JP2019033750A - アプタマーおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年10月23日に出願された米国特許仮出願第61/717,566号;2012年11月29日に出願された同第61/731,419号;2012年12月11日に出願された同第61/735,915号;2013年1月2日に出願された同第61/748,437号;2013年1月7日に出願された同第61/749,773号;2013年1月8日に出願された同第61/750,331号;2013年1月18日に出願された同第61/754,471号;2013年2月20日に出願された同第61/767,131号;2013年2月25日に出願された同第61/769,064号;2013年3月26日に出願された同第61/805,365号;2013年4月3日に出願された同第61/808,144号;2013年5月7日に出願された同第61/820,419号;2013年5月23日に出願された同第61/826,957号;2013年6月24日に出願された同第61/838,762号;2013年7月5日に出願された同第61/843,256号;2013年8月6日に出願された同第61/862,809号;2013年8月8日に出願された同第61/863,828号;2013年8月14日に出願された同第61/866,014号;2013年8月20日に出願された同第61/867,978号;2013年8月28日に出願された同第61/871,107号;および2013年9月6日に出願された同第61/874,621号の恩典を主張し、これらの全ての出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
MPEP §1730 II.B.2(a)において認可されかつ明記される米国特許商標庁EFS-WEBサーバを介した配列表の以下の電子的提出物の全内容は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み入れられる。この配列表は、電子的に提出された、以下に特定されるテキストファイルに包含されている。
ファイル名:37901811601SeqList.txt
作成日:2013年10月23日
サイズ(バイト):82,464,193 バイト
本発明は、微小胞表面抗原に結合することが可能なアプタマーの分野に概して関連し、これらのアプタマーは、微小胞が関係する癌および/または他の疾患もしくは障害の治療薬および診断薬として有用である。本発明はさらに、微小胞に結合することが可能なアプタマーの投与のための材料および方法にも関連する。微小胞は、癌を示す細胞に由来し得る。
本明細書で言及したすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み入れられているよう具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
[本発明1001]
(a)表18に記載される、SEQ ID NO: 230900〜230903、230908、230913〜230927、もしくは任意の上記配列の可変配列;または(b)任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、微小胞に結合するアプタマー。
[本発明1002]
SEQ ID NO: 230900〜230903、230908、230913〜230927、またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、本発明1001のアプタマー。
[本発明1003]
前記機能的断片が、表18に示される「可変配列」領域を含む、前記本発明のいずれかのアプタマー。
[本発明1004]
微小胞が前立腺癌細胞から流出したものである、前記本発明のいずれかのアプタマー。
[本発明1005]
(a)表23に記載される、SEQ ID NO: 231018〜231031もしくはそれらの可変配列;(b)表24に記載される、SEQ ID NO: 231032〜231051もしくはそれらの可変配列;(c)SEQ ID NO: 231032〜241535;または(d)任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、微小胞に結合するアプタマー。
[本発明1006]
SEQ ID NO: 231018〜231031またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、本発明1005のアプタマー。
[本発明1007]
SEQ ID NO: 231032〜231051またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、本発明1005のアプタマー。
[本発明1008]
前記機能的断片が、表23〜24のいずれかに示される「可変配列」領域を含む、本発明1005〜1007のいずれかのアプタマー。
[本発明1009]
微小胞が乳癌細胞から流出したものである、本発明1005〜1008のいずれかのアプタマー。
[本発明1010]
(a)SEQ ID NO: 1〜230810;(b)表11、12、13、15に記載される、SEQ ID NO: 230822〜230899、230904〜230907、230909〜230911、もしくは任意のそれらの可変配列;または(c)任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、上皮細胞接着分子(EpCAM)タンパク質に結合するアプタマー。
[本発明1011]
アプタマー4 ($$SEQ ID NO: 1)、オリゴ6 (SEQ ID NO: 230810)、オリゴ4B (SEQ ID NO: 183132)、CAR003 (SEQ ID NO: 230822またはSEQ ID NO: 230823)、CAR016 (SEQ ID NO: 230840)、またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、本発明1010のアプタマー。
[本発明1012]
表5、6、7、8、11、12、13、15、16、またはそれらの機能的断片のいずれかに由来する、本発明1010のアプタマー。
[本発明1013]
前記機能的断片が、表11、12、13、15のいずれかに示される「可変配列」領域、またはそれらの機能的断片を含む、本発明1010〜1012のいずれかのアプタマー。
[本発明1014]
インビトロでのEpCAMシグナル伝達を調節する、本発明1010〜1013のいずれかのアプタマー。
[本発明1015]
(a)表20に記載される、SEQ ID NO: 230932〜230935もしくはそれらの可変配列;または(b)任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、前立腺特異的膜抗原(PSMA)タンパク質に結合するアプタマー。
[本発明1016]
少なくとも1つの化学修飾を含むようにさらに改変されている、前記本発明のいずれかのアプタマー。
[本発明1017]
前記修飾が、核酸の、糖位置での化学的置換;リン酸位置での化学的置換;および塩基位置での化学的置換からなる群より選択される、本発明1016のアプタマー。
[本発明1018]
前記修飾が、ビオチン化、蛍光標識の取り込み、修飾ヌクレオチドの取り込み、3'キャッピング、アミンリンカーへの結合、高分子量の非免疫原性化合物への結合、親油性化合物への結合、薬物への結合、細胞傷害性部分への結合、および放射性同位体を用いた標識からなる群より選択される、本発明1016のアプタマー。
[本発明1019]
ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、前記アプタマーの5'末端に結合している、本発明1018のアプタマー。
[本発明1020]
ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、前記アプタマーの3'末端に結合している、本発明1018のアプタマー。
[本発明1021]
細胞傷害性部分がナノ粒子中に封入されている、本発明1018のアプタマー。
[本発明1022]
ナノ粒子が、リポソーム、デンドリマー、および櫛形ポリマーからなる群より選択される、本発明1021のアプタマー。
[本発明1023]
細胞傷害性部分が小分子の細胞傷害性部分を含む、本発明1018のアプタマー。
[本発明1024]
小分子の細胞傷害性部分が、ビンブラスチンヒドラジド、カリチアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、ツブリシン、ドラスタチン-10、ドラスタチン-15、アウリスタチンE、リゾキシン、エポチロンB、エポチロンD、タキソイド、メイタンシノイド、ならびにそれらの任意のバリアントおよび誘導体からなる群より選択される、本発明1023のアプタマー。
[本発明1025]
放射性同位体が、イットリウム-90、インジウム-111、ヨウ素-131、ルテチウム-177、銅-67、レニウム-186、レニウム-188、ビスマス-212、ビスマス-213、アスタチン-211、およびアクチニウム-225からなる群より選択される、本発明1018のアプタマー。
[本発明1026]
細胞傷害性部分がタンパク毒素である、本発明1018のアプタマー。
[本発明1027]
タンパク毒素が、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス外毒素Aからなる群より選択される、本発明1026のアプタマー。
[本発明1028]
非免疫原性の高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、本発明1018のアプタマー。
[本発明1029]
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、本発明1028のアプタマー。
[本発明1030]
γ線放出放射性同位体によって標識されている、本発明1016のアプタマー。
[本発明1031]
活性物質が前記アプタマーに結合している、本発明1016のアプタマー。
[本発明1032]
活性物質が治療物質または診断物質を含む、本発明1031のアプタマー。
[本発明1033]
治療物質または診断物質が、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物学的活性物質、生物学的分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン系抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブチル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトセシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、ラパマイシン(シロリムス)、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタクセル、パミドロナート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、トランスプラチナ(transplatinum)、抗血管内皮成長因子化合物(「抗VEGF」)、抗上皮細胞成長因子受容体化合物(「抗EGFR」)、5-フルオロウラシルおよび誘導体、放射性核種、ポリペプチド毒素、アポトーシス誘導物質、治療増感物質、酵素またはその活性断片、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される治療物質である、本発明1031〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
治療的有効量の本発明1001〜1033のいずれかのアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1035]
それを必要とする対象に本発明1034の組成物を投与する工程を含む、疾患または障害を治療するかまたは寛解させる方法。
[本発明1036]
対象に治療的有効量の前記組成物を投与する工程が以下をもたらす、本発明1035の方法:
(a)活性物質単独の送達と比較した、疾患部位への活性物質の送達の増大;または(b)微小胞クリアランスの増大による、アプタマーの標的となる微小胞の血中濃度の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下;または(c)該アプタマーの標的となる微小胞の生物活性の、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下。
[本発明1037]
微小胞の生物活性が、免疫抑制または遺伝情報の伝達を含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
疾患または障害が、新生物性の、増殖性の、または炎症性の疾患または障害を含む、本発明1035〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
治療的有効量の本発明1026のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1040]
前記本発明のいずれかのアプタマーまたはその薬学的組成物を含む、キット。
[本発明1041]
本発明1001〜1033のいずれかのアプタマーを生物学的試料と接触させる工程および該生物学的試料中の微小胞に対する該アプタマーの結合の有無を検出する工程を含む、方法。
[本発明1042]
生物学的試料が血液または血液成分を含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
アプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、本発明1041の方法。
[本発明1044]
基体がビーズを含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
アプタマーが、検出可能な標識に結合している、本発明1041の方法。
[本発明1046]
微小胞集団を含有することが疑われる生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する方法であって、該生物学的試料を、微小胞集団に特異的な1種または複数種の結合物質および本発明1001〜1033のいずれかの1種または複数種のアプタマーと接触させる工程、ならびに、該1種または複数種の結合物質および該1種または複数種のアプタマーの両方によって認識された微小胞を検出する工程であって、それによって該生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する、工程を含む、方法。
[本発明1047]
生物学的試料が、組織試料、細胞培養物、または体液を含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
体液が、血液、血清、または血漿を含む、本発明1047の方法。
[本発明1050]
1種または複数種の結合物質が、表3、表4、およびそれらの組み合わせから選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、本発明1046の方法。
[本発明1051]
1種または複数種の結合物質が、表26中の標的から選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、本発明1046の方法。
[本発明1052]
1種または複数種の結合物質が、EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP、KLK2、SSX2、SSX4、PBP、SPDEF、EGFR、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、本発明1046の方法。
[本発明1053]
1種または複数種の結合物質が、EGFR、PBP、EpCAM、KLK2、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、本発明1046の方法。
[本発明1054]
1種または複数種の結合物質が、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、本発明1046の方法。
[本発明1055]
1種または複数種のアプタマーが、検出可能な標識に結合している、本発明1054の方法。
[本発明1056]
1種または複数種の結合物質が、検出可能な標識に結合している、本発明1046の方法。
[本発明1057]
1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、本発明1056の方法。
[本発明1058]
1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、本発明1046の方法。
[本発明1059]
1種または複数種のアプタマーが、検出可能な標識に結合している、本発明1046の方法。
[本発明1060]
生物学的試料中の微小胞集団の存在またはレベルを検出する工程が、疾患の診断、予後判定、またはセラノーシス(theranosis)を提供する、本発明1046〜1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
疾患が癌を含む、本発明1060の方法。
[本発明1062]
癌が、急性リンパ芽球性白血病;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;AIDS関連癌;AIDS関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;膀胱癌;脳幹神経膠腫;脳腫瘍(脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む);乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;原発不明癌;カルチノイド腫瘍;原発不明癌腫;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;子宮頸癌;小児癌;脊索腫;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;内分泌膵島細胞腫瘍;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;鼻腔神経芽細胞腫;ユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝臓外胆管癌;胆嚢癌;胃癌;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質細胞腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;毛様細胞性白血病;頭頸部癌;心臓癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;眼内黒色腫;膵島腫瘍;カポジ肉腫;腎臓癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇癌;肝臓癌;肺癌;悪性線維性組織球腫;骨癌;髄芽腫;髄上皮種;黒色腫;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄増殖性腫瘍;鼻腔癌;鼻咽頭癌;神経芽細胞腫;非ホジキンリンパ腫;非黒色腫皮膚癌;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔癌;口腔咽頭癌;骨肉腫;その他の脳および脊髄の腫瘍;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;乳頭腫症;副鼻腔癌;副甲状腺癌;骨盤癌;陰茎癌;咽頭癌;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫;下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫;原発性肝細胞肝癌;前立腺癌;直腸癌;腎臓癌;腎細胞(腎臓)癌;腎細胞癌;気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺癌;セザリー症候群;小細胞肺癌;小腸癌;軟部組織肉腫;扁平上皮癌;頸部扁平上皮癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫;精巣癌;咽喉癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺癌;移行上皮癌;腎盂尿管移行上皮癌;絨毛性腫瘍;尿管癌;尿道癌;子宮癌;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍を含む、本発明1061の方法。
[本発明1063]
癌が前立腺癌を含む、本発明1061の方法。
[本発明1064]
癌が乳癌を含む、本発明1061の方法。
[本発明1065]
(a)生物学的試験試料を、本発明1001〜1033のいずれかの1種または複数種のアプタマーと接触させる工程;
(b)工程(a)で形成された、該生物学的試験試料における1種または複数種のアプタマーと該1種または複数種のアプタマーに結合された標的との間の複合体の存在またはレベルを検出する工程;および
(c)工程(b)で検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料に由来する参照レベルと比較する工程であって、それによって疾患または障害を特徴決定する、工程
を含む、疾患または障害を特徴決定する方法。
[本発明1066]
生物学的試験試料および生物学的対照試料がそれぞれ、組織試料、細胞培養物、または生物学的流体を含む、本発明1065の方法。
[本発明1067]
生物学的流体が体液を含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、本発明1067の方法。
[本発明1069]
体液が、血液、血清、または血漿を含む、本発明1067の方法。
[本発明1070]
生物学的流体が微小胞を含む、本発明1066の方法。
[本発明1071]
1種または複数種のアプタマーがポリペプチドまたはその断片に結合する、本発明1065の方法。
[本発明1072]
ポリペプチドまたはその断片が可溶性であるか膜結合性である、本発明1065の方法。
[本発明1073]
ポリペプチドまたはその断片が表3または表4のバイオマーカーを含む、本発明1065の方法。
[本発明1074]
1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合する、本発明1065または1070の方法。
[本発明1075]
特徴決定が、疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを含む、本発明1065〜1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
疾患または障害が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、および/または疼痛を含む、本発明1075の方法。
[本発明1077]
疾患または障害が癌を含む、本発明1075の方法。
[本発明1078]
癌が、急性リンパ芽球性白血病;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;AIDS関連癌;AIDS関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;膀胱癌;脳幹神経膠腫;脳腫瘍(脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む);乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;原発不明癌;カルチノイド腫瘍;原発不明癌腫;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;子宮頸癌;小児癌;脊索腫;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;内分泌膵島細胞腫瘍;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;鼻腔神経芽細胞腫;ユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝臓外胆管癌;胆嚢癌;胃癌;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質細胞腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;毛様細胞性白血病;頭頸部癌;心臓癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;眼内黒色腫;膵島腫瘍;カポジ肉腫;腎臓癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇癌;肝臓癌;肺癌;悪性線維性組織球腫;骨癌;髄芽腫;髄上皮種;黒色腫;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄増殖性腫瘍;鼻腔癌;鼻咽頭癌;神経芽細胞腫;非ホジキンリンパ腫;非黒色腫皮膚癌;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔癌;口腔咽頭癌;骨肉腫;その他の脳および脊髄の腫瘍;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;乳頭腫症;副鼻腔癌;副甲状腺癌;骨盤癌;陰茎癌;咽頭癌;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫;下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫;原発性肝細胞肝癌;前立腺癌;直腸癌;腎臓癌;腎細胞(腎臓)癌;腎細胞癌;気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺癌;セザリー症候群;小細胞肺癌;小腸癌;軟部組織肉腫;扁平上皮癌;頸部扁平上皮癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫;精巣癌;咽喉癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺癌;移行上皮癌;腎盂尿管移行上皮癌;絨毛性腫瘍;尿管癌;尿道癌;子宮癌;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍を含む、本発明1077の方法。
[本発明1079]
癌が前立腺癌を含む、本発明1077の方法。
[本発明1080]
癌が乳癌を含む、本発明1077の方法。
[本発明1081]
本発明1041〜1080のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1082]
本発明1041〜1080のいずれかの方法を実施するための試薬の使用。
[本発明1083]
試薬が本発明1001〜1033のいずれかのアプタマーを含む、本発明1081のキットまたは本発明1082の使用。
[本発明1084]
生物学的試料中に存在する複数の標的に結合することが可能な、SEQ ID NO: 1〜230810、230811〜230899、230900〜230927、または231018〜241535から選択される複数種のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1085]
SEQ ID NO: 1〜230810、230811〜230899、230900〜230927、または231018〜241535から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1086]
SEQ ID NO: 231018〜241535に列挙されるオリゴヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000個、または全てを含む、本発明1084または1085の組成物。
[本発明1087]
SEQ ID NO: 1〜230810に列挙されるオリゴヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000個、または全てを含む、本発明1084または1085の組成物。
[本発明1088]
生物学的試料中に存在する複数の標的に結合することが可能な、表23〜24のいずれかに記載される1種または複数種のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1089]
表23〜24のいずれかに列挙される1種または複数種のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1090]
表23または表24に列挙される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20種のオリゴヌクレオチドを含む、本発明1088または1089の組成物。
[本発明1091]
微小胞試料を、該微小胞試料中に存在する1種または複数種の標的に結合することが可能な複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、該試料の状態を特徴決定することが事前に確認されている、該試料との複合体を形成するオリゴヌクレオチドセットを特定する工程であって、それによって試料の状態を特徴決定する、工程を含む、試験試料の状態を特徴決定するための方法。
[本発明1092]
(a)微小胞試料を複数種のオリゴヌクレオチドと接触させ、該微小胞試料との複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを単離する工程、
(b)工程(a)で微小胞試料との複合体を形成したオリゴヌクレオチドそれぞれの配列および/またはコピー数を決定する工程であって、それによって試験試料に結合したオリゴヌクレオチドのセットを特定する、工程
を含む、試験試料に結合したオリゴヌクレオチドのセットを特定するための方法。
[本発明1093]
微小胞試料を、非癌試料に由来する微小胞と比較して癌試料に由来する微小胞との複合体を優先的に形成することが事前に確認されている複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、癌性であるとしてまたは癌性になりやすいとして試料を診断する方法。
[本発明1094]
特定する工程が、全てもしくは一部のオリゴヌクレオチドの配列決定、全てもしくは一部のオリゴヌクレオチドの増幅、および/またはアレイに対する全てもしくは一部のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実施することを含む、本発明1091の方法。
[本発明1095]
一段階または複数段階のポジティブ選択またはネガティブ選択を通して複数種のオリゴヌクレオチドが事前に選択され、ポジティブ選択が、試験試料と比較して実質的に類似した特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含み、ネガティブ選択が、試験試料と比較して実質的に異なる特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含む、本発明1092または1093の方法。
[本発明1096]
工程(b)が、ハイスループット配列決定、増幅、またはアレイに対するハイブリダイゼーションを実施することを含む、本発明1092の方法。
[本発明1097]
試料が、癌を有することまたは有しやすいことが疑われる対象に由来する、本発明1092の方法。
[本発明1098]
(a)生物学的試験試料を複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程;
(b)工程(a)で形成された、複数種のオリゴヌクレオチドのメンバーそれぞれと生物学的試験試料との間の複合体の存在またはレベルを検出する工程;および
(c)工程(b)で検出された存在またはレベルを参照レベルと比較する工程であって、それによって疾患または障害を特徴決定する、工程
を含む、疾患または障害を特徴決定する方法。
[本発明1099]
生物学的試験試料および生物学的対照試料がそれぞれ、組織試料、細胞培養物、または生物学的流体を含む、本発明1098の方法。
[本発明1100]
生物学的流体が体液を含む、本発明1099の方法。
[本発明1101]
体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
体液が、血液、血清、または血漿を含む、本発明1100の方法。
[本発明1103]
生物学的流体が微小胞を含む、本発明1099の方法。
[本発明1104]
生物学的試験試料を、微小胞の単離前に複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる、本発明1103の方法。
[本発明1105]
生物学的試験試料が、単離された微小胞を含む、本発明1103の方法。
[本発明1106]
1種または複数種のアプタマーがポリペプチドまたはその断片に結合する、本発明1098の方法。
[本発明1107]
ポリペプチドまたはその断片が可溶性であるか膜結合性である、本発明1098の方法。
[本発明1108]
ポリペプチドまたはその断片が表3または表4のバイオマーカーを含む、本発明1098の方法。
[本発明1109]
1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合する、本発明1098または1108の方法。
[本発明1110]
特徴決定が、疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを含む、本発明1098〜1109のいずれかの方法。
[本発明1111]
疾患または障害が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛を含む、本発明1110の方法。
[本発明1112]
状態が疾患または障害である、本発明1091の方法。
[本発明1113]
状態が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、および/または疼痛を含む、本発明1091の方法。
[本発明1114]
複数種のオリゴヌクレオチドが、正常細胞から流出した微小胞よりも、罹患細胞から流出した微小胞に優先的に結合することが可能である、本発明1092の方法。
[本発明1115]
罹患細胞が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛に関連する、本発明1114の方法。
[本発明1116]
癌が、急性リンパ芽球性白血病;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;AIDS関連癌;AIDS関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;膀胱癌;脳幹神経膠腫;脳腫瘍(脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む);乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;原発不明癌;カルチノイド腫瘍;原発不明癌腫;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;子宮頸癌;小児癌;脊索腫;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;内分泌膵島細胞腫瘍;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;鼻腔神経芽細胞腫;ユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝臓外胆管癌;胆嚢癌;胃癌;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質細胞腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;毛様細胞性白血病;頭頸部癌;心臓癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;眼内黒色腫;膵島腫瘍;カポジ肉腫;腎臓癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇癌;肝臓癌;肺癌;悪性線維性組織球腫;骨癌;髄芽腫;髄上皮種;黒色腫;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄増殖性腫瘍;鼻腔癌;鼻咽頭癌;神経芽細胞腫;非ホジキンリンパ腫;非黒色腫皮膚癌;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔癌;口腔咽頭癌;骨肉腫;その他の脳および脊髄の腫瘍;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;乳頭腫症;副鼻腔癌;副甲状腺癌;骨盤癌;陰茎癌;咽頭癌;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫;下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫;原発性肝細胞肝癌;前立腺癌;直腸癌;腎臓癌;腎細胞(腎臓)癌;腎細胞癌;気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺癌;セザリー症候群;小細胞肺癌;小腸癌;軟部組織肉腫;扁平上皮癌;頸部扁平上皮癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫;精巣癌;咽喉癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺癌;移行上皮癌;腎盂尿管移行上皮癌;絨毛性腫瘍;尿管癌;尿道癌;子宮癌;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍を含む、本発明1097、1111、1113、または1115の方法。
[本発明1117]
前癌状態がバレット食道を含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1118]
自己免疫疾患が、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス(SLE)、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、強直性脊椎炎 シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1119]
心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞、または血栓性事象を含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1120]
神経疾患が、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病(HD)、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス(NPSLE)、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイスラー-シャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害(例えば脳卒中)、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群を含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1121]
疼痛が、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1122]
感染症が、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1123]
複数種のオリゴヌクレオチドが本発明1084〜1090のいずれかの組成物を含む、本発明1091〜1122のいずれかの方法。
[本発明1124]
(a)微小胞試料を用いて、複数種のオリゴヌクレオチドの少なくとも1回の(i)ネガティブ選択または(ii)1回のポジティブ選択を実施する工程;
(b)複数種のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを提供するために、オリゴヌクレオチドのセットを取得する工程であって、複数種のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合せず、かつ複数種のオリゴヌクレオチドのポジティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合する、工程;
(c)ネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを試験試料と接触させる工程;
(d)複数種の溶離オリゴヌクレオチドを提供するために、該試験試料に結合したオリゴヌクレオチドを溶離する工程;および
(e)該複数種の溶離オリゴヌクレオチドのメンバーの配列および/またはコピー数を特定するために、該複数種の溶離オリゴヌクレオチドのハイスループット配列決定を実施する工程
を含む、ハイスループット配列決定を実施する方法。
[本発明1125]
(a)標的試料との複合体を形成することが事前に確認されているオリゴヌクレオチドのセットを提供するために、試料用の複数種のオリゴヌクレオチドを富化する工程;
(b)オリゴヌクレオチドと試験試料との複合体を形成させるために、工程(a)の複数種を試験試料と接触させる工程;
(c)オリゴヌクレオチドの回収されたサブセットを提供するために、工程(b)で複合体を形成したオリゴヌクレオチドを回収する工程;および
(d)ハイスループット配列決定、増幅、またはハイブリダイゼーションによって、該オリゴヌクレオチドの回収されたサブセットのプロファイリングを行う工程であって、それによって試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを特定する、工程
を含む、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを特定するための方法。
[本発明1126]
試験試料が複数種の微小胞を含む、本発明1125の方法。
[本発明1127]
オリゴヌクレオチドが、RNA、DNA、または両方を含む、本発明1125の方法。
[本発明1128]
少なくとも90%の配列同一性を含むオリゴヌクレオチドのサブセットを特定するためにインフォマティクス解析を実施する工程をさらに含む、本発明1125の方法。
[本発明1129]
本発明1091〜1128のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1130]
本発明1091〜1080のいずれかの方法を実施するための試薬の使用。
[本発明1131]
試薬が本発明1084〜1090のいずれかのアプタマーを含む、本発明1129のキットまたは本発明1130の使用。
[本発明1132]
生物学的試験試料をアプタマー分子のプールと接触させる工程、該プールを対照生物学的試料または参照生物学的試料に接触させる工程、該試験試料中の成分に結合するが対照試料にも参照試料にも結合しない1種または複数種のアプタマーを特定する工程であって、それによって生物学的試験試料についてのアプタマープロファイルを特定する、工程を含む、生物学的試料についての標的特異的アプタマープロファイルを特定する方法。
[本発明1133]
(a)生物学的対照試料をオリゴヌクレオチドのプールと接触させる工程;
(b)該生物学的対照試料に結合しない、該オリゴヌクレオチドのプールの第1のサブセットを単離する工程;
(c)生物学的試験試料を、該オリゴヌクレオチドのプールの第1のサブセットと接触させる工程;および
(d)該生物学的試験試料に結合する、該オリゴヌクレオチドのプールの第2のサブセットを単離する工程であって、それによってアプタマーのプールを選択する、工程
を含む、アプタマーのプールを選択する方法。
[本発明1134]
オリゴヌクレオチドのプールが少なくとも107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、または少なくとも1018種類のオリゴヌクレオチドを含む、本発明1133の方法。
[本発明1135]
工程(a)〜(d)が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回、または少なくとも20回繰り返され、各反復において、工程(d)で選択されたアプタマーのプールが工程(a)でのオリゴヌクレオチドのプールとして使用される、本発明1133の方法。
[本発明1136]
生物学的試験試料および生物学的対照試料が微小胞を含む、本発明1133の方法。
[本発明1137]
生物学的試験試料および任意で生物学的対照試料が体液を含む、本発明1133の方法。
[本発明1138]
体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性体液(malignant fluid)、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、または他の洗浄液を含む、本発明1137の方法。
[本発明1139]
生物学的試験試料および任意で生物学的対照試料が細胞培地を含む、本発明1133の方法。
[本発明1140]
生物学的試験試料が罹患試料を含み、かつ生物学的対照試料が非罹患試料を含む、本発明1133の方法。
[本発明1141]
(a)アプタマーのプールを第1の試料由来の微小胞の集団に接触させる工程;
(b)第1の試料由来の微小胞の集団に対する親和性を示すアプタマーのサブプールを富化する工程;
(c)該サブプールを第2の試料由来の微小胞の第2の集団に接触させる工程;および
(d)第2の試料由来の微小胞の第2の集団に対する親和性を示すアプタマーの第2のサブプールを枯渇させる工程であって、それによって第1の試料由来の微小胞の集団に対する優先的親和性を有するアプタマーの群を選択する、工程
を含む、アプタマーの群を選択する方法。
[本発明1142]
第1の試料および/または第2の試料が生物学的流体を含み、任意で、該生物学的流体が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性体液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、または他の洗浄液を含む、本発明1141の方法。
[本発明1143]
第1の試料および/または第2の試料それぞれが、プールされた試料を含む、本発明1141の方法。
[本発明1144]
工程(a)〜(d)が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回繰り返され、各反復において、工程(d)で選択されたアプタマーの群が工程(a)でのアプタマーのプールとして使用される、本発明1141の方法。
[本発明1145]
第1の試料および/または第2の試料が、工程(a)〜(d)の繰り返しの前に別の試料と置き換えられる、本発明1141の方法。
[本発明1146]
選択されたアプタマーの群のメンバーを特定する工程をさらに含み、任意で、該特定する工程がハイスループット配列決定によって実施される、本発明1141の方法。
[本発明1147]
第1の試料が罹患試料を含み、かつ第2の試料が対照試料を含み、任意で、該対照試料が非罹患試料である、本発明1141の方法。
[本発明1148]
(a)アプタマー候補のプールを、標的分子を含む試料に接触させる工程;
(b)結合していないアプタマー候補を取り除く工程;
(c)該試料を、該標的分子に対するリガンドと接触させる工程;および
(d)該リガンドとの競合によって該標的分子から分離したアプタマー候補を単離する工程であって、それによって該リガンドと同じ標的に結合するアプタマーの群を選択する、工程
を含む、アプタマーの群を選択する方法。
[本発明1149]
標的分子がタンパク質を含む、本発明1148の方法。
[本発明1150]
タンパク質が微小胞表面抗原である、本発明1149の方法。
[本発明1151]
標的分子が基体につながれている、本発明1148の方法。
[本発明1152]
標的分子が微小胞の表面抗原であり、かつ該微小胞が基体につながれている、本発明1148の方法。
[本発明1153]
リガンドが小分子またはタンパク質を含む、本発明1148の方法。
[本発明1154]
リガンドが抗体を含む、本発明1153の方法。
[本発明1155]
工程(a)〜(d)が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回繰り返され、各反復において、工程(d)で単離されたアプタマー候補が工程(a)に投入されるアプタマー候補のプールとして使用される、本発明1148の方法。
[本発明1156]
選択されたアプタマーの群のメンバーを特定する工程をさらに含み、任意で、該特定する工程がハイスループット配列決定によって実施される、本発明1148の方法。
[本発明1157]
第1の試料が罹患試料を含み、かつ第2の試料が対照試料を含み、任意で、該対照試料が非罹患試料である、本発明1148の方法。
[本発明1158]
関心対象の標的に結合する1種または複数種のアプタマーを選択する方法であって、
(a)標的枯渇生物学的試料を形成するために、標的を第1の生物学的試料から分離する工程;
(b)分離した標的を基体につなげる工程;
(c)つながれた標的を、干渉生物学的試料と混合する工程;
(d)(c)からの混合物を出発アプタマーライブラリーと接触させる工程;および
(e)該つながれた標的に優先的に結合するアプタマーライブラリーのメンバーを回収する工程であって、それによって、該標的に結合する1種または複数種のアプタマーを選択する、工程
を含む、方法。
[本発明1159]
基体がビーズまたは平面を含む、本発明1158の方法。
[本発明1160]
干渉生物学的試料が、(a)からの標的枯渇生物学的試料を含む、本発明1158の方法。
[本発明1161]
標的が微小胞を含む、本発明1158の方法。
[本発明1162]
標的が関心対象の微小胞を含み、干渉生物学的試料が非標的微小胞を含む、本発明1158の方法。
[本発明1163]
工程(c)の前に、非標的微小胞が、標的微小胞と異なる基体につながれている、本発明1158の方法。
[本発明1164]
基体が磁気ビーズを含み、かつ異なる基体が非磁気ビーズを含むか、または基体が非磁気ビーズを含み、かつ異なる基体が磁気ビーズを含む、本発明1158の方法。
[本発明1165]
第1の生物学的試料および/または干渉生物学的試料が体液を含み、任意で、生物学的流体が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性体液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、または他の洗浄液を含む、本発明1158の方法。
[本発明1166]
第1の生物学的試料が罹患試料を含み、かつ干渉生物学的試料が非罹患試料を含む、本発明1158の方法。
[本発明1167]
第1の生物学的試料が非罹患試料を含み、かつ干渉生物学的試料が罹患試料を含む、本発明1158の方法。
[本発明1168]
(a)参照微小胞集団を、1種または複数種の微小胞表面マーカーに結合することが可能な複数種のリガンドと接触させる工程;
(b)該参照微小胞集団に対する親和性を有しない複数種のリガンドのサブセットを含む複数種の参照リガンドを単離する工程;
(c)1種または複数種の試験微小胞を、該複数種の参照リガンドと接触させる工程;および
(d)該複数種の参照リガンドから、該1種または複数種の試験微小胞上の表面マーカーとの複合体を形成するリガンドのサブセットを特定する工程であって、それによって該複数種の標的リガンドを特定する、工程
を含む、複数種の標的リガンドを特定するための方法。
[本発明1169]
標的微小胞の表面マーカーを特定する工程をさらに含む、本発明1168の方法。
[本発明1170]
複数種のリガンドがアプタマーおよび/または抗体を含む、本発明1168の方法。
[本発明1171]
(a)候補アプタマーのプールを、関心対象の標的を含まない1種または複数種のアッセイ成分と接触させる工程;
(b)(a)で1種または複数種のアッセイ成分に結合しない該候補アプタマーのプールのメンバーを回収する工程;
(c)1種または複数種の交絡する(confounding)標的の存在下で、工程(b)で回収された候補アプタマーのプールのメンバーを関心対象の標的と接触させる工程;および
(d)工程(c)で関心対象の標的に結合する候補アプタマーを回収する工程であって、それによって関心対象の標的に特異的なアプタマーを特定する、工程
を含む、関心対象の標的に特異的なアプタマーを特定する方法。
[本発明1172]
工程(c)が実施される前に、工程(a)〜(b)が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回、または少なくとも20回繰り返される、本発明1171の方法。
[本発明1173]
関心対象の標的に特異的なアプタマーを特定する工程の前に、工程(c)〜(d)が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回、または少なくとも20回繰り返される、本発明1171の方法。
[本発明1174]
候補アプタマーのプールが少なくとも106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、または少なくとも1018種の核酸配列を含む、本発明1171の方法。
[本発明1175]
1種または複数種のアッセイ成分が、基体、ビーズ、平面アレイ、カラム、チューブ、ウェル、またはフィルタの1つまたは複数を含む、本発明1171の方法。
[本発明1176]
関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的がタンパク質を含む、本発明1171の方法。
[本発明1177]
関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的が微小胞を含む、本発明1171の方法。
[本発明1178]
関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的が1種または複数種の微小胞表面抗原を含む、本発明1171の方法。
[本発明1179]
1種または複数種の微小胞表面抗原が、表3、4、および26から選択される、本発明1178の方法。
[本発明1180]
関心対象の標的が、SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEFからなる群より選択されたタンパク質であり、1種または複数種の交絡する標的が該群の他のメンバーを含む、本発明1171の方法。
[本発明1181]
1種または複数種の微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、本発明1178の方法。
[本発明1182]
疾患が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛を含む、本発明1140、1147、1157、1166、1167、または1178の方法。
[本発明1183]
癌が、急性リンパ芽球性白血病;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;AIDS関連癌;AIDS関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;膀胱癌;脳幹神経膠腫;脳腫瘍(脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む);乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;原発不明癌;カルチノイド腫瘍;原発不明癌腫;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;子宮頸癌;小児癌;脊索腫;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;内分泌膵島細胞腫瘍;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;鼻腔神経芽細胞腫;ユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝臓外胆管癌;胆嚢癌;胃癌;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質細胞腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;毛様細胞性白血病;頭頸部癌;心臓癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;眼内黒色腫;膵島腫瘍;カポジ肉腫;腎臓癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇癌;肝臓癌;肺癌;悪性線維性組織球腫;骨癌;髄芽腫;髄上皮種;黒色腫;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄増殖性腫瘍;鼻腔癌;鼻咽頭癌;神経芽細胞腫;非ホジキンリンパ腫;非黒色腫皮膚癌;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔癌;口腔咽頭癌;骨肉腫;その他の脳および脊髄の腫瘍;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;乳頭腫症;副鼻腔癌;副甲状腺癌;骨盤癌;陰茎癌;咽頭癌;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫;下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫;原発性肝細胞肝癌;前立腺癌;直腸癌;腎臓癌;腎細胞(腎臓)癌;腎細胞癌;気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺癌;セザリー症候群;小細胞肺癌;小腸癌;軟部組織肉腫;扁平上皮癌;頸部扁平上皮癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫;精巣癌;咽喉癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺癌;移行上皮癌;腎盂尿管移行上皮癌;絨毛性腫瘍;尿管癌;尿道癌;子宮癌;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍を含む、本発明1182の方法。
[本発明1184]
前癌状態がバレット食道を含む、本発明1182の方法。
[本発明1185]
自己免疫疾患が、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス(SLE)、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、強直性脊椎炎 シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む、本発明1182の方法。
[本発明1186]
心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞、または血栓性事象を含む、本発明1182の方法。
[本発明1187]
神経疾患が、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病(HD)、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス(NPSLE)、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイスラーシャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害(例えば脳卒中)、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群を含む、本発明1182の方法。
[本発明1188]
疼痛が、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む、本発明1182の方法。
[本発明1189]
感染症が、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む、本発明1182の方法。
[本発明1190]
複数種の細胞外微小胞を、ランダムに生成された結合物質のライブラリーと接触させる工程、細胞外微小胞の1種または複数種の成分に対する親和性を有する結合物質のライブラリーのサブセットを特定する工程を含む、結合物質を特定するための方法。
[本発明1191]
結合物質がアプタマーおよび/または抗体を含む、本発明1190の方法。
[本発明1192]
試験生物学的試料を、本発明1158に従属する本発明1158〜1189のいずれかの標的に結合する1種または複数種のアプタマーと接触させる工程を含む、表現型を特徴決定する方法。
[本発明1193]
表現型の特徴決定が、本発明1182〜1189のいずれかの疾患または障害を検出する工程を含む、本発明1192の方法。
[本発明1194]
選択されたアプタマーの1種または複数種の標的を特定する工程をさらに含む、本発明1132〜1191のいずれかの方法。
[本発明1195]
本発明1132〜1194のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1196]
本発明1132〜1194のいずれかの方法を実施するための試薬の使用。
[本発明1197]
(a)微小胞の表面抗原を含む標的を結合物質と結合させるために、結合物質を該標的と接触させる工程;
(b)標的と結合物質との結合を分断しない条件下で、微小胞を分断する工程;
(c)標的と結合物質との間の複合体を単離する工程;および
(d)結合物質に結合された標的を特定する工程
を含む、結合物質の標的を特定する方法。
[本発明1198]
結合物質が本発明1132〜1194のいずれかの方法によって特定されたアプタマーを含む、本発明1197の方法。
[本発明1199]
結合物質が本発明1190の方法によって特定される、本発明1197の方法。
[本発明1200]
結合物質が本発明1168〜1170のいずれかの方法によって特定されたリガンドを含む、本発明1197の方法。
[本発明1201]
標的が、タンパク質、核酸、脂質、または糖質を含む、本発明1197の方法。
[本発明1202]
工程(b)の前に標的が結合物質に架橋している、本発明1197の方法。
[本発明1203]
架橋が、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミダート、N-ヒドロキシスクシンイミド-エステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベラート(BS3)、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DDC)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDCまたはEDAC)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)およびスルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(Sulfo-SMCC)、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロプリオナート(Sulfo-SBED)、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチン-アミドカプロイル)-L-リシニル]エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-Biotin)、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノ-カプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リシニルアミド]}エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-LC-Biotin)、光反応性アミノ酸、L-Photo-Leucine、L-Photo-Methionine、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン、またはこれらの任意の組み合わせもしくは修飾を含む、本発明1202の方法。
[本発明1204]
工程(b)での微小胞の分断が、洗浄剤、界面活性剤、溶解剤、酵素、機械的せん断、ビーズミリング、ホモジネーション、マイクロ流体化、音波処理、フレンチプレス、衝突、コロイドミル、減圧、浸透圧性ショック、熱分解、凍結融解、および乾燥の1つまたは複数の使用を含む、本発明1197の方法。
[本発明1205]
酵素が、リゾチーム、リソスタフィン、ザイモラーゼ、セルラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、およびマンナーゼの1つまたは複数を含む、本発明1204の方法。
[本発明1206]
洗浄剤が、オクチルチオグルコシド(OTG)、オクチルβ-グルコシド(OG)、非イオン性洗浄剤、Triton X、Tween 20、脂肪アルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル(Brij)、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、ノノキシノール-9、グリセロールアルキルエステル、グリセリルラウラート、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリソルベート、ソルビタンアルキルエステル、コカミドMEA、コカミドDEA、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマー、ポロキサマー、ポリエトキシル化タローアミン(POEA)、両性イオン性洗浄剤、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート(CHAPS)、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩(LAS)、アルキルフェノールエトキシラート(APE)、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、ベタイン、コカミドプロピルベタイン、レシチン、イオン性洗浄剤、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、臭化セトリモニウム(CTAB)、塩化セチルトリメチルアンモニウム(CTAC)、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム(CPC)、塩化ベンザルコニウム(BAC)、塩化ベンゼトニウム (BZT)、5-ブロモ-5-ニトロ-1,3-ジオキサン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド(DODAB)、デオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール(TergitolタイプNP-40;NP-40)、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム(ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES))、ミレス硫酸ナトリウム、アルキルカルボン酸塩、ステアリン酸ナトリウム、ナトリウムラウロイルサルコシナート、カルボン酸塩をベースにしたフッ素系界面活性剤、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロオクタン酸(PFOAまたはPFO)、および生物系界面活性剤の1つまたは複数を含む、本発明1204の方法。
[本発明1207]
結合物質が基体につながれている、本発明1197の方法。
[本発明1208]
基体がミクロスフェアを含む、本発明1207の方法。
[本発明1209]
基体が平面の基体を含む、本発明1207の方法。
[本発明1210]
結合物質が標識されている、本発明1197の方法。
[本発明1211]
標的と結合物質との間の複合体を単離する工程が、該標識を介して結合物質を捕捉することを含む、本発明1210の方法。
[本発明1212]
標識がビオチン標識を含む、本発明1210の方法。
[本発明1213]
標的がタンパク質を含み、かつ該標的を特定する工程が、質量分析(MS)、ペプチドマスフィンガープリンティング(PMF;タンパク質フィンガープリンティング)、配列決定、N末端アミノ酸解析、C末端アミノ酸解析、エドマン分解、クロマトグラフィー、電気泳動、二次元ゲル電気泳動(2Dゲル)、抗体アレイ、およびイムノアッセイの使用を含む、本発明1197の方法。
[本発明1214]
本発明1197〜1213のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1215]
1種または複数種の試薬が、本発明1132〜1194のいずれかの方法によって特定されたアプタマーを含む、本発明1214のキット。
[本発明1216]
SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列に対して少なくとも50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%相同である配列を含む、核酸。
[本発明1217]
SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列を含む、核酸。
[本発明1218]
SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列に対して少なくとも50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%相同である配列を含む、単離された核酸。
[本発明1219]
SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列を含む、単離された核酸。
[本発明1220]
少なくとも1つの化学修飾を含むようにさらに改変されている、本発明1216〜1219のいずれかの核酸。
[本発明1221]
前記修飾が、核酸の、糖位置での化学的置換;リン酸位置での化学的置換;および塩基位置での化学的置換からなる群より選択される、本発明1220の核酸。
[本発明1222]
前記修飾が、修飾されたヌクレオチドの取込み、3'のキャッピング、ビオチン化、アミンリンカーへの結合、高分子量の非免疫原性化合物への結合、親油性化合物への結合からなる群より選択される、本発明1220の核酸。
[本発明1223]
非免疫原性の高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、本発明1222の核酸。
[本発明1224]
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、本発明1223の核酸。
[本発明1225]
本発明1216〜1224のいずれかの核酸を含む組成物。
[本発明1226]
本発明1216〜1225のいずれかの核酸または組成物を含む、キット。
[本発明1227]
基体に結合した非標的結合核酸を含む陰性対照組成物。
[本発明1228]
非標的結合核酸が基体に共有結合している、本発明1227の陰性対照組成物。
[本発明1229]
非標的結合核酸が基体に非共有結合的に結合している、本発明1227の陰性対照組成物。
[本発明1230]
非標的結合核酸が、本発明1216〜1224のいずれかから選択される核酸を含む、本発明1227の陰性対照組成物。
[本発明1231]
非標的結合核酸が、スクランブルされたSEQ ID NO: 1〜241535のいずれかの配列またはこれらの機能的断片を含む、本発明1227の陰性対照組成物。
[本発明1232]
生物学的実体を含むことが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、
(a)基体および本発明1227〜1230のいずれかの陰性対照組成物を含む組成物を提供する工程であって、該基体が、生物学的実体に対する1種または複数種の結合物質を含む、工程;
(b)生物学的試料を、工程(a)で提供された組成物と接触させる工程;
(c)工程(b)において1種または複数種の結合物質によって認識された生物学的実体の量に対応する標的シグナルを検出する工程;ならびに
(d)工程(c)で検出された標的シグナルを、陰性対照組成物によって生じたシグナルの量に対応する対照シグナルに対して正規化する工程であって、それによって該生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する、工程
を含む、方法。
[本発明1233]
標的シグナルの正規化が、標的シグナルから対照シグナルを差し引くことを含む、本発明1232の方法。
[本発明1234]
1種または複数種の結合物質が抗体またはアプタマーを含む、本発明1232の方法。
[本発明1235]
生物学的実体がタンパク質を含む、本発明1232の方法。
[本発明1236]
生物学的実体が微小胞を含む、本発明1232の方法。
[本発明1237]
1種または複数種の結合物質が微小胞表面抗原に特異的である、本発明1236の方法。
[本発明1238]
微小胞表面抗原が、表3〜4、または26から選択される、本発明1237の方法。
[本発明1239]
微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、本発明1237の方法。
[本発明1240]
疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供する、本発明1239の方法。
[本発明1241]
本発明1232〜1240のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1242]
1種または複数種の試薬が、1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、本発明1241のキット。
[本発明1243]
非標的結合核酸を含む、ブロッキング組成物。
[本発明1244]
非標的結合核酸が本発明1216〜1224のいずれかから選択される核酸を含む、本発明1243のブロッキング組成物。
[本発明1245]
ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、pepticase、非イオン性界面活性剤、Tween(登録商標)20、Triton(登録商標)X-100、非反応性抗体またはその断片、FSG(魚皮ゼラチン)、純粋なゼラチン、ゼラチンヒドロラーゼ、ポリエチレングリコール(PEG)、非反応性血清、および非反応性タンパク質からなる群より選択される1種または複数種の成分をさらに含む、本発明1243のブロッキング組成物。
[本発明1246]
生物学的実体を含むことが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、
(a)基体を、本発明1243〜1245のいずれかのブロッキング組成物と接触させる工程であって、該基体が、生物学的実体に対する1種または複数種の結合物質を含む、工程;
(b)生物学的試料を、工程(a)で提供されたブロッキングされた基体と接触させる工程;および
(c)工程(b)で生物学的実体が1種または複数種の結合物質によって認識されたかどうか検出する工程であって、それによって該生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する、工程
を含む、方法。
[本発明1247]
1種または複数種の結合物質が抗体またはアプタマーを含む、本発明1246の方法。
[本発明1248]
生物学的実体がタンパク質を含む、本発明1246の方法。
[本発明1249]
生物学的実体が微小胞を含む、本発明1246の方法。
[本発明1250]
1種または複数種の結合物質が微小胞表面抗原に特異的である、本発明1249の方法。
[本発明1251]
微小胞表面抗原が、表3、4、または26から選択される、本発明1250の方法。
[本発明1252]
微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、本発明1250の方法。
[本発明1253]
疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供する、本発明1252の方法。
[本発明1254]
本発明1246〜1253のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1255]
1種または複数種の試薬が、1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、本発明1254のキット。
[本発明1256]
官能基に特異的に結合するアプタマー。
[本発明1257]
官能基が、炭化水素、ハロゲン、酸素を含む基(すなわちC-O結合)、窒素を含む基、硫黄を含む基、リンを含む基、またはホウ素を含む基からなる群より選択される、本発明1256のアプタマー。
[本発明1258]
炭化水素が、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、トルエン誘導体、分枝または環状アルカン、カルボカチオン、およびカルボアニオンからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1259]
ハロゲンが、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、およびヨードアルカンからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1260]
酸素を含む基が、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カルボナート、カルボキシラート、カルボン酸、エステル、ヒドロペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、およびオルトカルボナートからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1261]
窒素を含む基が、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアナート、ニトラート、ニトリル、ニトライト、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、およびピリジン誘導体からなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1262]
硫黄を含む基が、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、硫酸、スルホン酸、チオシアナート、イソチアナート、チオン、およびチアールからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1263]
リンを含む基が、ホスフィン、ホスファン、ホスホン酸、ホスファート、およびホスホジエステルからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1264]
ホウ素を含む基が、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸、およびボリン酸エステルからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1265]
官能基が、アセタール、アシル基、ハロゲン化アシル、アルケニル基、アルコキシド、アルコキシ基、アルキニル基、アミド、アミンオキシド、アミン、カルボジイミド、カルボキシミダート、カルボン酸、シアナミド、シアナート、ジチオカルバマート、エノール、エステル、エーテル、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、イミド、イソシアナート、イソシアニド、イソチオシアナート、ケタール、ケテン、ケトン、脱離基、ニトリル、有機ハロゲン化物、有機リン、オルトエステル、オキシム、ホスホノフルオリダート、ホスホノチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロフルオリダート、ホスホロチオアート、保護基、ピロホスファート、セミカルバジド、セミカルバゾン、スルファマート、スルホン酸エステル、スルホン、スルホン酸、スルホニル基、スルホキシイミン、スルフリル化合物、チオアミド、チオシアナート、チオエステル、チオラート、チオン、チオホスホリル化合物、およびチオスルフィナートからなる群より選択される、本発明1256のアプタマー。
[本発明1266]
官能基が、アセタール、アセトキシ基、アセチリド、酸無水物、活性化基、塩化アシル、ハロゲン化アシル、アシラール、アシロイン、アシルシラン、アルコール、アルデヒド、アルジミン、アルカン、アルケン、アルコキシド、アルキルシクロアルカン、亜硝酸アルキル、アルキン、アレン、アミド、アミジン、アミナール、アミンオキシド、アジド、アジン、アジリジン、アゾキシ、二官能性、ビスチオセミカルバゾン、ビウレット、ボロン酸、カルバマート、カルバミノ、カルバジド、カルベン、カルビノール、炭酸エステル、カルボニル、カルボキサミド、カルボキシミダート、カルボン酸、クロロホルマート、クムレン、シアン酸エステル、シアニミド、シアノヒドリン、不活性化基、デプシド、ジアゾ、ジオール、ジチオカルバマート、エナミン、エンジイン、エノール、エノールエーテル、エノン、エニン、エピスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、フルオロスルホナート、ハロヒドリン、ハロケトン、ヘミアセタール、ヘミアミナール、ヘミチオアセタール、ヒドラジド、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、イミン、イミニウム、イソチオウロニウム、ケテン、ケテンイミン、ケトン、ケチル、ラクタム、ラクトール、ラクトン、メチン、メチル基、ニトラート、ニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトロ化合物、ニトロアミン、ニトロナート、ニトロン、ニトロニウムイオン、ニトロソアミン、ニトロソ、オルトエステル、オサゾン、オキサジリジン、オキシム、n-オキソアンモニウム塩、ペルオキシド、ペルオキシ酸、パーシステントカルベン、フェノール、ホスファアルケン、ホスファアルキン、ホスファート、ホスフィナート、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスフィニト、ホスホナート、ホスホニト、ホスホニウム、ホスホラン、s-ニトロソチオール、シッフ塩基、セレノール、セレノン酸、セロン、セミカルバジド、セミカルバゾン、シリルエノールエーテル、シリルエーテル、スルフェンアミド、スルフェン酸、塩化スルフェニル、スルフィド、スルフィルイミン、スルフィンアミド、スルフィン酸、亜硫酸エステル、スルホンアミド、スルホンアニリド、スルホナート、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、スルホキシド、スルフリル、スルトン、テルロール、チアール、チオアセタール、チオアミド、チオカルバマート、チオカルボキシ、チオシアナート、チオエステル、チオエーテル、チオケタール、チオケトン、チオール、チオラクトン、チオ尿素、トシルヒドラゾン、トリアゼン、トリオール、尿素、バニリル、キサンタート、イリド、およびイノラートからなる群より選択される、本発明1256のアプタマー。
[本発明1267]
官能基が、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、および/またはクロロメチル基を含む、本発明1256のアプタマー。
[本発明1268]
官能基がカルボキシル基を含む、本発明1256のアプタマー。
[本発明1269]
本発明1216〜1224のいずれかから選択される核酸を含む、本発明1256〜1267のアプタマー。
[本発明1270]
本発明1256〜1269のいずれかのアプタマーおよび基体を含む、組成物。
[本発明1271]
基体が平面の基体を含む、本発明1270の組成物。
[本発明1272]
基体がミクロスフェアを含む、本発明1270の組成物。
[本発明1273]
基体が、カルボキシル修飾、アミノ修飾、ヒドロキシル修飾、ヒドラジド修飾、クロロメチル修飾、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の修飾を含む、本発明1270の組成物。
[本発明1274]
基体がカルボキシル基を含む、本発明1270の組成物。
[本発明1275]
アプタマーがカルボキシル基に結合している、本発明1273の組成物。
[本発明1276]
基体が結合物質を含む、本発明1270の組成物。
[本発明1277]
結合物質が抗体またはアプタマーを含む、本発明1276の組成物。
[本発明1278]
微小胞をさらに含む、本発明1270の組成物。
[本発明1279]
本発明1256〜1278のいずれかのアプタマーまたは組成物を含む、キット。
[本発明1280]
本発明1256〜1269のいずれかのアプタマーを基体と接触させる工程を含む、方法。
[本発明1281]
基体が平面の基体である、本発明1280の方法。
[本発明1282]
基体がミクロスフェアである、本発明1280の方法。
[本発明1283]
基体が、カルボキシル修飾、アミノ修飾、ヒドロキシル修飾、ヒドラジド修飾、クロロメチル修飾、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の修飾を含む、本発明1280の方法。
[本発明1284]
基体がカルボキシル基を含む、本発明1280の方法。
[本発明1285]
アプタマーがカルボキシル基に結合している、本発明1283の方法。
[本発明1286]
基体が結合物質を含む、本発明1280の方法。
[本発明1287]
結合物質が抗体またはアプタマーを含む、本発明1286の方法。
[本発明1288]
基体を結合物質の標的と接触させる工程をさらに含む、本発明1286の方法。
[本発明1289]
本発明1280〜1288のいずれかの方法を実施するための試薬を含み、任意で、1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、キット。
[本発明1290]
生物学的実体を含むことが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、
(a)カルボキシル化された基体に付着した生物学的実体に特異的な1種または複数種の結合物質を含む組成物を提供する工程であって、該カルボキシル化された基体が、本発明1256〜1269のいずれかのアプタマーと結合している、工程;
(b)生物学的試料を、工程(a)で提供された組成物と接触させる工程;および
(c)工程(b)で生物学的実体が1種または複数種の結合物質によって認識されたかどうかを検出する工程であって、それによって該生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する、工程
を含む、方法。
[本発明1291]
1種または複数種の結合物質が抗体またはアプタマーを含む、本発明1290の方法。
[本発明1292]
生物学的実体がタンパク質を含む、本発明1290の方法。
[本発明1293]
生物学的実体が微小胞を含む、本発明1290の方法。
[本発明1294]
1種または複数種の結合物質が微小胞表面抗原に特異的である、本発明1290の方法。
[本発明1295]
微小胞表面抗原が、表3、4、または26から選択される、本発明1294の方法。
[本発明1296]
微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、本発明1294の方法。
[本発明1297]
疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供する、本発明1295の方法。
[本発明1298]
本発明1290〜1297のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキットであって、任意で、1種または複数種の該試薬が1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、キット。
[本発明1299]
(a)基体を、カルボキシル基に結合することが可能なアプタマーと接触させる工程であって、該基体が、1種または複数種の選択された核酸またはポリペプチド分子も含む、工程;および(b)基体を、該核酸またはポリペプチド分子に結合することが可能な結合物質と接触させる工程であって、それによって、カルボキシル基に結合したアプタマーが、該核酸またはポリペプチド分子に対する結合物質の結合を増強する、工程
を含む、結合を増強するための方法。
[本発明1300]
アプタマーが、本発明1256〜1269のいずれかのアプタマーである、本発明1299の方法。
[本発明1301]
基体が平面の基体である、本発明1299の方法。
[本発明1302]
基体がミクロスフェアである、本発明1299の方法。
[本発明1303]
核酸またはポリペプチドが、アミド結合を介してカルボキシル基に共有結合している、本発明1299の方法。
[本発明1304]
基体が結合物質を含む、本発明1299の方法。
[本発明1305]
本発明1299〜1304のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキットであって、任意で、1種または複数種の該試薬が1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、キット。
[本発明1306]
(a)基体-生物学的試料複合体を形成させるために、基体を生物学的試料と接触させる工程;
(b)基体-生物学的試料複合体を複数種の候補結合物質と接触させる工程;および
(c)基体-生物学的試料複合体と結合する複数種の候補結合物質の1つまたは複数のメンバーを特定する工程であって、それによって1種または複数種の結合物質を選択する、工程
を含む、1種または複数種の結合物質を選択する方法。
[本発明1307]
1種または複数種の結合物質が、核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体複合体、抗体断片、アプタマー、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、レクチン、ポリペプチド、ペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識剤、化学物質、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1306の方法。
[本発明1308]
生物学的試料が組織試料または細胞培養物試料を含む、本発明1306の方法。
[本発明1309]
生物学的試料が体液を含み、任意で、体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、臍帯血、またはこれらのいずれかの派生物を含む、本発明1306の方法。
[本発明1310]
生物学的試料が、濃縮血漿試料、血清試料、浄化血清試料、または浄化血漿試料を含む、本発明1306の方法。
[本発明1311]
生物学的試料が異種微小胞集団または同種微小胞集団を含む、本発明1306〜1310のいずれかの方法。
[本発明1312]
浄化血清または浄化血漿試料が、非浄化対照試料と比較して低下したレベルの、1種または複数種の高存在量タンパク質を有する、本発明1311の方法。
[本発明1313]
1種または複数種の高存在量タンパク質が血液タンパク質を含む、本発明1312の方法。
[本発明1314]
1種または複数種の高存在量タンパク質が、1種または複数種のアルブミン、IgG、トランスフェリン、フィブリノーゲン、フィブリン、IgA、α2-マクログロブリン、IgM、α1-抗トリプシン、補体C3、ハプトグロブリン、アポリポタンパク質A1、A3、およびB;α1-酸性糖タンパク質、セルロプラスミン、補体C4、C1q、IgD、プレアルブミン(トランスチレチン)、プラスミノーゲン、これらのいずれかの誘導体、およびこれらの組み合わせを含み、1種または複数種の高存在量タンパク質が、1種または複数種のアルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、プレアルブミン、α1抗トリプシン、α1酸性糖タンパク質、α1フェトプロテイン、ハプトグロビン、α2マクログロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体タンパク質C3およびC4、β2ミクログロブリン、βリポタンパク質、γグロブリンタンパク質、C反応性タンパク質(CRP)、リポタンパク質(カイロミクロン、VLDL、LDL、HDL)、他のグロブリン(α、β、およびγ型)、プロトロンビン、マンノース結合レクチン(MBL)、これらのいずれかの誘導体、およびこれらの組み合わせを含み得る、本発明1312の方法。
[本発明1315]
1種または複数種の高存在量タンパク質が、クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性、沈殿、またはこれらの組み合わせによって浄化血清または浄化血漿試料から全体的または部分的に分離される、本発明1312の方法。
[本発明1316]
1種または複数種の高存在量タンパク質が、生物学的試料をトロンボプラスチンと接触させる工程の後に浄化血清または浄化血漿試料から分離される、本発明1312の方法。
[本発明1317]
非浄化対照試料と比較して、1種または複数種の高存在量タンパク質の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%が浄化血清または浄化血漿試料から分離される、本発明1312の方法。
[本発明1318]
基体-生物学的試料複合体が、基体と生物学的試料の成分との間の架橋を含み、任意で、該架橋が、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミダート、脂質架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミド-エステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベラート(BS3)、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DDC)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDCまたはEDAC)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(Sulfo-SMCC)、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロプリオナート(Sulfo-SBED)、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチン-アミドカプロイル)-L-リシニル]エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-Biotin)、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノ-カプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リシニルアミド]}エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-LC-Biotin)、光反応性アミノ酸、L-Photo-Leucine、L-Photo-Methionine、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン、またはこれらの任意の組み合わせもしくは修飾を含む、本発明1306の方法。
[本発明1319]
基体が、生物学的試料の成分に直接架橋されている、本発明1318の方法。
[本発明1320]
基体が、リンカーを介して生物学的試料の成分に架橋されている、本発明1318の方法。
[本発明1321]
生物学的試料の成分が微小胞を含む、本発明1319または1320の方法。
[本発明1322]
リンカーが微小胞膜中に埋め込まれている、本発明1320に従属する本発明1321の方法。
[本発明1323]
リンカーが、官能化脂質を含み、任意で、該官能化脂質が、16:0ビオチニルPE 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)(ナトリウム塩)、18:1ビオチニルPE 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)(ナトリウム塩)、16:0ビオチニルキャップPE 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)(ナトリウム塩)、18:1ビオチニルキャップPE 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)(ナトリウム塩)、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1322の方法。
[本発明1324]
リンカーが、ジアシルグリセロール、ジアシルホスホグリセロール(リン脂質)もしくはステロール、ジアルキルグリセロール、ジアルキル-もしくはジアシル-1-アミノ-2,3-ジヒドロキシプロパン、長鎖アルキルもしくはアシル、スフィンゴ脂質、セラミド、リン脂質、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)膜アンカー配列、糖リン脂質膜アンカー、膜受容体断片、タンパク質結合受容体、金属キレート受容体、免疫グロブリンFc結合受容体、サイトカインもしくは成長因子結合受容体、薬物結合受容体、脂質模倣(lipid mimicking)受容体、膜貫通受容体、合成タンパク質結合受容体、合成金属キレート受容体、合成免疫グロブリンFc結合受容体、合成サイトカインもしくは成長因子結合受容体、合成薬物結合受容体、合成脂質模倣受容体、合成膜貫通受容体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、スフィンゴ脂質、ステロイド、コレステロール、ジヒドロコレステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、コレステリルアミン、ジヒドロコレステリルアミン、エルゴステリルアミン、ブラシカステリルアミン、3-コレステリルアミン、3-ジヒドロコレステリルアミン、3-エルゴステリルアミン、3-ブラシカステリルアミン 3β-コレステリルアミン、3β-ジヒドロコレステリルアミン、3β-エルゴステリルアミン、3β-ブラシカステリルアミン、またはこれらのいずれかの機能的断片もしくは誘導体を含む、本発明1322の方法。
[本発明1325]
基体が、生物学的試料の成分に対する結合物質と結合している、本発明1318の方法。
[本発明1326]
結合物質が、抗体、アプタマー、またはレクチンを含み、任意で、該レクチンがコンカナバリンA(ConA)を含む、本発明1325の方法。
[本発明1327]
生物学的試料の成分が微小胞を含み、任意で、結合物質が微小胞表面抗原に対する結合物質を含む、本発明1325または1326の方法。
[本発明1328]
1種または複数種の結合物質を特定する工程をさらに含む、本発明1306の方法。
[本発明1329]
基体-微小胞複合体を含み、該基体が合成基体を含む、組成物。
[本発明1330]
基体が、ビーズ、ウェル、または平面の基体を含み、任意で、該ビーズが磁気ビーズ、またはポリスチレンビーズを含む、本発明1329の組成物。
[本発明1331]
本発明1306〜1328のいずれかの方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットであって、任意で、該1種または複数種の試薬が1種または複数種の基体-微小胞複合体およびリンカー物質を含む、キット。
[本発明1332]
安定した基体-微小胞複合体を作製する方法であって、基体を微小胞と接触させる工程を含み、該基体が、該微小胞の表面上に存在する少なくとも1つの成分に直接結合することが可能な化学基によって官能化されている、方法。
[本発明1333]
基体が、ビーズ、ウェル、マトリックス、または平面の基体を含む、本発明1332の方法。
[本発明1334]
化学基が、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、レクチン、ペプチド/ポリペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識剤、化学物質、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミダート、脂質架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミド-エステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベラート(BS3)、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DDC)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDCまたはEDAC)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(Sulfo-SMCC)、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロプリオナート(Sulfo-SBED)、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチン-アミドカプロイル)-L-リシニル]エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-Biotin)、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノ-カプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リシニルアミド]}エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-LC-Biotin)、光反応性アミノ酸、L-Photo-Leucine、L-Photo-Methionine、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1332の方法。
[本発明1335]
化学基が、炭化水素、ハロゲン、酸素を含む基(すなわちC-O結合)、窒素を含む基、硫黄を含む基、リンを含む基、ホウ素を含む基、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1332の方法。
[本発明1336]
炭化水素が、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、トルエン誘導体、分枝または環状アルカン、カルボカチオン、およびカルボアニオンからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1337]
ハロゲンが、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、およびヨードアルカンからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1338]
酸素を含む基が、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カルボナート、カルボキシラート、カルボン酸、エステル、ヒドロペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、およびオルトカルボナートからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1339]
窒素を含む基が、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアナート、ニトラート、ニトリル、ニトライト、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、およびピリジン誘導体からなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1340]
硫黄を含む基が、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、硫酸、スルホン酸、チオシアナート、イソシアナート、チオン、およびチアールからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1341]
リンを含む基が、ホスフィン、ホスファン、ホスホン酸、ホスファート、およびホスホジエステルからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1342]
ホウ素を含む基が、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸、およびボリン酸エステルからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1343]
化学基が、アセタール、アシル基、ハロゲン化アシル、アルケニル基、アルコキシド、アルコキシ基、アルキニル基、アミド、アミンオキシド、アミン、カルボジイミド、カルボキシミダート、カルボン酸、シアナミド、シアナート、ジチオカルバマート、エノール、エステル、エーテル、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、イミド、イソシアナート、イソシアニド、イソチオシアナート、ケタール、ケテン、ケトン、脱離基、ニトリル、有機ハロゲン化物、有機リン、オルトエステル、オキシム、ホスホノフルオリダート、ホスホノチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロフルオリダート、ホスホロチオアート、保護基、ピロホスファート、セミカルバジド、セミカルバゾン、スルファマート、スルホン酸エステル、スルホン、スルホン酸、スルホニル基、スルホキシイミン、スルフリル化合物、チオアミド、チオシアナート、チオエステル、チオラート、チオン、チオホスホリル化合物、および/またはチオスルフィナートを含む、本発明1332の方法。
[本発明1344]
化学基が、アセタール、アセトキシ基、アセチリド、酸無水物、活性化基、塩化アシル、ハロゲン化アシル、アシラール、アシロイン、アシルシラン、アルコール、アルデヒド、アルジミン、アルカン、アルケン、アルコキシド、アルキルシクロアルカン、亜硝酸アルキル、アルキン、アレン、アミド、アミジン、アミナール、アミンオキシド、アジド、アジン、アジリジン、アゾキシ、二官能性、ビスチオセミカルバゾン、ビウレット、ボロン酸、カルバマート、カルバミノ、カルバジド、カルベン、カルビノール、炭酸エステル、カルボニル、カルボキサミド、カルボキシミダート、カルボン酸、クロロホルマート、クムレン、シアン酸エステル、シアニミド、シアノヒドリン、不活性化基、デプシド、ジアゾ、ジオール、ジチオカルバマート、エナミン、エンジイン、エノール、エノールエーテル、エノン、エニン、エピスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、フルオロスルホナート、ハロヒドリン、ハロケトン、ヘミアセタール、ヘミアミナール、ヘミチオアセタール、ヒドラジド、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、イミン、イミニウム、イソチオウロニウム、ケテン、ケテンイミン、ケトン、ケチル、ラクタム、ラクトール、ラクトン、メチン、メチル基、ニトラート、ニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトロ化合物、ニトロアミン、ニトロナート、ニトロン、ニトロニウムイオン、ニトロソアミン、ニトロソ、オルトエステル、オサゾン、オキサジリジン、オキシム、n-オキソアンモニウム塩、ペルオキシド、ペルオキシ酸、パーシステントカルベン、フェノール、ホスファアルケン、ホスファアルキン、ホスファート、ホスフィナート、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスフィニト、ホスホナート、ホスホニト、ホスホニウム、ホスホラン、s-ニトロソチオール、シッフ塩基、セレノール、セレノン酸、セロン、セミカルバジド、セミカルバゾン、シリルエノールエーテル、シリルエーテル、スルフェンアミド、スルフェン酸、塩化スルフェニル、スルフィド、スルフィルイミン、スルフィンアミド、スルフィン酸、亜硫酸エステル、スルホンアミド、スルホンアニリド、スルホナート、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、スルホキシド、スルフリル、スルトン、テルロール、チアール、チオアセタール、チオアミド、チオカルバマート、チオカルボキシ、チオシアナート、チオエステル、チオエーテル、チオケタール、チオケトン、チオール、チオラクトン、チオ尿素、トシルヒドラゾン、トリアゼン、トリオール、尿素、バニリル、キサンタート、イリド、およびイノラートからなる群より選択される、本発明1332の方法。
[本発明1345]
化学基が、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、および/またはクロロメチル基を含む、本発明1332の方法。
[本発明1346]
化学基がカルボキシル基を含む、本発明1332の方法。
[本発明1347]
少なくとも1つの成分が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、糖質、これらの誘導体、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1332の方法。
[本発明1348]
基体-微小胞複合体を含み、該基体が合成基体を含む、組成物。
[本発明1349]
不活性基体に直接結合した微小胞を含む、安定化した微小胞組成物。
[本発明1350]
基体が、ビーズ、ウェル、マトリックス、または平面の基体を含み、任意で、該ビーズが磁気ビーズ、またはポリスチレンビーズを含む、本発明1348または1349の組成物。
[本発明1351]
本発明1332〜1347のいずれかの方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットであって、任意で、該1種または複数種の試薬が1種または複数種の基体-微小胞複合体およびリンカー物質を含む、キット。
[本発明1352]
(a)微小胞を、微小胞抗原に対する結合物質と接触させる工程であって、該結合物質が標識を含む、工程;
(b)走査型電子顕微鏡(SEM)の基体に、該接触させた微小胞を固定する工程;
(c)固定された微小胞をスパッターコーティングする工程;および
(d)SEMを使用して微小胞および標識を可視化する工程
を含む、微小胞を可視化する方法。
[本発明1353]
微小胞が、工程(a)の前に基体に付着している、本発明1352の方法。
[本発明1354]
微小胞が、共有結合を介して基体に付着している、本発明1353の方法。
[本発明1355]
微小胞が、免疫親和性結合を介して基体に付着している、本発明1353の方法。
[本発明1356]
結合物質が直接標識されている、本発明1352の方法。
[本発明1357]
結合物質が間接的に標識されている、本発明1352の方法。
[本発明1358]
結合物質が、抗体、機能的抗体断片、またはアプタマーを含む、本発明1352の方法。
[本発明1359]
間接的な標識が、微小胞抗原に対する結合物質との複合体を形成する標識された結合物質を含む、本発明1357の方法。
[本発明1360]
微小胞抗原が、表3、表4、または表26から選択される、本発明1352の方法。
[本発明1361]
微小胞抗原が、テトラスパニン、CD9、CD63、CD81、またはこれらの任意の組み合わせである、本発明1352の方法。
[本発明1362]
スパッターコーティングが金および/またはパラジウムコーティングを含む、本発明1352の方法。
[本発明1363]
スパッターコーティングが炭素コーティングを含む、本発明1352の方法。
[本発明1364]
SEMが、微小胞を可視化するための二次電子(SE)モード、および/または標識を可視化するための後方散乱電子(BSE)モードを含む、本発明1352の方法。
[本発明1365]
標識が金を含む、本発明1352〜1364のいずれかの方法。
[本発明1366]
i. 微小胞が、工程(a)の前に共有結合を介して基体に付着しており;
ii. 微小胞抗原に対する結合物質が、間接的に標識された抗体であり、該間接的な標識が、微小胞抗原に対する抗体と複合体を形成する金標識抗体を含み;
iii. 微小胞抗原がCD9であり;
iv. スパッターコーティングが炭素コーティングを含み;かつ
v. SEMが、微小胞を可視化するための二次電子(SE)モード、および/または標識を可視化するための後方散乱電子(BSE)モードを含む
、本発明1352の方法。
本発明の一つまたは複数の態様の詳細が以下の付随の説明に記載される。本明細書に記載されるものに類似している、または等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは、好ましい方法および材料を記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は詳細な説明から明らかになる。本明細書中、別段明らかに指示されない限り、単数形は複数をも含む。別段定義されない限り、本明細書において使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先する。
SELEX法
アプタマーを生成するのに適した方法は、たとえば、1990年6月11日に出願され、今や放棄された米国特許出願第07/536,428号、「Nucleic Acid Ligands」と題する米国特許第5,475,096号および「Nucleic Acid Ligands」と題する米国特許第5,270,163号(WO91/19813も参照)に概して記載されている「Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment」(「SELEX法」)と呼ばれるプロセスを用いる方法である。各SELEX同定核酸リガンド、すなわち各アプタマーは、所与の標的化合物または分子に特異的なリガンドである。SELEXプロセスは、核酸が、多様な二次元および三次元構造を形成するのに十分な能力と、モノマーであるかポリマーであるかを問わず事実上いかなる化学物質とでもリガンドとして働く(すなわち、特異的結合対を形成する)のに十分な、それらのモノマー内で利用可能な化学的融通性とを有するという独自の洞察に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が標的として働くことができる。
アプタマーが治療剤としての使用に適するためには、好ましくは、インビボで安全かつ安定に合成することが低廉である。野生型RNAおよびDNAアプタマーは一般に、ヌクレアーゼによる分解を受けやすいため、インビボで安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する耐性は、2'位における修飾基の組み込みによって大きく高めることができる。
バイオマーカー検出および診断
本発明のアプタマーは、生物学的試料中のバイオマーカー、たとえば、タンパク質、核酸または微小胞のような関心対象の生物学的実体の存在またはレベルを評価するための様々な方法において使用することができる。アプタマーは、同族標的分子の存在またはレベルを評価するための結合物質として機能する。したがって、診断、予後判定またはセラノーシスに関する本発明の様々な態様において、本発明の1種または複数種のアプタマーは、本発明の1種または複数種のアプタマーを、選択された生物学的試料と接触させ、1種または複数種のアプタマーがその標的分子と結合する、リガンド−標的ベースのアッセイにおいて構成される。本発明のアプタマーは、評価される生物学的試料および検出されるバイオマーカーに基づいて候補バイオシグネチャーを同定するために使用される。さらなる態様において、アプタマーは、それ自体が特定の病状または疾患のバイオシグネチャーを提供し得る。バイオシグネチャーとは、1種または複数種の関心対象のバイオマーカーの存在、レベルまたは評価することができる他の特徴(非限定的に、配列、突然変異、再配列、転座、欠失、後成的修飾、メチル化、翻訳後修飾、対立遺伝子、活性、複合体パートナー、安定性、半減期などを含む)を含む生物学的試料のバイオマーカープロフィールをいう。バイオシグネチャーは、診断および/または予後判定基準、たとえば疾患の存在、病期決定、疾患モニタリング、疾患層別化または疾患の検出、転移もしくは再発もしくは進行の監視を評価するために使用することができる。たとえば、微小胞表面抗原に対するアプタマーを使用する本発明の方法は、微小胞抗原を含むバイオシグネチャーを選択された病状または疾患と相関させるのに有用である。バイオシグネチャーはまた、治療介入を含む治療モダリティに関する決定を下す際に臨床的に使用することもできる。バイオシグネチャーはさらに、手術を実施するかどうか、または手術と共にどの治療標準を使用すべきかを含む治療の決定を下すために臨床的に使用することもできる(たとえば術前または術後に)。説明のための例として、侵攻型の癌を示す循環バイオマーカーのバイオシグネチャーは、患者を治療するために、より積極的な外科処置および/またはより積極的な治療計画を必要とし得る。
バイオシグネチャーは、治療関連の診断において、疾患を診断するのに有用な試験を提供する、または正しい治療計画を選択する、たとえばセラノーシスを提供するために使用することができる。セラノーシスは、罹病状態の治療法または治療に影響する能力を提供する診断試験を含む。セラノーシス試験は、診断または予後判定試験がそれぞれ診断または予後判定を提供するのと同様なやり方でセラノーシスを提供する。本明細書において使用されるセラノーシスは、予測的医療、個別化医療、統合医療、薬理診断学およびDx/Rxパターニングを含む、任意の所望の形態の治療関連の試験を包含する。治療関連の試験は、個々の対象における薬物応答を予測および評価する、すなわち、個別化医療を提供するために使用することができる。薬物応答の予測は、たとえば対象が暴露される、または他のやり方で治療される前にその対象が候補治療物質に対して応答者である可能性が高いのか、非応答者である可能性が高いのかを決定することであることができる。薬物応答の評価は、薬物に対する応答をモニターすること、たとえば治療の開始後、時間経過と共に対象の改善またはその欠如をモニターすることであることができる。治療関連の試験は、治療から恩恵を受ける可能性が特に高い対象をその治療に選択する、または個々の対象において治療効能の早期的かつ客観的指示を提供するのに有用である。このように、本明細書に開示されるバイオシグネチャーは、より有望な治療を選択するために治療を変更すべきであることを示し、それにより、有益な治療を遅らせる多大な損失を避け、効果のない薬物を投与する金銭的および罹患率の犠牲を避け得る。
本発明の組成物および方法は、生物学的試料と関連する表現型を特徴決定するために生物学的試料中の任意の有用なバイオマーカーを評価するために使用することができる。そのようなバイオマーカーは、すべての種類の生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、脂質、糖質、それらのいずれかの複合体および微小胞を含む。微小胞表面と結合した、または微小胞内に包含された様々な分子(本明細書においては「ペイロード」と呼ぶ)がバイオマーカーとして働くことができる。微小胞はまた、それ自体をバイオマーカーとして使用することもできる。
平面アレイに代わるものとして、粒子またはミクロフェアを使用するアッセイ法、たとえばビーズベースのアッセイ法もまた、本発明のアプタマーを使用することができる。アプタマーおよび抗体のような結合物質は市販のビーズと容易にコンジュゲートする。たとえば、Srinivas et al. Anal. Chem. 2011 Oct. 21, Aptamer functionalized Microgel Particles for Protein Detectionを参照すること。また、治療物質および診断物質としてのアプタマーに関するレビュー文献、Brody and Gold, Rev. Mol. Biotech. 2000, 74:5-13を参照すること。
生物学的試料由来の循環バイオマーカ、たとえばタンパク質抗原またはバイオマーカ包含細胞、細胞フラグメントもしくは小胞の単離または検出はまた、サイトメトリープロセスにおいて本発明のアプタマーを使用して達成されてもよい。非限定的な例として、本発明のアプタマーは、ビーズまたはミクロスフェアのような粒子の使用を含むアッセイ法において使用することができる。本発明は、粒子にコンジュゲートし得るアプタマーを結合物質として提供する。流体流中に懸濁した微視的粒子をソートするためにはフローサイトメトリー法を使用することができる。粒子が通過するとき、粒子は選択的に荷電され、出るとき、別々の流路の中にそらされることができる。したがって、元の混合物、たとえば生物学的試料から高い精度および速度で集団を分離することが可能である。フローサイトメトリー法は、光学/電子検出装置の中を流れる単一細胞の物理的および/または化学的特徴の同時マルチパラメータ分析を可能にする。一つの波長(色)の光ビーム、通常はレーザービームが流体力学的に集束した流体流に向けて送られる。いくつかの検出器:光ビームと平行である一つの検出器(前方散乱またはFSC)、それに対して垂直であるいくつかの検出器(側方散乱またはSSC)および一つまたは複数の蛍光検出器が、流れが光ビームを通過する点に照準を定めている。
本発明の1種または複数種のアプタマーは、任意の有用な平面またはビーズ基体にコンジュゲートさせる、または他のやり方でその上に配置することができる。本発明の一つの局面において、本発明の1種または複数種のアプタマーは、マイクロ流体装置上に配置され、それにより、関心対象のポリペプチド抗原またはその機能性フラグメントを含む生物学的試料の成分の評価、特徴決定または単離を容易にする。たとえば、循環抗原またはその抗原を含む細胞、細胞フラグメントもしくは細胞由来の小胞は、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して(または、さらなる結合物質と共に)評価することができる。また、「Lab-on-a-Chip」システム、バイオメディカルマイクロエレクトロメカニカルシステム(Bio-MEM)またはマルチコンポーネント集積システムとも呼ばれ得るマイクロ流体装置を小胞の単離および分析のために使用することができる。そのようなシステムは、小胞の結合、バイオシグネチャーの検出および他のプロセスを可能にするプロセスを小型化し、区画化する。
本明細書に開示されるものは、本発明の方法および組成物を使用して表現型を特徴決定するための生成物およびプロセスである。本明細書において使用される語「表現型」は、本発明の組成物および/または方法を部分的または完全に使用して同定されるバイオマーカープロフィールに帰される任意の特性または特徴を意味することができる。たとえば、表現型は、対象から得られた試料に関して特徴決定されたバイオマーカープロフィールに基づく診断、予後判定またはセラノーシスであることができる。表現型は、任意の観測可能な特徴または特性、たとえば疾患もしくは病状、病期もしくは病状期、疾患もしくは病状に対する感受性、病期もしくは病状の予後、生理学的病状または治療剤に対する応答/潜在的応答であることができる。表現型は、対象の遺伝的構成ならびに環境要因の影響および二つの間の相互作用ならびに核酸配列に対する後成的修飾から生じることができる。
対象の1つ以上の表現型を、対象から得られる生体試料中の小胞などの一つまたは複数の小胞を分析することによって決定することができる。対象または患者としては、ウシ、トリ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または霊長類動物(ヒトおよび非ヒト霊長類を含む)等の哺乳動物を挙げることができるが、これらに限定されない。対象はまた、シベリアトラ等の絶滅の危機に瀕しているために重要な哺乳動物、ヒトによって消費用に農場で育てられる動物等の経済的に重要な哺乳動物、またはペットとして、または動物園で飼育されている動物等の、ヒトにとって社会的に重要な動物が含まれ得る。このような動物の例としては、ネコおよびイヌ等の肉食動物、ブタ(pig)、雄ブタ、およびイノシシを含むブタ(swine)、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、およびラクダ、またはウマ等の反芻動物または有蹄動物が挙げられるが、これらに限定されない。また、絶滅の危機に瀕したトリ、または、動物園で飼育されるトリ、ならびに家禽(fowl)、さらに具体的には、家畜化された家禽、すなわち、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ等の家禽類(poultry)も含まれる。また、家畜化されたブタおよびウマ(競争馬を含む)も含まれる。加えて、農業および水産、ならびに他の活動と関係がある動物等の、商業活動と関係がある任意の動物種も含まれ、ここで、疾患のモニタリング、診断、および治療の選択は、経済的生産性および/または食物連鎖の安全性のため、畜産において通常の業務である。
本発明の組成物および方法によって使用および/または評価される試料は、非限定的に組織切片、たとえば外科的もしくは他の処置の間に除去された生検材料もしくは組織、体液、検死試料、組織学的目的に採取された凍結切片および細胞培養物を含む、バイオマーカー評価に使用することができる任意の適切な生物学的試料を含む。そのような試料は、血液および血液分画または産物(たとえば血清、バフィーコート、血漿、血小板、赤血球など)、痰、悪性浸出液、頬細胞組織、培養細胞(たとえば初代培養物、外植片および形質転換細胞)、糞便、尿、他の生物学的または体液(たとえば前立腺液、胃液、腸液、腎臓液、肺液、脳脊髄液など)などを含む。試料は、新鮮な凍結ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックである、ホルマリン固定パラフィン包埋されている、またはRNA保存液+ホルマリン固定液内にある生物学的材料を含むことができる。患者ごとに一つより多いタイプの一つより多い試料を使用することができる。
本明細書に記載されるように、本発明の方法および組成物は、一つまたは複数の関心対象のバイオマーカーの存在またはレベルを検出するためのアッセイにおいて使用することができる。バイオマーカーは、本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の有用なバイオマーカーであることができる。ある態様において、バイオマーカーはタンパク質またはポリペプチドを含む。本明細書において使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、別段述べられない限り、互換可能に使用される。バイオマーカーは、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような、DNA、RNAおよびそれらのいずれかの様々な亜種を含む核酸であることができる。バイオマーカーは脂質を含むことができる。バイオマーカーは糖質を含むことができる。バイオマーカーはまた、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および/または糖質を含む複合体であることができる。いくつかの態様において、バイオマーカーは微小胞を含む。ある態様において、本発明は、アプタマーのプールを使用して、プールの各メンバーによって標的化される正確な微小胞抗原を知ることなく、関心対象の微小胞集団の存在および/またはレベルを評価する方法を提供する。たとえば図15B〜Cを参照すること。他の場合、微小胞と結合したバイオマーカーが本発明の方法にしたがって評価される。たとえば図1A〜1F;図15Aを参照すること。
本明細書において使用される「治療有効量」とは、哺乳動物における疾患または病状の一つまたは複数の症候を軽減する組成物の量(ある程度、熟練した医療実施者の判断による)をいう。加えて、組成物の「治療有効量」とは、疾患または病状と関連する、またはその原因となる生理学的または生化学的パラメータを部分的または完全のいずれかに正常に戻す量を意味する。医療当業者は、たとえば静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与または吸入によって投与されたとき特定の病状または障害を治療または予防するために、組成物の治療有効量を決定することができる。治療的に有効であるために求められる組成物の正確な量は、数多くの要因、たとえば有効薬剤の比活性、用いられる送達装置、薬剤の物理的特徴、投与の目的、さらには多くの患者固有の考慮事項に依存する。しかし、治療有効量の決定は、本明細書に記載される開示を考慮すると、通常の医療当業者の技能の範囲内である。
これまでの広範な研究が、一定範囲の適応症のための、主に癌の治療に向けられ、第一に血液腫瘍に焦点を当てた潜在的治療としての抗体−毒素コンジュゲート(「免疫コンジュゲート」)の概念を広く展開している。タンパク質毒素、高効力小分子細胞毒、放射性同位体およびリポソーム封入薬物を含む、標的化送達のための多様な異なるペイロードが前臨床および臨床試験において試験されている。これらの努力は血液腫瘍のための三つのFDA承認治療を生み出すことに成功したが、クラスとしての免疫コンジュゲート(特に固形腫瘍のための)は、歴史的に、非ヒト化抗体に対する中和抗体応答を発生させる傾向、固形腫瘍への限られた浸透、毒素コンジュゲートの結果としての標的結合親和性の損失および全体的治療指数を制限する抗体半減期と毒素コンジュゲート半減期との不均衡を含む抗体の複数の異なる性質に帰すことができる、失望させる結果しかもたらしていない(Reff and Heard, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 40 (2001):25-35によって考察されている)。
核酸配列は、二次および三次モチーフ、特にそれらのヌクレオチド配列へとフォールディングする。これらのモチーフは、配列が標的分子、たとえばタンパク質および他のアミノ酸配列上の特定の位置に結合することを可能にする位置において核酸配列に正および負の電荷を配置する。これらの結合配列は当技術分野においてアプタマーとして知られている。相対的に短いヌクレオチドの伸長(たとえば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40個のヌクレオチド)においてさえ何兆もの特有のヌクレオチド配列が可能であるせいで、多様なモチーフを生成して、ほぼいかなる所望のタンパク質または他の標的のためのアプタマーも得ることができる。
公知のアプタマー製造法は、結合したすべてのアプタマーを標的配列から溶離させる工程を含み得る。いくつかの場合、これは、所望のアプタマー配列を同定するのに十分ではない。たとえば、アッセイ中に抗体を交換しようとするとき、交換される抗体の特定のエピトープに結合するアプタマーだけを捕集することが望ましい場合もある。本発明は、抗体エピトープに結合するアプタマーの選択的捕集を可能にするために、交換される抗体をアプタマー/標的反応に付加する工程を含む方法を提供する。ある態様において、方法は、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を関心対象の標的と共にインキュベートする工程、標的に結合しない非結合アプタマーを反応混合物から除去する工程、関心対象のエピトープに結合する抗体を反応混合物に加える工程、および抗体によって置換されるアプタマーを捕集する工程を含む。標的はタンパク質であることができる。
本明細書に記載されるように、アプタマーは、関心対象の標的に対して同定することができる。図3に概説するように、競合的結合スキーム30を使用して、関心対象の標的に対するアプタマーを同定することができる。分析対象物、たとえばタンパク質または微小胞のような生物学的実体を基体に捕捉する(31)。基体は、たとえば平面基体またはビーズであることができる。分析対象物は、共有結合的または非共有結合的に捕捉することができ、たとえば、分析対象物は、抗体、アプタマーまたはストレプトアビジン−ビオチン結合を使用して捕捉することができる。捕捉された分析対象物をオリゴヌクレオチドアプタマー候補のプールと接触させる(32)。ある態様において、プールは、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチド、たとえば少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1023、1015、1016、1017、1018、1019個または少なくとも1020個のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、分析対象物、基体、捕捉物質(たとえば抗体(Ab)、アプタマーなど)、反応チューブまたはウェル、壊死組織片などを含む、混合物中の様々な成分に結合する(33)。分析対象物に結合するオリゴヌクレオチドは、関心対象の標的に対するアプタマー候補を含む(34)。非結合オリゴヌクレオチドを洗浄によって除去する(35)。この工程ののち、反応混合物は、アプタマー候補と結合した捕捉分析対象物を含む。特定のエピトープを認識するリガンド、たとえば抗体を反応混合物と接触させる(37)。リガンドは、エピトープを求める競合により、リガンドと同じエピトープに結合したアプタマー候補を分離させる(38)。分離させたアプタマー候補を捕集し、増幅する(39)。工程32〜39を一定の回数n、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20回繰り返して、リガンドと同じエピトープに結合するアプタマー候補をさらに富化する。反復サイクルののち、残るアプタマーを配列決定および本明細書に記載される他の特徴決定によって評価する(310)。
大部分のアプタマー実験においては、標的に結合する複数のアプタマー配列が同定される。これらのアプタマーは様々な結合親和性を有する。これら多くのアプタマーをそれぞれの親和性を評価するのに十分な量で生成するには時間と労力を要する。大きなサブセットを物理的にスクリーニングすることなく最高の親和性を有する多数のアプタマーを同定するために、本発明は、関心対象の標的に対する一つまたは複数の高親和性アプタマーの二次元構造の分析を含む方法を提供する。ある態様において、方法は、類似した二次元構造、すなわちモチーフを有するが、必ずしも類似した一次配列を有するわけではないアプタマーを求めてデータベースをスクリーニングする工程を含む。ある態様において、方法は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような従来の方法(たとえば表面プラズモン共鳴結合アッセイ法、たとえば図4を参照)を使用して高親和性アプタマーを同定する工程、高親和性アプタマーの二次元構造を近似する工程、および高親和性アプタマーに類似した二次元構造を有すると予測されるアプタマーを配列のプールから同定する工程を含む。これにより、方法は、関心対象の標的にも結合する候補のプールを提供する。オリゴの二次元構造は、当技術分野において公知の方法を使用して、たとえば、内容が参照により全体として本明細書に組み入れられるMathews, D., Sabina, J., Zucker, M. & Turner, H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters provides robust prediction of RNA secondary structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999);Hofacker et al., Monatshefte f. Chemie 125: 167-188 (1994);およびHofacker, I. L. Vienna RNA secondary structure server. Nucleic Acids Res. 31, 3429-3431 (2003)に記載されているように、市販のソフトウェアプログラム、たとえばViennaまたはmFoldを使用して実施される自由エネルギー(ΔG)算出によって予測することができる。図5A〜5Bを参照すること。配列のプールは、ランダムに生成されたアプタマー候補のプールから、ハイスループット配列決定プラットフォーム、たとえばLife Technologiesのイオントレントプラットフォームを使用して配列決定することができる。高親和性アプタマーに類似した二次元構造を有すると予測されるアプタマーを配列のプールから同定する工程は、得られた配列を好みのソフトウェアプログラムにロードして、高親和性アプタマーと同様な二次元構造を有する配列プールのメンバーを同定する工程を含み得る。そして、配列のプールの親和性をインサイチューで、たとえば表面プラズモン共鳴結合アッセイ法などで測定することができる。
疾患、たとえば癌を検出するためのアッセイ法を開発するためには、一般に、正常および疾患患者由来の既知のバイオマーカーの大きな集団をスクリーニングして、疾患と相関するマーカーを同定する。このプロセスは、弁別マーカーがすでに記載されている場合しかうまく行かない。この問題に対処するために、本発明は、はじめに非標的微小胞または細胞と共にインキュベートすることにより、大きなアプタマープールから非弁別アプタマーを減じる工程を含む方法を提供する。非標的細胞は、正常な細胞または正常な細胞から流出した微小胞であることができる。そして、正常な微小胞または細胞に結合しなかったアプタマーを罹病微小胞または細胞と共にインキュベートする。そして、罹病微小胞または細胞に結合するが、正常細胞には結合しなかったアプタマーが、疾患を検出するためのアッセイ法にとって可能な候補である。このプロセスは、疾患試料中の特定のマーカーの存在を知ることからは独立している。
本発明は、試料中に存在する標的分子に特異的である、またはそれに結合する結合物質を同定する方法の複数の変形を考慮する。結合物質は、本明細書の態様のいずれに関しても、所望の標的分子に結合することができる任意の分子であることができる。そのような結合物質の例が、本明細書中、以下に開示される。本明細書の態様のいずれも、試験される生物学的試料中に存在する一つまたは複数の成分に結合することができる様々なタイプの結合物質を同定する方法を含むことができる。さらなる態様において、結合物質が結合する特定の標的が上記のように特徴決定される。
アプタマーは、結合物質に依存する数多くのタイプのアッセイを含む様々な生物学的アッセイにおいて使用することができる。たとえば、アプタマーは、免疫ベースアッセイにおいて抗体の代わりに、または抗体と共に使用することができる。本発明は、アッセイ工程を通じていかなる面(基体、チューブ、フィルター、ビーズ、他の抗原など)にも結合せず、関心対象の抗原に特異的に結合するアプタマーを同定するアプタマースクリーニング法を提供する。アッセイは、ネガティブ選択に依存して、最終アッセイの非標的抗原成分に結合するアプタマーを除去する。ネガティブ選択に続きポジティブ選択を実施して、所望の抗原に結合するアプタマーを同定する。
上記方法およびキットは、二つのバイオマーカー集団を区別する結合物質を同定するために使用することができる。本発明はさらに、この項に記載されるように、結合物質の標的を同定する方法を提供する。たとえば、方法はさらに、結合物質によって認識される標的微小胞の表面マーカーを同定する工程を含み得る。
本発明のアプタマーは、生物学的試料を特徴決定するために使用することができる。たとえば、アプタマーを使用して、試料中のバイオマーカーに結合させることができる。結合したバイオマーカーの存在またはレベルは、例の特徴、たとえば試料に関連する疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを示すことができる。
ある局面において、本発明は、試料を様々なアプタマーのプールと接触させ、プール中の様々なアプタマーが試料に結合する頻度を測定することによって、試料を特徴決定する方法を提供する。たとえば、非癌患者由来の微小胞に比べて癌患者由来の微小胞に優先的に結合するアプタマーのプールを同定する。たとえば癌を有することが疑われる患者由来の試験試料を捕集し、アプタマーのプールと接触させる。試験試料に結合するアプタマーを試験試料から溶離させ、捕集し、同定し、結合したアプタマーの組成を、癌試料に結合することが知られているものと比較する。溶離したアプタマーを同定するために、様々な配列決定、増幅およびハイブリダイゼーション技術を使用することができる。大きなアプタマープールが使用される場合、アプタマー同定は、ハイスループット配列決定またはハイブリダイゼーションによって実施されてもよい。試験試料がアプタマープールによって同様なやり方で癌患者由来の微小胞に結合しているならば(たとえばバイオインフォマティックス分類法によって判定)、試料は同じく癌を示す。この方法を使用すると、アプタマープールの各メンバーの正確な標的を必ずしも知ることなく、1種または複数種の微小胞抗原に結合するアプタマープールを使用して試料を特徴決定することができる。本明細書の実施例23〜24は本発明の態様を示す。
もう一つの局面において、本発明は、非標的結合核酸および基体を含む陰性対照組成物を提供する。非標的結合核酸は、本発明の上記選択法によって提供することができ、核酸は非標的結合アプタマーとして同定される。たとえば、非標的結合アプタマーは、ポジティブ選択中に非標的結合アプタマーとして同定することができる。いくつかの態様において、非結合アプタマーは、存在するとしても最小限の二次構造しか有しないと予測される。核酸配列を同定したならば、その二次元フォールディング構造を推定するためのソフトウェアプログラムを使用してその配列を分析することができる。モチーフ同定のための周知の配列整合プログラムおよびアルゴリズムを使用して、配列モチーフを同定し、大きな配列データセットの次元数をも減らすことができる。さらに、Viennaおよびmfoldのようなソフトウェアプログラムがアプタマー選択の当業者に周知であり、それを使用して、二次構造モチーフ(共有形状)に基づいて配列をさらに分類することができる。
いくつかの態様において、本発明の核酸は基体のためのブロッキング物質として働く。基体と所望の分子または実体、たとえば結合物質との間のカップリング反応ののち、ブロッキング物質を基体に適用して、コートされた基体と非標的分子との間の非特異的相互作用を最小限にすることができる。ブロッキング物質は、非特異的相互作用を最小限にするが、任意の所望の相互作用、たとえば基体にコンジュゲートした関心対象の分子と試験溶液中の別の関心対象の分子との間の特異的相互作用には干渉しないように選択することができる。一般に使用されるブロッカーは、BSA(ウシ血清アルブミン)、カゼイン(乳タンパク質)、pepticase(加水分解カゼイン)、非イオン界面活性剤(たとえばTween(登録商標)20およびTriton(登録商標)X-100)、非反応性抗体またはそのフラグメント(たとえばオフ種)、FSG(フィッシュスキンゼラチン)、高純度ゼラチンまたはゼラチンヒドロラーゼ、PEG(ポリエチレングリコール)、非反応性血清、非反応性タンパク質および当業者に公知の様々な市販のブロッカーを含む。非反応性タンパク質とは、するとしても最小限しかアッセイの成分と相互作用しないタンパク質をいう。
ある局面において、本発明は、関心対象の官能基に結合することができるアプタマーを提供する。本明細書において使用される官能基とは、分子の特徴的な化学反応の原因である、それらの分子内の原子または結合の群である。同じ官能基は、それが一部を成す分子のサイズにかかわらず、同一または類似の化学反応を受ける。しかし、その相対的反応性は近くの官能基によって変化することができる。「部分」は、官能基であることもできるし、または一つまたは複数の官能基で構成されることもできる。
本発明はまた、本発明の方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットを提供する。たとえば、1種または複数種の試薬は、1種または複数種のアプタマー、バッファ、ブロッカー、酵素またはそれらの組み合わせであることができる。1種または複数種の試薬は、非限定的にアプタマーライブラリー、基体、たとえばマイクロビーズまたは平面アレイもしくはウェル、バイオマーカーおよび/または微小胞単離のための試薬、特定の標的に対するアプタマー、バイオマーカー/微小胞集団の検出を容易にするアプタマープール、核酸配列決定または増幅のためのプライマーのような試薬、核酸ハイブリダイゼーションのためのアレイ、検出可能な標識、溶媒またはバッファなど、様々なリンカー、様々なアッセイ成分、ブロッカーなどを含む、主題の方法を実施するための任意の有用な試薬を含み得る。1種または複数種の試薬はまた、本発明によって提供される様々な組成物を含み得る。ある態様において、1種または複数種の試薬は本発明の1種または複数種のアプタマーを含む。1種または複数種の試薬は、基体、たとえば平面基体、カラムまたはビーズを含むことができる。キットは、1種または複数種の試薬を使用して様々なアッセイを実施するための取り扱い説明を含むことができる。
標的を、スライドガラスまたは磁気ビーズなどの固体基体に付着させる。磁気ビーズの調製のためには、ビーズを、0.1〜1 mg/mlの範囲の濃度の標的タンパク質とインキュベーションする。特定のビーズ製造業者により提供される化学に従って、標的タンパク質をビーズに結合させる。典型的には、これは、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)官能基プロセスを介したカップリングを含む。占有されていないNHS基を、標的との結合後に不活性にする。
抗体などの、標的に対する公知のリガンドを、結合したオリゴ種を溶出するために使用する(カオトロピック剤とは対照的に、またはカオトロピック剤に加えて)以外は、上記の実施例1におけるようにプロセスを行う。この場合は、Santa Cruz Biotechnology, Inc.由来の抗EpCAM抗体を、標的EpCAMからアプタマーを溶出するために使用した。
上述の結合アッセイから生成されたアプタマーを、Life Technologies由来のIon Torrentなどのハイスループット配列決定プラットフォームを用いて、配列決定する。
上記の実施例におけるプロセスに続いて、関心対象の標的に対する高親和性アプタマーを特定する。ひとたび高親和性アプタマーを特定すると、その配列を、次に、その二次元フォールディング構造を推定するためにソフトウェアプログラムを用いて解析する。周知の配列アラインメントプログラムおよびモチーフ特定のためのアルゴリズムを、配列モチーフを特定するため、および配列の一様な大きなデータセットの次元を低減させるために使用することができる。さらに、Viennaおよびmfoldなどのソフトウェアプログラムが、アプタマー選択の当業者に周知であり、二次構造モチーフ(共有される形状)に基づいてさらに配列をグループ化するために使用することができる。例となる構造予測については、図5A〜図5Bを参照されたい。共有される二次構造は、当然、同一の三次元構造を保証するものではない。従って、1セットのインシリコのツールではまだ、アプタマー候補のセットの中で最適なアプタマーを正確に予測することができないため、アプタマーの「ウェットラボ」評定が、依然として有用である。
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本実施例は、生物学的試料において見出されるバイオマーカーを認識するアプタマーのアプタマープールを枯渇させるプロセスを示す。方法は、健康な個体由来の微小胞を認識するアプタマーを枯渇させるために使用することができる。枯渇させたアプタマーは、罹患した個体由来の微小胞に対してスクリーニングすることができ、それにより健康に対して疾患を優先的に認識するアプタマーを特定する、アプタマーのプールを提供する。
循環微小胞を、以下の方法のうちの1つを用いて正常血漿(例えば、癌を有さない個体由来)から単離する:1)製造業者のプロトコルに従う、ExoQuick試薬を用いる単離;2)50,000〜150,000gでの1〜20時間のスピンを含み、その後沈殿物をPBSに再懸濁する、超遠心分離;3)製造業者のプロトコルに従う、Life Technologies由来のTEXIS試薬を用いた単離;ならびに4)濾過方法論。濾過法を、より詳細に以下に記載する:
上記の実施例は、疾患特異的アプタマーを特定する方法を示す。本実施例はさらに、疾患特異的アプタマーの標的を特定する方法を示す。
以下の表は、本発明の例証となるアプタマーを含む。アプタマーは、実施例1に記載されているランダムアプタマーのプールの一部であった。表8に開示されているヌクレオチド配列は、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつEpCAM抗原またはその機能断片に対する結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。任意の定義された数値単位の文脈において使用される際、「約」という用語は、その数値単位の10%上または下、およびその間のすべての単位の変動を意味する。表8に示されている修飾は、アプタマー配列の結合を可能にするために、アプタマープールに対してなされた。チミンテールまたは類似した部分は、アプタマーのいずれの末端にも結合し得ることを、当業者は理解するであろう。
アプタマーを、バイオマーカーを検出するための結合剤として使用することができる。本実施例においては、アプタマーを、微小胞と会合したEpCAMタンパク質を検出するための結合剤として使用する。
アプタマーは、結合剤に依拠する多数のタイプのアッセイを含む種々の生物学的アッセイにおいて使用することができる。例えば、アプタマーを、免疫ベースのアッセイにおいて抗体の代わりに使用することができる。本実施例は、アッセイ工程を通していかなる表面(基体、チューブ、フィルター、ビーズ、他の抗原など)にも結合せず、関心対象の抗原に特異的に結合するアプタマーを特定するアプタマースクリーニング法を提供する。アッセイは、最終的なアッセイの非標的抗原成分に結合するアプタマーを除去する、ネガティブ選択に依拠する。ネガティブ選択の後に、所望の抗原に結合するアプタマーを特定するポジティブ選択を行う。
1.ビーズのネガティブ選択ミックスを調製する:1200個の非磁気ビーズを、標準的なブロッキング剤と20分間インキュベーションする。
開始前に、当技術分野において公知の条件を用いて、関心対象のタンパク質バイオマーカー(SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEF)を望ましい非磁気マイクロビーズに結合させる。組み換え精製された出発材料には、以下が含まれた:Novus Biologicals (Littleton, CO, USA)、カタログ番号H00025803-P01のSPDEF組み換えタンパク質;Novus、カタログ番号H00003817-P02のKLK2組み換えタンパク質;Novus、カタログ番号H00006757-P01のSSX2組み換えタンパク質;Fitzgerald Industries International (Action, MA, USA)、カタログ番号30R-1382のPBP組み換えタンパク質;GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA)、カタログ番号GWB-E219ACのSSX4組み換えタンパク質。
1.3回目の洗浄(PBS-BN)後に、25μlの試料をフィルターの上部から1.5 mlチューブ中に収集した。
1.工程5)における最終的な洗浄後に、5μg/mlのストレプトアビジン-PEをアプタマー混合物に添加し、30分間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションした。
このラウンドを開始する前に、関心対象の抗原(SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEF)を、当技術分野において公知である方法を用いて、カルボキシル化磁気ビーズに結合させた。
上記の実施例における各ラウンドの選択後に、回収されたアプタマープールを、標準プロトコルのPCRを用いて増幅した。PCR産物を、本実施例に示されている方法論を用いて捕捉し、鎖分離した。
20μL/PCRのストレプトアビジン磁気ビーズ(Thermo Scientific, Rockford,IL, USA)を、磁石上に1分間置くことにより調製する。保存緩衝液を完全に除去する。PBS-Tで3回洗浄する。開始時と等容積のPBS-Tに再懸濁する。96ウェルプレート中のすべての関連するアプタマーのウェル(25/プレート)に、20μL/ウェルを分注する。
1.各試料を、1.7 mlエッペンドルフチューブ中に分注する。
本実施例においては、上記の実施例9〜10における技術を用いて特定されたEpCAMに対するアプタマーを特徴決定する。上述のようなEpCAM結合アプタマーのプールについての選択後に、Ion Torrent標準プロトコル(Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いてアプタマーライブラリーを配列決定した。リード候補を、(a)完全な期待される長さの産物でのすべての読み取り配列にわたる非常に高存在量のモチーフおよび(b)強い二次構造、を有するものとして選択した(図20B)。
アプタマーの特徴(サイズ、安定性、結合親和性、および特異性など)を、EpCAMまたは他の標的に特異的な対照アプタマーに対して比較することができる。例えば、アプタマーを、Kaur and Yung, 2012に記載されているような抗VEGFアプタマー:
と比較する。
本実施例は、上記に示されているアプタマーCAR016(SEQ ID NO: 230840)の最適化を実証する。CAR016は、上述のようないくつかのラウンドのEpCAMアプタマー選択において特定された最も優勢なアプタマーであった(実施例9を参照されたい)。上記に示されているようなその可変配列および共通モチーフを有する配列は、選択されたアプタマープールの50%より多くに相当していた。表15は、9ラウンドの選択後のIon Torrentプラットフォームを用いた2回の独立した配列決定試験(配列決定試験1および2)由来の、最も頻度が高いCAR016関連バリアントを示す。
本実施例においては、前立腺癌VCAP細胞株より流出した微小胞を認識するアプタマーを特定した。VCAP微小胞を、高結合表面を有する標準的なELISAプレート上にコーティングした。過剰な結合していない微小胞をウェルから洗浄した後に、ウェルをPluronic(登録商標)F-127(Sigma Aldrich)でブロッキングした。20nアプタマーライブラリー(表9を参照されたい)を、ウェル結合微小胞とインキュベーションした。結合していないアプタマーを除去するために、ウェルを洗浄した。残ったVCAP微小胞アプタマーを溶出し、精製し、増幅し、鎖分離し、かつ次のラウンドの前に清浄にした。上記の詳細な方法論を参照されたい。前の工程を、8ラウンド繰り返した。ラウンド8後に、選択されたアプタマープールを、IonTorrent配列決定に供した。
本実施例においては、ミクロスフェアに結合させたアプタマーを、上述のようなライブラリースクリーニング法により特定された2個のアプタマーの標的を決定することを手助けするために用いる。全般的なアプローチを、図14に示す。アプローチを、EpCAMを認識するライブラリースクリーニングにより特定されたアプタマーであるCAR029、およびVCAP微小胞の表面上の未知の標的を認識するライブラリースクリーニングにより特定されたアプタマーであるCAR024の標的を検証するために使用する。CAR029およびCAR024の両方については、上述を参照されたい。本アプローチにおいては、CAR029およびCAR024の配列を、ミクロスフェアへの連結の前にランダムに再配列させる。ミクロスフェアを、意図される標的分子に類似しているが同一ではない標的に結合する対照として、使用する。
本実施例においては、アプタマーライブラリーを、上記の実施例におけるような6ラウンドのポジティブ選択を用いて特定された、前立腺特異的膜抗原(PSMA/FOLH1/NAALADアーゼI)タンパク質に対するアプタマーについてスクリーニングする。上述のようなPSMA結合アプタマーのプールについての選択後に、アプタマーライブラリーを、Ion Torrent標準プロトコル(Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて配列決定した。リード候補を、以下のような特性について選択した:スクリーニングしたライブラリーにおける高頻度の出現、標的に対する親和性、標的に対する特異性、規定された分子構造、好みのコンフォメーションの存在、そのようなコンフォメーションの安定性、作業濃度で凝集の割合が全くないかまたは小さいこと、簡単なかつ再現性を有する合成および精製。
本明細書に記載されているように、アプタマーを関心対象の標的に対して特定することができる。本実施例においては、関心対象の標的に対するアプタマーを特定するために、競合的結合スキームを用いる。
本実施例は、タンパク質に結合する候補アプタマーを特定するために、タンパク質に対するアプタマーライブラリーをスクリーニングするプロトコルを提供する。プロトコルは、標的タンパク質を標的微小胞で置換することにより、微小胞に結合するアプタマー候補を特定するために使用することができる。微小胞に相当するためのプロトコル中の調整を、適切な場合に述べる。
1.精製されたタンパク質をDynabeads上に結合させる。
1.Dynabeads(登録商標)M-270 Carboxylic Acid(「ビーズ」)(Life Tech, 14305D)
a.MES(2[N-モルホリノ]エタンスルホン酸)(Sigma, M2933)
b.5N NaOH(1N NaOHに希釈)(Fisher, SS256-500)
a.PBS, pH 7.5(Sigma, P3813)
b.TWEEN(登録商標)20(Sigma, 9416)
a.例えば、Hisタグ-Epcam、C-ter Epcam、Hisタグ-PSMA、タグなし-FYN、タグなし-AMACR、タグなし-DBF4B
1.USA Scientificコポリマーポリプロピレン1.5 ml微量遠心分離機チューブ(USA Scientific, 1415-2500)
1.磁石:DynaMag(商標)-Spin Magnet(「磁石」)(Life Tech, 12320D)
工程1:標的タンパク質の結合
目的:占有されていない活性化部位をブロッキングするため、および選択中の非特異的なアプタマー結合を回避するために、磁気ビーズに標的タンパク質およびMA-PEGを同時に結合させること。
a.Vi-Cellバイアルにおいて14 ulのビーズを1386 ulの保存緩衝液に添加することにより、ビーズ:保存緩衝液の1:100希釈液を調製する。
b.希釈したビーズを、上下に数回ピペット操作することにより、十分に混合する。
c.700 ulの希釈したビーズを新たなVi-Cellバイアルに移す。
d.全細胞について二連のバイアルを読み取る。
e.全細胞数に工程19aにおける希釈係数(すなわち、100)を掛けることにより、ビーズ/ulの濃度を決定する。
f.濃度に工程18における再懸濁容積(すなわち、200 ul)を掛けることにより、結合後のビーズの全収量を決定する。
1.200 ulの1% PBS-Bを、Costarの平底非結合性プレートのウェルに添加する。
目的:親和性の成熟。
目的:個々のアプタマーコロニーを分離して、精製されたプラスミドを取得すること。
目的:限定された量の単一クローンssDNAを調製し、スクリーニング試験の準備をすること。
目的:標的および対照タンパク質に対する個々のアプタマークローン(ssDNA)の親和性(基準に基づいて陽性または陰性)を試験すること。
目的:標的に対する親和性のさらなる確認のために、アプタマー候補クローンからより多い量のssDNAを調製すること。
目的:選択されたクローンを定量的様式においてさらに評定すること。
目的:選択されたクローンから配列情報を取得すること。
本実施例は、上記の実施例において行われたSUL1 RNAライブラリー選択についてのプロトコルを提供する。プロトコルは、望ましいように、他のアプタマーライブラリーおよび試料投入に採り入れられ得る。
作業空間を、作業前に80% EtOHで清浄にする。
・MilliQ水
・100mM MgCl2
・5×転写緩衝液(200mMトリス pH 7.9)
・1×PBS
・3mM MgCl2を含む1×PBS
・10×PBS
・選択緩衝液(0.1% BSAおよび3mM MgCl2を含む1×PBS)
略語:TK−転写;NTC−鋳型なし対照。
1.第1ラウンド:1nmolの精製された2'F SUL1 RNAを、20μlの再懸濁されたビーズ(微小胞と結合させたもの)と混合する。10uLの10×PBS+1% BSA、3μl 100 mM MgCl2、および47uL H20。これにより、1×PBS、0.1% BSA、3mM MgCl2の終濃度になる。
1.1 この工程におけるMgCl2の添加により、3mM MgCl2の濃度になる。これは、プロセス全体のための結合濃度である。
1.2 その後のラウンド:20μlの転写産物(内部に15 mM MgCl2)を、20μlの洗浄された微小胞コーティングビーズ、加えて9uLの1% BSAを含む10×PBS、51uL H2Oと混合する。希釈された転写産物(TK)中のMgCl2が3mM MgCl2の終濃度を提供するため、追加のMgCl2は必要とされない。
2.30分間37℃でインキュベーションし、1000rpmで振盪し、10分毎にピペットで混合する。
3.ビーズを洗浄する:
3.1 1回の洗浄サイクルは以下を含む:
3.1.1 ビーズを磁石から取り外す。
3.1.2 ビーズを磁石から外して、100μlの1×PBS+3mM MgCl2に再懸濁する。
3.1.3 試料を磁石から外して、30秒間インキュベーションする。
3.1.4 試料を磁石上に戻して置き、ビーズが側面に寄るまで待つ。
3.1.5 上清を除去して廃棄する。
3.1.6 磁石から外して、100μlの1×PBS+3mM MgCl2+0.1% BSAに再懸濁する。
3.1.7 試料を磁石から外して、3分間インキュベーションする。
3.1.8 試料を磁石上に戻して置き、ビーズが側面に寄るまで待つ。
3.1.9 上清を除去して廃棄する。
3.2 第1ラウンド:ビーズ混合物を磁石上に置き、上清を除去する。100μlの1×PBS+3mM MgCl2+0.1% BSAで1回洗浄し(ビーズをピペットで混合することにより)、緩衝液を廃棄する。
3.3 その後のラウンド:洗浄工程を、1ラウンドおきに、1回多い洗浄工程により3回の洗浄工程まで増大させる。
4.55μlのMilliQ水をビーズ試料に添加する。
5.ビーズ試料を5分間80℃でインキュベーションすることにより、RNAを溶出する。
5.1 50μlあるかどうかを確認し、ない場合は、凝縮された水を上部から離してスピンダウンするために、試料をスピンする。
5.2 上清を新たなバイアルに移す。鎖がビーズに再結合することを回避するために素早く作業する。
5.2.1 その後のRT-PCRに50μlの溶出液を使用し、残りを-20℃で保存する。
実施の手引き
・RT-PCR試料およびTK-PCR試料の残りは、-20℃で保存する。
・RNAは、4℃で約1時間保存することができる。
・RT-PCR産物は、一晩4℃で保存することができる。
・最適なRNA品質のために、転写後直ちに次の選択サイクルに進む。
・RNAをボルテックスすることは回避する。
・氷上で混合する。
・0.5ml PCRチューブを使用する。
・すべてのRT-PCRは、鋳型の代わりに水を含む鋳型なし対照(NTC)を有する。
・DTTを、1回より多くは凍結融解しない。
6.第1ラウンドの前にマスターミックス(表21を参照されたい)を調製し、それを0.5 pmol RNAで確認し、48μlのアリコートを使用まで-20℃で保存する。
8.65℃で5分間、インキュベーションする。
9.4℃に冷却した後に、以下を添加する:
9.1 1μl Superscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen、カタログ番号18064)(200 U/μl)
9.2 1μl GoTaqFlexi DNA polymerase(5単位/μl)Promegaカタログ番号M8305。
a)10分、54℃
(この工程は、逆転写酵素のためだけであり、より多くのラウンドが必要とされる場合、工程Aは繰り返さない。)
b)1分、95℃
c)1分、60℃
d)1分、72℃
10.工程b〜dのサイクルを行う。
10.1 第1ラウンドはb〜dを4サイクル。5μLのPCR産物を4%アガロースゲル上で泳動する。
10.1.1 その後のラウンド:RNAの量は第1ラウンド後に減少し、必要とされるPCRサイクルの増大をもたらす。各々の時に必要とされるサイクルの回数を決定するために、前のラウンドの選択から、アガロースゲル由来のバンドの強度を確認する。その回数のサイクルを用いて、次のラウンドのRT-PCRを開始する。注意:常にアガロースゲル上の結果を確認する。
10.1.1.1 アガロースゲルの結果:産物のバンドが、標的の長さで見られるであろう。バンドの強度は、50bpラダーのバンドとほぼ同じであろう(同じでない場合は、少し強度が低い)。バンドが十分な強度ではない(かろうじて見える)場合は、適切な量より多くサイクルを行い、アガロースゲル上で再確認する。
すべての混合を氷上で行う。転写マスターミックス(表22)を調製し、85.7μlのアリコートを使用まで-20℃で保存する。
11.使用前に、ストックの200 mMトリス pH 7.9のpHを検証する。経時的なpHの変化は、転写で問題を引き起こす可能性がある。
13.1μlのRNasin(40単位/μl)を添加する。
13.1 Promega Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor カタログ番号N2515/N2511
14.4μlのT7 Y639F変異ポリメラーゼを添加する(25U/μl使用:反応当たり全部で100U)。
15.反応を30分間、37℃で行う。
16.転写産物を、次の選択ラウンドに直接使用する。次の工程が実行可能ではない場合は、転写産物を-20Cで凍結する。
ビーズのインキュベーション、RT-PCRおよび転写を、必要に応じてしばしば繰り返す。上述したように、すべてのラウンドにおいて試料について類似したバンド強度のRT-PCR産物を有するように努める。
癌で選択されたアプタマーの対照ビーズ(血漿超遠心分離由来の上清に結合させたもの、上記を参照されたい)への非特異的な結合を決定して評価するために、望ましいラウンドの選択後に結合アッセイを行い、同様に非癌対照試料についても行う。結合アッセイはまた、選択されたアプタマーの意図される標的微小胞に対する結合を評価するために行うこともできる。
1.-80℃冷凍庫から微小胞試料を取り出して、融解する。
2.ビーズを磁石上に置き(試料実験当たり200,000個)、ビーズ保存緩衝液を除去する。
3.1×PBS、3mM MgCl2緩衝液で各々1分間、1×200μLで洗浄する。1チューブ中に200,000個になるようにビーズをプールする。
4.ビーズを70μLの選択緩衝液に再懸濁する。(試料当たり10μlの10×PBS、1% BSA+3μL 100mM MgCl2+57μL H2O)。
5.30μLの放射性標識されたRNAアプタマーライブラリーを、それぞれの試料に添加する。
6.1000 rpmで振盪しながら、37℃で30分間インキュベーションする。
7.試料を磁石上に置く。
8.上清を除去して取っておく。
9.ビーズを、200μLの洗浄緩衝液1×PBS 3mM MgCl2 pH 7.4で、磁石から外して3分間インキュベーションし、洗浄する。
10.試料を磁石上に置き、洗浄溶液を除去して取っておく。
11.工程9、10を繰り返す。
12.100μLの水を試料に添加し、ピペットで混合する。
13.80℃で5分間、加熱する。
14.試料を磁石上に置き、上清を除去して取っておく。
15.ビーズを、100μLの水に再懸濁する。
16.シンチレーションカウンターを用いて、すべての画分の放射活性を測定する。
17.存在するバックグラウンド結合の量を解析する。
望ましいように、ネガティブ選択工程を、アプタマーライブラリーを標的微小胞に結合させたビーズとインキュベーションする前に追加する(すなわち、上記の「微小胞コーティング磁気ビーズへの2'F SUL1 RNAプールの結合」の手順)。ネガティブ選択は、微小胞を試料から濾過または沈降させた後の上清または投入試料(例えば、血漿)に結合させたビーズ(「非微小胞コーティングビーズ」、「微小胞枯渇試料」、または類似して呼ばれる)を用いて行うことができる。工程は、以下である。
本実施例においては、アプタマーライブラリーを、乳癌患者の血液中に循環している微小胞と、健康な対照個体(すなわち、乳癌を有していない)の血液中に循環している微小胞とを識別するアプタマーを特定するためにスクリーニングする。
である。アプタマーライブラリーは、3個のセクションからなる:フォワードプライマー- 15ヌクレオチド、可変領域- 40ヌクレオチド;リバースプライマー- 25ヌクレオチド。すべてのピリミジン(CおよびU)は、2'フルオロ修飾されていた。
本実施例においては、アプタマーライブラリーを、乳癌患者の血液中に循環している微小胞と、健康な対照個体(すなわち、乳癌を有していない)の血液中に循環している微小胞とを識別するアプタマーを特定するためにスクリーニングする。手順は、上記の実施例17〜19におけるものと同じ試料およびアプタマーライブラリーを使用する。ネガティブ選択を、第3ラウンドのポジティブ選択後に開始して、各ポジティブ選択の前に行う。
であり、配列中、N40は40個のランダムなヌクレオチドを意味する。アプタマーライブラリーは、3個のセクションからなる:フォワードプライマー- 15ヌクレオチド、可変領域- 40ヌクレオチド;リバースプライマー- 25ヌクレオチド。すべてのピリミジン(CおよびU)は、2'フルオロ修飾されていた。
本実施例は、増殖性疾患を診断するための本発明のアプタマーの使用を例証する。
本実施例は、マウスにおいて増殖性疾患を治療するための本発明のアプタマーの使用を例証する。
本実施例は、関心対象の表現型を示す微小胞を検出するためのアプタマープールの使用を例証する。方法は、関心対象の表現型を示す関心対象の標的に対して富化されているアプタマーのプールを使用する。本実施例における方法により、標的実体を優先的に認識するためのアプタマーのライブラリーの効率的な使用が可能になる。
1)未知の医学的語源を有する患者の試料(血漿、血清、尿、または任意の他の生物学的試料)を取得し、関心対象の標的の利用可能性を確実にするために、それに応じて前処理する(下記を参照されたい)。関心対象の標的が微小胞集団である場合は、微小胞を単離し、任意で、マイクロビーズなどの固体支持体につなげてもよい。
アプタマー-配列決定アッセイの目的を果たす4種の基本プロトコルが、現在存在する。試料は、任意の生物学的試料であることができる。
微小胞を単離するための、沈殿の2回の洗浄を伴う、1〜5 mlの体液試料(例えば、血漿/血清/尿)の超遠心分離(120K×g、スクロースなし)。
この代替的なプロトコルは、微小胞単離工程、ビーズへの微小胞の結合、または分離した分配工程を含まない。これは、投入試料に対するアプタマーの非特異的結合を示す可能性がある。
このプロトコルは、超遠心分離の代わりに濾過を使用し、より少ない時間および試料容積を必要とし得る。
微小胞を単離するための、沈殿の2回の洗浄を伴う、1〜5 mlの体液試料の超遠心分離(120K×g、スクロースなし)。
上記の実施例23における方法を、癌細胞に由来する体液試料において微小胞を検出するために使用する。微小胞は、癌細胞から流出したものであってもよい。アプタマーライブラリーは、非癌個体に対して癌患者由来の微小胞に優先的に結合する、上記の実施例18〜20に記載されているアプタマーのサブセットを含む。配列を、SEQ ID NO: 231032〜241535として本明細書で列挙する。方法を、癌を示す微小胞の有無を検出するために使用する。
古典的なアプタマー選択技術(すなわち、SELEX)は、典型的に、非標的分子(競合相手)での干渉が最小化されている「きれいな」条件において、特定の標的についてアプタマーを富化するために行われる。しかしながら、選択されたアプタマーについての種々の適用は、アプタマーが、多様な環境において、例えば、高存在量の潜在的干渉分子を伴う生物学的試料または組織培養培地において、その標的に結合するように働くことを必要としている。この場合には、選択プロセス中に存在しなかったそのような干渉分子が、理想的な条件において選択されたアプタマーによる標的に認識を干渉する可能性がある。本実施例は、標的に対して非常に特異的なアプタマーを選択するためにアプタマーライブラリーをスクリーニングし、かつまた、潜在的干渉分子を含む生物学的試料において行うことができるアプタマー選択プロセスを提供する。
→微小胞を、超遠心分離を用いて癌および正常の血漿試料から単離する。微小胞枯渇試料を構成する上清を、陰性対照試料として保存する。
→単離された微小胞を、磁気ビーズに捕捉/結合させる。
→上記由来の上清(すなわち、微小胞枯渇血漿)と混合された微小胞結合ビーズを用いて、アプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始する。上清にMgCl2を補給する。癌由来および正常(非癌由来)の微小胞についてのアプタマースクリーニングおよび選択を、並行して行うことができる。各ラウンドは、望ましいようにネガティブ選択およびポジティブ選択からなる。
→微小胞を、超遠心分離を用いて癌および正常の血漿試料から単離する。
→単離された癌由来の微小胞を、磁気ビーズに捕捉/結合させる。
→MgCl2を補給した正常微小胞(非結合)と混合された癌微小胞結合ビーズを用いて、アプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始する。アプタマースクリーニングおよび選択を、磁気ビーズで保持されているアプタマーのみを保持することにより、癌由来の微小胞のみについて行う。
→微小胞を、超遠心分離を用いて癌血漿試料から単離する。
→単離された癌由来の微小胞を、磁気ビーズに捕捉/結合させる。
→MgCl2を補給した正常血漿(非結合)と混合された癌微小胞結合ビーズを用いて、アプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始する。アプタマースクリーニングおよび選択を、磁気ビーズで保持されているアプタマーのみを保持することにより、癌微小胞のみについて行う。
→癌由来の微小胞を、磁気ビーズに捕捉/結合させる。
→正常(非癌)微小胞を、非磁気ビーズに捕捉/結合させる。
→両方のビーズセットを混合し、開始アプタマーライブラリーでアプタマースクリーニングおよび選択プロセスを行う。
→アプタマーライブラリーとのインキュベーション後に、磁気ビーズと非磁気ビーズとを分離する。磁石を用いて磁気ビーズを捕捉し、その後、遠心分離して非磁気ビーズを分離する。
→分離された磁気ビーズおよび非磁気ビーズを、別々に洗浄する。
→両方のタイプのビーズから別々に、アプタマーを溶出および再増幅する。
→ラウンド2:両方のタイプのビーズから増幅されたアプタマープールを混合し、混合されたビーズに添加する。
→上記を繰り返す。
当技術分野において公知であるブロッキング緩衝液は、一般的に、合成ペプチド、BSA、トリプシン処理されたタンパク質、またはランダムなDNAプール(合成もしくは天然、例えば、サケ精子DNA)の混合物を含む。これらの複合体混合物は、さらにそのブロッキング効果が、アッセイにおいて追加的な偽標的を提供し、それにより偽陽性を生じる可能性がある、分子を含有し得る。
。
アプタマーブロッキング候補のブロッキング特性を試験するために、以下の実験を行った。
以下の表25は、本発明の例証となるアプタマーを含む。アプタマーは、実施例26に記載されているアプタマーのプールの一部であり、特定されたブロッキングアプタマーの共通のプールの一部であった。表25に開示されているヌクレオチド配列は、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつカルボキシル官能基への結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。本明細書における任意の定義された数値単位の文脈において使用される際、「約」という用語は、その数値単位の10%上または下、およびその間のすべての単位の変動を意味する。
微小胞を、種々の方法を用いて基体に結合させることができる。本実施例においては、以下の3種の方法を、微小胞を基体に付加するために使用する:1)直接結合;2)脂質アンカリング;3)抗体結合;および4)アプタマー結合。図7A〜図7Dにおける概略図を参照されたい。図7Aは、カルボキシル化ミクロスフェアの小胞表面抗原に対する直接結合を示す。図7Bは、ビオチン官能化脂質アンカーを介した微小胞のミクロスフェアに対するアンカリングを示す。図7Cは、小胞表面抗原に対する抗体結合を示し、該抗体は、カルボキシル化ミクロスフェアに結合している。図7Dは、小胞表面抗原に対するアプタマー結合を示し、該アプタマーは、カルボキシル化ミクロスフェアに結合している。本実施例における方法により生成されたミクロスフェア付加微小胞を、上記の実施例に記載されているようにアプタマーライブラリーをスクリーニングするために、使用することができる。
下記のプロトコルを、タンパク質(例えば、抗体)または微小胞をカルボキシル化ミクロスフェア(MagPlex(登録商標)磁気ミクロスフェアまたはMicroPlex(登録商標)非磁気ミクロスフェア、Luminex Corporation, Austin, TX)に結合させるために使用する。
領域15:Luminex カタログ番号MC10015-01 ロット番号B28049 期限:2016/12/16
ミクロスフェアを、本手順を通して、光への長期の曝露から保護する。
1.ミクロスフェアと共に提供された製品情報シートに記載されている指示に従って、ストックのカップリングされていないミクロスフェア懸濁液を再懸濁する。
2.5.0×106個のストックのミクロスフェアを、USA Scientific微量遠心分離チューブに移す。タンパク質/ビーズの比:20μg/5×106個。4μg/106個まで縮小することができる。
3.チューブを磁気分離器中に置き、60秒間分離が起きるようにする。下記の技術注記1を参照されたい。
4.チューブを磁気分離器にまだ位置づけた状態で、上清を除去する。ミクロスフェアを乱さないように気をつける。
5.チューブを磁気分離器から取り外し、ミクロスフェアを100μL dH2Oに、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処理により再懸濁する。
6.チューブを磁気分離器中に置き、60秒間分離が起きるようにする。
7.チューブを磁気分離器にまだ位置づけた状態で、上清を除去する。ミクロスフェアを乱さないように気をつける。
8.チューブを磁気分離器から取り外し、洗浄されたミクロスフェアを80μLの100 mMリン酸二水素ナトリウム、pH 6.2に、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処理により再懸濁する。
9.10μLの50 mg/mLスルホ-NHS(dH2Oにおいて希釈)をミクロスフェアに添加し、ボルテックスにより穏やかに混合する。
10.10μLの50 mg/mL EDC(dH2Oにおいて希釈)をミクロスフェアに添加し、ボルテックスにより穏やかに混合する。
11.20分間室温で、10分間隔でのボルテックスにより穏やかな混合しながら、インキュベーションする。
12.チューブを磁気分離器中に置き、60秒間分離が起きるようにする。
13.チューブを磁気分離器にまだ位置づけた状態で、上清を除去する。ミクロスフェアを乱さないように気をつける。
14.チューブを磁気分離器から取り外し、ミクロスフェアを250μLの50 mM MES、pH 5.0に、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処理により再懸濁する。下記の技術注記2を参照されたい。
15.工程12および13を繰り返す。これは、合計で2回の50 mM MES、pH 5.0での洗浄である。
16.チューブを磁気分離器から取り外し、活性化されかつ洗浄されたミクロスフェアを100μLの50 mM MES、pH 5.0に、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処理により再懸濁する。
17.20μgのタンパク質または等価の微小胞を、再懸濁されたミクロスフェアに添加する。
18.総容積を50 mM MES、pH 5.0で500μLにする。注意: 106個のビーズの結合の場合には、この容積を縮小することができる。
19.カップリング反応をボルテックスにより混合する。
20.室温で混合(MixMate上で800 rpm)しながら、2時間インキュベーションする。
21.チューブを磁気分離器中に置き、60秒間分離が起きるようにする。
22.チューブを磁気分離器にまだ位置づけた状態で、上清を除去する。ミクロスフェアを乱さないように気をつける。
23.チューブを磁気分離器から取り外し、カップリングされたミクロスフェアを500μLのPBS-Tに、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処置により再懸濁する。下記の技術注記3を参照されたい。
24.室温で(回転により)混合しながら、30分間インキュベーションする。ミクロスフェアを同じ日に使用したため、この工程を行った。
25.チューブを磁気分離器中に置き、30〜60秒間分離が起きるようにする。
26.チューブを磁気分離器にまだ位置づけた状態で、上清を除去する。ミクロスフェアを乱さないように気をつける。
27.チューブを磁気分離器から取り外し、ミクロスフェアを1mLのPBS-TBNに、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処理により再懸濁する。技術注記4を参照されたい。
28.工程25および26を繰り返す。これは、合計で2回の1mL PBS-TBNでの洗浄である。
29.チューブを磁気分離器から取り外し、カップリングされかつ洗浄されたミクロスフェアを250 ul PBS-TBNに再懸濁する(100万個のビーズについては150ul、PBS-TBN)。
30.ミクロスフェア懸濁液を、vicellにより計数する。
アプタマーライブラリーの分配のための戦略には、以下が含まれる:(i)固体支持体に固定された標的(例えば、アガロース、ポリメチルメタクリラート、または常磁性ビーズ);(ii)ゲル移動度シフト;(iii)タンパク質と結合するがDNAと結合しないニトロセルロース膜;および(iv)キャピラリー電気泳動。癌特異的タンパク質に対するアプタマーを開発するために、これらのアプローチの各々は、典型的に、アプタマープールの「結合剤」および「非結合剤」集団への分配を可能にする様式で、固体支持体上に固定された、癌と関連している(少なくともいくらかの程度まで)ことが既知である組み換えタンパク質で始まる。これらのアプローチはさらに、以下を想定する:(i)タンパク質の化学的固定化はその構造およびコンフォメーションを改変する可能性があるが、組み換えタンパク質のフォールディングは、インサイチュの(例えば、組織または血液などの体液における)天然のタンパク質を表し得ること;ならびに(ii)所望の生物学的試料において他の成分との相互作用はないこと。従って、確認された癌を有する患者由来、および健康な個体由来の試料を用いて癌を検出するためのアプタマーを特定することおよび開発することは、課題のままである。本実施例は、アプタマー標的の事前の知識なしに癌を区別するアプタマーであって、標的がその天然の環境/コンフォメーションにおいて見出されるアプタマーの選択を可能にする、1つのそのようなアプローチを記載する。
本実施例は、癌患者および癌を有さない対照試料(例えば、「正常」)由来の微小胞を区別するために使用され得るアプタマーを選択する方法を示す。癌は、特定の系列の癌として選択され得る。追加的な層の複雑性を提供するために、対照は、種々の病理群(例えば、選択された癌以外の条件について陽性)に分割され得る。方法は、癌由来の微小胞に結合するが、対照微小胞には結合しないアプタマーメンバーについて、アプタマーライブラリーを富化する。
本明細書に記載されているように、微小胞の検出および特徴決定のための標準的な方法は、ウエスタンブロット、動的光散乱、フローサイトメトリー、および電子顕微鏡法を含む。上述のように、微小胞を、マイクロビーズに結合させた抗体により捕捉し、フローベースのマイクロビーズアッセイにおいて別の標識抗体で検出することができる。実施例28を参照されたい。本免疫アッセイにおいてビーズ上に捕捉された微小胞の存在を確認するために、電子顕微鏡法を使用することができる。本実施例は、ミクロスフェア上に結合または免疫沈降された微小胞を画像化するための、免疫金標識を伴う電子顕微鏡法を提供する。
出発材料は、MicroPlexビーズに直接結合させた微小胞試料を含む。全般的な方法論については、実施例28を参照されたい。
上記のプロトコルに従ったビーズ結合微小胞の画像化を、図12A〜図12Eに示す。
実施例31の方法を、関心対象の微小胞抗原に結合するアプタマーを特定するために行う。抗テトラスパニン抗体をマイクロビーズにつなぎ、前立腺癌患者からの血漿試料由来のcMVとインキュベーションする。捕捉されたcMVは、実施例31の方法における被分析物として働く。アプタマー候補を、表26中の抗体を用いて、微小胞から解離させる。
Claims (366)
- (a)表18に記載される、SEQ ID NO: 230900〜230903、230908、230913〜230927、もしくは任意の上記配列の可変配列;または(b)任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、微小胞に結合するアプタマー。
- SEQ ID NO: 230900〜230903、230908、230913〜230927、またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、請求項1記載のアプタマー。
- 前記機能的断片が、表18に示される「可変配列」領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載のアプタマー。
- 微小胞が前立腺癌細胞から流出したものである、前記請求項のいずれか一項記載のアプタマー。
- (a)表23に記載される、SEQ ID NO: 231018〜231031もしくはそれらの可変配列;(b)表24に記載される、SEQ ID NO: 231032〜231051もしくはそれらの可変配列;(c)SEQ ID NO: 231032〜241535;または(d)任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、微小胞に結合するアプタマー。
- SEQ ID NO: 231018〜231031またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、請求項5記載のアプタマー。
- SEQ ID NO: 231032〜231051またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、請求項5記載のアプタマー。
- 前記機能的断片が、表23〜24のいずれかに示される「可変配列」領域を含む、請求項5〜7のいずれか一項記載のアプタマー。
- 微小胞が乳癌細胞から流出したものである、請求項5〜8のいずれか一項記載のアプタマー。
- (a)SEQ ID NO: 1〜230810;(b)表11、12、13、15に記載される、SEQ ID NO: 230822〜230899、230904〜230907、230909〜230911、もしくは任意のそれらの可変配列;または(c)任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、上皮細胞接着分子(EpCAM)タンパク質に結合するアプタマー。
- アプタマー4 ($$SEQ ID NO: 1)、オリゴ6 (SEQ ID NO: 230810)、オリゴ4B (SEQ ID NO: 183132)、CAR003 (SEQ ID NO: 230822またはSEQ ID NO: 230823)、CAR016 (SEQ ID NO: 230840)、またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、請求項10記載のアプタマー。
- 表5、6、7、8、11、12、13、15、16、またはそれらの機能的断片のいずれかに由来する、請求項10記載のアプタマー。
- 前記機能的断片が、表11、12、13、15のいずれかに示される「可変配列」領域、またはそれらの機能的断片を含む、請求項10〜12のいずれか一項記載のアプタマー。
- インビトロでのEpCAMシグナル伝達を調節する、請求項10〜13のいずれか一項記載のアプタマー。
- (a)表20に記載される、SEQ ID NO: 230932〜230935もしくはそれらの可変配列;または(b)任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、前立腺特異的膜抗原(PSMA)タンパク質に結合するアプタマー。
- 少なくとも1つの化学修飾を含むようにさらに改変されている、前記請求項のいずれか一項記載のアプタマー。
- 前記修飾が、核酸の、糖位置での化学的置換;リン酸位置での化学的置換;および塩基位置での化学的置換からなる群より選択される、請求項16記載のアプタマー。
- 前記修飾が、ビオチン化、蛍光標識の取り込み、修飾ヌクレオチドの取り込み、3'キャッピング、アミンリンカーへの結合、高分子量の非免疫原性化合物への結合、親油性化合物への結合、薬物への結合、細胞傷害性部分への結合、および放射性同位体を用いた標識からなる群より選択される、請求項16記載のアプタマー。
- ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、前記アプタマーの5'末端に結合している、請求項18記載のアプタマー。
- ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、前記アプタマーの3'末端に結合している、請求項18記載のアプタマー。
- 細胞傷害性部分がナノ粒子中に封入されている、請求項18記載のアプタマー。
- ナノ粒子が、リポソーム、デンドリマー、および櫛形ポリマーからなる群より選択される、請求項21記載のアプタマー。
- 細胞傷害性部分が小分子の細胞傷害性部分を含む、請求項18記載のアプタマー。
- 小分子の細胞傷害性部分が、ビンブラスチンヒドラジド、カリチアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、ツブリシン、ドラスタチン-10、ドラスタチン-15、アウリスタチンE、リゾキシン、エポチロンB、エポチロンD、タキソイド、メイタンシノイド、ならびにそれらの任意のバリアントおよび誘導体からなる群より選択される、請求項23記載のアプタマー。
- 放射性同位体が、イットリウム-90、インジウム-111、ヨウ素-131、ルテチウム-177、銅-67、レニウム-186、レニウム-188、ビスマス-212、ビスマス-213、アスタチン-211、およびアクチニウム-225からなる群より選択される、請求項18記載のアプタマー。
- 細胞傷害性部分がタンパク毒素である、請求項18記載のアプタマー。
- タンパク毒素が、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス外毒素Aからなる群より選択される、請求項26記載のアプタマー。
- 非免疫原性の高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項18記載のアプタマー。
- ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項28記載のアプタマー。
- γ線放出放射性同位体によって標識されている、請求項16記載のアプタマー。
- 活性物質が前記アプタマーに結合している、請求項16記載のアプタマー。
- 活性物質が治療物質または診断物質を含む、請求項31記載のアプタマー。
- 治療物質または診断物質が、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物学的活性物質、生物学的分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン系抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブチル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトセシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、ラパマイシン(シロリムス)、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタクセル、パミドロナート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、トランスプラチナ(transplatinum)、抗血管内皮成長因子化合物(「抗VEGF」)、抗上皮細胞成長因子受容体化合物(「抗EGFR」)、5-フルオロウラシルおよび誘導体、放射性核種、ポリペプチド毒素、アポトーシス誘導物質、治療増感物質、酵素またはその活性断片、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される治療物質である、請求項31〜32のいずれか一項記載の方法。
- 治療的有効量の請求項1〜33のいずれか一項記載のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
- それを必要とする対象に請求項34記載の組成物を投与する工程を含む、疾患または障害を治療するかまたは寛解させる方法。
- 対象に治療的有効量の前記組成物を投与する工程が以下をもたらす、請求項35記載の方法:
(a)活性物質単独の送達と比較した、疾患部位への活性物質の送達の増大;または(b)微小胞クリアランスの増大による、アプタマーの標的となる微小胞の血中濃度の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下;または(c)該アプタマーの標的となる微小胞の生物活性の、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下。 - 微小胞の生物活性が、免疫抑制または遺伝情報の伝達を含む、請求項36記載の方法。
- 疾患または障害が、新生物性の、増殖性の、または炎症性の疾患または障害を含む、請求項35〜37のいずれか一項記載の方法。
- 治療的有効量の請求項26記載のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
- 前記請求項のいずれか一項記載のアプタマーまたはその薬学的組成物を含む、キット。
- 請求項1〜33のいずれか一項記載のアプタマーを生物学的試料と接触させる工程および該生物学的試料中の微小胞に対する該アプタマーの結合の有無を検出する工程を含む、方法。
- 生物学的試料が血液または血液成分を含む、請求項41記載の方法。
- アプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、請求項41記載の方法。
- 基体がビーズを含む、請求項43記載の方法。
- アプタマーが、検出可能な標識に結合している、請求項41記載の方法。
- 微小胞集団を含有することが疑われる生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する方法であって、該生物学的試料を、微小胞集団に特異的な1種または複数種の結合物質および請求項1〜33のいずれか一項記載の1種または複数種のアプタマーと接触させる工程、ならびに、該1種または複数種の結合物質および該1種または複数種のアプタマーの両方によって認識された微小胞を検出する工程であって、それによって該生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する、工程を含む、方法。
- 生物学的試料が、組織試料、細胞培養物、または体液を含む、請求項46記載の方法。
- 体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、請求項47記載の方法。
- 体液が、血液、血清、または血漿を含む、請求項47記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質が、表3、表4、およびそれらの組み合わせから選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、請求項46記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質が、表26中の標的から選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、請求項46記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質が、EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP、KLK2、SSX2、SSX4、PBP、SPDEF、EGFR、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、請求項46記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質が、EGFR、PBP、EpCAM、KLK2、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、請求項46記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質が、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、請求項46記載の方法。
- 1種または複数種のアプタマーが、検出可能な標識に結合している、請求項54記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質が、検出可能な標識に結合している、請求項46記載の方法。
- 1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、請求項56記載の方法。
- 1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、請求項46記載の方法。
- 1種または複数種のアプタマーが、検出可能な標識に結合している、請求項46記載の方法。
- 生物学的試料中の微小胞集団の存在またはレベルを検出する工程が、疾患の診断、予後判定、またはセラノーシス(theranosis)を提供する、請求項46〜59のいずれか一項記載の方法。
- 疾患が癌を含む、請求項60記載の方法。
- 癌が、急性リンパ芽球性白血病;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;AIDS関連癌;AIDS関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;膀胱癌;脳幹神経膠腫;脳腫瘍(脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む);乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;原発不明癌;カルチノイド腫瘍;原発不明癌腫;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;子宮頸癌;小児癌;脊索腫;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;内分泌膵島細胞腫瘍;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;鼻腔神経芽細胞腫;ユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝臓外胆管癌;胆嚢癌;胃癌;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質細胞腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;毛様細胞性白血病;頭頸部癌;心臓癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;眼内黒色腫;膵島腫瘍;カポジ肉腫;腎臓癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇癌;肝臓癌;肺癌;悪性線維性組織球腫;骨癌;髄芽腫;髄上皮種;黒色腫;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄増殖性腫瘍;鼻腔癌;鼻咽頭癌;神経芽細胞腫;非ホジキンリンパ腫;非黒色腫皮膚癌;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔癌;口腔咽頭癌;骨肉腫;その他の脳および脊髄の腫瘍;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;乳頭腫症;副鼻腔癌;副甲状腺癌;骨盤癌;陰茎癌;咽頭癌;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫;下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫;原発性肝細胞肝癌;前立腺癌;直腸癌;腎臓癌;腎細胞(腎臓)癌;腎細胞癌;気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺癌;セザリー症候群;小細胞肺癌;小腸癌;軟部組織肉腫;扁平上皮癌;頸部扁平上皮癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫;精巣癌;咽喉癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺癌;移行上皮癌;腎盂尿管移行上皮癌;絨毛性腫瘍;尿管癌;尿道癌;子宮癌;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍を含む、請求項61記載の方法。
- 癌が前立腺癌を含む、請求項61記載の方法。
- 癌が乳癌を含む、請求項61記載の方法。
- (a)生物学的試験試料を、請求項1〜33のいずれか一項記載の1種または複数種のアプタマーと接触させる工程;
(b)工程(a)で形成された、該生物学的試験試料における1種または複数種のアプタマーと該1種または複数種のアプタマーに結合された標的との間の複合体の存在またはレベルを検出する工程;および
(c)工程(b)で検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料に由来する参照レベルと比較する工程であって、それによって疾患または障害を特徴決定する、工程
を含む、疾患または障害を特徴決定する方法。 - 生物学的試験試料および生物学的対照試料がそれぞれ、組織試料、細胞培養物、または生物学的流体を含む、請求項65記載の方法。
- 生物学的流体が体液を含む、請求項66記載の方法。
- 体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、請求項67記載の方法。
- 体液が、血液、血清、または血漿を含む、請求項67記載の方法。
- 生物学的流体が微小胞を含む、請求項66記載の方法。
- 1種または複数種のアプタマーがポリペプチドまたはその断片に結合する、請求項65記載の方法。
- ポリペプチドまたはその断片が可溶性であるか膜結合性である、請求項65記載の方法。
- ポリペプチドまたはその断片が表3または表4のバイオマーカーを含む、請求項65記載の方法。
- 1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合する、請求項65または70記載の方法。
- 特徴決定が、疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを含む、請求項65〜74のいずれか一項記載の方法。
- 疾患または障害が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、および/または疼痛を含む、請求項75記載の方法。
- 疾患または障害が癌を含む、請求項75記載の方法。
- 癌が、急性リンパ芽球性白血病;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;AIDS関連癌;AIDS関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;膀胱癌;脳幹神経膠腫;脳腫瘍(脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む);乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;原発不明癌;カルチノイド腫瘍;原発不明癌腫;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;子宮頸癌;小児癌;脊索腫;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;内分泌膵島細胞腫瘍;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;鼻腔神経芽細胞腫;ユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝臓外胆管癌;胆嚢癌;胃癌;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質細胞腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;毛様細胞性白血病;頭頸部癌;心臓癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;眼内黒色腫;膵島腫瘍;カポジ肉腫;腎臓癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇癌;肝臓癌;肺癌;悪性線維性組織球腫;骨癌;髄芽腫;髄上皮種;黒色腫;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄増殖性腫瘍;鼻腔癌;鼻咽頭癌;神経芽細胞腫;非ホジキンリンパ腫;非黒色腫皮膚癌;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔癌;口腔咽頭癌;骨肉腫;その他の脳および脊髄の腫瘍;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;乳頭腫症;副鼻腔癌;副甲状腺癌;骨盤癌;陰茎癌;咽頭癌;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫;下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫;原発性肝細胞肝癌;前立腺癌;直腸癌;腎臓癌;腎細胞(腎臓)癌;腎細胞癌;気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺癌;セザリー症候群;小細胞肺癌;小腸癌;軟部組織肉腫;扁平上皮癌;頸部扁平上皮癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫;精巣癌;咽喉癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺癌;移行上皮癌;腎盂尿管移行上皮癌;絨毛性腫瘍;尿管癌;尿道癌;子宮癌;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍を含む、請求項77記載の方法。
- 癌が前立腺癌を含む、請求項77記載の方法。
- 癌が乳癌を含む、請求項77記載の方法。
- 請求項41〜80のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキット。
- 請求項41〜80のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬の使用。
- 試薬が請求項1〜33のいずれか一項記載のアプタマーを含む、請求項81記載のキットまたは請求項82記載の使用。
- 生物学的試料中に存在する複数の標的に結合することが可能な、SEQ ID NO: 1〜230810、230811〜230899、230900〜230927、または231018〜241535から選択される複数種のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
- SEQ ID NO: 1〜230810、230811〜230899、230900〜230927、または231018〜241535から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
- SEQ ID NO: 231018〜241535に列挙されるオリゴヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000個、または全てを含む、請求項84または85記載の組成物。
- SEQ ID NO: 1〜230810に列挙されるオリゴヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000個、または全てを含む、請求項84または85記載の組成物。
- 生物学的試料中に存在する複数の標的に結合することが可能な、表23〜24のいずれかに記載される1種または複数種のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
- 表23〜24のいずれかに列挙される1種または複数種のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
- 表23または表24に列挙される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20種のオリゴヌクレオチドを含む、請求項88または89記載の組成物。
- 微小胞試料を、該微小胞試料中に存在する1種または複数種の標的に結合することが可能な複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、該試料の状態を特徴決定することが事前に確認されている、該試料との複合体を形成するオリゴヌクレオチドセットを特定する工程であって、それによって試料の状態を特徴決定する、工程を含む、試験試料の状態を特徴決定するための方法。
- (a)微小胞試料を複数種のオリゴヌクレオチドと接触させ、該微小胞試料との複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを単離する工程、
(b)工程(a)で微小胞試料との複合体を形成したオリゴヌクレオチドそれぞれの配列および/またはコピー数を決定する工程であって、それによって試験試料に結合したオリゴヌクレオチドのセットを特定する、工程
を含む、試験試料に結合したオリゴヌクレオチドのセットを特定するための方法。 - 微小胞試料を、非癌試料に由来する微小胞と比較して癌試料に由来する微小胞との複合体を優先的に形成することが事前に確認されている複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、癌性であるとしてまたは癌性になりやすいとして試料を診断する方法。
- 特定する工程が、全てもしくは一部のオリゴヌクレオチドの配列決定、全てもしくは一部のオリゴヌクレオチドの増幅、および/またはアレイに対する全てもしくは一部のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実施することを含む、請求項91記載の方法。
- 一段階または複数段階のポジティブ選択またはネガティブ選択を通して複数種のオリゴヌクレオチドが事前に選択され、ポジティブ選択が、試験試料と比較して実質的に類似した特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含み、ネガティブ選択が、試験試料と比較して実質的に異なる特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含む、請求項92または93記載の方法。
- 工程(b)が、ハイスループット配列決定、増幅、またはアレイに対するハイブリダイゼーションを実施することを含む、請求項92記載の方法。
- 試料が、癌を有することまたは有しやすいことが疑われる対象に由来する、請求項92記載の方法。
- (a)生物学的試験試料を複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程;
(b)工程(a)で形成された、複数種のオリゴヌクレオチドのメンバーそれぞれと生物学的試験試料との間の複合体の存在またはレベルを検出する工程;および
(c)工程(b)で検出された存在またはレベルを参照レベルと比較する工程であって、それによって疾患または障害を特徴決定する、工程
を含む、疾患または障害を特徴決定する方法。 - 生物学的試験試料および生物学的対照試料がそれぞれ、組織試料、細胞培養物、または生物学的流体を含む、請求項98記載の方法。
- 生物学的流体が体液を含む、請求項99記載の方法。
- 体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、請求項100記載の方法。
- 体液が、血液、血清、または血漿を含む、請求項100記載の方法。
- 生物学的流体が微小胞を含む、請求項99記載の方法。
- 生物学的試験試料を、微小胞の単離前に複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる、請求項103記載の方法。
- 生物学的試験試料が、単離された微小胞を含む、請求項103記載の方法。
- 1種または複数種のアプタマーがポリペプチドまたはその断片に結合する、請求項98記載の方法。
- ポリペプチドまたはその断片が可溶性であるか膜結合性である、請求項98記載の方法。
- ポリペプチドまたはその断片が表3または表4のバイオマーカーを含む、請求項98記載の方法。
- 1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合する、請求項98または108記載の方法。
- 特徴決定が、疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを含む、請求項98〜109のいずれか一項記載の方法。
- 疾患または障害が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛を含む、請求項110記載の方法。
- 状態が疾患または障害である、請求項91記載の方法。
- 状態が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、および/または疼痛を含む、請求項91記載の方法。
- 複数種のオリゴヌクレオチドが、正常細胞から流出した微小胞よりも、罹患細胞から流出した微小胞に優先的に結合することが可能である、請求項92記載の方法。
- 罹患細胞が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛に関連する、請求項114記載の方法。
- 癌が、急性リンパ芽球性白血病;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;AIDS関連癌;AIDS関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;膀胱癌;脳幹神経膠腫;脳腫瘍(脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む);乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;原発不明癌;カルチノイド腫瘍;原発不明癌腫;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;子宮頸癌;小児癌;脊索腫;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;内分泌膵島細胞腫瘍;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;鼻腔神経芽細胞腫;ユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝臓外胆管癌;胆嚢癌;胃癌;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質細胞腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;毛様細胞性白血病;頭頸部癌;心臓癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;眼内黒色腫;膵島腫瘍;カポジ肉腫;腎臓癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇癌;肝臓癌;肺癌;悪性線維性組織球腫;骨癌;髄芽腫;髄上皮種;黒色腫;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄増殖性腫瘍;鼻腔癌;鼻咽頭癌;神経芽細胞腫;非ホジキンリンパ腫;非黒色腫皮膚癌;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔癌;口腔咽頭癌;骨肉腫;その他の脳および脊髄の腫瘍;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;乳頭腫症;副鼻腔癌;副甲状腺癌;骨盤癌;陰茎癌;咽頭癌;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫;下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫;原発性肝細胞肝癌;前立腺癌;直腸癌;腎臓癌;腎細胞(腎臓)癌;腎細胞癌;気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺癌;セザリー症候群;小細胞肺癌;小腸癌;軟部組織肉腫;扁平上皮癌;頸部扁平上皮癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫;精巣癌;咽喉癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺癌;移行上皮癌;腎盂尿管移行上皮癌;絨毛性腫瘍;尿管癌;尿道癌;子宮癌;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍を含む、請求項97、111、113、または115記載の方法。
- 前癌状態がバレット食道を含む、請求項111、113、または115記載の方法。
- 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス(SLE)、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、強直性脊椎炎 シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む、請求項111、113、または115記載の方法。
- 心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞、または血栓性事象を含む、請求項111、113、または115記載の方法。
- 神経疾患が、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病(HD)、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス(NPSLE)、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイスラー-シャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害(例えば脳卒中)、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群を含む、請求項111、113、または115記載の方法。
- 疼痛が、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む、請求項111、113、または115記載の方法。
- 感染症が、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む、請求項111、113、または115記載の方法。
- 複数種のオリゴヌクレオチドが請求項84〜90のいずれか一項記載の組成物を含む、請求項91〜122のいずれか一項記載の方法。
- (a)微小胞試料を用いて、複数種のオリゴヌクレオチドの少なくとも1回の(i)ネガティブ選択または(ii)1回のポジティブ選択を実施する工程;
(b)複数種のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを提供するために、オリゴヌクレオチドのセットを取得する工程であって、複数種のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合せず、かつ複数種のオリゴヌクレオチドのポジティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合する、工程;
(c)ネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを試験試料と接触させる工程;
(d)複数種の溶離オリゴヌクレオチドを提供するために、該試験試料に結合したオリゴヌクレオチドを溶離する工程;および
(e)該複数種の溶離オリゴヌクレオチドのメンバーの配列および/またはコピー数を特定するために、該複数種の溶離オリゴヌクレオチドのハイスループット配列決定を実施する工程
を含む、ハイスループット配列決定を実施する方法。 - (a)標的試料との複合体を形成することが事前に確認されているオリゴヌクレオチドのセットを提供するために、試料用の複数種のオリゴヌクレオチドを富化する工程;
(b)オリゴヌクレオチドと試験試料との複合体を形成させるために、工程(a)の複数種を試験試料と接触させる工程;
(c)オリゴヌクレオチドの回収されたサブセットを提供するために、工程(b)で複合体を形成したオリゴヌクレオチドを回収する工程;および
(d)ハイスループット配列決定、増幅、またはハイブリダイゼーションによって、該オリゴヌクレオチドの回収されたサブセットのプロファイリングを行う工程であって、それによって試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを特定する、工程
を含む、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを特定するための方法。 - 試験試料が複数種の微小胞を含む、請求項125記載の方法。
- オリゴヌクレオチドが、RNA、DNA、または両方を含む、請求項125記載の方法。
- 少なくとも90%の配列同一性を含むオリゴヌクレオチドのサブセットを特定するためにインフォマティクス解析を実施する工程をさらに含む、請求項125記載の方法。
- 請求項91〜128のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキット。
- 請求項91〜80のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬の使用。
- 試薬が請求項84〜90のいずれか一項記載のアプタマーを含む、請求項129記載のキットまたは請求項130記載の使用。
- 生物学的試験試料をアプタマー分子のプールと接触させる工程、該プールを対照生物学的試料または参照生物学的試料に接触させる工程、該試験試料中の成分に結合するが対照試料にも参照試料にも結合しない1種または複数種のアプタマーを特定する工程であって、それによって生物学的試験試料についてのアプタマープロファイルを特定する、工程を含む、生物学的試料についての標的特異的アプタマープロファイルを特定する方法。
- (a)生物学的対照試料をオリゴヌクレオチドのプールと接触させる工程;
(b)該生物学的対照試料に結合しない、該オリゴヌクレオチドのプールの第1のサブセットを単離する工程;
(c)生物学的試験試料を、該オリゴヌクレオチドのプールの第1のサブセットと接触させる工程;および
(d)該生物学的試験試料に結合する、該オリゴヌクレオチドのプールの第2のサブセットを単離する工程であって、それによってアプタマーのプールを選択する、工程
を含む、アプタマーのプールを選択する方法。 - オリゴヌクレオチドのプールが少なくとも107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、または少なくとも1018種類のオリゴヌクレオチドを含む、請求項133記載の方法。
- 工程(a)〜(d)が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回、または少なくとも20回繰り返され、各反復において、工程(d)で選択されたアプタマーのプールが工程(a)でのオリゴヌクレオチドのプールとして使用される、請求項133記載の方法。
- 生物学的試験試料および生物学的対照試料が微小胞を含む、請求項133記載の方法。
- 生物学的試験試料および任意で生物学的対照試料が体液を含む、請求項133記載の方法。
- 体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性体液(malignant fluid)、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、または他の洗浄液を含む、請求項137記載の方法。
- 生物学的試験試料および任意で生物学的対照試料が細胞培地を含む、請求項133記載の方法。
- 生物学的試験試料が罹患試料を含み、かつ生物学的対照試料が非罹患試料を含む、請求項133記載の方法。
- (a)アプタマーのプールを第1の試料由来の微小胞の集団に接触させる工程;
(b)第1の試料由来の微小胞の集団に対する親和性を示すアプタマーのサブプールを富化する工程;
(c)該サブプールを第2の試料由来の微小胞の第2の集団に接触させる工程;および
(d)第2の試料由来の微小胞の第2の集団に対する親和性を示すアプタマーの第2のサブプールを枯渇させる工程であって、それによって第1の試料由来の微小胞の集団に対する優先的親和性を有するアプタマーの群を選択する、工程
を含む、アプタマーの群を選択する方法。 - 第1の試料および/または第2の試料が生物学的流体を含み、任意で、該生物学的流体が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性体液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、または他の洗浄液を含む、請求項141記載の方法。
- 第1の試料および/または第2の試料それぞれが、プールされた試料を含む、請求項141記載の方法。
- 工程(a)〜(d)が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回繰り返され、各反復において、工程(d)で選択されたアプタマーの群が工程(a)でのアプタマーのプールとして使用される、請求項141記載の方法。
- 第1の試料および/または第2の試料が、工程(a)〜(d)の繰り返しの前に別の試料と置き換えられる、請求項141記載の方法。
- 選択されたアプタマーの群のメンバーを特定する工程をさらに含み、任意で、該特定する工程がハイスループット配列決定によって実施される、請求項141記載の方法。
- 第1の試料が罹患試料を含み、かつ第2の試料が対照試料を含み、任意で、該対照試料が非罹患試料である、請求項141記載の方法。
- (a)アプタマー候補のプールを、標的分子を含む試料に接触させる工程;
(b)結合していないアプタマー候補を取り除く工程;
(c)該試料を、該標的分子に対するリガンドと接触させる工程;および
(d)該リガンドとの競合によって該標的分子から分離したアプタマー候補を単離する工程であって、それによって該リガンドと同じ標的に結合するアプタマーの群を選択する、工程
を含む、アプタマーの群を選択する方法。 - 標的分子がタンパク質を含む、請求項148記載の方法。
- タンパク質が微小胞表面抗原である、請求項149記載の方法。
- 標的分子が基体につながれている、請求項148記載の方法。
- 標的分子が微小胞の表面抗原であり、かつ該微小胞が基体につながれている、請求項148記載の方法。
- リガンドが小分子またはタンパク質を含む、請求項148記載の方法。
- リガンドが抗体を含む、請求項153記載の方法。
- 工程(a)〜(d)が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回繰り返され、各反復において、工程(d)で単離されたアプタマー候補が工程(a)に投入されるアプタマー候補のプールとして使用される、請求項148記載の方法。
- 選択されたアプタマーの群のメンバーを特定する工程をさらに含み、任意で、該特定する工程がハイスループット配列決定によって実施される、請求項148記載の方法。
- 第1の試料が罹患試料を含み、かつ第2の試料が対照試料を含み、任意で、該対照試料が非罹患試料である、請求項148記載の方法。
- 関心対象の標的に結合する1種または複数種のアプタマーを選択する方法であって、
(a)標的枯渇生物学的試料を形成するために、標的を第1の生物学的試料から分離する工程;
(b)分離した標的を基体につなげる工程;
(c)つながれた標的を、干渉生物学的試料と混合する工程;
(d)(c)からの混合物を出発アプタマーライブラリーと接触させる工程;および
(e)該つながれた標的に優先的に結合するアプタマーライブラリーのメンバーを回収する工程であって、それによって、該標的に結合する1種または複数種のアプタマーを選択する、工程
を含む、方法。 - 基体がビーズまたは平面を含む、請求項158記載の方法。
- 干渉生物学的試料が、(a)からの標的枯渇生物学的試料を含む、請求項158記載の方法。
- 標的が微小胞を含む、請求項158記載の方法。
- 標的が関心対象の微小胞を含み、干渉生物学的試料が非標的微小胞を含む、請求項158記載の方法。
- 工程(c)の前に、非標的微小胞が、標的微小胞と異なる基体につながれている、請求項158記載の方法。
- 基体が磁気ビーズを含み、かつ異なる基体が非磁気ビーズを含むか、または基体が非磁気ビーズを含み、かつ異なる基体が磁気ビーズを含む、請求項158記載の方法。
- 第1の生物学的試料および/または干渉生物学的試料が体液を含み、任意で、生物学的流体が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性体液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、または他の洗浄液を含む、請求項158記載の方法。
- 第1の生物学的試料が罹患試料を含み、かつ干渉生物学的試料が非罹患試料を含む、請求項158記載の方法。
- 第1の生物学的試料が非罹患試料を含み、かつ干渉生物学的試料が罹患試料を含む、請求項158記載の方法。
- (a)参照微小胞集団を、1種または複数種の微小胞表面マーカーに結合することが可能な複数種のリガンドと接触させる工程;
(b)該参照微小胞集団に対する親和性を有しない複数種のリガンドのサブセットを含む複数種の参照リガンドを単離する工程;
(c)1種または複数種の試験微小胞を、該複数種の参照リガンドと接触させる工程;および
(d)該複数種の参照リガンドから、該1種または複数種の試験微小胞上の表面マーカーとの複合体を形成するリガンドのサブセットを特定する工程であって、それによって該複数種の標的リガンドを特定する、工程
を含む、複数種の標的リガンドを特定するための方法。 - 標的微小胞の表面マーカーを特定する工程をさらに含む、請求項168記載の方法。
- 複数種のリガンドがアプタマーおよび/または抗体を含む、請求項168記載の方法。
- (a)候補アプタマーのプールを、関心対象の標的を含まない1種または複数種のアッセイ成分と接触させる工程;
(b)(a)で1種または複数種のアッセイ成分に結合しない該候補アプタマーのプールのメンバーを回収する工程;
(c)1種または複数種の交絡する(confounding)標的の存在下で、工程(b)で回収された候補アプタマーのプールのメンバーを関心対象の標的と接触させる工程;および
(d)工程(c)で関心対象の標的に結合する候補アプタマーを回収する工程であって、それによって関心対象の標的に特異的なアプタマーを特定する、工程
を含む、関心対象の標的に特異的なアプタマーを特定する方法。 - 工程(c)が実施される前に、工程(a)〜(b)が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回、または少なくとも20回繰り返される、請求項171記載の方法。
- 関心対象の標的に特異的なアプタマーを特定する工程の前に、工程(c)〜(d)が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回、または少なくとも20回繰り返される、請求項171記載の方法。
- 候補アプタマーのプールが少なくとも106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、または少なくとも1018種の核酸配列を含む、請求項171記載の方法。
- 1種または複数種のアッセイ成分が、基体、ビーズ、平面アレイ、カラム、チューブ、ウェル、またはフィルタの1つまたは複数を含む、請求項171記載の方法。
- 関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的がタンパク質を含む、請求項171記載の方法。
- 関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的が微小胞を含む、請求項171記載の方法。
- 関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的が1種または複数種の微小胞表面抗原を含む、請求項171記載の方法。
- 1種または複数種の微小胞表面抗原が、表3、4、および26から選択される、請求項178記載の方法。
- 関心対象の標的が、SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEFからなる群より選択されたタンパク質であり、1種または複数種の交絡する標的が該群の他のメンバーを含む、請求項171記載の方法。
- 1種または複数種の微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、請求項178記載の方法。
- 疾患が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛を含む、請求項140、147、157、166、167、または178記載の方法。
- 癌が、急性リンパ芽球性白血病;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;AIDS関連癌;AIDS関連リンパ腫;肛門癌;虫垂癌;星状細胞腫;非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;基底細胞癌;膀胱癌;脳幹神経膠腫;脳腫瘍(脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む);乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;原発不明癌;カルチノイド腫瘍;原発不明癌腫;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;子宮頸癌;小児癌;脊索腫;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;内分泌膵島細胞腫瘍;子宮内膜癌;上衣芽腫;上衣腫;食道癌;鼻腔神経芽細胞腫;ユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝臓外胆管癌;胆嚢癌;胃癌;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質細胞腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;毛様細胞性白血病;頭頸部癌;心臓癌;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;眼内黒色腫;膵島腫瘍;カポジ肉腫;腎臓癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;口唇癌;肝臓癌;肺癌;悪性線維性組織球腫;骨癌;髄芽腫;髄上皮種;黒色腫;メルケル細胞癌;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄増殖性腫瘍;鼻腔癌;鼻咽頭癌;神経芽細胞腫;非ホジキンリンパ腫;非黒色腫皮膚癌;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔癌;口腔咽頭癌;骨肉腫;その他の脳および脊髄の腫瘍;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵臓癌;乳頭腫症;副鼻腔癌;副甲状腺癌;骨盤癌;陰茎癌;咽頭癌;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫;下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫;原発性肝細胞肝癌;前立腺癌;直腸癌;腎臓癌;腎細胞(腎臓)癌;腎細胞癌;気道癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺癌;セザリー症候群;小細胞肺癌;小腸癌;軟部組織肉腫;扁平上皮癌;頸部扁平上皮癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫;精巣癌;咽喉癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺癌;移行上皮癌;腎盂尿管移行上皮癌;絨毛性腫瘍;尿管癌;尿道癌;子宮癌;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍を含む、請求項182記載の方法。
- 前癌状態がバレット食道を含む、請求項182記載の方法。
- 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス(SLE)、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、強直性脊椎炎 シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む、請求項182記載の方法。
- 心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞、または血栓性事象を含む、請求項182記載の方法。
- 神経疾患が、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病(HD)、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス(NPSLE)、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイスラーシャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害(例えば脳卒中)、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群を含む、請求項182記載の方法。
- 疼痛が、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む、請求項182記載の方法。
- 感染症が、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む、請求項182記載の方法。
- 複数種の細胞外微小胞を、ランダムに生成された結合物質のライブラリーと接触させる工程、細胞外微小胞の1種または複数種の成分に対する親和性を有する結合物質のライブラリーのサブセットを特定する工程を含む、結合物質を特定するための方法。
- 結合物質がアプタマーおよび/または抗体を含む、請求項190記載の方法。
- 試験生物学的試料を、請求項158に従属する請求項158〜189のいずれか一項記載の標的に結合する1種または複数種のアプタマーと接触させる工程を含む、表現型を特徴決定する方法。
- 表現型の特徴決定が、請求項182〜189のいずれか一項記載の疾患または障害を検出する工程を含む、請求項192記載の方法。
- 選択されたアプタマーの1種または複数種の標的を特定する工程をさらに含む、請求項132〜191のいずれか一項記載の方法。
- 請求項132〜194のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキット。
- 請求項132〜194のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬の使用。
- (a)微小胞の表面抗原を含む標的を結合物質と結合させるために、結合物質を該標的と接触させる工程;
(b)標的と結合物質との結合を分断しない条件下で、微小胞を分断する工程;
(c)標的と結合物質との間の複合体を単離する工程;および
(d)結合物質に結合された標的を特定する工程
を含む、結合物質の標的を特定する方法。 - 結合物質が請求項132〜194のいずれか一項記載の方法によって特定されたアプタマーを含む、請求項197記載の方法。
- 結合物質が請求項190記載の方法によって特定される、請求項197記載の方法。
- 結合物質が請求項168〜170のいずれか一項記載の方法によって特定されたリガンドを含む、請求項197記載の方法。
- 標的が、タンパク質、核酸、脂質、または糖質を含む、請求項197記載の方法。
- 工程(b)の前に標的が結合物質に架橋している、請求項197記載の方法。
- 架橋が、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミダート、N-ヒドロキシスクシンイミド-エステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベラート(BS3)、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DDC)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDCまたはEDAC)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)およびスルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(Sulfo-SMCC)、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロプリオナート(Sulfo-SBED)、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチン-アミドカプロイル)-L-リシニル]エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-Biotin)、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノ-カプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リシニルアミド]}エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-LC-Biotin)、光反応性アミノ酸、L-Photo-Leucine、L-Photo-Methionine、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン、またはこれらの任意の組み合わせもしくは修飾を含む、請求項202記載の方法。
- 工程(b)での微小胞の分断が、洗浄剤、界面活性剤、溶解剤、酵素、機械的せん断、ビーズミリング、ホモジネーション、マイクロ流体化、音波処理、フレンチプレス、衝突、コロイドミル、減圧、浸透圧性ショック、熱分解、凍結融解、および乾燥の1つまたは複数の使用を含む、請求項197記載の方法。
- 酵素が、リゾチーム、リソスタフィン、ザイモラーゼ、セルラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、およびマンナーゼの1つまたは複数を含む、請求項204記載の方法。
- 洗浄剤が、オクチルチオグルコシド(OTG)、オクチルβ-グルコシド(OG)、非イオン性洗浄剤、Triton X、Tween 20、脂肪アルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル(Brij)、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、ノノキシノール-9、グリセロールアルキルエステル、グリセリルラウラート、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリソルベート、ソルビタンアルキルエステル、コカミドMEA、コカミドDEA、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマー、ポロキサマー、ポリエトキシル化タローアミン(POEA)、両性イオン性洗浄剤、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート(CHAPS)、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩(LAS)、アルキルフェノールエトキシラート(APE)、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、ベタイン、コカミドプロピルベタイン、レシチン、イオン性洗浄剤、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、臭化セトリモニウム(CTAB)、塩化セチルトリメチルアンモニウム(CTAC)、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム(CPC)、塩化ベンザルコニウム(BAC)、塩化ベンゼトニウム (BZT)、5-ブロモ-5-ニトロ-1,3-ジオキサン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド(DODAB)、デオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール(TergitolタイプNP-40;NP-40)、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム(ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES))、ミレス硫酸ナトリウム、アルキルカルボン酸塩、ステアリン酸ナトリウム、ナトリウムラウロイルサルコシナート、カルボン酸塩をベースにしたフッ素系界面活性剤、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロオクタン酸(PFOAまたはPFO)、および生物系界面活性剤の1つまたは複数を含む、請求項204記載の方法。
- 結合物質が基体につながれている、請求項197記載の方法。
- 基体がミクロスフェアを含む、請求項207記載の方法。
- 基体が平面の基体を含む、請求項207記載の方法。
- 結合物質が標識されている、請求項197記載の方法。
- 標的と結合物質との間の複合体を単離する工程が、該標識を介して結合物質を捕捉することを含む、請求項210記載の方法。
- 標識がビオチン標識を含む、請求項210記載の方法。
- 標的がタンパク質を含み、かつ該標的を特定する工程が、質量分析(MS)、ペプチドマスフィンガープリンティング(PMF;タンパク質フィンガープリンティング)、配列決定、N末端アミノ酸解析、C末端アミノ酸解析、エドマン分解、クロマトグラフィー、電気泳動、二次元ゲル電気泳動(2Dゲル)、抗体アレイ、およびイムノアッセイの使用を含む、請求項197記載の方法。
- 請求項197〜213のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキット。
- 1種または複数種の試薬が、請求項132〜194のいずれか一項記載の方法によって特定されたアプタマーを含む、請求項214記載のキット。
- SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列に対して少なくとも50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%相同である配列を含む、核酸。
- SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列を含む、核酸。
- SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列に対して少なくとも50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%相同である配列を含む、単離された核酸。
- SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列を含む、単離された核酸。
- 少なくとも1つの化学修飾を含むようにさらに改変されている、請求項216〜219のいずれか一項記載の核酸。
- 前記修飾が、核酸の、糖位置での化学的置換;リン酸位置での化学的置換;および塩基位置での化学的置換からなる群より選択される、請求項220記載の核酸。
- 前記修飾が、修飾されたヌクレオチドの取込み、3'のキャッピング、ビオチン化、アミンリンカーへの結合、高分子量の非免疫原性化合物への結合、親油性化合物への結合からなる群より選択される、請求項220記載の核酸。
- 非免疫原性の高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項222記載の核酸。
- ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項223記載の核酸。
- 請求項216〜224のいずれか一項記載の核酸を含む組成物。
- 請求項216〜225のいずれか一項記載の核酸または組成物を含む、キット。
- 基体に結合した非標的結合核酸を含む陰性対照組成物。
- 非標的結合核酸が基体に共有結合している、請求項227記載の陰性対照組成物。
- 非標的結合核酸が基体に非共有結合的に結合している、請求項227記載の陰性対照組成物。
- 非標的結合核酸が、請求項216〜224のいずれか一項から選択される核酸を含む、請求項227記載の陰性対照組成物。
- 非標的結合核酸が、スクランブルされたSEQ ID NO: 1〜241535のいずれかの配列またはこれらの機能的断片を含む、請求項227記載の陰性対照組成物。
- 生物学的実体を含むことが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、
(a)基体および請求項227〜230のいずれか一項記載の陰性対照組成物を含む組成物を提供する工程であって、該基体が、生物学的実体に対する1種または複数種の結合物質を含む、工程;
(b)生物学的試料を、工程(a)で提供された組成物と接触させる工程;
(c)工程(b)において1種または複数種の結合物質によって認識された生物学的実体の量に対応する標的シグナルを検出する工程;ならびに
(d)工程(c)で検出された標的シグナルを、陰性対照組成物によって生じたシグナルの量に対応する対照シグナルに対して正規化する工程であって、それによって該生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する、工程
を含む、方法。 - 標的シグナルの正規化が、標的シグナルから対照シグナルを差し引くことを含む、請求項232記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質が抗体またはアプタマーを含む、請求項232記載の方法。
- 生物学的実体がタンパク質を含む、請求項232記載の方法。
- 生物学的実体が微小胞を含む、請求項232記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質が微小胞表面抗原に特異的である、請求項236記載の方法。
- 微小胞表面抗原が、表3〜4、または26から選択される、請求項237記載の方法。
- 微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、請求項237記載の方法。
- 疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供する、請求項239記載の方法。
- 請求項232〜240のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキット。
- 1種または複数種の試薬が、1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、請求項241記載のキット。
- 非標的結合核酸を含む、ブロッキング組成物。
- 非標的結合核酸が請求項216〜224のいずれか一項から選択される核酸を含む、請求項243記載のブロッキング組成物。
- ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、pepticase、非イオン性界面活性剤、Tween(登録商標)20、Triton(登録商標)X-100、非反応性抗体またはその断片、FSG(魚皮ゼラチン)、純粋なゼラチン、ゼラチンヒドロラーゼ、ポリエチレングリコール(PEG)、非反応性血清、および非反応性タンパク質からなる群より選択される1種または複数種の成分をさらに含む、請求項243記載のブロッキング組成物。
- 生物学的実体を含むことが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、
(a)基体を、請求項243〜245のいずれか一項記載のブロッキング組成物と接触させる工程であって、該基体が、生物学的実体に対する1種または複数種の結合物質を含む、工程;
(b)生物学的試料を、工程(a)で提供されたブロッキングされた基体と接触させる工程;および
(c)工程(b)で生物学的実体が1種または複数種の結合物質によって認識されたかどうか検出する工程であって、それによって該生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する、工程
を含む、方法。 - 1種または複数種の結合物質が抗体またはアプタマーを含む、請求項246記載の方法。
- 生物学的実体がタンパク質を含む、請求項246記載の方法。
- 生物学的実体が微小胞を含む、請求項246記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質が微小胞表面抗原に特異的である、請求項249記載の方法。
- 微小胞表面抗原が、表3、4、または26から選択される、請求項250記載の方法。
- 微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、請求項250記載の方法。
- 疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供する、請求項252記載の方法。
- 請求項246〜253のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキット。
- 1種または複数種の試薬が、1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、請求項254記載のキット。
- 官能基に特異的に結合するアプタマー。
- 官能基が、炭化水素、ハロゲン、酸素を含む基(すなわちC-O結合)、窒素を含む基、硫黄を含む基、リンを含む基、またはホウ素を含む基からなる群より選択される、請求項256記載のアプタマー。
- 炭化水素が、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、トルエン誘導体、分枝または環状アルカン、カルボカチオン、およびカルボアニオンからなる群より選択される、請求項257記載のアプタマー。
- ハロゲンが、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、およびヨードアルカンからなる群より選択される、請求項257記載のアプタマー。
- 酸素を含む基が、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カルボナート、カルボキシラート、カルボン酸、エステル、ヒドロペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、およびオルトカルボナートからなる群より選択される、請求項257記載のアプタマー。
- 窒素を含む基が、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアナート、ニトラート、ニトリル、ニトライト、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、およびピリジン誘導体からなる群より選択される、請求項257記載のアプタマー。
- 硫黄を含む基が、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、硫酸、スルホン酸、チオシアナート、イソチアナート、チオン、およびチアールからなる群より選択される、請求項257記載のアプタマー。
- リンを含む基が、ホスフィン、ホスファン、ホスホン酸、ホスファート、およびホスホジエステルからなる群より選択される、請求項257記載のアプタマー。
- ホウ素を含む基が、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸、およびボリン酸エステルからなる群より選択される、請求項257記載のアプタマー。
- 官能基が、アセタール、アシル基、ハロゲン化アシル、アルケニル基、アルコキシド、アルコキシ基、アルキニル基、アミド、アミンオキシド、アミン、カルボジイミド、カルボキシミダート、カルボン酸、シアナミド、シアナート、ジチオカルバマート、エノール、エステル、エーテル、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、イミド、イソシアナート、イソシアニド、イソチオシアナート、ケタール、ケテン、ケトン、脱離基、ニトリル、有機ハロゲン化物、有機リン、オルトエステル、オキシム、ホスホノフルオリダート、ホスホノチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロフルオリダート、ホスホロチオアート、保護基、ピロホスファート、セミカルバジド、セミカルバゾン、スルファマート、スルホン酸エステル、スルホン、スルホン酸、スルホニル基、スルホキシイミン、スルフリル化合物、チオアミド、チオシアナート、チオエステル、チオラート、チオン、チオホスホリル化合物、およびチオスルフィナートからなる群より選択される、請求項256記載のアプタマー。
- 官能基が、アセタール、アセトキシ基、アセチリド、酸無水物、活性化基、塩化アシル、ハロゲン化アシル、アシラール、アシロイン、アシルシラン、アルコール、アルデヒド、アルジミン、アルカン、アルケン、アルコキシド、アルキルシクロアルカン、亜硝酸アルキル、アルキン、アレン、アミド、アミジン、アミナール、アミンオキシド、アジド、アジン、アジリジン、アゾキシ、二官能性、ビスチオセミカルバゾン、ビウレット、ボロン酸、カルバマート、カルバミノ、カルバジド、カルベン、カルビノール、炭酸エステル、カルボニル、カルボキサミド、カルボキシミダート、カルボン酸、クロロホルマート、クムレン、シアン酸エステル、シアニミド、シアノヒドリン、不活性化基、デプシド、ジアゾ、ジオール、ジチオカルバマート、エナミン、エンジイン、エノール、エノールエーテル、エノン、エニン、エピスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、フルオロスルホナート、ハロヒドリン、ハロケトン、ヘミアセタール、ヘミアミナール、ヘミチオアセタール、ヒドラジド、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、イミン、イミニウム、イソチオウロニウム、ケテン、ケテンイミン、ケトン、ケチル、ラクタム、ラクトール、ラクトン、メチン、メチル基、ニトラート、ニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトロ化合物、ニトロアミン、ニトロナート、ニトロン、ニトロニウムイオン、ニトロソアミン、ニトロソ、オルトエステル、オサゾン、オキサジリジン、オキシム、n-オキソアンモニウム塩、ペルオキシド、ペルオキシ酸、パーシステントカルベン、フェノール、ホスファアルケン、ホスファアルキン、ホスファート、ホスフィナート、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスフィニト、ホスホナート、ホスホニト、ホスホニウム、ホスホラン、s-ニトロソチオール、シッフ塩基、セレノール、セレノン酸、セロン、セミカルバジド、セミカルバゾン、シリルエノールエーテル、シリルエーテル、スルフェンアミド、スルフェン酸、塩化スルフェニル、スルフィド、スルフィルイミン、スルフィンアミド、スルフィン酸、亜硫酸エステル、スルホンアミド、スルホンアニリド、スルホナート、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、スルホキシド、スルフリル、スルトン、テルロール、チアール、チオアセタール、チオアミド、チオカルバマート、チオカルボキシ、チオシアナート、チオエステル、チオエーテル、チオケタール、チオケトン、チオール、チオラクトン、チオ尿素、トシルヒドラゾン、トリアゼン、トリオール、尿素、バニリル、キサンタート、イリド、およびイノラートからなる群より選択される、請求項256記載のアプタマー。
- 官能基が、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、および/またはクロロメチル基を含む、請求項256記載のアプタマー。
- 官能基がカルボキシル基を含む、請求項256記載のアプタマー。
- 請求項216〜224のいずれか一項から選択される核酸を含む、請求項256〜267記載のアプタマー。
- 請求項256〜269のいずれか一項記載のアプタマーおよび基体を含む、組成物。
- 基体が平面の基体を含む、請求項270記載の組成物。
- 基体がミクロスフェアを含む、請求項270記載の組成物。
- 基体が、カルボキシル修飾、アミノ修飾、ヒドロキシル修飾、ヒドラジド修飾、クロロメチル修飾、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の修飾を含む、請求項270記載の組成物。
- 基体がカルボキシル基を含む、請求項270記載の組成物。
- アプタマーがカルボキシル基に結合している、請求項273記載の組成物。
- 基体が結合物質を含む、請求項270記載の組成物。
- 結合物質が抗体またはアプタマーを含む、請求項276記載の組成物。
- 微小胞をさらに含む、請求項270記載の組成物。
- 請求項256〜278のいずれか一項記載のアプタマーまたは組成物を含む、キット。
- 請求項256〜269のいずれか一項記載のアプタマーを基体と接触させる工程を含む、方法。
- 基体が平面の基体である、請求項280記載の方法。
- 基体がミクロスフェアである、請求項280記載の方法。
- 基体が、カルボキシル修飾、アミノ修飾、ヒドロキシル修飾、ヒドラジド修飾、クロロメチル修飾、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の修飾を含む、請求項280記載の方法。
- 基体がカルボキシル基を含む、請求項280記載の方法。
- アプタマーがカルボキシル基に結合している、請求項283記載の方法。
- 基体が結合物質を含む、請求項280記載の方法。
- 結合物質が抗体またはアプタマーを含む、請求項286記載の方法。
- 基体を結合物質の標的と接触させる工程をさらに含む、請求項286記載の方法。
- 請求項280〜288のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含み、任意で、1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、キット。
- 生物学的実体を含むことが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、
(a)カルボキシル化された基体に付着した生物学的実体に特異的な1種または複数種の結合物質を含む組成物を提供する工程であって、該カルボキシル化された基体が、請求項256〜269のいずれか一項記載のアプタマーと結合している、工程;
(b)生物学的試料を、工程(a)で提供された組成物と接触させる工程;および
(c)工程(b)で生物学的実体が1種または複数種の結合物質によって認識されたかどうかを検出する工程であって、それによって該生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する、工程
を含む、方法。 - 1種または複数種の結合物質が抗体またはアプタマーを含む、請求項290記載の方法。
- 生物学的実体がタンパク質を含む、請求項290記載の方法。
- 生物学的実体が微小胞を含む、請求項290記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質が微小胞表面抗原に特異的である、請求項290記載の方法。
- 微小胞表面抗原が、表3、4、または26から選択される、請求項294記載の方法。
- 微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、請求項294記載の方法。
- 疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供する、請求項295記載の方法。
- 請求項290〜297のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキットであって、任意で、1種または複数種の該試薬が1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、キット。
- (a)基体を、カルボキシル基に結合することが可能なアプタマーと接触させる工程であって、該基体が、1種または複数種の選択された核酸またはポリペプチド分子も含む、工程;および(b)基体を、該核酸またはポリペプチド分子に結合することが可能な結合物質と接触させる工程であって、それによって、カルボキシル基に結合したアプタマーが、該核酸またはポリペプチド分子に対する結合物質の結合を増強する、工程
を含む、結合を増強するための方法。 - アプタマーが、請求項256〜269のいずれか一項記載のアプタマーである、請求項299記載の方法。
- 基体が平面の基体である、請求項299記載の方法。
- 基体がミクロスフェアである、請求項299記載の方法。
- 核酸またはポリペプチドが、アミド結合を介してカルボキシル基に共有結合している、請求項299記載の方法。
- 基体が結合物質を含む、請求項299記載の方法。
- 請求項299〜304のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキットであって、任意で、1種または複数種の該試薬が1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、キット。
- (a)基体-生物学的試料複合体を形成させるために、基体を生物学的試料と接触させる工程;
(b)基体-生物学的試料複合体を複数種の候補結合物質と接触させる工程;および
(c)基体-生物学的試料複合体と結合する複数種の候補結合物質の1つまたは複数のメンバーを特定する工程であって、それによって1種または複数種の結合物質を選択する、工程
を含む、1種または複数種の結合物質を選択する方法。 - 1種または複数種の結合物質が、核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体複合体、抗体断片、アプタマー、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、レクチン、ポリペプチド、ペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識剤、化学物質、またはこれらの組み合わせを含む、請求項306記載の方法。
- 生物学的試料が組織試料または細胞培養物試料を含む、請求項306記載の方法。
- 生物学的試料が体液を含み、任意で、体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、臍帯血、またはこれらのいずれかの派生物を含む、請求項306記載の方法。
- 生物学的試料が、濃縮血漿試料、血清試料、浄化血清試料、または浄化血漿試料を含む、請求項306記載の方法。
- 生物学的試料が異種微小胞集団または同種微小胞集団を含む、請求項306〜310のいずれか一項記載の方法。
- 浄化血清または浄化血漿試料が、非浄化対照試料と比較して低下したレベルの、1種または複数種の高存在量タンパク質を有する、請求項311記載の方法。
- 1種または複数種の高存在量タンパク質が血液タンパク質を含む、請求項312記載の方法。
- 1種または複数種の高存在量タンパク質が、1種または複数種のアルブミン、IgG、トランスフェリン、フィブリノーゲン、フィブリン、IgA、α2-マクログロブリン、IgM、α1-抗トリプシン、補体C3、ハプトグロブリン、アポリポタンパク質A1、A3、およびB;α1-酸性糖タンパク質、セルロプラスミン、補体C4、C1q、IgD、プレアルブミン(トランスチレチン)、プラスミノーゲン、これらのいずれかの誘導体、およびこれらの組み合わせを含み、1種または複数種の高存在量タンパク質が、1種または複数種のアルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、プレアルブミン、α1抗トリプシン、α1酸性糖タンパク質、α1フェトプロテイン、ハプトグロビン、α2マクログロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体タンパク質C3およびC4、β2ミクログロブリン、βリポタンパク質、γグロブリンタンパク質、C反応性タンパク質(CRP)、リポタンパク質(カイロミクロン、VLDL、LDL、HDL)、他のグロブリン(α、β、およびγ型)、プロトロンビン、マンノース結合レクチン(MBL)、これらのいずれかの誘導体、およびこれらの組み合わせを含み得る、請求項312記載の方法。
- 1種または複数種の高存在量タンパク質が、クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性、沈殿、またはこれらの組み合わせによって浄化血清または浄化血漿試料から全体的または部分的に分離される、請求項312記載の方法。
- 1種または複数種の高存在量タンパク質が、生物学的試料をトロンボプラスチンと接触させる工程の後に浄化血清または浄化血漿試料から分離される、請求項312記載の方法。
- 非浄化対照試料と比較して、1種または複数種の高存在量タンパク質の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%が浄化血清または浄化血漿試料から分離される、請求項312記載の方法。
- 基体-生物学的試料複合体が、基体と生物学的試料の成分との間の架橋を含み、任意で、該架橋が、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミダート、脂質架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミド-エステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベラート(BS3)、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DDC)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDCまたはEDAC)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(Sulfo-SMCC)、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロプリオナート(Sulfo-SBED)、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチン-アミドカプロイル)-L-リシニル]エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-Biotin)、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノ-カプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リシニルアミド]}エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-LC-Biotin)、光反応性アミノ酸、L-Photo-Leucine、L-Photo-Methionine、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン、またはこれらの任意の組み合わせもしくは修飾を含む、請求項306記載の方法。
- 基体が、生物学的試料の成分に直接架橋されている、請求項318記載の方法。
- 基体が、リンカーを介して生物学的試料の成分に架橋されている、請求項318記載の方法。
- 生物学的試料の成分が微小胞を含む、請求項319または320記載の方法。
- リンカーが微小胞膜中に埋め込まれている、請求項320に従属する請求項321記載の方法。
- リンカーが、官能化脂質を含み、任意で、該官能化脂質が、16:0ビオチニルPE 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)(ナトリウム塩)、18:1ビオチニルPE 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)(ナトリウム塩)、16:0ビオチニルキャップPE 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)(ナトリウム塩)、18:1ビオチニルキャップPE 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)(ナトリウム塩)、またはこれらの組み合わせを含む、請求項322記載の方法。
- リンカーが、ジアシルグリセロール、ジアシルホスホグリセロール(リン脂質)もしくはステロール、ジアルキルグリセロール、ジアルキル-もしくはジアシル-1-アミノ-2,3-ジヒドロキシプロパン、長鎖アルキルもしくはアシル、スフィンゴ脂質、セラミド、リン脂質、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)膜アンカー配列、糖リン脂質膜アンカー、膜受容体断片、タンパク質結合受容体、金属キレート受容体、免疫グロブリンFc結合受容体、サイトカインもしくは成長因子結合受容体、薬物結合受容体、脂質模倣(lipid mimicking)受容体、膜貫通受容体、合成タンパク質結合受容体、合成金属キレート受容体、合成免疫グロブリンFc結合受容体、合成サイトカインもしくは成長因子結合受容体、合成薬物結合受容体、合成脂質模倣受容体、合成膜貫通受容体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、スフィンゴ脂質、ステロイド、コレステロール、ジヒドロコレステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、コレステリルアミン、ジヒドロコレステリルアミン、エルゴステリルアミン、ブラシカステリルアミン、3-コレステリルアミン、3-ジヒドロコレステリルアミン、3-エルゴステリルアミン、3-ブラシカステリルアミン 3β-コレステリルアミン、3β-ジヒドロコレステリルアミン、3β-エルゴステリルアミン、3β-ブラシカステリルアミン、またはこれらのいずれかの機能的断片もしくは誘導体を含む、請求項322記載の方法。
- 基体が、生物学的試料の成分に対する結合物質と結合している、請求項318記載の方法。
- 結合物質が、抗体、アプタマー、またはレクチンを含み、任意で、該レクチンがコンカナバリンA(ConA)を含む、請求項325記載の方法。
- 生物学的試料の成分が微小胞を含み、任意で、結合物質が微小胞表面抗原に対する結合物質を含む、請求項325または326記載の方法。
- 1種または複数種の結合物質を特定する工程をさらに含む、請求項306記載の方法。
- 基体-微小胞複合体を含み、該基体が合成基体を含む、組成物。
- 基体が、ビーズ、ウェル、または平面の基体を含み、任意で、該ビーズが磁気ビーズ、またはポリスチレンビーズを含む、請求項329記載の組成物。
- 請求項306〜328のいずれか一項記載の方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットであって、任意で、該1種または複数種の試薬が1種または複数種の基体-微小胞複合体およびリンカー物質を含む、キット。
- 安定した基体-微小胞複合体を作製する方法であって、基体を微小胞と接触させる工程を含み、該基体が、該微小胞の表面上に存在する少なくとも1つの成分に直接結合することが可能な化学基によって官能化されている、方法。
- 基体が、ビーズ、ウェル、マトリックス、または平面の基体を含む、請求項332記載の方法。
- 化学基が、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、レクチン、ペプチド/ポリペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識剤、化学物質、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミダート、脂質架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミド-エステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベラート(BS3)、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DDC)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDCまたはEDAC)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(Sulfo-SMCC)、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロプリオナート(Sulfo-SBED)、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチン-アミドカプロイル)-L-リシニル]エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-Biotin)、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノ-カプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リシニルアミド]}エチルメタンチオスルホナート(Mts-Atf-LC-Biotin)、光反応性アミノ酸、L-Photo-Leucine、L-Photo-Methionine、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項332記載の方法。
- 化学基が、炭化水素、ハロゲン、酸素を含む基(すなわちC-O結合)、窒素を含む基、硫黄を含む基、リンを含む基、ホウ素を含む基、またはこれらの組み合わせを含む、請求項332記載の方法。
- 炭化水素が、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、トルエン誘導体、分枝または環状アルカン、カルボカチオン、およびカルボアニオンからなる群より選択される、請求項335記載の方法。
- ハロゲンが、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、およびヨードアルカンからなる群より選択される、請求項335記載の方法。
- 酸素を含む基が、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カルボナート、カルボキシラート、カルボン酸、エステル、ヒドロペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、およびオルトカルボナートからなる群より選択される、請求項335記載の方法。
- 窒素を含む基が、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアナート、ニトラート、ニトリル、ニトライト、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、およびピリジン誘導体からなる群より選択される、請求項335記載の方法。
- 硫黄を含む基が、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、硫酸、スルホン酸、チオシアナート、イソシアナート、チオン、およびチアールからなる群より選択される、請求項335記載の方法。
- リンを含む基が、ホスフィン、ホスファン、ホスホン酸、ホスファート、およびホスホジエステルからなる群より選択される、請求項335記載の方法。
- ホウ素を含む基が、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸、およびボリン酸エステルからなる群より選択される、請求項335記載の方法。
- 化学基が、アセタール、アシル基、ハロゲン化アシル、アルケニル基、アルコキシド、アルコキシ基、アルキニル基、アミド、アミンオキシド、アミン、カルボジイミド、カルボキシミダート、カルボン酸、シアナミド、シアナート、ジチオカルバマート、エノール、エステル、エーテル、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、イミド、イソシアナート、イソシアニド、イソチオシアナート、ケタール、ケテン、ケトン、脱離基、ニトリル、有機ハロゲン化物、有機リン、オルトエステル、オキシム、ホスホノフルオリダート、ホスホノチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロフルオリダート、ホスホロチオアート、保護基、ピロホスファート、セミカルバジド、セミカルバゾン、スルファマート、スルホン酸エステル、スルホン、スルホン酸、スルホニル基、スルホキシイミン、スルフリル化合物、チオアミド、チオシアナート、チオエステル、チオラート、チオン、チオホスホリル化合物、および/またはチオスルフィナートを含む、請求項332記載の方法。
- 化学基が、アセタール、アセトキシ基、アセチリド、酸無水物、活性化基、塩化アシル、ハロゲン化アシル、アシラール、アシロイン、アシルシラン、アルコール、アルデヒド、アルジミン、アルカン、アルケン、アルコキシド、アルキルシクロアルカン、亜硝酸アルキル、アルキン、アレン、アミド、アミジン、アミナール、アミンオキシド、アジド、アジン、アジリジン、アゾキシ、二官能性、ビスチオセミカルバゾン、ビウレット、ボロン酸、カルバマート、カルバミノ、カルバジド、カルベン、カルビノール、炭酸エステル、カルボニル、カルボキサミド、カルボキシミダート、カルボン酸、クロロホルマート、クムレン、シアン酸エステル、シアニミド、シアノヒドリン、不活性化基、デプシド、ジアゾ、ジオール、ジチオカルバマート、エナミン、エンジイン、エノール、エノールエーテル、エノン、エニン、エピスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、フルオロスルホナート、ハロヒドリン、ハロケトン、ヘミアセタール、ヘミアミナール、ヘミチオアセタール、ヒドラジド、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、イミン、イミニウム、イソチオウロニウム、ケテン、ケテンイミン、ケトン、ケチル、ラクタム、ラクトール、ラクトン、メチン、メチル基、ニトラート、ニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトロ化合物、ニトロアミン、ニトロナート、ニトロン、ニトロニウムイオン、ニトロソアミン、ニトロソ、オルトエステル、オサゾン、オキサジリジン、オキシム、n-オキソアンモニウム塩、ペルオキシド、ペルオキシ酸、パーシステントカルベン、フェノール、ホスファアルケン、ホスファアルキン、ホスファート、ホスフィナート、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスフィニト、ホスホナート、ホスホニト、ホスホニウム、ホスホラン、s-ニトロソチオール、シッフ塩基、セレノール、セレノン酸、セロン、セミカルバジド、セミカルバゾン、シリルエノールエーテル、シリルエーテル、スルフェンアミド、スルフェン酸、塩化スルフェニル、スルフィド、スルフィルイミン、スルフィンアミド、スルフィン酸、亜硫酸エステル、スルホンアミド、スルホンアニリド、スルホナート、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、スルホキシド、スルフリル、スルトン、テルロール、チアール、チオアセタール、チオアミド、チオカルバマート、チオカルボキシ、チオシアナート、チオエステル、チオエーテル、チオケタール、チオケトン、チオール、チオラクトン、チオ尿素、トシルヒドラゾン、トリアゼン、トリオール、尿素、バニリル、キサンタート、イリド、およびイノラートからなる群より選択される、請求項332記載の方法。
- 化学基が、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、および/またはクロロメチル基を含む、請求項332記載の方法。
- 化学基がカルボキシル基を含む、請求項332記載の方法。
- 少なくとも1つの成分が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、糖質、これらの誘導体、またはこれらの組み合わせを含む、請求項332記載の方法。
- 基体-微小胞複合体を含み、該基体が合成基体を含む、組成物。
- 不活性基体に直接結合した微小胞を含む、安定化した微小胞組成物。
- 基体が、ビーズ、ウェル、マトリックス、または平面の基体を含み、任意で、該ビーズが磁気ビーズ、またはポリスチレンビーズを含む、請求項348または349記載の組成物。
- 請求項332〜347のいずれか一項記載の方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットであって、任意で、該1種または複数種の試薬が1種または複数種の基体-微小胞複合体およびリンカー物質を含む、キット。
- (a)微小胞を、微小胞抗原に対する結合物質と接触させる工程であって、該結合物質が標識を含む、工程;
(b)走査型電子顕微鏡(SEM)の基体に、該接触させた微小胞を固定する工程;
(c)固定された微小胞をスパッターコーティングする工程;および
(d)SEMを使用して微小胞および標識を可視化する工程
を含む、微小胞を可視化する方法。 - 微小胞が、工程(a)の前に基体に付着している、請求項352記載の方法。
- 微小胞が、共有結合を介して基体に付着している、請求項353記載の方法。
- 微小胞が、免疫親和性結合を介して基体に付着している、請求項353記載の方法。
- 結合物質が直接標識されている、請求項352記載の方法。
- 結合物質が間接的に標識されている、請求項352記載の方法。
- 結合物質が、抗体、機能的抗体断片、またはアプタマーを含む、請求項352記載の方法。
- 間接的な標識が、微小胞抗原に対する結合物質との複合体を形成する標識された結合物質を含む、請求項357記載の方法。
- 微小胞抗原が、表3、表4、または表26から選択される、請求項352記載の方法。
- 微小胞抗原が、テトラスパニン、CD9、CD63、CD81、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項352記載の方法。
- スパッターコーティングが金および/またはパラジウムコーティングを含む、請求項352記載の方法。
- スパッターコーティングが炭素コーティングを含む、請求項352記載の方法。
- SEMが、微小胞を可視化するための二次電子(SE)モード、および/または標識を可視化するための後方散乱電子(BSE)モードを含む、請求項352記載の方法。
- 標識が金を含む、請求項352〜364のいずれか一項記載の方法。
- i. 微小胞が、工程(a)の前に共有結合を介して基体に付着しており;
ii. 微小胞抗原に対する結合物質が、間接的に標識された抗体であり、該間接的な標識が、微小胞抗原に対する抗体と複合体を形成する金標識抗体を含み;
iii. 微小胞抗原がCD9であり;
iv. スパッターコーティングが炭素コーティングを含み;かつ
v. SEMが、微小胞を可視化するための二次電子(SE)モード、および/または標識を可視化するための後方散乱電子(BSE)モードを含む
、請求項352記載の方法。
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