TWI505833B - 針對β－ＮＧＦ之適體與彼等在治療涉及β－ＮＧＦ之疾病及異常之用途 - Google Patents

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Description

針對β-NGF之適體與彼等在治療涉及β-NGF之疾病及異常之用途
本發明大體係關於核酸領域且更特定言之係關於能夠結合至神經生長因子，更特定言之神經生長因子之β次單位(「β-NGF」)之適體，且該等適體適用作預防、治療或緩解瘙癢、瘙癢病狀及/或其他涉及β-NGF之疾病或病狀的治療劑。本發明進一步係關於用於投與能夠結合至β-NGF之適體的材料及方法。
本申請案主張2010年4月12日申請之美國臨時申請案第61/323,145號之權利，該案以全文引用的方式併入本文中。
以下描述提供關於本發明之資訊的概述且不承認本文所提供資訊或所參考公開案之任一者為本發明之先前技術。
重度瘙癢負面地影響數百萬人每天的生活品質。重度瘙癢可能與各種健康病狀有關聯，包括皮膚瘙癢病狀，諸如疥瘡、濕疹、乾燥症、牛皮癬及蕁麻疹，以及全身性病狀，包括慢性肝病或腎病及淋巴瘤。類似地，疼痛為常發事件，且為就診之主要原因之一。疼痛可能與多種類型之損傷或病狀有關，且不治癒急性疼痛可能導致慢性疼痛問題以及免疫及代謝失調。除了降低遭受瘙癢及/或疼痛之個體的生活品質以外，亦對保健預算有重要影響，尤其與皮膚瘙癢病狀以及慢性疼痛異常相關時。當前對於管理或治療瘙癢及/或疼痛所作之努力被公認為是不夠的。
神經生理學研究已證實瘙癢路徑與疼痛路徑不同。瘙癢感覺由專屬C神經元感知及傳遞，C神經元與處理疼痛感覺之疼痛感受器不同(Schmelz,Neurosci. Biobehav. Rev. doi:10.1016/j.neubiorev.2008.12.004,2009)。專屬C神經元隨後將瘙癢刺激傳遞至特定類別之背角神經元從而投射至丘腦(Stander and Schmelz,Eur. J. Pain10 :473,2006)。咸信在周圍神經末梢上沒有專門的瘙癢受體且瘙癢C神經元之特異性係基於其與瘙癢路徑之脊髓連接。觀察到瘙癢與疼痛在腦激活模式上有差異，諸如瘙癢感覺對頂葉之丘腦及軀體感覺皮層不產生可偵測激活(Yosipovitch等人，Lancet36l :690,2003)。
一般將疼痛分為急性疼痛或慢性疼痛。急性疼痛通常為對組織損傷之反應，其特徵為短暫性的且變為初始損傷癒合。慢性疼痛為持續性的且可能與外傷事件無明顯關聯。疼痛可進一步基於疼痛之機構起源分類且包括感受傷害性疼痛及非感受傷害性疼痛。感受傷害性疼痛由特定受體(感受傷害性受體)介導，該等受體由特定刺激(損傷、發炎、化學品等)激活。感受傷害性疼痛可進一步分為軀體痛或內臟痛。軀體痛在諸如皮膚、肌肉、關節、骨骼或韌帶之組織中發生。軀體痛一般為定位明確之銳痛。當前治療包括使用類鴉片及非類固醇消炎藥(NSAIDS)。內臟痛在內部器官中發生。其常為定位不明確之疼痛且一般用類鴉片來治療。
非感受傷害性疼痛可進一步分為神經痛或交感神經痛。神經痛可在周圍或中樞神經系統中出現。神經痛可能與退化性病狀、發炎或感染性疾病有關。此類疼痛導致過敏(痛覺過敏)且常描述為刺痛或灼痛。可選治療包括N-甲基-D-天冬胺酸(NMDA)拮抗劑、抗心律不整藥、抗驚厥藥或抗抑鬱藥。神經痛常常對習知鎮痛藥有抗性。交感神經痛在交感神經系統以及周圍與中樞神經系統中出現且一般與某些類型之損傷有關。損傷部位可顯示過敏性提高且溫度異常。治療一般涉及多藥物療法，包括交感神經阻滯劑、血管舒張藥、抗痙攣藥、抗心律不整藥及抗抑鬱藥。
不推薦用類鴉片鎮痛劑來常規及長期治療疼痛，此係由於擔心類鴉片之潛在成癮性、副作用、耐受性及依賴性。類鴉片副作用可包括噁心、嘔吐、便秘、呼吸抑制等。許多當前治療存在功效不足，副作用嚴重，且藥物傳遞方法不能幫助充分控制疼痛的問題。此等問題證明需要較佳疼痛控制治療劑。
雖然瘙癢與疼痛為明顯不同的感覺，但瘙癢與疼痛之間存在重要的相互作用。眾所周知瘙癢可由撓抓造成的疼痛感覺而減輕。而起減輕疼痛感覺作用之鎮痛藥(諸如類鴉片)實際上可增強瘙癢感覺。因此，一些疼痛治療劑可加劇瘙癢症狀，進一步證明需要具有治療瘙癢及疼痛兩者之潛能之較佳治療劑。
神經生長因子(NGF)為神經營養性細胞因子或神經營養因子家族中之一員。神經營養因子藉由控制細胞存活、分化及細胞凋亡在周圍及中樞神經系統之發育及維持中起重要作用。除了此等神經系統功能之外，亦顯示NGF可增加組織胺之釋放、肥大細胞之產生及B淋巴細胞之生長及分化。亦已顯示NGF可調整某些脂質介體之嗜鹼性產生。嗜中性白血球之細胞凋亡亦可受NGF抑制。所有此等因素表明NGF在免疫系統以及神經系統中之作用。
NGFβ鏈(β-NGF)單獨負責NGF之神經生長刺激活性。在細胞中，β-NGF以二聚體形式存在且結合至神經元細胞及非神經元細胞中的兩種類型之細胞表面受體上。蛋白質之三級結構係基於三個胱胺酸二硫鍵及兩個逆平行β股。人類、小鼠及大鼠蛋白質之胺基酸同源性為約90%。β-NGF像所有神經營養因子一樣以nM級親和力結合至p75細胞受體。β-NGF亦以pM級親和力結合至一種酪胺酸激酶受體(Trk)，尤其TrkA。與p75受體之反應可誘發細胞死亡，而結合至TrkA有利於細胞存活。β-NGF結合至TrkA引起受體及內部細胞蛋白質磷酸化。β-NGF藉由受體介導之內飲作用而內化。在諸多非神經元組織中發現Trk受體。
由皮膚之角質細胞釋放的神經生長因子(NGF)為尤其藉由促進神經纖維之萌出來增加真皮神經密度及影響形態之主要介體之一(Schmelz,Neurosci. Biobehav. Rev. doi:10.1016/j.neubiorev.2008.12.004,2009)。已發現慢性瘙癢患者呈現出皮內神經纖維密度增加。此外，已發現NGF可尤其藉由觸發NGF之受體(酪胺酸激酶TrkA)來提高周邊神經元之敏感性(Stander and Schmelz,Eur. J. Pain10 :473,2006)。
NGF在介導瘙癢以及疼痛中的重要性由在可具有瘙癢及疼痛兩種症狀之特應性病狀中所量測的高濃度NGF來呈現。異位性皮炎患者的NGF血清含量大大增加，NGF血清含量與該病狀之嚴重性正相關。接觸性皮炎患者的局部NGF濃度較高且結節性癢疹(prurigo nodularis)患者亦呈現較高NGF含量及TrkA活化水準(Schmelz,Neurosci. Biobehav. Rev. doi:10.1016/j.neubiorev.2008.12.004,2009)。
已研究藉由腹膜內注射全身性投與抗NGF抗體對異位性皮炎小鼠模型的症狀之作用且結果「表明抗NGF抗體阻斷NGF對周邊神經系統之作用且抑制表皮神經分佈、皮炎及撓抓行為」(Takano等人J. Pharmacol Sci 99:277 :284,2005)。研究亦發現抗NGF抗體不改變血清NGF含量，不降低所測試皮膚區域的NGF濃度且不完全抑制撓抓行為。因此，仍需要更完全地減輕或消除與異位性皮炎有關之瘙癢。
大量證據表明NGF充當某些疼痛狀態之介體。已顯示抗NGF抗體可產生持續性熱及化學鎮痛作用且阻斷由角叉菜膠誘發之炎症發展來的痛覺過敏(McMahon等人，Nat. Med.1 :774,1995)。關於小分子NGF受體拮抗劑阻斷NGF之生物活性之研究已顯示對神經性及發炎性疼痛狀態之鎮痛作用(Owolabi等人，J. Pharmacol. Exp. Ther.289 :1271,1999)。在Owolabi等人之研究中，小分子NGF活性抑制劑之鎮痛作用可小於嗎啡之鎮痛作用，此視投藥途徑而定。因為諸如嗎啡之類鴉片具有許多有害副作用，所以仍需要在由NGF介導之多種疼痛狀態中提供止痛作用，同時允許在有效投藥方面存在靈活性。
本發明提供結合至神經生長因子之β次單位的各種適體，本文中個別地稱為「β-NGF適體」；及使用該等β-NGF適體來治療涉及β-NGF之疾病及異常(包括治療疼痛及瘙癢以及瘙癢病狀)的方法。包括含β-NGF適體或其醫藥學上可接受之鹽及至少一種醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物或調配物。
本發明之組合物可以任何合適的醫藥學上可接受之劑型來製備。本文中所述之調配物及劑量經設計以使治療各種病狀(諸如疼痛及瘙癢以及瘙癢病狀)之臨床功效最大，同時降低或最小化不利副作用。
本發明進一步提供預防、治療或緩解涉及β-NGF之疾病或病狀的方法，該等方法包含向脊椎動物，特定言之哺乳動物，更特定言之人類投與β-NGF適體或β-NGF適體之醫藥組合物。特定而言，本發明提供治療、預防或緩解疼痛及瘙癢以及瘙癢病狀的方法。在一些實施例中，待治療、預防或緩解之疾病為異位性皮炎。
在一實施例中，治療作用(例如治療、預防或緩解疼痛及瘙癢以及瘙癢病狀)可藉由向所治療患者投與β-NGF適體以使得該適體暴露於且可結合至β-NGF來達成，不管適體之傳遞方法如何。在一相關實施例中，治療作用可藉由投與β-NGF適體以使得其暴露於且結合至β-NGF且藉此防止或減少β-NGF與其各種細胞受體中之一或多者結合來達成。在一實施例中，細胞受體為p75。在另一實施例中，細胞受體為Trk受體。在又一實施例中，細胞受體為TrkA。在又一實施例中，β-NGF適體防止或減小β-NGF受體及其他內部細胞蛋白質之磷酸化程度。
所提供方法涵蓋投與β-NGF適體以及一或多種第二活性劑。該投藥可為連續投藥或以組合組合物形式投藥。
在另一態樣中，本發明提供一種活體外診斷方法，其包含將β-NGF適體與疑似包含β-NGF之樣品接觸。在另一態樣中，本發明提供一種活體內診斷方法，其包含提供適當經標記之β-NGF適體，將該適體注射至疑似患有涉及β-NGF之疾病或異常的個體內，及偵測經標記適體以達成診斷或評估個體之健康狀況的目的。將根據待使用之成像模態選擇所用標記。
現將詳細描述本發明之代表性實施例。儘管本發明將結合列舉實施例來描述，但應理解本發明不欲限於彼等實施例。相反，本發明意欲涵蓋可包括在如由申請專利範圍所限定的本發明範疇內的所有替代、修改及相等物。
熟習此項技術者將認識到與本文中所述類似或相等之許多方法及材料，該等方法及材料可在本發明之實踐中使用且屬於本發明之實踐的範疇內。本發明絕不受限於所述方法及材料。
除非另作定義，否則本文中使用的技術及科學術語具有與本發明之一般技術者通常所理解相同之含義。雖然與本文中所述類似或相等之任何方法、裝置及材料可用於本發明之實踐或測試中，但現在描述較佳方法、裝置及材料。
本發明中引用的所有公開案、公開專利文獻及專利申請案體現本發明所屬技術的技能水準。本文中引用的所有公開案、公開專利文獻及專利申請案係以引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同已特定地及個別地將各個公開案、公開專利文獻及專利申請案以引用的方式併入一般。
如本發明(包括隨附申請專利範圍)中所用，除非文中另外明確指出，否則單數形式「一」及「該」包括複數個提及物，且可與「至少一個」及「一或多個」互換使用。因此，「一適體」包括適體之混合物，及其類似情況。
如本文中所用，術語「約」表示數值之微小改變或變化以使此數值相關的項目之基本功能無變化。
術語「各」當在本文中使用時係指複數個項目意欲指至少兩個該等項目。並非必需要形成複數項之所有項目均滿足相關額外限制。
如本文中所用，術語「包含」、「包括」、「含有」及其任何變化形式意欲涵蓋非排他性包含，以使得包含、包括或含有要素或要素清單之製程、方法、製程界定產物(product-by-process)或目標組合物不僅包括彼等要素，亦可包括該製程、方法、製程界定產物或目標組合物未明確列出或固有之其他要素。
如本文中所用，術語「核苷酸」係指核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或其經修飾形式以及其類似物。核苷酸包括以下物質，包括嘌呤(例如腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤及其衍生物及類似物)以及嘧啶(例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物及類似物)。
如本文中所用，「核酸」、「寡核苷酸」及「聚核苷酸」可互換用於指代核苷酸聚合物且包括DNA、RNA、DNA/RNA雜合物及此類核酸、寡核苷酸及聚核苷酸之修飾，其中包括各種實體或部分與核苷酸單元在任何位置之連接。術語「聚核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」包括雙股或單股分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸及聚核苷酸為比術語適體範圍更廣之術語，且因此，術語核酸、寡核苷酸及聚核苷酸包括作為適體之核苷酸聚合物，但術語核酸、寡核苷酸及聚核苷酸不限於適體。
如本文中所用，術語「修飾(modify)」、「經修飾」、「修飾(modification)」及其任何變化形式當關於寡核苷酸使用時意謂寡核苷酸之四種構成性核苷酸鹼基(亦即A、G、T/U及C)中之至少一者為天然產生之核苷酸之類似物或酯。在一些實施例中，經修飾核苷酸賦予寡核苷酸以核酸酶抗性。在C-5位置處有取代之嘧啶為經修飾核苷酸之一實例。修飾可包括主鏈修飾、甲基化、不尋常鹼基配對組合(諸如異鹼基異胞苷及異胍)及其類似物。修飾亦可包括3'及5'修飾，諸如封端。其他修飾可包括一或多種天然產生之核苷酸經類似物取代；核苷酸間修飾，諸如彼等具有不帶電鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酯、胺基甲酸酯等)之修飾及彼等具有帶電鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之修飾、彼等具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)之修飾、彼等含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)之修飾、彼等含有烷化劑之修飾及彼等具有經修飾鍵(例如α變旋異構核酸等)之修飾。此外，通常存在於核苷酸之糖上的任何羥基可經膦酸酯基或磷酸酯基置換；經標準保護基保護；或經活化以製備連接至其他核苷酸或固體支撐物之其他鍵。5'及3'末端OH基團可經磷酸化或經以下取代：胺、具有約1至約20個碳原子之有機封端基團部分、在一實施例中在約10至約80 kDa範圍內之聚乙二醇(PEG)聚合物、在另一實施例中在約20至約60 kDa範圍內之PEG聚合物或其他親水性或疏水性生物或合成聚合物。在一實施例中，修飾在嘧啶之C-5位置處。此等修飾可經由直接位於C-5位置處之醯胺鍵或其他類型之鍵產生。
聚核苷酸亦可含有此項技術中通常已知的核糖或脫氧核糖之類似形式，包括2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖(arabinose)、木糖或來蘇糖(lyxose))、哌喃糖、呋喃糖、七碳糖、非環狀類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。如上所述，一或多個磷酸二酯鍵可由替代性鍵聯基團替代。此等替代性鍵聯基團包括以下實施例，其中磷酸酯基經P(O)S(「硫代酯基」)、P(S)S(「二硫代酯基」)、(O)NR2 (「醯胺基」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 (「甲縮醛」)置換，其中R或R'各自獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵之經取代或未經取代之烷基(1-20C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。聚核苷酸中之所有鍵不必均相同。在設計最終產物時，類似形式之糖、嘌呤及嘧啶之取代可為有利的，例如，如聚醯胺主鏈之替代性主鏈結構可為有利的。
如本文中所用，術語「C-5修飾之嘧啶」係指在C-5位置處具有修飾之嘧啶，包括(但不限於)圖10中所說明之彼等部分。C-5修飾之嘧啶之實例包括彼等在美國專利第5,719,273號及第5,945,527號以及2009年11月25日申請之標題為「Nuclease Resistant Oligonucleotides」的美國臨時申請案第61/264,545號中所述之C-5修飾之嘧啶。C-5修飾之實例包括在C-5位置處之脫氧尿苷經獨立地選自以下之取代基取代：苄基甲醯胺(或稱為苄基胺基羰基)(Bn)、萘基甲基甲醯胺(或稱為萘基甲基胺基羰基)(Nap)、色胺基甲醯胺(或稱為色胺基羰基)(Trp)及異丁基甲醯胺(或稱為異丁基胺基羰基)(iBu)，如下文隨即圖示。
C-5修飾之嘧啶之化學修飾亦可與單獨或任何組合形式之2'位置糖修飾、環外胺處之修飾及4-硫代尿苷取代及其類似修飾組合。
代表性C-5修飾之嘧啶包括：5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基甲醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(iBudU)、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷、氯化5-(N-[1-(3-三甲基銨)丙基]甲醯胺)-2'-脫氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷或5-(N-[1-(2,3-二羥基丙基)]甲醯胺)-2'-脫氧尿苷)。
若存在，則可在裝配聚合物之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列可雜有非核苷酸組份。聚核苷酸可在聚合之後進一步經修飾，諸如藉由與標記組份結合。
如本文中所用，術語「至少一個嘧啶」當關於核酸之修飾時係指在核酸中之一個、若干個或所有嘧啶，表明核酸中任何或所有C、T或U之任何或所有出現可經修飾或未經修飾。
如本文中所用，「核酸配位體」、「適體」及「純系」可互換用於指代對目標分子具有所要作用的非天然產生之核酸。所要作用包括(但不限於)結合目標、以催化方式改變目標、以修飾或改變目標或目標之功能活性之方式與目標反應、共價連接至目標(如在自殺型抑制劑中)及促進目標與另一分子之間的反應。在一實施例中，該作用為對目標分子之特異性結合親和力，該目標分子具有不為聚核苷酸之三維化學結構，其經由不依賴於Watson/Crick鹼基配對或三螺旋形成之機制結合至核酸配位體，其中適體不為具有經目標分子結合之已知生理功能的核酸。針對既定目標之適體包括藉由包含以下步驟之方法自候選核酸混合物鑑別之核酸，其中該適體為目標之配位體：(a)使候選混合物與目標接觸，其中對目標之親和力比候選混合物中之其他核酸高的核酸可與候選混合物之其餘核酸分開；(b)將高親和力核酸與候選混合物之其餘核酸分開；及(c)擴增高親和力核酸以產生配位體增濃之核酸混合物，藉此鑑別目標分子之適體。認識到親和力相互作用為程度問題；然而，在此情形下，適體對其目標之「特異性結合親和力」意謂適體通常以比其結合至混合物或樣品中之其他非目標組份高得多之親和力結合至其目標。「適體」或「核酸配位體」為具有特定核苷酸序列之一類或一種核酸分子之複本集合。適體可包括任何合適數量之核苷酸。「適體」係指一個以上該分子集合。不同適體可具有相同或不同數量之核苷酸。適體可為DNA或RNA且可為單股、雙股，或含有雙股區或三股區。
如本文中所用，「蛋白質」與「肽」、「多肽」或「肽片段」同義使用。「經純化」多肽、蛋白質、肽或肽片段實質上不含細胞物質或來自獲取胺基酸序列之細胞、組織或無細胞來源的其他污染蛋白質，或實質上不含化學前驅體或其他化合物(經化學合成時)。
如本文中所用，「調節」意謂改變(增加或減少)肽或多肽之含量或改變(提高或降低)肽或多肽之穩定性或活性。術語「抑制」意謂減少肽或多肽之含量或降低肽或多肽之穩定性或活性。如本文中所描述，經調節或抑制之蛋白質為β-NGF。
如本文中所用，術語「生物活性」表示(例如經由結合、信號傳導等)對一或多個可影響生理或病理生理過程之細胞或細胞外過程的作用。
如本文中所用，術語「神經生長因子」、「NGF」及「β-NGF」係指保留NGF之至少一部分活性的神經生長因子之β次單位及其變異體。如本文中所用，NGF包括所有哺乳動物物種之原生序列NGF，包括人類、犬科動物、貓科動物、鼠科動物、靈長類動物、馬科動物及牛科動物。
如本文中所用，「NGF受體」係指由NGF結合或由NGF活化之多肽。NGF受體包括任何哺乳動物物種之TrkA受體及p75受體，包括(但不限於)人類、犬科動物、貓科動物、鼠科動物、馬科動物、靈長類動物及牛科動物。
「β-NGF適體」為能夠結合至β-NGF且改變其活性之適體。如本文中所用，「β-NGF適體」係指能夠結合至β-NGF及/或抑制β-NGF生物活性及/或由β-NGF信號傳導介導之下游路徑的適體。
如本文中所用，「由β-NGF介導之疾病或醫學病狀」係指β-NGF活性可在疾病過程之某一階段直接或間接引起疼痛或瘙癢的疾病或醫學病狀，包括表7中列出之任一種疾病或醫學病狀。因此，用β-NGF適體治療抑制此等疾病或醫學病狀中由於β-NGF活性而出現的疼痛或瘙癢。針對β-NGF之適體可進一步阻斷β-NGF與其一或多個受體之結合。
如本文中所用，「疼痛」係指急性疼痛、慢性疼痛、感受傷害性疼痛、內臟痛、軀體痛、非感受傷害性疼痛、神經痛、交感神經痛或與涉及β-NGF之發炎過程相關之疼痛。
術語「瘙癢」係指可在輕度瘙癢疼痛感覺至強烈瘙癢疼痛感覺範圍內之瘙癢。瘙癢可伴有原發性皮膚病或可為全身性疾病之一症狀，有時為唯一症狀。瘙癢最嚴重的皮膚病尤其包括疥瘡、蝨症、昆蟲咬傷、乾燥症、蕁麻疹、異位性皮炎、接觸性皮炎、扁平苔癬、栗疹及疱疹樣皮炎。瘙癢之全身性原因包括慢性肝病或腎病及淋巴瘤。
術語「皮膚異常」及「皮膚病」係指影響或涉及皮膚之任何疾病或病狀，包括皮膚病狀，諸如異位性皮炎、魚鱗癬、乾皮病、脂溢性皮炎、過敏性接觸性皮炎、禿頭症、天疱瘡、疱疹樣皮炎、牛皮癬、念珠菌病、粉刺、皮癬菌病、尿布疹、乳痂(cradle cap)、濕疹、鉤蟲及由例如創傷、灼傷及大便及尿失禁造成的皮膚損傷。
如本文中所用，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦或州政府之管理機構批准或在美國藥典(U.S. Pharmacopoeia)或用於動物且更特定言之人類之其他公認藥典中列出。術語「載劑」係指用於投與治療劑之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑且包括(但不限於)諸如水及油之無菌液體。
β-NGF適體之「醫藥學上可接受之鹽」或「鹽」為含有離子鍵且通常藉由使所揭示化合物與酸或鹼反應而產生並適於投與個體的所揭示化合物之產物。醫藥學上可接受之鹽可包括(但不限於)酸加成鹽，包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、烷基磺酸鹽、芳基磺酸鹽、芳基烷基磺酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、丁二酸鹽、乳酸鹽及酒石酸鹽；鹼金屬陽離子(諸如Li、Na、K)，鹼土金屬鹽(諸如Mg或Ca)，或有機胺鹽。
「醫藥組合物」為包含適於投與個體之形式的β-NGF適體之調配物。醫藥組合物通常經調配以與預定投藥途徑相容。投藥途徑之實例包括(但不限於)經口及非經腸，例如靜脈內、皮內、皮下、吸入、表面、經皮、經黏膜及直腸投藥。
如本文中所用，術語「治療有效量」一般意謂緩解如本文中所述的有待預防、減輕或治療之異常或病狀之至少一種症狀所必需之量。片語「治療有效量」當其關於本發明之β-NGF適體時意謂提供將大量適體投與需要該治療之個體所欲達成之特定藥理學反應的適體劑量。應強調在特定情況下投與特定個體的治療有效量之適體不會始終有效治療本文中所述之病狀/疾病，儘管該劑量被熟習此項技術者視為治療有效量。
SELEX方法
術語「SELEX」及「SELEX方法」在本文中可互換用於一般性指代以下(1)與(2)之組合：(1)選擇以所要方式與目標分子相互作用之核酸，例如以高親和力結合至蛋白質，(2)擴增彼等選出之核酸。SELEX方法可用於鑑別以高親和力與特定目標分子或生物標誌物結合的適體。
SELEX一般包括製備候選核酸混合物，使候選混合物結合至所要目標分子以形成親和力複合物，將親和力複合物與未結合候選核酸分開，將核酸與親和力複合物分開及分離，純化核酸及鑑別特定適體序列。該方法可包括多個輪次以進一步改進選出適體之親和力。該方法可在該方法之一或多個時點包括擴增步驟。參見，例如標題為「Nucleic Acid Ligands」之美國專利第5,475,096號。SELEX方法可用於產生共價結合其目標之適體以及非共價結合其目標之適體。參見，例如標題為「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX」之美國專利第5,705,337號。
SELEX方法可用於鑑別含有經修飾核苷酸之高親和力適體，該等經修飾核苷酸賦予適體以改良特徵，例如改良的活體內穩定性或改良的傳遞特徵。該等修飾之實例包括在核糖及/或磷酸酯及/或鹼基位置上的化學取代。SELEX方法鑑別之含有經修飾核苷酸之適體描述於標題為「High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides」之美國專利第5,660,985號中，該專利描述含有在嘧啶之5'-位置及2'-位置經化學修飾之核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利第5,580,737號(參見上文)描述含有一或多個經2'-胺基(2'-NH2 )、2'-氟(2'-F)及/或2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸的高特異性適體。亦參見標題為「SELEX and PHOTOSELEX」之美國專利申請公開案第20090098549號，其描述具有擴展物理及化學性質的核酸文庫及其於SELEX及photoSELEX中的用途。
2009年11月25日申請的標題為「Nuclease Resistant Oligonucleotides」之美國臨時申請案第61/264,545號描述製造具有改良核酸酶抗性之寡核苷酸的方法。核酸酶抗性寡核苷酸包括至少一個在C-5位置處經選自圖10中所列之基團修飾的嘧啶。在各個實施例中，修飾包括C-5位置處之脫氧尿苷經獨立地選自以下之取代基取代：苄基甲醯胺(Bn)、萘基甲基甲醯胺(Nap)、色胺基甲醯胺(Trp)及異丁基甲醯胺，如上所說明。
SELEX亦可用於鑑別具有所要解離速率特徵之適體。參見標題為「Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates」之美國專利公開案第20090004667號，其描述產生可結合至目標分子之適體的改良SELEX方法。描述製造與其各別目標分子之解離速率較慢之適體及光適體(photoaptamer)的方法。該等方法涉及使候選混合物與目標分子接觸，允許形成核酸-目標複合物及執行慢解離速率增濃過程，其中具有快解離速率之核酸-目標複合物解離且不重新形成，而具有慢解離速率之複合物保持完整。另外，該等方法包括在製備候選核酸混合物過程中使用經修飾之核苷酸以產生具有改良解離速率效能之適體(參見美國專利公開案第20090098549號，標題為「SELEX and PhotoSELEX」)。
「目標」或「目標分子」在本文中指代核酸可以所要方式作用所針對的任何化合物。目標分子可為(但不限於)蛋白質、肽、核酸、碳水化合物、脂質、多醣、醣蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、病原體、毒性物質、受質、代謝物、過渡態類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營養素、生長因子、細胞、組織、上述各物任一者之任何部分或片段等等。實際上，任何化學或生物效應子可為合適目標。任何尺寸之分子均可充當目標。目標亦可以某些方式經修飾以增強目標與核酸之間的相互作用之可能性或強度。目標亦可包括特定化合物或分子之任何較小變化，例如胺基酸序列中之較小變化(諸如在蛋白質之情況下)、二硫鍵形成、糖基化作用、脂質化作用、乙醯化作用、磷酸化作用或任何其他操縱或修飾，諸如與標記組份結合，其不實質上改變分子之本性。「目標分子」或「目標」為能夠結合至適體之一類或一種分子或多分子結構之複本集合。「目標分子」或「目標」係指一個以上該分子集合。SELEX方法之實施例描述於標題為「Modified SELEX Processes Without Purified Protein」之美國專利第6,376,190號中。在本發明之情況下，目標為β-NGF。
適體
本發明之適體係使用如實例1中所述用於鑑別具有慢解離速率之適體的改良SELEX方法鑑別，實例1描述選擇及製造針對β-NGF之DNA適體的代表性方法。選擇過程中使用的β-NGF形式為重組人類蛋白且以分子量為13.2 kD之蛋白質單體形式分離。在溶液中，單體形成二聚體。使用此方法，鑑別指定為適體2426-66(SEQ ID NO: 1)的針對β-NGF之DNA適體。
使用適體2426-66(SEQ ID NO: 1)進行研究以鑑別維持對β-NGF之強親和力所需之最小序列長度，如實例2中所述。最小化序列長度允許化學過程中更具可再現性的適體合成且可能有助於穿過皮膚吸收以及併入醫藥調配物中。截短研究使得鑑別出具有許多截短序列之適體，其亦為極需要之β-NGF結合劑，Kd 值至多約30 nM。此等序列包括SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149(表3及4)。詳言之，鑑別適體2426-66-50(SEQ ID NO: 2；表4)，一種對β-NGF之Kd 為1.4 nM的28聚體。
對選出2426-66(SEQ ID NO: 1)之序列池進行另外測序研究。所用測序方法為454測序。此為使用平行焦磷酸測序之大規模高輸出量方法。該方法提供不偏樣品製備及極精確序列分析。在此方法中，結合生物素之DNA片段捕捉於抗生蛋白鏈菌素珠粒上隨後藉由PCR擴增。未結合生物素之股由珠粒釋放且用作單股模板DNA文庫。此文庫接著藉由PCR擴增。各珠粒因而含有DNA片段之擴增純系複本。此珠粒文庫接著用於酶測序方法中。使用測序資料來鑑別β-NGF適體之共同序列。此外，實例3中描述的核苷酸取代研究有以下發現：在共同序列中的9個BndU位置中有7個為β-NGF結合所需，但2個BndU位置可經dT置換，而無結合活性損失。共同序列展示於圖2A中，亦展示相對於2426-66(SEQ ID NO: 1)適體在各位置處的核苷酸頻率之圖示。如圖2A中所示，共同序列為：
其中B係選自除A以外之任何核苷酸；R獨立地選自A或G；S係選自C或G；W獨立地選自Z或T；D係選自除C以外之任何核苷酸；.及Z獨立地選自經修飾之核苷酸，特定言之經修飾之嘧啶。
在一態樣中，B係選自C、G或Z；D係選自A、G或Z且R、S、W及Z如以上所定義。
在另一態樣中，共同序列為：
其中B、R、S、D及Z如上文所定義。
在一些實施例中，Z為經修飾之尿苷。在其他實施例中，Z為如上文所定義之C-5修飾之嘧啶。在其他實施例中，Z為獨立地選自由以下組成之群的C-5修飾之嘧啶：5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基甲醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(iBudU)、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷、氯化5-(N-[1-(3-三甲基銨)丙基]甲醯胺)-2'-脫氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷及5-(N-[1-(2,3-二羥基丙基)]甲醯胺)-2'-脫氧尿苷)。在其他實施例中，Z為5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(BndU)。預期此等核苷酸修飾中之任一者同樣有效地促進高親和力結合至β-NGF且提供慢解離速率。
如本文中「共同序列」當用於一系列相關核酸時，係指反映最常選擇序列中各位置處鹼基之核苷酸序列，其中已對該系列相關核酸進行深入的數學及/或序列分析。
本發明提供使用SELEX方法鑑別且在表3及4中列出的β-NGF適體(SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149)。本發明亦涵蓋實質上與任一所列適體同源且具有與選自表3及4中所列適體(SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149)之群的適體實質上類似的結合β-NGF之能力的β-NGF適體。此外，本發明亦涵蓋具有與本文中所鑑別之適體實質上相同之結構形式且具有與選自表3及4中所列適體(SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149)之群的適體實質上類似的結合β-NGF之能力的β-NGF適體。
在一態樣中，本發明提供特異性結合至β-NGF且包括一級核酸序列之適體。在一實施例中，一級核酸序列係選自SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149。在其他實施例中，選擇一級核酸序列，以使其與選自SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149之一級核酸序列至少約75%一致、至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致或至少約95%一致。
術語「序列一致性」、「序列一致性百分比」、「一致性百分比」、「一致%」、「一致性%」及其變化形式當用於兩個或兩個以上核酸序列之情況中時可互換用於指代當比較及比對達成最大對應性時，如使用序列比較演算法或藉由目測檢驗所量測，兩個或兩個以上相同或具有指定百分比的相同核苷酸之序列或子序列。序列比較時，通常一序列用作與測試序列比較之參考序列。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，若需要則指定子序列同等物，且指定序列演算法程式參數。序列比較演算法隨後基於指定程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。供比較之序列的最佳比對可例如藉由以下方法進行：Smith及Waterman,Adv. Appl. Math.,2:482,1981之局部同源性演算法、Needleman及Wunsch,J. Mol. Biol.,48:443,1970之同源性比對演算法、Pearson及Lipman,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444,1988之搜尋相似性方法、電腦實施此等演算法(在Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或目測檢驗(參見一般Ausubel,F. M.等人， Current Protocols in Molecular Biology,由Greene Publishing Assoc.及Wiley-Interscience出版(1987))。
適用於測定序列一致性百分比之演算法之一實例為基礎局部比對搜尋工具(下文中「BLAST」)中使用的演算法，參見例如Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410,1990及Altschul等人， Nucleic Acids Res.,15:3389-3402,1997。用於執行BLAST分析之軟體可由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)(下文中「NCBI」)公開獲得。使用獲自NCBI之軟體(例如BLASTN)(用於核苷酸序列)測定序列一致性的預設參數描述於McGinnis等人，Nucleic Acids Res.,32:W20-W25,2004中。
如本文中所用，當描述諸如β-NGF適體之核酸之一致性百分比，其序列與參考核苷酸序列至少例如約95%一致時，意欲除該核酸序列可包括每100個參考核酸序列之核苷酸至多5個點突變以外，核酸序列與參考序列一致。換言之，為了獲得想要的核酸序列，其序列與參考核酸序列至少約95%一致，參考序列中至多5%核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或一定數量之核苷酸，至多佔參考序列中核苷酸總數的5%可插入參考序列中(本文中稱為插入物)。產生想要序列的此等參考序列突變可在參考核苷酸序列之5'或3'末端位置處或在彼等末端位置之間的任何地方發生，個別地散佈於參考序列之核苷酸中或在參考序列內的一或多個鄰接基團中。參考(查詢)序列可為SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149中展示的完整核苷酸序列中之任一者或任何此等序列之任何片段。
在一態樣中，SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 3之共同序列各自可經修飾以包括至少一個插入物。在一實施例中，SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 3之共同序列經修飾以使得一個核苷酸(N)插入共同序列中的鹼基9與10之間。在另一實施例中，SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 3之共同序列經修飾以使得一個核苷酸(N)插入共同序列中的鹼基15與16之間。在另一實施例中，SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 3之共同序列經修飾以使得一個核苷酸(N)插入共同序列中的鹼基9與10之間且另一個核苷酸(N)插入共同序列中的鹼基15與16之間。此等實施例如下所說明：
其中B、R、S、D及Z如上文所定義且N獨立地選自任何天然產生或經修飾之核苷酸(A、C、G或T)。
在另一態樣中，本發明提供β-NGF適體，其一結合β-NGF即調節β-NGF功能。在各個實施例中，適體調節活體內β-NGF功能。在各個實施例中，β-NGF適體包括與SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149之任一者中包括的鄰接核苷酸序列一致的鄰接核苷酸序列。在各個實施例中，β-NGF適體中的鄰接核苷酸序列可包括任何數量的與SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149之任一者中包括的鄰接核苷酸序列中的相同數量之核苷酸一致之核苷酸。在各個實施例中，β-NGF適體中的鄰接核苷酸序列包括與SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149之任一者中包括的約4至約30個鄰接核苷酸序列一致的約4至約30個鄰接核苷酸序列。在一例示性實施例中，β-NGF適體包括與SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149之任一者中包括的30個鄰接核苷酸序列一致的30個鄰接核苷酸序列。在另一例示性實施例中，β-NGF適體包括與SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149之任一者中包括的20個鄰接核苷酸序列一致的20個鄰接核苷酸序列。在又一例示性實施例中，β-NGF適體包括與SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149之任一者中包括的8個鄰接核苷酸序列一致的8個鄰接核苷酸序列。在又一例示性實施例中，β-NGF適體包括與SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149之任一者中包括的4個鄰接核苷酸序列一致的4個鄰接核苷酸序列。
在一實施例中，β-NGF適體為SEQ ID NO: 1。在另一實施例中，β-NGF適體為SEQ ID NO: 2。在另一實施例中，β-NGF適體源自SEQ ID NO: 3之共同序列。在其他實施例中，β-NGF適體為SEQ ID NOS: 9-44及149中之任一者。在一實施例中，β-NGF適體與SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149中之任一者至少約95%一致、至少約90%一致、至少約85%一致、至少約80%一致或至少約75%一致。在另一實施例中，β-NGF適體包括來自SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149中之任一者之序列及此等序列任一者之片段。
除了β-NGF結合區以外，β-NGF適體亦可含有任何數量之核苷酸。在各個實施例中，β-NGF適體可包括至多約100個核苷酸、至多約95個核苷酸、至多約90個核苷酸、至多約85個核苷酸、至多約80個核苷酸、至多約75個核苷酸、至多約70個核苷酸、至多約65個核苷酸、至多約60個核苷酸、至多約55個核苷酸、至多約50個核苷酸、至多約45個核苷酸、至多約40個核苷酸、至多約35個核苷酸、至多約30個核苷酸、至多約25個核苷酸及至多約20個核苷酸。
在又一實施例中，β-NGF適體係選自具有與選自由SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149組成之群的適體類似之結合特徵及治療β-NGF相關性疼痛或瘙癢及瘙癢病狀之能力的適體。
可選擇具有任何合適之β-NGF解離常數(Kd )的β-NGF適體。在一例示性實施例中，β-NGF適體具有約10 nM或小於10 nM之β-NGF解離常數(Kd )。在另一例示性實施例中，β-NGF適體具有約15 nM或小於15 nM之β-NGF解離常數(Kd )。在又一例示性實施例中，β-NGF適體具有約20 nM或小於20 nM的β-NGF解離常數(Kd )。在又一例示性實施例中，β-NGF適體具有約25 nM或小於25 nM的β-NGF解離常數(Kd )。合適解離常數可用結合檢定使用多點滴定且擬合如以下實例1中所述之方程式y=(max-min)(蛋白質)/(Kd +蛋白質)+min來測定。應瞭解解離常數之測定極大地取決於其量測條件且因此此等數值可隨諸如平衡時間等因素而顯著變化。在其他實施例中，β-NGF適體為Kd 小於或等於選自SEQ ID NOS: 1、2、9-44及149之適體的Kd 之適體。
適體2426-66(SEQ ID NO : 1)以1:1化學計量與β-NGF單體結合。因為β-NGF形成緊密均二聚體，此為與其目標受體反應所需，所以對β-NGF活性之更有效抑制可能藉由使用二聚或其他多聚形式之2426-66適體獲得。因此，在另一實施例中，β-NGF適體為以上序列之任何組合的多聚化。圖3及4說明二聚化2426-66適體之可能方法。相同策略可應用於具有對於β-NGF之適當結合特徵的任何適體序列。亦可使用類似方法製造具有所要多個適體序列複本之多聚適體。在此情況下，使用截短適體之2426-66-50(SEQ ID NO: 2)序列，但亦可利用全長2426-66序列。圖3說明兩個2426-66序列之頭接尾構築體，其具有一或多個己二醇(HEG)或無鹼基糖磷酸酯作為新適體序列之兩個區段之間的連接子。圖4描繪經由使用視情況包括己二醇(HEG)或無鹼基糖磷酸酯作為連接子的分支鏈胺基磷酸酯二聚化2426-66序列。
包括β-NGF適體之醫藥組合物
本發明涵蓋包括至少一種β-NGF適體及至少一種醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。合適載劑描述於由Lippincott Williams & Wilkins出版之「Remington: The Science and Practice of Pharmacy,Twenty-first Edition」中，該文獻以引用方式併入本文中。包括至少一種β-NGF適體及至少一種醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物亦可包括一或多種不為β-NGF抑制劑之活性劑。
本文中所述之適體可以任何醫藥學上可接受之劑型使用，該劑型包括但不限於可注射劑型、液體分散液、凝膠、氣溶膠、軟膏、乳膏、凍乾調配物、乾燥散劑、錠劑、膠囊、控制釋放調配物、快速熔融調配物、延遲釋放調配物、持續釋放調配物、脈衝式釋放調配物、立即釋放及控制釋放混合調配物等。特定而言，本文中所述之適體可經調配：(a)以供選自以下任一者之投藥：經口、經肺、靜脈內、動脈內、鞘內、關節內、直腸、經眼、結腸、非經腸、腦池內、陰道內、腹膜內、局部、頰內、經鼻及表面投藥；(b)成選自以下任一者之劑型：液體分散液、凝膠、氣溶膠、軟膏、乳膏、錠劑、藥囊及膠囊；(c)成選自以下任一者之劑型：凍乾調配物、乾燥散劑、快速熔融調配物、控制釋放調配物、延遲釋放調配物、持續釋放調配物、脈衝式釋放調配物、及立即釋放與控制釋放混合調配物；或(d)其任何組合。
用於非經腸、皮內或皮下應用之溶液或懸浮液可包含一或多種以下組份：(1)無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；(2)抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；(3)抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；(4)螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；(5)緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及(5)用於調整張力之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。pH值可用諸如鹽酸或氫氧化鈉之酸或鹼來調節。非經腸製劑可裝入安瓿、拋棄式注射器或由玻璃或塑膠製成的多劑量小瓶中。
適於可注射使用之醫藥組合物可包括無菌水溶液(若水溶)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌散劑。關於靜脈內投藥，合適載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物應為無菌的且應為容易注射之流體。醫藥組合物在製造及儲存條件下應穩定且應在避免諸如細菌及真菌之微生物的污染作用下保存。如本文中所用之術語「穩定的」意謂保持適於投與患者之狀態或條件。
載劑可為溶劑或分散介質，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物。適當流動性可例如藉由利用諸如卵磷酯之塗層，在分散液之情況下藉由保持所要粒度及藉由利用界面活性劑來維持。預防微生物作用可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、諸如甘露糖醇或山梨糖醇之多元醇、及諸如氯化鈉之無機鹽。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
無菌可注射溶液可藉由將活性劑(例如β-NGF適體)以所要量併入含有一種以上列舉之成份或成份之組合的適當溶劑中，視需要隨後過濾滅菌來製備。一般而言，分散液藉由將至少一種β-NGF適體併入含有鹼性分散介質及任何其他所要成份之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，例示性製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，兩者均將自先前無菌過濾之β-NGF適體加上任何其他所要成份之溶液產生散劑。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載劑。其可封入例如明膠膠囊中或壓縮成錠劑。對於經口投與治療劑，β-NGF適體可與賦形劑合併且以錠劑、糖衣錠或膠囊形式使用。口服組合物亦可使用流體載劑來製備以作為漱口藥使用，其中流體載劑中之化合物經口施用且含漱(swish)且吐出或吞咽。可包括醫藥相容性結合劑及/或佐劑物質作為組合物之一部分。
對於藉由吸入投藥，以來自含有合適推進劑(例如，諸如二氧化碳之氣體)之加壓容器或分配器之氣溶膠噴霧、噴霧液體或來自合適裝置之乾燥粉末的形式傳遞化合物。對於經黏膜或經皮投藥，調配物中使用適於滲透過障壁之滲透劑。該等滲透劑在此項技術中通常已知且包括例如(對於經黏膜投藥)清潔劑、膽汁鹽及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜投藥可經由使用鼻用噴霧或栓劑完成。對於經皮投藥，活性劑經調配成如此項技術中通常已知的軟膏、油膏、凝膠或乳膏。對於直腸傳遞，藥劑亦可製備成栓劑(例如，用諸如可可脂及其他甘油酯之習知栓劑基劑)或保留灌腸劑形式。
在一實施例中，β-NGF適體經調配以供表面投藥。如本文中所用，「表面投藥」係指藉由將包含β-NGF適體之調配物直接或以其他方式接觸動物之全部或一部分皮膚(表皮)來向動物傳遞β-NGF適體。該術語涵蓋若干投藥途徑，包括(但不限於)表面及經皮。此等投藥模式之一般要求係有效傳遞至目標組織或層。在一態樣中，表面投藥用作滲透表皮及真皮且最終實現β-NGF適體之全身傳遞的手段。在另一態樣中，表面投藥用作選擇性傳遞β-NGF適體至動物之表皮或真皮或至其特定層之手段。
對於表面投藥，β-NGF適體可經調配成醫藥學上可接受之軟膏、乳膏、洗劑、眼用軟膏、滴眼劑、滴耳劑、浸漬敷料及氣溶膠、含藥散劑、含藥黏著劑、泡沫，且可含有適當習知添加劑或賦形劑，包括例如防腐劑或幫助藥物滲透之溶劑以及軟膏、凝膠及乳膏中之潤膚劑。該等表面調配物亦可含有相容性習知載劑，例如用於洗劑之乙醇或油醇。該等載劑可構成約1重量%至約98重量%之調配物；更通常，該等載劑將構成至多約80重量%之調配物。用於表面傳遞適體之特定調配物描述於美國專利第6,841,539號及美國公開案第20050096287號中。於表面調配物中傳遞之劑量經設計以適應連續傳遞模式。
在一實施例中，β-NGF適體用將防止自體內快速排出之載劑製備。舉例而言，可使用包括植入物及微膠囊化傳遞系統之控制釋放調配物。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之方法將為熟習此項技術者顯而易知。該等材料亦可自Alza Corporation 及Nova Pharmaceuticals,Inc購得。
脂質體懸浮液(包括靶向含有針對病毒抗原之單株抗體的受感染細胞之脂質體)亦可用作醫藥學上可接受之載劑。此等懸浮液可根據熟習此項技術者所知之方法來製備，例如如美國專利第4,522,811號中所描述。
另外，β-NGF適體之懸浮液可製備成適當油性注射懸浮液。合適親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯、三酸甘油酯或脂質體。亦可使用非脂質聚陽離子胺基聚合物傳遞。視情況，懸浮液亦可包括合適穩定劑或增加化合物之溶解性且允許製備極濃溶液之試劑。
在一些情況下，可能尤其適宜調配呈易於投與且劑量均勻的單位劑型之經口或非經腸組合物。如本文中所用之單位劑型係指適用作待治療個體之單劑量的物理個別單元；各單元含有經計算以產生所要治療作用的預定量之β-NGF適體以及所要醫藥載劑。本文中所述之β-NGF適體之單位劑型的規格由特定β-NGF適體之獨特特徵及待實現之特定治療作用及混配該種活性劑用於治療個體之技術中所固有之限制決定且直接取決於上述各者。
包含至少一種β-NGF適體之醫藥組合物可包括一或多種醫藥賦形劑。該等賦形劑之實例包括(但不限於)結合劑、填充劑、潤滑劑、懸浮劑、甜味劑、調味劑、防腐劑、緩衝劑、濕潤劑、崩解劑、起泡劑及其他賦形劑。該等賦形劑在此項技術中已知。例示性賦形劑包括：(1)結合劑，其包括各種纖維素及交聯聚乙烯吡咯啶酮、微晶纖維素(諸如PH101及PH102)、矽化微晶纖維素(ProSolv SMCCTM )、黃著膠及明膠；(2)填充劑，諸如各種澱粉、乳糖、乳糖單水合物及無水乳糖；(3)崩解劑，諸如褐藻酸、Primogel、玉米澱粉、輕度交聯聚乙烯吡咯啶酮、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉及改質澱粉、交聯羧甲纖維素鈉、交聯聚維酮、羥基乙酸澱粉鈉及其混合物；(4)潤滑劑，包括作用於待壓縮粉末之流動性的試劑，包括硬脂酸鎂、膠態二氧化矽(諸如200)、滑石、硬脂酸、硬脂酸鈣及矽膠；(5)滑動劑，諸如膠態二氧化矽；(6)防腐劑，諸如山梨酸鉀、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸及其鹽、對羥基苯甲酸之其他酯(諸如對羥基苯甲酸丁酯)、諸如乙醇或苯甲醇之醇、諸如苯酚之酚系化合物，或諸如氯化苯甲烴銨之四級銨化合物；(7)稀釋劑，諸如醫藥學上可接受之惰性填充劑，諸如微晶纖維素、乳糖、磷酸氫鈣、醣及/或任何以上各物之混合物；稀釋劑之實例包括微晶纖維素，諸如PH101及PH102；乳糖，諸如乳糖單水合物、無水乳糖及DCL21；磷酸氫鈣，諸如；甘露糖醇；澱粉；山梨糖醇；蔗糖及葡萄糖；(8)甜味劑，包括任何天然或人造甜味劑，諸如蔗糖、糖精蔗糖、木糖醇、糖精鈉、賽克拉美(cyclamate)、阿斯巴甜糖(aspartame)及安賽蜜(acesulfame)；(9)調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯、香橙味調味劑、(商標MAFCO)、泡泡糖味調味劑、水果味調味劑及其類似物；及(10)起泡劑，包括起泡偶合物，諸如有機酸及碳酸鹽或碳酸氫鹽。合適有機酸包括例如檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、反丁烯二酸、己二酸、丁二酸及褐藻酸及酸酐及酸鹽。合適碳酸鹽及碳酸氫鹽包括例如碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鎂、甘胺酸碳酸鈉、L-離胺酸碳酸鹽及精胺酸碳酸鹽。或者，可僅存在起泡偶合物之碳酸氫鈉組份。
在各個實施例中，本文中所述之調配物為實質上純的。如本文中所用，「實質上純的」意謂活性成份(β-NGF適體)為存在的主要物質(亦即以莫耳計其含量高於組合物中的任何其他個別物質)。在一實施例中，實質上純的部分為活性成份佔存在的所有巨分子物質至少約50%(以莫耳計)的組合物。一般而言，實質上純的組合物將包括大於約80%存在於組合物中的所有巨分子物質。在各個實施例中，實質上純的組合物將包括至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%存在於組合物中的所有巨分子物質。在各個實施例中，活性成份經純化以達到必需的均質性(藉由習知偵測方法在組合物中偵測不到污染物質)，其中組合物基本上由單一巨分子物質組成。
包含β-NGF適體組合物之套組
本發明提供包含本文中所述之任一β-NGF適體之套組。該等套組可包含例如(1)至少一種β-NGF適體；及(2)至少一種醫藥學上可接受之載劑，諸如溶劑或溶液。其他套組組份可視情況包括例如：(1)本文中鑑別之任一醫藥學上可接受之賦形劑，諸如穩定劑、緩衝劑等，(2)至少一種用於容納及/或混合套組組份之容器、小瓶或類似器件；及(3)傳遞器件。
治療方法
本發明提供經由使用β-NGF適體預防或治療醫學病狀(例如減輕其一或多種症狀)之方法。該等方法包含向有需要之患者投與治療有效量之β-NGF適體。所述適體亦可用於預防性療法。在一些實施例中，表面投與β-NGF適體。
治療方法中使用的β-NGF適體可為：(1)藉由本文所述之方法製備的新穎β-NGF或其醫藥學上可接受之鹽或其前藥。
個體或患者可為任何動物(家畜、牲畜或野生動物)，包括(但不限於)貓、狗、馬、豬及牛，且較佳為人類患者。如本文中所用，術語患者、個體(individual)及個體(subject)可互換使用。
如本文中所用，「治療」描述出於治療疾病、病狀或異常之目的對患者進行之管理及護理且包括向患者投與β-NGF適體以預防疾病、病狀或異常之症狀或併發症的發作；減輕疾病、病狀或異常之症狀或併發症；或消除疾病、病狀或異常之存在。更特定言之，「治療」包括逆轉、削弱、減輕、最小化、抑制或中止疾病(異常)狀況、疾病進展、疾病病原體(例如細菌或病毒)或其他異常病狀之至少一種有害症狀或作用。只要症狀及/或病理狀況緩解，則通常繼續治療。
在各個實施例中，所揭示組合物(包括表面調配物)及方法用於治療皮炎，其常表徵為皮膚之淺表性發炎或皮疹，以充血、水腫、滲出物、結痂、起鱗及(有時)水泡為特徵。瘙癢(癢感)常見於皮炎中。濕疹為常與皮炎互換使用的術語。皮炎或濕疹之實例包括例如異位性皮炎(亦稱為嬰兒濕疹或屈部濕疹)、接觸性皮炎(包括過敏性及刺激性皮炎)、乾燥性濕疹(亦稱為缺脂性濕疹、裂紋狀濕疹(craquele/craquelatum)、冬季癢或冬季瘙癢)、脫落性皮炎、手及腳皮炎、神經性皮炎(例如慢性單純性苔蘚)、脂溢性皮炎(嬰兒乳痂、頭皮屑)、盤狀濕疹(亦稱為錢幣狀濕疹、滲出性濕疹、微生物引起之濕疹)、汗皰症、靜脈性濕疹(重力性濕疹、淤積性皮炎、靜脈曲張性濕疹、淤積性皮炎)、疱疹樣皮炎(杜氏病(Duhring's Disease))、自體濕疹化(亦稱為自體過敏反應、自體敏感作用)、尾蚴性皮炎(例如游泳者之瘙癢或鴨瘙癢)、漆酚誘發之接觸性皮炎，亦稱為毒漆皮炎(toxicodendron dermatitis)及漆樹皮炎(rhus dermatitis)(例如毒橡、毒長春籐、漆樹)、日光皮炎及家庭主婦濕疹。
在一實施例中，所揭示化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥可與改善或根除瘙癢之其他治療組合投與。包括所揭示β-NGF適體之組合物可含有例如一種以上適體，例如IgE、IL-6及/或PAR2適體及β-NGF適體。在一些實例中，含有一或多種適體之β-NGF適體組合物與另一有效止癢組合物組合投與，諸如抗組織胺劑、鎮痛藥、抗膽鹼劑、非類固醇消炎藥、類固醇、抗氧化劑、維生素、白三烯調節劑、介白素拮抗劑、肥大細胞抑制劑、抗IgE抗體、選擇性血清素再吸收抑制劑、5-羥色胺受體拮抗劑、抗生素、鈣調神經磷酸酶抑制劑、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑、加巴汀(gabapentin)或納洛酮(naloxone)，其中活性成份以游離形式或醫藥學上可接受之鹽形式存在且視情況包含至少一種醫藥學上可接受之載劑以供同時、分別或依序全身或表面使用或投藥之用、或其類似物。一般而言，適用於該等組合的已知治療劑之現用劑型將合適。
「組合療法」(或「共同療法」)包括投與β-NGF適體組合物及至少一種第二藥劑作為意欲自此等治療劑之共同作用提供有益作用的特定治療方案之一部分。組合之有益作用包括(但不限於)由治療劑之組合引起的藥物動力學或藥效學共同作用。此等治療劑之組合投藥通常在限定時間內(通常為幾分鐘、幾小時、幾天或幾週，視所選組合而定)執行。
「組合療法」可但通常不欲涵蓋投與兩種或兩種以上此等治療劑作為獨立單治療方案之一部分，該等方案偶然且任意地產生本發明之組合。「組合療法」意欲涵蓋以連續方式投與此等治療劑，亦即其中各治療劑在不同時間投與，以及以實質上同時之方式投與此等治療劑或至少兩種治療劑。實質上同時投藥可例如藉由向個體投與具有固定比率之各治療劑的單劑量或以各治療劑之多次單劑量達成。
利用β-NGF適體之給藥方案係根據多種因素選擇，包括例如患者之類型、物種、年齡、體重、性別及醫學病狀；待治療病狀之嚴重性；投藥途徑；患者之腎功能及肝功能；及所用特定β-NGF適體或其鹽。一般熟練醫師或獸醫可容易確定及開出預防、對抗或阻止病狀進展所需的有效量之組合物。
一般而言，劑量(亦即治療有效量)在每天每公斤治療個體體重約1 μg至約100 mg範圍內。
功效
實例4說明各種β-NGF適體及其截短變異體抑制人類β-NGF介導之神經突生長的能力(圖5-7)及抑制由β-NGF引起的TrkA磷酸化之能力(圖8及9)。
實例5說明藉由向患病小鼠投與適體2426-66-50(SEQ ID NO: 2)，β-NGF適體降低撓抓頻率及改善臨床皮膚病狀之功效。參看圖11，可發現用適體2426-66-50處理之小鼠(●)之撓抓頻率自第14天-第28天穩定降低，相比之下，在未經處理小鼠(■)或用親水性軟膏(HO)處理之小鼠(▲)中未觀察到變化。同樣，參看圖12，可發現經4週用適體2426-66-50(SEQ ID NO: 2)處理之患病小鼠(●)的臨床皮膚病狀改善，且與撓抓頻率一樣，未經處理小鼠(■)或用HO處理之小鼠(▲)無改善。
實例
以下實例僅出於說明性目的提供且不欲限制如隨附申請專利範圍所限定之本發明範疇。本文中所述之所有實例使用已為熟習此項技術者所熟知且常用的標準技術執行。以下實例中描述的常用分子生物學技術可如諸如以下之標準實驗手冊中所述來執行：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2001)。
實例1.　適體選擇及序列
A.　製備候選混合物
如表1中所示，藉由聚合酶延長與結合生物素之ssDNA模板黏接的DNA引子來製備部分隨機化之ssDNA寡核苷酸之候選混合物。候選混合物含有40個核苷酸隨機化卡匣，其含有dATP、dGTP、dCTP及BndUTP(三磷酸5-(N-苄基甲醯胺-2'-脫氧尿苷)。
將4.8 nmol在5'端具有獨特發色團硝基疊氮基苯胺(ANA，在序列中表示為X)之引子1(SEQ ID NO:165)及4 nmol具有兩個生物素殘基(在序列中表示為B')及40個隨機化位置(A、C、G或T)(在序列中表示為N)之模板1(SEQ ID NO: 46)在100 μL 1×KOD DNA聚合酶緩衝液(Novagen)中組合，加熱至95℃歷時8分鐘，且在冰上冷卻。將100 μL引子:模板混合物添加至400 μL含有1×KOD DNA聚合酶緩衝液、0.125 U/μL KOD XLDNA聚合酶及各0.5 mM dATP、dCTP、dGTP及BndUTP之延長反應物中，且在70℃下培育30分鐘。藉由添加1 mL抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁性珠粒(MagnaBind抗生蛋白鏈菌素，Pierce，5 mg/mL，在含有0.05% TWEEN-20之3 M NaCl中)且在25℃下在混合下培育10分鐘，經由模板股生物素捕捉雙股產物。用0.75 mL SB17T緩衝液(40 mM HEPES，pH 7.5、125 mM NaCl、5 mM KCl、5 mM MgCl2 、0.05% TWEEN-20)洗滌珠粒三次。用1.2 mL 20 mM NaOH自珠粒溶離適體股，用0.3 mL 80 mM HCl中和且用15 μL 1 M HEPES(pH 7.5)緩衝。用Centricon-30濃縮候選混合物至約0.2 mL，且藉由UV吸收光譜法定量。
B.　製備目標蛋白質
藉由共價偶合NHS-PEO4-生物素(Pierce)至離胺酸殘基來使無標籤之人類β-NGF(R&D Systems)結合生物素。用Sephadex G-25 microspin管柱將蛋白質(300 pmol，在50 μL中)交換至SB17T中。添加NHS-PEO4-生物素至1.5 mM且在4℃下培育反應物16小時。用Sephadex G-25 microspin 管柱移除未反應之NHS-PEO4-生物素。
C.　固定目標蛋白質
在第1輪SELEX中，將目標蛋白質固定在MyOne-SA順磁性珠粒(MyOne SA，Invitrogen，或在下文中稱為SA珠粒)上。將β-NGF在0.5 mL SB17T中稀釋至0.2 mg/mL且添加至0.5 mL SA珠粒中(用20 mM NaOH預先洗滌兩次且用SB17T洗滌一次)。在25℃下旋轉混合物30分鐘且在4℃下儲存直至使用。
D.　使用慢解離速率增濃過程及光交聯選擇適體
用候選混合物執行選擇，對具有目標蛋白質之樣品(信號S)與不具有目標蛋白質之樣品(本底B)進行結合比較。前三輪用親和力選擇(無光交聯)來執行；第二及第三輪包括慢解離速率增濃過程。第4至9輪包括慢解離速率增濃過程及光交聯兩者。
對於各樣品，在SB17T中用10-20 pmol候選混合物(56 pmol，在第一輪中)及56 pmol反置引子製備90 μL DNA混合物。加熱樣品至95℃歷時3分鐘且以0.1C/秒之速率冷卻至37℃。將樣品與10 μL蛋白質競爭混合物(0.1% HSA、10μM酪蛋白及10 μM凝血酶原，在SB17T中)組合，添加至0.5 mg SA珠粒中且在37℃下在混合下培育5分鐘。藉由磁性分離移除珠粒。
藉由添加10 μL目標蛋白質(0.5 μM，在SB17T中)或SB17T至40 μL DNA混合物中且在37℃下培育30分鐘來執行結合反應。以三種不同方式使用慢解離速率增濃過程。在第2輪及第3輪中，藉由添加950 μL SB17T(預熱至37℃)將樣品稀釋20倍，且在37℃下培育15分鐘，隨後捕捉複合物。在第4輪及第5輪中，藉由添加950 μL SB17T(預熱至37℃)將樣品稀釋20倍，且在37℃下培育30分鐘，隨後交聯。在第6輪及第7輪中，藉由添加970 μL SB17T(預熱至37℃)將樣品稀釋20倍。將各50 μL稀釋樣品藉由轉移至含有10 mM硫酸葡聚糖(5 kDa)之950 μL SB17T(預熱至37℃)中再稀釋以得到總共400倍之稀釋，且在37℃下培育60分鐘，隨後交聯。在第8輪及第9輪中，藉由添加950 μL SB17T(預熱至37℃)將樣品稀釋20倍，且將各50 μL樣品藉由轉移至950 μL SB17T(預熱至37℃)中再稀釋以得到400倍之稀釋。最終，將各50 μL 400倍之稀釋樣品藉由轉移至含有10 mM硫酸葡聚糖(5 kDa)之950 μL SB17T(預熱至37℃)中再稀釋以得到總共8000倍之稀釋，且在37℃下培育60分鐘，隨後交聯。當使用光交聯時，用470 nm LED陣列自上方照射1 mL在慢解離速率增濃過程之後的結合反應物60秒，隨後捕捉複合物。
藉由添加0.25 mg MyOne-SA珠粒(Invitrogen)且在25℃下在混合下培育15分鐘，經由蛋白質生物素將複合物捕捉在SA珠粒上。藉由用SB17T洗滌珠粒5次移除游離DNA。除非指出，否則藉由在100 μL洗滌溶液中再懸浮珠粒，在25℃下混合30秒，用磁體分離珠粒且移除洗滌溶液來執行所有洗滌。藉由添加85 μL 20 mM NaOH且在37℃下在混合下培育1分鐘自珠粒溶離適體股。在磁性分離之後將80μL適體溶離液轉移至新試管中，用20 μL 80 mM HCl中和，且用1 μL 0.5 M Tris-HCl(pH 7.5)緩衝。
當使用光選擇時，如上捕捉複合物，且藉由用50℃之含有0.05% TWEEN-20之4 M胍-HCl洗滌珠粒一次歷時10分鐘，用25℃之20 mM NaOH洗滌一次歷時2分鐘，用SB17T洗滌兩次且用16 mM NaCl洗滌一次來移除未交聯DNA。不自珠粒表面移除交聯DNA以用於擴增步驟。
E.　適體擴增及純化
藉由QPCR擴增及定量選出的適體DNA。將48 μL DNA添加至12 μL QPCR混合物(5×KOD DNA聚合酶緩衝液、25 mM MgCl2 、10 μM前置PCR引子(引子2，SEQ ID NO: 47)、10 μM結合生物素之反置PCR引子(引子3，SEQ ID NO: 48)、5×SYBR Green I、0.125 U/μL KOD XL DNA聚合酶及各1 mM dATP、dCTP、dGTP及dTTP)中且在Bio-Rad MyIQ QPCR器具中用以下方案進行熱循環：1個循環：99.9℃，15秒，55℃，10秒，68℃，30分鐘；30個循環：99.9℃，15秒，72℃，1分鐘。用器具軟體完成定量且將具有目標蛋白質及不具有目標蛋白質之所選DNA之複本數相比較以測定信號/本底比率。
當使用光選擇時，藉由在珠粒表面上進行引子延長來製備所選DNA之cDNA複本。將經洗滌珠粒再懸浮於20 μL cDNA延長混合物(含有5 μM未結合生物素之反置PCR引子(引子4，SEQ ID NO: 169)、各0.5 mM dATP、dCTP、dGTP及dTTP，及0.125 U/μL KOD XL DNA聚合酶之引子延長緩衝液)中且在68℃下在混合下培育30分鐘。用SB17T洗滌珠粒3次，且藉由添加85 μL 20 mM NaOH且在37℃下在混合下培育1分鐘自珠粒溶離cDNA股。在磁性分離之後將80 μL適體溶離液轉移至新試管中，用20 μL 80 mM HCl中和，且用1 μL 0.5 M Tris-HCl(pH 7.5)緩衝。藉由如上所述之QPCR，用30個循環(99.9℃，15秒，72℃，1分鐘)擴增及定量cDNA。
擴增之後，經由結合生物素之反義股將PCR產物捕捉於SA珠粒上。用0.5 mL 20 mM NaOH洗滌1.25 mL SA珠粒(10 mg/mL)兩次，用0.5 mL SB17T洗滌一次，再懸浮於1.25 mL 3 M NaCl+0.05% Tween中，且在4℃下儲存。將25 μL SA珠粒(10 mg/mL，於3 M NaClT中)添加至50 μL雙股QPCR產物中且在25℃下在混合下培育5分鐘。用SB17T洗滌珠粒一次，且藉由添加200 μL 20 mM NaOH且在37℃下在混合下培育1分鐘自珠粒溶離「有義」股。棄去所溶離之股且用SB17T洗滌珠粒3次且用16 mM NaCl洗滌一次。
藉由自固定反義股之引子延長，用ANA發色團製備適體有義股。將珠粒再懸浮於20 μL引子延長反應混合物(1×引子延長緩衝液、1.5 mM MgCl2 、5 μM具有5' ANA發色團之前置引子(引子1，SEQ ID NO:165)、各0.5 mM dATP、dCTP、dGTP及BndUTP、及0.125 U/μL KOD XL DNA聚合酶)中且在68℃下在混合下培育30分鐘。用SB17T洗滌珠粒3次，且藉由添加85 μL 20 mM NaOH且在37℃下在混合下培育1分鐘自珠粒溶離適體股。在磁性分離之後將80 μL適體溶離液轉移至新試管中，用20 μL 80 mM HCl中和，且用5 μL 0.1 M HEPES(pH 7.5)緩衝。
F.　選擇嚴格性及反饋
選擇步驟之相對目標蛋白質濃度在每一輪中響應於如下之S/B比率而降低，其中信號S及本底B在上文部分D中定義：若S/B<10，則[P]( i +1) =[P] i 若10S/B<100，則[P]( i +1) =[P] i /3.2若S/B100，則[P]( i +1) =[P] i /10其中[P]=蛋白質濃度且i =當前輪數。
在每一輪選擇之後，測定增濃DNA混合物之融合狀況。用含有1×SYBR Green I之4 mM MgCl2 將10 μL雙股QPCR產物稀釋至200 μL。用75 μL矽油覆蓋樣品且使用量測雙股寡核苷酸之複合混合物的雜交時間之C0 t分析來分析融合情況。用以下方案來熱循環樣品：3個循環：98℃，1分鐘，85℃，1分鐘；1個循環：93℃，1分鐘，85℃，15分鐘。在85℃下15分鐘期間，每間隔5秒量測螢光影像。繪出螢光強度隨對數(時間)變化之曲線，且觀察到每一輪SELEX雜交率增長，指示序列融合。
G.　純系篩選過程&適體鑑別
選殖在9輪SELEX之後的融合池且為其測序。用未結合生物素之SELEX引子PCR擴增選出的DNA以產生AGCT DNA，使用QIAquick 96 PCR純化套組(目錄號28181)純化，且使用Stratagene PCR-Script選殖套組(目錄號211189)根據製造商方案選殖經純化的插入物。將接合SELEX池送至測序供應商(Cogenics,Houston,Texas)以進行轉型，排列至96孔板中，進行DNA製備且測序。獲得約42個純系之序列且使用測定序列計數/複本數之定製軟體來分析其融合情況且使用局部比對演算法鑑別共同融合模式。將池中具有最高表示/複本數之序列及融合至共同結合基元之序列選出用於下游篩選。選出6個序列用於進一步分析且使用自Cogenics獲得之質體DNA作為PCR擴增之模板來以酶促方式製備。
H.　量測平衡結合常數(K d )
在親和力檢定中量測6個選出序列之平衡結合常數。在95℃下，於SB17T-0.002(含有TWEEN-20之SB17T，降低至0.002%)中加熱放射性標記的DNA3分鐘且緩慢冷卻至37℃。藉由將低濃度放射性標記的DNA(約1×10-11 M)與一定濃度範圍之目標蛋白質(1×10-7 M至1×10-12 M)於SB17T-0.002中混合且在37℃下培育30分鐘來形成複合物。將一部分各反應物轉移至耐綸膜上且乾燥以測定各反應物中之總計數。複合物捕捉於ZORBAX樹脂(Agilent)上，使其在真空下通過MultiScreen HV板(Millipore)且用200 μL SB17T-0.002緩衝液洗滌以將蛋白質結合複合物與未結合之DNA分離。使耐綸膜及MultiScreen HV板磷光成像且使用FUJI FLA-3000定量各樣品中之放射性含量。繪出捕捉到的DNA之分率隨蛋白質濃度(Pt )而變之曲線且使用y=(max-min)(Pt )/(Kd +Pt )+min測定平衡結合常數(Kd )。選出純系2426-66(SEQ ID NO: 1，列於表3中)(Kd =5×10-9 M之76聚體)作為引導純系以用於進一步表徵，參見圖1。
I. SELEX池之深度測序
為了更完全地評估2426-66適體家族內之序列，使用454焦磷酸測序技術對增濃池測序。用如上所述之454引子擴增DNA池且使用Sequal校正板(Invitrogen，目錄號A10510-01)純化及校正PCR產物。使溶離液在凝膠上跑膠以確認各擴增子之尺寸及純度。在位於Aurora CO之University of Colorado Health Science Center之454焦磷酸測序設施上對純化PCR產物測序。
藉由CLUSTAL分析將454序列與2426-66比對。總共1165多複本序列中，165序列具有與2426-66類似之模式。基於在此等序列中之5'序列共同性，將其比對至三個組。在所有三個組中序列之中間區域保留。對於所有序列，如圖2B中所列計算在每個位置與2426-66之一致性百分比。表2列出2426-66適體家族序列的許多代表性序列，其中Z'表示BndU。
基於此，如上所述，結合至β-NGF之共同序列經測定為以下序列：
其中B、Z、R及S如上文所定義。儘管共同序列之長度為28個核苷酸，但表2中列出之許多序列在此共同序列中具有單鹼基插入物。圖2B顯示約91%序列在位置12處具有缺失，但約7%序列在此位置具有G或Z，且約95%在位置19處具有缺失，但約3%在此位置具有G。此觀察結果表明在β-NGF共同序列(SEQ ID NO: 3)中在一些位置處容許存在插入物且此等插入物不會使β-NGF適體失活。
實例2.　序列截短研究
β-NGF適體2426-66(SEQ ID NO: 1)之長度為76個核苷酸，Kd =5×10-9 M。對於最有效之化學合成，重要的是鑑別最短的高親和力適體序列及將適體截短至可能的最小尺寸。其他優點為組織滲透性及活體內對核酸酶活性之穩定性提高。
為了鑑別適體2426-66(SEQ ID NO: 1)中保留結合親和力的最小區域，合成一系列截短變異體，其代表2426-66中可能存在的所有鄰接50個核苷酸長度之序列。變異體序列列於表3中，其中Z'表示BndU且T表示dT。在如上所述之親和力結合檢定中測試變異體對β-NGF之親和力。
除變異體2426-66-2(SEQ ID NO: 4)、2426-66-3(SEQ ID NO: 5)、2426-66-4(SEQ ID NO: 6)、2426-66-5(SEQ ID NO: 7)及2426-66-6(SEQ ID NO: 8)之外，所有變異體均保留β-NGF結合活性，表明2426-66之5'端26個核苷酸(位置1-26)及3'端21個核苷酸(位置56-76)不為結合β-NGF所需，且其餘29個核苷酸要素(位置27-55)中之全部或部分可能足夠。此假設係藉由合成第二系列之變異體2426-66(SEQ ID NO: 1)並量測其結合親和力來驗證。變異體序列列於表4中，其中Z'表示BndU且T表示dT。除變異體2426-66-56(SEQ ID NO: 150)、2426-66-57(SEQ ID NO: 151)、2426-66-58(SEQ ID NO: 152)及2426-66-59(SEQ ID NO: 153)之外，所有變異體均保留β-NGF結合活性。變異體2426-66-55(SEQ ID NO: 149)(一種25聚體)為β-NGF結合親和力等於全長適體2426-66(SEQ ID NO: 1)的最短序列。變異體2426-66-54(SEQ ID NO: 44)(一種26聚體)之β-NGF親和力略高於全長適體2426-66(SEQ ID NO: 1)且被選出以作進一步優化。
實例3.　測定所要BndU位置
26聚體BndU單取代為dT
適體2426-66-54(SEQ ID NO: 44)之26個核苷酸中有9個為BndU。為了確定哪些BndU位置涉及結合，合成2426-66-54之9種變異體，每一變異體在9個BndU位置之一者處含有單dT取代，且量測β-NGF親和力。變異體序列列於表5中，其中Z'表示BndU且T表示dT。
在位置9(變異體2426-66-68，SEQ ID NO: 158)及位置16(變異體2426-66-71，SEQ ID NO: 161)處用dT取代BndU展示與未經取代之(所有BndU)適體2426-66-54(SEQ ID NO: 44)相比無β-NGF親和力損失。在位置1(變異體2426-66-66，SEQ ID NO: 156)、位置8(變異體2426-66-67，SEQ ID NO: 157)及位置14(2426-66-69，SEQ ID NO: 159)處用dT取代BndU展示部分親和力損失，且在位置15(2426-66-70，SEQ ID NO: 160)、位置22(2426-66-72，SEQ ID NO: 162)、位置23(2426-66-73，SEQ ID NO: 163)及位置25(2426-66-74，SEQ ID NO: 164)處之取代展示完全親和力損失。此等結果表明在位置1、8、14、15、22、23及25處之經修飾之尿苷殘基為最大β-NGF結合親和力所需。
合成在位置9及16處之BndU殘基經dT置換的2426-66(SEQ ID NO: 1)之截短變異體且測試其對β-NGF之親和力。序列列於表6中，其中Z'表示BndU且T表示dT。三種變異體中任一者在兩個位置處用dT取代BndU展示與未經取代之對照相比無親和力損失。
基於概括於圖2A中之此等結果，結合至β-NGF之共同序列(SEQ ID NO:3)如下經修飾以反映在兩個位置處dT取代BndU之能力：
其中Z、R、S、Z及W如上文所定義。
實例4.　細胞檢定
在兩個活體外細胞檢定中針對β-NGF活性抑制來篩選β-NGF適體2426-66(SEQ ID NO: 1)及2426-66之截短變異體。PC12細胞(來自ATCC之CRL-1721)(一種來自大鼠嗜鉻細胞瘤及神經元分化模型之癌細胞株)回應於β-NGF誘導神經元表現型。此反應之兩個表現為膜結合之TrkA磷酸化及神經突延長。測試適體抑制PC12細胞之β-NGF刺激之TrkA磷酸化及神經突生長的能力。
神經突生長檢定
將PC12細胞零星塗於60 mm盤中且使其附著於該板隔夜。附著之後，正常生長培養基更換為低血清培養基(LSM)，此係由於PC12細胞在正常高血清生長培養基中不分化之故。將β-NGF(100 ng/mL)及適體(100 nM)預混入LSM中且使其平衡1小時，接著添加至板中達到10 ng/mL β-NGF(0.38 nM)及10 nM適體之最終濃度。培育細胞三天，且在第3天如前所述更換培養基、β-NGF及適體。在第5天，用位相差顯微鏡捕捉細胞影像且使用ImageJ之NeuronJ plugin(NIH程式)量測神經突長度。計算神經突長度/細胞且針對無適體對照樣品之100值來校正(相對於神經突生長)。
在神經突生長檢定中測試適體抑制PC12細胞之人類β-NGF誘發之分化的能力。合成在3'端具有反向dT醯胺(3'-idT)之適體以提供對存在於培養基中的3'-5'外切核酸酶之抗性(參見圖5)。
適體2426-66(SEQ ID NO: 1)及截短變異體2426-66-50(SEQ ID NO: 2)有效地抑制由β-NGF誘發的神經突生長。變異體2426-66-53(SEQ ID NO: 43)、2426-66-54(SEQ ID NO: 44)及2426-66-55(SEQ ID NO: 149)抑制β-NGF介導之神經突生長之有效性低於2426-66-50，表明28個核苷酸之最小適體長度為最大抑制所需。變異體2426-66-75(SEQ ID NO:166)(其中2426-66-50在位置11及18處之BndU殘基經dT殘基置換)亦不能有效阻斷β-NGF介導之神經突生長。變異體2426-66-3(SEQ ID NO:5)(一種對β-NGF具有弱親和力之50聚體)展示幾乎不抑制β-NGF介導之神經突生長。
藉由在0.5 nM至8.0 nM範圍內之適體濃度下量測相對神經突生長來測定適體抑制β-NGF介導之神經突生長的有效性且使用非線性曲線擬合(具有可變斜率之S形劑量反應)計算一半最大抑制濃度(IC50 )(參見圖6)。在此檢定中，適體2426-66(SEQ ID NO:1)之IC50 =2×10-9 M，且截短變異體2426-66-50(SEQ ID NO:2)之IC50 =1×10-9 M。
在神經突生長檢定中測試適體2426-66(SEQ ID NO:1)及截短變異體2426-66-50(SEQ ID NO:2)及2426-66-53(SEQ ID NO:43)對小鼠β-NGF及大鼠β-NGF的抑制。所有三種適體抑制小鼠β-NGF之有效性類似於抑制人類β-NGF之有效性，且抑制大鼠β-NGF之有效性較低(參見圖7)。
TrkA磷酸化檢定
β-NGF結合至PC12細胞表面上的TrkA受體，誘發受體二聚化及自體磷酸化。TrkA磷酸化檢定檢驗在用已經適體預平衡之β-NGF處理之後10分鐘TrkA之磷酸化狀況。儘管神經突生長檢定為最終檢定，但考慮到β-NGF刺激之終點，TrkA磷酸化檢定簡單反映緊接於β-NGF刺激之後的信號傳導事件。
在100 mm板上接種PC12細胞且使其附著隔夜。附著之後，將培養基更換為LSM。將細胞留在LSM中隔夜，且接著用單獨的β-NGF(10 ng/mL最終濃度或0.38 nM)、具有TrkA磷酸化抑制劑K252a之β-NGF(0.2 μM)及在10 nM最終濃度下用適體預平衡之β-NGF處理10分鐘。收集細胞，溶解，且用全Trk抗體(TrkA為在PC12細胞中表現的唯一Trk受體)使TrkA自澄清溶解產物中免疫沈澱。使免疫沈澱物在SDS-PAGE凝膠上跑膠，電點漬於PVDF膜上，且用磷酸酪胺酸抗體探測以定量磷酸化TrkA之量。剝離墨點且用TrkA抗體探測以定量全部TrkA之量。計算各樣品之TrkA磷酸化百分比(磷酸化TrkA/全部TrkA之比率)且針對無適體對照之100值來校正。結果展示於圖8中。
測試適體2424-66(SEQ ID NO: 1)及截短變異體2426-66-50(SEQ ID NO: 2)及2426-66-3(SEQ ID NO: 5)對人類β-NGF誘發之TrkA磷酸化的抑制。適體2426-66及截短變異體2426-66-50有效地抑制由β-NGF誘發的TrkA受體之磷酸化。變異體2426-66-3(一種對β-NGF具有弱親和力之50聚體)展示幾乎不抑制由β-NGF誘發的TrkA磷酸化。
在TrkA磷酸化檢定中測試變異體2426-66-50(SEQ ID NO: 2)對小鼠β-NGF及大鼠β-NGF之抑制。結果展示於圖9中。變異體2426-66-50有效地抑制小鼠β-NGF及大鼠β-NGF誘發的TrkA磷酸化。
實例5.　在小鼠模型系統中異位性皮炎之β-NGF適體治療
在非無菌(習知)環境下飼養之近親繁殖的NC/NgaTnd小鼠自發地發展類似於人類之異位性皮炎病變的皮膚病變且為用於研究異位性皮炎之治療而建立的模型(Matsuda等人，Int. Immunol.9 :461,1997)。以下研究經設計以評估NGF中和適體減輕或消除此小鼠模型中活體內異位性皮炎之臨床表現的能力。
將NC/NgaTnd小鼠維持在20-26℃下之空氣不受控制之習知環境下，採用12小時白天/黑夜循環，且不限量給與標準食物及水。此研究中使用顯現輕度皮膚病變(疾病表型)的8-10週齡之小鼠。NC/NgaTnd小鼠保持在無特定病原體(SPF)條件下且不顯現異位性皮炎之臨床徵象或症狀(無疾病表型)之小鼠用作對照。
根據日本藥典(Japanese Pharmacopoeia)(25%白凡士林(white petrolatum)、20%硬脂醇、12%丙二醇、4%聚氧乙烯氫化蓖麻油60、1%單硬脂酸甘油酯、0.1%對羥基苯甲酸甲酯、0.1%對羥基苯甲酸丙酯)製備親水性軟膏(HO)。藉由將20 g HO於85℃之水浴中熔融，添加20 g 2%適體水溶液，且於冰冷水浴中混合直至冷卻來將適體製備於HO中。
將小鼠分成四組。第1組含有7個患有皮炎但未經處理的小鼠。第2組含有7個患有皮炎且經HO處理的小鼠。第3組含有7個患有皮炎，經具有3'-idT(1% w/v，於HO中)之適體2426-66-50(SEQ ID NO : 2)處理的小鼠。第4組含有7個未經處理之正常SPF小鼠。藉由每日一次歷時4週向患病背部區域施用100 mg樣品處理第2組及第3組之小鼠。每週一次，歷時4週(第0、7、14、21、28天)，定量小鼠之撓抓行為及臨床皮膚病狀分數。
使用SCLABA-Real系統(Scratch Counting for LABoratory Animals,Noveltec Inc.,Kobe,Japan)(Hattori等人，J. Immunol.184 :2729,2010)定量自發性撓抓行為。在量測之前30分鐘將小鼠置於SCLABA器具中以使其適應新環境，且在觀察室中計數1小時之撓抓次數。將以伸出後爪至頭部、面部或背部開始且以收回爪結束的一系列撓抓行為計數為一次撓抓。
根據Matsuda等人，Int. Immunol.9 :461,1997中描述之準則確定臨床皮膚病狀分數。觀察項目為1)瘙癢/癢感，2)紅斑/出血，3)水腫，4)表皮脫落/糜爛，及5)起鱗/乾燥。各觀察項目之分數分為以下等級：0(沒有)，1(輕度)，2(中度)及3(重度)。臨床皮膚病狀分數為5個觀察項目分數之總和。
圖11說明各處理組在撓抓頻率上之變化，用標準誤差條繪出平均值。在第3組(適體處理)中自第14天開始至第28天撓抓頻率穩定降低，但第1組(無處理)及第2組(HO處理)經28天展示頻率無變化。第4組(正常SPF小鼠)之撓抓頻率極低(數據未圖示)。圖12說明各處理組在臨床皮膚病狀分數方面之變化，用標準誤差條繪出平均值。第3組(適體處理)皮膚病狀分數自第14天開始至第28天穩定降低，但第1組(無處理)及第2組(HO處理)經28天展示無變化。第4組(正常SPF小鼠)之皮膚病狀分數極低(數據未圖示)。
以上實施例及實例僅欲作為實例。特定實施例、實例、或特定實施例或實例之要素均不應視為任一請求項之關鍵、必需或基本要素或特徵。此外，除非明確地描述為「基本」或「關鍵」，否則本文中所述之要素均不為隨附申請專利範圍之實踐所必需的。可在不偏離由隨附申請專利範圍限定之本發明範疇之情況下對所揭示實施例作出各種更改、修改、替換及其他改變。包括圖式及實例之說明書被視為說明性，而非限制性，且所有該等修改及替代均欲包括在本發明範疇內。因此，本發明範疇應由隨附申請專利範圍及其法定相等物決定，而非由上文給出之實例決定。舉例而言，在申請專利範圍之任一方法或過程項中所述之步驟可以任何可行的次序執行且不限於任一實施例、實例或申請專利範圍中提出之次序。
圖1說明適體2426-66(■)(SEQ ID NO: 1)與隨機文庫(○)相比之結合曲線；
圖2A及2B描繪使用454測序鑑別之適體2426-66(SEQ ID NO: 1)的適體共同序列；
圖3說明β-NGF適體之二聚策略1；
圖4說明β-NGF適體之二聚策略2；
圖5圖解說明各種適體抑制PC12細胞之人類β-NGF誘發之分化的能力，如在實例4中所述之神經突生長檢定中所測試；
圖6圖解說明適體2426-66(■)(SEQ ID NO: 1)及其截短變異體2426-66-50(○)(SEQ ID NO: 2)對β-NGF介導之神經突生長之抑制隨適體濃度的變化，如實例4中所述量測；
圖7圖解說明適體2426-66(SEQ ID NO: 1)及截短變異體2426-66-50(SEQ ID NO: 2)及2426-66-53(SEQ ID NO: 43)對人類β-NGF、小鼠β-NGF及大鼠β-NGF介導之神經突生長之抑制。所有三種適體抑制小鼠β-NGF之有效性類似於抑制人類β-NGF之有效性，而抑制大鼠β-NGF之有效性較低；
圖8圖解說明使用適體2426-66(SEQ ID NO: 1)及截短變異體2426-66-50(SEQ ID NO: 2)及2426-66-3(SEQ ID NO: 5)的TrkA磷酸化檢定結果；
圖9圖解說明使用小鼠及大鼠β-NGF對截短適體2426-66-50(SEQ ID NO: 2)之TrkA磷酸化檢定；
圖10描繪用於製備本文中所述之適體的C-5嘧啶修飾；
圖11圖解說明經4週用適體2426-66-50(SEQ ID NO: 2)處理的患病小鼠(●)的撓抓頻率降低，但未經處理小鼠(■)或用親水性軟膏(HO)處理之小鼠(▲)之撓抓頻率不降低，如實例5中所述。在SOMAmer處理與無處理(*)之間或在SOMAmer處理與HO處理(#)之間觀察到統計學顯著差異(p<0.05)，如由t檢驗所測定；及
圖12圖解說明經4週用適體2426-66-50(SEQ ID NO: 2)處理的患病小鼠(●)的臨床皮膚病狀分數降低，但未經處理小鼠(■)或用HO處理之小鼠(▲)的臨床皮膚病狀分數不降低，如實例5中所述。在SOMAmer處理與無處理(*)之間或在SOMAmer處理與HO處理(#)之間觀察到統計學顯著差異(p<0.05)，如由t檢驗所測定。
<110> 美商身體邏輯股份有限公司(SomaLogic,Inc.)
<120> 針對β-NGF之適體與彼等在治療涉及β-NGF之疾病及異常之用途
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<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<400> 162
<210> 163
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<400> 163
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<400> 164
<210> 165
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 165
<210> 166
<211> 28
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<400> 166
<210> 167
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(24)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<400> 167
<210> 168
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷
<400> 168
<210> 169
<211> 28
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 169

Claims (27)

  1. 一種適體，其由以下序列所組成：BAZGRGGRSN (0-1) ZZGGGGN (0-1) ZZZADCCGZZRZG(SEQ ID NO：155)其中B係選自C、G或Z；R獨立地選自A或G；S係選自C或G；D係選自A、G或Z；N獨立地選自任何天然產生或經修飾之核苷酸；及Z為經修飾之嘧啶。
  2. 一種適體，其由以下序列所組成：BAZGRGGRSZZGGGGZZZADCCGZZRZG(SEQ.ID.NO：3)其中B係選自C、G或Z；R獨立地選自A或G；S係選自C或G；D係選自A、G或Z；及Z為經修飾之嘧啶。
  3. 如請求項1或2之適體，其中該適體結合至β-NGF。
  4. 如請求項3之適體，其中該適體抑制β-NGF之功能。
  5. 如請求項3之適體，其中該適體具有調節β-NGF與其一或多個細胞受體之結合的能力。
  6. 如請求項5之適體，其中該細胞受體係選自p75或TrkA。
  7. 如請求項4之適體，其中該適體對β-NGF之Kd 為30nM或小於30nM。
  8. 如請求項1或2之適體，其中該經修飾之嘧啶為C-5修飾之嘧啶。
  9. 如請求項8之適體，其中該C-5修飾之嘧啶係選自由以下組成之群：5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(BndU)、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(iBudU)、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(TrpdU)及5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(NapdU)。
  10. 如請求項8之適體，其中該C-5修飾之嘧啶為5-(N-苄基甲醯胺)-2'-脫氧尿苷(BndU)。
  11. 一種結合至β-NGF之適體，其包含選自由SEQ ID NOS：1、2、9-44及149組成之群的序列。
  12. 如請求項11之適體，其中該適體抑制β-NGF之功能。
  13. 如請求項11之適體，其中該適體具有調節β-NGF與其一或多個細胞受體之結合的能力。
  14. 如請求項13之適體，其中該細胞受體係選自p75或TrkA。
  15. 如請求項14之適體，其中該序列為具有至少約95%一致性者。
  16. 如請求項1之適體，其中該適體為包含兩種組份之二聚體，且其中該兩種組份連接。
  17. 如請求項16之適體，其中該兩種組份係由烴連接基團連接。
  18. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至17中任一項之適體或其醫藥學上可接受之鹽或其片段、及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  19. 如請求項18之醫藥組合物，其進一步包含稀釋劑、抗微生物劑、結合劑、填充劑、濕潤劑、懸浮劑、潤膚劑及乳化劑。
  20. 如請求項18或19之醫藥組合物，其中該醫藥組合物為選自由以下組成之群的表面調配物：乳膏、洗劑、軟膏、凝膠、浸漬敷料、氣溶膠、含藥散劑、含藥黏著劑及泡沫。
  21. 如請求項1、2及11至17中任一項之適體，其係用於治療、預防或緩解由β-NGF介導之疾病的方法者。
  22. 如請求項21之適體，其係用於治療、預防或緩解由β-NGF介導之疾病的方法者，其中該β-NGF介導之疾病或病狀為β-NGF活性可在疾病過程之某一階段直接或間接引起瘙癢之疾病或病狀。
  23. 如請求項21之適體，其係用於治療、預防或緩解由β-NGF介導之疾病的方法者，其中該疾病或病狀為皮炎或濕疹。
  24. 如請求項21之適體，其係用於治療、預防或緩解由β-NGF介導之疾病的方法者，其中該皮炎為異位性皮炎。
  25. 如請求項21之適體，其係用於治療、預防或緩解由β-NGF介導之疾病的方法者，其中該方法包含對一投藥對象以該適體之藥學上有效量表面投與該適體。
  26. 如請求項21之適體，其係用於治療、預防或緩解由β-NGF介導之疾病的方法者，其中該方法包含以每天每公斤體重投與約1μg至約100mg之劑量投與該適體。
  27. 如請求項22之適體，其係用於治療、預防或緩解由β- NGF介導之疾病的方法者，其中該方法包含將該適體與用於治療瘙癢之另一藥劑組合投與。
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