CN114250310B - 用于检测结核病的dna甲基化标志物、诊断模型、甲基化探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测结核病的DNA甲基化标志物、诊断模型、甲基化探针和试剂盒，涉及医学检测技术领域，该DNA甲基化标志物包括以下3个甲基化区域中的一个或多个：chr3：195635643‑195636243、chr6：29691631‑29692475和chr11：65315205‑65315625。本发明通过检测以上3个甲基化区域中的一个或多个，能够对结核病具有强大的诊断能力，同时DNA甲基化作为生物标志物弥补了样品不稳定的局限性，反映了结核分枝杆菌与宿主之间的相互作用。本发明还提供了基于本发明的3个DNA甲基化区域通过Logistic回归和弹性网络回归方法构建而成的3DMRs诊断分类器，具有较高的灵敏度、特异性和曲线下面积(AUC)，对结核病具有强大的诊断能力。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测和诊断技术领域，尤其是涉及一种用于检测结核病的DNA甲基化标志物、诊断模型、甲基化探针及试剂盒。
背景技术
结核病是一种可预防和治愈的疾病，其发病机制涉及宿主、结核分枝杆菌、环境以及这些因素之间的动态相互作用。尽管基因组生物标记物具有很强的DNA稳定性，但由于无法监测从潜伏期到活跃期的过程，限制了基因组生物标记物的应用。转录生物标记物可以反映结核分枝杆菌与宿主之间的相互作用，但RNA的不稳定性阻碍了其在临床应用中的可行性。现有的结核检测方法包括病原学检测如Xpert MTB/RIF、痰涂片、培养等，以及基于宿主免疫的检测能力的IFN-γ释放试验(IGRA)、结核菌素试验等。然而病原学检验的检测能力在很大程度上取决于样品质量。而基于宿主免疫的检验方法其检验能力由宿主免疫状态决定。
DNA甲基化是最广泛研究的表观遗传修饰，指在DNA甲基转移酶的作用下通过甲基转移至胞嘧啶碱基的碳-5位而形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化涉及广泛的生物过程，包括调节基因表达、调节染色质结构和错配的DNA碱基，其具有成为结核病诊断生物标志物的巨大潜力。基于此，本申请提供了能够用于结核病检测的差异性甲基化区域(DMRs)的生物标志物，为临床诊断效果提供有力的依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测结核病的DNA甲基化标志物，通过检测结核病相关的3个差异性甲基化区域，对结核病具有强大的诊断能力。将DNA甲基化作为生物标志物弥补了样品不稳定的局限性，反映了结核分枝杆菌与宿主之间的相互作用。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测结核病的诊断模型，且诊断模型是基于本发明的3个DNA甲基化区域chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625通过Logistic回归构建而成的3-DMR logistics分类器。具有较高的灵敏度、特异性和曲线下面积(AUC)，对结核病具有强大的诊断能力，能够广泛应用于临床实践，提高临床诊断效果。
本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供一种用于检测结核病的DNA甲基化标志物，包括以下3个甲基化区域中的一个或多个：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625。
根据一种优选实施方式，所述的甲基化区域chr3：195635643-195636243来源于目标基因TNK2-AS1，所述的甲基化区域chr6：29691631-29692475来源于目标基因HLA-F，所述的甲基化区域chr11：65315205-65315625来源于目标基因LTBP3。
根据一种优选实施方式，所述的甲基化区域chr3：195635643-195636243具有如SEQ ID NO.1所示的基因序列；所述的甲基化区域chr6：29691631-29692475具有如SEQ IDNO.2所示的基因序列；所述的甲基化区域chr11：65315205-65315625具有如SEQ ID NO.3所示的基因序列。
本发明还提供了一种用于检测结核病的诊断模型，所述诊断模型是基于以下3个甲基化区域：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625通过Logistic回归构建而成的3-DMR logistics分类器。
本发明还提供了一种用于检测结核病的甲基化探针，所述甲基化探针对应检测以下三个甲基化区域的一个或多个：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625。
本发明还提供了一种用于检测结核病的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述的DNA甲基化标志物的试剂。
根据一种优选实施方式，所述试剂包括与检测以下3个甲基化区域中的一个或多个相对应的甲基化探针：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625。
基于上述技术方案，本发明的用于检测结核病的DNA甲基化标志物、诊断模型、甲基化探针和试剂盒至少具有如下技术效果：
本发明提供了一种用于检测结核病的DNA甲基化标志物，包括以下3个甲基化区域中的一个或多个：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625。通过检测以上3个结核相关的差异性甲基化区域中的一个或多个，能够对结核病具有强大的诊断能力，同时DNA甲基化作为生物标志物弥补了样品不稳定的局限性，反映了结核分枝杆菌与宿主之间的相互作用。
另一方面，本发明还提供了用于检测结核病的诊断模型，该诊断模型是基于以下3个甲基化区域：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625通过Logistic回归构建而成的3-DMR logistics分类器。本发明的诊断模型具有较高的灵敏度、特异性和曲线下面积(AUC)，对结核病具有强大的诊断能力，能够广泛应用于临床实践，提高临床诊断效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本发明提供了一种用于检测结核病的DNA甲基化标志物，包括以下3个甲基化区域中的一个或多个：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625。优选的，甲基化区域1：chr3：195635643-195636243来源于目标基因TNK2-AS1，甲基化区域2：chr6：29691631-29692475来源于目标基因HLA-F，甲基化区域3：chr11：65315205-65315625来源于目标基因LTBP3。优选的，甲基化区域1：chr3：195635643-195636243具有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。甲基化区域2：chr6：29691631-29692475具有如SEQ ID NO.2所示的基因序列；甲基化区域3：chr11：65315205-65315625具有如SEQ IDNO.3所示的基因序列。
具体信息如下：
实施例2
本发明实施例2提供了一种检测结核病的诊断模型，根据实施例1所涉及的3个结核相关的差异性甲基化区域(DMRs)由Logistic回归构建基于上述DMRs的3-DMR诊断分类器。
2.1采集检索数据集样本：
检索NCBI Gene Expression Omnibus数据库和欧洲生物信息学研究所ArrayExpress截至2020年10月3日的结核相关DNA甲基化阵列数据集。
2.2模型建立过程：
采用GEO数据库中所有结核相关的DNA甲基化芯片数据集，使用Minfi对原始DNA甲基化文件进行数据处理，使用sva校正不同数据集之间的批次效应。LIMMA用于鉴定|倍数变化fold change(FC)|>1.5的不同甲基化探针(p<0.05)，使用DMRcate按照错误发现率<0.05原则寻找差异甲基化区域后，采用logistic回归挖掘与TB诊断相关的差异甲基化区域，筛选出上述3个甲基化区域并进行拟合构建3-DMR诊断分类器。基于来自4个数据集(GEO数据库中结核的甲基化芯片数据集)的67名TB患者和45名健康对照，共鉴定了89种DMP和24种DMR。
使用拟合后的3-DMR logistics分类器的灵敏度为86.89％，特异性为72.54％，AUC为88.8％。
实施例3
本实施例提供了对3个结核相关的甲基化区域利用3DMRs诊断分类器进行进行检测验证的过程。验证数据集样本为通过纳排标准收集的临床TB患者以及健康对照(HC)标本。具体步骤如下：
3.1EDTA抗凝血离心后收集白膜
DNA提取：
1、往15ml离心管管底加入100微升Qiagen蛋白酶。
2、加入1ml全血。
注：全血体积不足1ml时，PBS补齐1ml。
3、加入1.2mlAL缓冲液，充分混匀，震荡器上斡旋震荡至少一分钟，使溶液成为均相溶液。
4、70℃水浴锅温育10分钟。
5、加入1ml无水乙醇，充分震荡。
6、转移液体至吸附柱，3000rpm离心3分钟，拿出吸附柱，倾倒滤液，将吸附柱重新放回15ml离心管中。
7、小心加入AW1缓冲液至吸附柱中，盖上盖子，5000rpm离心1分钟。
8、加入2ml AW2缓冲液至吸附柱中，盖上盖子，5000rpm离心15分钟。
9、将吸附柱转移至一新的15ml离心管中，弃去装有滤液的收集管。
10、加入200微升AE洗脱液，室温静置5分钟，5000rpm离心2分钟。
11、获得的基因组DNA进行浓度及质量测定。
3.2使用区域多重测序的方式进行测序，具体步骤包括：
1)超声打断双链DNA成300bp左右的片段；
2)用磁珠纯化DNA片段；
3)进行亚硫酸氢盐处理；
4)PNK磷酸化修饰亚硫酸氢盐转化后的DNA；
5)修饰后的DNA加入5’-adapter；
6)1.8x纯化磁珠纯化加完接头的DNA；
7)进行Primer Specific PCR；
8)用普通Taq酶进行第二轮PCR扩增；
9)凝胶电泳检测；
10)磁珠纯化后使用illumina测序。
以检测3DMR在62个人的甲基化情况；在62个独立人群分析分类器的性能灵敏度，结果显示，3-DMR logistics分类器的特异性和AUC达到灵敏度的83.87％，特异性的77.42％和AUC的90.40％。
因此，在发现数据集和独立人群验证队列中发现并验证了3-DMR logistics分类器。3-DMR logistics分类器具有较高的灵敏度、特异性和曲线下面积(AUC)，对结核病具有强大的诊断能力，能够广泛应用于临床实践，提高临床诊断效果。
实施例4
本实施例提供了一种用于检测结核病的甲基化探针，该甲基化探针对应检测以下三个甲基化区域的一个或多个：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625。
实施例5
本实施例提供了一种用于检测结核病的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测实施例1所述的DNA甲基化标志物的试剂。优选的，该试剂包括与检测以下3个甲基化区域中的一个或多个相对应的甲基化探针：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种用于检测结核病的DNA甲基化标志物、诊断模型、甲基化探针和试剂盒
<130> 2021.11.12
<141> 2021-11-15
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 601
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 1
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ccctgcgctc gcgggggcct tccccggact cggacgccgg ttcgggctgc tgcagcagcc 300
tccgcgggct cccctccccg cgctcctgca ccccggcccg ggcctcgccg cgctcctgca 360
ctgcggggct gcctccgccc ttctcctggt gctgcccgcg gggccccagc ccctcctcct 420
gcgccacagg ccagcccgcc gagcccgtcc accacggcgg gcgcccccag cccgcgccgt 480
ccggcggccc ccacaccacc ccccggctgg gctcgtggcc gcggccgccg cgctcctgca 540
gccccgggcc caccccgccc tcctcctgca ccgccgggcc caccccgccc cgctcctcca 600
c 601
<210> 2
<211> 845
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 2
cgccaaggcc aacgcacaga ctgaccgagt ggccctgagg aacctgctcc gccgctacaa 60
ccagagcgag gctggtgagt gaacccggcc gggggcgcag gtcacgacca ccccccatcc 120
gccacggacc gcccgggtcc ctcagagtct ccggatccga aatctacccc gaggcagcgg 180
gacccgccca gaccctccac ccgggagagt cccaggcgcc tttacccagg ttcattttca 240
gtttaggcca aaatccccgc gggttgggcg gggagggggc ggggctagct gggcggggct 300
gactgcgggg accggctagg gtctcacacc ctccagggaa tgaatggctg cgacatgggg 360
cccgacggac gcctcctccg cgggtatcac cagcacgcgt acgacggcaa ggattacatc 420
tccctgaacg aggacctgcg ctcctggacc gcggcggaca ccgtggctca gatcacccag 480
cgcttctatg aggcagagga atatgcagag gagttcagga cctacctgga gggcgagtgc 540
ctggagttgc tccgcagata cttggagaat gggaaggaga cgctacagcg cgcaggtacc 600
aggggccatg ggcgccttcc ctatctcctg tagatctctt gggatggcct cgcacaaggt 660
tgggaggaaa gtggacccaa tgctaggata tcgccctccc tctagtcctg agtaggaaga 720
atcttcctgg ctttcgagat ccggtaccag agagtgactg tgagagtccg ccctgctctc 780
tgggacaatt aagggatgaa atttctgagg gaatggaggg aagacagtcc ctggaatacc 840
gatcc 845
<210> 3
<211> 421
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 3
cggttgcagt ggcaattgta ggagccgccg gtgttcatgc agatgcccct ccccgggcca 60
cagggctctg cctcgcactc gttcacatct gagaagaacg ggtaggccaa gaaaagtcaa 120
aggaagcgtc gttatctggg gtcccccccc acccacctgc atgcccgccg cctgccctgc 180
gctcacccac gcagtagcgg tgctggggat gtgaccggta gccggggttg cagtggcagg 240
agtagtcagg ggggcccggc acgcactctc cgtggccaca gatgttctgg ttcagtcggc 300
actcatcagt ctctgcgggc atggccaggt caagcggcag agcagggagc gctcaccttc 360
tgccatatcc ccagggcaga cctcaacacc ccagtcacac catgacctca ggttcctgta 420
c 421
Claims (6)
1.一种用于检测结核病的DNA甲基化标志物，其特征在于，包括以下3个甲基化区域：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625，所述的甲基化区域chr3：195635643-195636243具有如SEQ ID NO.1所示的基因序列；所述的甲基化区域chr6：29691631-29692475具有如SEQ ID NO.2所示的基因序列；所述的甲基化区域chr11：65315205-65315625具有如SEQ ID NO.3所示的基因序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测结核病的DNA甲基化标志物，其特征在于，所述的甲基化区域chr3：195635643-195636243来源于目标基因TNK2-AS1，所述的甲基化区域chr6：29691631-29692475来源于目标基因HLA-F，所述的甲基化区域chr11：65315205-65315625来源于目标基因LTBP3。
3.一种用于检测结核病的诊断模型，其特征在于，所述诊断模型是基于以下3个甲基化区域：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625通过Logistic回归构建而成的3-DMR logistics分类器，所述的甲基化区域chr3：195635643-195636243具有如SEQ ID NO.1所示的基因序列；所述的甲基化区域chr6：29691631-29692475具有如SEQ ID NO.2所示的基因序列；所述的甲基化区域chr11：65315205-65315625具有如SEQ ID NO.3所示的基因序列。
4.一种用于检测结核病的甲基化探针，其特征在于，所述甲基化探针对应检测以下三个甲基化区域：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625，所述的甲基化区域chr3：195635643-195636243具有如SEQ ID NO.1所示的基因序列；所述的甲基化区域chr6：29691631-29692475具有如SEQ ID NO.2所示的基因序列；所述的甲基化区域chr11：65315205-65315625具有如SEQ ID NO.3所示的基因序列。
5.一种用于检测结核病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测前述权利要求1至2任一项所述的DNA甲基化标志物的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括检测以下3个甲基化区域的甲基化探针：chr3：195635643-195636243、chr6：29691631-29692475和chr11：65315205-65315625，所述的甲基化区域chr3：195635643-195636243具有如SEQ ID NO.1所示的基因序列；所述的甲基化区域chr6：29691631-29692475具有如SEQ ID NO.2所示的基因序列；所述的甲基化区域chr11：65315205-65315625具有如SEQ ID NO.3所示的基因序列。
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