ES2912033T3 - Aptámeros y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un método de caracterización de un fenotipo de una muestra que contiene microvesículas que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un grupo de diferentes aptámeros enriquecidos para dirigir a una o más microvesículas; (b) retirar los aptámeros no unidos; (c) eluir los aptámeros unidos; y (d) identificar los aptámeros que se eluyen, mediante secuenciación, y en la que (i) la presencia y el número de copias de los aptámeros identificados se usa para caracterizar el fenotipo; (ii) no es necesario conocer la diana precisa de los diferentes aptámeros; y, (iii) el fenotipo es cáncer

Description

DESCRIPCIÓN
Aptámeros y usos de los mismos
Antecedentes de la invención
La invención se refiere en general al campo de los aptámeros capaces de unirse a antígenos de superficie de microvesículas, que son útiles como agentes terapéuticos y de diagnóstico de cáncer y/u otras enfermedades o trastornos en los que están implicadas las microvesículas. La invención se refiere además a materiales y métodos para la administración de aptámeros capaces de unirse a microvesículas. Las microvesículas pueden derivar de células indicativas de cáncer.
Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico que tienen una afinidad de unión específica a las moléculas a través de interacciones distintas del clásico apareamiento de bases de Watson-Crick.
Los aptámeros, como los péptidos generados por expresión de fagos o anticuerpos monoclonales ("mAb"), son capaces de unirse específicamente a dianas seleccionadas y modular la actividad de la diana, por ejemplo, mediante la unión de aptámeros se puede bloquear la capacidad de funcionamiento de su diana. Creados mediante un procedimiento de selección in vitro a partir de grupos de oligonucleótidos de secuencia aleatoria, se han generado aptámeros para más de 100 proteínas, incluidos factores de crecimiento, factores de transcripción, enzimas, inmunoglobulinas y receptores. Un aptámero típico tiene un tamaño de 10-15 kDa (30-45 nucleótidos), se une a su diana con afinidad subnanomolar y discrimina dianas estrechamente relacionadas (por ejemplo, los aptámeros por lo general no se unirán a otras proteínas de la misma familia de genes). Una serie de estudios estructurales han demostrado que los aptámeros son capaces de usar los mismos tipos de interacciones de unión (por ejemplo, enlaces de hidrógeno, complementariedad electrostática, contactos hidrófobos, exclusión estérica) que impulsan la afinidad y la especificidad en los complejos anticuerpo-antígeno.
Los aptámeros tienen un número de características deseables para su uso como agentes terapéuticos y de diagnóstico que incluyen alta especificidad y afinidad, eficacia biológica y excelentes propiedades farmacocinéticas. Además, ofrecen ventajas competitivas específicas frente a los anticuerpos y otras biologías de las proteínas, por ejemplo:
Velocidad y control. Los aptámeros se producen mediante un procedimiento totalmente in vitro, lo que permite la rápida generación de pistas iniciales, incluidas las pistas terapéuticas. La selección in vitro permite que la especificidad y la afinidad del aptámero estén estrictamente controladas y permite la generación de pistas, incluidas las pistas frente a dianas tanto tóxicas como no inmunogénicas.
Toxicidad e inmunogenicidad. Los aptámeros como clase han demostrado poca o ninguna toxicidad o inmunogenicidad. En la dosificación crónica de ratas o marmotas con altos niveles de aptámero (10 mg/kg diarios, durante 90 días), no se observa toxicidad por ninguna medida clínica, celular o bioquímica. Mientras que la eficacia de muchos anticuerpos monoclonales puede verse gravemente limitada por la respuesta inmunitaria a los anticuerpos mismos, es extremadamente difícil obtener anticuerpos contra los aptámeros, muy probablemente porque las células T no pueden presentar los aptámeros a través del MHC y la respuesta inmunitaria generalmente está entrenada para no reconocer fragmentos de ácido nucleico.
Administración. Mientras que la mayoría de los agentes terapéuticos de anticuerpos aprobados actualmente se administran mediante infusión intravenosa (por lo general, durante 2-4 horas), los aptámeros se pueden administrar mediante inyección subcutánea (la biodisponibilidad de los aptámeros mediante administración subcutánea es >80 % en estudios con monos (Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)). Esta diferencia se debe principalmente a la solubilidad comparativamente baja y, de este modo, a los grandes volúmenes necesarios para la mayoría de los mAb terapéuticos. Con una buena solubilidad (>150 mg/mL) y un peso molecular comparativamente bajo (aptámero: 10-50 kDa; anticuerpo: 150 kDa), se puede administrar una dosis semanal de aptámero mediante inyección en un volumen inferior a 0.5 mL. Además, el pequeño tamaño de los aptámeros les permite penetrar en áreas de constricciones conformacionales que no permiten la penetración de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, lo que presenta otra ventaja más de la profilaxis o los agentes terapéuticos basados en aptámeros.
Escalabilidad y coste. Los aptámeros se sintetizan químicamente y se escalan fácilmente según sea necesario para satisfacer la demanda de producción para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Mientras que las dificultades para escalar la producción actualmente limitan la disponibilidad de algunos productos biológicos y el coste de capital de una planta de producción de proteínas a gran escala es enorme, un solo sintetizador de oligonucleótidos a gran escala puede producir más de 100 kg/año y requiere una inversión inicial relativamente modesta. El coste actual de los bienes para la síntesis de aptámeros a escala de kilogramos se estima en $100/g, comparable al de los anticuerpos altamente optimizados.
Estabilidad. Los aptámeros son químicamente robustos. Están intrínsecamente adaptados para recuperar la actividad después de la exposición a factores tales como el calor y los desnaturalizantes y se puede almacenar, durante períodos prolongados (>1 año) a temperatura ambiente como polvos liofilizados. El documento WO 2011/109440 A1 describe aptámeros que pueden reconocer biomarcadores conocidos en las membranas de microvesículas. El documento WO 2009/100029 A1 describe el diagnóstico de cáncer usando biomarcadores conocidos en la membrana de microvesículas de sujetos. El documento WO 2011/031892 A1 describe el uso, inter alia, de aptámeros con una diana conocida para identificar microvesículas de sujetos con mutaciones K- Ras. Disease Specific Biomarker Discovery by Aptamers (Henning Ulrich et al, Cytometry Part A, Volume 75, no. 9, pages 727-733, 1 September 2009) describe el uso de citometría de flujo para identificar aptámeros que se pueden unir preferentemente a antígenos de superficie en microvesículas de sujetos enfermos sobre sujetos sanos.
Sumario de la invención
La invención proporciona, como se especifica en las reivindicaciones, un método de caracterización de un fenotipo de una muestra que contiene microvesículas que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un grupo de diferentes aptámeros enriquecidos para dirigir a una o más microvesículas; (b) retirar los aptámeros no unidos; (c) eluir los aptámeros unidos; e identificar los aptámeros que se eluyen, mediante secuenciación, y en el que (i) se usa la presencia y el número de copias de los aptámeros identificados para caracterizar el fenotipo; (ii) no es necesario conocer la diana precisa de los diferentes aptámeros; y, (iii) el fenotipo es cáncer. Características adicionales de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes. El tema descrito en este documento pero no cubierto por las reivindicaciones puede ser útil para comprender la invención. Los métodos de la invención proporcionan aptámeros que se unen a biomarcadores de interés tales como antígenos de superficie de microvesículas o fragmentos funcionales de antígenos de superficie de microvesículas. En diversas realizaciones, los aptámeros se usan en procedimientos de diagnóstico, pronóstico o teranóstico para cribar una muestra biológica en busca de la presencia o niveles de antígenos de superficie de microvesícula determinados para proporcionar una lectura de diagnóstico, pronóstico o teranóstico. El diagnóstico, pronóstico o teranosis puede estar relacionado con el cáncer. La invención también proporciona métodos para facilitar el cribado de bibliotecas de aptámeros y métodos de detección de aptámeros.
Los aptámeros útiles para la realización de la invención incluyen un aptámero que se une a una microvesícula, que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento homóloga de cualquiera de: a) SEQ ID NOs. 230900-230903, 230908, 230913-230927 o una secuencia variable de cualquier secuencia anterior como se describe en la tabla 18; o b) un fragmento funcional de cualquier secuencia precedente. El aptámero puede comprender cualquiera de las SEQ ID NOs. 230900-230903, 230908, 230913-230927, o un fragmento funcional de las mismas. El fragmento funcional puede comprender cualquier fragmento que conserve la capacidad de unirse a la diana del aptámero, incluyendo, sin limitación, una región de "secuencia variable” como se indica en la tabla 18. La microvesícula se puede desprender de una célula de cáncer de próstata.
Los aptámeros útiles para la realización de la invención incluyen un aptámero que se une a una microvesícula, que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento homóloga de cualquiera de: a) SEQ ID NOs. 231018-231031 o una secuencia variable de los mismos como se describe en la tabla 23; b) SEQ ID NOs. 231032-231051 o una secuencia variable de los mismos como se describe en la tabla 24; c) SEQ ID NOs. 231032-241535; o d) un fragmento funcional de cualquier secuencia precedente. El aptámero puede comprender cualquiera de las SEQ ID NOs. 231018-231031, o un fragmento funcional del mismo. El aptámero también puede comprender cualquiera de las SEQ ID NOs. 231032-231051, o un fragmento funcional del mismo. El fragmento funcional puede comprender cualquier fragmento que retenga la capacidad de unirse a la diana del aptámero, incluyendo, sin limitación, una región de "secuencia variable “como se indica en cualquiera de las tablas 23-24. La microvesícula se puede desprender de una célula de cáncer de mama.
Los aptámeros útiles para la realización de la invención incluyen un aptámero que se une a una proteína de molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento homóloga de cualquiera de: a) SEQ ID NOs. 1-230810; b) SEQ ID NOs. 230822-230899, 230904-230907, 230909-230911 o una secuencia variable de cualquiera de los mismos como se describe en las tablas 11, 12, 13, 15; o c) un fragmento funcional de cualquier secuencia precedente. El aptámero puede comprender cualquiera de aptámero 4 (SEQ ID NO. 1), Oligo6 (Se Q ID NO. 230810), Oligo4B (SEQ ID NO. 183132), CAR003 (SEQ ID NO. 230822 o SEQ ID NO. 230823), CAR016 (SEQ ID NO. 230840), o un fragmento funcional del mismo. El aptámero puede ser de cualquiera de las tablas 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 15, 16 o un fragmento funcional del mismo. El fragmento funcional puede comprender cualquier fragmento que retenga la capacidad de unirse a la diana del aptámero, incluyendo, sin limitación, una región de "secuencia variable” como se indica en cualquiera de las tablas 11, 12, 13, 15, o un fragmento funcional de la misma. El aptámero puede tener la capacidad de modular la transducción de señales de EpCAM in vitro. Además, el aptámero puede tener la capacidad de modular la transducción de señales de EpCAM in vivo.
Los aptámeros útiles para la realización de la invención incluyen un aptámero que se une a una proteína del antígeno prostático específico de membrana (PSMA), que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento homóloga de cualquiera de: a) SEQ ID NOs. 230932­ 230935 o una secuencia variable de los mismos como se describe en la tabla 20; o b) un fragmento funcional de cualquier secuencia precedente.
Los aptámeros para su uso en la invención se pueden identificar en este documento en forma de ADN o ARN. A menos que se especifique lo contrario, un experto en la técnica apreciará que un aptámero se puede sintetizar generalmente en varias formas de ácido nucleico. Los aptámeros también pueden llevar diversas modificaciones químicas y permanecer dentro del alcance de la invención.
Se puede modificar un aptámero para su uso con la invención para que comprenda al menos una modificación química. La modificación puede incluir, sin limitación, una sustitución química en una posición de azúcar; una sustitución química en una posición de fosfato; y una sustitución química en una posición de base del ácido nucleico. La modificación se puede seleccionar del grupo que consiste en: biotinilación, incorporación de una etiqueta fluorescente, incorporación de un nucleótido modificado, una pirimidina modificada en 2', caperuza en 3', conjugación con un enlazante de amina, conjugación con un alto peso molecular, compuesto no-inmunogénico, conjugación con un compuesto lipofílico, conjugación con un fármaco, conjugación con una unidad estructural citotóxica y marcaje con un radioisótopo u otra modificación como se divulga en este documento. La posición de la modificación se puede variar según se desee. Por ejemplo, la biotinilación, la etiqueta fluorescente o la unidad estructural citotóxica se pueden conjugar con el extremo 5' del aptámero. La biotinilación, la etiqueta fluorescente o la unidad estructural citotóxica también se pueden conjugar con el extremo 3' del aptámero.
La unidad estructural citotóxica se puede encapsular en una nanopartícula. La nanopartícula se puede seleccionar del grupo que consiste en: liposomas, dendrímeros y polímeros de peine. La unidad estructural citotóxica puede comprender una unidad estructural citotóxica de molécula pequeña. La unidad estructural citotóxica de molécula pequeña puede incluir, sin limitación, vinblastina hidrazida, caliqueamicina, alcaloide de la vinca, una criptoficina, una tubulisina, dolastatina-10, dolastatina-15, auristatina E, rizoxina, epotilona B, epotilona D, taxoides, maitansinoides y cualquier variante y derivado de los mismos. La unidad estructural citotóxica puede comprender una toxina proteica. Por ejemplo, la toxina proteica se puede seleccionar del grupo que consiste en toxina diftérica, ricina, abrina, gelonina y exotoxina A de Pseudomonas. Los compuestos de alto peso molecular no inmunogénicos para su uso con la invención incluyen polialquilenglicoles, por ejemplo, polietilenglicol. Los radioisótopos adecuados incluyen itrio-90, indio-Ill, yodo-131, lutecio-177, cobre-67, renio-186, renio-188, bismuto-212, bismuto-213, astatina-211 y actinio-225. El aptámero se puede marcar con un radioisótopo emisor de rayos gamma.
Se puede conjugar un agente activo con el aptámero. Por ejemplo, el agente activo puede ser un agente terapéutico o un agente de diagnóstico. El agente terapéutico se puede seleccionar del grupo que consiste en inhibidores de tirosina quinasa, inhibidores de quinasa, agentes biológicamente activos, moléculas biológicas, radionúclidos, adriamicina, antibióticos de ansamicina, asparaginasa, bleomicina, busulfano, cisplatino, carboplatino, carmustina, capecotabina, clorambucilo, citarabina, ciclofosfamida, camptotecina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, dexrazoxano, docetaxel, doxorrubicina, etopósido, epotilonas, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecán, lomustina, mecloretamina, mercaptopurina, melfalán, metotrexato, rapamicina (sirolimus), mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nitrosurea, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, procarbazina, rituximab, estreptozocina, tenipósido, tioguanina, tiotepa, taxanos, vinblastina, vincristina, vinorelbina, taxol, combretastatinas, discodermolidas, transplatino, compuestos antivasculares del factor de crecimiento endotelial ("anti -VEGF"), compuestos del receptor del factor de crecimiento antiepidérmico ("anti-EGFR"), 5-fluorouracilo y derivados, radionúclidos, toxinas polipeptídicas, inductores de apoptosis, sensibilizadores de terapia, enzima o fragmento activo de los mismos, y combinaciones de los mismos.
También se describe en este documento una composición farmacéutica, en la que la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del aptámero descrito anteriormente o una sal del mismo, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica alternativa comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del aptámero o una de sus sales y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. De manera relacionada, la divulgación proporciona un método de tratamiento o mejora de una enfermedad o trastorno, que comprende administrar la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite. La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición al sujeto puede dar como resultado: (a) una mejora del suministro del agente activo a un sitio de la enfermedad en relación con el suministro del agente activo solo; o (b) una mejora de la eliminación de microvesículas que resulta en una disminución de al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en un nivel en sangre de microvesículas dirigidas por el aptámero; o (c) una disminución en la actividad biológica de las microvesículas dirigidas por el aptámero de al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %. La actividad biológica de las microvesículas puede comprender la supresión inmunitaria o la transferencia de información genética. La enfermedad o trastorno puede incluir, sin limitación, los divulgados en este documento. Por ejemplo, la enfermedad o trastorno puede comprender una enfermedad o trastorno neoplásico, proliferativo o inflamatorio, metabólico, cardiovascular o neurológico. Véase, la sección "Fenotipos".
También se describe en este documento un kit que comprende un aptámero divulgado en este documento, o una composición farmacéutica del mismo.
En un aspecto, la invención proporciona un método que comprende poner en contacto el aptámero como se describe anteriormente con una muestra biológica y detectar la presencia o ausencia de unión del aptámero a una microvesícula en la muestra biológica. Como se divulga en este documento, la muestra biológica puede ser una muestra de tejido, fluido o cultivo celular. Por ejemplo, la muestra biológica puede comprender sangre o un componente de la sangre. En algunas realizaciones, el aptámero se conjuga con un sustrato antes del contacto con la muestra biológica. Por ejemplo, el sustrato puede comprender una perla o un pocillo de placa. El aptámero también se puede conjugar con una etiqueta detectable. En este documento se proporcionan diversas configuraciones del método. Véanse, por ejemplo, las figuras 1A-1B.
También se describe en este documento un método de detección de la presencia o el nivel de una población de microvesículas en una muestra biológica sospechosa de contener la población de microvesículas, que comprende poner en contacto la muestra biológica con uno o más agentes de unión específicos para la población de microvesículas y uno o más aptámeros como se describe anteriormente, y detectar microvesículas que son reconocidas tanto por el uno o más agentes de unión como por el uno o más aptámeros, detectando así la presencia o el nivel de la población de microvesículas en la muestra biológica.
La muestra biológica puede ser una muestra de tejido, un cultivo celular o un fluido corporal. El fluido corporal puede ser cualquier fluido útil, incluidos, sin limitación, uno o más de sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido de Cowper o líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural y peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción mucosa, agua de heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, líquido de la cavidad del blastocisto y sangre del cordón umbilical. En algunas realizaciones, el fluido corporal comprende sangre, suero o plasma.
Se puede usar cualquier agente de unión útil en los métodos en cuestión. El uno o más agentes de unión pueden comprender un anticuerpo o aptámero para un antígeno de superficie de microvesícula seleccionado de la tabla 3, la tabla 4 y una combinación de los mismos. El uno o más agentes de unión también pueden ser un anticuerpo o aptámero contra un antígeno de superficie de microvesículas seleccionado de una diana en la tabla 26. Por ejemplo, el uno o más agentes de unión pueden ser un anticuerpo o aptámero contra un antígeno de superficie de microvesículas seleccionado del grupo que consiste en EpCam, CD9, PCSA, CD63, CD81, PSMA, B7H3, PSCA, ICAM, STEAP, KLK2, SSX2, SSX4, PBP, SPDEF, EGFR y una combinación de los mismos. El uno o más agentes de unión también pueden comprender un anticuerpo o aptámero para un antígeno de superficie de microvesícula seleccionado del grupo que consiste en EGFR, PBP, EpCAM, KLK2 y una combinación de los mismos.
Se contemplan diversas configuraciones. Por ejemplo, se puede usar un formato de "sándwich". Véanse, por ejemplo, las figuras 1A-1B. El uno o más agentes de unión se pueden conjugar con un sustrato antes del contacto con la muestra biológica. En esta configuración, el uno o más aptámeros se pueden conjugar con una etiqueta detectable para servir como agente detector. El uno o más agentes de unión se pueden conjugar con una etiqueta detectable. En esta configuración, el uno o más aptámeros se pueden conjugar con un sustrato antes del contacto con la muestra biológica para servir como agente de captura. Adicionalmente, el uno o más aptámeros se pueden conjugar con un sustrato antes del contacto con la muestra biológica, y/o el uno o más aptámeros se conjugan con una etiqueta detectable. En tales casos, el uno o más aptámeros pueden actuar como ya sea un agente de captura y un agente de detección o como ambos.
El método de detección de una presencia o nivel de una población de microvesículas en una muestra biológica se puede usar para proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de una enfermedad o trastorno. La enfermedad o trastorno puede incluir, sin limitación, los divulgados en este documento. Por ejemplo, la enfermedad o trastorno puede comprender una enfermedad o trastorno neoplásico, proliferativo o inflamatorio, metabólico, cardiovascular o neurológico. Véase, la sección "Fenotipos". La enfermedad comprende un cáncer. Por ejemplo, la enfermedad puede ser una leucemia linfoblástica aguda; leucemia mieloide aguda; carcinoma adrenocortical; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de vejiga; glioma de tronco encefálico; tumor cerebral (incluyendo glioma de tronco encefálico, tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central, tumores embrionarios del sistema nervioso central, astrocitomas, craneofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma); cáncer de mama, tumores bronquiales; linfoma de Burkitt; cáncer de sitio primario desconocido; tumor carcinoide; carcinoma de sitio primario desconocido; tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central; tumores embrionarios del sistema nervioso central; cáncer de cuello uterino; cánceres infantiles; cordoma; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T; tumores de células de los islotes pancreáticos endocrinos; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; estesioneuroblastoma; sarcoma de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (de estómago); tumor carcinoide gastrointestinal; tumor de células del estroma gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal (GIST); tumor trofoblástico gestacional; glioma; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; melanoma intraocular; tumores de células de los islotes; sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón; histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; cáncer óseo de histiocitoma fibroso maligno; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; carcinoma de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndromes de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide; síndromes mielodisplásicos; neoplasias mieloproliferativas; cáncer de cavidad nasal; cáncer de nasofaringe; neuroblastoma; linterna de no-Hodgkin; cáncer de piel no melanoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer bucal; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma; otros tumores cerebrales y de la médula espinal; cáncer de ovarios; cáncer epitelial de ovario; tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer de páncreas; papilomatosis; cáncer de senos paranasales; cáncer de paratiroides; cáncer pélvico; cáncer de pene; cáncer de faringe; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma; tumor pituitario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central (CNS); cáncer hepático hepatocelular primario; cáncer de próstata; cáncer de recto; cáncer renal; cáncer de células renales (riñón); cáncer de células renales; cáncer de las vías respiratorias; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de glándulas salivales; síndrome de Sézary; cáncer de pulmón de células pequeñas; cáncer de intestino delgado; sarcoma de tejidos blandos; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso; cáncer de estómago (gástrico); tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; linfoma de células T; cáncer testicular; cáncer de garganta; carcinoma tímico; timoma; cáncer de tiroides; cáncer de células de transición; cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter; tumor trofoblástico; cáncer de uréter; cáncer de uretra; cáncer uterino; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; macroglobulinemia de Waldenstrom; o tumor de Wilm. El cáncer puede ser un cáncer de próstata. El cáncer puede ser un cáncer de mama.
En otro aspecto relacionado, la invención proporciona un método de caracterización de una enfermedad o trastorno, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de prueba biológica con uno o más aptámeros como se proporciona en este documento; (b) detectar una presencia o nivel de un complejo entre uno o más aptámeros y la diana unida por el uno o más aptámeros en la muestra de prueba biológica formada en la etapa (a); y (c) comparar la presencia o nivel detectado en la etapa (b) con un nivel de referencia de una muestra de control biológico, caracterizando así la enfermedad o trastorno. El nivel de referencia se puede derivar de un nivel de la diana en un individuo de muestra sano, por ejemplo, uno que no tiene o no se sabe que tiene la enfermedad o trastorno. El nivel de referencia también se puede derivar de un individuo o muestra que tenga una enfermedad tratada, controlada o alternativa.
La muestra de prueba biológica y la muestra de control biológico cada una puede comprender una muestra de tejido, un cultivo celular o un fluido biológico. En algunas realizaciones, el fluido biológico comprende un fluido corporal. El fluido corporal puede ser cualquier fluido útil, incluyendo, sin limitación, uno o más de sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido de Cowper o líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural y peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción mucosa, agua de heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, líquido de la cavidad del blastocisto o sangre del cordón umbilical. En algunas realizaciones, el fluido corporal comprende sangre, suero o plasma. El fluido biológico puede comprender o se sospecha que comprende microvesículas.
El uno o más aptámeros se pueden unir a un polipéptido o fragmento del mismo. La unión puede ser promiscua o selectiva según se desee. El polipéptido o fragmento del mismo puede ser soluble o estar unido a la membrana, por ejemplo, en la membrana de una microvesícula o fragmento celular. El polipéptido o fragmento del mismo comprende un biomarcador en la tabla 3, la tabla 4 o la tabla 26. El uno o más aptámeros se pueden unir a un antígeno de superficie de microvesícula en la muestra biológica.
El método en este documento para caracterizar una enfermedad o trastorno puede incluir proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de la enfermedad o trastorno. La enfermedad o trastorno puede incluir, sin limitación, los divulgados en este documento. Por ejemplo, la enfermedad o trastorno puede comprender un cáncer, una afección premaligna, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad inmunitaria, una enfermedad o trastorno autoinmune, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno neurológico, una enfermedad infecciosa y/o dolor. Véase la sección "fenotipos” en este documento. La enfermedad o trastorno comprende un cáncer. El cáncer comprende una leucemia linfoblástica aguda; leucemia mieloide aguda; carcinoma adrenocortical; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de vejiga; glioma de tronco encefálico; tumor cerebral (incluyendo glioma de tronco encefálico, tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central, tumores embrionarios del sistema nervioso central, astrocitomas, craneofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma); cáncer de mama; tumores bronquiales; linfoma de Burkitt; cáncer de sitio primario desconocido; tumor carcinoide; carcinoma de sitio primario desconocido; tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central; tumores embrionarios del sistema nervioso central; cáncer de cuello uterino; cánceres infantiles; cordoma; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T; tumores de células de los islotes pancreáticos endocrinos; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; estesioneuroblastoma; sarcoma de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (de estómago); tumor carcinoide gastrointestinal; tumor de células del estroma gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal (GIST); tumortrofoblástico gestacional; glioma; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; linterna de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; melanoma intraocular; tumores de células de los islotes; sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón; histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; cáncer óseo de histiocitoma fibroso maligno; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; carcinoma de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndromes de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide; síndromes mielodisplásicos; neoplasias mieloproliferativas; cáncer de cavidad nasal; cáncer de nasofaringe; neuroblastoma; linfoma de no-Hodgkin; cáncer de piel no melanoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer bucal; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma; otros tumores cerebrales y de la médula espinal; cáncer de ovarios; cáncer epitelial de ovario; tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer de páncreas; papilomatosis; cáncer de senos paranasales; cáncer de paratiroides; cáncer pélvico; cáncer de pene; cáncer de faringe; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma; tumor pituitario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central (CNS); cáncer hepático hepatocelular primario; cáncer de próstata; cáncer de recto; cáncer renal; cáncer de células renales (riñón); cáncer de células renales; cáncer de las vías respiratorias; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de glándulas salivales; síndrome de Sézary; cáncer de pulmón de células pequeñas; cáncer de intestino delgado; sarcoma de tejidos blandos; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso; cáncer de estómago (gástrico); tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; linfoma de células T; cáncer testicular; cáncer de garganta; carcinoma tímico; timoma; cáncer de tiroides; cáncer de células de transición; cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter; tumor trofoblástico; cáncer de uréter; cáncer de uretra; cáncer uterino; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; macroglobulinemia de Waldenstrom; o tumor de Wilm. El cáncer puede ser un cáncer de próstata. El cáncer puede ser un cáncer de mama.
También se describe en este documento un kit, que comprende un reactivo para llevar a cabo los métodos en este documento y también el uso del reactivo para llevar a cabo los métodos. El reactivo puede comprender un aptámero divulgado en este documento y/u otros componentes como se divulgan en este documento.
Se describen composiciones de un grupo de aptámeros útiles para la realización de la invención, en las que el grupo comprende una pluralidad de oligonucleótidos para detectar biomarcadores de interés. Tales composiciones pueden facilitar la caracterización de un fenotipo en una muestra biológica. Una composición de la materia útil para la realización de la invención comprende una pluralidad de oligonucleótidos seleccionados de SEQ ID NOs. 1-230810, 230811-230899, 230900-230927 o 231018-241535, cuyos oligonucleótidos son capaces de unirse a una pluralidad de dianas presentes en una muestra biológica. La composición de la materia también puede comprender un oligonucleótido seleccionado de SEQ ID NOs. 1-230810, 230811-230899, 230900-230927 o 231018-241535. Las composiciones pueden comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 o todos los oligonucleótidos enumerados en SEQ ID NOs. 231018-241535. Las composiciones pueden comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 o todos los oligonucleótidos enumerados en SEQ ID NOs. 1-230810. Otra composición de la materia útil para la realización de la invención comprende uno o más oligonucleótidos expuestos en cualquiera de las tablas 23-24 capaces de unirse a una pluralidad de dianas presentes en una muestra biológica. La composición de la materia puede comprender uno o más oligonucleótidos enumerados en cualquiera de las tablas 23-24. La composición puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 oligonucleótidos enumerados en la tabla 23 o la tabla 24
En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método de caracterización de una afección para una muestra de prueba que comprende: poner en contacto una muestra de microvesículas con una pluralidad de oligonucleótidos capaces de unirse a una o más dianas presentes en dicha muestra de microvesículas, identificar un conjunto de oligonucleótidos que forman un complejo con la muestra en el que el conjunto está predeterminado para caracterizar una afección para la muestra, caracterizando así una afección para una muestra. La identificación de oligonucleótidos puede comprender realizar la secuenciación de todos o algunos de los oligonucleótidos. La identificación también puede comprender realizar la amplificación de todos o algunos de los oligonucleótidos, por ejemplo, a través de la metodología de PCR y variantes de los mismos (RT-PCR, qPCR, etc.). La identificación también puede comprender realizar la hibridación de todos o algunos de los oligonucleótidos en una matriz. La afección puede ser una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, la afección puede ser un cáncer, una afección premaligna, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad inmunitaria, una enfermedad o trastorno autoinmune, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno neurológico, una enfermedad infecciosa y/o dolor. Véase la sección "fenotipos” en este documento.
En otro aspecto relacionado, la invención proporciona un método de identificación de un conjunto de oligonucleótidos asociados con una muestra de prueba, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de microvesículas con una pluralidad de oligonucleótidos, aislar un conjunto de oligonucleótidos que forman un complejo con la muestra de microvesículas, (b) determinar una secuencia y/o un número de copias para cada uno de los oligonucleótidos que formaron un complejo con la muestra de microvesículas en (a), identificando así un conjunto de oligonucleótidos asociados con la muestra de prueba. La etapa (b) puede incluir la realización de una secuenciación de alto rendimiento. La etapa (b) también puede incluir realizar la hibridación con una matriz o amplificación. En una realización, la muestra es de un sujeto del que se sospecha que tiene o está predispuesto a tener un cáncer. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos es capaz de unirse preferentemente a una microvesícula que se desprende de las células enfermas contra las células normales. Las células enfermas pueden estar asociadas con un cáncer, una afección premaligna, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad inmunitaria, una enfermedad o trastorno autoinmune, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno neurológico, una enfermedad o dolor infeccioso.
En otro aspecto relacionado, la invención proporciona un método de diagnóstico de una muestra como cancerosa o predispuesta a ser cancerosa, que comprende poner en contacto una muestra de microvesículas con una pluralidad de oligonucleótidos que están predeterminados para formar preferentemente un complejo con microvesículas de una muestra de cáncer en comparación con las microvesículas de una muestra no cancerosa.
En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos se preselecciona a través de una o más etapas de selección positiva o negativa, en las que la selección positiva comprende la selección de oligonucleótidos frente a una muestra que tiene características sustancialmente similares en comparación con la muestra de prueba, y en las que la selección negativa, comprende la selección de oligonucleótidos frente a una muestra que tiene características sustancialmente diferentes en comparación con la muestra de prueba.
En otro aspecto más relacionado, la invención proporciona un método de caracterización de una enfermedad o trastorno, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de prueba biológica con un grupo de aptámeros; (b) detectar una presencia o nivel de un complejo formado en la etapa (a) entre los miembros del grupo de aptámeros y la muestra de prueba biológica; y (c) comparar la presencia o nivel detectado en la etapa (b) con un nivel de referencia, caracterizando así la enfermedad o trastorno. El nivel de referencia se puede derivar de un nivel de la diana en un individuo de muestra sano, por ejemplo, uno que no tiene o no se sabe que tiene la enfermedad o trastorno. El nivel de referencia también se puede derivar de un individuo o muestra que tenga una enfermedad tratada, controlada o alternativa. La muestra de prueba biológica puede comprender una muestra de tejido, un cultivo celular o un fluido biológico. En algunas realizaciones, el fluido biológico comprende un fluido corporal. El fluido corporal puede ser cualquier fluido útil, incluyendo, sin limitación, uno o más de sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido de Cowper o líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural y peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción mucosa, agua de heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, líquido de la cavidad del blastocisto o sangre del cordón umbilical. En algunas realizaciones, el fluido corporal comprende sangre, suero o plasma. El fluido biológico puede comprender o se sospecha que comprende microvesículas. En tales casos, el grupo de aptámeros se puede elegir para unirse a las microvesículas. Las microvesículas se pueden aislar antes del contacto con el grupo de aptámeros, o la muestra de prueba se puede poner en contacto directamente con el grupo de aptámeros antes de aislar las microvesículas.
Como se indicó, las composiciones y los métodos para el uso de un grupo de aptámeros que comprenden una pluralidad de oligonucleótidos se pueden usar para detectar, diagnosticar, pronosticar o someter a teranosis diversas enfermedades y trastornos, incluyendo, sin limitación un cáncer, una afección premaligna, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad inmune, una enfermedad o trastorno autoinmune, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno neurológico, una enfermedad o dolor infeccioso. El cáncer puede comprender una leucemia linfoblástica aguda; leucemia mieloide aguda; carcinoma adrenocortical; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de vejiga; glioma de tronco encefálico; tumor cerebral (incluyendo glioma de tronco encefálico, tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central, tumores embrionarios del sistema nervioso central, astrocitomas, craneofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma); cáncer de mama; tumores bronquiales; linfoma de Burkitt; cáncer de sitio primario desconocido; tumor carcinoide; carcinoma de sitio primario desconocido; tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central; tumores embrionarios del sistema nervioso central; cáncer de cuello uterino; cánceres infantiles; cordoma; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T; tumores de células de los islotes pancreáticos endocrinos; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; estesioneuroblastoma; sarcoma de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (de estómago); tumor carcinoide gastrointestinal; tumor de células del estroma gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal (GIST); tumortrofoblástico gestacional; glioma; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; melanoma intraocular; tumores de células de los islotes; sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón; histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; cáncer óseo de histiocitoma fibroso maligno; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; carcinoma de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndromes de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide; síndromes mielodisplásicos; neoplasias mieloproliferativas; cáncer de cavidad nasal; cáncer de nasofaringe; neuroblastoma; linfoma de no-Hodgkin; cáncer de piel no melanoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer bucal; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma; otros tumores cerebrales y de la médula espinal; cáncer de ovarios; cáncer epitelial de ovario; tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer de páncreas; papilomatosis; cáncer de senos paranasales; cáncer de paratiroides; cáncer pélvico; cáncer de pene; cáncer de faringe; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma; tumor pituitario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central (CNS); cáncer hepático hepatocelular primario; cáncer de próstata; cáncer de recto; cáncer renal; cáncer de células renales (riñón); cáncer de células renales; cáncer de las vías respiratorias; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de glándulas salivales; síndrome de Sézary; cáncer de pulmón de células pequeñas; cáncer de intestino delgado; sarcoma de tejidos blandos; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso; cáncer de estómago (gástrico); tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; linfoma de células T; cáncer testicular; cáncer de garganta; carcinoma tímico; timoma; cáncer de tiroides; cáncer de células de transición; cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter; tumor trofoblástico; cáncer de uréter; cáncer de uretra; cáncer uterino; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; macroglobulinemia de Waldenstrom; o tumor de Wilm. La afección premaligna puede ser el esófago de Barrett. La enfermedad autoinmune puede comprender enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad de Crohn (CD), colitis ulcerosa (UC), inflamación pélvica, vasculitis, psoriasis, diabetes, hepatitis autoinmune, esclerosis múltiple, miastenia grave, diabetes tipo I, artritis reumatoide, psoriasis, lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, espondilitis anquilosante, enfermedad de Sjogren, síndrome CREST, esclerodermia, enfermedad reumática, rechazo de órganos, colangitis esclerosante primaria o sepsis. La enfermedad cardiovascular puede comprender aterosclerosis, insuficiencia cardiaca congestiva, placa vulnerable, accidente cerebrovascular, isquemia, hipertensión arterial, estenosis, oclusión de vasos o un evento trombótico. La enfermedad neurológica puede incluir, sin limitación, esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Parkinson (PD), enfermedad de Alzheimer (AD), esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión, autismo, enfermedad priónica, enfermedad de Pick, demencia, enfermedad de Huntington (HD), síndrome de Down, enfermedad cerebrovascular, encefalitis de Rasmussen, meningitis viral, lupus eritematoso sistémico neuropsiquiátrico (NPSLE), esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, encefalopatía espongiforme transmisible, daño por reperfusión isquémica (por ejemplo, accidente cerebrovascular), traumatismo cerebral, infección por microbios o síndrome de fatiga crónica. El dolor puede incluir fibromialgia, dolor neuropático crónico o dolor neuropático periférico. La enfermedad infecciosa puede comprender una infección bacteriana, una infección viral, una infección por levaduras, la enfermedad de Whipple, la enfermedad priónica, la cirrosis, el estafilococo áureo resistente a la meticilina, VIH, HCV, la hepatitis, la sífilis, la meningitis, la malaria, la tuberculosis y la gripe.
En los métodos para el uso de un grupo de aptámeros que comprende una pluralidad de oligonucleótidos, la pluralidad de oligonucleótidos puede ser una composición como se proporciona en este documento.
En otro aspecto relacionado, la invención proporciona un método para realizar una secuenciación de alto rendimiento que comprende: (a) realizar al menos una (i) selección negativa o (ii) una selección positiva de una pluralidad de oligonucleótidos con una muestra de microvesículas; (b) obtener un conjunto de oligonucleótidos para proporcionar un subconjunto de aglutinante negativo o un subconjunto de aglutinante positivo de la pluralidad de oligonucleótidos, en el que el subconjunto de aglutinante negativo de la pluralidad de oligonucleótidos no se une a la muestra de microvesículas y en el que el subconjunto de aglutinante positivo de la pluralidad de oligonucleótidos se une a la muestra de microvesículas; (c) poner en contacto el subconjunto de aglutinante negativo o el subconjunto de aglutinante positivo con una muestra de prueba; (d) eluir los oligonucleótidos que se unen a la muestra de prueba para proporcionar una pluralidad de oligonucleótidos eluidos; y (e) realizar una secuenciación de alto rendimiento de la pluralidad de oligonucleótidos eluidos para identificar la secuencia y/o el número de copias de los miembros de la pluralidad de oligonucleótidos eluidos.
En otro aspecto relacionado, la invención proporciona un método de identificación de oligonucleótidos específicos para una muestra de prueba que comprende: (a) enriquecer una pluralidad de oligonucleótidos para una muestra para proporcionar un conjunto de oligonucleótidos predeterminado para formar un complejo con una muestra diana; (b) poner en contacto la pluralidad en (a) con una muestra de prueba para permitir la formación de complejos de oligonucleótidos con la muestra de prueba; (c) recuperar oligonucleótidos que formaron complejos en (b) para proporcionar un subconjunto recuperado de oligonucleótidos; y (d) perfilar el subconjunto recuperado de oligonucleótidos mediante secuenciación, amplificación o hibridación de alto rendimiento, identificando así los oligonucleótidos específicos para una muestra de prueba. La muestra de prueba puede incluir una pluralidad de microvesículas. Los oligonucleótidos pueden ser ARN, ADN o ambos. El método puede comprender además realizar un análisis informático para identificar un subconjunto de oligonucleótidos que comprenda una identidad de secuencia de al menos el 90 %.
También se describe un kit en este documento, que comprende el kit un reactivo para llevar a cabo los métodos de uso de un grupo de aptámeros y también el uso del reactivo para llevar a cabo tales métodos. El reactivo puede comprender un aptámero relacionado o una composición divulgados en este documento y/u otros componentes divulgados en este documento.
Los métodos de identificación del grupo de aptámeros también se describen en este documento. En un aspecto, dicho método de identificación de un perfil del aptámero específico de diana para una muestra biológica comprende poner en contacto una muestra de prueba biológica con un grupo de moléculas de aptámero, poner en contacto el grupo con una muestra biológica de control o de referencia, identificar uno o más aptámeros que se unen a un componente en dicha muestra de prueba pero no a la muestra de control o de referencia, identificando así un perfil del aptámero para dicha muestra de prueba biológica.
También se describe un método de selección de un grupo de aptámeros, comprendiendo dicho método: (a) poner en contacto una muestra de control biológico con un grupo de oligonucleótidos; (b) aislar un primer subconjunto del grupo de oligonucleótidos que no se unen a la muestra de control biológico; (c) poner en contacto la muestra de prueba biológica con el primer subconjunto del grupo de oligonucleótidos; y (d) aislar un segundo subconjunto del grupo de oligonucleótidos que se unen a la muestra de prueba biológica, seleccionando así el grupo de aptámeros. El grupo inicial de oligonucleótidos puede comprender un gran número de secuencias, por ejemplo, al menos 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, o al menos 1018 oligonucleótidos. Las etapas (a)-(d) se pueden repetir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o al menos 20 veces, en el que el grupo de aptámeros seleccionado en la etapa (d) se usa como el grupo de oligonucleótidos en la etapa (a) en cada iteración.
En algunas realizaciones, la muestra de prueba biológica y la muestra de control biológico comprenden microvesículas. La muestra de prueba biológica y, opcionalmente, la muestra de control biológico pueden ser cualquier muestra biológica útil como se divulga en este documento. Por ejemplo, pueden comprender un fluido corporal. El fluido corporal puede incluir, sin limitación, sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido de Cowper, líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido maligno, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción de la mucosa, agua de las heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares u otros líquidos de lavado. La muestra de prueba biológica y, opcionalmente, la muestra de control biológico también puede comprender una muestra de tejido o un cultivo celular. La muestra de prueba biológica puede ser una muestra enferma y la muestra de control biológico puede ser una muestra no enferma. Tal configuración puede permiten la identificación de grupos de aptámeros que reconocen preferentemente una muestra enferma, o reconocen preferentemente una muestra no enferma.
Se describe otro método de selección de un grupo de aptámeros, comprendiendo el método: (a) poner en contacto un grupo de aptámeros con una población de microvesículas de una primera muestra; (b) enriquecer un subgrupo de aptámeros que muestran afinidad con la población de microvesículas de la primera muestra; (c) poner en contacto el subgrupo con una segunda población de microvesículas de una segunda muestra; y (d) agotar un segundo subgrupo de aptámeros que muestran afinidad por la segunda población de microvesículas de la segunda muestra, seleccionando así el grupo de aptámeros que tienen afinidad preferencial para la población de microvesículas de la primera muestra.
La primera muestra y/o la segunda muestra pueden ser cualquier muestra biológica útil como se divulga en este documento. Por ejemplo, pueden comprender un fluido corporal. El fluido corporal puede incluir, sin limitación, sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido de Cowper, líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido maligno, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción de la mucosa, agua de las heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares u otros líquidos de lavado. La primera muestra y/o la segunda muestra cada una puede comprender una muestra agrupada, es decir, una muestra agrupada de diversas fuentes tales como diferentes individuos. La primera muestra puede ser una muestra enferma mientras que la segunda muestra comprende una muestra de control, en el que opcionalmente la muestra de control es una muestra sin enfermedad. Alternativamente, la primera muestra puede ser una muestra de control mientras que la segunda muestra comprende una muestra de enfermedad, en el que opcionalmente la muestra de control es una muestra sin enfermedad.
Las etapas (a)-(d) se pueden repetir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces, en el que el grupo de aptámeros seleccionado en la etapa (d) se usa como el grupo de aptámeros en la etapa (a) en cada iteración. La primera muestra y/o la segunda muestra se pueden reemplazar con una muestra diferente antes de repetir las etapas (a)-(d). Por ejemplo, la primera muestra y/o la segunda muestra pueden ser de un individuo diferente o comprender un grupo de muestras diferente.
El método puede comprender además la identificación de los miembros del grupo seleccionado de aptámeros, en el que opcionalmente la identificación se realiza mediante secuenciación, amplificación o hibridación de alto rendimiento.
Se describe un método de selección de un grupo de aptámeros, comprendiendo el método: (a) poner en contacto un conjunto de candidatos a aptámeros con una muestra que comprende una molécula diana; (b) retirar los candidatos a aptámeros no unidos; (c) poner en contacto la muestra con un ligando con la molécula diana; y (d) aislar candidatos a aptámeros que se disocian de la molécula diana por competencia con el ligando, seleccionando así el grupo de aptámeros que se unen a la misma diana que el ligando. La molécula diana puede ser una proteína, incluyendo, sin limitación, un antígeno de superficie de microvesículas. La molécula diana está atada a un sustrato. La molécula diana puede ser un antígeno de superficie de una microvesícula y la microvesícula puede estar atada a un sustrato. El ligando puede ser una molécula pequeña o una proteína, por ejemplo, el ligando puede ser un anticuerpo. Las etapas (a)-(d) se pueden repetir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces, en el que los candidatos a aptámeros aislados en la etapa (d) se usan en el grupo de candidatos a aptámeros introducidos en la etapa (a) en cada iteración. El método puede comprender además la identificación de los miembros del grupo seleccionado de aptámeros, en el que opcionalmente la identificación se realiza mediante secuenciación, amplificación o hibridación de alto rendimiento. La primera muestra puede ser una muestra enferma mientras que la segunda muestra comprende una muestra de control, en el que opcionalmente la muestra de control es una muestra sin enfermedad. Alternativamente, la primera muestra puede ser una muestra de control mientras que la segunda muestra comprende una muestra de enfermedad, en el que opcionalmente la muestra de control es una muestra sin enfermedad.
También de describe un método de selección de uno o más aptámeros que se unen a una diana de interés, comprendiendo el método: (a) separar la diana de una primera muestra biológica para formar una muestra biológica agotada en la diana; (b) atar la diana separada a un sustrato; (c) mezclar la diana atada con una muestra biológica de interferencia; (d) poner en contacto la mezcla de (c) con una biblioteca de aptámeros de partida; y (e) recuperar miembros de la biblioteca de aptámeros que preferentemente se unen a la diana atada, seleccionando así uno o más aptámeros que se unen a la diana. El sustrato puede ser una perla o una superficie plana. La muestra biológica que interfiere puede comprender la muestra biológica agotada en la diana (a). La diana puede ser una microvesícula. La diana puede comprender una microvesícula de interés y la muestra biológica que interfiere comprende una microvesícula no diana. La microvesícula no diana se puede atar a un sustrato diferente al de la microvesícula diana antes de la etapa (c). El sustrato puede comprender una perla magnética y el sustrato diferente comprende una perla no magnética, o el sustrato puede comprender una perla no magnética y el sustrato diferente comprende una perla magnética.
La primera muestra biológica y/o la muestra biológica de interferencia puede ser cualquier muestra biológica útil como se divulga en este documento. Por ejemplo, pueden comprender un fluido corporal. El fluido corporal puede incluir, sin limitación, sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido de Cowper, líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido maligno, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción de la mucosa, agua de las heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares u otros líquidos de lavado. La primera muestra biológica puede comprender una muestra enferma y la muestra biológica de interferencia comprende una muestra no enferma. Alternativamente, la primera muestra biológica puede comprender una muestra que no presenta una enfermedad, mientras que la muestra biológica de interferencia comprende una muestra de una enfermedad.
En este documento también se describen métodos de cribado de una biblioteca de agentes de unión tales como aptámeros para identificar agentes de unión a una diana de interés. Dicho método de identificación de una pluralidad de ligandos diana puede comprender: (a) poner en contacto una población de microvesículas de referencia con una pluralidad de ligandos que son capaces de unirse a uno o más marcadores de superficie de microvesículas; (b) aislar una pluralidad de ligandos de referencia, en el que la pluralidad de ligandos de referencia comprende un subconjunto de la pluralidad de ligandos que no tienen afinidad por la población de microvesículas de referencia; (c) poner en contacto una o más microvesículas de prueba con la pluralidad de ligandos de referencia; y (d) identificar un subconjunto de ligandos de la pluralidad de ligandos de referencia que forman complejos con un marcador de superficie en una o más microvesículas de prueba, identificando así la pluralidad de ligandos diana. El método puede comprender además identificar el marcador de superficie de la microvesícula diana. La pluralidad de ligandos pueden ser aptámeros y/o anticuerpos.
También se describe en este documento un método de identificación de un aptámero específico para una diana de interés, comprendiendo el método: (a) poner en contacto un grupo de aptámeros candidatos con uno o más componentes del ensayo, en el que los componentes del ensayo no comprenden la diana de interés; (b) recuperar los miembros del grupo de aptámeros candidatos que no se unen al uno o más componentes del ensayo en (a); (c) poner en contacto a los miembros del grupo de aptámeros candidatos recuperados en (b) con la diana de interés en presencia de una o más dianas de confusión; y (d) recuperar un aptámero candidato que se une a la diana de interés en la etapa (c), identificando así el aptámero específico a la diana de interés. El método puede retirar aptámeros candidatos que se unen a moléculas no diana. Las etapas (a)-(b) se pueden repetir al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o al menos 20 veces antes de realizar la etapa (c). Además, las etapas (c)-(d) se pueden repetir al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o al menos 20 veces antes de identificar el aptámero específico a la diana de interés. El grupo inicial de aptámeros candidatos puede incluir al menos 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, o al menos 1018 secuencias de ácidos nucleicos. El uno o más componentes del ensayo pueden incluir, sin limitación, uno o más de un sustrato, una perla, una matriz plana, una columna, un tubo, un pocillo o un filtro.
La diana de interés y la una o más dianas de confusión pueden comprender proteínas. La diana de interés y la una o más dianas de confusión también pueden comprender una microvesícula. La diana de interés y la una o más dianas de confusión pueden comprender uno o más antígenos de superficie de microvesículas. El antígeno de superficie de microvesículas se puede seleccionar de las tablas 3, 4 y/o 26. A modo de ejemplo no limitante, la diana de interés puede ser una proteína seleccionada del grupo que consiste en SSX4, SSX2, PBP, KLK2, SPDEF, mientras que la una o más dianas de confusión comprende los otros miembros del grupo.
El uno o más antígenos de superficie de microvesículas pueden ser un biomarcador de una enfermedad o trastorno, incluyendo, sin limitación, los divulgados en este documento. La enfermedad puede comprender un cáncer, una afección premaligna, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad inmunitaria, una enfermedad o trastorno autoinmune, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno neurológico, una enfermedad o dolor infeccioso. El cáncer puede ser una leucemia linfoblástica aguda; leucemia mieloide aguda; carcinoma adrenocortical; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de vejiga; glioma de tronco encefálico; tumor cerebral (incluyendo glioma de tronco encefálico, tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central, tumores embrionarios del sistema nervioso central, astrocitomas, craneofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma); cáncer de mama; tumores bronquiales; linfoma de Burkitt; cáncer de sitio primario desconocido; tumor carcinoide; carcinoma de sitio primario desconocido; tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central; tumores embrionarios del sistema nervioso central; cáncer de cuello uterino; cánceres infantiles; cordoma; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T; tumores de células de los islotes pancreáticos endocrinos; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; estesioneuroblastoma; sarcoma de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (de estómago); tumor carcinoide gastrointestinal; tumor de células del estroma gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal (GIST); tumor trofoblástico gestacional; glioma; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; melanoma intraocular; tumores de células de los islotes; sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón; histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; cáncer óseo de histiocitoma fibroso maligno; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; carcinoma de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndromes de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide; síndromes mielodisplásicos; neoplasias mieloproliferativas; cáncer de cavidad nasal; cáncer de nasofaringe; neuroblastoma; linfoma de no-Hodgkin; cáncer de piel no melanoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer bucal; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma; otros tumores cerebrales y de la médula espinal; cáncer de ovarios; cáncer epitelial de ovario; tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer de páncreas; papilomatosis; cáncer de senos paranasales; cáncer de paratiroides; cáncer pélvico; cáncer de pene; cáncer de faringe; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma; tumor pituitario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central (CNS); cáncer hepático hepatocelular primario; cáncer de próstata; cáncer de recto; cáncer renal; cáncer de células renales (riñón); cáncer de células renales; cáncer de las vías respiratorias; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de glándulas salivales; síndrome de Sézary; cáncer de pulmón de células pequeñas; cáncer de intestino delgado; sarcoma de tejidos blandos; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso; cáncer de estómago (gástrico); tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; linfoma de células T; cáncer testicular; cáncer de garganta; carcinoma tímico; timoma; cáncer de tiroides; cáncer de células de transición; cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter; tumor trofoblástico; cáncer de uréter; cáncer de uretra; cáncer uterino; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; macroglobulinemia de Waldenstrom; o tumor de Wilm. La afección premaligna puede ser el esófago de Barrett. La enfermedad autoinmune puede comprender enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad de Crohn (CD), colitis ulcerosa (UC), inflamación pélvica, vasculitis, psoriasis, diabetes, hepatitis autoinmune, esclerosis múltiple, miastenia grave, diabetes tipo I, artritis reumatoide, psoriasis, lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, espondilitis anquilosante, enfermedad de Sjogren, síndrome CREST, esclerodermia, enfermedad reumática, rechazo de órganos, colangitis esclerosante primaria o sepsis. La enfermedad cardiovascular puede comprender aterosclerosis, insuficiencia cardiaca congestiva, placa vulnerable, accidente cerebrovascular, isquemia, hipertensión arterial, estenosis, oclusión de vasos o un evento trombótico. La enfermedad neurológica puede incluir, sin limitación, esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Parkinson (PD), enfermedad de Alzheimer (AD), esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión, autismo, enfermedad priónica, enfermedad de Pick, demencia, enfermedad de Huntington (HD), síndrome de Down, enfermedad cerebrovascular, encefalitis de Rasmussen, meningitis viral, lupus eritematoso sistémico neuropsiquiátrico (NPSLE), esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, encefalopatía espongiforme transmisible, daño por reperfusión isquémica (por ejemplo, accidente cerebrovascular), traumatismo cerebral, infección por microbios o síndrome de fatiga crónica. El dolor puede incluir fibromialgia, dolor neuropático crónico o dolor neuropático periférico. La enfermedad infecciosa puede comprender una infección bacteriana, una infección viral, una infección por levaduras, la enfermedad de Whipple, la enfermedad priónica, la cirrosis, el estafilococo áureo resistente a la meticilina, el VIH, el VHC, la hepatitis, la sífilis, la meningitis, la malaria, la tuberculosis y la gripe.
En este documento se describen métodos de identificación de agentes de unión, los métodos que comprenden poner en contacto una pluralidad de microvesículas extracelulares con una biblioteca de agentes de unión generada aleatoriamente e identificar un subconjunto de la biblioteca de agentes de unión que tienen una afinidad con uno o más componentes de las microvesículas extracelulares. Los agentes de unión pueden ser aptámeros y/o anticuerpos.
Los ligandos que incluyen aptámeros de oligonucleótidos identificados por los métodos de la invención se pueden usar en ensayos para caracterizar un fenotipo de una muestra, por ejemplo, para proporcionar un diagnóstico, pronóstico y/o teranosis de una enfermedad o trastorno. Tal método de caracterización de un fenotipo puede comprender poner en contacto una muestra biológica de prueba con uno o más ligandos o aptámeros que se unen a una diana de interés. El fenotipo puede incluir la detección de una enfermedad o trastorno como se divulga en este documento.
También se describe un kit en este documento, comprendiendo dicho kit un reactivo para llevar a cabo los métodos de cribado de bibliotecas de ligandos y aptámeros frente a una o más dianas de interés. También se describe un uso del reactivo para llevar a cabo los métodos de cribado de bibliotecas de ligandos y aptámeros frente a una o más dianas de interés. El reactivo puede comprender una biblioteca o composición de aptámeros divulgada en este documento y/u otros componentes como se divulga en este documento.
Los métodos de cribado de bibliotecas de ligandos y aptámeros frente a una o más dianas de interés pueden incluir además la identificación de una o más dianas de los ligandos/aptámeros seleccionados. Tales métodos se divulgan en este documento y/o se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, la figura 14. Se describe un método de identificación de una diana de un agente de unión, comprendiendo el método: (a) poner en contacto el agente de unión con la diana para unir la diana con el agente de unión, en el que la diana comprende un antígeno de superficie de una microvesícula; (b) romper la microvesícula en condiciones que no interrumpan la unión de la diana con el agente de unión; (c) aislar el complejo entre la diana y el agente de unión; y (d) identificar la diana unida por el agente de unión. El agente de unión puede ser un ligando o un aptámero identificado por los métodos de cribado anteriores o en cualquier otro lugar en este documento. Véanse, por ejemplo, las figuras 13A-13B. La diana del agente de unión puede ser cualquier biomarcador apropiado, incluida una proteína, un ácido nucleico, un lípido, un carbohidrato o una microvesícula.
La diana se puede reticular con el agente de unión antes de la etapa (b). La reticulación puede comprender fotorreticulación, un reticulante de imidoéster, suberimidato de dimetilo, un reticulante de éster de N-hidroxisuccinimida, suberato de bissulfosuccinimidilo (BS3), un aldehído, acroleína, crotonaldehído, formaldehído, un reticulante de carbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DDC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC o EDAC), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), y sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC), un sulfo-N-hidroxisuccinimidil-2-(6-[biotinamido]-2-(p-azido benzamido)-hexanoamido)etil-1,3'-ditiopropionato (Sulfo-SBED), 2-[N2-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil)-N6-(6-biotina-amidocaproil)-L-lisinil]etilmetanotiosulfonato (Mts-Atf -biotina), 2-{N2-[N6-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil-6-amino-caproil)-N6-(6-biotinamidocaproil)-L-lisinilamido] }etilo metanotiosultonato (Mts-Atf-LC-Biotina), un aminoácido fotorreactivo, L-foto-leucina, L-foto-metionina, un reticulante de N-hidroxisuccinimida (NHS), un reactivo NHS-azida, NHS-azida, NHS-PEG4-azida, NHS-PEG12-azida, un reactivo de NHS-fosfina, NHS-fosfina, Sulfo-NHS-fosfina, o cualquier combinación o modificación de los mismos. La interrupción de la microvesícula en la etapa (b) puede incluir el uso de uno o más de un detergente, un surfactante, un disolvente, una enzima, cizalla mecánica, molienda de perlas, homogeneización, microfluidización, sonicación, prensa francesa, impacto, un molino coloidal, descompresión, choque osmótico, termólisis, congelación-descongelación y desecación. La enzima puede ser una o más de lisozima, lisostafina, zimolasa, celulasa, mutanolisina, una glicanasa, una proteasa y manasa. Los detergentes útiles incluyen uno o más de octiltioglucósido (OTG), octil beta-glucósido (OG), un detergente no iónico, Triton X, Tween 20, un alcohol graso, un alcohol cetílico, un alcohol estearílico, alcohol cetoestearílico, un alcohol oleílico, un polioxietilenglicol alquil éter (Brij), octaetilenglicol monododecil éter, pentaetilenglicol monododecil éter, un polioxipropilenglicol alquil éter, un glucósido alquil éter, decil glucósido, lauril glucósido, octil glucósido, un polioxietilenglicol octilfenol éter, un polioxietilenglicol alquilfenol éter, nonoxinol-9, un éster alquílico de glicerol, laurato de glicerilo, un éster alquílico de sorbitán de polioxietilenglicol, polisorbato, un éster alquílico de sorbitán, cocamida MEA, cocamida DEA, óxido de dodecildimetilamina, copolímeros en bloque de polietilenglicol y polipropilenglicol, poloxámeros, amina de sebo polietoxilada (POEA), un detergente zwitteriónico, 3-[(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), un sulfonato de alquilbenceno lineal (LAS), un etoxilato de alquilfenol (APE), cocamidopropil hidroxisultaína, una betaína, cocamidopropil betaína, lecitina, un detergente iónico, dodecilsulfato de sodio (SdS), bromuro de cetrimonio (CTAB), cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC), diclorhidrato de octenidina, cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de benzalconio (BAC), cloruro de bencetonio (BZT), 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxano, cloruro de dimetildioctadecilamonio, bromuro de dioctadecildimetilamonio (DODAB), desoxicolato de sodio, nonilfenoxipolietoxiletanol (Tergitol-tipo NP-40; NP-40), laurilsulfato de amonio, laureth sulfato de sodio (sulfato de lauril éter de sodio (SLES)), mireth sulfato de sodio, un carboxilato de alquilo, estearato de sodio, lauroil sarcosinato de sodio, un fluorosurfactante a base de carboxilato, perfluorononanoato, perfluorooctanoato (PFOA o PFO) y un biosurfactante.
El agente de unión se puede atar a un sustrato. Véase, por ejemplo, la figura 14. El sustrato puede ser una microesfera o un sustrato plano. El agente de unión se puede marcar. Aislar el complejo entre la diana y el agente de unión puede comprender capturar el agente de unión a través de la etiqueta. La etiqueta puede ser una etiqueta de biotina.
Cuando la diana comprende una proteína, identificar la diana puede comprender el uso de espectrometría de masas (MS), huellas dactilares de masas peptídicas (PMF; huellas dactilares de proteínas), secuenciación, análisis de aminoácidos N-terminal, análisis de aminoácidos C-terminal, degradación de Edman, cromatografía, electroforesis, electroforesis en gel bidimensional (gel 2D), matriz de anticuerpos e inmunoensayo.
También se describe un kit en este documento, comprendiendo el kit un reactivo para llevar a cabo los métodos de identificación de diana. También se describe el uso del reactivo para llevar a cabo los métodos de identificación diana. El reactivo puede comprender diversos sustratos, enlazantes, detergentes y/u otros componentes como se divulga en este documento.
También se divulgan composiciones y métodos para facilitar el cribado de bibliotecas de aptámeros y los ensayos basados en aptámeros. Estos incluyen, sin limitación, control negativo y aptámeros de bloqueo. La divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia al menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % homóloga a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de SEQ ID NOs.
230938-231008. La divulgación también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008. La divulgación proporciona además un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia al menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % homóloga a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de SEQ ID NO. 230938­ 231008. La divulgación proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008. Los ácidos nucleicos se pueden modificar adicionalmente para comprender al menos una modificación química. La modificación puede incluir, sin limitación, una sustitución química en una posición de azúcar; una sustitución química en una posición de fosfato; y una sustitución química en una posición de base del ácido nucleico. La modificación se puede seleccionar del grupo que consiste en: incorporación de un nucleótido modificado, protección 3', pirimidina modificada en 2', biotinilación, conjugación con un enlazante de amina, conjugación con un compuesto no inmunogénico de alto peso molecular, conjugación con un compuesto lipofílico. El compuesto no inmunogénico de alto peso molecular puede ser un polialquilenglicol, por ejemplo, polietilenglicol.
La divulgación proporciona una composición que comprende un ácido nucleico anterior y también un kit que comprende un ácido nucleico anterior o la composición. La divulgación proporciona además una composición de control negativo que comprende un ácido nucleico que no se une a la diana unida a un sustrato. El ácido nucleico que no se une a la diana se puede unir covalentemente a un sustrato. Alternativamente, el ácido nucleico que no se une a la diana se puede unir de forma no covalente a un sustrato. El ácido nucleico que no se une a la diana puede ser un ácido nucleico anterior (por ejemplo, en relación con cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008). El ácido nucleico que no se une a la diana puede comprender una secuencia codificada de cualquiera de las SEQ ID NOs. 1-241535 o un fragmento funcional del mismo. Una secuencia codificada incluye una secuencia que se reorganiza aleatoriamente en su totalidad o en parte.
También se describe en este documento un método de detección de la presencia o el nivel de una entidad biológica en una muestra biológica sospechosa de contener la entidad biológica, que comprende: (a) proporcionar una composición que comprende un sustrato y una composición de control negativo como se describe anteriormente, en el que el sustrato comprende uno o más agentes de unión a la entidad biológica; (b) poner en contacto la muestra biológica con la composición proporcionada en la etapa (a); (c) detectar una señal diana correspondiente a la cantidad de entidad biológica reconocida por el uno o más agentes de unión en la etapa (b); y (d) normalizar la señal diana detectada en la etapa (c) a una señal de control correspondiente a la cantidad de señal producida por la composición de control negativo, detectando así la presencia o el nivel de la entidad biológica en la muestra biológica. La normalización de la señal diana puede comprender restar la señal de control de la señal diana.
El uno o más agentes de unión pueden comprender un anticuerpo o un aptámero. La entidad biológica puede ser una proteína. La entidad biológica también puede ser una microvesícula. El uno o más agentes de unión pueden ser específicos para un antígeno de superficie de microvesícula, incluyendo, sin limitación, un antígeno de superficie de microvesícula seleccionado de cualquiera de las tablas 3-4 o 26. La entidad biológica, por ejemplo, una proteína, microvesícula o antígeno de superficie de microvesícula, puede ser elegida como biomarcador de una enfermedad o trastorno. En tales casos, el método puede proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de la enfermedad o trastorno como se describe adicionalmente en este documento.
También se describe en este documento un kit que comprende un reactivo para llevar a cabo el método. También se describe un uso del reactivo para llevar a cabo los métodos. El reactivo puede comprender la composición de control negativo.
La divulgación también proporciona una composición de bloqueo que comprende un ácido nucleico que no se une a la diana. El ácido nucleico que no se une a la diana puede comprender un ácido nucleico divulgado anteriormente, por ejemplo, en relación con cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008. La composición de bloqueo puede incluir además una o más selecciones de componentes del grupo que consiste en albúmina de suero bovino (BSA), caseína, pepticase, surfactantes no iónicos, Tween® 20, Triton® X -100), un anticuerpo no reactivo o fragmento del mismo, FSG (gelatina de piel de pescado), gelatina pura, una gelatina hidrolasa, polietilenglicol (PEG), sueros no reactivos y una proteína no reactiva.
La divulgación también proporciona un método de detección de la presencia o el nivel de una entidad biológica en una muestra biológica sospechosa de contener la entidad biológica, que comprende: (a) poner en contacto un sustrato con la composición de bloqueo descrita anteriormente, en el que el sustrato comprende uno o más agente de unión a la entidad biológica; (b) poner en contacto la muestra biológica con el sustrato bloqueado proporcionado en la etapa (a); y (c) detectar si la entidad biológica es reconocida por el uno o más agentes de unión en la etapa (b), detectando así la presencia o el nivel de la entidad biológica en la muestra biológica.
El uno o más agentes de unión pueden comprender un anticuerpo o un aptámero. La entidad biológica puede ser una proteína. La entidad biológica también puede ser una microvesícula. El uno o más agentes de unión pueden ser específicos para un antígeno de superficie de microvesícula, incluyendo, sin limitación, un antígeno de superficie de microvesícula seleccionado de cualquiera de las tablas 3-4 o 26. La entidad biológica, por ejemplo, una proteína, microvesícula o antígeno de superficie de microvesícula, puede ser elegido como biomarcador de una enfermedad o trastorno. En tales casos, el método puede proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de la enfermedad o trastorno como se describe adicionalmente en este documento.
Se describe un kit que comprende un reactivo para llevar a cabo el método. También se describe un uso del reactivo para llevar a cabo los métodos. El reactivo puede comprender la composición de control negativo.
Un aptámero que se une específicamente a un grupo funcional puede ser útil en la realización de la invención. El aptámero que se une al grupo funcional puede comprender un ácido nucleico divulgado anteriormente, por ejemplo, en relación con cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008. El aptámero que se une al grupo funcional puede servir como agente de bloqueo al bloquear diversos grupos funcionales y, por lo tanto, se puede usar para mejorar el rendimiento de un ensayo.
El grupo funcional se puede seleccionar del grupo que consiste en un hidrocarburo, un halógeno, un grupo que contiene oxígeno (es decir, enlaces C-O), un grupo que contiene nitrógeno, un grupo que contiene azufre, un grupo que contiene fósforo o un grupo que contiene boro. El hidrocarburo se puede seleccionar del grupo que consiste en alcanos, alquenos, alquinos, derivados de benceno, derivados de tolueno, alcanos ramificados o de anillo, carbocationes y carboaniones. El halógeno se puede seleccionar del grupo que consiste en haloalcanos, fluoroalcanos, cloroalcanos, bromoalcanos y yodoalcanos. El grupo que contiene oxígeno se puede seleccionar del grupo que consiste en alcoholes, cetonas, aldehídos, haluros de acilo, carbonatos, carboxilatos, ácidos carboxílicos, ésteres, hidroperóxidos, éteres, hemiacetales, hemicetales, acetales, cetales, ortoésteres y ortocarbonatos. El grupo que contiene nitrógeno se puede seleccionar del grupo que consiste en amidas, aminas, iminas, imidas, azidas, compuestos azo, cianatos, nitratos, nitrilos, nitritos, compuestos nitro, compuestos nitroso y derivados de piridina. El grupo que contiene azufre se puede seleccionar del grupo que consiste en tioles, sulfuros, disulfuros, sulfóxidos, sulfonas, ácidos sulfónicos, ácidos sulfónicos, tiocianatos, isocianatos, tionas y tiales. El grupo que contiene fósforo se puede seleccionar del grupo que consiste en fosfinas, fosfanos, ácidos fosfónicos, fosfatos y fosfodiésteres. El grupo que contiene boro se puede seleccionar del grupo que consiste en ácidos borónicos, ésteres borónicos, ácidos borínicos y ésteres borónicos.
El grupo funcional se puede seleccionar del grupo que consiste en acetales, grupos acilo, haluros de acilo, grupos alquenilo, alcóxidos, grupos alcoxi, grupos alquinilo, amidas, óxidos de amina, aminas, carbodiimidas, carboximidatos, ácidos carboxílicos, cianamidas, cianatos, ditiocarbamatos, enoles, ésteres, éteres, hidrazinas, hidrazonas, ácidos hidroxámicos, imidas, isocianatos, isocianuros, isotiocianatos, cetales, cetenos, cetonas, grupos salientes, nitrilos, organohaluros, organofosforados, ortoésteres, oximas, fosfonofluoridatos, fosfonotioatos, fosforamidotioatos, fosforoditioatos, fosforofluoridatos, fosforotioatos, grupos protectores, pirofosfatos, semicarbazidas, semicarbazonas, sulfamatos, ésteres de sulfonato, sulfonas, ácidos sulfónicos, grupos sulfonilo, sulfoximinas, compuestos de sulfurilo, tioamidas, tiocianatos, tioésteres, tiolatos, tionas, compuestos de tiofosforilo y tiosulfinatos. El grupo funcional también se puede seleccionar del grupo que consiste en acetal, grupo acetoxi, acetiluro, anhídrido de ácido, grupo activador, cloruro de acilo, haluro de acilo, acilal, aciloína, acilsilano, alcohol, aldehído, aldimina, alcano, alqueno, alcóxido, alquilo cicloalcano, nitritos de alquilo, alquino, aleno, amida, amidina, aminal, óxido de amina, azida, azina, aziridina, azoxi, bifuncional, bistiosemicarbazona, biuret, ácido borónico, carbamato, carbamino, carbazida, carbeno, carbinol, éster de carbonato, carbonilo, carboxamida, carboximidato, ácido carboxílico, cloroformiato, cumuleno, éster de cianato, cianimida, cianohidrina, grupos desactivadores, depsido, diazo, diol, ditiocarbamato, enamina, enediina, enol, enol éter, enona, enina, episulfuro, epóxido, éster, éter, fluorosulfonato, halohidrina, halocetona, hemiacetal, hemiaminal, hemitioacetal, hidrazida, hidrazona, ácido hidroxámico, hidroxilo, hidroxilamina, imina, iminio, isotiouronio, cetena, cetenimina, cetona, cetilo, lactama, lactatol, lactona, metina, grupo metilo, nitrato, iluro de nitrilo, nitrilimina, compuesto nitro, nitroamina, nitronato, nitrona, ion nitronio, nitrosamina, nitroso, ortoéster, osazona, oxaziridina, oxima, sal de n-oxoamonio, peróxido, peroxiácido, carbeno persistente, fenoles, fosfaalqueno, fosfaalquino, fosfato, fosfinato, fosfina, óxido de fosfina, fosfinita, fosfonato, fosfonita, fosfonio, fosforano, s-nitrosotiol, base de Schiff, selenol, ácido selenónico, selone, semicarbazida, semicarbazona, éter silílico de enol, éter silílico, sulfenamida, ácido sulfénico, cloruro de sulfenilo, sulfuro, sulfilimina, sulfinamida, ácido sulfínico, éster de sulfito, sulfonamida, sulfonanilida, sulfonato, sulfonilo, haluro de sulfonilo, sulfóxido, sulfurilo, sultona, telurol, tial, tioacetal, tioamida, tiocarbamato, tiocarboxi, tiocianato, tioéster, tioéter, tioketal, tioketona, tiol, tiolactona, tiourea, tosilhidrazona, triazeno, triol, urea, vanillilo, xantato, iluro e ynolato. El grupo funcional puede comprender un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo hidroxilo, un grupo hidrazida y/o un grupo clorometilo. Por ejemplo, el grupo funcional puede ser un grupo carboxilo.
También se describe en este documento una composición que comprende el aptámero que se une al grupo funcional y un sustrato. El sustrato puede ser cualquier sustrato útil, por ejemplo, un sustrato plano o una microesfera. Véanse, por ejemplo, las figuras 16A-16B. El sustrato se puede modificar, por ejemplo, con una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en modificado con carboxilo, modificado con amino, modificado con hidroxilo, modificado con hidrazida, modificado con clorometilo y una combinación de los mismos. El sustrato puede comprender un grupo carboxilo. El aptámero puede estar unido al grupo carboxilo. El sustrato también puede comprender un agente de unión, incluyendo, sin limitación, un anticuerpo o un aptámero. La composición puede comprender además una microvesícula.
También se describe un kit que comprende un reactivo y el uso del reactivo, en el que el reactivo puede comprender un aptámero que se une a un grupo funcional y/o la composición descrita anteriormente.
También se describe un método, comprendiendo dicho método poner en contacto un aptámero que se une a un grupo funcional como se describe anteriormente con un sustrato, por ejemplo, un sustrato plano o una microesfera. Como se describió anteriormente, el sustrato se puede modificar, por ejemplo, con una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en modificado con carboxilo, modificado con amino, modificado con hidroxilo, modificado con hidrazida, modificado con clorometilo y una combinación de los mismos. El sustrato puede comprender un grupo carboxilo. El aptámero puede estar unido al grupo carboxilo. El sustrato también puede comprender un agente de unión, incluyendo, sin limitación, un anticuerpo o un aptámero. El método puede comprender además poner en contacto el sustrato con una diana del agente de unión, por ejemplo, una proteína o una microvesícula.
También se describe un kit que comprende un reactivo para llevar a cabo el método. También se describe un uso del reactivo para llevar a cabo los métodos. El reactivo puede comprender un aptámero que se une a un grupo funcional y/o la composición descrita anteriormente.
También se describe en este documento un método de detección de la presencia o el nivel de una entidad biológica en una muestra biológica sospechosa de contener la entidad biológica, comprendiendo dicho método: (a) proporcionar una composición que comprende uno o más agentes de unión específicos para la entidad biológica unida a un sustrato carboxilado, en el que el sustrato carboxilado está unido a un aptámero de unión a un grupo funcional; (b) poner en contacto la muestra biológica con la composición proporcionada en la etapa (a); y (c) detectar si la entidad biológica es reconocida por el uno o más agentes de unión en la etapa (b), detectando así la presencia o el nivel de la entidad biológica en la muestra biológica. El aptámero de unión al grupo funcional puede ser un aptámero de unión al grupo funcional descrito anteriormente.
El uno o más agentes de unión pueden comprender un anticuerpo o un aptámero. La entidad biológica puede ser una proteína. La entidad biológica también puede ser una microvesícula. El uno o más agentes de unión pueden ser específicos para un antígeno de superficie de microvesícula, incluyendo, sin limitación, un antígeno de superficie de microvesícula seleccionado de cualquiera de las tablas 3-4 o 26. La entidad biológica, por ejemplo, una proteína, microvesícula o antígeno de superficie de microvesícula, puede ser elegida como biomarcador de una enfermedad o trastorno. En tales casos, el método puede proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de la enfermedad o trastorno como se describe adicionalmente en este documento.
También se describe en este documento un kit que comprende un reactivo para llevar a cabo el método. También se describe un uso del reactivo para llevar a cabo los métodos. El reactivo puede comprender uno o más del aptámero de unión al grupo funcional y el sustrato.
También se describe en este documento un método de mejora de la unión, comprendiendo el método: (a) poner en contacto un sustrato con un aptámero capaz de unirse a un grupo carboxilo, en el que el sustrato también comprende una o más moléculas seleccionadas de ácido nucleico o polipéptido; y (b) poner en contacto el sustrato con un agente de unión capaz de unirse a la molécula de ácido nucleico o polipéptido, por lo que la unión del aptámero al grupo carboxilo mejora la unión del agente de unión a la molécula de ácido nucleico o polipéptido. El aptámero de unión al grupo funcional puede ser un aptámero de unión al grupo funcional descrito anteriormente. El sustrato puede ser cualquier sustrato útil, por ejemplo, un sustrato plano o una microesfera. El ácido nucleico o polipéptido se puede unir covalentemente a un grupo carboxilo a través de un enlace amida. El sustrato puede comprender el agente de unión.
Se describe un kit que comprende un reactivo para llevar a cabo el método. También se describe un uso del reactivo para llevar a cabo los métodos. El reactivo puede comprender uno o más del aptámero de unión al grupo funcional y el sustrato.
También se describen composiciones que comprenden un complejo entre un sustrato y una muestra, y métodos de uso de las mismas. Se describe un método de selección de uno o más agentes de unión, comprendiendo el método: (a) poner en contacto un sustrato con una muestra biológica para permitir la formación de un complejo sustrato-muestra biológica; (b) poner en contacto el complejo sustrato-muestra biológica con una pluralidad de agentes de unión candidatos; y (c) identificar uno o más miembros de la pluralidad de agentes de unión candidatos que se asocian con el complejo sustrato-muestra biológica, seleccionando así el uno o más agentes de unión. El uno o más agentes de unión pueden ser un ácido nucleico, molécula de ADN, molécula de ARN, anticuerpo, conjugado de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero, peptoide, ADNz, ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA), lectina, polipéptido, péptido, dendrímero, agente marcador de proteína de membrana, compuesto químico o una combinación de los mismos. El uno o más agentes de unión pueden comprender un aptámero.
La muestra biológica puede ser cualquier muestra útil, por ejemplo, una muestra de tejido, una muestra de cultivo celular o un fluido biológico. La muestra biológica puede comprender un fluido corporal, opcionalmente en el que el fluido corporal comprende sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido de Cowper o líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural y peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción de la mucosa, agua de heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, líquido de la cavidad del blastocisto, sangre del cordón umbilical o un derivado de cualquiera de estos. La muestra biológica puede incluir una población heterogénea de microvesículas o una población homogénea de microvesículas.
La muestra biológica puede ser una muestra de plasma concentrado, una muestra de suero, una muestra de suero clarificado o una muestra de plasma clarificado. La muestra de suero clarificado o plasma clarificado puede tener niveles reducidos de una o más proteínas abundantes en comparación con una muestra de control no clarificada. La una o más proteínas abundantes puede ser una proteína de la sangre. Tales proteínas sanguíneas abundantes incluyen, sin limitación, albúmina, IgG, transferrina, fibrinógeno, fibrina, IgA, a2-macroglobulina, IgM, a1-antitripsina, complemento C3, haptoglobulina, apolipoproteína A1, A3 y B; a1 glicoproteína ácida, ceruloplasmina, complemento C4, C1q, IgD, prealbúmina (transtiretina), plasminógeno, un derivado de cualquiera de los mismos y una combinación de los mismos. La una o más proteínas abundantes pueden comprender una o más de albúmina, inmunoglobulinas, fibrinógeno, prealbúmina, alfa 1 antitripsina, alfa 1 glicoproteína ácida, alfa 1 fetoproteína, haptoglobina, alfa 2 macroglobulina, ceruloplasmina, transferrina, proteínas del complemento C3 y C4, beta 2 microglobulina, beta lipoproteína, proteínas gamma globulinas, proteína C reactiva (CRP), lipoproteínas (quilomicrones, VLDL, LDL, HDL), otras globulinas (tipos alfa, beta y gamma), protrombina, lectina de unión a manosa (MBL), un derivado de cualquiera de los mismos, y una combinación de los mismos.
La una o más proteínas abundantes se pueden separar del suero clarificado o muestra de plasma clarificado en su totalidad o en parte por cromatografía, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, inmunoafinidad, precipitación o una combinación de los mismos. La una o más proteínas abundantes también se pueden separar del suero clarificado o de la muestra de plasma clarificado después de poner en contacto la muestra biológica con tromboplastina. Al menos 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de la una o más proteínas abundantes se pueden separar de la muestra de suero clarificado o plasma clarificado en comparación con la muestra de control no clarificado.
El complejo sustrato-muestra biológica puede comprender una reticulación entre el sustrato y un componente de la muestra biológica, en el que opcionalmente la reticulación comprende una fotoreticulación, un reticulante imidoéster, suberimidato de dimetilo, un reticulante lipídico, un reticulante éster de N-hidroxisuccinimida, suberato de bissulfosuccinimidilo (BS3), un aldehído, acroleína, crotonaldehído, formaldehído, un reticulante de carbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DDC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC o EDAC), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), un sulfosuccinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC), un sulfo-N-hidroxisuccinimidil-2-(6-[biotinamido]-2-(p-azido benzamido)-hexanoamido) etil-1,3'-ditiopropionato (Sulfo-SBED), metanotiosulfonato de 2-[N2-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil)-N6-(6-biotina-amidocaproil)-L-lisinil]etilo (Mts-Atf-Biotina), metanotiosultonato de 2-{N2-[N6-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil-6-aminocaproil)-N6-(6-biotinamidocaproil)-L-lisinilamido]} etilo (Mts-Atf -LC- biotina), un aminoácido fotorreactivo, L-foto-leucina, L-foto-metionina, un reticulante de N- hidroxisuccinimida (NHS), un reactivo NHS-azida, NHS-azida, NHS-PEG4-azida, NHS-PEG12-azida, un reactivo NHS-fosfina, NHS-fosfina, Sulfo-NHS-fosfina, o cualquier combinación o modificación de los mismos. El sustrato se puede reticular directamente con el componente de la muestra biológica, o el sustrato se puede reticular con el componente de la muestra biológica a través de un enlazante.
El componente de la muestra biológica puede comprender una microvesícula. Cuando se usa un enlazante, el enlazante se puede incrustar dentro de la membrana de la microvesícula. Véanse, por ejemplo, las figuras 10A-10B. Dicho enlazante puede incluir, sin limitación, un lípido funcionalizado, opcionalmente en el que el lípido funcionalizado comprende 16:0 Biotinilo PE 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinilo) (sal sódica), 18:1 Biotinilo PE 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinilo) (sal sódica), 16:0 Biotinilo Cap PE 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinilo) (sal de sodio), 18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinilo) (sal de sodio), o una combinación de los mismos.
El enlazante también puede comprender un diacil glicerol, diacil fosfoglicerol (fosfolípido) o esterol, dialquil glicerol, dialquil- o diacil-1-amino-2,3-dihidroxipropano, alquil o acilo de cadena larga, esfingolípido, ceramida, fosfolípido, secuencia de anclaje de membrana de glicosilfosfatidilinositol (GPI), anclaje de membrana de glicofosfolípido, fragmento de receptor de membrana, receptor de unión a proteínas, receptor quelante de metales, receptor de unión a Fc de inmunoglobulina, receptor de unión a citocinas o factor de crecimiento, receptor de unión a fármacos, receptor que imita lípidos, receptor de transmembrana, receptor de unión a proteínas sintético, receptor quelante de metales sintético, receptor de unión a Fc de inmunoglobulina sintética, receptor de unión a factor de crecimiento o citocina sintético, receptor de unión a fármacos sintético, receptor imitador de lípidos sintéticos, receptor transmembrana sintético, proteína, péptido, peptidomimético, esfingolípido, esteroide, colesterol, dihidrocolesterol, ergosterol, brasicasterol, colesterilamina, dihidrocolesterolamina, ergosterilamina, brasicasterilamina, 3-colesterilamina, 3-dihidrocolesterilamina, 3-ergosterilamina, 3-brassicasterilamina, 3 p-colesterilamina, 3 p-dihidrocolesterilamina, 3 pergosterilamina, 3 p-brasicasterilamina, o un fragmento funcional o derivado de cualquiera de los mismos.
El sustrato se puede conjugar con un agente de unión al componente de la muestra biológica. El agente de unión puede ser un anticuerpo, un aptámero o una lectina, en el que opcionalmente la lectina comprende concanavalina A (ConA). El componente de la muestra biológica puede ser una microvesícula, en el que opcionalmente el agente de unión comprende un agente de unión a un antígeno de superficie de microvesícula. Véanse, por ejemplo, las figuras 7A-7D.
El método puede comprender además la identificación del uno o más agentes de unión, por ejemplo, usando los métodos divulgados en este documento.
También se describe en este documento una composición de la materia, comprendiendo la composición un complejo sustrato-microvesícula, en el que el sustrato comprende un sustrato sintético. Tal sustrato puede ser una perla, un pocillo o un sustrato plano, en el que opcionalmente la perla comprende una perla magnética o una perla de poliestireno.
También se describe un kit que comprende un reactivo para llevar a cabo el método. También se describe un uso del reactivo para llevar a cabo los métodos. El reactivo puede comprender uno o más de un complejo sustratomicrovesículas y un agente enlazante. El reactivo puede comprender la composición anterior.
También se describe un método de producción de un complejo sustrato-microvesícula estable, comprendiendo el método poner en contacto un sustrato con una microvesícula, en el que el sustrato se funcionaliza con un grupo químico capaz de unirse directamente a al menos un componente presente en la superficie de la microvesícula. El sustrato puede ser una perla, un pocillo, una matriz o un sustrato plano. El al menos un componente puede ser un biomarcador útil, incluyendo, sin limitación, un péptido, polipéptido, proteína, lípido, carbohidrato, un derivado del mismo o una combinación de los mismos. El grupo químico puede ser un peptoide, ADNz, ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA), lectina, péptido/polipéptido, dendrímero, agente de marcaje de proteínas de membrana, compuesto químico, una fotoreticulación, un reticulante de imidoéster, suberimidato de dimetilo, un reticulante lipídico, un reticulante de éster de N-hidroxisuccinimida, suberato de bissulfosuccinimidilo (BS3), un aldehído, acroleína, crotonaldehído, formaldehído, un reticulante de carbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DDC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC o EDAC), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), un Sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC), un sulfo-N-hidroxisuccinimidil-2-(6-[biotinamido]-2-(p-azido benzamido)-hexanoamido) etil-1,3'-ditiopropionato (Sulfo-SBED), metanotiosulfonato de 2-[N2-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil)-N6-(6-biotina-amidocaproil)-L-lisinil]etilo (Mts- Atf -biotina), metanotiosultonato de 2-{N2-[N6-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil-6-amino-caproil)-N6-(6-biotinamidocaproil)-L-lisinilamido]} etilo (Mts-Atf -LC-biotina), un aminoácido fotorreactivo, L-foto-leucina, L-foto-metionina, un reticulante de N- hidroxisuccinimida (NHS), un reactivo NHS-azida, NHS-azida, NHSPEG4-azida, NHS-PEG12-Azida, un reactivo de NHS-fosfina, NHs-fosfina, Sulfo-NHS-fosfina, o una combinación de los mismos. El grupo químico puede comprender un hidrocarburo, un halógeno, un grupo que contiene oxígeno (es decir, enlaces C-O), un grupo que contiene nitrógeno, un grupo que contiene azufre, un grupo que contiene fósforo, un grupo que contiene boro o una combinación de los mismos. El hidrocarburo se puede seleccionar del grupo que consiste en alcanos, alquenos, alquinos, derivados de benceno, derivados de tolueno, alcanos ramificados o de anillo, carbocationes y carboaniones. El halógeno se puede seleccionar del grupo que consiste en haloalcanos, fluoroalcanos, cloroalcanos, bromoalcanos y yodoalcanos. El grupo que contiene oxígeno se puede seleccionar del grupo que consiste en alcoholes, cetonas, aldehídos, haluros de acilo, carbonatos, carboxilatos, ácidos carboxílicos, ésteres, hidroperóxidos, éteres, hemiacetales, hemicetales, acetales, cetales, ortoésteres y ortocarbonatos. El grupo que contiene nitrógeno se puede seleccionar del grupo que consiste en amidas, aminas, iminas, imidas, azidas, compuestos azo, cianatos, nitratos, nitrilos, nitritos, compuestos nitro, compuestos nitrosos y derivados de piridina. El grupo que contiene azufre se puede seleccionar del grupo que consiste en tioles, sulfuros, disulfuros, sulfóxidos, sulfonas, ácidos sulfónicos, ácidos sulfónicos, tiocianatos, isotianatos, tionas y tiales. El grupo que contiene fósforo se puede seleccionar del grupo que consiste en fosfinas, fosfanos, ácidos fosfónicos, fosfatos y fosfodiésteres. El grupo que contiene boro se puede seleccionar del grupo que consiste en ácidos borónicos, ésteres borónicos, ácidos borínicos y ésteres borónicos.
El grupo químico puede comprender un acetal, grupo acilo, haluro de acilo, grupo alquenilo, alcóxido, grupo alcoxi, grupo alquinilo, amida, óxido de amina, amina, carbodiimida, carboximidato, ácido carboxílico, cianamida, cianato, ditiocarbamato, enol, éster, éter, hidrazina, hidrazona, ácido hidroxámico, imida, isocianato, isocianuro, isotiocianato, cetal, cetena, cetona, grupo saliente, nitrilo, organohaluro, organofosforo, ortoéster, oxima, fosfonofluoridato, fosfonotioato, fosforamidotioato, fosforoditioato, fosforofluoridato, fosforotioato, grupo protector, pirofosfato, semicarbazida, semicarbazona, sulfamato, éster de sulfonato, sulfona, ácido sulfónico, grupo sulfonilo, sulfoximina, compuesto de sulfurilo, tioamida, tiocianato, tioéster, tiolato, tiona, compuesto de tiofosforilo y/o tiosulfinatos. El grupo químico se puede seleccionar del grupo que consiste en acetal, grupo acetoxi, acetiluro, anhídrido de ácido, grupo activador, cloruro de acilo, haluro de acilo, acilal, aciloína, acilsilano, alcohol, aldehido, aldimina, alcano, alqueno, alcóxido, alquil cicloalcano, nitritos de alquilo, alquino, aleno, amida, amidina, aminal, óxido de amina, azida, azina, aziridina, azoxi, bifuncional, bistiosemicarbazona, biuret, ácido borónico, carbamato, carbamino, carbazida, carbeno, carbinol, éster de carbonato, carbonilo, carboxamida, carboximidato, ácido carboxílico, cloroformiato, cumuleno, éster de cianato, cianimida, cianohidrina, grupos desactivadores, depsido, diazo, diol, ditiocarbamato, enamina, enediina, enol, enol éter, enona, enina, episulfuro, epóxido, éster, éter, fluorosulfonato, halohidrina, halocetona, hemiacetal, hemiaminal, hemitioacetal, hidrazida, hidrazona, ácido hidroxámico, hidroxilo, hidroxilamina, imina, iminio, isotiouronio, cetena, cetenimina, cetona, cetil, lactama, lactol, lactona, metino, grupo metilo, nitrato, iluro de nitrilo, nitrilimina, compuesto nitro, nitroamina, nitronato, nitrona, ion nitronio, nitrosamina, nitroso, ortoéster, osazona, oxaziridina, oxima, sal de n-oxoamonio, peróxido, peroxiácido, carbeno persistente, fenoles, fosfaalqueno, fosfaalquino, fosfato, fosfinato, fosfina, óxido de fosfina, fosfinita, fosfonato, fosfonita, fosfonio, fosforano, s-nitrosotiol, base de Schiff, selenol, ácido selenónico, selone, semicarbazida, semicarbazona, éter silílico de enol, éter silílico, sulfenamida, ácido sulfénico, cloruro de sulfenilo, sulfuro, sulfilimina, sulfinamida, ácido sulfínico, éster de sulfito, sulfonamida, sulfonanilida, sulfonato, sulfonilo, haluro de sulfonilo, sulfóxido, sulfurilo, sultona, telurol, tial, tioacetal, tioamida, tiocarbamato, tiocarboxi, tiocianato, tioéster, tioéter, tiocetal, tiocetona, tiol, tiolactona, tiourea, tosilhidrazona, triazeno, triol, urea, vanillilo, xantato, iluro e ynolato. El grupo químico puede comprender un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo hidroxilo, un grupo hidrazida y/o un grupo clorometilo. Por ejemplo, el grupo químico puede ser un grupo carboxilo.
También se describe en este documento una composición de la materia, comprendiendo la composición un complejo sustrato-microvesícula, en el que el sustrato comprende un sustrato sintético como se describe anteriormente. También se describe una composición de microvesículas estabilizada que comprende una microvesícula directamente conjugada con un sustrato inerte. El sustrato puede ser una perla, un pocillo, una matriz o un sustrato plano, en el que opcionalmente la perla comprende una perla magnética o una perla de poliestireno. Véase, por ejemplo, cualquiera de las figuras 7A-7d , las figuras 10A-12E.
También se describe un kit que comprende uno o más reactivos para llevar a cabo el método anterior, opcionalmente en el que el uno o más reactivos comprenden uno o más de un complejo sustrato-microvesícula y un agente enlazante. También se describe un uso del uno o más reactivos para llevar a cabo el método.
También se describe un método de visualización de una microvesícula. Véanse, por ejemplo, las figuras 11A-12E. El método comprende: (a) poner en contacto la microvesícula con un agente de unión a un antígeno de microvesícula, en el que el agente de unión comprende una etiqueta; (b) fijar la microvesícula contactada a un sustrato de microscopía electrónica de barrido (SEM); (c) recubrimiento por pulverización catódica de la microvesícula fijada; y (d) usando SEM para visualizar la microvesícula y la etiqueta. La microvesícula se puede unir a un sustrato antes de la etapa (a). La microvesícula se puede unir al sustrato a través de un enlace covalente. La microvesícula también se puede unir al sustrato a través de un enlace de inmunoafinidad. Véanse, por ejemplo, las figuras 7A-7E; La figura 10B.
El agente de unión se puede marcar directamente o el agente de unión se puede marcar indirectamente. La etiqueta indirecta puede comprender un agente de unión marcado que forma un complejo con el agente de unión al antígeno de la microvesícula. Se puede usar cualquier agente de unión útil en el método, por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo funcional o un aptámero.
El antígeno de la microvesícula se puede elegir para visualizar una microvesícula de interés. El antígeno se puede seleccionar de la tabla 3, tabla 4 o tabla 26. Por ejemplo, el antígeno de microvesícula puede ser un marcador de vesícula general, incluyendo, sin limitación, una tetraspanina, CD9, CD63, CD81 o cualquier combinación de los mismos.
El recubrimiento por pulverización catódica puede comprender un recubrimiento de oro y/o paladio. El recubrimiento por pulverización catódica puede comprender un recubrimiento de carbono. El SEM puede comprender el modo de electrones secundarios (SE) para visualizar las microvesículas y/o el modo de electrones retrodispersados (BSE) para visualizar la etiqueta. La etiqueta puede contener oro.
La (i) la microvesícula se puede unir a un sustrato antes de la etapa (a) a través de un enlace covalente; (ii) el agente de unión al antígeno de microvesículas es un anticuerpo marcado indirectamente, en el que la etiqueta indirecta comprende un anticuerpo marcado con oro que forma un complejo con el anticuerpo contra el antígeno de microvesículas; (iii) el antígeno de la microvesícula es CD9; (iv) el recubrimiento por pulverización catódica comprende un recubrimiento de carbono; y (v) el SEM comprende el modo de electrones secundarios (SE) para visualizar las microvesículas y/o el modo de retrodispersión de electrones (BSE) para visualizar la etiqueta.
También se describen kits y usos de uno o más reactivos para llevar a cabo los métodos de la invención. El uno o más reactivos pueden comprender cualquier reactivo útil para llevar a cabo los métodos en cuestión, incluyendo, sin limitación, bibliotecas de aptámeros, sustratos tales como microperlas o matrices planas o pocillos, reactivos para biomarcadores y/o aislamiento de microvesículas, aptámeros dirigidos a dianas específicas, grupos de aptámeros que facilitan la detección de una población de biomarcadores/microvesículas, reactivos tales como cebadores para la secuenciación o amplificación de ácidos nucleicos, matrices para la hibridación de ácidos nucleicos, etiquetas detectables, disolventes o soluciones reguladoras y similares, diversos enlazantes, diversos componentes de ensayo, bloqueadores y similares. El uno o más reactivos también pueden comprender diversas composiciones descritas en este documento.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A-1F ilustran métodos de evaluación de biomarcadores tales como antígenos de superficie de microvesículas. La figura 1A es un esquema de un sustrato plano recubierto con un agente de captura, tal como un aptámero o un anticuerpo, que captura vesículas que expresan el antígeno diana del agente de captura. El agente de captura se puede unir a una proteína expresada en la superficie de las vesículas desprendidas de las células enfermas ("vesícula de la enfermedad"). El agente de detección, que también puede ser un aptámero o un anticuerpo, lleva una etiqueta detectable, en este documento una señal fluorescente. El agente de detección se une a la vesícula capturada y proporciona una señal detectable a través de su etiqueta fluorescente. El agente de detección puede detectar un antígeno que generalmente está asociado con vesículas, o está asociado con una célula de origen o una enfermedad, por ejemplo, un cáncer. La figura 1B es un esquema de una perla de partículas conjugada con un agente de captura, que captura vesículas que expresan el antígeno diana del agente de captura. El agente de captura se puede unir a una proteína expresada en la superficie de las vesículas desprendidas de las células enfermas ("vesícula de la enfermedad"). El agente de detección, que también puede ser un aptámero o un anticuerpo, lleva una etiqueta detectable, en este documento una señal fluorescente. El agente de detección se une a la vesícula capturada y proporciona una señal detectable a través de su etiqueta fluorescente. El agente de detección puede detectar un antígeno que generalmente está asociado con vesículas, o está asociado con una célula de origen o una enfermedad, por ejemplo, un cáncer. La figura 1C es un ejemplo de un esquema de cribado que se puede realizar usando diferentes combinaciones de agentes de captura y detección para los biomarcadores indicados. Las combinaciones de biomarcadores se pueden detectar usando ensayos como se muestra en las figuras 1A-1B. Las figuras 1D-1E presentan esquemas ilustrativos para capturar y detectar vesículas para caracterizar un fenotipo. La figura 1F presenta esquemas ilustrativos para evaluar la carga útil de vesículas para caracterizar un fenotipo.
Las figuras 2A-2B ilustran una estrategia de selección de ensayo competitivo. Un grupo aleatorio de candidatos a aptámeros de ácidos nucleicos (la biblioteca) se incuba con una diana de interés 202. Se pueden realizar múltiples rondas de unión en las que: 1) la biblioteca se incuba con la diana; 2) la mezcla biblioteca-diana se lava para retirar los candidatos a aptámeros no unidos; 3) los candidatos a aptámeros unidos se eluyen de la diana; y 4) los candidatos a aptámeros eluidos se agregan de nuevo a la diana y se permite que se unan. La figura 2A ilustra el candidato 201 a aptámero unido a la diana 202. En la etapa i), luego se agrega a la reacción un anticuerpo 203 competidor. La figura 2B ilustra el anticuerpo 203 candidato compitiendo con el candidato 201 a aptámero en el epítopo del anticuerpo. El candidato 201 a aptámero es desplazado por el anticuerpo y luego se recoge.
La figura 3 presenta un esquema para identificar aptámeros frente a una diana de interés.
La figura 4 ilustra los resultados de un ensayo de unión que muestra la afinidad de unión de un aptámero de ejemplo (Aptámero ID BTX176881 (SEQ ID NO. 98883)) a la proteína EpCAM diana en diversas concentraciones diana. El aptámero que se va que se va a probar se fija a un sustrato usando una cola de biotina y se incuba con diversas concentraciones de diana (125, 250 y 500 nM). La prueba se realiza en una máquina de resonancia de plasmones superficiales (SPR). La máquina de SPR detecta la asociación y disociación del aptámero y la diana. La diana se aplica hasta que los eventos de asociación y disociación sean iguales, lo que da como resultado una meseta de la curva. Las ecuaciones que describen la curva en cada concentración se pueden usar para calcular la Kd del aptámero (véase, la tabla 5).
Las figuras 5A-5B ilustran las secuencias de nucleótidos del aptámero y la predicción de la estructura secundaria correspondiente. La figura 5A ilustra una estructura secundaria de un oligonucleótido de 32-mer, el aptámero 4, con la secuencia 5'-CCCCCCGAATCACATGACTTGGGCGGGGGTCG (SEQ ID NO. 1). En la figura, la secuencia se muestra con 6 nucleótidos de timina agregados al final, que pueden actuar como un espaciador para unir una molécula de biotina. Este oligo particular tiene una alta afinidad de unión a la diana, EpCAM (véase, la tabla 5). Los aglutinantes de EpCAM candidatos adicionales se identifican mediante el modelado de la base de datos completa de oligos secuenciados a la estructura secundaria de este oligo. La figura 5B ilustra otro oligo de 32-mer con la secuencia 5'-ACCGGATAGCGGTTGGAGGCGTGCTCCACTCG (SEQ ID NO. 3840) que tiene una estructura secundaria diferente a la del aptámero de la figura 5A. Este aptámero también se muestra con una cola de 6-timina.
La figura 6 ilustra un procedimiento para producir un conjunto de aptámeros específicos de diana usando un método de sustracción de células, en el que la diana es un biomarcador asociado con una enfermedad específica. En la etapa 1, se pone en contacto un grupo aleatorio de oligonucleótidos con una muestra biológica de un paciente normal. En la etapa 2, los oligos que no se unieron en la etapa 1 se agregan a una muestra biológica aislada de pacientes enfermos. Los oligos unidos de esta etapa luego se eluyen, se capturan a través de su enlace de biotina y luego se combinan nuevamente con una muestra biológica normal. Luego, los oligos no unidos se agregan nuevamente a la muestra biológica derivada de la enfermedad y se aíslan. Este procedimiento puede repetirse iterativamente. Los aptámeros eluidos finales se prueban con muestras de pacientes para medir la sensibilidad y la especificidad del conjunto. Las muestras biológicas pueden incluir sangre, incluidos plasma o suero, u otros componentes del sistema circulatorio, tales como microvesículas.
Las figuras 7A-7D ilustran métodos para unir microvesículas a un sustrato. La figura 7A ilustra la conjugación directa de una microesfera carboxilada con un antígeno de superficie vesicular. La figura 7B ilustra el anclaje de una microvesícula a una microesfera a través de un anclaje de lípido funcionalizado con biotina. La figura 7C ilustra la unión del anticuerpo a un antígeno de la superficie de la vesícula, en el que el anticuerpo se conjuga con una microesfera carboxilada. La figura 7D ilustra la unión del aptámero a un antígeno de la superficie de la vesícula, en el que el aptámero se conjuga con una microesfera carboxilada.
Las figuras 8A-8B ilustran la detección de microvesículas derivadas de VCAP conjugadas con microperlas. Las vesículas conjugadas con perlas se detectaron usando perlas MagPlex según el protocolo del fabricante (Luminex Corp., Austin TX). Las microvesículas se detectaron con anticuerpos marcados con ficoeritrina (PE) contra CD9 (Figura 8A) o CD63 (Figura 8B), dos proteínas superficiales de microvesículas comunes. El eje Y de las figuras muestra la intensidad fluorescente media (MFI) de las microvesículas detectadas. Varias condiciones experimentales se indican a lo largo del eje X. Los ensayos se realizaron con varios agentes de bloqueo ("SBB": StartingBlock, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL.; "milk": dried milk blocking buffer; "Casein(pbs)": casein blocking buffer) o sin bloqueo (“sin bloque"). Los controles se ejecutaron sin detectores donde se indica.
Las figuras 9A-9D ilustran la captura de microvesículas usando microesferas conjugadas con anticuerpos. La figura 9A muestra títulos de microvesículas derivadas de Vcap frente a perlas conjugadas de Ab. Las perlas MagPlex se conjugaron con anticuerpos contra EpCAM, CD63 o CD81 según el protocolo del fabricante (Luminex Corp., Austin TX). Las microvesículas se detectaron con anticuerpos marcados con ficoeritrina (PE) contra CD9, una proteína común de la superficie de las microvesículas. El eje Y de las figuras muestra la intensidad fluorescente media (MFI) de las microvesículas detectadas. El eje X indica la cantidad de entrada de vesículas VCap. La figura 9B muestra la captura de microvesículas de plasma usando anticuerpos anti-CD63 conjugados con perlas para la captura y anticuerpos anti-CD9 marcados con PE para la detección. El gráfico muestra la detección de diversos números de microesferas como se indica para microvesículas aisladas en diversas condiciones: microvesículas después de ultracentrifugación con gradiente de sacarosa sin o con Tween 20 al 0.1 % ("UC-PBS” y "UC-PBST", respectivamente), microvesículas concentradas de plasma sometidas a ultrafiltración ("N3-Conc") y microvesículas purificadas usando la metodología ExoQuick ("N3-Exo"). Las muestras de "Control (PBS)” no tienen microvesículas. La figura 9C muestra la titulación de microvesículas capturadas con microesferas conjugadas con anticuerpos con entrada que comprende microvesículas derivadas de plasma de dos pacientes. En todas las muestras, se detectaron 5000 microesferas. Las microvesículas (cMV) se capturaron usando anticuerpos anti-CD63 o anticuerpos anti-CD81 conjugados con perlas, como se indica, y anticuerpos anti-CD9 marcados con PE para la detección. El eje X de los diagramas indica el número de vesículas en la muestra. La figura 9D muestra la estabilidad de los complejos microvesícula-microesfera capturados con anticuerpos. Las microvesículas (cMV) de tres pacientes se purificaron con la tecnología ExoQuick, luego se capturaron con anticuerpos anti-CD81 conjugados con perlas y anticuerpos anti-CD9 marcados con PE para la detección. Se detectaron aproximadamente 8.96E+07 microvesículas por 5000 perlas antes y después de la incubación de las microvesículas capturadas con perlas, durante 1 h a 800 rpm a temperatura ambiente.
Las figuras 10A-10P ilustran el anclaje de microvesículas a microesferas usando un enlazante heterobifuncional con un grupo funcional lipídico. La figura 10A ilustra un anclaje de lípidos ilustrativa: 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinilo) (sal de sodio) ("16:0 Biotinilo Cap PE"). El peso molecular es 1053.394. La figura 10A muestra la estructura química arriba y la estructura 3D abajo. El reticulante está disponible en Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, Alabama. La figura 10B ilustra el anclaje de lípidos funcionalizados con biotina de microvesículas a las microesferas. Como se muestra, una microesfera 101 carboxilada se conjuga con estreptavidina 102. El reticulante 103 se une a la estreptavidina a través de una unidad estructural de biotina (véase la figura 10A). Finalmente, el enlazante de lípidos 103 está incrustado en la membrana de bicapa lipídica de la microvesícula 104. Las figuras 10C-10E ilustran la citometría de flujo de microvesículas VCAP ancladas a microesferas usando el anclaje lipídico de las figuras 10A-10B. Las microvesículas se detectaron usando anticuerpos anti-CD9 y anti-CD63 marcados con PE. En la figura 10C, no se usó anclaje lipídico. La figura 10D es idéntica a la figura 10C con la adición del anclaje de lípidos. Estos datos ilustran microvesículas enriquecidas conjugadas con microesferas a través del anclaje de lípidos. La figura 10E y la figura 10F ilustran la replicación independiente de los experimentos de la figura 10C y la figura 10D, respectivamente. La figura 10G ilustra la titulación de cantidades variables de vesículas ancladas a lípidos detectadas como se indicó anteriormente. La figura 10H ilustra otra vista de la titulación de cantidades variables de vesículas ancladas a lípidos detectadas como antes. La cantidad indicada de vesículas VCap (cMV) se detectó usando ya sea un anticuerpo IgG anti-ratón marcado con PE como control o anticuerpos anti-CD9 y anti-CD63 marcados con PE. Las figuras 10I-10J ilustran la captura de VCaP EV (40 mg/mL) por unidad estructural de lípidos en microesferas LumAvidin y detectados con anti-CD9-PE y anti-CD63-PE por MoFlo (Figura 101) o con anti-CD9-PE de Luminex (Figura 10J). Las figuras 10K-10L ilustran la detección de vesículas aisladas de muestras de plasma usando ultracentrifugación. Por lo demás, las condiciones experimentales son como en la figura 10C y la figura 10D, respectivamente. La figura 10M y la figura 10N ilustran la detección de microvesículas VCAP ancladas a microesferas usando el anclaje lipídico de las figuras 10A-10B. Las microvesículas se detectaron usando anticuerpos anti-CD9 y anti-CD63 marcados con PE. En la figura 10M, las condiciones son similares a la figura 10D y la figura 10F. Sin embargo, en el experimento mostrado en la figura 10N, se agregaron 30 mg/ml de albúmina de suero humano (HSA) a las muestras antes de la detección. Las figuras 10O-10P muestran los valores de MFI de microvesículas conjugadas con microesferas antes (Día 0; Figura 10O) y después (Día 12; Figura 10P) 12 días de almacenamiento a -80 °C. Las vesículas aisladas usando diferentes métodos se analizaron según lo indicado por las condiciones a lo largo del eje X: 1) kit ExoQuick™ (System Biosciences, Inc., Mountain View, CA) seguido de ultrafiltración; 2) ultracentrifugación; 3) ultracentrifugación seguida de Exoquick; 4) Kit ExoQuick a ExoMir™ (Bioo Scientific Corp., Austin TX); 5) preparación de vesículas VCAP ultrafiltrada #1; 6) preparación de vesículas VCAP ultrafiltrada #2; y 7) ultrafiltración seguida de ultracentrifugación.
Las figuras 11A-11M ilustran imágenes de microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM) usadas para la evaluación de protocolos alternativos para atar las microvesículas aisladas de plasma a la superficie de microesferas. La figura 11A muestra una microesfera que no ha sido funcionalizada o conjugada. La figura 11B muestra la conjugación directa de microvesículas de plasma aisladas mediante ultracentrifugación en perlas no magnéticas. La figura 11C muestra una ampliación de la región indicada de la figura 11B. Las flechas apuntan a diversas microvesículas. La figura 11D y la figura 11E corresponden a la figura 11B y la figura 11C, respectivamente, excepto que las perlas son magnéticas. Las figuras 11F-H muestran perlas magnéticas funcionalizadas. La figura 11F muestra perlas conjugadas de avidina funcionalizadas con concanavalina A biotinilada (ConA), que es una lectina (es decir, una proteína de unión a carbohidratos) que se une específicamente a ciertas estructuras que se encuentran en diversos azúcares, glicoproteínas y glicolípidos, principalmente grupos internos y terminales no reductores a-D-manosilo y a-D-glucosilo. La figura 11G muestra perlas conjugadas con avidina funcionalizadas con un anclaje de lípidos biotinilada. La figura 11H muestra perlas directamente conjugadas con anticuerpos anti-CD9. La figura 11I muestra la captura de perlas de microvesículas de plasma aisladas usando ultracentrifugación para perlas funcionalizadas con ConA. La figura 11J muestra una ampliación de la región indicada de la figura 11I. Las flechas apuntan a diversas microvesículas. La figura 11K muestra la captura de perlas de microvesículas de plasma aisladas usando ultracentrifugación para perlas funcionalizadas con anclaje de lípidos. La figura 11L muestra una ampliación de la región indicada de la figura 11K. Las flechas apuntan a diversas microvesículas. La figura 11M muestra la captura de perlas de microvesículas de plasma aisladas usando ultracentrifugación para perlas funcionalizadas con anclaje de lípidos. La figura 11N muestra una ampliación de la región indicada de la figura 11M. Las flechas apuntan a diversas microvesículas.
Las figuras 12A-12E ilustran el protocolo FE-SEM-ImmunoGold para obtener imágenes de microvesículas conjugadas con microperlas. Las imágenes muestran imágenes de electrones secundarios (SE) y electrones retrodispersados (BSE) de perlas carboxiladas conjugadas con microvesículas. Las figuras 12A-12B imagen de microvesículas teñidas con 10 |jg/ml de anticuerpo primario anti CD9 marcado en suspensión. La figura 12A muestra imágenes SE y la figura 12B muestra imágenes BSE. En la figura 12B, las nanopartículas de oro son puntos blancos brillantes señalados con flechas. Las características más grandes pueden ser materias inorgánicas (cristales amortiguadores) o placas lipídicas, ya que son más densas y se ven en la BSE. Las figuras12C-12D imagen de microvesículas teñidas con 10 jg/m l de anticuerpo primario anti CD9 marcado en portaobjetos de vidrio. La figura 12C muestra imágenes SE y la figura 12D muestra imágenes BSE. En la figura 12D, las nanopartículas de oro son puntos blancos brillantes señalados con flechas. La figura 12E muestra una imagen BSE (ImmunoGold) superpuesta sobre imágenes SE (microvesículas). Las nanopartículas de oro (10 nm) se representan con flechas. Las características más grandes pueden ser materias inorgánicas (cristales amortiguadores) o placas lipídicas, ya que son más densas y se ven en la BSE.
Las figuras 13A-13B ilustran esquemas para cribar una biblioteca de aptámeros para identificar uno o más aptámeros candidatos. La figura 13A ilustra un esquema 1300 para rondas positivas y opcionalmente negativas de cribado de una biblioteca de oligonucleótidos frente a una diana de interés. Se proporciona una biblioteca de oligo candidatos 1301. Para realizar una selección positiva, los oligos se ponen en contacto con la diana 1302 de interés. La mezcla se lava para retirar los oligos no unidos y luego los oligos se disocian de la mezcla lavada y se recolectan 1303. Los oligos recolectados se pueden usar como entrada para una nueva ronda de enlace de diana, que se puede repetir cualquier número de veces (indicado como 1...n). Entre rondas de selección positiva, se realiza opcionalmente una selección negativa en la que los oligos se ponen en contacto con una o más entidades 1304 no diana. Durante la selección negativa, los oligos que no se unen a una o más entidades no diana se retienen y se usan como entrada para una nueva ronda de selección 1302 positiva. Los oligos recolectados después del número deseado de rondas de selección 1303 positiva o selección 1304 negativa, se recolectan como aptámeros candidatos que se indica que se unen a la diana 1305 de interés. La figura 13B ilustra un esquema para la selección de aptámeros frente a muestras de cáncer contra muestras de control no cancerosas. El esquema muestra 8 muestras de cáncer (Ca1-Ca8) y 7 muestras de control (nCa1-nCa7), cada una de las cuales consiste en muestras individuales o muestras agrupadas. Siete selecciones diferentes (Selección 1-Selección 7) se ejecutaron en paralelo. En cada selección, un grupo de entrada de aptámeros candidatos se enriquece en aptámeros frente a una de las muestras de cáncer ("selección positiva"), y luego el grupo se agota en aptámeros frente a una de las muestras de control ("selección negativa"). Este procedimiento se repite como se indica. El orden de las muestras se modifica en cada selección para evitar sesgos de selección. Los aptámeros que quedan después de la última ronda de selección positiva comprenden los aptámeros seleccionados, que luego pueden desarrollarse más, por ejemplo, como parte de un ensayo para diferenciar las muestras cancerosas de las no cancerosas. Los grupos de aptámeros se pueden secuenciar después de cada ronda para rastrear el enriquecimiento, el agotamiento, los posibles problemas, etc.
La figura 14 comprende un esquema para identificar una diana de un aptámero seleccionado, tal como un aptámero seleccionado por el procedimiento anterior. La figura muestra un agente 1402 de unión, en este documento un aptámero con fines ilustrativos, atado a un sustrato 1401. El agente 1402 de unión se puede unir covalentemente al sustrato 1401. El agente 1402 de unión también se puede unir de forma no covalente. Por ejemplo, el agente 1402 de unión puede comprender un marcador que puede atraerse al sustrato, como un grupo de biotina que puede formar un complejo con una molécula de avidina/estreptavidina que está unida covalentemente al sustrato. El agente 1402 de unión se une a un antígeno 1403 de superficie de microvesícula 1404. En la etapa indicada por la flecha (i), la microvesícula se rompe dejando intacto el complejo entre el agente 1402 de unión y el antígeno 1403 de superficie. La microvesícula 1405 rota se retira, por ejemplo, mediante lavado o intercambio de solución reguladora, en la etapa indicada por la flecha (ii). En la etapa indicada por la flecha (iii), el antígeno 1403 de superficie se libera del agente 1402 de unión. El antígeno 1403 de superficie se puede analizar para determinar su identidad.
Las figuras 15A-B ilustran el uso de aptámeros en métodos de caracterización de un fenotipo. La figura 15A es un esquema 1500 que muestra una configuración de ensayo que se puede usar para detectar y/o cuantificar una diana de interés. En la figura, el aptámero 1502 de captura está unido al sustrato 1501. La diana 1503 de interés está unida por el aptámero 1502 de captura. El aptámero 1504 de detección también está unido a la diana 1503 de interés. El aptámero 1504 de detección lleva la etiqueta 1505 que se puede detectar para identificar la diana capturada al sustrato 1501 a través del aptámero 1502 de captura. La figura 15B es un esquema 1510 que muestra el uso de un grupo de aptámeros para caracterizar un fenotipo. Se proporciona 1511 un grupo de aptámeros para una diana de interés. El grupo se pone en contacto con una muestra de prueba para caracterizar 1512. La mezcla se lava para retirar los aptámeros no unidos. Los aptámeros restantes se disocian y se recolectan 1513. Los aptámeros recolectados se identifican y la identidad de los aptámeros retenidos se usa para caracterizar el fenotipo 1514. La figura 15C es un esquema 1520 que muestra una implementación del método de la figura 15B. Se proporciona 1521 un grupo de aptámeros identificados como que se unen a una población de microvesículas. La muestra de entrada comprende microvesículas que se aíslan de una muestra 1522 de prueba. El grupo se pone en contacto con las microvesículas aisladas que se van a caracterizar 1523. La mezcla se lava para retirar los aptámeros no unidos y los aptámeros restantes se disocian y se recolectan 1525. Los aptámeros recolectados se identifican y la identidad de los aptámeros retenidos se usa para caracterizar el fenotipo 1526.
La figura 16A ilustra el enlace de hidrógeno entre una porción de un aptámero 1601 con los grupos 1602 carboxilo unidos a un sustrato 1603 plano. La figura 16B ilustra el enlace de hidrógeno entre una porción de un aptámero 1601 con los grupos 1602 carboxilo unidos a un sustrato 1604 de microesfera. Los grupos 1602 carboxilo se unen además a un anticuerpo 1605.
La figura 17A y la figura 17B ilustran los enlaces de hidrógeno entre una porción de un aptámero 1701 con los grupos 1702 carboxilo unidos a un sustrato 1703. En la figura 17A, el agente 1704 de unión también se une al sustrato 1703. El agente de unión tiene especificidad por la diana 1705, que puede ser una entidad biológica tal como una proteína, un ácido nucleico, una microvesícula, una célula o una porción de cualquiera de estos. En la figura 17B, la diana 1705, que puede ser una entidad biológica como una proteína, un ácido nucleico, una microvesícula, una célula o una porción de cualquiera de estos, también se une al sustrato 1703. La diana 1705 está unida por el agente 1704 de unión.
Las figuras 18A-18D ilustran el uso de un aptámero anti-EpCAM (Aptámero 4; SEQ ID NO. 1) para detectar una población de microvesículas. Se capturaron vesículas en muestras de plasma de pacientes usando anticuerpos conjugados con perlas para los antígenos de superficie de microvesículas indicados: La figura 18A) EGFR; La figura 18B) PBP; La figura 18C) EpCAM; y la figura 18D) KLK2. Se usó aptámero 4 marcado con fluorescencia como detector en el ensayo de microperlas. Las figuras muestran valores medios de fluorescencia (valores MFI) promedio para tres muestras de cáncer (C1-C3) y tres muestras normales (N1-N3) en cada gráfico. En cada gráfico, las muestras de izquierda a derecha están ordenadas como: C1, C2, C3, N1, N2, N3.
Las figuras 19A-19E ilustran la selección de aptámeros para antígenos de interés. Véase el ejemplo 9. Se incubaron cinco bibliotecas de aptámeros de ADN (marcadas 1M-5M) después de la selección negativa como se describe en este documento con una mezcla de 4 antígenos (SSX2, SSX4, PBP, KLK2) conjugados con microperlas y complementados con antígeno SPDEF conjugado con perlas magnéticas. Las muestras se procesaron según un protocolo de sección positiva como se describe en este documento. Después de recoger las perlas magnéticas, los aptámeros de ADN unidos se extrajeron de las perlas y se volvieron a amplificar. Las figuras 19A-19C ilustran los aptámeros recuperados de cada biblioteca inicial después de una (Figura 19A), dos (Figura 19B) y tres rondas (Figura 19C) de selección positiva. Las figuras 19D-19E ilustran el cribado de 25 bibliotecas de aptámeros después de la ronda 13 de selección positiva frente al antígeno específico (5 bibliotecas por cada uno de los antígenos SSX2, SSX4, PBP, KLK2 y SPDEF). La selección de aptámeros después de esta ronda se modificó con la inclusión de antígenos de confusión como se describe en el ejemplo 9 (sección titulada "Ronda 14 de selección positiva se modificó como sigue"). Los aptámeros de ADN unidos a perlas magnéticas conjugadas con los aptámeros de interés se extrajeron de las perlas y se volvieron a amplificar. Las bibliotecas recuperadas se muestran en la figura 19D. La figura 19E muestra las bibliotecas después de una ronda adicional de selección y lavado riguroso.
La figura 20A ilustra la secuencia del aptámero CAR003 de EPCAM (SEQ ID NO. 230822). La figura 20B ilustra la estructura secundaria óptima de CAR003 con una energía libre mínima (AG) de -30.00 kcal/mol. Con fines ilustrativos, el aptámero se muestra como un aptámero de ARN (SEQ ID NO. 230847) correspondiente a la secuencia de ADN de la figura 20A. La figura 20C ilustra la purificación de un grupo de aptámeros. La figura comprende un cromatograma de FPLC con todos los productos y fracciones asignados en grupos después de comprobar la calidad en gel. La figura 20D ilustra un gel teñido con SYBR GOLD con diferentes fracciones de FPLC del aptámero CAR003 después de la síntesis. Se combinaron diferentes fracciones en grupos en base a la cantidad de cadenas sin terminar en orden de mayor a menor (grupo 1-grupo 3). Los grupos 1-3 corresponden a los indicados en la figura 20C. Las figuras 20E-F ilustran la unión de CAR003 a la proteína EPCAM en HEPES 25 mM con PBS-BN (Figura 20E) o en HEPES 25 mM con MgCh 1 mM (Figura 20F). La figura 20G ilustra la unión de CAR003 a EpCAM en las sales indicadas con y sin adición de albúmina de suero bovino (BSA). La figura 20H ilustra el efecto de la desnaturalización en la unión de CAR003 a la proteína EPCAM. En cada grupo de cuatro barras, el aptámero es de izquierda a derecha: Aptámero 4, CAR003 Grupo 1, CAR003 Grupo 2, CAR003 Grupo 3. La figura 20I ilustra la titulación de aptámeros frente a proteína recombinante EPCAM (entrada constante 5 |ig). La figura 20J ilustra una transferencia Western con aptámero CAR003 contra proteína marcada con his de EPCAM, BSA y HSA (5 |ig cada una). El gel se bloqueó con F127 al 0.5 % y se sondeó con ~ 50 |ig/ml de aptámero biotinilado CAR003, fracción 3. La transferencia se visualizó con NeutrAvidin-HRP seguido de SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate.
Las figuras 21A-21J muestran la estructura secundaria predicha de CAR016 (SEQ ID NO. 230840) y variantes indicadas de la misma.
La figura 22 ilustra la afinidad de unión de los aptámeros candidato anti-PSMA CAR050 (SEQ ID NO. 230932) y CAR051 (SEQ ID NO. 230933) frente a la proteína PSMA determinada por ensayo ELISA frente a PSMA purificado recombinante.
Las figuras 23A-C ilustran la unión de aptámeros seleccionados frente a microperlas conjugadas con diversas muestras de entrada. Los aptámeros se seleccionaron de una biblioteca de aptámeros como unión a microperlas conjugadas con microvesículas derivadas de cáncer de mama. Los detalles experimentales se encuentran en el ejemplo 20. Cada gráfico muestra los resultados obtenidos con el aptámero indicado arriba del gráfico. El eje Y indica el nivel de unión. En cada grupo de muestras, se muestra la unión de 9 candidatos a aptámeros purificados. La muestra de entrada se indica en el eje X de izquierda a derecha de la siguiente manera: 1) Exosoma de cáncer: aptámero que se une a microperlas conjugadas con microvesículas aisladas de muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama; 2) No exosoma de cáncer: aptámero que se une a microperlas conjugadas con muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama después de la remoción de microvesículas por ultracentrifugación; 3) Exosoma no canceroso: aptámero que se une a microperlas conjugadas con microvesículas aisladas de muestras de plasma de pacientes normales (es decir, sin cáncer de mama); 4) No exosómico No cancerígeno: aptámero que se une a microperlas conjugadas con muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama después de la remoción de microvesículas por ultracentrifugación.
Las figuras 24A-24B ilustran la detección de microvesículas en muestras de plasma de pacientes. Las microvesículas de las muestras de plasma se incubaron con microperlas conjugadas con anticuerpos contra antígenos de microvesículas de interés. Las microvesículas capturadas en la cuenta se detectaron con un aptámero anti-EpCAM biotinilado y estreptavidina-ficoeritrina (SAPE). El eje Y muestra la señal fluorescente de las microvesículas capturadas por perlas. El eje X muestra barras para plasma de pacientes con cáncer de próstata (c1-c4), condiciones benignas de próstata (b1-b4) y un control negativo de PBS. Las diferentes condiciones experimentales se indican debajo del eje X. Antes de la incubación con las muestras de plasma, las perlas conjugadas con anticuerpos se bloquearon con un agente de bloqueo estándar (agentes reguladores de bloqueo StartingBlock, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EE. UU.), con el bloque estándar y la concentración 1x de un aptámero de bloqueo descrito en este documento (principalmente SEQ ID NO. 230938), o con el bloque estándar y la concentración 0.5x de un aptámero de bloqueo descrito en este documento (principalmente SEQ ID NO. 230938). Las figuras 24A-24B ilustran los resultados de dos aptámeros que no se unen a antígenos, cada uno de los cuales sirve como control negativo. Los dos aptámeros que no se unen a antígeno son: Neg 5 (Figura 24A): 5' TGCAAGCTGC TAATCAGCGA TGCTCTTTg G AGTTTTTT (biotina) 3' (SEQ ID NO. 230936); Neg 9 (Figura 24B): 5' TTTCAAGGCA CTCGTGTTCC CGACATGAGT GTTTTTT (biotina) 3' (SEQ ID NO. 230937).
Descripción detallada de la invención
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en la siguiente descripción adjunta. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción. En la memoria descriptiva, las formas singulares también incluyen el plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva.
En este documento se divulgan composiciones y métodos que se pueden usar para evaluar un perfil de biomarcador, que puede incluir la presencia o el nivel de uno o más biomarcadores. Los métodos de la invención comprenden el uso de aptámeros que se unen a antígenos de superficie de microvesículas o a un fragmento funcional de los mismos. Los antígenos por lo general comprenden proteínas o polipéptidos, pero pueden ser cualquier componente que se muestre en la superficie de una microvesícula, incluidos lípidos y/o carbohidratos. En general, los aptámeros divulgados son moléculas de ácido nucleico, incluidos ADN y ARN, y variaciones de los mismos. Los métodos divulgados comprenden procedimientos y técnicas de diagnóstico que usan uno o más aptámeros descritos en este documento, para determinar el nivel o la presencia de antígenos de superficie de microvesículas relevantes o un fragmento funcional de los mismos. Alternativamente, un aptámero como se describe en este documento también se puede usar como agente de unión para capturar, aislar o enriquecer una célula, un fragmento celular, una vesícula o cualquier otro fragmento o complejo que comprenda los antígenos de superficie o fragmentos funcionales de los mismos.
Las composiciones y los métodos descritos en este documento pueden comprender aptámeros individuales que se identifican para su uso en la evaluación de un perfil de biomarcador. La invención divulga además métodos de grupos de aptámeros que se pueden usar para detectar un perfil de biomarcador en una muestra dada.
Los aptámeros y las secuencias de aptámeros divulgados en este documento se pueden identificar en este documento en forma de ADN o ARN. A menos que se especifique lo contrario, un experto en la técnica apreciará que un aptámero generalmente se puede sintetizar como cualquier forma de ácido nucleico y llevar diversas modificaciones químicas y permanecer dentro del alcance de la invención.
Además, un aptámero descrito en este documento también se puede usar para proporcionar detección o formación de imágenes in vitro o in vivo, para proporcionar cualquier lectura de diagnóstico (por ejemplo, diagnóstico, pronóstico o teranóstico).
Por separado, un aptámero descrito en este documento también se puede usar para el tratamiento o como agente terapéutico para dirigirse específicamente a una célula, tejido u órgano.
Aptámeros
SELEX
Un método apropiado para generar un aptámero es con el procedimiento titulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment “("SELEX") generalmente descrito en, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Ser. No. 07/536,428, presentada Jun. 11, 1990, ahora abandonada, Patente de los Estados Unidos No.
5,475,096 titulada "Nucleic Acid Ligands", y Patente de los Estados Unidos No. 5,270,163 (véase, también WO 91/19813) titulada "Nucleic Acid Ligands". Cada ligando de ácido nucleico identificado por SELEX, es decir, cada aptámero, es un ligando específico de un compuesto o molécula diana dado. El procedimiento SELEX se basa en la idea única de que los ácidos nucleicos tienen suficiente capacidad para formar una variedad de estructuras bidimensionales y tridimensionales y suficiente versatilidad química disponible dentro de sus monómeros para actuar como ligandos (es decir, formar pares de unión específicos) con prácticamente cualquier compuesto químico, ya sea monomérico o polimérico. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden servir como dianas.
SELEX se basa como punto de partida en una gran biblioteca o grupo de oligonucleótidos monocatenarios que comprenden secuencias aleatorias. Los oligonucleótidos pueden ser híbridos de ADN, ARN o ADN/ARN modificados o no modificados. En algunos ejemplos, el grupo comprende oligonucleótidos 100 % aleatorios o parcialmente aleatorios. En otros ejemplos, el grupo comprende oligonucleótidos aleatorios o parcialmente aleatorios que contienen al menos una secuencia fija y/o conservada incorporada dentro de una secuencia aleatoria. En otros ejemplos, el grupo comprende oligonucleótidos aleatorios o parcialmente aleatorios que contienen al menos una secuencia fija y/o conservada en su extremo 5' y/o 3' que puede comprender una secuencia compartida por todas las moléculas del grupo de oligonucleótidos. Las secuencias fijas son secuencias tales como sitios de hibridación para cebadores de PCR, secuencias promotoras para ARN polimerasas (por ejemplo, T3, T4, T7 y SP6), sitios de restricción o secuencias homopoliméricas, tales como tractos poli A o poli T, núcleos catalíticos, sitios para la unión selectiva a columnas de afinidad y otras secuencias para facilitar la clonación y/o secuenciación de un oligonucleótido de interés. Las secuencias conservadas son secuencias, distintas de las secuencias fijas descritas anteriormente, compartidas por un número de aptámeros que se unen a la misma diana.
Los oligonucleótidos del grupo incluyen preferiblemente una porción de secuencia aleatoria así como secuencias fijas necesarias para una amplificación eficaz. Por lo general, los oligonucleótidos del grupo inicial contienen secuencias terminales 5' y 3' fijas que flanquean una región interna de 30-50 nucleótidos aleatorios. Los nucleótidos aleatorizados se pueden producir en un número de formas, incluida la síntesis química y la selección de tamaño a partir de ácidos nucleicos celulares escindidos al azar. La variación de secuencia en los ácidos nucleicos de prueba también se puede introducir o aumentar mediante mutagénesis antes o, durante las iteraciones de selección/amplificación.
La porción de secuencia aleatoria del oligonucleótido puede tener cualquier longitud y puede comprender ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos y puede incluir nucleótidos modificados o no naturales o análogos de nucleótidos. Véase, por ejemplo Patente de los Estados Unidos No. 5,958,691; Patente de los Estados Unidos No.
5,660,985; Patente de los Estados Unidos No. 5,958,691; Patente de los Estados Unidos No. 5,698,687; Patente de los Estados Unidos No. 5,817,635; Patente de los Estados Unidos No. 5,672,695, y la Publicación PCT WO 92/07065. Los oligonucleótidos aleatorios se pueden sintetizar a partir de nucleótidos unidos a fosfodiéster usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) and Froehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986). Los oligonucleótidos aleatorios también se pueden sintetizar usando métodos en fase de solución tales como métodos de síntesis de triéster. Véase, por ejemplo, Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) and Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449 (1978). Las síntesis típicas realizadas en equipos automatizados de síntesis de ADN producen 1014-1016 moléculas individuales, un número suficiente para la mayoría de los experimentos SELEX. Las regiones suficientemente grandes de secuencia aleatoria en el diseño de la secuencia aumentan la probabilidad de que cada molécula sintetizada represente una secuencia única.
La biblioteca inicial de oligonucleótidos se puede generar mediante síntesis química automatizada en un sintetizador de ADN. Para sintetizar secuencias aleatorias, se agregan mezclas de los cuatro nucleótidos en cada etapa de adición de nucleótidos, durante el procedimiento de síntesis, lo que permite la incorporación aleatoria de nucleótidos. Como se indicó anteriormente, los oligonucleótidos aleatorios pueden comprender secuencias completamente aleatorias; sin embargo, alternativamente, los oligonucleótidos aleatorios pueden comprender tramos de secuencias no aleatorias o parcialmente aleatorias. Se pueden crear secuencias parcialmente aleatorias agregando los cuatro nucleótidos en diferentes proporciones molares en cada etapa de adición.
La biblioteca inicial de oligonucleótidos puede ser, por ejemplo, ARN, ADN o híbrido ARN/ADN. En aquellos casos dónde se va a usar una biblioteca de ARN como biblioteca inicial, por lo general se genera mediante la transcripción de una biblioteca de ADN in vitro usando ARN polimerasa T7 o ARN polimerasas T7 modificadas y se purifica. Luego, la biblioteca se mezcla con la diana en condiciones favorables para la unión y se somete a iteraciones paso a paso de unión, partición y amplificación, usando el mismo esquema de selección general, para lograr prácticamente cualquier criterio deseado de afinidad y selectividad de unión. Más específicamente, comenzando con una mezcla que contiene el grupo inicial de ácidos nucleicos, el método SELEX incluye las etapas de: (a) poner en contacto la mezcla con la diana en condiciones favorables para la unión; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido específicamente a las moléculas diana; (c) disociar los complejos diana-ácido nucleico; (d) amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos diana-ácido nucleico para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con ligandos; y (e) reiterar las etapas de unión, partición, disociación y amplificación a través de tantos ciclos como se desee para producir ligandos de ácido nucleico altamente específicos y de alta afinidad para la molécula diana. En aquellos casos en los que se seleccionan aptámeros de ARN, el método SELEX comprende además las etapas de: (i) transcripción inversa de los ácidos nucleicos disociados de los complejos diana-ácido nucleico antes de la amplificación en la etapa (d); y (ii) transcribir los ácidos nucleicos amplificados de la etapa (d) antes de reiniciar el procedimiento.
Dentro de una mezcla de ácidos nucleicos que contiene un gran número de posibles secuencias y estructuras, existe una amplia gama de afinidades de unión para una diana dada. Una mezcla de ácidos nucleicos que comprende, por ejemplo, un segmento aleatorizado de 20 nucleótidos puede tener de 420 posibilidades de candidato. Aquellos que tienen las constantes de afinidad más altas por la diana tienen más probabilidades de unirse a la diana. Después de la partición, disociación y amplificación, se genera una segunda mezcla de ácidos nucleicos, enriquecida para los candidatos de mayor afinidad de unión. Las rondas adicionales de selección favorecen progresivamente a mejores ligandos hasta que la mezcla de ácidos nucleicos resultante se compone predominantemente de solo una o unas pocas secuencias. A continuación, estos pueden clonarse, secuenciarse y analizarse individualmente en cuanto a la afinidad de unión como ligandos o aptámeros puros.
Los ciclos de selección y amplificación se repiten hasta que se logra el objetivo deseado. En el caso más general, la selección/amplificación continúa hasta que no se logra una mejora significativa en la fuerza de unión con la repetición del ciclo. El método se usa por lo general para tomar muestras de aproximadamente 1014 especies de ácidos nucleicos diferentes, pero se puede usar para tomar muestras de hasta alrededor de 1018 especies de ácidos nucleicos diferentes. Generalmente, las moléculas de aptámero de ácido nucleico se seleccionan en un procedimiento de 5 a 20 ciclos. La heterogeneidad se puede introducir solo en las etapas iniciales de selección y no ocurre, durante todo el procedimiento de replicación.
En un ejemplo de SELEX, el procedimiento de selección es tan eficaz para aislar aquellos ligandos de ácido nucleico que se unen más fuertemente a la diana seleccionada, que solo se requiere un ciclo de selección y amplificación. Dicha selección eficiente puede ocurrir, por ejemplo, en un procedimiento de tipo cromatográfico en el que la capacidad de los ácidos nucleicos para asociarse con dianas unidas en una columna opera de tal manera que la columna es lo suficientemente capaz de permitir la separación y el aislamiento de los ligandos de ácido nucleico de mayor afinidad.
En muchos casos, no es necesariamente deseable realizar las etapas iterativas de SELEX hasta que se identifique un único ligando de ácido nucleico. La solución de ligando de ácido nucleico específica de la diana puede incluir una familia de estructuras o motivos de ácido nucleico que tienen un número de secuencias conservadas y un número de secuencias que se pueden sustituir o agregarse sin afectar significativamente la afinidad de los ligandos de ácido nucleico por la diana. Terminando el procedimiento SELEX antes de su finalización, es posible determinar la secuencia de un número de miembros de la familia de soluciones de ligandos de ácidos nucleicos. También se describen la identificación de grupos de aptámeros y usos de los mismos que se pueden usar conjuntamente para caracterizar una muestra de prueba. Por ejemplo, el grupo de aptámeros se pueden identificar a través de rondas de selección positiva y negativa para identificar microvesículas indicativas de una enfermedad o afección. También se describe el uso de tales grupos de aptámeros para detectar y/o cuantificar tales microvesículas en una muestra, lo que permite proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis.
Existe una variedad de estructuras primarias, secundarias y terciarias de ácidos nucleicos. Las estructuras o motivos que se ha demostrado que están implicados con mayor frecuencia en interacciones de tipo no-Watson-Crick se denominan bucles de horquilla, protuberancias simétricas y asimétricas, pseudonudos y una miríada de combinaciones de los mismos. Casi todos los casos conocidos de dichos motivos sugieren que pueden formarse en una secuencia de ácido nucleico de no más de 30 nucleótidos. Por esta razón, a menudo se prefiere que los procedimientos SELEX con segmentos aleatorizados contiguos se inicien con secuencias de ácido nucleico que contienen un segmento aleatorizado de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 50 nucleótidos y, a veces, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nucleótidos. En un ejemplo, la secuencia fijada en 5':aleatoria:fijada en 3' comprende una secuencia aleatoria de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nucleótidos.
El método básico SELEX se ha modificado para lograr un número de dianas específicas. Por ejemplo, Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,707,796 describe el uso de SELEX junto con electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características estructurales específicas, tales como ADN doblado. La Patente de los Estados Unidos No. 5,763,177 describe métodos basados en SELEX para seleccionar ligandos de ácido nucleico que contienen grupos fotorreactivos capaces de unir y/o fotoreticular y/o fotoinactivar una molécula diana. La Patente de los Estados Unidos No. 5,567,588 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,861,254 describen métodos basados en SELEX que consiguen una partición muy eficaz entre oligonucleótidos que tienen alta y baja afinidad por una molécula diana. La Patente de los Estados Unidos No. 5,496,938 describe métodos para obtener ligandos de ácido nucleico mejorados después de que se haya realizado el procedimiento SELEX. La Patente de los Estados Unidos No. 5,705,337 describe métodos para unir covalentemente un ligando a su diana.
También se puede usar SELEX para obtener ligandos de ácido nucleico que se unen a más de un sitio en la molécula diana y para obtener ligandos de ácido nucleico que incluyen especies que no son de ácido nucleico que se unen a sitios específicos en la diana. SELEX proporciona medios para aislar e identificar ligandos de ácidos nucleicos que se unen a cualquier objetivo imaginable, incluidas biomoléculas grandes y pequeñas, tales como proteínas de unión a ácidos nucleicos y proteínas que no se sabe que se unen a ácidos nucleicos como parte de su función biológica, así como cofactores y otras moléculas pequeñas. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,580,737 divulga secuencias de ácido nucleico identificadas a través de SELEX que son capaces de unirse con alta afinidad a la cafeína y al análogo estrechamente relacionado, la teofilina.
Counter-SELEX es un método de mejora de la especificidad de los ligandos de ácido nucleico para una molécula diana mediante la eliminación de secuencias de ligando de ácido nucleico con reactividad cruzada con una o más moléculas no diana. Counter-SELEX comprende las etapas de: (a) preparar una mezcla de candidatos de ácidos nucleicos; (b) poner en contacto la mezcla de candidatos con la diana, en el que los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad con la diana en relación con la mezcla de candidatos pueden dividirse del resto de la mezcla de candidatos; (c) repartir los ácidos nucleicos de mayor afinidad del resto de la mezcla de candidatos; (d) disociar los ácidos nucleicos de mayor afinidad de la diana; e) poner en contacto los ácidos nucleicos de afinidad aumentada con una o más moléculas no diana de manera que se retiren los ligandos de ácido nucleico con afinidad específica por la(s) molécula(s) no diana; y (f) amplificar los ácidos nucleicos con afinidad específica solo por la molécula diana para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácidos nucleicos con una afinidad y especificidad relativamente mayores para unirse a la molécula diana. Como se describió anteriormente para SELEX, los ciclos de selección y amplificación se repiten según sea necesario hasta lograr el objetivo deseado.
Un problema potencial encontrado en el uso de ácidos nucleicos como agentes terapéuticos y vacunas es que los oligonucleótidos en su forma de fosfodiéster se pueden degradar rápidamente en los fluidos corporales por enzimas intracelulares y extracelulares tales como endonucleasas y exonucleasas antes de que se manifieste el efecto deseado. Por lo tanto, el método SELEX abarca la identificación de ligandos de ácido nucleico de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tales como una estabilidad in vivo mejorada o características de administración mejoradas. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen sustituciones químicas en las posiciones de ribosa y/o fosfato y/o base. Los ligandos de ácido nucleico identificados por SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,660,985, que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en la posición 2' de la ribosa, la posición 5 de las pirimidinas y la posición 8 de las purinas, la Patente de los Estados Unidos No. 5,756,703 que describe oligonucleótidos que contienen diversas pirimidinas modificadas en 2', y la Patente de los Estados Unidos No. 5,580,737 que describe ligandos de ácido nucleico altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con sustituyentes 2'-amino (2 --NH2), 2'-fluoro (2'-F) y/o 2'-O-metil (2'-OMe).
Las modificaciones de los ligandos de ácido nucleico contempladas para su uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a, aquellas que proporcionan otros grupos químicos que incorporan carga adicional, capacidad de polarización, hidrofobicidad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática y fluxionalidad a las bases del ligando del ácido nucleico o al ligando de ácido nucleico como un todo. Las modificaciones para generar poblaciones de oligonucleótidos que sean resistentes a las nucleasas también pueden incluir uno o más enlaces internucleotídicos sustitutos, azúcares alterados, bases alteradas o combinaciones de los mismos. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de azúcar en la posición 2', modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones de purina en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodo-uracilo; modificaciones del esqueleto, modificaciones de fosforotioato o fosfato de alilo, metilaciones y combinaciones inusuales de apareamiento de bases, tales como las isobases isocitidina e isoguanosina. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones de 3' y 5', tales como tapado.
Se pueden proporcionar oligonucleótidos en los que el grupo P(O)O se reemplaza por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), P(o )n R2 ("amidato”), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 (“formacetal”) o 3'-amina (--NH--CH2--CH2-), en el que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido. Los grupos de enlace se pueden unir a nucleótidos adyacentes a través de un enlace --0--, --N-- o --S--. No se requiere que todos los enlaces en el oligonucleótido sean idénticos. Como se usa en este documento, el término fosforotioato abarca uno o más átomos de oxígeno que no forman puentes en un enlace fosfodiéster reemplazado por uno o más átomos de azufre.
Los oligonucleótidos pueden comprender grupos de azúcar modificados, por ejemplo, uno o más de los grupos hidroxilo se reemplazan con halógeno, grupos alifáticos o se funcionalizan como éteres o aminas. La posición 2' del residuo de furanosa puede estar sustituida por cualquiera de un grupo O-metilo, O-alquilo, O-alilo, S-alquilo, S-alilo o halo. Los métodos de síntesis de azúcares modificados en 2' se describen, por ejemplo, en Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991); Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); y Hobbs, et al., Biochemistry 12:5138-5145 (1973). Otras modificaciones son conocidas para un experto en la técnica. Tales modificaciones pueden ser modificaciones previas al procedimiento SELEX o modificaciones posteriores al procedimiento SELEX (modificación de ligandos no modificados previamente identificados) o se pueden realizar mediante incorporación en el procedimiento SELEX.
Las modificaciones previas al procedimiento SELEX o las realizadas por incorporación en el procedimiento SELEX producen ligandos de ácido nucleico tanto con especificidad para su diana SELEX como con estabilidad mejorada, por ejemplo, estabilidad in vivo. Las modificaciones posteriores al procedimiento SELEX realizadas en los ligandos de ácido nucleico pueden dar como resultado una estabilidad mejorada, por ejemplo, estabilidad in vivo sin afectar negativamente a la capacidad de unión del ligando de ácido nucleico.
El método SELEX abarca la combinación de oligonucleótidos seleccionados con otras unidades funcionales oligonucleotídicas y no oligonucleotídicas seleccionadas como se describe en la Patente de los Estados Unidos No.
5,637,459 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,683,867. El método SELEX comprende además la combinación de ligandos de ácido nucleico seleccionados con compuestos lipofílicos o no inmunogénicos de alto peso molecular en un complejo de diagnóstico o terapéutico, como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No.
6,011,020, la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,698 y Publicación PCT No. WO 98/18480. Estas patentes y solicitudes enseñan la combinación de una amplia gama de formas y otras propiedades, con las propiedades eficientes de amplificación y replicación de los oligonucleótidos, y con las propiedades deseables de otras moléculas.
También se ha explorado la identificación de ligandos de ácido nucleico para péptidos pequeños y flexibles a través del método SELEX. Los péptidos pequeños tienen estructuras flexibles y por lo general existen en solución en un equilibrio de múltiples confórmeros y, de este modo, inicialmente se pensó que las afinidades de unión pueden estar limitadas por la entropía conformacional perdida al unirse un péptido flexible. Sin embargo, la viabilidad de identificar ligandos de ácido nucleico para péptidos pequeños en solución se demostró en la Patente de los Estados Unidos No.
5,648,214. En esta patente, se identificaron ligandos de ácido nucleico de ARN de alta afinidad a la sustancia P, un péptido de 11 aminoácidos.
Los aptámeros con especificidad y afinidad de unión a la(s) diana(s) descrita(s) en este documento se pueden seleccionar mediante el procedimiento SELEX N como se describe en este documento. Como parte del procedimiento SELEX, las secuencias seleccionadas para unirse a la diana se minimizan opcionalmente para determinar la secuencia mínima que tiene la afinidad de unión deseada. Las secuencias seleccionadas y/o las secuencias minimizadas se optimizan opcionalmente realizando mutagénesis aleatoria o dirigida de la secuencia para aumentar la afinidad de unión o, alternativamente, para determinar qué posiciones en la secuencia son esenciales para la actividad de unión. Además, las selecciones se pueden realizar con secuencias que incorporan nucleótidos modificados para estabilizar las moléculas de aptámero frente a la degradación in vivo.
SELEX modificado de 2'
Para que un aptámero sea apropiado para su uso como agente terapéutico, es preferiblemente económico de sintetizar, seguro y estable in vivo. Los aptámeros de ADN y ARN de tipo salvaje por lo general no son estables in vivo debido a su susceptibilidad a la degradación por nucleasas. La resistencia a la degradación por nucleasas puede incrementarse mucho mediante la incorporación de grupos modificadores en la posición 2'.
Los grupos fluoro y amino se han incorporado con éxito en grupos de oligonucleótidos de los que se han seleccionado posteriormente aptámeros. Sin embargo, estas modificaciones aumentan en gran medida el coste de la síntesis del aptámero resultante y pueden presentar problemas de seguridad en algunos casos debido a la posibilidad de que los nucleótidos modificados puedan reciclarse en el ADN del huésped mediante la degradación de los oligonucleótidos modificados y el uso posterior de los nucleótidos como sustratos para la síntesis de ADN.
Los aptámeros que contienen nucleótidos 2'-O-metil ("2'-OMe"), como se proporciona en este documento, pueden superar muchos de estos inconvenientes. Los oligonucleótidos que contienen nucleótidos 2'-OMe son resistentes a las nucleasas y económicos de sintetizar. Aunque los nucleótidos 2'-OMe son omnipresentes en los sistemas biológicos, las polimerasas naturales no aceptan los NTP 2'-OMe como sustratos en condiciones fisiológicas, de este modo no hay problemas de seguridad sobre el reciclaje de los nucleótidos 2'-OMe en el ADN del huésped. El método SELEX usado para generar aptámeros modificados en 2' se describe, por ejemplo, en la Solicitud Provisional de la Patente de los Estados Unidos Ser. No. 60/430,761, presentada el 3 de diciembre, 2002, la Solicitud Provisional de la Patente de los Estados Unidos Ser. No. 60/487,474, presentada el 15 de julio, 2003, la Solicitud Provisional de la Patente de los Estados Unidos Ser. No. 60/517,039, presentada el 4 de noviembre, 2003, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Ser. No. 10/729,581, presentada el 3 de diciembre, 2003, y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Ser. No. 10/873,856, presentada el 21 de junio, 2004, titulada "Method for in vitro Selection of 2'-O-methyl substituted Nucleic Acids".
Métodos
Detección y diagnóstico de biomarcadores
Los aptámeros descritos en este documento se pueden usar en diversos métodos de evaluación de la presencia o el nivel de biomarcadores en una muestra biológica, por ejemplo, entidades biológicas de interés tales como proteínas, ácidos nucleicos o microvesículas. El aptámero funciona como agente de unión para evaluar la presencia o el nivel de la molécula diana afín. Por lo tanto, cuando se dirige a diagnósticos, pronósticos o teranósticos, uno o más aptámeros descritos en este documento se pueden configurar en un ensayo basado en una diana de ligando, donde uno o más aptámeros descritos en este documento se ponen en contacto con una muestra biológica seleccionada, donde el o más aptámeros asociados con o unidos a sus moléculas diana. Los aptámeros descritos en este documento se usan para identificar biofirmas de candidatos en base a las muestras biológicas evaluadas y los biomarcadores detectados. Los aptámeros pueden por sí mismos proporcionar una biofirma para una afección o enfermedad particular. Una biofirma se refiere a un perfil de biomarcador de una muestra biológica que comprende una presencia, nivel u otra característica que se puede evaluar (incluyendo, sin limitación, una secuencia, mutación, reordenamiento, translocación, eliminación, modificación epigenética, metilación, modificación postraduccional, alelo, actividad, socios complejos, estabilidad, semivida y similares) de uno o más biomarcadores de interés. Las biofirmas se pueden usar para evaluar criterios de diagnóstico y/o pronóstico, tales como la presencia de enfermedad, la estadificación de la enfermedad, el seguimiento de la enfermedad, la estratificación de la enfermedad o la vigilancia para la detección, metástasis o recurrencia o progresión de la enfermedad. Por ejemplo, los métodos de la invención que usan aptámeros frente a antígenos de superficie de microvesículas son útiles para correlacionar una biofirma que comprende antígenos de microvesículas con una afección o enfermedad seleccionada. Una biofirma también se puede usar clínicamente para tomar decisiones sobre las modalidades de tratamiento, incluida la intervención terapéutica. Una biofirma se puede usar además clínicamente para tomar decisiones de tratamiento, incluso si se debe realizar una cirugía o qué estándares de tratamiento se deben usar junto con la cirugía (por ejemplo, ya sea antes de la cirugía o después de la cirugía). Como ejemplo ilustrativo, una biofirma de biomarcadores circulantes que indica una forma agresiva de cáncer puede requerir un procedimiento quirúrgico más agresivo y/o un régimen terapéutico más agresivo para tratar al paciente.
Se puede usar una biofirma en cualquiera de los métodos divulgados en este documento, por ejemplo, para evaluar si un sujeto padece una enfermedad, si tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o para evaluar el estadio o la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, se puede usar una biofirma para evaluar si un sujeto tiene cáncer de próstata, cáncer de colon u otro cáncer como los descritos en este documento. Adicionalmente, una biofirma se puede usar para determinar el estadio de una enfermedad o afección, tal como el cáncer de colon. El perfil de biofirma/biomarcador que comprende una microvesícula puede incluir la evaluación de la carga útil dentro de la microvesícula. Por ejemplo, uno o más aptámeros descritos en este documento se pueden usar para capturar una población de microvesículas, proporcionando así una lectura de los antígenos de las microvesículas, y luego se puede evaluar el contenido de la carga útil dentro de las microvesículas capturadas, proporcionando así una lectura de biomarcadores adicional del contenido de la carga útil.
Una biofirma para caracterizar un fenotipo puede comprender cualquier número de criterios útiles. Como se describe más adelante, el término “fenotipo", como se usa en este documento, puede significar cualquier rasgo o característica que se atribuya a un perfil de biofirma/biomarcador. Un fenotipo se puede detectar o identificar en parte o en su totalidad usando los métodos de la invención. Se puede usar al menos un criterio para cada biomarcador. Se pueden usar al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o al menos 100 criterios. Por ejemplo, para la caracterización de un cáncer, se pueden usar un número de criterios diferentes cuando al sujeto se le diagnostica un cáncer: 1) si la cantidad de microARN en una muestra de un sujeto es mayor que un valor de referencia; 2) si la cantidad de un microARN dentro de vesículas específicas de tipo celular (es decir, vesículas derivadas de un tejido u órgano específico) es mayor que un valor de referencia; o 3) si la cantidad de microARN dentro de las vesículas con uno o más biomarcadores específicos de cáncer es mayor que un valor de referencia. Se pueden aplicar reglas similares si la cantidad de microARN es menor o igual que la referencia. El método puede incluir además una medida de control de calidad, de modo que los resultados se proporcionen al sujeto si las muestras cumplen la medida de control de calidad. Si se cumplen los criterios pero el control de calidad es cuestionable, el sujeto puede ser reevaluado.
Teranósticos
Una biofirma se puede usar en diagnósticos relacionados con la terapia para proporcionar pruebas útiles para diagnosticar una enfermedad o elegir el régimen de tratamiento correcto, tal como proporcionar una teranosis. Los teranósticos incluye pruebas de diagnóstico que brindan la capacidad de afectar la terapia o el tratamiento de un estado patológico. Las pruebas de teranóstica proporcionan una teranosis de manera similar que las pruebas de diagnóstico o pronóstico proporcionan un diagnóstico o pronóstico, respectivamente. Como se usa en este documento, la teranóstica abarca cualquier forma deseada de pruebas relacionadas con la terapia, incluida la medicina predictiva, la medicina personalizada, la medicina integrada, el farmacodiagnóstico y la asociación Dx/Rx. Las pruebas relacionadas con la terapia se pueden usar para predecir y evaluar la respuesta al fármaco en sujetos individuales, es decir, para proporcionar una medicina personalizada. Predecir una respuesta a un fármaco puede determinar si un sujeto responde probablemente o no responde a un agente terapéutico candidato, por ejemplo, antes de que el sujeto haya sido expuesto o tratado de otro modo con el tratamiento. Evaluar una respuesta a un fármaco puede ser controlar una respuesta a un fármaco, por ejemplo, controlar la mejora del sujeto o la ausencia de la misma a lo largo del tiempo después de iniciar el tratamiento. Las pruebas relacionadas con la terapia son útiles para seleccionar un sujeto para el tratamiento que es particularmente probable que se beneficie del tratamiento o para proporcionar una indicación temprana y objetiva de la eficacia del tratamiento en un sujeto individual. De este modo, una biofirma como se divulga en este documento puede indicar que el tratamiento debe modificarse para seleccionar un tratamiento más prometedor, evitando así el gran gasto de retrasar el tratamiento beneficioso y evitando los costes financieros y de morbilidad de administrar un fármaco ineficaz.
Los métodos de la invención se pueden usar para identificar o detectar una biofirma asociada con enfermedades y trastornos seleccionados, que incluyen, pero no se limitan a enfermedades cardiovasculares, cáncer, enfermedades infecciosas, sepsis, enfermedades neurológicas, enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central, enfermedades endovasculares relacionadas y enfermedades autoinmunes relacionadas. Los diagnósticos relacionados con la terapia también ayudan en la predicción de la toxicidad del fármaco, la resistencia al fármaco o la respuesta al fármaco. Las pruebas relacionadas con la terapia se pueden desarrollar en cualquier formato de prueba de diagnóstico apropiado, que incluyen, pero no se limitan a, pruebas inmunohistoquímicas, química clínica, inmunoensayo, tecnologías basadas en células, pruebas de ácido nucleico o métodos de imagen corporal. Las pruebas relacionadas con la terapia pueden incluir, pero no se limitan a, pruebas que ayuden a determinar la terapia, pruebas que controlen la toxicidad terapéutica o pruebas de respuesta a la terapia. De este modo, se puede usar una biofirma para predecir o monitorear la respuesta de un sujeto a un tratamiento. Se puede determinar una biofirma en diferentes puntos de tiempo para un sujeto después de iniciar, retirar o alterar un tratamiento en particular.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan una determinación o predicción de si un sujeto está respondiendo a un tratamiento en base a un cambio en la cantidad de uno o más componentes de una biofirma (es decir, el microARN, vesículas y/o biomarcadores de interés), una cantidad de uno o más componentes de una biofirma particular, o la biofirma detectada para los componentes. En otra realización, la afección de un sujeto se monitorea determinando una biofirma en diferentes momentos. Se determina la progresión, regresión o recurrencia de una afección. La respuesta a la terapia también se puede medir a lo largo del tiempo. De este modo, la invención proporciona un método de control del estado de una enfermedad u otra afección médica en un sujeto, que comprende aislar o detectar una biofirma de una muestra biológica del sujeto, detectar la cantidad total de los componentes de una biofirma particular, o detectar la biofirma de uno o más componentes (tales como la presencia, ausencia o nivel de expresión de un biomarcador). Las biofirmas se usan para controlar el estado de la enfermedad o afección.
También se pueden identificar una o más biofirmas novedosas de una vesícula. Por ejemplo, se pueden aislar una o más vesículas de un sujeto que responde a un tratamiento farmacológico o régimen de tratamiento y compararlas con una referencia, tal como otro sujeto que no responde al tratamiento farmacológico o régimen de tratamiento. Las diferencias entre las biofirmas se pueden determinar y usar para identificar a otros sujetos como respondedores o no respondedores a un fármaco o régimen de tratamiento en particular.
En algunas realizaciones, se usa una biofirma para determinar si una enfermedad o afección particular es resistente a un fármaco, en cuyo caso un médico no necesita perder un tiempo valioso con tal tratamiento farmacológico. Para obtener una validación temprana de una elección de fármaco o régimen de tratamiento, se determina una biofirma para una muestra obtenida de un sujeto. La biofirma se usa para evaluar si la enfermedad del sujeto en particular tiene el biomarcador asociado con la resistencia a los fármacos. Dicha determinación permite a los médicos dedicar un tiempo crítico, así como los recursos financieros del paciente, a tratamientos eficaces.
Las biofirmas se pueden usar en la teranosis de un cáncer, tales como identificar si un sujeto que padece cáncer es un probable respondedor o no respondedor a un tratamiento contra el cáncer en particular. Los métodos en cuestión se pueden usar para someter a teranosis cánceres incluidos los enumerados en este documento, por ejemplo, en la sección “fenotipo” anterior. Estos incluyen, sin limitación, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas (incluido el carcinoma de células pequeñas [cáncer de células de avena], carcinoma mixto de células pequeñas/células grandes y carcinoma de células pequeñas combinado), cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer de ovario, cáncer de estómago, melanoma, cáncer de huesos, cáncer gástrico, cáncer de mama, glioma, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma renal papilar, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, leucemia, linfoma, mieloma u otros tumores sólidos.
Se puede usar una biofirma de biomarcadores circulantes, incluidos los marcadores asociados con un componente presente en una muestra biológica (por ejemplo, célula, fragmento de célula, vesícula extracelular derivada de célula), en una muestra de un sujeto que padece cáncer, para seleccionar un tratamiento candidato para el sujeto. La biofirma se puede determinar según los métodos de la invención presentados en este documento. El tratamiento candidato puede comprender un estándar de atención para el cáncer. El tratamiento puede ser un tratamiento contra el cáncer tal como radiación, cirugía, quimioterapia o una combinación de los mismos. El tratamiento contra el cáncer puede ser terapéutico tal como agentes anticancerígenos y regímenes quimioterapéuticos. Adicionales asociaciones y reglas de fármacos se encuentran en la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos 12/658,770, presentada el 12 de febrero, 2010; la Solicitud de la Patente PCT Internacional PCT/US2010/000407, presentada el 11 de febrero, 2010; la Solicitud de la Patente PCT Internacional PCT/US2010/54366, presentada el 27 de octubre, 2010; y la Solicitud Provisional de la Patente de los Estados Unidos 61/427,788, presentada el 28 de diciembre, 2010. Véase, por ejemplo, "Table 4: Rules Summary for Treatment Selection" de PCT/US2010/54366.
Detección de biomarcadores
Los métodos de la invención se pueden usar para evaluar cualquier biomarcador útil en una muestra biológica para caracterizar un fenotipo asociado con la muestra. Dichos biomarcadores incluyen todo tipo de entidades biológicas como proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, complejos de cualquiera de estos y microvesículas. Varias moléculas asociadas con la superficie de una microvesícula o encerradas dentro de la microvesícula (denominadas en este documento “carga útil") pueden servir como biomarcadores. Las propias microvesículas también se pueden usar como biomarcadores.
Los aptámeros descritos en este documento se pueden usar para evaluar los niveles o la presencia de una población de microvesículas. Véanse, por ejemplo, las figuras 15B-15C. Los aptámeros descritos en este documento también se pueden usar para evaluar los niveles o la presencia de su molécula diana específica. Véase, por ejemplo, la figura 15A. Además, los aptámeros descritos en este documento se usan para capturar o aislar un componente presente en una muestra biológica que tiene presente la molécula diana del aptámero. Por ejemplo, si un antígeno de superficie de microvesícula dado está presente en una célula, fragmento de célula o vesícula extracelular derivada de célula. Se puede usar un agente de unión al biomarcador, incluyendo, sin limitación, un aptámero descrito en este documento, para capturar o aislar la célula, el fragmento celular o las vesículas extracelulares derivadas de células. Véanse, por ejemplo, las figuras 1A-1B, 1D-1E. Tales entidades capturadas o aisladas se pueden caracterizar aún más para evaluar antígenos de superficie adicionales o moléculas internas de “carga útil” presentes (es decir, moléculas de ácido nucleico, lípidos, azúcares, polipéptidos o fragmentos funcionales de los mismos, o cualquier otra cosa presente en el medio celular que pueda usarse como biomarcador), donde uno o más biomarcadores proporcionan una biofirma para evaluar un fenotipo deseado, tal como una enfermedad o afección. Véase, por ejemplo, la figura 1F. Por lo tanto, los aptámeros descritos en este documento no solo se usan para evaluar uno o más antígenos de superficie de microvesículas de interés, sino que también se usan para separar un componente presente en una muestra biológica, donde los propios componentes se pueden evaluar más para identificar una biofirma de candidato.
Los métodos de la invención pueden comprender análisis múltiplex de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50, 75 o 100 biomarcadores diferentes. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de una población heterogénea de vesículas con una pluralidad de partículas que están marcadas diferencialmente. Puede haber al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50, 75 o 100 partículas marcadas diferencialmente. Las partículas se pueden etiquetar externamente, tal como con una etiqueta, o se pueden etiquetar intrínsecamente. Cada partícula marcada diferencialmente se puede acoplar a un agente de captura, tal como un agente de unión, para una vesícula, dando como resultado la captura de una vesícula. Los múltiples agentes de captura se pueden seleccionar para caracterizar un fenotipo de interés, incluidos los agentes de captura frente a biomarcadores de vesículas generales, biomarcadores específicos de células de origen y biomarcadores de enfermedades. A continuación, se pueden detectar uno o más biomarcadores de la vesícula capturada mediante una pluralidad de agentes de unión. El agente de unión se puede marcar directamente para facilitar la detección. Alternativamente, el agente de unión está marcado por un agente secundario. Por ejemplo, el agente de unión puede ser un anticuerpo para un biomarcador en la vesícula, en el que el agente de unión está unido a biotina. Un agente secundario comprende estreptavidina unida a un indicador y se puede agregar para detectar el biomarcador. La vesícula capturada se puede analizar por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50, 75 o 100 biomarcadores diferentes. Por ejemplo, múltiples detectores, es decir, la detección de múltiples biomarcadores de una vesícula o población de vesículas capturada, puede aumentar la señal obtenida, permitir una mayor sensibilidad, especificidad o ambas, y el uso de cantidades más pequeñas de muestras. La detección puede ser con más de un biomarcador, incluyendo, sin limitación, más de un marcador general de vesículas, tal como en la tabla 3.
Se puede usar un método basado en inmunoensayo (por ejemplo, ensayo sándwich) para detectar un biomarcador de una vesícula. Un ejemplo incluye ELISA. Un agente de unión se puede unir a un pocillo. Por ejemplo, se puede unir a un pocillo un agente de unión tal como un aptámero o un anticuerpo contra un antígeno de una vesícula. Se puede detectar un biomarcador en la vesícula capturada en base a los métodos descritos en este documento. La figura 1A muestra un esquema ilustrativo para un inmunoensayo de tipo sándwich. El agente de captura puede ser frente a un antígeno de vesícula de interés, por ejemplo, un biomarcador de vesícula general, un marcador de célula de origen o un marcador de enfermedad. En la figura, las vesículas capturadas se detectan usando un agente de unión marcado con fluorescencia (agente de detección) frente a los antígenos de vesícula de interés. Se pueden usar múltiples agentes de unión de captura, por ejemplo, en direcciones distinguibles en una matriz o pocillos diferentes de una placa de inmunoensayo. Los agentes de unión de detección pueden ser frente a el mismo antígeno que el agente de unión de captura, o pueden estar dirigidos frente a otros marcadores. El agente de unión de captura puede ser cualquier agente de unión útil, por ejemplo, aptámeros, anticuerpos o lectinas atados, y/o los anticuerpos detectores se pueden sustituir de manera similar, por ejemplo, con aptámeros, anticuerpos, lectinas u otras proteínas de unión o entidades detectables (por ejemplo, marcadas). Se pueden usar uno o más agentes de captura para un biomarcador general de vesículas, un marcador de célula de origen y/o un marcador de enfermedad junto con agentes de detección frente a biomarcadores de vesículas generales, tales como moléculas de tetraspanina incluyendo, sin limitación uno o más de CD9, CD63 y CD81, u otros marcadores en la tabla 3 en este documento. Ejemplos de antígenos de superficie de microvesículas se divulgan en este documento, por ejemplo, en las tablas 3 o 4, o son conocidos en la técnica, y los ejemplos útiles en los métodos de la invención se divulgan en la Solicitud de la Patente Internacional No. de Serie PCT/US2011/031479, titulada "Circulating Biomarkers for Disease" y presentada el 6 de abril, 2011.
La figura ID presenta un esquema ilustrativo para analizar vesículas según los métodos de la invención. Los agentes de captura se usan para capturar vesículas, los detectores se usan para detectar las vesículas capturadas y el nivel o la presencia de las microvesículas capturadas y detectadas se usa para caracterizar un fenotipo. Los agentes de captura, los detectores y los fenotipos de caracterización pueden ser cualquiera de los descritos en este documento. Por ejemplo, los agentes de captura incluyen anticuerpos o aptámeros atados a un sustrato que reconoce un antígeno de vesícula de interés, los detectores incluyen anticuerpos o aptámeros marcados para un antígeno de vesícula de interés, y la caracterización de un fenotipo incluye un diagnóstico, pronóstico o teranosis de una enfermedad. En el esquema mostrado en la figura ID i), se captura una población de vesículas con uno o más agentes de captura frente a biomarcadores (100) generales de vesículas. Las vesículas capturadas luego se marcan con detectores frente a biomarcadores (101) de células de origen y/o biomarcadores (102) específicos de enfermedades. Si solo se usan detectores (101) de células de origen, la biofirma usada para caracterizar el fenotipo (103) puede incluir los marcadores de vesículas generales (100) y los biomarcadores (101) de células de origen. Si solo se usan detectores (102) de enfermedades, la biofirma usada para caracterizar el fenotipo (103) puede incluir los marcadores (100) generales de vesículas y los biomarcadores (102) de enfermedades. Alternativamente, los detectores se usan para detectar biomarcadores (101) de células de origen y biomarcadores (102) específicos de enfermedades. En este caso, la biofirma usada para caracterizar el fenotipo (103) puede incluir los marcadores (100) generales de vesículas, los biomarcadores (101) de células de origen y los biomarcadores (102) de enfermedades. Las combinaciones de biomarcadores se seleccionan para caracterizar el fenotipo de interés y se pueden seleccionar de los biomarcadores y fenotipos descritos en este documento, por ejemplo, en las tablas 3 o 4.
En el esquema mostrado en la figura ID ii), se captura una población de vesículas con uno o más agentes de captura frente a biomarcadores (110) de células de origen y/o biomarcadores (111) de enfermedades. Las vesículas capturadas luego se detectan usando detectores frente a biomarcadores (112) generales de vesículas. Si solo se usan agentes (110) de captura de células de origen, la biofirma usada para caracterizar el fenotipo (113) puede incluir los biomarcadores (110) de células de origen y los marcadores (112) de vesículas generales. Si solo se usan agentes de captura de biomarcadores (111) de enfermedades, la biofirma usada para caracterizar el fenotipo (113) puede incluir los biomarcadores (111) de enfermedades y los biomarcadores (112) de vesículas generales. Alternativamente, se usan agentes de captura para uno o más biomarcadores (110) de células de origen y uno o más biomarcadores (111) específicos de enfermedades para capturar vesículas. En este caso, la biofirma usada para caracterizar el fenotipo (113) puede incluir los biomarcadores (110) de células de origen, los biomarcadores (111) de enfermedades, y los marcadores (113) generales de vesículas. Las combinaciones de biomarcadores se seleccionan para caracterizar el fenotipo de interés y se pueden seleccionar de los biomarcadores y fenotipos descritos en este documento.
Los métodos de la invención comprenden la captura y detección de microvesículas de interés usando cualquier combinación de biomarcadores útiles. Por ejemplo, una población de microvesículas se puede capturar usando uno o más agentes de unión para cualquier combinación deseada de marcadores de células de origen, específicos de enfermedad o de vesículas generales. Las microvesículas capturadas pueden entonces detectarse usando uno o más agentes de unión para cualquier combinación deseada de marcadores de células de origen, específicos de enfermedad o de vesículas generales. La figura 1E representa un diagrama de flujo de tales configuraciones. Uno cualquiera o más de un biomarcador (140) de células de origen, biomarcadores (144) de enfermedad y biomarcador (142) de vesículas general para capturar una población de microvesículas. A partir de entonces, uno cualquiera o más de biomarcadores (143) de células de origen, biomarcadores (144) de enfermedad y biomarcador (145) de vesículas general para detectar la población de microvesículas capturadas. La biofirma de las microvesículas capturadas y detectadas se usa luego para caracterizar un fenotipo. Las combinaciones de biomarcadores se seleccionan para caracterizar el fenotipo de interés y se pueden seleccionar de los biomarcadores y fenotipos descritos en este documento.
Una molécula de carga útil de microvesículas se puede evaluar como miembro de un panel de biofirma. Una molécula de carga útil comprende cualquiera de las entidades biológicas contenidas dentro de una célula, fragmento celular o membrana vesicular. Estas entidades incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos, por ejemplo, ARNm, microARN o fragmentos de ADN; proteína, por ejemplo, proteínas solubles y asociadas a la membrana; carbohidratos; lípidos; metabolitos; y diversas moléculas pequeñas, por ejemplo, hormonas. La carga útil puede ser parte del medio celular que se encapsula cuando se forma una vesícula en el medio celular. La carga útil se puede analizar además de detectar antígenos de superficie de vesículas. Las poblaciones específicas de vesículas se pueden capturar como se describe anteriormente, luego la carga útil en las vesículas capturadas se puede usar para caracterizar un fenotipo. Por ejemplo, las vesículas capturadas en un sustrato se pueden aislar aún más para evaluar la carga útil en estas.
Alternativamente, las vesículas en una muestra se detectan y clasifican sin captura. Las vesículas así detectadas se pueden aislar aún más para evaluar la carga útil en estas. Las poblaciones de vesículas se pueden clasificar mediante citometría de flujo y se analiza la carga útil en las vesículas clasificadas. En el esquema mostrado en la figura 1F iii), se captura y/o detecta una población de vesículas (120) usando uno o más biomarcadores (120) de células de origen, biomarcadores (121) de enfermedades y/o marcadores (122) de vesículas generales. Se evalúa la carga útil de las vesículas (123) aisladas. Una biofirma detectada dentro de la carga útil se puede usar para caracterizar un fenotipo (124). En un ejemplo no limitante, se puede analizar una población de vesículas en una muestra de plasma de un paciente usando anticuerpos frente a uno o más antígenos vesiculares de interés. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de captura que están atados a un sustrato para aislar una población de vesículas deseada. Alternativamente, los anticuerpos se pueden marcar directamente y las vesículas marcadas se pueden aislar mediante clasificación con citometría de flujo. La presencia o el nivel de microARN o ARNm extraído de la población de vesículas aisladas se puede usar para detectar una biofirma. La biofirma se usa luego para diagnosticar, pronosticar o someter a teranosis al paciente.
La carga útil celular o de vesículas se puede analizar en una población (por ejemplo, células o vesículas) sin capturar o detectar primero subpoblaciones de vesículas. Por ejemplo, una población de vesículas celulares o extracelulares se puede aislar generalmente de una muestra usando centrifugación, filtración, cromatografía u otras técnicas como las descritas en este documento y conocidas en la técnica. En lo sucesivo, la carga útil de tales componentes de la muestra se puede analizar para detectar una biofirma y caracterizar un fenotipo. En el esquema mostrado en la figura 1F v), se aísla una población de vesículas (130) y se evalúa la carga útil de las vesículas aisladas (131). Una biofirma detectada dentro de la carga útil se puede usar para caracterizar un fenotipo (132). En un ejemplo no limitante, se aísla una población de vesículas de una muestra de plasma de un paciente usando exclusión por tamaño y filtración por membrana. La presencia o el nivel de microARN o ARNm extraído de la población de vesículas se usa para detectar una biofirma. La biofirma se usa luego para diagnosticar, pronosticar o someter a teranosis al paciente.
Los biomarcadores usados para detectar una población de vesículas se pueden seleccionar para detectar una población de microvesículas de interés, por ejemplo, una población de vesículas que proporciona un diagnóstico, pronóstico o teranosis de una afección o enfermedad seleccionada, incluyendo, sin limitación, un cáncer, una afección premaligna, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad inmunitaria, una enfermedad o trastorno autoinmune, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno neurológico, una enfermedad o dolor infeccioso. Véase la sección “fenotipos” en este documento para obtener más detalles. Los biomarcadores se pueden seleccionar del grupo que consiste en EpCam (molécula de adhesión de células epiteliales), CD9 (molécula de tetraspanina CD9), PCSA (antígeno específico de células prostáticas), véase Rokhlin et al., 5E10: un anticuerpo monoclonal reactivo en la superficie específico de la próstata. cáncer Lett. 1998 131:129-36), CD63 (molécula de tetraspanina CD63), CD81 (molécula de tetraspanina c D81), PSMA (FOLH1, folato hidrolasa (antígeno de membrana específico de la próstata) 1), B7H3 (molécula CD276), PSCA (antígeno de células madre prostáticas), ICAM (molécula de adhesión intercelular), STEAP (STEAP1, seis antígenos epiteliales transmembrana de la próstata 1), KLK2 (peptidasa relacionada con la calicreína 2), SSX2 (sarcoma sinovial, punto de ruptura X 2), SSX4 (sarcoma sinovial, punto de ruptura X 4), PBP (proteína de unión prostática), SPDEF (dominio puntiagudo SAM que contiene el factor de transcripción ets), EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) y una combinación de los mismos. Uno o más de estos marcadores pueden proporcionar una biofirma para una afección específica, tal como detectar un cáncer, incluyendo, sin limitación, un carcinoma, un cáncer de próstata, un cáncer de mama, un cáncer de pulmón, un cáncer colorrectal, un cáncer de ovario, melanoma, un cáncer de cerebro u otro tipo de cáncer como se divulga en este documento. Se puede usar un agente de unión para uno o más de estos marcadores para capturar una población de microvesículas, y se puede usar un aptámero como se describe en este documento para ayudar en la detección de las vesículas de captura como se describe en este documento. Se puede usar un aptámero como se describe en este documento para capturar una población de microvesículas, y se puede usar un agente de unión para uno o más de estos marcadores para ayudar en la detección de las vesículas de captura como se describe en este documento. Los agentes de unión pueden ser cualquier agente de unión útil como se divulga en este documento o se conoce en la técnica, por ejemplo, anticuerpos o aptámeros.
Los métodos de caracterización de un fenotipo pueden emplear una combinación de técnicas para evaluar un componente o población de componentes presentes en una muestra biológica de interés. Por ejemplo, se puede usar un aptámero como se describe en este documento para evaluar una única célula, una única vesícula extracelular o una población de células o una población de vesículas. Una muestra se puede dividir en diversas alícuotas, donde cada una se analiza por separado. Por ejemplo, se determina el contenido de proteínas de una o más alícuotas y se determina el contenido de microARN de una o más alícuotas. El contenido de proteína y el contenido de microARN se pueden combinar para caracterizar un fenotipo. Se puede aislar un componente presente en una muestra biológica de interés y se puede evaluar la carga útil en esta (por ejemplo, capturar una población de subpoblación de vesículas usando un aptámero descrito en este documento y evaluar aún más el ácido nucleico o las proteínas presentes en las vesículas aisladas).
Se puede aislar una población de vesículas con un marcador de superficie dado usando un agente de unión a un marcador de superficie de microvesículas. Véanse, por ejemplo, las figuras 1A, 1B, 15A. El agente de unión puede ser un aptámero que se identificó para dirigirse al marcador de superficie de microvesículas usando los métodos descritos en este documento. Las vesículas aisladas se evalúan en busca de biomarcadores adicionales, tales como contenido de superficie o carga útil, que pueden ser contemporáneos a la detección de la diana específica del aptámero o la evaluación de biomarcadores adicionales puede ser anterior o posterior a la detección de la diana específica del aptámero.
Una biofirma se puede detectar cualitativa o cuantitativamente mediante la detección de una presencia, nivel o concentración de un biomarcador circulante, por ejemplo, un microARN, proteína, vesícula u otro biomarcador, como se divulga en este documento. Estos componentes de la biofirma se pueden detectar usando un número de técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, un biomarcador se puede detectar mediante análisis de micromatrices, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (incluidos métodos basados en PCR, tales como la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (Q-PCR/qPCR) y similares), hibridación con sondas específicas de alelo, detección de mutaciones enzimáticas, reacción en cadena de ligadura (LCR), ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA), análisis heterodúplex de citometría de flujo, escisión química de apareamientos incorrectos, espectrometría de masas, secuenciación de ácidos nucleicos, polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP), electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE), polimorfismos de fragmentos de restricción, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) o combinaciones de los mismos. Un biomarcador, tal como un ácido nucleico, se puede amplificar antes de la detección. Un biomarcador también se puede detectar mediante inmunoensayo, inmunotransferencia, inmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA; EIA), radioinmunoensayo (RIA), citometría de flujo o microscopía electrónica (EM).
Las biofirmas se pueden detectar usando aptámeros descritos en este documento que funcionan como agentes de captura y agentes de detección, como se describe en este documento. Un agente de captura puede comprender un anticuerpo, aptámero u otra entidad que reconoce un biomarcador y se puede usar para capturar el biomarcador. Los biomarcadores que se pueden capturar incluyen biomarcadores circulantes, por ejemplo, una proteína, un ácido nucleico, un lípido o un complejo biológico en solución en un fluido corporal. De manera similar, el agente de captura se puede usar para capturar una vesícula. Un agente de detección puede comprender un anticuerpo u otra entidad que reconozca un biomarcador y se pueda usar para detectar la vesícula biomarcadora, o que reconozca una vesícula y sea útil para detectar una vesícula. El agente de detección se puede marcar y la etiqueta se puede detectar, detectando así el biomarcador o la vesícula. El agente de detección puede ser un agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un aptámero. El agente de detección puede comprender una molécula pequeña tal como un agente marcador de proteína de membrana. Véanse, por ejemplo, los agentes marcadores de proteínas de membrana divulgados en Alroy et al., la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos US 2005/0158708. Las vesículas se pueden aislar o capturar como se describe en este documento, y se pueden usar uno o más agente marcador de proteínas de membrana para detectar las vesículas. En muchos casos, el antígeno u otra unidad estructural de vesícula que se reconoce por los agentes de captura y detección son intercambiables.
Una vesícula que tiene un antígeno específico de célula de origen en su superficie y un antígeno específico de cáncer en su superficie se puede capturar usando un agente de unión que es específico para un antígeno específico de células, por ejemplo, atando el anticuerpo de captura o aptámero a un sustrato, y luego la vesícula se detecta usando un agente de unión a un antígeno específico de la enfermedad, por ejemplo, marcando el agente de unión usado para la detección con un colorante fluorescente y detectando la radiación fluorescente emitida por el colorante.
Será evidente para un experto en la técnica que cuando la molécula diana para un agente de unión (tales como un aptámero descrito en este documento) es informativa en cuanto a la evaluación de una afección o enfermedad, el mismo agente de unión se puede usar tanto para capturar un componente que comprende la molécula diana (por ejemplo, antígeno de superficie de microvesícula de interés) y también modificarse para comprender una etiqueta detectable a fin de detectar la molécula diana, por ejemplo, agente de unión1-antígeno-agente de unión2*, en el que el * significa una etiqueta detectable; el agente de unión1 y el agente de unión2 pueden ser el mismo agente de unión o un agente de unión diferente (por ejemplo, el mismo aptámero o aptámero diferente). Además, el agente de unión1 y el agente de unión2 se pueden seleccionar de categorías completamente diferentes de agentes de unión (por ejemplo, anticuerpo, aptámero, anticuerpo sintético, molécula de ácido nucleico-péptido o cualquier molécula que esté configurada para unirse o asociarse específicamente con su molécula diana). Tales moléculas de unión se pueden seleccionar únicamente en base a su especificidad de unión por una molécula diana.
Las técnicas de detección de biomarcadores o captura de componentes de la muestra usando un aptámero descrito en este documento incluyen el uso de un sustrato plano tal como una matriz (por ejemplo, biochip o micromatriz), con moléculas inmovilizadas en el sustrato como agentes de captura que facilitan la detección de un biofirma particular. La matriz se puede proporcionar como parte de un kit para analizar uno o más biomarcadores. Ejemplos adicionales de agentes de unión descritos anteriormente y útiles en los métodos de la invención se divulgan en la Solicitud de la Patente Internacional No. de Serie No. p Ct /US2011/031479, titulada "Circulating Biomarkers for Disease" y presentada el 6 de abril, 2011. Se pueden incluir aptámeros descritos en este documento en una matriz para la detección y diagnóstico de enfermedades que incluyen enfermedades presintomáticas. Una matriz puede comprender una matriz personalizada que comprende biomoléculas seleccionadas para identificar específicamente biomarcadores de interés. Las matrices personalizadas se pueden modificar para detectar biomarcadores que aumentan el rendimiento estadístico, por ejemplo, biomoléculas adicionales que identifican una biofirma que conducen a tasas de error de validación cruzada mejoradas en modelos de predicción multivariable (por ejemplo, regresión logística, análisis discriminante o modelos de árbol de regresión). Se pueden construir matrices personalizadas para estudiar la biología de una enfermedad, afección o síndrome y perfilar biofirmas en estados fisiológicos definidos. Los marcadores para su inclusión en la matriz personalizada se elegirán en función de criterios estadísticos, por ejemplo, que tengan un nivel deseado de significación estadística para diferenciar entre fenotipos o estados fisiológicos. La significación estándar del valor p = 0.05 puede elegirse para excluir o incluir biomoléculas en la micromatriz. Los valores p se pueden corregir para comparaciones múltiples. Como ejemplo ilustrativo, los ácidos nucleicos extraídos de muestras de un sujeto con o sin una enfermedad se pueden hibridar con una micromatriz de alta densidad que se une a miles de secuencias de genes. Los ácidos nucleicos cuyos niveles son significativamente diferentes entre las muestras con o sin la enfermedad se pueden seleccionar como biomarcadores para distinguir las muestras que tienen la enfermedad o no. Se puede construir una matriz personalizada para detectar los biomarcadores seleccionados. Las matrices personalizadas pueden comprender micromatrices de baja densidad, que se refieren a matrices con un número menor de agentes de unión direccionables, por ejemplo, decenas o centenas en lugar de miles. Se pueden formar matrices de baja densidad sobre un sustrato. Las matrices de baja densidad personalizables usan la amplificación por PCR en pocillos de placa, por ejemplo, los ensayos de expresión génica TaqMan® (Applied Biosystems by Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA).
Un aptámero descrito en este documento u otro agente de unión útil se puede unir directa o indirectamente a una superficie o sustrato sólido. Véanse, por ejemplo, las figuras 1A-1B, 14, 15A. Una superficie o sustrato sólido puede ser cualquier sólido físicamente separable al que se pueda unir directa o indirectamente un agente de unión, incluyendo, pero no limitado a, superficies proporcionadas por micromatrices y pocillos, partículas tales como perlas, columnas, fibras ópticas, toallitas, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, cuarzo, mica, membranas diazotadas (papel o nailon), poliformaldehído, celulosa, acetato de celulosa, papel, cerámica, metales, metaloides, materiales semiconductores, puntos cuánticos, perlas o partículas recubiertas, otros materiales cromatográficos, partículas magnéticas; plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno u otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, material de teflón, etc.), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, resinas, sílice o materiales a base de sílice, incluidos el silicio y el silicio modificado, el carbono, metales, vidrios inorgánicos, plásticos, cerámicas, polímeros conductores (incluyendo polímeros tales como polipirrol y poliindol); superficies micro o nanoestructuradas tales como matrices de mosaico de ácido nucleico, superficies decoradas con nanotubos, nanocables o nanopartículas; o superficies porosas o geles tales como metacrilatos, acrilamidas, polímeros de azúcar, celulosa, silicatos, u otros polímeros fibrosos o trenzados. Además, tales como es conocido en la técnica, el sustrato se puede recubrir usando recubrimientos pasivos o derivados químicamente con cualquier número de materiales, incluidos polímeros, tales como dextranos, acrilamidas, gelatinas o agarosa. Tales recubrimientos pueden facilitar el uso de la matriz con una muestra biológica.
Como se proporciona en los ejemplos, a continuación, un aptámero u otro agente de unión útil se puede conjugar con una entidad o etiqueta detectable. Las etiquetas apropiadas incluyen, sin limitación, una etiqueta magnética, una unidad estructural fluorescente, una enzima, una sonda quimioluminiscente, una partícula metálica, una partícula coloidal no metálica, una partícula de colorante polimérico, una molécula de pigmento, una partícula de pigmento, una especie electroquímicamente activa, nanocristal semiconductor u otras nanopartículas, incluidos puntos cuánticos o partículas de oro, fluoróforos, puntos cuánticos o etiquetas radiactivas. Las etiquetas de proteína incluyen proteína fluorescente verde (GFP) y variantes de la misma (por ejemplo, proteína fluorescente cian y proteína fluorescente amarilla); y proteínas luminiscentes tales como luciferasa, como se describe a continuación. Las etiquetas radiactivas incluyen, sin limitación, radioisótopos (radionúclidos), tales como 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, o 213Bi. Las etiquetas fluorescentes incluyen, sin limitación, un quelato de tierras raras (por ejemplo, quelato de europio), rodamina; tipos de fluoresceína que incluyen, sin limitación, FITC, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína; un tipo de rodamina que incluye, sin limitación, TAMRA; dansilo; lisamina; cianinas; ficoeritrinas; rojo Texas; Cy3, Cy5, dapoxyl, NBD, Cascade Yellow, dansyl, PyMPO, pireno, ácido 7-dietilaminocumarina-3-carboxílico y otros derivados de la cumarina, Marina Blue™, Pacific Blue™, Cascade Blue™, 2-antracenosulfonilo, PyMPO, ácido 3,4,9,10-perileno-tetracarboxílico, 2,7-difluorofluoresceína (Oregon Green™ 488-X), 5-carboxifluoresceína, Texas Red™-X, Alexa Fluor 430, 5-carboxitetrametilrodamina (5-TAMRA), 6-carboxitetrametilrodamina (6-TAMRA), BODIPY FL, bimane y Alexa Fluor 350, 405, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 y 750, y derivados de los mismos, entre muchos otros. Véase, por ejemplo, “The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies", décima edición, disponible en Internet en probes (punto) invitrogen (punto) com/handbook. La etiqueta fluorescente puede ser uno o más de FAM, dRHO, 5-FAM, 6FAM, dR6G, JOE, HEX, VIC, TET, dTAMRA, TAMRA, NED, dROX, PET, BHQ, Gold540 y LIZ.
Usando técnicas convencionales, un aptámero se puede marcar directa o indirectamente, por ejemplo, la etiqueta se une al aptámero a través de biotina-estreptavidina (por ejemplo, sintetizar un aptámero biotinilado, que luego es capaz de unirse a una molécula de estreptavidina que a su vez está conjugada a una etiqueta detectable; un ejemplo no limitante es la estreptavidina, conjugada con ficoeritrina (SAPE)). Los métodos para el acoplamiento químico usando procedimientos de múltiples etapas incluyen biotinilación, acoplamiento de trinitrofenol (TNP) o digoxigenina usando, por ejemplo, ésteres de succinimida de estos compuestos. La biotinilación se puede lograr, por ejemplo, mediante el uso de D-biotinil-N-hidroxisuccinimida. Los grupos succinimida reaccionan eficazmente con los grupos amino a valores de pH superiores a 7, y preferentemente entre aproximadamente pH 8.0 y aproximadamente pH 8.5. Alternativamente, un aptámero no se marca, pero luego se pone en contacto con un segundo anticuerpo que se marca después de que el primer anticuerpo se une a un antígeno de interés.
También se pueden usar diversas etiquetas de enzima-sustrato junto con un método de la invención. Tales etiquetas de sustrato enzimático están disponibles comercialmente (por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No.
4,275,149). La enzima generalmente cataliza una alteración química de un sustrato cromogénico que se puede medir usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Los ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; la Patente de los Estados Unidos No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tales como la peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), pgalactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante (HRP) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en las que la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (t Mb )); fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y p -D-galactosidasa (p -D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-p-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil- p -D-galactosidasa.
Los aptámeros se pueden unir a un sustrato tal como un sustrato plano. Una matriz plana generalmente contiene ubicaciones direccionables (por ejemplo, almohadillas, direcciones o microubicaciones) de biomoléculas en un formato de matriz. El tamaño de la matriz dependerá de la composición y el uso final de la matriz. Se pueden hacer matrices que contengan desde 2 moléculas diferentes hasta muchos miles. Generalmente, la matriz comprende desde dos hasta 100,000 o más moléculas, dependiendo del uso final de la matriz y el método de fabricación. Una micromatriz para su uso con la invención comprende al menos una biomolécula que identifica o captura un biomarcador presente en una biofirma de interés, por ejemplo, un microARN u otra biomolécula o vesícula que constituye la biofirma. En algunas matrices, se usan múltiples sustratos, ya sea de composiciones diferentes o idénticas. Según lo anterior, las matrices planas pueden comprender una pluralidad de sustratos más pequeños.
La presente invención puede hacer uso de muchos tipos de matrices para detectar un biomarcador, por ejemplo, un biomarcador asociado con una biofirma de interés. Las matrices o micromatrices útiles incluyen, sin limitación, micromatrices de ADN, tales como micromatrices de ADNc, micromatrices de oligonucleótidos y micromatrices de SNP, micromatrices de ARN, micromatrices de proteínas, micromatrices de anticuerpos, micromatrices de tejidos, micromatrices celulares (también llamadas micromatrices de transfección), micromatrices de compuestos químicos y matrices de carbohidratos (glicomatrices). Estas matrices se describen con más detalle anteriormente. Las micromatrices pueden comprender biochips que proporcionan matrices inmovilizadas de alta densidad de moléculas de reconocimiento (por ejemplo, aptámeros o anticuerpos), donde la unión de biomarcadores se controla indirectamente (por ejemplo, mediante fluorescencia).
Una matriz o micromatriz que se puede usar para detectar uno o más biomarcadores de una biofirma y que comprende uno o más aptámeros se puede hacer según los métodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos.
6,329,209; 6,365,418; 6,406,921; 6,475,808; y 6,475,809, y la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos No. de Ser. 10/884,269. Las matrices personalizadas para detectar selecciones específicas de conjuntos de biomarcadores descritos en este documento se pueden realizar usando los métodos descritos en estas patentes. También se pueden usar micromatrices disponibles comercialmente para llevar a cabo los métodos de la invención, incluyendo, sin limitación, las de Affymetrix (Santa Clara, CA), Illumina (San Diego, CA), Agilent (Santa Clara, CA), Exiqon (Dinamarca), o Invitrogen (Carlsbad, CA). Las matrices personalizadas y/o comerciales incluyen matrices para la detección de proteínas, ácidos nucleicos y otras moléculas y entidades biológicas (por ejemplo, células, vesículas, virii) como se describe en este documento.
Se pueden disponer múltiples moléculas de captura en una matriz, por ejemplo, proteínas, péptidos o moléculas de ácido nucleico adicionales. Las proteínas se pueden inmovilizar usando métodos y materiales que minimicen la desnaturalización de las proteínas, que minimicen las alteraciones en la actividad de las proteínas, o que minimicen las interacciones entre la proteína y la superficie sobre la que se inmovilizan. Las moléculas de captura pueden comprender uno o más aptámeros descritos en este documento. Se puede construir una matriz para la hibridación de un grupo de aptámeros. Luego, la matriz se puede usar para identificar los miembros del grupo que se unen a una muestra, facilitando así la caracterización de un fenotipo. Véanse, las figuras 15B-15C y la divulgación relacionada para obtener más detalles.
Las superficies de matriz útiles pueden tener cualquier forma, forma o tamaño deseado. Los ejemplos no limitantes de superficies incluyen chips, superficies continuas, superficies curvas, superficies flexibles, películas, placas, láminas o tubos. Las superficies pueden tener áreas que van desde aproximadamente una micra cuadrada hasta aproximadamente 500 cm2. El área, la longitud y el ancho de las superficies pueden variar según los requisitos del ensayo que se va a realizar. Las consideraciones pueden incluir, por ejemplo, la facilidad de manejo, las limitaciones del material o materiales de los que está formada la superficie, los requisitos de los sistemas de detección, los requisitos de los sistemas de deposición (por ejemplo, matrices) o similares.
Puede ser deseable emplear un medio físico para separar grupos o matrices de islas de unión o biomoléculas inmovilizadas: tal separación física facilita la exposición de diferentes grupos o matrices a diferentes soluciones de interés. Por lo tanto, las matrices pueden estar situadas dentro de placas de micropocillos que tengan cualquier número de pocillos. En tales casos, los fondos de los pocillos pueden servir como superficies para la formación de matrices, o los matrices se pueden formar sobre otras superficies y luego colocarse en los pocilios. Cuando se usa una superficie sin pocillos, se pueden formar islas de unión o se pueden inmovilizar moléculas sobre una superficie y se puede colocar sobre la superficie una junta que tiene orificios dispuestos espacialmente de modo que correspondan a las islas o biomoléculas. Dicha junta es preferiblemente hermética a los líquidos. Se puede colocar una junta sobre una superficie en cualquier momento, durante el procedimiento de fabricación de la matriz y se puede retirar si ya no es necesaria la separación de grupos o matrices.
Las moléculas inmovilizadas se pueden unir a uno o más biomarcadores o vesículas presentes en una muestra biológica en contacto con las moléculas inmovilizadas. Las moléculas inmovilizadas pueden modificar o pueden ser modificadas por moléculas presentes en una o más vesículas que contactan con las moléculas inmovilizadas. El contacto con la muestra por lo general comprende superponer la muestra sobre la matriz.
Las modificaciones o la unión de moléculas en solución o inmovilizadas en una matriz se pueden detectar usando técnicas de detección conocidas en la técnica. Los ejemplos de tales técnicas incluyen técnicas inmunológicas tales como ensayos de unión competitiva y ensayos tipo sándwich; detección de fluorescencia usando instrumentos tales como escáneres confocales, microscopios confocales o sistemas y técnicas basados en CCD tales como fluorescencia, polarización de fluorescencia (FP), transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET), fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS); técnicas colorimétricas/espectrométricas; resonancia de plasmones superficiales, mediante la cual se miden los cambios en la masa de los materiales adsorbidos en las superficies; técnicas que usan radioisótopos, incluidos los ensayos de proximidad de centelleo (SPA) y unión de radioisótopos convencionales; espectroscopia de masas, tal como espectroscopia de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) y espectroscopia de masas MALDI-tiempo de vuelo (TOF); elipsometría, que es un método óptico para medir el espesor de películas de proteínas; microbalanza de cristal de cuarzo (QCM), un método muy sensible para medir la masa de materiales que se adsorben en las superficies; microscopías de sonda de barrido, tales como microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía de fuerza de barrido (SFM) o microscopía electrónica de barrido (SEM); y técnicas tales como detección electroquímica, de impedancia, acústica, de microondas e IR/Raman. Véase, por ejemplo, Mere L, et al., “Miniaturized FRET assays and microfluidics: key components for ultra-high-throughput screening", Drug Discovery Today 4(8):363-369 (1999), y las referencias citadas en este; Lakowicz J R, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Plenum Press (1999,), oJain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteomics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volumen 1: Totowa, N.J.: Humana Press, 2007.
La tecnología de micromatrices se puede combinar con el análisis de espectroscopia de masas (MS) y otras herramientas. La interfaz de electroaspersión con un espectrómetro de masas se puede integrar con un capilar en un dispositivo de microfluidos. Por ejemplo, un sistema comercialmente disponible contiene indicadores eTag que son etiquetas fluorescentes con movilidades electroforéticas únicas y bien definidas; cada etiqueta se acopla a sondas biológicas o químicas a través de enlaces escindibles. La dirección de movilidad distinta de cada indicador eTag permite que las mezclas de estas etiquetas se desenreden y se cuantifiquen rápidamente mediante electroforesis capilar. Este sistema permite realizar análisis simultáneos de expresión génica, expresión de proteínas y función de proteínas a partir de la misma muestra Jain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteomics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volumen 1: Totowa, N.J.: Humana Press, 2007.
Un biochip puede incluir componentes para un ensayo microfluídico o nanofluídico. Se puede usar un dispositivo de microfluidos para aislar o analizar biomarcadores, tales como determinar una biofirma. Los sistemas de microfluidos permiten la miniaturización y compartimentación de uno o más procedimientos para aislar, capturar o detectar una vesícula, detectar un microARN, detectar un biomarcador circulante, detectar una biofirma y otros procedimientos. Los dispositivos microfluídicos pueden usar uno o más reactivos de detección en al menos un aspecto del sistema, y dicho reactivo de detección se puede usar para detectar uno o más biomarcadores. El dispositivo puede detectar un biomarcador en una vesícula aislada o unida. Se pueden usar diversas sondas, anticuerpos, proteínas u otros agentes de unión para detectar un biomarcador dentro del sistema de microfluidos. Los agentes de detección se pueden inmovilizar en diferentes compartimentos del dispositivo de microfluidos o entrar en una reacción de hibridación o detección a través de diversos canales del dispositivo.
Se puede lisar una vesícula en un dispositivo de microfluidos y su contenido se puede detectar dentro del dispositivo de microfluidos, tales como proteínas o ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN o ARN, tales como miARN o ARNm. El ácido nucleico se puede amplificar antes de la detección, o detectarse directamente, dentro del dispositivo de microfluidos. De este modo, el sistema de microfluidos también se puede usar para la detección multiplexada de diversos biomarcadores. Las vesículas se pueden capturar dentro del dispositivo de microfluidos, las vesículas capturadas se lisan y se determina una biofirma de microARN de la carga útil de la vesícula. La biofirma puede comprender además el agente de captura usado para capturar la vesícula.
Nuevas técnicas de nanofabricación están abriendo las posibilidades para aplicaciones de biodetección que se basan en la fabricación de matrices de precisión de alta densidad, por ejemplo, chips basados en nucleótidos y matrices de proteínas también conocidas como nanomatrices heterogéneas. La nanofluídica permite una mayor reducción de la cantidad de analito fluido en un microchip a niveles de nanolitros, y los chips usados aquí se denominan nanochips.
Véase, por ejemplo, Unger M et. al., Biotechniques 1999; 27(5):1008-14, Kartalov EP et. al., Biotechniques 2006; 40(l):85-90. Los nanochips disponibles comercialmente actualmente proporcionan ensayos simples de una etapa, tales como ensayos de colesterol total, proteína total o glucosa, que se pueden analizar combinando muestras y reactivos, mezclando y controlando la reacción. Enfoques analíticos sin gel basados en cromatografía líquida (LC) y separaciones nanoLC (Cutillas et al. Proteomics, 2005;5:101-112 y Cutillas et al., Mol Cell Proteomics 2005;4:1038-1051).
Se puede incluir en un kit una matriz apropiada para identificar una enfermedad, afección, síndrome o estado fisiológico. Un kit puede incluir un aptámero como se describe en este documento, incluyendo como ejemplos no limitantes, uno o más reactivos útiles para preparar moléculas para la inmovilización en islas de unión o áreas de una matriz, reactivos útiles para detectar la unión de una vesícula a moléculas inmovilizadas, e instrucciones de uso.
Además, se proporciona en este documento un dispositivo de detección rápida que facilita la detección de una biofirma particular en una muestra biológica. El dispositivo puede integrar la preparación de muestras biológicas con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un chip. El dispositivo puede facilitar la detección de una biofirma particular de una vesícula en una muestra biológica, y se proporciona un ejemplo como se describe en Pipper et al., Angewandte Chemie, 47(21), p. 3900-3904 (2008). Se puede incorporar una biofirma usando sensores de sistema micro/nanoelectroquímico (MEMS/NEMS) y fluido oral para aplicaciones de diagnóstico como se describe en Li et al., Adv Dent Res 18(1): 3-5 (2005).
Además de actuar como agentes de unión para una diana de interés en un ensayo, ciertos aptámeros descritos en este documento, por ejemplo, aptámeros de unión a grupos funcionales y/o aptámeros de bloqueo, se pueden usar para mejorar el rendimiento de diversas técnicas de detección de biomarcadores divulgadas en este documento. o conocidas en la técnica. Como se describe más adelante, tales aptámeros se pueden usar en un ensayo que usa un sustrato, en el que los aptámeros mitigan la unión no específica al sustrato.
Ensayos de partículas
Como alternativa a las matrices planas, los ensayos que usan partículas o microesferas, tales como los ensayos basados en perlas, también se pueden usar con un aptámero descrito en este documento. Los agentes de unión, tales como los aptámeros y los anticuerpos, se conjugan fácilmente con perlas disponibles en el mercado. Véase, por ejemplo, Srinivas et al. Anal. Chem. 2011 Oct. 21, Partículas de microgel funcionalizadas con aptámero para la detección de proteínas; Véase también el artículo de revisión sobre aptámeros como agentes terapéuticos y de diagnóstico, Brody and Gold, Rev. Mol. Biotech. 2000, 74:5-13.
Se pueden usar ensayos multiparamétricos u otros ensayos de detección de alto rendimiento que usan recubrimientos de perlas con ligandos afines y moléculas indicadoras con actividades específicas consistentes con automatización de alta sensibilidad. En un sistema de ensayo basado en perlas, un agente de unión para un biomarcador o vesícula, tal como un agente de captura (por ejemplo, un anticuerpo de captura), puede inmovilizarse en una microesfera direccionable. Cada agente de unión para cada ensayo de unión individual puede acoplarse a un tipo distinto de microesfera (es decir, microperlas) y la reacción del ensayo tiene lugar en la superficie de la microesfera, tal como se muestra en la figura 1B. Un agente de unión para una vesícula puede ser un anticuerpo de captura acoplado a una perla. Las microesferas teñidas con intensidades de fluorescencia discretas se cargan por separado con su agente de unión apropiado o sondas de captura. Los diferentes conjuntos de perlas que llevan diferentes agentes de unión se pueden agrupar según sea necesario para generar matrices de perlas personalizadas. A continuación, las matrices de perlas se incuban con la muestra en un único recipiente de reacción para realizar el ensayo. Las microvesículas se pueden conjugar directamente con perlas. Véanse, por ejemplo, las figuras 7A-7D. Las vesículas conjugadas con perlas se pueden usar para enriquecer los aptámeros que se unen a las microvesículas. Véanse
Ejemplos 28-33.
Los ensayos basados en perlas también se pueden usar con uno o más aptámeros descritos en este documento. Un sustrato de perlas puede proporcionar una plataforma para unir uno o más agentes de unión, incluidos los aptámeros. Para la multiplexación, múltiples conjuntos de perlas diferentes (por ejemplo, Illumina, Luminex) pueden tener diferentes agentes de unión (específicos para diferentes moléculas diana). Por ejemplo, una perla se puede conjugar con un agente de unión, por ejemplo, un aptámero descrito en este documento, que se usa para detectar la presencia (cuantitativa o cualitativamente) de un antígeno de interés, o también se puede usar para aislar un componente presente en una muestra biológica seleccionada (por ejemplo, célula, fragmento de célula o vesícula que comprende la molécula diana a la que el aptámero está configurado para unirse o asociarse). Cualquier molécula de origen orgánico se puede conjugar satisfactoriamente con una perla de poliestireno mediante el uso de kits disponibles en el mercado.
Uno o más aptámeros descritos en este documento se pueden usar con cualquier sustrato basado en perlas, incluyendo, sin limitación, el método de captura magnética, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o la citometría láser. Los métodos de captura magnética pueden incluir, pero no se limitan a, el uso de microperlas o columnas magnéticas del clasificador de células activadas magnéticamente (MACS). Los ejemplos de métodos basados en perlas o partículas que se pueden modificar para su uso un aptámero descrito en este documento incluyen métodos y sistemas de perlas descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,551,435, 4,795,698, 4,925,788, 5,108,933, 5,186,827, 5,200,084 o 5,158,871; 7,399,632; 8,124,015; 8,008,019; 7,955,802; 7,445,844; 7,274,316; 6,773,812; 6,623,526; 6,599,331; 6,057,107; 5,736,330; la Solicitud de la Patente Internacional No. PCT/US2012/42519; PCT/US1993/04145 .
Citometría de flujo
El aislamiento o la detección de biomarcadores circulantes, por ejemplo, antígenos proteicos, de una muestra biológica, o de células, fragmentos celulares o vesículas que comprenden biomarcadores también se puede lograr usando un aptámero descrito en este documento en un procedimiento de citometría. Como ejemplo no limitante, los aptámeros descritos en este documento se pueden usar en un ensayo que comprende el uso de una partícula tal como una perla o una microesfera. Los aptámeros se pueden usar como agentes de unión, que se pueden conjugar con la partícula. La citometría de flujo se puede usar para clasificar partículas microscópicas suspendidas en una corriente de líquido. A medida que las partículas pasan, pueden cargarse selectivamente y, al salir, pueden desviarse en caminos de flujo separados. Por lo tanto es posible separar poblaciones de una mezcla original, tales como una muestra biológica, con un alto grado de precisión y velocidad. La citometría de flujo permite el análisis multiparamétrico simultáneo de las características físicas y/o químicas de células únicas que fluyen a través de un aparato de detección óptico/electrónico. Un haz de luz, generalmente luz láser, de una única frecuencia (color) se dirige hacia una corriente de fluido enfocada hidrodinámicamente. Un número de detectores apuntan al punto donde la corriente pasa a través del haz de luz; uno en línea con el haz de luz (Forward Scatter o FSC) y varios perpendiculares al mismo (Side Scatter o SSC) y uno o más detectores fluorescentes.
Cada partícula suspendida que pasa a través del haz dispersa la luz de alguna manera, y los productos químicos fluorescentes en la partícula pueden excitarse para emitir luz a una frecuencia más baja que la fuente de luz. Esta combinación de luz dispersa y fluorescente es captada por los detectores, y al analizar las fluctuaciones en el brillo en cada detector (uno para cada pico de emisión fluorescente), es posible deducir diversos hechos sobre la estructura física y química de cada partícula individual. FSC se correlaciona con el tamaño de la célula y SSC depende de la complejidad interna de la partícula, tal como la forma del núcleo, la cantidad y el tipo de gránulos citoplasmáticos o la rugosidad de la membrana. Algunos citómetros de flujo han eliminado la necesidad de fluorescencia y solo usan dispersión de luz para la medición.
Los citómetros de flujo pueden analizar varios miles de partículas cada segundo en “tiempo real” y pueden separar y aislar activamente partículas que tienen propiedades específicas. Ofrecen cuantificación y separación automatizadas de alto rendimiento de los parámetros establecidos para una gran cantidad de células únicas, durante cada sesión de análisis. Los citómetros de flujo pueden tener múltiples láseres y detectores de fluorescencia, lo que permite usar múltiples etiquetas para especificar con mayor precisión una población diana por su fenotipo. De este modo, se puede usar un citómetro de flujo, tal como un citómetro de flujo multicolor, para detectar una o más vesículas con múltiples etiquetas o colores fluorescentes. El citómetro de flujo también puede clasificar o aislar diferentes poblaciones de vesículas, tal como, por tamaño o por diferentes marcadores.
El citómetro de flujo puede tener uno o más láseres, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más láseres. El citómetro de flujo puede detectar más de un color o etiqueta fluorescente, tal como al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 colores diferentes o etiquetas fluorescentes. Por ejemplo, el citómetro de flujo puede tener al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 detectores de fluorescencia.
Los ejemplos de citómetros de flujo comercialmente disponibles que se pueden usar para detectar o analizar una o más vesículas, para clasificar o separar diferentes poblaciones de vesículas incluyen, sin limitación, el clasificador de células MoFlo™ XDP (Beckman Coulter, Brea, CA), el clasificador de células MoFlo™ Legacy (Beckman Coulter, Brea, CA), el clasificador de células BD FACSAria™ (BD Biosciences, San Jose, CA), BD™ LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA), y BD FACSCalibur™ (BD Biosciences, San Jose, CA). El uso de citómetros multicolor o multi-fluor se puede usar en el análisis multiplex de vesículas, como se describe más adelante. El citómetro de flujo puede clasificar y, recopilar o clasificar así, más de una población de vesículas en base a una o más características. Por ejemplo, dos poblaciones de vesículas difieren en tamaño, de modo que las vesículas dentro de cada población tienen un intervalo de tamaño similar y se pueden detectar o clasificar de forma diferente. Dos poblaciones diferentes de vesículas pueden marcarse de manera diferente.
Los datos resultantes de los citómetros de flujo pueden representarse en 1 dimensión para producir histogramas o verse en 2 dimensiones como diagramas de puntos o en 3 dimensiones con software más nuevo. Las regiones en estos diagramas se pueden separar secuencialmente mediante una serie de extracciones de subconjuntos que se denominan puertas. Existen protocolos de sincronización específicos con fines diagnósticos y clínicos, especialmente en relación con la hematología. Los diagramas a menudo se hacen en escalas logarítmicas. Debido a que los espectros de emisión de diferentes colorantes fluorescentes se superponen, las señales en los detectores deben compensarse electrónica y computacionalmente. Los fluoróforos para marcar biomarcadores pueden incluir los descritos en Ormerod, Flow Cytometry 2‘ ed., Springer-Verlag, Nueva York (1999), y en Nida et al., Gynecologic Oncology 2005;4 889-894. En un ensayo multiplexado, incluyendo, sin limitación, un ensayo de citometría de flujo, se pueden evaluar una o más moléculas diana diferentes. Al menos una de las moléculas diana puede ser un biomarcador, por ejemplo, un antígeno de superficie de microvesículas, evaluado usando un aptámero descrito en este documento.
Microfluidos
Uno o más aptámeros descritos en este documento se pueden conjugar o disponer de otro modo en cualquier sustrato plano o de perlas útil. En un aspecto de la invención, uno o más aptámeros descritos en este documento se disponen en un dispositivo de microfluidos, facilitando así la evaluación, caracterización o aislamiento de un componente de una muestra biológica que comprende un antígeno polipeptídico de interés o un fragmento funcional del mismo. Por ejemplo, el antígeno circulante o una célula, fragmento celular o vesículas derivadas de células que comprenden el antígeno se pueden evaluar usando uno o más aptámeros descritos en este documento (alternativamente junto con agentes de unión adicionales). Los dispositivos de microfluidos, que también pueden denominarse sistemas de “ laboratorio en un chip", sistemas microelectromecánicos biomédicos (bioMEM) o sistemas integrados multicomponente, se pueden usar para aislar y analizar una vesícula. Tales sistemas miniaturizan y compartimentan los procedimientos que permiten la unión de vesículas, la detección de biofirmas y otros procedimientos.
También se puede usar un dispositivo de microfluidos para el aislamiento de una vesícula a través de la diferencia de tamaño o la selección por afinidad. Por ejemplo, un dispositivo de microfluidos puede usar uno o más canales para aislar una vesícula de una muestra biológica en función del tamaño o usando uno o más agentes de unión para aislar una vesícula de una muestra biológica. Una muestra biológica se puede introducir en uno o más canales microfluídicos, lo que permite selectivamente el paso de una vesícula. La selección se puede basar en una propiedad de la vesícula, tal como el tamaño, la forma, la deformabilidad o la biofirma de la vesícula.
Se puede introducir una población heterogénea de vesículas en un dispositivo de microfluidos, y se pueden obtener una o más poblaciones homogéneas de vesículas diferentes. Por ejemplo, diferentes canales pueden tener diferentes selecciones de tamaño o agentes de unión para seleccionar diferentes poblaciones de vesículas. De este modo, un dispositivo de microfluidos puede aislar una pluralidad de vesículas en el que al menos un subconjunto de la pluralidad de vesículas comprende una biofirma diferente de otro subconjunto de la pluralidad de vesículas. Por ejemplo, el dispositivo de microfluidos puede aislar al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 diferentes subconjuntos de vesículas, en el que cada subconjunto de vesículas comprende una biofirma diferente.
El dispositivo de microfluidos puede comprender uno o más canales que permiten un mayor enriquecimiento o selección de una vesícula. Una población de vesículas que se ha enriquecido después del paso a través de un primer canal se puede introducir en un segundo canal, lo que permite enriquecer aún más el paso de la vesícula deseada o la población de vesículas, tal como a través de uno o más agentes de unión presentes en el segundo canal.
Los ensayos basados en matriz y los ensayos basados en perlas se pueden usar con un dispositivo de microfluidos. Por ejemplo, el agente de unión se puede acoplar a las perlas y la reacción de unión entre las perlas y la vesícula se puede realizar en un dispositivo de microfluidos. La multiplexación también se puede realizar usando un dispositivo de microfluidos. Diferentes compartimentos pueden comprender diferentes agentes de unión para diferentes poblaciones de vesículas, donde cada población es de una población de vesículas específica de célula de origen diferente. Cada población tiene una biofirma diferente. La reacción de hibridación entre la microesfera y la vesícula se puede realizar en un dispositivo de microfluidos y la mezcla de reacción se puede suministrar a un dispositivo de detección. El dispositivo de detección, tal como un sistema de detección de láser dual o múltiple, puede ser parte del sistema de microfluidos y puede usar un láser para identificar cada perla o microesfera por su código de color, y otro láser puede detectar la señal de hibridación asociada con cada perla.
Se puede usar cualquier dispositivo de microfluidos apropiado en los métodos de la invención. Los ejemplos de dispositivos microfluídicos que se pueden usar o adaptar para su uso con vesículas incluyen, sin limitación, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,591,936, 7,581,429, 7,579,136, 7,575,722, 7,568,399, 7,552,741, 7,544,506, 7,541,578, 7,518,726, 7,488,596, 7,485,214, 7,467,928, 7,452,713, 7,452,509, 7,449,096, 7,431,887, 7,422,725, 7,422,669, 7,419,822, 7,419,639, 7,413,709, 7,411,184, 7,402,229, 7,390,463, 7,381,471, 7,357,864, 7,351,592, 7,351,380, 7,338,637, 7,329,391, 7,323,140, 7,261,824, 7,258,837, 7,253,003, 7,238,324, 7,238,255, 7,233,865, 7,229,538, 7,201,881, 7,195,986, 7,189,581, 7,189,580, 7,189,368, 7,141,978, 7,138,062, 7,135,147, 7,125,711, 7,118,910, 7,118,661, 7,640,947, 7,666,361, 7,704,735; y la Publicación de la Patente Internacional WO 2010/072410. Otro ejemplo para su uso con los métodos divulgados en este documento se describe en Chen et al., "Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum vesicles", Lab on a Chip, Dec. 8, 2009 DOI: 10.1039/b916199f.
Otros dispositivos microfluídicos para su uso con la invención incluyen dispositivos que comprenden capas, válvulas y bombas elastoméricas, incluyendo, sin limitación, a los divulgados en las Patentes de los Estados Unidos Nos.
5,376,252, 6,408,878, 6,645,432, 6,719,868, 6,793,753, 6,899,137, 6,929,030, 7,040,338, 7,118,910, 7,144,616, 7,216,671, 7,250,128, 7,494,555, 7,501,245, 7,601,270, 7,691,333, 7,754,010, 7,837,946; la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos Nos. 2003/0061687, 2005/0084421, 2005/0112882, 2005/0129581, 2005/0145496, 2005/0201901, 2005/0214173, 2005/0252773, 2006/0006067; y las Patentes EP Nos. 0527905 y 1065378. En algunos casos, muchos o todos los dispositivos están compuestos de material elastomérico. Ciertos dispositivos están diseñados para realizar reacciones de ciclos térmicos (por ejemplo, PCR) con dispositivos que incluyen una o más válvulas elastoméricas para regular el flujo de solución a través del dispositivo. Los dispositivos pueden comprender matrices de sitios de reacción, lo que permite realizar una pluralidad de reacciones. De este modo, los dispositivos se pueden usar para evaluar los microARN circulantes de forma múltiplex, incluidos los microARN aislados de vesículas. El dispositivo de microfluidos puede comprender (a) una primera pluralidad de canales de flujo formados en un sustrato elastomérico; (b) una segunda pluralidad de canales de flujo formados en el sustrato elastomérico que se cruzan con la primera pluralidad de canales de flujo para definir una matriz de sitios de reacción, cada sitio de reacción ubicado en una intersección de uno de los canales de flujo primero y segundo; (c) una pluralidad de válvulas de aislamiento dispuestas a lo largo de la primera y segunda pluralidad de canales de flujo y espaciadas entre los sitios de reacción que se pueden accionar para aislar una solución dentro de cada uno de los sitios de reacción de las soluciones en otros sitios de reacción, en el que las válvulas de aislamiento comprenden uno o más canales de control cada uno de los cuales se superpone e intersecta uno o más de los canales de flujo; y (d) medios para accionar simultáneamente las válvulas para aislar los sitios de reacción entre sí. Se prevén diversas modificaciones a la estructura básica del dispositivo dentro del alcance de la invención. Los microARN se pueden detectar en cada uno de los sitios de reacción mediante el uso de métodos de PCR. Por ejemplo, el método puede comprender las etapas de las etapas de: (i) proporcionar un dispositivo de microfluidos, que comprende el dispositivo de microfluidos: un primer canal fluídico que tiene un primer extremo y un segundo extremo en comunicación fluida entre sí a través del canal; una pluralidad de canales de flujo, terminando cada canal de flujo en una pared terminal; en el que cada canal de flujo se ramifica y está en comunicación fluida con el primer canal fluídico, en el que un fluido acuoso que ingresa a uno de los canales de flujo desde el primer canal fluídico puede fluir fuera del canal de flujo solo a través del primer canal fluídico; y una entrada en comunicación fluida con el primer canal fluídico, la entrada para introducir una muestra de fluido; en el que cada canal de flujo está asociado con una válvula que, cuando se cierra, aísla un extremo del canal de flujo del primer canal fluídico, por lo que se forma un sitio de reacción aislado entre la válvula y la pared terminal; un canal de control; en el que cada válvula es una membrana desviable que se desvía hacia el canal de flujo asociado con la válvula cuando se aplica una fuerza de accionamiento al canal de control, cerrando así la válvula; y en el que cuando se aplica la fuerza de accionamiento al canal de control, se cierra una válvula en cada uno de los canales de flujo, para producir el sitio de reacción aislado en cada canal de flujo; (ii) introducir el fluido de muestra en la entrada, llenando el fluido de muestra los canales de flujo; (iii) accionar la válvula para separar el fluido de muestra en porciones separadas dentro de los canales de flujo; (iv) amplificar el ácido nucleico en el fluido de muestra; (v) analizar las porciones del fluido de muestra para determinar si la amplificación produjo la reacción. El fluido de muestra puede contener una diana de ácido nucleico amplificable, por ejemplo, un microARN, y las condiciones pueden ser condiciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de modo que la reacción da como resultado la formación de un producto de PCR.
El dispositivo de microfluidos puede tener uno o más agentes de unión unidos a una superficie en un canal, o presentes en un canal. Por ejemplo, el microcanal puede tener uno o más agentes de captura, tal como un agente de captura para uno o más antígenos de microvesículas generales en la tabla 3 o una célula de origen o antígeno relacionado con el cáncer en la tabla 4, incluyendo, sin limitación, EpCam, CD9, PCSA, CD63, CD81, PSMA, B7H3, PSCA, ICAM, STEAP, KLK2, SSX2, SSX4, p Bp , SPDEF y EGFR. El agente de captura puede ser un aptámero seleccionado por los métodos descritos en este documento. La superficie del canal también se puede poner en contacto con un aptámero de bloqueo descrito en este documento. Una superficie de un microcanal se puede tratar con avidina y se puede inyectar un agente de captura, tal como un anticuerpo, que está biotinilado en el canal para unir la avidina. Los agentes de captura pueden estar presentes en cámaras u otros componentes de un dispositivo de microfluidos. Los agentes de captura también se pueden unir a perlas que se pueden manipular para moverse a través de los canales de microfluidos. Los agentes de captura se pueden unir a perlas magnéticas. Las perlas se pueden manipular con imanes.
Se puede hacer fluir una muestra biológica en el dispositivo de microfluidos, o un microcanal, a velocidades tales como al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 |il por minuto, tal como entre aproximadamente 1-50, 5-40, 5-30, 3- 20 o 5-15 |il por minuto. Una o más vesículas se pueden capturar y detectar directamente en el dispositivo de microfluidos. Como alternativa, la vesícula capturada puede liberarse y salir del dispositivo de microfluidos antes del análisis. Una o más vesículas capturadas se pueden lisar en el microcanal y el lisado se puede analizar, por ejemplo, para examinar la carga útil dentro de las vesículas. La solución reguladora de lisis se puede hacer fluir a través del canal y lisar las vesículas capturadas. Por ejemplo, la solución reguladora de lisis puede fluir hacia el dispositivo o microcanal a velocidades tales como al menos aproximadamente a, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 |il por minuto, tales como entre aproximadamente 1-50, 5-40, 10-30, 5-30 o 10-35 |il por minuto. El lisado se puede recoger y analizar, tal como realizando RT-PCR, PCR, espectrometría de masas, transferencia Western u otros ensayos, para detectar uno o más biomarcadores de la vesícula.
Fenotipos
En este documento se divulgan productos y procedimientos para caracterizar un fenotipo usando los métodos de la invención. El término “fenotipo", como se usa en este documento, puede significar cualquier rasgo o característica que se atribuye a un perfil de biomarcador que se identifica usando en parte o en su totalidad los métodos de la invención. Por ejemplo, un fenotipo puede ser una determinación diagnóstica, pronóstica o teranóstica en base a un perfil de biomarcador caracterizado para una muestra obtenida de un sujeto. Un fenotipo puede ser cualquier característica o rasgo observable, tal como una enfermedad o afección, un estadio de una enfermedad o afección, susceptibilidad a una enfermedad o afección, pronóstico de un estadio de una afección o enfermedad, un estado fisiológico o una respuesta/respuesta potencial a la terapéutica. Un fenotipo puede ser el resultado de la composición genética de un sujeto, así como de la influencia de factores ambientales y las interacciones entre ambos, así como de modificaciones epigenéticas en las secuencias de ácidos nucleicos.
Un fenotipo en un sujeto se puede caracterizar obteniendo una muestra biológica de un sujeto y analizando la muestra usando los métodos de la invención. Por ejemplo, la caracterización de un fenotipo para un sujeto o individuo puede incluir la detección de una enfermedad o afección (incluida la detección presintomática de un estadio temprano), la determinación de un pronóstico, diagnóstico o teranosis de una enfermedad o afección, o la determinación del estadio o progresión de una enfermedad o afección. La caracterización de un fenotipo puede incluir la identificación de tratamientos apropiados o la eficacia del tratamiento para enfermedades específicas, afecciones, estadios de la enfermedad y estadios de la afección, predicciones y análisis de probabilidad de progresión de la enfermedad, particularmente recurrencia de la enfermedad, diseminación metastásica o recaída de la enfermedad. Un fenotipo también puede ser un tipo o subtipo clínicamente distinto de una afección o enfermedad, tal como un cáncer o un tumor. La determinación del fenotipo también puede ser una determinación de una afección fisiológica o una evaluación de la aflicción del órgano o el rechazo del órgano, tal como después del trasplante. Las composiciones y los métodos descritos en este documento permiten la evaluación de un sujeto de forma individual, lo que puede proporcionar los beneficios de decisiones más eficientes y económicas en el tratamiento.
En un aspecto, la invención se refiere al análisis de biomarcadores tales como microvesículas para proporcionar un diagnóstico, pronóstico y/o teranosis de una enfermedad o afección. La teranóstica incluye pruebas de diagnóstico que brindan la capacidad de afectar la terapia o el tratamiento de una enfermedad o estado patológico. Las pruebas de teranóstica proporcionan una teranosis de manera similar que las pruebas de diagnóstico o pronóstico proporcionan un diagnóstico o pronóstico, respectivamente. Como se usa en este documento, la teranóstica abarca cualquier forma deseada de pruebas relacionadas con la terapia, incluida la medicina predictiva, la medicina personalizada, la medicina integrada, el farmacodiagnóstico y la asociación Dx/Rx. Las pruebas relacionadas con la terapia se pueden usar para predecir y evaluar la respuesta al fármaco en sujetos individuales, es decir, para proporcionar una medicina personalizada. Predecir una respuesta a un fármaco puede determinar si un sujeto responde probablemente o no responde a un agente terapéutico candidato, por ejemplo, antes de que el sujeto haya sido expuesto o tratado de otro modo con el tratamiento. Evaluar una respuesta a un fármaco puede ser controlar una respuesta a un fármaco, por ejemplo, controlar la mejora del sujeto o la ausencia de la misma a lo largo del tiempo después de iniciar el tratamiento. Las pruebas relacionadas con la terapia son útiles para seleccionar un sujeto para el tratamiento que es particularmente probable que se beneficie del tratamiento o para proporcionar una indicación temprana y objetiva de la eficacia del tratamiento en un sujeto individual. De este modo, el análisis que usa los métodos de la invención puede indicar que el tratamiento debe modificarse para seleccionar un tratamiento más prometedor, evitando así el gran gasto de retrasar el tratamiento beneficioso y evitando los costes financieros y de morbilidad de administrar uno o unos fármacos ineficaces.
De este modo, los métodos de la invención pueden ayudar a predecir si es probable que un sujeto responda a un tratamiento para una enfermedad o trastorno. Caracterizar un fenotipo incluye predecir el estado de respondedor/no respondedor del sujeto, en el que un respondedor responde a un tratamiento para una enfermedad y un no respondedor no responde al tratamiento. Los biomarcadores, tales como las microvesículas, se pueden analizar en el sujeto y comparar frente a los de los sujetos anteriores que se sabía que respondían o no a un tratamiento. Si el perfil de biomarcadores en el sujeto se alinea más estrechamente con el de los sujetos anteriores que se sabía que respondían al tratamiento, el sujeto se puede caracterizar, o predecir, como respondedor al tratamiento. De manera similar, si el perfil de biomarcadores en el sujeto se alinea más estrechamente con el de los sujetos anteriores que no respondieron al tratamiento, el sujeto se puede caracterizar o predecir como no respondedor al tratamiento. El tratamiento puede ser para cualquier enfermedad, trastorno u otra afección apropiada, incluyendo, sin limitación, los divulgados en este documento.
En algunas realizaciones, el fenotipo comprende una enfermedad o afección tal como las enumeradas en la tabla 1. Por ejemplo, el fenotipo puede comprender detectar la presencia o probabilidad de desarrollar un tumor, neoplasia o cáncer, o caracterizar el tumor, neoplasia o cáncer (por ejemplo, estadio, grado, agresividad, probabilidad de metástasis o recurrencia, etc.). Los cánceres que se pueden detectar o evaluarse mediante métodos o composiciones descritos en este documento incluyen, sin limitación, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, pólipo hiperplásico, adenoma, cáncer colorrectal, displasia de alto grado, displasia de bajo grado, hiperplasia prostática, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro (tales como un glioblastoma), neoplasia hematológica, carcinoma hepatocelular, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), carcinoma de células renales (RCC) o cáncer gástrico. El cáncer colorrectal puede ser CRC Dukes B o Dukes C-D. La neoplasia hematológica puede ser leucemia linfocítica crónica de células B, linfoma de células B-DLBCL, linfoma de células B-DLBCL similar al centro germinal, linfoma de células B-DLBCL similar a células B activadas y linfoma de Burkitt.
El fenotipo puede ser una afección premaligna, tales como queratosis actínica, gastritis atrófica, leucoplasia, eritroplasia, granulomatosis linfomatoide, preleucemia, fibrosis, displasia cervical, displasia cervical uterina, xeroderma pigmentoso, esófago de Barrett, pólipo colorrectal u otro crecimiento de tejido anormal o lesión que es probable que se convierta en un tumor maligno. Las infecciones virales transformativas tales como el VIH y e1HPV también presentan fenotipos que se pueden evaluar.
Un cáncer caracterizado por los métodos de la invención puede comprender, sin limitación, un carcinoma, un sarcoma, un linfoma o leucemia, un tumor de células germinales, un blastoma u otros cánceres. Los carcinomas incluyen, sin limitación, neoplasias epiteliales, neoplasias de células escamosas, carcinoma de células escamosas, neoplasias de células basales, carcinoma de células basales, papilomas y carcinomas de células de transición, adenomas y adenocarcinomas (glándulas), adenoma, adenocarcinoma, linitis insulinoma plástica, glucagonoma, gastrinoma, vipoma, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma adenoide quístico, tumor carcinoide de apéndice, prolactinoma, oncocitoma, adenoma de células de Hurthle, carcinoma de células renales, tumor de Grawitz, adenomas endocrinos múltiples, adenoma endometrioide, neoplasias anexiales y de apéndices cutáneos, neoplasias mucoepidermoides, neoplasias quísticas, mucinosas y serosas, cistadenoma, pseudomixoma peritoneal, neoplasias ductales, lobulillares y medulares, neoplasias de células acinares, neoplasias epiteliales complejas, tumor de Warthin, timoma, neoplasias gonadales especializadas, tumor del estroma de los cordones sexuales, tecoma, tumor de células de la granulosa, arrenoblastoma, tumor de células de Sertoli Leydig, tumores glómicos, paraganglioma, feocromocitoma, tumor glómico, nevus y melanomas, nevus melanocítico, melanoma maligno, melanoma, melanoma nodular, nevus displásico, melanoma lentigo maligno, melanoma de extensión superficial y melanoma lentiginoso acral maligno. El sarcoma incluye, entre otros, tumor de Askin, botriodias, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, hemangioendotelioma maligno, schwannoma maligno, osteosarcoma, sarcomas de tejidos blandos que incluyen: sarcoma alveolar de partes blandas, angiosarcoma, cistosarcoma filoides, dermatofibrosarcoma, tumor desmoide, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, sarcoma epitelioide, condrosarcoma extraesquelético, osteosarcoma extraesquelético, fibrosarcoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, linfosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, neurofibrosarcoma, rabdomiosarcoma y sinovialsarcoma. El linfoma y la leucemia incluyen, sin limitación, leucemia linfocítica crónica/linfoma de linfocitos pequeños, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocitario (tal como la macroglobulinemia de Waldenstrom), linfoma de la zona marginal esplénica, mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma, enfermedades por depósito de inmunoglobulina monoclonal, enfermedades de cadenas pesadas, linfoma de células B de la zona marginal extranodal, también llamado linfoma de malta, linfoma de células B de la zona marginal nodal (nmzl), linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células B grandes mediastinal (tímico), linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de efusión primario, linfoma/leucemia de burkitt, leucemia prolinfocítica de células T, leucemia linfocítica granular grande de células T, leucemia de células NK agresiva, leucemia/linfoma de células T de adultos, linfoma de células T/NK extraganglionar, tipo nasal, linfoma de células T tipo enteropatía, Linfoma de células T hepatoesplénico, linfoma blástico de células NK, micosis fungoide/síndrome de sézary, Trastornos linfoproliferativos de células T positivo a CD30 cutáneo primario, linfoma anaplásico de células grandes cutáneo primario, papulosis linfomatoide, linfoma de células T angioinmunoblástico, linfoma de células T periférico, no especificado, linfoma anaplásico de células grandes, linfomas de Hodgkin clásicos (esclerosis nodular, celularidad mixta, rico en linfocitos, agotada o no agotada en linfocitos) y linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares. Los tumores de células germinales incluyen, sin limitación, germinoma, disgerminoma, seminoma, tumor de células germinales no germinomatoso, carcinoma embrionario, tumor del seno endodérmico, coriocarcinoma, teratoma, poliembrioma y gonadoblastoma. El blastoma incluye, sin limitación, nefroblastoma, meduloblastoma y retinoblastoma. Otros cánceres incluyen, sin limitación, carcinoma labial, carcinoma de laringe, carcinoma de hipofaringe, carcinoma de lengua, carcinoma de glándulas salivales, carcinoma gástrico, adenocarcinoma, cáncer de tiroides (carcinoma de tiroides medular y papilar), carcinoma renal, carcinoma de parénquima renal, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de cuerpo uterino, carcinoma de endometrio, carcinoma de corion, carcinoma de testículo, carcinoma urinario, melanoma, tumores cerebrales tales como glioblastoma, astrocitoma, meningioma, meduloblastoma y tumores neuroectodérmicos periféricos, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma bronquial, mieloma múltiple, basalioma, teratoma, retinoblastoma, melanoma de coroidea, seminoma, rabdomiosarcoma, craneofaringeoma, osteosarcoma, condrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma, sarcoma de Ewing y plasmocitoma.
En una realización adicional, el cáncer bajo análisis puede ser un cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de pulmón de células pequeñas (incluyendo carcinoma de células pequeñas (cáncer de células de avena), carcinoma mixto de células pequeñas/células grandes, y carcinoma de células pequeñas combinado), cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de piel, cáncer de huesos, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de páncreas, glioma, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma papilar renal, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, leucemia, linfoma, mieloma o un tumor sólido.
En realizaciones, el cáncer comprende una leucemia linfoblástica aguda; leucemia mieloide aguda; carcinoma adrenocortical; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de vejiga; glioma de tronco encefálico; tumor cerebral (incluyendo glioma de tronco encefálico, tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central, tumores embrionarios del sistema nervioso central, astrocitomas, craneofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma); cáncer de mama; tumores bronquiales; linfoma de Burkitt; cáncer de sitio primario desconocido; tumor carcinoide; carcinoma de sitio primario desconocido; tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central; tumores embrionarios del sistema nervioso central; cáncer de cuello uterino; cánceres infantiles; cordoma; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T; tumores de células de los islotes pancreáticos endocrinos; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; estesioneuroblastoma; sarcoma de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (de estómago); tumor carcinoide gastrointestinal; tumor de células del estroma gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal (GIST); tumor trofoblástico gestacional; glioma; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; melanoma intraocular; tumores de células de los islotes; sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón; histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio; cáncer de hígado; cáncer óseo de histiocitoma fibroso maligno; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; carcinoma de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndromes de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide; síndromes mielodisplásicos; neoplasias mieloproliferativas; cáncer de cavidad nasal; cáncer de nasofaringe; neuroblastoma; linfoma de no-Hodgkin; cáncer de piel no melanoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer bucal; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma; otros tumores cerebrales y de la médula espinal; cáncer de ovarios; cáncer epitelial de ovario; tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer de páncreas; papilomatosis; cáncer de senos paranasales; cáncer de paratiroides; cáncer pélvico; cáncer de pene; cáncer de faringe; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma; tumor pituitario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central (CNS); cáncer hepático hepatocelular primario; cáncer de próstata; cáncer de recto; cáncer renal; cáncer de células renales (riñón); cáncer de células renales; cáncer de las vías respiratorias; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de glándulas salivales; síndrome de Sézary; cáncer de pulmón de células pequeñas; cáncer de intestino delgado; sarcoma de tejidos blandos; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso; cáncer de estómago (gástrico); tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; linfoma de células T; cáncer testicular; cáncer de garganta; carcinoma tímico; timoma; cáncer de tiroides; cáncer de células de transición; cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter; tumor trofoblástico; cáncer de uréter; cáncer de uretra; cáncer uterino; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; macroglobulinemia de Waldenstrom; o tumor de Wilm. Los métodos de la invención se pueden usar para caracterizar estos y otros cánceres. De este modo, caracterizar un fenotipo puede proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de uno de los cánceres divulgados en este documento.
En algunas realizaciones, el cáncer comprende una leucemia mieloide aguda (AML), carcinoma de mama, colangiocarcinoma, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma del conducto biliar extrahepático, neoplasia del tracto genital femenino, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma gastroesofágico, tumores del estroma gastrointestinal (GIST), glioblastoma, carcinoma escamoso de cabeza y cuello, leucemia, carcinoma hepatocelular de hígado, glioma de bajo grado, carcinoma bronquioloalveolar de pulmón (BAC), cáncer de pulmón de células no pequeñas de pulmón (NSCLC), cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), linfoma, neoplasia maligna del tracto genital masculino, tumor fibroso solitario maligno de la pleura (MSFT), melanoma, mieloma múltiple, tumor neuroendocrino, linfoma de células B grandes difuso nodular, cáncer de ovario no epitelial (no EOC), carcinoma epitelial de la superficie del ovario, adenocarcinoma pancreático, carcinomas hipofisarios, oligodendroglioma, adenocarcinoma prostático, carcinoma retroperitoneal o peritoneal, sarcoma retroperitoneal o peritoneal, neoplasia del intestino delgado, tumor de tejidos blandos, carcinoma tímico, carcinoma de tiroides o melanoma uveal. Los métodos de la invención se pueden usar para caracterizar estos y otros cánceres. De este modo, caracterizar un fenotipo puede proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de uno de los cánceres divulgados en este documento.
El fenotipo también puede ser una enfermedad inflamatoria, una enfermedad inmune o una enfermedad autoinmune. Por ejemplo, la enfermedad puede ser enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad de Crohn (CD), colitis ulcerosa (UC), inflamación pélvica, vasculitis, psoriasis, diabetes, hepatitis autoinmune, esclerosis múltiple, miastenia grave, diabetes tipo I, artritis reumatoide, psoriasis, lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, enfermedad de Sjogren espondilitis anquilosante, síndrome CREST, esclerodermia, enfermedad reumática, rechazo de órganos, colangitis esclerosante primaria o sepsis.
El fenotipo también puede comprender una enfermedad cardiovascular, tal como aterosclerosis, insuficiencia cardíaca congestiva, placa vulnerable, accidente cerebrovascular o isquemia. La enfermedad o afección cardiovascular puede ser hipertensión arterial, estenosis, oclusión de un vaso o un evento trombótico.
El fenotipo también puede comprender una enfermedad neurológica, tal como esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Parkinson (PD), enfermedad de Alzheimer (AD), esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión, autismo, enfermedad priónica, enfermedad de Pick, demencia, enfermedad de Huntington (HD), síndrome de Down, enfermedad cerebrovascular, encefalitis de Rasmussen, meningitis viral, lupus eritematoso sistémico neuropsiquiátrico (NPSLE), esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, encefalopatía espongiforme transmisible, daño por reperfusión isquémica (por ejemplo, accidente cerebrovascular), traumatismo cerebral, infección microbiana o síndrome de fatiga crónica. El fenotipo también puede ser una afección tal como la fibromialgia, el dolor neuropático crónico o el dolor neuropático periférico.
El fenotipo también puede comprender una enfermedad infecciosa, tal como una infección bacteriana, viral o por levaduras. Por ejemplo, la enfermedad o afección puede ser la enfermedad de Whipple, la enfermedad priónica, la cirrosis, el estafilococo áureo resistente a la meticilina, el VIH, la hepatitis, la sífilis, la meningitis, la malaria, la tuberculosis o la gripe. Las proteínas virales, como el VIH o las partículas similares al VHC, se pueden evaluar en una vesícula para caracterizar una afección viral.
El fenotipo también puede comprender una afección perinatal o relacionada con el embarazo (por ejemplo, preeclampsia o parto prematuro), enfermedad o afección metabólica, tal como una enfermedad o afección metabólica asociada con el metabolismo del hierro. Por ejemplo, la hepcidina se puede analizar en una vesícula para caracterizar una deficiencia de hierro. La enfermedad o afección metabólica también puede ser diabetes, inflamación o una afección perinatal.
Los métodos de la invención se pueden usar para caracterizar estas y otras enfermedades y trastornos que pueden evaluarse a través de biomarcadores. De este modo, caracterizar un fenotipo puede proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de una de las enfermedades y trastornos divulgados en este documento.
Sujeto
Uno o más fenotipos de un sujeto se pueden determinar analizando una o más vesículas, tales como vesículas, en una muestra biológica obtenida del sujeto. Un sujeto o paciente puede incluir, sin limitación, mamíferos tales como animales bovinos, aviares, caninos, equinos, felinos, ovinos, porcinos o primates (incluidos humanos y primates no humanos). Un sujeto también puede incluir un mamífero de importancia por estar en peligro de extinción, tal como un tigre siberiano; o de importancia económica, tal como un animal criado en una granja para el consumo humano, o un animal de importancia social para los humanos, tal como un animal mantenido como mascota o en un zoológico. Los ejemplos de tales animales incluyen, pero no se limitan a, carnívoros tales como gatos y perros; cerdos, incluidos cerdos, cerdos y jabalíes; rumiantes o ungulados tales como vacas, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes, camellos o caballos. También se incluyen aves en peligro de extinción o mantenidas en zoológicos, así como aves y más particularmente aves domesticadas, es decir, aves de corral, tales como pavos y pollos, patos, gansos, pintadas. También se incluyen cerdos y caballos domesticados (incluidos los caballos de carrera). Además, también se incluye cualquier especie animal relacionada con actividades comerciales, tales como aquellos animales relacionados con la agricultura y la acuicultura y otras actividades en las que el control de enfermedades, el diagnóstico y la selección de terapias son prácticas rutinarias en la cría para la productividad económica y/o la seguridad de la cadena alimenticia.
El sujeto puede tener una enfermedad o afección preexistente, tal como cáncer. Alternativamente, el sujeto puede no tener ninguna afección preexistente conocida. El sujeto también puede no responder a un tratamiento existente o pasado, tal como un tratamiento para el cáncer.
Muestras
Una muestra usada y/o evaluada a través de los métodos de la invención incluye cualquier muestra biológica relevante que se pueda usar para la evaluación de biomarcadores, incluyendo, sin limitación, secciones de tejidos tales como biopsia o tejido retirado, durante procedimientos quirúrgicos u otros, fluidos corporales, muestras de autopsia, secciones congeladas tomadas con fines histológicos y cultivos celulares. Tales muestras incluyen sangre y fracciones o productos sanguíneos (por ejemplo, suero, capa leucocítica, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y similares), esputo, efusión maligna, tejido de las células de la mejilla, células cultivadas (por ejemplo, cultivos primarios, explantes y células transformadas), heces, orina, otros fluidos biológicos o corporales (por ejemplo, líquido prostático, líquido gástrico, líquido intestinal, líquido renal, líquido pulmonar, líquido cefalorraquídeo y similares), etc. La muestra puede comprender material biológico que es un bloque fresco congelado e incrustado en parafina fijado en formalina (FFPE), incrustado en parafina fijado en formalina, o está dentro de un conservante de ARN fijador de formalina. Se puede usar más de una muestra de más de un tipo para cada paciente.
La muestra usada en los métodos descritos en este documento puede ser una muestra fijada en formalina incrustada en parafina (FFPE). La muestra FFPE puede ser una o más de tejido fijado, portaobjetos sin teñir, núcleo o coágulo de médula ósea, biopsia con aguja gruesa, fluidos malignos y aspiración con aguja fina (FNA). El tejido fijado puede comprender un tumor que contiene un bloque incrustado en parafina fijado con formalina (FFPE) de una cirugía o biopsia. Los portaobjetos sin teñir pueden comprender portaobjetos sin teñir, cargados y sin hornear de un bloque de parafina. El núcleo o coágulo de médula ósea puede comprender un núcleo descalcificado. Un núcleo y/o un coágulo fijados en formalina pueden incrustarse en parafina. La biopsia con aguja gruesa puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, por ejemplo, 3-4, muestras de biopsia incrustadas en parafina. Se puede usar una biopsia con aguja de calibre 18. El líquido maligno puede comprender un volumen suficiente de líquido pleural/ascítico fresco para producir unas pellas de células de 5x5x2 mm. El líquido puede ser formalina fijada en un bloque de parafina. La biopsia con aguja gruesa puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, por ejemplo, 4-6 aspirados incrustados en parafina.
Una muestra se puede procesar según las técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Una muestra puede ser, sin limitación, células o tejido frescos, congelados o fijados. Una muestra puede comprender tejido fijado en formalina e incrustado en parafina (FFPE), tejido fresco o tejido fresco congelado (FF). Una muestra puede comprender células cultivadas, incluidas líneas celulares primarias o inmortalizadas derivadas de una muestra del sujeto. Una muestra también puede referirse a un extracto de una muestra de un sujeto. Por ejemplo, una muestra puede comprender ADN, ARN o proteína extraída de un tejido o fluido corporal. Muchas técnicas y kits comerciales están disponibles para tales fines. La muestra fresca del individuo puede tratarse con un agente para conservar el ARN antes de su posterior procesamiento, por ejemplo, lisis celular y extracción. Las muestras pueden incluir muestras congeladas recolectadas para otros fines. Las muestras se pueden asociar con información relevante tales como la edad, el sexo y los síntomas clínicos presentes en el sujeto; fuente de la muestra; y métodos de recolección y almacenamiento de la muestra. Una muestra se obtiene por lo general de un sujeto.
Una biopsia comprende el procedimiento de remoción de una muestra de tejido para la evaluación de diagnóstico o pronóstico, y la propia muestra de tejido. Cualquier técnica de biopsia conocida en la técnica se puede aplicar a los métodos de perfilado molecular de la presente invención. La técnica de biopsia aplicada puede depender del tipo de tejido que se va a evaluar (por ejemplo, colon, próstata, riñón, vejiga, ganglio linfático, hígado, médula ósea, glóbulo, pulmón, mama, etc.), del tamaño y tipo del tumor (por ejemplo, sólido o suspendido, sangre o ascitis), entre otros factores. Las técnicas de biopsia representativas incluyen, pero no se limitan a, biopsia por escisión, biopsia por incisión, biopsia con aguja, biopsia quirúrgica y biopsia de médula ósea. Una “biopsia por escisión” se refiere a la remoción de una masa tumoral completa con un pequeño margen de tejido normal que la rodea. Una “biopsia por incisión” se refiere a la remoción de una cuña de tejido que incluye un diámetro transversal del tumor. El perfil molecular puede usar una “biopsia con aguja central” de la masa tumoral, o una “biopsia por aspiración con aguja fina” que generalmente obtiene una suspensión de células dentro de la masa tumoral. Las técnicas de biopsia se analizan, por ejemplo, en Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Capítulo 70, y en toda la parte V.
Las técnicas estándar de biología molecular conocidas en la técnica y no descritas específicamente se siguen generalmente como en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), y como en Ausubel et al., Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989) y como en Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988), y como en Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York y en Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998) y la metodología expuesta en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede llevar a cabo generalmente como en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, California (1990).
La muestra biológica evaluada usando los métodos de la invención puede ser cualquier fluido corporal o biológico útil, incluyendo, sin limitación, sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen (incluido el líquido prostático), líquido de Cowper o líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural y líquido peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción mucosa, agua de las heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, otros líquidos de lavado, células, cultivo celular o un sobrenadante de cultivo celular. Una muestra biológica también puede incluir la cavidad del blastocisto, la sangre del cordón umbilical o la circulación materna, que puede ser de origen fetal o materno. La muestra biológica también puede ser un cultivo celular, una muestra de tejido o una biopsia a partir de la cual se pueden obtener vesículas y otros biomarcadores circulantes. Por ejemplo, se pueden cultivar células de interés y aislarse vesículas del cultivo. En diversas realizaciones, los biomarcadores o, más particularmente, las biofirmas divulgadas en este documento se pueden evaluar directamente a partir de dichas muestras biológicas (por ejemplo, identificación de la presencia o los niveles de biomarcadores de ácido nucleico o polipéptido o fragmentos funcionales de los mismos) usando diversos métodos, tales como la extracción de moléculas de ácido nucleico de sangre, plasma, suero o cualquiera de las muestras biológicas anteriores, uso de matrices de proteínas o anticuerpos para identificar biomarcadores de polipéptidos (o fragmentos funcionales), así como otras técnicas de matriz, secuenciación, PCR y proteómica conocidas en la técnica para la identificación y evaluación de moléculas de ácido nucleico y polipéptido. Además, uno o más componentes presentes en tales muestras se pueden aislar o enriquecerse primero y luego procesarse para evaluar la presencia o los niveles de biomarcadores seleccionados, para evaluar una biofirma dada (por ejemplo, microvesículas aisladas antes del perfil de biomarcadores de proteína y/o ácido nucleico).
La tabla 1 presenta una lista no limitante de enfermedades, afecciones o estados biológicos y las muestras biológicas correspondientes que se pueden usar para el análisis según los métodos de la invención.
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Los métodos de la invención se pueden usar para caracterizar un fenotipo usando una muestra de sangre o un derivado de la sangre. Los derivados de la sangre incluyen plasma y suero. El plasma sanguíneo es el componente líquido de la sangre entera y constituye aproximadamente el 55 % del volumen total de sangre. Se compone principalmente de agua con pequeñas cantidades de minerales, sales, iones, nutrientes y proteínas en solución. En la sangre entera, los glóbulos rojos, los leucocitos y las plaquetas están suspendidos dentro del plasma. El suero sanguíneo se refiere al plasma sanguíneo sin fibrinógeno u otros factores de coagulación (es decir, sangre entera menos tanto las células como los factores de coagulación).
La muestra biológica se puede obtener a través de una tercera parte, tal como una parte que no realiza el análisis de los biomarcadores, ya sea la evaluación directa de una muestra biológica o mediante el perfilado de una o más vesículas obtenidas de la muestra biológica. Por ejemplo, la muestra se puede obtener a través de un clínico, médico u otro administrador de atención médica de un sujeto del que se deriva la muestra. Alternativamente, la muestra biológica se puede obtener por la misma parte que analiza la vesícula. Además, las muestras biológicas se analizan, se archivan (por ejemplo, se congelan) o se almacenan de otro modo en condiciones de conservación.
Adicionalmente, una muestra biológica puede comprender una vesícula o fragmento de membrana celular que se deriva de una célula de origen y está disponible extracelularmente en el fluido biológico o medio extracelular de un sujeto.
Los métodos de la invención pueden incluir evaluar una o más vesículas, incluida la evaluación de poblaciones de vesículas. Una vesícula, como se usa en este documento, es una vesícula de membrana que se desprende de las células. Las vesículas o vesículas de membrana incluyen, sin limitación: microvesículas circulantes (cMV), microvesícula, exosoma, nanovesícula, dexosoma, ampolla, pequeña burbuja, prostasoma, micropartícula, vesícula intraluminal, fragmento de membrana, vesícula endosómica intraluminal, vesícula similar a endosomas, vehículo de exocitosis, vesícula de endosoma, vesícula endosómica, cuerpo apoptótico, cuerpo multivesicular, vesícula secretora, vesícula de fosfolípidos, vesícula liposomal, argosoma, texasoma, secretosoma, tolerosoma, melanosoma, oncosoma o vehículo exocitosado. Adicionalmente, aunque las vesículas se pueden producir mediante diferentes procedimientos celulares, los métodos de la invención no se limitan ni dependen de ningún mecanismo, en la medida en que tales vesículas estén presentes en una muestra biológica y se puedan caracterizar mediante los métodos divulgados en este documento. A menos que se especifique lo contrario, los métodos que hacen uso de una especie de vesícula se pueden aplicar a otros tipos de vesículas. Las vesículas comprenden estructuras esféricas con una bicapa lipídica similar a las membranas celulares que rodea un compartimento interno que puede contener componentes solubles, a veces denominado carga útil. En algunas realizaciones, los métodos de la invención usan exosomas, que son pequeñas vesículas secretadas de aproximadamente 40-100 nm de diámetro. Para una revisión de las vesículas de membrana, incluidos los tipos y caracterizaciones, véase Thery et al., Nat Rev Immunol. 2009 Aug;9(8):581-93. Algunas propiedades de los diferentes tipos de vesículas incluyen las de la tabla 2:
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Las vesículas incluyen partículas unidas a la membrana desprendida, o “micropartículas", que se derivan de la membrana plasmática o de una membrana interna. Las vesículas se pueden liberar en el entorno extracelular de las células. Las células que liberan vesículas incluyen, sin limitación, células que se originan o se derivan del ectodermo, endodermo o mesodermo. Las células pueden haber sufrido variaciones o alteraciones genéticas, ambientales y/o de cualquier otro tipo. Por ejemplo, la célula puede ser células tumorales. Una vesícula puede reflejar cualquier cambio en la célula de origen y, refleja así, cambios en las células de origen, por ejemplo, células que tienen diversas mutaciones genéticas. En un mecanismo, una vesícula se genera intracelularmente cuando un segmento de la membrana celular se invagina espontáneamente y por último se exocita (véase, por ejemplo, Keller et al., Immunol. Lett. 107 (2): 102-8 (2006)). Las vesículas también incluyen estructuras derivadas de células unidas por una membrana de bicapa lipídica que surge tanto de la separación de la evaginación herniada (pequeña burbuja) como y del sellado de porciones de la membrana plasmática o de la exportación de cualquier estructura vesicular unida a la membrana intracelular que contenga diversas proteínas de origen tumoral asociadas a la membrana, incluidas las moléculas unidas a la superficie derivadas de la circulación del huésped que se unen selectivamente a las proteínas derivadas del tumor junto con las moléculas contenidas en el lumen de la vesícula, incluyendo, sin limitación, los microARN derivados del tumor o las proteínas intracelulares. Las ampollas y las pequeñas burbujas se describen con más detalle en Charras et al., Nature Reviews Molecular and Cell Biology, Vol. 9, No. 11, p. 730-736 (2008). Una vesícula desprendida en la circulación o en los fluidos corporales de las células tumorales puede denominarse “vesícula derivada de un tumor circulante". Cuando tal vesícula es un exosoma, puede denominarse exosoma derivado de un tumor circulante (CTE). En algunos casos, una vesícula se puede derivar de una célula de origen específica. La CTE, al igual que con una vesícula específica de célula de origen, por lo general tiene uno o más biomarcadores únicos que permiten aislar de la CTE o la vesícula específica de célula de origen, por ejemplo, de un fluido corporal y, a veces, de una manera específica. Por ejemplo, se usan marcadores específicos de una célula o tejido para identificar la célula de origen. Los ejemplos de tales marcadores específicos de células o tejidos se divulgan en este documento y se puede acceder a ellos en la base de datos de regulación y expresión génica específica de tejido (TiGER), disponible en bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/; Liu et al. (2008) TiGER: una base de datos para la expresión y regulación de genes específicos de tejido. BMC Bioinformatics. 9:271; TissueDistributionDBs, disponible en genome.dkfzheidelberg.de/menu/tissue_db/index.html.
Una vesícula puede tener un diámetro superior a aproximadamente 10 nm, 20 nm o 30 nm. Una vesícula puede tener un diámetro superior a 40 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 1500 nm, 2000 nm o superior a 10,000 nm. Una vesícula puede tener un diámetro de aproximadamente 20-2000 nm, aproximadamente 20-1500 nm, aproximadamente 30-1000 nm, aproximadamente 30-800 nm, aproximadamente 30-200 nm o aproximadamente 30­ 100 nm. En algunas realizaciones, la vesícula tiene un diámetro de menos de 10,000 nm, 2000 nm, 1500 nm, 1000 nm, 800 nm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm o menos de 10 nm. Como se usa en este documento, el término “aproximadamente” en referencia a un valor numérico significa que las variaciones del 10 % por encima o por debajo del valor numérico están dentro del intervalo asignado al valor especificado. En la tabla 2 se muestran los tamaños típicos para diversos tipos de vesículas. Las vesículas se pueden evaluar para medir el diámetro de una única vesícula o cualquier número de vesículas. Por ejemplo, se puede determinar el intervalo de diámetros de una población de vesículas o un diámetro promedio de una población de vesículas. El diámetro de las vesículas se puede evaluar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, tecnologías de formación de imágenes tales como microscopía electrónica. En una realización, se determina el diámetro de una o más vesículas usando detección óptica de partículas. Véase, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos 7,751,053, titulada "Optical Detection and Analysis of Particles" y emitida el 6 de julio de 2010; y la Patente de los Estados Unidos 7,399,600, titulada "Optical Detection and Analysis of Particles" y emitida el 15 de julio de 2010.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención comprenden la evaluación de vesículas directamente, tal como en una muestra biológica, sin aislamiento previo, purificación o concentración de la muestra biológica. Por ejemplo, la cantidad de vesículas en la muestra puede por sí misma proporcionar una biofirma que proporciona una determinación de diagnóstico, pronóstico o teranóstica. Alternativamente, la vesícula en la muestra se puede aislar, capturar, purificar o concentrar de una muestra antes del análisis. Como se indicó, el aislamiento, la captura o la purificación como se usa en este documento comprende el aislamiento parcial, la captura parcial o la purificación parcial aparte de otros componentes de la muestra. El aislamiento de vesículas se puede realizar usando diversas técnicas como se describe en este documento, por ejemplo, cromatografía, filtración, centrifugación, citometría de flujo, captura por afinidad (por ejemplo, a una superficie plana o perla) y/o usando microfluidos. Las figuras 15B-15C presentan una visión general de un método de la invención para evaluar microvesículas usando un grupo de aptámeros.
Las vesículas tales como los exosomas se pueden evaluar para proporcionar una caracterización fenotípica comparando las características de las vesículas con una referencia. En algunas realizaciones, se evalúan los antígenos de superficie en una vesícula. Los antígenos de superficie pueden proporcionar una indicación del origen anatómico y/o celular de las vesículas y otra información fenotípica, por ejemplo, el estado del tumor. Por ejemplo, en el que las vesículas encontradas en una muestra de un paciente, por ejemplo, un fluido corporal tal como sangre, suero o plasma, se evalúan en busca de antígenos de superficie indicativos de origen colorrectal y la presencia de cáncer. Los antígenos de superficie pueden comprender cualquier entidad biológica informativa que se pueda detectar en la superficie de la membrana de la vesícula, incluyendo, sin limitación, proteínas de superficie, lípidos, carbohidratos y otros componentes de la membrana. Por ejemplo, la detección positiva de vesículas derivadas de colon que expresan antígenos tumorales puede indicar que el paciente tiene cáncer colorrectal. Como tal, los métodos de la invención se pueden usar para caracterizar cualquier enfermedad o afección asociada con un origen anatómico o celular, evaluando, por ejemplo, biomarcadores específicos de enfermedad y específicos de células de una o más vesículas obtenidas de un sujeto.
En otra realización, los métodos de la invención comprenden evaluar una o más cargas útiles de vesículas para proporcionar una caracterización fenotípica. La carga útil con una vesícula comprende cualquier entidad biológica informativa que se pueda detectar como encapsulada dentro de la vesícula, incluyendo, sin limitación, proteínas y ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN genómico o cADN, ARNm o fragmentos funcionales de los mismos, así como microARN (miR). Además, los métodos de la invención están dirigidos a detectar antígenos de superficie de vesículas (además o exclusivamente de la carga útil de vesículas) para proporcionar una caracterización fenotípica. Por ejemplo, las vesículas se pueden caracterizar mediante el uso de agentes de unión (por ejemplo, anticuerpos o aptámeros) que son específicos de los antígenos de la superficie de las vesículas, y las vesículas unidas se pueden evaluar adicionalmente para identificar uno o más componentes de la carga útil divulgados en estas. Como se describe en este documento, los niveles de vesículas con antígenos de superficie de interés o con carga útil de interés se pueden comparar con una referencia para caracterizar un fenotipo. Por ejemplo, la sobreexpresión en una muestra de antígenos de superficie relacionados con el cáncer o carga útil de vesículas, por ejemplo, un ARNm o microARN asociado a un tumor, en comparación con una referencia, puede indicar la presencia de cáncer en la muestra. Los biomarcadores evaluados pueden estar presentes o ausentes, aumentados o reducidos en base a la selección de la muestra diana deseada y la comparación de la muestra diana con la muestra de referencia deseada. Los ejemplos no limitantes de muestras diana incluyen: enfermedad; tratada/no tratada; diferentes puntos de tiempo, como en un estudio longitudinal; y ejemplos no limitantes de muestra de referencia: no enfermedad; normal; diferentes puntos de tiempo; y sensibles o resistentes a los tratamientos candidatos.
Biomarcadores
Como se describe en este documento, los métodos de la invención se pueden usar en ensayos para detectar la presencia o el nivel de uno o más biomarcadores de interés. El biomarcador puede ser cualquier biomarcador útil divulgado en este documento o conocido para los expertos en la técnica. En una realización, el biomarcador comprende una proteína o un polipéptido. Como se usa en este documento, “proteína", “polipéptido” y “péptido” se usan indistintamente a menos que se indique lo contrario. El biomarcador puede ser un ácido nucleico, incluidos ADN, ARN y diversas subespecies de cualquiera de los mismos, como se divulga en este documento o se conoce en la técnica. El biomarcador puede comprender un lípido. El biomarcador puede comprender un carbohidrato. El biomarcador también puede ser un complejo, por ejemplo, un complejo que comprende proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y/o carbohidratos. En algunas realizaciones, el biomarcador comprende una microvesícula. En una realización, la invención proporciona un método en el que se usa un grupo de aptámeros para evaluar la presencia y/o el nivel de una población de microvesículas de interés sin conocer el antígeno de microvesículas preciso al que se dirige cada miembro del grupo. Véanse, por ejemplo, las figuras 15B-C. En otros casos, los biomarcadores asociados con microvesículas se evalúan según los métodos de la invención. Véanse, por ejemplo, las figuras 1A-1F; la figura 15A.
Una biofirma que comprende más de un biomarcador puede comprender un tipo de biomarcador o múltiples tipos de biomarcadores. Como ejemplo no limitante, una biofirma puede comprender múltiples proteínas, múltiples ácidos nucleicos, múltiples lípidos, múltiples carbohidratos, múltiples complejos de biomarcadores, múltiples microvesículas o una combinación de cualquiera de estos. Por ejemplo, la biofirma puede comprender una o más microvesículas, una o más proteínas y uno o más microARN, en la que la una o más proteínas y/o uno o más microARN están opcionalmente asociados con la microvesícula como antígeno de superficie y/o carga útil, según corresponda.
En algunas realizaciones, las vesículas se detectan usando antígenos de superficie de vesículas. Un antígeno de superficie de vesícula comúnmente expresado se puede denominar “proteína de mantenimiento” o biomarcador de vesícula general. El biomarcador puede ser CD63, CD9, CD81, CD82, CD37, CD53, Rab-5b, Anexina V o MFG-E8. Las tetraspaninas, una familia de proteínas de membrana con cuatro dominios transmembrana, se pueden usar como biomarcadores de vesículas generales. Las tetraspaninas incluyen CD151, CD53, CD37, CD82, CD81, CD9 y CD63. Se han identificado más de 30 tetraspaninas en mamíferos, incluidas TSPAN1 (TSP-1), TSPAN2 (TSP-2), TSPAN3 (TSP-3), TSPAN4 (TSP-4, NAG-2), TSPAN5 (TSP-5), TSPAN6 (TSP-6), TSPAN7 (CD231, TALLA-1, A15), TSPAN8 (CO-029), TSPAN9 (NET-5), TSPAN10 (Oculospanina), TSPAN11 (similar a CD151), TSPAN12 (NET-2), TSPAN13 (NET-6), TSPAN14, TSPAN15 (NET-7), TSPAN16 (TM4-B), TSPAN17, TSPAN18, TSPAN19, TSPAN20 (UP1b, UPK1B), TSPAN21 (UP1a, UPK1A), TSPAN22 (RDS, PRPH2), TSPAN23 (ROM1), TSPAN24 (CD151), TSPAN25 (CD53), TSPAN26 (CD37), TSPAN27 (CD82), TSPAN28 (CD81), TSPAN29 (CD9), TSPAN30 (CD63), TSPAN31 (SAS), TSPAN32 (t Ss C6), TSPAN33, y TSPAN34. Otros marcadores de vesículas comúnmente observados incluyen los enumerados en la tabla 3. Una o más de estas proteínas pueden ser biomarcadores útiles para caracterizar un fenotipo usando los métodos y composiciones en cuestión.
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Cualquiera de los tipos de biomarcadores descritos en este documento se puede usar y/o evaluar a través de los métodos y composiciones en cuestión. Los biomarcadores de ejemplo incluyen, sin limitación, los de la tabla 4. Los marcadores se pueden detectar como proteína o como ARNm, que puede estar circulando libremente o en un complejo con otras moléculas biológicas. Según corresponda, los marcadores de la tabla 4 también se pueden usar para capturar y/o detectar vesículas para caracterizar fenotipos como se divulga en este documento. En algunos casos, se usan múltiples capturas y/o detectores para mejorar la caracterización. Véanse, por ejemplo, las figuras 1C-1E. Los marcadores se pueden detectar como antígenos de superficie de vesículas y/o carga útil de vesículas. La “clase ilustrativa” indica las indicaciones para las cuales los marcadores son marcadores conocidos. Los expertos apreciarán que los marcadores también se pueden usar en configuraciones alternativas en ciertos casos. Por ejemplo, un marcador que se puede usar para caracterizar un tipo de enfermedad también se puede usar para caracterizar otra enfermedad según corresponda. Considere un ejemplo no limitante de un marcador tumoral que se puede usar como biomarcador para tumores de diversos linajes. Las referencias de biomarcadores en la tabla 4 son las comúnmente usadas en la técnica. Los alias y las descripciones de los genes se pueden encontrar usando una variedad de bases de datos en línea, incluidas GeneCards® (www.genecards.org), HUGO Gene Nomenclatura (www.genenames.org), Entrez Gene (www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene), UniProtKB/Swiss-Prot (www.uniprot.org), UniProtKB/TrEMBL (www.uniprot.org), OMIM (www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM), GeneLoc (genecards.weizmann.ac.il/geneloc/), y Ensembl (www.ensembl.org). En general, los símbolos y nombres de los genes a continuación corresponden a los aprobados por HUGO, y los nombres de las proteínas son los recomendados por UniProtKB/Swiss-Prot. También se proporcionan alternativas comunes. En algunos casos, los biomarcadores se denominan números de referencia de Ensembl, que tienen la forma “ENSG” seguida de un número, por ejemplo, ENSG00000005893 que corresponde a LAMP2. En la tabla 4, únicamente en aras de la brevedad, “E." se usa a veces para representar “En Sg 00000". Por ejemplo, “E.005893 representa “ENSG00000005893". Cuando el nombre de una proteína indica un precursor, también se implica la proteína madura. A lo largo de la solicitud, los símbolos de genes y proteínas se pueden usar indistintamente y el significado se puede derivar del contexto según sea necesario.
Tabla4: Biomarcadores ilustrativos
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HNF1A, HRAS. 11 Jl 11. JAK2. JAK3, K D R (V E G FR J). K IT . KRAS. M ET. M L H 1 M H , N O TC H 1, N P M 1. NRAS, PDGFRA, P1K3CA. PTEN, PTPN 11, R B 1, RET. SM AD4. S M A R fR I 5M O STK1I TPS3, VH L
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Marcadores asacados AR, AREG (airtmegiina), BR AF. BRCA l . cK IT , CMET, EGFR, EGFR w)T79üM, E M L4-al yaa-ner® dd A L K . ER. ERBE33, ERBB4. ERCC’ I. EREG G N A I i GNAQ . liE N T -1.H e rin se rt)d e le m n cáncer 20 de Her2. IGF IR . KÍ67, KRAS. M G M T. meSaaón del MGMT.MSH2. MSI. NRAS. PGP (M O R I). PIK.'C’A. PR. PTEN.RO SL iranstocadón ROS1, R R M L SPAR C .TLE3.TO PO ] . IO P 02A . TS. T L 'B B ', VFQFR2
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al ¡rsiTBíTiflo dd EKBB3. FRBB-I ERCCI. FREO, G K A l L GNAQ . H erí, inserto <fel exón 2Í> de Her2. IGFRl. cáncer K ió7, KRAS, M G M T-M c, MSH2. MSI. NRAS. PGP (M D R -l), P IR IC A . PR. PTEN, Tanstocaocr ROS1, R R M I. SPARC. 1LE3, TO PO ], T O P O ÍA ,TS , TU BtM , VEGFR2 Marcadores asteados AREG BRAF. EGFR E M L4-A LK . ERCCI EREG KRAS MSI NRAS. PIK3CA PTEN. é rala-nonti dd cáncer TS, VEGFR2
fe cota
Marcadores ascoados AR E G ,B R A F, EGFR, E M L4-A LK , ER C C I, EREG, KR AS, M S I NRAS, PIK3CA. PTEN, al m riM tM Jd cáncer T$. VEGFR2
de colon
Marcadores asocados BRAF. cKIT, ERBB.7 ERBB4. ERCCI. G N A I 1 GNAQ. M G M T. mefcraSnda MGMT al raa-nerto dd NRAS PIKTCA. TUBB3, VEGFK2
roeUrarca
Marcadores asacados BRAF. cKIT, ERBB.T ERBB4. ERCCI, G N A I!. GNAQ . M G M T-M c, NRAS PIKTCA, al ría-nenti dd
rndararca T U B B T VEGFR2
Marcadores asacados B R C A c M E T , E M L 4-A L K .E R . h R B B '. ERCCI, l iE M - l HhR2, IG FIR P G ^ M D R l) al ¡raamoerin dd cáncer P IK ÍC A , PR. PTEN. R R M l , T m . TOPO 1, TOPOLA. TS
de ovario
Marcadores asociados BR C A 1, cM ET, LM L 4-A L K iiaralocadón). ER. ER B B J,E R C C I, IIER2, P IK3CA. PR at ría-n-enti dd cáncer PTEN. R R M I. T LE 3.TS
de ovara
Marcadores amoados BRAF. B R C A I. EiGF R, E G FR T7 * j\T, EM 1.4-ALIK. ER. ERBB3. E R C C I.H E R I, KJ67. a raearcBefflo dd cánee* PGP (M O R I), PIK3CA. PR, PTEN, RQSl, ran s txew n RQS1, R R M I TOEV TOPO 1. de ¡ñama IO P Ü 2A .TS
Marcadores asocados BRAF. BRCA i. EGFR u.TTW lM . E M L4-A LK . ER. ERBBT ERCCI. H ER Í. K i6T KRAS. al ¡na-n-erti dd cárter PIK3CA, PR. PTEN, íansJücaóófi ROS1, R R M I. T L E L TO PO I. TO PÜ 2A.TS de marca
Marcadores asacaros a. BR AF. BRCA 1. cM ET. EG FR. HG KR u /T 7W M . KM L 4 -A I.K KR C C 1. ir .^ ro del exón 23 de ígearcoemnid cáncer se Her2, KRAS. MSH2, PÍK3CA. PTEN, ROS1 (lmiH>. RRM 1. TLE3, TS. VEGFR2 NSCLC
Marcadores asocadosi B R A F,cM E T. EGFR, EGFR w/TTPOM. L M U -A L K . ERCC I,insenodelexw 20 Oe Her2, raaTier» dd cáncer de KRAS. M $II2 , PIK3CA, PTEN, nanslocación ROS1, R R M I, TLE .l, TS
NSClC
A K T t A LK . APC. A TM BRAF. C D H I. C D KN 2A í> K ilT C-McL CSFIR. C TN N B I Mitedoen cárteres EGFR ERBB2. ERBB4, FBXW 7. FGFRI FGFR2 FGFRT FLT3. G N A I 1. GNAQ. GNAS,
H N FI A .H R A S IDH1. JAK2. J A K L K D R . KRAS. M LH 1. M FL. N O TC H I. NPM 1. NRAS. P IX IF R A .P IK IC A , PTEN, PTF'NI 1, RBL, KHT 5M A D 4. SM AR Í B l. SMO. SRC. S í K M , TPÍ3, VH L
Mvudoen cánceres A LK , BRAF. BRC A I, URCA2, EGI R, ER R BÍ, G N A I 1. GNAQ, IDH1, IDH2. K IT . KRAS,
MET. NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET, SRC.TP,13
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E .O M » . E.090565, E 090612. E .090615. E.090674, E .090861. E 090889. E.Ü91140.
E.091483, E 091542, E.091732. E.«92020, E 092199. E 092421. E.092621. E 092820, E.092871, E.0K2978, E .0930 LO. E.094753, E.095139, E.095380. E 095483. E.095627, E 096060. E 096384, E .099331. E.099715. E 099783, E 099785. E.099800.15099821. E.099899, E.099917, E,O9995ó,E.lO0O23,E.lOOO56, E.100065, E.100084, E.1001+2, E.100I9I.E .100216,E,100242,E. 100271,EJ 00284.E.100299, E .100311.E, 100348.
E.100359, E .1W1393, E 100399, E.100401, E .L<XM12. E.11J0442, E 100375, E J (>0677. E. 100583. E.100601. E 100603. E.100612 E.100632, E.100714. EJ00739. E 1007%, H 100802, K 100815. E.100823.E.100836. E 100883, H 101057. E.101126. E 101152, h 101222. E 101246, E.101265, E.101.365. E LO 1439. K 101557, E.J01639. E J0J654.
E 101811. E 101812, E 101901,E 102030, E 102054. E.IÜ2J03, E.102158. E.102J74.
E .I«224l. E.102290, E 102316,E.102362, E.102384 E.102710, EJ«278Ü. E 102904.
E. 103035, E.103067, E.103175, E.103194, E l «34+9, E.ll 13439. E 103591, E 103599, E.103855, E.103978, E.104064. E.1 E.10+131, E 104164, E.UUI77. E. l«4228.
E. 104331. E.l 04365. E 104419. E.1(4442. E 104611. E.104626. E J 04723. EJ 04760, E.104805, E.104812, E.104823. E .l 04824, E.105127, E.105220, E.105221. E.105281, h 105379. K 1Ü5402, H.11)5404. E .l05409. h 105419. K ]i)M28, K. 105486. H 105514. E 105518. E 105618, E 105705, E.105723, E 105939. E.105948, E. 106(149. E.106078, E.106128, E.106153, E 106346. E.106392. E.106554. E . l06565. E.106603. E 106633, E.107104, E 11)7164. E.l 1)7404. E.l 07485. L.107551. E.l D75SI. E.107623. E 107798, H 107816, H 107835. E.107890,E.107897, K l«7%8. E 108296, E.108312. E 108375, E . l08387. E ] 1)8405, E.108417 ,E.108465, E 108561. E.108582, E.108639, E.1086+) . E. 108848, E.108883. E .l08955. E.109062. E.109184, E.109572, E J09625. E 109758, E.J09790. E.1098J4, E 109846, E l 09956, E.l 10065. E.l 10066, E.110J04. EJ IOIG7, E.11032 |. E.l 10.328, E.l 10921,E 110955, E.l 11057. E.l 11218, E.l 11261. E.l 11335, E.l 11540. E . IJ1605, E.l 11647. EJ 11785, E J 11790.E.l 11801, E.111907.EJ 12039. E.l 12081. E.l 12096, E l 12110, E l 12144, E.l 12232. E.l 12234. E.l 1247.1. E.U257X.
E.l 12584. E.l 12715. E.l 12941. E .l 13013. E.l 13163, E .l 13282. E.l 13368. E.l 13441. E.l 13448, E 113522. E 113580, E 113645,E l 13719, E.l 13739, E 113790. E.l 14054, E.l 14127. EJ 14302, E.l 1435 J, E.l 14588, E.114491. E.l 14861. E.114867. EJ 15053, E.l 15221. EJ 15234, EJ 15259. E.l 15241. EJ 15257, E.l 15359. EJ 15540, EJ 15541. E.l 15561, EJ 15604, E.115648. E.l 15738. EJ 15758. E. 116044. EJ 16096. EJ 16127.
E.l 16254. EJ 16288, E.l 16455. E.l I647&. EJ 16604,E .l 16649, E.l 16726.E.l 16754, E 116831. E 117298, E .l 17308. E.l 17335. E I 17362. E 11741 I. E.l 1742.5. H I 17448, E .l 17480. E .l 17592, E .l 17593, E.117614, E.117676, E .l 17713, E.117748, E.117751, E I I 7877. R I 18181, E.l 18197, E.l 18260, E I 18292. R I 18513. E.l 18525. R 118640. EJ 18898. EJ 19121, E 119138, E.l 19518, EJ 19321. E .l 19335. EJ 19383. EJ 19421, E J 19636, EJ 19681, EJ 19711, E 119820, EJ 19888, E.l 19906, E.120159. EJ20328.
E. 12< 1537. E.12< 1.37|j. C.120656. E.12u733. E.120837, E .120868. E.120915. E. 12'>948. E . l2 Ki22. E.121057, E .l21068. E.121104. EJ21390, E.121671, E.121690. EJ21749.
E 121774. E 121879, E.I2IB92, E.121903, E.l 2194(1. E.l 21957, E.122025. E 122033, EJ22126. E.122507, E.l 22566. E.122705. EJ22753. E.l 22870. EJ22884. EJ22952, E J 23066. E J 25080. E l 23143, E .l23154. E 123178, E .l23416, E J 23427. E J 23595. EJ 23901, EJ 23908, E.123983. E.l 23992. EJ 24143. E.l 24164, EJ24181, EJ24193, EJ24216, E J 24232, E.124529. E.124562, E J 24570, E .124693. EJ24749. EJ24“ fi” . E.124788, E J 24795, E,124831, E J 24942, E .l 25246, E J 25257, E.125304, E, 125352, t J 25775. E J 25445. E .l25492. E .l25676. t . l25 ~ 5 i.E . l25798. E J 25844. E. 125868. H 125901. E 125944, E 125995,E. 126062. K 126207. E I 26653, E.126773. E 126777. E 126814. K 126858, E.126883,E.126934, E I 26945. K 126952, EJ 27022. Ei 127128. E 127329. E 127399, EJ274J5. E.l 27554. E 127616. E.l 27720. E.127H24. E. 127884.
EJ 27914. E J 27946, E J 27948, E i 28050, EJ 28311. E J 28342, E l 28609. E.128626, E J 28683. E J 287118. E .l28331. E.129315, E 129351, E .l29355. E 129514 E J 29636. E.129657, E.129757, E, 129810, E J 29990, E.130175i, E, 130177, E.130193, E.130255, h 130299. K 130305, E 130338, RJ.10.140. h 110402. K 13«4L3, E.110612, H IK ) 7 i iL E I307Ú4, E. 130770, E.130810. E 130826. E 130935, E.l 31351, E.131-I4>7. E l i 1473. E. 131771. EJ 51773, E J 32002, E.132275, EJ 32323. E.l.12382, E.l 32475. E. 132481. E J 32589. E l 32646, E l 32716, E.132831. E l 33313, E . l33315, E . l33687, E l 33835, EJ 33863, E J 33874, E 133961. EJ 341)77. EJ 34138, E J 34207. E.l 34248. E.l 34308. E . l34444, E l 34452, E J 34548, E.134684, EJ 3+759, E . l34809, E.134851, E 134955, E.135052, E . l35297, E . l35298,E . l35387,E J 35390, E.135476, E.133486. E.135525,
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E.169710 (FASN), 113tJ4 (P I E1P] j. E .057252 (SOAT1), H 059378 (PARP 12}. H 082258 (CCNT2). E.087301 (TXNDC16). E.100575 (TIMM9), E.101152 (DNAJC5). E.101812 (H3BFM), E.102384 (CENP1), E 108641 (B9l>l). E 11^158 (KLF9), E .l 19820 (Y1PF4), E.l 25005 (ROMOl). E.132523 (ILKAP), E.l 348(19 (TIMMlO). E 134955 (SLC37A2). E.135476 (ESPL I), E. J36527 (TRA2B). E.137776 |$LTM ), E. J39211 (AM IG02), E.159428 fM MAB). E .L39S74 (SSTRl), E .l45321 (HDGF). E .l64244 (PRRCl), E 164270 (HTR4>, E.165119 (HNRNPK). E 165637 (VDAC2). E 165661 (QSOX2), E 167258 (C D K l2 i. E 167815 (PRDX2), E.168014 (C2CD3), E.L68653 (ND1JFS5). E.168769 (TET2). E 169242 (EFNAl), E 175334 (BAÑEJ); E . l75416 (CLTB), E. I 77156 (TA LD O lj. E.180035 (ZNF48), E.186591 (UBE2H). E.187097 (ENTPD5). E.188739 (RBM34), E . l96497 (IP04), E.197323 (TRIM33), E 197857 (ZNF44), E.197976 (AKAP17A), E .064201 (TSPAN32). E.088992 (TESC).h 092421 (SEMA6A). E 100601. (ALKBH1XE.101557 «JSP14), K 103035 (PSMD7). E.106128 (GHRKR). E.l 15541 (HSPEJ), E.121390(PSPCJ). E.J24216 (SNAIJ), E.130713 (EXG5C2), E.132002 (DNAJBJ), E.139697 (SBNOJ). E.140481 (CCDC35V E .143013 (LM 04), E.145020 (AMT). E.l 45990 (GFOD1). E 146070 (PLA2GT|f E.164924 (YW HAZ), E 165807 (PPPIR36), E 167751 (KLK2). E 169213 (RABIO). E.170906 (NDUFA3), E.172725 (COROIB ). E . l74332 (GL1S1),E.181924 (CHCHD8). E 183128 (CALHM3), E.204560 (DHX16), E.204574 (A B C FI). E 146701 (MDH2). E 198366 (H1ST1H3A), E.0B1181 l AR.G2). E 185896 (LAMP1). E 077514 (POLD3) E.099800 (TIMM13K E, 100299 (ARSA), E, 105419 (ME1S3), E, 108417 (KRT37), E,113739 (STC2). E, I 25868 (DSTN), H, 145908 (ZNF300), E 168575 (SLC20A2). K. 182271 (TM(GDL). E . l97223 (C ID), E.186834 (HEXIM I). E.(JO 1561 (ENPP4), E0U451 (W1Z), E.053108 (FSTL41. E.064655 (EYA2), E.065308 (TRAM2). E.075I31 (TIP1N), E 081087 (OSTMI), E 092020 (PPP2R3C). E 096384 (HSP90AB1), E .l00348 (TXN2). E.100577 (GSTZ1). E lOOaD2(Cl4o1V3), E l 01365 [1DH3B). E 101654 (RNMT). E. L03067 (E&RP2), E.104064 (GABPB1). E 104823 (ECH1). E.106565 (TMEM176B). E 108561 (CIQBPl E I 15257 (PCSK4),E 116127(ALMS1KE i 17411 (B40ALT2),E .l 19335(SET).E . l20337 (TNFSFJW). E 122033 (MTIF3). E 122507 (BBS9), E.122H70 (BICCI) E . l3(1177 (ODCIO). E 130193 (CB o £55; THEM6). E . l30413 (51X33), E 130770 (ATP1FJ). E .l33687 (TK1TCJ), E .136874 (STX17), E . l37409 (MTCH1), H.139626 (1TGB7), E.141744 (PNMT), E 145888 (G LR A l). E.146067 (FAM193B), E.146433 (TM E M lS l). E.149480 (MTA2). E.152377 ÍSPOCKI), E .l52763 (WDR78). E.156076 (EIF4A2), E . l57827 (FMNL2), E.158485 (CD1B). E L58863 (FAM160B2), E 161202 (DVL3); E.161714 (PLCD3). E.163064 (EN I ). E.l 63468 (CCT31. E.164309 (CMYA51. E 164916 (EOXKI). E.165215 (CLDN3). E 167658 (EEF2). H.17054*) (1RX1). H 171680 CÉLEKHG5), K 178234 (C A L N T ll) . E.179869 (ABCA13X E .L79912 (R3HDM2), E . l80869 (C l o f 180), E.180979(LRRC57). E.1S2S72 (RBMlO). E.183207 (RUVBL2). E 184113 (CLDN5), E.185972 (CC1N). E.189144 (ZNF573), E.197353 (LYPD2), E.197770 (ZK F8I). E . l08807 (PAX0), E.100442 (FKBP3), E .111790 (FGFR1OP2). E 13604+ (APPL2), E 06L794 (MRPS35). E.065427 (K ARS). E.068885 (1FTK0), E 104164 (PLDN;BLOCIS6) E .l05127 (AKAP8), E 123066 ÍMED13L), E.124S3J (LRRF1P1), E . l25304 (TM0SF2), E.126934 (MAP2K21. E.130305 (NSUN5). E 135298 (BAI3), E 135900 (MRPL44), E . l36371 (XÍTHFS), E. 136574 (GATA4). E l 40326 (CDANIF E 141378 (PTRB2). E .l41543 (E1F4A3). E.150%1 (SHC24DK E 155368 (DBB. E.161649 (CD300LG), E 161692 (DBF4B), E.162437 (RAVER2), E.163257 (DCAF16), E.163576 (EFHB). E 163781 (TOPBPl), E.163013 ÍIFTJ22). E.164597 (COG5), E .l65359 (DDX26B), E .i 65646tSLC 18A2). E.169592 (INO80E). E 169957 (ZNF768), E 171492 (LRRCSD), E.17179.3 (CTPS; CTPSl), E .l71953 (ATPAF2), E.I75IS2 (FAM131AX E.l 77554 (C10orf71) E.181610 (MRPS25). E.l 81873 (IBA57), E.IS7792íZNF7(h). E .l87823 (ZCCHC16),E.196872 (C2of55: K1AA1211L), E 198168 (SVIP), E 160633 (SAFB).E 177697 (CD 151), E 181072 (CHRM2), E 012779 (ALOX5). E.065G54 (SLC9A3R2), E 074071 (MRPS34). K.IDOS 15 (TRIPl I). K 102030 (NAA10), E 106153 (CHCHD2), E 126814 (TRMT5), E.120952 (NXF5), E.156450 (SRSFl). E. 136710 (CCDC115), E.l 37124 (ALDH1B1). E.145353 (LYPLAL1). E.162490 (C l o f ] 87; DRAXIN), E.167799 (NUDT8), E .171490 (RSL1D l )s E.173826 (K C N E16). E, 173808 (SPTBN2), E, 176900 (OR 51T 1X E, 181513 (ACBD4). E.185554 (NXF2).
E 185945 (NXF2B). E 108848 (LIJC7L3). E.020363 (BCLAFl). E.038002 (AGA), E.108312 (UBTF). E.L6634L (DCHSll. E.l 154118(THRAP3). E 135670 (MDM2V E.166860 (ZBTB39), E .l83684 (THOC4; ALYREFY E.ÍI04S3S (ZMYND10). E .007264 (MATK). E .020922 (M R EU A), £.041353 (RAB27B). H 052795 <FNF2), E.075711 (DLG1).
E.087Q87 (5RRT), E.O9Q060 (PAPOLA). E.095139 (ARCN1), E.099715 (PCDHl 1Y).
Figure imgf000066_0001
E.14269» (C l o f94K E 143390 (RFX5). E.148438 (STSSlAfiX E 148737 (TÍ.T7L2).
E.151491 (EPS&X E 152422 (XRCC4), E.134832 (CXXC1X E 158321 (AUTS2), E 159147 (DONSON). E.160285 (LSS), E 16ÜS62 (AZGPI), E.l 60943 (VPS28). E 160972 (PPPIR16AX E.165914 (CPSF2), E, 167604 [N FKB lI», E, 167766 (ZNFS3). E 168803 <ADAL), E.169612 (FAM101A1), E.171262 (FAM98B), E.17289.1 (DHCR7). E.171889 (PHC3), E . l76971 (F1BIN), E. L7754H (RABEP2). E. 179119 (SPTY2DI), E.184378 (ACTRT?), E.184508 (ElDDC3X E 185043 (O B I) H.186814 (ZSCAN30),E l 86868 (MAPT). E.196812 (ZSCAN16X E.198563 (DDX39B). E.124529 (HIST1H4B), E.141002 {TCF25), E 174100 (MRPL45). E I09S14 (UGDB). E.118756 (BMP2K), E,065457 (ADATJX E.105948 (TTC26>. E.109184 (DC U N IIM ), E.125257 (ABCC4), E.126062 (TMEM115X E .142515 (KLK3), E.144381 (HSPDl). E.166710 (B2M), E.198324 (CHAM PI). E.078902 (TOLLIP). E.099311 (M Y09B), E.102710 (FAM48A), E.11)7485 (GATA3X E 120948 (TARDBP). E.1.87764 (SEMA4D t. E.101855 (0X276). E.117751 (PPP1R8X E.171714 (WFIKKN2), E.172115 (CYCS). E.005882 (PDK2), E .007952 (NO XI), E 008118 (CAMK1GK E.012061 [ERCCJ). E.015171 (Z M Y N D il), E 036257 (CULI), E 057608 (GD12); E 058729 (RIOK 2). E 071246 (VASH I ), E 073050 (XRCC1); E 073150 (LLGL21. E.079246 (XRCCí), E 085733 (CJTN), E.Q91542 (ALKBH5). E.091732 (ZC1HC1), K 092621 (PHGDI I), E ,099899 (TRMT2A), E,099917 (M E D I5 \ E, 101439
(CST3), E 101479 (RBL2). E.104611 (SH2D4A) E.105281 (Í4LCJA51. E.106192
(C lG A LT I), E 107104 (KANK1), E.107798 (UPA). E.108296 (CWC25), E.109572 (CLCN3), E l 12110 (MRPL18), E l 13790 (EHHADH). E. 115648 (MLPH). E 117308 (GALK), E 117715 (CU46). E.118513 (MYB), H 118640 (VAMP8), K 119721 [FKBP15), E.122705 (CLTAK E l 21983 (ACSL1), E.124212 (RBPJL).E.125901 (MRPS26X E.127199 (LRRC6I), E.127554 (CFER). E.128708 (HAT IX E. 129355 (CDKN2D). E 130340 ÍSNX9), E, 110915 (NO LI l) L F, 111771 (PPPIRIB), F.151861 (TEXI5), F. 1U2<)7 (SVT6), E.136915 (CiOLGAJ), E.141425 (RPRDIA), E.141374 (TARS2), E 145771 (CS'1H4). E.146966 (DENND2A). E.148672 (GLUDI). E 150593 (PDCD4). E.151916(HE2STI), E 154099 (D N A AF l), E 156006 (N A T I), E 136282 (CLDN17). E.158545 (ZC3H1S), E 158604 (TMED4). E.158813 (EDA). E 159184 (JiOXB 11), ti 161267 (BDI11X E 163492 (CCDCI4J). E.163629 (PTPN11X E 164163 (ABCEl). E.164520 (RAETIE). E 165133 (ANKS6). E.165921 (AGBL2). E.166484 (MAPK7). E.166747 (APIG1) E.166971 (AKT1P). E.167744 (NTF4). E.168071 (CCDC88BX E.169087 (HSPBAP1X E.170396 (ZNF804AX E, 170445 (.1LARS), E 170632 (ARMC10). E.170741 (SYT9), E, 171428 (N A T I), E.172346 (CSDC2), E.171805 (H APlX E.175175 (PPM1EX E.175201 (DCTN2), E. 177542 (SLC25A22X E.177679 (SRRM1), E.178828 (RNF186X E 182013 (PNMAL1), E.182054 (1DH2). E.182890 (GLUD2), E.184156 (KCNQ3), E.134697 (CLDN6), E 184715 (DDX55). E .l84841MTMED9X E 185219 <ZNF445); E.18619S (SLC51BX E.186205 (M ÜSCI;M ARC1X E 189143 (CLDN4X E 19670(1 (ZNF5I2BX E .l96743 (GM2A), K, 198087 (CD2AF). E, 198951 (HAGA), E.2G4406(MBDS), E.O02310 (BAD), E.105404 (RABACl), E .l 14127 (XR N I). E.117711 (AR ID IAX E . l21141 (PKMI), E, 110764 (LRRC47). E.131771 (KHDRBS1). E 137806 (NDUFAF1). E .l42864 (SERBP1X E 158747 (NOLI). E 175063 (UBE2Q, E.l 78104 (PDE4DÍP). E.186472 (PELO). E 069956 (MAPK6). E .l 1294] (PAPI>7)l E 116604 (MEF2DX E 142875 [PRKACB). K 147111 (TAF1X E.157510(AFAP lL I X E 006625 (GGCTX E .l55980 (K4F5A), E.174444 [X IA A 1468). Er 107968 (MAP3K8), E.117592 (PRDX6), E .l21154 (WDR81), E.115297 ( M IO !).
E 115829 (DHX9>. E.149543 (CCDCI5X E.152086 (TUBA3EX E 167553 (TUBA1C), E.169826(C&GALNACT2), E.l 7112 I (KCNMB3). E.198033 (TUBA3C), E.147724 (FAM135B). E .l71)854 (M IN A ),E 006695 (COXIO), E.067369 (TP53BPI). E.089248 (ERP29X E. í 12096 (SOD2), E.138073 (PREB). E 146856 (AGBL3X E.159423 (ALDH4A1X E. 171.145 (KRT19X E 172145 íST ARDI). E.l 11047 (U H R FIB P IL). E.l 17877 (CD3EAP), E.155714 (PDZD9X E.156603 (M E D I 9). E.075886 (TUBA1D). E. 167699 (GLOD4X E. 121749 (TBCJD15), E.090861 (AARS), E 091010 (COMT). E.l 17676 [RPSóKAJX E.157502 (M U M IL l) , E.159921 (CNE) E 169562 (GJBIX E . l79776 (CDH5X E.07I626 (DAZAPI). E.085224 (ATRX), E U6478 (HD ACl), E, 117293 (ECEl), E . l7617] (BNIP1). E. 177425 iPAWR), E .l7914» (GATA2). Er 187840 (EIF4EBPI), E.0.1103» (ZCCHCK). E 049239 (H6PD ) E.060688 (SNRNP4U), E.075239 (ACATJ). E 095627 (TDRDJX E 109625 (CPZ),E 113719 (ERG1CI), E .l26771 ( C U o f l l . v PCNXL4). E.149218 (ENDOD1), E.162975 (KCNF1). E. 183785 (TUBAS), E.198589 (LRBAj. E.105379 (ETFB). E .011052 (NME2XE 011143 (M K S l), E.048544 fMRPSlO) E062485 (CS). E 114054
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(FCCBX E.113587 (M N SlX E.l 55959 (VBPJX E.181222 (POLR2AX E .l31721(C M [M 4)L
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CDKn.CD86. CDH I, CDH5.CEA, CFL2, CHCHD3, CHMP3. CHRDL2,O B 1. CKAP4. COPA, COXÍB. CRABP2. CRLPI. CRlSPLDl, CRMP-2.CRTAP, C IL M , CUL3. CXCR3. CXCR4, CXCR6, CYBJB, CYB5R1, CYCS,CYFF A 21, DBI, DDX2J. DDXWB.dcriin 1, DIICR7. U liv e DLL). DLL4, DNAJÜL, DPIV>, DSTN. etadtwrin* EEFTD, EEI'2. EFTUDÍ, EIF4A2. EIF4AL Lpt’aM. FpliAL ER( 1 > E5R1 . ER12) ESR2 . Erb B4, Eít)2. Cfl) - (! ■ * -BVn, ERLIN2, ESD. FARSA. FASN. FFM FKBPS. FLNB. FOXPV FUS, Gal3. GCDPF-15 ü t N L GN A l2 GNG5 GNPTG. GPt (> DPI): GEMIR (GPECid| LiSPTl I13F3B
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MlSTlH.'D, H ÍSTlHIE, HISTIH3F, HISTIH3G, HISTIH3H, HISTlH.1l, H ISTIH ’ J, H.IST2H2BF, HIST2H3A. HIST2H3C. HIST2H1D, HIST3H3. HMGLH. HNRNPA2BI. HNRNPAB, HNRNFC. HNRNPD, HNRNPH2. HNRNPk, HNRKPL. HNRNPM.
IINRNPU. IIPS3. HSP-27,HSP70,HSP90Blt HSPAJA. HS?A2,HSPA9,HSPEI. K3b. IDE, IDH.1B. IIX )I. IFIVI, ILIRL2. IL7. IL8.1LF2.tLR. IQCG, ISOC2,1STI. ITGA7. ITGU7. unión pLako-glebina. queratina B, KRAS. KRTI‘7. kRT2. KRT7. KRTR* KRT».
KTNI.LAM PL LMNA. LMMBl. LNPEP. LRPPRC. LRRCÍ7. Mamaglotnm M AM A l. MANIA2. MARTI. MATR3. M13D5. MCT2. MDH2. MFGES. M!rGEK. MGP. MMPV. MRPX. MUCL MUCI7, MUC2. MY05B. MYOF. NAPA, NCAM. NCL, NG2 (CSPG4>, N pl. NHE-3. NUE2. NONO. NPM]. NQOl. NT5E (CD71e. QDCL OPG. OPN iSCl.OSV. p53, PACSJN3, PAICS, PARK7. PARVA, PC, PCNA. PCSA, PD 1. PO LL PD-L2.
PCP9.S. PHB. PHB2. Plk1C2B, PkP3, PPL, PR<B|?, PRDX2, PRKCB, PRkCD. PRKDC. PSA. PSAP. PSMA. PSMB7. PSMD2. PSMET PYCARD. RABI A RAB^D, RAB7A.
RAGE, RBL2, RNPEP, RFL14, KPL27, RPLJó. RPS2S, KPS4X, RPS4Y1, KPS4Y2.
RUVBL2, SET, SHMT2. SLA1N1. SLC39A L4. SLC9A3R2, SMARCA4, SNRPD2.
S N I I P D S S \ - SNV>. SPEN. SPR, SOSTMI.SSÜPI.STIGALI, STNBP4, SUBI, SUCLG2, Survivina. SY IV, TFF1 (secfílala). IGOLN2, THBSI. TLMP1, TIMP2, TMEDI», TMFD4, TMFDV, TMFM2I l.TOM 1. TRAF4 I andíniaje L TRAII -R2, TR API, TriB. Ts.g IOLTXNDC16, U2AF2. UEVLD. UFC], UNCVIi USPI4. VASP. VCP. VDACl. VEGFA.
VLGI R!, VLGKR2, VPS37C, W12. XRCC5. XR( ÍV;, YB-!. YWHA'Í
tin a r dí pulmón P^nnc l (en mponente 1 de La membr ama del reteptd r de prdqeslerd na) ,-Te c e ptd i s i p ni a-2, STE-: \P. EZ H 2 cáncer He pulmón prchititna. CD23. peptido de amilina, WRP, R jid íl. Pax-S. Oct-V, GLU F-LPSCA,
IrnmlMSpondiiia. I’HIT. a-E-Cristalina. LcnxisA. Crecimiento endoteliadvascular
FaclortVEGFi, Homcligedel factor de hepalocitn-í, Fli-4, GluRfP?, Apoptosis de próstala Re$pu«la Pndtíina-4, GluR], Fli*i. Ucocoiltn. SRXIA4. ]4-3*í beta. PWJS. HOACl í'G !^ >. f>J-1. COX2, MMP-IV. Acbna, múscuto esquelético, Claudmaí, Cadherina-P, Colágena IX. p27KÍpl, Cfltepsma 0. CD3U (minCidor celular Reeí-Sternberg), ubi quilina, FSll-b, TrxR2.
CCk-M, CiclimaC, CDI38. TGF-bcin 2, Hormona adrenocertientrépita. PPAR-gaitiitH. R d ' 0. GLUT-3, IGF-I, mRAMKL, fas-lijando, Filanina, Calretinina, Ocl-I. Hormona iHcatireidía, Claudina 5. Clauíina 4, Raí-] (fasfeespecíllco). COCHA Fsstatasa.Hitflconilria.APC.
Dastriwl K*i{p4Mi).GaiL\PA. Prnteína de unión a maltasa, MdanmafcpLOO). Foetotirasina. amlcida A, CXCR4/F iishi. Factoi nuclear hepático-30, Caspasaf, HPV
Uj-L7.Coras de oree ¡mienta aconaLLcli, Dmilina tte£CártH)cilas.a. gamma glulamilcisleína SintetasatGCSVQiiítámata Osieina ügasa. ERCC1, CaianoduiinA caspas* 7 (M d i ii,
CEH37 t-klBBX flíido nítrico sintasa, cerebriubMW), L2I--2, IL-JDR, L-PtasUo, CDI8, Fimentina, CDÍO/1CAM-3. Soperósido dismulasa. adenqvirus tipa 5 E)A. PHAS-I Receptor de prflgesteroiva(fdífflejpecí1itJj Satina 2'W. MH(‘ 11 (HLA-DQl, XPG. F.R C'ln-2 ATPasaZ, Laranna-s. El-Rfoteínade unian <ARMl>, CD45RO,CDl.C*2, MMP-IO IEstromeiltsina-2). sin, Prnteína Surfaclante B iPro), Apoltpoproteina 0.CD46. Giueratina S i|Ser73 (bitaespecífica), PCNA. PLAP. CD20, SU. LH. Queratina 1?, AUP-ribosilacidri Fncior(ARF-fi), luí-2 Dneopcstem*. Lucifer&sa.AIF(Factor inductor de tpoptusis), GrtO. bel-X. CDI6, PaviUiii. MHCII (HLA-OP y DR|. Célula H.pílW AFl.MHC II <HLA-DRX lirnsmasa, F2F-I. Pdst, CátponiriA Muesc*. CD2fi/DPP IV, SV4IE AntígenoTgrande, ku (pTO/pSO), Pertorina. 7ÍFF. SIM Ag (SIMA-4D3X Cdkl/p34cdc2, tnolasaEspecifita de neurona, bí-HicJíslobulin* DNA PolimerasaBele. Receptor (te hormona tiroidea, humano, toífalsss alcalina t AFe. Harcalof de c éiuas plasmáti c as. P rnteina de choque térmico 71 >/hsp7i e, 1 'RP75 / gp75. SK1' ¡Fotlor de HesniestaséricaL Unnmr.a BL'bl.Quiriasa de mastodtos, Caldesmon. CEA / CDüCc.
CD24. Receptor de Relmsides 1 {hRXR). nM.VTÍiHi.LCA.vinis de laiatna.ülocmmo c,D(U. bckXL. Fascin. C ÍJ7I¡ Receptor de transferrina
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cáncer de pulrm miR*4Vf
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WE5C. C0CJ4. cocjj. co*7. ddw. c * l c * V p M td a m . n w . c* a , c* 5, pan. das . cq *n . h?wío, CDw7S.CH*íT6. CE> jtO tt í , c-ertfl-tylEft-i/neu A 6 - I |í ltt , c-eibO-AjUEH-A. t-ías. OA/L gouúdtrepiita ccnóntca tela(fiCG-bctaj. ciemegraniu A, CÍE-A.DDE-3 Q-EDI, c-1u- Cíati'ina. CLaudina 71.CLaudina 2. CLaudina 3.Cíaudina ¿.ClBudina 5.CLaudins7.CLaudina 1.ChlPBsa.CalBgEnD II.CalsgEnoIV.Colsgena IX.CaLágena VI. Cín;>:ins ¿3, COtí, WFB, Proteínj de m tn a CHEH &irpt*wccus meoformans, c-Scr, Cuüin-I P M , M t in - 2 P l- ¡ ) r Cu<Üi»-3 (CUL-3). CKCRi/Fuiina. Ciclina El, Ciclina C, Ciclina DI. Cialina D3. CicLina E, Cic lia a E2. R e la to r transmemliraiH de fiircsis quiítma.ülOCrOmnC. Di-DDLÜiu,OcR). J)cR2 y fltAL-R t / THUNDD.DEsmina. DFFAO IF&Cl&r Oí fragmentación de AON AOWEAD. Q FFí S / ICAD, DI - UDH Ligase L ADH peli mer asa teta, AQ N pdümefasa gamma AON prunasa (pAí). AON prunasa (jjSffj. AON-PKts.GP 2.0B3. ORS. di slerimt di Jirofina. E2T-L E2F-2. E2F*\ EF-*.E2F-S,pfoteínade im ¡jna í3 [AHM|.EGFR.EMA/CAE-3,VUC-I Endostafin* « 'seno de membrana spi Wiat (EMAjCA15-3JMU(M. antí geno epitelial específico. ER bek FH 02 AlPastf. ERCk Erkl ERKZ estradicl. estrul. receptar íe estrógenc. Eral. Earir.'pBl ,'BDtí .'citoviln* F. IflVWF. art'gent relacienadí con el ráete: v*. FADD (preteina que contiene el domina de muerte asociada a FAS], Fascina, ligante Fas, f« n b rn FGF-l F 6F-1 FU H fian lina-l fldronecl ra. F¡Lag riña. F ilm a riTC. FU-t FlP. Ftk-VKOR I Vt&FRl Flt-V VEGFR l Ftl-A, F r i i FSH, FSH - h. F> r„ G aQ. Gab-1. GA BA i R septo r \ GA045. Sal, gamma giman: L transieras! (gfll). gamma glutamitdslHna sirtetasa |0CS}/WLUtafnato- cisterna ügasa. OAPDH. gastrina l GCQFP-fi.0-CSFr OFAP. gticentina. gtncagóu. pretérita regulada por fbicesa 74. GluH 1 }i. Gluft L GlaHA.
BWó/7. OLIFT-l GLIfT-G, glucógeno si mase gurisa 3610SKÍ5). glicoforina A, GH-ISF, receptar de
GnftH, complejo de &olpr grpnidjocit«$r gr entuna EL GrW. praterna EluorescentE mde(GFR) GRI> ;
Hormona de crecí interno IhGH >. GS K-3. GST. DSTmu H. Pylor i . KDACl H DJ-2.TI NAJ. Factor de tiuque térmica X Factor de cheque lí r m c o 2. ? r oleína de choque lérmi ce í7/hsp27. Proteina de choque térmica ífl/hsptfl, Proteica de cheque térmica 70jl»sp7Q, Pr oleína de choque Dérmiu'FyhspTi Preteína de choque térmica TOa/hspíí, P reteína de choque termes ííc.tts p3¿. h eticobecier pyteri. P reteog nace de suLfatc de heperán. Factor nuclear hepáhco-W, Hepetwto. Homuliogo del laclar hepáhea A, Hepalactto Factor de cretimi Hito. Hereguliiu. HF - la. H i siena H| h?L. GPV lí. HPV ü - E7, HSP. S íntima de ybdire de sodio tmano |hNS|. i-FLLCf / CASPER. FH gamma. L$A. GF-Vt, GF-i, IqG. tgH (cadena pesada m), l-Aappa-J qwnasa i (KKb), L - l atfa. l - l beta. l -H .1-10R, i t i . L -í, U l-3CL L -*. l - i . t-é , L-B. initbina alfa, msui na. r ecepf :r dt im u in i s istr ato del r etepter í e ins u(i na -1 c ncc pe teína Lnt- 2. trtegnna teta S.
Lotertíren afl0.lntt[fscpii-¡¡r im(Liicrim1 P t^R G Í. marcador deptotirsraciánPG-38, RAN. DX. JtlK a lo nasa activador a (J K K cadena ligera K appa. querati na D i querati na D/t3. querabna U. querahna TS. queratinali. qiier abnalÉ.quí ratina tó.quei afina ÍÜ.quer arma querafinaS/8; querafina Í.Quir afina I |S cr n lesiaespecífica], Quer ah na Ijt8. Guer afina a m íl. úuer atina (rry ti). Qaer ah na (Paré. KiíT, ku [pTOj'pStn. Kd (peo. Molécula de adhesión celular Ll. cadeno de luzlembda, larmnína BVbl lamí rana BJígl receptor de lamnína. lamnínaL U k Lck [p56-lck). leucotrien» (CA.0¿. E-íJ. LeansA. LewisEL LHr L-pAastma. LHP/MVP. tuc.lwasa. macráfego. HADO. MAGE-lPrateína de rnón a maltosai KAPft MAP2ah.
MAHT- ),Velan-A. qu masa de mastocites. Mct-1 v&2. MCMS, MDMZ acelaito de medrexipt agesttrona
(pp A). W k l Mck2. Mcki. H d É - l M lm m a IgptOO). rn G litl mGluflS.
HGMI. MHCt(HlASy HU-Aw3í. MHC1 (WLA-A|, MHCI (HIA-A.6,0. Wtd OUA-B). M«C I (HIA-QP f OH). MHGI IKL A - D P.. MH C11H LA ■ Q U). «H CI |N L A - Dttf. MH C l(H L A - DHI k mi í< c n alní i proteina de membrana del glóbulo de grasa láctea rmtocondrias.MlHl Wf-Hcotagenasa-Q. WP-Uleslroinelisina-í). WP-D
(estro me lisina-3). WP-míolageflasa-St.Mrtt-lA/Hn-HHP. W P-liíFm-twP.
MHP-N.W-I {colagenasa I1F7!KDb)fMMP-23LIW-7 (inatnUsipa).MW 7(totagenasaÍF« ttkOat, nuesi na mSAHKL, M«-\ rmjcma 2, m«ira 3 [WC3|. muema SAC, MyDW. mieti njjotigodendrocilio, marcador específico mielsióe. MielaperiiKidBsa. MioDErmogemna. miogtohna cadena pesada de imiscido Liso de Jiuasma N:k central negabvu para ratón IgG \ ccrírcl negativa para ratón lgE2a central negafava para tgG3 de ratón Control negat vt par a IgM de i alón, tortol negadm para IgO de coneia. Neuroti i amento, Heucrfilamerido (lí(W)i), Neuroti lamería (200kGa). Nevadamente ÜGtGii. Entlasa especifica de nevona. Elslsa Pe neutrófiia, HF kappa BfpSOlHF kappa & /péS (R el A), receptor HGF (pTWG FR}. tuda nítrico si H»a cerebral (MIOS), onda nttrice endolrtal Siiiasa (eHDS). rm23. HDS-ir HOS-y WntcK. Nuclenfosmina (NPPfl. Ni*(A. O d - l Dct-2.'. Set-i.'. Drnltins DescarboxilaSA DstHpOnbna, pl3D. püOcas. plAARF, pFMKAb,
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L A M B I. LCN2. M AP7, M B . M M P7, M M P9. M PZL2. M SLN . M TA 3, M TS S I. O C LN, PCOLCE2. PECAM 1. PLAUR. PLXN B1. PPL. PPP1R9A. RASSF8. SCNN1A. SERPINB2. SERPINE1. SFRP1. SH 3YL1. SLC27A2. SM AD 7. SNA11. SNA12. SPARC. SPDEF. SRPX. STA T5A, TB X 2, TJP3, TM EM 125. TM E M 45B, TW IS T1, V C A N , V IM , VW F, XBP1,
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Y B X 1. Z BTB10. Z E B L ZEB2________________________________________________________
Los ejemplos de biomarcadores adicionales que se pueden incorporar en los métodos de la invención incluyen, sin limitación, los divulgados en las Solicitudes de Patente Internacional Nos. PCT/US2012/042519 (No. de referencia del abogado 37901-797.601), presentada el 14 de junio de 2012 y PCT/US2012/050030 (No. de ref. de abogado 37901­ 797.602), presentada el 8 de agosto de 2012.
En diversas realizaciones de la invención, los biomarcadores o biofirma usados para detectar o evaluar cualquiera de las afecciones o enfermedades divulgadas en este documento pueden comprender uno o más biomarcadores en una de varias categorías diferentes de marcadores, en los que las categorías incluyen, sin limitación, uno o más de: 1) biomarcadores específicos de enfermedades; 2) biomarcadores específicos de células o tejidos; 3) marcadores específicos de vesículas (por ejemplo, biomarcadores de vesículas generales); 4. biomarcadores específicos de angiogénesis; y 5) biomarcadores inmunomoduladores. Los ejemplos de tales marcadores se divulgan en este documento y son conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Adicionalmente, un biomarcador conocido en la técnica que se caracteriza por desempeñar un papel en una enfermedad o afección particular se puede adaptar para su uso como diana en los métodos de la invención. En realizaciones adicionales, tales biomarcadores que están asociados con vesículas pueden ser todos marcadores de superficie de vesícula, o una combinación de marcadores de superficie de vesícula y marcadores de carga útil de vesícula (es decir, moléculas encerradas por una vesícula). Los biomarcadores evaluados se pueden provenir de una combinación de fuentes. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno se puede detectar o caracterizar evaluando una combinación de proteínas, ácidos nucleicos, vesículas, biomarcadores circulantes, biomarcadores de una muestra de tejido y similares. Además, como se indica en este documento, la muestra biológica evaluada puede ser cualquier fluido biológico o puede comprender componentes individuales presentes en tal fluido biológico (por ejemplo, vesículas, ácidos nucleicos, proteínas o complejos de los mismos).
EpCAM es un antígeno de diferenciación pan-epitelial que se expresa en muchas células tumorales. Está intrínsecamente relacionado con la vía Cadherina-Catenina y, por consiguiente, con la vía WNT fundamental responsable de la polaridad y la señalización intracelular. Se ha usado como diana inmunoterapéutica en el tratamiento de carcinomas gastrointestinales, urológicos y otros. (Chaudry MA, Sales K, Ruf P, Lindhofer H, Winslet MC (April 2007). Br. J. Cancer 96 (7): 1013-9.). Se expresa en células madre pluripotentes no diferenciadas. EpCAM es miembro de una familia que incluye al menos dos proteínas de membrana de tipo I y funciona como una molécula de adhesión celular homotípica independiente del calcio. Las mutaciones en este gen dan como resultado una enteropatía congénita en penacho. Se ha observado EpCAM en la superficie de microvesículas derivadas de células cancerosas de diversos linajes. EpCAM se usa como ejemplo de antígeno de superficie en diversos ejemplos en este documento. Un experto apreciará que diversas realizaciones y ejemplos que usan EpCAM también se pueden aplicar a otros biomarcadores, incluidos otros antígenos de superficie de microvesículas.
Agentes terapéuticos
Como se usa en este documento, “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de una composición que alivia (hasta cierto punto, a juicio de un médico experto) uno o más síntomas de la enfermedad o afección en un mamífero. Además, por “cantidad terapéuticamente eficaz” de una composición se entiende una cantidad que vuelve a la normalidad, ya sea parcial o completamente, los parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados o causantes de una enfermedad o afección. Un médico experto en la técnica puede determinar la cantidad terapéuticamente eficaz de una composición para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno particular cuando se administra, tal como por vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, oral o por inhalación. La cantidad precisa de la composición requerida para ser terapéuticamente eficaz dependerá de numerosos factores, por ejemplo, tales como la actividad específica del agente activo, el dispositivo de administración empleado, las características físicas del agente, el propósito de la administración, además de muchas consideraciones específicas de los pacientes. Pero la determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la experiencia de un médico con experiencia ordinaria tras la apreciación de la divulgación expuesta en este documento.
Los términos “tratar", “tratamiento", “terapia” y “tratamiento terapéutico” como se usan en este documento se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica o terapia preventiva. Un ejemplo de “terapia preventiva” es la prevención o disminución de la probabilidad de una enfermedad diana (por ejemplo, cáncer u otra enfermedad proliferativa) o una afección relacionada con la misma. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen la enfermedad o afección, así como aquellos propensos a tener la enfermedad o afección que se va a prevenir. Los términos “tratar", “tratamiento", “terapia” y “tratamiento terapéutico” como se usan en este documento también describen el manejo y cuidado de un mamífero con el propósito de combatir una enfermedad o afección relacionada, e incluye la administración de una composición para aliviar los síntomas, efectos secundarios u otras complicaciones de la enfermedad, afección. El tratamiento terapéutico para el cáncer incluye, pero no se limita a, cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia génica e inmunoterapia.
Como se usa en este documento, el término “agente” o “fármaco” o “agente terapéutico” se refiere a un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos, o células o tejidos animales (particularmente mamíferos) que se sospecha que tienen propiedades terapéuticas. El agente o fármaco puede estar purificado, sustancialmente purificado o parcialmente purificado. Un “agente” según la presente La invención también incluye un agente de radioterapia o un “agente quimioterapéutico”.
Como se usa en este documento, el término “agente de diagnóstico” se refiere a cualquier producto químico usado en la formación de imágenes de tejido enfermo, como, por ejemplo, un tumor.
Como se usa en este documento, el término “agente quimioterapéutico” se refiere a un agente con actividad frente a el cáncer, enfermedades neoplásicas y/o proliferativas, o que tiene la capacidad de destruir células cancerosas directamente.
Como se usa en este documento, “formulaciones farmacéuticas” incluyen formulaciones para su uso humano y veterinario sin efectos toxicológicos adversos significativos. “Formulación farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento, se refiere a una composición o formulación que permite la distribución eficaz de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en la ubicación física más apropiada para su actividad deseada.
Como se usa en este documento, el término “portador farmacéuticamente aceptable” pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones.
Conjugados aptámero-toxina como agente terapéutico contra el cáncer
Un extenso trabajo anterior ha desarrollado el concepto de conjugados de anticuerpo-toxina ("inmunoconjugados") como terapias potenciales para una variedad de indicaciones, principalmente dirigidas al tratamiento contra el cáncer con un enfoque principal en tumores hematológicos. Se han probado una variedad de cargas útiles diferentes para la administración dirigida en estudios preclínicos y clínicos, incluidas toxinas proteicas, citotóxicos de molécula pequeña de alta potencia, radioisótopos y fármacos encapsulados en liposomas. Si bien estos esfuerzos han producido con éxito tres terapias aprobadas por la FDA para tumores hematológicos, los inmunoconjugados como clase (especialmente para tumores sólidos) históricamente han arrojado resultados decepcionantes que se han atribuido a múltiples propiedades diferentes de los anticuerpos, incluida la tendencia a desarrollar respuestas de anticuerpos neutralizantes a anticuerpos no humanizados, penetración limitada en tumores sólidos, pérdida de la afinidad de unión a la diana como resultado de la conjugación de la toxina y desequilibrios entre la semivida del anticuerpo y la semivida del conjugado de la toxina que limitan el índice terapéutico general (revisado por Reff and Heard, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 40 (2001):25-35).
Los aptámeros son funcionalmente similares a los anticuerpos, excepto que sus propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción ("ADME") son intrínsecamente diferentes y generalmente carecen de muchas de las funciones efectoras inmunitarias generalmente asociadas con los anticuerpos (por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, citotoxicidad dependiente del complemento). Al comparar muchas de las propiedades de los aptámeros y los anticuerpos descritos anteriormente, varios factores sugieren que la administración de toxinas a través de los aptámeros ofrece varias ventajas concretas sobre la administración con anticuerpos, lo que en última instancia les otorga un mejor potencial como agentes terapéuticos. Varios ejemplos de las ventajas de la administración de toxinas a través de aptámeros sobre los anticuerpos son los siguientes:
1) Los conjugados aptámero-toxina se sintetizan químicamente en su totalidad. La síntesis química proporciona más control sobre la naturaleza del conjugado. Por ejemplo, la estequiometría (proporción de toxinas por aptámero) y el sitio de unión se pueden definir con precisión. Se pueden ensayar fácilmente diferentes químicas de enlazantes. La reversibilidad del plegamiento del aptámero significa que la pérdida de actividad, durante la conjugación es poco probable y brinda más flexibilidad para ajustar las condiciones de conjugación para maximizar los rendimientos.
2) El tamaño más pequeño permite una mejor penetración en el tumor. La mala penetración de anticuerpos en tumores sólidos se cita a menudo como un factor que limita la eficacia de los enfoques conjugados. Véase Colcher, D., Goel, A., Pavlinkova, G., Beresford, G., Booth, B., Batra, S. K. (1999) "Effects of genetic engineering on the pharmacokinetics of antibodies", Q. J. Nucl. Med., 43: 132-139. Los estudios que comparan las propiedades de los aptámeros antitenascina C no PEGilados con los anticuerpos correspondientes demuestran una captación eficiente en los tumores (según lo definido por la proporción tumor:sangre) y evidencia de que el aptámero localizado en el tumor tiene una vida inesperadamente larga (t-i/2 >12 horas) (Hicke, B. J., Stephens, A. W., "Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy", J. Clin. Invest., 106:923-928 (2000)).
3) PK sintonizable. La semivida/metabolismo del aptámero se puede ajustar fácilmente para que coincida con las propiedades de la carga útil, optimizando la capacidad de administrar la toxina al tumor y minimizando la exposición sistémica. Las modificaciones apropiadas al esqueleto del aptámero y la adición de PEG de alto peso molecular deberían hacer posible igualar la semivida del aptámero con la semivida intrínseca de la toxina conjugada/enlazante, minimizando la exposición sistémica a metabolitos portadores de toxinas no funcionales (esperado si t-i/2 (aptámero)<<t-i/2 (toxina)) y reduciendo la probabilidad de que el aptámero no conjugado persistente bloquee funcionalmente la absorción de aptámero conjugado (esperado si t-i/2 (aptámero)>>t-i/2 (toxina)).
4) Requerimientos de material relativamente bajos. Es probable que los niveles de dosificación estén limitados por la toxicidad intrínseca a la carga útil citotóxica. Como tal, un único curso de tratamiento probablemente implicará cantidades relativamente pequeñas (<100 mg) de aptámero, lo que reduce la probabilidad de que el coste de la síntesis de oligonucleótidos sea una barrera para las terapias basadas en aptámeros.
5) Se prefiere la administración parenteral para esta indicación. No habrá una necesidad especial de desarrollar formulaciones alternativas para impulsar la aceptación del paciente/médico.
Métodos de identificación de aptámeros
Las secuencias de ácido nucleico se pliegan en motivos secundarios y terciarios específicos de su secuencia de nucleótidos. Estos motivos colocan las cargas positivas y negativas en las secuencias de ácido nucleico en lugares que permiten que las secuencias se unan a lugares específicos en moléculas diana, por ejemplo, proteínas y otras secuencias de aminoácidos. Estas secuencias de unión se conocen en el campo como aptámeros. Debido a los trillones de posibles secuencias de nucleótidos únicas incluso en un tramo relativamente corto de nucleótidos (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos), se puede generar una gran variedad de motivos, lo que da como resultado aptámeros para casi cualquier proteína u otro diana.
Los aptámeros se crean mediante la generación aleatoria de oligonucleótidos de una longitud específica, por lo general de 20-80 pares de bases, por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 4 1, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 pares de bases. Estos oligonucleótidos aleatorios luego se incuban con la proteína diana de interés. Después de varias etapas de lavado, los oligonucleótidos que se unen a la diana se recolectan y amplifican. Luego, los aptámeros amplificados se agregan a la diana y el procedimiento se repite, a menudo de 15-20 veces. Una versión común de este procedimiento conocida para los expertos en la técnica como el método SELEX.
El resultado final comprende uno o más aptámeros con alta afinidad por la diana. Se puede usar un procesamiento adicional de tales aptámeros resultantes para proporcionar características deseables: 1) ensayos de unión competitiva para identificar los aptámeros en un epítopo deseado; 2) análisis de motivos para identificar aptámeros de unión de alta afinidad in silico; y 3) ensayos de selección de aptámeros basados en microvesículas para identificar aptámeros que se pueden usar para detectar una enfermedad particular. La invención también proporciona el uso de los aptámeros para detectar una diana de interés, por ejemplo, para detectar una entidad biológica tal como una proteína, un ácido nucleico o una microvesícula. Los aptámeros descritos en este documento se pueden unir a grupos funcionales de interés, por ejemplo, grupos carboxilo, para su uso como agentes de bloqueo, controles negativos y similares. Los métodos se describen con más detalle a continuación y más adelante en los ejemplos.
Se contemplan las secuencias de aptámero que son altamente homólogas a las secuencias que se descubren mediante los métodos descritos en este documento. “Alta homología” por lo general se refiere a una homología del 40 % o superior, preferentemente del 60 % o superior, más preferentemente del 80 % o superior, incluso más preferentemente del 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o superior entre una secuencia de polinucleótidos y una secuencia de referencia. La secuencia de referencia puede comprender la secuencia de uno o más aptámeros proporcionados en este documento. Las homologías porcentuales (también denominadas identidad porcentual) se llevan a cabo por lo general entre dos secuencias alineadas de manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de las secuencias y la comparación pueden realizarse, por ejemplo, usando el algoritmo de "Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)". Los cálculos de homología también se pueden realizar usando BLAST, que se puede encontrar en el servidor www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/(Altschul S F, et al, Nucleic Acids Res. 1997; 25(17):3389-402; Altschul S F, et al, J Mol. Biol. 1990; 215(3):403-10). En el caso de un polinucleótido aislado que es más largo o equivalente en longitud a la secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia identificada por los métodos en este documento, la comparación se realiza con la longitud completa de la secuencia de referencia. Cuando el polinucleótido aislado es más corto que la secuencia de referencia, por ejemplo, más corto que una secuencia identificada por los métodos en este documento, la comparación se realiza con un segmento de la secuencia de referencia de la misma longitud (excluyendo cualquier bucle requerido por el cálculo de homología).
También se contemplan las secuencias de aptámeros que son fragmentos funcionales de las secuencias que se descubren mediante los métodos descritos en este documento. En el contexto de una secuencia de aptámero, un “fragmento funcional” de la secuencia de aptámero puede comprender una subsecuencia que se une a la misma diana que la secuencia de longitud completa. En algunos casos, una secuencia de aptámero candidata es de un miembro de una biblioteca que contiene secuencias líder en 5' y/o una secuencia de cola en 3'. Tales secuencias líder o secuencias de cola pueden servir para facilitar la unión del cebador para la amplificación o la captura, etc. El fragmento funcional de la secuencia de longitud completa puede comprender la subsecuencia de la secuencia de aptámero candidato sin las secuencias líder y/o de cola.
Adición de anticuerpos competitivos
Los métodos de producción de aptámeros conocidos pueden implicar la elución de todos los aptámeros unidos de la secuencia diana. En algunos casos, esto no es suficiente para identificar la secuencia de aptámero deseada. Por ejemplo, cuando se intenta reemplazar un anticuerpo en un ensayo, puede ser deseable recoger solamente aptámeros que se unan al epítopo específico del anticuerpo que se reemplaza. La divulgación proporciona un método que comprende la adición de un anticuerpo que se va a reemplazar a la reacción aptámero/diana para permitir la recolección selectiva de aptámeros que se unen al epítopo del anticuerpo. El método puede comprender incubar una mezcla de reacción que comprende oligonucleótidos generados aleatoriamente con una diana de interés, retirar los aptámeros no unidos de la mezcla de reacción que no se unen a la diana, agregar un anticuerpo a la mezcla de reacción que se une a ese epítopo de interés y recoger los aptámeros que son desplazados por el anticuerpo. La diana puede ser una proteína.
Las figuras 2A-2B ilustran una estrategia de selección de ensayo competitivo. Un grupo aleatorio de candidatos a aptámeros de ácidos nucleicos (la biblioteca) se incuba con una diana de interés 202. Se pueden realizar múltiples rondas de unión en las que: 1) la biblioteca se incuba con la diana; 2) la mezcla biblioteca-diana se lava para retirar los candidatos a aptámeros no unidos; 3) los candidatos a aptámeros unidos se eluyen de la diana; y 4) los candidatos a aptámeros eluidos se agregan de nuevo a la diana y se permite que se unan. La figura 2A ilustra el candidato 201 a aptámero unido a la diana 202. En la etapa i), luego se agrega a la reacción un anticuerpo 203 competidor. La figura 2B ilustra el anticuerpo 203 candidato compitiendo con el candidato 201 a aptámero en el epítopo del anticuerpo. El candidato 201 a aptámero es desplazado por el anticuerpo y luego se recoge.
Unión competitiva
Como se describe en este documento, los aptámeros se pueden identificar frente a una diana de interés. Se puede usar un esquema 30 de unión competitiva para identificar aptámeros frente a una diana de interés, como se indica en la figura 3. Un analito de interés, por ejemplo, una entidad biológica tal como una proteína o una microvesícula, se captura en un sustrato 31. El sustrato puede ser, por ejemplo, un sustrato plano o una perla. El analito se puede capturar de forma covalente o no covalente, por ejemplo, el analito se puede capturar usando un enlace de anticuerpo, aptámero o estreptavidina-biotina. El analito capturado se pone en contacto con un grupo de candidatos 32 a aptámeros de oligonucleótidos. El grupo puede comprender oligonucleótidos generados aleatoriamente, por ejemplo, al menos 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1023, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019 o al menos 1020 oligonucleótidos. Los oligonucleótidos se unen a diversas componentes de la mezcla, incluido el analito, el sustrato, el agente de captura (por ejemplo, anticuerpo (Ab), aptámero, etc.), tubo o pocillo de reacción, desechos biológicos, etc. 33. Los oligonucleótidos que se unen al analito comprenden candidatos a aptámeros para la diana de interés 34. Los oligonucleótidos no unidos se retiran mediante lavado 35. Después de esta etapa, la mezcla de reacción comprende el analito de captura unido por candidatos de aptámeros. Un ligando que reconoce un epítopo específico, por ejemplo, un anticuerpo, se pone en contacto con la mezcla 37 de reacción. El ligando disocia candidatos a aptámeros unidos al mismo epítopo que el ligando a través de la competencia por el epítopo 38. Los candidatos a aptámeros disociados se recolectan y amplifican 39. Las etapas 32-39 se repiten un número determinado de veces, n, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces, para enriquecer aún más los candidatos a aptámeros con aquellos que se unen al mismo epítopo que el ligando. Después de los ciclos repetidos, los aptámeros restantes se evalúan mediante secuenciación y otras caracterizaciones 310 como se describe en este documento.
El cribado de control se realiza en paralelo con el método anterior. Cualquier aptámero identificado a través del cribado de control se descarta. Los analitos de control incluyen, sin limitación, el sustrato desnudo incubado con el analito, el sustrato desnudo sin el analito y el método realizado con un ligando de control, tal como un anticuerpo que no se une a una diana de interés.
El ligando puede ser un anticuerpo contra un biomarcador de interés. El método se puede usar para identificar un aptámero para sustituir un anticuerpo en un ensayo biológico. Por ejemplo, el aptámero se puede producir de forma más reproducible y eficiente que un anticuerpo equivalente. El biomarcador puede ser cualquier biomarcador útil, incluyendo, sin limitación, un biomarcador de la tabla 3 o 4. El biomarcador puede ser un antígeno de superficie de microvesícula seleccionado de la tabla 3 o 4.
También se describe en este documento un método de selección de un grupo de aptámeros, comprendiendo el método: (a) poner en contacto un conjunto de candidatos a aptámeros con una muestra que comprende una molécula diana; (b) retirar los candidatos a aptámeros no unidos; (c) poner en contacto la muestra con un ligando con la molécula diana; y (d) aislar candidatos a aptámeros que se disocian de la molécula diana por competencia con el ligando, seleccionando así el grupo de aptámeros que se unen a la misma diana que el ligando. La molécula diana puede ser una proteína. La proteína puede ser un antígeno de superficie de microvesículas. El antígeno de superficie se puede aislar de una microvesícula o permanecer incrustado dentro de una membrana de microvesícula. La molécula diana se puede atar directa o indirectamente a un sustrato. Por ejemplo, la molécula diana puede ser una proteína que se une a un anticuerpo o aptámero en la superficie del sustrato. En otro ejemplo, la molécula diana es un antígeno de superficie de una microvesícula y la microvesícula está atada al sustrato.
El ligando usado para desplazar a los candidatos a aptámeros puede comprender una pequeña molécula o proteína. El ligando puede comprender un anticuerpo. De este modo, el método se puede usar para identificar aptámeros que se unen al mismo epítopo que un anticuerpo.
Como se describe en este documento, las etapas (a)-(d) se pueden repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces, en las que los candidatos a aptámeros aislados en la etapa (d) se usan en el grupo de candidatos a aptámeros introducidos en la etapa (a) en cada iteración. Este procedimiento iterativo se usa para enriquecer aún más el grupo de candidatos a aptámeros con aquellos que se unen a la misma diana que el ligando.
Los miembros del grupo seleccionado de aptámeros se pueden identificar para una caracterización adicional. La identificación se puede realizar mediante secuenciación de alto rendimiento (HTS). E1HTS puede ser secuenciación de última generación.
Análisis de motivos
En la mayoría de los experimentos de aptámeros, se identifican múltiples secuencias de aptámeros que se unen a la diana. Estos aptámeros tendrán diversas afinidades de unión. Puede llevar mucho tiempo y ser laborioso generar cantidades suficientes de estos muchos aptámeros para evaluar las afinidades de cada uno. Para identificar un gran número de aptámeros con las afinidades más altas sin cribar físicamente grandes subconjuntos, se describe en este documento un método que comprende el análisis de la estructura bidimensional de uno o más aptámeros de alta afinidad a la diana de interés. El método puede comprender cribar la base de datos en busca de aptámeros que tengan estructuras o motivos bidimensionales similares, pero no necesariamente secuencias primarias similares. El método puede comprender identificar un aptámero de alta afinidad usando métodos tradicionales tales como los divulgados en este documento o conocidos en la técnica (por ejemplo, ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial, véase, por ejemplo, la figura 4), aproximando la estructura bidimensional del aptámero de alta afinidad, e identificar aptámeros de un grupo de secuencias que se predice que tienen una estructura bidimensional similar al aptámero de alta afinidad. Por lo tanto, el método proporciona un grupo de candidatos que también se unen a la diana de interés. La estructura bidimensional de un oligo se puede predecir usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a través de cálculos de energía libre (AG) realizados usando un programa de software comercialmente disponible tales como Vienna o mFold, por ejemplo como se describe en Mathews, D., Sabina, J., Zucker, M. & Turner, H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters provides robust prediction of RNA secondary structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999); Hofacker et al., Monatshefte f. Chemie 125: 167-188 (1994); and Hofacker, I. L. Vienna RNA secondary structure server. Nucleic Acids Res. 31, 3429-3431 (2003). Véanse, las figuras 5A-5B. El grupo de secuencias se puede secuenciar a partir de un grupo de candidatos a aptámeros generados aleatoriamente usando una plataforma de secuenciación de alto rendimiento, tal como la plataforma Ion Torrent de Life Technologies. La identificación de aptámeros de un grupo de secuencias que se predice que tienen una estructura bidimensional similar al aptámero de alta afinidad puede comprender cargar las secuencias resultantes en el programa de software de elección para identificar miembros del grupo de secuencias con estructuras bidimensionales similares como el aptámero de alta afinidad. Luego de pueden determinar in situ las afinidades del grupo de secuencias, por ejemplo, ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial o similar.
Métodos de sustracción de aptámeros
Con el fin de desarrollar un ensayo para detectar una enfermedad, por ejemplo, cáncer, por lo general se criba una gran población de biomarcadores conocidos de pacientes normales y enfermos para identificar marcadores que se correlacionan con la enfermedad. Este procedimiento solo funciona si los marcadores discriminantes ya están descritos. Para abordar este problema, se describe en este documento un método que comprende sustraer aptámeros no discriminatorios de un gran grupo de aptámeros incubándolos inicialmente con microvesículas o células no diana. Las células no diana pueden ser células normales o microvesículas desprendidas de las mismas. Los aptámeros que no se unieron a las microvesículas o células normales se incuban luego con microvesículas o células enfermas. Los aptámeros que se unen a las microvesículas o células enfermas pero que no se unieron a las células normales son entonces posibles candidatos para un ensayo para detectar la enfermedad. Este procedimiento es independiente de conocer la existencia de un determinado marcador en la muestra enferma.
Los métodos de sustracción se pueden usar para identificar aptámeros que reconocen preferentemente una población deseada de dianas. El método de sustracción se puede usar para identificar aptámeros que reconocen preferentemente la diana de una población diana enferma sobre una población de control (por ejemplo, normal o no enferma). La población diana enferma puede ser una población de vesículas de un individuo o individuos enfermos, mientras que la población de control comprende vesículas de un individuo o individuos no enfermos. La enfermedad puede ser un cáncer u otra enfermedad divulgada en este documento o conocida en la técnica. En consecuencia, el método proporciona aptámeros que identifican preferentemente dianas de enfermedad contra dianas de control.
Las microvesículas circulantes se aíslan del plasma de control, por ejemplo, plasma de individuos “normales” que no tienen una enfermedad de interés, tal como la ausencia de cáncer. Las vesículas en el plasma se aíslan usando un método divulgado en este documento o conocido en la técnica. Por ejemplo, las vesículas se pueden aislar del plasma mediante uno de los siguientes métodos: filtración, reactivo ExoQuick, ultracentrifugación, usando un reactivo de acumulación molecular (por ejemplo, TEXIS de Life Technologies), aislamiento por afinidad, selección por afinidad o una combinación de cualquiera de estos métodos. Las microvesículas aisladas en cada caso serán una mezcla de tipos de vesículas y tendrán diversos tamaños con la excepción de los métodos de ultracentrifugación, que tienen tendencia a producir vesículas de tamaño exosomal. Las bibliotecas de oligonucleótidos generadas aleatoriamente (por ejemplo, producidas como se describe en el ejemplo 1 a continuación) se incuban con las vesículas normales aisladas. Los aptámeros que no se unen a estas vesículas se aíslan, por ejemplo, centrifugando las vesículas y recogiendo el sobrenadante que contiene los aptámeros que no se unen. A continuación, estos aptámeros que no se unen se ponen en contacto con vesículas aisladas de pacientes enfermos (por ejemplo, usando los mismos métodos que se han descrito anteriormente) para permitir que los aptámeros reconozcan las vesículas enfermas. A continuación, se recogen los aptámeros que están unidos a las vesículas enfermas. Las vesículas se pueden aislar y luego lisarse usando un agente caotrópico (por ejemplo, SDS o un detergente similar) y los aptámeros luego se capturan pasando la mezcla de lisis sobre una columna de afinidad. La columna de afinidad puede comprender perlas de estreptavidina en el caso de grupos de aptámeros conjugados con biotina. Los aptámeros aislados son los amplificados. Luego, el procedimiento puede repetirse, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más veces.
De acuerdo con la divulgación, se identifica un perfil del aptámero que se puede usar para caracterizar una muestra biológica de interés. Un grupo de oligonucleótidos generados aleatoriamente, por ejemplo, al menos 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019 o al menos 1020 oligonucleótidos, se pueden poner en contacto con un componente biológico o diana de interés de una población de control. Los oligonucleótidos que no se unen al componente biológico o a la diana de interés de la población de control se aíslan y luego se ponen en contacto con un componente biológico o a la diana de interés de una población de prueba. Se retienen los oligonucleótidos que se unen al componente biológico o a la diana de interés de la población de prueba. Los oligonucleótidos retenidos se pueden usar para repetir el procedimiento poniendo en contacto los oligonucleótidos retenidos con el componente biológico o la diana de interés de la población de control, aislando los oligonucleótidos retenidos que no se unen al componente biológico o a la diana de interés de la población de control, y nuevamente poniendo en contacto estos oligonucleótidos aislados con el componente biológico o la diana de interés de la población de prueba y aislando los oligonucleótidos de unión. El “componente” o “diana” puede ser cualquier cosa que esté presente en la muestra a la que los oligonucleótidos sean capaces de unirse (por ejemplo, polipéptidos, péptidos, moléculas de ácido nucleico, carbohidratos, lípidos, etc.). Luego se repite el procedimiento, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. Los oligonucleótidos resultantes comprenden aptámeros que pueden detectar diferencialmente la población de prueba contra el control. Estos aptámeros proporcionan un perfil del aptámero, que comprende una biofirma que se determina usando uno o más aptámeros, por ejemplo, una biofirma que comprende una presencia o nivel del componente o diana que se detecta usando uno o más aptámeros.
El procedimiento de ejemplo se ilustra en la figura 6, que demuestra el método de identificación del aptámero que reconoce preferentemente las vesículas cancerosas usando vesículas de individuos normales (no cancerosos) como control. En la figura, se ejemplifican los exosomas, pero un experto apreciará que se pueden usar otras microvesículas de la misma manera. Los aptámeros resultantes pueden proporcionar un perfil que puede detectar diferencialmente las vesículas cancerosas de las vesículas normales. Un experto apreciará que se pueden usar las mismas etapas para derivar un perfil del aptámero para caracterizar cualquier enfermedad o afección de interés.
Se describe un polinucleótido aislado identificado por los métodos anteriores. También se describe un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que es al menos un 60 % idéntica a la secuencia de nucleótidos identificada por los métodos anteriores. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada es al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, idéntica a la secuencia de nucleótidos identificada por los métodos anteriores. En el caso de un polinucleótido aislado que es más largo o equivalente en longitud a la secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia identificada por los métodos anteriores, la comparación se realiza con la longitud completa de la secuencia de referencia. Cuando el polinucleótido aislado es más corto que la secuencia de referencia, por ejemplo, más corto que una secuencia identificada por los métodos anteriores, la comparación se realiza con un segmento de la secuencia de referencia de la misma longitud (excluyendo cualquier bucle requerido por el cálculo de homología).
En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método de caracterización de un fenotipo biológico usando un perfil del aptámero. El perfil del aptámero se puede determinar usando el método anterior. El perfil del aptámero se puede determinar para una muestra de prueba y comparar con un perfil del aptámero de control. El fenotipo puede ser una enfermedad o trastorno tal como un cáncer. Caracterizar el fenotipo puede incluir, sin limitación, proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis. De este modo, el perfil del aptámero puede proporcionar una lectura de diagnóstico, pronóstico y/o teranóstica para el sujeto del que se obtiene la muestra de prueba.
Se puede determinar un perfil del aptámero para una muestra de prueba poniendo en contacto un grupo de moléculas de aptámero con la muestra de prueba, poniendo en contacto el mismo grupo de aptámeros con una muestra de control e identificando una o más moléculas de aptámero que se unen diferencialmente a un componente o diana en la muestra de prueba pero no en la muestra de control (o viceversa). Un “componente” o “diana", como se usa en el contexto de la muestra de prueba biológica o la muestra de control, puede ser cualquier cosa que esté presente en la muestra a la que los aptámeros puedan unirse (por ejemplo, polipéptidos, péptidos, moléculas de ácido nucleico, carbohidratos, lípidos, etc.). Por ejemplo, si una muestra es una muestra de plasma o suero, las moléculas de aptámero se pueden unir a un biomarcador polipeptídico que se expresa únicamente o se expresa diferencialmente (sobre o subexpresado) en un estado patológico en comparación con un sujeto no enfermo. La comparación del perfil del aptámero en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control se puede basar en la medida cualitativa y cuantitativa de la unión de aptámeros (por ejemplo, unión contra no unión, o nivel de unión en la muestra de prueba contra diferente nivel de unión en la muestra control de referencia)
También se describe en este documento un método de identificación de un perfil del aptámero específico de diana, que comprende poner en contacto una muestra de prueba biológica con un grupo de moléculas de aptámero, poner en contacto el grupo con una muestra biológica de control, identificar uno o más aptámeros que se unen a un componente en dicha muestra de prueba pero no en la muestra de control, identificando así un perfil del aptámero para dicha muestra de prueba biológica. Se puede seleccionar un grupo de aptámeros frente a una muestra de enfermedad y compararla con una muestra de referencia, los aptámeros en un subconjunto que se unen a uno o más componentes en la muestra de enfermedad pero no en la muestra de referencia se pueden secuenciar usando técnicas de secuenciación convencionales para identificar el subconjunto que se une, identificando así un perfil del aptámero para la muestra de enfermedad particular. De esta forma, el perfil del aptámero proporciona una plataforma individualizada para detectar enfermedades en otras muestras que se criban. Adicionalmente, al seleccionar una muestra de control o de referencia apropiada, el perfil del aptámero puede proporcionar una lectura de diagnóstico, pronóstico y/o teranóstica para el sujeto del que se obtiene la muestra de prueba.
También se describe en este documento un método de selección de un grupo de aptámeros, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de control biológico con un grupo de oligonucleótidos; (b) aislar un primer subconjunto del grupo de oligonucleótidos que no se unen a la muestra de control biológico; (c) poner en contacto la muestra de prueba biológica con el primer subconjunto del grupo de oligonucleótidos; y (d) aislar un segundo subconjunto del grupo de oligonucleótidos que se unen a la muestra de prueba biológica, seleccionando así el grupo de aptámeros. El grupo de oligonucleótidos puede comprender cualquier número de secuencias deseadas, por ejemplo, al menos 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019 o al menos 1020 oligonucleótidos pueden estar presentes en el grupo inicial. Las etapas (a)-(d) se pueden repetir para perfeccionar aún más el grupo de aptámeros. Estas etapas se pueden repetir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o al menos 20 veces.
Como se describe en este documento, la muestra de prueba biológica y la muestra de control biológico pueden comprender microvesículas. En una realización, la muestra de prueba biológica y, opcionalmente, la muestra de control biológico comprende un fluido corporal. El fluido corporal puede comprender, sin limitación, sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido de Cowper, líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido maligno, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción de la mucosa, agua de las heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares u otros líquidos de lavado. La muestra de prueba biológica y, opcionalmente, el control biológico también pueden comprender una muestra de tumor, por ejemplo, células de un tumor o tejido tumoral. En otras realizaciones, la muestra de prueba biológica y, opcionalmente, la muestra de control biológico comprenden un medio de cultivo celular. En realizaciones, la muestra de prueba biológica comprende una muestra enferma y la muestra de control biológico comprende una muestra no enferma. De acuerdo con lo anterior, el grupo de aptámeros se puede usar para proporcionar una lectura de diagnóstico, pronóstico y/o teranóstica de una enfermedad.
Como se indicó, la invención se puede usar para evaluar microvesículas. Las microvesículas son biomarcadores poderosos porque las vesículas proporcionan una entidad biológica que comprende múltiples piezas de información. Por ejemplo, como se describe, una vesícula puede tener múltiples antígenos de superficie, cada uno de los cuales proporciona información complementaria. Considerar un marcador de cáncer y un marcador específico de tejido. Si ambos marcadores están presentes individualmente en una muestra, por ejemplo, ambos son proteínas o ácidos nucleicos circulantes, es posible que no se pueda determinar si el marcador de cáncer y el marcador específico de tejido se derivan del mismo lugar anatómico. Sin embargo, si tanto el marcador de cáncer como el marcador específico de tejido son antígenos de superficie en una única microvesícula, la propia vesícula une los dos marcadores y proporciona una indicación de una enfermedad (a través del marcador de cáncer) y el origen de la enfermedad (a través del marcador específico de tejido). Adicionalmente, la vesícula puede tener cualquier cantidad de antígenos de superficie y también una carga útil que se puede evaluar. De acuerdo con lo anterior, en este documento se describe un método de identificación de agentes de unión, que comprende poner en contacto una pluralidad de microvesículas extracelulares con una biblioteca de agentes de unión generada aleatoriamente, identificando un subconjunto de la biblioteca de agentes de unión que tienen afinidad con uno o más componentes de las microvesículas extracelulares. Los agentes de unión pueden comprender aptámeros, anticuerpos y/o cualquier otro tipo útil de agente de unión divulgado en este documento o conocido en la técnica.
También se describe en este documento un método de identificación de una pluralidad de ligandos diana, comprendiendo el método, (a) poner en contacto una población de microvesículas de referencia con una pluralidad de ligandos que son capaces de unirse a uno o más marcadores de superficie de microvesículas, (b) aislar una pluralidad de ligandos de referencia, en el que la pluralidad de ligandos de referencia comprende un subconjunto de la pluralidad de ligandos que no tienen afinidad por la población de microvesículas de referencia; (c) poner en contacto una o más microvesículas de prueba con la pluralidad de ligandos de referencia; y (d) identificar un subconjunto de ligandos de la pluralidad de ligandos de referencia que forman complejos con un marcador de superficie en una o más microvesículas de prueba, identificando así la pluralidad de ligandos diana. El término “ ligando” puede referirse a una molécula, o un grupo molecular, que se une a otra entidad química para formar un complejo más grande. De acuerdo con lo anterior, un agente de unión comprende un ligando. La pluralidad de ligandos puede comprender aptámeros, anticuerpos y/u otros agentes de unión útiles descritos en este documento o conocidos en la técnica.
También se describen en este documento kits que comprenden uno o más reactivos para llevar a cabo los métodos anteriores. El uno o más reactivos pueden comprender una biblioteca de agentes de unión potenciales que comprende uno o más de un aptámero, anticuerpo y otros agentes de unión útiles descritos en este documento o conocidos en la técnica.
Complejos Sustrato-Muestra
Se contemplan múltiples variaciones del método de identificación de un agente de unión que sea específico o se una a una molécula diana presente en una muestra. El agente de unión en cualquier contexto descrito en este documento puede ser cualquier molécula que sea capaz de unirse a una molécula diana deseada. A continuación se divulgan en este documento ejemplos de tales agentes de unión. En cualquiera de las divulgaciones en este documento se puede incluir un método de identificación de diversos tipos de agentes de unión que son capaces de unirse a uno o más componentes presentes en una muestra biológica analizada. La diana específica al que se une o se asocia un agente de unión se puede caracterizar como se describe anteriormente.
En este documento se describe un método que comprende: (a) poner en contacto un sustrato con una muestra biológica para permitir la formación de un complejo sustrato-muestra biológica; (b) poner en contacto el complejo con una pluralidad de agentes de unión candidatos; y (c) identificar uno o más agentes de unión que se unen o se asocian con el complejo, seleccionando así uno o más agentes de unión.
El agente de unión puede ser cualquier agente de unión apropiado, incluidos los descritos en este documento, tales como ácido nucleico, molécula de ADN, molécula de ARN, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero, peptoide, ADNz, ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA), lectina, péptido, dendrímero, agente marcador de proteína de membrana, compuesto químico o una combinación de los mismos. El agente de unión puede comprender un anticuerpo, un conjugado de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y/o un aptámero. El agente de unión puede comprender un polipéptido, un péptido o una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, el agente de unión puede ser un aptámero. El polipéptido puede ser un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.
La muestra biológica puede comprender una muestra de tejido o una muestra de cultivo celular, un fluido corporal o cualquier componente de un sujeto animal o humano que pueda aislarse para su evaluación. En cualquiera de las realizaciones en este documento, el fluido corporal comprende sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido bronquialveolar. líquido de lavado, semen, líquido prostático, líquido de Cowper o líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural y peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción de la mucosa, agua de heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, líquido de la cavidad del blastocisto, sangre del cordón umbilical o un derivado de cualquiera de estos. La muestra biológica de estos u otros orígenes puede comprender una población de microvesículas heterogénea o una población de microvesículas homogénea.
En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende una muestra de plasma concentrado, una muestra de suero, una muestra de suero clarificado o una muestra de plasma clarificado. La muestra biológica de estos u otros orígenes puede comprender una población de microvesículas heterogénea o una población de microvesículas homogénea. Tal como se usa en el contexto de las microvesículas, el término “heterogéneo” significa que la población de microvesículas puede comprender microvesículas que son de diferente origen celular o tisular, se producen a través de diferentes mecanismos biológicos o celulares y/o comprenden microvesículas de diferentes tamaños como se discute en este documento. Como se usa en el contexto de las microvesículas, el término “homogéneo” significa, sin limitación, que la población de microvesículas comprende microvesículas que son del mismo origen celular o tisular, se producen a través de los mismos mecanismos biológicos o celulares y/o comprenden microvesículas del mismo intervalo de tamaño como se discute en este documento. En un ejemplo no limitante, se puede obtener una población de microvesículas homogéneas a partir de una población de microvesículas heterogéneas sometiendo la población de microvesículas heterogéneas a una metodología de aislamiento por afinidad o exclusión por tamaño.
Como se usa en este documento, una muestra de suero “clarificado” o plasma “clarificado” tiene niveles reducidos de una o más proteínas abundantes en comparación con una muestra no clarificada. En tales casos, la una o más proteínas abundantes comprenden una proteína sanguínea. Por ejemplo, una o más proteínas abundantes pueden comprender una o más de albúmina, IgG, transferrina, fibrinógeno, fibrina, IgA, a2-marcroglobulina, IgM, a1-Antitripsina, complemento C3, haptoglobulina, apolipoproteína A1, A3 y B; a1 glicoproteína ácida, ceruloplasmina, complemento C4, C1q, IgD, prealbúmina (transtiretina), plasminógeno, un derivado de cualquiera de los mismos y una combinación de los mismos. La una o más proteínas abundantes pueden comprender una o más de albúmina, inmunoglobulinas, fibrinógeno, prealbúmina, alfa 1 antitripsina, alfa 1 glicoproteína ácida, alfa 1 fetoproteína, haptoglobina, alfa 2 macroglobulina, ceruloplasmina, transferrina, proteínas del complemento C3 y C4, beta 2 microglobulina, beta lipoproteína, proteínas gamma globulinas, proteína C reactiva (CRP), lipoproteínas (quilomicrones, VLDL, l Dl , HDL), otras globulinas (tipos alfa, beta y gamma), protrombina, lectina de unión a manosa (MBL), un derivado de cualquiera de los mismos, y una combinación de los mismos.
La una o más proteínas abundantes se pueden agotar usando métodos conocidos en la técnica o divulgados en este documento. Por ejemplo, las proteínas abundantes se pueden separar en su totalidad o en parte mediante métodos de cromatografía (exclusión por tamaño, intercambio iónico, inmunoafinidad, etc.), inmunoafinidad, precipitación o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el agotamiento selectivo de una o más proteínas abundantes comprende poner en contacto la muestra biológica con tromboplastina. Esta etapa puede servir para precipitar el fibrinógeno, facilitando así su remoción.
La una o más proteínas abundantes se agotan preferiblemente a un nivel que mejora el rendimiento de las etapas de procesamiento aguas abajo. Por ejemplo, el agotamiento selectivo de una o más proteínas abundantes de la muestra biológica puede comprender el agotamiento de al menos el 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de la una o más proteínas abundantes.
El complejo sustrato-muestra biológica puede comprender un enlace entre el sustrato y un componente de la muestra. Se puede usar cualquier método útil de reticulación divulgado en este documento o conocido en la técnica. En cualquiera de las realizaciones en este documento, el enlace puede comprender un enlace cruzado. Se puede usar cualquier método útil de reticulación como se divulga en este documento o se conoce en la técnica. En una realización, la reticulación comprende una fotoreticulación, una reticulación imidoéster, suberimidato de dimetilo, un reticulante lipídico, un reticulante de éster de N-hidroxisuccinimida, suberato de bissulfosuccinimidilo (BS3), un aldehído, acroleína, crotonaldehído, formaldehído, un reticulante de carbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DDC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC o EDAC), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), un sulfosuccinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC), un Sulfo-N-hidroxisuccinimidil-2-(6-[ biotinamido]-2-(p-azido benzamido)-hexanoamido)etil-1,3'-ditiopropionato (Sulfo-SBED), metanotiosulfonato de 2-[N2-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil)-N6-(6-biotinaamidocaproil)-L-lisinil]etilo (Mts-Atf-Biotina; disponible de Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford IL.), metanotiosultonato de 2-{N2-[N6-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil-6-amino-caproil)-N6-(6-biotinamidocaproil)-L-lisinilamido]} etilo (Mts- Atf -LC-biotina; disponible de Thermo Fisher Scientific Inc), un aminoácido fotorreactivo (por ejemplo, L-foto-leucina y L-foto-metionina, véase, por ejemplo, Suchanek, M., et al. (2005). La foto-leucina y la fotometionina permiten la identificación de interacciones proteína-proteína. Nat. Methods 2:261-267), un reticulante de N-hidroxisuccinimida (NHS), un reactivo NHS-azida (por ejemplo, NHS-azida, NHS-PEG4-azida, NHS-PEG12-azida; cada uno disponible de Thermo Fisher Scientific, Inc.), un reactivo NHS-fosfina (por ejemplo, NHS-fosfina, Sulfo-NHS-fosfina; cada uno disponible de Thermo Fisher Scientific, Inc.), o cualquier combinación o modificación de los mismos.
En cualquiera de las realizaciones en este documento, el sustrato se reticula directamente con un componente de muestra, por ejemplo, una microvesícula. Cualquier unidad estructural útil en la superficie de la microvesícula puede ser una diana del enlace, por ejemplo, una unidad estructural de proteína, carbohidrato o lípido de la superficie. En otras realizaciones, el sustrato se une a la microvesícula a través de un enlazante.
En cualquiera de las realizaciones en este documento, el sustrato y la muestra se pueden unir a través de un enlazante que comprende componentes adicionales que proporcionan un enlace funcional, donde, por ejemplo, el enlazante tiene el mismo o dos componentes diferentes en cada extremo (por ejemplo, fórmula de X - enlazante - X o X -enlazante - Y), en el que “X” e “Y” representan unidades estructurales funcionales que están configuradas para unirse o asociarse con un sustrato y un componente presente en la muestra biológica. De este modo, será evidente que en algunos casos X e Y son unidades estructurales funcionales iguales o diferentes. En este documento se divulgan ejemplos no limitantes de tales unidades estructurales funcionales para enlazar, reticular o interquelar con una unidad estructural diana deseada. El enlazante puede ser un ácido nucleico o una molécula peptídica (por ejemplo, que proporciona un brazo que reduce o previene el impedimento estérico). El enlazante también puede ser un esqueleto químico que a su vez termina en grupos funcionales que están disponibles para el enlace covalente con un grupo químico específico presente en el sustrato seleccionado (por ejemplo, perlas) y la muestra seleccionada (por ejemplo, microvesículas). El enlazante puede comprender un lípido funcionalizado. Los lípidos funcionalizados útiles incluyen, sin limitación, biotinilo PE 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinilo) (sal sódica) 16:0, biotinilo PE 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinilo) (sal sódica) 18:1, Biotinilo Cap PE 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinilo) (sal sódica) 16:0 o Biotinilo Cap PE 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinilo) (sal sódica) 18:1, biotina esfingosina, biotina S1P, biotinilo MG 12:0, biotina DG 18:1-12:0, ácido N-graso de biotinilo 12:0, Biotina PS 18:1-12:0, Biotina PA 18:1-12:0, Biotina PE 18:1-12:0, Biotina PC 18:1-12:0, Biotina CA 18:1-12:0, Biotinilo LPA 12:0, Biotina PIP3 18:1-12:0, Biotinilo Coenzima A 12:0, todos los cuales están disponibles en Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, Alabama). El lípido funcional puede servir como lípido o anclaje de membrana.
A modo de ilustración, en un ejemplo X - enlazante - Y, la X es una unidad estructural capaz de unirse o asociarse fuertemente con el sustrato (por ejemplo, perla, placa, matriz) e Y es una unidad estructural capaz de unirse a un componente de la muestra biológica, tal como una célula, una microvesícula, etc. X puede ser un reticulante convencional, tal como compuestos específicos de amina/carbonilo como se describe en este documento o conocidos en la técnica. Y también puede ser un reticulante convencional, tales compuestos específicos de amina/carbonilo como se describe en este documento o se conocen en la técnica. En otras realizaciones, Y es una unidad estructural específica de membrana lipídica. Y se puede configurar para incrustarse dentro de una membrana lipídica de una vesícula, célula u otra entidad biológica.
Además de los lípidos funcionales descritos anteriormente, otras entidades de anclaje de membrana útiles incluyen, sin limitación, diacil gliceroles, diacil fosfogliceroles (fosfolípidos) y esteroles, dialquil gliceroles, dialquil-o diacil-1-amino-2,3-dihidroxipropanos, alquilos o acilos de cadena larga con 8 a 25 átomos de carbono, esfingolípidos, ceramidas, fosfolípidos, secuencias de anclaje de membrana de glicosil fosfatidilinositol (GPI), anclajes de membrana de glicofosfolípidos, fragmentos de receptores de la membrana, receptores de unión a proteínas, receptores quelantes de metales, receptores de unión a inmunoglobulina Fc, receptores de unión a citocinas o factores de crecimiento, receptores de unión a fármacos, receptores que imitan lípidos, receptores de transmembrana, receptores de unión a proteínas sintéticas, receptores quelantes de metales sintéticos, receptores de unión a Fc de inmunoglobulina sintética, receptores de unión a factor de crecimiento o citocina sintéticos, receptores de unión a fármacos sintéticos, receptores imitadores de lípidos sintéticos, receptores transmembrana sintéticos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, fosfolípidos, esfingolípidos, esteroides, colesterol, dihidrocolesterol, ergosterol, brasicasterol, colesterilamina, dihidrocolesterilamina, ergosterilamina, brasicasterilamina, 3-colesterilamina, 3-dihidrocolesterilamina, 3-ergosterilamina, 3-brasicasterilamina, 3p-colesterilamina, 3p-dihidrocolesterilamina, 3p-ergosterilamina, 3pbrasicasterilamina y derivados de cualquiera de los mismos. El término “derivado” se puede usar para referirse a una molécula que contiene al menos la porción que permite que la molécula se inserte en una membrana lipídica. Los ejemplos de derivados del colesterol incluyen ésteres de colesterilo y carbamatos de colesterilo. Los ejemplos de derivados de 3p-colesterilamina incluyen, sin limitación, N-alquilo, N-arilo y N-acilo 3p-colesterilaminas. En las siguientes referencias se describen otras unidades estructurales de anclaje de membrana útiles y métodos de uso: Nizard et al., "Anchoring Antibodies to Membranes Using a Diphtheria Toxin T Domain-ZZ Fusion Protein as a pH Sensitive Membrane Anchor," FEBs Letters 433:83-88, 1998; Nizard et al., "Prolonged Display or Rapid Internalization of the IgG-Binding Protein ZZ Anchored to the Surface of Cells Using the Diphtheria Toxin T Domain," Protein Engineering 14(6):439-446, 2001; Caras et al., "Signal peptide for protein secretion directing glycophospholipid membrane anchor attachment", Science, vol. 243:1196-1198 (1989); Lin et al., "Expression of T Cell Antigen Receptor Heterodimers in a Lipid-Linked Form," Science Reports, 1990; 249:677-679; Hussey, Stephen L., et al., "A Synthetic Membrane-Anchored Antigen Efficiently Promotes Uptake of Antifluorescein Antibodies and Associated Protein a by Mammalian Cells", J. Am. Chem. Soc., 2001, vol. 123, pp. 12712-12713; la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos 2006/0068388 A1; las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,083,958, 7,160,856, 7,288,368, 7,371,404, 7,407,947, 7,514,400, 7,611,863, 7,858,117, 7,947,647, 8,013,131, 8,048,448, 8,088,601, 8,198,230; las Solicitudes de Patentes PCT PCT/US98/15124 (WO 99/05255), WO 00/59474, PCT/NZ02/00214 (WO 03/034074), PCT/NZ03/00059 (WO 03/087346).
También se contempla la identificación del agente de unión identificado por el método en este documento. Los métodos de identificación de entidades biológicas son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden identificar mediante secuenciación (Sanger, NextGen, etc.).
También se describe una composición de la materia en este documento, la composición que comprende un complejo sustrato-microvesículas, en la que el sustrato es sintético. Como se usa en el contexto de un complejo sustratomicrovesícula, el término “sintético” significa que el sustrato está hecho por el hombre. El sustrato puede ser una perla (por ejemplo, una perla magnética, una perla de poliestireno, etc.), un sustrato plano u otro sustrato útil divulgado en este documento o conocido en la técnica. La composición se puede usar en los métodos anteriores para identificar agentes de unión. La composición también se puede usar para proporcionar normalización en un ensayo que comprende un sustrato. Como ejemplo no limitante, se puede usar una perla unida a una microvesícula para proporcionar normalización en un ensayo en el que se capturan y detectan microvesículas en una muestra biológica usando perlas.
En una realización, la muestra comprende una microvesícula unida a un sustrato. A continuación, el método se puede usar para identificar aptámeros y/u otros agentes de unión que se unen a una microvesícula, incluyendo, sin limitación, un antígeno de superficie de microvesícula. Las microvesículas se pueden unir a un sustrato usando diversos métodos, por ejemplo: 1) conjugación directa; 2) anclaje de lípidos; 3) unión de anticuerpos; y 4) unión al aptámero. Véanse los esquemas en las figuras 7A-D. La figura 7A ilustra la conjugación directa de una microesfera carboxilada con un antígeno de superficie vesicular. La figura 7B ilustra el anclaje de una microvesícula a una microesfera a través de un anclaje de lípido funcionalizado con biotina. La figura 7C ilustra la unión del anticuerpo a un antígeno de la superficie de la vesícula, en el que el anticuerpo se conjuga con una microesfera carboxilada. La figura 7D ilustra la unión del aptámero a un antígeno de la superficie de la vesícula, en el que el aptámero se conjuga con una microesfera carboxilada. Las microvesículas unidas al sustrato producidas por el método se pueden usar para seleccionar una biblioteca de aptámeros frente a la microvesícula como se describe en este documento. Las figuras 8-10 ilustran el uso de complejos microvesícula-sustrato para seleccionar bibliotecas de aptámeros. Las figuras 11-12 presentan imágenes de microvesículas conjugadas con microperlas.
En un aspecto, también se describe un método de producción de un complejo sustrato -microvesícula estable, que comprende poner en contacto un sustrato con una microvesícula, en el que el sustrato se funcionaliza con un grupo químico capaz de unirse directamente a al menos un componente presente en la superficie de la microvesícula. El sustrato puede ser una perla, un pocillo, una matriz, por ejemplo, una matriz de gel en una columna, o un sustrato plano. El grupo químico puede comprender cualquier grupo químico útil que pueda unir una microvesícula a una perla, como los descritos anteriormente. Por ejemplo, el grupo químico puede comprender, sin limitación, un peptoide, ADNz, ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA), lectina, péptido/polipéptido, dendrímero, agente marcador de proteína de membrana, compuesto químico, una fotoreticulación, un imidoéster reticulante, suberimidato de dimetilo, un reticulante lipídico, un reticulante de éster de N-hidroxisuccinimida, suberato de bissulfosuccinimidilo (BS3), un aldehído, acroleína, crotonaldehído, formaldehído, un reticulante de carbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DDC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC o EDAC), succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), un sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometilo) ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC), un Sulfo-N-hidroxisuccinimidil-2-(6-[biotinamido]-2-(p-azidobenzamido)-hexanoamido) etil-1,3'-ditiopropionato (Sulfo-SBED), metanotiosulfonato de 2-[N2-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil)-N6-(6-biotina-amidocaproil)-L-lisinil]etilo (Mts-Atf- biotina; disponible de Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford IL.), 2-{N2-[N6-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil-6-amino-caproil)-N6-(6-biotinamidocaproil)- Llysinylamido]} metanetiosultonato de etilo (Mts-Atf -LC-Biotina; disponible de Thermo Fisher Scientific Inc), un aminoácido fotorreactivo (por ejemplo, L-foto-leucina y L-foto-metionina, véase, por ejemplo, Suchanek, M., et al. (2005). La foto-leucina y la foto-metionina permiten la identificación de interacciones proteínaproteína. Nat. Methods 2:261-267), un reticulante de N-hidroxisuccinimida (NHS), un reactivo NHS-azida (por ejemplo, NHS-Azida, NHS-PEG4-Azida, NHS-PEG12-Azida; cada uno disponible en Thermo Fisher Scientific, Inc.), un reactivo NHS-fosfina (por ejemplo, NHS-fosfina, Sulfo-NHS-fosfina; cada uno disponible en Thermo Fisher Scientific, Inc.), o una combinación de los mismos. El grupo químico puede no incluir anticuerpos o aptámeros. El grupo químico puede comprender un grupo funcional como el divulgado en este documento, incluyendo, sin limitación, un hidrocarburo, un halógeno, un grupo que contiene oxígeno (es decir, enlaces CO), un grupo que contiene nitrógeno, un grupo que contiene azufre, un grupo que contiene fósforo, un grupo que contiene boro, un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo hidroxilo, un grupo hidrazida, un grupo clorometilo o una combinación de los mismos. El al menos un componente puede comprender cualquier componente biológico útil tal como se divulga en este documento, incluyendo, sin limitación, un péptido, polipéptido, proteína, lípido, carbohidrato, un derivado del mismo o una combinación de los mismos.
En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona un método de aislamiento de una microvesícula de una muestra que comprende poner en contacto una muestra biológica con un sustrato dispuesto con una unidad estructural de lípido que es capaz de formar un complejo con una microvesícula, dividir cualquier complejo formado a partir de la muestra, aislando así la microvesícula. En este documento también se describe un complejo aislado, comprendiendo el complejo un sustrato sintético unido directamente a una unidad estructural de lípido que forma un complejo con una microvesícula tal como en la figura 10B. Una unidad estructural de lípido (también denominada “anclaje lipídico” se puede incorporar a un sustrato fijo, tal como una hoja plana o una esfera, que luego se usa como reactivo para separar o aislar una microvesícula de una muestra biológica de origen (Figura 10B). El sustrato se une al anclaje lipídico a través de un enlace covalente directo (tal como a través de un enlace amida) o el anclaje lipídico se funcionaliza para unirse al sustrato indirectamente, tal como mediante el uso de estreptavidina o avidina (Figura 10B). La muestra biológica usada en los métodos de la invención puede ser cualquier fluido biológico de un sujeto o de un cultivo celular, incluyendo, sin limitación, sangre, plasma, suero, medios de cultivo celular (ya sean crudos o clarificados). Ejemplos de anclajes lipídicos que se pueden incorporar en la práctica los métodos de la invención o la fabricación de las composiciones de la invención incluyen los divulgados en este documento o en las Publicaciones de la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos que tienen los siguientes números de referencia: 2013/0035371, 2012/0264810, 2012/0101148, 2012/0027803; o la Patente de los Estados Unidos No. 6,986,902.
También se describen en este documento kits que comprenden uno o más reactivos para llevar a cabo los métodos anteriores. El uno o más reactivos puede comprender una biblioteca de agentes de unión potenciales que comprende uno o más de un aptámero, anticuerpo y otros agentes de unión útiles divulgados en este documento o conocidos en la técnica. El uno o más reactivos pueden comprender un aptámero identificado por los métodos anteriores. El uno o más reactivos pueden comprender un complejo sustrato-microvesículas y/o un reactivo que forma parte de dicho complejo, por ejemplo, un enlazante o un reticulante como se describe en este documento. El kit puede comprender componentes divulgados en este documento útiles para formar complejos microvesícula-sustrato mediante diversos métodos, por ejemplo, mediante conjugación directa, anclaje de lípidos, unión de anticuerpos y/o unión de aptámeros.
Selección de aptámeros negativos y positivos
Los aptámeros se pueden usar en diversos ensayos biológicos, incluidos numerosos tipos de ensayos que se basan en un agente de unión. Por ejemplo, los aptámeros se pueden usar en lugar de o junto con anticuerpos en ensayos basados en el sistema inmunitario. Un método de cribado de aptámeros descrito en este documento que identifica aptámeros que no se unen a ninguna superficie (sustratos, tubos, filtros, perlas, otros antígenos, etc.) a lo largo de las etapas del ensayo y se unen específicamente a un antígeno de interés. El ensayo se basa en la selección negativa para retirar los aptámeros que se unen a componentes antigénicos no diana del ensayo final. La selección negativa va seguida de una selección positiva para identificar los aptámeros que se unen al antígeno deseado.
Un método de identificación de un aptámero específico para una diana de interés descrito en este documento, comprendiendo el método (a) poner en contacto un grupo de aptámeros candidatos con uno o más componentes del ensayo, en el que los componentes del ensayo no comprenden la diana de interés; (b) recuperar los miembros del grupo de aptámeros candidatos que no se unen a uno o más componentes del ensayo en (a); (c) poner en contacto a los miembros del grupo de aptámeros candidatos recuperados en (b) con la diana de interés en presencia de una o más dianas de confusión; y (d) recuperar un aptámero candidato que se une a la diana de interés en la etapa (c), identificando así el aptámero específico a la diana de interés. En el método, las etapas (a) y (b) proporcionan una selección negativa para retirar los aptámeros que se unen a entidades que no son diana. Por el contrario, las etapas (c) y (d) proporcionan una selección positiva identificando aptámeros que se unen a la diana de interés pero no a otras dianas de confusión, por ejemplo, otros antígenos que pueden estar presentes en una muestra biológica que comprende la diana de interés. El grupo de aptámeros candidatos puede comprender al menos 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019o al menos 1020 secuencias de ácido nucleico. Un medio de realizar el método se ilustra en detalle en el ejemplo 9.
Las etapas (a)-(b) pueden ser opcionales. Las etapas (a)-(b) se pueden repetir al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o al menos 20 veces antes de realizar la selección positiva en la etapa (c). La selección positiva también se puede realizar en múltiples rondas. Las etapas (c)-(d) se pueden repetir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o al menos 20 veces antes de identificar el aptámero específico a la diana de interés. Múltiples rondas pueden proporcionar una mayor rigurosidad de selección.
El uno o más componentes del ensayo que se ponen en contacto con el grupo de aptámeros, durante la selección negativa pueden comprender uno o más de un sustrato, una perla, una matriz plana, una columna, un tubo, un pocillo o un filtro. Un experto apreciará que los componentes del ensayo pueden incluir cualquier sustancia que pueda formar parte de un ensayo biológico.
La diana de interés puede ser cualquier entidad apropiada que se pueda detectar cuando es reconocida por un aptámero. La diana de interés comprende una proteína o polipéptido. Como se usa en este documento, “proteína", “polipéptido” y “péptido” se usan indistintamente a menos que se indique lo contrario. La diana de interés puede ser un ácido nucleico, incluidos el ADN, el ARN y diversas subespecies de cualquiera de los mismos, como se divulga en este documento o se conoce en la técnica. La diana de interés puede comprender un lípido. La diana de interés puede comprender un carbohidrato. La diana de interés también puede ser un complejo, por ejemplo, un complejo que comprende proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y/o carbohidratos. La diana de interés puede comprender una microvesícula. En tales casos, el aptámero puede ser un agente de unión a un antígeno de superficie de microvesícula, por ejemplo, una proteína. Los antígenos de superficie de microvesículas generales incluyen tetraspanina, CD9, CD63, CD81, CD63, CD9, CD81, CD82, CD37, CD53, Rab-5b, Anexina V y MFG-E8. En la tabla 3 en este documento se proporcionan antígenos de superficie de microvesículas generales adicionales.
El antígeno de superficie de microvesículas también puede ser un biomarcador de una enfermedad o trastorno. En tales casos, el aptámero se puede usar para proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, una o más proteínas pueden comprender uno o más de PSMA, PCSA, B7H3, EpCam, ADAM-10, BCNP, EGFR, IL1B, KLK2, MMP7, p53, PBP, SERPINB3, SPDEF, SSX2 y SSX4. Estos marcadores se pueden usar para detectar un cáncer de próstata. En las tablas 3-4 en este documento se proporcionan antígenos de superficie de microvesículas adicionales.
La una o más dianas de confusión pueden ser un antígeno distinto de la diana de interés. Por ejemplo, una diana de confusión puede ser otra entidad que puede estar presente en una muestra que se va a analizar. Como ejemplo no limitante, considérese que la muestra que se va a evaluar es una muestra de plasma de un individuo. La diana de interés puede ser una proteína, por ejemplo, un antígeno de superficie de microvesículas, que está presente en la muestra. En este caso, se podría seleccionar una diana de confusión de cualquier otro antígeno que probablemente esté presente en la muestra de plasma. De acuerdo con lo anterior, la selección positiva debe proporcionar aptámeros candidatos que reconozcan la diana de interés pero que tengan interacciones mínimas, si las hay, con las dianas de confusión. La diana de interés y la una o más dianas de confusión pueden comprender el mismo tipo de entidad biológica, por ejemplo, todas las proteínas, todos los ácidos nucleicos, todos los carbohidratos o todos los lípidos. Como ejemplo no limitante, la diana de interés puede ser una proteína seleccionada del grupo que consiste en SSX4, SSX2, PBP, KLK2, SPDEF y EpCAM, y la una o más dianas de confusión comprende los otros miembros de este grupo. La diana de interés y la una o más dianas de confusión pueden comprender diferentes tipos de entidades biológicas, por ejemplo, cualquier combinación de proteína, ácido nucleico, carbohidrato y lípidos. La una o más dianas de confusión también pueden comprender diferentes tipos de entidades biológicas, por ejemplo, cualquier combinación de proteína, ácido nucleico, carbohidrato y lípidos.
En este documento se describe un polinucleótido aislado, o un fragmento del mismo, identificado por los métodos anteriores. También se describe en este documento un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que es al menos un 60 % idéntica a la secuencia de nucleótidos identificada por los métodos anteriores. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada es al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, idéntica a la secuencia de nucleótidos identificada por los métodos anteriores. En el caso de un polinucleótido aislado que es más largo o equivalente en longitud a la secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia identificada por los métodos anteriores, la comparación se realiza con la longitud completa de la secuencia de referencia. Cuando el polinucleótido aislado es más corto que la secuencia de referencia, por ejemplo, más corto que una secuencia identificada por los métodos anteriores, la comparación se realiza con un segmento de la secuencia de referencia de la misma longitud (excluyendo cualquier bucle requerido por el cálculo de homología).
También se describe en este documento un método de selección de un grupo de aptámeros, que comprende: (a) poner en contacto un grupo de aptámeros con una población de microvesículas de una primera muestra; (b) enriquecer un subgrupo de aptámeros que muestran afinidad con la población de microvesículas de la primera muestra; (c) poner en contacto el subgrupo con una segunda población de microvesículas de una segunda muestra; y (d) agotar un segundo subgrupo de aptámeros que muestran afinidad por la segunda población de microvesículas de la segunda muestra, seleccionando así el grupo de aptámeros que tienen afinidad preferencial por la población de microvesículas de la primera muestra.
La primera muestra y/o la segunda muestra pueden comprender un fluido biológico tal como se divulga en este documento. Por ejemplo, el fluido biológico puede incluir, sin limitación, sangre, un derivado de la sangre, plasma, suero u orina. La primera muestra y/o la segunda muestra también se pueden derivar de un cultivo celular.
La primera muestra puede comprender una muestra de cáncer y la segunda muestra puede comprender una muestra de control, tal como una muestra no cancerosa. La primera muestra y/o la segunda muestra cada una puede comprender una muestra agrupada. Por ejemplo, la primera muestra y/o la segunda muestra pueden comprender fluido corporal de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más de 100 personas. En tales casos, los miembros de un grupo se pueden elegir para representar un fenotipo deseado. En un ejemplo no limitante, los miembros del primer grupo de muestras pueden ser de pacientes con cáncer y los miembros del segundo grupo de muestras pueden ser de controles sin cáncer.
Las etapas (a)-(d) se pueden repetir un número deseado de veces para enriquecer aún más el grupo en aptámeros que tienen una afinidad preferencial por la población de microvesículas de la primera muestra. Por ejemplo, las etapas (a)-(d) se pueden repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de 20 veces. La salida de la etapa (d) se puede usar como entrada para repetir la etapa (a). La primera muestra y/o la segunda muestra se pueden reemplazar con una muestra diferente antes de repetir las etapas (a)-(d). En un ejemplo no limitante, los miembros de un primer grupo de muestras pueden ser de pacientes con cáncer y los miembros de un segundo grupo de muestras pueden ser de controles sin cáncer. Durante las repeticiones posteriores de las etapas (a)-(d), el primer grupo de muestras puede comprender muestras de diferentes pacientes con cáncer que en la(s) ronda(s) anterior(es). De manera similar, el segundo grupo de muestras puede comprender muestras de diferentes controles a los de la ronda o rondas anteriores.
El método puede comprender además identificar los miembros del grupo seleccionado de aptámeros, por ejemplo, mediante secuenciación de ADN. La secuenciación se puede realizar mediante secuenciación de última generación según se desee.
El método también puede comprender identificar las dianas del grupo seleccionado de aptámeros. En este documento se divulgan métodos de identificación de dianas de aptámeros.
La figura 13A ilustra un esquema 1300 para rondas positivas y opcionalmente negativas de cribado de una biblioteca de oligonucleótidos frente a una diana de interés. Se proporciona un grupo de bibliotecas de candidatos oligo 1301. El grupo de aptámeros candidatos oligo puede comprender cualquier número de miembros deseados, por ejemplo, al menos 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019 o al menos 1020 secuencias de ácido nucleico. Para realizar la selección positiva, los oligos se ponen en contacto con la diana 1302 de interés. La diana de interés puede ser cualquier entidad apropiada que se pueda detectar cuando la reconoce un aptámero. La diana de interés puede comprender una proteína o polipéptido, un ácido nucleico, incluidos ADN, ARN y diversas subespecies de los mismos, un lípido, un carbohidrato, un complejo, por ejemplo, un complejo que comprende proteína, ácidos nucleicos, lípidos y/o carbohidratos. La diana de interés puede comprender una microvesícula. La diana se puede inmovilizar en un sustrato usando métodos divulgados en este documento (véanse, por ejemplo, los ejemplos 28-31) o conocidos en la técnica. La mezcla se lava para retirar los oligos no unidos y luego los oligos se disocian de la mezcla lavada y se recolectan 1303. Los oligos recolectados se pueden usar como entrada para una nueva ronda de unión a la diana, que se puede repetir cualquier número de veces (indicado como 1...n). Por ejemplo, la selección positiva se puede repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de 20 veces. Entre rondas de selección positiva, se realiza opcionalmente una selección negativa en la que los oligos se ponen en contacto con una o más entidades 1304 no diana. La entidad no diana puede ser cualquier entidad que pueda interferir con la unión específica de los aptámeros resultantes a la diana de interés, incluyendo, sin limitación, otras entidades biológicas, dianas no específicas de enfermedades y diversos componentes de ensayo (sustratos, tubos, etc.). Durante la selección negativa, los oligos que no se unen a una o más entidades no diana se retienen y se usan como entrada para una nueva ronda de selección 1302 positiva. Esta etapa sirve para retirar los oligos que tienen afinidad por las entidades no diana. Los oligos recolectados después del número deseado de rondas de selección 1303 positiva y/o selección 1304 negativa se recolectan como aptámeros candidatos que se indica que se unen a la diana 1305 de interés.
La figura 13B ilustra uno de tales esquemas para la selección de aptámeros frente a muestras de cáncer contra muestras de control no cancerosas. El esquema muestra 8 muestras de cáncer (Ca1-Ca8) y 7 muestras de control (nCa1-nCa7), cada una de las cuales consiste en muestras individuales o muestras agrupadas. Siete selecciones diferentes (Selección 1-Selección 7) se analizan en paralelo. En cada selección, un grupo de entrada de aptámeros candidatos se enriquece en aptámeros frente a una de las muestras de cáncer ("selección positiva"), y luego el grupo se agota en aptámeros frente a una de las muestras de control ("selección negativa"). Este procedimiento se repite como se indica. El orden de las muestras se modifica en cada selección para evitar sesgos de selección. Los aptámeros que quedan después de la última ronda de selección positiva comprenden los aptámeros seleccionados, que luego pueden desarrollarse más, por ejemplo, como parte de un ensayo para diferenciar las muestras cancerosas de las no cancerosas. Los grupos de aptámeros se pueden secuenciar después de cada ronda para rastrear el enriquecimiento, el agotamiento, los posibles problemas, etc.
Identificación de dianas de aptámeros
Los métodos y kits anteriores se pueden usar para identificar agentes de unión que diferencian entre dos poblaciones de biomarcadores. También se describen métodos de identificación de las dianas de los agentes de unión, como se describe en esta sección. Por ejemplo, los métodos pueden comprender además la identificación de un marcador de superficie de una microvesícula diana que es reconocida por el agente de unión.
En este documento se describe un método de identificación de una diana de un agente de unión, comprendiendo el método: (a) poner en contacto el agente de unión con la diana para unir la diana con el agente de unión, en el que la diana comprende un antígeno de superficie de una microvesícula; (b) romper la microvesícula en condiciones que no interrumpan la unión de la diana con el agente de unión; (c) aislar el complejo entre la diana y el agente de unión; y (d) identificar la diana unida por el agente de unión. El agente de unión puede ser un agente de unión identificado por los métodos anteriores, por ejemplo, un aptámero, ligando, anticuerpo u otro agente de unión útil que pueda diferenciar entre dos poblaciones de biomarcadores.
Un esquema ilustrativo para llevar a cabo el método se muestra en la figura 14. La figura muestra un agente 1402 de unión, en este documento un aptámero con fines ilustrativos, atado a un sustrato 1401. El agente 1402 de unión se puede unir covalentemente al sustrato 1401. El agente 1402 de unión también se puede unir de forma no covalente. Por ejemplo, el agente 1402 de unión puede comprender una etiqueta que puede atraerse al sustrato, tal como un grupo de biotina que puede formar un complejo con una molécula de avidina/estreptavidina que está unida covalentemente al sustrato. Esto puede permitir que se forme un complejo entre el aptámero y la microvesícula mientras están en solución, seguido de la captura del aptámero usando la etiqueta de biotina. El agente 1402 de unión se une a un antígeno 1403 de superficie de microvesícula 1404. En la etapa indicada por la flecha (i), la microvesícula se rompe dejando intacto el complejo entre el agente 1402 de unión y el antígeno 1403 de superficie. La microvesícula 1405 rota se retira, por ejemplo, mediante lavado o intercambio de solución reguladora, en la etapa indicada por la flecha (ii). En la etapa indicada por la flecha (iii), el antígeno 1403 de superficie se libera del agente 1402 de unión. El antígeno 1403 de superficie se puede analizar para determinar su identidad usando métodos divulgados en este documento y/o conocidos en la técnica. La diana del método puede ser cualquier entidad biológica útil asociada con una microvesícula. Por ejemplo, la diana puede comprender una proteína, ácido nucleico, lípido o carbohidrato, u otra entidad biológica divulgada en este documento o conocida en la técnica.
La diana se puede reticular con el agente de unión antes de romper la microvesícula. Sin estar ligado a la teoría, esta etapa puede ayudar a mantener el complejo entre el agente de unión y la diana mientras se rompe la vesícula. Se puede usar cualquier método útil de reticulación divulgado en este documento o conocido en la técnica. La reticulación puede comprender fotorreticulación, un reticulante de imidoéster, suberimidato de dimetilo, un reticulante de éster de N-hidroxisuccinimida, suberato de bissulfosuccinimidilo (BS3), un aldehído, acroleína, crotonaldehído, formaldehído, un reticulante de carbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DDC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC o EDAC), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), un sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC), un sulfo-N-hidroxisuccinimidil-2-(6-[biotinamido]-2-(p-azido benzamido)-hexanoamido) etil-1,3'-ditiopropionato (Sulfo-SBED), 2-[N2-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil)-N6-(6-biotina-amidocaproil)-L-lisinil]etilmetanotiosulfonato (Mts-Atf-Biotina; disponible de Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford IL.), metanotiosultonato de 2-{N2-[N6-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil-6-amino-caproil)-N6-(6-biotinamidocaproil)-L-lisinilamido]}etilo (Mts-Atf-LC-biotina; disponible de Thermo Fisher Scientific Inc), un aminoácido fotorreactivo (por ejemplo, L-foto-leucina y L-foto-metionina, véase, por ejemplo, Suchanek, M., et al. (2005). La foto-leucina y la foto-metionina permiten la identificación de interacciones proteína-proteína. Nat. Methods 2:261-267), un reticulante de N-hidroxisuccinimida (NHS), un reactivo de NHS-azida (por ejemplo, NHS-azida, NHS-PEG4-azida, NHS-PEG12-azida; cada uno disponible de Thermo Fisher Scientific, Inc.), un reactivo NHS-fosfina (por ejemplo, NHS-fosfina, Sulfo-NHS-fosfina; cada uno disponible de Thermo Fisher Scientific, Inc.), o cualquier combinación o modificación de los mismos.
Se puede usar una variedad de métodos para romper la microvesícula. Por ejemplo, la membrana de la vesícula se puede romper usando fuerzas mecánicas, agentes químicos o una combinación de los mismos. La interrupción de la microvesícula puede comprender el uso de uno o más de un detergente, un surfactante, un disolvente, una enzima o cualquier combinación útil de los mismos. La enzima puede comprender una o más de lisozima, lisostafina, zimolasa, celulasa, mutanolisina, una glicanasa, una proteasa y manasa. El detergente o surfactante puede comprender uno o más de un octiltioglucósido (OTG), octil beta-glucósido (OG), un detergente no iónico, Triton X, Tween 20, un alcohol graso, un alcohol cetílico, un alcohol estearílico, alcohol cetoestearílico, un alcohol oleílico, un éter alquílico de polioxietilenglicol (Brij), éter monododecílico de octaetilenglicol, éter monododecílico de pentaetilenglicol, un éter alquílico de polioxipropilenglicol, un éter alquílico de glucósido, decilglucósido, laurilglucósido, octilglucósido, un octilfenoléter de polioxietilenglicol, un polioxietilenglicol éter de alquilfenol, nonoxinol-9, un éster de alquilo de glicerol, laurato de glicerilo, ésteres de alquilo de sorbitán de polioxietilenglicol, polisorbato, un éster de alquilo de sorbitán, cocamida MEA, cocamida DEA, óxido de dodecildimetilamina, copolímeros en bloque de polietilenglicol y polipropilenglicol, poloxámeros, amina de sebo polietoxilada (POEA), un detergente zwitteriónico, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), un sulfonato de alquilbenceno lineal (LAS), un etoxilato de fenol de alquilo (APE), cocamidopropil hidroxisultaína, una betaína, cocamidopropil betaína, lecitina, un detergente iónico, dodecilsulfato de sodio (SDS), bromuro de cetrimonio (CTAB), cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC), diclorhidrato de octenidina, cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de benzalconio (BAC), cloruro de bencetonio (BZT), 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxano, cloruro de dimetildioctadecilamonio, bromuro de dioctadecildimetilamonio (DODAB), desoxicolato de sodio, nonilfenoxipolietoxiletanol (Tergitol-tipo NP-40; NP-40), laurilsulfato de amonio, sulfato de laureth de sodio (sulfato de lauril éter de sodio (SLES)), mireth sulfato de sodio, un carboxilato de alquilo, estearato de sodio, lauroil sarcosinato de sodio, un fluorosurfactante a base de carboxilato, perfluorononanoato, perfluorooctanoato (PFOA o PFO) y un biosurfactante. Los métodos mecánicos de disrupción que se pueden usar comprenden, sin limitación, cizalla mecánica, molienda en perlas, homogeneización, microfluidización, sonicación, prensa francesa, impacto, molino coloidal, descompresión, choque osmótico, termólisis, congelación-descongelación, desecación o cualquier combinación de los mismos.
Como se muestra en la figura 14, el agente de unión se puede atar a un sustrato. El agente de unión se puede atar antes o después de que se forme el complejo entre el agente de unión y la diana. El sustrato puede ser cualquier sustrato útil tal como se divulga en este documento o se conoce en la técnica. El sustrato puede comprender una microesfera. El sustrato puede comprender un sustrato plano. El agente de unión también se puede marcar. Aislar el complejo entre la diana y el agente de unión puede comprender capturar el agente de unión a través de la etiqueta. Por ejemplo, la etiqueta puede ser una etiqueta de biotina. En tales casos, el agente de unión se puede unir al sustrato a través de un evento de unión de biotina-avidina.
Los métodos de identificación de la diana después de la liberación del agente de unión dependerán del tipo de diana de interés. Por ejemplo, cuando la diana comprende una proteína, identificar la diana puede comprender el uso de espectrometría de masas (MS), huellas dactilares de masas peptídicas (PMF; huellas dactilares de proteínas), secuenciación, análisis de aminoácidos N-terminal, análisis de aminoácidos C-terminal, degradación de Edman, cromatografía, electroforesis, electroforesis en gel bidimensional (gel 2D), matriz de anticuerpos e inmunoensayo. Los ácidos nucleicos se pueden identificar mediante secuenciación.
Un experto apreciará que el método se puede usar para identificar cualquier diana adecuada, incluidos aquellos no asociados con una vesícula. Por ejemplo, con respecto a la figura 14, todas las etapas excepto la etapa indicada por la flecha (i) (es decir, romper la microvesícula), se podrían realizar para una diana circulante tal como una proteína, ácido nucleico, lípido, carbohidrato o una combinación de los mismos.
Caracterización de muestras
Los aptámeros descritos en este documento se pueden usar para caracterizar una muestra biológica. Por ejemplo, se puede usar un aptámero para unir un biomarcador en la muestra. La presencia o nivel del biomarcador unido puede indicar una característica del ejemplo, tal como un diagnóstico, pronóstico o teranosis de una enfermedad o trastorno asociado con la muestra.
En un aspecto, la invención proporciona un método de caracterización de una enfermedad o trastorno, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de prueba biológica con uno o más aptámeros de la invención; (b) detectar una presencia o nivel de un complejo entre uno o más aptámeros y la diana unida por el uno o más aptámeros en la muestra de prueba biológica formada en la etapa (a); (c) poner en contacto una muestra de control biológico con el uno o más aptámeros; (d) detectar una presencia o nivel de un complejo entre el uno o más aptámeros y la diana unida por el uno o más aptámeros en la muestra de control biológico formada en la etapa (c); y (e) comparar la presencia o el nivel detectado en las etapas (b) y (d), caracterizando así la enfermedad o trastorno. El uno o más aptámeros pueden comprender cualquier aptámero útil para caracterizar la enfermedad o el trastorno, por ejemplo, los aptámeros que comprenden cualquiera de las SEQ ID NOs. 1-241535 en este documento, una modificación útil, o un fragmento funcional de la misma.
La muestra de prueba biológica y la muestra de control biológico cada una puede comprender una muestra de tejido, un cultivo celular o un fluido biológico. En algunas realizaciones, la muestra de prueba biológica y la muestra de control biológico comprenden el mismo tipo de muestra, por ejemplo, ambas son muestras de tejido o ambas son muestras de fluidos. En otras realizaciones, se pueden usar diferentes tipos de muestras para las muestras de prueba y de control. Por ejemplo, la muestra de control puede comprender una muestra manipulada o artificial.
El fluido biológico puede comprender un fluido corporal. El fluido corporal puede incluir, sin limitación, uno o más de sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido de Cowper o líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural y peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción de la mucosa, agua de las heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades de los senos paranasales, aspirados broncopulmonares, líquido de la cavidad del blastocisto o sangre del cordón umbilical. En algunas realizaciones, el fluido corporal comprende sangre, suero o plasma.
El fluido biológico puede comprender microvesículas. Por ejemplo, el fluido biológico puede ser un tejido, un cultivo celular o un fluido corporal que comprenda microvesículas liberadas de las células de la muestra. Las microvesículas pueden ser microvesículas circulantes.
El uno o más aptámeros se pueden unir a un biomarcador diana, por ejemplo, un biomarcador útil para caracterizar la muestra. El biomarcador puede comprender un polipéptido o un fragmento del mismo, u otro biomarcador útil descrito en este documento o conocido en la técnica (lípido, carbohidrato, complejo, ácido nucleico, etc.). En realizaciones, el polipéptido o fragmento del mismo es soluble o está unido a la membrana. Los polipéptidos unidos a membrana pueden comprender un antígeno de superficie celular o un antígeno de superficie de microvesículas. El biomarcador puede ser un biomarcador seleccionado de la tabla 3 o la tabla 4.
La caracterización puede comprender un diagnóstico, pronóstico o teranosis de la enfermedad o trastorno. Se pueden caracterizar diversas enfermedades y trastornos usando las composiciones y los métodos descritos en este documento, incluyendo, sin limitación, un cáncer, una afección premaligna, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad inmunitaria, una enfermedad o trastorno autoinmune, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno neurológico, una enfermedad infecciosa y/o dolor. Véase la sección “fenotipos” en este documento para obtener más detalles. En realizaciones, la enfermedad o trastorno comprende una enfermedad o trastorno proliferativo o neoplásico. Por ejemplo, la enfermedad o trastorno puede ser un cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer comprende cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, melanoma o cáncer de cerebro.
La figura 15A es un esquema 1500 que muestra una configuración de ensayo que se puede usar para detectar y/o cuantificar una diana de interés usando uno o más aptámeros descritos en este documento. El aptámero 1502 de captura se une al sustrato 1501. El sustrato puede ser un sustrato plano, pocillo, microperla u otro sustrato útil como se divulga en este documento o se conoce en la técnica. La diana 1503 de interés está unida por el aptámero 1502 de captura. La diana de interés puede ser cualquier entidad apropiada que se pueda detectar cuando es reconocida por un aptámero u otro agente de unión. La diana de interés puede comprender una proteína o polipéptido, un ácido nucleico, incluidos ADN, ARN y diversas subespecies de los mismos, un lípido, un carbohidrato, un complejo, por ejemplo, un complejo que comprende proteína, ácidos nucleicos, lípidos y/o carbohidratos. En algunas realizaciones, la diana de interés comprende una microvesícula. La diana de interés puede ser un antígeno de superficie de microvesículas. La diana de interés puede ser un biomarcador, incluido un biomarcador asociado a vesículas, en las tablas 3 o 4. La entrada de microvesículas se puede aislar de una muestra usando diversas técnicas como se describe en este documento, por ejemplo, cromatografía, filtración, centrifugación, citometría de flujo, captura por afinidad (por ejemplo, a una superficie plana, columna o perla) y/o usando microfluidos. El aptámero 1504 de detección también está unido a la diana 1503 de interés. El aptámero 1504 de detección lleva la etiqueta 1505 que se puede detectar para identificar la diana capturada en el sustrato 1501 a través del aptámero 1502 de captura. La etiqueta puede ser una etiqueta fluorescente, radiomarcada, enzimática u otra etiqueta detectable como se divulga en este documento. Ya sea el aptámero 1502 de captura o el aptámero 1504 de detección se pueden sustituir con otro agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo. Por ejemplo, la diana se puede capturar con un anticuerpo y detectar con un aptámero, o viceversa. Cuando la diana de interés comprende un complejo, los agentes de captura y detección (aptámero, anticuerpo, etc.) pueden reconocer la misma o diferentes dianas. Por ejemplo, cuando la diana es una microvesícula, el agente de captura puede reconocer un antígeno de superficie de microvesícula mientras que el agente de detección reconoce otro antígeno de superficie de microvesícula. Alternativamente, los agentes de captura y detección pueden reconocer el mismo antígeno de superficie.
La configuración anterior comprende un formato de ensayo “sándwich” que puede comprender un formato de inmunoensayo tal como ELISA o ensayo de microperlas. En otras realizaciones, la diana 1503 de interés no se captura en un sustrato sino que se detecta en solución. En tales casos, el aptámero 1504 de detección se puede poner en contacto con la diana de interés y detectarse directamente en solución, por ejemplo, usando un ensayo de citometría de flujo o similar.
Grupos de aptámeros para caracterizar una muestra
En un aspecto, la invención proporciona un método de caracterización de una muestra poniendo en contacto la muestra con un grupo de diferentes aptámeros y determinando la frecuencia a la que diversos aptámeros en el grupo se unen a la muestra. Por ejemplo, se identifica un grupo de aptámeros que se unen preferentemente a microvesículas de pacientes con cáncer en comparación con pacientes sin cáncer. Se recoge una muestra de prueba, por ejemplo, de un paciente del que se sospecha que tiene cáncer, y se pone en contacto con el grupo de aptámeros. Los aptámeros que se unen a la muestra de prueba se eluyen de la muestra de prueba, se recolectan e identifican, y la composición de los aptámeros unidos se compara con los que se sabe que se unen a las muestras de cáncer. Se pueden usar diversas técnicas de secuenciación, amplificación e hibridación para identificar los aptámeros eluidos. Cuando se usa un gran grupo de aptámeros, la identificación de aptámeros se puede realizar mediante secuenciación de alto rendimiento o mediante hibridación. Si la muestra de prueba está unida por el grupo de aptámeros de manera similar (por ejemplo, según lo determinado por métodos de clasificación bioinformática) a las microvesículas de pacientes con cáncer, entonces la muestra de prueba también es indicativa de cáncer. Con este método, se puede usar un grupo de aptámeros que se unen a uno o más antígenos de microvesículas para caracterizar la muestra sin conocer necesariamente la diana precisa de cada miembro del grupo de aptámeros. Los ejemplos 23-24 en este documento ilustran una realización de la invención.
En un aspecto, la invención proporciona un método de caracterización de una condición para una muestra de prueba que comprende: poner en contacto una muestra de microvesículas con una pluralidad de aptámeros de oligonucleótidos capaces de unirse a una o más dianas presentes en dicha muestra de microvesículas, identificar un conjunto de oligonucleótidos que forman un complejo con la muestra en el que el conjunto está predeterminado para caracterizar una condición para la muestra, caracterizando así una condición para una muestra.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método de identificación de un conjunto de aptámeros de oligonucleótidos asociados con una muestra de prueba, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de microvesículas con una pluralidad de oligonucleótidos, aislar un conjunto de oligonucleótidos que forman un complejo con la muestra de microvesículas, (b) determinar la secuencia y/o el número de copias para cada uno de los oligonucleótidos, identificando así un conjunto de oligonucleótidos asociados con la muestra de prueba.
En aun otro aspecto relacionado, la invención proporciona un método de diagnóstico de una muestra como cancerosa o predispuesta a ser cancerosa, que comprende poner en contacto una muestra de microvesículas con una pluralidad de aptámeros de oligonucleótidos que están predeterminados para formar preferentemente un complejo con microvesículas de una muestra cancerosa en comparación con las microvesículas de una muestra no cancerosa.
Los oligonucleótidos se pueden identificar mediante secuenciación, por ejemplo, mediante secuenciación de terminación de colorante (Sanger) o métodos de alto rendimiento. Los métodos de alto rendimiento pueden comprender técnicas para secuenciar rápidamente una gran número de ácidos nucleicos, incluidas las técnicas de última generación, tales como la secuenciación de firmas masivamente paralelas (MPSS; secuenciación Polony; pirosecuenciación 454; secuenciación Illumina (Solexa); secuenciación SOLiD; secuenciación de semiconductores Ion Torrent; secuenciación de ADN de nanoesferas; secuenciación de molécula única con helioscopio; secuenciación de molécula única en tiempo real (SMRT), u otros métodos tales como la secuenciación de ADN con nanoporos; secuenciación de ADN con corrientes de túnel; secuenciación por hibridación; secuenciación con espectrometría de masas; secuenciación microfluídica de Sanger; técnicas basadas en microscopía; secuenciación de RNAP; secuenciación de alto rendimiento de virus in vitro. Los oligonucleótidos también se pueden identificar mediante técnicas de hibridación. Por ejemplo, se puede usar una micromatriz que tiene locales direccionables para hibridar y, por lo tanto, detectar los diversos miembros del grupo.
La pluralidad o grupo de aptámeros de oligonucleótidos puede comprender cualquier número deseado de aptámeros de oligonucleótidos para permitir la caracterización de la muestra. En diversas realizaciones, el grupo comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o al menos 10000 miembros de oligonucleótidos diferentes.
La pluralidad de aptámeros de oligonucleótidos se puede preseleccionar a través de una o más etapas de selección positiva o negativa, en el que la selección positiva comprende la selección de oligonucleótidos frente a una muestra que tiene características sustancialmente similares en comparación con la muestra de prueba, y en el que la selección negativa comprende la selección de oligonucleótidos frente a una muestra que tiene características sustancialmente diferentes en comparación con la muestra de prueba. Las características sustancialmente similares significan que las muestras usadas para la selección positiva son representativas de la muestra de prueba en una o más características de interés. Por ejemplo, las muestras usadas para la selección positiva pueden ser de pacientes con cáncer o líneas celulares y la muestra de prueba puede ser una muestra de un paciente que tiene o se sospecha que tiene cáncer. Las características sustancialmente diferentes significan que las muestras usadas para la selección negativa difieren de la muestra de prueba en una o más características de interés. Por ejemplo, las muestras usadas para la selección negativa pueden ser de individuos o líneas celulares que no tienen cáncer (por ejemplo, muestras “normales” o de otro modo “control") y la muestra de prueba puede ser una muestra de un paciente que tiene o se sospecha que tiene un cáncer El cáncer puede ser cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de cerebro u otro cáncer.
Mediante la selección de muestras representativas de los fenotipos deseados para detectar y/o distinguir, la caracterización puede comprender un diagnóstico, pronóstico o teranosis para cualquier número de enfermedades o trastornos. Se pueden caracterizar diversas enfermedades y trastornos usando las composiciones y métodos de la invención, incluyendo, sin limitación, un cáncer, una afección premaligna, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad inmunitaria, una enfermedad o trastorno autoinmune, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno neurológica, una enfermedad infecciosa y/o dolor. Véase la sección “Fenotipos” en este documento para obtener más detalles. La enfermedad o trastorno puede comprender una enfermedad o trastorno proliferativo o neoplásico. La enfermedad o trastorno puede ser un cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer comprende cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, melanoma o cáncer de cerebro.
La figura 15B es un esquema 1510 que muestra el uso de un grupo de aptámeros para caracterizar un fenotipo de una muestra, tal como los enumerados anteriormente. Se proporciona un grupo de aptámeros para una diana de interés 1511. Por ejemplo, el grupo de aptámeros se puede enriquecer para dirigir a una o más microvesículas. Los miembros del grupo se pueden unir a diferentes dianas (por ejemplo, un antígeno de superficie de microvesícula) o diferentes epítopos de la misma diana presente en la una o más microvesículas. El grupo se pone en contacto con una muestra de prueba que se va a caracterizar 1512. Por ejemplo, la muestra de prueba puede ser una muestra biológica de un individuo que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno dado. La mezcla se lava para retirar los aptámeros no unidos. Los aptámeros restantes se eluyen o de otra manera se disocian de la muestra y se recogen 1513. Los aptámeros recogidos se identifican, por ejemplo, mediante secuenciación o hibridación. La presencia y/o el número de copias de los identificados se usa para caracterizar el fenotipo 1514. Por ejemplo, el grupo de aptámeros se puede elegir como aptámeros que reconozcan preferentemente microvesículas desprendidas de células cancerosas. El método se puede emplear para detectar si la muestra retiene aptámeros que se unen a las microvesículas relacionadas con el cáncer, lo que permite que la muestra se caracterice como cancerosa o no.
La figura 15C es un esquema 1520 que muestra una implementación del método de la figura 15B. Se proporciona 1521 un grupo de aptámeros identificados como que se unen a una población de microvesículas. La población de microvesículas se puede aislar de una muestra usando diversas técnicas como se describe en este documento, por ejemplo, cromatografía, filtración, ultrafiltración, centrifugación, ultracentrifugación, citometría de flujo, captura por afinidad (por ejemplo, a una superficie plana, columna o perla), y/o usando microfluidos. La muestra de entrada comprende microvesículas que se aíslan de una muestra 1522 de prueba. Por ejemplo, la muestra de prueba puede ser una muestra biológica de un individuo que padece o se sospecha que padece una enfermedad o trastorno dado. El grupo se pone en contacto con las microvesículas aisladas que se van a caracterizar 1523. La mezcla se lava para retirar los aptámeros no unidos y los aptámeros restantes se eluyen o de otra manera se disocian de la muestra y se recolectan 1524. Los aptámeros recolectados se identifican 1525 y la presencia y/o número de copias de aptámeros retenidos se usa para caracterizar el fenotipo 1526 como antes.
En una realización alternativa a la figura 15C, el grupo de aptámeros 1520 se pone en contacto directamente con una muestra biológica que comprende o se espera que comprenda microvesículas. En lo sucesivo, las microvesículas se aíslan de la muestra y la mezcla se lava para retirar los aptámeros no unidos y los aptámeros restantes se disocian y recogen 1524. Las siguientes etapas se realizan como se indicó anteriormente. Como ejemplo de esta configuración alternativa, una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de sangre, suero o plasma, se pone en contacto directamente con el grupo de aptámeros. A continuación, las microvesículas se aíslan mediante diversas técnicas divulgadas en este documento, que incluyen, sin limitación, ultracentrifugación, ultrafiltración, citometría de flujo, aislamiento por afinidad o similares. A continuación, se identifican los aptámeros restantes, por ejemplo, mediante secuenciación, hibridación o amplificación.
En este documento se describe una composición de la materia, la composición que comprende una pluralidad de oligonucleótidos que se pueden usar para llevar a cabo los métodos que comprenden el uso de un grupo de aptámeros para caracterizar un fenotipo. La pluralidad de oligonucleótidos puede comprender cualquiera de los descritos en este documento, incluidos uno o más de SEQ ID NOs. 1-241535. La pluralidad de oligonucleótidos se puede seleccionar de SEQ ID NOs. 1-230810. La pluralidad de oligonucleótidos se puede seleccionar de SEQ ID NOs. 230811-230899. La pluralidad de oligonucleótidos se puede seleccionar de SEQ ID NOs. 230900-230927, o de SEQ ID NOs. 231018­ 241535. La composición puede comprender cualquiera de estas secuencias. Los oligonucleótidos seleccionados pueden ser capaces de unirse a una pluralidad de dianas presentes en una muestra biológica. La composición puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 o todos los oligonucleótidos enumerados en SEQ ID NOs. 231018-241535. La composición puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 o todos los oligonucleótidos enumerados en SEQ ID NOs. 231018-241535. La composición de la materia también puede comprender uno o más oligonucleótidos expuestos en cualquiera de las tablas 23-24 que son capaces de unirse a una pluralidad de dianas presentes en una muestra biológica. Por ejemplo, la composición puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 oligonucleótidos enumerados en la tabla 23 o la tabla 24. Los oligonucleótidos se pueden usar en los métodos en cuestión para caracterizar una muestra de cáncer, incluyendo, sin limitación, una muestra de cáncer de mama o una muestra de cáncer de próstata.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para realizar una secuenciación de alto rendimiento que comprende: realizar al menos una (i) selección negativa o (ii) una selección positiva de una pluralidad de oligonucleótidos con una muestra de microvesículas; obtener un conjunto de oligonucleótidos para proporcionar un subconjunto de aglutinante negativo o un subconjunto de aglutinante positivo de la pluralidad de oligonucleótidos, en el que el subconjunto de aglutinante negativo de la pluralidad de oligonucleótidos no se une a la muestra de microvesículas y en el que el subconjunto de aglutinante positivo de la pluralidad de oligonucleótidos se une la muestra de microvesículas; poner en contacto el subconjunto de aglutinante negativo o el subconjunto de aglutinante positivo con una muestra de prueba; eluir oligonucleótidos que se unen a la muestra de prueba para proporcionar una pluralidad de oligonucleótidos eluidos; y realizar una secuenciación de alto rendimiento de la pluralidad de oligonucleótidos eluidos para identificar la secuencia y/o el número de copias de los miembros de la pluralidad de oligonucleótidos eluidos. La selección negativa y positiva de la pluralidad de oligonucleótidos usando una muestra de microvesículas se puede realizar como se divulga en este documento. El perfil del aptámero revelado por la secuencia y/o el número de copias de los miembros de la pluralidad de oligonucleótidos eluatos se puede usar para caracterizar un fenotipo de la muestra de prueba como se describe en este documento.
En un aspecto similar, la invención proporciona un método de identificación de oligonucleótidos específicos para una muestra de prueba. El método comprende: (a) enriquecer una pluralidad de oligonucleótidos para una muestra para proporcionar un conjunto de oligonucleótidos predeterminados para formar un complejo con una muestra diana; (b) poner en contacto la pluralidad en (a) con una muestra de prueba para permitir la formación de complejos de oligonucleótidos con la muestra de prueba; (c) recuperar oligonucleótidos que formaron complejos en (b) para proporcionar un subconjunto recuperado de oligonucleótidos; y (d) perfilar el subconjunto recuperado de oligonucleótidos mediante secuenciación o hibridación de alto rendimiento, identificando así los oligonucleótidos específicos para una muestra de prueba. La muestra de prueba puede comprender una pluralidad de microvesículas. Los oligonucleótidos pueden comprender ARN, ADN o ambos. El método puede comprender además realizar un análisis informático para identificar un subconjunto de oligonucleótidos que comprende una identidad de secuencia de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 % de los oligonucleótidos predeterminados para formar un complejo con la muestra diana.
En este documento se describe un kit para facilitar el uso de un grupo de aptámeros para caracterizar un fenotipo. El kit puede comprender un reactivo para llevar a cabo la metodología en cuestión. De manera relacionada, la invención proporciona el uso de un reactivo para llevar a cabo tales métodos. El reactivo puede comprender un aptámero, un grupo de aptámeros o una composición que comprende tales aptámeros como se describe anteriormente.
Controles negativos de ácido nucleico
En este documento se describe una composición de control negativo que comprende un ácido nucleico que no se une a la diana y un sustrato. El ácido nucleico que no se une a la diana puede proporcionarse mediante los métodos de selección descritos anteriormente, en los que el ácido nucleico se identifica como un aptámero que no se une a la diana. Por ejemplo, el aptámero que no se une se puede identificar como un aptámero que no se une a la diana, durante la selección positiva. Se puede predecir que el aptámero que no se une tiene una estructura secundaria mínima o nula. Una vez que se identifica una secuencia de ácido nucleico, su secuencia se puede analizar usando un programa de software para estimar su estructura de plegamiento bidimensional. Los programas y algoritmos de alineación de secuencias bien conocidos para la identificación de motivos se pueden usar para identificar motivos de secuencia y reducir la dimensionalidad incluso de grandes conjuntos de datos de secuencias. Además, los programas de software tales como Vienna y mfold son bien conocidos para los expertos en la técnica de la selección de aptámeros y se pueden usar para agrupar más secuencias en función de motivos de estructura secundaria (formas compartidas).
El ácido nucleico que no se une a la diana se puede asociar con el sustrato. La asociación puede ser mediante unión covalente o no covalente. El ácido nucleico que no se une a la diana se puede conjugar con el sustrato. Se puede realizar un ensayo de detección como se describe en este documento o se conoce en la técnica usando la composición como control negativo. El control negativo se puede usar de cualquier manera apropiada. Por ejemplo, cuando se usa una placa de microtitulación o una matriz plana (véase, por ejemplo, la figura 1A), un pocillo o un área de la matriz se puede poner en contacto con el ácido nucleico que no se une a la diana. El ensayo se puede realizar y cualquier señal resultante del área de la matriz en contacto con el ácido nucleico que no se une a la diana se puede sustraer de la señal del ensayo derivada de la diana. De forma similar, cuando se usa una matriz de microperlas en un ensayo (véase, por ejemplo, la figura 1B), se puede incluir una porción de las perlas en el ensayo que se ponen en contacto con el ácido nucleico que no se une a la diana. El ensayo se puede realizar y cualquier señal que resulte del contacto de las perlas con el ácido nucleico que no se une a la diana se puede sustraer de la señal del ensayo derivada de la diana. Como se indicó, el ácido nucleico que no se une a la diana puede o no conjugarse con el sustrato según se desee.
El ácido nucleico de control negativo que no se une a la diana descrito en este documento puede comprender un ácido nucleico que tiene una secuencia de al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % homóloga a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938­ 231008. Por ejemplo, el ácido nucleico puede tener una secuencia al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % homóloga a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008. El ácido nucleico puede tener la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008, por ejemplo, la SEQ ID NO. 230938. El ácido nucleico se puede usar como un ácido nucleico de control negativo según los métodos y composiciones divulgados en este documento.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método de detección de la presencia o el nivel de una entidad biológica en una muestra biológica sospechosa de contener la entidad biológica, que comprende: (a) proporcionar una composición que comprende un sustrato y una composición de control negativo como se describe anteriormente, en la que el sustrato comprende uno o más agentes de unión a la entidad biológica; (b) poner en contacto la muestra biológica con la composición proporcionada en la etapa (a); (c) detectar una señal diana correspondiente a la cantidad de entidad biológica reconocida por el uno o más agentes de unión en la etapa (b); y (d) normalizar la señal diana detectada en la etapa (c) a una señal de control correspondiente a la cantidad de señal producida por la composición de control negativo, detectando así la presencia o el nivel de la entidad biológica en la muestra biológica. Como se indicó, la normalización de la señal diana puede comprender sustraer la señal de control de la señal diana.
El uno o más agentes de unión pueden ser un anticuerpo, un aptámero u otro agente de unión adecuado divulgado en este documento o conocido en la técnica. De manera similar, la entidad biológica puede ser cualquier biomarcador adecuado divulgado en este documento o conocido en la técnica. En una realización, la entidad biológica comprende una proteína. En otra realización, la entidad biológica comprende una microvesícula. En tal caso, el uno o más agentes de unión pueden ser específicos de un antígeno de superficie de microvesículas. El antígeno de superficie de microvesículas puede ser un antígeno divulgado en este documento, por ejemplo, en las tablas 3-4. En algunas realizaciones, el antígeno de superficie de microvesículas es un biomarcador de una enfermedad o trastorno. De acuerdo con lo anterior, el método puede proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de la enfermedad o trastorno.
En este documento se describe un polinucleótido aislado, o un fragmento del mismo, identificado mediante los métodos anteriores. También se describe en este documento un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que es al menos un 60 % idéntica a la secuencia de nucleótidos identificada por los métodos anteriores. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada es al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, idéntica a la secuencia de nucleótidos identificada por los métodos anteriores. En el caso de un polinucleótido aislado que es más largo o equivalente en longitud a la secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia identificada por los métodos anteriores, la comparación se realiza con la longitud completa de la secuencia de referencia. Cuando el polinucleótido aislado es más corto que la secuencia de referencia, por ejemplo, más corto que una secuencia identificada por los métodos anteriores, la comparación se realiza con un segmento de la secuencia de referencia de la misma longitud (excluyendo cualquier bucle requerido por el cálculo de homología).
Los aptámeros de control negativo en los que las secuencias de aptámero comprenden versiones codificadas de un ácido nucleico de unión a la diana se describen en este documento. Por ejemplo, en este documento se divulgan aptámeros que se unen a proteínas (por ejemplo, EpCAM, PSMA) o microvesículas (por ejemplo, microvesículas de cáncer de próstata y de mama). Un control negativo para cualquiera de los aptámeros de unión a la diana puede ser una secuencia codificada al azar de los mismos.
En este documento se describe un kit para llevar a cabo estos métodos. Como se describe más adelante, el kit puede comprender uno o más reactivos para llevar a cabo el método. El uno o más reactivos pueden comprender el ácido nucleico de control negativo que no se une a la diana o la composición de control negativo. El kit puede comprender el sustrato y/o un agente de unión de interés para una diana de interés. La composición de control negativo se puede usar para normalizar una señal producida por la unión de un agente de unión y una diana de interés.
Aptámeros de bloqueo
Los ácidos nucleicos descritos en este documento pueden servir como agente de bloqueo para el sustrato. Después de una reacción de acoplamiento entre un sustrato y una molécula o entidad deseada, por ejemplo, un agente de unión, se pueden aplicar agentes de bloqueo al sustrato para minimizar las interacciones no específicas entre el sustrato recubierto y las moléculas no diana. Los agentes de bloqueo se pueden seleccionar para minimizar las interacciones no específicas pero sin interferir con las interacciones deseadas, tal como la interacción específica entre una molécula de interés conjugada con el sustrato y otra molécula de interés en una solución de prueba. Los bloqueadores de uso común incluyen BSA (albúmina de suero de bovino), caseína (una proteína a base de leche), pepticase (caseína hidrolizada), surfactantes no iónicos (por ejemplo, Tween® 20 y Triton® X-100), anticuerpos o fragmentos de los mismos que no reaccionan (por ejemplo, fuera de la especie), FSG (gelatina de piel de pescado), gelatina pura o gelatina hidrolasa, PEG (polietilenglicol), sueros que no reaccionan, proteínas que no reaccionan y diversos bloqueadores disponibles en el mercado conocidos por los especialistas en la técnica. Una proteína que no reacciona se refiere a una proteína que debe tener una interacción mínima, si la hay, con los componentes de un ensayo.
Las figuras 16A-16B ilustran el uso de un aptámero para bloquear un grupo carboxilo no conjugado en un sustrato. La figura 16A ilustra el enlace de hidrógeno entre una porción de un aptámero 1601 a grupos 1602 carboxilo unidos a un sustrato 1603 plano. La figura 16B ilustra el enlace de hidrógeno entre una porción de un aptámero 1601 a los grupos 1602 carboxilo unidos a un sustrato 1604 de microesfera. Los grupos 1602 carboxilo se unen además a un anticuerpo 1605. La guanina es el único nucleótido que puede formar dos enlaces de hidrógeno.
En este documento se describe un ácido nucleico que no se une. El ácido nucleico que no se une se puede seleccionar para que tenga una interacción mínima, si la hay, con los componentes de un ensayo de interés. Por ejemplo, el ácido nucleico que no se une puede tener una interacción mínima, si la hay, con las moléculas diana de un ensayo de interés. Sin embargo, el aptámero de bloqueo se puede unir a otros componentes del ensayo, por ejemplo, sustratos, tubos, perlas, etc., minimizando así la interacción entre las moléculas diana y cualquier componente del ensayo que no sean los agentes de unión específicos para las moléculas diana. Las composiciones de bloqueo también se describen en este documento, las composiciones que comprenden el ácido nucleico que no se une y uno o más componentes de bloqueo seleccionados del grupo que consiste en BSA (albúmina de suero bovino), caseína (una proteína a base de leche), pepticasa (caseína hidrolizada), surfactantes no iónicos (por ejemplo, Tween®20 y Triton® X-100), anticuerpos que no reaccionan o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fuera de especie), FSG (gelatina de piel de pescado), gelatina pura o gelatina hidrolasa, PEG (polietilenglicol), sueros que no reaccionan, proteínas que no reaccionan y diversos bloqueadores disponibles en el mercado conocidos para los expertos en la técnica.
El ácido nucleico que no se une puede comprender una secuencia de al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 % homóloga a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008. Por ejemplo, el ácido nucleico puede tener una secuencia al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % homóloga a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008. El ácido nucleico puede tener la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938­ 231008, por ejemplo, SEQ ID NO. 230938.
En este documento se describe un método que comprende poner en contacto el ácido nucleico que no se une con un sustrato para bloquear el sustrato, poner en contacto una muestra biológica con el sustrato bloqueado y detectar la unión de una o más entidades biológicas al sustrato. El ácido nucleico que no se une se puede incluir en una composición de bloqueo proporcionada anteriormente. El sustrato también puede ser un sustrato tal como se describe en este documento, incluyendo, sin limitación, un sustrato plano o una microesfera. Tal bloqueo puede inhibir total o parcialmente eventos de unión no deseados.
En este documento se describe un kit para llevar a cabo estos. Como se describe más adelante, el kit puede comprender uno o más reactivos para llevar a cabo el método. El uno o más reactivos pueden comprender el ácido nucleico que no se une o la composición de bloqueo. El kit puede comprender el sustrato y/o un agente de unión de interés para una diana de interés. El ácido nucleico que no se une o la composición de bloqueo se pueden usar para bloquear el sustrato.
En este documento se describe un polinucleótido aislado, o un fragmento del mismo, identificado por los métodos anteriores. También se describe en este documento un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que es al menos un 60 % idéntica a la secuencia de nucleótidos identificada por los métodos anteriores. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada es al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, idéntica a la secuencia de nucleótidos identificada por los métodos anteriores. En el caso de un polinucleótido aislado que es más largo o equivalente en longitud a la secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia identificada por los métodos anteriores, la comparación se realiza con la longitud completa de la secuencia de referencia. Cuando el polinucleótido aislado es más corto que la secuencia de referencia, por ejemplo, más corto que una secuencia identificada por los métodos anteriores, la comparación se realiza con un segmento de la secuencia de referencia de la misma longitud (excluyendo cualquier bucle requerido por el cálculo de homología).
Se pueden seleccionar aptámeros de bloqueo que se unen a grupos funcionales, por ejemplo, grupos funcionales que están presentes en uno o más componentes de un ensayo biológico. Tales aptámeros que se unen a grupos funcionales se describen con más detalle a continuación.
Aptámeros de unión de grupos funcionales
En este documento se describe un aptámero capaz de unirse a un grupo funcional de interés. Los grupos funcionales, como se usan en este documento, son grupos de átomos o enlaces dentro de moléculas que son responsables de las reacciones químicas características de esas moléculas. El mismo grupo funcional sufrirá las mismas reacciones químicas o similares, independientemente del tamaño de la molécula de la que forme parte. Sin embargo, su reactividad relativa puede verse modificada por grupos funcionales cercanos. Una “unidad estructural” puede ser un grupo funcional o puede estar compuesto por uno o más grupos funcionales.
Los átomos de los grupos funcionales están unidos entre sí y con el resto de la molécula por enlaces covalentes. Cuando el grupo de átomos unidos covalentemente tiene una carga neta, el grupo puede denominarse ion poliatómico o ion complejo. Cualquier subgrupo de átomos de un compuesto también puede llamarse radical, y si un enlace covalente se rompe homolíticamente, los radicales resultantes del fragmento se denominan radicales libres.
Los aptámeros descritos en este documento se pueden dirigir a diversos grupos funcionales de interés. El grupo funcional puede incluir, sin limitación, hidrocarburos, halógenos, grupos que contienen oxígeno (es decir, enlaces CO), grupos que contienen nitrógeno, grupos que contienen azufre, grupos que contienen fósforo o grupos que contienen boro. Los hidrocarburos ilustrativos incluyen, sin limitación, alcanos, alquenos, alquinos, derivados de benceno, derivados de tolueno, alcanos ramificados o de anillo, carbocationes y carboaniones. Los halógenos ilustrativos incluyen, sin limitación, haloalcanos, fluoroalcanos, cloroalcanos, bromoalcanos y yodoalcanos. Los grupos ilustrativos que contienen oxígeno incluyen, sin limitación, alcoholes, cetonas, aldehídos, haluros de acilo, carbonatos, carboxilatos, ácidos carboxílicos, ésteres, hidroperóxidos, éteres, hemiacetales, hemicetales, acetales, cetales, ortoésteres y ortocarbonatos. Los grupos ilustrativos que contienen nitrógeno incluyen, sin limitación, amidas, aminas, iminas, imidas, azidas, compuestos azo, cianatos, nitratos, nitrilos, nitritos, compuestos nitro, compuestos nitroso y derivados de piridina. Los grupos ilustrativos que contienen azufre incluyen, sin limitación, tioles, sulfuros, disulfuros, sulfóxidos, sulfonas, ácidos sulfúnicos, ácidos sulfónicos, tiocianatos, isocianatos, tionas y tiales. Los grupos ilustrativos que contienen fósforo incluyen, sin limitación, fosfinas, fosfanos, ácidos fosfónicos, fosfatos y fosfodiésteres. Los grupos ilustrativos que contienen boro incluyen, sin limitación, ácidos borónicos, ésteres borónicos, ácidos borínicos y ésteres borónicos.
Los aptámeros descritos en este documento pueden estar dirigidos a uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en acetales, grupos acilo, haluros de acilo, grupos alquenilo, alcóxidos, grupos alcoxi, grupos alquinilo, amidas, óxidos de amina, aminas, carbodiimidas, carboximidatos, ácidos carboxílicos, cianamidas, cianatos, ditiocarbamatos, enoles, ésteres, éteres, hidrazinas, hidrazonas, ácidos hidroxámicos, imidas, isocianatos, isocianuros, isotiocianatos, cetales, cetenos, cetonas, grupos salientes, nitrilos, organohaluros, organofosforados, ortoésteres, oximas, fosfonofluoridatos, fosfonotioatos, fosforamidotioatos, fosforoditioatos, fosforofluoridatos, fosforotioatos, grupos protectores, pirofosfatos, semicarbazidas, semicarbazonas, sulfamatos, ésteres de sulfonato, sulfonas, ácidos sulfónicos, grupos sulfonilo, sulfoximinas, compuestos de sulfurilo, tioamidas, tiocianatos, tioésteres, tiolatos, tionas, compuestos de tiofosforilo y tiosulfinatos.
Los aptámeros descritos en este documento pueden estar dirigidos a uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en acetal, grupo acetoxi, acetiluro, anhídrido de ácido, grupo activador, cloruro de acilo, haluro de acilo, acilal, aciloína, acilsilano, alcohol, aldehído, aldimina, alcano, alqueno, alcóxido, alquilcicloalcano, nitritos de alquilo, alquino, aleno, amida, amidina, aminal, óxido de amina, azida, azina, aziridina, azoxi, bifuncional, bistiosemicarbazona, biuret, ácido borónico, carbamato, carbamino, carbazida, carbeno, carbinol, éster de carbonato, carbonilo, carboxamida, carboximidato, ácido carboxílico, cloroformiato, cumuleno, éster de cianato, cianimida, cianhidrina, grupos desactivadores, dépsido, diazo, diol, ditiocarbamato, enamina, enediyne, enol, enol éter, enona, enino, episulfuro, epóxido, éster, éter, fluorosulfonato, halohidrina, halocetona, hemiacetal, hemiaminal, hemitioacetal, hidrazida, hidrazona, ácido hidroxámico, hidroxilo, hidroxilamina, imina, iminio, isotiouronio, cetena, cetenimina, cetona, cetilo, lactama, lactol, lactona, metina, grupo metilo, nitrato, iluro de nitrilo, nitrilimina, compuesto nitro, nitroamina, nitronato, nitrona, ion nitronio, nitrosamina, nitroso, ortoéster, osazona, oxaziridina, oxima, sal de noxoamonio, peróxido, peroxiácido, carbeno persistente, fenoles, fosfaalqueno, fosfaalquino, fosfato, fosfinato, fosfina, óxido de fosfina, fosfinita, fosfonato, fosfonita, fosfonio, fosforano, s-nitrosotiol, base de Schiff, selenol, ácido selenónico, selone, semicarbazida, semicarbazona, éter silílico de enol, éter silílico, sulfenamida, ácido sulfénico, cloruro de sulfenilo, sulfuro, sulfilimina, sulfinamida, ácido sulfínico, éster de sulfito, sulfonamida, sulfonanilida, sulfonato, sulfonilo, haluro de sulfonilo, sulfóxido, sulfurilo, sultona, telurol, thial, tioacetal, tioamida, tiocarbamato, tiocarboxi, tiocianato, tioéster, tioéter, tioketal, tioketona, tiol, tiolactona, tiourea, tosilhidrazona, triazeno, triol, urea, vanillilo, xantato, iluro e ynolato.
El grupo funcional se puede atar a la superficie de un sustrato para facilitar la unión covalente de otras moléculas a la superficie del sustrato. Por ejemplo, el sustrato puede ser modificado con carboxilo, modificado con amino, modificado con hidroxilo, modificado con hidrazida y/o modificado con clorometilo.
El aptámero se puede unir a un grupo carboxilo. El aptámero puede tener un alto contenido de GC, por ejemplo, superior al 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de contenido de GC. La secuencia de ácido nucleico del aptámero puede ser un ácido nucleico que tenga una secuencia de al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % homóloga a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008. Por ejemplo, el ácido nucleico puede tener una secuencia al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % homóloga a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938-231008. El ácido nucleico puede tener la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs. 230938­ 231008, por ejemplo, el aptámero puede tener la secuencia de SEQ ID NO. 230938.
En algunas realizaciones, el aptámero se modifica adicionalmente para comprender al menos una modificación química. La modificación química se puede seleccionar del grupo que consiste en: una sustitución química en una posición de azúcar; una sustitución química en una posición de fosfato; y una sustitución química en una posición de base del ácido nucleico. La modificación química también se puede seleccionar del grupo que consiste en: incorporación de un nucleótido modificado, protección 3', conjugación con un enlazante de amina, conjugación con un compuesto no inmunogénico de alto peso molecular, conjugación con un compuesto lipofílico, conjugación con un fármaco, conjugación con una unidad estructural citotóxica y marcaje con un radioisótopo. La unidad estructural citotóxica se puede conjugar con el extremo 5' del aptámero, se puede conjugar con el extremo 3' del aptámero o se puede conjugar una unidad estructural citotóxica con ambos extremos del aptámero. En algunas realizaciones, la unidad estructural citotóxica se encapsula en una nanopartícula, por ejemplo, un liposoma, dendrímero y/o polímero de peine. En otras realizaciones, la unidad estructural citotóxica comprende una unidad estructural citotóxica de molécula pequeña. La unidad estructural citotóxica de molécula pequeña se puede seleccionar del grupo que consiste en vinblastina hidrazida, caliqueamicina, alcaloide de la vinca, una criptoficina, una tubulisina, dolastatina-10, dolastatina-15, auristatina E, rizoxina, epotilona B, epotilona D, taxoides, maitansinoides, y variantes y derivados de cualquiera de los mismos. La unidad estructural citotóxica también puede ser una toxina proteica. En realizaciones, la toxina proteica se selecciona del grupo que consiste en toxina diftérica, ricina, abrina, gelonina y exotoxina A de Pseudomonas. El radioisótopo se puede seleccionar del grupo que consiste en itrio-90, indio-111, yodo-131, lutecio -177, cobre-67, renio-186, renio-188, bismuto-212, bismuto-213, astato-211 y actinio-225. El compuesto no inmunogénico de alto peso molecular puede ser un polialquilenglicol, tal como polietilenglicol.
Se describe en este documento una composición, comprendiendo la composición un aptámero como se describe anteriormente, y un sustrato. Como se describe en este documento, el sustrato puede ser cualquier sólido físicamente separable al que se pueda unir directa o indirectamente un agente de unión, incluyendo, sin limitación, superficies proporcionadas por micromatrices y pocillos, partículas tales como perlas, columnas, fibras ópticas, toallitas, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, cuarzo, mica, membranas diazotadas (papel o nailon), poliformaldehído, celulosa, acetato de celulosa, papel, cerámica, metales, metaloides, materiales semiconductores, puntos cuánticos, perlas o partículas recubiertas, otros materiales cromatográficos, partículas magnéticas; plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno u otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, material de teflón, etc.), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, resinas, sílice o materiales a base de sílice, incluidos el silicio y el silicio modificado, el carbono, metales, vidrios inorgánicos, plásticos, cerámicas, polímeros conductores (incluidos polímeros tales como polipirrol y poliindol); superficies micro o nanoestructuradas tales como matrices de mosaico de ácido nucleico, superficies decoradas con nanotubos, nanocables o nanopartículas; o superficies porosas o geles tales como metacrilatos, acrilamidas, polímeros de azúcar, celulosa, silicatos, u otros polímeros fibrosos o trenzados. Además, como es conocido en la técnica, el sustrato se puede recubrir usando recubrimientos pasivos o derivados químicamente con cualquier número de materiales, incluidos polímeros, tales como dextranos, acrilamidas, gelatinas o agarosa. El sustrato también se puede recubrir con un grupo funcional para facilitar la unión covalente a la superficie de cualquier molécula deseada. Tales recubrimientos pueden facilitar el uso de la matriz con una muestra biológica. El sustrato puede estar en cualquier forma útil. El sustrato puede ser un sustrato plano. Por ejemplo, el sustrato puede ser el pocillo de una placa o una micromatriz. El sustrato puede ser una microesfera. Por ejemplo, el sustrato puede ser una microesfera o perla marcada magnética o fluorescentemente.
El sustrato de la composición puede comprender un grupo carboxilo. Por ejemplo, la superficie del sustrato se puede recubrir con un grupo funcional tal como un grupo carboxilo. El aptámero se puede unir al grupo carboxilo. El aptámero se puede unir al grupo carboxilo a través de la unión de hidrógeno.
El aptámero puede servir como agente de bloqueo para el sustrato. Después de una reacción de acoplamiento entre un sustrato y una molécula o entidad deseada, por ejemplo, un agente de unión, se pueden aplicar agentes de bloqueo al sustrato para minimizar las interacciones no específicas entre el sustrato recubierto y las moléculas no diana. Los agentes de bloqueo se pueden seleccionar para minimizar las interacciones no específicas pero sin interferir con las interacciones deseadas, tales como la interacción específica entre una molécula de interés conjugada con el sustrato y otra molécula de interés en una solución de prueba. Los bloqueadores de uso común incluyen BSA (albúmina de suero de bovino), caseína (una proteína a base de leche), pepticase (caseína hidrolizada), surfactantes no iónicos (por ejemplo, Tween® 20 y Triton® X-100), anticuerpos o fragmentos que no reaccionan de los mismos (por ejemplo, fuera de la especie), FSG (gelatina de piel de pescado), gelatina pura o gelatina hidrolasa, PEG (polietilenglicol), sueros no reactivos y diversos bloqueadores disponibles en el mercado conocidos para los expertos en la técnica.
El sustrato puede comprender un agente de unión. El agente de unión puede ser un ácido nucleico, una proteína u otra molécula que se pueda unir a una diana de interés, por ejemplo, una entidad biológica. El agente de unión puede tener especificidad por la diana de interés. El agente de unión puede comprender ADN, ARN, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, Fabs, Fab', anticuerpos monocatenarios, anticuerpos sintéticos, aptámeros (ADN/ARN), peptoides, ADNz, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), lectinas, compuestos químicos sintéticos o naturales (incluyendo, sin limitación, fármacos, reactivos de marcaje), dendrímeros o una combinación de los mismos. Por ejemplo, el agente de unión puede ser un anticuerpo o un aptámero. El agente de unión puede comprender un agente marcador de proteínas de membrana. Véanse, por ejemplo, los agentes de marcaje de proteínas de membrana divulgados en Alroy et al., la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos US 2005/0158708.
La composición puede comprender otras entidades. La composición puede comprender una entidad biológica. Por ejemplo, la entidad biológica puede ser un ácido nucleico/polinucleótido, una proteína o una microvesícula. La proteína puede estar asociada con una microvesícula. Por ejemplo, la proteína puede ser un antígeno de superficie de microvesículas. La proteína también puede ser una carga útil de microvesículas. El antígeno de superficie de microvesículas y/o la carga útil puede ser un biomarcador divulgado en este documento, por ejemplo, en las tablas 3­ 4.
Se muestra en la figura 17A una configuración de ejemplo de una composición como se describe en este documento. La figura 17A ilustra el enlace de hidrógeno entre una porción de un aptámero 1701 a los grupos 1702 carboxilo unidos a un sustrato 1703. El agente 1704 de unión también está unido al sustrato 1703. El agente de unión tiene especificidad para la diana 1705, que puede ser cualquier entidad biológica apropiada descrita en este documento o conocidos en la técnica, tales como una proteína, un ácido nucleico, una microvesícula, una célula o una porción de cualquiera de los mismos. Sin estar ligado a la teoría, el aptámero 1701 puede servir para bloquear parte o toda la unión no deseada de la diana 1705, o cualquier otra molécula o entidad, al sustrato 1703. La figura 17B muestra una configuración alternativa en la que una entidad biológica de interés está unida al sustrato 1703.
Como se describe más adelante, en este documento se describe un kit, comprendiendo el kit un aptámero o una composición descrita anteriormente.
También se describe en este documento un método, comprendiendo el método poner en contacto el aptámero descrito en este documento con un sustrato. El sustrato también puede ser un sustrato tal como el descrito anteriormente, incluido un sustrato plano o una microesfera. El sustrato puede comprender un grupo carboxilo. Por ejemplo, la superficie del sustrato se puede funcionalizar con unidades estructurales carboxilo. El aptámero puede estar unido al grupo carboxilo. El aptámero se puede unir al grupo carboxilo mediante enlaces de hidrógeno. Sin estar ligado a la teoría, el aptámero puede servir para bloquear los grupos carboxilo en el sustrato de eventos de unión no deseados.
El sustrato puede comprender un agente de unión. El agente de unión puede ser cualquier agente de unión divulgado en este documento o conocido en la técnica que pueda unirse mediante enlaces covalentes o no covalentes al sustrato. El agente de unión puede comprender un anticuerpo o un aptámero.
El método de poner en contacto el aptámero descrito en este documento con un sustrato puede comprender además poner en contacto el sustrato con una muestra que comprende una diana del agente de unión. Una posible configuración para el método se muestra en la figura 17A. Como se muestra en la figura 17A, la diana 1705 se reconoce por el agente 1704 de unión mientras que el grupo 1702 carboxilo está enmascarado por el aptámero 1701. La superficie del sustrato 1703 puede estar cubierta por grupos 1702 carboxilo para facilitar la unión covalente del agente 1704 de unión al sustrato. Después de la unión del agente 1704 de unión al sustrato 1703, el aptámero 1701 se puede aplicar para bloquear cualquier grupo 1702 carboxilo no conjugado. Finalmente, el sustrato 1703 bloqueado se puede poner en contacto con una muestra que comprende la diana 1705. El método puede mejorar la capacidad de detectar la unión eventos entre el agente 1704 de unión y la diana 1705. Por ejemplo, el bloqueo por el aptámero puede reducir cualquier evento de unión no específica con el sustrato 1703 que podría interferir con la unión específica entre el agente 1704 de unión y la diana 1705. Alternativamente, el bloqueo por el aptámero puede reducir cualquier evento de unión no específica entre la diana 1705 y el sustrato 1703. Un experto apreciará que ambos mecanismos pueden operar simultáneamente. La figura 17B muestra una configuración alternativa en la que una entidad biológica de interés está unida al sustrato 1703.
En este documento se describe un polinucleótido aislado, o un fragmento del mismo, identificado por los métodos anteriores. También se describe en este documento un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que es al menos un 60 % idéntica a la secuencia de nucleótidos identificada por los métodos anteriores. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada es al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, idéntica a la secuencia de nucleótidos identificada por los métodos anteriores. En el caso de un polinucleótido aislado que es más largo o equivalente en longitud a la secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia identificada por los métodos anteriores, la comparación se realiza con la longitud completa de la secuencia de referencia. Cuando el polinucleótido aislado es más corto que la secuencia de referencia, por ejemplo, más corto que una secuencia identificada por los métodos anteriores, la comparación se realiza con un segmento de la secuencia de referencia de la misma longitud (excluyendo cualquier bucle requerido por el cálculo de homología).
También se describe un kit, el kit para llevar a cabo los métodos descritos en este documento. Como se describe más adelante, el kit puede comprender uno o más reactivos para llevar a cabo el método. El uno o más reactivos pueden comprender el aptámero y/o el sustrato.
En este documento se describe un método de detección de la presencia o el nivel de una entidad biológica en una muestra biológica sospechosa de contener la entidad biológica. El método comprende: (a) proporcionar una composición que comprende uno o más agentes de unión específicos para la entidad biológica unidos a un sustrato carboxilado, en el que el sustrato carboxilado se une al aptámero descrito en este documento; (b) poner en contacto la muestra biológica con la composición proporcionada en la etapa (a); y (c) detectar si la entidad biológica es reconocida por el uno o más agentes de unión en la etapa (b), detectando así la presencia o el nivel de la entidad biológica en la muestra biológica. Una posible configuración para el método se muestra en la figura 17A. Como se muestra en la figura 17A, la diana 1705 se reconoce por el agente 1704 de unión mientras que el grupo 1702 carboxilo está enmascarado por el aptámero 1701. La superficie del sustrato 1703 puede estar cubierta por grupos 1702 carboxilo para facilitar la unión covalente del agente 1704 de unión al sustrato. Después de la unión del agente 1704 de unión al sustrato 1703, el aptámero 1701 se puede aplicar para bloquear cualquier grupo 1702 carboxilo no conjugado. Finalmente, el sustrato 1703 bloqueado se puede poner en contacto con una muestra que comprende la diana 1705. El método puede mejorar la capacidad de detectar la unión eventos entre el agente 1704 de unión y la diana 1705. Por ejemplo, el bloqueo por el aptámero puede reducir cualquier evento de unión no específica con el sustrato 1703 que podría interferir con la unión específica entre el agente 1704 de unión y la diana 1705. Alternativamente, el bloqueo por el aptámero puede reducir cualquier evento de unión no específica entre la diana 1705 y el sustrato 1703. Un experto apreciará que ambos mecanismos pueden operar simultáneamente. La figura 17B muestra una configuración alternativa en la que una entidad biológica de interés está unida al sustrato 1703.
La entidad biológica puede ser cualquier entidad adecuada que se pueda detectar cuando es reconocida por el agente de unión. La entidad biológica puede comprender una proteína o un polipéptido. Como se usa en este documento, “proteína", “polipéptido” y “péptido” se usan indistintamente a menos que se indique lo contrario. La entidad biológica puede ser un ácido nucleico, incluidos ADN, ARN y diversas subespecies de cualquiera de los mismos, como se divulga en este documento o se conoce en la técnica. La entidad biológica puede comprender un lípido. La entidad biológica puede comprender un carbohidrato. La entidad biológica también puede ser un complejo, por ejemplo, un complejo que comprende proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y/o carbohidratos. La entidad biológica puede comprender una microvesícula. En tales casos, el agente de unión puede ser un agente de unión a un antígeno de superficie de microvesícula, por ejemplo, una proteína. Los antígenos de superficie de microvesículas generales incluyen tetraspanina, CD9, CD63, CD81, CD63, CD9, CD81, CD82, CD37, CD53, Rab-5b, Anexina V y MFGE8. En la tabla 3 en este documento se proporcionan antígenos de superficie de microvesículas generales adicionales.
El antígeno de superficie de microvesículas también puede ser un biomarcador de una enfermedad o trastorno. El método puede proporcionar un diagnóstico, pronóstico o teranosis de la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, la una o más proteínas pueden comprender uno o más de PSMA, PCSA, B7H3, EpCam, ADAM-10, BCNP, e Gf R, IL1B, KLK2, MMP7, p53, PBP, Se Rp INB3, SPDEF, SSX2 y SSX4. Estos marcadores se pueden usar para detectar un cáncer de próstata. En las tablas 3-4 en este documento se proporcionan antígenos de superficie de microvesículas adicionales.
También se describe un kit en este documento, dicho kit para llevar a cabo los métodos descritos en este documento. Como se describe más adelante, el kit puede comprender uno o más reactivos para llevar a cabo el método. El uno o más reactivos pueden comprender el aptámero, el sustrato y/o el agente de unión. El kit puede comprender el sustrato recubierto con el grupo carboxilo, las instrucciones para conjugar un agente de unión de interés para el sustrato y el aptámero. El aptámero se puede usar para bloquear cualquier grupo carboxilo no conjugado.
En este documento se describe un método de mejora de la unión, que comprende: (a) poner en contacto un sustrato con un aptámero capaz de unirse a un grupo carboxilo, en el que el sustrato también comprende una o más moléculas seleccionadas de ácido nucleico o polipéptido; y (b) poner en contacto el sustrato con un agente de unión capaz de unirse a la molécula de ácido nucleico o polipéptido, por lo que la unión del aptámero al grupo carboxilo mejora la unión del agente de unión a la molécula de ácido nucleico o polipéptido. El aptámero puede ser un aptámero descrito en este documento, por ejemplo, un aptámero que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs. 230938-231008. El sustrato puede ser un sustrato tal como se describe en este documento o conocido en la técnica, incluidos sustratos planos o microesferas perlas. Un esquema ilustrativo se muestra en la figura 17A y la figura 17B. Con respecto a la figura 17A, el sustrato 1703 comprende la una o más moléculas 1704 seleccionadas de ácido nucleico o polipéptido, que en esta ilustración representa un anticuerpo. El aptámero 1701 se muestra uniendo un grupo 1702 carboxilo en la superficie del sustrato 1703. El agente 1705 de unión es una molécula o entidad que se une a la una o más moléculas 1704 de ácido nucleico o polipéptido seleccionadas. Con respecto a la figura 17B, el sustrato 1703 comprende la una o más moléculas 1705 de ácido nucleico o polipéptido seleccionadas, que en esta ilustración representa una entidad diana, por ejemplo, una proteína o microvesícula. El aptámero 1701 se muestra uniendo un grupo 1702 carboxilo en la superficie del sustrato 1703. El agente 1704 de unión es un anticuerpo específico para uno o más moléculas 1705 seleccionadas de ácido nucleico o polipéptido. Un experto apreciará que diversos agentes de unión se pueden usar como se divulga en este documento o como se conoce en la técnica.
El ácido nucleico o polipéptido se puede unir covalentemente a un grupo carboxilo a través de un enlace amida. Un enlace amida, o enlace peptídico, es un enlace químico covalente formado entre dos moléculas cuando el grupo carboxilo de una molécula reacciona con el grupo amino de la otra molécula, provocando la liberación de una molécula de agua.
Los aptámeros descritos en este documento se pueden identificar usando cualquier metodología de selección útil. Por ejemplo, un aptámero se puede identificar usando SELEX o variantes del mismo, tal como se describe en Pan and Clawson, Primer-free aptamer selection using a random DNA library. Methods Mol Biol. 2010;629:369-85. El aptámero se puede identificar usando métodos de selección negativos y positivos tales como los descritos en este documento. El aptámero se puede identificar usando el método descrito por Mei, H, et al. Functional-group specific aptamers indirectly recognizing compounds with alkyl amino group. Anal Chem. 2012 Sep 4;84(17):7323-9. Epub 2012 Aug 21.
kits
También se describe un kit en este documento, comprendiendo el kit uno o más reactivos para llevar a cabo los métodos divulgados en este documento. Por ejemplo, el uno o más reactivos pueden ser uno o más aptámeros, una solución reguladora, un bloqueador, una enzima o una combinación de los mismos. El uno o más reactivos pueden comprender cualquier reactivo útil para llevar a cabo los métodos en cuestión, incluyendo, sin limitación, bibliotecas de aptámeros, sustratos tales como microperlas o matrices planas o pocillos, reactivos para biomarcadores y/o aislamiento de microvesículas, aptámeros dirigidos a dianas específicas, grupos de aptámeros que facilitan la detección de una población de biomarcadores/ microvesículas, reactivos tales como cebadores para la secuenciación o amplificación de ácidos nucleicos, matrices para la hibridación de ácidos nucleicos, etiquetas detectables, disolventes o soluciones reguladoras y similares, diversos enlazantes, diversos componentes de ensayo, bloqueadores y similares. El uno o más reactivos también pueden comprender diversas composiciones descritas en este documento. El uno o más reactivos pueden comprender uno o más aptámeros descritos en este documento. El uno o más reactivos pueden comprender un sustrato, tal como un sustrato plano, una columna o una perla. El kit puede contener instrucciones para realizar diversos ensayos usando uno o más reactivos.
El kit puede comprender un aptámero o una composición proporcionada en este documento. El kit se puede configurar para llevar a cabo los métodos proporcionados en este documento. Por ejemplo, el kit puede incluir un aptámero descrito en este documento, un sustrato o tanto un aptámero descrito en este documento como un sustrato.
El kit se puede configurar para llevar a cabo un ensayo. Por ejemplo, el kit puede contener uno o más reactivos e instrucciones para detectar la presencia o el nivel de una entidad biológica en una muestra biológica. En tales casos, el kit puede incluir uno o más agentes de unión a una entidad biológica de interés. El uno o más agentes de unión se pueden unir a un sustrato.
El kit puede comprender un conjunto de aptámeros que proporcionan un perfil del aptámero particular para una muestra biológica. Un perfil del aptámero puede incluir, sin limitación, un perfil que se puede usar para caracterizar una enfermedad o trastorno particular. Por ejemplo, la enfermedad o trastorno puede ser una enfermedad o trastorno proliferativo, incluyendo, sin limitación, un cáncer.
Ejemplo 1: Identificación de oligonucleótidos de ADN que se unen a una diana
La diana se fija a un sustrato sólido, tal como un portaobjetos de vidrio o una perla magnética. Para una preparación de perlas magnéticas, las perlas se incuban con una concentración de proteína diana que oscila entre 0.1 y 1 mg/ml. La proteína diana se conjuga con las perlas según una química proporcionada por el fabricante de perlas en particular. Por lo general, esto implica el acoplamiento a través de un procedimiento de grupo funcional de N-hidroxisuccinimida (NHS). Los grupos NHS desocupados se vuelven inactivos después de la conjugación con la diana.
Los oligonucleótidos (oligos) generados aleatoriamente de una determinada longitud, tales como 32 pares de bases de largo, se agregan a un recipiente que contiene la diana estabilizada. Cada oligo contiene 6 nucleótidos de timina (una “cola de timina") ya sea en el extremo cebador 5 o 3, junto con una única molécula de biotina conjugada con la cola de timina. Se podrían agregar moléculas adicionales de biotina. Cada oligo también se fabrica con un tramo corto de nucleótidos en cada extremo (de 5 a 10 pares de bases de largo) correspondientes a los cebadores de amplificación para PCR ("colas de cebador"). Las secuencias de un grupo grande de aptámeros de 32-mer se muestran en SEQ ID NOs. 1-230810. Las secuencias se muestran sin las colas de timina o las colas del cebador.
Los oligonucleótidos se incuban con la diana a una temperatura y tiempo especificados en solución salina regulada con fosfato (PBS) a 37 grados Celsius en un volumen de reacción de 500 microlitros.
La combinación de diana/oligo se lava de 1 a 10 veces con solución reguladora para retirar el oligo no unido. El número de lavados aumenta con cada repetición del procedimiento (como se indica a continuación).
Los oligos unidos a la diana se eluyen usando una solución reguladora que contiene un agente caotrópico tal como urea 7 M o SDS al 1 % y se recogen usando la etiqueta de biotina. Los oligos se amplifican usando la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos para las secuencias 5' y 3' que se agregan a la región aleatoria de los oligos. Los oligos amplificados se agregan nuevamente a la diana para otra ronda de selección. Este procedimiento se repite según sea necesario para observar el enriquecimiento de unión.
Ejemplo 2: ensayo competitivo
El procedimiento se realiza como en el ejemplo 1 anterior, excepto que se usa un ligando conocido para la dina, tal como un anticuerpo, para eluir las especies de oligos unidas (en contraposición o además del agente caotrópico). En este caso, se usó el anticuerpo anti-EpCAM de Santa Cruz Biotechnology, Inc. para eluir los aptámeros del EpCAM diana.
Ejemplo 3: Cribado y análisis de afinidad
Los aptámeros generados a partir de los ensayos de unión descritos anteriormente se secuencian usando una plataforma de secuenciación de alto rendimiento, tal como Ion Torrent de Life Technologies:
Preparación de la biblioteca: los aptámeros se agruparon después de ligar los códigos de barras y las secuencias adaptadoras (Life Technologies) según los protocolos del fabricante. En resumen, se realizaron grupos equimolares de los aptámeros mediante las siguientes etapas: Se analizó una alícuota de cada biblioteca con un instrumento Bioanalyzer™ y el kit Agilent DNA 1000 o el kit Agilent High Sensitivity, según corresponda para la concentración final de la biblioteca. La concentración molar (nmol/L) de cada biblioteca de amplicón se determinó usando el software comercialmente disponible (Agilent).
Se preparó un grupo equimolar de la biblioteca a la concentración más alta posible.
Se calculó la concentración combinada de la reserva de biblioteca agrupada.
El factor de dilución de la plantilla del grupo de la biblioteca se determinó usando la siguiente ecuación: Factor de dilución de la plantilla = (concentración del grupo de la biblioteca [pM])/26 pM).
Preparación de la plantilla: usando una biblioteca recién diluida, el grupo de aptámeros resultante de los ensayos de unión proporcionados anteriormente se secuenció usando protocolos de secuenciación convencionales. Los métodos de secuenciación de alto rendimiento (NextGen) se pueden usar según se desee. Las secuencias del grupo de aptámeros se identifican en SEQ ID NOs. 1-230810.
Se seleccionaron veinte aptámeros en base a ensayos directos o competitivos que evalúan la unión a EpCAM (como se describe anteriormente). Véase el ejemplo 7 y la tabla 8 para las secuencias seleccionadas.
Mediciones de afinidad: estos veinte aptámeros se probaron luego para determinar la afinidad de unión usando una plataforma de unión in vitro. Se puede usar SPR para esta etapa, por ejemplo, una máquina Biacore SPR que usa el software de control T200, de la siguiente manera:
Diluir el antígeno a una concentración de 32 nM.
Preparar las diluciones necesarias para la cinética, comenzando con 32 nM, preparar diluciones dobles de antígeno hasta 0.5 nM.
El software de control Biacore 200 está programado con las siguientes condiciones: Solución: solución reguladora HBS-PD+; Número de ciclos: 3; tiempo de contacto: 120 s; Velocidad de flujo: 30 pl/min; Tiempo de disociación: 300 s; Solución: Glicina-HCl pH 2.5; tiempo de contacto: 120 s; Velocidad de flujo: 20 pl/min; Periodo de estabilización: 0 s. Las afinidades de unión de estos aptámeros luego se miden usando el ensayo SPR anterior, o un ensayo in vitro alternativo que evalúa el aptámero para una función deseada.
La figura 4 muestra los datos de SPR para el aptámero BTX176881 (SEQ ID NO: 98883). La figura comprende un gráfico de asociación y disociación del modelo de ajuste 1:1 de los aptámeros biotinilados a la proteína EpCAM en las concentraciones indicadas (nM). La tabla 5 muestra los valores de Kd calculados de las medidas de SPR que se ilustran en la figura 4. Además, la tabla 5 muestra los datos de SPR y el Kd calculado valores para BTX187269 (SEQ ID NO: 109271) y aptámero 4 (SEQ ID NO. 1).
Tabla 5: Valores de Kd calculados a partir de mediciones de SPR
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Ejemplo 4: Análisis de motivo
El procedimiento de los ejemplos anteriores se sigue para identificar un aptámero de alta afinidad con una diana de interés. Una vez que se identifica un aptámero de alta afinidad, su secuencia se analiza luego usando un programa de software para estimar su estructura de plegamiento bidimensional. Los programas y algoritmos de alineación de secuencias bien conocidos para la identificación de motivos se pueden usar para identificar motivos de secuencia y reducir la dimensionalidad incluso de grandes conjuntos de datos de secuencias. Además, los programas de software como Vienna y mfold son bien conocidos para los expertos en la técnica de la selección de aptámeros y se pueden usar para agrupar más secuencias en base a motivos de estructura secundaria (formas compartidas). Véanse, las figuras 5A-5B para predicciones de estructuras de ejemplo. La estructura secundaria compartida, por supuesto, no garantiza una estructura tridimensional idéntica. Por lo tanto, la validación de aptámeros en “ laboratorio húmedo” sigue siendo útil, ya que ningún conjunto de herramientas in silico ha podido predecir con precisión el aptámero óptimo entre un conjunto de candidatos a aptámero.
Usando el mismo software, las secuencias producidas en la secuenciación de alto rendimiento de un grupo de aptámeros candidatos (producidos como se describe en el ejemplo 1 anterior) se analizan en busca de motivos estructurales similares al aptámero de alta afinidad. Las comparaciones de estructuras se basan en cálculos de energía libre realizados con Vienna. Las tablas 6 y 7 presentan una selección ilustrativa de cálculos de energía libre para los veinte miembros principales de la biblioteca que se calcula que tienen una alta identidad con el aptámero 4 (SEQ ID NO. 1) y el Oligo6 (SEQ ID NO. 230810), respectivamente. En las tablas 6 y 7, la columna “ Identidad” indica la proporción de alineación idéntica del aptámero 4 con las secuencias de la biblioteca indicadas. El valor de identidad comprende el resultado de la alineación por pares dividido por el número de nucleótidos en la alineación. La columna “código mfe” comprende la salida de “notación de paréntesis” de Vienna 2.0.7. Las estructuras secundarias libres de pseudonudos se pueden representar en la notación de paréntesis eficiente en el espacio, que se usa en todo el paquete de ARN de Vienna. Brevemente, una estructura en una secuencia de longitud n se representa mediante una cadena de igual longitud que consiste en paréntesis y puntos coincidentes. Un par de bases entre las bases i y j se representa con a'(' en la posición i y a')' en la posición j, y las bases no apareadas se representan con puntos. Información adicional sobre la notación de paréntesis Código mfe está disponible en rna.tbi.univie.ac.at/help.html. La columna “Valor mfe” en las tablas 6 y 7 proporciona el cálculo de energía libre mínima calculado con Vienna 2.0.7 con el archivo de parámetros predeterminado.
Tabla 6: Comparación de identidad y estructura secundaria con el aptámero 4
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En total, 880 secuencias tenían una puntuación de identidad de 0.65 o superior en comparación con el aptámero 4. Las SEQ ID NOs. de estas secuencias ordenadas por identidad con el aptámero 4 de alta a baja son 1, 83833, 404, 192457, 46196, 181195, 85436, 159336, 174291, 83832, 188968, 14201, 91259, 95567, 87637, 152235, 164943, 208225, 37604, 173781, 229801, 162649, 141236, 229277, 197636, 208288, 222015, 46488, 41404, 20282, 37215, 164674, 88106, 230291, 222830, 86840, 106217, 153548, 69938, 22919, 148527, 23133, 62644, 150047, 195461, 165410, 95492, 187335, 143568, 229624, 211801, 89529, 49853, 86203, 229309, 148998, 227639, 12831, 207967, 83812, 100031, 24403, 44443, 86417, 85531, 177048, 222142, 224357, 191046, 25876, 176402, 78410, 169614, 170692, 220915, 227125, 88394, 211129, 167260, 21437, 95247, 229151, 1344, 18302, 94815, 105377, 130159, 47458, 77703, 229665, 446, 6632, 222154, 5925, 89185, 166992, 82685, 190696, 227012, 165589, 140293, 165488, 184824, 22443, 89500, 139968, 26382, 223375, 21852, 175936, 191752, 227183, 229246, 28597, 79173, 218544, 90815, 115055, 118391, 147334, 228629, 63019, 112671, 14867, 31453, 49788, 83331, 170600, 182781, 65037, 77839, 219756, 22498, 169879, 84231, 87890, 87951, 93241, 95274, 25145, 229605, 229647, 145760, 5602, 5944, 129548, 229432, 148342, 165400, 62962, 71321, 130354, 227261, 96175, 1923, 3602, 88544, 112311, 229170, 168079, 195903, 203783, 129930, 208300, 215426, 224543, 227717, 82099, 221395, 10847, 61398, 99233, 165100, 208999, 15946, 44819, 164778, 190331, 224367, 181869, 221786, 229009, 67955, 87277, 202044, 63204, 97683, 119091, 127373, 176380, 2790, 182858, 226993, 40773, 86822, 149227, 189749, 223226, 109, 7382, 142902, 190403, 2511, 14476, 125189, 224206, 86454, 130486, 147726, 108815, 18082, 190843, 45237, 83778, 191228, 229117, 96465, 171461, 186224, 82242, 176191, 181376, 184432, 147735, 214179, 159297, 2709, 45318, 105849, 171053, 222127, 52894, 125871, 164642, 84142, 45997, 86837, 94742, 130073, 175675, 222007, 112130, 221515, 127575, 141509, 525, 173934, 201340, 135715, 209835, 23712, 83926, 6015, 215164, 206485, 5690, 50212, 118847, 61503, 202365, 225979, 8859, 45779, 176358, 113963, 45463, 66945, 188869, 15231, 22936, 84157, 12271, 58672, 135632, 180563, 200213, 12292, 74327, 88219, 163713, 208378, 229071, 3089, 12468, 140336, 155915, 331, 115507, 206325, 225180, 230194, 21183, 113125, 229023, 41920, 105992, 210427, 213341, 76296, 104423, 146335, 178047, 228984, 12604, 83530, 90950, 185519, 222186, 222283, 27831, 88097, 116409, 154939, 168206, 5549, 195919, 217797, 22658, 154805, 171036, 214987, 225767, 62979, 85662, 222046, 224554, 226930, 227276, 27161, 166910, 202893, 8124, 8714, 23847, 39241, 27746, 165206, 166056, 423, 36640, 86849, 137280, 190114, 202287, 230304, 5179, 6067, 6505, 6611, 41483, 37479, 45749, 107382, 117315, 202535, 29748, 82654, 84060, 87907, 157362, 206589, 223382, 28495, 44462, 62270, 100524, 173820, 192490, 222297, 1390, 19210, 22495, 118163, 133889, 179659, 192074, 204965, 2461, 77762, 106037, 166379, 167776, 182280, 228707, 808, 47456, 152081, 222818, 229813, 148355, 148387, 167853, 167857, 187723, 357, 163173, 175586, 224340, 12254, 24110, 158863, 199558, 228579, 500, 85061, 94630, 162650, 165617, 168065, 222121, 228609, 51102, 112611, 125773, 190879, 215724, 227812, 229506, 442, 12284, 36658, 44057, 95079, 97943, 167653, 177081, 204180, 209922, 18882, 62824, 89180, 107532, 131610, 179747, 181924, 208078, 208690, 631, 46216, 96215, 105283, 150525, 166187, 227449, 103425, 185880, 837, 26023, 157638, 165823, 175971, 228232, 230020, 36086, 61478, 171159, 177192, 196612, 215002, 225782, 84127, 88107, 111059, 147670, 149254, 166308, 175530, 206924, 221620, 2514, 2717, 23418, 51045, 83895, 83974, 84095, 84146, 86150, 104166, 106868, 152996, 185740, 222844, 229172, 229254, 27401, 160516, 165619, 172635, 189302, 220615, 221183, 229356, 230021, 83828, 124068, 152013, 181636, 190744, 194448, 195157, 196263, 215307, 229390, 229807, 28160, 33150, 84689, 150169, 170181, 175758, 202239, 1872, 7459, 22350, 39454, 82329, 101757, 151736, 162225, 7946, 83756, 159512, 164932, 185169, 217855, 229824, 7381, 45608, 55427, 85522, 92756, 94362, 149604, 166378, 166572, 185619, 1200, 20260, 20952, 22787, 78128, 80744, 108103, 116667, 129831, 130067, 168581, 178969, 208724, 222116, 8122, 144078, 164779, 218167, 220960, 22637, 24612, 24944, 106584, 156344, 167262, 222022, 228813, 44051, 77865, 82089, 88152, 93245, 94935, 152153, 190789, 200547, 201908, 225916, 1323, 2837, 10181, 22043, 25177, 26567, 93412, 104099, 127374, 130454, 147664, 150419, 177674, 183092, 9715, 12644, 22918, 40833, 77732, 82992, 83365, 210202, 229833, 3976, 11015, 13524, 65438, 90954, 98759, 148864, 163106, 163192, 74660, 79359, 83110, 95108, 95525, 112590, 171072, 172776, 183058, 224159, 226062, 228518, 12809, 15906, 23455, 42107, 76961, 91318, 129989, 137160, 155158, 177958, 2759, 46018, 48333, 78031, 86611, 128087, 135823, 180253, 191245, 209093, 230546, 20542, 63496, 71991, 83901, 142432, 171932, 227515, 61337, 160422, 172960, 173608, 189801, 210407, 216678, 229101,65755, 79467, 94134, 98247, 197374, 202491,225597, 77739, 94166, 95667, 151387, 168443, 187779, 220937, 5921, 7576, 148846, 177037, 190387, 190580, 190594, 229692, 12103, 32693, 92399, 114220, 163673, 223983, 652, 5953, 22926, 45297, 119857, 181369, 190352, 227216, 173208, 191585, 207218, 214989, 229099, 229137, 19556, 20676, 20726, 55409, 63187, 82431, 83731, 91667, 108942, 167838, 208244, 208660, 226483, 486, 98243, 147746, 186732, 190125, 222129, 13059, 47113, 63281, 63816, 147364, 191597, 194319, 226191, 80867, 88703, 141125, 165353, 7836, 44100, 84750, 97305, 151159, 163292, 166160, 174457, 187346, 206359, 212868, 3743, 4210, 7231, 77720, 101878, 151668, 158168, 203331, 226481, 12095, 51060, 78232, 85545, 145684, 164617, 169839, 180765, 203890, 209861, 222276, 12511, 120891, 163107, 171003, 176280, 20466, 195366, 222140, 72978, 141852, 158096, 162904, 2767, 8748, 105451, 111950, 229203, 229612, 6031, 12231,93001, 172784, 174080, 195635, 222160, 2077, 148220, 190414, 207102, 84111, 89221, 177736, 222281, 51841, 83873, 112121, 129029, 130969, 147734, 148231, 148343, 152004, 172491, 192443, 200375, 230195, 165471, 169651, 87960, 230440, 83966, 101115, 158138, 191593, 191892, 229621, 13073, 31147, 44055, 71915, 905, 130121, 130286, 83984, 94826, 201315, 2654, 3052, 5288, 62828, 109159, 45345, 57797, 77490, 83203, 150059, 180295, 210195, 227209, 229074, 7529, 86462, 87778, 130059, 229341, 83520, 14855, 45242, 51014, 89143, 163311, 164805, 206146, 210232, 156377, 172805, 192953, 4313, 22875, 63708, 77497, 165430, 187428, 190477, 105395, 176513, 172889, 217595, 2587, 75016, 193089, 12089, 211658, 61730, 61745, 63353, 83986, 84548, 94951, 124283, 229118.
Tabla 7: Comparación de identidad y estructura secundaria con Oligo6
Figure imgf000117_0001
Figure imgf000118_0001
En total, 548 secuencias tenían una puntuación de identidad de 0.65 o superior en comparación con Oligo6. Las SEQ ID NOs. de estas secuencias ordenadas por la identidad a Oligo6 de alta a baja son 153288, 230810, 72324, 28200, 53868, 181518, 42357, 57489, 73227, 172055, 2952, 44405, 75929, 71429, 20006, 184108, 47784, 92897, 220240, 57283, 52420, 140995, 146820, 169084, 39855, 146442, 147185, 181215, 56691, 75368, 53201, 146451, 147211, 63615, 228278, 173786, 46890, 75306, 107324, 221968, 14758, 47455, 135584, 30860, 33832, 43355, 120959, 131982, 146257, 229669, 52947, 140895, 37532, 161060, 167186, 115635, 199581, 32146, 152683, 56718, 147067, 220159, 49808, 50500, 176682, 154788, 201850, 3316, 146032, 147160, 155055, 48737, 139597, 72670, 207849, 170684, 54938, 3636, 128263, 156447, 145935, 51375, 116222, 119142, 127442, 142254, 153286, 155023, 22541, 46005, 182785, 205662, 61165, 144596, 51275, 177954, 48823, 219645, 3084, 8721, 146275, 17565, 57305, 118912, 146989, 206013, 128221, 40437, 55270, 192802, 92525, 183937, 220230, 43550, 46880, 56462, 193987, 152961, 162432, 43249, 157821, 56686, 103350, 57509, 147179, 204595, 144580, 91355, 155573, 50702, 96578, 229726, 33377, 146294, 144529, 38645, 53968, 174050, 42652, 107918, 209673, 131257, 175795, 182083, 39709, 51680, 145326, 202876, 139743, 133866, 221057, 47843, 135884, 194660, 80602, 5151, 69290, 49106, 41372, 50054, 119798, 201995, 27833, 213489, 2552, 103757, 139126, 205965, 21565, 109594, 139143, 95213, 168594, 8295, 107746, 48633, 51565, 121759, 124806, 165297, 8858, 168415, 205374, 36291, 38832, 188342, 65224, 51894, 136891, 182808, 50398, 134134, 161741, 214580, 52534, 88648, 111909, 130891, 144347, 145899, 33191, 35279, 125042, 178432, 1128, 15284, 28047, 62081, 72359, 144383, 166893, 177544, 27186, 33119, 53848, 56247, 10318, 13463, 112272, 138972, 15079, 24082, 36118, 55252, 127295, 144690, 10788, 14263, 74803, 179469, 221824, 52269, 136543, 72810, 108106, 134688, 13605, 34744, 107781, 183957, 195805, 14823, 17943, 20827, 35634, 40892, 51368, 54007, 117928, 179645, 205008, 223768, 15354, 40102, 48730, 103308, 213735, 13491, 36202, 39617, 54305, 55719, 79126, 144251, 181386, 199426, 24145, 48970, 85613, 108868, 126137, 160451, 182602, 196198, 202593, 205100, 205178, 221276, 120234, 5534, 15236, 50585, 84864, 129328, 219741, 156356, 86591, 11670, 29721, 54364, 71545, 74815, 131589, 139261, 146096, 50285, 71392, 114854, 152931, 169999, 8242, 57478, 62417, 111260, 182506, 17688, 34796, 43260, 146362, 157911, 175343, 5282, 45570, 52948, 56261, 57527, 79678, 128070, 170101, 85036, 103923, 106792, 146449, 156276, 195604, 196920, 3796, 40839, 50916, 51342, 52751, 116864, 135801, 140220, 193642, 196275, 220855, 226649, 1694, 11775, 43184, 107072, 151999, 184762, 6175, 150549, 182543, 200143, 203039, 98018, 112499, 134073, 136233, 147188, 182640, 206111,22684, 34862, 53055, 72815, 181471, 197260, 203774, 14892, 23173, 49134, 55035, 55769, 130459, 131392, 214574, 223101, 36256, 51551, 51755, 137626, 143652, 146917, 219821, 69499, 143367, 34770, 105892, 122539, 128264, 144806, 152945, 181300, 204421, 204755, 42340, 56630, 147194, 170809, 188435, 209724, 213559, 23949, 54193, 67388, 179249, 211115, 31368, 34502, 51837, 57080, 94239, 133863, 178270, 216886, 131090, 139144, 205199, 40207, 54308, 55444, 56625, 56828, 90681, 126395, 128352, 146092, 146416, 161065, 200089, 53369, 56071, 127939, 178282, 37651, 39118, 39693, 47389, 61289, 73185, 132055, 145917, 181354, 199583, 218281, 10820, 133779, 141303, 200009, 54698, 70129, 91825, 168148, 202370, 213819, 220132, 93335, 145481, 199400, 54628, 178071, 202831, 57710, 73719, 143175, 146419, 161948, 180016, 14543, 66627, 57374, 89825, 124215, 155543, 181422, 205448, 205630, 49108, 55482, 57015, 98225, 146453, 218426, 103338, 179980, 207727, 178323, 27665, 55329, 96775, 136240, 144944, 180598, 93933, 146163, 183627, 13029, 103967, 127930, 147087, 176958, 54661, 122836, 183775, 193643, 205616, 48939, 102882, 157197, 17752, 28989, 74331, 154261, 39112, 43618, 140934, 185185, 138825, 138909, 143865, 147257, 67515, 205974, 24649, 55488, 75948, 122503, 23338, 39818, 89053, 90410, 137944, 158565, 53667, 110669, 41983, 155574, 199831, 7910, 183865, 52679, 54099, 157927, 42198, 220071, 223787, 54235, 98792, 146366, 178495, 146625, 78716, 121036.
Los aptámeros con motivos similares se eligen y fabrican usando el sintetizador de oligos. La afinidad de los candidatos prometedores se determina usando SPR como en el ejemplo 3.
Ejemplo 5: ensayo de sustracción de aptámero basado en microvesículas
Este ejemplo presenta un procedimiento de agotamiento de un grupo de aptámeros de aptámeros que reconocen biomarcadores encontrados en una muestra biológica. El método se puede usar para agotar los aptámeros que reconocen microvesículas de individuos sanos. Los aptámeros agotados proporcionan un grupo de aptámeros que se pueden detectar frente a microvesículas de individuos enfermos, identificando así aptámeros que reconocen preferentemente la enfermedad contra los sanos.
Sustracción del grupo de aptámeros
Las microvesículas circulantes se aíslan del plasma normal (por ejemplo, de individuos sin cáncer) usando uno de los siguientes métodos: 1) Aislamiento usando el reactivo ExoQuick según el protocolo del fabricante; 2) Ultracentrifugación que comprende centrifugar de 50,000 a 150,000 g, durante 1 a 20 horas, luego volver a suspender las pellas en PBS; 3) Aislamiento usando el reactivo TEXIS de Life Technologies según el protocolo del fabricante; y 4) metodología de filtración. El método de filtración se describe con más detalle a continuación:
Colocar la jeringa y el filtro (1.2 |im Acrodisc Syringe Filter Versapor Membrane Non-Pyrogenic Ref: 4190, Pall Life Sciences) en una columna abierta de 7 ml 150K MWCO (concentradores Pierce, 150K MWCO (corte de peso molecular) 7 ml. Parte número: 89922). Llenar el extremo abierto de la jeringa con 5.2 ml de IX PBS filtrado preparado en agua estéril de grado molecular.
Medir con pipeta el plasma del paciente (900-1000 |il) en el PBS en la jeringa, pipetear la mezcla dos veces
Filtrar el plasma en la columna de 7 ml 150K MWCO.
Centrifugar columnas de 7 ml 150K MWCO a 2000 x g a 20 °C (16 °C a 24 °C), durante 1 hora.
Después de 1 hora de centrifugado, verter el fluido continuo en lejía al 10 % para ser descartado.
Inspeccionar visualmente el volumen de la muestra. Si el concentrado de plasma está por encima de la graduación de 8.5 ml en el tubo concentrador, continuar la centrifugación de la muestra de plasma en incrementos de 10 minutos a 2000 x g a 20 °C (16 °C a 24 °C) verificando el volumen después de cada centrifugado hasta que el concentrado de plasma esté entre 8.0 y 8.5 ml.
Mezclar con pipeta lentamente en la columna un mínimo de 6 veces y ajustar la pipeta para determinar el volumen de concentrado de plasma. Si el volumen está entre 100 |il y el volumen diana, transferir el concentrado de plasma a un tubo de copolímero de 1.5 ml previamente marcado. Si el volumen sigue siendo mayor que el volumen diana, repetir la etapa de centrifugado anterior.
Verter ~45 ml de IX PBS filtrado preparado en agua estéril de grado molecular en un tubo cónico de 50 ml para su uso en la siguiente etapa.
Agregar la cantidad apropiada de IX PBS filtrado para reconstituir la muestra al volumen diana.
Las microvesículas producidas usando cualquiera de los métodos de aislamiento comprenderán una mezcla de tipos de vesículas y tendrán diversos tamaños con la excepción de los métodos de ultracentrifugación, que tienden a aislar los exosomas.
Los oligonucleótidos generados aleatoriamente (producidos como se describe en el ejemplo 1 anterior) se incuban con las vesículas normales aisladas en PBS, durante la noche a temperatura ambiente o a 4 grados Celsius.
Los aptámeros que no se unen a estas vesículas se aíslan centrifugando las vesículas de 50,000 a 150,000 X g, durante 1 a 20 horas y recogiendo el sobrenadante.
Los oligonucleótidos de aptámero se recogen del sobrenadante pasando la mezcla por una columna que contiene perlas recubiertas de estreptavidina. Estos aptámeros luego se agregan a las vesículas aisladas de pacientes enfermos (usando los mismos métodos que antes) y se incuban, durante la noche en PBS a temperatura ambiente o 4 grados Celsius.
A continuación, las vesículas se centrifugan a 50.000 a 150.000 X g, durante 1 a 20 horas y se desecha el sobrenadante. Las vesículas se vuelven a suspender en PBS y se lisan usando SDS o algún detergente similar.
Los aptámeros se capturan luego pasando la mezcla de lisis sobre una columna de perlas recubiertas con estreptavidina. Los aptámeros aislados luego se someten a una ronda de PCR para amplificar los productos.
A continuación, el procedimiento se repite un número determinado de veces, por ejemplo, cinco o más veces. El grupo restante de aptámeros se ha agotado de aptámeros que reconocen las microvesículas que se encuentran en el plasma “normal". Según lo anterior, este método se puede usar para enriquecer el grupo en aptámeros que reconocen vesículas de cáncer. Véase, la figura 6.
Ejemplo 6: Identificación de dianas aptámeros
El ejemplo anterior presenta un método de identificación de aptámeros específicos de enfermedades. El ejemplo presenta además métodos de identificación de las dianas de los aptámeros específicos de la enfermedad.
Un aptámero identificado según el método del ejemplo 5 se ata a una microperla. El aptámero ha mostrado la capacidad de reconocer preferentemente las vesículas de cáncer contra los controles. La microperla se incuba con una muestra biológica que comprende vesículas cancerosas en condiciones tales que el aptámero se pueda unir al antígeno que reconoce en la superficie de la microvesícula cancerosa. Una vez que se ha formado el complejo, el aptámero se fotorreticula con el antígeno. A continuación, la vesícula se rompe con un surfactante, dejando así el complejo aptámero-diana atado a la microesfera. Las microperlas se lavan y se recuperan. Las reticulaciones se interrumpen liberando así la diana en la solución. Las perlas se centrifugan a partir de la solución y la diana se concentra y aísla aún más mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La diana purificada se somete a espectrometría de masas para su identificación. Véase, la figura 14 para un esquema ilustrativo.
Ejemplo 7: Secuencias de aptámeros ilustrativas
Las siguientes tablas comprenden aptámeros ilustrativos útiles para la realización de la invención. Los aptámeros formaban parte del grupo de aptámeros aleatorios descritos en el ejemplo 1. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que se divulgan en la tabla 8 se pueden modificar en la medida en que las modificaciones resultantes den como resultado un aptámero que tenga aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de homología con la secuencia divulgada y conservan la funcionalidad de unión al antígeno EpCAM o fragmentos funcionales del mismo. Como se usa en el contexto de cualquier unidad numérica definida, el término “aproximadamente” significa una variación del 10 % por encima o por debajo de esa unidad numérica y todas las unidades intermedias. Las modificaciones indicadas en la tabla 8 se realizaron en los grupos de aptámeros para permitir la conjugación de la secuencia de aptámeros. Un experto apreciará que la cola de timina o una unidad estructural similar se puede conjugar con cualquiera de los extremos del aptámero.
Tabla 8: Aptámeros de EpCAM ilustrativos
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Ejemplo 8: Detección de microvesículas usando aptámeros anti-EpCAM
Los aptámeros se pueden usar como agentes de unión para detectar un biomarcador. En este ejemplo, los aptámeros se usan como agentes de unión para detectar la proteína EpCAM asociada con microvesículas.
Las figuras 18A-18D ilustran el uso de un aptámero anti-EpCAM (Aptámero 4; SEQ ID NO. 1) para detectar una población de microvesículas en muestras de plasma. Se obtuvieron muestras de plasma de tres hombres con cáncer de próstata y tres hombres sin cáncer de próstata (denominados controles o normales). Se conjugaron anticuerpos contra los siguientes antígenos de proteínas de superficie de microvesículas de interés con microperlas (Luminex Corp, Austin, TX): A) EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico); B) PBP (proteína de unión prostática; también conocida como PEBP1 (proteína 1 de unión a fosfatidiletanolamina)); C) EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales); y D) KLK2 (peptidasa 2 relacionada con calicreína). Las microvesículas en las muestras de plasma se capturaron usando anticuerpos conjugados con perlas. Se usó el aptámero 4 marcado con fluorescencia como detector en el ensayo de microperlas. Las figuras 18A-18D muestran los valores medios de fluorescencia (valores MFI) promedio detectados para las microvesículas capturadas con perlas y detectadas con el aptámero 4. Cada gráfico muestra individualmente los tres cánceres (C1-C3) y las tres muestras normales (N1-N3). Estos datos muestran que, en promedio, las muestras de cáncer de próstata tienen niveles más altos de microvesículas que contienen las proteínas diana que las muestras normales.
Ejemplo 9: Selección negativa y positiva de aptámeros
Los aptámeros se pueden usar en diversos ensayos biológicos, incluidos numerosos tipos de ensayos que se basan en un agente de unión. Por ejemplo, se pueden usar aptámeros en lugar de anticuerpos en ensayos basados en el sistema inmunitario. Este ejemplo proporciona un método de selección de aptámeros que identifica aptámeros que no se unen a ninguna superficie (sustratos, tubos, filtros, perlas, otros antígenos, etc.) a lo largo de las etapas del ensayo y se unen específicamente a un antígeno de interés. El ensayo se basa en la selección negativa para retirar los aptámeros que se unen a componentes antigénicos no diana del ensayo final. La selección negativa va seguida de una selección positiva para identificar los aptámeros que se unen al antígeno deseado.
Se hicieron experimentos preliminares con cinco bibliotecas de aptámeros de ADN con 1015 secuencias cada una y se amplificaron previamente longitudes variables (60, 65, 70, 75, 80 mers) y se separaron las cadenas para que la cadena directa (no biotinilada) sirva como aptámero. Se realizaron múltiples rondas de selección negativa y selección positiva. Antes de cada ronda, los productos de aptámero recuperados se amplificaron mediante PCR y se separaron las cadenas usando la metodología estándar.
La biblioteca de aptámeros y los cebadores usados para amplificar los aptámeros recuperados después de cada ronda de selección se muestran en la tabla 9. En las secuencias de la biblioteca de aptámeros, 20N-40N se refieren al número de nucleótidos aleatorios en la secuencia de la biblioteca.
Tabla 9: Biblioteca de aptámeros y cebadores de PCR
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Las selecciones se realizaron de la siguiente manera:
Selección negativa
1. Preparar la mezcla de selección negativa de perlas: Incubar 1200 perlas no magnéticas con agente de bloqueo estándar, durante 20 min.
2. Agregar 50 pl de biblioteca de aptámeros (5 bibliotecas en total) a un tubo de tira de PCR con 4.5 pl de cada mezcla de perlas. Incubar, durante 2 h a 37 °C con agitación a 550 rpm.
3. Humedecer previamente la placa de filtro (1.2 |im, Millipore) con solución reguladora PBS-BN. Agregar 150 pl de PBS-BN.
4. Transferir las muestras de los tubos de tiras de PCR a la placa de filtro, incubar, durante 1 h a temperatura ambiente con agitación a 550 rpm.
5. Recoger el flujo de la placa de filtro en una placa de recolección (NBS) usando un colector de vacío.
6. Concentrar y limpiar las muestras para retirar el exceso de materiales según se desee.
El procedimiento de selección negativa se repite hasta 6-7 veces.
Selección positiva
Antes de comenzar, conjugar los biomarcadores proteicos de interés (SSX4, SSX2, PBP, KLK2, SPDEF) con las microperlas no magnéticas deseadas usando condiciones conocidas en la técnica. El material de partida recombinante purificado incluía: proteína recombinante SPDEF de Novus Biologicals (Littleton, CO, EE. UU.), número de catálogo H00025803-P01; proteína recombinante KLK2 de Novus, número de catálogo H00003817-P02; proteína recombinante SSX2 de Novus, número de catálogo H00006757-P01; proteína recombinante PBP de Fitzgerald Industries International (Action, MA, EE. UU.), número de catálogo 30R-1382; proteína recombinante SSX4 de GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA, EE. UU.), número de catálogo GWB-E219AC.
1. Bloqueo de perlas: Incubar el número deseado de cada perla (8400 x número de bibliotecas de aptámeros (5) x un factor de exceso de (1.2)) con un bloque inicial, durante 20 min.
2. Mezclar 50 pl de cada muestra de la biblioteca de aptámeros en los tubos de tiras de PCR y agregar 2.3 pl de la muestra de microperlas con el antígeno particular. Incubar, durante 2 h a 37 °C con agitación a 550 rpm.
3. Humedecer previamente la placa de filtro (1.2 |im, Millipore) con solución reguladora PBS-BN. Agregar 150 pl de PBS-BN.4
4. Transferir las muestras de los tubos de tiras de PCR a la placa de filtro, incubar, durante 1 h a temperatura ambiente con agitación a 550 rpm.
5. Lavar 3 veces con PBS-BN, agregar 50 pl de PBS y recoger muestras desde la parte superior del filtro hasta los tubos de 1.5 ml.
La selección positiva se repite hasta 16 veces. Ciertas rondas de selección positiva tienen etapas adicionales para tratar el ARN recuperado (es decir, los candidatos a aptámeros restantes) de la siguiente manera:
La ronda 8 de selección positiva se modificó de la siguiente manera:
1. Después del tercer lavado (PBS-BN), se recogieron 25 pl de muestra de la parte superior del filtro en tubos de 1.5 ml.
2. La placa de filtro se incubó a 45 °C, durante ~10 min y se lavó inmediatamente al vacío. La placa se lavó tres veces más con PBS-BN.
3. Se agregaron 50 pl de PBS a la placa y se repitió la etapa 2.
4. Después del último lavado, se agregaron 25 pl de PBS a los pocillos. Las muestras se mezclaron bien y se recogieron de la parte superior del filtro en tubos de 1.5 ml.
La ronda 9 de selección positiva se modificó de la siguiente manera:
1. Después del lavado final en la etapa 5), se agregaron 5 pg/ml de estreptavidina-PE a la mezcla de aptámeros y se incubó, durante 30 min a temperatura ambiente con agitación a 550 rpm.
2. Las muestras en la placa de filtro se lavaron 3 veces con PBS-BN (+ NaCl 500 mM adicional).
3. Se realizó un lavado adicional con PBS-BN normal.
4. Se agregaron 50 pl de PBS a las muestras seguido de recogida como se indicó anteriormente en tubos de 1.5 ml.
5. Las muestras se almacenaron a -20 °C.
La ronda 14 de selección positiva se modificó de la siguiente manera:
Antes de comenzar esta ronda, los antígenos de interés (SSX4, SSX2, PBP, KLK2, SPDEF) se conjugaron con perlas magnéticas carboxiladas usando métodos conocidos en la técnica.
1. Bloqueo de perlas: tomar el número deseado de cada perla no magnética (3000 x número de bibliotecas de aptámeros (5) x un factor de exceso de 1.2), agregar el bloque inicial (3:1, bloqueo por 1200 perlas), hacer 5 mezclas de 4 antígenos y complementar cada uno con un antígeno diana diferente conjugado con perlas magnéticas (véase, la tabla 10 a continuación, en la que los antígenos están conjugados con perlas no magnéticas excepto cuando se indique), incubar 20 min.
Tabla 10: Mezclas de bloqueo de perlas
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2. Agregar 50 pl de bibliotecas de aptámeros a los tubos de tiras de PCR, agregar mezclas de perlas con el antígeno diana en perlas magnéticas a los tubos con la biblioteca de aptámeros correspondiente preseleccionada e incubar, durante 2 h a 37 °C con agitación a 550 rpm.
3. Humedecer previamente la placa de filtro con solución reguladora PBS-BN, agregar 150 pl de PBS-BN.
4. Transferir las muestras de los tubos de tiras de PCR a la placa de filtro, incubar 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 550 rpm.5
5. Después del último lavado (estándar), agregar 5 pg/ml de estreptavidina-PE, incubar, durante 30 min a temperatura ambiente con agitación a 550 rpm;
6. Lavar 3x con PBS-BN (+ NaCI 500 mM adicional).
7. Realizar un lavado adicional con PBS-BN normal.
8. Se agregaron 50 |il de PBS a las muestras, seguido de la recogida como antes en tubos de 1.5 ml.
9. Retirar las perlas magnéticas con un soporte magnético y reemplazarlas con solución reguladora PBS nueva.
10. Las muestras se almacenaron a -20 °C para la posterior extracción de ADN y separación de cadenas.
Las etapas opcionales implementadas en la última ronda de selección positiva están destinados a aumentar la rigurosidad de la unión del aptámero (por ejemplo, mayor calor o concentración de sal).
Las figuras 19A-19E ilustran la selección de aptámeros para antígenos de interés, durante la selección positiva. Previamente se habían realizado tres rondas de selección negativa. Las figuras 19A-19C ilustran cinco bibliotecas de aptámeros de ADN (marcadas 1M-5M) seleccionadas para unirse a SPDEF. Después de la selección negativa, las bibliotecas se incubaron con una mezcla de 4 antígenos (SSX2, SSX4, PBP, KLK2) conjugados con microperlas y complementados con antígeno SPDEF conjugado con perlas magnéticas. Las muestras se procesaron según el protocolo de sección positiva anterior. Después de recoger las perlas magnéticas, los aptámeros de ADN unidos se extrajeron de las perlas y se volvieron a amplificar. Las figuras 19A-19C ilustran los aptámeros recuperados de cada biblioteca inicial después de una (Figura 19A), dos (Figura 19B) y tres rondas (Figura 19C) de selección positiva.
Las figuras 19D-19E ilustran el cribado de 25 bibliotecas de aptámeros después de la ronda 13 de selección positiva frente al antígeno específico (5 bibliotecas por cada uno de los antígenos SSX2, SSX4, PBP, KLK2 y SPDEF). La selección de aptámeros después de esta ronda se modificó con la inclusión de antígenos de confusión según las modificaciones de la ronda 13 descritas anteriormente. Los aptámeros de ADN unidos a perlas magnéticas conjugadas con los aptámeros de interés se extrajeron de las perlas y se volvieron a amplificar. Las bibliotecas recuperadas se muestran en la figura 19D. La figura 19E muestra las bibliotecas después de una ronda adicional de selección y lavado riguroso.
Ejemplo 10: Separación de cadenas
Después de cada ronda de selección en el ejemplo anterior, el grupo de aptámeros recuperado se amplificó usando PCR con protocolos estándar. Los productos de la PCR se capturaron y la cadena se separó usando la metodología presentada en este ejemplo.
Separación de cadenas de selección negativa
Preparar 20 |iL/PCR de perlas magnéticas de estreptavidina (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) colocándolas en un imán, durante 1 min. Retirar la solución reguladora de almacenamiento por completo. Lavar 3 veces con PBS-T. Volver a suspender en volumen equivalente de PBS-T como al inicio. Dividir en alícuotas de 20 jj,L/pocillo en todos los pocillos de aptámeros relevantes (25/placa) en una placa de 96 pocillos.
Agregar 80 |iL adicionales de PBS-T/pocillo.
Agregar los contenidos de PCR restantes para cada aptámero respectivo en el pocillo apropiado. Incubar a temperatura ambiente, durante 15 minutos con agitación suave. Colocar las placas en el imán. Retirar el sobrenadante y descartarlo. Lavar 3X con 150 |iL de PBS.
Después del lavado final, colocarlo en un imán y retirar el PBS. Agregar 50 |iL de NaOH 0.1 M e incubar, durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, retirar el aptámero de la solución de la cadena separada y colocarlo en un nuevo pocillo de 96 dejando la cadena complementaria inmovilizada en las perlas. Neutralizar la solución con la adición de 5 |iL de HCl 1 M. Llevar el volumen hasta 100 |iL con 45 |iL de agua.
Precipitar con etanol agregando 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M pH 5.2 y 3X volúmenes de etanol al 95 %.
Agregar 1.25 |iL de glucógeno (Roche 20 |ig/|iL) y centrifugar a temperatura ambiente, durante 15 minutos. Descartar el sobrenadante y permitir que se seque el sedimento.
Volver a suspender en solución reguladora apropiada para la siguiente ronda de selección.
Separación de cadenas de selección positiva
1. Tomar una alícuota de cada muestra en un tubo Eppendorf de 1.7 ml.
2. Tomar una alícuota previa en tubos etiquetados de 5 |iL de HCl 1M. Debe haber un tubo/muestra.
3. Si el volumen de la muestra es de ~38 |iL, agregar 420 |iL de Tween al 0.05 % en IX PBS (para preparar, agregar 250 |iL de Tween en 500 mL de Hyclone PBS y mezclar bien, pipetear el tween lentamente, el material es viscoso).
4. Para preparar las perlas de estreptavidina, se necesitan 40 |iL por muestra (mantener las perlas agrupadas en un tubo para los lavados). Si realiza separaciones de 25 cadenas, hacer una alícuota de 540 |iL de perlas x2 tubos (incluye excedente). Agitar bien con vortex las perlas antes de prepararlas, no debe haber grumos evidentes.
5. Colocar las perlas en el imán y esperar a que se aclare la solución.
6. Retirar el sobrenadante sin perturbar las perlas.
7. Agregar 1 mL de Tween al 0.05 % en IX PBS a las perlas y mezclar el imán. Reemplazar el imán después de mezclar y esperar a que la solución se aclare.
8. Retirar el sobrenadante sin perturbar las perlas.
9. Repetir las etapas 7 y 8. Volver a suspender las perlas en solución de tween-PBS en el mismo volumen de las alícuotas anteriormente.
10. Agitar bien con vortex las perlas fuera del imán y agregar 40 |iL a cada una de las muestras.
11. Tapar bien las muestras y colocarlas en el rotador, durante 15 minutos a temperatura ambiente.
12. Volver a colocar las muestras en el imán para lavar las muestras no unidas.
13. Agregar 1 mL de Tween al 0.05 % en IX PBS a cada tubo, apuntando hacia la pared magnética. Espere a que la solución se aclare.
14. Retirar el sobrenadante sin perturbar las perlas.
15. Repetir las etapas 12 y 13. Asegurarse de que no queden los restos de solución en el tubo.
16. Fuera del imán, agregar 50 |iL de NaOH 0.1 M a cada muestra.
17. Colocar los tubos en Mix Mate, durante 5 minutos a 350 RPM a temperatura ambiente.
18. Después de 5 minutos, colocar los tubos en el imán.
19. Después de que las perlas se aclaren y se peguen al imán, retirar el sobrenadante y agregarlo a los tubos de HCl de 5 |iL debidamente etiquetados (estos deben haber sido divididos en alícuotas y marcados antes de comenzar la separación de las cadenas). Esto debería neutralizar la solución. La solución debe estar ligeramente turbia.
20. Llevar el volumen a 100 |iL en cada tubo agregando 45 |iL de agua libre de RNasa/DNasa de grado molecular. Colocar las muestras brevemente en hielo.
21. Agregar 11 |iL de acetato de sodio 3M a cada tubo. Esto podría aclarar parte de la solución.
22. Agregar 350 |iL de etanol al 95 % a cada tubo.
23. Agregar 1.25 |iL de glucógeno a cada tubo, debe haber un rastro blanquecino tenue que se pueda ver.
24. Mezclar por inversión 10x.
25. Centrifugar los tubos de etanol, durante un mínimo de 16 minutos a máxima velocidad a temperatura ambiente.
26. Cuando se complete la centrifugación, retirar el etanol de los tubos, con cuidado de no alterar las pellas. Usar primero un p1000, seguido de un p200.
27. Dejar que las muestras se sequen al aire, durante ~5 minutos o hasta que desaparezcan los residuos de etanol. No dejar que se seque al aire demasiado tiempo.
28. Volver a suspender las muestras en 55 |iL de HEPES 25 mM en PBS-BN.
29. Dejar reposar, durante ~2 minutos y agitar con vortex la muestra y dejar hasta que se detenga.
30. Tomar una alícuota de 5 |iL en tubos etiquetados con selección positiva, el número de ronda, la fecha, el número de muestra y 'post-Amp'. Congelar a -20 °C.
31. Los 50 |iL restantes se usan para la siguiente ronda de selección.
Ejemplo 11: Descubrimiento y caracterización de aptámeros anti-EpCAM
En este ejemplo, se caracteriza un aptámero de EpCAM identificado mediante la técnica de los ejemplos 9-10 anteriores. Después de la selección de un grupo de aptámeros de unión a EpCAM como se describe anteriormente, la biblioteca de aptámeros se secuenció usando el protocolo estándar Ion Torrent (Life Technologies, Carlsbad, CA). Los candidatos principales se seleccionaron como aquellos que tenían (a) motivos muy abundantes en todas las secuencias de lectura con el producto de longitud completa esperada y (b) estructura secundaria fuerte (Figura 20B).
Se seleccionaron aptámeros para la proteína EPCAM conjugada con perlas MicroPlex en competencia con proteínas recombinantes SSX4, SSX2, PBP, KLK2 y SPDEF. Una porción de los aptámeros se seleccionó en rondas iniciales frente a EpCAM que se unió a una etiqueta Fc, y después de la ronda 8, la selección se cambió a EPCAM con una etiqueta de histidina. Se seleccionó otra porción de los aptámeros en las rondas iniciales frente a EpCAM que se unió a una etiqueta de histidina, y después de la ronda 8, la selección se cambió a EPCAM con una etiqueta Fc. Los expertos en la técnica conocen métodos para el uso de etiquetas de Fc y de histidina para la purificación y captura de proteínas. En la tabla 11 se muestra un número de secuencias representativas obtenidas de estos procedimientos. En la tabla 11, las secuencias se muestran de 5' a 3' de izquierda a derecha, en las que cada secuencia completa consiste en la secuencia líder 5' indicada seguida de la secuencia variable indicada seguida de la secuencia de cola 3' indicada. Cada secuencia se deriva de una biblioteca que tiene un líder y una cola (véase, la tabla 9) con una secuencia variable entre estas. La tabla indica si la secuencia identificada comprende una unidad estructural de biotina en el extremo 5' o 3'. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que se divulgan en la tabla 11 también se pueden modificar en la medida en que las modificaciones resultantes den como resultado un aptámero que tenga aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de homología con la secuencia divulgada y conservan la funcionalidad de unión al antígeno EpCAM o fragmentos funcionales del mismo.
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Se eligieron candidatos a aptámeros adicionales en el cribado clonal inicial y se validaron adicionalmente tanto en Fc -EpCam como en diana Histag Epcam por titulación del aptámero y la proteína EpCAM diana. En la tabla 12 se muestra un número de secuencias representativas obtenidas de estos procedimientos. CAR027 y CAR028 se identificaron inicialmente frente a la diana Fc- EpCam, mientras que CAR029 y CAR030 se identificaron inicialmente frente a la diana Histag EpCam. En la tabla 12, las secuencias se muestran de 5' a 3' de izquierda a derecha, en las que cada secuencia completa consiste en la secuencia líder 5' indicada seguida de la secuencia variable indicada seguida de la secuencia de cola 3' indicada. Cada secuencia se deriva de una biblioteca que tiene un líder y una cola (véase, la tabla 9) con una secuencia variable entre estas. La tabla indica si la secuencia identificada comprende una unidad estructural de biotina en el extremo 5' o 3'. La tabla 13 presenta aptámeros candidatos modificados en base a las secuencias completas de la tabla 12. En la tabla se enumeran los fundamentos de las modificaciones. Las secuencias se acortan en la medida en que conservan la estructura secundaria esperada. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que se divulgan en las tablas 12 y 13 se pueden modificar en la medida en que las modificaciones resultantes den como resultado un aptámero que tenga aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de homología con la secuencia divulgada y conservan la funcionalidad de unión al antígeno EpCAM o fragmentos del mismo.
Tabla 12: Secuencias candidatas de aptámeros adicionales de EpCAM 10*5
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Tabla 13: Optimización de aptámeros EpCAM
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Desarrollo de aptámeros
Como aptámero de ARN, CAR003 con secuencia de cola alternativa tiene la siguiente secuencia de ARN (SEQ ID NO. 230847):
-auccagagug acgcagcagu cuuuucugau ggacacgugg uggucuagua ucacuaagcc
accgugucca-3f
CAR003 (CAR003.2_5'-B, CAR003.2_3'-B) se caracterizó adicionalmente. El aptámero CAR003 de EpCAM se modifica según se desee en el extremo 3' mediante la unión de una unidad estructural de biotina (CAR003.2_3'-B). La biotina se puede usar para unir el aptámero usando un sistema de estreptavidina-biotina, por ejemplo, para marcaje, captura y/o anclaje. La figura 20B ilustra la estructura secundaria óptima de CAR003 con una energía libre mínima (AG) de -30.00 kcal/mol. En la ilustración, el aptámero se muestra como un aptámero de ARN (SEQ ID NO. 230847) correspondiente a la secuencia de ADN CAR003 (SEQ ID NOs. 230822-230823).
Síntesis y purificación. El aptámero CAR003 seleccionado se volvió a sintetizar usando el sintetizador AKTA OligoPilot 100 (GE Healthcare Life Sciences Corp., Piscataway, NJ) con una biotina de 3' y detritilación final. El producto se purificó con cromatografía de intercambio de aniones por FPLC. Varias fracciones después de FPLC se combinaron como se muestra en los grupos 1-3 indicados en la figura 20C. La figura comprende un cromatograma de FPLC con todos los productos y fracciones asignados en grupos después de comprobar la calidad en gel. La figura 20D ilustra un gel teñido con SYBR GOLD con diferentes fracciones de FPLC del aptámero CAR003 después de la síntesis. Se combinaron diferentes fracciones en grupos en función de la cantidad de cadenas sin terminar en orden de mayor a menor (grupo 1-grupo 3). Los grupos 1-3 corresponden a los indicados en la figura 20C.
Caracterización del aptámero CAR003. Se analizó el aptámero CAR003 purificado para determinar la unión a la proteína EPCAM recombinante con una etiqueta de polihistidina ("marcado con His") usando el siguiente ensayo desarrollado internamente. Se mezclaron perlas conjugadas con etiqueta anti-His con proteína marcada con EPCAM-His. El aptámero que se va a probarse marcó con estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE). Se mezclaron las perlas EpCAM y los aptámeros marcados con SA-PE. La unión se determinó como valor medio de fluorescencia en un ensayo de perlas como se describe en este documento. Los valores de MFI (Figura 20E-F) aumentan con el aumento de la unión del aptámero marcado con SA-PE a la EpCAM recombinante. Las figuras 20E-F ilustran la unión de CAR003 a la proteína EPCAM en HEPES 25 mM con PBS-BN (PBS, BSAal 1 %, azida al 0.05 %, pH 7.4) (Figura 20E) o en HEPES 25 mM con MgCh 1 mM (Figura 20F). Se usó un aptámero de EPCAM, aptámero 4 (véase arriba) para la comparación. Como se muestra en las figuras, el grupo 3 de CAR003 se une más eficientemente a su diana en presencia de MgCh (Figura 20F) que en presencia de BSA (Figura 20E).
Para comprender mejor su rendimiento, se probó la unión de CAR003 en presencia de ambos BSA y MgCh en diversas soluciones reguladoras. La figura 20G ilustra la unión de CAR003 a EpCAM en las sales indicadas con y sin adición de albúmina de suero bovino (BSA). Nuevamente, la unión de CAR003 a EpCAM es más eficiente cuando BSA no está presente. Además, se probó NaCl 150 mM pero no pareció mejorar el rendimiento de CAR003 sobre MgCh.
Otro factor que podría influir en el rendimiento del aptámero es la desnaturalización con diferentes composiciones de sal. La figura 20H ilustra el efecto de la desnaturalización en la unión de CAR003 a la proteína EPCAM. Como se ve en el gráfico, la desnaturalización del aptámero tiene un efecto positivo en la unión de CAR003 a EpCAM similar al efecto en CAR003 de MgCh. Sin embargo, la desnaturalización en presencia de MgCh puede no mejorar sinérgicamente la unión de CAR003 a EpCAM. Curiosamente, CAR003 parecía más estable en comparación con el control aptámero 4 en las condiciones probadas.
La afinidad de CAR003 por EpCAM en el entorno del ensayo de perlas se evaluó en el mismo ensayo que el anterior con aptámero titulado a través de una entrada constante de antígeno. La figura 20I ilustra la titulación de aptámeros frente a proteína recombinante EPCAM (entrada constante 5 pg). En las condiciones probadas, el aptámero 4 tenía una mayor afinidad por la proteína EPCAM en comparación con CAR003, como se sugiere a partir del nivel de saturación que comienza con 5 pg de entrada de aptámero.
Para evaluar la especificidad de CAR003, se probó usando Western Blot frente a la proteína recombinante EPCAM y controles que comprendían albúmina de suero bovino (BSA) y albúmina de suero humano (HSA).
La figura 20J ilustra un Western blot con aptámero CAR003 contra proteína marcada con his de EPCAM, BSA y HAS (5 |ig cada uno). El gel se bloqueó con F127 al 0.5 % y se sondeó con ~50 pg/ml de aptámero biotinilado CAR003, fracción 3. La transferencia se visualizó con NeutrAvidin-HRP seguido de SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate. El Western blot probado con el aptámero CAR003 mostró una clara preferencia del aptámero por la proteína EPCAM sobre las albúminas.
Prueba de CAR003 con muestras de plasma. Muestras de plasma de cinco sujetos con cáncer de próstata y cinco sujetos normales se analizaron con CAR003 para detectar microvesículas usando proteínas conjugadas con perlas para capturar las microvesículas y aptámero marcado con SA-PE para detectar las vesículas como se describe en el ejemplo 8. Se usó un detector de aptámero 4 marcado con SA-PE, usado como control. Los niveles de cambio de cáncer sobre normal se muestran en la tabla 14. Los niveles de cambio se muestran sin normalización ("sin procesar") o con normalización a un control negativo. Las vesículas se capturaron con anticuerpos conjugados con perlas para SSX4, PBP, SPDEF, EPCAM, KLK2 y SSX2 como se indica.
Tabla 14: CAR003 para detectar microvesículas
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Bajo las condiciones probadas, las muestras detectadas con CAR003 tenían valores MFI más bajos en comparación con la detección con el aptámero 4, mientras que CAR003 tenía una mejor proporción señal-ruido y mostró una mejor separación entre las muestras con cáncer y normales con marcadores de captura SSX4, SPDEF, EPCAM y SSX2. Aptámero de control
Las características de los aptámeros (tamaño, estabilidad, afinidad de unión y especificidad, etc.) se pueden comparar con los aptámeros de control específicos de EpCAM u otras dianas. Por ejemplo, los aptámeros se comparan con el aptámero anti-VEGF 5' biotina-CA ATT GGG CCC GTC CGT ATG GTG g Gt (Se Q. ID NO. 230912) como se describe en Kaur and Yung, 2012.
Referencias:
1. Müller, J., et al. "Selection of high affinity DNA-aptamer for activated protein C using capillary electrophoresis."Research in Pharmaceutical Sciences 7.5 (2012): S987.
2. Cerchia, L., and V. de Franciscis. "Nucleic Acid Aptamers Against Protein Kinases". Current medicinal chemistry 18.27 (2011): 4152-4158.
3. Wu, Jie, et al. "Identification, Characterization and Application of a G-Quadruplex Structured DNA Aptamer against Cancer Biomarker Protein Anterior Gradient Homolog 2". PloS ONE 7.9 (2012): e46393
4. Mitkevich, Olga V., et al. "DNA aptamers detecting generic amyloid epitopes". Prion 6.4 (2012): 400-406.
5. Kaur H, Yung L-YL (2012) Probing High Affinity Sequences of DNA Aptamer against VEGF165. PLoS ONE 7(2): e31196. doi:10.1371/journal.pone.0031196.
Ejemplo 12: Optimización de aptámeros anti-EpCAM
Este ejemplo demuestra la optimización del aptámero CAR016 (SEQ ID NO. 230840), que se presenta anteriormente. CAR016 fue el aptámero más prevalente identificado en varias rondas de selección de aptámeros EpCAM como se describe anteriormente (véase, el ejemplo 9). Su secuencia variable, como se muestra arriba, y las secuencias con motivos comunes representaron más del 50 % de los grupos de aptámeros seleccionados. La tabla 15 muestra las variantes relacionadas con CAR016 más comunes de dos análisis de secuenciación independientes (Análisis de Sec 1 y 2) usando una plataforma Ion Torrent después de 9 rondas de selección.
Tabla 15: Secuencias representativas del cribado de aptámeros EpCAM
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Juntas, las secuencias de la tabla 15 se pueden representar mediante la siguiente secuencia, donde [AT] especifica que está presente una adenina (A) o una timina (T): 5'-CGTA[AT] G[TG] [AT] TAT [CG] TG[TC] [At ] CA (ID CAR016_CAN; SEQ ID NO. 230870).5*10
Las pruebas a través de ELISA demostraron que CAR016 se unía a EpCAM-Fc en placas de ELISA estándar y a la proteína marcada con EPCAMHis en placas de ELISA recubiertas de níquel. En los ensayos de unión de microperlas con microperlas recubiertas de microvesículas, CAR016 tuvo los valores medios de fluorescencia más altos entre todos los aptámeros candidato probados, incluido el Aptámero 4. De este modo, se crearon una variedad de variantes de CAR016 para probar el rendimiento mejorado. Las variantes de secuencia se muestran en la tabla 16 y el razonamiento detrás de cada variante se describe en la tabla 17. “n/a” en la tabla 16 indica que la sección del aptámero no está presente. Los nucleótidos subrayados en la tabla 16 indican nucleótidos modificados en comparación con CAR016. Véase la tabla 17 para una descripción más detallada. Se realizan ciertas mutaciones para examinar los efectos de la estabilidad del aptámero según lo estimado por los cálculos de AG. La estabilidad estimada de CAR016 es AG = -10.89 kcal/mol. Un Ag más bajo indica una mayor estabilidad estimada. Véase en particular CAR016_M23 a CAR016 M27.
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Tabla 17: secuencia racional del mutante CAR016 del aptámero EpCAM
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Como se observa en las tablas 16 y 17, se realizan diversas modificaciones a lo largo de los aptámeros, incluidas las secuencias del cebador líder en 5' y cola en 3'. Las variantes de aptámero se sintetizan y la unión a EpCAM se evalúa mediante ELISA y ensayo de microperlas como se describe anteriormente para CAR016. Los resultados divulgan regiones de la secuencia del aptámero que mejoran o degradan la capacidad del aptámero para unirse específicamente a la proteína EpCAM y las microvesículas EpCAM+. Las figuras 21A-21J muestran las estructuras secundarias predichas de CAR016 y las variantes de CAR016 indicadas en las tablas 16 y 17.
Ejemplo 13: Aptámeros a microvesículas VCAP
En este ejemplo, se identificaron aptámeros que reconocen microvesículas desprendidas por la línea celular VCAP de cáncer de próstata. Las microvesículas de VCAP se recubrieron sobre una placa ELISA estándar con una superficie de alta unión. Después de lavar el exceso de microvesículas no unidas de los pocillos, los pocillos se bloquearon con Pluronic® F-127 (Sigma Aldrich). Se incubó una biblioteca de aptámeros 20n (véase, la tabla 9) con las microvesículas unidas-pocillo. Los pocillos se lavaron para retirar los aptámeros no unidos. Los aptámeros de microvesículas VCAP restantes se eluyeron, purificaron, amplificaron y separaron y se limpiaron antes de la próxima ronda. Véase, la metodología detallada arriba. Las etapas anteriores se repitieron, durante 8 rondas. Después de la ronda 8, el grupo de aptámeros seleccionado se sometió a secuenciación IonTorrent.
Los aptámeros que tienen la frecuencia más alta entre las lecturas totales se muestran en la tabla 18. En la tabla 18, las secuencias se muestran de 5' a 3' de izquierda a derecha, en las que cada secuencia completa consiste en la secuencia líder 5' indicada seguida de la secuencia variable indicada seguida de la secuencia de cola 3' indicada. Cada secuencia se deriva de una biblioteca que tiene un líder y una cola (véase, la tabla 9) con una secuencia variable entre estas. La tabla indica si la secuencia identificada comprende una unidad estructural de biotina en el extremo 5' o 3'. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que se divulgan en la tabla 18 también se pueden modificar en la medida en que las modificaciones resultantes den como resultado un aptámero que tenga aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de homología con la secuencia divulgada y conserve la funcionalidad de unión a antígenos vesiculares o fragmentos funcionales de los mismos.
Tabla 18: Secuencias de aptámeros de microvesículas VCAP
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Las secuencias en la tabla 18 fueron las más comúnmente representadas en el grupo de secuenciación con dos análisis de secuenciación independientes. Las frecuencias más altas fueron: 1) CAR023, 18.3 %; 2) CAR024, 12.7 %; 3) CAR025, 9.8 %; y 4) CAR026, 8.8 %. CAR031 fue la quinta secuencia más común. Las secuencias se validaron aún más mediante la titulación de los aptámeros y los exosomas de VCap diana.
Los aptámeros en la tabla 18 también se modifican directamente con una etiqueta en lugar de la unidad estructural biotina 5'. Por ejemplo, la biotina se puede sustituir con una digoxigenina 5' (NHS Ester) (abreviado como “/5DigN/"). El grupo de la digoxigenina proporciona una etiqueta fluorescente. La digoxigenina 5' se puede separar de la secuencia de nucleótidos con un espaciador, por ejemplo, espaciador Int 18 (abreviado como “/Int18/"), que es un espaciador de hexaetilenglicol de 18 átomos y está disponible en Integrated DNA Technologies (IDT). Los espaciadores similares también disponibles de IDT que se pueden usar incluyen: 1) espaciador C3, una fosforamidita que se puede incorporar internamente o en el extremo 5' del oligo. Se pueden agregar múltiples espaciadores C3 en cualquier extremo de un oligo para introducir un brazo espaciador hidrofílico largo para la unión de fluoróforos u otros grupos colgantes; 2) El espaciador PC (fotoescindible) se puede colocar entre bases de ADN o entre el oligo y un grupo modificador 5'. Ofrece un brazo espaciador de 10 átomos que se puede dividir con la exposición a la luz ultravioleta en el intervalo espectral de 300-350 nm. La escisión libera el oligo con un grupo 5'-fosfato; 3) El hexanodiol es un espaciador de glicol de seis carbonos que es capaz de bloquear la extensión por las ADN polimerasas. Esta modificación 3' es capaz de soportar la síntesis de oligos más largos; 4) El espaciador 9 es un espaciador de trietilenglicol que se puede incorporar en el extremo 5' o el extremo 3' de un oligo o internamente. Se pueden usar inserciones múltiples para crear brazos espaciadores largos; y 5) La modificación 1',2'-Didesoxirribosa (espaciador d) se usa para introducir un sitio abásico estable dentro de un oligonucleótido.
Ejemplo 14: Identificación de aptámeros diana
En este ejemplo, los aptámeros conjugados con microesferas se usan para ayudar a determinar la diana de dos aptámeros identificados mediante métodos de cribado de bibliotecas como se describe anteriormente. El enfoque general se muestra en la figura 14. El enfoque se usa para verificar las dianas de CAR029, un aptámero identificado mediante cribado de biblioteca para reconocer EpCAM, y CAR024, un aptámero identificado mediante cribado de biblioteca para reconocer una diana desconocida en la superficie de las microvesículas VCAP. Véase la descripción anterior para CAR029 y CAR024. En este enfoque, las secuencias de CAR029 y CAR024 se reorganizan aleatoriamente antes de vincularlas a las microesferas. Las microesferas se usan como controles para unirse a dianas que son similares pero no idénticos a la molécula diana prevista.
Los controles de aptámero de ejemplo usados en este estudio se muestran en la tabla 19. En la tabla 19, las secuencias se muestran de 5' a 3' de izquierda a derecha. Cada secuencia se deriva del reordenamiento aleatorio de CAR029 o CAR024 como se indica en la ID del aptámero en la tabla. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que se divulgan en la tabla 19 también se pueden modificar en la medida en que las modificaciones resultantes den como resultado un aptámero que tenga aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de homología con la secuencia divulgada y conserve la funcionalidad deseada.
Tabla 19: Secuencias de aptámeros de control negativo
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El protocolo usado es el siguiente:
1) Los aptámeros candidatos (aquí, CAR029 y CAR024) y los aptámeros de control (aquí, CAR029-Neg1, CAR029-Neg2, CAR024-Neg1, CAR024-Neg2) se sintetizan con modificaciones para permitir la captura (aquí, los aptámeros se biotinilan) y se someten a reticulación (aquí, usando el kit y el reactivo de transferencia de etiquetas de biotina Sulfo-SBED, número de catálogo 33073 de Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, para permitir la fotoreticulación).
2) Cada uno de los aptámeros se mezcla individualmente con microvesículas que tienen la diana de interés (aquí, microvesículas VCAP).
3) Después de la incubación para permitir que los aptámeros se unan a la diana, se aplica luz ultravioleta a las mezclas para desencadenar la reticulación de los aptámeros con las dianas de las microvesículas.
4) Las microvesículas se lisan, liberando así el complejo diana-aptámero reticulado en solución.
5) Los complejos diana-aptámero reticulados se capturan de la solución usando un sustrato recubierto con estreptavidina.
6) Los complejos diana-aptámero reticulados para cada aptámero se analizan individualmente en electroforesis en gel SDS-PAGE. Las dianas de proteínas capturadas se visualizan con tinción con azul de Coomasie.
7) Las etapas de reticulación y unión pueden ser promiscuos, de modo que en cada uno de los geles aparecerán múltiples bandas, incluida la diana prevista, pero también proteínas aleatorias. La diana prevista se encontrará en una banda que aparece en el gel con el aptámero candidato (aquí, CAR029 y CAR024) pero no con los aptámeros de control negativo relacionados (aquí, CAR029-Neg1, CAR029-Neg2; o CAR024-Neg1, CAR024-Neg2; respectivamente). Las bandas correspondientes a la diana se extirpan del gel.
8) Se usa espectrometría de masas (MS) para identificar la diana aptámero de las bandas extirpadas.
Ejemplo 15: aptámeros anti-PSMA
En este ejemplo, una biblioteca de aptámeros se criba en busca de aptámeros para la proteína del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA/FOLH1/NAALADasa I) identificada usando 6 rondas de selección positiva como en los ejemplos anteriores. Después de la selección de un grupo de aptámeros de unión a PSMA como se describe anteriormente, la biblioteca de aptámeros se secuenció usando el protocolo estándar Ion Torrent (Life Technologies, Carlsbad, CA). Los candidatos principales se seleccionaron por propiedades tales como las siguientes: aparición común en la biblioteca examinada, afinidad con la diana, especificidad con la diana, estructura molecular definida, presencia de la conformación favorita, estabilidad de tal conformación, tasa de agregación nula o pequeña en las concentraciones de trabajo, síntesis y purificación sencillas y reproducibles.
Un protocolo experimental detallado se presenta en el ejemplo 17 a continuación. Una descripción general de los parámetros y el protocolo de detección incluyó lo siguiente:
1. Se usó una biblioteca de ADNmc de “6 aptámeros” generada a partir de una biblioteca de ADN sintetizada de cadena directa mediante AS PCR. La biblioteca de 6 aptámeros comprendía secuencias variables de 10n, 20n, 25n, 30n, 35n y 40n con las secuencias líder y de cola que se muestran en la tabla 20.
2. Histag de PSMA conjugado en Dynabeads.
3. Se realizaron varias rondas de selección positiva mediante la mezcla de perlas conjugadas con PSMA con una biblioteca de aptámeros diluidos en F127/PEG4000 a aproximadamente 2e12 copias/selección.
4. Después de cada ronda, las perlas resuspendidas se agregaron directamente a la reacción de PCR para amplificación, sin elución implicada.
5. Después de la amplificación por PCR, las PCR se digirieron con nucleasa lambda, durante 2 horas y el ADNmc se purificó con el kit de purificación zymo ADNmc.
6. Se realizó un total de 9 rondas de selección. Para la biblioteca de 35n y 40n solo se realizaron 6 rondas ya que las bibliotecas no funcionaron.
7. La recuperación de selección de la ronda 6 y la ronda 9 se usó en la clonación por PCR y se eligieron 30 clones de la ronda 6 y la ronda 9 de cada biblioteca y los plásmidos se amplificaron y purificaron.
8. Para la ronda 6, se usaron 180 clones en el cribado inicial. Para la ronda 9, se usaron un total de 120 clones en el cribado inicial frente a la diana.
9. Los clones individuales de ADNmc se amplificaron en miniescala y se probaron en el cribado inicial frente a la proteína diana (proteína Histag PSMA), así como proteínas no diana BSA e Ig de ratón. Se calculó la proporción señal/ruido.
10. Según el cribado anterior, se eligieron clones individuales y se amplificó el ADNmc en una escala midi, y luego se tituló en el formato ELISA frente a la diana.
11. Se realizó la secuenciación de Sanger para los clones finales y se analizaron los datos de secuenciación.
Los resultados más reproducibles se observaron en la biblioteca de aptámeros 30n. Las secuencias representativas obtenidas de estos procedimientos se muestran en la tabla 20. En la tabla 20, las secuencias se muestran de 5' a 3' de izquierda a derecha, en las que cada secuencia completa consiste en la secuencia líder 5' indicada seguida de la secuencia variable indicada seguida de la secuencia de la cola 3' indicada. Cada secuencia se deriva de una biblioteca que tiene un líder y una cola con una secuencia variable entre estas. La tabla indica si la secuencia identificada comprende una unidad estructural de biotina en el extremo 5' o 3'. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que se divulgan en la tabla 20 también se pueden modificar en la medida en que las modificaciones resultantes den como resultado un aptámero que tenga aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de homología con la secuencia divulgada y conserve la funcionalidad de unión al antígeno PSMA o fragmentos funcionales del mismo.
Tabla 20: Secuencias de aptámeros candidato de PSMA
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CAR050 y CAR051 se identificaron mediante clonación. La afinidad de unión de estos dos aptámeros se probó frente a la proteína recombinante PSMA/FOLH1/NAALADasa I mediante ELISA. Véase la figura 22. CAR052 y CAR053 se identificaron mediante secuenciación usando el sistema Ion Torrent después de nueve rondas de selección. CAR052 fue la secuencia más común en el torrent con el 5.91 % del recuento total de lecturas. CAR053, la segunda secuencia más común, representó el 3.34 % del recuento total de lecturas.
Ejemplo 16: Aislamiento competitivo de aptámeros
Como se describe en este documento, los aptámeros se pueden identificar frente a una diana de interés. En este ejemplo, se usa un esquema de unión competitiva para identificar aptámeros frente a una diana de interés.
El método 30 de identificación de aptámero se describe en la figura 3. Un analito de interés, por ejemplo, una entidad biológica tal como una proteína o una microvesícula, se captura en un sustrato 31. El sustrato puede ser, por ejemplo, un sustrato plano o una perla. El analito se puede capturar de forma covalente o no covalente, por ejemplo, el analito se puede capturar usando un enlace de anticuerpo, aptámero o estreptavidina-biotina. El analito capturado se pone en contacto con una biblioteca de candidatos 32 a aptámeros de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos se unen a diversos componentes de la mezcla, incluido el analito, el sustrato, el agente de captura (por ejemplo, anticuerpo (Ab), aptámero, etc.), tubo o pocillo de reacción, desechos biológicos, etc. 33. Los oligonucleótidos que se unen al analito comprenden aptámeros candidato a la diana de interés 34. Los oligonucleótidos no unidos se retiran mediante lavado 35. Después de esta etapa, la mezcla de reacción comprende el analito de captura unido por aptámeros candidato. Un ligando que reconoce un epítopo específico, por ejemplo, un anticuerpo, se pone en contacto con la mezcla 37 de reacción. El ligando disocia los aptámeros candidato unidos al mismo epítopo que el ligando a través de la competencia por el epítopo 38. Los aptámeros candidato disociados se recolectan y amplifican 39 Las etapas 32-39 se repiten un número determinado de veces, n, por ejemplo, 1-20 veces, para enriquecer aún más los candidatos a aptámeros con aquellos que se unen al mismo epítopo que el ligando. Después de los ciclos repetidos, los aptámeros restantes se evalúan mediante secuenciación y otras caracterizaciones 310 como se describe en este documento.
El cribado de control se realiza en paralelo con el método anterior. Cualquier aptámero identificado a través del cribado de control se descarta. Los analitos de control incluyen, sin limitación, el sustrato desnudo incubado con el analito, el sustrato desnudo sin el analito y el método realizado con un ligando de control, tal como un anticuerpo que no se une a una diana de interés.
Ejemplo 17: Protocolo de selección de aptámeros
Este ejemplo proporciona un protocolo de cribado de una biblioteca de aptámeros frente a una proteína para identificar el aptámero candidato que se une a la proteína. El protocolo se puede usar para identificar candidatos a aptámeros que se unen a microvesículas mediante la sustitución de la proteína diana con microvesículas objetivo. Los ajustes en el protocolo para tener en cuenta las microvesículas se indican en su caso.
Diseño experimental:
1. Proteína purificada conjugada en las Dynabeads.
2. Selección positiva (SELEX) para el número deseado de rondas
3. Secuenciación de alto rendimiento después de rondas seleccionadas (por ejemplo, Next Generation usando Ion Torrent)
4. Clonación y validación de clones seleccionados después de las rondas deseadas
El protocolo de selección de afinidad de aptámero detallado es el siguiente:
Reactivos:
1. Ácido carboxílico Dynabeads® M-270 ("perlas") (Life Tech, 14305D)
2. Agua, grado de reactivo de biología molecular (Sigma, W4502)
3. Sulfo-NHS (Fisher Scientific, PI-24510)
4. EDC (Fisher Scientific, PI-77149)
5. Solución reguladora de acoplamiento MES: 0.05 M MES, pH 5.0 (el pH puede depender del punto isoeléctrico de la proteína diana, pI)
a. MES (ácido 2[N-morfolino] etanosulfónico) (Sigma, M2933)
b. NaOH 5 N (Diluir a NaOH 1 N) (Fisher, SS256-500)
6. Solución reguladora de lavado de conjugación de perlas y solución reguladora de almacenamiento: PBS-Tween 20 al 0.01 %
a. PBS, pH 7.5 (Sigma, P3813)
b. TWEEN® 20 (Sigma, 9416)
7. Proteína diana
a. Por ejemplo, Histag-Epcam, C-ter Epcam, Histag -PSMA, sin etiqueta-FYN, sin etiqueta-AMACR, sin etiqueta-DBF4B
8. Solución reguladora de lavado ELISA: PBS al 0.05 %-Triton
9. Anticuerpos primarios diluidos en PBS al 1 %-B
10. Anticuerpos secundarios diluidos en PBS al 1 %-B
11. Biblioteca de aptámeros, biblioteca inversa 10n, 20n, 25n, 30n, 35n, 40n (lambda digerida y purificada). Véase la tabla 21, donde n significa un nucleótido seleccionado aleatoriamente.
Tabla 21: Biblioteca de aptámeros y cebadores de PCR
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12. 4 % de E-Gel de alta resolución
13. Solución reguladora de dilución de bloqueo y aptámero (0.5 % de F127, 0.5 % de PEG4000 en PBS (Hyclone)) 14. Solución reguladora de lavado (PBS+BSA al 1 %-B)
15. Reactivos de PCR Phusion (New England Biolabs, Inc (NEB), Ipswich, MA)
16. Aptámero PCR-F-5Phos/ Aptámero-R-bio
17. Placa blanca no adherente de 96 pocillos. (véase consumibles)
18. Nanodrop.
19. Kit de exonucleasa lambda (NEB, 5 unidades/ul).
20. Reactivos de secuenciación de Sanger
21. Cebador directo M13 (-20): 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT (SEQ ID NO. 231015)
22. Cebador inverso M13 (-27): 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC (SEQ ID NO. 231016)
23 PEG4000, PEG8000
Consumibles:
1. Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml de polipropileno de copolímero de USA Scientific (USA Scientific, 1415-2500) 2. Vi-cellvials (Beckman Coulter, 723908)
3. Placas blancas de fondo plano, no adhesivas, de 96 pocillos (Corning® Costar® #3600)
4. Placas blancas de fondo redondo, no adhesivas, de 96 pocillos (Corning® Costar® #3605)
5. Placa transparente de fondo plano de unión media de 96 pocillos (Corning® Costar® # 9017)
Equipo:
1. Imán: Imán giratorio DynaMag™ ("imán") (Life Tech, 12320D)
2. Analizador de viabilidad celular Vi-Cell XR
3. Veriti
4. Nanodrop
5. Centrífuga (Eppendorf, 5415)
6. Imán de placa: Separador de placa magnética ("imán de placa") (Luminex, CN-0269-01)
7. Mix Mate
8. Lector de placas BioTek Synergy 2
Procedimiento:
Etapa 1: Conjugación de la proteína diana
Propósito: Para conjugar conjuntamente las perlas magnéticas con proteína diana y MA-PEG para bloquear sitios activados desocupados y evitar la unión no específica de aptámeros, durante la selección
1. Volver a suspender el stock de perlas agitando con vortex, durante 2 minutos.
2. Medir con pipeta el volumen deseado de perlas en un tubo de copolímero y llevar a 100 ul con MES 25 mM, pH 5 (solución reguladora de acoplamiento diluida con agua 1:1).
3. Formar pellas con las perlas transferidas colocando el tubo en el imán, durante 2 minutos y retirar el sobrenadante.
4. Agregar 100 ul de MES (solución reguladora de acoplamiento) 25 mM y agitar a 800 rpm, durante 10 minutos. 5. Colocar el imán, durante 1 minuto y retirar el sobrenadante.
6. Repetir para un total de lavados de 2-10 minutos con MES.
7. Inmediatamente antes de usar, diluir Sulfo-NHS con MES 25 mM frío para lograr una concentración final de 50 mg/ml (multiplicar mg x 20 para lograr el volumen de agua en ul).
8. Inmediatamente antes de usar, diluir el EDC con MES 25 mM frío agregando 200 ul por vial hasta una concentración final de 50 mg/ml.
9. Agregar 200 ul de 50 mg/ml de Sulfo-NHS y 200 ul de 50 mg/ml de EDC a las perlas y mezclar suavemente con vortex (800 rpm), durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente o 2 horas a 4 °C.
10. Formar pellas con las perlas activadas colocándolas en el imán, durante 1 minuto y retirar el sobrenadante. 11. Volver a suspender las perlas en 400 ul de solución reguladora de acoplamiento MES 25 mM y mezclar suavemente mediante vortex (800 rpm).
12. Formar pellas con las perlas colocándolas en el imán, durante 1 minuto y retirar el sobrenadante.
13. Repetir las etapas 11 y 12 para un total de dos lavados con solución reguladora de acoplamiento MES 25 mM.
14. Volver a suspender la proteína activada y lavada con la proteína diana y mezclar suavemente mediante vortex.
15. Incubar, durante al menos 30 minutos con mezcla (por rotación) a temperatura ambiente.
16. Formar pellas con las perlas acopladas colocándolas en el imán, durante 1 minuto y retirar el sobrenadante. 17. Lavar las perlas cuatro veces con PBS al 0.01 %-Tween 20.
18. Formar pellas con el sobrenadante y volver a suspender las perlas acopladas y lavadas en 200 ul de solución reguladora de almacenamiento y almacenar en alícuotas de perlas/tubo de 500 K a -80 °C.
19. Contar la suspensión de perlas usando el contador Vi-Cell.
a. Preparar una dilución 1:100 de perlas: solución reguladora de almacenamiento agregando 14 ul de perlas a 1386 ul de solución reguladora de almacenamiento en un vial Vi-Cell.
b. Mezclar los pocillos de perlas diluidas pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
c. Transferir 700 ul de perlas diluidas a un nuevo vial de Vi-Cell.
d. Leer los viales duplicados de células totales.
e. Determinar la concentración de perlas/ul multiplicando el recuento total de células por el factor de dilución en la etapa 19a (es decir, 100).
f. Determinar el rendimiento total de perlas después de la conjugación multiplicando la concentración por el volumen de resuspensión en la etapa 18 (es decir, 200 ul).
Etapa 2a: evaluar la conjugación de perlas mediante ELISA
1. Agregar 200 ul de PBS al 1 %-B a los pocillos de la placa Costar, de fondo plano, no adherente.
2. Agregar 50,000 perlas conjugadas, selle la placa e incubar, durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) con agitación a 800 rpm.
3. Colocar el imán de la placa, durante 30 segundos con una agitación de 800 rpm. Retirar el sobrenadante.
4. Retirar la placa del imán de la placa.
5. Lavar 3x con 200 ul de PBS al 0.05 %-Triton, 3 min cada uno con agitación de 800 rpm.
6. Colocar el imán de la placa, durante 30 segundos con una agitación de 800 rpm. Retirar el sobrenadante.
7. Agregar 100 ul de anticuerpo primario (AB) diluido en PBS al 1 %-B a los pocillos apropiados.
8. Sellar los pocillos de la placa, incubar 1 h a 37 °C con agitación, 800 rpm (en Jitterbug. Cambiar Jitterbug a la velocidad original después de una hora aum.).
9. Girar la placa para recoger la condensación.
10. Colocar el imán de la placa, durante 3 min, retirar el AB primario y la solución reguladora.
11. Retirar la placa del imán de la placa.
12. Lavar 3x con 200 ul de PBS al 0.05 %-Triton, 3 min cada uno con agitación de 800 rpm a TA.
13. Colocar el imán de la placa, durante 30 segundos con una agitación de 800 rpm. Retirar el sobrenadante.
14. Agregar 100 ul de AB secundario diluido en PBS al 1 %-B a los pocillos apropiados.
15. Sellar los pocillos de la placa, incubar TIEMPO --hasta una hora-- a TA con agitación, 800 rpm. NOTA: proteger de la luz.
16. Colocar el imán de la placa, durante 3 min, retirar el AB secundario y la solución reguladora.
17. Retirar la placa del imán de la placa.
18. Lavar 3x con 200 ul de PBS al 0.05 %-Triton, 3 min cada uno con agitación de 800 rpm a TA.
19. Colocar el imán de la placa, durante 30 segundos con una agitación de 800 rpm. Retirar el sobrenadante.
20. Agregar 100 ul de sustrato (TMB), pipetear, mezclar, sellar e incubar TIEMPO --hasta 30 min-- con agitación de 800 rpm a TA. NOTA: proteger de la luz.
21. Agregar 100 ul de solución de parada (ácido sulfúrico 2N), sellar e incubar 1 min con agitación de 800 rpm a TA.
22. Colocar la placa en el imán de la placa, durante 3 min, luego transferir el sobrenadante a una nueva placa transparente de unión al medio y leer a 450-630 nm con un lector de microplacas.
Etapa 3: Cribado y selección de aptámeros basados en perlas
Propósito: maduración de la afinidad
Usar la biblioteca de aptámeros inversos sintéticos directamente (la entrada será 1013 a 1015 si es necesario) 1. Diluir las perlas en solución reguladora de PBS F127 al 0.5 %/PEG4000 (sin MgCh) hasta 100,000 perlas/50 ul (usar 100,000 perlas para la primera ronda y usar la cantidad de perlas más baja que desee para lograr mayor rigurosidad), agitar en vórtice a 800 rpm, durante 1 hora
2. Tomar una alícuota de 50 ul con 100,000 perlas en cada pocillo en la placa blanca de fondo plano no adherente.
3. En un tubo de copolímero separado (USA Scientific), diluir la biblioteca de aptámeros en PBS F127 al 0.5 %/PEG4000 apropiado con MgCh 2 mM para lograr el número apropiado de copias de aptámeros en un volumen total de 50 ul por pocillo (la cantidad de aptámeros de entrada podría ser mayor a l0 A14 para formato de perlas) 4. Agregar 50 ul de biblioteca de aptámeros diluidos a cada muestra de 50 ul de perla solución reguladora de la placa de unión e incubar a TA con agitación vorticial a 800 rpm, durante 30 min.
5. Colocar la placa con perlas en el imán de la placa, durante 2 min con agitación de 800 rpm (las perlas se concentrarán en el centro del pocillo).
6. Retirar completamente la solución reguladora; dejar la placa en el imán de la placa e inclinar la placa para recoger líquido en la esquina sin molestar las perlas.
7. Retirar la placa del imán de la placa y lavar las perlas con 200 ul de solución reguladora de lavado (usando solución reguladora de incubación de aptámero para los primeros 3 lavados, luego la solución reguladora de lavado general es PBS-B, puede aumentar la concentración de sal hasta NaCl 500 mM según sea necesario más adelante en rondas posteriores) y agitar con vortex a 700 rpm, durante 1 min.
8. Colocar la placa sobre el imán de la placa, durante 2 min con agitación a 700 rpm. Repetir los lavados 10 veces, un minuto por lavado con solución reguladora de bloqueo, durante las primeras 3 veces, luego use PBS-B (o PBS-B con solución reguladora de sal incrementada) para el resto.
9. Después del último lavado, colocar la placa en el imán de la placa, durante 3 minutos con agitación de 700 rpm y luego retirar completamente la solución reguladora.
10. Volver a suspender la perla con 52 ul de agua libre de ADNasa, mezclar bien pipeteando.
11. Transferir las perlas resuspendidas a un tubo nuevo de 1.5 ml (para la primera ronda, utilizarlas todas en la reacción de PCR)
12. Preparar la reacción de PCR. Usar 4 (5 para la primera ronda) reacciones para cada muestra. Usar 10 ul de perlas resuspendidas en 1 reacción de PCR, un total de 4 reacciones para 1 muestra (Guardar 10 ul para la clonación). 13. Amplificación por PCR de recuperación de aptámeros: Para todas las bibliotecas, la PCR se puede realizar con la polimerasa Phusion: con aditivo p Eg 8000, 98 °C 30 seg, ciclo a 98 °C por 10 seg, 60 °C por 30 seg y 68 °C, durante 1 min. Para bibliotecas de aptámeros de 10n a 30n, usar hasta 30 ciclos de PCR. Para bibliotecas de 35n y 40n, usar menos de 25 ciclos.
14. Después de la amplificación por PCR, agregar 10 ul de la exonucleasa lambda directamente a la reacción de PCR, agitar e incubar a 37 °C, durante 2 horas, terminar calentando hasta 80 °C, durante 10 minutos y luego enfriar nuevamente hasta 4 °C. Antes de terminar la digestión, analizar 2 ul en un E-Gel de alta resolución al 4 %. Si todavía hay una banda de ADNbc, continuar con la digestión, si solo se muestra una banda de ADNmc, finalizar la digestión.
15. Purificación de ADNmc con Zymo del producto digerido con lambda.
16. Nanodrop (solo si está purificado con Zymo) para cuantificar ajustado a 2e12 copias estimadas para la siguiente ronda. (Si la lectura de nanodrops es baja, se necesita qPCR para calcular la concentración del ADNmc)
17. Repetir el número deseado de rondas de selección
Etapa 4: Clonación y producción de ADNmc y amplificación de plásmidos clonados
Propósito: separar colonias de aptámeros individuales y obtener el plásmido purificado
1. La reacción de PCR de clonación de Phusion se prepara con cebadores de biblioteca de aptámeros directos e inversos sin modificación en 5' o 3'.
2. A partir del aptámero de recuperación (en las perlas anteriores), agregar 5 ul de las perlas resuspendidas a la reacción de PCR.
3. Los ciclos de PCR, para todas las bibliotecas, deben ser inferiores a 25 ciclos.
4. Agregar 5 ul de solución reguladora de gel E directamente a la reacción de PCR, mezclar y cargar la muestra en el gel E al 4 %, 2 pocillos, 20 ul/pocillo. Analizar hasta que el colorante amarillo se cierre hasta el final del gel.
5. Tomar una imagen del gel en el dispositivo de imagen.
6. Abrir el gel con el abridor de E-gel, sin romper el gel. Colocar el gel en la parte superior de la caja UV dentro de la máquina de imágenes.
7. Rebanar el gel en base al borde estimado de la banda verticalmente, encender la luz ultravioleta y cortar rápidamente la banda de ADN lo más rápido posible (usar el UV de 365 nm), colocar el gel con la banda de ADN en un tubo de 1.5 ml.
8. Calcular el tamaño del gel (alrededor de 100 ul-200 ul). Purificar el ADN del gel usando el kit de extracción Zymo Gel según las instrucciones.
9. Elución final del ADN con 10 ul de agua libre de ADNasa/RNasa
10. Según el kit de clonación de extremo romo TOPO de Invitrogen: mezclar 2 ul del producto eluido de PCR aptámero, 1 ul de solución salina y 1 ul del vector y 2 ul de agua. Mezclar con pipeta. Incubar a TA, durante 15-30 min.
1. Descongelar el medio SOC y las células competentes químicamente TOP10 en hielo; agregar la solución de ligadura TOPO anterior directamente a las células, mezclar con pipeta. Incubar en hielo, durante 30 min.
2. Colocar el tubo en un baño de agua a 42 °C, durante exactamente 30 segundos, luego enfriar inmediatamente en hielo, durante un par de minutos.
3. Agregar 250 ul del medio SOC en el tubo; agitar horizontalmente el tubo a 200rpm a 37 °C, durante 1h.
4. Transferir 125 ul del cultivo a una placa de agar LB precalentada con 100 ug/ml de ampicilina. Incubar a 37 °C, durante la noche.
5. Preparar suficiente medio líquido LB y agregar 100 ug/ul de stock de ampicilina para preparar 100 ug/ml de medio LB. Transferir al tubo de cultivo, 1ml/tubo.
6. Usar la punta esterilizada de 20 ul para recoger colonias individuales en los respectivos tubos de cultivo. Agitar a 300 rpm, durante la noche a 37 °C.
7. Extracción del plásmido con 700 ul del cultivo bacteriano según el protocolo Pure-Link plasmid mini pre. Elución final a 75ul TE (la extracción de plásmido también podría usar el kit Promega plasmid minipre Vacuume o el kit de placa de centrifugar Genescript, pero debe incluir un centrifugado final a máxima velocidad, durante 10 minutos para retirar cualquier traza de productos químicos).
8. Usar2ul en Egel al 1 %, tomar la imagen para registro.
9. Calcular la concentración de la prep del plásmido usando Nanodrop. Ajustar toda la preparación del plásmido a 2.5 ng/ul en agua según hoja de cálculo (alrededor de 5e8 cp/ul).
Etapa 5: Mini-pre de ADNmc clonal para la prueba de detección inicial
Propósito: preparar una cantidad limitada de ADNmc de un único clon y listo para la prueba de cribado.
1. Para la producción de aptámeros (cadena inversa), configure la reacción de PCR con cebadores de biblioteca de aptámeros directos fosforilados y reversos biotinilados. Usar 10 ul de la solución de plásmido de 2.5 ng/ul anterior en un volumen de reacción de PCR de 40 ul. PCR para 30 ciclos.
2. Después de la PCR, agregar 10 ul de exonucleasa lambda directamente a la reacción de PCR, agitar en vortex y centrifugar, incubar a 37 °C, durante 2 horas, seguido de 80 °C, durante 10 minutos y luego enfriar a 4 °C. Usar 2 ul de análisis en E-gel al 4 % para verificar si la digestión está completa. Una vez que confirme que la digestión está completa, detenga la digestión y continuar con la purificación.
3. Purificar el ADNmc según las instrucciones del kit de purificación zymo ADNmc (para fines de alto rendimiento, puede usar el kit de purificación Zymo Oligo en formato de placa, cambiar la velocidad de centrifugación a 5000 para todas las etapas y al máximo para la centrifugación en seco final, durante 10 min en la centrífugar grande en lugar de 2000 en el manual). En ambos casos, eluir el ADNmc con 30 ul de agua libre de DNasa/RNasa.
4. Estimar la concentración del ADNmc usando el Nanodrop.
Etapa 6: prueba de cribado de clones
Propósito: para probar la afinidad (positiva o negativa en base a los criterios) de clones de aptámeros individuales (ADNmc) frente a la proteína diana y de control.
1. Según la hoja de trabajo de la prueba de cribado inicial, el día anterior a la prueba, cubrir la proteína diana y la proteína de control a la concentración deseada, 100 ul/pocillo en una placa ELISA de alta unión, a TA, durante 3-5 horas.
2. Bloquear la placa con 250 ul de PBS F127 al 0.5 %/PEG4000 (sin MgCh), durante la noche a 4 °C.
3. Según los datos de Nanodrop, elegir el volumen para todas las muestras que podría alcanzar el nivel de ADNmc en aproximadamente 10 e11 a 10 e12 /pocillo.
4. Diluir el ADNmc en PBS F127 al 0.5 %/PEG4000 más una concentración final de 2 mM MgCl2.
5. Retirar la solución de bloqueo de la placa; lavar dos veces con PBS, 1 min para cada lavado. Tocar con la toalla de papel para retirar el líquido residual.
6. Agregar 100 ul de dilución de ADNmc (10e11-10e13/pocillo. 100 ul), incubar a TA con agitación a 800 rpm, durante 4 horas.
7. Lavar la placa con PBS+BSA al 1 % 3 veces, 1 min/lavado a 400-800 rpm con agitación. Retirar el líquido y tocar con la toalla de papel después de cada lavado.
8. Diluir estreptavidina-poliHRP a 1:1000 en solución reguladora PBS+BSA al 1 %, agregar 100 ul en cada pocillo. Incubar a TA, durante 1 hora con agitación
9. Lavar la placa 3 veces con PBS-BSA al 1 %, tocar con la toalla de papel para retirar el líquido residual después de cada lavado, 1 min/lavado.
10. Precalentar el sustrato Ultra ELISA a TA, agregar 100 ul del sustrato en cada pocillo e incubar en la oscuridad con agitación, durante 30 min.
11. Detener la reacción agregando 100 ul de H2SO42N y leer la OD450-630 con el lector de microplacas.
12. Según un criterio definido (por ejemplo, OD por encima de cierto nivel en este protocolo estandarizado o por encima de la proteína de control), para juzgar qué clon es positivo o negativo.
Etapa 7: Producción a mediana escala de aptámero ADNmc a partir de un clon candidato para una evaluación cuantitativa adicional
Propósito: preparar una mayor cantidad de ADNmc del clon candidato aptámero para una mayor confirmación de la afinidad con la diana.
1. Para la producción de aptámeros (cadena inversa), configurar la reacción de PCR con cebadores de biblioteca de aptámeros directos fosforilados y reversos biotinilados. Usar 5 ul de la solución de plásmido de 2.5 ng/ul anterior en un volumen de reacción de PCR de 40 ul, 12 reacciones por muestra. Analizar la amplificación por PCR, durante 30 ciclos.
2. Después de la amplificación por PCR, agregar 10 ul de exonucleasa lambda directamente a la reacción de PCR, agitar con vortex y centrifugar, incubar a 37 °C, durante la noche, durante 2 horas. Usar 2 ul de la reacción para analizar en un Egel al 4 %, para verificar la digestión como se describe anteriormente.
3. Purificar el ADNmc según las instrucciones del kit de purificación zymo ADNmc (4 reacciones a través de 1 columna de purificación zymo). NOTA: Esta etapa usa el kit de purificación de ADNmc, No el kit de purificación de oligo de placa usado anteriormente.
4. Combinar diferentes eluciones de la misma muestra, usar Nanodrop para cuantificar la concentración de ADNmc.
5. Guardar el aptámero purificado a -80 °C
Etapa 8 : Ensayo de validación de clones de aptámeros individuales
Propósito: evaluar más a fondo los clones seleccionados de manera cuantitativa.
1. Para una prueba de validación adicional, tanto la diana como el aptámero se titularon entre sí. Se titula al menos 1 proteína no diana (a 1 concentración de recubrimiento) frente al aptámero para evaluar la unión no específica.
2. Recubrir los pocillos de la placa ELISA con tres concentraciones diferentes de la proteína diana (por ejemplo, 1 ug, 0.5 ug y 0.25 ug/ml, a 100 ul/pocillo) así como la proteína no diana (generalmente 0.5 ug/ml y 100 ul/pocillo) en PBS, durante 3-5 horas. Bloquear la placa, durante la noche con F127 al 0.5 %/PEG4000 al 0.5 % (sin MgCh) en PBS. 3. Diluir el aptámero en al menos 4 órdenes de magnitud (por ejemplo, de 10e13 a 10e10/pocillo o de 10e12 a 10e9/pocillo según la recuperación) en PBS con F127 al 0.5 %/PEG4000. Agregar 100 ul de la dilución de aptámero a los pocillos respectivos. Incubar la placa a TA a 800 rpm, durante 4 horas. NOTA: Si usan microvesículas en lugar de proteína purificada para evaluar la unión del aptámero, incubar a 300 rpm en lugar de 800 rpm.4*
4. Lavar la placa con 250 ul de PBS-BSA al 1 %, tocar con la toalla de papel después de cada lavado para retirar el líquido residual.
5. Diluir estreptavidina-poliHRP a 1:1000 en PBS-BSA al 1 %, agregar 100 ul de la solución a cada pocilio, incubar a TA con 800 rpm, durante 1 h. NOTA: si usa microvesículas en lugar de proteína purificada para evaluar la unión del aptámero, incubar a 300 rpm en lugar de 800 rpm.
6. Lavar la placa 3 veces con PBS-BSA al 1 %, tocar con la toalla de papel para retirar el líquido residual.
7. Agregar 100 ul de UltraSubstrate (precalentar a TA al menos 2 horas antes de usar) a cada pocillo, cubrir la parte superior con el papel aluminio. Agitar a 300-400 rpm, durante 30 min a TA. Agregar 100 ul de H2SO42N para detener la reacción.
8. Leer OD450-630.
Etapa 9: secuenciación de Sanger
Propósito: Obtener información de la secuencia de los clones seleccionados.
1. Cebadores de secuenciación: M13 Directo (-20) y M13 Inverso (-27)
2. Según el protocolo de secuenciación de Sanger, hacer la mezcla maestra de secuenciación y hacer una alícuota de 8 ul/pocillo.
3. El plásmido mini-pre de los clones seleccionados se usará directamente para la secuenciación (la concentración de plásmido debe ser de al menos 10 ng/ul).
4. Agregar 2 ul de las muestras del plásmido mini-pre al pocillo respectivo. Los ciclos como la reacción estándar de BDT.
5. Usar Cleanseq con la muestra según el protocolo establecido.
6. Realizar el análisis de secuenciación de Sanger.
7. En el software FinchTV, abrir el archivo de secuenciación deseado (F primero, si el archivo F no se puede leer o la calidad es deficiente, usar el archivo R).
8. En la barra de búsqueda, ingrese EcoRI (GAATTC) y hacer clic en buscar.
9. El sitio EcoRI está 6 bases por delante del inicio de la secuenciación del cebador del aptámero si el producto de la PCR del aptámero se clonó con éxito en el vector. Haga clic en invertir la pantalla de secuencia, desde la última base en el sitio EcoR1 (C), las siguientes 6 bases del vector deben ser GCCCTt , la siguiente secuencia debe coincidir ya sea con el patrón directo del aptámero (ATCCAGA...) o con la cadena inversa plantilla (ACTAA...).102
10. Dado que la dirección de clonación del aptámero es aleatoria, por lo tanto, el inicio de la secuencia del aptámero podría ser directo (comenzando como ATCCAGA... GCAGCA) o inverso (comenzando en ACTAA... GTCCA). Al verificar la secuencia, identifique la dirección del aptámero (dirección directa o inversa).
11. Leer base por base en el diagrama de secuenciación para verificar que la llamada sea correcta.
12. Grabar la secuencia tanto en dirección directa como inversa.
Ejemplo 18: Protocolo de selección de bibliotecas de aptámeros
Este ejemplo proporciona el protocolo para la selección de la biblioteca de ARN de SUL1 realizada en el ejemplo anterior. El protocolo se puede seguir para otras bibliotecas de aptámeros y entradas de muestras según se desee. Preparación
El espacio de trabajo se limpia con EtOH al 80 % antes de trabajar.
Las perlas son perlas MagPlex (Luminex Corp., Austin, TX). Se pueden sustituir otras perlas según se desee.
Soluciones reguladoras/Reactivos para preparar:
• Agua MilliQ
• MgCl2100 mM
• Solución reguladora de transcripción 5x (Tris 200 mM pH 7.9)
• 1x PBS
• 1x PBS con MgCl23 mM
• 10x PBS
• Solución reguladora de selección (1x PBS con BSA al 0.1 % y MgCh 3 mM)
Antes de comenzar con la selección, retirar la solución reguladora de almacenamiento de perlas y lavar las perlas con PBS 1x con MgCl23 mM 1 veces (200 uL en total en los 4 tubos). Se usan 200,000 perlas por selección.
Grupo de ARN de 2'F SUL1 de unión a perlas magnéticas recubiertas de microvesículas
Abreviaturas: TK-Transcripción; NTC-Sin control de plantilla.
Etapas:
1. 1a ronda: Mezclar 1 nmol de ARN de 2'F SUL1 purificado con 20 |il de perlas resuspendidas (conjugadas con microvesículas). 10 ul de PBS 10x BSA al 1 %, 3 |il de MgCh 100 mM y 47 ul de H2O. Esto da una concentración final de 1x PBS, BSA al 0.1 %, MgCh 3 mM.
1.1 La adición de MgCh en esta etapa da una concentración de MgCh 3 mM. Esta es la concentración de unión para todo el procedimiento.
1.2 Rondas siguientes: Mezclar 20 |il del producto de transcripción (MgCh 15 mM en el interior) con 20 |il de perlas recubiertas de microvesículas lavadas, más 9 ul de PBS 10x con BSA al 1 %, 51 ul de H2O. No se necesita MgCh adicional porque el MgCh en el producto de transcripción diluido (TK) proporciona una concentración final de MgCh 3 mM.
2. Incubar, durante 30 min a 37 °C, agitar a 1000 rpm y mezclar con pipeta cada 10 minutos.
3. Lavar las perlas:
3.1 Un ciclo de lavado comprende:
3.1.1 Retirar las perlas del imán
3.1.2 Volver a suspender perlas en 100 |il 1x PBS MgCh 3 mM fuera del imán.
3.1.3 Incubar la muestra, durante 30 segundos fuera del imán.
3.1.4 Volver a colocar la muestra en el imán y esperar hasta que las perlas estén a un lado.
3.1.5 Retirar y descartar el sobrenadante.
3.1.6 Volver a suspender en 100 |il 1x PBS MgCh 3 mM BSA al 0.1 % fuera del imán.
3.1.7 Incubar la muestra, durante 3 minutos fuera del imán.
3.1.8 Volver a colocar la muestra en el imán y esperar hasta que las perlas estén a un lado.
3.1.9 Retirar y descartar el sobrenadante
3.2 1a ronda: colocar la mezcla de perlas en un imán y retirar el sobrenadante. Lavar una vez con 100 |il de PBS 1x MgCl23 mM BSA al 0.1 % (mezclando las perlas con una pipeta) y descartar la solución reguladora.
3.3 Siguientes rondas: Aumentar las etapas de lavado cada segunda ronda en una etapa de lavado más hasta 3 etapas de lavado.
4. Agregar 55 |il de agua MilliQ a la muestra de perlas.
5. Eluir el ARN incubando la muestra de perlas, durante 5 min a 80 °C
5.1 Verificar si hay 50 |il, si no, centrifugar la muestra para centrifugar el agua condensada de la parte superior. 5.2 Transferir el sobrenadante a un vial nuevo. Trabajar rápidamente para evitar que las cadenas se vuelvan a unir las perlas.
5.2.1 Usar 50 |il del eluato para la siguiente RT-PCR y almacenar el resto a -20 °C
RT-PCR de candidatos a aptámeros recuperados
Guías prácticas
• El resto de la muestra de RT-PCR y la muestra de TK-PCR se almacena a -20 °C
• El ARN se puede almacenar a 4 °C, durante ~1 h
• El producto de RT-PCR se puede almacenar, durante la noche a 4 °C
• Continuar con el siguiente ciclo de selección para obtener una calidad de ARN óptima inmediatamente después de la transcripción.
• Evitar agitar con vortex el ARN
• Mezclar en hielo
• Usar tubos de PCR de 0.5 ml
• Cada RT-PCR debe tener un control sin plantilla (NTC) con agua en lugar de plantilla
• No congelar-descongelar la DTT más de una vez
6. Preparar una mezcla maestra (véase, la tabla 21) antes de la primera ronda, verificarla con ARN 0.5 pmol y almacenar alícuotas de 48 pl a -20 °C hasta su uso.789
Tabla 21: Mezcla maestra de RT-PCR
Figure imgf000153_0001
7. Agregar 50 pl de agua MilliQ como control negativo (NTC) (pipetear esto primero) o 50 pl de eluato de selección. Mezclar con pipetas.
8. Incubar a 65 °C, durante 5 min.
9. Después de enfriar a 4 °C, agregar:
9.1 1 |il de Transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, No. de cat. 18064) (200 U/pl)
9.2 1 |il de GoTaqFlexi ADN polimerasa (5 unidades/pl) Promega No. de cat. M8305.
Programa PCR (SARTPCR)
a) 10 min 54 °C
(Esta etapa es solo para la transcriptasa inversa, si se necesitan más rondas, no repetir la etapa A).
b) 1 min 95 °C
c) 1 min 60 °C
d) 1 min 72 °C
10. Etapas de ciclo b-d para
10.1 1a ronda b-d 4 ciclos. Analizar los productos de PCR de 5 pL en un gel de agarosa al 4 %.
10.1.1 Rondas posteriores: la cantidad de ARN disminuye después de la primera ronda, lo que lleva a un aumento en los ciclos de PCR requeridos. Para determinar el número de ciclos necesarios cada vez, verificar la intensidad de la banda del gel de agarosa de la ronda de selección anterior. Usar ese número de ciclos para iniciar la siguiente ronda de RT-PCR. Nota: verificar siempre los resultados en un gel de agarosa.
10.1.1.1 Resultados del gel de agarosa: la banda del producto debe verse en la longitud diana. La intensidad de la banda debe ser aproximadamente la misma que la banda de escalera de 50 pb (si no un poco menos intensa). Si la banda no es lo suficientemente intensa (apenas visible), ciclar una cantidad apropiada más y vuelva a verificar en un gel de agarosa.
Transcripción
Toda la mezcla se realizó en hielo. Preparar la mezcla maestra de transcripción (Tabla 22) y almacenar alícuotas de 85.7 pl a -20 °C hasta su uso.
11. Verificar el pH del stock Tris 200 mM, pH 7.9 antes de su uso. Un cambio en el pH con el tiempo puede causar problemas con la transcripción.
Tabla 22: Mezcla maestra de transcripción (TK) para la biblioteca SUL1
Figure imgf000154_0001
12. Agregar 10 pl del producto de RT-PCR a la mezcla maestra.
13. Agregar 1 pl RNasin (40 unidades/pl)
13.1 Promega recombinante RNasin Ribonuclease Inhibitor No. de cat. N2515/N2511
14. Agregar 4 pl de polimerasa mutante T7 Y639F (25U/pl de uso: 100U total por reacción)
15. Realizar la reacción, durante 30 min a 37 °C
16. Usar el producto de transcripción directamente para la siguiente ronda de selección. Si la siguiente etapa no es factible, congelar el producto de transcripción a -20C.
Rondas posteriores
Repetir la incubación de perlas, la RT-PCR y la transcripción tantas veces como sea necesario. Tratar de tener una intensidad de banda similar del producto RT-PCR para la muestra en todas las rondas como se indicó anteriormente.
Ensayo de unión
Se realiza un ensayo de unión después de las rondas de selección deseadas para determinar la evaluación de la unión no específica de los aptámeros seleccionados para el cáncer a las perlas de control (conjugadas con el sobrenadante de la ultracentrifugación de plasma, véase más arriba) y de la misma manera para las muestras de control no cancerosas. También se pueden realizar ensayos de unión para evaluar la unión de aptámeros seleccionados frente a las microvesículas diana previstas.
Protocolo de Cherenkov: Realizado usando una biblioteca de aptámeros marcada radiactivamente con 32P.
Concentración final de solución reguladora de selección: 1x PBS+ MgCh 3 mM BSA al 0.01 % pH 7.4 Solución reguladora de lavado: 1x PBS MgCh 3 mM pH 7.4
1. Retirar las muestras de microvesículas del congelador a -80 °C y descongelarlas.
2. Colocar las perlas en el imán (200,000 por experimento de muestra), retirar la solución reguladora de almacenamiento de perlas.
3. Lavar 1x 200 |iL, durante 1 minuto cada uno con 1x PBS, solución reguladora MgCh 3 mM. Perlas del grupo para hacer 200,000 en un tubo.
4. Volver a suspender las perlas en 70 |il de la solución reguladora de selección. (10 |il de 10x PBS, BSA al 1 % 3 |iL de MgCl2100 mM 57 |iL de H2O por muestra).
5. Agregar 30 |iL de una biblioteca de aptámeros de ARN marcada radiactivamente a su muestra respectiva.
6. Incubar con agitación a 1000 rpm a 37 °C, durante 30 min.
7. Colocar las muestras en un imán.
8. Retirar y guardar el sobrenadante.
9. Lavar las perlas con 200 |iL de solución reguladora de lavado 1x PBS MgCh 3 mM pH 7.4 e incubar fuera del imán, durante 3 minutos.
10. Colocar las muestras en el imán, retirarlas y guardar la solución de lavado.
11. Repetirlas etapas 9, 10.
12. Agregar 100 |iL de agua a la muestra, mezclar con pipeta.
13. Calentar a 80 °C, durante 5 minutos.
14. Colocar las muestras en un imán, retirar el sobrenadante y guardarlo.
15. Volver a suspender las perlas en 100 |iL de agua.
16. Medir la radiactividad de cada fracción usando un contador de centelleo.
17. Analizar la cantidad de unión de fondo presente.
Selección negativa
Según se desee, se agrega una etapa de selección negativa antes de incubar la biblioteca de aptámeros con las perlas conjugadas con las microvesículas diana (es decir, el procedimiento “Unión del grupo de ARN de 2'F SUL1 a perlas magnéticas recubiertas de microvesículas” anterior). La selección negativa se puede realizar usando perlas conjugadas con el sobrenadante o las muestras de entrada (por ejemplo, plasma) después de filtrar o sedimentar las microvesículas de la muestra (denominadas “perlas agotado en microvesículas recubiertas", “muestras agotadas en microvesículas” o similares). Las etapas son:
1) Comenzar con el producto de la biblioteca de aptámeros de la ronda deseada después de la transcripción como se describe anteriormente. Lavar las perlas antes de comenzar: retirar la solución reguladora de almacenamiento, lavar las perlas con 200 |iL de solución reguladora de lavado, luego reemplazar la solución reguladora como se indica a continuación:
2) Etapa de selección negativa: Agregar y mezclar con pipeta 20 |iL de producto de transcripción (MgCh 15 mM) con perlas recubiertas “agotado en microvesículas” recién lavadas con 10 |iL de PBS 10x con BSA al 1 %, 70 |iL de H2O. No se necesita MgCh adicional porque el MgCh en el producto de transcripción diluido (TK) proporciona una concentración final de MgCh 3 mM.3
3) Incubar, durante 30 min a 37 °C, agitar a 1000 rpm.
4) Retirar el sobrenadante y agregarlo a las perlas de selección positiva (directamente), que son perlas recubiertas de microvesículas lavadas.
Continuar con la incubación de selección positiva. Véase unión del grupo de ARN de 2'F SUL1 a perlas magnéticas recubiertas de microvesículas anterior, comenzando en la etapa 2. Las etapas adicionales a través de la transcripción se detallan anteriormente.
Ejemplo 19: Aptámeros para microvesículas derivadas de cáncer de mama (BrCa)
En este ejemplo, se criba una biblioteca de aptámeros para identificar aptámeros que distingan entre microvesículas que circulan en la sangre de pacientes con cáncer de mama y microvesículas que circulan en la sangre de individuos de control sanos (es decir, sin cáncer de mama).
Se aislaron microvesículas del plasma de un grupo de 60 pacientes con cáncer de mama (BrCa+). También se aislaron microvesículas de un grupo de 60 muestras no cancerosas (BrCa-). Las microvesículas se aislaron del plasma mediante ultracentrifugación (120,000 x g). Había microvesículas en las pellas procedentes de la ultracentrifugación. El sobrenadante de la ultracentrifugación se guardó para su uso como control. Las microvesículas de ambos tipos de muestras se conjugaron con perlas MagPlex (Luminex Corp, Austin TX). Opcionalmente, las microvesículas aisladas se incuban con perlas anti-HSA/IgG/fibrinógeno para retirar estas proteínas sanguíneas muy abundantes. Sin embargo, la etapa de conjugación se puede optimizar para favorecer la conjugación de las microvesículas de modo que no sea estrictamente necesaria la remoción de proteínas muy abundantes.
La biblioteca de aptámeros usada consistió en una biblioteca de aptámeros de ARN 2'F SUL1. La secuencia es 5'-GGGAGGACGAUGCGG-N40-CAGACGACUCGCUGAGGAUCCGAGA-3' (SEQ ID NO. 231017). La biblioteca de aptámeros consta de tres secciones: cebador directo-15 nucleótidos, región variable-40 nucleótidos; cebador inverso-25 nucleótidos. Todas las pirimidinas (C y U) se modificaron con 2'Fluoro.
La biblioteca de aptámeros se incubó con ya sea las perlas conjugadas con microvesículas de control o de cáncer. Se realizaron en paralelo trece rondas de selección positiva de aptámeros que se unen a las microvesículas para ambos tipos de muestras. Véase el ejemplo 18 anterior para conocer el protocolo detallado de las etapas de selección positiva. No se realizó la selección negativa.
Los aptámeros que se retuvieron de la selección positiva anterior se secuenciaron usando tecnología de secuenciación de última generación que consiste en Ion Torrent NGS (Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA). También se puede usar el sistema MiSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA). Las secuencias se comparan para identificar los aptámeros que se encuentran en las muestras de cáncer y no en las muestras de control, y viceversa. Tales aptámeros proporcionan candidatos que se pueden usar para distinguir entre muestras BrCa y no BrCa.
Un número de secuencias representativas obtenidas de estos procedimientos se muestran en la tabla 23. Las secuencias de la tabla se identificaron en los grupos de aptámeros de la selección frente a microvesículas BrCa pero no estaban en el grupo de aptámeros seleccionados frente a muestras no cancerosas. En la tabla 23, las secuencias se muestran de 5' a 3' de izquierda a derecha, en el que cada secuencia completa consiste en la secuencia líder 5' indicada seguida de la secuencia variable indicada seguida de la secuencia de cola 3' indicada. Cada secuencia se deriva de una biblioteca que tiene un líder y una cola (véase, la descripción anterior) con una secuencia variable entre estas. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que se divulgan en la tabla 23 también se pueden modificar en la medida en que las modificaciones resultantes den como resultado un aptámero que tenga aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de homología con la secuencia divulgada y conservan la funcionalidad de unión a antígenos de microvesículas o fragmentos funcionales de los mismos.
Tabla 23: secuencias candidatas de aptámeros de microvesículas de BrCa
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Cada secuencia en la tabla 23 se sintetiza en dos variantes para investigación adicional: biotinilada en 5' y biotinilada en 3'. Esto proporciona variantes de aptámero que se pueden capturar en el extremo 5' o en el extremo 3' según se desee. Los aptámeros se sintetizan adicionalmente con cada pirimidina (C y U) modificada en 2'Fluoro.
La secuencia de ADN correspondiente a cada secuencia de ARN en la tabla 23 se proporciona en la lista de secuencias, donde la secuencia de ADN sigue directamente a su secuencia de ARN correspondiente. Por ejemplo SEQ ID NO. 231019 es la secuencia de ADN correspondiente a la secuencia de ARN SEQ iD NO. 231018, etc. Las formas de ADN de los aptámeros también se sintetizan para su posterior caracterización.
Los aptámeros anteriores se identificaron usando selección positiva para aptámeros que reconocen microvesículas BrCa y no BrCa conjugadas a microperlas.
Ejemplo 20: Aptámeros adicionales a microvesículas derivadas de cáncer de mama (BrCa)
En este ejemplo, se criba una biblioteca de aptámeros para identificar aptámeros que distinguen entre microvesículas que circulan en la sangre de pacientes con cáncer de mama y microvesículas que circulan en la sangre de individuos de control sanos (es decir, sin cáncer de mama). El procedimiento usa las mismas muestras y biblioteca de aptámeros que en los ejemplos 17-19 anteriores. La selección negativa se realiza antes de cada selección positiva a partir de la tercera ronda de selección positiva.
La selección negativa sirve para retirar aptámeros que se unen a proteínas solubles/abundantes/no informativas y comunes para proteínas cancerosas y no cancerosas. La selección negativa incluye realizar una selección negativa en los candidatos a aptámeros seleccionados frente a microvesículas derivadas de cáncer de la siguiente manera: (i) usando microperlas conjugadas con el sobrenadante de la etapa de ultracentrifugación de plasma derivado de cáncer (que no debe contener microvesículas); (ii) usar microperlas conjugadas con el sobrenadante de la etapa de ultracentrifugación de plasma negativo para cáncer (que no debe contener microvesículas); (iii) usar microperlas conjugadas con microvesículas negativas para el cáncer. La selección negativa también se puede realizar en los candidatos a aptámeros seleccionados frente a microvesículas negativas para cáncer de la siguiente manera: (i) usando microperlas conjugadas con el sobrenadante de la etapa de ultracentrifugación de plasma positivo para cáncer (que no debe contener microvesículas); (ii) usar microperlas conjugadas con el sobrenadante de la etapa de ultracentrifugación de plasma negativo para cáncer (que no debe contener microvesículas); (iii) usar microperlas conjugadas con microvesículas positivas para cáncer. Las rondas de selección negativa se realizan entre rondas de selección positiva como se describe en este documento.
Las microvesículas se aíslan del plasma de un grupo de 60 pacientes positivos para cáncer y de un grupo de 60 muestras no cancerosas usando ultracentrifugación (120,000 x g). Se encuentran microvesículas en las pellas de la ultracentrifugación. El sobrenadante de la ultracentrifugación se guarda para su uso como control. Las microvesículas de ambos tipos de muestras se conjugan con perlas MagPlex (Luminex Corp, Austin TX).
La biblioteca de aptámeros usada consta de una biblioteca de aptámeros de ARN 2'F SUL1. La secuencia es 5'-GGGAGGACGAUGCGG-N40-CAGACGACUCGCUGAGGAUCCGAGA-3' (SEQ ID NO. 231017), en la que N40 significa 40 nucleótidos aleatorios. La biblioteca de aptámeros consiste en tres secciones: cebador directo: 15 nucleótidos, región variable: 40 nucleótidos; cebador inverso-25 nucleótidos. Todas las pirimidinas (C y U) se modificaron con 2'Fluoro.
La biblioteca de aptámeros se incuba con perlas conjugadas con microvesículas de control o de cáncer. Nueve rondas de selección positiva de aptámeros que se unen a las microvesículas se realizan en paralelo para ambos tipos de muestras. La selección negativa se realiza frente a perlas conjugadas con el sobrenadante de plasma de entrada después de la ultracentrifugación antes de la selección positiva en las rondas 4-9. Véanse los ejemplos anteriores para conocer el protocolo detallado de las etapas de selección positiva y selección negativa.
Los aptámeros que se retienen de la selección positiva anterior se secuencian usando tecnología de secuenciación de última generación que consiste en Ion Torrent NGS (Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA). Cualquier plataforma de secuenciación de alto rendimiento apropiada, tal como el sistema MiSeq, se puede usar para esta etapa (Illumina, Inc., San Diego, CA). Las secuencias se comparan para identificar los aptámeros que se encuentran en las muestras de cáncer y no en las muestras de control, y viceversa. Tales aptámeros proporcionan candidatos que se pueden usar para distinguir entre muestras cancerosas y no cancerosas.
Los datos de secuenciación se analizan según el siguiente procedimiento:
Etapa 1: Las secuencias se clasifican según las frecuencias en todo el grupo de aptámeros recuperados en la ronda 9 después de la selección negativa frente a perlas conjugadas con plasma canceroso agotado en microvesículas seguido de selección positiva frente a perlas conjugadas con microvesículas cancerosas.
Etapa 2: Se calculan los niveles de cambio entre la muestra señalada en la etapa 1 y: (i) la misma muestra después de una selección negativa adicional frente a plasma canceroso agotado en microvesículas; (ii) la misma muestra después de una selección negativa adicional frente a microvesículas no cancerosas; (iii) la misma muestra después de una selección negativa adicional frente a plasma no canceroso agotado en microvesículas.
Etapa 3: Las secuencias se clasifican en base a los niveles de cambio calculados en la etapa 2 para identificar las secuencias que son abundantes o deficientes en el grupo de aptámeros seleccionado para las microvesículas derivadas del cáncer de mama.
Etapa 4: Las posibles secuencias mutantes (por ejemplo, debido a PCR u otros errores) se retiran en base a los resultados del análisis de consolidación.
Etapa 5: Las secuencias se identifican con niveles de cambio superiores a 3 y una frecuencia mínima de 50 en las tres variantes (i, ii y iii en la etapa 2).
Se realizan los mismos esquemas de selección que en las etapas 1-5 para aptámeros seleccionados frente a perlas conjugadas con microvesículas no cancerosas.
Las secuencias resultantes se sintetizan en dos variantes para investigación adicional: biotiniladas en 5' y biotiniladas en 3'. Esto proporciona variantes de aptámero que se pueden capturar en el extremo 5' o en el extremo 3' según se desee. Los aptámeros se sintetizan adicionalmente con cada pirimidina (C y U) modificada en 2'Fluoro. Los aptámeros también se pueden sintetizar como la secuencia de ADN correspondiente a cada secuencia de ARN. Las bibliotecas de aptámeros también se pueden filtrar en base a la secuencia secundaria predicha, la energía libre y otros parámetros, como se describe en este documento. Las secuencias identificadas suelen estar sobrerrepresentadas en los grupos positivos para cáncer en comparación con los controles. Sin embargo, también se observan secuencias identificadas sobrerrepresentadas en los grupos no cancerosos.
En la tabla 24 se muestra un número de secuencias representativas obtenidas de estos procedimientos. Las secuencias de la tabla se identificaron en los grupos de aptámeros de la selección frente a microvesículas obtenidas de plasma de pacientes con cáncer de mama, pero no estaban en los grupos de aptámeros seleccionados frente a muestras de plasma sin cáncer. En la tabla 24, las secuencias se muestran de 5' a 3' de izquierda a derecha, en las que cada secuencia completa consiste en la secuencia líder 5' indicada seguida de la secuencia variable indicada seguida de la secuencia de cola 3' indicada. Cada secuencia se deriva de una biblioteca que tiene un líder y una cola (véase, la descripción anterior) con una secuencia variable entre estas. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que se divulgan en la tabla 24 también se pueden modificar en la medida en que las modificaciones resultantes den como resultado un aptámero que tenga aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de homología con la secuencia divulgada y conservan la funcionalidad de unión a antígenos de microvesículas o fragmentos funcionales de los mismos.
Tabla 24: secuencias candidatas de aptámeros de microvesículas de BrCa
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Las figuras 23A-C muestran la unión de los aptámeros indicados en la tabla 24 frente a microperlas conjugadas con diversas muestras de entrada. El aptámero se indica encima de cada gráfico. Véase, la tabla 24. La muestra de entrada se indica en el eje X de izquierda a derecha de la siguiente manera: 1) Exosoma de cáncer: aptámero que se une a microperlas conjugadas con microvesículas aisladas de muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama; 2) cáncer no exosómico: aptámero que se une a microperlas conjugadas con muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama después de la remoción de microvesículas por ultracentrifugación; 3) Exosoma no canceroso: aptámero que se une a microperlas conjugadas con microvesículas aisladas de muestras de plasma de pacientes normales (es decir, cáncer no de mama); 4) No cáncer No exosoma: aptámero que se une a microperlas conjugadas con muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama después de la remoción de microvesículas por ultracentrifugación. Como se muestra en las figuras 23A-C, cada uno de los aptámeros pudo distinguir entre las muestras de microvesículas cancerosas contra las muestras de control de sobrenadante y las microvesículas no cancerosas. Además, se observó que todas las secuencias de la tabla 24 se unían más abundantemente a las microvesículas derivadas del cáncer en comparación con las microvesículas no derivadas del cáncer con la excepción de BCE10 y BCE14, que se observó que se unían más abundantemente a las microvesículas no derivadas del cáncer en comparación con las microvesículas derivadas del cáncer.
En base a las comparaciones realizadas en este ejemplo, se obtienen aptámeros que se unen a diferentes insumos de partida, que incluyen: 1) aptámeros que se unen preferentemente a microvesículas derivadas de cáncer sobre microvesículas no derivadas de cáncer; 2) aptámeros que preferentemente se unen a microvesículas no derivadas de cáncer sobre microvesículas derivadas de cáncer; 3) aptámeros que se unen tanto a microvesículas no derivadas de cáncer como a microvesículas derivadas de cáncer (por ejemplo, aglutinantes “universales"); y 4) aptámeros que se unen a los componentes del plasma que se han agotado en microvesículas.
Las bibliotecas de aptámeros en este ejemplo se someten además a cuatro rondas de selección adicional negativa y positiva. La selección positiva se realiza como se describe en este ejemplo. Las rondas de selección negativa se realizan usando perlas conjugadas con microvesículas no cancerosas como selección negativa para aptámeros obtenidos por selección positiva frente a perlas conjugadas con microvesículas cancerosas. De manera similar, las rondas de selección negativa se realizan usando perlas conjugadas con microvesículas cancerosas como selección negativa para aptámeros obtenidos por selección positiva frente a perlas conjugadas con microvesículas no cancerosas.
Ejemplo 21: Diagnóstico de enfermedad
Este ejemplo ilustra el uso de los aptámeros útiles para la realización de la presente invención para diagnosticar una enfermedad proliferativa.
Se sintetiza una cantidad apropiada de un aptámero que se une a una microvesícula derivada de cáncer mediante medios químicos conocidos en la técnica. Los aptámeros se conjugan con un agente de diagnóstico apropiado para la detección, tal como una unidad estructural fluorescente, usando un método de conjugación conocido en la técnica.
La composición se aplica a microvesículas aisladas de muestras de sangre tomadas de una cohorte de prueba de pacientes que padecen una enfermedad proliferativa asociada con la sobreexpresión de microvesículas, por ejemplo, cáncer de próstata, mama o pulmón. La composición se aplica igualmente sobre microvesículas aisladas a partir de muestras de sangre extraídas de una cohorte de control negativo, que no padece una enfermedad proliferativa.
El uso de técnicas de detección apropiadas (por ejemplo, ensayo de microperlas o citometría de flujo) en las muestras de la cohorte de prueba indica la presencia de enfermedad, mientras que las mismas técnicas aplicadas a las muestras de la cohorte de control indican la ausencia de enfermedad.
Los resultados muestran que los aptámeros descritos en este documento son útiles para diagnosticar enfermedades proliferativas.
Ejemplo 22: aptámeros terapéuticos
Este ejemplo ilustra el uso de los aptámeros descritos en este documento para tratar una enfermedad proliferativa en un ratón.
Se sintetiza una cantidad apropiada de un aptámero que se une a una microvesícula derivada de cáncer mediante medios químicos conocidos en la técnica. Los aptámeros se conjugan con un agente quimioterapéutico usando un método de conjugación conocido en la técnica. El conjugado se formula en una composición acuosa.
La composición se administra por vía intravenosa, en una o más dosis, a una cohorte de prueba de ratones que padecen una enfermedad proliferativa asociada con la sobreexpresión de las microvesículas, por ejemplo, modelo de cáncer de próstata, mama o pulmón. A una cohorte de control, que no padece una enfermedad proliferativa, se le administra la composición idéntica por vía intravenosa, según un régimen de dosificación correspondiente.
El análisis patológico de las muestras tumorales y/o la supervivencia del ratón indican que la mortalidad y/o la morbilidad mejoran en la cohorte de prueba con respecto a la cohorte de control.
Los resultados muestran que los aptámeros descritos en este documento son útiles en el tratamiento de enfermedades proliferativas.
Se pueden usar aptámeros útiles para tratar el cáncer en otros organismos, por ejemplo, un ser humano.
Ejemplo 23: Aptámero-Método de detección de secuenciación
Este ejemplo ilustra el uso de un grupo de aptámeros para detectar microvesículas que son indicativas de un fenotipo de interés. El método usa un grupo de aptámeros que se han enriquecido frente a una diana de interés que es indicativo de un fenotipo de interés. El método de este ejemplo permite el uso eficiente de una biblioteca de aptámeros para reconocer preferentemente una entidad diana.
Con fines de ilustración, el método se describe en el ejemplo con una diana de microvesículas de una muestra de fluido corporal. Un experto apreciará que el método se puede extender a otros tipos de entidades diana (por ejemplo, células, proteínas, diversos otros complejos biológicos), muestra (por ejemplo, tejido, cultivo celular, biopsia, otros fluidos corporales) y otros fenotipos (otros cánceres, otras enfermedades, etc.) mediante el enriquecimiento de una biblioteca de aptámeros frente a las muestras de entrada deseadas.
Flujo de trabajo general:
1) Obtener muestras (plasma, suero, orina o cualquier otra muestra biológica) de pacientes con etimología médica desconocida y tratarlos previamente de acuerdo con lo anterior para garantizar la disponibilidad de la diana de interés (véase más abajo). Cuando la diana de interés es una población de microvesículas, las microvesículas se pueden aislar y, opcionalmente, atar a un soporte sólido, tal como una microperla.
2) Exponer la muestra a un grupo de aptámeros con cierta especificidad frente a la diana de interés. Como se describe en este documento, un grupo de aptámeros que tiene cierta especificidad frente a la diana de interés puede enriquecerse usando diversos esquemas de selección, por ejemplo, usando microvesículas no cancerosas para la selección negativa y microvesículas cancerosas para la selección positiva como se describe anteriormente. Se pueden usar aptámeros de ADN o ARN según se desee.
3) Poner en contacto la biblioteca de aptámeros con la muestra.
4) Eluir cualquier aptámero unido a la diana.
5) Secuenciar el aptámero eluido. Se pueden usar métodos de secuenciación de última generación.
6) Analizar el perfil del aptámero de la secuenciación. Un perfil de los aptámeros que se sabe que se une a la diana de interés indica la presencia de la diana dentro de la muestra de entrada. El perfil se puede usar para caracterizar la muestra, por ejemplo, como cancerosa o no cancerosa.
Variaciones del protocolo:
Actualmente hay cuatro protocolos básicos que sirven para el ensayo de secuenciación de aptámeros. Las muestras pueden ser cualquier muestra biológica.
Protocolo 1:
Ultracentrifugación de muestras de fluidos corporales de 1-5 ml (por ejemplo, plasma/suero/orina) (120K x g, sin sacarosa) con dos lavados del precipitado para aislar microvesículas.
Medir la concentración de proteína total de la muestra recuperada que contiene las microvesículas aisladas.
Conjugar las microvesículas aisladas con perlas magnéticas (por ejemplo, perlas MagPlex (Luminex Corp. Austin TX)). Incubar microvesículas conjugadas con el grupo de aptámeros de interés.
Lavar los aptámeros no unidos reteniendo las perlas usando un imán.
Aptámeros eluidos unidos a las microvesículas.
Amplificar y purificar los aptámeros eluidos.
Secuenciación de aptámeros (por ejemplo, métodos de última generación; Ion Torrent: PCR de fusión, PCR en emulsión, secuenciación).
Evaluar el perfil del aptámero.
Protocolo 2:
Este protocolo alternativo no incluye una etapa de aislamiento de microvesículas, conjugación de microvesículas a las perlas o etapa de partición separada. Este puede presentar una unión no específica de los aptámeros frente a la muestra de entrada.
Retirar las células/desechos de la muestra de fluido corporal y diluir la muestra con PBS que contiene MgCh (2 mM). Mezclar previamente la muestra preparada anteriormente con la biblioteca de aptámeros.
Ultracentrifugación de mezcla de aptámero/muestra (120K x g, sin sacarosa). Lavar las microvesículas precipitadas. Recuperar el precipitado y eluir los aptámeros unidos a las microvesículas.
Amplificar y purificar los aptámeros eluidos.
Secuenciación de aptámeros (por ejemplo, métodos de última generación; Ion Torrent: PCR de fusión, PCR en emulsión, secuenciación).
Evaluar el perfil del aptámero.
Protocolo 3:
Este protocolo usa filtración en lugar de ultracentrifugación y puede requerir menos tiempo y volumen de muestra. Retirar las células/desechos de la muestra de fluido corporal y diluirla con PBS que contiene MgCh (2 mM).
Mezclar previamente la muestra preparada anteriormente con la biblioteca de aptámeros.
Cargar la muestra en el filtro (es decir, un filtro MWCO de 150K o 300K o cualquier otro que pueda eliminar los aptámeros no unidos o no deseados). Centrifugar la muestra para concentrarla. La muestra concentrada debe contener microvesículas.
Lavar el concentrado. Variante 1: Diluir el concentrado con la solución reguladora especificada anteriormente hasta el volumen original y repita la centrifugación. Variante 2: Diluir el concentrado con la solución reguladora especificada anteriormente hasta el volumen original y transferir el concentrado a una nueva unidad de filtrado y centrífugar. Repetir dos veces.
Recuperar el concentrado y eluir los aptámeros unidos a las microvesículas.
Amplificar y purificar los aptámeros eluidos.
Secuenciación de aptámeros (por ejemplo, métodos de última generación; Ion Torrent: PCR de fusión, PCR en emulsión, secuenciación).
Evaluar el perfil del aptámero.
Protocolo 4:
Ultracentrifugación de 1-5 ml de muestra de fluido corporal (120K x g, sin sacarosa) con 2 lavados del precipitado para aislar las microvesículas.
Mezclar previamente las microvesículas con el grupo de aptámeros.
Cargar la muestra en una unidad de filtro MWCO de 300K y centrifugar (2000xg). La tasa de concentración es ~3x. Lavar el concentrado. Variante 1: Diluir el concentrado con la solución reguladora especificada anteriormente hasta el volumen original y centrifugar. Repetir dos veces. Variante 2: Diluir el concentrado con la solución reguladora especificada anteriormente hasta el volumen original y transferir el concentrado a una nueva unidad de filtrado y centrífugar. Repetir dos veces
Recuperar el concentrado y eluir los aptámeros unidos a las microvesículas.
Amplificar y purificar los aptámeros eluidos.
Secuenciación de aptámeros (por ejemplo, métodos de última generación; Ion Torrent: PCR de fusión, PCR en emulsión, secuenciación).
Evaluar el perfil del aptámero.
Ejemplo 24: Detección de microvesículas derivadas de cáncer usando secuenciación de aptámeros
El método del ejemplo 23 anterior se usa para detectar microvesículas en una muestra de fluido corporal que se derivan de células cancerosas. Las microvesículas se pueden desprender de las células cancerosas. La biblioteca de aptámeros comprende un subgrupo de aptámeros descritos en los ejemplos 18-20 anteriores que se unen preferentemente a microvesículas de pacientes con cáncer contra individuos sin cáncer. Las secuencias se enumeran en este documento como SEQ ID NOs. 231032-241535. El método se usa para detectar la presencia o ausencia de microvesículas que son indicativas de cáncer.
La muestra de prueba comprende muestras de plasma que se recogen de pacientes que tienen o se sospecha que tienen cáncer. Una muestra de prueba es una muestra que se va a caracterizar por los métodos de la invención. El método se realiza para determinar la presencia o ausencia de microvesículas derivadas de cáncer en la circulación del paciente.
El método se usa además para detectar evidencia de cáncer antes de la biopsia. La muestra de prueba comprende muestras de plasma que se recogen de pacientes programados para someterse a una biopsia. La muestra de ensayo es una muestra que se va a caracterizar por los métodos de la invención. El método se realiza para determinar la presencia o ausencia de microvesículas derivadas de cáncer en la circulación del paciente antes de la biopsia. Si no se detectan microvesículas derivadas del cáncer, se puede tomar la decisión de renunciar a la biopsia.
Ejemplo 25: Selección de aptámeros para microvesículas
Las técnicas clásicas de selección de aptámeros (es decir, SELEX) se realizan por lo general para enriquecer los aptámeros para la diana particular en condiciones “ limpias” cuando se minimiza la interferencia con moléculas no diana (competidores). Sin embargo, diversas aplicaciones para los aptámeros seleccionados requieren que los aptámeros trabajen para unirse a su diana en diversos entornos, por ejemplo, en una muestra biológica o en un medio de cultivo de tejidos con una gran cantidad de moléculas potencialmente interferentes. En este caso, tales moléculas de interferencia que no estuvieron presentes, durante el procedimiento de selección pueden interferir con el reconocimiento de la diana por parte de los aptámeros seleccionados en condiciones ideales. Este ejemplo proporciona un procedimiento de selección de aptámeros para cribar una biblioteca de aptámeros con el fin de seleccionar aptámeros muy específicos para las dianas y también capaces de funcionar en una muestra biológica que comprende las moléculas potencialmente interferentes.
En este ejemplo, la diana comprende una microvesícula de tal manera que se criba una biblioteca de aptámeros en busca de miembros que se unen a microvesículas derivadas de cáncer en comparación con microvesículas normales (controles no cancerosos). Un experto apreciará que el método se puede extender a otros tipos de entidades diana (por ejemplo, células, proteínas, diversos otros complejos biológicos). El método puede emplear diversos tipos de muestras (por ejemplo, tejido, cultivo celular, biopsia, otros fluidos corporales) y se puede dirigir moléculas diana que se pueden usar para caracterizar diversos fenotipos (diversos tipos de cáncer, otras enfermedades, etc.) al enriquecer una biblioteca de aptámeros frente a las muestras de entrada deseadas. Además, las muestras de cáncer y normales se pueden cambiar para detectar aptámeros que se unen preferentemente a las muestras normales.
Variante 1: selección de aptámeros basada en microvesículas en competición con plasma agotado de microvesículas. Flujo de trabajo:
-> Las microvesículas se aíslan de muestras de plasma canceroso y normal mediante ultracentrifugación. El sobrenadante que comprende la muestra agotada en microvesículas se almacena como muestra de control negativo.
-> Capturar/conjugar las microvesículas aisladas con perlas magnéticas.
-> Iniciar el procedimiento de cribado y selección de aptámeros usando perlas conjugadas de microvesículas mezcladas con el sobrenadante de arriba (es decir, plasma agotado en microvesículas). Suplemento sobrenadante con MgCl2. El cribado y la selección de aptámeros para microvesículas normales (no derivadas de cáncer) y derivadas de cáncer se pueden realizar en paralelo. Cada ronda consiste en selecciones negativas y positivas según se desee.
Dado que la biblioteca de aptámeros inicial se expone simultáneamente a dianas de microvesículas así como a competidores (proteínas solubles) del plasma, los aptámeros recuperados de las microvesículas/perlas pueden ser más específicos para las dianas en la membrana de microvesículas. Tales aptámeros pueden funcionar de manera efectiva en muestras biológicas sin requerir una purificación extensa de la diana antes de la unión/detección de la diana.
Variante 2: selección de aptámeros para microvesículas derivadas de cáncer (por ejemplo, desprendidas de células cancerosas) en competencia con microvesículas aisladas de muestras normales. Flujo de trabajo:
-> Las microvesículas se aíslan de muestras de plasma canceroso y normal mediante ultracentrifugación.
-> Capturar/conjugar las microvesículas aisladas derivadas del cáncer a perlas magnéticas.
-> Iniciar el procedimiento de cribado y selección de aptámeros usando perlas conjugadas de microvesículas de cáncer mezcladas con microvesículas normales (no conjugadas) suplementadas con MgCh. El cribado y la selección de aptámeros se realiza para las microvesículas derivadas del cáncer solo al retener solo los aptámeros que se retienen con las perlas magnéticas.
Dado que la biblioteca de aptámeros se expondrá simultáneamente a ambos tipos de microvesículas (cancerosas y normales), el método selecciona aptámeros que preferentemente se unen a microvesículas derivadas de cáncer en presencia de microvesículas no cancerosas.
Variante 3: selección de aptámeros para microvesículas derivadas de cáncer (por ejemplo, desprendidas de células cancerosas) en competencia con plasma normal (sin que esté agotado en microvesículas). Flujo de trabajo:
-> Las microvesículas se aíslan de muestras de plasma canceroso mediante ultracentrifugación.
-> Capturar/conjugar las microvesículas aisladas derivadas del cáncer con perlas magnéticas.
-> Iniciar el procedimiento de cribado y selección de aptámeros usando perlas conjugadas de microvesículas de cáncer mezcladas con plasma normal (no conjugado) suplementado con MgCh. El cribado y la selección de aptámeros se realiza para microvesículas de cáncer solo al retener solo los aptámeros que se retienen con las perlas magnéticas. Este enfoque combina las ventajas de las variantes 1 y 2 anteriores. Cada ronda incluye competencia con plasma normal. Los aptámeros deberían ser más selectivos para la diana en presencia de proteínas plasmáticas que interfieren y otras entidades biológicas.
Variante 4: Selección paralela de aptámeros de cáncer/normales en perlas mixtas. Flujo de trabajo:
-> Capturar/conjugar microvesículas derivadas del cáncer con perlas magnéticas
-> Capturar/conjugar microvesículas normales (no cancerosas) con perlas no magnéticas
-> Mezclar ambos conjuntos de perlas y realizar el procedimiento de cribado y selección de aptámeros con la biblioteca de aptámeros inicial
-> Separar las perlas magnéticas y no magnéticas después de la incubación con la biblioteca de aptámeros. Usar un imán para capturar las perlas magnéticas, luego centrifugar para separar las perlas no magnéticas.
-> Lavar las perlas magnéticas y no magnéticas separadas por separado.
-> Eluir y volver a amplificar los aptámeros de ambos tipos de perlas por separado.
-> Ronda 2: mezclar grupos de aptámeros amplificados de ambos tipos de perlas y agregarlos a las perlas mezcladas -> Repetir desde arriba
Las ventajas de la variante 4 incluyen: (i) usar la misma alícuota de la biblioteca de aptámeros para iniciar el procedimiento de cribado y selección de aptámeros para microvesículas tanto cancerosas como no cancerosas; (ii) usar la competencia entre microvesículas cancerosas y no cancerosas directamente en una mezcla en cada ronda; (iii) se puede agregar sobrenadante como competidor adicional para aumentar el rigor de la selección; (iv) enriquecimiento paralelo para aptámeros específicos de cáncer y no cáncer en competencia para dar como resultado aptámeros que identifiquen solo normales o solo cáncer (dado que existe la opción de unir cualquiera de los dos). Ejemplo 26: Selección de aptámeros de ADN de bloqueo universal para grupos carboxilo
Las soluciones reguladoras de bloqueo conocidos en la técnica generalmente comprenden una mezcla de péptidos sintéticos, BSA, proteínas tripsinizadas o grupos de ADN aleatorio (sintético o natural, por ejemplo, ADN de esperma de salmón). Estas mezclas complejas pueden contener moléculas que, además del efecto de bloqueo, podrían proporcionar dianas falsas adicionales en un ensayo, generando así falsos positivos.
En este ejemplo, se desarrolló un reactivo de bloqueo para que sirviera como bloqueador específico para un sustrato carboxilado. El reactivo de bloqueo comprende un aptámero con reactividad cruzada minimizada con cualquier otra dina que no sean los grupos carboxilo en el sustrato.
Se realizaron experimentos preliminares con cinco bibliotecas de aptámeros de ADN con 1015 secuencias cada una y se amplificaron previamente longitudes variables (60, 65, 70, 75, 80-mers) y se separaron las cadenas para que la cadena directa (no biotinilada) sirva como aptámero. Se realizaron múltiples rondas de selección negativa y selección positiva como se describe en
Ejemplo 9 anterior.
Para identificar posibles aptámeros bloqueantes, se identificaron secuencias comúnmente observadas en los procedimientos de selección con diferentes dianas de proteínas. Una secuencia de aptámero que se identificó como una de las más abundantes recuperadas del procedimiento de selección anterior también se identificó en el grupo de aptámero final para cada una de las diferentes proteínas diana. Este aptámero fue seleccionado como candidato bloqueador de aptámeros:
5'-GGTGTGGTTGGGGGTGGTGGAGGTGGGGTTTGTGGTGGGA (SEQ ID NO. 230938)
Sin estar ligado a la teoría, es que las secuencias que son ricas en guanina se unen a grupos carboxilo en las perlas del sustrato a través de enlaces de hidrógeno. Véase la figura 16A y 16B. La figura 16A ilustra el enlace de hidrógeno entre una porción de un aptámero 1601 a grupos 1602 carboxilo unidos a un sustrato 1603 plano. La figura 16B ilustra el enlace de hidrógeno entre una porción de un aptámero 1601 a los grupos 1602 carboxilo unidos a un sustrato 1604 de microesfera. Los grupos 1602 carboxilo se unen además a un anticuerpo 1605. La guanina es el único nucleótido que puede formar dos enlaces de hidrógeno.
Pruebas
Con el fin de probar las propiedades de bloqueo del candidato de bloqueo de aptámero, se realizó el siguiente experimento: Para obtener el aptámero, el conjunto de PBP de 40 mer después de la selección positiva, que contenía la mayor parte de la secuencia presentada anteriormente, se volvió a amplificar PCR, cadena separada y precipitado con etanol. También se amplificaron algunas secuencias relacionadas, pero no se consideró que afectaran a los resultados en sus concentraciones menores.
Microperlas conjugadas con anticuerpos frente a los biomarcadores de proteína deseados (SSX4, PBP, SPDEF, EPCAM, KLK2, SSX2), con un anticuerpo anti-IgG2B de control negativo y con aptámeros de control negativo (es decir, aptámeros que no se unen a cualquiera de los biomarcadores proteicos, denominados Neg5 y Neg9) se bloquearon con una solución que comprendía el aptámero de bloqueo candidato anterior, durante 20 min. Después de incubar la microperla conjugada con anticuerpo con el candidato bloqueador de aptámero, se agregó una solución estándar de bloqueo de microperlas y se incubaron las perlas, durante 20 min adicionales. Luego, las perlas se distribuyeron en tubos de tiras de PCR y se mezclaron con muestras de plasma de pacientes con cáncer de próstata o trastornos benignos de la próstata. La mezcla se incubó, durante 2 horas a 37 °C. Las muestras se transfirieron a las placas de filtro y se mezclaron con un aptámero anti-EpCAM biotinilado que debería reconocer las microvesículas capturadas por las microperlas conjugadas con anticuerpos. Las perlas se incubaron con el aptámero anti-EpCAM, durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se agregó Streptavidin-PE y las muestras se incubaron, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las placas y se midió la fluorescencia del PE en complejo con las microperlas con 100 |il de solución de la muestra. Cada muestra se probó en pocillos por triplicado y se promediaron los resultados. También se analizaron controles negativos que usaban un anticuerpo anti-IgG2b y dos aptámeros que no se unían. Los resultados que se muestran para los dos aptámeros que no se unen, Neg5 y Neg9, se muestran en las figuras 24A-24B, respectivamente. Los resultados, como se muestra en las figuras 24A-24B reveló niveles de fondo más bajos cuando las perlas se bloquearon previamente con condiciones de bloqueo estándar (soluciones reguladoras de bloqueo de bloque de inicio, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EE. UU.), bloqueo estándar con aptámero de bloqueo candidato IX (~ 34 |ig/ml), y al bloqueo estándar con bloqueo de aptámero 0.5X.
Debido a que los aptámeros de bloqueo son ricos en guanina, los experimentos se repitieron con una solución que comprendía un único nucleótido de guanina solo seguida del bloque de partida estándar. No se observaron mejoras usando solo el único nucleótido.
Ejemplo 27: Secuencias ilustrativas de aptámeros bloqueantes
La siguiente tabla 25 comprende aptámeros ilustrativos útiles para la realización de la invención. Los aptámeros formaban parte del grupo de aptámeros descrito en el ejemplo 26 y formaban parte del conjunto común de aptámeros de bloqueo identificados. Se entiende que las secuencias de nucleótidos que se divulgan en la tabla 25 se pueden modificar en la medida en que las modificaciones resultantes den como resultado un aptámero que tenga aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de homología con la secuencia divulgada y retenga la funcionalidad de unir grupos funcionales carboxilo. Como se usa en el contexto de cualquier unidad numérica definida en este documento, el término “aproximadamente” significa una variación del 10 % por encima o por debajo de esa unidad numérica y todas las unidades intermedias.
Tabla 25: Aptámeros ilustrativos
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Ejemplo 28: Microvesículas unidas a microesferas
Las microvesículas se pueden unir a un sustrato usando diversos métodos. En este ejemplo, se usan tres métodos para unir microvesículas a un sustrato: 1) conjugación directa; 2) anclaje de lípidos; 3) unión de anticuerpos; y 4) unión al aptámero. Véanse los esquemas en las figuras 7A-D. La figura 7A ilustra la conjugación directa de una microesfera carboxilada con un antígeno de superficie vesicular. La figura 7B ilustra el anclaje de una microvesícula a una microesfera a través de un anclaje de lípido funcionalizado con biotina. La figura 7C ilustra la unión del anticuerpo a un antígeno de la superficie de la vesícula, en el que el anticuerpo se conjuga con una microesfera carboxilada. La figura 7D ilustra la unión del aptámero a un antígeno de la superficie de la vesícula, en el que el aptámero se conjuga con una microesfera carboxilada. Las microvesículas unidas a microesferas producidas mediante los métodos de este ejemplo se pueden usar para cribar una biblioteca de aptámeros como se describe en los ejemplos anteriores.
Conjugación directa: se probó la conjugación directa de microvesículas con microesferas usando microvesículas liberadas de la línea celular de cáncer de próstata VCAP. Protocolo: las microvesículas de VCAP se conjugaron con perlas MagPlex (Luminex Corp, Austin TX) según el protocolo establecido para anticuerpos (5 millones de perlas, 20 |ig de microvesículas). Véase el ejemplo 29 a continuación para obtener un protocolo detallado. Las microvesículas aisladas se conjugaron con perlas carboxiladas usando la química de carbodiimida de dos etapas estándar como se conoce en la técnica. El ensayo MagPlex se realizó según el protocolo del fabricante con 1200 perlas por pocillo. Las perlas se probaron con tres soluciones reguladoras de bloqueo así como, sin bloqueo para excluir cualquier posible señal impulsada por perlas. Para marcar las microvesículas, las perlas se incubaron con 5 pg/ml de anticuerpos detectores antitetraspanina marcados con PE (anti-CD9-PE y anti-CD63-PE), durante 1 hora a temperatura ambiente. Los resultados se muestran en las figuras 8A-8B. Como se ve en las figuras, las microvesículas de VCAP conjugadas con perlas se detectaron específicamente con ambos anticuerpos detectores. Además, la respuesta a anticuerpos específicos reflejó la prevalencia natural de las proteínas de superficie CD9 y CD63 en las microvesículas (es decir, c D9 es más frecuente que CD63, lo que se refleja en los mayores valores de MFI cuando se usan anticuerpos detectores anti-CD9 (Figura 8A) contra anticuerpos detectores anti-CD63 (Figura 8B)).
Unión de anticuerpos: las perlas MagPlex se conjugaron con anticuerpos para EpCAM, CD63 o CD81 según el protocolo del fabricante (Luminex Corp., Austin TX). Las microvesículas se detectaron con anticuerpos marcados con ficoeritrina (PE) contra CD9, una proteína común de la superficie de las microvesículas. El eje Y de las figuras muestra la intensidad fluorescente media (MFI) de las microvesículas detectadas. Los resultados se muestran en las figuras 9A-9E. Como se muestra en las figuras 9A y 9C, cantidades crecientes de vesículas de células VCap (Figura 9A) o muestras de plasma de pacientes (Figura 9C) dieron como resultado una señal MFI creciente. La preparación de la muestra pareció afectar la señal detectada, ya que las vesículas aisladas de ExoQuick produjeron una señal mayor que las aisladas con ultracentrifugación o ultracentrifugación. Véase la figura 9B. Finalmente, las vesículas capturadas con anticuerpos parecían estar atadas de manera estable a las microperlas, como lo muestra la señal estable después de una incubación prolongada. Véase la figura 9D.
Anclaje de lípidos: las microvesículas de VCAP se conjugaron con microesferas usando la membrana lipídica de la microvesícula como diana de conjugación. Se usó un reticulante heterobifuncional con un grupo funcional lipídico como se muestra en la figura 10 A. El enlace entre la microesfera y la microvesícula usando el reticulante heterobifuncional es como se muestra en la figura 10B. Las perlas recubiertas de estreptavidina se incuban con lípido funcionalizado con biotina (el “anclaje de lípido"), se lavan y se incuban con las microvesículas deseadas. Como se muestra en la figura 10B, la unión del anclaje lipídico con la microesfera se realiza por afinidad estreptavidina-biotina, y la captura de las microvesículas se facilita mediante la incorporación de análogos de fosfolípidos en la membrana bicapa lipídica de la vesícula. El protocolo es el siguiente:
1. Lavar 600 |il de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Pierce No. de cat. 88817) dos veces con solución salina regulada con fosfato (PBS).
2. Volver a suspender las perlas en 500 |il de PBS solo (como control) o 500 |il de PBS con 1 |il de la unidad estructural de lípido funcionalizada [1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinilo)] (Avanti Polar Lipids, Alabaster AL, No. de cat. 870277X; dilución 1:1000 en agua). Incubar, durante 30 min a 37 °C con rotación.
3. Lavar las perlas con agua UltraPure (N°. de catálogo Invitrogen 10977) y luego dos veces con PBS (N°. de catálogo HyClone SH30256).
4. Agregar 100 mg de microvesículas VCAP o plasma humano a las perlas con o sin el anclaje lipídico. Elevar el volumen a 500 |il con PBS. Incubar, durante 1 hora a 37 °C con rotación. Almacenar, durante la noche a 4 °C.
5. Pipetear una alícuota de las perlas necesarias para el siguiente experimento, lavar dos veces con PBS.
6. Probar la presencia de microvesículas capturadas con citometría de flujo (instrumento MoFlo™ XDP, Beckman Coulter, Inc., Indianápolis, IN) usando anticuerpos específicos de microvesículas de CD9 anti-humano marcado con PE (BD Pharmingen No. de cat. 555372) y c D63 anti-humano marcado con PE (BD Pharmingen, No. de catálogo 556020), o un IgG1 kappa de ratón PE de control de isotipo (eBioscience No. de catálogo 12-4714-42).
7. Las muestras se incubaron, durante 1 hora a temperatura ambiente en un Eppendorf MixMate en la oscuridad. Luego, las perlas se lavaron dos veces, se volvieron a suspender en PBS y se analizaron en MoFlo XDP o Luminex 200.
Siguiendo este protocolo, las microvesículas VCaP fueron capturadas por la unidad estructural de lípidos biotinilados [1,2-dihexadecanoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinilo)] unida a perlas magnéticas de estreptavidina. Cuando estas microvesículas se tiñeron con anticuerpos marcados con PE frente a las tetraspaninas CD9 y CD63, la MFI de la señal de PE detectada por MoFlo se tituló junto con la cantidad de entrada de microvesículas VCaP. Adicionalmente, las perlas se saturaron con microvesículas a las concentraciones más altas de entrada de VCaP. Véanse, las figuras 10C-10F para obtener resultados que demuestren el enriquecimiento de microvesículas conjugadas con perlas en presencia del anclaje de lípidos. La señal derivada de las vesículas ancladas a lípidos se correlacionó con la cantidad de vesículas, como se muestra en la figura 10G y la figura 10H.
La unidad estructural de lípidos biotinilados también se unió a perlas de LumAvidin y se usó para capturar microvesículas VCaP, que luego podrían analizarse usando citometría de flujo tradicional (Figura 10I) o Luminex (Figura 10J). La señal de tetraspanina solo se detectó en muestras que contenían perlas unidas con la unidad estructural de lípidos e incubadas con microvesículas; las muestras de control que no contenían microvesículas o en las que las perlas no estaban unidas a la unidad estructural de lípidos fueron negativas para la señal anti-CD9.
Unión de lectinas: las lectinas son proteínas de unión a carbohidratos. Se pueden usar diversas lectinas para unir unidades estructurales de azúcar en la superficie de las microvesículas. Por ejemplo, la concanavalina A (ConA) es una lectina que se une específicamente a ciertas estructuras que se encuentran en diversos azúcares, glicoproteínas y glicolípidos, principalmente grupos a-D-manosilo y a-D-glucosilo terminales internos y no reductores. Las perlas recubiertas de estreptavidina se incuban con ConA funcionalizado con biotina, se lavan y se incuban con las microvesículas deseadas.
Las microvesículas conjugadas con microesferas producidas por cualquiera de los métodos anteriores se pueden usar para cribar una biblioteca de aptámeros como se describe en los ejemplos en este documento.
Efectos de la preparación de la muestra: la preparación de la muestra se puede optimizar para la captura y/o detección de microvesículas atadas al sustrato. Como se muestra en la figura 10K y la figura 10L, se encontraron pocas vesículas ancladas en lípidos al anclar vesículas aisladas de muestras de plasma mediante ultracentrifugación. Se observaron resultados similares cuando las vesículas derivadas de plasma se aislaron usando ExoQuick (no se muestra). Además, también se observaron resultados similares cuando se usaron microvesículas de muestras de plasma directamente conjugadas con microesferas (no mostradas). Sin estar ligado a la teoría, se planteó la hipótesis de que las proteínas muy abundantes en las muestras de plasma pueden interferir con el anclaje de lípidos de microvesículas o la conjugación directa del sustrato. Para probar esta teoría, se detectaron microvesículas Vcap con (Figura 10N) o sin (Figura 10M) 30 mg/ml de albúmina de suero humano (HSA) agregada a las muestras antes de la detección. Estas figuras muestran que la señal de las vesículas detectadas estaba disminuida en presencia de HSA.
Diversos métodos para mejorar la preparación de muestras de microvesículas derivadas de sangre incluyen el agotamiento de proteínas muy abundantes (por ejemplo, HSA/IgG/fibrinógeno), remoción de lípidos de la sangre, concentración de plasma con filtros MWCO de l50k, 300K y 1000K para retirar proteínas y otros materiales que interfieren, y/o aislamiento por afinidad (por ejemplo, inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad) usando agentes de unión frente a antígenos de la superficie de las vesículas. Luego, estos enfoques son seguidos por el aislamiento de vesículas (por ejemplo, ultracentrifugación, ultrafiltración, Exoquick).
Estabilidad: debido a que las microvesículas se acoplan covalentemente a las microperlas, debería haber un “sangrado” mínimo de las microvesículas conjugadas de las perlas una vez que se realiza la conjugación y las perlas se lavan correctamente. Se realizó un experimento para probar la estabilidad de las microvesículas conjugadas con perlas. Las microvesículas purificadas usando diversos métodos se conjugaron directamente con microesferas como se describe anteriormente. La señal de las perlas conjugadas con microvesículas se determinó después del almacenamiento de las perlas conjugadas, durante 2-3 días a 4 °C y nuevamente después de que las mismas perlas se almacenaron, durante 11-12 días a -80 °C. Las microvesículas se marcaron con anticuerpo anti-CD9 conjugado con PE o anticuerpo anti-CD63 conjugado con PE. Se determinaron los valores de MFI para cada uno de los lotes de perlas. Las figuras 10O-10P muestra que se observó una degradación mínima de la señal antes y después de 12 días de almacenamiento a -80 °C usando el detector anti-CD9. Las vesículas aisladas usando diferentes métodos se probaron según lo indicado por las condiciones a lo largo del eje X: 1) kit ExoQuick™ (System Biosciences, Inc., Mountain View, CA) seguido de ultrafiltración; 2) ultracentrifugación; 3) ultracentrifugación seguida de Exoquick; 4) Kit ExoQuick a ExoMir™ (Bioo Scientific Corp., Austin TX); 5) preparación de vesículas VCAP ultrafiltradas #1; 6) preparación de vesículas VCAP ultrafiltradas #2; y 7) ultrafiltración seguida de ultracentrifugación. Se observaron resultados idénticos con el detector anti-CD63.
Formación de imágenes de microvesículas atadas: se usó microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM) para evaluar los protocolos alternativos para atar las microvesículas aisladas de plasma a la superficie de microesferas. Las figuras 11A-11N muestran las imágenes FE-SEM. La figura 11A muestra una microesfera que no ha sido funcionalizada o conjugada. La figura 11B muestra la conjugación directa de microvesículas de plasma aisladas mediante ultracentrifugación en perlas no magnéticas. La figura 11C muestra una ampliación de la región indicada de la figura 11B. Las flechas apuntan a diversas microvesículas. La figura 11D y la figura 11E corresponden a la figura 11B y la figura 11C, respectivamente, excepto que las perlas son magnéticas. Las figuras 11F-H muestran perlas magnéticas funcionalizadas. La figura 11F muestra perlas conjugadas con avidina funcionalizadas con ConA biotinilada. La figura 11G muestra perlas conjugadas con avidina funcionalizadas con un anclaje de lípidos biotinilados. La figura 11H muestra perlas directamente conjugadas con anticuerpos anti-CD9. La figura 11I muestra la captura de perlas de microvesículas de plasma aisladas usando ultracentrifugación para perlas funcionalizadas con ConA. La figura 11J muestra una ampliación de la región indicada de la figura 11I. Las flechas apuntan a diversas microvesículas. La figura 11K muestra la captura de perlas de microvesículas de plasma aisladas usando ultracentrifugación para perlas funcionalizadas con anclaje de lípidos. La figura 11L muestra una ampliación de la región indicada de la figura 11K. Las flechas apuntan a diversas microvesículas. La figura 11M muestra la captura de perlas de microvesículas de plasma aisladas usando ultracentrifugación para perlas funcionalizadas con anclaje de lípidos. La figura 11N muestra una ampliación de la región indicada de la figura 11M. Las flechas apuntan a diversas microvesículas.
Resumen: Las tres plataformas para atar las vesículas a las microesferas (conjugación directa, unión de anticuerpos y anclaje de lípidos) se demostraron usando microvesículas derivadas de Vcap (línea celular de próstata humana). Con condiciones de muestra optimizadas (por ejemplo, remoción de proteínas muy abundantes), se observan resultados similares usando vesículas aisladas de muestras de plasma humano. Es sorprendente obtener un acoplamiento suficiente de una estructura de microvesículas compleja directamente a perlas dado el potencial de interferencia de entidades moleculares, incluida, pero no limitando a, la interferencia estérica a través de vesículas de diferentes tamaños, la formación de agregados, el bloqueo de proteínas solubles o la interferencia de fragmentos de vesículas. Las microvesículas unidas a microesferas producidas mediante los métodos de este ejemplo se pueden usar para cribar una biblioteca de aptámeros como se describe en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 29: Protocolo para el acoplamiento de carbodiimida en dos etapas de proteína o microvesículas a microesferas carboxiladas
El siguiente protocolo se usa para conjugar proteínas (por ejemplo, anticuerpos) o microvesículas con microesferas carboxiladas (microesferas magnéticas MagPlex® o microesferas no magnéticas MicroPlex®, Luminex Corporation, Austin, TX).
Materiales:
Región 15: Luminex Catálogo # MC10015-01 Lote # B28049 Exp: 2016/12/16
Región 18: Luminex Catálogo # MC10018-01 Lote # B29449 Exp: 2017/3/14
Protocolo:
Las microesferas deben protegerse de la exposición prolongada a la luz, durante este procedimiento.
1. Volver a suspender la suspensión stock de microesferas desacopladas según las instrucciones descritas en la hoja de información del producto proporcionada con las microesferas.
2. Transferir 5.0 x 106 de las microesferas madre a un tubo de microcentrífuga de USA Scientific. Proporción Proteína/Perlas: 20 |ig/5 x 106. Se puede reducir a escala hasta 4 jj.g/106.
3. Colocar el tubo en un separador magnético y dejar que se produzca la separación, durante 60 segundos. Véase la nota técnica 1 a continuación.
4. Con el tubo aún colocado en el separador magnético, retirar el sobrenadante. Tener cuidado de no perturbar las microesferas.
5. Retirar el tubo del separador magnético y volver a suspender las microesferas en 100 |iL de dH2O agitando con vortex y sonicación, durante aproximadamente 20 segundos.
6. Colocar el tubo en un separador magnético y dejar que se produzca la separación, durante 60 segundos.
7. Con el tubo aún colocado en el separador magnético, retirar el sobrenadante. Tener cuidado de no perturbar las microesferas.
8. Retirar el tubo del separador magnético y volver a suspender las microesferas lavadas en 80 |iL de fosfato sódico monobásico 100 mM, pH 6.2 agitando con vortex y sonicación, durante aproximadamente 20 segundos.
9. Agregar 10 |iL de Sulfo-NHS de 50 mg/ml (diluido en dH2O) a las microesferas y mezclar suavemente con vortex.
10. Agregar 10 |iL de 50 mg/mL de EDC (diluido en dH2O) a las microesferas y mezclar suavemente con vortex.
11. Incubar, durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitación suave en vórtex a intervalos de 10 minutos.
12. Colocar el tubo en un separador magnético y dejar que se produzca la separación, durante 60 segundos.
13. Con el tubo aún colocado en el separador magnético, retirar el sobrenadante. Tener cuidado de no perturbar las microesferas.
14. Retirar el tubo del separador magnético y volver a suspender las microesferas en 250 |iL de MES 50 mM, pH 5.0 agitando con vortex y sonicación, durante aproximadamente 20 segundos. Véase la nota técnica 2 a continuación.
15. Repetir las etapas 12 y 13. Esto es un total de dos lavados con MES 50 mM, pH 5.0.
16. Retirar el tubo del separador magnético y volver a suspender las microesferas activadas y lavadas en 100 |iL de MES 50 mM, pH 5.0 agitando con vortex y sonicación, durante aproximadamente 20 segundos.
17. Agregar 20 |ig de proteína o microvesículas equivalentes a las microesferas resuspendidas.
18. Llevar el volumen total a 500 |iL con MES 50 mM, pH 5.0. Nota: este volumen se puede reducir en caso de conjugación de 106 perlas.
19. Mezclar la reacción de acoplamiento agitando con vortex.
20. Incubar, durante 2 horas mezclando (800 rpm en MixMate) a temperatura ambiente.
21. Colocar el tubo en un separador magnético y dejar que se produzca la separación, durante 60 segundos.
22. Con el tubo aún colocado en el separador magnético, retirar el sobrenadante. Tener cuidado de no perturbar las microesferas.
23. Retirar el tubo del separador magnético y volver a suspender las microesferas acopladas en 500 |iL de PBS-T agitando con vortex y sonicación, durante aproximadamente 20 segundos. Véase la nota técnica 3 a continuación.
24. Incubar, durante 30 minutos mezclando (por rotación) a temperatura ambiente. Realizar esta etapa usando las microesferas el mismo día.
25. Colocar el tubo en un separador magnético y dejar que se produzca la separación, durante 30 a 60 segundos.
26. Con el tubo aún colocado en el separador magnético, retirar el sobrenadante. Tener cuidado de no perturbar las microesferas.
27. Retirar el tubo del separador magnético y volver a suspender las microesferas en 1 ml de PBS-TBN agitando con vortex y sonicación, durante aproximadamente 20 segundos. Véase la nota técnica 4.
28. Repetir las etapas 25 y 26. Esto es un total de dos lavados con 1 ml de PBS-TBN.
29. Retirar el tubo del separador magnético y volver a suspender las microesferas acopladas y lavadas en 250 ul de PBS-TBN (150 ul para 1 millón de perlas en PBS-TBN).
30. Contar la suspensión de microesferas por vicell
Nota técnica 1: para obtener una lista de separadores magnéticos, véanse, las recomendaciones del fabricante de perlas. El tiempo de separación óptimo puede variar según el tipo de separador usado.
Nota técnica 2: el acoplamiento se puede realizar en MES 100 mM, pH 6.0 con resultados similares. En algunos casos, se puede lograr una mejor solubilidad y un mejor acoplamiento a un pH de acoplamiento más alto o en una solución reguladora diferente. Si la diana no se acopla satisfactoriamente según estas recomendaciones, pruebe con PBS, pH 7.4, como solución reguladora de acoplamiento alternativo.
Nota técnica 3: Ya sea PBS-TBN (PBS, BSA al 0.1 %, Tween-20 al 0.02 %, azida al 0.05 %, pH 7.4) o PBS-BN (PBS, BSA al 1 %, azida al 0.05 %, pH 7.4) se puede usar como solución reguladora de bloqueo/almacenamiento.
Nota técnica 4: Se puede usar PBS-TBN o PBS, Tween-20 al 0.05 % como solución reguladora de lavado.
Ejemplo 30: microvesículas conjugadas con microesferas como plataforma para identificar aptámeros específicos de cáncer
Las estrategias para la partición de bibliotecas de aptámeros incluyen: (i) diana fija de soporte sólido (por ejemplo, agarosa, metacrilato de polimetilo o perlas paramagnéticas); (ii) cambio de movilidad del gel; (iii) membrana de nitrocelulosa que se une a las proteínas pero no al ADN; y (iv) electroforesis capilar. Para desarrollar un aptámero para una proteína específica del cáncer, cada uno de estos enfoques por lo general comienza con una proteína recombinante que ya se sabe que está asociada (al menos en cierta medida) con el cáncer asegurada en un soporte sólido de una manera que permite la partición del grupo de aptámeros en poblaciones “aglutinantes” y “no aglutinantes". Estos enfoques suponen además que: (i) el plegamiento de la proteína recombinante reflejará la proteína natural in situ (por ejemplo, en un tejido o fluido corporal tal como la sangre), aunque la inmovilización química de la proteína puede modificar su estructura y conformación; y (ii) no hay interacción con otros componentes en la muestra biológica deseada. De acuerdo con lo anterior, identificar y desarrollar aptámeros para detectar cáncer usando muestras de pacientes con cáncer confirmado, así como de individuos sanos, sigue siendo un desafío. Este ejemplo describe uno de tales enfoques que permite la selección de aptámeros que diferencian el cáncer sin un conocimiento previo de la diana del aptámero y en el que las dianas se encuentran en su entorno/conformación nativos.
Las microvesículas intactas, en lugar de proteínas individuales, aisladas de muestras de pacientes se conjugan directamente con microesferas. Las perlas carboxiladas son útiles para inmovilizar microvesículas a través de grupos amino primarios de proteínas de superficie de microvesículas. Alternativamente, las microvesículas se pueden inmovilizar a través del anclaje de lípidos. Véase, los ejemplos 28 arriba. Las microesferas marcadas permiten confirmar la conjugación y el enriquecimiento de la biblioteca de aptámeros directamente en un único ensayo. Las perlas magnéticas pueden proporcionar una comodidad adicional para el manejo. Aunque las microvesículas se pueden unir a microvesículas a través de un enlace no covalente (por ejemplo, unión de anticuerpos o aptámeros, adsorción), tal unión por lo general tiene una estabilidad insuficiente para permitir un cribado eficaz de aptámeros.
El procedimiento de desarrollo de aptámeros se realiza siguiendo estas etapas:
1) Aislar las microvesículas de muestras de sangre de pacientes normales y con cáncer (plasma o suero). Las muestras se agotan de proteínas muy abundantes (por ejemplo, IgG, albúmina de suero humano (HSA)) antes del aislamiento de vesículas.
2) Conjugar las microvesículas aisladas con perlas carboxiladas usando la química estándar de carbodiimida de dos etapas como se conoce en la técnica. Alternativamente, las microvesículas se conjugan a través del anclaje de lípidos.
3) Incubar las perlas conjugadas de vesículas con una biblioteca de aptámeros en paralelo para muestras normales y de cáncer. La biblioteca de aptámeros se incuba previamente con los componentes del ensayo (por ejemplo, perlas y perlas recubiertas de plasma) para retirar cualquier aptámero que se una a tales componentes.
4) Descartar el sobrenadante que contiene aptámeros no unidos. Lavar las perlas conjugadas con vesículas ~ 10 veces con solución salina regulada con fosfato (PBS) con Tween 20 al 0.1 %.
5) Desasociar los aptámeros unidos a las microvesículas mediante tratamiento con NaOH, neutralizar la solución, precipitar los aptámeros y amplificar los aptámeros recuperados mediante qPCR. Los productos de qPCR recuperados se usan como biblioteca inicial para la siguiente ronda de selección (es decir, para repetir el procedimiento a partir de la etapa 3).
6) Una vez que la complejidad de la biblioteca de aptámeros se reduce al menos a 106 miembros (a partir de, por ejemplo, 1015), los aptámeros se secuencian usando tecnología de secuenciación de última generación de alto rendimiento (Illumina MiSeq® System, Illumina, Inc., San Diego, CA). Después de secuenciar en paralelo los grupos de aptámeros específicamente enriquecidos con cáncer y normal, las secuencias que se superponen tanto en el grupo de cáncer como en el normal se descartan y aquellas secuencias específicas para la mayoría de las muestras de cáncer se consideran candidatas a aptámero.
Ejemplo 31: Método de selección de aptámeros de microvesículas
Este ejemplo presenta un método de selección de aptámeros que se pueden usar para diferenciar microvesículas de pacientes con cáncer y muestras de control sin cáncer (por ejemplo, “normales”). El cáncer se puede elegir como un linaje particular de cáncer. Los controles se pueden dividir en diversos grupos de patología (por ejemplo, positivos para condiciones distintas al cáncer elegido) para proporcionar una capa adicional de complejidad. El método enriquece una biblioteca de aptámeros para miembros de aptámeros que se unen a microvesículas derivadas del cáncer pero no a las microvesículas de control.
En el esquema, “selección positiva” se refiere al enriquecimiento de aptámeros en microvesículas derivadas de cáncer, mientras que “selección negativa” se refiere al agotamiento de aptámeros que se unen a microvesículas de control. Generalmente, el esquema alterna entre selección positiva y negativa, de manera que se realizan selecciones negativas entre cada selección positiva. Las selecciones se realizan frente a microvesículas conjugadas con perlas como se describe anteriormente.
Se obtiene una cohorte de 250 muestras de plasma. Aproximadamente un tercio de las muestras son de pacientes con cáncer y el resto son controles. Las muestras se agrupan en grupos de 5 a 6 muestras, lo que da como resultado ~16 grupos de cáncer. Las microvesículas de las muestras agrupadas se conjugan con microperlas usando los métodos descritos anteriormente.
Primero se realiza la selección positiva para cada grupo. Se realiza la siguiente selección negativa. Siete selecciones positivas/negativas se realizan en paralelo. En cada selección paralela, los grupos se ordenan aleatoriamente para evitar sesgos de selección. Véase la figura 13B para representación gráfica. Después de cada ronda, los grupos de aptámeros restantes se secuencian usando la tecnología de secuenciación de última generación. La secuenciación puede identificar cualquier enriquecimiento en las rondas positivas y/o agotamiento en las rondas negativas. Cualquier secuencia de consenso (secuencia y/o estructura) también se identifica después de cada ronda. Si las secuencias de consenso identificadas se pierden después de ciertas rondas en una minoría de grupos pero no en otros, esos grupos pueden analizarse para determinar si se ha introducido algún error.
Ejemplo 32: Marcaje con ImmunoGold de microvesículas conjugadas o inmunoprecipitadas en microesferas
Como se describe en este documento, los métodos estándar para la detección y caracterización de microvesículas incluyen transferencia Western, dispersión de luz dinámica, citometría de flujo y microscopía electrónica. Como se describió anteriormente, las microvesículas se pueden capturar con anticuerpos conjugados con microperlas y detectarse con otro anticuerpo marcado en un ensayo de microperlas basado en flujo. Véase el ejemplo 28. Se puede usar microscopía electrónica para confirmar la presencia de microvesículas capturadas en las perlas en este inmunoensayo. Este ejemplo proporciona microscopía electrónica con marcaje ImmunoGold para obtener imágenes de microvesículas conjugadas o inmunoprecipitadas en microesferas.
Consideraciones generales: las microvesículas se aislaron mediante ultracentrifugación a partir de plasma humano y se conjugaron con microesferas carboxiladas no magnéticas (MicroPlex® Microspheres, Luminex Corporation, Austin TX). Después de la conjugación, las perlas se marcan con anticuerpo monoclonal murino anti-CD9 seguido de anti­ ratón- ImmunoGold (partículas de 10 nm), se montan en un cubreobjetos recubierto de polilisina, se secan, se deshidratan, se secan en el punto crítico, se recubren con carbón y se obtienen imágenes usando Scanning. microscopía electrónica de barrido con (a) modo de electrones secundarios (SE)-para visualizar microvesículas y (b) modo de electrones retrodispersados (BSE)-para visualizar las nanopartículas de oro.
Las etapas implicadas incluyen: (i) marcar las microvesículas en perlas con anticuerpo específico de proteína de membrana y conjugado anti-especie Gold correspondiente; (ii) etapas regulares de preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido (SEM); (iii) recubrimiento por pulverización catódica de carbono (en lugar de oropaladio); (iv) combinación de imágenes SE y BSE.
La conjugación de microvesículas con perlas se puede reemplazar con inmunoprecipitación de microvesículas con perlas, por ejemplo, usando perlas conjugadas con un anticuerpo frente a un antígeno de superficie de microvesículas.
Protocolo:
El material de partida comprende una muestra de microvesículas directamente conjugada con perlas MicroPlex. Véase el ejemplo 28 para conocer la metodología general.
1. Centrifugar una alícuota de 4 |il del material de partida (en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml), durante 1 min a 13,000 rpm para sedimentar las perlas. Retirar el sobrenadante sin perturbar el precipitado.
2. Agregar 20 |il de solución reguladora de bloqueo PBS-BSAT (solución salina regulada con fosfato con albúmina de suero bovino y Tween®-20: (NaPO4 0.1 M pH 7.2/NaCl 150 mM/BSA al 1 %/T20 al 0.01 %)) y volver a suspender las pellas. Incubar, durante 30 min a temperatura ambiente.
3. Centrifugar, durante 1 min a 13,000 rpm para formar las pellas de las perlas. Retirar el sobrenadante.
4. Agregar 20 |il de solución de anticuerpo primario (10 o 100 |ig/ml, anticuerpo monoclonal anti-CD9 de ratón (BD Biosciences No. de catálogo 555370, Lote 2097575) con PBS-BSAT) y volver a suspender las pellas. Incubar, durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Lavar 3 veces con 50 |il de PBS-BSAT (pellas por centrifugación 1 min a 13.000 rpm, retirar el sobrenadante), durante 5 min a temperatura ambiente.678910
6. Agregar 20 |il de solución de anticuerpo secundario (a 1:100, 0.3 |ig/ml, anti-ratón-oro (anticuerpo de cabra antiratón-oro, 10 nm, MP Biomedicals No. de catálogo #67854) con PBS- BSAT) y volver a suspender las pellas. Incubar, durante 20 min a temperatura ambiente.
7. Lavar 3 veces con 50 |il de PBS (1x, HyClone, pH 7.4), durante 5 min a temperatura ambiente.
8. Después de retirar el sobrenadante, agregar 10 |il de PBS y volver a suspender las pellas.
9. Llevar 2 |il de perlas etiquetadas y resuspendidas a un cubreobjetos recubierto con poli-L-lisina y frotar suavemente para esparcir las perlas en la superficie
10. Incubar el cubreobjetos en una cámara húmeda, durante 10 min, tapado a temperatura ambiente.
11. Fijación primaria con 3 ml de Glutaldehído al 2 % con 1x PBS, en placa Petri de descarte individual, tapada, durante 30 min a temperatura ambiente. Trabajar en campana de seguridad.
12. Lavar el cubreobjetos 3 veces con 1x PBS. Descartar la solución de fijación primaria y los lavados en un contenedor designado de desechos peligrosos.
13. Fijación secundaria con tetráxido de Osmio al 0.5 % en PBS 1x, tapado, durante 30 min a temperatura ambiente en campana de seguridad.
14. Lavar el cubreobjetos 3 veces con agua nanopura. Descartar la solución de fijación secundaria y los lavados en un contenedor designado de desechos peligrosos.
15. Deshidratar el cubreobjetos en series de etanol, colocar el cubreobjetos en una canasta de malla de acero inoxidable, 5 min cada uno a temperatura ambiente: 1) 20 % de etanol; 2) 50 % de etanol; 3) 75 % de etanol; 4) 100 % de etanol; 5) repetir etanol al 100 % dos veces más.
16. Secado en punto crítico (CPD) en dióxido de carbono líquido.
17. Montar el cubreobjetos en el escenario de aluminio con adhesivo
18. Recubrimiento de pulverización catódica de carbono
19. Obtener las imágenes usando SE (enfoque) y BSE (detección de oro).
Resultados:
Se muestran imágenes de microvesículas conjugadas con perlas según el protocolo anterior en las figuras 12A-12E. Referencias: S.L. Erlandsen, P. T. Macechko and C. Frethem. High resolution backscatter electron (bse) imaging of immunogold with in-lens and below-the-lens field emission scanning electron microscopes. Scanning Microscopy 13:43-54 (1999).
Ejemplo 33: Aislamiento competitivo de aptámeros a microvesículas
El método del ejemplo 31, se realiza para identificar aptámeros que se unen a antígenos de microvesículas de interés. Los anticuerpos anti-tetraspanina se atan a las microperlas y se incuban con cMV de muestras de plasma de pacientes con cáncer de próstata. Los cMV capturados sirven como el analito en el método del ejemplo 31. Los candidatos a aptámeros se disocian de la microvesícula usando los anticuerpos de la tabla 26.
Tabla 26: Anticuerpos
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El método se usa para desarrollar aptámeros para sustituir los anticuerpos en la tabla 26. Los aptámeros se usan para la captura y/o detección de microvesículas de interés. El método se usa para desarrollar aptámeros para EGFR, TOMM22, NDRG1, VDAC2, KLK6, MMP7, EDIL3 (del-1), CCR5, BDNF, Hsp10, GOLPH2, Hsp40/DNAJB 1, KLK4, LGALS3BP, p130/RBL2, SCARB2, Estanniocalcina 2/STC2, TGN46/TGOLN2, ANXA2, TMPRSS1, KLK14, SPEN/ RBM15, ME1, PhIP, ALDOA, MMP25, NCL, EDNRB/EDN3, MTA1, CDH1, KLK15, CHRDL2, CXCR3. El método se usa para desarrollar aptámeros para CD81, EDN-3, Citocromo C, CD10, CD151, seprasa/FAP, HGF, PAP, CD41, IGFBP-2, TWEAK, MMP 2, H3F3A, DDX1, 99-14-3-3 zeta/beta, IDH2, CD49d, KLK12, DCTN2-50, Histona H4, EDIL3 (del-1), CD9, COX2, hnRNP M1-M4, CDH2, SPEN/ RBM15, 81-Prohibitina, SYT9. Estos aptámeros se usan con un anticuerpo o aptámero anti-cadherina E (CDH1) para un par de captura/detector para detectar microvesículas de interés. Las microvesículas se identifican para distinguir las muestras de cáncer de próstata de las muestras que no son de cáncer de próstata.
Aunque las realizaciones preferidas de la presente invención se han mostrado y descrito en este documento, será obvio para los expertos en la técnica que tales realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método de caracterización de un fenotipo de una muestra que contiene microvesículas que comprende:
(a) poner en contacto la muestra con un grupo de diferentes aptámeros enriquecidos para dirigir a una o más microvesículas;
(b) retirar los aptámeros no unidos;
(c) eluir los aptámeros unidos; y
(d) identificar los aptámeros que se eluyen, mediante secuenciación, y en la que
(i) la presencia y el número de copias de los aptámeros identificados se usa para caracterizar el fenotipo;
(ii) no es necesario conocer la diana precisa de los diferentes aptámeros; y,
(iii) el fenotipo es cáncer
2. El método de la reivindicación 1, en el que la secuenciación comprende realizar una secuenciación de alto rendimiento.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra es de un sujeto que se sospecha que tiene o está predispuesto a tener un cáncer.
4. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende una muestra de tejido, un cultivo celular o un fluido biológico.
5. El método de la reivindicación 4, en el que:
(i) el fluido biológico comprende un fluido corporal; o
(ii) el fluido biológico comprende sangre periférica, sueros, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido de Cowper o líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural y peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción de la mucosa, agua de las heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades de los senos paranasales, aspirados broncopulmonares, líquido de la cavidad del blastocisto o sangre del cordón umbilical.
6. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el fluido biológico se pone en contacto con la pluralidad de aptámeros antes de aislar las microvesículas.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la muestra comprende microvesículas aisladas.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
(i) al menos un miembro del grupo de aptámeros se une a un polipéptido o fragmento del mismo;
(ii) al menos un miembro del grupo de aptámeros se une a un polipéptido o fragmento del mismo y el polipéptido o fragmento del mismo es soluble o se une a la membrana; y/o
(iii) al menos un miembro del grupo de aptámeros se une a un polipéptido o fragmento del mismo y el polipéptido o fragmento del mismo comprende un biomarcador en la tabla 3 o la tabla 4.
9. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que al menos un miembro del grupo de aptámeros se une a un antígeno de superficie de microvesículas.
10. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el cáncer comprende una leucemia linfoblástica aguda; leucemia mieloide aguda; carcinoma adrenocortical; cánceres relacionados con el SIDA; linfoma relacionado con el SIDA; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; tumor teratoideo/rabdoideo atípico; carcinoma de células basales; cáncer de vejiga; glioma de tronco encefálico; tumor cerebral (incluyendo glioma de tronco encefálico, tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central, tumores embrionarios del sistema nervioso central, astrocitomas, craneofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma); cáncer de mama; tumores bronquiales; linfoma de Burkitt; cáncer de sitio primario desconocido; tumor carcinoide; carcinoma de sitio primario desconocido; tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central; tumores embrionarios del sistema nervioso central; cáncer de cuello uterino; cánceres infantiles; cordoma; leucemia linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craneofaringioma; linfoma cutáneo de células T; tumores de células de los islotes pancreáticos endocrinos; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer de esófago; estesioneuroblastoma; sarcoma de Ewing; tumor extracraneal de células germinales; tumor extragonadal de células germinales; cáncer de vías biliares extrahepáticas; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (estómago); tumor carcinoide gastrointestinal; tumor de células del estroma gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal (GIST); tumor trofoblástico gestacional; glioma; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; linfoma de Hodgkin; cáncer de hipofaringe; melanoma intraocular; tumores de células de los islotes; sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón; histiocitosis de células de Langerhans; cáncer de laringe; cáncer de labio; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; cáncer óseo de histiocitoma fibroso maligno; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; carcinoma de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto; cáncer de boca; síndromes de neoplasia endocrina múltiple; mieloma múltiple; mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide; síndromes mielodisplásicos; neoplasias mieloproliferativas; cáncer de cavidad nasal; cáncer de nasofaringe; neuroblastoma; linfoma de no-Hodgkin; cáncer de piel no melanoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer bucal; cáncer de cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma; otros tumores cerebrales y de la médula espinal; cáncer de ovarios; cáncer epitelial de ovario; tumor de células germinales de ovario; tumor de ovario de bajo potencial maligno; cáncer de páncreas; papilomatosis; cáncer de senos paranasales; cáncer de paratiroides; cáncer pélvico; cáncer de pene; cáncer de faringe; tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia; pineoblastoma; tumor pituitario; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central (CNS); cáncer hepático hepatocelular primario; cáncer de próstata; cáncer de recto; cáncer renal; cáncer de células renales (riñón); cáncer de células renales; cáncer de las vías respiratorias; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de glándulas salivales; síndrome de Sézary; cáncer de pulmón de células pequeñas; cáncer de intestino delgado; sarcoma de tejidos blandos; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso; cáncer de estómago (gástrico); tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales; linfoma de células T; cáncer testicular; cáncer de garganta; carcinoma tímico; timoma; cáncer de tiroides; cáncer de células de transición; cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter; tumor trofoblástico; cáncer de uréter; cáncer de uretra; cáncer uterino; sarcoma uterino; cáncer de vagina; cáncer de vulva; macroglobulinemia de Waldenstrom; o tumor de Wilm.
11. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el grupo de aptámeros comprende al menos 50 aptámeros diferentes.
12. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que las microvesículas se aíslan usando cromatografía, filtración, ultrafiltración, centrifugación, ultracentrifugación, citometría de flujo, captura por afinidad y/o microfluidos.
13. El método de cualquier reivindicación anterior, donde una presencia alterada o el número de copias del grupo de aptámeros que formaron un complejo con las microvesículas en comparación con una muestra de referencia indica que la muestra es cancerosa o está predispuesta a ser cancerosa.
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