴＢ治療に従い得ることを予後診断すること；３）ＴＢの見かけの治癒後のＴＢ進行もしくは再発を検出または監視すること（すなわち、「ＴＢの見かけの治癒後の監視」は、彼もしくは彼女がＴＢの成功裏の処置を受けた後の時点での個人を試験することを意味する）および／または４）潜伏感染から活動性疾患への進行を検出することを含み得る。
「処置」は、本明細書において使用される場合、障害の発症の予防または病状の改変を意図して行われる介入を指す。したがって、「処置」は、治療的および予防または防止的措置の両方を指す。処置を必要とする者は、すでに障害を有する者、および障害が予防されるべき者を含む。ＴＢに対する標準的な処置は、現在、薬物感受性ＴＢの処置においては、イソニアジド、エタンブトールおよびピラジンアミドと組み合わせたリファンピン、または、薬物耐性ＴＢに対しては第２の抗生物質の標準レジメンを含む。
「治療」は、本明細書において使用される場合、障害の発症の予防または病状の改変を意図して行われる介入を指す。「治療」は、病気と闘う特定の薬剤により特定の疾患を標的化する様々な方法を指す。例えば、標的化ＴＢ治療は、結核菌の根絶を目的とした抗菌薬または免疫調節薬を含んでもよい。
本明細書において使用される場合、「追加の生物医学情報」は、ＴＢリスクに関連した、本明細書に記載のバイオマーカーのいずれかの使用以外での、個人の１つ以上の評価を指す。「追加の生物医学情報」は、疾患の兆候および症状、個人の身体的記述子；個人の身長および／または体重（ＢＭＩ）；体重の変化；個人の性別および民族性；関連した第２の診断（例えば、肺外または胸膜の関与）；追加の合併疾患情報（例えば、ＨＩＶ、マラリア、悪性腫瘍、肝障害、糖尿病等）；現在の処方および非処方薬の使用（例えばＴＢ処方計画および試料採取前に受けた処置の日数、他の薬物治療）；タバコ、アルコール、娯楽のための薬物の使用；任意の検査結果（関連した培養結果、すなわち試料中の細菌負荷、培養陽性までの時間、または利用可能な場合は陰性喀痰塗抹結果への培養変換までの時間；利用可能な場合はＣＸＲ空洞化範囲）；職業歴；家族歴；個人または家族におけるＴＢのより高いリスクに関連した遺伝子マーカー（複数を含む）の存在；他の臨床症状、例えば持続性の咳、熱、体重減少のいずれかを含む。追加の生物医学情報は、当該技術分野において知られた慣例的技術を使用して個人から、例えば、慣例的な患者アンケートもしくは既往歴アンケート等の使用により個人自身から、または医師等から得ることができる。代替として、追加の生物医学情報は、治験医師、データ収集用紙、面接等から得ることができる。
他の臨床検査を含む任意の追加の生物医学情報の評価と組み合わせたバイオマーカーレベルの試験は、例えば、バイオマーカー試験のみ、または追加の生物医学情報の任意の特定事項の評価のみと比較して、ＴＢの検出（または他のＴＢ関連の用途）の感受性、特異性、および／またはＡＵＣを改善し得る。
「曲線下面積」または「ＡＵＣ」という用語は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積を指し、これらは共に当該技術分野において周知である。ＡＵＣの測定は、完全データ範囲にわたる分類手段の正確性の比較に有用である。より高いＡＵＣを有する分類手段は、対象となる２つの群（例えば、ＴＢ試料および正常もしくは対照試料または異なる形態のＴＢ疾患を有する患者からのＴＢ試料（例えば、重度対軽度、肺対肺外疾患））の間の未知なるものを正確に分類する能力がより高い。ＲＯＣ曲線は、２つの集団（例えば、ＴＢを有する症例およびＴＢを有さない対照、または処置に失敗した、もしくはＴＢ処置に対する応答が遅い傾向のある者）を区別する上で、特定の特徴（例えば、本明細書に記載のバイオマーカーのいずれか、および／また処置に対する応答者対非応答者等の追加の生物医学情報の任意の項目）の性能をプロットするために有用である。典型的には、全集団（例えば、症例および対照）にわたる特徴データは、単一の特徴の値に基づいて昇順でソートされる。次いで、その特徴の各値において、そのデータの真陽性および偽陽性率が計算される。真陽性率は、その特徴に対する値を上回る症例の数を計数し、次いで全症例数で除することにより決定される。偽陽性率は、その特徴に対する値を上回る対照の数を計数し、次いで全対照数で除することにより決定される。この定義は、特徴が対照と比較して症例において高いシナリオを指すが、この定義はまた、特徴が対照と比較して症例においてより低いシナリオにも適用される（そのようなシナリオにおいては、その特徴に対する値を下回る試料が計数される）。ＲＯＣ曲線は、単一の特徴に対して、および他の単一の出力に対して生成されてもよく、例えば、２つ以上の特徴の組み合わせが数学的に結合されて（例えば、加算される、減算される、乗算される等）単一の合計値を生成し、この単一の合計値がＲＯＣ曲線にプロットされてもよい。さらに、複数の特徴の任意の組み合わせ（組み合わせは単一の出力値を導く）が、ＲＯＣ曲線にプロットされてもよい。これらの特徴の組み合わせは、試験を含んでもよい。ＲＯＣ曲線は、試験の偽陽性率（１特異性）に対する試験の真陽性率（感受性）のプロットである。
本明細書において使用される場合、バイオマーカー値に関して「検出する」または「決定する」ことは、バイオマーカー値に対応するシグナルを観察および記録するために必要な機器、ならびにそのシグナルを生成するために必要な材料（複数を含む）の両方の使用を含む。様々な実施形態において、バイオマーカー値は、蛍光、化学発光、表面プラズモン共鳴、表面音響波、質量分析、赤外分光法、ラマン分光法、原子間力顕微鏡、走査トンネル顕微鏡、電気化学検出法、核磁気共鳴、量子ドット等を含む任意の好適な方法を使用して検出される。本明細書において同義的に使用される「検出する」および「決定する」は、共に、生体試料におけるバイオマーカーの存在の特定もしくは観察、および／または、バイオマーカー値の測定を指す。
「固体担体」は、本明細書において、共有または非共有結合により分子が直接的または間接的に結合し得る表面を有する任意の基材を指す。「固体担体」は、様々な物理的形式を有してもよく、これは、例えば、膜；チップ（例えば、タンパク質チップ）；スライド（例えば、スライドガラスまたはカバースリップ）；カラム；中空、固体、半固体、細孔もしくは空隙含有粒子、例えばビーズ等；ゲル；光ファイバー材料を含む線維；マトリックス；および試料容器を含み得る。例示的な試料容器は、試料ウェル、管、毛細管、バイアル、および試料を保持することができる任意の他の器、溝または刻み目を含む。試料容器は、例えばマイクロタイタープレート、スライド、マイクロ流体デバイス等の複数試料プラットフォームに格納されてもよい。担体は、天然または合成材料、有機または無機材料で構成されてもよい。捕捉試薬が結合する固体担体の組成は、一般に、結合の方法（例えば、共有結合）に依存する。他の例示的な容器は、その中でアッセイおよび関連操作が行われ得る微液滴およびマイクロ流体制御またはバルク油／水型エマルジョンを含む。好適な固体担体は、例えば、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカ系材料、機能化ガラス、修飾ケイ素、炭素、金属、無機ガラス、膜、ナイロン、天然繊維（例えば、絹、毛および綿等）、ポリマー等を含む。固体担体を構成する材料は、例えば、捕捉試薬の結合に使用されるカルボキシ、アミノ、またはヒドロキシル基等の反応基を含み得る。ポリマー固体担体は、例えば、ポリスチレン、ポリエチレングリコールテトラフタレート、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）フッ化ビニリデン、ポリカーボネート、およびポリメチルペンテンを含み得る。使用され得る好適な固体担体粒子は、例えば、コードされた粒子、例えばＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）型コード化粒子、磁性粒子、およびガラス粒子を含む。
バイオマーカーの例示的使用
様々な例示的実施形態において、本明細書に記載の分析方法のいずれかを含む任意の数の分析方法により、血清もしくは血漿中等の個人の血液循環中に存在する、あるいは、尿中に分泌もしくは排出された、または痰中に存在する１つ以上のバイオマーカーに対応する１つ以上のバイオマーカー値を検出することにより、個人におけるＴＢを診断するための方法が提供される。これらのバイオマーカーは、例えば、ＴＢを有さない個人と比較して、ＴＢを有する個人において差次的に発現している。個人におけるバイオマーカーの差次的発現の検出は、例えば、ＴＢの早期診断を可能にするため、一度検出されたＴＢを処置するため、治療後の個人におけるＴＢの未来の転帰を予後診断するため、および／または治療後のＴＢ再発を監視して、潜伏感染から活動性疾患に移行し得る者を予測するため、または他の臨床的適応のために使用され得る。
本明細書に記載のバイオマーカーのいずれも、これらに限定されないが、ＴＢの検出（例えば高リスクまたは症状を有する個人または集団）；ＴＢの処置、ＴＢ予後診断の決定；ＴＢの進行の監視またはＴＢ再発の監視；処置選択の監視；治療薬剤または他の処置に対する応答の監視；バイオマーカー試験と上述の追加の生物医学情報の組み合わせ；および臨床経過観察に関する決断の容易化を含む、ＴＢの様々な臨床的適応において使用され得る。さらに、説明されたバイオマーカーはまた、ＴＢの適応が画像化モダリティもしくは他の臨床的相関により検出される前、または症状が現れる前に、これらの使用のいくつかを可能とする上で有用となり得る。
本明細書に記載のバイオマーカーのいずれかがＴＢの診断に使用され得る様式の例として、ＴＢを有することが知られていない個人における説明されたバイオマーカーの１つ以上の差次的発現は、個人がＴＢを有することを示すことができ、それにより、おそらくはＴＢが他の手段により検出される前、または症状が現れる前の、処置が最も効果的である疾患の早期段階において、ＴＢの検出を可能とすることができる。ＴＢの経過中のバイオマーカーの１つ以上の「正常」からの増加した差次的発現（いくつかのバイオマーカーは、疾患と共に下方調整され得るため）は、ＴＢの進行を示す（したがって不良な予後診断を示す）ことができ、一方、バイオマーカーの１つ以上が差次的に発現する程度の減少（すなわち、後のバイオマーカー試験において、個人における発現レベルが「正常な」発現レベルに向かう、または近付く）は、ＴＢ解消を示す（したがって、良好またはより良好な予後診断を示し、治療に対する陽性応答を示す）ことができる。同様に、ＴＢ治療の経過中のバイオマーカーの１つ以上が差次的に発現する程度の増加（すなわち、後のバイオマーカー試験において、個人における発現レベルが「正常な」発現レベルからさらに離れる）は、ＴＢが進行していること、または、薬物耐性ＴＢが存在し、したがって治療が非効果的であることを示し得る、もしくはＴＢ細菌が、患者が治療されている薬物の１つ以上に対して耐性であることの早期指標となることができ、一方、ＴＢ治療の経過中のバイオマーカーの１つ以上の差次的発現の減少は、治療に対するＴＢ応答を示すことができ、したがって治療が成功裏に作用していることを示すことができる。さらに、個人が見かけ上ＴＢを治癒された後のバイオマーカーの１つ以上の差次的発現の増加または減少は、ＴＢ再発を示し得る。このような状況において、例えば、個人は治療を再開することができる。さらに、個人におけるバイオマーカーの１つ以上の差次的発現レベルは、特定の治療薬剤に対する個人の反応を予測することができる。ＴＢ再発または進行の監視において、バイオマーカー発現レベルの変化は、例えば、ＴＢ感染状態もしくは負荷を決定する、または治療の変更の必要性を決定するため、または１つの試験計画の別の試験計画に対する優位性を臨床試験医師に知らせるために、反復的なバイオマーカーアッセイまたは画像化の反復の必要性を示すことができる。個人内でバイオマーカーの変化を縦方向に監視することにより、個人的ベースラインが確立され、改変された疾患状態の臨床的な発生の前に明らかとなり得る変化を検出するための高感度の方法が提供される。
本明細書に記載のバイオマーカーのいずれかの検出は、例えば、処置の成功を評価するため、または、処置後のＴＢ、再発、再活性化、および／もしくは進行を監視するために、ＴＢ処置後に、またはそれを併用して特に有用となり得る。ＴＢ処置は、例えば、個人への１つ以上の治療薬剤の投与、または当該技術分野において使用される任意の他の種類のＴＢ処置、ならびにこれらの処置の任意の組み合わせを含み得る。例えば、バイオマーカーのいずれも、処置後少なくとも１回検出され得る、または、処置後に（例えば定期的な間隔で）複数回検出され得る、または、処置前および処置後の両方に検出され得る。個人におけるバイオマーカーのいずれかの経時的な差次的発現レベルは、ＴＢの進行、再発または再活性化を示すことができ、その例は、処置前のバイオマーカーの発現レベルと比較した、処置後のバイオマーカーの発現レベルの増加または減少；処置後のより早い時点でのバイオマーカーの発現レベルと比較した、処置後のより遅い時点でのバイオマーカーの発現レベルの増加または減少；および、バイオマーカーの正常レベルと比較した、処置後の単一時点でのバイオマーカーの差次的発現レベルのいずれかを含む。
関連する症状、身体的兆候、微生物学的データまたは画像化データと併せてバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーに関する情報もまた、他の種類のデータ、特に、個人のＴＢのリスクを示すデータ（例えば、体液、ＴＢの原因物質の組織培養物、患者の病歴、疾患のＸ線写真上の重症度、症状、ＴＢの家族歴、遺伝子マーカー（複数を含む）の存在等のリスク因子、および／または他のバイオマーカーの状態、臨床症状等）と併せて評価され得る。これらの様々なデータは、自動化された方法、例えばコンピュータまたは他の装置／デバイスにおいて具現化され得るコンピュータプログラム／ソフトウェアにより評価され得る。
説明されたバイオマーカーはいずれも、画像化試験において使用されてもよい。例えば、説明されたバイオマーカーのいずれかと造影剤が結合されてもよく、これは、他の用途の中でも、ＴＢ診断を補助するため、処置後の転帰を予後診断するため、疾患の進行／回復を監視するため、疾患の再発、再活性化を監視するため、または治療に対する応答を監視するために使用することができる。
バイオマーカーおよびバイオマーカー値の検出および決定
本明細書に記載のバイオマーカーのバイオマーカー値は、様々な既知の分析方法のいずれかを使用して検出され得る。一実施形態において、バイオマーカー値は、捕捉試薬を使用して検出される。本明細書において使用される場合、「捕捉薬剤」または「捕捉試薬」は、バイオマーカーに特異的に結合することができる分子を指す。様々な実施形態において、捕捉試薬は、溶液中のバイオマーカーに暴露されてもよく、または、捕捉試薬が固体担体上に固定化されている間にバイオマーカーに暴露されてもよい。他の実施形態において、捕捉試薬は、固体担体上の第２の特徴と反応性である特徴を含有する。これらの実施形態において、捕捉試薬は、溶液中のバイオマーカーに暴露されてもよく、次いで、捕捉試薬上の特徴が固体担体上の第２の特徴と併せて使用されて、バイオマーカーを固体担体上に固定化してもよい。捕捉試薬は、行われる分析の種類に基づいて選択される。捕捉試薬は、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、他の抗体模倣物および他のタンパク質骨格、自己抗体、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ（ａｆｆｙｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディ、インプリントポリマー、アヴィマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、ペプチド模倣物、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、および合成受容体、ならびにそれらの修飾および断片を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、バイオマーカー値は、バイオマーカー／捕捉試薬複合体を使用して検出される。
他の実施形態において、バイオマーカー値は、バイオマーカー／捕捉試薬複合体から得られ、例えば、バイオマーカー／捕捉試薬相互作用に続く反応の結果として間接的に検出されるが、バイオマーカー／捕捉試薬複合体の形成に依存する。
いくつかの実施形態において、バイオマーカー値は、生体試料におけるバイオマーカーから直接検出される。
一実施形態において、バイオマーカーは、生体試料中の２つ以上のバイオマーカーの同時検出を可能とする多重形式を使用して検出される。多重形式の一実施形態において、捕捉試薬は、固体担体上の個別の場所で、直接的または間接的に、共有結合的または非共有結合的に固定化される。別の実施形態において、多重形式は、個別の固体担体を使用し、各固体担体は、例えば量子ドット等、その固体担体に関連した一意の捕捉試薬を有する。別の実施形態において、生体試料中の検出される複数のバイオマーカーのそれぞれ１つの検出のために、個々のデバイスが使用される。個々のデバイスは、生体試料中の各バイオマーカーを同時に処理させるように構成され得る。例えば、プレート内の各ウェルが、生体試料中の検出される複数のバイオマーカーの１つを一意に分析するように使用されるように、マイクロタイタープレートが使用され得る。
上記実施形態の１つ以上において、蛍光タグを使用して、バイオマーカー／捕捉複合体の成分を標識化し、バイオマーカー値の検出を可能にすることができる。様々な実施形態において、蛍光標識は、既知の技術を使用して、本明細書に記載のバイオマーカーのいずれかに特異的な捕捉試薬に複合化することができ、次いで、蛍光標識は、対応するバイオマーカー値を検出するために使用され得る。好適な蛍光標識は、希土類元素キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ−３、Ｑｄｏｔ ６０５、リサミン、フィコエリトリン、テキサスレッド、ならびにその他のそのような化合物を含む。
一実施形態において、蛍光標識は、蛍光染料分子である。いくつかの実施形態において、蛍光染料分子は、少なくとも１種の置換インドリウム環系を含み、インドリウム環の３−炭素上の置換基が、化学反応基または複合物質を含有する。いくつかの実施形態において、染料分子は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ分子、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７００を含む。他の実施形態において、染料分子は、第１の種類および第２の種類の染料分子、例えば２種の異なるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ分子等を含む。他の実施形態において、染料分子は、第１の種類および第２の種類の染料分子を含み、２種の染料分子は異なる発光スペクトルを有する。
蛍光は、広範なアッセイ形式に適合する様々な機器で測定され得る。例えば、蛍光光度計は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、印刷アレイ、キュベット等を分析するように設計されている（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ｂｙ Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．，（２００４）；Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＆ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ＆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｐｈｉｌｉｐ Ｅ．Ｓｔａｎｌｅｙ ａｎｄ Ｌａｒｒｙ Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｊａｎｕａｒｙ（２００２））。
上記実施形態の１つ以上において、バイオマーカー／捕捉複合体の成分を標識化し、バイオマーカー値の検出を可能とするために、化学発光タグが任意に使用されてもよい。好適な化学発光材料は、塩化オキサリル、Ｒｏｄａｍｉｎ ６Ｇ、Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３ ２＋、ＴＭＡＥ（テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン）、Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）、Ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ、ペルオキシオキサレート、アリールオキサレート、アクリジニウムエステル、ジオキセタン、およびその他のうちのいずれかを含む。
さらに他の実施形態において、検出方法は、バイオマーカー値に対応する検出可能なシグナルを生成する酵素／基質の組み合わせを含む。一般に、酵素は、分光光度法、蛍光、および化学発光を含む様々な技術を使用して測定され得る発色基質の化学的変質を触媒する。好適な酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等を含む。
さらに他の実施形態において、検出方法は、測定可能なシグナルを生成する蛍光、化学発光、放射性核種または酵素／基質の組み合わせであってもよい。多様なシグナル伝達は、バイオマーカーアッセイ形式において独特の有利な特性を有し得る。
より具体的には、本明細書に記載のバイオマーカーのバイオマーカー値は、以下で詳細に説明されるように、単一アプタマーアッセイ、多重アプタマーアッセイ、単一または多重免疫測定法、ｍＲＮＡ発現プロファイリング、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、質量分析、組織学的／細胞学的方法等を含む、既知の分析方法を使用して検出され得る。
アプタマーベースアッセイを使用したバイオマーカー値の決定
生体試料および他の試料中の生理学的に有意義な分子の検出および定量に関するアッセイは、科学的研究およびヘルスケア分野において重要なツールである。そのようなアッセイの１つのクラスは、固体担体上に固定化された１つ以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を含む。アプタマーは、それぞれ、極めて特異的に、および非常に高い親和性で標的分子に結合することができる。例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」と題する、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたく、また、例えば、それぞれ「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」と題する、米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、および米国特許第６，５０３，７１５号を参照されたい。マイクロアレイが試料と接触されると、アプタマーは、試料中のそのそれぞれの標的分子に結合し、それにより、バイオマーカーに対応するバイオマーカー値の決定を可能にする。
本明細書において使用される場合、「アプタマー」は、標的分子に対する特異的結合親和性を有する核酸を指す。親和性相互作用は、程度の問題であることが認識されているが、この文脈において、アプタマーのその標的に対する「特異的結合親和性」は、アプタマーが、一般に試験試料中の他の成分に結合するよりもはるかに高い程度の親和性でその標的に結合することを意味する。「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つのタイプまたは種のコピーのセットである。アプタマーは、任意の数の化学修飾されたヌクレオチドを含む任意の好適な数のヌクレオチドを含み得る。「アプタマー」は、そのような分子のセットの２つ以上を指す。異なるアプタマーは、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有し得る。アプタマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは化学修飾された核酸であってもよく、一本鎖、二本鎖であってもよく、または二本鎖領域を含有してもよく、より高次の構造を含んでもよい。アプタマーは、低オフ速度修飾アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ（商標）アプタマーであってもよい。（例えば、米国特許第７，９４７，４４７号、名称「Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」を参照されたい。）アプタマーはまた、フォトアプタマーであってもよく、光反応性または化学反応性官能基がアプタマー中に含まれ、その対応する標的に共有結合させる。本明細書において開示されるアプタマー法のいずれも、同じ標的分子に特異的に結合する２つ以上のアプタマーを含んでもよい。以下でさらに説明されるように、アプタマーは、タグを含み得る。アプタマーがタグを含む場合、アプタマーの全てのコピーが同じタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーがそれぞれタグを含む場合、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグを有してもよい。
アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスを含む任意の既知の方法を使用して特定され得る。一度特定されたら、アプタマーは、化学合成法および酵素合成法を含む任意の既知の方法に従って調製または合成され得る。
「ＳＥＬＥＸ」および「ＳＥＬＥＸプロセス」という用語は、本明細書において、一般に（１）望ましい様式で標的分子と相互作用する、例えば高い親和性でタンパク質に結合するアプタマーの選択と、（２）それらの選択された核酸の増幅との組み合わせを指すように、同義的に使用される。ＳＥＬＥＸプロセスは、特異的な標的またはバイオマーカーへの高い親和性を有するアプタマーを特定するために使用され得る。
ＳＥＬＥＸは、一般に、核酸の候補混合物を調製すること、候補混合物を所望の標的分子に結合させ、親和性複合体を形成すること、未結合候補核酸から親和性複合体を分離すること、親和性複合体から核酸を分離および単離すること、核酸を精製すること、ならびに特定のアプタマー配列を特定することを含む。このプロセスは、選択されたアプタマーの親和性をさらに精密化するために複数のラウンドを含んでもよい。プロセスは、プロセスの１つ以上の点で増幅ステップを含んでもよい。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、名称「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」を参照されたい。ＳＥＬＥＸプロセスは、その標的に共有結合するアプタマー、およびその標的に非共有結合的に結合するアプタマーの両方を生成するために使用され得る。例えば、米国特許第５，７０５，３３７号、名称「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ」を参照されたい。
ＳＥＬＥＸプロセスは、アプタマー上の改善された特性、例えば、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ安定性または改善された送達特性等を付与する修飾されたヌクレオチドを含有する高親和性アプタマーを特定するために使用され得る。そのような修飾の例は、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または基底位置における化学置換を含む。修飾されたヌクレオチドを含有するＳＥＬＥＸプロセスで特定されたアプタマーは、米国特許第５，６６０，９８５号、名称「Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載されており、これは、ピリミジンの５’−および２’−位置において化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを説明している。米国特許第５，５８０，７３７号（上記参照）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する極めて特異的なアプタマーを説明している。また、拡張された物理的および化学的特性を有する核酸ライブラリ、ならびにＳＥＬＥＸおよびｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸにおけるその使用を説明している、米国特許出願公開第２００９／００９８５４９号、名称「ＳＥＬＥＸ ａｎｄ ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」を参照されたい。
このアッセイの変形例は、アプタマーが共有結合する、またはその標的分子を「光架橋」することを可能にする光反応性官能基を含むアプタマーを使用する。例えば、米国特許第６，５４４，７７６号、名称「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」を参照されたい。これらの光反応性アプタマーは、フォトアプタマーとも呼ばれる。例えば、米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、および米国特許第６，２９１，１８４号、それぞれ名称「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ」を参照されたく；また、米国特許第６，４５８，５３９号、名称「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」も参照されたい。マイクロアレイが試料と接触され、フォトアプタマーがその標的分子に結合する機会を得た後、フォトアプタマーが光活性化され、任意の非特異的に結合した分子を除去するために固体担体が洗浄される。フォトアプタマー上の光活性化された官能基（複数を含む）により形成された共有結合のために、フォトアプタマーに結合した標的分子は一般に除去されないため、激しい洗浄条件が使用されてもよい。このようにして、アッセイは、試験試料中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値の検出を可能にする。
これらのアッセイ形式の両方において、アプタマーは、試料と接触される前に固体担体上に固定化される。しかしながら、ある特定の状況下で、試料との接触前のアプタマーの固定化は、最適なアッセイを提供しない可能性がある。例えば、アプタマーの事前固定化は、固体担体の表面上でのアプタマーと標的分子との非効率的な混合をもたらす可能性があり、恐らくは、長い反応時間、ひいてはその標的分子へのアプタマーの効率的な結合を可能とするためのインキュベーション期間の延長をもたらし得る。さらに、フォトアプタマーがアッセイにおいて使用される場合、および固体担体として使用される材料に依存して、固体担体は、フォトアプタマーとその標的分子との間の共有結合の形成を実現するために使用される光を散乱または吸収する傾向を有し得る。さらに、使用される方法に依存して、固体担体の表面もまた、使用される任意の標識化薬剤に暴露され、またそれにより影響され得るため、そのアプタマーに結合した標的分子の検出は、不正確性の影響を受ける可能性がある。最後に、固体担体上のアプタマーの固定化は、一般に、アプタマーの試料への暴露前のアプタマー調製ステップ（すなわち固定化）を含み、この調製ステップは、アプタマーの活性または官能性に影響し得る。
アプタマーに溶液中のその標的を捕捉させ、次いで検出前にアプタマー−標的混合物の特定の成分を除去するように設計された分離ステップを使用するアプタマーアッセイもまた、説明されている（米国特許第７，９４７，４４７号、名称「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｔｅｓｔ Ｓａｍｐｌｅｓ」を参照されたい）。説明されたアプタマーアッセイ法は、核酸（すなわちアプタマー）を検出および定量することにより、試験試料中の非核酸標的（例えばタンパク質標的）の検出および定量を可能にする。説明された方法は、非核酸標的の検出および定量のための核酸の代理（すなわちアプタマー）を形成し、したがってこれにより増幅を含む広範な核酸技術が、タンパク質標的を含むより幅広い範囲の所望の標的に適用され得る。
アプタマーは、アプタマーバイオマーカー複合体（またはフォトアプタマーバイオマーカー共有結合複合体）からのアッセイ成分の分離を促進するように、ならびに検出および／または定量のためにアプタマーの単離を可能とするように構築され得る。一実施形態において、これらのコンストラクトは、アプタマー配列内に切断可能または解放可能な要素を含み得る。他の実施形態において、追加の官能性、例えば、標識化もしくは検出可能な成分、スペーサ成分、または特異的結合タグもしくは固定化要素がアプタマーに導入されてもよい。例えば、アプタマーは、切断可能な部分、標識、標識を分離するスペーサ成分、および切断可能な部分を介してアプタマーに接続されたタグを含んでもよい。一実施形態において、切断可能な要素は、光切断可能なリンカーである。光切断可能なリンカーは、ビオチン部分およびスペーサセクションに結合してもよく、アミンの誘導体化のためのＮＨＳ基を含んでもよく、アプタマーにビオチン基を導入するために使用されてもよく、それにより、アッセイ方法の後の部分でアプタマーの解放を可能とし得る。
溶液中の全てのアッセイ成分と共に行われる均質アッセイは、シグナルの検出前に試料および試薬の分離を必要としない。これらの方法は、迅速で使用が容易である。これらの方法は、その特異的標的と反応する分子捕捉または結合試薬に基づいてシグナルを生成する。ＴＢの場合、分子捕捉試薬は、アプタマーまたは抗体等であり、特異的標的は、表２または８から１２のＴＢバイオマーカーである。
一実施形態において、シグナル生成のための方法は、フルオロフォア標識化捕捉試薬のその特異的バイオマーカー標的との相互作用による異方性シグナル変化を利用する。標識化捕捉因子がその標的と反応すると、増加した分子量が、複合体に結合したフルオロフォアの回転運動をもたらし、異方性値をはるかに遅く変化させるようになる。異方性変化を監視することにより、結合イベントを使用して、溶液中のバイオマーカーを定量的に測定することができる。他の方法は、蛍光偏光アッセイ、分子指標法、時間分解蛍光消光、化学発光、蛍光共鳴エネルギー移動等を含む。
生体試料中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出するために使用され得る例示的な溶液ベースアプタマーアッセイは、（ａ）第１のタグを含み、バイオマーカーに対する特異的親和性を有するアプタマーに生体試料を接触させることにより、混合物を調製することであって、アプタマー親和性複合体は、試料中にバイオマーカーが存在する場合に形成される、調製することと；（ｂ）第１の捕捉要素を含む第１の固体担体に、混合物を暴露し、第１のタグを第１の捕捉要素に関連させることと；（ｃ）第１の固体担体に関連していない混合物の任意の成分を除去することと；（ｄ）アプタマー親和性複合体のバイオマーカー成分に第２のタグを結合させることと；（ｅ）第１の固体担体からアプタマー親和性複合体を解放させることと；（ｆ）解放されたアプタマー親和性複合体を、第２の捕捉要素に関連した第２の固体担体に暴露し、第２のタグを第２の捕捉要素に関連させることと；（ｇ）アプタマー親和性複合体から非複合化アプタマーを分配することにより、混合物から任意の非複合化アプタマーを除去することと；（ｈ）固体担体からアプタマーを溶出することと；（ｉ）アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出することにより、バイオマーカーを検出することとを含む。
ＳＥＬＥＸはまた、所望のオフ速度特性を有するアプタマーを特定するために使用され得る。標的分子に結合し得るアプタマーを生成するための改善されたＳＥＬＥＸ法を説明している米国特許第７，９４７，４４７号、名称「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」を参照されたい。それぞれの標的分子からのより遅い解離速度を有するアプタマーおよびフォトアプタマー（本明細書においてＳＯＭＡｍｅｒ（商標）アプタマーとも呼ばれる）が説明されている。その方法は、候補混合物を標的分子と接触させることと、核酸−標的複合体の形成を生じさせることと、低オフ速度濃縮プロセスを行うこととを含み、速い解離速度を有する核酸標的複合体は、解離して再形成せず、一方遅い解離速度を有する複合体は、無傷のままとなる。さらに、方法は、改善されたオフ速度性能を有するアプタマーを生成するための、候補核酸混合物の生成における修飾されたヌクレオチドの使用を含む。
診断用途でのその使用に関して、低オフ速度アプタマーを含むアプタマーは、より低い分子量、より高い多重化能力（低い交差反応性、普遍的に適用可能なアッセイ条件）、化学安定性（熱、乾燥、および溶媒に対するもの、可逆的な再生）、試薬製造の容易性、一貫したロット間性能およびより低いコスト（完全合成）を含む、抗体に勝るいくつかの利点を有する。それらは、室温で、生理化学的条件の範囲にわたり安定である。
当該技術分野において知られた任意の手段を使用して、アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出することによりバイオマーカー値を検出することができる。いくつかの異なる検出方法、例えばハイブリダイゼーションアッセイ、質量分析、またはＱＰＣＲ等が、親和性複合体のアプタマー成分を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態において、核酸配列決定法を使用して、アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出し、それによりバイオマーカー値を検出することができる。簡潔に述べると、試験試料は、試験試料中に存在する１つ以上のアプタマーの配列（複数を含む）を特定および定量するために、任意の種類の核酸配列決定法に供することができる。
いくつかの実施形態において、配列は、アプタマー分子全体、または、分子を一意に特定するために使用され得る分子の任意の部分を含む。他の実施形態において、特定する配列決定は、アプタマーに付加される特定の配列であり、そのような配列は、しばじば「タグ」、「バーコード」、または「ジップコード」と呼ばれる。
いくつかの実施形態において、配列決定法は、アプタマー配列を増幅させるため、または、任意の位置への化学修飾を含有するＲＮＡおよびＤＮＡを含む任意の種類の核酸を、配列決定に適切な任意の他の種類の核酸に変換するための、酵素的ステップを含む。
いくつかの実施形態において、配列決定法は、１つ以上のクローニングステップを含む。他の実施形態において、配列決定法は、クローニングなしでの直接配列決定法を含む。
いくつかの実施形態において、配列決定法は、試験試料中の１つ以上のアプタマーを標的化する特異的プライマーを用いた方向性のあるアプローチを含む。他の実施形態において、配列決定法は、試験試料中の全てのアプタマーを標的化する強制的アプローチを含む。
いくつかの実施形態において、配列決定法は、配列決定のために標的化された分子を増幅する酵素的ステップを含む。他の実施形態において、配列決定法は、単一分子を直接配列決定する。
生体試料中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出するために使用され得る例示的な核酸配列決定ベースの方法は、（ａ）化学修飾されたヌクレオチドを含有するアプタマーの混合物を、酵素的ステップにより非修飾核酸に変換することと；（ｂ）得られた非修飾核酸を、例えば４５４ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＡＢＩ ＳＯＬｉＤ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはＰｏｌｏｎａｔｏｒ Ｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）等の大量並行配列決定プラットフォームを用いて強制配列決定することと；（ｃ）特異的配列および配列カウントにより混合物中に存在するアプタマーを特定および定量することとを含む。
免疫測定法を使用したバイオマーカー値の決定
免疫測定法は、抗体のその対応する標的または分析物との反応に基づき、特定のアッセイ形式に依存して試料中の分析物を検出することができる。免疫反応性に基づいてアッセイ方法の特異性および感度を改善するために、その特異的エピトープ認識という理由により、モノクローナル抗体がしばしば使用される。ポリクローナル抗体もまた、モノクローナル抗体と比較したその標的に対する増加した親和性により、様々な免疫測定法において成功裏に使用されている。免疫測定法は、広範な生体試料マトリックスとの使用のために設計されている。免疫測定形式は、定性的、半定量的、および定量的な結果を提供するように設計されている。
定量的結果は、検出される既知の濃度の特異的分析物により作成される標準曲線の使用により生成される。未知試料からの反応またはシグナルが標準曲線上にプロットされ、未知試料中の標的に対応する量または値が確立される。
数多くの免疫測定形式が設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物の検出に関して定量的となり得る。この方法は、分析物または抗体のいずれかに対する標識の結合に依存し、標識成分は、直接的または間接的に酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は、分析物の直接的、間接的、競合的、またはサンドイッチ検出用の形式にされ得る。他の方法は、例えば、放射性同位体（Ｉ１２５）または蛍光等の標識に依存する。追加的な技術は、例えば、凝集、ネフェロメトリー、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈降法、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ、およびその他（ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ｂｒｉａｎ Ｌａｗ編、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｔｄ発行、２００５年版を参照されたい）を含む。
例示的なアッセイ形式は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法、蛍光、化学発光、および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）免疫測定法を含む。バイオマーカーを検出するための手順の例は、サイズおよびペプチドレベル識別を可能とする、バイオマーカー免疫沈降法に続く定量法、例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面電気クロマトグラフィー等を含む。
検出可能な標識またはシグナル生成材料を検出および／または定量する方法は、標識の性質に依存する。適切な酵素により触媒される反応の生成物は（検出可能な標識が酵素である場合；上記参照）、限定されることなく、蛍光性、発光性もしくは放射性であってもよく、または、可視光または紫外光を吸収してもよい。そのような検出可能な標識を検出するために好適な検出器の例は、限定されることなく、ｘ線フィルム、放射能カウンタ、シンチレーションカウンタ、分光光度計、比色計、蛍光光度計、照度計、および密度計を含む。
検出のための方法のいずれも、任意の好適な調製、処理、および反応の分析を可能とする任意の形式で行うことができる。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルもしくは３８４ウェル）内であってもよく、または、任意の好適なアレイもしくはマイクロアレイを使用してもよい。各種薬剤の原液は、手作業で、またはロボット操作により作製されてもよく、その後の全てのピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料読出し、データ収集および分析は、市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、および検出可能な標識を検出することができる検出機器を使用して、ロボット操作により行うことができる。
遺伝子発現プロファイリングを使用したバイオマーカー値の決定
生体試料中のｍＲＮＡの測定を、生体試料中の対応するタンパク質のレベルの検出の代理手段として使用することができる。したがって、本明細書に記載のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルはまた、適切なＲＮＡを検出することにより検出され得る。
ｍＲＮＡ 発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲに続くｑＰＣＲ）により測定される。ＲＴ−ＰＣＲは、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを形成するために使用される。ｃＤＮＡは、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を生成するために、ｑＰＣＲアッセイにおいて使用される。標準曲線との比較により、ｑＰＣＲは、細胞当たりのｍＲＮＡのコピー数等の絶対測定を生成し得る。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、およびキャピラリー電気泳動と組み合わせたＲＴ−ＰＣＲは、全て、試料中のｍＲＮＡの発現レベルを測定するために使用されている。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｓｈｉｍｋｅｔｓ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照されたい。
ｍｉＲＮＡ分子は、非コードであるが遺伝子発現を制御し得る小ＲＮＡである。また、ｍＲＮＡ発現レベルの測定に好適な方法のいずれも、対応するｍｉＲＮＡに使用され得る。近年、多くの研究室が疾患のバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用を調査している。多くの疾患には、広範な転写調節が関与し、ｍｉＲＮＡのバイオマーカーとしての役割が見出され得ることは驚くべきことではない。ｍｉＲＮＡ濃度と疾患との間のつながりは、多くの場合、タンパク質レベルと疾患との間のつながりよりも不明瞭であるが、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの価値は実質的となり得る。当然ながら、疾患の間差次的に発現した任意のＲＮＡと同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断製品の開発が直面している問題としては、疾患細胞においてｍｉＲＮＡが存続し、分析のために容易に抽出されること、または、ｍｉＲＮＡが血液もしくは他のマトリックス中に放出され、測定されるために十分長期間存続しなければならないことの要件が含まれる。タンパク質バイオマーカーは、同様の要件を有するが、多くの潜在的タンパク質バイオマーカーは、疾患の間中、傍分泌形式で病変および機能の部位において意図的に分泌される。多くの潜在的タンパク質バイオマーカーは、その中でそれらのタンパク質が合成される細胞の外で機能するように設計される。
Ｉｎ Ｖｉｖｏ分子画像化技術を使用したバイオマーカーの検出
また、説明されたバイオマーカー（表１、２、４、５および８から１２を参照されたい）のいずれも、分子画像化試験において使用され得る。例えば、造影剤は、説明されたバイオマーカーのいずれかに結合することができ、これは、他の用途の中でも、ＴＢ診断、予後診断を補助するため、疾患の進行を監視するため、疾患の再発を監視するため、または、治療に対する応答を監視するために使用され得る。
Ｉｎ ｖｉｖｏ画像化技術は、個人の身体における特定の疾患の状態を決定するための非侵襲的方法を提供する。例えば、身体の部分の全体、またはさらに全身を、３次元画像として見ることができ、それにより、身体内の形態および構造に関連する貴重な情報を提供することができる。そのような技術は、本明細書に記載のバイオマーカーの検出と組み合わせて、ＴＢ状態に関する情報、特に個人のＴＢ状態を提供することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ分子画像化技術の使用は、技術における様々な進歩により拡大している。これらの進歩には、体内で強力なシグナルを提供し得る、新たな造影剤または標識、例えば放射線標識および／もしくは蛍光標識の開発；ならびに、有用な情報を提供するのに十分な感度および正確性をもって身体外からこれらのシグナルを検出および分析することができる、強力な新画像化技術の開発が含まれる。造影剤は、適切な画像化システムにおいて可視化され、それにより、造影剤が位置する身体の部分（複数を含む）の画像が提供され得る。造影剤は、例えばアプタマーもしくは抗体等の捕捉試薬、ならびに／あるいはペプチドもしくはタンパク質、またはオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子発現の検出用）、または１つ以上の巨大分子および／もしくは他の粒子形態を有するそれらのいずれかを含有する複合体と、結合または関連することができる。
造影剤はまた、画像化に有用な放射性原子を特徴とし得る。好適な放射性原子は、シンチグラフ検査用のテクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１２３を含む。他の容易に検出可能な部分は、例えば、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）用のスピン標識、例えば、再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄等を含む。そのような標識は、当該技術分野において周知であり、当業者により容易に選択され得る。
標準的画像化技術は、限定されないが、核磁気共鳴画像化、造影腹腔内または経膣超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）等を含む。診断ｉｎ ｖｉｖｏ画像化では、利用可能な検出機器の種類が、所与の放射性核種等の所与の造影剤、および標的（タンパク質、ｍＲＮＡ等）に使用される特定のバイオマーカーの選択における主要な要因である。選択される放射性核種は、典型的には、所与の種類の機器により検出可能な崩壊の種類を有する。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ診断のために放射性核種を選択する場合、その半減期は、標的組織による最大取り込みの時間において検出を可能とするのに十分長いが、宿主の有害な放射が最小限化となるのに十分短くなるべきである。
例示的な画像化技術は、これらに限定されないが、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴを含み、これらは、放射性核種が合成的または局所的に個人に投与される画像化技術である。放射性追跡子のその後の取り込みが経時的に測定され、標的化組織およびバイオマーカーに関する情報を得るために使用される。使用される特定の同位体の高エネルギー（ガンマ線）放出、ならびにそれらを検出するために使用される機器の感度および精巧さのため、身体の外からの放射能の２次元分布が推測され得る。
ＰＥＴにおいて一般的に使用されるポジトロン放出各種は、例えば、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、およびフッ素−１８を含む。電子捕捉および／またはガンマ放出により崩壊する同位体は、ＳＰＥＣＴにおいて使用され、例えば、ヨウ素−１２３およびテクネチウム−９９ｍを含む。テクネチウム−９９ｍでアミノ酸を標識化するための例示的方法は、不安定なテクネチウム−９９ｍ−前駆体複合体を形成するための、キレート前駆体の存在下での過テクネチウム酸塩の還元であり、次いでこの複合体は、二官能性修飾走化性ペプチドの金属結合基と反応し、テクネチウム−９９ｍ−走化性ペプチド複合体を形成する。
そのようなｉｎ ｖｉｖｏ画像化診断法には抗体がしばしば使用される。ｉｎ ｖｉｖｏ診断のための抗体の調製および使用は、当該技術分野において周知である。表２および８から１２中のバイオマーカーのいずれかに特異的に結合する標識化抗体は、個人の疾患状況を診断または評価することを目的として、使用される特定のバイオマーカーにより検出可能なある特定の種類の疾患（例えば、ＴＢ）を有することが疑われる個人に注射され得る。使用される標識は、前述のように、使用される画像診断法に従って選択される。器官または組織内の標識の量もまた、器官または組織内の疾患の存在または非存在の決定を可能にする。
同様に、アプタマーは、そのようなｉｎ ｖｉｖｏ画像診断法に使用され得る。例えば、表２および８から１２に記載の特定のバイオマーカーを特定するために使用された（したがってその特定のバイオマーカーに特異的に結合する）アプタマーは、個人のＴＢ状態を診断または評価することを目的として、適切に標識化され、特定のバイオマーカーにより検出可能なＴＢを有することが疑われる個人に注射され得る。使用される標識は、前述のように、使用される画像診断法に従って選択される。器官または組織内の標識の量もまた、器官または組織内のＴＢの存在または非存在の決定を可能にする。アプタマーを対象とした造影剤は、組織透過性、組織分布、動態学、排除、効力、および選択性に関連する、他の造影剤と比較して独特の有利な特性を有し得る。
そのような技術はまた、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた画像化による遺伝子発現の検出のため、標識化オリゴヌクレオチドを使用して任意に行われてもよい。これらの方法は、例えば、標識として蛍光分子または放射性核種を用いて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用される。遺伝子発現の検出のための他の方法は、例えば、レポーター遺伝子の活性の検出を含む。
別の一般的な種類の画像化技術は、光学的画像化であり、対象内の蛍光シグナルが、対象の外にある光学デバイスにより検出される。これらのシグナルは、実際の蛍光および／または生物発光によるものであってもよい。光学的検出デバイスの感度の改善は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイのための光学的画像化の有用性を増加させている。
臨床試験等において、例えば、新たな疾患治療のための臨床試験においてより迅速に臨床的有効性を測定するために、および／またはそれらの疾患、例えば多発性硬化症のためのプラセボによる長期的処置を回避するために（そのような長期的処置は倫理的に問題があると見なされ得る）、ｉｎ ｖｉｖｏ分子バイオマーカー画像化の使用が増加している。
他の技術の考察に関しては、Ｎ．Ｂｌｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，６，４６５−４６９，２００９を参照されたい。
組織学的または細胞学的方法を使用したバイオマーカー値の決定
ＴＢの評価のために、様々な組織および体液試料が、組織学的または細胞学的方法において使用され得る。試料選択は、疾患の場所および試料の入手可能性に依存する。例えば、痰採取、微細針吸引、カッティング針、コア生検、および切除、サンプリングまたは生検された感染体液または組織を、組織学試験に使用することができる。ＴＢ ＥＶＤを有する個人において上方調整されることが示された、本明細書において特定されるバイオマーカーのいずれも、疾患の指標として組織学的検体を染色するために使用され得る。
一実施形態において、対応するバイオマーカーに特異的な１種以上の捕捉試薬が、ＴＢ試料の細胞学的評価において使用され、痰もしくは他の体液または組織細胞試料を採取すること、細胞試料を固定すること、脱水すること、清浄化すること、顕微鏡スライド上に細胞試料を固定化すること、細胞試料を透過化すること、分析物回復のために処理すること、染色すること、脱染色すること、洗浄すること、ブロックすること、および緩衝液中で１種以上の捕捉試薬と反応させることのうちの１つ以上を含み得る。別の実施形態において、細胞試料は、細胞ブロックから生成される。
別の実施形態において、対応するバイオマーカーに特異的な１種以上の捕捉試薬が、ＴＢ組織試料の組織学的評価において使用され、組織検体を採取すること、組織試料を固定すること、脱水すること、清浄化すること、顕微鏡スライド上に組織試料を固定化すること、組織試料を透過化すること、分析物回復のために処理すること、染色すること、脱染色すること、洗浄すること、ブロックすること、水分補給すること、および緩衝液中で捕捉試薬と反応させることの１つ以上を含み得る。別の実施形態において、固定すること、および脱水することは、凍結することと置き換えられる。
別の実施形態において、対応するバイオマーカーに特異的な１つ以上のアプタマーを、組織学的または細胞学的試料と反応させ、核酸増幅法における核酸標的として機能させることができる。好適な核酸増幅法は、例えば、ＰＣＲ、ｑ−ベータレプリカーゼ、ローリングサークル増幅、鎖置換、ヘリカーゼ依存性増幅、ループ媒介性等温増幅、リガーゼ鎖反応、ならびに制限および環化補助ローリングサークル増幅を含む。
一実施形態において、組織学的または細胞学的評価における使用のための対応するバイオマーカーに特異的な１種以上の捕捉試薬が、遮断物質、競合物質、洗浄剤、安定剤、担体核酸、ポリアニオン物質等のいずれをも含み得る緩衝溶液中に混合される。
「細胞学プロトコル」は、一般に、試料採取、試料固定、試料固定化、および染色を含む。「細胞調製」は、調製された細胞の染色のための１つ以上の低オフ速度アプタマーの使用を含む、試料採取後のいくつかの処理ステップを含み得る。
試料採取は、処理されていない移送容器内に試料を直接入れること、ある種の媒体を含有する移送容器内に試料を入れること、またはいかなる処理もしくは固定も行わずに試料を直接スライド上に設置すること（固定化）を含み得る。
試料固定化は、採取された検体の一部をポリリシン、ゼラチン、またはシランで処理されたスライドガラスに塗布することにより改善され得る。スライドは、細胞の薄い均一な層をスライドに塗ることにより調製され得る。一般に、機械的変形および乾燥アーチファクトを最小限化するように注意される。細胞ブロック法においては、液体検体を処理することができる。代替として、室温で約１０分間、液体検体を１：１で固定液と混合することができる。
細胞ブロックは、残留浸出物、痰、尿沈渣、胃腸液、細胞剥離物、腹水、または微細針吸引から調製され得る。細胞は、遠心分離または膜濾過により濃縮または充填される。細胞ブロック調製のためのいくつかの方法が開発されている。代表的な手順は、固定沈渣、細菌寒天、または膜濾過法を含む。固定沈渣法においては、細胞沈渣を、Ｂｏｕｉｎｓ、ピクリン酸、または緩衝ホルマリン等の固定剤と混合し、次いで混合物を遠心分離して固定細胞をペレット化する。上澄みを除去し、可能な限り完全に細胞ペレットを乾燥させる。ペレットを回収し、レンズペーパーで包み、次いで組織カセット内に設置する。組織カセットを、追加の固定剤を有する瓶内に入れ、組織試料として処理する。寒天法は、非常に類似しているが、ペレットが除去され、ペーパータオル上で乾燥され、次いで半分に切断される。切断面をスライドガラス上の溶融寒天の滴に設置し、次いで、寒天内に気泡が形成しないようにしながら、ペレットを寒天で被覆する。寒天を硬化させ、次いで任意の過剰の寒天を切り取る。これを組織カセット内に設置し、組織プロセスが完了する。代替として、ペレットを６５℃の２％液体寒天中に直接懸濁させ、試料を遠心分離してもよい。寒天細胞ペレットを４℃で１時間固化させる。固体寒天を遠心管から除去し、半分にスライスすることができる。寒天を濾紙で包み、次いで組織カセットに入れる。この時点以降の処理は、上述の通りである。任意のこれらの手順において、遠心分離は、膜濾過と置き換えることができる。これらのプロセスのいずれも、「細胞ブロック試料」を生成するために使用され得る。
細胞ブロックは、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ樹脂、ＬＲ Ｗｈｉｔｅ、ＬＲ Ｇｏｌｄ、Ｕｎｉｃｒｙｌ、およびＭｏｎｏＳｔｅｐを含む特別な樹脂を使用して調製され得る。これらの樹脂は、低粘度を有し、低温で紫外（ＵＶ）光を用いて重合され得る。包埋プロセスは、脱水中の試料の漸進的冷却、樹脂への試料の移動、および、適切なＵＶ波長での最終的な低温度でのブロックの重合に依存する。
細胞ブロック切片は、細胞形態学的検査のためにヘマトキシリン−エオシンで染色することができ、一方、追加の切片が、特異的マーカーの検査に使用される。
プロセスが細胞学的であるかまたは組織学的であるかに関わらず、試料は、試料分解を防止するために追加的処理の前に固定され得る。このプロセスは、「固定」と呼ばれ、同義的に使用され得る広範な材料および手順を説明する。試料固定プロトコルおよび試薬は、検出される標的および分析される特定の細胞／組織型に基づいて実験的に最も良く選択される。試料固定は、エタノール、ポリエチレングリコール、メタノール、ホルマリンまたはイソプロパノール等の試薬に依存する。試料は、採取およびスライドへの付着後可能な限り速やかに固定されるべきである。しかしながら、選択される固定剤は、様々な分子標的に構造的変化を導入し、それらのその後の検出をより困難なものにする可能性がある。固定および固定化プロセス、ならびにそれらの順番は、細胞の外見を変化させる可能性があり、これらの変化は、細胞検査技師により予測および認識されなければならない。固定剤は、ある特定の細胞型の収縮をもたらし、細胞質を粒状または網状に見せる可能性がある。多くの固定剤は、細胞成分の架橋により機能する。これは、特定のエピトープを損傷または改質し、新たなエピトープを生成し、分子集合をもたらし、膜透過性を低減し得る。ホルマリン固定は、最も一般的な細胞学的および組織学的アプローチの１つである。ホルマリンは、隣接タンパク質の間、またはタンパク質内でメチル架橋を形成する。沈殿または凝集もまた固定に使用され、この種の固定においてはエタノールが頻繁に使用される。架橋および沈殿の組み合わせもまた、固定に使用され得る。強力な固定プロセスは、形態学的情報を保存するのに最善であり、一方より弱い固定プロセスは、分子の保存に最善である。しかしながら、悪性のヒト型結核菌は、バイオセーフティレベル３の微生物であることを考慮して、エアロゾル生成のリスクを有するいかなる処理も、実験室スタッフへの偶発的な暴露を防止するために、除染効率が確実とされるべきである。
代表的固定剤は、５０％の無水エタノール、２ｍＭのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１．８５％のホルムアルデヒドである。この製剤に関する変形例は、エタノール（５０％から９５％）、メタノール（２０％〜５０％）、およびホルマリン（ホルムアルデヒド）のみを含む。別の一般的な固定剤は、２％のＰＥＧ１５００、５０％のエタノール、および３％のメタノールである。スライドは、室温で約１０から１５分間固定剤に入れられ、次いで取り出されて乾燥される。スライドが固定されたら、ＰＢＳ等の緩衝溶液で濯ぐことができる。
細胞、細胞内、および組織の特徴または形態学的構造を差次的に強調および対比させる、または「染色」するために、広範な染料を使用することができる。核を青色または黒色に染色するために、ヘマトイリンが使用される。Ｏｒａｎｇｅ Ｇ−６およびＥｏｓｉｎ Ａｚｕｒｅは、共に細胞の細胞質を染色する。Ｏｒａｎｇｅ Ｇは、ケラチンおよびグリコーゲン含有細胞を黄色に染色する。Ｅｏｓｉｎ Ｙは、核小体、繊毛、赤血球、および表面の扁平上皮細胞を染色するために使用される。Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｙ染料は、空気乾燥スライドに使用され、多形性の向上および細胞質内物質からの細胞外物質の区別において有用である。
染色プロセスは、染料に対する細胞の透過性を増加させるための処理を含み得る。透過性を増加させるために、洗浄剤による細胞の処理を使用することができる。細胞および組織透過性を増加させるために、固定試料をさらに溶媒、サポニン、または非イオン性洗浄剤でさらに処理してもよい。また、酵素消化は、組織試料中の特定の標的の接近性を改善することができる。
染色後、試料は、アルコール濃度を増加させながらアルコールで連続的に濯ぐことにより脱水される。最終洗浄は、スライドに適用されるカバースリップの屈折率に近い屈折率を有する、キシレンまたはシトラステルペン等のキシレン代替物により行われる。この最終ステップは、清浄化と呼ばれる。試料が脱水および清浄化されたら、封入剤が適用される。封入剤は、ガラスに近い屈折率を有するように選択され、カバースリップをスライドに接着することができる。また、細胞試料の追加的な乾燥、収縮、または退色を阻害する。
使用される染料または処理とは無関係に、腎臓の細胞学的検体の最終的評価は、形態の目視検査およびマーカーの存在または非存在の決定を可能とするように、ある種の顕微鏡法により行われる。例示的な顕微鏡法は、明視野、位相差、蛍光、および微分干渉コントラストを含む。
検査後に試料に対し二次試験が必要である場合、カバースリップを取り外してスライドを脱染色してもよい。脱染色は、元々スライドの染色において使用された元の溶媒系を、染料の追加なしで、および元の染色手順と逆の手順で使用することを含む。脱染色はまた、スライドを酸アルコール中に細胞が無色となるまで含浸することにより完了され得る。無色となったら、スライドを水浴中で十分濯ぎ、第２の染色手順を適用する。
さらに、抗体または核酸プローブまたはアプタマー等の特定の分子試薬の使用により、細胞形態分析と併せて特定の分子差別化も可能となり得る。これは、診断細胞学の正確性を改善する。顕微解剖を使用して、さらなる評価のため、特に、異常染色体、遺伝子発現、または突然変異の遺伝子評価のために、細胞のサブセットを単離することができる。
組織学的評価のための組織試料の調製は、消毒、固定、脱水、浸潤、包埋、および切片化を含む。組織学において使用される固定試薬は、細胞学において使用されるものと非常に類似または同一であり、個々のタンパク質等の分子的特徴を犠牲にして、形態学的特徴を保存するという同じ問題を有する。組織試料が固定および脱水されないが、代わりに凍結され、次いで凍結中に切片化されれば、時間が節約され得る。これはより穏やかな処理手順であり、個々のマーカーをより多く保存することができる。しかしながら、凍結は、氷の結晶の導入に起因して細胞内の情報が失われるため、組織試料の長期保存には許容されない。また、凍結組織試料中の氷により、切片化プロセスは非常に薄いスライスを生成することができず、したがってある程度の微視的解像度および細胞内構造の画像化が失われる可能性がある。ホルマリン固定に加え、リン脂質（膜）を固定および染色するために、四酸化オスミウムが使用される。
組織または痰もしくは他の液体の脱水は、増加するアルコール濃度での連続的洗浄により達成される。清浄化は、アルコールおよび包埋材料と混和性の材料を使用し、５０：５０アルコール清浄化試薬で開始し、次いで１００％清浄化剤（キシレンまたはキシレン代替物）での段階的プロセスを含む。浸潤は、最初に５０：５０包埋剤：清浄化剤および１００％包埋剤で、液体形態の包埋剤（温かいろう、ニトロセルロース溶液）と共に組織をインキュベートすることを含む。包埋は、組織を型またはカセット内に設置し、ろう、寒天、またはゼラチン等の溶融した包埋剤を充填することにより完了する。包埋剤を硬化させる。次いで、硬化した組織試料は、染色およびその後の検査のために薄い切片にスライスされ得る。
染色前、組織切片を脱ろうし、水分補給する。切片を脱ろうするためにキシレンが使用され、キシレンの１回以上の交換が使用されてもよく、組織は、減少する濃度のアルコール中での連続的洗浄により水分補給される。脱ろうの前、組織切片をガラススライドに約８０℃で約２０分間熱固定化してもよい。
レーザキャプチャーマイクロダイセクションは、さらなる分析のために、細胞のサブセットの組織切片からの分離を可能にする。
細胞学の場合のように、微視的特徴の可視化を向上させるために、組織切片またはブロックまたはスライスは、様々な染料で染色することができる。膨大な種類の市販の染料を使用して、特定の特徴を向上または特定することができる。
分子試薬の細胞学的または組織学的試料との相互作用をさらに増加させるために、「分析物回復」のためのいくつかの技術が開発されている。第１のそのような技術は、固定試料の高温加熱を使用する。この方法はまた、加熱エピトープ回復法またはＨＩＥＲとも呼ばれる。蒸気加熱、マイクロ波照射、オートクレーブ処理、水浴、圧力処理またはそれらの加熱方法の組み合わせを含む、様々な加熱技術が使用されている。分析物回復溶液は、例えば、水、クエン酸塩、および緩衝生理食塩水を含む。分析物回復の鍵は、高温での時間であるが、より低い温度でより長期間もまた成功裏に使用されている。分析物回復の別の鍵は、加熱溶液のｐＨである。低ｐＨは、最善の免疫染色を提供することが判明しているが、陰性対照とし第２の組織切片の使用をしばしば必要とする背景も生じる。最も一貫した利益（背景の増加を伴わない増加した免疫染色）は、一般に、緩衝液組成に関わらず高いｐＨ溶液により得られる。特定の標的のための分析物回復プロセスは、プロセス最適化のための変数として熱、時間、ｐＨ、および緩衝液組成を使用して、標的に合わせ実験的に最適化される。マイクロ波分析物回復法の使用は、抗体試薬による異なる標的の連続染色を可能とする。しかしながら、染色ステップ間の抗体および酵素の複合体を達成するために必要な時間もまた、細胞膜分析物を劣化させることが示されている。マイクロ波加熱法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法もまた改善させている。
分析物回復プロセスを開始するために、まず切片を脱ろうし、水和させる。次いで、スライドを、皿または瓶内の１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０中に入れる。代表的な手順は、１１００Ｗマイクロ波を使用し、１００％出力で２分間マイクロ波照射し、続いてスライドが液体中にカバーされていることを確認した後、２０％出力で１８分間スライドをマイクロ波照射する。次いで、カバーのない容器内でスライドを冷却し、次いで蒸留水で濯ぐ。ＨＩＥＲは、免疫化学試薬への標的の反応性を改善するために、酵素消化と組み合わせて使用されてもよい。
１つのそのような酵素消化プロトコルは、プロテイナーゼＫを使用する。プロテイナーゼＫの２０μｇ／ｍｌ濃度は、５０ｍＭトリス塩基、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ８．０緩衝液中で調製される。そのプロセスは、まず、それぞれ５分間の２回交換によるキシレン中での脱ろうを含む。次いで、試料を、それぞれ３分間の２回交換により１００％エタノール中で水和させ、それぞれ１分間９５％および８０％エタノール中で水和させ、次いで蒸留水中で濯ぐ。切片をプロテイナーゼＫ希釈標準溶液で覆い、加湿チャンバ内で３７℃で１０〜２０分間インキュベートする（最適なインキュベーション時間は、組織型および固定の程度に依存して変動し得る）。切片を室温で１０分間冷却し、次いで、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ２０中で２×２分間濯ぐ。所望により、切片をブロックして、内因性化合物および酵素からの緩衝の可能性を排除することができる。次いで、切片を、１次抗体希釈緩衝液中、適切な希釈率で、室温で１時間または４℃で一晩、１次抗体と共にインキュベートする。次いで、切片をＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ２０で２×２分間濯ぐ。特定の用途において必要な場合は、追加のブロックを行うことができ、続いてＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ２０で３×２分追加的に濯ぎ、次いで最後に免疫染色プロトコルを完了することができる。
室温での１％ＳＤＳによる簡単な処理もまた、免疫組織化学的染色を改善することが示されている。スライドに載せた切片および浮遊切片に対し、分析物回復法が適用されている。別の処理の選択肢は、ｐＨ６．０のクエン酸および０．１ Ｎｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ４０を含有する瓶内にスライドを入れ、９５℃に加熱することである。次いで、スライドをＰＢＳ等の緩衝溶液で濯ぐ。
組織の免疫学的染色のために、血清または無脂肪乾燥乳等のタンパク質溶液中に切片を含浸させることにより、抗体の組織タンパク質との非特異的会合をブロックすることが有用となり得る。
反応をブロックすることは、単独で、または組み合わせて、内因性ビオチンのレベルの低減；内因性電荷効果の排除；内因性ヌクレアーゼの不活性化；およびペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ等の内因性酵素の不活性化のいずれかを行う必要性を含み得る。内因性ヌクレアーゼは、プロテイナーゼＫによる分解により、熱処理、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ等のキレート剤の使用、担体ＤＮＡまたはＲＮＡの導入、尿素、チオ尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸リチウム等、またはピロ炭酸ジエチル等のカオトロープによる処理により、不活性化され得る。アルカリホスファターゼは、室温で５分間の０．１ＮのＨＣｌによる処理、または１ｍＭのレバミゾールでの処理により不活性化され得る。ペルオキシダーゼ活性は、０．０３％過酸化水素による処理により排除され得る。内因性ビオチンは、アビジン（ストレプトアビジン、ニュートロアビジンで置き換えることができる）溶液中に、室温で少なくとも１５分間スライドまたは切片を含浸することによりブロックされ得る。次いで、スライドまたは切片は、少なくとも１０分間緩衝液中で洗浄される。これは、少なくとも３回反復することができる。次いで、スライドまたは切片は、ビオチン溶液中に１０分間含浸される。これは、毎回新鮮なビオチン溶液で少なくとも３回反復することができる。緩衝液洗浄手順が繰り返される。細胞もしくは組織構造、または対象標的（複数を含む）への損傷を防止するために、ブロッキングプロトコルは最小限化されるべきであるが、これらのプロトコルの１つ以上が、１つ以上の低オフ速度アプタマーとの反応の前にスライドまたは切片を「ブロック」するために組み合わされてもよい。Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ，Ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｓ，ａｕｔｈｏｒｅｄ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇ．Ｋｅｓｓｅｌ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８を参照されたい。
質量分析法を使用したバイオマーカー値の決定
質量分析計の様々な構成を使用して、バイオマーカー値を検出することができる。いくつかの種類の質量分析計が利用可能であり、または、様々な構成で形成することができる。一般に、質量分析計は、試料入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空システムおよび機器制御システム、ならびにデータシステムという主要な構成要素を有する。試料入口、イオン源、および質量分析器における差異は、一般に、機器の種類およびその能力を決定付ける。例えば、入口は、キャピラリカラム液体クロマトグラフィー源であってもよく、または、マトリックス支援レーザ脱離において使用されるような直接プローブまたはステージであってもよい。一般的なイオン源は、例えば、ナノスプレーおよびマイクロスプレーを含むエレクトロスプレー、またはマトリックス支援レーザ脱離である。一般的な質量分析器は、四重極マスフィルター、イオントラップ質量分析器、および飛行時間型質量分析器を含む。追加的な質量分析法は、当該技術分野において周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７ Ｒ−７１６Ｒ；Ｋｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい）。
タンパク質バイオマーカーおよびバイオマーカー値は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、２次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）、ウルトラフレックスＩＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦと呼ばれるタンデム型飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）Ｎ、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、定量質量分析、ならびにイオントラップ質量分析のいずれかにより検出および測定され得る。
試料調製戦略が、タンパク質バイオマーカーの質量分析特性決定およびバイオマーカー値の決定の前に試料を標識化および濃縮するために使用される。標識化方法は、相対的および絶対的定量化のための同重体タグ（ｉＴＲＡＱ）および細胞培養物中のアミノ酸での安定同位体標識化（ＳＩＬＡＣ）を含むが、これらに限定されない。質量分光分析前に候補バイオマーカータンパク質の試料を選択的に濃縮するために使用される捕捉試薬は、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ（ａｆｆｙｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替的な抗体骨格（例えば二特異性抗体等）、インプリントポリマー、アヴィマー（ａｖｉｍｅｒ）、ペプチド模倣物、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体および合成受容体、ならびにそれらの修飾物および断片を含むが、これらに限定されない。
近接ライゲーションアッセイを使用したバイオマーカー値の決定
近接ライゲーションアッセイを使用して、バイオマーカー値を決定することができる。簡潔に述べると、試験試料が、抗体の対またはアプタマーの対であってもよい親和性プローブの対と接触され、対の各メンバーはオリゴヌクレオチドで伸長されている。親和性プローブの対のための標的は、１つのタンパク質上の２つの異なる決定基または２つの異なるタンパク質のそれぞれの１つの決定基であってもよく、これは、ホモまたはヘテロ多量体として存在し得る。プローブが標的決定基に結合すると、オリゴヌクレオチド伸長部の遊離端は、十分密接に近接して互いにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチド伸長部のハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチド伸長部が十分近接して位置した際にそれらを互いに架橋するように作用する、一般的な連結オリゴヌクレオチドにより促進される。プローブのオリゴヌクレオチド伸長部がハイブリダイズされたら、伸長部の末端が酵素ＤＮＡライゲーションにより互いに連結される。
各オリゴヌクレオチド伸長部は、ＰＣＲ増幅のためのプライマーを含む。オリゴヌクレオチド伸長部が互いにライゲーションされたら、オリゴヌクレオチドは、連続ＤＮＡ配列を形成し、これは、ＰＣＲ増幅により、標的タンパク質の同一性および量に関する情報、ならびにタンパク質−タンパク質相互作用に関する情報を明らかにするが、標的決定基は２つの異なるタンパク質上にある。近接ライゲーションは、リアルタイムＰＣＲの使用により、リアルタイムのタンパク質濃度および相互作用情報の極めて感度の高い特異的なアッセイを提供することができる。対象決定基に結合しないプローブは、近接させられる対応するオリゴヌクレオチド伸長部を有さず、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅は進行することができず、シグナルは生成されない。
アプタマーベースアッセイ
ＳｏｍａＬｏｇｉｃプロテオミクス技術は、長い解離速度（＞３０分）、および標準ＲＮＡまたはＤＮＡアプタマーと比較したこれらの試薬の比類ない親和性をもたらす修飾ヌクレオチドの組み込みにより改善された結合特性を有するアプタマー（低オフ速度アプタマーとも呼ばれる）の使用を含み得る、アプタマーベースアッセイである。低オフ速度アプタマーは、典型的には、アミノ酸側鎖を模倣するようにその５−位において修飾されたピリミジン残基を含有し得る一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）から作製される。これらのアプタマーのその標的に対する親和性は、ヌクレオチド配列ではなく３次元形状およびこれらの側鎖修飾の結果である（
低オフ速度アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセス（上で詳細に説明される）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで選択される。現在まで、ヒトタンパク質に結合するように開発された１０００を超える低オフ速度アプタマーがある。診断用途でのその使用に関して、低オフ速度アプタマーを含むアプタマーは、より良好な性能（親和性、正確性）、より高い多重化能力（低い交差反応性、同一のアッセイ条件）、化学安定性（熱、乾燥、再生）、試薬製造の容易性および再現性、ならびにより低いコスト（完全合成）を含む、抗体に勝るいくつかの利点を有する。
本明細書に記載のアプタマーベースアッセイの現在のバージョンは、僅か８μＬの試料（血清、血漿、ＣＳＦ、血液、尿、痰、洗浄液、または組織溶解物）を使用して、定量的に約１，０３０のヒトタンパク質を同時に測定する。少ない試料体積は、アッセイの高い感度（アレイに対するハイブリダイゼーションおよび蛍光走査）を反映するが、実際の初めの試料体積は限定されず、より多量の試料（例えば、０．５ｍｌ血清）を使用することができる。アッセイは、病原体分析物および病原体自体の濃縮のための親和性カラムを含んでもよい。そのような濃縮手順は、非常に低い存在度のバイオマーカーを検出するために試料を濃縮する（例えば、０．５ｍｌから５０μＬ未満に）ための、ビーズ固定化標的特異的アプタマーにより成功裏に行われている。
このアッセイを使用して、現在血清が３つの異なる濃度（５％、０．３％、０．０１％）で試験されている。これらの血清希釈は、単に、それぞれ低、中、および高存在度タンパク質の正確な測定を得るためという実際的な目的で使用される。血清中の分析物の定量的決定のために、データ点は、アッセイの直線範囲内、および定量下限（ＬＬＯＱ）と定量上限（ＵＬＯＱ）との間に十分収まるべきである。血清の希釈は、最も豊富なタンパク質に対して望ましくなり得、アッセイの直線領域は、典型的には０．００３％から０．１％の間の血清であり、シグナルは、１％以上の血清濃度でプラトーに達する。
対照的に、低い存在量のタンパク質は、希釈度の低い血清において、より正確に測定され、検出がより容易である。アッセイは、現在、５％血清中の試験されるほぼ全ての低存在量ヒトタンパク質を測定するのに完璧に機能するが、そのような血清の２０倍希釈はそのアッセイには必要ない。実際、アッセイは、５０％血清中で良好に機能し、５％血清におけるシグナルと比較して数倍増加したシグナルをもたらす。より多い試料サイズおよびより希釈の少ない血清の使用は、共に、ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）（病原体由来）マーカーの場合そうであり得るように、極めて低い存在量のタンパク質の検出の感度をさらに改善する。
低オフ速度アプタマーは、１００ｆＭの平均感度を有し、アプタマーベースアッセイは、５対数を超えるダイナミックレンジ、ならびに血清および血漿試料の反復実行において繰り返し測定された個々のタンパク質に対して５％の中央変動係数（％ＣＶ）を有する。１０００を超える低オフ速度アプタマーの全てに対して、精製タンパク質を緩衝液に注入することにより得られた標準曲線において測定されたシグナル、およびＬＬＯＱとＵＬＯＱとの間の濃度範囲にわたる％ＣＶを示す正確なプロファイルを含む性能データが利用可能である。
アプタマーの感度は優れており、単一のアッセイにおいて１０００を超える分析物の多重化により悪影響を受けない。中央ＬＬＯＱは３００ｆＭであり、これは、小２０ｋＤａタンパク質に対して６ｐｇ／ｍＬである。各アプタマーの検出限界（ＬＯＤ）は、標的に対するその親和性（Ｋｄ）によく相関する。過去数年にわたり、アプタマーの親和性（Ｋｄ）は、数桁改善した。高ナノモル範囲内のＫｄを有する標準ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーと比較して、低オフ速度アプタマーは、ピコモル範囲内の典型的なＫｄを有する。そのような高親和性アプタマーは、アッセイにおいて低フェムトモルＬＯＤをもたらす。血液中のＭｔｂ病原体マーカーの濃度はおおむね未知であり；痰中の抗原８５レベルは、１００ｐｇ／ｍｌ範囲内であり、これは、３ｐＭであり、したがって十分アッセイの感度内である。さらに、試薬の親和性は、交互の５−位修飾ヌクレオチドをアプタマーに組み込むことによりさらに増加され得る。このアッセイの実用性は、腫瘍学、心臓血管、腎臓、神経および感染性疾患において実証されている（Ｏｓｔｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰｌｏＳ ｏｎｅ ５：ｅ１５００３）。
このアプタマーベースアッセイは、対象となる医学的状態に典型的な血清プロテオームシグニチャーを特定し、次いで検証するための強力なツールである。バイオマーカーのサブセットが特定されたら、対応する「スモールプレックス（ｓｍａｌｌ−ｐｌｅｘ）」アプタマーパネルを組み立てることができる（すなわち、いくつかの分析物からなるパネル）。アプタマーアッセイは、標準臨床検査室アッセイ（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ）を含む、スライドアレイへのハイブリダイゼーション以外の複数の形式およびプラットフォームに容易に適合されるが、ビーズ、プレート、または膜を用いた非常に単純なサンドイッチ型アッセイ、ならびに様々なシグナル増強および検出方法も使用され得る。後者の方法は、ポイントオブケア用途に十分好適である。想定されるアプタマーベースＴＢ試験は、染色、または、分子増幅アッセイに典型的に必要とされる高価な機器を必要としない。また、この試験は、試薬の冷蔵のための電気、または、検出デバイスへの電力供給の必要性からの独立の可能性を有する。診断試薬およびプロテオミクスプラットフォームのこれらの相対的な利点は、この世界的な健康問題に対する非常に好ましい影響を有し得る、単純、迅速、および安価なＴＢ試験の開発に向け有望である。
前述のアッセイは、ＴＢの評価または診断のための方法において有用なバイオマーカー値の検出を可能にし、方法は、個人からの生体試料において、表２および８から１２に記載のバイオマーカーからなる群から選択されるバイオマーカーにそれぞれ対応する少なくともＮ個のバイオマーカー値を検出することを含み、以下で詳細に説明されるように、バイオマーカー値を使用した分類は、個人がＴＢ ＥＶＤを有するかどうかを示す。説明されたＴＢバイオマーカーのいくつかは、ＴＢの検出、評価および診断に単独で有用であるが、それぞれ２つ、３つ、４つまたはそれ以上のバイオマーカーのパネルとして有用なＴＢバイオマーカーの複数のサブセットのグループ化のための方法もまた、本明細書において説明される。本明細書に記載の方法のいずれかによれば、バイオマーカー値が個々に検出および分類され得るか、または、例えば多重アッセイ形式の場合のように集合的に検出および分類され得る。
別の態様において、ＴＢの非存在を検出するための方法であって、個人からの生体試料において、表２および８から１２に記載のバイオマーカーからなる群から選択されるバイオマーカーにそれぞれ対応する少なくともＮ個のバイオマーカー値を検出することを含み、以下で詳細に説明されるように、バイオマーカー値の分類は、個人におけるＴＢの非存在を示す方法が提供される。本明細書に記載の方法のいずれかによれば、バイオマーカー値が個々に検出および分類され得るか、または、例えば多重アッセイ形式の場合のように集合的に検出および分類され得る。
バイオマーカーの分類およびＴＢ予後スコアの計算
所与の評価試験に対するバイオマーカー「シグニチャー」は、マーカーのセットを含有し、各マーカーは、対象の集団において異なるレベルを有する。これに関して、異なるレベルは、２つ以上の群における個人のマーカーレベルの異なる平均、または２つ以上の群における異なる変動性、またはその両方の組み合わせを指し得る。評価試験の最も単純な形式においては、これらのマーカーは、個人からの未知試料を、疾患または非疾患の２つの群の１つに割り当てるために使用され得る。２つ以上の群の１つへの試料の割り当ては、分類として知られ、この割り当てを達成するために使用される手順は、分類手段または分類法として知られる。分類法はまた、スコア化法と呼ぶこともできる。バイオマーカー値のセットから評価分類手段を構築するために使用され得る多くの分類方法がある。一般に、分類法は、教師あり学習技術を使用して最も容易に実行され、区別したい２つ（複数分類状態の場合はそれ以上）の異なる群内の個人から得られた試料を使用してデータセットが収集される。各試料が属するクラス（群または集団）は、各試料に対して予め知られているため、分類法は、所望の分類反応を示すように訓練され得る。また、教師なし学習技術を使用して、予後分類手段を生成することも可能である。
評価分類手段を開発するための一般的アプローチは、決定木；バギング＋ブースティング＋フォレスト；ルール推論に基づく学習；Ｐａｒｚｅｎ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）；線形モデル；記号論理学；ニューラルネットワーク法；教師なしクラスタリング；Ｋ平均法；階層的昇順／降順分類法；半教師あり学習；プロトタイプ法；最近隣法；カーネル密度推定；サポートベクターマシン；隠れマルコフモデル；ボルツマン学習法を含み、分類手段は、単純に、または特定の目的関数を最小限化する様式で組み合わされてもよい。考察については、例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｒ．Ｏ．Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照されたく、また、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ−Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９も参照されたいが、これらはそれぞれ、参照によりその全体が組み込まれる。
教師あり学習技術を使用して分類手段を生成するために、訓練データと呼ばれる試料のセットが得られる。予後試験に関して、訓練データは、未知の試料が後に割り当てられる異なる群（クラス）からの試料を含む。例えば、対照集団における個人および特定疾患集団にける個人から採取された試料は、訓練データを構成し、未知試料（または、より具体的には試料が得られる個人）を疾患を有する、または疾患を有さないものとして分類し得る分類手段を開発することができる。訓練データから分類手段の開発は、分類手段の訓練として知られる。分類手段訓練に関する特定の詳細は、教師あり学習技術の性質に依存する。例示を目的として、ランダムフォレスト分類手段の訓練の例を以下で説明する（例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｒ．Ｏ．Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照されたく、また、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ−Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９も参照されたい）。
典型的には、訓練セット内の試料よりもさらに多くの潜在的バイオマーカー値があるため、過剰適合を回避するように注意しなければならない。過剰適合は、統計モデルが根本的関係の代わりに確率的誤差またはノイズを説明する場合に生じる。過剰適合は、例えば、分類手段の開発において使用されるマーカーの数を制限することによる、マーカー反応が互いに独立していると仮定することによる、使用されている根本的統計モデルの複雑性を制限することによる、および根本的統計モデルがデータに適合するのを確実にすることによる等の様々な様式で回避され得る。
バイオマーカーのセットを使用した評価試験の開発の実例は、ランダムフォレスト分類手段の適用を含む（Ｓｈｉ ａｎｄ Ｈｏｒｖａｔｈ（２００６）Ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ．（Ｍａｒｃｈ ２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １５（１）：１１８−１３８）。ＲＦ予測因子は、個々の分類ツリー予測因子の集合である（Ｂｒｅｉｍａｎ（２００１）Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ４５（１）：５−３２）。各観察について、それぞれの個々のツリーが、１つのクラスに投票し、フォレストが、複数の票を有するクラスを予測する。ユーザは、各ノードでの最善の分割のために検索されるべきランダムに選択される変数の数を指定しなければならない。Ｇｉｎｉ指数（Ｂｒｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）は、分割基準として使用される。可能な最大のツリーが成長し、剪定されない。フォレスト内の各ツリーのルートノードは、訓練セットとしてのオリジナルデータからのブートストラップ試料を含有する。訓練セット内にない観察、オリジナルデータセットのおよそ１＝３は、アウトオブバッグ（ＯＯＢ）観察と呼ばれる。以下のようにＯＯＢ予測に到達し得る：オリジナルデータにおける場合では、対応するブーストラップ試料における場合を含有しないそれらのツリーのみを含む複数の投票により結果を予測する。これらのＯＯＢ予測を訓練セット結果と対比させることにより、ＯＯＢ誤差率と呼ばれる予測誤差率の推定に到達し得る。
各バイオマーカーは、各クラスにおける測定されたＲＦＵ値またはｌｏｇ ＲＦＵ（相対蛍光単位）値のクラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）により説明される。１つのクラス内のマーカーのセットに対する連結ｐｄｆは、各バイオマーカーの個々のクラス依存性ｐｄｆの積と仮定される。クラス依存性ｐｄｆの任意の根本的モデルを使用することができるが、モデルは、一般に訓練セット内に観察されるデータに適合すべきである。
ランダムフォレスト分類手段の性能は、分類手段を構築および訓練するために使用されるバイオマーカーの数および質に依存する。単一のバイオマーカーは、本明細書において例示されるそのＫＳ距離（コルモゴロフ−スミルノフ）およびそのＰＣＡ値に従い機能する。分類手段性能メトリクスが感度（真陽性の割合、ｆＴＰ）および特異性（１−偽陽性の割合、１−ｆＦＰ）の和として定義される場合、完璧な分類手段は、２のスコアを有し、ランダムな分類手段は、平均して、１のスコアを有する。ＫＳ距離の定義を使用すると、ｃｄｆ関数における差を最大化するその値ｘ＊は、

をｘに関して解くことにより見出すことができ、これにより

となり、すなわち、ＫＳ距離は、クラス依存性ｐｄｆが交差する点で生じる。このｘ＊の値をＫＳ距離の表現に代入すると、ＫＳの以下の定義が得られる。




Ｓ距離は、ｘ＊でのカットオフによる試験を使用した１−全誤差割合、本質的には単一分析物ベイジアン分類手段である。我々は、
のスコアを定義しているので、ＫＳ距離の上記の定義を組み合わせることにより、
となる。我々は、分類手段の構築に本質的に適した統計値を有するバイオマーカーを選択する。
良好なＫＳ距離（例えば＞０．３）を有するその後のマーカーの添加は、一般に、その後に添加されたマーカーが第１のマーカーと独立している場合、分類性能を改善する。分類手段スコアとして感度および特異性を使用して、多くの高スコア分類手段を生成することが分かりやすい。
関連バイオマーカーを特定するための別の手法は、主成分分析（ＰＣＡ）によるものである。ＰＣＡは、因子間の共分散分析を実行することによりデータの次元を低減する方法である。したがって、これは、タンパク質または遺伝子発現における大規模な実験等の複数次元のデータセットに好適である。ＰＣＡは、直交変換を使用して、関連している可能性のある変数の観察のセットを、主成分と呼ばれる関連していない変数の値のセットに変換する。これは、探索的データ分析における、および予測モデルのためのツールとして使用される。主成分分析（ＰＣＡ）の中心となる考えは、データセットに存在する可能な限り多くの変動性を維持しながら、大量の相関した変数からなるデータセットの次元を低減することである。これは、変数の新たなセット、すなわち主成分（ＰＣ）への変換により達成され、これらは相関しておらず、最初のいくつかが元の変数の全てに存在する変動のほとんどを維持するように順序付けられる（Ｊｏｌｉｆｆｅ ＩＴ．（２００２）Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。
分類手段性能を表現する別の手法は、受信者動作特性（ＲＯＣ）、または単にＲＯＣ曲線によるものである。ＲＯＣは、その弁別閾値が変動するため、二項分類手段系に対する感度、または真陽性率対偽陽性率（１−特異性もしくは１−真陰性率）の図式プロットである。ＲＯＣはまた、陽性のうちの真陽性の割合（ＴＰＲ＝真陽性率）対陰性のうちの偽陽性の割合（ＦＰＲ＝偽陽性率）をプロットすることにより、同等に表現することができる。これは、基準の変化に伴う２つの動作特性（ＴＰＲおよびＦＰＲ）の比較であるため、相対的動作特性曲線としても知られる。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）が、診断の正確性の集約尺度として一般的に使用される。これは、０．０から１．０の値をとることができる。ＡＵＣは、重要な統計学的特性を有し、すなわち、分類手段のＡＵＣは、分類手段が、ランダムに選択された陽性インスタンスをランダムに選択された陰性インスタンスより高く順位付けする確率に等しい（Ｆａｗｃｅｔｔ Ｔ（２００６）Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７：８６１−８７４）。これは、ウィルコクソン順位検定と同等である（Ｈａｎｌｅｙ ａｎｄ ＭｃＮｅｉｌ（１９８２）Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １４３：２９−３６）。
ここで使用されるアルゴリズムアプローチが、本明細書において例示される。簡潔に述べると、全ての単一分析物分類手段が、潜在的バイオマーカーの表から生成され、リストに追加される。続いて、格納された単一分析物分類手段のそれぞれへの第２の分析物の全ての可能な追加が次いで実行され、最善スコアの対の所定の数、例えば１０００が、新たなリスト上に保存される。全ての可能な３マーカー分類手段が、最善の２マーカー分類手段のこの新たなリストを使用して調査され、再びこれらの最善の１０００が保存される。このプロセスは、さらなるマーカーが追加された際にスコアが停滞する、または低下し始めるまで継続する。集束後に残るそれらの高スコア化分類手段は、使用目的における所望の性能に関して評価され得る。例えば、１つの予後診断用途において、高い感度および適度の特異性を有する分類手段は、適度の感度および高い特異性よりも望ましくなり得る。別の予後診断用途において、高い特異性および適度の感度を有する分類手段がより望ましくなり得る。所望のレベルの性能は、一般に、特定の予後診断用途においてそれぞれ容認され得る偽陽性および偽陰性の数の間でなされなければならないトレードオフに基づいて選択される。そのようなトレードオフは、一般に、偽陽性または偽陰性の誤差の医学的結果に基づく。
当該技術分野において様々な他の技術が知られており、ランダムフォレスト分類手段を使用してバイオマーカーのリストから多くの潜在的分類手段を生成するために使用され得る。一実施形態において、上で定義される適合性スコアを使用して異なるマーカーを組み合わせるために、遺伝的アルゴリズムとも呼ばれるものを使用することができる。遺伝的アルゴリズムは、潜在的分類手段の大規模で多様な集団の探索に特に良好に適合する。別の実施形態において、いわゆる蟻コロニー最適化を使用して、分類手段のセットを生成することができる。例えば、他の進化戦略、ならびに模擬アニーリングおよび他の確率的探索法を含む、当該技術分野において知られている他の戦略もまた使用することができる。メタヒューリスティクス法、例えばハーモニーサーチ等を使用することもできる。
表１、２、４、５、および８から１２に列挙されるマーカーは、多くの手法で組み合わされて、ＴＢを評価および診断するための分類手段を生成し得る。いくつかの実施形態において、バイオマーカーのパネルは、選択される特定の診断性能基準に基づいて異なる数の分析物を含む。例えば、バイオマーカーのある特定の組み合わせは、他の組み合わせよりも高感度の（またはより特異的な）試験をもたらす。
パネルが表２および８から１２からのバイオマーカーの特定のセットを含むように定義され、訓練データのセットから分類手段が構築されたら、診断試験の定義は完了である。生体試料は適切に希釈され、次いで、分類に使用される関連した定量的バイオマーカーレベルを生成するように１つ以上のアッセイにおいて使用される。測定されたバイオマーカーレベルは、分類、およびクラス割り当ての確実性を反映する試料の任意のスコアを出力する分類法に対する入力として使用される。
表８から１２は、ＴＢ処置効果の評価に有用な１２２のバイオマーカーを特定している。我々は、これらのマーカーの（ＴＢ特異的マーカーとの）任意の組み合わせを、ＴＢ疾患の推定診断シグニチャーとして考える。これは、バイオマーカー発見作業中に典型的に見出されるものと比較して、予測よりも驚異的に大きい数であり、説明された研究の規模に起因し得、これは、いくつかの場合においては低フェムトモル範囲内の濃度で、数百もの個人試料において測定された１，０３０を超えるタンパク質を包含した。推定上、多数の発見されたバイオマーカーは、ＴＢ生物学、ならびにＴＢの存在に対する身体の反応およびその後の処置または薬物に対する身体の反応の両方に関わる広範な生化学的経路を反映し、各経路およびプロセスには多くのタンパク質が関与する。結果は、タンパク質の小さい群の単一のタンパク質は、そのような複雑なプロセスに関して一意に情報を与えるものではなく、むしろ、関連したプロセス、例えば炎症、凝固カスケード、組織再構築、抗微生物タンパク質機能、アポトーシスまたは細胞外基質代謝回転および修復または線維症瘢痕および治癒等において、複数のタンパク質が関与することを示す。
説明された研究中に特定されるバイオマーカーの数を考慮すると、様々な診断法において使用され得る十分な数の高性能分類手段を得ることができることが予測される。表２および８から１２に示されるバイオマーカーの多くのサブセットが、互いに、またはＴＢ特異的マーカーと組み合わされて、有用な分類手段を生成し得ることが判明した。
分類手段評価試験の結果は、ある特定の考えられる結論を示唆する：まず、多数のバイオマーカーの特定は、同様に高い性能を提供する広範な数の分類手段への集合を可能とする。第２に、分類手段は、根本的疾患プロセスの複雑性に疑いなく浸透する冗長性を反映する様式で、特定のバイオマーカーが他のバイオマーカーに置換され得るように構築され得る。すなわち、表２および８から１２において特定される任意の個々のバイオマーカーにより寄与される疾患に関する情報は、表２および８から１２中の特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーの小さな群が任意の分類手段に含まれなくてもよい可能性があるように、他のバイオマーカーにより寄与される情報と重複する。
例示的な実施形態は、未知試料を分類するために、表２および８から１２中のデータから構築されるランダムフォレスト分類手段を使用する。一実施形態において、生体試料は、任意に希釈され、多重化アプタマーアッセイにおいて使用される。アッセイからのデータは正規化および較正され、得られたバイオマーカーレベルは、ランダムフォレスト分類スキームへの入力として使用される。
アプタマーベースプロテオームアッセイを行うための一般的方法が、実施例１に記載される。実施例２は、活性ＴＢに関連し、また４剤処置に応答して変化するタンパク質マーカーを特定および定量するために使用された、標的化プロテオームアッセイを説明している。実施例２を参照すると、効果的抗ＴＢ治療を伴う治癒プロセスが、線維症治癒プロセスと極めて関連しているようであり、ＴＢ治療により生じることが知られているＸ線写真の変化に一致することが分かる。特定された多様な経路のうち、最も優勢なのは、抗菌防御および組織再構築／治癒機能の中心的な生物学的テーマを表すものであった。
炎症および抗菌防御のバイオマーカー
抗菌機能の原因とされている自然および適応免疫に関与する差次的に発現したタンパク質が特定された。特定されたタンパク質のいくつは、これらに限定されないが、補体カスケード成分、ＣＲＰ、α−１抗トリプシン（ＡＡＴ）、ヘプシジン（ＬＥＡＰ）、殺菌性透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、リポ多糖類結合タンパク質（ＬＢＰ）、およびホスホリパーゼＡ２（ＮＰＳ−ＰＬＡ２）を含み、これらは全て大半の患者において経時的に減少した。Ｃ９およびＣ３分解産物（Ｃ３ｂおよびＣ３ｄ）は、大半の患者において治療により減少した。ＭＴＢ菌の成分は、鉄処理および抗菌特性の両方を有することが報告されている抗菌分子ヘプシジン（ＬＥＡＰ）を誘導することが知られている。８週目試料をベースライン試料から区別する上位マーカーとしてのＮＰＳ−ＰＬＡ２の所見は、このタンパク質の重要性を強調しており、これは、宿主において抗菌および脂肪分解機能の両方を有している。ＮＰＳ−ＰＬＡ２は、アラキドン酸および脂肪酸生成に関与する自然免疫抗菌分子であり、肺ＴＢに関して見られるリポイド肺炎に関与し得る。低酸素ＴＢ肉芽腫において見られる抗菌分子およびセリンプロテアーゼであるカテプシンＧは、大半の患者において治療後減少した。ＴＢに関与して自然免疫系を活性化することが知られている別のパターン認識分子であるマンノース受容体Ｃタイプ２（ＭＲＣ−２）は、ベースラインと８週目との間で差次的に発現した上位３つのマーカーの１つであった。
組織再構築のバイオマーカー
プロテアーゼおよび抗プロテアーゼ、線維形成プロセスタンパク質、コラーゲンおよび細胞外基質（ＥＣＭ）の再構築、ならびに凝集カスケードのメンバーを含む組織治癒に関与するいくつかのタンパク質もまた特定された。全ての分析物において見出されるマーカーである、プラスミノーゲンは、免疫反応を回避するためにＭＴＢおよび他の呼吸器病原体に取り込まれることが報告されている。活性化されたら、プラスミノーゲンは、フィブリンを分解して補体を活性化し得るセリンプロテアーゼであるプラスミンに変換される。プラスミンはまた、宿主の病変を改変し、結核菌をより容易に広めさせることができる、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびＴＧＦ−βを含む多くのタンパク質の活性を増加させることが報告されている。トロンボスポンジン−４（ＴＳＰ４）は、対および不対分析の両方において顕著に出現する。トロンボスポンジンは、細胞−細胞間および細胞−マトリックス間相互作用を媒介する細胞外基質糖タンパク質のファミリーである。それらは、肺接着、線維症、新血管形成および心臓組織再構築に関与することが報告されているが、現在まで、活性ＴＢとは関連していないと考えられている。線維芽細胞活性化タンパク質（ＳＥＰＲ）もまた、コラーゲンおよび細胞外基質分解に関与する。追加的なＭＭＰおよびその内因性阻害剤、メタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の組織阻害剤は共に、線維症および肉芽腫性炎症の適切な形成、組織再構築ならびに正常および病変状態における細胞外基質物質の代謝回転に関与する酵素のクラスである。これらのタンパク質の差次的発現は、薬物毒性、根本的な空洞性疾患、液状化の解消および線維症による完全な治癒に関連し得る。
血管形成および凝固のバイオマーカー
血管形成は、陽性および陰性シグナルの両方により制御される複雑な生物学的現象である。経時的に変化する上位マーカーのうちの３つの形態の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体の発見は、血管形成および血管再構築のための興味深い役割を支持し、最近では、他者によりＴＢに関連することが示されている。凝固カスケードのタンパク質メンバー（例えば抗トロンビンＩＩＩ）のレベルにおける顕著な変化が見出されており、ＴＢの経過におけるそのようなカスケードの重要性が強調されている。ＴＢにおいて凝固促進状態が存在し、他者により、血液学的／凝固因子がＴＢ感染のバイオマーカーとなり得ることが示されている。実際に、ヒトの肺組織病理学および実験的ＭＴＢ感染の慎重な研究により、損傷形成に寄与する血管炎および血管内微小血栓の領域が明らかとなっている。
疾患重症度に関連したバイオマーカー
疾患の重症度に関連したマーカーを考慮すると、いくつかのタンパク質を具体的にコメントする価値がある。様々な細胞−マトリックス間相互作用を制御するタンパク質であるトロンボスポンジン−２（ＴＳＰ−２）のレベルは、より空洞性の疾患の兆候を有する者においてより高いことが判明した。ＤＫＫ−１、血清アミロイドＰおよびアディポネクチンの３つの追加的なマーカーが、疾患重症度のロジスティック回帰分析において突出していた。ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤であるＤＫＫ−１はまた、線維症を改変することが示されており、発現は、クラミジア感染モデルにおいて上方調整される。血清アミロイドＰは、パターン認識および補体活性化に関与するタンパク質のペントラキシンファミリーのメンバー（ＣＲＰと同様）であり、レベルは、疾患重症度および熱傷治癒の迅速性と相関することが示されている。アディポネクチンは、代謝症候群およびインスリン耐性に関連し、減少した体脂肪と共に増加することが知られており、したがって、重度の疾患における低レベルの発見は、我々の患者における低ＢＭＩのみに起因している関連性と相反する。このアディポカインの受容体は、肺において示されており、低レベルのアディポネクチンが他の重篤な肺疾患（例えば喘息）の発達に関連しているため、アディポネクチンは、肺においても重要となり得る。特定されたいくつかの神経学的および他のマーカーは、薬物毒性に関連し得る。
実施例４を参照すると、「低応答者」（８週目までにまだ反応していない対象）、およびベースラインまたは８週間のＴＢ処置後の応答者の治療の間で差次的に存在したいくつかのタンパク質が特定されたことが分かる（表８）。「応答者」とは、本明細書において使用される場合、固体および液体培養培地上で、８週目に陰性痰培養結果を有する者を指し、「低応答者」とは、８週目において一方または両方の培地タイプにおいて陽性を有する者を指す。
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質は、実行された複数の分析における処置応答の強い予測因子であった。予想外ではないが、ｇｐ−１３０、ＴＮＦ経路分子、補体成分、カタラーゼ、ＩｇＧ、ＩＦＮ−λ、ＰＳＭＥ１、ＰＳＤ７を含む、自然および適応免疫に関与する多くのタンパク質が差次的に発現した。ベースラインにおいて、処置応答を予測する最も強力なマーカーは、免疫プロテアソームのＩＦＮ−γ−誘導性成分、ＰＳＭＥ１であった。このタンパク質のレベルは、強化された免疫反応の条件下で増加することが知られており、効率的な抗原処理に重要である。ＩＬ−１１ Ｒαは、ＩＬ−１１の受容体であり、高親和性ｇｐ１３０形質導入ドメインを使用するが、これはまたベースラインおよび８週目データの両方に出現し、共に急性期反応タンパク質である。ＡＰＲＩＬは、ＴＮＦファミリーリガンドであり、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与することができ、病原体に対する応答における役割を有することが示されている。ＴＧＦ−βおよびＴＮＦは両方とも、ＴＢにおける重要なサイトカインである。ＡＰＲＩＬはまた、Ｔ細胞増殖および生存の促進に関与することが示されている。ＭＭＰ−１２およびＭＭＰ−１３は、ベースラインにおいて差次的に発現した。ＭＭＰ−１２の主要な基質は、肺結合組織の主要タンパク質であるエラスチンであり、肺疾患において検出されている。マトリックスプロテオグリカン（ＢＧＮ）およびＢＧＨ３もまた、細胞外基質および組織再構築に関与し得る。応答者における高いＥＣＭ１の発見は興味深いが、関連性の強さは、年齢に関して調節すると幾分弱くなる（データは示さず）。アミロイド／フィブリル（ＢＧＨ３）に関与するタンパク質、および潜在的にＨＳＰ７０は、より注目に値し、ＴＢ損傷の構成に関連する可能性があり、治療により変化し得る。ＸＰＮＰＥＰ１は、神経ペプチドの分解に関与するメタロアミノペプチダーゼであり、これらの分析におけるＶＩＰの発見は、ＴＢの治療における神経ペプチドの役割に関して興味深い。８週間での最も強力なマーカーとしての凝固因子Ｖの発見は、応答者におけるより良好なタンパク質カロリー栄養素、またはその組織再構築、線維素溶解における変化、および肺ＴＢ損傷の解消が、これまで述べられていない凝固カスケードとのつながりを有することを示唆し得る。
我々は、８週間培養状態の予測のためのいくつかの数学モデルを構築した。一例は、ベースラインにおける血清タンパク質レベルの測定中に得られた４つの特徴を、対象年齢と併せて使用したロジスティック回帰モデルである。このモデルは、試料分類において極めて正確に機能し、ＡＵＣ＝０．９６のＲＯＣ曲線をもたらした（図２１を参照されたい）。ＫＳ距離に基づくベースラインでの上位５つの血清タンパク質マーカーを含有するモデルに対して、同様の性能が観察された（図２１を参照されたい）。別個に、我々はまた、大きなＫＳ距離（≧０．５）に基づく８週間での上位マーカーを選択し、単純ベイズ分類手段において５つの特徴のシグニチャー（凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ｇｐ１３０、ＴＩＭＰ−２およびＥＣＭ１）を組み合わせて処置応答を「予測」したが、これはＡＵＣ＝０．８８のＲＯＣ曲線を示した（図１９を参照されたい）。
血清タンパク質測定値の培養時間との相関は、以前の分析において見出されたマーカーのいくつかを裏付け、いくつかの他のタンパク質を好中球機能に関連付けた。
キット
表１、２、４、５、および８から１２のバイオマーカーの任意の組み合わせ（ならびに追加の生物医学情報）は、例えば本明細書において開示される方法の実践における使用のための好適なキットを使用して検出され得る。さらに、いかなるキットも、例えば蛍光部分等の本明細書に記載の１つ以上の検出可能な標識を含有することができる。
一実施形態において、キットは、（ａ）生体試料における１つ以上のバイオマーカーを検出するための１種以上の捕捉試薬（例えば、少なくとも１種のアプタマーまたは抗体）であって、バイオマーカーは、表１、２、４、５、および８から１２に記載のバイオマーカーのいずれかを含む捕捉試薬と、任意に（ｂ）ＴＢ状態の評価のために、生体試料が得られる者から個人を分類するための１つ以上のソフトウェアまたはコンピュータプログラム製品とを含む。代替として、１つ以上のコンピュータプログラム製品ではなく、人間により上記ステップを手作業で実行するための１つ以上の説明が提供されてもよい。
固体担体の対応する捕捉試薬およびシグナル生成材料との組み合わせは、本明細書において、「検出デバイス」または「キット」と呼ばれる。キットはまた、デバイスおよび試薬を使用する、試料を取り扱う、ならびにデータを分析するための説明を含んでもよい。さらに、キットは、生体試料を分析し、その分析の結果を報告するために、コンピュータシステムまたはソフトウェアと共に使用されてもよい。
キットはまた、生体試料を処理するための１種以上の試薬（例えば、可溶化緩衝液、洗浄剤、洗浄液、または緩衝液）を含有してもよい。また、本明細書に記載のキットはいずれも、例えば、緩衝液、遮断薬、質量分析マトリックス材料、抗体捕捉剤、陽性対照試料、陰性対照試料、ソフトウェアならびにプロトコル、指針および参照データ等の情報を含んでもよい。
一態様において、本発明は、ＴＢ状態の分析のためのキットを提供する。キットは、表１、２、４、５、および８から１２から選択される１つ以上のバイオマーカーのＰＣＲプライマーを含む。キットは、さらに、使用およびバイオマーカーのＴＢとの相関に関する説明を含んでもよい。キットはまた、単独または組み合わせとして、表１、２、４、５、および８から１２から選択されるバイオマーカーの１つ以上の補体を含有するＤＮＡアレイ、および試料ＤＮＡを増幅または単離するための酵素のいずれかを含んでもよい。キットは、リアルタイムＰＣＲ用の試薬、例えばＴａｑＭａｎプローブおよび／またはプライマー、ならびに酵素等を含んでもよい。
例えば、キットは、（ａ）試験試料中の１つ以上のバイオマーカーを定量するための少なくとも捕捉試薬を含む試薬であって、前記バイオマーカーは、表１、２、４、５、および８から１２に記載のバイオマーカー、または本明細書に記載の任意の他のバイオマーカーもしくはバイオマーカーパネルを含む試薬と；任意で、（ｂ）試験試料において定量された各バイオマーカーの量を、１つ以上の所定のカットオフと比較し、前記比較に基づいて定量された各バイオマーカーに対しスコアを割り当て、定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを組み合わせて全スコアを得、全スコアを所定のスコアと比較し、前記比較を使用して個人におけるＴＢ状態を評価するための、１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムとを備えてもよい。代替として、１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムではなく、人間により上記ステップを手作業で実行するための１つ以上の説明が提供されてもよい。
コンピュータ方法およびソフトウェア
バイオマーカーまたはバイオマーカーパネルが選択されたら、ＴＢ状態に関して個人を評価するための方法は、１）生体試料を採取または別様に得ることと；２）分析方法を実行して、生体試料におけるパネル内のバイオマーカー（複数を含む）を検出および測定することと；３）バイオマーカー値を収集するために使用される方法に必要な任意のデータ正規化または標準化を実行することと；４）マーカースコアを計算することと；５）マーカースコアを組み合わせて、全診断スコアを得ることと；６）個人の診断スコアを報告することとを含んでもよい。このアプローチにおいて、診断スコアは、疾患の存在または非存在の指標である所定の閾値と比較される、全てのマーカー計算の合計から決定される単一の数であってもよい。または、診断スコアは、それぞれバイオマーカー値を表す一連のバーであってもよく、応答のパターンは、疾患の存在または非存在の決定のための所定のパターンと比較され得る。
本明細書に記載の方法の少なくともいくつかの実施形態は、コンピュータの使用により実現され得る。コンピュータシステム１００の例を、図３に示す。図３を参照すると、システム１００は、バス１０８を介して電気的に結合されるハードウェア要素から構成されるように示されており、プロセッサ１０１、入力デバイス１０２、出力デバイス１０３、記憶デバイス１０４、コンピュータ可読記憶媒体リーダ１０５ａ、通信システム１０６、処理促進（例えば、ＤＳＰまたは特殊用途プロセッサ）１０７およびメモリ１０９を含む。コンピュータ可読記憶媒体リーダ１０５ａは、コンピュータ可読記憶媒体１０５ｂにさらに結合され、この組み合わせは、総合的に、一時的および／またはより永久的にコンピュータ可読情報を含有するための、遠隔、ローカル、固定および／または取り外し可能な記憶デバイスと記憶媒体、メモリ等を表し、これは、記憶デバイス１０４、メモリ１０９および／または任意の他のそのようなアクセス可能なシステム１００リソースを含み得る。システム１００はまた、オペレーティングシステム１９２および他のコード１９３、例えばプログラム、データ等を含む、ソフトウェア要素（現在作業メモリ１９１内に位置しているように示されている）を備える。
図３に関して、システム１００は、広範囲に及ぶ柔軟性および設定可能性を有する。したがって、例えば、単一のアーキテクチャを使用して、現在望ましいプロトコル、プロトコルの変形型、拡張等に従ってさらに構成され得る１つ以上のサーバを実装することができる。しかしながら、当業者には、実施形態が、より特定のアプリケーション要件に従って良好に使用され得ることが明らかである。例えば、１つ以上のシステム要素がシステム１００コンポーネント内（例えば、通信システム１０６内）の部分要素として実装され得る。カスタマイズされたハードウェアもまた使用され得、および／または特定の要素がハードウェア、ソフトウェアもしくはその両方において実装され得る。さらに、ネットワーク入力／出力デバイス（図示せず）等の他のコンピュータデバイスへの接続が使用されてもよいが、他のコンピュータデバイスへの有線、無線、モデム、および／または他の接続（複数を含む）もまた使用され得る。
一態様において、システムは、ＴＢのバイオマーカー特性の特徴を含有するデータベースを含み得る。バイオマーカーデータ（またはバイオマーカー情報）は、コンピュータ実装方法の一部としての使用のためのコンピュータへの入力として使用され得る。バイオマーカーデータは、本明細書に記載のデータを含み得る。
一態様において、システムは、１つ以上のプロセッサに入力データを提供するための１つ以上のデバイスをさらに備えてもよい。
システムは、さらに、順位付けされたデータ要素のデータセットを格納するためのメモリを備える。
別の態様において、入力データを提供するためのデバイスは、データ要素の特性を検出するための検出器、例えば質量分析計または遺伝子チップリーダ等を備える。
さらに、システムは、データベース管理システムを備えてもよい。ユーザのリクエストまたはクエリは、訓練セットのデータベースから関連情報を抽出するためにクエリを処理するデータベース管理システムにより理解される適切な言語でフォーマットされ得る。
システムは、ネットワークサーバおよび１つ以上のクライアントが接続されるネットワークに接続可能であってもよい。ネットワークは、当該技術分野において知られているように、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）または広域ネットワーク（ＷＡＮ）であってもよい。好ましくは、サーバは、コンピュータプログラム製品（例えば、ソフトウェア）を実行して、ユーザのリクエストを処理するためのデータベースデータにアクセスするために必要なハードウェアを含む。
システムは、データベース管理システムからの指示を実行するためのオペレーティングシステム（例えば、ＵＮＩＸ（登録商標）またはＬｉｎｕｘ（登録商標））を含み得る。一態様において、オペレーティングシステムは、インターネット等のグローバル通信ネットワーク上で動作し、そのようなネットワークに接続するためにグローバル通信ネットワークサーバを使用することができる。
システムは、当該技術分野において知られているグラフィカルユーザインターフェースにおいて慣例的に見られるように、ボタン、プルダウンメニュー、スクロールバー、テキスト入力欄等のインターフェース要素を備えるグラフィカル表示インターフェースを備える１つ以上のデバイスを含んでもよい。ユーザインターフェース上で入力されたリクエストは、システムデータベースの１つ以上の中の関連情報を検索するためのフォーマットのため、システム内のアプリケーションプログラムに伝送され得る。ユーザにより入力されたリクエストまたはクエリは、任意の好適なデータベース言語で構築され得る。
グラフィカルユーザインターフェースは、オペレーティングシステムの一部としてのグラフィカルユーザインターフェースコードにより生成されてもよく、データを入力するため、および／または入力されたデータを表示するために使用され得る。処理されたデータの結果は、インターフェース内に表示され、システムと通信しているプリンタ上にプリントされ、メモリデバイス内に保存され、および／もしくはネットワークを介して伝送され得るか、または、コンピュータ可読媒体の形態で提供され得る。
システムは、データ要素に関するデータをシステムに提供するための入力デバイスと通信し得る（例えば発現値）。一態様において、入力デバイスは、例えば、質量分析計、遺伝子チップまたはアレイリーダ等を含む遺伝子発現プロファイルシステムを含んでもよい。
様々な実施形態によるＴＢバイオマーカー情報を分析するための方法および装置は、任意の好適な様式で、例えば、コンピュータシステム上で動作するコンピュータプログラムを使用して実装され得る。プロセッサおよびランダムアクセスメモリを備える従来のコンピュータシステム、例えば遠隔アクセス可能なアプリケーションサーバ、ネットワークサーバ、パーソナルコンピュータまたはワークステーションが使用されてもよい。追加的なコンピュータシステム構成要素は、メモリデバイスまたは情報記憶システム、例えば大容量記憶システムならびにユーザインターフェース、例えば従来のモニタ、キーボードおよび追跡装置を含み得る。コンピュータシステムは、スタンドアロン型システム、またはサーバおよび１つ以上のデータベースを含むコンピュータネットワークの一部であってもよい。
ＴＢバイオマーカー分析システムは、データ収集、処理、分析、報告および／または診断等のデータ分析を完了するための機能および動作を提供し得る。例えば、一実施形態において、コンピュータシステムは、ＴＢバイオマーカーに関連した情報を受け取り、保存、検索、分析、および報告し得るコンピュータプログラムを実行することができる。コンピュータプログラムは、様々な機能または動作を実行する複数のモジュール、例えば未処理データを処理し補足データを生成するための処理モジュール、ならびに未処理データおよび補足データを分析してＴＢ状態および／または診断を生成するための分析モジュールを備えてもよい。ＴＢ状態の評価は、ＴＢに対する個人の状態に関する、追加の生物医学情報を含む任意の他の情報を生成または収集すること、さらなる試験が望ましくなり得るかどうかを特定すること、または、別様に個人の健康状態を評価することを含んでもよい。
ここで、図４を参照すると、開示される実施形態の原理に従いコンピュータを使用する方法の例を見ることができる。図４において、フローチャート３０００が示されている。ブロック３００４において、個人に対してバイオマーカー情報が取得され得る。バイオマーカー情報は、例えば個人の生体試料の試験が行われた後に、コンピュータデータベースから取得され得る。バイオマーカー情報は、表１、２、４、５、および８から１２に記載のバイオマーカーにおいて提供されるバイオマーカーからなる群から選択される、少なくともＮ個のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含んでもよい。ブロック３００８において、コンピュータは、バイオマーカー値のそれぞれを分類するために使用され得る。ブロック３０１２において、複数の分類に依存してＴＢ状態に関して評価が行われ得る。個人により視認可能なように、表示がディスプレイまたは他の指示デバイスに出力され得る。したがって、例えば、表示は、コンピュータのディスプレイ画面または他の出力デバイス上に表示され得る。
ここで、図５を参照すると、別の実施形態によるコンピュータの代替の使用方法が、フローチャート３２００により示され得る。ブロック３２０４において、コンピュータは、個人に対するバイオマーカー情報を取得するために使用され得る。バイオマーカー情報は、表１、２、４、５、および８から１２に記載のバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む。ブロック３２０８において、バイオマーカー値の分類は、コンピュータにより実行され得る。ブロック３２１２において、分類に依存して個人のＴＢ状態に関して表示がなされ得る。個人により視認可能なように、表示がディスプレイまたは他の指示デバイスに出力され得る。したがって、例えば、表示は、コンピュータのディスプレイ画面または他の出力デバイス上に表示され得る。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、コンピュータプログラム製品を含むように実現され得る。コンピュータプログラム製品は、アプリケーションプログラムをデータベースを有するコンピュータ上で実行させるための、媒体に具現化されたコンピュータ可読プログラムコードを有するコンピュータ可読媒体を含み得る。
本明細書において使用される場合、「コンピュータプログラム製品」という用語は、任意の性質の物理媒体上に含有され（例えば、記述された、電子的な、磁気的な、光学的な、または別様の）、コンピュータまたは他の自動化されたデータ処理システムと共に使用され得る、自然またはプログラミング言語の記述の形態の系統的な指示のセットを指す。そのようなプログラミング言語記述は、コンピュータまたはデータ処理システムにより実行された場合、コンピュータまたはデータ処理システムを、記述の特定の内容に従い機能させる。コンピュータプログラム製品は、限定されることなく、ソースおよびオブジェクトコード内のプログラム、ならびに／またはコンピュータ可読媒体に埋め込まれた試験もしくはデータライブラリを含む。さらに、コンピュータシステムまたはデータ処理機器デバイスが予め選択された様式で機能することを可能にするコンピュータプログラム製品が、これらに限定されないが、オリジナルソースコード、アセンブリコード、オブジェクトコード、機械言語、上記の暗号化または圧縮されたバージョン、およびありとあらゆる均等物を含むいくつかの形態で提供されてもよい。
一態様において、個人のＴＢ状態を評価するためのコンピュータプログラム製品が提供される。コンピュータプログラム製品は、コンピュータデバイスまたはシステムのプロセッサにより実行可能なプログラムコードを具現化するコンピュータ可読媒体を含み、プログラムコードは、個人からの生体試料に帰属するデータを取得するコードであって、データは、表１、２、４、５、および８から１２に記載のバイオマーカーの群から選択される生体試料中の少なくともＮ個のバイオマーカーの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含む、コードと、バイオマーカー値の関数として個人のＴＢ状態を示す分類方法を実行するコードとを含む。
さらに別の態様において、ＴＢ状態を評価するためのコンピュータプログラム製品が提供される。コンピュータプログラム製品は、コンピュータデバイスまたはシステムのプロセッサにより実行可能なプログラムコードを具現化するコンピュータ可読媒体を含み、プログラムコードは、個人からの生体試料に帰属するデータを取得するコードであって、データは、表１、２、４、５、および８から１２に記載のバイオマーカーの群から選択される生体試料中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む、コードと、バイオマーカー値の関数として個人のＴＢ疾患状態を示す分類方法を実行するコードとを含む。
様々な実施形態を方法または装置として説明したが、実施形態は、コンピュータと結合したコード、例えば、コンピュータ上に存在するコードまたはコンピュータによりアクセス可能なコードを介して実現され得ることが理解されたい。例えば、ソフトウェアおよびデータベースが、上述の方法の多くを実現するために使用され得る。したがって、ハードウェアにより達成される実施形態に加えて、これらの実施形態は、本説明において開示された機能を有効にすることをもたらす、具現化されたコンピュータ可読プログラムコードを有する、コンピュータにより使用可能な媒体を含む製造品の使用により達成され得る。したがって、実施形態はまた、そのプログラムコード手段においても同様に、本特許により保護されると見なされることが望まれる。さらに、実施形態は、限定されることなく、ＲＡＭ、ＲＯＭ、磁気媒体、光学媒体、または磁気光学媒体を含む、事実上任意の種類のコンピュータ可読メモリ内に保存されたコードとして具現化され得る。さらにより一般的には、実施形態は、これらに限定されないが、汎用プロセッサ、マイクロコード、ＰＬＡ、またはＡＳＩＣ上で動作するソフトウェアを含め、ソフトウェアとして、ハードウェアとして、またはそれらの任意の組み合わせとして実装されてもよい。
また、実施形態は、搬送波に具現化されたコンピュータシグナル、および伝送媒体を介して伝搬されるシグナル（例えば、電気および光学）として達成され得ることが想定される。したがって、上述の様々な種類の情報が、データ構造等の構造でフォーマットされ、伝送媒体を介して電気シグナルとして伝送されるか、またはコンピュータ可読媒体上に保存され得る。
実施例２を参照すると、ベースラインまたはＴＢ処置から８週間後の処置低応答者と応答者との間に差次的に存在したいくつかのタンパク質が特定されたことが分かる（表１、２、４、５、および８から１２）。炎症、免疫、凝固、組織再構築、液状化、線維素溶解および組織修復を中心としたある特定のテーマが現れている。予想外ではないが、抗菌機能の原因とされている自然および適応免疫に関与する多くのタンパク質が、差次的に発現する（これらに限定されないが、ｇｐ−１３０、ＴＮＦ経路分子、補体成分、カタラーゼ、ＩｇＧ、ＩＦＮ−λ、ＰＳＭＥ、ＰＳＤ７等を含む）。ベースラインにおいて、処置応答を予測する最も強力なマーカーは、免疫プロテアソームのＩＦＮ−γ−誘導性成分である、ＰＳＭＥである。このタンパク質のレベルは、強化された免疫反応の条件下で増加することが知られており、効率的な抗原処理に重要である（Ｋｏｈｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：４９２３−４９３５）。
また、本明細書において列挙された構造、材料、および行為の多くは、機能を実行するための手段または機能を実行するためのステップとして列挙され得る。したがって、そのような表現は、本明細書内に開示される全てのそのような構造、材料、または行為、および、参照により組み込まれる事項を含むそれらの均等物を網羅することが認められることを理解されたい。
実施例
以下の例は、例示のみを目的として示され、添付の特許請求の範囲により定義される本出願の範囲を限定することを意図しない。本明細書に記載の全ての実施例は、当業者には周知であり慣例的である標準的技術を使用して行われた。以下の実施例において説明される慣例的な分子生物学的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２００１）等の標準的実習マニュアルに記載のように実行することができる。
結果を生成するためのアレイおよび方法
本明細書において示される試験において使用されるＳｏｍａＬｏｇｉｃアプタマーベースプロテオミクス発見プラットフォームは、少ない試料体積からの血清、血漿、ＣＳＦ組織溶解物または血液を使用して同時に約１０３０のタンパク質を定量的に測定するが、これはアッセイの高感度を反映する（アレイへのハイブリダイゼーションおよび蛍光走査）（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１５００４）。全１０３０のタンパク質にわたり、中央定量下限は０．３ｐＭであり、５対数を超えるダイナミックレンジ、および５％の中央変動係数（％ＣＶ）を有する（Ｏｓｔｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７３：６４９−６６６）。
ＳｏｍａＬｏｇｉｃプロテオミクス発見プラットフォームは、多重プロテオミクスアッセイであり、これは、特定のタンパク質の量を、等価または比例する量のその同族アプタマーに変換することによりタンパク質を測定するが、この同族アプタマーがアッセイにおいて捕捉され、カスタムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイへのハイブリダイゼーションにより定量される（任意のＤＮＡチップが使用され得る）。低オフ速度アプタマー試薬およびＳｏｍａＬｏｇｉｃ多重プロテオミクスアッセイのプロセスおよび性能の完全な説明は、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１５００４に記載されている（図２を参照されたい）。
試験デザインおよびデータ分析
試験対象母集団
参加者は、リファンピン、イソニアジド、ピラジンアミドおよびエタンブトールを含む標準ＴＢ治療の有効性および安全性を、リファンピンを置換したリファペンチンと比較する、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＴＢＴＣ）Ｓｔｕｄｙ ２９、プロスペクティブ多施設非盲検フェーズ２Ｂ臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ００６９４６２９）から登録された（Ｄｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０６：１０３０−４０）。この予備計画に含まれた３９名の参加者は、全て、Ｋａｍｐａｌａ、ＵｇａｎｄａをベースとするＴＢＴＣサイトからのものであり、喀痰塗抹陽性およびＨＩＶ非感染であった。この試験に含まれる患者試料は、登録時に報告された有意な共存症を含まないように選択され（２００８年１２月から２００９年７月）、合理的に正常な腎臓、肝臓および血液機能を有した。３９名の試験参加者の年齢は、１９歳から５３歳までの範囲であり、２８名は男性であり、平均ボディマスインデックス（ＢＭＩ）は１９．３ｋｇ／ｍ２であり、２２名（５６％）は空洞性疾患を有し、そのうち３名は、両側性空洞を有していた。
参加者は、６ヶ月から２４ヶ月の抗ＴＢ処置を完了した。処置の終わりまでの経過観察は、いかなる処置の失敗も示さなかった。１名の参加者は、ＩＮＨおよびＲＩＦ耐性結核を有し；１名の参加者は、ＩＮＨへの単剤耐性を有し、１名は二剤耐性（ストレプトマイシンおよびリファンピンに対して）を有したが、全て参加者が集中期処置を完了した後に検出された。４名の参加者は、登録前に標準的化学治療である３〜５日の間の４剤処置を受けた。
ベースライン（登録時）、および８週間（４０投薬）の集中期治療後に、血清を収集し、処理し、保存した。計画の有効性を、Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ（ＬＪ）固体培地およびＭＧＩＴ ９６０システムを使用したＢＡＣＴＥＣ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ Ｔｕｂｅ（ＭＧＩＴ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）液体培地の両方に対する痰培養状態の決定により評価した。この分析において、両方の培地タイプに対する８週間の処置の完了時に培養陰性であった患者は、「応答者」として分類され、一方、培養培地のいずれか（または両方）において培養陽性を維持した患者は、「低応答者」と見なされた。ＴＢＴＣ Ｓｔｕｄｙ ２９のＩＲＢ承認は、全ての参加機関およびＣｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）から得られた。さらに、この予備計画はまた、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（Ｈ４５２７９−３４１０２−０２Ａ）により承認された。３９名の参加者のうち、２５名の患者がリファペンチン治療群にランダムに割り当てられ、１４名がリファンピン治療群に割り当てられた。４名の患者は、登録前に３〜５日の間の治療を受けた。設計上、この分析に選択された対象の半分が、ＬＪおよびＭＧＩＴ液体培地上での培養状態により定義されるように、８週間後（８週）の治療に反応した。ベースラインおよび集中期治療（８週）の終わりの血清試料の全３９対が、それぞれ、１０３０のタンパク質を測定するためのプロテオームアッセイに含まれた。臨床的、Ｘ線写真および微生物学的データは、全てのプロテオーム測定が完了し、結果がＣＤＣに送られた後まで受容されなかった。処置の全期間および処置の最後の治癒状態を含む追加の情報は、Ｋａｍｐａｌａ、ＵｇａｎｄａにおいてＧＭにより患者カルテから取得された。
プロテオーム法
アプタマーは、複数ラウンドの選択、分配、および増幅からなるＳＥＬＥＸプロセスによりｉｎ ｖｉｔｒｏ で選択された（Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：５−１３；Ｇｏｌｄ，Ｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０：１３５８１−１３５８４）。上で詳述したように、ＳＥＬＥＸの成功および得られたアプタマーの親和性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択のためのＤＮＡの化学を拡大するための修飾されたヌクレオチドの使用により大きく改善された（Ｖａｕｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３２：４１４１−４１５１）。現在まで、１０００を超えるヒト血清タンパク質に対する優れた親和性を有するアプタマー（サブナノモルＫｄ）が生成されており、本明細書に記載の極めて多重化されたアプタマーベースアッセイにおいて使用されている。血清は、それぞれ低、中、および高存在度タンパク質のダイナミックレンジ内の正確な測定値を得るために、３つの異なる濃度（５％、０．３％、０．０１％）で試験された。試験のために提供された血清試料の完全性は、既知の試料処理アーチファクトに関して監視された（Ｏｓｔｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７３：６４９−６６６）。アプタマーベースプロテオームアッセイは、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（（２０１０）ＰｌｏＳ ｏｎｅ ５：ｅ１５００４）に詳細に説明されている。簡潔に述べると、アッセイは、フルオロフォア標識化アプタマーおよび溶液中の血漿または血清中のタンパク質の平衡結合、ならびにその同族タンパク質と複合化したアプタマーのみを捕捉するための自動化された分配ステップからなる。本質的に、アッセイは、スライド当たり８つのマイクロアレイを有するハイブリダイゼーションガスケットスライドを使用したアンチセンスプローブアレイへのハイブリダイゼーション（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、タンパク質の測定値を、対応するアプタマー（ＤＮＡ）の測定値に変換する。アッセイ（タンパク質結合）の液体処理ステップは、Ｂｉｏｍｅｋロボットにより行われ、ハイブリダイゼーションステップにおいて生成された蛍光シグナルは、蛍光スライドスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して捕捉される。タンパク質濃度は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で報告される。
統計分析
統計演算のためのＭａｔｌａｂ（商標）およびＲ環境（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）が、統計分析に使用された。フィッシャーの正確確率検定を使用して、応答者および非応答者におけるＸ線写真における発見の割合を比較した。線形回帰分析を使用して、ｌｏｇ ＲＦＵで測定されたタンパク質レベルと培養変換時間との間の関連性を評価した。ノンパラメトリックコルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）試験を、急速および低応答者におけるタンパク質分布の非対比較に適用した。ＫＳ統計値は、符号のない量であるが、「符号付」の値は、差次的発現の方向性、すなわち、対象となる所与の比較における増加または減少したタンパク質レベルのそれぞれ正または負のＫＳ距離を伝えるために報告される。
ウィルコクソン順位和検定を使用して、それぞれ応答者および低応答者におけるベースラインと８週目との間の対（対象内）差次的反応を有するタンパク質を特定した。偽発見率（ＦＤＲ）方法（Ｓｔｏｒｅｙ（２００２）Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔ Ｓｏｃ，Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ ６４：４７９−４９８）を使用して、複数の比較補正を行った。各統計値において、ｐ値、およびＲパッケージｑ値で演算された関連したＦＤＲ補正「ｑ値」の両方（Ｄａｂｎｅｙ ｅｔ ａｌ．ｑｖａｌｕｅ：Ｑ−ｖａｌｕｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．２６．０ ２０１１：ｈｔｔｐ：／／ＣＲＡＮ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅ＝ｑｖａｌｕｅ）が報告される。ｑ値は、ｐ値に類似しており、偽陽性の確率ではなく偽陽性の予測される数に関して、特定の観察の統計的優位性を測定する。注釈、可視化および統合された発見（ＤＡＶＩＤ）分析を、機能的クラスタリングおよび注釈に使用した（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７：１−１３；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ４：４４−５７；Ｊｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８：１８０５−１８０６）。
正規化ロジスティック回帰モデルを使用して、応答者を低応答者から区別する変数を選択した。ランダム化ｌａｓｓｏを使用した安定性選択（Ｍｅｉｎｓｈａｕｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｈｌｍａｎｎ（２００６）Ｔｈｅ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ３４：１４３６−１４６２）を使用して、広範な正規化パラメータにわたる高い選択確率を有するタンパク質を特定した。選択確率は、ランダム化ｌａｓｓｏを使用した観察の５００のランダム分割から演算された。「応答者」および「低応答者」の１００のランダム置換を使用して、安定性選択のための偽発見率に対する下限を予測した。最終的なロジスティック回帰モデルは、最も高い選択確率を有するマーカーに再フィッティングされ（正規化なし）、処置応答により対象を分類する際の得られた感度および特性が、階層化交差検証を使用して推定された。
試料処理
ＳｏｍａＬｏｇｉｃ Ｉｎｃ．，（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）が全てのプロテオーム評価を行い、本試験のために血清を得た参加患者の臨床的特徴は知らされていなかった。親和性ベースプロテオーム技術は、時点毎、対象当たり、血清から１，０３０のタンパク質を成功裏に測定した。単回アッセイにおいて試料を分析し、時点、臨床的または微生物学的詳細の事前の知識なしで、内部アッセイ対照を使用してデータ検証を行った。ベースラインと８週目試料セットとの間の全体的タンパク質濃度における僅かな系統的差異（４％）は、正規化の間除去された。３つの試料は、共に他の対照と比較して、ヘモグロビンレベルを、それに対応して低ハプトグロビンレベルを上昇させ、内部アッセイ補正手段が、ある程度の溶血を示唆している。試料処理誤差の他の証拠（Ｏｓｔｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７３：６４９−６６６）は観察されず、したがって全ての試料は、その後のデータ分析への包含に適合すると見なされた。
活性ＴＢの非特異的マーカー
ベースラインのＴＢ患者における血清タンパク質濃度を、治療８週間後の同じ患者において測定された血清タンパク質濃度と比較した。急性期反応物質Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）が、１人を除く全ての対象において、ベースラインから８週目にかけて減少した（図６）。血清アルブミンが、１人を除く全ての対象において、ベースラインと８週目との間で増加した。ハプトグロビン、アルファ−１抗トリプシン（ＡＡＴ）および血清アミロイド Ａ タンパク質を含む、他の既知の重要な急性期反応物質は、疾患の負担の低減と一致して、ベースラインから８週目にかけて下降した。
疾患の重症度との相関
微生物学的およびＸ線写真パラメータを使用して、ＴＢ疾患の重症度を評価する。ベースラインにおいて、全空洞体積およびＭＧＩＴ培養における検出までの時間が、それぞれ疾患の重症度および痰中の細菌負荷のマーカーである。本試験に関与する患者に対して利用可能なデータのうち、ＣＸＲクラス（ベースラインＣＸＲ上の空洞化の存在およびサイズにより定義され、クラス１＝空洞化なし；クラス２＝空洞化が存在、＜４ｃｍのサイズ；クラス３＝空洞化が存在、＞４ｃｍのサイズ）が、ボディマスインデックス（ＢＭＩ、図７Ａ）およびＭＧＩＴ培養における検出までの時間（ＴＴＤ、図７Ｂ）等の他のパラメータとの最も強い関連性を示し、予測されたように、両方とも、空洞性疾患を有さない（ＣＸＲクラス１）１７名の患者と比較して、大型および／または両側性の空洞（ＣＸＲクラス３）を有する１３名の患者においてより低かったが、群間に大幅な重複があった。クラス１と比較してＣＸＲクラス３においてより低かったプラスミノーゲン（図７Ｃ）およびクラス１と比較してＣＸＲクラス３においてより高いトロンボスポンジン−２（ＴＳＰ−２）（図７Ｄ）は、ＣＸＲクラス１をクラス３患者から最も良く識別するが、これらの効果は、１８％偽発見率を有していた。
ベースラインでより重度の疾患（スコア＞０．６０）を有する１３名の患者、およびより重症度の低い疾患（スコア＜０．４０）を有する１３名の患者を区別する上位マーカーは、ＣＲＰ、ＳＡＡ、およびＮＰＳ−ＰＬＡ２であり、中央値の約２倍増加したレベルを有した。
回帰分析を使用して、測定された増加する疾患重症度と共に変化したタンパク質を特定した。線形モデルにおける反応としてベースライン（ｌｏｇ）ＲＦＵを、および５％偽発見率を使用して、ヘパリン補因子２、血小板因子−４（ＰＦ−４）、Ｇ−タンパク質結合受容体関連選別タンパク質−２（ＧＡＳＰ−２）、およびα２−抗プラスミンが、我々の疾患重症度スコアと相関するベースライン濃度を有していた（図８Ａ−Ｄ）。低レベルのヘパリン補因子２およびＧＡＳＰ２が、共に、より重度の疾患と関連していた。興味深いことに、８週間でのα２−抗プラスミンレベルもまた、重症度スコアの増加と共に減少した（図８Ｅ）。対照的に、８週間で測定されたフィブリノゲンレベルは、重度の疾患を有する患者においてより高かった（図８Ｆ）。ベースライン濃度に対する８週目の（ｌｏｇ２）比および５％偽発見率を使用した回帰分析は、その変化率が疾患重症度と関連する追加的なタンパク質を明らかにした。上位マーカーは、ＤＫＫ−１、アディポネクチンおよび血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）であった（図３Ｇ−Ｉ）。ＤＫＫ−１レベルは、軽度の疾患を有する患者において、ベースラインから８週目にかけて減少したが、より重度の疾患を有する患者においては高いままであったか、またはさらに増加した。アディポネクチンは、軽度の疾患を有する患者の大半において増加したが、最も高い疾患重症度スコアを有する患者においては変化しなかった（データは示さず）。
ベースライン対ＴＢ治療８週目における血清タンパク質の対分析
０．０１％偽発見率（ｑ＜０．０００１）において、ウィルコクソン符号順位検定を使用して、測定された１，０３０のタンパク質のうちの２３９がベースラインと処置８週目との間で差次的に発現したと特定された。１６のタンパク質が、３９名の患者全てにおいてベースラインから８週目にかけて同じ方向にシフトし、多くの他のタンパク質が、患者の少なくとも４分の３（３９名のうち３０名）において、ベースラインから８週目にかけて一貫したシフトを示した。患者内シフトは、上方または下方調整を示す患者の数を示す。上位患者内マーカー（ｑ＜１０−６）を、表１に示す。０．０１％偽発見率（ｑ＜１０−４）を有する２３９のタンパク質の完全なリストを、表２に示す。また、未加工ｐ値、および複数試験補正を反映する最終的ＦＤＲ補正「ｑ値」も示される。
符号順位検定は、測定の順位に基づいているため、これらのタンパク質のいくつかに対する変化の大きさを理解するのは困難である。図９において、ベースラインと８週目との間の中央倍数変化を使用した上位順位のタンパク質が示されている。ＳＡＡ（血清アミロイドＡタンパク質）、ＮＰＳ−ＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）、およびＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）は、それぞれ、６．８倍、５．９倍、および４．７倍の中央対象内減少を示した。１６の追加のタンパク質が、少なくとも１．５倍（中央倍数変化）降下し、ＴＳＰ−４、抗トロンビンＩＩＩ、マンノース受容体２（ＭＲＣ−２）、フェチュイン様タンパク質（ＦＥＴＵＢ）および血漿セリンプロテアーゼ阻害剤（ＰＣＩ）を含むいくつかのマーカーが、ベースラインと８週目との間で増加した。
次いで、注釈、可視化および統合された発見のためのデータベース（ＤＡＶＩＤ）を使用して、対データを分析した。表２に示される２３９のタンパク質を、全タンパク質およびタンパク質内の領域に関する構造関数情報を含有するＤＡＶＩＤに入力した。ＤＡＶＩＤ分析は、機能的類似性に基づいて２３９のタンパク質をクラスタ化した。ボンフェローニ補正ｐ値≦０．０５を有する＞１．３の濃縮スコアを有するそれらのクラスタが、有意であると見なされた。クラスタ（遺伝子オントロジーコードで注釈されている）は、創傷に対する応答、炎症反応、防御反応および凝固に関与する経路におけるタンパク質が、特定された２３９のタンパク質の中でもよく見られることを示した。注釈されたクラスタの完全なリストを、下の表３に示す。
不対分析
予後診断用途において、目的は、単一試料のみを使用して処置応答を予測することができることである。不対分析により、８週目の分布と異なるベースライン測定分布を有するタンパク質を特定することが行われた。０．１％偽発見率（ｑ＜０．００１）で、ＫＳ試験により、１，０３０タンパク質のうちの１１６が、ベースラインと８週目との間で差次的に発現したと特定された。全てのタンパク質に対するＫＳ距離を、図１０に記載する。上位６０マーカー（ｑ＜１０−４）を表４に示し、全１１６マーカー（ｑ＜１０−３）を表５に示す。全５５／１１６の特徴が経時的に上方調整され、６１／１１６が下方調整された。最も有意な変化は、ＴＳＰ−４、線維芽細胞活性化タンパク質α（ＳＥＰＲ）、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＰＣＩ、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）、α２−ＨＳ−糖タンパク質、およびホスホリパーゼＡ２（ＮＰＳ−ＰＬＡ２）において見られた。上位８マーカーのベースラインおよび８週目タンパク質測定に対する実験的累積分布関数（分布間のＫＳ距離の表示と共に）が図１１に示され、５１の追加のタンパク質のプロットが、図１２において見ることができる。ベースラインと８週目試料との間に差次的に発現した上位２マーカーを使用した散布図を、図１３に見ることができる。これらのタンパク質の１つ以上の測定値を使用して、このデータセット内の各試料を、９０％を超える感度および特異性をもって、ベースライン群（ＴＢ）または８週目群（治療されたＴＢ）に属するものとして分類することができる。
疾患重症度スコアの計算
血清の分析および臨床データの受領後、胸部Ｘ線（ＣＸＲ）の範囲および空洞性疾患（非存在、全ての空洞の直径の和が４ｃｍ未満または４ｃｍ超）（Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．（１９６９）Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）；喀痰塗抹標本グレード（Ｋｅｎｔ ａｎｄ Ｋｕｂｉｃａ ＧＰ（１９８５）Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌ ＩＩＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）；接種後の液体培地中の陽性培養の検出までの日数ならびにボディマスインデックス［体重（ｋｇ）／身長（ｍ）］２に基づき、カスタム疾患重症度スコアを計算した。疾患重症度のさらなる精密化が、より重度の疾患に関連したマーカーを解明し得るかを見出すために、重症度の臨床スペクトルを決定した。ＢＭＩ（Ｚａｃｈａｒｉａｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ ９６：２９１−２９４）および両側性空洞化（Ｐａｋａｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ６３：１１３０−１１３５）の臨床的重要性を考慮して、これらの因子を２の倍数で加重した。
以下の８つのパラメータを単一の疾患重症度スコアに組み合わせた。
疾患の重症度との相関
微生物学的およびＸ線写真パラメータを使用して、ＴＢ感染の重症度を評価した。全空洞体積およびＭＧＩＴ培養における検出までの時間は、それぞれ疾患の重症度および痰中の細菌負荷のマーカーである。試験に関与する患者に対して利用可能なデータから、ＣＸＲクラスは、ボディマスインデックス（ＢＭＩ、図１４Ａ）およびＭＧＩＴ培養における検出までの時間（ＴＴＤ、図１４Ｂ）等の他のパラメータとの強い関連性を示した。予期されたように、両方とも、空洞性疾患を有さない（ＣＸＲクラス１）１７名の患者と比較して、大型および／または両側性空洞を有する（ＣＸＲクラス３）１３名の患者においてより低かった。ＣＸＲクラス３においてクラス１と比較してより低かったプラスミノーゲン（図１４Ｃ）、およびＣＸＲクラス３においてクラス１と比較してより高かったトロモスポンジン−２（ＴＳＰ−２）（図１４Ｄ）は、ＣＸＲクラス１をクラス３患者から最も良く識別するが、これらの効果は、１８％偽発見率を有し、したがって、６つのそのような効果の平均的に約１つは、「偽」の発見であることが予測される。
血清タンパク質レベルおよび疾患重症度のより総合的な関連性に向けて、８つの臨床パラメータ（ＣＸＲクラス、ＣＸＲ範囲、検出までの時間、塗抹標本の状態、任意の空洞の存在、両側性空洞の存在または異常、ＢＭＩ）を、上述のように連続的疾患重症度スコアに組み合わせた。ベースラインでより重度の疾患（スコア＞０．６０）を有する１３名の患者、およびより重症度の低い疾患（スコア＜０．４０）を有する１３名の患者を区別する上位マーカーは、ＣＲＰ、ＳＡＡ、およびＰＬＡ２であり、中央値の約２倍増加したレベルを有した。
回帰分析を使用して、我々の複合スコアにより測定されるような増加する重症度と共に増加／減少したタンパク質を特定した。線形モデルにおける反応としてベースライン（ｌｏｇ）ＲＦＵを、および５％偽発見率を使用して、ヘパリン補因子２、血小板因子−４（ＰＦ−４）、Ｇ−タンパク質結合受容体関連選別タンパク質−２（ＧＡＳＰ−２）、およびα２−抗プラスミンが、我々の疾患重症度スコアと相関するベースライン濃度を有していた（図１５Ａ〜Ｄ）。低レベルのヘパリン補因子２およびＧＡＳＰ２は、共に、より重度の疾患と関連していた。興味深いことに、８週間でのα２−抗プラスミンレベルもまた、重症度スコアの増加と共に減少した（図１５Ｅ）。対照的に、８週間で測定されたフィブリノゲンレベルは、重度の疾患を有する患者においてより高かった（図１５Ｆ）。ベースライン濃度に対する８週目の（ｌｏｇ２）比および５％偽発見率を使用した回帰分析は、その変化率が疾患重症度と関連する追加的なタンパク質を明らかにした。上位マーカーは、ＤＫＫ−１、アディポネクチンおよび血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）であった（図１５Ｇ〜Ｉ）。ＤＫＫ−１レベルは、軽度の疾患を有する患者において、ベースラインから８週目にかけて減少したが、より重度の疾患を有する患者においては高いままであったか、またはさらに増加した。アディポネクチンは、軽度の疾患を有する患者の大半において増加したが、最も高い疾患重症度スコアを有する患者においては変化しなかった。
処置応答を予測するタンパク質
基本的な人口統計学的パラメータおよびその処置応答との相関
年齢は、ＴＢ処置応答の重要な予測因子であった（図１５Ａ）。応答者は、低応答者よりも若かった（中央年齢２５．７歳対３１．８歳、ｐ＝０．０１）。応答者は、低応答者より若干高いＢＭＩを有した（１９．７対１８．８のＢＭＩ（図１５Ｂ））が、差は有意ではなく（ｐ＞０．１）、また液体培養における検出までの日数として決定されるベースラインにおける定量的培養分析における差も有意ではなかった（ｐ＞０．１）（図１５Ｃ）。ＴＢ感染の程度または重症度を評価するために使用されたＸ線写真パラメータのうち、胸部Ｘ線（ＣＸＲ）範囲は、応答者と低応答者との間で異なり（ｐ＝０．０２）、図１５Ｄに示されるように、２倍の数の応答者がＣＸＲ範囲Ｂ（中程度）を有し、２倍の数の低応答者がＣＸＲ範囲Ｃ（広範囲）を有していた。
処置応答に基づくベースラインにおけるタンパク質マーカー
一実施形態において、ベースラインにおいて応答者を低応答者から区別するタンパク質が、コルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）試験を使用して特定された。図１６Ａおよび表８は、１０３０のタンパク質のそれぞれにおける応答者と低応答者との間の比較のためのＫＳ距離を示す。図１６Ｂは、応答者（Ｒ）および低応答者（Ｓ）との間の最大ＫＳ距離を有する上位２０タンパク質の相対蛍光単位（ＲＦＵ）の実験的累積分布関数のプロットを示す。表９（上部セクション）は、全１０３０タンパク質のうちの、応答者と低応答者との間の比較のための最大ＫＳ距離を有する上位１０タンパク質を示す。上位５タンパク質は、２９％の偽発見率を有し、これは、これらの５つのうち２つが、偽発見であると予測され得ることを示す。応答者は、プロテアソーム活性化因子複合体サブユニット１（ＰＳＭＥ１）、熱ショック７０ｋＤａ同族タンパク質８（ＨＳＰ７０）、α２−抗プラスミン、インターフェロンラムダ２（ＩＦＮ−λ）、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１２（ＭＭＰ−１２）の低応答者よりも高いレベルを有していた。一方、低応答者は、急速応答者と比較してより高いレベルのインターロイキン１１受容体拮抗薬（ＩＬ−１１ Ｒα）、ガレクチン−８、マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ−１３）、ｉＣ３ｂ、およびＴＮＦリガンドファミリーの増殖誘発性リガンド（ＡＰＲＩＬ）を有した。
処置応答に基づく８週間でのタンパク質マーカー
８週目試料において測定された全てのタンパク質に対して、応答者と低応答者との間のＫＳ距離が決定され（図１７Ａ）、応答者（Ｒ）と低応答者（Ｓ）との間の最大ＫＳ距離を有する上位２０タンパク質に対して、累積分布関数プロット（図１７Ｂ）が示される。表９（中央セクション）は、ＫＳ距離に基づき、８週目に応答者と低応答者との間の最大差次的発現を示したタンパク質を示す。凝固因子Ｖが、最も有意な差を示し、低応答者と比較して応答者において上昇した。Ｘａａ−Ｐｒｏアミノペプチダーゼ１（ＸＰＮＰＥＰ１）、可溶性ｇｐ１３０、形質転換成長因子−ベータ−誘発性タンパク質ｉｇ−ｈ３（ＢＧＨ３）、メタロプロテイナーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ−２）、細胞外基質タンパク質１（ＥＣＭ−１）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、インターフェロンアルファ−２（ＩＦＮ−αＡ）、ＩＬ−１１もまた、低応答者と比較して応答者において上昇した。表２のこのセクションに列挙した他のタンパク質のうち、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３（ＡＰＲＩＬ）のみが、低応答者よりも応答者において低かった。
応答者および低応答者の「対」分析が、「倍数変化」メトリクスとして対象内ベースラインから８週目の反応の対数比を使用して行われた（図１８）。この分析は、低応答者（Ｓ）と比較して応答者（Ｒ）において２つの時点の間の差次的変化を示すタンパク質を標的とする。２つの群における対数比の分布に関連したＫＳ距離によるタンパク質の順位付けを、表９に示す（下部セクション）。上位２つの特徴は、ＥｐｈＡ１（エフリンタイプＡ受容体１）およびｇｐ１３０であったが、両方とも、以前に不対分析において特定されている。また、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−８（メタロプロテイナーゼ−８、好中球コラゲナーゼとしても知られる）、ＡＭＰＭ２（メチオニンアミノペプチダーゼ ２）、およびＭＭＰ−１２（マクロファージメタロエラスターゼ）も見られる。
その後、ウィルコクソン順位和検定を使用してタンパク質を順位付けし、応答者および低応答者において異なる中央倍数変化を有するものを特定した。最も差次的な変化を有する１０のタンパク質を、表１０に列挙する。これらのタンパク質の最初の９つにおいて、ベースラインから８週目までのシグナルにおける倍数変化は、低応答者よりも応答者において大きかった。これらの特徴は、ネクチン様タンパク質１、ＥｐｈＡ１（エフリンタイプＡ受容体１）、ｇｐ１３０、ＣＡＴＺ、ＣＮＤＰ１、ＴＧＦ−ｂ ＲＩＩＩ、ＭＲＣ２、ＡＤＡＭ９、およびＣＤＯＮであった。ＩＬ−２ ｓＲαは、両方の群において減少した唯一のタンパク質であるが、低応答者と比較して応答者においてより大きな程度まで減少した。
表１１は、８週目の低応答者と全てのベースライン試料との間よりも、８週目の応答者と低応答者との間でより大きな程度まで変化したいくつかの追加のマーカーを示す。これらのタンパク質のレベルは、ベースラインおよび８週目の低応答者において互いに近い軌跡をとるが、８週目の応答者においては明確に異なる。
マーカーの組み合わせによる処置応答の予測
処置応答のシグニチャーを特定するため、具体的には血清タンパク質測定値を８週間での培養状態の予測に使用するためのいくつかの戦略を探索した。最初のアプローチにおいて、８週間で、応答者対低応答者を区別する上位マーカーが、低シグナル強度（＜５００ ＲＦＵ）を有するマーカーを排除した後に、大きなＫＳ距離（≧０．５）に基づいて選択された。凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ｇｐ１３０、ＴＩＭＰ−２およびＥＣＭ１を含む５つの特徴のシグニチャーが、単純ベイズ分類手段において組み合わされ、８週目データを使用して処置応答が「予測」された。手順は、図１ＡおよびＢにおいて概略的に示されている。一実施形態において、生体試料が、任意に希釈され、多重化アプタマーアッセイにおいて使用される。この５つの特徴の分類手段は、０．８９のＡＵＣ値および０．７５〜０．９８の信頼性区間を有するＲＯＣ曲線を示した（図１９Ａ）。訓練試料の対応する分類を、１９Ｂに示す。モデルは、安定したパラメータ推定を使用してｌｏｇ ＲＦＵ値にフィッティングされた。共変量調整は行わなかったが、対象の年齢およびＢＭＩは共に処置応答の強力な予測因子である。この予備試験は、分類手段性能を評価するための独立した試験セットを保持するには小さすぎたため、５倍階層化交差検証を使用して、性能推定値を生成した。感度および特異性は、０．８５＋／−０．１および０．９５＋／−０．０５であり、ＡＵＣは０．８８＋／−０．０７であった。
第２のアプローチにおいて、８週目の低応答者と全てのベースライン試料との間よりも８週目の応答者と低応答者との間でより大きな程度まで変化したマーカーが特定された。図２０Ａは、ベースライン試料の８週目の低応答者との比較のためのＫＳ距離対８週目の応答者および低応答者の比較のためのＫＳ距離の散布図を示す。処置応答に関連したマーカーは、８週目の低応答者とベースラインとの間よりも、８週目においてより大きな差次的発現（より大きいＫＳ距離）があるため、右下の領域に集合する。上で特定されたタンパク質の多くは、右下の角に現れ、さらに、ＢＧＮ（マトリックスプロテオグリカン）、ＹＥＳおよびＬＹＮＢ（チロシンキナーゼ）およびＩＬ−７が、その領域に位置する。図２０Ｂは、４つの代表的マーカー（ＢＧＮ、ＩＬ−７、凝固因子Ｖ、およびＬＹＮＢ）に対する実験的累積分布関数（ＣＤＦ）を示し、これらのタンパク質のレベル、ベースラインおよび８週目の低応答者において互いに近い軌跡をとるが、８週目の応答者においては明確に異なることを示している。
さらに別の実施形態において、年齢、性別、ＢＭＩ、塗抹標本の状態、ＣＸＲクラス、ＣＸＲ範囲および検出までの時間と組み合わされた１０３０のタンパク質測定値のセットから共変量のサブセットを特定するために、安定性選択が使用された。ベースラインにおける最も安定した予測マーカーは、ＩＬ−１１ Ｒα、α２−抗プラスミン、ＰＳＭＥ１、ＳＡＡ、および対象年齢であった（図２１Ａ）。それらのタンパク質の３つ、上述のように応答者と低応答者との間の大きなＫＳ距離を有するものに含まれ、伴うｑ値は、平均してこれらのうちの少なくとも１つが偽発見であることを示唆した。この評価は、異なる選択確率での安定性選択により予測された偽発見の平均数に一致する（図２１Ａ）。８週間において、処置応答の最も予測的な安定マーカーは、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ１、ＣＡＴＺ、凝固因子Ｖ、およびＳＡＡ（図２１Ｂ）であった。
処置応答を「予測」するための５−マーカーシグニチャーの例として、ＩＬ−１１ Ｒα、α２−抗プラスミン、ＰＳＭＥ１、およびＳＡＡのベースライン測定値を、ロジスティック回帰モデルにおける対象年齢と組み合わせた。対応する試料分類（図２１Ｃ）および得られたＲＯＣ曲線（図２１Ｄ）は、訓練データに対するこのモデルの性能を示す。本試験における試料は、独立した「試験セット」を保持するには少なすぎたため、５倍階層化交差検証を使用して、モデル性能を推定した。交差検証下、推定されたＡＵＣは０．９±０．０５であり、感度は０．９±０．０６、および特異性は０．９５±０．０５であった。同様の性能が、最善のＫＳ距離を有する表９中の最初の５つのタンパク質（ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、およびα２−抗プラスミン）のベースライン測定値を使用して構築された単純ベイズモデルから観察された。
最終分析は、低応答者から応答者を区別する８週目のマーカーを検索したが、これは、８週目の低応答者と全てのベースライン試料との間に大きな変化を示さなかった（図２１Ｅ）。８週目の低応答者のベースライン試料との比較のためのＫＳ距離対８週目の応答者および低応答者の比較のためのＫＳ距離のこの散布図において、処置応答と関連するマーカーは、右下の領域に集合する。凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＹＥＳ、血管作動性腸管ペプチド、ＥＣＭ１、ＢＧＮ（マトリックスプロテオグリカン）、ＬＹＮＢ（チロシンキナーゼ）、およびＩＬ−７等の、上で特定されたタンパク質の多くが見られる。これらのマーカーの実験的累積分布関数は、これらのタンパク質のレベルが、ベースラインおよび８週目の低応答者において互いに近い軌跡をとるが、８週目の応答者においては異なる（図２１Ｆ）ことを示している。
培養変換までの時間に関連したマーカー
処置応答の代理マーカーの特定に向けて、メタデータおよび血清タンパク質データを、陰性培養（固体および液体）が得られた少なくとも２つの連続した時点の最初として定義される培養変換までの時間（ＴＴＣＣ）に関して分析した。３９名の患者のうち、４週間（ｎ＝３）、６週間（ｎ＝４）、８週間（ｎ＝１２）、１２週間（ｎ＝１０）、１６週間（ｎ＝９）、および２０週間（ｎ＝１）のＴＴＣＣを有する６つの応答者群があった。ＴＴＣＣは、塗抹標本／培養物結果、胸部Ｘ線分類、空洞の存在、またはＢＭＩ（データは示さず）等のベースラインで得られた臨床データと相関しなかった。ＴＴＣＣに対するベースラインおよび８週目のタンパク質測定値（ｌｏｇ ＲＦＵ）の一変量回帰分析を行い、統計的優位性によりソートした（表１２）。ベースラインにおいて、より低いレベルのＥＲＰ２９、ペルオキシレドキシン−５、ＨＳＰ−７０、およびα２−抗プラスミンが、より長いＴＴＣＣと関連していた（図２２Ａ）。８週間で、ＮＫＧ２Ｄ（ＫＬＲＫ１）およびＣＤＫ８が、より長いＴＴＣＣを有する患者からの試料において増加したレベルを示したが、一方ＸＰＮＰＥＰ１およびＢＧＨ３（ＴＧＦＢＩ）レベルは、より低かった（図２２Ｂ）。異なる応答者群内の全ての８週間測定値の中央値の比較は、好中球機能に関連した大量のタンパク質を示した（図２２Ｃ）。ＢＰＩ（殺菌性透過性増加因子）およびＩＬ−１ Ｒ４は、低応答者と比較して高速応答者においてより高く、カテプシンＤは、低応答者と比較して高速応答者においてより低かった。応答者群間の最大の差は、８週間で測定されたＳＡＡに対するものであり、ベースラインデータおよび８週目データを使用したより詳細な回帰分析は、シグナルがベースラインから８週目にかけてほぼ１０分の１に降下したことを示したが、高速応答者からの試料において、はるかに急激な減少が観察された（図２２Ｄ）。
ａスケール／正規化
ｂ重み因子
ｃ（ｂｍｉ−１２）／４

Claims (69)

  1. 個人がＴＢを有している、または有していないと診断する方法であって、
    表１、２、４、５または８から１２に列挙されるうちのＮ個（Ｎは、１から２３９の整数である）のバイオマーカータンパク質を含むバイオマーカーパネルを提供することと、
    個人からの生体試料においてバイオマーカータンパク質を検出し、それぞれパネル中の前記Ｎ個のバイオマーカータンパク質の１つに対応するバイオマーカー値を得ることを含み、前記個人は、前記バイオマーカー値に基づいてＴＢを有している、または有していないものとして分類される方法。
  2. 前記バイオマーカー値を検出することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行うことを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、前記バイオマーカーのそれぞれに対応する少なくとも１種の捕捉試薬を含み、前記方法は、前記少なくとも１種の捕捉試薬を、アプタマー、抗体、および核酸プローブからなる群から選択することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記少なくとも１種の捕捉試薬は、アプタマーである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、免疫測定法、アプタマーに基づくアッセイ、組織学的または細胞学的アッセイ、およびｍＲＮＡ発現レベルアッセイからなる群から選択される、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 所定の閾値から逸脱する分類スコアに基づいて、個人がＴＢを有するものとして分類される、または個人がＴＢを有している尤度が決定される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記生体試料が、痰、尿、肺または他の感染した組織であり、前記バイオマーカー値は、前記組織の組織学的または細胞学的分析から得られる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記生体試料は、痰、全血、血漿、尿、体（例えば胸膜）液および血清からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記生体試料は、痰である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記個人は、ヒトである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. Ｎ＝３から２３９である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. Ｎ＝４から２３９である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  13. Ｎ＝５から２３９である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  14. Ｎ＝１０から２３９である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  15. Ｎ＝１５から２３９である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  16. 少なくとも１つのバイオマーカーは、表１および／または表４および／または表５および／または表８から１２からなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 少なくとも１つのバイオマーカーは、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 個人がＮＥＤの第１の評価を有する、またはＥＶＤの第２の評価を有するものとして分類するためのコンピュータ実装方法であって、
    ａ）コンピュータ上で個人のバイオマーカー情報を取得することであって、バイオマーカー情報は、表１、２、４、５または８から１２の少なくとも１つのバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む、取得することと、
    ｂ）ステップａ）の前記バイオマーカー値を、対照集団のバイオマーカー値と比較して、差次的発現があるかどうか決定することと、
    ｃ）前記対照集団に比べてバイオマーカー値のステップｂ）における差次的発現がない場合、個人を、ＮＥＤの第１の評価を有するものとして分類し、また前記対照集団に比べてバイオマーカー値の差次的発現がある場合、ＥＶＤの第２の評価を有するものとして分類することを含む方法。
  19. 前記評価は、診断、予後診断、ＴＢの再発の決定、および／またはそれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＮＥＤの評価は、ＴＢがないという診断、選択された未来の時点でＴＢがないという転帰の予後診断、ＴＢの再発がないという決定、および／またはそれらの組み合わせを示し得る、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＥＶＤの評価は、ＴＢの診断、選択された未来の時点でのＴＢの処置の転帰の予後診断、ＴＢの再発の決定、および／またはそれらの組み合わせを示し得る、請求項１９に記載の方法。
  22. コンピュータデバイスまたはシステムのプロセッサにより実行可能なプログラムコードを具現化するコンピュータ可読媒体を備えるコンピュータプログラム製品であって、前記プログラムコードは、
    ａ）個人からの生体試料に帰属するデータを取得するコードであって、データは、表１、２、４、５または８から１２の少なくとも１つのバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む、コードと、
    ｂ）ステップａ）の前記バイオマーカー値を、対照集団のバイオマーカー値と比較するためのコードと、
    ｃ）前記対照集団に比べてステップｂ）における個人のバイオマーカー値の差次的発現がない場合、ＮＥＤの第１の評価を示し、または、前記対照集団に比べて個人のバイオマーカー値の差次的発現がある場合、ＥＶＤの第２の評価を示す分類方法を実行するコードとを備える、コンピュータプログラム製品。
  23. 結核（ＴＢ）に関して個人を評価する方法であって、前記評価は、個人を、ＴＢを有する、もしくは有さないと診断すること、ＴＢの未来の経過を予後診断すること、処置応答、ＴＢが見かけ上治癒された個人におけるＴＢの再発もしくは再活性化を決定すること、またはそれらの任意の組み合わせを含み、前記方法は、
    表１、２、４、５、８または１２に列挙されるうちのＮ個（Ｎは、２から２３９の整数である）のバイオマーカータンパク質を含むバイオマーカーパネルを提供することと、
    個人からの生体試料においてバイオマーカータンパク質を検出し、それぞれパネル中の前記Ｎ個のバイオマーカータンパク質の１つに対応する値を得ることを含み、前記個人は、前記バイオマーカー値に基づいてＴＢを有している、または有していないものとして分類される方法。
  24. 前記バイオマーカー値を検出することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行うことを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、前記バイオマーカーのそれぞれに対応する少なくとも１種の捕捉試薬を含み、前記方法は、前記少なくとも１種の捕捉試薬を、アプタマー、抗体、および核酸プローブからなる群から選択することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記少なくとも１種の捕捉試薬は、アプタマーである、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、免疫測定法、アプタマーに基づくアッセイ、組織学的または細胞学的アッセイ、およびｍＲＮＡ発現レベルアッセイからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  28. 所定の閾値から逸脱する分類スコアに基づいて、個人がＴＢを有するものとして分類される、または個人がＴＢを有している尤度が決定される、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記生体試料が、肺、痰、尿、または他の感染した組織であり、バイオマーカー値は、前記試料の組織学的または細胞学的分析から得られる、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記生体試料は、痰、全血、血漿、他の感染した組織、または体液および血清からなる群から選択される、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記生体試料が、痰である、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記個人は、ヒトである、請求項２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. Ｎ＝３から２３９である、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. Ｎ＝４から２３９である、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
  35. Ｎ＝５から２３９である、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
  36. Ｎ＝１０から２３９である、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
  37. Ｎ＝１５から２３９である、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
  38. 少なくとも１つのバイオマーカーは、表１および／または表４および／または表５および／または表８から１２からなる群から選択される、請求項２３から３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 少なくとも１つのバイオマーカーは、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される、請求項２３から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 個人における結核感染を処置するための方法であって、
    前記個人の生体試料中の表１、２、４、５、または８から１２のＮ個のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定させることにより、結核感染を診断することであって、
    前記決定は、前記バイオマーカーの差次的発現に関して、前記個人の前記バイオマーカー値を、対照集団における前記バイオマーカー値と比較することを含み、
    前記バイオマーカーの差次的発現は、前記個人における結核感染の存在を示し、
    Ｎは、少なくとも１である、診断することと、
    そのようにして結核感染を診断された前記個人に結核感染に対する処置を施すこととを含む方法。
  41. 前記生体試料は、痰、尿、肺、または他の感染した組織であり、前記バイオマーカー値は、前記組織の組織学的または細胞学的分析から得られる、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記生体試料は、痰、全血、血漿、尿、体（例えば胸膜）液および血清からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記生体試料は、痰である、請求項４０に記載の方法。
  44. 前記個人は、ヒトである、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. Ｎ＝２から２３９である、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. Ｎ＝３から２３９である、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. Ｎ＝４から２３９である、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
  48. Ｎ＝５から２３９である、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
  49. Ｎ＝１０から２３９である、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
  50. Ｎ＝１５から２３９である、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
  51. 少なくとも１つのバイオマーカーは、表１および／または表４および／または表５および／または表８から１２からなる群から選択される、請求項４０から５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 少なくとも１つのバイオマーカーは、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される、請求項４０から５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 個人における結核感染を診断するためのアッセイであって、
    前記個人の生体試料中の表１、２、４、５、または８から１２のＮ個のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定させることであって、
    前記決定は、前記バイオマーカーの差次的発現に関して、前記個人の前記バイオマーカー値を、対照集団における前記バイオマーカー値と比較することを含み、
    前記バイオマーカーの差次的発現は、前記個人における結核感染の存在を示し、
    Ｎは、少なくとも１である、決定させることと、
    前記バイオマーカーの前記差次的発現に基づいて、個人が結核感染を有すると診断することとを含むアッセイ。
  54. 前記生体試料は、痰、全血、血漿、尿、体（例えば胸膜）液、血清からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記生体試料は、感染した組織であり、前記バイオマーカー値は、前記組織の組織学的または細胞学的分析から得られる、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記生体試料は、痰である、請求項５３に記載の方法。
  57. 前記個人は、ヒトである、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. Ｎ＝２から２３９である、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. Ｎ＝３から２３９である、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の方法。
  60. Ｎ＝４から２３９である、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の方法。
  61. Ｎ＝５から２３９である、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の方法。
  62. Ｎ＝１０から２３９である、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の方法。
  63. Ｎ＝１５から２３９である、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の方法。
  64. 少なくとも１つのバイオマーカーは、表１および／または表４および／または表５および／または表８から１２からなる群から選択される、請求項５３から６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 少なくとも１つのバイオマーカーは、ＴＳＰ４、ＴＩＭＰ−２、ＳＥＰＲ、ＭＲＣ−２、抗トロンビンＩＩＩ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＬＥＡＰ−１、ＬＢＰ、凝固因子Ｖ、ＸＰＮＰＥＰ１、ＰＳＭＥ１、ＩＬ−１１ Ｒα、ＨＳＰ７０、ガレクチン−８、α２−抗プラスミン、ＥＣＭ１、ＹＥＳ、ＩＧＦＢＰ−１、ＣＡＴＺ、ＢＧＮ、ＬＹＮＢ、およびＩＬ−７からなる群から選択される、請求項５３から６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 患者に結核感染に対する処置を施すべきかどうかを決定するための方法であって、
    ａ）前記個人の生体試料中の表１、２、４、５、または８から１２のＮ個のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定するために、アッセイを行わせることであって、
    前記決定は、前記バイオマーカーの差次的発現に関して、前記個人の前記バイオマーカー値を、対照集団における前記バイオマーカー値と比較することを含み、
    前記バイオマーカーの差次的発現は、前記個人における結核感染の存在を示し、
    Ｎは、少なくとも１である、行わせることと、
    ｂ）前記バイオマーカーの前記差次的発現に基づいて、個人が結核感染を有すると診断することと、
    ｃ）結核感染に対する処置を施すこととを含む方法。
  67. 患者に結核感染に対する処置を施すべきかどうかを決定するための方法であって、
    ａ）前記患者から生体試料を得ることと、
    ｂ）前記個人の前記生体試料中の表１、２、４、５、または８から１２のＮ個のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定するために、アッセイを行わせることであって、
    前記決定は、前記バイオマーカーの差次的発現に関して、前記個人の前記バイオマーカー値を、対照集団における前記バイオマーカー値と比較することを含み、
    前記バイオマーカーの差次的発現は、前記個人における結核感染の存在を示し、
    Ｎは、少なくとも１である、行わせることと、
    ｃ）前記バイオマーカーの前記差次的発現に基づいて、個人が結核感染を有すると診断することと、
    ｄ）結核感染に対する処置を施すこととを含む方法。
  68. 個人における結核感染の再発または再活性化を処置するための方法であって、
    前記個人の生体試料中の表１、２、４、５、または８から１２のＮ個のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定させることにより、結核感染の再発または再活性化を診断することであって、
    前記決定は、前記バイオマーカーの差次的発現に関して、前記個人の前記バイオマーカー値を、対照集団における前記バイオマーカー値と比較することを含み、
    前記バイオマーカーの差次的発現は、前記個人における結核感染の再発または再活性化を示す、診断することと、
    そのようにして結核感染の再発または再活性化を有すると診断された前記個人に、結核感染の再発または再活性化に対する処置を施すこととを含む方法。
  69. 個人における結核感染の処置を修正するための方法であって、
    前記個人の生体試料中の表８から１２のＮ個のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定させることにより、結核感染の状態を評価することであって、
    前記評価は、前記バイオマーカーの差次的発現に関して、前記個人の前記バイオマーカー値を、対照集団における前記バイオマーカー値と比較することを含み、
    前記バイオマーカーの差次的発現は、前記個人における結核感染の処置を強化する必要性を示す、評価することと、
    そのようにして結核感染の修正された処置が必要であると評価された前記個人への結核感染の処置を修正することとを含む方法。
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